UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE GEOCIÊNCIAS ... · Você sabe que isso pode acontecer, Mas não desvalorize cada passo dado... Erga os olhos em direção ao destino final

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE GEOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GEOLOGIA

DANUSIA FERREIRA LIMA

AVALIAÇÃO DE PROCESSOS GEOQUÍMICOS E DA EFICIÊNCIA DE CONSÓRCIOS FÚNGICOS EM TESTES DE SIMULAÇÃO DA BIORREMEDIAÇÃO EM SEDIMENTOS DE

MANGUEZAL CONTAMINADOS COM ÓLEO

Salvador 2014

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DANUSIA FERREIRA LIMA

AVALIAÇÃO DE PROCESSOS GEOQUÍMICOS E DA

EFICIÊNCIA DE CONSÓRCIOS FÚNGICOS EM TESTES DE SIMULAÇÃO DA BIORREMEDIAÇÃO EM SEDIMENTOS DE

MANGUEZAL CONTAMINADOS COM ÓLEO

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação, da Universidade Federal da Bahia, do Curso de Pós-Graduação em Geologia, área de concentração em Geologia Ambiental, Hidrogeologia e Recursos Hídricos, submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências – Geologia.

Orientadores: Profa. Dra. Olívia Maria Cordeiro de Oliveira Prof. Dr. Manoel Jerônimo Moreira Cruz Co-orientadora: Profa. Dra. Regina Maria Geris dos Santos

Salvador 2014

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L732 Lima, Danusia Ferreira

Avaliação de processos geoquímicos e da eficiência de consórcios fúngicos em

testes de simulação da biorremediação em sedimentos de manguezal contaminados

com óleo / Danusia Ferreira Lima.- Salvador, 2014.

229 f. : il.

Orientadora: Profa. Dra. Olívia Maria Cordeiro de Oliveira.

Tese (Doutorado em Geologia) - Programa de Pós-Graduação em Geologia,

Universidade Federal da Bahia, Instituto de Geociências, 2014.

1. Geoquímica ambiental – Recôncavo (BA). 2. Geoquímica ambiental – Rio de

Janeiro. 3. Bacias sedimentares. 4. Manguezais. 5. Hidrocarbonetos. 6.

Biorremediação. I. Oliveira, Olívia Maria Cordeiro de. II. Universidade Federal da

Bahia. Instituto de Geociências. III. Título.

CDU: 550.4:504(81)

_____________________________________________________________________

Elaborada pela Biblioteca do Instituto de Geociências da UFBA.

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“Dedico esse trabalho a Deus: Senhor, obrigada porque sei que sempre estás

presente em minha vida. Agradeço-te por ter me dado à vida e por guiar os meus

passos, tanto nos momentos mais difíceis, como nas alegrias e conquistas. Dedico

esse trabalho à minha família, por serem as pessoas mais importantes para mim e os

que me ensinaram os valores da vida, honestidade, humildade e do amor. Obrigada

por serem exemplos de perfeição e dedicação”.

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AGRADECIMENTOS

Em primeiro quero agradecer a Deus pela minha existência, pela realização deste trabalho, pela família maravilhosa que tenho, pelos amigos verdadeiros e por

ter me iluminado nas horas mais difíceis. A tua benção, Senhor!

Ao Prof. Dr. Manoel Jerônimo Moreira Cruz, pela orientação, confiança, incentivo e oportunidade de aprendizado na área de geologia e principalmente pela

amizade e por acreditar na minha capacidade profissional. Você é a base deste meu sucesso! Muito Obrigado!

A Profa Dra.Olívia Maria Cordeiro de Oliveira pela orientação, paciência, incentivo,

oportunidade para realização deste trabalho e pelo aprendizado na temática de remediação de áreas impactadas por atividades petrolíferas. Mas acima de tudo por ter confiado em mim, pela amizade, compreensão, e por sempre estar presente em

todos os momentos de diálogo. Você é muito especial! Obrigada!

A profa Regina Geris pelo apoio técnico científico na área de microbiologia. Obrigada por ter me recebido, por ter confiado na minha capacidade e por sempre estar disponível para transmitir seus conhecimentos. A senhora foi o “anjo bom” que

cruzou o meu caminho, sendo de extrema importância para o desenvolvimento deste trabalho. Muito obrigada!

Ao Prof. Dr. Jorge Alberto Trigüis, pesquisador renomado com grande sapiência na

área de Geoquímica orgânica, pela disponibilidade sempre em transmitir seus conhecimentos. O grande mentor deste projeto. Confiou e acreditou na minha

competência. O senhor foi muito importante para o alcance desta vitória. Meus sinceros agradecimentos!

Ao curso e professores da Pós-Graduação em Geologia do Instituto de Geociências

(UFBA) pela oportunidade e pelos conhecimentos transmitidos.

A todos os colegas de pós-graduação pela amizade, companheirismo e alegrias

compartilhadas... a Antônio Bomfim, Rodrigo e Manuel... um grande Abraço! E obrigada pela grande amizade.

Ao CNPq pelo apoio através da concessão da Bolsa de Doutorado.

À FINEP, pelo apoio financeiro através convênio FINEP no 01.05.0016.00 e

Referência FAPEX no 040318 associado ao Convênio PETROBRAS no 4600204631 – 0050.0020078.06.4 e Referência FAPEX no 060061, intitulado “Rede Cooperativa

em Recuperação de Áreas Contaminadas (RECUPETRO) Pesquisas e Desenvolvimento Tecnológico nos Laboratórios Integrados de Petróleo da Região

Nordeste RECUPETRO 5”, que permitiu a realização deste trabalho. Muito obrigada por tudo!

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A toda equipe do Núcleo de Estudos Ambientais – NEA, em especial ao Prof. Dr. Antônio Fernando Souza pela confiança e apoio recebido desde as primeiras

etapas desta jornada... a Cícero Gonçalves da Silva, Izabel Biasi, Adriana, Lismar e Alexsandro Rocha, que se mostraram presente em todos os momentos

administrativos de realização deste trabalho.

Aos meus queridos bolsistas e filhos científicos Roberto Gomes, Eduardo Carrilho, Natali Santos, Narayana, Jessyca Beatriz, Taise, Lucas, Naijane

(sorridente), Cibele, Thiara (dedicada), Isana (menina de ouro), Luana (amiga inseparável) pela amizade, companheirismo, pelo aprendizado que tivemos juntos e

por todo o apoio nos trabalhos de campo e laboratório... Sem vocês seria difícil a execução deste trabalho. Obrigada!!!

Ao Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) do Instituto de Geociências

(IGEO/UFBA) pela realização das análises químicas e geoquímicas... À coordenadora do LEPETRO, Dra. Karina Garcia que sempre se mostrou disponível

em ajudar... ao Técnico em química Jorge Palma que com sua boa vontade, amizade me proporcionou momentos de aprendizado, Rui Garcia, Isabel, e em

especial a Química Dra. Sarah Adriana, amiga que se disponibilizou a me ajudar em todos os momentos e a técnica Gisele Moraes dedicada e amiga tão especial. É de coração que agradeço, serei eternamente grata por tudo que fizeram por mim e para

realização deste trabalho.

Aos colegas Ketlyn Fioravanti, Verônica, Daiane, Ícaro Moreira, Carine, Daniele Magalhães e seus alunos de iniciação Científica... que se disponibilizaram em me

ajudar durante o desenvolvimento deste trabalho. Muito Obrigada!

Aos técnicos em informática Joaquim e Eduardo pela ajuda em momentos de sufoco e riscos de perder o banco de dados! Muito Obrigada!

A Daniela Assunção pela ajuda nos tratamentos dos dados e a Renan pelos

esclarecimentos na interpretação dos dados estatísticos. Ao amigo Marcos Melo pelo momentos compartilhados. Muito obrigada!

As amigas que conquistei... em especial a Luana amiga fiel que me

acompanhou em todos os momentos com sua garra e boa vontade, a Sarah amiga em todos os momentos e sentidos...a Claudia pelo incentivo e disponibilidade em

transmitir seus conhecimentos. Vocês são muito especiais para mim.

A Nilton, secretário da pós- graduação em Geologia, amigo que sempre buscou resolver de forma sensata as minhas solicitações... É de coração que te

agradeço!

Aos motoristas e servidores do Instituto de Geociências. Em especial a Jairo que acompanhou e ajudou em muitas fases deste trabalho, com seu carisma e

simplicidade. Ao conhecido “Boçal” que nunca se negou a ajudar no desenvolvimento desse trabalho. Muito Obrigada!

Ao Laboratório de LBQM na pessoa da Profa. Dra. Regina Geris, que me recebeu e teve toda disponibilidade em me treinar e me ajudar em todas as etapas do trabalho

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microbiológico...aos alunos de mestrado Hênia, Ailton e Adriana que sempre estiveram dispostos a me ajudar. As profa. Lurdinha e Isley pelo momento de

aprendizado que me propocionaram. Obrigada!

Ao Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) na pessoa da profa. Lilia e mestre Deloar pelas análises de

toxicologia.

À Petrobras UN-BA, na pessoa de Isabela Pereira Moreira Santos por disponibilizar os seguranças para acompanhamento das coletas em campo.

Às minhas amigas Jamile Batista, Sulamita Telles, pela amizade, compreensão, apoio, incentivos fundamentais para realização deste trabalho. Pela disposição em

me ajudar, escutar... meu Muito Obrigado! À minha irmã, Denize Lima, pelo apoio incondicional, pela ajuda, por me acudir nas

horas difíceis, pelo carinho e dedicação. A meu sobrinho e afilhado Arthur, a sua chegada trouxe mais sentido a minha vida! Muito Obrigada!

À Césio Eloy, pela compreensão, apoio, dedicação, incentivo, ânimo, força e

conselhos... Muito Obrigada! Aos meus pais, Domingos Lima e Dasdores Oliveira, meus ombros gigantes... pelo grande amor, carinho, afeto e dedicação plena, pelas constantes palavras de força, pela presença mesmo que a distância... com esforço incansável, pelas noites sem

dormir, pelos domingos sem descanso que com certeza conseguiram construir com muito amor e carinho um lar de paz e amor, uma família maravilhosa. Pelas

alegrias compartilhadas, pelos problemas vencidos... Vocês foram o alicerce desta minha vitória e que sem essa força jamais seria possível chegar até aqui!!!!

E a todos que de certa forma contribuíram para a concretização deste momento.

Os meus sinceros agradecimentos a todos!

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“É difícil alguém não lutar pelo próprio sonho Mas é inevitável que alguém lhe diga: Não vai dar certo!!

Você sabe que isso pode acontecer, Mas não desvalorize cada passo dado...

Fortaleça sua fé e continue tentando Erga os olhos em direção ao destino final..

e siga em frente. Sempre vai haver um novo obstáculo

E cada vez mais você terá orgulho de superá-lo Não importa o quão demore a chegada ao topo.

