Upload
lamdat
View
236
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
LUIS ALBERTO SOTO DANTAS SILVA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO PARA COMPLEXOS METÁLICOS
BASEADO EM HIDROGEL TERMOSSENSÍVEL
Salvador 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
LUIS ALBERTO SOTO DANTAS SILVA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO PARA COMPLEXOS METÁLICOS
BASEADO EM HIDROGEL TERMOSSENSÍVEL
Salvador 2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmácia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como um dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Farmácia.
Orientadora: Professora Dra. Renata Galvão de Lima
Co-orientadora: Professora Dra. Elaine Christine de Magalhães Cabral Albuquerque
Sistema de Bibliotecas da UFBA
Silva, Luis Alberto Soto Dantas. Desenvolvimento e caracterização físico-química de sistemas de liberação para complexos metálicos baseado em hidrogel termossensível / Luis Alberto Soto Dantas Silva. - 2014. 95 f. : il. Orientadora: Prof. Dr. Renata Galvão de Lima.
Co-orientadora: Prof. Dr. Elaine Christine de Magalhães Cabral Albuquerque. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador, 2013.
1. Polímeros. 2. Complexos metálicos. 3. Fisíco-Químíca. I. Lima, Renata Galvão de. II. Albuquerque, Elaine Christine de Magalhães Cabral. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Farmácia. IV. Título. CDD - 547.7 CDU - 678.7
APOIO FINANCEIRO
CAPES
Dedico este trabalho aos meus pais, familiares e amigos pelo incentivo e apoio constante durante este tempo.
Obrigado!
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar, porque foi Ele quem me permitiu ingressar na pós-graduação e me deu inteligência, graça e perseverança durante toda minha caminhada. Aos meus pais, Luis Alberto e Leila Maria, pela educação e amor todos esses anos, esta conquista também é deles. A minha querida irmã Sâmara, pelo apoio e por acreditar no meu potencial. A Fabiana Cavalcante, por me “aturar” até nos momentos de stress, sendo sempre carinhosa e paciente. Aos meus amigos, em especial Jonatas Rodrigues, que me acompanhou nesta pós-graduação e contribuiu muito neste tempo. À minha orientadora, Dra Renata Galvão de Lima, pela orientação, atenção, apoio e, principalmente, paciência em todos os momentos da realização deste trabalho. À minha co-orientadora, Dra Elaine Cabral Albuquerque, pelos ensinamentos passados neste tempo. Ao professor Dr. Jose Mário Barichello, pelo auxilio na realização do trabalho. Aos professores Dr. Eudes Velozo e Dr. Marcelo Castilho, por cederem seus laboratórios e equipamentos no decorrer deste projeto. Ao professor Dr. Roberto Santana da Silva e os integrantes do seu laboratório, por realizarem as medidas fotoquímicas. A professora Dra. Heloysa Martins Carvalho Andrade, pelas análises de infravermelho. A professora Dra. Maria do Carmo Rangel, pelas análises de difração de raios-X. A professora Dra. Maria Vitória Bentley, por realizar as análises de potencial zeta e tamanho de partícula. Aos integrantes do laboratório de Microscopia da FIOCRUZ Bahia, por realizarem as análises de MEV. Ao Programa de Pós-Graduação em Farmácia e aos professores deste programa, pelas contribuições no meu aprendizado e na minha formação ao longo do curso. A CAPES pelo apoio financeiro. E agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente na realização deste trabalho.
SILVA, Luis Alberto Soto Dantas. Desenvolvimento e caracterização físico-química de sistemas de liberação para complexos metálicos baseado em hidrogel termossensível. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2013.
RESUMO
Polímeros como Poloxameros ou Pluronics® são surfactantes não iônicos que, em solução aquosa, apresentam a propriedade de se auto-organizarem em micelas. Essas soluções micelares quando submetidas a aquecimento ou ao um aumento na concentração do surfactante, forma-se um gel in situ, o que tem levado a sua utilização como um veículo farmacêutico. O objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento e caracterização físico-química de formulações a base de PluronicÒ F127 (PF-127), incorporados com complexos metálicos do tipo ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+. As formulações foram preparadas pelo método a frio e pelo método a quente, e depois caracterizadas por espectroscopia na região do UV/Visível, infravermelho; espectrofluorimetria, difração de raios-X, microscopia eletrônica de varredura, potencial zeta, tamanho de partícula; além de ser também avaliado a liberação de espécies reativas de oxigênio como o oxigênio singlete (1O2), e espécies reativas de óxido nítrico como o radical óxido nítrico (NO) sob estímulo luminoso. Os resultados encontrados por espectroscopia na região do UV/Visível e espectrofluorimetria demonstraram que os complexos ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, em meio heterogêneo, comportaram-se de modo semelhante a quando em meio homogêneo, pois não houve alteração no seu perfil espectral. As analises por difração de raios-X demonstraram que não houve mudança na cristalinidade das formulações e quando comparados ao controle, indicando, juntamente com os dados de infravermelho, que não há algum tipo de reação química entre os complexos e o PF-127. As formulações contendo ZnPC e ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ mostraram-se estáveis durante 28 dias. Morfologicamente, as formulações apresentaram-se com um aspecto homogêneo, poroso e lamelar. As formulações apresentaram um potencial zeta negativo, sendo que os géis contendo o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ tiveram um valor menos negativo, possivelmente devido a carga deste complexo, e os géis contendo a ZnPC um valor mais negativo. Foi evidenciado que houve a saída controlada de NO e 1O2, após irradiação luminosa na região do visível. Logo, as formulações desenvolvidas neste trabalho PF-127demonstram ser sistemas de liberação adequados para a incorporação de complexos metálicos de diferentes polaridades, ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+. Palavras-chaves: Pluronic® F127, complexos metálicos, caracterização físico-química.
SILVA, Luis Alberto Soto Dantas. Development and physicochemical characterization of delivery systems for metal complexes based on thermosensitive hydrogel. Master Dissertation – Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2013.
ABSTRACT Polymers such as poloxamers or Pluronics® are nonionic surfactants, in aqueous solution, have the property of self-organize into micelles. These micellar solutions when subjected to heating or to increase the concentration of surfactant forms a gel in situ, which has led to its use as a pharmaceutical. The objective of this work is the development and physical-chemical based formulations of PluronicÒ F127 (PF-127), incorporated with metal complex-type ZnPC and [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+. The formulations were prepared by cold and hot methods, and then characterized by spectroscopy in the UV/Visible, infrared, spectrofluorimetric, X-ray diffraction, scanning electron microscopy, zeta potential, particle size, in addition to be also evaluated the release of reactive oxygen species such as singlet oxygen (1O2), and reactive species such as nitric oxide radical nitric oxide (NO) under light stimulation. The results found by spectroscopy in the UV/Visible and spectrofluorometric showed that ZnPC complexes and [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3 + in heterogeneous medium, behaved similarly to when in homogeneous, because there was no change in its spectral profile. The analysis by X-ray diffraction showed no change in crystallinity of the formulations and compared to control, indicating, together with the infrared data, that there are not chemical reaction between the complex and the PF-127. Formulations containing ZnPC and ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ are stable for 28 days. Morphologically, the formulations presented with a homogeneous aspect, porous and lamellar. The formulations showed negative zeta potential, and the gels containing the complex [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ had a less negative value, possibly due to charge of the complex and gels containing a value ZnPC more negative. It was shown that there was a controlled output NO and 1O2 under light irradiation in the visible region. Thus, the formulations developed in this work showed been release systems suitable for the incorporation of metal complexes of different polarities, ZnPC and [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+. Keywords: Pluronic® F-127, metal complexes, physicochemical characterization.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais picos obtidos através da espectroscopia na região do
infravermelho das formulações analisadas ............................................................... 63
Tabela 2 – Valores de 2θ para as formulações estudadas ....................................... 69
Tabela 3 – Valores de potencial zeta obtidos para as preparações em géis de PF-
127 ............................................................................................................................ 83
Tabela 4 – Distribuição de tamanhos das formulações com gel PF-127 ................... 85
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Formação de micelas poliméricas a partir de diferentes tipos de
copolímeros em bloco ............................................................................................... 21
Figura 2 – Estrutura química do Pluronic .................................................................. 23
Figura 3 – Processo de formação dos géis de Pluronic® F127 ................................ 25
Figura 4 – Princípio básico da Terapia Fotodinâmica ............................................... 27
Figura 5 – Diagrama de Jablonski e reações fotofísicas do mecanismo da TFD ...... 28
Figura 6 – Estrutura química das metalo ftalocianinas .............................................. 32
Figura 7 – Estruturas químicas da ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ ......................... 39
Figura 8 – Representação esquemática da preparação do gel contendo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 pelo método a frio ............................................................... 42
Figura 9 – Representação esquemática da preparação do gel contendo ZnPC pelo
método a quente ....................................................................................................... 43
Figura 10 – Representação esquemática do preparo do gel contendo ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 pelo método a quente ......................................................... 43
Figura 11 – Medida do NO liberado através do NOmeter (acima) e da fibra do laser
(abaixo) ..................................................................................................................... 47
Figura 12 – Representação da reação do DPBF com oxigênio singlete e formação de
endoperóxido ............................................................................................................. 48
Figura 13 – Espectro de absorção na região do UV/Vis do complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ (50 μmol/L) em tampão fosfato, pH=7,4 a temperatura
ambiente (» 30 0C) .................................................................................................... 51
Figura 14 – E Espectro de absorção na região do UV/Vis da ZnPC (5 μmol/L) em
DMSO/DMF (1:1) a temperatura ambiente (» 30 0C) ................................................ 52
Figura 15 – Espectro de absorção na região do UV-visível dos fármacos
incorporados em géis de PF-127, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (vermelho), ZnPC (azul), e
da associação entre [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 + ZnPC (preto) a temperatura ambiente
(» 30 0C) .................................................................................................................... 53
Figura 16 – Variação da absorbância no comprimento de onda de 670 nm em função
da concentração de ZnPC em gel de PF-127 a temperatura ambiente (» 30 0C) ..... 56
Figura 17 – Variação da absorbância no comprimento de onda em 510 nm em
função da concentração de [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 em gel de PF-127 a temperatura
ambiente (» 30 0C) .................................................................................................... 57
Figura 18 – Espectro de absorção na região do UV/Vis da ZnPC incorporada em gel
de PF-127. Em vermelho, dia 0; azul, 7 dias; verde, 14 dias; rosa, 21 dias; e preto,
28 dias de estocagem no escuro a 25 ºC .................................................................. 59
Figura 19 – Espectro de absorção na região do UV/Vis da ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 incorporados em gel de PF-127. Em vermelho, dia 0; azul, 7
dias; verde, 14 dias; rosa, 21 dias; e preto, 28 dias de estocagem de estocagem no
escuro a 25 ºC ........................................................................................................... 60
Figura 20 – Espectro por reflectância difusa na região do infravermelho para as
formulações: A, gel vazio; B, ZnPC; C, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+; e D,
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC ................................................................................ 62
Figura 21 – Espectro de fluorescência do gel de PF-127 com ZnPC (5 mmol L-1)
(verde), ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (5 mmol L-1/50 mmol L-1) (preto) e da ZnPC
em DMSO:DMF (5 mmol L-1) (vermelho) a temperatura ambiente (» 30 0C). lexcitação=
610 nm ...................................................................................................................... 65
Figura 22 – Difratograma das quatro formulações: A, vazio; B, ZnPC; C,
[Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+; e D, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 + ZnPC. As medidas foram
realizadas a 25 ºC ..................................................................................................... 68
Figura 23 – Difratograma das formulações gel vazio liofilizado (vermelho) e gel vazio
hidratado a 25 0C (preto) ........................................................................................... 70
Figura 24 – Imagem de MEV dos géis liofilizados: A, somente PF-127; B, PF-127
com ZNPC; C, PF-127 com [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3; e D, PF-127 com ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 ............................................................................................. 71
Figura 25 – Imagem do LED com emissão em 630 nm ............................................ 73
Figura 26 – Variação do perfil do espectro de absorção na região do UV/Vis da
solução de DBPF em acetonitrila (tempo irradiação: 0, 300s, 600s e 900s) (A) e a
mistura da solução de ZnPC (DMSO/DMF) em presença de DBPF (B) a temperatura
ambiente (» 30 0C) .................................................................................................... 74
Figura 27 – Espectro de absorção na região do UV/Vis do DPBF juntamente com a
ZnPC (5 µmol L-1) em gel de PF-127. Tempo de irradiação: 0s (preto), 5s (vermelho),
10s (verde), 15s (azul escuro), 20s (azul claro) e 25s (rosa). As medidas foram
realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C) ............................................................ 75
Figura 28 – Espectro de absorção na região do UV/Vis do DPBF juntamente com a
ZnPC (5 µmol L-1) em gel de PF-127. Tempo de irradiação: 0s (preto), 5s (vermelho),
10s (verde), 15s (azul escuro), 20s (azul claro) e 25s (rosa). As medidas foram
realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C) ............................................................ 76
Figura 29 – Decaimento da absorção em 417 nm com tempo de irradiação para a
ZnPC em meio homogêneo (·) e meio heterogêneo (·) ............................................ 77
Figura 30 – Cronoamperograma para o gel contendo o complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 sob irradiação de laser em 470 nm. As medidas foram
realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C) ............................................................ 78
Figura 31 – Cronoamperograma para o gel contendo os dois complexos,
[Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ e ZnPC, sob irradiação de laser em 670 nm. As medidas
foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C) .................................................. 79
Figura 32 – Espectro na região do UV-visível para o complexo
[Ru(H2O)(tpy)(NH.NHq](PF6)2 em meio aquoso [complexo]=4x10-5 mol.L-1 .............. 80
Figura 33 – Gel de PF-127 contendo o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3, após
irradiação em 470 nm. Tom de rosa mais escuro é atribuído ao complexo
[RuII(H2O)(tpy)(NH.NHq)]+2 e o tom de rosa mais claro ao complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 ............................................................................................. 81
Figura 34 – Distribuição de partícula para a preparação do gel PF 127 com ZnPC a
35 0C ......................................................................................................................... 85
LISTA DE ABREVIATURAS
BHL Balanço hidrofílico-lipofílico
CMC Concentração micelar crítica
CO Monóxido de carbono
DMF Dimetilforfamida
DMSO Dimetilsufóxido
DPBF 1,3-Difenilisobenzofurano
EROs Espécies reativas de oxigênio
ERONs Espécies reativas de óxido nítrico
ERP Efeito de retenção e permeabilidade
FRED Fator de relaxamento endotélio dependente
FS Fotossenbilizadores
HpD Hematoporfirina
NO Óxido nítrico
NO+ Íon nitrosônio
NO- Ânion nitróxido
NOS Óxido nítrico sintase
NPS Nitroprussiato de sódio
O2 Oxigênio molecular 1O2 Oxigênio singlete
O2-· Ânion superóxido
OE Óxido de etileno
OH. Radical hidroxil
OP Óxido de propileno
PBS Tampão fosfato pH 7,40
PC Ftalocianinas
PF-127 PluronicÒ F127
PEO Poli(óxido de etileno)
PPO Poli(óxido de propileno)
RuNO [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3
Sn Estado eletrônico de maior energia
S0 Estado fundamental
S1 Estado singlete
TCML Transferência de carga metal ligante
TFD Terapia Fotodinâmica
TGC Temperatura de gel crítica
TMC Temperatura micelar crítica
T1 Estado tripleto excitado
UV/Vis Ultravioleta/visível
ZnPC Zinco ftalocianina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
1.1 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS .................................................... 19
1.2 PLURONIC® ....................................................................................................... 22
1.3 TERAPIA FOTODINÂMICA ................................................................................. 26
1.4 FOTOSSENBILIZADORES ................................................................................. 29
1.5 IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA DO ÓXIDO NÍTRICO ............................................ 33
1.6 APLICAÇÕES FARMACÊUTICAS DE COMPLEXOS ........................................ 36
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 39
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 39
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 40
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 41
3.1 MATERIAIS ......................................................................................................... 41
3.1.1 Reagentes ........................................................................................................ 41
3.2 METODOLOGIAS ............................................................................................... 41
3.2.1 Preparo das soluções ....................................................................................... 41
3.2.2 Preparo dos géis .............................................................................................. 42
3.2.3 Medidas de Ph ................................................................................................. 44
3.2.4 Liofilização das amostras ................................................................................. 44
3.2.5 Espectroscopia na região do Ultravioleta/Visível .............................................. 44
3.2.6 Espectrofluorimetria ......................................................................................... 44
3.2.7 Espectroscopia na região do Infravermelho ..................................................... 45
3.2.8 Difração de Raio-X ........................................................................................... 45
3.2.9 Análise de tamanho de partícula e potencial zeta ............................................ 45
3.2.10 Determinação amperométrica do NO liberado ............................................... 46
3.2.11 Irradiação dos complexos ............................................................................... 46
3.2.12 Estudos de estabilidade ................................................................................. 47
3.2.13 Determinação da concentração estudada ...................................................... 47
3.2.14 Detecção de oxigênio singlete ........................................................................ 48
3.2.15 Microscopia eletrônica de varredura .............................................................. 49
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 50
4.1 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO UV/VISÍVEL ........................................... 50
4.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ESTUDADA ...................................... 54
4.3 ESTUDOS DE ESTABILIDADE .......................................................................... 58
4.4 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO ................................ 61
4.5 ESPECTROFLUORIMETRIA .............................................................................. 64
4.6 DIFRAÇÃO DE RAIO-X....................................................................................... 66
4.7 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA .............................................. 70
4.8 DETECÇÃO DE OXIGÊNIO SINGLETE ............................................................. 72
4.9 ESTUDO DE DETECÇÃO DE NO ...................................................................... 77
4.10 POTENCIAL ZETA ............................................................................................ 82
4.11 ANÁLISE DO TAMANHO DE PARTÍCULA ....................................................... 84
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 86
19
1. INTRODUÇÃO
1.1. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS
A tecnologia de liberação de fármacos representa uma das fronteiras da
ciência, a qual envolve aspectos multidisciplinares e pode contribuir muito para o
avanço da saúde. Os sistemas de liberação de fármacos oferecem vantagens
quando comparados a formas farmacêuticas convencionais (COLLETT; MORETON,
2005; COUTO, 2010).
Formas farmacêuticas convencionais são caracterizadas por apresentarem
uma liberação rápida e não controlada do fármaco no organismo (COLLETT;
MORETON, 2005; VILLANOVA; ORÉFICE; CUNHA, 2010). Devido a este pouco
controle na liberação do agente terapêutico, as formas farmacêuticas convencionais
apresentam algumas limitações, principalmente relacionadas à manutenção das
concentrações plasmáticas do fármaco no organismo, em um regime terapêutico
(COLLETT; MORETON, 2005; KERALIYA et al., 2012; SWARBRICK, 2007). Nesse
contexto, sistemas de liberação de fármacos são desenvolvidos para melhorar a
farmacocinética do fármaco e/ou fornecer uma cinética liberação modificada,
podendo também direciona-lo para um tecido especifico (ALLEN; CULLIS, 2004;
COUTO, 2010; SWARBRICK, 2007).
Tais sistemas de liberação são responsáveis por manter os níveis do fármaco
no plasma na faixa terapêutica desejável, assim eliminando ou reduzindo efeitos
colaterais; prolongar o tempo de ação de fármacos com meia-vida curta; aumentar a
adesão do paciente ao tratamento; melhorar algumas características indesejáveis
referentes a alguns fármacos como baixa solubilidade, instabilidade e baixa
biodisponibilidade (COUTO, 2010; LOFTSSON, 2012; OLIVEIRA, 2009; RICCI-
JÚNIOR; MARCHETTI, 2006; SWARBRICK, 2007; WEBSTER, 2006).
Nas últimas décadas houve um aumento no desenvolvimento dos sistemas de
liberação de fármacos. A razão para este fato é que estes sistemas apresentam
menor custo de desenvolvimento e requerem um tempo menor de introdução no
mercado ($20-50 milhões e 3-4 anos, respectivamente), quando comparados ao
desenvolvimento de novas moléculas para uso terapêutico (aproximadamente 800
20
milhões e 10-12 anos, respectivamente). Adicionalmente, quando um fármaco é
veiculado em um novo sistema de liberação, este é aprimorado, aumentando assim
seu valor de mercado, sua competitividade e seu tempo de patente (COUTO, 2010;
FREITAS et al., 2007; KERALIYA et al., 2012; TIWARI et al., 2012).
Diante deste panorama uma ampla variedade de sistemas de liberação,
visando condicionar a velocidade e o local de liberação dos fármacos, tem sido
objeto de investigação na área da indústria farmacêutica (LOPES; LOBO; COSTA,
2005; RICCI-JÚNIOR; MARCHETTI, 2006). Uma parte desses trabalhos vem sendo
dirigido para o estudo de micelas poliméricas como carreadores de fármacos, sendo
o primeiro deles realizado por BADER e colaboradores (1984).
Micelas poliméricas são partículas coloidais, geralmente esféricas, que são
formadas a partir de copolímeros em bloco ou copolímeros enxertados (GRALLERT,
2012; VILLANOVA, ORÉFICE; CUNHA, 2010; YOKOYAMA, 2011). Estes
copolímeros são constituídos por unidades de monômeros hidrofílicos e
hidrofóbicos, o que fornece a eles a propriedade de se auto-organizarem quando
dissolvidos em um solvente seletivo (LOH, 2002). Por exemplo, em meio aquoso, a
uma determinada temperatura e concentração, as porções hidrofóbicas do
copolímero agregam-se formando o núcleo da micela, enquanto que a parte
hidrofílica circunda este núcleo, evitando assim o contato deste com o meio exterior
(Figura 1) (DU; LU, 2012; JONES; LEUROX, 1999). Estas micelas formadas
possuem um tamanho (diâmetro) médio na faixa de 10 a 100 nm (FRANCIS;
CRISTEA; WINNIK, 2004; JONES; LEUROX, 1999).
21
Figura 1. Formação de micelas poliméricas a partir de diferentes tipos de copolímeros em bloco em solução aquosa (tradução de GRALLERT et al., 2012).
Estas características estruturais fornecem as micelas poliméricas algumas
propriedades que as tornam promissoras para a utilização como carreadores de
fármacos, como:
· a possibilidade de transportar diversos tipos de fármacos,
principalmente os de características hidrofóbicas, pois o núcleo da
micela, em condições fisiológicas, possui um caráter hidrofóbico que
permite que compostos com pouca solubilidade em água sejam
incorporados nesse núcleo, aumentando assim a sua estabilidade e
biodisponibilidade, e diminuindo alguns efeitos tóxicos relacionados a
eles (YONCHEVA et al., 2012);
· a permanência por longos períodos na circulação sanguínea,
permitindo que fármacos sejam administrados por períodos de tempo
mais longos. Este maior tempo de permanência no organismo também
fornece a estes carreadores a possibilidade de se acumular em sítios
patológicos com vasos afetados (por exemplo, em tumores e
inflamações) o que pode melhorar ou aumentar a liberação dos
fármacos nessas áreas, que é conhecido como efeito de retenção e
permeabilidade (ERP) ou direcionamento passivo (TORCHILIN, 2001;
22
FRANCIS et al., 2004);
· a possibilidade de direcionamento para um sítio específico de ação,
ligando moléculas específicas aos copolímeros, tais como: anticorpos,
açucares ou por introdução de um polímero sensível a variação de
temperatura e pH (JONES; LEUROX, 1999; TORCHILIN, 2001).
As micelas poliméricas são estudadas como carreadores de agentes
antineoplásicos, pois a maioria desses agentes possui baixa solubilidade em água e
apresentam algum tipo de toxicidade contra células sadias. Algumas dessas
formulações já estão sendo testadas clinicamente como, por exemplo, a SP1049C,
que utiliza a doxorrubicina incorporada em micelas mistas de Pluronic L61 e F127
para o tratamento de adenocarcinoma de esôfago e junção gasoesofágica; a NK105,
em que o placlitaxel é incorporado em micelas de poli(etileno glicol)-poli(ácido
aspártico) para tratar o câncer avançado de estômago; e NC-6004, no qual a
cisplatina é incorporada nas micelas de poli(etileno glicol)-poli(ácido glutâmico) para
o tratamento de tumores sólidos (GONG et al., 2012 ;OERLEMANS et al., 2010).
Entre os copolímeros que formam as micelas poliméricas, as classes dos
poli(oxido de etileno)-poli(L-amino ácidos), poli(oxido de etileno)-poli(ésteres) e
poli(oxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), também
conhecidos como Pluronic® ou poloxamer, são os mais comumente estudados.
Neste trabalho utilizaremos o Pluronic® devido a algumas características únicas que
estes possuem (ADAMS; LAVASANAFIR; KWON, 2003; GAUCHER et al., 2005).
1.2. PLURONIC®
Pluronic® ou poloxamer são uma série de copolímeros em bloco sintéticos,
não iônicos, que consistem em blocos de óxido de etileno (OE) e óxido de propileno
(OP) arranjados em uma estrutura básica A-B-A: OEx-OPy-OEx. Sua estrutura
química é mostrada na Figura 2. Esse arranjo resulta em um copolímero com
propriedades anfifílicas, caracterizado pelo valor do balanço hidrofílico-lipofílico
(BHL), que é altamente dependente dos valores de x e y. Variando o valor das
unidades hidrofílicas, OE (x), e hidrofóbicas, OP (y), pode-se alterar o tamanho,
hidrofilicidade, e lipofilicidade desses copolímeros em bloco (DUMORTIER, 2006;
23
FUSCO; BORZACCHIELO; NETTI, 2006; KABANOV; BATRAKOVA; ALAKHOV,
2002; ROWE, 2005; VYAS, 2009).
Figura 2. Estrutura química do Pluronic® (x: número de unidades de óxido de etileno e y: número de unidades de óxido de propileno).
Os Pluronics® tem a propriedade de se auto-organizarem em micelas, em
solução aquosa (FUSCO; BORZACCHIELO; NETTI, 2006; KABANOV;
BATRAKOVA; ALAKHOV, 2002). Este processo de auto-organização em micelas,
denominado micelização, é altamente dependente de dois fatores, a temperatura e a
concentração do polímero (BOUCHEMAL et al., 2009; DESAI et al., 2001; MICHELS;
WATON; ZANA, 2001). Quando se fixa uma determinada temperatura, as soluções
de Pluronic® que estão abaixo da concentração micelar crítica (CMC), que é a
concentração na qual ocorre a formação de micelas em solução, as cadeias
individuais dos copolímeros em bloco, denominadas “unímeros”, estão como
monômeros dissolvidos em solução (BOUCHEMAL et al., 2009; HUANG, 2002;
KABANOV; BATRAKOVA; ALAKHOV, 2002). Em uma concentração superior a
CMC, os unímeros se agregam formando as micelas (SHARMA; BHATIA, 2004;
ZHANG; LAM, 2005). Mantendo-se a concentração constante, as soluções de
Pluronic® apresentam-se como unímeros dissolvidos em solução (geralmente
abaixo de 15 ºC) em temperaturas abaixo da temperatura micelar crítica (TMC),
temperatura em que se inicia o processo de micelização. Aumentando-se a
temperatura acima da TMC, os blocos de OP dos unímeros se desidratam levando
assim a formação das micelas (BONACUCINA et al., 2007; FAHAD, 2011; RUEL-
GARIÉPY; LEROUX, 2004;). Estas micelas apresentam uma estrutura em que o
núcleo hidrofóbico do copolímero é formado pelas cadeias de OP, que são
separados do exterior aquoso pela coroa hidrofílica, a qual é composta pelas
cadeias de OE (DESAI, 2001; FEITOSA, 2010).
24
Devido as suas características como surfactante, os Pluronics® são utilizados
para as mais diversas aplicações industriais, tais como, detergentes, dispersantes,
estabilizantes, solubilizantes, emulsificantes, agentes espumantes, entre outras
(ARTZNER, 2007; BOODHWANI et al., 2006; CABANA; AIT-KADI; JUHÁSZ, 1997;
KADAM et al., 2011; MASKARINEC; WU; LEE, 2005). Como estes copolímeros em
bloco apresentam uma baixa toxicidade, provocam uma resposta imune mínima, são
biocompatíveis e possuem a capacidade de incorporar uma diversidade de
compostos nas suas micelas, têm-se aumentado os estudos no uso deste material
na área biomédica (BOGDANOVA, 2008; GONG et al., 2012; HUANG et al., 2002).
Pluronic® F127 ou poloxamer 407 (PF-127) é um membro do grupo dos
Pluronics®, que possui um peso molecular em torno de 12600 Da, sendo constituído
de 70% de OE e 30% de OP. O PF-127 é um sólido branco, tendo um ponto de
fusão de 56ºC, exibe um valor de BHL igual a 22, e pode ser representado pela sua
fórmula estrutural EO100OP65OE100 (BARBA et al., 2009; OH; BRONICH; KABANOV,
2004; SHATALOVA et al., 2008; ZHAO et al., 2008). Este tipo de Pluronic®
apresenta um fenômeno conhecido como gelificação térmica reversa, ou seja, em
soluções aquosas com concentrações de 20% ou mais, estes polímeros são líquidos
micelares a baixas temperaturas, os quais se transformam em géis semi-rígidos com
o aumento da temperatura acima da temperatura ambiente (KHATTAK, 2005; LIU,
2007; MOORE et al., 2000; PANDIT; WANG, 1998).
A formação do gel ainda é um processo não totalmente compreendido, porém
alguns autores afirmam que o aumento da temperatura, em uma dada concentração,
leva a um enfraquecimento das interações dos blocos de OE da micela com a água
circundante, tornando-as menos favoráveis, enquanto as interações dos blocos de
OE com os blocos de OP tornam-se mais favoráveis. Assim, ao aumentar ainda mais
a temperatura a certo valor, conhecido como temperatura de gel crítica (TGC),
devido ao aumento das atrações polímero-polímero, as micelas entram em contato e
ocorre um enovelamento destas. Este enovelamento gera um aumento acentuado
na viscosidade da solução até que se forme um gel rígido, que é quando as micelas
não conseguem mais se mover. Este processo é totalmente reversível, pois quando
colocado sob resfriamento o gel passa a ser solução novamente (Figura 3)
(CABANA; AIT-KADI; JUHÁSZ, 1997; FAHAD, 2011).
25
Figura 3. Processo de formação dos géis de Pluronic® F127 (adaptado de FAHAD, 2011).
O fenômeno de transição sol-gel dependente de temperatura possibilita que
as formulações possam ser aplicadas na forma de soluções, transformando-se em
um gel rígido conforme aquece com a temperatura do organismo (YONG et al.,
2001; BONACUCINA et al., 2011). Outra característica importante desse gel é que é
possível incorporar compostos de diversas solubilidades (MOORE et al., 2000). Géis
de PF-127 tem sido utilizados como sistemas de liberação para fármacos anti-
inflamatórios (SCHIN, 2000), insulina (BARICHELLO et al., 1999), peptídeos (LIU et
al., 2007), terapia gênica (GUO et al., 2012), compostos naturais (SAHU et al.,
2010), fotossensibilizadores (BOURRE et al., 2002; SEZGIN et al., 2006), doadores
de NO (SHISHIDO et al., 2003) entre outros.
Tendo em vista a versatilidade do copolímero Pluronic® F127 em comportar-
se como gel rígido a temperatura de 37 0C, a sua utilização como sistema de
26
liberação tópico é bastante promissor (ESCOBAR-CHAVEZ et al., 2006; ALMEIDA et
al., 2012). Sendo assim, o estudo de fármacos fotossensibilizadores utilizados em
terapia fotodinâmica e Pluronic F127 tem destaque neste trabalho.
1.3. TERAPIA FOTODINÂMICA
A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um tratamento não invasivo, para uma
variedade de doenças oncológicas, cardiovasculares, dermatológicas e oftálmicas
(ALLÉMANN, 2002; KONAN; GURNY; MACHADO, 2000; MILLER et al., 2007;
WEISS et al.,2012). Essa terapia clínica consiste na administração sistêmica, tópica
ou local de fármacos, denominados fotossensibilizadores (FS), que após se
acumularem preferencialmente nos tecidos lesados e na presença de oxigênio
molecular são irradiados com luz visível, com comprimento de onda na região de
600 a 800 nm (chamado de janela terapêutica), gerando assim espécies reativas de
oxigênio (EROs), tais como oxigênio singlete (1O2), ânion superóxido (O2-·), radical
hidroxil (OH.), que causam danos irreversíveis para estes tecidos,
consequentemente, levando a morte destes por necrose ou apoptose (Figura 4)
(DOUGHERTY, 1995; NAWALANY et al., 2012; ROBERTSON; EVANS;
ABRAHAMSE, 2009).
27
Figura 4. Principio básico da Terapia Fotodinâmica: 1. Introdução do FS no paciente; 2. Tempo de incubação do FS e acumulação do FS no tecido lesado; 3. Irradiação da região com luz visível; 4. Destruição do tecido lesado (SILVA, É., 2010).
Conforme o diagrama de Jablonski (Figura 5), quando o FS absorve o fóton,
ele é excitado do seu estado fundamental (S0) para o estado eletrônico de maior
energia, o estado singlete excitado (Sn), decaindo rapidamente por processos não
radiativos ao mais baixo estado singlete (S1). Deste nível energético, as moléculas
podem decair ao estado S0 por emissão de fluorescência ou então passar para o
estado tripleto excitado (T1) via cruzamento intersistema. Este estado T1 é
caracterizado por ter um tempo de vida muito mais longo (µs) do que o estado S1
(ns). A partir do estado T1, o FS pode retornar para o estado fundamental, por
processo de conversão interna ou por processo de emissão de fosforescência, ou
então reagir com substratos biológicos por dois diferentes mecanismos:
Mecanismo tipo I: envolve a abstração de um átomo de hidrogênio ou
transferência de elétrons entre o fotossensibilizador no estado T1 e um substrato
(macromoléculas biológicas), produzindo radicais livres. Esses radicais livres podem
reagir com o oxigênio molecular (O2) presente no meio, gerando O2-·, OH., que
interagem com centros específicos dentro dos sistemas celulares, desencadeando a
morte de tais tecidos. Finalmente, o fotossenbilizador volta para seu estado S0 (DE
ROSA; BENTLEY, 2000; DE ROSA; CRUTCHLEY, 2002).
Mecanismo tipo II: envolve a transferência de energia do fotossensibilizador
no estado T1 para o oxigênio molecular, cujo seu estado fundamental é tripleto (3O2),
produzindo oxigênio singlete. O 1O2 é extremamente reativo e oxida vários
28
substratos biológicos. Acredita-se que o 1O2 seja a principal espécie que causa os
danos fotodinâmicos, pois ele rapidamente reage com os mais variados
componentes celulares (lipídeos insaturados, proteínas, ácidos nucleicos) uma vez
que os compostos orgânicos insaturados são, de forma geral, suscetíveis à ação
dele, levando a inativação destas células (JOSEFSEN; BOYLE, 2008; ORMOND;
FREEMAN, 2013; ROBERTSON; EVANS; ABRAHAMSE, 2009).
Figura 5. Diagrama de Jablonski e reações fotofísicas do mecanismo da TFD (adaptado de Konan et al., 2002).