A vista de lá estará lhe esperando. esse é o momento em que você deve se lembrar...

Que dias de chuva ainda virão Mas você pode continuar.

A guerra não acaba: A batalha sempre permanece e você deve aprender a perder.

Para ganhar com nobreza no final

Julia Venite

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LIMA, Danusia Ferreira. Avaliação de processos geoquímicos e da eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em sedimentos de manguezal contaminados com óleo. Tese (doutorado) – Instituto de Geociências, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2014.

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo avaliar os processos geoquímicos e a eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em sedimento de manguezal contaminados por dois tipos de óleos (óleo da bacia do Recôncavo e óleo da bacia de Campos). Para isto foram montados três experimentos. O experimento 1 consistiu na avaliação geoquímica das frações (saturados, aromáticos e NSO) do óleo da bacia do Recôncavo em sedimentos e na investigação de fungos específicos, degradadores de cada fração para obtenção de consórcios. O experimento 2 consistiu na avaliação dos processos geoquímicos e da eficiência dos consórcios fúngicos na degradação de dois tipos de óleos (bacia do Recôncavo e bacia de Campos) em sedimentos de manguezal em condições laboratoriais. E o experimento 3 consistiu na avaliação dos processos geoquímicos e na eficiência dos consórcios fúngicos na degradação do óleo da Bacia do Recôncavo em sedimentos de manguezal confinados em protótipos de biorreatores. No experimento 1 o monitoramento geoquímico mostrou que ao longo de 30 dias houve degradação dos n-alcanos (saturados). No entanto, não foi observada degradação nas demais frações do óleo da bacia do Recôncavo. Os parâmetros físico-químicos e químicos foram favoráveis, não sendo parâmetros impeditivos para o processo de biodegradação e foram isolados 72 fungos, sendo que a menor quantidade de isolados foi obtida da unidade de simulação contaminada com fração de saturados. Os fungos isolados foram selecionados, utilizando o indicador redox 2,6 diclorofenol-indofenol (DCPIP), com base no acompanhamento do crescimento radial e através do teste de antagonismo. O consórcio 1 (com potencialidade para degradar o óleo da bacia do Recôncavo) foi composto por 30 isolados e o consórcio 2 (com potencialidade para degradar o óleo da bacia de Campos) por 28 isolados. Os consórcios foram imobilizados com polímeros a base de fibra de coco e folha de manguezal em pó. A aplicação dos consórcios imobilizados com potencialidade em degradar os dois tipos de óleo estudados (experimento 2) em condições laboratoriais apresentou resultados promissores para o entendimento do processo de biorremediação em sedimentos de manguezal. Em relação ao processo de bioestimulação utilizando a fibra de coco e folha de manguezal em pó imobilizada, não foi possível observar uma diferença significativa na eficiência em relação à liberação de nutrientes. Em contrapartida, pode ser observado que de alguma forma foram mantidos os teores de nutrientes adequados ao longo de 90 dias de experimento, o que não ocorreria se não tivesse sido adicionado nenhum tipo de aditivo nutricional. Já em relação ao bioaumento foi possível observar aceleração na biodegradação em relação ao controle com atenuação natural. A partir da visualização dos cromatogramas foi possível observar que o óleo da bacia do Recôncavo sofreu uma modificação no perfil ao longo dos 90 dias, houve redução dos n-alcanos mais leves com aumento da linha de base, mostrando que também ocorreu degradação das frações mais pesadas. Os cromatogramas que mostram a

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modificação do perfil do óleo da bacia de Campos levam a conclusão que os fungos contidos no consórcio têm habilidade em reduzir os hidrocarbonetos saturados (n-alcanos), mas parecem ter maior habilidade em degradar os compostos aromáticos e NSO. Os resultados obtidos para o experimento 3, utilizando um protótipo de biorreator foram melhores quando comparados ao experimento 2. A redução de n-alcanos do óleo da bacia do Recôncavo foi bem mais expressiva. Os resultados no geral apontam que os consórcios são promissores para o processo de biorremediação. Entretanto seria necessário uma maior atenção na interação entre os fungos (sinergismo). Palavras- chave: consórcio fúngico, bacia do Recôncavo, bacia de Campos, biorremediação,

hidrocarbonetos totais do petróleo.

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LIMA, Danusia Ferreira. Evaluation of geochemical processes and efficiency of fungal consortia simulation of bioremediation in mangrove sediments contaminated with oil tests. Thesis ( Ph.D. ) - Institute of Geosciences, Federal University of Bahia, Salvador, 2014.

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the geochemical processes and efficiency of fungal consortia simulation of bioremediation in mangrove sediment contaminated by two types of oils (the Reconcavo Basin and oil in the Campos Basin) tests. For this experiments were assembled. Experiment 1 consisted of the evaluation of geochemical fractions (saturates, aromatics and NSO) in the Reconcavo Basin oil in sediments and in the investigation of specific fungi, decomposers of each fraction to obtain consortia. Experiment 2 consisted of the evaluation of geochemical processes and efficiency of these fungal consortia in degradation of both types of oils (and Reconcavo Basin Campos Basin) in mangrove sediments under laboratory conditions. And the third experiment consisted in the evaluation of geochemical processes and efficiency of fungal consortia in degradation of oil in the Reconcavo Basin sediments of mangrove confined in prototype bioreactors. In experiment 1 geochemical monitoring showed that over 30 days there was degradation of n- alkanes (saturated), however no degradation was observed in the other fractions of the oil from the Reconcavo basin. The physico- chemical and chemical parameters were favorable, being not impede parameters for the process of biodegradation and 72 were isolated, of which the smaller quantity of isolated unit was obtained from the fraction contaminated with saturated simulation. The isolates were selected based on two types of oxidation tests, using the indicator redox indicator 2,6 - dichlorophenol indophenol (DCPIP), based on the monitoring of radial growth and through the antagonism test. The consortium 1 (with the potential to degrade the oil of the Reconcavo basin) was composed of 30 isolates and consortium 2 (with potential to degrade the oil in the Campos Basin) for 28 isolates. Consortia were immobilized with a polymer base of coconut fiber and mangrove leaf powder. The application of immobilized consortia with the potential to degrade the two oil types studied (experiment 2) in laboratory conditions showed promising results for understanding the process of bioremediation in mangrove sediments. Regarding the biostimulation process using the fiber from coconut and mangrove leaf on immobilized powder did not exhibit a significant difference in efficiency in relation to the release of nutrients. By contrast can be observed that somehow the appropriate levels throughout the 90 days of the experiment, which would not happen if he had not been added to any kind of nutritional additive nutrients was maintained. In relation to biaumento was observed acceleration in the biodegradation compared to control with performance of natural attenuation. From the view of the chromatograms was observed that the oil Reconcavo basin has undergone a change in profile over 90 days, reduction of the lighter n-alkanes increase from baseline, demonstrating that degradation also occurred more fractions heavy. The chromatograms show that the modification of the oil in the Campos Basin profile lead to the conclusion that the strains contained in the consortium have ability to reduce saturated (n- alkane) hydrocarbons, but seem to

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have greater ability to degrade aromatic compounds and NSO. The results for Experiment 3, using a prototype bioreactor showed better results when compared to experiment 2. The reduction of n-alkanes oil Reconcavo basin was much more expressive. The results in general indicate that consortia are promising for the process of bioremediation, however greater attention on the interaction between fungi (synergism) would be necessary. Keywords : fungal consortium, Reconcavo Basin, Campos basin, bioremediation, total petroleum hydrocarbons.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Imagem de satélite do trecho do rio São Paulo (próximo a sua foz)

localizado no município de São Francisco do Conde, Bahia e área de coleta ....... 33

Figura 2 - Mapa de situação e localização da área de estudo. a) Mapa de situação da

BTS; b) imagem de satélite da área em destaque de amarelo ................................. 34

Figura 3 - Estruturas dos isoprenóides: (a) pristano e (b) fitano ................................... 36

Figura 4 - Estruturas dos hidrocarbonetos aromáticos (a) antraceno e (b) fenantreno 37

Figura 5 - Estrutura de compostos polares contendo nitrogênio. 2-cloro-6-

triclorometilpireno ...................................................................................................... 38

Figura 6 – Esquematização demonstrativa da biodegradação do pristano ................... 40

Figura 7 – Esquematização demonstrativa da biodegradação anaeróbica de alcanos 41

Figura 8 - Esquematização demonstrativa da biodegradação do (a) antraceno, (b,c)

alternativas para fenantreno ...................................................................................... 42

Figura 9 – Desenho esquemático do mecanismo de biodegradação dos contaminantes

agregados ao sedimento ............................................................................................ 48

Figura 10 – Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica

de bioestimulação ...................................................................................................... 49

Figura 11 - Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica

de bioaumentação ...................................................................................................... 52

Figura 12 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 1 de biorremediação

montado no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação,

Candeias-BA ............................................................................................................... 56


montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA. Onde

BR- bacia do Recôncavo; BC- bacia de Campos; AQ.- aquário .............................. 56


montado em biorreatores no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO),

Salvador-BA ................................................................................................................ 58

Figura 15 - Investigação da área de manguezal localizada nas margens do estuário do

rio São Paulo: (a) Área de coleta (b) Coleta do sedimento ..................................... 58

Figura 16 - Coleta do sedimento de manguezal do estuário do rio São Paulo para

montagem dos experimentos de biorremediação .................................................... 59

Figura 17 - Montagem do experimento 1 (parte 1) de biorremediação no Laboratório de

Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) unidades de

simulação; (b) provetas vasadas revestidas com sacos de algodão sustentadas

por suporte de madeira; (c) aquários com bomba de oxigenação e (d) bancada

montada com as unidades de simulação .................................................................. 60

Figura 18 - Montagem do experimento 1 (parte 2) de biorremediação no Laboratório de

Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) placas de Petri

com sedimento contaminado com frações; (b e c) transferência do sedimento

contaminado para as provetas e (d) unidades de simulação cheias, simulando a

maré alta ...................................................................................................................... 61

Figura 19 - Coleta das amostras de sedimento no experimento 1 de Biorremediação

montado no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação,

Candeias-BA: (a) suspensão do suporte com as provetas para coleta, (b) retirada

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das provetas, (c) homogeneização das amostras e (d) acondicionamento das

amostras...................................................................................................................... 63

Figura 20 - Montagem do Experimento 2 (fase 1) de biorremediação no Laboratório de

Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) sedimento homogeneizado sendo colocado

nas provetas; (b) provetas com sedimento; (c) sedimento esterilizado e (d)

proveta sendo revestida e colocadas no suporte de madeira ................................. 64

Figura 21 - Montagem do Experimento 2 (fase 2) de biorremediação no Laboratório de

Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) inserção das cápsulas com consórcios

imobilizados; (b) simulação do derrame com óleo; (c) inserindo os suportes com

as provetas nos aquários; (d) inserindo a tampa no aquário; (e) aquário lacrado e