Os mecanismos tipo I e II ocorrem simultaneamente e competitivamente. A
razão entre esses processos depende do tipo de fotossensibilizador usado, a
concentração dos substratos e o oxigênio molecular, bem como a afinidade de
ligação dos sensibilizadores pelo substrato. Entretanto, o mecanismo tipo II parece
desempenhar o papel central na toxicidade, por causa da interação altamente
eficiente do 1O2 com várias biomoléculas (De ROSA; BENTLEY, 2000; DOLMANS et
al., 2003; GONÇALVES, 2008).
A extensão do fotodano e citotoxicidade é multifactorial e depende do tipo de
FS, a sua localização extracelular e intracelular, a dose total administrada, a dose
total de exposição luminosa, a disponibilidade de oxigênio, e o tempo entre a
administração do FS e exposição à luz. Todos esses fatores são interdependentes
(DOLMANS et al., 2003).
A TFD é utilizada, principalmente, para o tratamento de diversos tipos de
neoplasias, tais como: bexiga, pulmão, cavidade oral, cabeça e pescoço, esôfago,
pele, entre outros; sendo que para o câncer de pele considera-se a TFD como
29
tratamento ideal, devido à facilidade de exposição desse órgão a luz (BAGNATO et
al., 2005; BECHET et al., 2012; MACHADO, 2000; CHATTERJEE; FONG; ZHANG,
2008;TRIESSCHEIJN et al., 2006). Além do tratamento de neoplasias, a TFD é
usada no tratamento de doenças oftálmicas (especialmente degeneração macular
da retina), dermatológicas (ex. queratose actínica, psoríase), inflamatórias (ex. artrite
reumatoide) e na erradicação de alguns microorganismos (vírus, bactérias e fungos)
(CHATTERJEE; FONG; ZHANG, 2008; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; PERUSSI,
2007).
Quando comparada a outras modalidades de tratamento, como a
quimioterapia, radioterapia, cirurgia (para neoplasias) e tratamento farmacológicos
(ex. uso de antibióticos), a TFD apresenta algumas vantagens, por exemplo: a não
necessidade de longos períodos de internação, a repetição da terapia sem efeito
tóxico cumulativo, a possibilidade de tratamento simultâneo de vários tumores, o não
desenvolvimento de mecanismos de resistência por parte dos microorganismos à
terapia, e a ocorrência de mínimos efeitos adversos, sendo o mais comum a
fotossensibilizade prolongada do paciente (AGOSTINIS et al., 2011; CHATERJEE et
al., 2008; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; MILLLER et al., 2007; ZEITOUNI;
OSEROFF; SHIEH, 2003). Isto ocorre pelo fato de que este tratamento médico é
altamente seletivo e específico, pois o fotossensibilizador tende a acumular-se,
preferencialmente, nos tecidos lesados e a fonte de luz é direcionada para este
tecido, minimizando possíveis danos aos tecidos sadios adjacentes (PERUSSI,
2007).
1.4. FOTOSSENBILIZADORES
Fotossensibilizadores (FS) podem ser definidos como compostos que
absorvem energia luminosa em comprimentos de onda específicos e são capazes
de usar esta energia absorvida para induzir reações em outras moléculas que não
absorvem energia (SIBATA et al., 2000).
A principal característica do fotossensibilizador é a possibilidade de acumular-
se, preferencialmente, em tecidos lesionados e gerar agentes citotóxicos para
induzir o efeito biológico desejado (SOARES, 2009). Entretanto, um
30
fotossensibilizador para ser considerado ideal deve apresentar algumas
características, tais como: alta absorção do FS na região 600-800nm, faixa
conhecida como “janela terapêutica”, onde a penetração da luz no tecido é elevada;
possuir mínima toxicidade no escuro; possuir acumulo máximo no tecido lesado em
curto intervalo de tempo após a administração; apresentar rápida liberação dos
tecidos normais, (minimizando os efeitos fototóxicos adversos; pureza química;
possuir alto rendimento quântico de oxigênio singlete; ausência de potencial
mutagênico, alérgico ou carcinogênico; não deve ser tóxico em doses normais e não
danificar células normais. Além destas características, é interessante que FS seja
anfifílico, ou seja, solúvel em meio fisiológico, mas que contenha também uma parte
hidrofóbica, permitindo a sua permeação na membrana celular (AGOSTINIS et al.,
2012; ALLISON et al., 2012; DE ROSA; BENTLEY, 2000; PASZKO et al., 2011;
SOARES, 2009).
A primeira geração de fotossensibilizadores foi constituída por compostos
derivados da hematoporfirina (HpD). A forma purificada de uma mistura de porfirinas
solúveis em água, o porfímero sódico (comercialmente conhecido como Photofrin®),
foi o primeiro FS aprovado para o uso clínico de TFD, em 1993 no Canadá
(AGOSTINIS et al., 2012; ALLISON et al., 2004; PASZKO et al., 2011;
TRIESSCHEIJN et al., 2006). Apesar de serem eficazes, esses FS de primeira
geração possuem uma série de inconvenientes, como baixa seletividade pelos
tecidos lesionados, em termos de razão tecido doente/tecido sadio; não possuírem
pureza química, sendo constituído por uma mistura complexa de várias porfirinas;
possuírem baixa absorção de luz no comprimento de onda máximo, necessitando de
altas doses de luz; e apresentam uma alta taxa de acumulação na pele, induzindo a
sensibilização desta de 6 a 8 semanas depois do tratamento (ALLISON et al., 2004;
BAE; NA, 2012; KONAN et al., 2002; CHATTERJEE et al., 2008; FRIMAYANTI et al.,
2011; ORMOND; FREEMAN, 2013; TRIESSCHEIJN et al., 2006).
Devido às limitações dos FS de primeira geração, novas moléculas
fotossensibilizadoras foram desenvolvidas, chamadas de FS de segunda geração,
como os derivados de porfirinas, as clorinas, as naftalocianinas e as ftalocianinas
(PC) (CHATERJEE et al., 2008; KONAN et al., 2002). Esses compostos apresentam
a vantagem de serem quimicamente puros, geradores efetivos de oxigênio singlete e
31
por apresentarem forte absorção na região do vermelho do espectro, comprimentos
de onda maiores que 630 nm. Além disso, apresentam maior seletividade pelos
tecidos lesionados que os de primeira geração; e eliminação mais rápida do
organismo, o que minimiza os efeitos adversos (KONAN et al., 2002; SOARES,
2009; XU et al., 2012).
Entre os FS de segunda geração, as PCs são as mais promissoras (NUNES;
SGUILLA; TEDESCO, 2004; SIBATA et al., 2004), pois apresentam baixa toxicidade,
uma alta capacidade de acumular-se nos tecidos lesados, possuem um alto
coeficiente de extinção molar no intervalo de 670-750 nm, tem alta estabilidade
fotoquímica e alta eficiência citotóxica devido a fotogeracão de oxigênio singlete
(DEROSA; CRUTCHLEY, 2002; LI et al., 2009; OLIVERIA et al., 2005; SEKKAT et
al., 2012; SIBATA et al., 2004).
As ftalocianinas são corantes sintéticos que possuem estrutura molecular
semelhante a das porfirinas (TOMAZINI et al., 2007). Essa estrutura (Figura 6)
consiste em um macrociclo tetrapirrólico que, ao contrário das porfirinas, tem átomos
de nitrogênio ligando as subunidades pirrólicas em vez das pontes de metileno.
Cada anel pirrólico é estendido por um anel de benzeno, que podem ser substituídos
ou não; resultando em uma maior absorção em comprimentos de onda na região do
vermelho do espectro visível (SEKKAT et al., 2012; SHARMAN et al., 1999).
32
Figura 6. Estrutura química das metalo ftalocianinas.
As propriedades fotofísicas desses fotossensibilizadores são altamente
dependentes do íon metálico central. As ftalocianinas complexadas com os íons Zn+2
e Al+3 apresentam as propriedades fotofísicas mais favoráveis dentre as metalo
ftalocianinas para aplicação em TFD, como por exemplo, relativo tempo de vida no
estado excitado singlete (3-8 ns) e alto rendimento quântico do estado triplete (ΦT >
0,4) (NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004).
Em vários centros de pesquisa, mais de 80% dos estudos em TFD se
baseiam na utilização do oxigênio singlete (1O2) como espécie reativa (DE ROSA;
CRUTCHLEY, 2002). Porém, é grande a procura por outras espécies úteis, na
produção de radicais livres derivados de fármacos fotossensibilizadores, além de
outras espécies radicalares independentes de oxigênio, uma vez que a característica
hipóxica de neoplasias de pequeno porte constitui-se uma grande barreira para o
33
sucesso da TFD como terapia efetiva na fase clínica. Uma possibilidade é utilizar
compostos que liberem fotoquimicamente óxido nítrico (NO), o qual além de possui
uma natureza radicalar, pode reagir com o ânion superóxido (O2·-) presente no meio
biológico e formar outros radicais com ação cititóxica em culturas de células (TAMIR
et al., 1996; KORBELIK et al., 2000).
1.5. IMPORTÂNCIA BIOLÓGICA DO ÓXIDO NÍTRICO
O NO apresenta surpreendente onipresença em seres vivos. É a única
molécula endógena conhecida que reúne as propriedades de neurotransmissor, de
mediador constitutivo e indutível e de agente citotóxico. Ela possui ação na
regulação da pressão sangüínea, no sistema imunológico e nas atividades do
cérebro, fígado, pâncreas, útero e pulmões (AINSCOUGH; BRODIE, 1995;
CULOTTA et al., 1992; FELDMAN et al. 1993; STAMLER, 1992; WINK et al., 1996).
A molécula de NO é a menor molécula classificada como mensageiro nos
processos biológicos. Nessa função o NO, não depende de transportadores
específicos nem de canais de passagem intracelulares. Ele difunde-se pela célula,
com a mesma facilidade em meio hidrofílico e em meio lipofílico. Sua ação fisiológica
depende muito mais de suas propriedades físico-químicas que de sua configuração
eletrônica (FELDMAN et al., 1993).
Atribuem-se as ações bioquímicas do óxido nítrico à diversidade de suas
espécies, ou seja, a espécie NO+ (íon nitrosônio), que é formada pela retirada do
elétron desemparelhado no orbital p*, e a espécie NO- (ânion nitróxido), que é
formada pela adição de um elétron ao orbital. O ânion nitróxido é isoeletrônico ao O2
e pode existir no estado singlete, de maior energia ou no estado triplete, de menor
energia. O íon nitrosônio é isoeletrônico ao monóxido de carbono (CO) e reage
rapidamente com água e outros nucleófilos (WINK et al., 1993).
Talvez a área de pesquisa sobre a bioquímica do NO que mais se
desenvolveu na ultimas décadas esteja relacionada com sua ação vasodilatadora.
Em 1987, constatou-se ser o NO o fator de relaxamento endotélio dependente
(FRED). Nas células endoteliais, o NO é produzido pela isoforma constitutiva da
Óxido Nítrico Sintase Endotelial (NOSe) (MUIJSERS et al., 2001).
34
Simplificadamente, esta enzima produz NO e o aminoácido L-citrulina a partir do
aminoácido L-arginina e de O2 presente no meio. As isoformas para as enzimas
constitutivas do óxido nítrico estão subdivididas em: isoenzima neuronal (nNOS ),
isoenzima endotelial (eNOS) e isoenzima induzida (iNOS) (CALS-GRIERSON;
ORMEROD, 2004).
Durante o processo de produção do NO há a transferência de cinco elétrons e
conversão de NADPH em NADP. No meio celular, mesmo em concentrações
menores que 5 mmol L-1, o NO interage com o íon metálico de ferro (II), presente na
enzima guanilato ciclase, ativando-a. Esta enzima produz um segundo mensageiro
biológico, a guanosina monofosfato cíclica, que desencadeia uma série de
processos fisiológicos, inclusive o relaxamento da musculatura lisa das artérias
(BUTLER, 1995).
O NO também atua em carcinogenesis, progressão tumoral e na terapia do
câncer dependendo da variedade de condições no meio intracelular, como tipo de
célula alvo, concentração de NO e a presença de outras espécies radicalares
(CHIANG, et al., 2005; WELLER, 2003). A resposta apoptótica celular parece
depender significativamente do potencial redox da célula que é influenciado pelos
níveis de óxido nítrico. No entanto, ao mesmo tempo em que altas concentrações de
NO promovem o efeito tumoricida (morte celular), mecanismos de proteção celular
anti apoptose (efeito tumorogênico) mediado pelo NO veem sendo estudados, mas
ainda não foram elucidados. Sob influência citotóxica do NO, as células tumorais
podem morrer por apoptose ou necrose dependendo do tipo de célula (KRÖNCKE et
al., 1997). Dentre as hipóteses para elucidação dos mecanismos que envolvem o
processo de apoptose ocasionada pelo NO destacam-se: indução da expressão de
Bcl-2 que é um inibidor do processo de ativação das caspases (CALS-GRIERSON;
ORMEROD, 2004), inativação de enzimas que reparam o DNA e indução do fator de
transcrição p53 (KRÖNCKE et al., 1997).
Em 1998, GUPTA, TORUNER e GROSZMANN demonstraram a produção de
NO durante o processo de fotossensibilização de células com tumor utilizando-se
uma ftalocianina como sensibilizador. O mecanismo de formação do NO durante a
terapia fotodinâmica foi explicado com base no fato de que a TFD resulta em um
aumento rápido e significativo da isoforma da enzima óxido nítrico sintase (NOS),
35
que é dependente do Ca2+ presente nos tecidos cerebrais e neuronais (NOS I). O
aumento da NOS I pode ser explicado pelo fato de que o processo de TFD leva a
liberação intracelular de Ca2+ a partir dos seus estoques dentro das células, o que
por sua vez, resulta em um aumento da produção de NO responsável pela indução
da apoptose (TIMOSHENKO et al., 2001). Em outro trabalho foi relatado o efeito
protetor do NO frente ao tratamento de células tumorais por processos fotoativos.
Células do tipo CCRF-CEM incubadas com AlPcS2 (ftalocinaina de alumínio
bisulfatada) sob estímulo luminoso produziram cerca de 50% de núcleo apoptótico,
mas em presença de L-arginina (doador de NO) o resultado foi um decréscimo de
35% nos núcleos apoptóticos. Neste estudo foi mostrada a potencialidade na
proteção celular causado pela presença do doador de NO (L-arginina). O trabalho
concluiu que o NO do meio não está envolvido na reação direta com as EROs
formadas, mas por mecanismos de inibição de PKG-dependente (proteína quinase
G) ou a níveis de ativação de caspases durante a ativação da cascata apoptótica
(GOMES et al., 2002). Existem na literatura relatos sobre os efeitos do NO em TFD e
os mecanismos que envolvem a morte celular (POGREBNIAK et al., 1994;
KRÖNCKE et al., 1997; WELLER, 2003), mas ainda nada concreto e muito a ser
elucidado.
Estas descobertas recentes têm estimulado o interesse na química e
bioquímica do NO levando ao desenvolvimento de novas drogas para a medicina
(AZIZZADEH et al., 2001; BONAVENTURA et al, 2004; DE LIMA et al., 2005 a,b;
IGNARRO et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2004; SAUAIA et al., 2003; SAUIAIA et al.,
2005 a,b; TOGNIOLO et al., 2001; ZAMBON et al., 1998). Devido à extrema
instabilidade das moléculas de NO em meio biológico e seu curto tempo de meia
vida (aproximadamente 5 seg), torna-se difícil o estudo de seus efeitos fisiológicos.
Assim existe um grande interesse em compostos químicos que possam servir de
pró-drogas para a liberação controlada do NO nos sistemas biológicos (NAPOLI;
IGNARRO, 2003; WORKS et al, 2002;). Esses compostos devem apresentar
algumas propriedades características como ser de fácil preparação em uma forma
pura e estável, de preferência hidrossolúveis, gerar NO quantitativamente, e os
produtos as saída do NO devem ser compostos inertes e atóxicos (ROY et al.,
1994). Dessa forma, o desenvolvimento de compostos que podem agir como
36
doadores de NO num organismo biológico é de interesse para a clinica médica, haja
vista a possibilidade de se controlar a liberação do óxido nítrico por reações
fotoquímicas e/ou redutimétricas.
1.6. APLICAÇÕES FARMACÊUTICAS DE COMPLEXOS
Alguns complexos nitrosilos com aplicação médica são conhecidos desde o
século XIX e muitos deles continuam sendo utilizados (SZCZEPURA; TAKEUCHI,
1990). O nitroprussiato de sódio, Na2[Fe(CN)5(NO)]. 2H2O ¾ vasodilatador útil no
controle da pressão arterial, especialmente em casos de emergência ¾ é um
exemplo de complexo metálico que carrega um ligante ativo (ligante nitrosil)
(MONCADA et al., 1991; STOCHEL et al., 1998). O uso destes compostos encontra,
às vezes, limitações devido às reações secundárias àquela de interesse. No caso
dos compostos nitrosilos, a reação desejada é a liberação de óxido nítrico.
Algumas alternativas para o controle da liberação seletiva de NO a partir de
compostos de coordenação são viáveis clinicamente, como a indução luminosa
(terapia fotodinâmica) e a redução eletroquímica do NO+ coordenado. Ambas as
técnicas levam em consideração a baixa afinidade observada entre o ligante NO0 e
alguns íons metálicos. Isso mostra que a fotoquímica e os processos eletroquímicos
podem ser utilizados para modelar diferentes processos bioquímicos (STOCHEL et
al., 1998).
Metalo-drogas, cujo centro metálico é o rutênio, possuem boa aplicação
clínica, principalmente por ser baixa a toxicidade do metal. Isto se deve, em parte, à
semelhança das propriedades físico-químicas deste metal com as do ferro. O
organismo consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro
através do aumento da produção de proteínas captadoras de íons ferro, como a
transferrina e a albumina. Alguns autores acreditam que o mecanismo de proteção
contra a toxicidade do rutênio seria o mesmo (ALLARDYCE; DYSON, 2001).