(f) bancada montada ................................................................................................... 65

Figura 22 - Sistema desenvolvido para simulação da maré no experimento 2 de

biorremediação no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) sistema

com galões alimentando os aquários, simulando a maré alta; (b) simulação da

descida da maré .......................................................................................................... 66

Figura 23 - Coleta das amostras de sedimento no experimento 2 de Biorremediação

montado no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador -BA: (a) aquários na

capela de fluxo laminar; (b) retirada das provetas; (c) homogeneização das

amostras e (d) acondicionamento das amostras ..................................................... 68

Figura 24 - Esquema do protótipo de biorreator de imersão temporária desenvolvido

para o experimento 3 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do

Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ............................................................................ 69

Figura 25 - Esquema do protótipo de biorreator de imersão temporária desenvolvido

para o experimento 3 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do

Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ............................................................................ 69

Figura 26 - Montagem do Experimento 3 de biorremediação montado em biorreatores

no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA: (a) biorreatores

com água do estuário e com sedimento esterilizado; (b) cápsulas com consórcios

imobilizados; (c) simulando o derrame com óleo; (d) vista superior do biorreator e

(e) protótipo montado ................................................................................................. 70

Figura 27 – Fotografia do protótipo de biorreator de imersão temporária: (a) biorreator

na fase de maré alta e (b) biorreator na fase de maré baixa. ................................... 71

Figura 28 - Coleta das amostras para determinações analíticas no Laboratório de

Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ......... 71

Figura 29 - Cromatogramas das amostras coletadas no ponto 1, 2 e 3 do manguezal

do estuário do rio São Paulo ..................................................................................... 79

Figura 30 – Cromatogramas do fracionamento do óleo da bacia do Recôncavo: (a)

perfil do óleo da Bacia do Recôncavo (BR); (b) perfil da fração de saturados do

óleo BR; (c) perfil da fração de aromáticos do óleo BR e (d) perfil da fração de

NSO do óleo BR (condições de análise vide apêndice A) ....................................... 81

Figura 31 – Cromatogramas do fracionamento do óleo da bacia de Campos: (a) perfil

do óleo da bacia de Campos (BC); (b) perfil da fração de saturados do óleo BC; (c)

perfil da fração de aromáticos do óleo BC e (d) perfil da fração de NSO do óleo

BC. (condições de análise vide apêndice A)............................................................. 83

Figura 32 - Cromatogramas dos extratos das unidades de simulação no tempo 0 e no

tempo 30: (a) Controle (REF01); (b) saturados(SAT); (c) Aromáticos (ARO03) e (d)

NSO (NSO04). Frações do óleo da bacia do Recôncavo.......................................... 85

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Figura 33 - Gráfico com variação dos teores de fósforo nas unidades de simulação no

1º e 30º dia de experimento ........................................................................................ 88

Figura 34 - Gráfico com variação dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação

no 1º e 30º dia de experimento .................................................................................. 88

Figura 35 - Gráfico com variação dos teores de CO% nas unidades de simulação no 1º

e 30º día de experimento ............................................................................................ 89

Figura 36 - Análise dos Componentes Principais (ACP). Onde: (a) – Variáveis: fósforo,

nitrogênio, matéria orgânica, temperatura, pH, Eh (mV), salinidade e O.D. aos

tempos amostrais T0 e T30 e (b) – Casos - amostras de sedimento controle (REF

01), contaminados com fração de saturados (SAT 02), contaminados com fração

de aromáticos (ARO 03) e contaminados com NSO (NSO 04). Círculos verdes

correspondem as principais variáveis que explicam o PC1. ................................... 90

Figura 37. Médias da fecundidade total expressa em indivíduos produzidos (a) e da

sobrevivência (b) da espécie Tisbe biminiensis quando exposta aos sedimentos,

contaminados com frações do óleo da bacia do Recôncavo, da área do estuário

do Rio São Paulo e controle (Maracaípe-PE ). .......................................................... 92

Figura 38 - Gráfico de linhas para número de células viáveis (UFCs x 105) em amostras

de sedimento controle (REF01) e contaminados com frações do óleo da bacia do

Recôncavo (SAT02, ARO03 e NSO04): (a) UFCs de fungos no T0 e T30, e (b) UFCs

de bactérias no T0 e T30 ............................................................................................ 93

Figura 39 – Gráfico de barras para quantidade dos fungos isolados em amostras de

sedimento do Estuário do rio São Paulo, Candeias- BA coletadas em cada

unidade de simulação (REF01, SAT02, ARO03 e NSO04) no T0 e T30 .................... 94

Figura 40 – Gráfico evidenciando os fungos testados quanto a sua oxidação para o

óleo da bacia do Recôncavo: (a) teste com fração de saturados; (b) teste com

fração de aromáticos e (c) teste com a fração de NSO ............................................ 98

Figura 41 – Ilustração mudança de cor do indicador após 48hs para dois fungos

testados quanto a sua oxidação para o óleo da Bacia do Recôncavo. (a) tempo 0 e

(b) após 48hs .............................................................................................................. 99

Figura 42 – Gráfico com fungos selecionados capazes de degradar as três frações

presentes no óleo da bacia do Recôncavo ............................................................. 100

Figura 43 - Gráfico evidenciando os fungos testados quanto a sua oxidação para o

óleo da Bacia de Campos ........................................................................................ 101

Figura 44 – Gráfico com fungos selecionados capazes de degradar as três frações

presentes no óleo da bacia de Campos .................................................................. 103

Figura 45 - Gráfico mostrando os fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da

bacia do Recôncavo ................................................................................................. 105

Figura 46 – ilustração mudança de cor do indicador após 24hs para dois fungos

testados quanto a sua oxidação para Óleo da Bacia do Recôncavo. (a) teste com a

linhagem R33 e (b) teste com a linhagem S52 ........................................................ 106

Figura 47 - Gráfico mostrando os fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da

Bacia de Campos ...................................................................................................... 107

Figura 48 – Ilustração mudança de cor do indicador após 24hs para dois fungos

testados quanto a sua oxidação para óleo da Bacia do Recôncavo. (a) teste com a

linhagem R11 e (b) teste com a linhagem A77 ........................................................ 108

Figura 49 – Gráfico de box plot para crescimento radial em dois tipos de meio (BDA e

Sabouraud), em duas condições (com e sem fração) para as frações (saturados,

aromáticos e NSO), do óleo da bacia do Recôncavo ............................................. 111

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Figura 50 – Gráfico de box plot para crescimento radial em dois tipos de meio (BDA e

Sabouraud) em duas condições (com e sem fração), para fração de saturados,

aromáticos e NSO do óleo da bacia de Campos .................................................... 114

Figura 51 – Gráfico de regressão linear para crescimento radial dos fungos isolados

para óleo da bacia do Recôncavo e óleo da bacia de Campos ............................. 114

Figura 52 – Teste de antagonismo dos isolados, com potencialidade em degradar

frações do óleo da bacia do Recôncavo. (a) isolados da fração de saturados, (b)

isolados da fração de aromáticos e (c) isolados da fração de NSO ..................... 116

Figura 53 - Teste de antagonismo dos isolados com potencialidade em degradar

frações do óleo da bacia de Campos. (a) isolados da fração de saturados, (b)

isolados da fração de aromáticos e (c) isolados da fração de NSO ..................... 117

Figura 54 – Micrografia dos isolados crescidos em meio BDA, em lâmina e imagem

fotográfica dos mesmos, que compuseram o Consórcio da bacia do Recôncavo.

Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x ............................ 120

Figura 55 – Continuação... Micrografia dos isolados fúngicas crescidos em meio BDA,

em lâmina e imagem fotográfica dos mesmos, que compuseram o Consórcio da

bacia do Recôncavo. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de

400x ........................................................................................................................... 121

Figura 56 - Micrografia e imagem fotográfica dos isolados que compuseram o

consórcio da bacia de Campos. Imagens obtidas por microscopia ótica com

aumento de 400x ....................................................................................................... 123

Figura 57 – Continuação... Micrografia e imagem fotográfica dos isolados que compôs

o Consórcio da bacia de Campos. Imagens obtidas por microscopia ótica com

aumento de 400x ....................................................................................................... 124

Figura 58 – Consórcios fúngicos encapsulados: (a) encapsulados à base de fibra de

coco e (b) encapsulados à base de folha de manguezal em pó ............................ 125

Figura 59 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de

simulação controle do experimento de biorremediação em sedimentos do

manguezal do estuário do rio São Paulo ................................................................ 129


simulação controle do óleo da bacia do Recôncavo do experimento de

biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo ..... 129


simulação controle do óleo da bacia de Campos do experimento de

biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo. Linha

pontilhada – corresponde ao início do processo ................................................... 130


simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco, do

experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio

São Paulo .................................................................................................................. 132


simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha de manguezal do


São Paulo .................................................................................................................. 134


simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco do


São Paulo .................................................................................................................. 136

XV

17


simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha de manguezal do


São Paulo .................................................................................................................. 137

Figura 66 – Gráfico com variação da razão Pristano/Fitano (ppb) nos tempos 0, 30, 60

e 90 dias de experimento ......................................................................................... 138

Figura 67 – Gráfico com variação da razão Pristano/Fitano nos tempos 0, 30, 60 e 90

dias de experimento ................................................................................................. 139

Figura 68 – Gráfico com variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias

de experimento ......................................................................................................... 140

Figura 69 – Gráfico com variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0 e média (dias)

do experimento ......................................................................................................... 141

Figura 70– Gráfico com variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias

de experimento ......................................................................................................... 141

Figura 71 – Gráfico com variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0 e média (dias) do

experimento .............................................................................................................. 142

Figura 72 – Gráfico com variação da HTP/UCM nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de

experimento .............................................................................................................. 143

Figura 73 - Análise dos Componentes Principais (ACP) para as razões dos parâmetros

geoquímicos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18) monitorados no experimento 2. Onde:

(a) –Variáveis (unidades de simulação) e (b) – Casos (HTP/UCM, P/F, P/nC17,

F/nC18, nos tempos 0 e 30, 60 e 90) ........................................................................ 144

Figura 74 – Gráfico de similaridade (Cluster) entre as variáveis dos parâmetros

geoquímicos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18) monitorados no experimento 2 ..... 145

Figura 75 - Gráfico com a variação dos valores da temperatura do experimento 2

mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90

dias ............................................................................................................................ 146

Figura 76 - Gráfico com a variação dos valores do pH do experimento 2 mensurados

nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias............ 147

Figura 77 - Gráfico com a variação dos valores do EH do experimento 2 mensurados


Figura 78 - Gráfico com a variação dos valores da salinidade do experimento 2

mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90

dias ............................................................................................................................ 149

Figura 79 - Gráfico com a variação dos valores de O.D. do experimento 2, mensurados


Figura 80 – Gráfico de box plot para os parâmetros físico-químicos (pH, temperatura,

EH, O.D. e salinidade monitorados no experimento 2 ............................................ 151

Figura 81 – Gráfico de similaridade (Cluster) entre as variáveis dos parâmetros físico-

químicos (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade monitorados no experimento 2

................................................................................................................................... 151

Figura 82 - Análise dos Componentes Principais (ACP) para parâmetros físico-

químicos (pH, temperatura, EH, salinidade monitorados no experimento 2. Onde:

(a) – Variáveis (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade) e (b) – Casos (T0, T30, T60

e T90) ......................................................................................................................... 152

Figura 83 – Gráfico de regressão linear para parâmetros físico-químicos (pH,

temperatura, EH, salinidade, monitorados no experimento 2 ................................ 153

XVI

18

Figura 84 - Gráfico com variação dos teores de fósforo nas unidades de simulação,

nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ........................................................... 154

Figura 85 - Gráfico com média dos teores de fósforo nas unidades de simulação nos

tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias................................................................... 155

Figura 86 - Gráfico com variação dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação,

nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias .......................................................... 156

Figura 87 - Gráfico com média dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação

nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ........................................................... 156

Figura 88 - Gráfico com variação dos teores de CO% nas unidades de simulação

simulação, nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ....................................... 157

Figura 89 - Gráfico com média dos teores de CO (%) nas unidades de simulação nos

tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias................................................................... 158

Figura 90 - Análise dos Componentes Principais (ACP) parâmetros químicos (fósforo,

nitrogênio e CO) monitorados no experimento 2. Onde: (A) –Variáveis (T0, T30,

T60 e T90) e (B) – Casos (fósforo, nitrogênio e CO) ............................................... 159

Figura 91 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de bactérias nas

unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias................... 160

Figura 92 – Gráfico de box plot de células bacterianas (UFC) monitorados no

experimento 2 ........................................................................................................... 161

Figura 93 – Gráfico de similaridade (Cluster) de células bacterianas (UFC)

monitorados no experimento 2 ................................................................................ 161

Figura 94 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de fungos nas

unidades de simulação simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias 162

Figura 95 – Gráfico de box plot de células fúngicas (UFC), monitorados no

experimento 2 ........................................................................................................... 163

Figura 96 – Gráfico de similaridade (Cluster) de células fúngicas (UFC), monitoradas

no experimento 2 ...................................................................................................... 163

Figura 97 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos

T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BRFO ............................................... 164

Figura 98 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0,

T30, T60 e T90 na unidade de simulação BRFI ....................................................... 165

Figura 99 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0,

T30, T60 e T90 na unidade de simulação BCFI ....................................................... 167

Figura 100 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos

T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BCFO ............................................... 168

Figura 101 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados dos biorreatores

(BIO1, BIO2 e BIO3) nos períodos T0, T30, T60 e T90 ............................................ 170

Figura 102 – Variação da razão Pristano/Fitano nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de

experimento 3 ........................................................................................................... 171

Figura 103 – Variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de

experimento 3 ........................................................................................................... 172

Figura 104 – Variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de

experimento 3 ........................................................................................................... 172

Figura 105 – Variação da razão HTP/UCM nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de

experimento 3 ........................................................................................................... 173

Figura 106 - Variação dos teores de fósforo nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas

unidades de biorreator ............................................................................................. 174

XVII

19

Figura 107 - Variação dos teores de nitrogênio nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas


Figura 108 - Variação dos teores de CO% nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas


Figura 109 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de bactérias nas

unidades de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias ......................................... 176

Figura 110 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de fungos nas

unidades de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias ......................................... 177

Figura 111 - Gráfico de linhas para número de células viáveis (UFC) nas unidade de

biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 ....................................................................... 178

XVIII

20

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Tabela com a indicação dos valores de temperatura (Temp.), pH, oxigênio

dissolvido (O.D.), salinidade (SAL.) e EH ao longo do experimento 1 mensurados

nas unidades de simulação (REF01, SAT02, ARO02 e NSO04) no tempo 0 (T0) e

após 30 dias (T30) ....................................................................................................... 86

Tabela 2 - Códigos dos fungos isolados em cada unidade de simulação do

experimento 1 ............................................................................................................. 96

Tabela 3 - Valores quantitativos da solução de esporos utilizados no teste de oxidação

para óleo da bacia do Recôncavo ........................................................................... 100

Tabela 4 - Valores quantitativos de esporos utilizados no teste de oxidação para

frações do óleo da bacia de Campos ...................................................................... 103

Tabela 5 - Velocidades de crescimento radial em diferentes meios (BDA, Saboraud), e

com as frações as do óleo da bacia do Recôncavo (Saturados, Aromáticos e

NSO). Destaque em vermelho – maiores velocidades. Destaque em verde –

maiores velocidades com adição das frações do óleo da bacia do Recôncavo .. 110

Tabela 6 - Velocidades de crescimento radial em diferentes meios (BDA, Saboraud), e

com as fração do óleo da bacia de Campos (Saturados, Aromáticos e NSO).

Destaque em vermelho – maiores velocidades. Destaque em verde – maiores

velocidades com adição das frações ...................................................................... 113

Tabela 7 – Isolados que compuseram o consórcio da bacia do Recôncavo e seus

principais resultados ................................................................................................ 119

Tabela 8 - Isolados que compuseram o consórcio da bacia do Recôncavo e seus

principais resultados ................................................................................................ 122

XIX

21

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Descrição dos tratamentos do Experimento 2 de biorremediação montado

no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ......................... 57

Quadro 2 - Análises realizadas ao longo do experimento 1 no Laboratório de Estudos

do Petróleo (LEPETRO) e no Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos

Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ...................... 62

Quadro 3 - Análises realizadas ao longo do experimento 2 no Laboratório de Estudos

do Petróleo (LEPETRO) e no Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos


Quadro 4 - Análises realizadas ao longo do Experimento 3 no Laboratório de Estudos

de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ....................... 72

Quadro 5 – Análises físicas realizadas na investigação da área no Laboratório de


Quadro 6 - Análises geoquímicas realizadas na investigação da área no Laboratório

de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 74

Quadro 7 - Análises físicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de Estudos de

Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ............................. 74

Quadro 8 - Análises geoquímicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de


Quadro 9 - Análises biológicas realizadas no experimento 1 no Laboratório Ao

Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE) da Universidade Federal de

Pernambuco (UFPE) ................................................................................................... 75

Quadro 10 - Análises microbiológicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de

Estudos de Petróleo (LEPETRO) e Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos


XX

22

LISTA DE ABREVIATURAS

BTS Baía de Todos os Santos

RLAM Refinaria Landulpho Alves

HPAs Hidrocarbonetos poliaromáticos

UFBA Universidade Federal da Bahia

BC Bacia de Campos

BR Bacia do Recôncavo

GPS Sistema de Posicionamento Global

PTFE Politetrafluoretileno

IGEO Instituto de Geociências/UFBA

NEA Núcleo de Estudos Ambientais/UFBA

IQ Instituto de Química/UFBA

LBQM Laboratório de Biotecnologia e Química dos

microrganismos/UFBA

LEPETRO Laboratório de Estudos do Petróleo/UFBA

DCPIP Indicador redox 2,6 diclorofenol-indofenol

pH Potencial hidrogeniônico

EH Potencial redox

C.O Carbono Orgânico

M.O Matéria orgânica

O,D. Oxigênio dissolvido

ACP Análise de Componentes Principais

UFC Unidade Formadora de Colônias

BDA Batata Dextrose Ágar

UCM Unresolved Complex Mixture

HTP Hidrocarbonetos Totais do petróleo

USEPA United States Environmental Protection Agency

XXI

23

SÚMARIO

RESUMO ............................................................................................................................... 9

ABSTRACT ......................................................................................................................... 11

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... 13

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... 20

LISTA DE QUADROS ......................................................................................................... 21

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................... 22

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL E OBJETIVOS ....................................................... 25

I.1.0 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 27

I.1.1 OBJETIVOS ............................................................................................................. 31

I.1.1.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 31

I.1.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 31

CAPÍTULO II - ÁREA DE AMOSTRAGEM ......................................................................... 32

II. 2.0 LOCALIZAÇÃO E SITUAÇÃO DA ÁREA DE AMOSTRAGEM ................................. 33

CAPÍTULO III - ESTADO DA ARTE .................................................................................... 35

II.3.0 PETRÓLEO E SUA COMPOSIÇÃO QUÍMICA ......................................................... 36

III. 3.1 BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS ..................................................... 38

III. 3.2 FUNGOS DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS ...................................... 43

III.3.3. BIORREMEDIAÇÃO ............................................................................................. 47

CAPÍTULO IV - MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 54

IV. 4.0 TRABALHOS DE ESCRITÓRIO ............................................................................ 55

IV. 4.1 TRABALHOS DE CAMPO ..................................................................................... 55

IV. 4.1.2 Experimento 1 (Isolamento e seleção de microrganismos) ............................. 59

IV. 4.1.3 Experimento 2 (aplicação em condições laboratoriais) ................................... 63

IV. 4.2 TRABALHOS DE LABORATÓRIO ......................................................................... 73

IV. 4.2.1 Investigação da área ...................................................................................... 73

IV. 4.2.2 Experimento 1 (Isolamento e seleção dos microrganismos) ........................... 74

IV. 4.2.3 Experimento 2 (aplicação em condições laboratoriais) ................................... 76

IV. 4.2.4 Experimento 3 (Biorreatores) ......................................................................... 76

CAPÍTULO V - RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................ 77

V. 5.0. ANÁLISES DAS AMOSTRAS PARA INVESTIGAÇÃO DA ÁREA DE

AMOSTRAGEM ............................................................................................................... 78

V. 5.1. ANÁLISES DAS FRAÇÕES DOS ÓLEOS (BACIA DO RECÔNCAVO E BACIA DE

CAMPOS) ........................................................................................................................ 80

V. 5.2. EXPERIMENTO 1 - ISOLAMENTO E SELEÇÃO DOS MICRORGANISMOS ........ 84

V. 5.2.1. Monitoramento geoquímico ............................................................................ 84

V. 5.2.2. Monitoramento físico-químico e químico ......................................................... 86

V. 5.2.3. Monitoramento biológico ................................................................................. 91

V. 5.2.4. Monitoramento microbiológico ........................................................................ 92

V. 5.3 EXPERIMENTO 2 (APLICAÇÃO EM CONDIÇÕES LABORATORIAIS) ................ 127

V. 5.3.1. Monitoramento geoquímico .......................................................................... 127

XXII

24

V. 5.3.2. Monitoramento químico e físico-químico ....................................................... 145

V. 5.3.3. Monitoramento microbiológico ...................................................................... 159

V. 5.3.4. Integração de dados biogeoquímicos do experimento 2 ............................... 164

V. 5.4 EXPERIMENTO 3 (BIORREATORES) ................................................................. 169

V. 5.4.1. Monitoramento geoquímico .......................................................................... 169

V. 5.4.2. Monitoramento químico ................................................................................ 173

V. 5.4.3. Monitoramento microbiológico ...................................................................... 176

CAPÍTULO VI - CONSIDERAÇÕES FINAIS E RECOMENDAÇÕES PARA TRABALHOS

FUTUROS ......................................................................................................................... 179