Para aumentar a possibilidade da utilização destes complexos como metalo-
fármaco, é preciso conhecer mais sobre seu comportamento químico e
eletroquímico, bem como seu mecanismo de ação em sistemas biológicos. O efeito
de co-ligantes nas espécies contendo a ligação Ru-NO, o acoplamento eletrônico
37
entre os orbitais do metal e do ligante e o controle da reatividade do ligante nitrosil
coordenado são alguns aspectos que direcionam os estudos de pesquisadores.
Neste contexto, complexos macrocíclicos são consideravelmente mais
estáveis termodinâmica e cineticamente, em relação à dissociação do íon metálico,
que os compostos análogos de cadeia aberta ou denticidade menor. O complexo
[RuCl[15ane]NO]2+ permite o controle da saída de NO tanto por estímulo fotoquímico
(OLIVEIRA et al.,2004) quanto redutimétrico o que possibilitou estudos quanto sua
ação como vasodilatador em aortas de ratos desnudas (BONAVENTURA et al.,
2004). Visando a contribuição desses compostos junto a TFD, sistemas do tipo
[Ru(NH3)5(pz)-Ru(bpy)2NO]5+ permitiram a liberação de NO sob irradiação em 532
nm (SAUAIA et al., 2003 a,b). Recentemente, o grupo relatou a possibilidade da
produção de NO por fotoindução em 355 nm a partir de compostos do tipo
[Ru(terpy)(bpy)NO2]+ e [Ru(bpy)2(py)NO0]2+, sendo que o composto
[Ru(terpy)(bpy)NO2]+ encontrava-se vinculado a uma formulação do tipo
microemulsão A/O promovendo ação vasodilatadora em aortas de ratos desnudas
sob irradiação em 355 nm (DE LIMA et al, 2005; SAUAIA et al., 2005a).
Outro complexo, o [Ru(tpy)(NH.NHq)NO](PF6)3 age como um agente liberador
de NO sob estímulo fotoquímico na região do ultravioleta (355 nm) e visível (532 nm)
(DE LIMA et al., 2006). Além dos promissores resultados como vasodilatador em
potencial ao nitroprussiato de sódio (NPS) (BENDHACK et al., 2006,
BONAVENTURA et al., 2006), os estudos relativos aos mecanismo de relaxamento
pelo complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO](PF6)3 originaram diversas discussões e
trabalhos científicos (BONAVENTURA et al, 2009; RODRIGUES et al., 2007, 2008).
Considerando a capacidade de complexos nitrosilos de rutênio liberar NO sob
estímulo fotoquímico na região do visível, a terapia fotodinâmica (TFD) é alvo de
estudos quanto à atividade antitumoral dessa classe de complexos.
Um dos trabalhos que relata sistemas baseados em complexos nitrosilos de
rutênio em TFD é a associação do fotossensibilizador clássico em TFD a zinco
ftalocianina (ZnPC) com o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO](PF6)3 em veículo
lipossomal. Tal sistema mostra que o lipossoma imobilizado com ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO](PF6)3 sob estímulo luminoso em 670 nm foi capaz de produzir
NO e 1O2. O efeito sinérgico das duas espécies reativas reduziu a viabilidade de
38
células tumorais em comparação a ação do lipossoma da ZnPC sozinho (MARANHO
et al., 2009). Considerando os promissores resultados para o sistema associado
ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO](PF6)3, estudos foram realizados afim de se
desenvolver sistemas lipossomais ultraflexiveis para utilização em tumores cutâneos
(DE LIMA et al, 2008).
Outros sistemas que envolvem a liberação de NO já na janela terapêutica,
como o complexo [Ru(NO)(NO2)pc] (DA ROCHA et al. 2008) e o sistema associado
entre complexo nitrosilo de rutênio e composto de terra rara, cis-
[Ru(dcbpy)2(Cl)(NO)] e Na4[Tb(TsPc)(acac)] (CICILLINI et al., 2008) vem sendo
estudados.
39
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho é desenvolver formulações para incorporação de
complexos metálicos do tipo ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ (Figura 7), baseadas
em géis de Pluronic® F127.
(A) (B)
Figura 7. Estruturas químicas dos complexos ZnPC (A) e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ (B).
40
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1. Caracterizar as formulações desenvolvidas por espectroscopia de absorção
na região do ultravioleta/visível e espectroscopia de emissão de fluorescência,
comparando o comportamento dos complexos metálicos em meio homogêneo e
heterogêneo.
2.2.2. Caracterizar os géis de PF-127 por espectroscopia na região do
infravermelho, comparando os géis contendo os complexos com o gel controle
(somente PF-127).
2.2.3. Investigar a cristalinidade dos géis de PF-127 por difração de Raios-X.
2.2.4. Avaliar a morfologia das formulações por microscopia eletrônica de varredura.
2.2.5. Avaliar a estabilidade das formulações, comparando os perfis espectrais dos
complexos ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, durante um período de tempo de 28
dias.
2.2.6. Avaliar a produção in situ de espécies reativas de oxigênio (1O2), produzidas
pelo complexo ZnPC, incorporados aos géis de Pluronic® F127.
2.2.7. Avaliar a produção in situ de espécies reativas de nitrogênio (NO), produzidas
pelo complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, incorporados aos géis de Pluronic® F127.
2.2.8. Determinar a carga superficial das formulações por medidas de potencial zeta.
2.2.9. Realizar análises de distribuição de tamanho das micelas das formulações na
presença e ausência dos complexos (controle).
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAIS
3.1.1. Reagentes
O copolímero PluronicÒ F127 foi cedido pela Basf (Brasil) em parceria com o
Prof. Dr. José Mario Barichello da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). A
ZnPC foi obtida da Sigma Aldrich (Brasil). O complexo metálico
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ foi sintetizado pela Profa Dra Renata Galvão de Lima,
conforme a literatura (de LIMA, 2006). O fosfato monobásico de sódio (NaH2PO4) e
fosfato dibásico de sódio (Na2HPO4) foram comprados da Anresco. Os solventes de
grau analítico foram obtidos através de suas respectivas empresas: álcool etílico 95
ºGL (cromato produtos químicos), dimetilformamida (DMF) e dimetilsulfóxido
(DMSO) através da Sigma Aldrich (Brasil).
3.2. Metodologias
3.2.1. Preparo das soluções
As soluções de tampão fosfato (pH 7,40) (PBS) foram preparadas pela
dissolução de 1, 1925 g de NaH2PO4 e de 0,8038 g de Na2HPO4 em 100mL de água
ultrapura.
As soluções estoques de [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 foram preparadas em
tampão fosfato pH 7,40, e as soluções estoque de ZnPC foram preparadas em
DMF/DMSO (1:1 v/v), sendo estas duas soluções armazenadas sob a proteção da
luz e sob resfriamento (» 5 0C). As concentrações destas soluções foram
determinadas após análise espectrofotométrica na região do UV-visível. Para este
cálculo, utilizou-se os coeficientes de absortividade molar (ε) em 670 nm: 2,04 x 105
mol L-1 cm-1, para a ZnPC (DMF/DMSO) (MARANHO et al., 2009) e em 510 nm:
4466,8 mol L-1 cm-1 para o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (solução aquosa) (DE
LIMA et al., 2006).
42
3.2.2. Preparo dos géis
Neste trabalho foram utilizadas duas metodologias para a preparação dos
géis, uma proposta por SCHMOLKA (1972), o método a frio, e uma nova
metodologia desenvolvida nesse trabalho, o método a quente. No método a frio, 2,0g
de Pluronic® F127 são dissolvidos em 8,0 mL de solução tampão fosfato pH 7,40
sob constante agitação e banho de gelo (4-8 ºC) até a sua completa dissolução.
Após a dissolução do copolímero, foi adicionada uma alíquota da solução estoque
de [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (para a concentração final do complexo no gel de 50
µmol L-1), ficando sob proteção da luz e agitação vigorosa durante 20 minutos. A
concentração final de [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 no gel foi calculada através do valor
de absortividade molar obtido (Figura 8).
Figura 8. Representação esquemática da preparação do gel contendo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 pelo método a frio.
O outro método utilizado foi à preparação a quente, no qual se dissolveu 2,0g
de PluronicÒ F127 em 2,3 mL de etanol (16% m/m), esta solução foi colocada em
banho de ultrassom até a sua dissolução completa. Após esta etapa, foi adicionada
uma alíquota da solução estoque de ZnPC à solução. Depois da sua completa
homogeneização e sob proteção da luz, esta solução contendo o polímero, etanol e
a ZnPC, foi inserida em 8,0 mL de tampão fosfato pH 7,4, que estava em um béquer
em agitação vigorosa e aquecida em banho-maria (temperatura ~ 45ºC), até que
ficasse com um caráter totalmente homogêneo. A concentração final de ZnPC no gel
foi calculada através do valor de absortividade molar obtido (Figura 9).
43
Figura 9. Representação esquemática da preparação do gel contendo ZnPC pelo método a quente.
A metodologia a quente também foi utilizada para preparar o gel no qual há
associação dos dois compostos [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC, sendo que para
essa preparação existe uma etapa a mais. Após a preparação do gel contendo a
ZnPC, este gel foi resfriado, para ficar novamente na forma líquida, e em seguida foi
adicionada uma alíquota da solução estoque de [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3, ficando sob
agitação constante, resfriamento e proteção da luz, até que ficasse totalmente
homogeneizada (Figura 10). A concentração de ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3
foram calculados com os seus respectivos coeficientes de absorção molar. Todos os
géis ficaram armazenados sob a proteção da luz à temperatura ambiente (25ºC).
Figura 10. Representação esquemática do preparo do gel contendo ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3pelo método a quente.
44
3.2.3. Medidas de Ph
As medidas de pH foram realizadas em um pHmetro digital Quims modelo Q400AS.
3.2.4. Liofilização das amostras
Os géis foram liofilizados em um liofilizador Liobras modelo L101, disponível
no Laboratório de Pescados e Cromatografia Aplicada (LAPESCA) da UFBA.
3.2.5. Espectroscopia na região do Ultravioleta/Visível
A caracterização por espectroscopia na região Ultravioleta/visível (UV/Vis)
dos géis contendo os complexos metálicos foram realizadas em um
espectrofotômetro FEMTO modelo 800 XI, no Laboratório de Pesquisa em Matéria
Médica (LAPEMM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA). Os géis foram
submetidos à varredura espectrofotométrica de 200 nm a 800 nm, utilizando uma
cubeta de quartzo de 1,000 cm de caminho óptico. A partir dos espectros de
absorção, foi possível fazer o cálculo direto das concentrações dos complexos a
partir dos seus coeficientes de absortividade molar.
3.2.6. Espectrofluorimetria
As medidas de emissão e excitação foram efetuadas no laboratório do Prof.
Roberto Santana da Silva da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo (FCFRP-USP), usando um espectrofotômetro
de fluorescência Hitachi modelo F-4500, utilizando celas de quartzo de 1,000 cm de
caminho óptico. Os espectros de emissão de fluorescência foram realizados em
meio homogênio (DMSO:DMF) e heterogênio (gel) a temperatura ambiente. Os
espectros foram registrados na faixa de 630 a 750 nm, com excitação fixa em 610
nm.
45
3.2.7. Espectroscopia na região do Infravermelho
Os espectros por refletância difusa na região do infravermelho dos géis
liofilizados foram obtidos com um espectrômetro Spectrum BX (Perkin-Elmer),
usando a técnica de pastilhas de KBr, no intervalo de 400 a 4000 cm-1, com
resolução de 1 cm-1. Estas análises foram gentilmente realizadas pelo grupo da
Profa. Dra. Heloysa Martins Carvalho Andrade do Instituto de Química da UFBA.
3.2.8. Difração de Raio-X
As análises de difração de Raio-X foram realizadas em um difratômetro
Shimadzu modelo XDR-6000, no Instituto de Geociências da Universidade Federal
da Bahia (UFBA), pelo grupo da Profa. Dra. Maria do Carmo Rangel. Os géis
liofilizados foram irradiados por uma lâmpada de Cu-Kα (λ=1.54184 A) em uma
voltagem de 40 kV, corrente de 40mA, uma taixa de varredura de 5º/min e 2θ na
faixa de 5º a 60º.
3.2.9. Análise de tamanho de partícula e potencial zeta
O tamanho das micelas nos hidrogéis (diâmetro hidrodinâmico) e potencial
zeta, foi avaliado utilizando o equipamento Zetasizer Nano system ZS da Malvern-
UK (disponível no laboratorio da Prof Dr. Maria Vitória Bentley da FCFRP-USP), o
qual possui possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no comprimento de onda
de 633 nm, permitindo realizar medidas não invasivas por “backscatter optics”
(NIBS) e possuindo a capacidade de determinar tamanho de partículas no intervalo
de 2 nm a 3 µm. As medidas foram realizadas num ângulo de detecção de 173º e a
posição da medida da cubeta foi automaticamente determinada pelo software do
equipamento. Todas as amostras foram preparadas pela diluição de 200 µL do
hidrogel em 2000 µL de água ultrapura.
46
3.2.10. Determinação amperométrica do NO liberado
A liberação fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um
sensor amperométrico amiNO-700, desenvolvido pela Innovative Intruments, Inc.
(NOmeter), disponível no laboratório do Prof. Roberto Santana da Silva na FCFRP-
USP. Este sensor é formado por um eletrodo envolto por uma membrana
semipermeável, com tempo de resposta relativamente curto, compatível com o
sistema pulsado de irradiação proposto.
3.2.11. Irradiação dos complexos
Foram realizados dois tipos diferentes de experimentos de fotólise: um com
acompanhamento da variação espectroscópica na região UV-visível e outro com
registro amperométrico in situ da liberação de NO gasoso (NOmeter).
Neste experimento utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum
Tech, no comprimento de onda de emissão em 675 nm acoplado a uma fibra óptica
operando no máxmo de 300 mW de potência, disponível no laboratório do Prof.
Roberto Santana da Silva na FCFRP-USP. A fotólise com acompanhamento in situ
da liberação de NO gasoso foi realizada pelo acoplamento do NOmeter na cubeta a
ser irradiada, como demonstrado na Figura 11.
47
Figura 11. Medida do NO liberado através do NOmeter (acima) e da fibra do laser (abaixo).
3.2.12. Estudos de estabilidade
Os estudos de estabilidade das formulações foram realizados por
comparação dos espectros obtidos por espectroscopia de absorção na região do
UV/Vis, durante um intervalo de tempo regular: 0, 7, 14, 21 e 28 dias. As
formulações permaneceram estocadas a temperatura de 25 ºC e protegidas da luz.
3.2.13. Determinação da concentração estudada
Neste experimento, quantidades crescentes de soluções estoque dos
complexos [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC foram adicionadas a 2,0 mL gel de PF-
127 que ficaram sob agitação e resfriamento até a sua completa homogeneização.
48
Em seguida, foram foi feita a análise espectrofotométrica na região do UV-visível
para cada amostra.
3.2.14. Detecção de oxigênio singlete
A geração de oxigênio singlete pode ser indiretamente detectada pela
oxidação de captadores de 1O2 que permitem, através do monitoramento do seu
consumo na solução, avaliar a produção de 1O2 (TADA et al., 2007). Um dos
substratos oxidáveis mais utilizados é o 1,3-Difenilisobenzofurano (DPBF). Quando o
DPBF está presente numa solução contendo 1O2, observa-se a sua degradação,
com a formação de produtos oxidados, como endoperóxido (Figura 12).
Figura 12. Representação da reação do DPBF com oxigênio singlete e formação de endoperóxido.
O DPBF é um composto fotossensível, que absorve radiação de comprimento
de onda igual a 417 nm, e se oxida facilmente na presença de radiação nessa faixa.
A reação pode ser monitorada pela medida do decréscimo da absorbância a 417
nm, resultado do consumo dessa espécie pelo 1O2 gerado em solução, desde que a
excitação do fotossensibilizador ocorra em região espectral que não induza a
degradação direta do DPBF. É recomendável que o acompanhamento dessas
reações não se estenda até o consumo de todo o DPBF ou qualquer outro substrato
oxidável, de modo que se possa evitar interferências nos resultados, causadas por
reações secundárias.
49
3.2.15. Microscopia eletrônica de varredura
As amostras liofilizadas foram pulverizadas com íons de ouro até formar uma
camada de 2-3 nm e daí foram observadas utilizando um JEOL JSM-6390LV SEM
(JEOL Ltda., Tóquio, Japão), disponível no Laboratório de Microscopia da FIOCRUZ
Bahia.
50
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os complexos Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC foram incorporados as
preparações do gel PF127 utilizando a metodologia a frio, porém durante o estudo
de estabilidade das preparações, verificou-se que as formulações que continham o
fotossensibilizador ZnPC tinham o perfil espectral na região do UV-visivel alterado
com o tempo. Os perfis espectrais indicavam um processo de agregação do ZnPC
no gel.
Neste caso, foi necessário alterar a metodologia de preparação do gel para a
incorporação do fotossensibilizador. Após a análise na literatura para diferentes
metodologias de incorporação de fármacos hidrofóbicos a gel PF127 propusemos a
formulação pelo método a quente, que se mostrou eficiente no processo de
incorporação da fase interna da micela.
Diante do sucesso das preparações, passou-se para as etapas de
caracterizações físicas e químicas do gel PF127 vazio e incorporados com os
complexos Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC.
4.1. ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO UV/VISÍVEL
A espectroscopia de absorção na região do UV/Vis é uma técnica analítica
que investiga as interações entre a radiação eletromagnética, na região de
comprimento de onda do UV/Vis, e a matéria (SKOOG, 2006). A absorção de
radiação ultravioleta e visível geralmente resulta da excitação de elétrons de ligação,
como consequência, os comprimentos de onda dos picos de absorção podem ser
correlacionados com os tipos de ligações nas espécies em estudo. (SKOOG et al.,
2002).