VI. 6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................ 180

VI. 6.1 RECOMENDAÇÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ....................................................... 184

CAPÍTULO VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA .......................................................... 185

VII. 7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 186

APÊNDICE A - PROTOCOLOS ........................................................................................ 207

PROTOCOLO Nº 1 PARA FRACIONAMENTO DO ÓLEO DA BACIA DO RECÔNCAVO ..................... 208

PROTOCOLO Nº 2 PARA FRACIONAMENTO DO ÓLEO DA BACIA DE CAMPOS ........................... 211

PROTOCOLO Nº 3 PARA SELEÇÃO DE FUNGOS DEGRADADORES ........................................... 212

PROTOCOLO Nº 4 PARA SELEÇÃO DE FUNGOS DEGRADADORES ........................................... 215

PROTOCOLO Nº 5 PARA SELEÇÃO DE FUNGOS DEGRADADORES CRESCIMENTO RADIAL ......... 218

PROTOCOLO Nº 6 PARA FORMAÇÃO E CRESCIMENTO DOS CONSÓRCIOS .............................. 221

PROTOCOLO Nº 7 PARA MICROCULTIVO ............................................................................. 223

PROTOCOLO Nº 8 PARA CONTAGEM DE ESPOROS ............................................................... 225

PROTOCOLO Nº 9 PARA TESTE DE ANTAGONISMO ............................................................... 227

XXIII

25

CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL E

OBJETIVOS

26

Apresentação do Trabalho

Este trabalho está disposto em capítulos, com a seguinte ordem: Capítulo I –

Introdução geral e objetivos; Capítulo II – Área de Amostragem; Capítulo III –

Estado da Arte; Capítulo IV – Materiais e Métodos; Capítulo V – Resultados e

Discussão; Capítulo VI - Considerações finais e Recomendações Futuras; Capítulo

VII - Referências Bibliográficas. Cada Capítulo apresenta as seguintes composições:

Capítulo I - Nesse capítulo será apresentado A introdução geral à pesquisa

contendo Objetivos - Gerais e Específicos;

Capítulo II – Será descrita a área de amostragem - Localização e situação da área

de estudo.

Capítulo III – Nesse capítulo será abordado o Estado da Arte com os principais

temas relacionados com a investigação científica realizada. Biorremediação e seus

processos, composição química do petróleo, principais microrganismos

degradadores de petróleo e biodegradação por microrganismos.

Capítulo IV – Serão demonstrados os materiais e métodos adotados: amostragem;

Metodologia de montagem do experimento; metodologias de simulação; metodologia

de retirada de amostras; monitoramento das unidades de simulação; procedimentos

analíticos.

Capítulo V - Nesse capítulo serão apresentadas as discussões dos resultados

obtidos ao longo de cada experimento. Resultados de análises físicas, químicas,

geoquímicas e biológicas.

Capítulo VI – Esse capítulo apresentará as considerações finais do trabalho e as

sugestões para pesquisas futuras.

Capítulo VII – Nesse capítulo serão apresentadas todas as referências utilizadas

para a construção deste trabalho.

Neste trabalho também serão apresentados em Apêndice, os protocolos

desenvolvidos ao longo da pesquisa.

27

I.1.0 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento populacional e o avanço da industrialização,

principalmente da cadeia produtiva do petróleo, tem levado inevitavelmente ao

aumento do impacto antropogênico na biosfera. São diferentes as fontes de petróleo

necessárias para atender a demanda mundial, por isso o processamento,

armazenamento e transporte são constantes. Em consequência, derramamentos de

petróleo, são uma das principais causas de poluição da água e do solo

(RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ et al, 2006; TABARI; TABARI, 2010; SONAWDEKAR,

2012).

Derramamentos de óleo no mar, especialmente acidentes em grande escala,

têm trazido ameaças e tem causado grandes danos ao ambiente marinho costeiro

dentre esses a destruição do “habitat” de animais e plantas aquáticas, bem como a

devastação de toda a fauna e flora circundante, além de trazer sérios riscos a saúde

para dos habitantes locais (VENOSA; ZHU, 2006; DIAS, 2007).

Atualmente, os métodos mais comuns que visam lidar com a contaminação

por hidrocarbonetos são físicos, químicos ou de natureza mecânica, evaporação e

dispersão. Porém essas tecnologias são muito dispendiosas e podem levar a

incompleta decomposição de contaminantes (SONAWDEKAR, 2012). Métodos

biológicos, denominados de biorremediação, têm se destacado ao longo dos últimos

anos como uma solução efetiva para a eliminação de diversos poluentes, entre eles

os produtos do petróleo, óleo bruto e graxas. Estes métodos são favorecidos por

serem ecologicamente corretos, mais limpos, com custos baixos e de mais fácil

aplicação em grande escala, além de não alterarem o equilíbrio dos ecossistemas

(YEUNG et al., 1997).

A persistência de um poluente no ambiente é influenciada pela natureza do

contaminante e pela interação entre as características biológicas, químicas,

geológicas e físicas do local contaminado (KOUL, 2013). Em teoria, solos e

sedimentos contaminados com esses compostos podem ser tratados utilizando

diferentes estratégias de limpeza. A biorremediação tem sido reconhecida como um

dos métodos menos invasivos e tem se mostrado uma ferramenta eficaz para o

tratamento de derrames de petróleo, sendo uma modalidade promissora para a

minimização ou até extinção das concentrações desses compostos (LIMA, 2010).

28

No entanto, muitas estratégias propostas têm sérios problemas econômicos e

de viabilidade. Os benefícios potenciais desses trabalhos poderiam incluir redução

dos custos de tratamento, uma melhor avaliação e concepção de tecnologias de

limpeza, regulação e uma maior aceitação pública do processo tecnológico

empregado.

A biorremediação, definida como um processo natural onde se utiliza

microrganismos para desintoxicar ou remover os poluentes, devido as suas diversas

capacidades metabólicas, é um método promissor para a remoção e degradação

dos diversos poluentes ambientais, incluindo os produtos das indústrias de petróleo

(MEDINA; BELLVER, 2005; KOUL, 2013). Além disso, acredita-se que a tecnologia

de biorremediação é menos invasiva e relativamente eficiente (APRIL, 1999). A

biorremediação que utiliza comunidades indígenas de microrganismos constitui um

dos principais mecanismos pelos quais o petróleo e outros hidrocarbonetos

contaminantes podem ser removidos, além de ser uma tecnologia de baixo custo em

relação a outras de recuperação (LEAHY;COLWELL, 1990; ULRICI, 2000; KOUL,

2013).

Essa tecnologia parte da premissa de que grande parte dos componentes do

petróleo são biodegradáveis na natureza, onde os microrganismos utilizam como

principal fonte de carbono os hidrocarbonetos em seus processos metabólicos,

podendo ocorrer em condições anaeróbicas e aeróbicas (ATLAS, 1981, 1984;

ROSA, 2001; MARIANO, 2006).

No entanto, esse processo natural pode ser acelerado pela utilização da

bioestimulação e/ou da bioaumentação. Na bioestimulação, nutrientes são

adicionados e as condições ambientais otimizadas, visando o desenvolvimento de

populações nativas de microrganismos (FENIMAN et al., 2009). Aditivos nutricionais

são agentes de biorremediação, um dos meios primários para aumentar a taxa de

crescimento de microrganismos que degradam petróleo. Este tipo de agente tem a

intenção de aumentar a biomassa que degrada o óleo já presente em uma área

afetada para um nível onde o petróleo irá ser utilizado como fonte primária de

alimentos ou energia. O ambiente natural não tem nutrientes suficientes para

estimular o metabolismo e crescimento dos microrganismos. Por conseguinte, é

necessários proporcionar nutrientes para manter ou aumentar a atividade microbiana

e a biodegradação natural (PEDIGO et al., 2011).

29

Pela bioaumentação, são adicionados microrganismos capazes de degradar

rapidamente os contaminantes específicos (FENIMAN et al., 2009). Em alguns

casos, os microrganismos podem ser colonizados em biorreatores. Todos os

agentes comercialmente disponíveis usam naturalmente os microrganismos. Alguns

agentes podem também conter nutrientes para assegurar a atividade das suas

culturas microbianas. Os agentes microbianos são projetados para aumentar a

biodegradação de petróleo, em qualquer localização e seria muito útil em zonas

onde a população de degradadores de petróleo indígenas é pequena (PEDIGO et

al., 2011).

Muitos microrganismos indígenas da água e do solo são capazes de degradar

hidrocarbonetos contaminantes (KUMARI et al., 2013). Portanto não é restrita a

apenas alguns gêneros de microrganismos, pois vários grupos de bactérias, fungos,

algas e algumas cianobactérias têm mostrado possuir essa capacidade (KATAOKA,

2001; MARIANO, 2006). Leahy e Colwell (1990) citam os seguintes gêneros de

bactérias como os mais importantes: Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes,

Arthobacter, Bacillus flavobacterium, Nocardia e Pseudomonas.

Riser-Roberts (1992) cita como as principais espécies que assimilam

hidrocarbonetos os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Contudo, esta

característica é uma propriedade individual da espécie e não necessariamente uma

característica particular do gênero. Dentre os gêneros de cianobactérias e algas

destaca-se: Oscillatoria, Microcoleus, Anabaena, Nostoc, Chlorella, Chlamydomonas

e Ulva (ATLAS, 1981).

O petróleo é considerado como uma mistura complexa onde dentre os

principais componentes encontra-se os alcanos, aromáticos e naftênicos, que

podem ser degradados por microrganismos (KIRCHMANN; EWNETU, 1998). No

entanto, o que se observa é que uma única espécie isoladamente não consegue

degradar todos os componentes do petróleo, e que sob condições favoráveis um

microrganismo consegue degradar um tipo ou uns poucos componentes ao mesmo

tempo (KORDA et al., 1997).

Na segunda metade do século XX, inúmeros acidentes ambientais

envolvendo derrames de óleo ocorreram na região norte da Baía de Todos os

Santos, Bahia, atingindo os manguezais da localidade. Depois de cinquenta anos de

convívio com derrames e vazamentos de óleo e derivados, a região é apontada pela

literatura especializada como uma área contaminada por hidrocarbonetos de

30

petróleo. Com isso vários estudos vem sendo desenvolvidos na tentativa de

minimizar os efeitos causados por essas contaminações (VEIGA, 2003).

Diversos trabalhos (SANTANA, 2008; LIMA, 2010; MOREIRA, 2011),

desenvolvidos em áreas contaminadas da Baía de Todos os Santos obtiveram bons

resultados, mas observou-se também a necessidade de se fazer ajustes para que os

resultados fossem mais satisfatórios quanto à degradação do óleo total. Verificou-se,

nesses trabalhos, que algumas frações dos hidrocarbonetos não haviam sido

degradadas, a exemplo dos biomarcadores (hidrocarbonetos cíclicos saturados), ou

hidrocarbonetos aromáticos, e de uma forma constante a não degradação da fração

das resinas e asfaltenos.

A finalidade de fracionar o óleo em compostos saturados, aromáticos e NSO

(resinas e asfaltenos) através de cromatografia líquida, contaminar o sedimento

limpo, em experimento de bancada, com cada fração separadamente com o intuito

de obter microrganismos (fungos) adequados e específicos para tal degradação, é a

principal justificativa desta pesquisa. A este aspecto alia-se a necessidade verificada

internacionalmente da identificação e isolamento dos microrganismos para possível

formação de um consórcio capaz de degradar o óleo total, melhorando desta forma

os resultados da biorremediação.

Segundo Rambeloarisoa et al.(1984), Cookson (1995), Chhatre et al. (1996),

Tanodebrah et al. (1999) e Venosa et al. (1999), para que ocorra a biodegradação

total se faz necessário uma assembléia ou pool de microrganismos capazes de

degradar todos os compostos contidos no petróleo e com isso várias pesquisas

internacionais têm proposto a utilização de culturas mistas para fins de

biorremediação.

31

I.1.1 OBJETIVOS

I.1.1.1 Objetivo Geral

O presente trabalho tem como objetivo avaliar os processos geoquímicos e a

eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em

sedimento de manguezal, contaminados por dois tipos de óleos (óleo da bacia do

Recôncavo e óleo da bacia de Campos).

I.1.1.2 Objetivos Específicos

Determinar a concentração de nutrientes: nitrogênio total e fósforo em

sedimento;

Monitorar os parâmetros físico-químicos, não conservativos em água:

temperatura, oxigênio dissolvido (O.D.), pH, EH e salinidade, durante todo o

experimento;

Simular derrames de frações do óleo (Saturados, Aromáticos e NSO) em

substrato de manguezal;

Monitorar a degradação dos hidrocarbonetos em sedimentos através de

técnicas cromatográficas;

Monitorar a dinâmica da comunidade microbiana (quantificação de fungos e

bactérias) para cada uma das simulações realizadas;

Isolar e verificar a capacidade dos fungos em degradar as frações do óleo;

Obter consórcios de fungos capazes de degradar o óleo total;

Imobilizar os consórcios fúngicos;

Testar a fibra de coco e a folha de manguezal como aditivos estruturante e

nutricionais;

Monitorar a eficiência dos consórcios fúngicos na degradação do óleo da

bacia do Recôncavo em biorreatores de imersão temporária;

Monitorar a eficiência dos consórcios fúngicos na degradação de dois tipos

de óleo (bacia do Recôncavo e bacia de Campos) em condições

laboratoriais.

32

CAPÍTULO II - ÁREA DE AMOSTRAGEM

33

II. 2.0 LOCALIZAÇÃO E SITUAÇÃO DA ÁREA DE AMOSTRAGEM

A área de amostragem é representativa do ecossistema manguezal e está

localizada nas cercanias do rio São Paulo (Figura 1) o qual deságua na Baía de

Todos os Santos (BTS), Bahia, município de São Francisco do Conde, próximo à

estação Pedra Branca, nas coordenadas 12º 44’ 26,0”(S) e 38º 31’ 53,9” (W).

Figura 1 – Imagem de satélite do trecho do rio São Paulo (próximo a sua foz) localizado no município de São Francisco do Conde, Bahia e área de coleta

Fonte: modificado de Google Earth, 2014

A área fica compreendida nos limites dos municípios de Madre de Deus,

Candeias e São Francisco do Conde. A principal via de acesso à região, a partir de

Salvador, é através da BR-324, onde no entroncamento com a BA-522 se toma a

direção para Candeia; em seguida segue-se na direção contínua nordeste da BA-

522 pela vicinal. Chegando à Refinaria Landulpho Alves (RLAM). Ao acesso à

esquerda segue-se até chegar à área de estudo que se encontra sinalizada por

placa indicativa e está localizada mais especificamente nas proximidades da

Estação de Produção da JO-BA (Petrobras) denominada “Estação Pedra Branca”,

com uma área de aproximadamente 10km² a NW de Salvador (Figura 2). A RLAM

que está instalada na região desde a década de 1950, é responsável por diversas

atividades ligadas à indústria petrolífera (campo de produção, refinaria, porto).

Rio São Paulo

Área de coleta

34

Figura 2 - Mapa de situação e localização da área de estudo. a) Mapa de situação da BTS; b) imagem de satélite da área em destaque de amarelo

550456

550226

548384

8593473

8595374

548473

8593359

8595317

548473

8593359

Fonte: (a) Modificado da folha da Baía de Todos os Santos: SD-24-X-A-IV (BAHIA, 2004); (b) Google

Earth, 2014)

Declinação M agnéticaVariação M agnética

Cresce 5' anualm ente

NMNV

Legenda

Continente

Mar

Drenagens

Estradas

Cidades

Área de Estudo

27

(a)

(b)

35

CAPÍTULO III - ESTADO DA ARTE

36

II.3.0 PETRÓLEO E SUA COMPOSIÇÃO QUÍMICA

Os hidrocarbonetos são os principais constituintes do petróleo, estes são

compostos orgânicos formados por hidrogênio e carbono. A composição química e a

natureza física do petróleo podem variar em função das características: matéria

orgânica original; grau de evolução térmica da rocha geradora e estado de

biodegradação do óleo; e fracionamento sofrido durante a migração até a rocha

reservatório; entre outras (IARC, 1989). Os principais grupos de hidrocarbonetos

presentes em frações leves, médias e pesadas são n-alcanos, naftênicos,

hidrocarbonetos aromáticos, resinas e asfaltenos (PETERS et al., 2005).

Fração dos Hidrocarbonetos Saturados

As principais famílias dos hidrocarbonetos saturados são os n-alcanos, alguns

isoprenóides (pristano e fitano) (Figura 3), terpanóides (hopanos) e derivados de

esteróides (esteranos) (KASSIM; SIMONEIT, 2001).

Figura 3 - Estruturas dos isoprenóides: (a) pristano e (b) fitano

Fonte: SANTOS, 2008

Os alcanos são hidrocarbonetos de cadeia aberta e saturada que apresentam

somente ligação simples entre os átomos de carbono, e também são conhecidos

como parafinas normais (BENTO, 2005).

Já os isoprenóides são hidrocarbonetos parafínicos que apresentam

ramificação em um ou mais átomos de carbono. Esse grupo apresenta uma grande

importância nos estudos geoquímicos (TISSOT; WELTE, 1984; HUNT, 1995).

37

Fração dos Hidrocarbonetos Aromáticos (HPAs)

Os hidrocarbonetos aromáticos são compostos orgânicos que possuem

alternadamente ligações carbono-carbono simples e dupla em uma estrutura cíclica

com seis átomos de carbono (Figura 4) (WAPLES, 1981). Os HPAs compreendem

de dois a sete anéis aromáticos condensados ou fundidos (KENNISH, 1991). O

composto mais simples dessa classe é o benzeno que aparentemente é apenas um

composto insaturado cíclico contendo várias duplas ligações, mas na verdade é

notavelmente estável e quimicamente bastante diferente dos compostos insaturados

(BARKER, 1979; WAPLES, 1981).

O anel benzênico pode ligar-se a outros anéis formando anéis aromáticos

polinucleares; juntar-se a anéis saturados formando compostos cicloaromáticos; ou

pode também ligar-se a cadeias lineares formando alquilaromáticos. Os compostos

aromáticos possuem baixo conteúdo de hidrogênio e isso é comprovado quando se

compara benzeno com a parafina normal cíclica de carbonos (BARKER, 1979).

Figura 4 - Estruturas dos hidrocarbonetos aromáticos (a) antraceno e (b) fenantreno

Fonte: NEILSON; ALLARD (2007)

Uma das principais características dos compostos aromáticos está

relacionada à sua elevada estabilidade química, quando comparada a de outros

compostos insaturados, que está associada à habilidade dos elétrons que participam

das ligações ocuparem uma extensa região do anel (ATKINS, 2000). Os HPAs com

dois e três anéis (baixo peso molecular) têm uma alta toxicidade, enquanto que

alguns HPAs com quatro a seis anéis (alto peso molecular) são potencialmente

(a) (b)

38

carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos (NEFF, 1979; WITT, 1995; KENNISH,

1991; SANTOS, 2008).

Compostos polares (NSO)

Quando o esqueleto básico da molécula de um composto de petróleo é

formado de um hidrocarboneto contendo heteroátomos como: enxofre, nitrogênio

(Figura 5) e oxigênio; são conhecidos como a fração de não-hidrocarbonetos (NSO).

Estes compostos estão presentes nas frações de asfaltenos e resinas (TISSOT;

WELTE, 1984; HUNT, 1996).

Na composição química dos NSO também podem ser encontradas

substâncias que possuem carbonos ligados a metais (C-metal) em pequenas

quantidades (ALLINGER et al., 1976), e entre eles predominam o níquel e o vanádio.

Outros metais como ferro, zinco, cobre, chumbo, arsênio, molibdênio, cobalto,

manganês e cromo também são encontrados, porém em menores concentrações

(TISSOT; WELTE, 1978).

Figura 5 - Estrutura de compostos polares contendo nitrogênio. 2-cloro-6-triclorometilpireno


III. 3.1 BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS

Além de ser constituído de uma mistura de hidrocarbonetos, o petróleo possui

em sua constituição outros compostos orgânicos, principalmente níquel e vanádio

(constituintes organometálicos complexados) (VAN HAMME et al., 2003), produtos

difíceis de serem degradados.

39

Segundo Vasconcelos (2006), microrganismos são munidos de arsenais

enzimáticos capazes de utilizar o petróleo como fonte de carbono e energia, o que

vem direcionando as pesquisas para o isolamento de espécies envolvidas nos

processos de degradação do petróleo.

A biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo consiste em um processo

complexo e está diretamente relacionada com a natureza e a quantidade dos

hidrocarbonetos. Estudos realizados pelo UNEP (1991) evidenciam que a velocidade

de degradação do petróleo depende também das condições do tempo e do clima.

Por exemplo, em sedimentos aquáticos os hidrocarbonetos são degradados

lentamente na ausência de luz e oxigênio.

Cooney et al. (1985), relata que diferentes fatores influenciam na degradação

de hidrocarbonetos. A disponibilidade limitada dos microrganismos no ambiente é o

principal fator. Portanto, a forma como esses compostos se ligam ao substrato e a

sua susceptibilidade em relação ao ataque microbiano também são fatores decisivos

para o processo de biodegradação. Essa suscetibilidade pode ser geralmente

classificada da seguinte forma: alcanos lineares > alcanos ramificados > pequenos

aromáticos > alcanos cíclicos (DAS; CHANDRAN, 2011).