Com base nas considerações apresentadas, estudos espectroscópicos na
região do UV-visível foram realizados a fim de se analisar o comportamento dos
compostos [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 e ZnPC em meio homogêneo e heterogêneo. Os
espectros de absorção para o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (50 μmol/L) em
tampão fosfato e da ZnPC (5 μmol/L) em DMF/DMSO (1:1), são apresentados nas
Figuras 13 e 14, respectivamente.
51
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Ab
sorb
ânci
a
Comprimento de onda (nm)
Figura 13. Espectro de absorção na região do UV/Vis do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (50 μmol/L) em tampão fosfato, pH=7,4 a temperatura ambiente (» 30 0C).
O perfil espectral para o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ apresentou um
ombro na região de 330 nm, que é atribuída como sendo uma banda de
transferência de carga metal ligante (TCML) do tipo dπ(RuII)→π*(NH.NHq, NO+).
Observou-se também uma banda de TCML na região do visível (500 nm) atribuída a
à transição eletrônica dπ(RuII)→π*(tpy + NH.NHq) do tipo TCML. Este perfil do
espectro de absorção do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ está de acordo com a
literatura (DE LIMA et al., 2006).
52
400 600 800 1000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Figura 14. Espectro de absorção na região do UV/Vis da ZnPC (5 μmol/L) em
DMSO/DMF (1:1) a temperatura ambiente (» 30 0C).
O espectro de absorção da ZnPC (5 μmol/L) revelou uma intensa absorbância
na região do vermelho, com absorção máxima em 674nm. Alem disso, o perfil
espectral apresenta um grupo de bandas-Q na região de 600 a 700 nm e uma banda
de Soret na região de 350 nm, característicos para ftalocianinas (NETO, 2010). Este
espectro de absorção da ZnPC em DMF/DMSO é semelhante aos encontrados em
outros estudos (MARANHO et al., 2009; RICCI JUNIOR; MARCHETTI, 2006;
SIBATA et al., 2004).
Na Figura 15 é apresentado os perfis espectroscópicos dos compostos ZnPC,
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e da associação ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+
incorporados em gel de PF-127.
53
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Ab
sorb
ânci
a
Comprimento de onda (nm)
Figura 15. Espectro de absorção na região do UV/Vis dos complexos incorporados em géis de PF-127, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (vermelho), ZnPC (azul), e da associação entre [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 + ZnPC (preto) a temperatura ambiente (» 30 0C).
É possível observar que após a incorporação dos compostos nos géis de PF-
127, não houve qualquer alteração na posição dos comprimentos de onda de
absorção e nos perfis espectrais para as formulações contendo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 e ZnPC, em relação a estes compostos em meio
homogêneo. As bandas de absorção características para o complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 (330 e na região de 500 nm) e para a ZnPC (a banda-Q na
região de 670 nm) são conservadas. Nota-se também, que quando estes dois
compostos são associados, o perfil espectral foi idêntico aos da ZnPC e
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 em meio heterogêneo, separadamente. Isto indica que
ambos os compostos mantém seu comportamento espectroscópico quando
associados.
54
Os espectros de absorção da Figura 15 também indicam que não ocorreu a
formação de agregados por parte da ZnPC já que não foi observado deslocamento
batocrômico da banda Q. A ZnPC é uma molécula hidrofóbica e é propicia a formar
agregados em soluções aquosas (NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004), porém
observa-se que os espectros de absorção no UV-visível das formulações de ZnPC e
ZnPC juntamente com [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 são semelhantes aos espectros de
absorção da ZnPC em DMF/DMSO, com uma intensa banda-Q na região de 670nm.
Os espectros de absorção tambem são similares a de outros estudos envolvendo a
incorporação da ZnPC em sistemas de liberação, tais como, nanoemusões (VIOR et
al., 2011), micelas de longo tempo de circulação (SIBATA et al., 2004),
nanopartículas (SOARES, 2009; RICCI-JÚNIOR et al., 2006) e lipossomas
(MARANHO et al., 2009; NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004).
Esta é uma observação importante no desenvolvimento destas formulações, o
que dá um forte apoio à nossa proposta, já que nenhuma mudança espectral foi
observada nas formulações contendo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3, ZnPC e
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 juntamente com ZnPC. Estes resultados estão de acordo
aos encontrados por Maranho e colaboradores (2009), que associou esses dois
compostos em lipossomas para o estudo em Terapia Fotodinâmica.
4.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ESTUDADA
A espectroscopia de absorção na região do UV/Vis está baseada na medida
de transmitância (T) ou absorbância (A) de soluções contidas em células
transparentes tendo um caminho óptico de “b” cm (SKOOG; HOLLER; NIEMAN,
2002). A transmitância pode ser definida como a razão entre a intensidade de luz
que sai da amostra (P) para a que incide na amostra (P0), a um comprimento de
onda particular (Equação 1) (UPSTONE, 2000):
T = P/P0 (1)
e a absorbância de uma amostra é o logaritmo negativo da transmitância (Equação
2):
55
A = − log T (2).
O princípio mais importante nas análises de absorção na região do UV/Vis é a
denominada lei de Beer-Lambert ou simplesmente lei de Beer. Esta lei estabelece
que para uma determinada espécie absorvente existe uma relação linear entre a
concentração (c) e a absorbância, desde que o caminho óptico (b) seja constante; o
coeficiente de absortividade molar (ε) é uma constante de cada molécula para um
determinado comprimento de onda (Equação 3):
A = εbc (3).
Com base nas medidas quantitativas por espectroscopia na região do UV/Vis,
foram realizados estudos para avaliar o comportamento dos complexos metálicos
quando adicionados gradativamente aos géis de PF-127, como representados nas
Figuras 16 e 17.
56
0 1 2 3 4 5 6 7 80,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6A
bso
rbâ
nci
a
Concentração (µmol L-1)
Figura 16. Variação da absorbância no comprimento de onda de 670 nm em função da concentração de ZnPC em gel de PF-127 a temperatura ambiente (» 30 0C).
57
0 10 20 30 40 50 600,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30A
bso
rbâ
nci
a
Concentração (µmol L-1)
Figura 17. Variação da absorbância no comprimento de onda em 510 nm em função da concentração de [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 em gel de PF-127 a temperatura ambiente (» 30 0C).
A Figura 16 mostra que a lei de Beer é obedecida para a ZnPC na faixa de
concentração de 0,0 a 7,6 µmol L-1 . Estes dados revelam que a ZnPC está em um
estado monomérico, pois quando há agregação, um desvio na lei de Beer é
observado, acarretando em um desvio na linearidade do gráfico (NUNES et al.,
2004). Como este fotossensibilizador apresenta características hidrofóbicas (log
P=100) (VISONÀ et al., 2000), supõe-se que ele se encontra no interior das micelas
de PF-127, uma vez que este núcleo micelar funciona como um reservatório sendo
protegido do meio externo pelas cadeias de OE, o que aumenta a solubilidade e
estabilidade de fármacos lipofílicos em soluções aquosas (SEZGIN; YÜKSEL;
BAYKARA, 2006).
A Figura 17 demonstra que a lei de Beer também é obedecida para o
complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 na faixa de concentração de 14 a 60 µmol L-1.
Este comportamento para o [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 já era esperado, pois como se
trata de um composto hidrofílico (log P = -1,70) (MARQUELE-OLIVEIRA et al., 2010)
58
este não tende a se agregar nos géis de PF-127 mesmo em concentrações
superiores as estudadas neste projeto.
Considerando os dados de obtidos neste teste e os resultados encontrados
por Maranho et al. (2009), decidiu-se trabalhar com concentrações de ZnPC de 5
µmol/L e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 50 µmol/L, que é semelhante a concentração
utilizada por esses autores em sistemas lipossomais.
4.3. ESTUDOS DE ESTABILIDADE
A estabilidade de uma especialidade farmacêutica é definida como o tempo
durante o qual esta ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente, mantém
dentro dos limites especificados e durante todo o período de estocagem e uso, as
mesmas condições e características que possuía quando da época de seu
desenvolvimento. A estabilidade depende de fatores ambientais como temperatura,
umidade, luz e de outros fatores relacionados ao próprio produto como propriedades
físicas e químicas, de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma
farmacêutica e sua composição (SILVA, K. et al., 2009).
Então, foram realizados estudos de estabilidade para verificar como os
complexos metálicos, incorporados em géis de PF-127, se comportavam durante um
período de tempo pré-definido (28 dias). Os espectros na região do UV/Vis dos géis
contendo ZnPC e ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3, com o passar dos dias, são
apresentados nas Figuras 18 e 19, respectivamente.
59
300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Ab
sorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 18. Espectro de absorção na região do UV/Vis da ZnPC incorporada em gel de PF-127. Em vermelho, dia 0; azul, 7 dias; verde, 14 dias; rosa, 21 dias; e preto, 28 dias de estocagem no escuro a 25 ºC.
60
300 400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Ab
sorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 19. Espectro de absorção na região do UV/Vis da ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 incorporados em gel de PF-127. Em vermelho, dia 0; azul, 7 dias; verde, 14 dias; rosa, 21 dias; e preto, 28 dias de estocagem no escuro a 25 ºC.
Analisando as Figuras 18 e 19, pode-se perceber que não houve mudanças
significativas nos espectros de absorção na região do UV/Vis. das formulações
estudadas. Tanto na formulação que possui o complexo ZnPC quanto na formulação
que possui a adição do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3, observa-se que estes
complexos mantém o seu perfil espectral permanece constante, sem alteração do
mesmo. Logo, estas formulações são estáveis durante o tempo de 28 dias, podendo
ser utilizadas neste mesmo período.
61
4.4. ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO
A espectroscopia no infravermelho é uma técnica analítica de análise
estrutural para uma grande variedade de amostras orgânicas, inorgânicas e
biológicas, podendo ser utilizada para determinações qualitativas e quantitativas. A
condição para que ocorra a absorção da radiação infravermelha é que haja variação
do momento de dipolo elétrico da molécula como consequência de seu movimento
vibracional ou rotacional. Como a absorbância em uma frequência particular é
característica de um grupo funcional presente em um composto químico, então cada
molécula possui um espectro de absorção no infravermelho específico
(SlLVERNSTEIN, 2010).
Diante do exposto acima, foram feitos estudos espectroscópicos na região do
infravermelho (4000-400 cm-1) para avaliar o comportamento espectral dos géis de
PF-127 na ausência (vazio) e na presença dos complexos metálicos
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3, ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 + ZnPC. A Figura 20
apresenta os espectros na região do infravermelho das quatro formulações
estudadas.
62
Figura 20. Espectro por reflectância difusa na região do infravermelho para as formulações: A, gel vazio; B, ZnPC; C, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+; e D, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC.
Analisando a Figura 20, pode-se observar que as bandas obtidas na região do
infravermelho para as demais formulações foram semelhantes aos encontrados pelo
gel vazio, não havendo a ocorrência de novos picos nas formulações. As
frequências vibracionais no infravermelho encontradas para cada uma das
formulações estudadas são resumidas na Tabela 1.
63
Tabela 1. Principais picos obtidos através da espectroscopia na região do infravermelho das formulações analisadas.
As formulações apresentam uma banda em 3330 cm-1, que foi atribuído as
vibrações dos grupos hidroxila (-OH) do PF-127. As bandas na região de 948-953
cm-1 e 1112-1126 cm-1 foram devidas às vibrações de estiramento simétrica e
assimétrica dos grupos éter (C-O), respectivamente. A banda em 1243 cm-1 foi
atribuída às vibrações do tipo torção do grupo –CH2 e a banda na região de 2875-
2886 cm-1 é por causa das vibrações de estiramento do grupamento C-H do PF-127
(FAHAD; GILBERT; DICKENS, 2012; SAHU et al., 2010; ZHOU et al., 2011).
Como esperado, a manutenção dos perfis espectrais das formulações que
continham os complexos metálicos foi semelhante ao da formulação contendo
apenas o copolímero, o que indica que estes complexos foram incorporados nas
micelas poliméricas através de interação física e não por uma ocasional formação de
ligações químicas (HA et al., 2011; SAHU, et al., 2010).
Frequência
vibracional
(cm-1)
Formulações
Gel
vazio
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 ZnPC [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3
+ ZnPC
nO-H 3330 3330 3330 3330
nC-O
simétrico
948 951 952 953
nC-O
assimétrico
1112 1126 1120 1114
n-CH2 1243 1243 1243 1243
nC-H 2875 2884 2886 2882
64
4.5. ESPECTROFLUORIMETRIA
A espectroscopia de luminescência é um método analítico derivado da
emissão de radiação eletromagnética por moléculas que se tornaram
eletronicamente excitadas após a absorção da radiação visível ou ultravioleta. O
processo de luminescência é dividido em fluorescência e fosforescência. A diferença
entre as duas é baseada principalmente no intervalo de tempo em que o fenômeno
de fluorescência e fosforescência persiste após o final da excitação, sendo a
primeira muito mais rápida (cerca de 10-5 s ou menos) que a segunda (podendo
levar de segundo a horas) (MIYAWA; SCHULMAN, 2002).
Os espectros de emissão de fluorescência da ZnPC em DMF/DMSO e em gel
de PF-127 foram registrados na faixa de 620 a 800 nm (Figura 21). A emissão de
fluorescência máxima foi observada no comprimento de onda de 680 nm para ZnPC
em meio homogêneo (DMSO/DMF) e de 677 nm para ZnPC e ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ em meio heterogêneo (incorporados ao gel PF-127).
65
620 640 660 680 700 720 740 760 780 8000
50
100
150
200
250
300
350
Inte
nsid
ade
Comprimento de onda (nm)
Figura 21. Espectro de fluorescência do gel de PF-127 com ZnPC (5 mmol L-1) (verde), ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ (5 mmol L-1/50 mmol L-1) (preto) e da ZnPC em DMSO:DMF (5 mmol L-1) (vermelho) a temperatura ambiente (» 30 0C). lexcitação= 610 nm.
O espectro de emissão de fluorescência da ZnPC em DMF/DMSO,
incorporada sozinha ou em associação com o complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ em
gel de PF-127 apresentaram o mesmo perfil dos espectros obtidos por Sibata et al.
(2004), Ricci-Junior e Marchetti (2006) e Maranho (2008), que determinaram os
espectros de emissão de fluorescência da ZnPC em etanol; e por Soares (2009),
que determinou o espectro de emissão de fluorescência em acetona.
A ZnPC é uma das ftalocianinas mais hidrofóbicas e quando ela está em meio
aquoso é propensa a agregação (NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004). Ball e
colaboradores (1998) estudaram este fotossensibilizador em soluções aquosas e
observaram que os espectros de emissão de fluorescência da ZnPC, quando
agregada, é caracterizado por dois picos na região de 600 – 700 nm,
66
aproximadamente em 630 e 680 nm. Em solvente orgânico, no entanto, há um
aumento da absorção em 680 nm, o desaparecimento do pico de 630 nm e o
surgimento do pico próximo a 610 nm, que são modificações que indicam a
monomerização da ZnPC.
A similaridade do perfil dos espectros de emissão de fluorescência da ZnPC
no gel de PF-127 com o perfil dos espectros da ZnPC em DMF/DMSO é uma
indicação de que não houve agregação da ZnPC e que também não houve nenhum
tipo de reação química com o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+; logo o gel de PF-
127 pode ser considerado um sistema de liberação adequado para a ela. A ZnPC é
uma substancia hidrofóbica e quando ela é incorporada em géis de PF-127 tende a
se localizar dentro dessas micelas, o que pode justificar a diminuição da absorbância
e da intensidade da emissão de fluorescência da ZnPC e o deslocamento da
posição máxima da emissão de fluorescência para a região azul (SIBATA et al.,
2004; SOARES, 2009).
Entretanto, quando se excita o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3 em
comprimentos de onda distintos, por exemplo, 355 e 532 nm, não é observada a
emissão de fluorescência. Este comportamento do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3
já foi observado em outros estudos feitos por de Lima (2006) e Maranho (2008).
4.6. DIFRAÇÃO DE RAIO-X
A difratometria de Raio-X corresponde a uma das principais técnicas de
caracterização microestrutural de materiais cristalinos, utilizando a natureza da
partícula e as ondas dos Raios-X para obter informações acerca da estrutura dos
materiais. Quando os feixes de Raios-X interagem com um material cristalino eles
geram um padrão de difração, cada componente têm seu padrão, que representa a
sua identidade. Quanto mais cristais em um plano de uma estrutura, mais intensos,
pontiagudos e estreitos serão os picos no difratograma.
Uma das principais aplicações da difratometria de Raios-X é a identificação
de compostos cristalinos, sejam orgânicos ou inorgânicos (KAHN, 2009; KREIDEL,
2009).
67
O PF-127 puro possui características estruturais cristalinas denominadas de
esferulita. A superfície do cristal de esferulita é dividida em cristalitos lamelares e
parte amorfa.
No caso do polímero PF-127, suas estruturas podem ter seu tamanho e
unidades de formação alteradas através da alteração da estrutura química do
polímero PF-127 por ligação química com outras espécies, como polímeros ou
fármacos (KABANOV; BATRAKOVA; ALAKHOV, 2002).
Foram realizadas análises de difração de Raios-X dos géis de PF-127
liofilizados para avaliar a cristalinidade na ausência (vazio) e na presença dos
complexos metálicos [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, ZnPC e ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ (Figura 22).
68
Figura 22. Difratograma das formulações A: gel vazio; B: ZnPC; C: [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+; e D: [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC. As medias foram realizadas a 25 0C.
As análises dos difratogramas confirmam a existência de uma estrutura
cristalina para as formulações de PF-127, apresentando dois picos principais
característicos, que são atribuídos à presença dos blocos de óxido de etileno
(SAHU, et al., 2010).
Liu e colaboradores (2011) afirmam que mudanças na forma cristalina podem
ocorrer devido ao processo de liofilização, porém este fato não acontece com essa
formulação, pois os valores de 2θ estão semelhantes aos valores encontrados nos
estudos realizados por Zhou et al. (2011), Sahu et al. (2010), por Kreidel (2009),
Xiong, Tam e Gan (2005), e Kweon et al., (2003), que utilizaram o PF-127 comercial
como padrão. A Tabela 2 resume os valores de 2θ das formulações estudadas.
69
Tabela 2. Valores de 2θ para as formulações estudadas.
a: dado obtido de SAHU et al. 2010
Os valores de 2θ encontrados pela difratometria de Raio-X foi semelhante em
todas as formulações, evidenciando que mesmo com a adição dos complexos
metálicos, as características cristalinas do PF-127 não foram alteradas, nas
concentrações estudadas. A manutenção dos picos de PF-127 indica também, que
não houve qualquer interação química entre o polímero e os complexos (KUMAR et
al., 2011).
No entanto, ao analisarmos os difratogramas do gel vazio liofilizado e
hidratado (Figura 23) é possível observar a perda parcial da cristalinidade do gel
hidratado. Tal comportamento é esperado já que a interação da molécula de água é
maior com a porção de oxietileno para organização micelar. Dessa forma a parte
lamelar da esferulita é perdida originando formação amorfa.
Formulação Valores de 2θ (º)
Padrão PF-127a 19,20; 23,30
Gel vazio 18,96; 23,15
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ 19,07; 23,22
ZnPC 19,06; 23,11
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC 19,08; 23,22
70
Figura 23. Difratograma das formulações gel vazio liofilizado (vermelho) e gel vazio hidratado a 25 0C (preto).
4.7. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) é uma das técnicas comumente
empregadas para a análise de superfícies. O microscópio eletrônico de varredura é
um instrumento que opera sob alto vácuo, onde um feixe de elétrons (com energia
de até 40 keV), focalizado por lentes magnéticas e defletido por bobinas de
varredura, incide sobre a amostra, varrendo sua superfície, dando origem a elétrons
secundários, elétrons retroespalhados, Raios-X. Todos esses sinais são gerados em
cada ponto varrido do material e podem ser usados para caracterizá-lo (DEDAVID;
GOMES; MACHADO, 2007; SILVA, 2009). Então, foram feitas analises por MEV
com o objetivo de avaliar a morfologia dos géis liofilizados (Figura 24).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
200
400
600
800
1000
1200In
tens
idad
e
2q
71
Figura 24. Imagem de MEV dos géis liofilizados: A, somente PF-127; B, PF-127 com ZNPC; C, PF-127 com [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3; e D, PF-127 com ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]+3.
Através das análises de MEV é possível observar que as imagens obtidas
para o gel vazio e com ZnPC pode ser descrito como um material homogêneo,
poroso e lamelar. No entanto, ao analisarmos a morfologia do gel contendo o
complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ (Figura 24 C e D) foi possível verificar uma
diminuição da porosidade do material e das lamelas. Podemos sugerir, tendo em
vista a restrita discussão sobre a técnica de microscopia de varredura para o
polímero PF-127 incorporado com compostos metálicos, que íons metálicos como
Ru(II) possuem uma maior influência na formação do gel que íons Zn(II)
(CASTELLUCI et al., 2011).
72
4.8. DETECÇÃO DE OXIGÊNIO SINGLETE
A espécie radicalar oxigênio singlete (1O2) é responsável por maior parte dos
fotodanos em terapia fotodinâmica. Neste caso, a evidência quanto a fotoliberação
dessa espécie no gel proposto é de grande importância.
A detecção de 1O2 gerado por fotoexcitação dos géis contendo o
fotossensibiliador ZnPC foi avaliada pelo método químico indireto usando 1,3-
difenilsobenzenofurano (DPBF) como uma sonda química para o 1O2 (TADA et al.,
2007). O DPBF reage irreversivelmente com o oxigênio singlete gerado pela
fotoexcitação de um fotossensibilizador e a reação pode ser acompanhada
espectrofotometricamente através da obtenção do decaimento da intensidade de
absorção do DPBF em 417 nm (CARLONI et al., 1993).
O sistema de irradiação utilizado na fotoestimulação foi um LED com emissão
de luz em 630 nm construído pelo Prof. Dr. Iuri M. Pepe do LAPO-UFBA (Figura 25).
73
Figura 25. Imagem do LED com emissão em 630 nm.
Inicialmente, analisamos o comportamento fotofísico com o LED em uma
solução de DPBF a fim de comprovarmos que o captador não interage com a luz no
comprimento de onda de 630 nm (Figura 26 A). Foi feito também a mistura entre a
solução de ZnPC e DPBF e observou-se que não há reação química entre as
espécies (Figura 26 B).
74
400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
400 500 600 700 800
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
Ab
sorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 26. Variação do perfil do espectro de absorção na região do UV-vis. da solução de DPBF em acetonitrila (tempo irradiação: 0, 300s, 600s e 900s) (A) e a mistura da solução de ZnPC (DMSO/DMF) em presença de DPBF (B) a temperatura ambiente (» 30 0C).
Em seguida, iniciou-se o teste qualitativo para liberação de 1O2 a partir da
ZnPC em meio homogêneo (DMSO/DMF, 1:1) e meio heterogênio (gel).
O espectro de absorção na região do UV/Visível do gel contendo ZnPC em
meio homogêneo e DPBF se comportou como esperado, pois a medida que o gel é
irradiado em função do tempo, o DPBF vai sendo consumido gradualmente,
evidenciando assim que há liberação de oxigênio singlete por parte do
fotossensibilizador (Figura 27).
75
400 500 600 700 8000,0
0,5
1,0
Ab
sorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 27. Espectro de absorção na região do UV/Vis do DPBF juntamente com a ZnPC (5 µmol L-1) em meio homogêneo. Tempo de irradiação: 0s (preto), 5s (vermelho), 10s (verde), 15s (azul escuro), 20s (azul claro) e 25s (rosa). As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
O mesmo comportamento foi observado para a ZnPC incorporado ao gel PF-
127 (Figura 28).
76
400 500 600 700 8000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Abs
orb
ânci
a
Comprimento de onda (nm)
Figura 28. Espectro de absorção na região do UV/Vis do DPBF juntamente com a ZnPC (5 µmol L-1) em meio heterogêneo. Tempo de irradiação: 0s (preto), 5s (vermelho), 10s (verde), 15s (azul escuro), 20s (azul claro) e 25s (rosa). As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
Em ambos os sistemas homogêneo e heterogêneo foram possíveis verificar a
diminuição da banda em 417 nm que evidencia a reação do DBPF com o oxigênio
singlete. No entanto, é possível concluir que a saída de 1O2 é maior em meio
homogêneo que em meio heterogêneo (Figura 29), já a matriz gel altera o efeito da
luz sobre a solução havendo espalhamento de luz e a solubilidade e difusão do
oxigênio molecular também é alterada em relação ao meio homogêneo.
77
0 5 10 15 20 250,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Abs
orçã
o l
MÀ
X=
417
nm
Tempo de irradiação (s)
Figura 29. Decaimento da absorção em 417 nm com tempo de irradiação para a ZnPC em meio homogêneo (·) e meio heterogêneo (·).
4.9. ESTUDO DE DETECÇÃO DE NO
A fotólise do complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ nas formulações em gel
contendo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC foram
realizadas usando um sensor de NO, que é um modo indubitável para provar a
liberação de NO (SANTANA et al., 2010). O sinal gravado pelo sensor de NO
gasoso aumenta rapidamente quando a fotólise é iniciada e diminui quando o feixe
de luz é interrompido. O decréscimo de corrente se deve ao consumo de NO por
vários caminhos, principalmente a oxidação (DE LIMA, 2006). As figuras 30 e 31
mostram o cronoamperograma de liberação de NO a partir dos géis
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ + ZnPC, respectivamente.
78
Figura 30. Cronoamperograma para o gel contendo o complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ sob irradiação de laser em 470 nm. As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
79
Figura 31. Cronoamperograma para o gel contendo os dois complexos, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC, sob irradiação de laser em 670 nm. As medidas foram realizadas a temperatura ambiente (» 30 0C).
Como pode ser visto nas Figuras 30 e 31, a presença de corrente é uma
prova direta da liberação de NO a partir dos géis de PF-127 quando foram irradiados
como descrito anteriormente.
O mecanismo de liberação de NO a partir do gel contendo associação dos
dois complexos metálicos, [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e ZnPC +
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, são diferentes. A saída de NO pelo complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ quando irradiado em 470 nm se deve a transferência de
elétron do ligante NH.NHq e redução do RuII-NO+ (DE LIMA et al. 2006)
Já a fotoexcitação em 670 nm para o sistema ZnPC + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+
há liberação de NO, pois conforme mecanismo citado anteriormente por MARANHO
e colaboradores (2009), a ZnPC no estado excitado singlete tem potencial redox
suficiente para reduzir o RuII-NO+ e promover a liberação de NO0.
80
Ambos experimentos acima, após a liberação de NO o fotoproduto formado é
complexo [RuII(H2O)(terpy)(NH.NHq)]+2 (Figura 32). A absorção em 480 nm é
indicada pela transmissão da cor vermelha evidenciada da Figura 33, após
irradiação com laser no gel incorporado com complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+.
300 400 500 6000,0
0,5
1,0
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 32. Espectro na região do UV/Vis para o complexo [Ru(H2O)(tpy)(NH.NHq](PF6)2 em meio aquoso [complexo]=4x10-5 mol.L-1.
81
Figura 33. Gel de PF-127 contendo o complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+, após irradiação em 470 nm. Tom de rosa mais escuro é atribuído ao complexo [RuII(H2O)(tpy)(NH.NHq)]+2 e o tom de rosa mais claro ao complexo [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+.
Os resultados encontrados para esse experimento de fotólise do complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ e a posterior liberação de NO está de acordo com o trabalho
desenvolvido por SHISHIDO e colaboradores (2003), no qual foi desenvolvida uma
formulação a base géis de PF-127 e nela foi incorporada a S-nitrotrosoglutationa e a
S-nitroso-N-acetilcisteína, que são compostos que agem como reservatório de NO in
vivo e liberam-no seletivamente quando irradiados em comprimentos de onda no
valor de 545 nm. Como era esperado, após a irradiação dos géis de PF-127 houve a
NO meter
tampão
gel
82
liberação seletiva de NO para ambas as formulações, pois como os géis de PF-127
são transparentes, eles permitem a irradiação dos compostos incorporados para
propostas fototerapêuticas (SHISHIDO et al., 2003).
4.10. POTENCIAL ZETA
Potencial zeta (ζ) é uma importante característica das partículas poliméricas
que reflete o potencial de superfície das partículas (SCHAFFAZICK et al., 2003).
Para partículas pequenas em meio liquido, não existe uma técnica satisfatória para
se determinar a sua carga da superfície. A prática comum é determinar o potencial
elétrico da partícula em um local diferente da superfície, na camada difusa. Essa
localização relacionada ao movimento da partícula no líquido é chamada de
superfície de cisalhamento, e o potencial medido nesse plano é chamado de
potencial zeta (SOARES, 2009).
O potencial zeta não pode ser medido diretamente, então se usa algum tipo
de medida indireta, a partir do qual se calcula o potencial zeta. A técnica mais usada
e mais aceita é através da mobilidade eletroforética, no qual se introduz o material a
ser analisado diluído em uma cuba com dois eletrodos e aplica-se um potencial
elétrico a este. As partículas com carga elétrica líquida movimentarão em direção ao
eletrodo de carga contraria, tão mais rapidamente quanto maior for sua carga
elétrica e maior o campo elétrico aplicado (PELEGRINO, 2007).
A determinação do potencial zeta é relevante por diversos motivos, sendo
muito útil para obtenção de informações como a estabilidade da formulação e o tipo
de interação entre a substância ativa e o carreador. (BARRAT, 1999; HAAS, 2007,
SOARES, 2009).
Os valores de potencial zeta para o gel de PF-127 vazio (controle) e
incorporados com complexos metálicos estão relatados na Tabela 3.
83
Tabela 3. Valores de potencial zeta obtidos para as preparações em géis de PF-127.
Formulação Potencial Zeta (mV)
Gel vazio -16,6
[Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ -12,4
ZnPC -24,1
[Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+ + ZnPC -34,0
Os potenciais zeta para as preparações em gel PF-127 vazio e na presença
dos complexos metálicos foram analisados e as preparações apresentaram
potencial zeta negativo, o que está de acordo com os trabalhos realizado por
SEZGIN e colaboradores (2006) e BASU e BANDYPADHYAY (2010). LIU et al.
(2011), também encontraram valores negativos para outro tipo de poloxamer em
tampão fosfato, o P123.
Com os valores da Tabela 3, é possível observar que a os complexos
metálicos afetam o potencial zeta em relação ao gel controle. Na formulação que
contem o complexo [Ru(tpy)(NH.NHq)NO]3+, apresentou um aumento do valor de
potencial zeta em relação ao gel controle, isto pode ser justificado pelo fato que o
complexo nitrosilo de rutênio apresentar carga positiva em solução.
No caso das preparações que contem a ZnPC, a alteração foi mais negativa
em comparação ao gel vazio. Tendo em vista, que o composto de ZnPC é
hidrofóbico, acredita-se que sua localização na micela polimérica seja na região
interna da mesma, onde na proporção de 20% m/m os grupamentos OP do
copolímero tribloco encontram-se orientados na região interna da micela normal.
Com a incorporação da ZnPC na fase interna da micela os grupos pendentes OE
tendem a se orientar na superfície da micela tornando-a mais negativa que a
superfície do gel controle (DING; WANG; GUO, 2004).
84
4.11. ANÁLISE DO TAMANHO DE PARTÍCULA
O PF-127 é um copolímero em bloco que tem a propriedade de formar
micelas em soluções aquosas. O tamanho dessas micelas é um parâmetro
importante do ponto de vista da liberação de fármacos, pois pode afetar fortemente a
circulação no sangue e a biodisponibilidade das partículas dentro do corpo
(KABANOV; BATRAKOVA; ALAKHOV, 2002). Então, para se determinar o tamanho
médio das partículas obtidas nas diferentes formulações, foram realizadas medidas
de espalhamento dinâmico de luz (em inglês, DLS - Dynamic Light Scattering).
Utilizando-se de determinadas propriedades da luz, é possível obter
informações a respeito do tamanho médio de partículas em dispersão. O
espalhamento dinâmico da luz é uma técnica bem conhecida para se determinar a
distribuição de tamanho de partículas com diâmetros variando entre poucos
nanômetros até micrometros. Nesta técnica, um feixe de laser incide sobre uma
dispersão contendo partículas esféricas em movimento browniano, causando um
efeito semelhante ao efeito Doppler quando a luz incide nas partículas em
movimento, mudando o comprimento de onda da luz. Esta mudança está
diretamente relacionada ao tamanho das partículas, ou seja, partículas menores
causam maiores variações no comprimento de onda da luz, uma vez que possuem
maior velocidade média do que as partículas maiores. Dessa maneira, é possível
estimar a distribuição de tamanho das partículas através da descrição do seu
movimento no meio, medindo o coeficiente de difusão das partículas e usando uma
função de autocorrelação (CASTRO, 2009).
As medidas de distribuição de tamanho para as formulações (Tabela 4) foram
realizadas em diferentes temperaturas, a fim de se avaliar o comportamento do gel
termossensivel.
85
Tabela 4. Distribuição de tamanhos das formulações com gel PF-127. Tamanho
nm (%)/PDI
10 0C 15 0C 20 0C 25 0C 35 0C
Gel vazio 5,49
(91)/0,172
5,73
(93)/0,242
6,54
(79)/0,486
37,4 (54) e 6,59
(46)/0,455
24,88
(100)/0,146
Gel ZnPC 5,80
(62)/0,309
5,80
(73)/0,259
6,76
(64)/0,310
29,0 (23) e 5,29
(77)/0,658
25,63
(100)/0,183
PDI= índice de polidispersividade
Os dados de espalhamento de luz indicam que a partir de 25 0C é possível
verificar a formação de micelas, com tamanho de 37,4 nm e 29,0 nm para gel vazio
(controle) e ZnPC respectivamente. Anterior a esta temperatura foi possível observar
a presença de unímeros (com tamanho na faixa de 5,5 a 6,8 nm) e agregados de
unímeros (alta polidispersividade) (BONACUCINA et al., 2007). Os perfis
monodispersão foram obtidos somente a 35 0C, onde 100 % das espécies em
solução são micelas e trata-se de uma preparação homogênea tendo em vista a
baixa polidispersividade (Figura 34).
Figura 34. . Distribuição de partícula para a preparação do gel PF-127 com ZnPC a 35 0C.
86
5. CONCLUSÕES
O desenvolvimento das formulações à base de géis de Pluronic® F127
mostrou-se satisfatório para a incorporação de complexos metálicos do tipo ZnPC e
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+. Através de técnicas espectroscópicas como as de absorção
de radiação eletromagnética na região do UV/Vis e de emissão de fluorescência, foi
possível verificar que estes complexos se comportaram de modo semelhante a
quando estão em meio homogêneo, sem alteração de suas características
espectrais.
As análises por espectroscopia na região do infravermelho demonstraram que
os géis de PF-127, quando incorporados com os complexos, possuíam o mesmo
perfil espectral do controle (gel apenas com o PF-127), confirmando que não houve
nenhuma reação química entre o veículo e os princípios ativos, sendo
provavelmente uma interação física nesta formulação.
Os estudos de estabilidade revelaram que as formulações desenvolvidas
neste trabalho permaneceram estáveis durante 28 dias de armazenamento, sem
alteração das características dos complexos metálicos ZnPC e
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+.