Os hidrocarbonetos alifáticos (alcanos e alcenos) são mais rapidamente e

facilmente degradados, seguidos pelos hidrocarbonetos aromáticos, e finalmente

cicloalcanos (ZOBELL, 1946; ATLAS, 1981), devido a sua estrutura molecular linear,

assim como por apresentarem os compostos mais leves do petróleo, possuindo

muita facilidade de serem evaporados. Os mecanismos predominantes de

degradação dos n-alcanos envolvem oxidações terminais dos grupos funcionais

correspondentes dos álcoois, aldeídos ou ácidos graxos (NAS, 1985). Os

isoprenóides altamente ramificados, tais como pristano e fitano, que se pensava

serem resistentes à biodegradação, tem demonstrado rápida biodegradabilidade

(Figura 6) (ATLAS, 1981). Contudo, os cicloalcanos são particularmente resistentes

à biodegradação. Compostos complexos como os hopanos e esteranos estão entre

os mais resistentes dos derrames de petróleo no meio ambiente (ATLAS, 1981).

40

Figura 6 – Esquematização demonstrativa da biodegradação do pristano


A biodegradação pode ser aeróbica e anaeróbica. A degradação aeróbia de

n-alcanos se inicia pela atividade de uma monooxigenase, a qual introduz um grupo

hidroxila na cadeia alifática. Os principais intermediários da degradação de alcanos

são ácidos graxos, os quais são produzidos a partir de alcanóis, via aldeídos. Estes

ácidos podem ser decompostos por rotas biossintéticas típicas de degradação de

ácidos carboxílicos, em que a molécula é quebrada em ácidos menores, que podem

servir como fontes de carbono para microrganismos de uma comunidade, podendo

aumentar o índice de degradação de hidrocarbonetos (VASCOCELOS, 2006).

Entretanto, a biodegradação anaeróbia (Figura 7) de hidrocarbonetos é um

processo muito lento, se comparada à aeróbia. As rotas metabólicas de degradação

de n-alcanos não são bem explicadas até o momento, sendo que muitos autores têm

discutido sobre um mecanismo de ativação molecular que envolve a adição de um

carbono ou uma molécula de fumarato aos hidrocarbonetos (WILKES et al., 2002;

SO et al., 2003; VASCOCELOS, 2006).

41

Figura 7 – Esquematização demonstrativa da biodegradação anaeróbica de alcanos


Os hidrocarbonetos aromáticos são geralmente mais resistentes à

biodegradação, apesar de alguns aromáticos de baixo peso molecular, tais como o

naftaleno, poderem ser oxidados antes de muitos saturados (FOCHT; WESTLAKE,

1987). Os hidrocarbonetos monoaromáticos são tóxicos para certos microrganismos

devido à sua ação solvente sobre as membranas celulares, mas em baixas

concentrações eles podem ser facilmente biodegradáveis sob condições aeróbicas.

Os caminhos metabólicos para a biodegradação dos compostos aromáticos têm sido

objeto de intensos estudos (ATLAS, 1981; CERNIGLIA, 1992; PRINCE, 1993).

Diferentes rotas de biodegradação têm sido demonstradas para compostos

aromáticos, onde o metabolismo pode iniciar-se pela atividade enzimática de uma

monooxigenase ou dioxigenase, havendo a adição de um ou dois átomos de

oxigênio no substrato (Figura 8). A molécula é oxidada formando um diol, havendo a

subsequente clivagem do anel. Piruvato é um dos principais intermediários dessa

reação, enquanto os produtos majoritários são biomassa e dióxido de carbono. É

importante ressaltar que a biodegradação aeróbia de aromáticos também poderá

ocorrer por reações denominadas como não específicas, obtendo-se os mesmos

produtos das reações promovidas pelas oxigenases (BERTHE; CORTI; HÖPNER,

2005).

42

Figura 8 - Esquematização demonstrativa da biodegradação do (a) antraceno, (b,c) alternativas para fenantreno


A biodegradação das resinas e asfaltenos comparada a dos saturados e

aromáticos, é muito pouco conhecida. Compostos persistentes são, por definição,

substâncias que têm meia vida longa, ou seja, lenta taxa de desaparecimento no

meio ambiente, devido, principalmente, à sua estabilidade química (BRO;

RASMUSSEN, 1986). Muitos xenobióticos persistem por um longo período no solo,

e esta persistência pode ser atribuída à toxicidade de certos compostos ou à

incapacidade dos microrganismos de crescer e/ou biodegradar tais compostos em

determinadas condições (DUA et al., 2002). Esse fato é devido a difícil análise de

suas complexas estruturas.

Resinas e asfaltenos foram previamente consideradas como refratárias à

degradação. Contudo, existem evidências da degradação dos asfaltenos através de

cometabolismo (LEAHY; COLWELL, 1990). Algumas resinas, particularmente as

frações de baixo peso molecular podem ser também biodegradadas em baixas

concentrações (NAS, 1985). Mais pesquisas são necessárias para o entendimento

da biodegradação desses compostos.

Em uma comunidade de microrganismos a capacidade metabólica é

meramente efeito aditivo da habilidade de cada membro desse consórcio em

degradar diferentes compostos de uma mistura, como por exemplo, o petróleo.

Torna-se irreal e simplista, afirmar que uma cultura degradou completamente um

43

óleo, uma vez que esse processo somente ocorrerá no ambiente,

cometabolicamente (MILLIOLI, 2009).

Hidrocarbonetos no ambiente são biodegradados principalmente por

bactérias, leveduras e fungos. A eficiência da biodegradação, em geral, varia em

média de 6% para 82% para fungos do solo, 13% a 50% para as bactérias do solo, e

0,003% a 100% para as bactérias marinhas. Muitos cientistas relataram que as

populações mistas com grande ação enzimática são necessárias para degradar

complexas misturas de hidrocarbonetos, como petróleo bruto no solo, na água, e em

ambientes marinhos (DAS; CHANDRAN, 2011).

Em resumo, a susceptibilidade dos hidrocarbonetos à degradação pelos

microrganismos é geralmente na seguinte ordem: n-alcanos>alcanos

ramificados>aromáticos de baixo peso molecular>alcanos cíclicos. Contudo, esta

feição não é universal (PERRY, 1984). A velocidade de degradação dos

constituintes de um mesmo óleo pode variar significativamente para diferentes óleos.

III. 3.2 FUNGOS DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS

Os fungos são organismos eucarióticos microscópicos onipresentes, e fazem

parte de um grupo diversificado. Desenvolvem-se e sobrevivem em quase todos os

habitats, desempenham um papel vital em todos os ecossistemas e são capazes de

ajustar o fluxo de nutrientes e energia através de suas redes de micélio (LAWTON;

JONES, 1995).

São microrganismos potenciais que podem ser utilizados na recuperação de

resíduos, tratamento de efluentes e na recuperação de áreas degradadas por

atividades petrolíferas. Estudiosos em todo o mundo tentam resolver os problemas

de resíduos e efluentes com a utilização de fungos saprófitas filamentosos onde

estes são capazes de degradar compostos presentes em efluentes e, assim,

contribuir para a sua limpeza (SINGH, 2006).

Os fungos são conhecidos por degradar e deteriorar uma grande variedade

de materiais e compostos, processos conhecidos como micodegradação e

micodeterioração. As atividades de degradação de fungos foram reconhecidas em

várias situações em que destroem os diferentes tipos de madeira, papel, têxteis,

plásticos, couro e materiais de empacotamento.

44

Alguns outros fungos possuem capacidade de metabolizar hidrocarbonetos de

petróleo, conhecida como micorremediação (CERNIGLIA; PERRY, 1973). Certos

fungos contêm enzimas extracelulares que podem auxiliar a degradação inicial de

hidrocarbonetos. Os fungos com suas estruturas de hifas, aumentam a área de

superfície e permitem uma melhor penetração e acesso aos hidrocarbonetos

agregados ao solo.

Estudos fragmentados têm mostrado um aumento na população de fungos

após derramamento de óleo. Isso indica que certos fungos desenvolvem um sistema

enzimático após um longo contato com hidrocarbonetos. Pinholt et al. (1979)

estudaram as mudanças microbianas no solo durante a decomposição do óleo. Eles

encontraram um aumento de 60 % a 82 % em fungos, utilizando óleo.

A extensão da biodegradação de hidrocarbonetos por fungos depende do

ecossistema e de suas condições locais. Os fungos são os principais

biodegradadores em ambientes marinhos. Entretanto, os fungos constituem uma

minoria nos ambientes marinhos, com o aumento da população em zona intertidal,

restingas e áreas de mangue (SINGH, 2006).

Em um dos primeiros estudos desenvolvidos por Cerniglia e Perry (1973)

sobre os fungos degradadores de hidrocarbonetos, foram isolados fungos

provenientes de sedimento estuarino, na costa da Carolina do Norte. Entre os

principais fungos selecionados, estavam Arpergillus versicolor, Cephalosporium

acremonium, Penicillium sp. e Cuninghamella elegans (CERNIGLIA; PERRY, 1973).

Segundo esses autores, o tratamento da poluição causada por petróleo em

ambientes marinhos pode ocorrer mais eficientemente se organismos degradadores

de hidrocarbonetos, incluindo os fungos, forem adicionados ao ambiente em grande

quantidade, juntamente com a adição de nitrogênio e fosfato quando, aplicados com

controle.

Vários outros fungos filamentosos e leveduras, que apresentaram capacidade

de utilizar o petróleo e derivados para o seu crescimento, foram isolados e

identificados. De solos contaminados por petróleo foram isolados fungos

filamentosos identificados como: Beauveria bassiana, Chrysosporium sp., Mortierella

sp., Paecilomyces sp., Penicillium e Trichoderma viride e Verticilium spp. (DAVIES;

WESTLAKE, 1979). Dentre os principais e mais eficientes em degradar compostos

saturados e aromáticos foram Beauveria alba e Penicillium simplicissimum

(CHAINEAU et al., 1999).

45

Experimentos sobre a degradação por fungos filamentosos das diferentes

frações de hidrocarbonetos saturados e aromáticos que compõem o petróleo tem

demonstrado que esses fungos degradam com mais facilidade e preferencialmente

os compostos saturados, degradando com menor eficiência a fração aromática

(SILVA; ESPOSITO, 2010). Entretanto, vários outros estudos foram realizados

utilizando fungos do gênero Penicillium na degradação de HPAs. Além destes o

Arpergillius niger e algumas leveduras também se mostraram eficientes na

degradação desses compostos mais recalcitrantes (SILVA; ESPOSITO, 2010).

Lemos e Araújo (2002), realizaram em seus estudos isolamento e

identificação de fungos filamentosos com capacidade de degradação do petróleo.