As análises por difração de Raios-X mostraram que a adição dos complexos
ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ não afetam a cristalinidade das formulações
liofilizadas, sendo semelhantes a formulação controle. O processo de liofilização foi
necessário, pois foi feita uma análise da forma gel e foi verificado que nesta havia a
perda da cristalinidade da formulação. Este dado é mais um indicativo de que os
complexos não reagem quimicamente com PF-127.
Morfologicamente as formulações tinham um aspecto homogêneo, poroso e
lamelar. O íon metálico Ru(II) parece possuir maior influência sobre a morfologia do
material, pois quando ele foi adicionado houve uma diminuição da porosidade e das
lamelas.
As formulações apresentaram um potencial zeta com valor negativo. Em
relação à formulação controle, a formulação contendo o complexo
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+ teve um aumento no valor desse potencial e as formulações
contendo ZnPC apresentaram um valor mais negativo.
87
As formulações a base de géis de Pluronic® F127 foram capazes de gerar
espécies reativas de oxigênio (1O2) e espécies reativas de nitrogênio (NO), após
irradiação luminosa, a partir dos complexos ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+,
respectivamente.
Portanto, as formulações a base de géis de Pluronic® F127demonstram ser
sistemas de liberação adequados para a incorporação de complexos metálicos de
diferentes polaridades, ZnPC e [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]3+, não afetando as suas
características físico-químicas e liberando seletivamente o 1O2 e NO.
88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, M. L.; LAVASANIFAR, A.; KWON, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 92, n. 7, p. 1343-1355, 2003. AGOSTINIS, P. et al. Photodynamic Therapy of Cancer: An Update. Ca-a Cancer Journal for Clinicians, v. 61, n. 4, p. 250-281, 2011. AINSCOUGH, E. W.; BRODIE, A. M. Nitric oxide – some old and new perspectives. Journal of Chemical Education, v. 72, p. 686-692, 1995. ALLISON, R. et al. Photodynamic therapy for in-situ squamous cell cancer of the head and neck. Lasers in Surgery and Medicine, v. 44, p. 56-56, 2012. ALLARDYCE, C. S.; DYSON, P. J. Ruthenium in medicine: current clinical uses and future prospects. Platinum Metals Review, v. 45, p. 62-69, 2001. ALLEN, T. M.; CULLIS, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Sciene, v. 303, p. 1818-1822, 2004. ALLISON, R. R. et al. Photosensitizers in clinical PDT. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 1, n. 1, p. 27-42, 2004. ALMEIDA, H. et al. Pluronic F-127 and pluronic lecithin organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Science, v. 15, n. 4, p. 592-605, 2012. ARTZNER, F. et al. Interactions between poloxamers in aqueous solutions: Micellization and gelation studied by differential scanning calorimetry, small angle X-ray scattering, and rheology. Langmuir, v. 23, n. 9, p. 5085-5092, 2007. AZIZZADEH, B. et al. Nitric oxide improves cisplatin cytotoxicity in head and neck squamous cell carcinoma. Laryngoscope, v. 111, n. 11, p. 1896-1900, 2001. BADER, H.; RINGSDORF, H.; SCHMIDT, B. Water soluble polymers in medicine. Angewandte Makromolekulare Chemie, v.123/124, pag. 457-485, 1984. BAGNATO, V. S. et al. PDT experience in Brazil: A regional profile. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 2, n. 2, p. 107-118, 2005. BALL, D.J. et al. The characterization of three substituted zinc phthalocyanines of different charge for use in photodynamic therapy. A comparative study of their aggregation and photosensitizing ability in relation to mTHPC and polyhaematoporphyrin. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 45, p. 28 – 35, 1998.
89
BARBA, A. A. et al. Investigation of Pluronic (c) F127-Water Solutions Phase Transitions by DSC and Dielectric Spectroscopy. Journal of Applied Polymer Science, v. 114, n. 2, p. 688-695, 2009. BARICHELLO, J. M. et al. Absorption of insulin from Pluronic F-127 gels following subcutaneous administration in rats. International Journal of Pharmaceutics, v. 184, n. 2, p. 189-198, 1999. BASU, S.; BANDYOPADHYAY, A. K. Development and Characterization of Mucoadhesive In Situ Nasal Gel of Midazolam Prepared with Ficus carica Mucilage. Aaps Pharmscitech, v. 11, n. 3, p. 1223-1231, 2010. BECHET, D. et al. Photodynamic therapy of malignant brain tumours: A complementary approach to conventional therapies. Cancer Treatment Reviews, 2012. BENDHACK, L. M.; BONAVENTURA, D.; de LIMA, R.G.; da SILVA, R.S. Mechanisms underlying relaxation induced by a new nitric oxide donor. Faseb Journal, v. 20, p. A1126, Part 2, 2006. BONACUCINA, G. et al. Effect of hydroxypropyl beta-cyclodextrin on the self-assembling and thermogelation properties of Poloxamer 407. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 32, n. 2, p. 115-122, 2007. BONACUCINA, G. et al. Thermosensitive Self-Assembling Block Copolymers as Drug Delivery Systems. Polymers, v. 3, n. 2, p. 779-811, 2011. BONAVENTURA, D. et al. A macrocyclic nitrosyl ruthenium complex is a NO donor that induces rat aorta relaxation. Nitric Oxide-Biology and Chemistry, v. 10, n. 2, p. 83-91, 2004. BONAVENTURA, D. et al. Characterization of the mechanisms of action and nitric oxide species involved in the relaxation induced by the ruthenium complex. Nitric Oxide-Biology and Chemistry, v. 15, n. 4, p. 387-394, 2006. BONAVENTURA, D. et al. Endothelium negatively modulates the vascular relaxation induced by nitric oxide donor, due to uncoupling NO synthase. Journal of Inorganic Biochemistry, v. 103, n. 10, p. 1366-1374, 2009. BOODHWANI, M. et al. Effects of purified poloxamer 407 get on vascular occlusion and the coronary endothetium. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery, v. 29, n. 5, p. 736-741, 2006. BOUCHEMAL, K. et al. A concise analysis of the effect of temperature and propanediol-1, 2 on Pluronic F127 micellization using isothermal titration microcalorimetry. Journal of Colloid Interface Science, v. 338, n. 1, p. 169-76, 2009.
90
BOURRE, L. et al. Potential efficacy of a delta 5-aminolevulinic acid thermosetting gel formulation for use in photodynamic therapy of lesions of the gastrointestinal tract. Pharmacological Research, v. 45, n. 2, p. 159-165, 2002. BUTLER, A. R. The biological roles of nitric oxide. Chemistry & Industry, v. 26, p. 828-30, 1995. CABANA, A.; AITKADI, A.; JUHASZ, J. Study of the gelation process of polyethylene oxide(a) polypropylene oxide(b) polyethylene oxide(a) copolymer (Poloxamer 407) aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science, v. 190, n. 2, p. 307-312, 1997. CALS-GRIERSON, M. M.; ORMEROD, A. D. Nitric oxide function in the skin. Nitric oxide: Biology and Chemistry, v. 10, p. 179-93, 2004. CARLONI, P. et al. On the use of 1,3-diphenylisobenzofuran (dpbf) - reactions with carbon and oxygen-centered radicals in model and natural systems. Research on Chemical Intermediates, v. 19, n. 5, p. 395-405, 1993. CASTELLUCCI, N. et al. Formation of gels in the presence of metal ions. Amino Acids, v. 41, n. 3, p. 609-620, 2011. CASTRO, E. G. Nanopartículas de platina e seus nanocompósitos com nanotubos e outras formas de carbono: preparação, caracterização e propriedades. 2009. 181 f. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2009. CHATTERJEE, D. K.; FONG, L. S.; ZHANG, Y. Nanoparticles in photodynamic therapy: an emerging paradigm. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 60, n. 15, p. 1627-37, 2008. CHIANG, T. M. et al. Sunscreen ingredients inhibit inducible nitric oxide synthase (iNOS): a possible biochemical explanation for the sunscreen melanoma controversy. Melanoma Research, v. 15, p. 3-6, 2005. CICILLINI, S. A. et al. Photobiological effect of nitric oxide and singlet oxygen in cancer cells occasioned by light irradiation in the phototherapeutic window of a nitrosyl ruthenium conjugated to a phthalocyanine rare earth complex. Nitric Oxide: Biology and Chemistry, v. 19, p. S67, 2008. COLLET, J.; MORETON, C. Formas farmacêuticas perorais de liberação modificada. In: AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. p. 298-313. COUTO, W. F. Complexos de dendímeros e ciclodextrinas com aplicação farmacêutica: síntese e caracterização. 2010. 120 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.
91
CULOTTA, E.; KOSHLAND JUNIOR, D. E. NO news is good news. Science. v. 258, p.1862-1865, 1992. DA ROCHA, Z. N. et al. Photochemical production of nitric oxide from a nitrosyl phthalocyanine ruthenium complex by irradiation with light in the phototherapeutic window. Inorganic Chemistry Communications, v. 11, n. 7, p. 737-740, 2008. DEDAVID, B. A.; GOMES, C. I.; MACHADO, G. Microscopia eletrônica de varredura aplicada aos polímeros. In: Microscopia eletrônica de varredura: aplicações e preparação de amostras: materiais poliméricos, metálicos e semicondutores. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2007. DE LIMA, R. G. et al. Influence of ancillary ligand L in the nitric oxide photorelease by the Ru(L)(tpy)NO (3+) complex and its vasodilator activity based on visible light irradiation. Inorganica Chimica Acta, v. 359, n. 8, p. 2543-2549, 2006. DE LIMA, R. G. et al. Controlled nitric oxide photo-release from nitro ruthenium complexes: The vasodilator response produced by UV light irradiation. Inorganica Chimica Acta, v. 358, n. 9, p. 2643-2650, 2005. DE LIMA, R. G. Reatividade química e fotoquímica de complexos nitrosilos de rutênio do tipo [Ru(terpy)(L)NO]n+. 2006. 289 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006. DE LIMA, R. G. et al. Photochemical and pharmacological aspects of nitric oxide release from some nitrosyl ruthenium complexes entrapped in sol-gel and silicone matrices. Polyhedron, v. 26, n. 16, p. 4620-4624, 2007. DE LIMA, R. G. et al. Development of ultradeformable liposome entrapped with nitrosyl ruthenium complex for PDT application. Nitric Oxide: Biology and Chemistry, v. 19, p. S67, 2008. DE ROSA, F. S.; BENTLEY, M. Photodynamic therapy of skin cancers: Sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research, v. 17, n. 12, p. 1447-1455, 2000. DE SANTANA, D. C. A. S. et al. Nitric oxide photorelease from hydrogels and from skin containing a nitro-ruthenium complex. International Journal of Pharmaceutics, v. 391, n. 1-2, p. 21-28, 2010. DEMIDOVA, T. N.; HAMBLIN, M. R. Photodynamic therapy targeted to pathogens. International Journal of Immunopathology and Pharmacology, v. 17, n. 3, p. 245-54, 2004. DEROSA, M. C.; CRUTCHLEY, R. J. Photosensitized singlet oxygen and its applications. Coordination Chemistry Reviews, v. 233, p. 351-371, 2002.
92
DESAI, P. R. et al. Effect of additives on the micellization of PEO:PPO:PEO block copolymer F127 in aqueous solution. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v. 178, p. 57–69, 2001. DING, Y. et al. Aggregation properties of amphiphilic poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) block copolymer studied by cyclic voltammetry. Journal of Surfactants and Detergents, v. 7, n. 4, p. 379-385, 2004. DOLMANS, D. E.; FUKUMURA, D.; JAIN, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nature Reviews Cancer, v. 3, n. 5, p. 380-7, 2003. DOUGHERTY, T. J. Photodynamic therapy: part II. Seminar Surgery Oncology, v.11, n. 5, p. 333-40, 1995. DUMORTIER, G. et al. A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics. Pharmaceutical Research, v. 23, n. 12, p. 2709-28, 2006. ESCOBAR-CHAVEZ, J. J. et al. Applications of thermoreversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v. 9, n. 3, p. 339-358, 2006. FAHAD, M. Novel support materials for jetting based additive manufacturing processes. 2011. 179 f. Thesis (Ph. D. thesis) - Leicestershire: Loughborough University, 2011. FAHAD, M.; GILBERT, M.; DICKENS, P. Thermal gelation of Pluronic F-127 in ethylene glycol as non-aqueous solvent. Plastics Rubber and Composites, v. 41, n. 3, p. 148-156, 2012. FEITOSA, E.; WINNIK, F. M. Interaction between Pluronic F127 and Dioctadecyldimethylammonium Bromide (DODAB) Vesicles Studied by Differential Scanning Calorimetry. Langmuir, v. 26, n. 23, p. 17852-17857, 2010. FELDMAN, P. L.; GRIFFITH, O. W.; STUEHR, D. J. The surprising life of nitric oxide. C&EM. v. 20, p. 26-33, 1993. FRANCIS, M. F.; CRISTEA, M.; WINNIK, F. M. Polymeric micelles for oral drug delivery: Why and how. Pure and Applied Chemistry, v. 76, p. 1321-1335, 2004. FREITAS, M. N. et al. Thermal analysis applied in the osmotic tablets-pre-formulation studies. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, v. 87, n. 3, p. 905-911, 2007. FRIMAYANTI, N. et al. Validation of Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) Model for Photosensitizer Activity Prediction. International Journal of Molecular Sciences, v. 12, n. 12, p. 8626-8644, 2011.
93
FUSCO, S.; BORZACCHIELLO, A.; NETTI, P. A. Perspectives on: PEO-PPO-PEO triblock copolymers and their biomedical applications. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, v. 21, n. 2, p. 149-164, 2006. GARCIA VIOR, M. C. et al. A comparative study of a novel lipophilic phthalocyanine incorporated into nanoemulsion formulations: Photophysics, size, solubility and thermodynamic stability. Dyes and Pigments, v. 91, n. 2, p. 208-214, 2011. GAUCHER, G. et al. Block copolymer micelles: preparation, characterization and application in drug delivery. Journal of Controlled Release, v. 109, n. 1-3, p. 169-188, 2005. GRALLERT, S. R. M. et al. Polymeric micelles and molecular modeling applied to the development of radiopharmaceuticals. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 48, n. 1, 2012. GONG, J. et al. Polymeric micelles drug delivery system in oncology. Journal of Controlled Release, v. 159, n. 3, p. 312-323, 2012. GUO, D.-D. et al. Synergistic effects of Akt1 shRNA and paclitaxel-incorporated conjugated linoleic acid-coupled poloxamer thermosensitive hydrogel on breast cancer. Biomaterials, v. 33, n. 7, p. 2272-2281, 2012. GUPTA, T. K.; TORUNER, M.; GROSZMANN, R. J. Role of nitric oxide. Digestion, v. 59, n. 4, p. 413-415, 1998. HAAS, S. E. Avaliação da eficácia e farmacocinética de nanocápsulas poliméricas de quinina em ratos infectados com Plasmodium berghei. 2007. 127 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2007. HUANG, K. et al. Synthesis and characterization of self-assembling block copolymers containing bioadhesive end groups. Biomacromolecules, v. 3, n. 2, p. 397-406, 2002. IGNARRO, L. J. et al. Nitric oxide as a signaling molecule in the vascular system: An overview. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 34, n. 6, p. 879-886, 1999. JAIN, K. K. Drug delivery systems. Methods in molecular biology, v. 437, p. 1-50, 2008. JONES, M.; LEROUX, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 48, n. 2, p. 101-111,1999. JOSEFSEN, L. B.; BOYLE, R. W. Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers. Metal-Based Drugs, v. 2008, p. 276109, 2008.
94
KABANOV, A. V.; BATRAKOVA, E. V.; ALAKHOV, V. Y. Pluronic (R) block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery. Journal of Controlled Release, v. 82, n. 2-3, p. 189-212, 2002. KADAM, Y. et al. Micelles from PEO-PPO-PEO block copolymers as nanocontainers for solubilization of a poorly water soluble drug hydrochlorothiazide. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, v. 83, n. 1, p. 49-57, 2011. KAHN, H. Difração de raios-X. Disponível em: <http://www.angelfire.com/crazy3/qfl2308/1 multipart xF8FF 2 DIFRACAO.pdf.> Acesso em: 14 jul. 2011. KERALIYA, R. A. et al. Osmotic drug delivery system as a part modified release dosage from. International Scholarly Research Network, 2012. KHATTAK, S. F.; BHATIA, S. R.; ROBERTS, S. C. Pluronic F127 as a cell encapsulation material: utilization of membrane-stabilizing agents. Tissue Engineering, v. 11, n. 5-6, p. 974-83, 2005. KREIDEL, R. N. Desenvolvimento e caracterização de dispersões sólidas de nimodipino empregando PEG 6000 ou Poloxamer 407. 2009. 155 f. Dissertação (Mestrado em Ciencias Farmaceuticas)- Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. KRÖNCKE, K.D., FEHSEL, K., KOLB-BACHOFEN, V. Nitric oxide: Cytotoxicity versus cytoprotection - How, why, when, and where? Nitric Oxide: Biology and
Chemistry, v. 1, p. 107-120, 1997. KUMAR, P. et al. Physiochemical Characterization and Release Rate Studies of SolidDispersions of Ketoconazole with Pluronic F127 and PVP K-30. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, v. 10, n.4, p. 685-694, 2011. KONAN, Y. N.; GURNY, R.; ALLEMANN, E. State of the art in the delivery of photosensitizers for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, v. 66, n. 2, p. 89-106, 2002. KWEON, H. Y. et al. Preparation of a Novel Poloxamer Hydrogel. Journal of Applied Polymer Science, v. 88, p. 2670 2676, 2003. LI, H. et al. Syntheses and properties of octa-, tetra-, and di-hydroxy-substituted phthalocyanines. Tetrahedron, v. 65, n. 17, p. 3357-3363, 2009. LIU, P. et al. Nanosuspensions of poorly soluble drugs: Preparation and development by wet milling. International Journal of Pharmaceutics, v. 411, p. 215-222, 2011. LIU, Y. et al. Controlled delivery of recombinant hirudin based on thermo-sensitive Pluronic (R) F127 hydrogel for subcutaneous administration: In vitro and in vivo characterization. Journal of Controlled Release, v. 117, n. 3, p. 387-395, 2007.
95
LIU, Z. et al. Docetaxel-Loaded Pluronic P123 Polymeric Micelles: in Vitro and in Vivo Evaluation. International Journal of Molecular Sciences, v. 12, n. 3, p. 1684-1696, 2011. LOH, W. Bolock copolymer micelles. In: SOMASUNDARAN, P. Encyclopedia of surface and colloid science. 2nd ed. New York: Taylor & Francis, 2006. p. 802-813. MACHADO, A. E. D. H. Photodynamic therapy: principles, potential of application and perspectives. Química Nova, v. 23, n. 2, p. 237-243, 2000. MARANHIO, D. S. Estudo da associação de complexos nitrosilos de rutênio liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina ZnPC em sistemas de liberação utilizados em Terapia Fotodinâmica. 2008. 96 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Riberão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. MARANHO, D. et al. Photoinduced Nitric Oxide and Singlet Oxygen Release from ZnPC Liposome Vehicle Associated with the Nitrosyl Ruthenium Complex: Synergistic Effects in Photodynamic Therapy Application. Photochemistry and Photobiology, v. 85, n. 3, p. 705-713, 2009. MARQUELE-OLIVEIRA, F. et al. Development of nitrosyl ruthenium complex-loaded lipid carriers for topical administration: improvement in skin stability and in nitric oxide release by visible light irradiation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 53, n. 4, p. 843-851, 2010. MASKARINEC, S. A.; WU, G. H.; LEE, K. Y. C. Membrane sealing by polymers. Cell Injury: Mechanisms, Responses, and Repair, v. 1066, p. 310-320, 2005. MICHELS, B.; WATON, G.; ZANA, R. Evidence of micelle growth in aqueous solutions of the amphiphilic poly(ethylene oxide)–poly(propylene oxide)–poly(ethylene oxide) triblock copolymers from differential scanning microcalorimetry. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v. 183-185, p. 55-65, 2001. MILLER, J. D. et al. Photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc 4: the case experience with preclinical mechanistic and early clinical-translational studies. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 224, n. 3, p. 290-9, 2007. MIYAWA. J. H.; SCHULMAN, S. G. Ultraviolet–Visible Spectrophotometry. In: OHANNESIAN, L. (Ed.); STREETER, A. J. (Ed.). Handbook of Pharmaceutical Analysis. New York: Informa Healthcare, 2001. p. 201-238. MONCADA, S.; PALMER, R.M.J.; HIGGS, E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacological Reviews, v. 43, p. 109-120, 1991.
96
MOORE, T. et al. Experimental investigation and mathematical modeling of Pluronic (R) F127 gel dissolution: drug release in stirred systems. Journal of Controlled Release, v. 67, n. 2-3, p. 191-202, 2000. MUIJSERS, R. B. et al. L-Arginine is not the limiting factor for nitric oxide synthesis by human alveolar macrophages in vitro. European Respiratory Journal, v. 18, n. 4, p. 667-71, 2001. NAPOLI, C.; IGNARRO, L. J. Nitric oxide-releasing drugs. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 43, p. 97-123, 2003. NAM SUNG, H. et al. Dissolution-Enhancing Mechanism of Alkalizers in Poloxamer-Based Solid Dispersions and Physical Mixtures Containing Poorly Water-Soluble Valsartan. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, v. 59, n. 7, p. 844-850, 2011. NAWALANY, K. et al. Novel nanostructural photosensitizers for photodynamic therapy: In vitro studies. International Journal of Pharmaceutics, v. 430, n. 1-2, p. 129-140, 2012. NUNES, S.; SGUILLA, F.; TEDESCO, A. Photophysical studies of zinc phthalocyanine and chloroaluminum phthalocyanine incorporated into liposomes in the presence of additives. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 37, n. 2, p. 273-284, 2004 OERLEMANS, C. et al. Polymeric Micelles in Anticancer Therapy: Targeting, Imaging and Triggered Release. Pharmaceutical Research, v. 27, n. 12, p. 2569-2589, 2010. OH, K. T.; BRONICH, T. K.; KABANOV, A. V. Micellar formulations for drug delivery based on mixtures of hydrophobic and hydrophilic Pluronic® block copolymers. Journal of Controlled Release, v. 94, p. 411-422, 2004. OLIVEIRA, F. D. et al. Nitrosyl ruthenium complex as nitric oxide delivery agent: synthesis, characterization and photochemical properties. Inorganic Chemistry Communications, v. 7, p. 160-164, 2004. OLIVEIRA, D. M. et al. Studies of zinc phthalocyanine/magnetic fluid complex as a bifunctional agent for cancer treatment. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, v. 289, p. 476-479, 2005. ORMOND, A. B.; FREEMAN, H. S. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials, v. 6, n. 3, p. 817-840, 2013. PAOLINO et al. Drug deivery systems. In: WEBSTER, J. G. Encyclopedia of medical devices and instrumentation. 2. ed. John Wiley & Sons, p. 437-495, 2006.
97
PANDIT, N. K.; WANG, D. Salt effects on the diffusion and release rate of propranolol from poloxamer 407 gels. International Journal of Pharmaceutics, v. 167, n. 1-2, p. 183-189, 1998. PASZKO, E. et al. Nanodrug applications in photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 8, n. 1, p. 14-29, 2011. PELEGRINO, A. C. Estudos fotosísicos, fotoquímicos e fotobiológicos de porfirinas e ftalocianinas derivadas de éter de coroa. 2007. 205 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007. PERUSSI, J. R. Inativação fotodinâmica de microrganismos. Química Nova, v. 30, n. 4, p. 988-994, 2007. POGBRENIAK, H. W. et al. Targeted phototherapy with sensitizer-monoclonal antibody conjugate and light. Surgical Oncology-Oxford, v. 2, n. 1, p. 31-42, 1994. RICCI-JUNIOR, E.; MARCHETTI, J. M. Zinc(II) phthalocyanine loaded PLGA nanoparticles for photodynamic therapy use. International Journal of Pharmaceutics, v. 310, p. 187-195, 2006. ROBERTSON, C. A.; EVANS, D. H.; ABRAHARNSE, H. Photodynamic therapy (PDT): A short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, v. 96, n. 1, p. 1-8, 2009. RODRIGUES, G. J. et al. Vitamin C improves the effect of a new nitric oxide donor on the vascular smooth muscle from renal hypertensive rats. Nitric Oxide-Biology and Chemistry, v. 18, n. 3, p. 176-183, 2008. RODRIGUES, G. J. et al. Caveolae dysfunction contributes to impaired relaxation induced by nitric oxide donor in aorta from renal hypertensive rats. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 323, n. 3, p. 831-837, 2007. ROWE, R.; SHESKEY, P.; OWEN, S. Pharmaceutical Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th edn., Pharmaceutical, London UK and American Pharmaceutical Association, Washington, USA, 2005. ROY, B.; DHARDEMARE, A. D.; FONTECAVE, M. New thionitrites - synthesis, stability, and nitric-oxide generation. Journal of Organic Chemistry, v. 59, n. 23, p. 7019-7026, 1994. RUEL-GARIEPY, E.; LEROUX, J. C. In situ-forming hydrogels - review of temperature-sensitive systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 58, n. 2, p. 409-426, 2004.
98
SAHU, A. et al. Encapsulation of curcumin in pluronic copolymer micelles for drug delivery applications. Journal of Biomaterials Applications, v. 00, 2010. SAUAIA, M. G.; da SILVA, R. S. The reactivity of nitrosyl ruthenium complexes containing polypyridyl ligands. Transition Metal Chemistry, v. 28, p. 254-9, 2003a.
SAUAIA, M. G.; de LIMA, R. G.; TEDESCO, A. C.; da SILVA, R. S. Photoinduced NO release by visible light irradiation from pyrazine-bridged nitrosyl ruthenium complexes. Journal of the American Chemical Society, v. 125, p. 14718-9, 2003b.
SAUAIA, M. G. et al. Nitric oxide production from visible light irradiation on aqueous solution of nitrosyl ruthenium complexes. Inorganic Chemistry, v. 44, n. 26, p. 9946-51, 2005a. SAUAIA, M. G. et al. Syntheses, characterization and photochemical properties of new NO center dot-ruthenium(II) complexes. Inorganic Chemistry Communications, v. 4, n. 8, p. 347-349, 2005b. SCHAFFAZICK, S. R. et al. Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para administração de fármacos. Química Nova, v. 26, n. 5, p. 726-737, 2003. SCHMOLKA, I. R. ARTIFICIAL SKIN .1. PREPARATION AND PROPERTIES OF PLURONIC F-127 GELS FOR TREATMENT OF BURNS. Journal of Biomedical Materials Research, v. 6, n. 6, 1972. SEKKAT, N. et al. Like a Bolt from the Blue: Phthalocyanines in Biomedical Optics. Molecules, v. 17, n. 1, p. 98-144, 2012. SEZGIN, Z.; YÜKSEL, N.; BAYKARA, T. Preparation and characterization of polymeric micelles for solubilization of poorly soluble anticancer drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 64, p. 261–268, 2006. SHARMAN, W. M.; ALLEN, C. M.; VAN LIER, J. E. Photodynamic therapeutics: basic principles and clinical applications. Drug Discovery Today, v. 4, n. 11, p. 507-517,1999. SHARMA, P. K.; BHATIA, S. R. Effect of anti-inflammatories on Pluronic (R) F127: micellar assembly, gelation and partitioning. International Journal of Pharmaceutics, v. 278, n. 2, p. 361-377, 2004. SHATALOVA, O. V. et al. Structure of pluronic F-127 and its tetraphenylporphyrin complexes: X-ray diffraction study. Polymer Science Series A, v. 50, n. 4, p. 417-421, 2008. SHIN, S. C.; KIM, J. Y. Enhanced permeation of triamcinolone acetonide through the buccal mucosa. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 50, n. 2, p. 217-220, 2000.
99
SHISHIDO, S. M. et al. Thermal and photochemical nitric oxide release from S-nitrosothiols incorporated in Pluronic F127 gel: potential uses from local and controlled nitric oxide. Biomaterials, v. 24, p. 3543-3553, 2003. SIBATA, C. H. et al. Photodynamic therapy: a new concept in medical treatment. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 33, n. 8, p. 869-880, 2000. SIBATA, M. N.; TEDESCO, A. C.; MARCHETTI, J.M. Photophysicals and photochemicals studies of zinc(II) phthalocyanine in long time circulation micelles for Photodynamic Therapy use. European Journal of Pharmaceutical Sciences. v. 23, p. 131–138, 2004. SILVA, É. R. Estudo da cinética e dos mecanismos de fototransformação do corante Acridina Laranja na sua interação com sistemas micro-organizados sob ação da luz visível. 2010. 115 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010. SILVA, K. et al. Modelos de avaliação da estabilidade de fármacos e medicamentos para a indústria farmacêutica. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 30, n. 2, p. 129-135, 2009. SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X.; KIEMLE, D. J. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. Rio de Janeiro: LTC, 2007, 7. ed. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de análise instrumental. Porto Alegre: Bookman, 2002, 7. ed. SKOOG, D. A. et al. Fundamentos de química analítica. São Paulo: Thomson Learning, 2006, 8. ed. SOARES, M. V. Desenvolvimento e Avaliacao de Nanoparticulas de Poli-ε-caprolactona contendo Zinco(II)ftalocianina para Uso na Terapia Fotodinâmica do Câncer. 2009. 142 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009. STAMLER, J. S.; SINGEL, D. J.; LOSCALZO, J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms. Science. v. 258, p. 1898-902, 1992. STOCHEL, G. et al. Light and metal complexes in Medicine. Coordination Chemistry Reviews, v. 171, p. 203-220, 1998. SZCZEPURA, L. F.; TAKEUCHI, K. J. Synthesis and characterization of novel (cyclopentadienyl)nitroruthenium complexes. Inorganic Chemistry, v. 29, p. 1772-1777, 1990.
100
SWARBRICK, J. Encyclopedia of pharmaceutical technology. Informa healthcare, v. 1, 1082-1103, 2007. TADA, D. B. et al. Methylene blue-containing silica-coated magnetic particles: A potential magnetic carrier for photodynamic therapy. Langmuir, v. 23, n. 15, p. 8194-8199, 2007. TAU, P. et al. Influence of cyclodextrins on the fluorescence, photostability and singlet oxygen quantum yields of zinc phthalocyanine and naphthalocyanine complexes. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines, v. 7, n. 6, p. 439-446, 2003. TIMOSHENKO, A. V. et al. Immunotherapy of C3H/HeJ mammary adenocarcinoma with interleukin-2, mistletoe lectin or their combination: effects on tumour growth, capillary leakage and nitric oxide (NO) production. European Journal of Cancer, v. 37, n. 15, p. 1910-1920, 2001. TIWARI, G. et al. Drug delivery systems: An updated review. International Journal of Pharmaceutical Investigation, v. 2, n. 1, p. 2-11, 2012. TOGNIOLO, V.; SILVA, R. S.; TEDESCO, A. C. Photo-induced nitric oxide release from chlorobis(2,2 '-bipyridine)nitrosylruthenium(II) in aqueous solution. Inorganica Chimica Acta, v. 316, p. 7-12, 2001. TOMAZINI, M. V. et al. Topical photodynamic therapy with zinc phthalocyanine: evaluation of fluorescence intensity, skin absorption, skin histological and immunohistochemical changes in animal model. Anais Brasileiros de Dermatologia, v. 82, n. 6, p. 535-541, 2007. TRIESSCHEIJN, M. et al. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist, v. 11, n. 9, p. 1034-1044, 2006. UPSTONE, S. L. Ultraviolet/Visible Light Absorption Spectrophotometry in Clinical Chemistry. In: MEYERS, R. A. (Ed.). Encyclopedia of analytical chemistry: applications, theory, and instrumentation. New Jersey: John Wiley & Sons, 2000, p. 1757-1771. VILLANOVA, J. C. O.; ORÉFICE, R. L.; CUNHA, A. S. Aplicação farmacêutica de polímeros. Polímeros: Ciencia e Tecnologia, v. 20, n. 1, p. 51-64, 2010. VISONA, A. et al. Local photodynamic therapy with Zn(II)-phthalocyanine in an experimental model of intimal hyperplasia. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, v. 57, n. 2-3, p. 94-101, 2000. VYAS, V. et al. Physicochemical characterization of solid dispersion systems of tadalafil with poloxamer 407. Acta Pharmaceutica, v. 59, n. 4, p. 453-461, 2009.
101
WEISS, A. et al. Angiogenesis inhibition for the improvement of photodynamic therapy: the revival of a promising idea. Biochim Biophys Acta, v. 1826, n. 1, p. 53-70, 2012. WELLER, R. Nitric Oxide: a key mediator in cutaneous physiology. Clinical and Experimental Dermatology, v. 28, p. 511-514, 2003. WINK, D. A. et al. Nitric-oxide protects against cellular-damage and cytotoxicity from reactive oxygen species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 90, n. 21, p. 9813-9817, 1993. WINK, D. A. et al. Direct and indirect effects of nitric oxide in chemical reactions relevant to biology. In: PACKER, L. (ed.) Nitric Oxide. Part A: sources and detection of NO; NO synthase. Methods in Enzimology. Califórnia, Academic Press, v. 268, Cap. 3, p. 12-31, 1996. WORKS, C. F. et al. Photochemical nitric oxide precursors: Synthesis, photochemistry, and ligand substitution kinetics of ruthenium salen nitrosyl and ruthenium salophen nitrosyl complexes. Inorganic Chemistry, v. 41, n. 14, p. 3728-3739, 2002. XIONG, X. Y.; TAM, K. C.; GAN, L. H. Release kinetics of hydrophobic and hydrophilic model drugs from pluronic F127/poly(lactic acid) nanoparticles. Journal of Controlled Release, v. 103, p. 73-82, 2005. XU, P. et al. Receptor-Targeting Phthalocyanine Photosensitizer for Improving Antitumor Photocytotoxicity. Plos One, v. 7, n. 5, 2012. YOKOYAMA, M. Clinical Applications of Polymeric Micelle Carrier Systems in Chemotherapy and Image Diagnosis of Solid Tumors. Journal of Experimental and Clinical Medicine, v. 3, n. 4, p. 151-158, 2011. YONCHEVA, K. et al. Stabilized micelles as delivery vehicles for paclitaxel. International Journal of Pharmaceutics, v. 436, n. 1-2, p. 258-264, 2012. ZEITOUNI, N. C.; OSEROFF, A. R.; SHIEH, S. Photodynamic therapy for nonmelanoma skin cancers. Current review and update. Molecular Immunology, v. 39, n. 17-18, p. 1133-6, 2003. ZHANG, Y.; LAM, Y. M. Poly(ethylene oxide)-b-poly(propylene oxide)-b-poly(ethylene oxide)-g-poly(vinyl pyrrolidone): Synthesis and characterization. Journal of Colloid and Interface Science, v. 285, n. 1, p. 80-85, 2005. ZHAO, W. et al. Fabrication of antifouling polyethersulfone ultrafiltration membranes using Pluronic F127 as both surface modifier and pore-forming agent. Journal of Membrane Science, v. 318, n. 1-2, p. 405-412, 2008.
102
ZHOU, Q. et al. Preparation and characterization of thermosensitive pluronic F127-b-poly(ε-caprolactone) mixed micelles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 86, p.45-57, 2011.
103