Foram obtidas oitenta linhagens a partir de um solo contaminado com 5% p/p de

petróleo, 75% destas linhagens apresentaram capacidade para degradar

hidrocarbonetos de petróleo. Os autores agruparam-os em quatro gêneros fúngicos

(Aspergillus, Penicillium, Parcilomyces e Fusarium), subdivididos nas seguintes

espécies: Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor,

Aspergillus niveus, Aspergillus niger, Penicillium corylophilum, Parcilomyces variotti,

Paecilomyces niveus e Fusarium sp.

Uma capacidade de degradar os hidrocarbonetos também foi observada nas

espécies de seis ordens de Ascomycetes (APRIL et al., 2000). Todas as espécies

degradadaram a fração de hidrocarbonetos de petróleo alifático. Hidrocarbonetos

totais de petróleo (TPHs) foram reduzidos consideravelmente por três culturas de

fungos após 4 meses, sob condições ricas em nitrogênio. Parcilomyces

chrysosporium degradou todos os componentes do BTEX, individualmente ou em

uma mistura composta (YADAV; REDDY, 1993).

Várias cepas de fungos com capacidade de assimilar hidrocarbonetos foram

isoladas de ambientes tropicais do solo de uma floresta, e dos sedimentos de um rio

contaminado por petróleo, em um estudo realizado por Oudot et al. (1993). As cepas

mais potenciais, que exibiram biodegradação de petróleo total superior a 25% foram

Eupenicillium javanicum, Graphium putredinis, e Aspergillus flavus. Essas cepas

foram mais eficientes na degradação de saturados, com valores superiores a 40%, e

para aromáticos foi superior a 30%. Nidulans emericella, Eupenicillium javanicum,

Gliocladium virens, e Aspergillus fumigatus degradaram significativamente as resinas

(15 a 28%). Emericella nidulans, Eupenicillium javanicum, Graphium putredinis, e

Acremonium spp. degradaram cerca de 15 a 40% de asfaltenos.

46

A análise multivariada de 22 parâmetros indicou uma tendência à reatividade

nos componentes durante a degradação do óleo da seguinte forma: n–alcanos de

baixo peso molecular > fenantreno > 3,2-metilfenatreno > n-alcanos de cadeia

intermediária de comprimento > n-alcanos de cadeia mais longa de comprimento >

isoprenóides ≈ 9,1-metilfenatreno. Independentemente da capacidade de

degradação, todas as espécies de fungos apresentam essa sequência de

degradação (SINGH, 2006).

Hussein (2012) coletou amostras de areia contaminadas com derramamento

de óleo da praia Pensacola (Golfo do México), onde foram isolados e investigados

os fungos com potecialidade para degradação de petróleo bruto. De dezesseis

cepas fúngicas, foram confirmadas quatro cepas para a capacidade de

biodegradação de petróleo bruto. Aspergillus niger apresentou maior atividade

seguido por Penicillium, Cochliobolus lutanus e Fusarium solani.

Pesquisas nas praias de Omã na Arábia isolaram dez espécies de fungos:

onde as especies Aspergillus niger, A. ochraceus e Penicillium chrysogenum foram

capazes de degradar n-alcanos (C13-C18). Além disso, foram encontradas diferenças

significativas na utilização de C15, C16, C17 e C18, com os três fungos. No entanto, o

coeficiente de correlação de biomassa e degradação do óleo não foi significativo

para Aspergillus niger e Aspergillus terreus, e foi altamente significativo para P.

chrysogenum (ELSHAFIE A et al., 2007).

Recentemente nove cepas fúngicas nativas foram isoladas de um solo

contaminado com petróleo bruto, e selecionadas com base em sua capacidade de

crescer e degradar petróleo e incluindo vários hidrocarbonetos aromáticos

policíclicos (HPAs) como fonte de carbono. Os resultados mostraram que os fungos

selecionados fazem parte dos gêneros Fusarium, Neurospora, Aspergillus,

Scedosporium, Penicillium, Neosartorya e Talaromyces. Foram feitas duas seleções,

onde Aspergillus terreus, Talaromyces spectabilis, e Fusarium sp., foram

selecionados com base na tolerância para 2.000mg de uma mistura de fenatreno e

pireno com 1kg de solo, durante 2 semanas. A percentagem de remoção de HPA

obtida pelas três cepas é de cerca de 21% (REYES-CÉZAR et al., 2013).

No entanto, as resinas de petróleo e asfaltenos são consideradas como

resistentes ou refratários à biodegradação. A cultura mista das cepas do solo é tão

ativa e mais eficiente do que as monoculturas (SINGH, 2006). Algumas culturas de

47

fungos inoculados têm demonstrado uma capacidade para degradar compostos

orgânicos voláteis (VOCs), como fontes de carbono e energia (QI et al., 2002).

Os cientistas defendem a hipótese de que uma única espécie de

microrganismos não conseguirá degradar completamente nenhum tipo de óleo,

sendo necessário um consórcio de microrganismos.

III.3.3. BIORREMEDIAÇÃO

A sociedade vem se tornando mais crítica e participativa em relação à

qualidade ambiental, exigindo atuação cada vez maior das autoridades. Desta

forma, em função da crescente demanda em relação ao gerenciamento de áreas

contaminadas, avanços significativos ocorreram nas últimas décadas nos estudos

que visavam à recuperação ambiental (MARIANO, 2006). Uma alternativa para a

descontaminação ambiental é a biorremediação. Esta técnica de limpeza é barata,

podendo ser aplicada em grandes áreas para atenuação de um grande número de

poluentes, como os hidrocarbonetos de petróleo.

Biorremediação é uma tecnologia que se utiliza da habilidade de

microrganismos ou outro membro da biosfera, para restaurar e preservar a

qualidade ambiental para todas as formas de vida de um ecossistema,

especialmente a humana. Tem sido sugerido que a tecnologia de biorremediação

possa ser mais efetiva do que as técnicas mecânicas e físico-químicas tradicionais

correspondentes (ABDEL MIGID et al., 2007). A utilização de plantas, bactérias e

fungos para os processos de biorremediação tem sido muito relatada ultimamente,

principalmente quanto ao uso de fungos e bactérias, devido ao seu grande potencial

genético. Esses, por sua vez, podem ser isolados de ambientes altamente

contaminados, devido ao seu poder de adaptação a essas condições

(SRIVASTAVA; THAKUR, 2006; MARTINS, 2009).

A biorremediação é uma técnica de despoluição de ambientes contaminados

baseada na aceleração do processo natural de biodegradação de determinadas

substâncias no meio ambiente. O processo é dependente de algumas condições

ambientais como: temperatura, presença de oxigênio, nutrientes e pH (COELHO,

2005).

48

Contaminante biodisponível

Microorganismos

Contaminante adsorvido

O uso da técnica de biorremediação foi descoberta através de pesquisas da

degradação de hidrocarbonetos no ambiente natural, nas quais foram identificados

alguns microrganismos capazes de usar tais hidrocarbonetos como fonte de carbono

e energia (ZOBELL, 1946; ATLAS, 1981). Mas só após a análise dos fatores bióticos

e abióticos envolvidos no processo de biodegradação (Figura 9) é que a técnica

passou a ser aplicada na limpeza de ambientes contaminados por óleo

(LINDSTROM et al., 1991).

Figura 9 – Desenho esquemático do mecanismo de biodegradação dos contaminantes agregados ao sedimento

Fonte: modificado de FEIJOO et al. (2003)

As técnicas de biorremediação podem ser classificadas como “ex situ” ou “in

situ”. Tecnologias “ex situ” são modalidades de tratamento nas quais o material

contaminado é removido, para um lugar diferente, onde possa ser tratado, com

biorreatores, landfarmings, biopilhas e compostagem (SOUZA, 2003). Já as técnicas

“in situ” são aplicadas no próprio local onde ocorreu a contaminação utilizando: i)

microrganismos autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de

tecnologias ativas de remediação (biorremediação intrínseca ou natural); ii) a adição

de agentes estimulantes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestímulo);

iii) a bioventilação de solos em ambientes contaminados; iv) a fitorremediação e a

inoculação de consórcios microbianos enriquecidos (bioaumento) (MARIANO, 2006).

Sedimento

49

A bioestimulação (Figura 10) é a aceleração da reprodução microbiana e de

suas atividades metabólicas, pela adição de oxigênio, água e nutrientes ao meio

ambiente contaminado (ROSA, 2001). A bioestimulação de populações de

microrganismos autóctones com o objetivo de aumentar as taxas de biodegradação ;

é frequentemente empregada em projetos de biorremediação (ATLAS, 1997). Para

se utilizar o processo de bioestimulação, deve-se demonstrar que existe no local

contaminado uma população natural de microrganismos capazes de biodegradar os

contaminantes presentes, e que as condições ambientais são insuficientes para se

obter altas taxas de atividade microbiológica dessa população (RAMASWAMI;

LUTHY, 1997; MARIANO, 2006).

Figura 10 – Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica de bioestimulação

Fonte: Modificado de LIMA, 2010

Durante a bioestimulação há fatores limitantes, como nutrientes e aceptores

de elétrons, que estimulam o metabolismo e a velocidade de crescimento dos

degradadores, o que acelera as taxas de biodegradação em condições ambientais

favoráveis. A adição de nutrientes em ambientes contaminados permite a

degradação mais rápida e eficaz dos hidrocarbonetos por parte dos microrganismos

nativos (VALLEJO et al., 2005).

Segundo Vallejo et al. (2005) estudos prévios reportam que a bioestimulação

acelera as taxas de biodegradação dos solos contaminados, quando os fatores são

controlados, como pH, porcentagens de umidade, concentração de hidrocarbonetos,

Disso lução

+

Biodegradação

Sedimentação

EspalhamentoEmulsificação

D ispersão

O xidação

Evaporação

Vento

Biodegradação usando Bioestimulo

Adição de Nutrientes

Co2 + H2O

Compostos menos

tóxicos

N utriente

M icrorganismos

Legenda

50

aceptores de elétrons e temperatura. A maioria dos estudos se baseia na adição de

nutrientes em forma de fertilizantes, de compostos inorgânicos e inorgânicos

simples, nitrogênio, fósforo e potássio (NPK).

A disponibilidade de oxigênio molecular, tem um profundo efeito na

biodegradação de vários compostos. Limitação de oxigênio é um problema frequente

na biorremediação “in situ” de hidrocarbonetos, e de outros poluentes que são

biodegradados em condições aeróbias (BROWN et al., 1994; MARIANO, 2006).

Tanto a adição de água como a oxigenação do ambiente contaminado

favorece a atuação da biodegradação. A aplicação de nutrientes ricos em nitrogênio

e fósforo tem sido amplamente estudada, principalmente quando a concentração

dessas substâncias é limitada, como ocorre nos ambientes costeiros localizados em

regiões de clima tropical (ROSA, 2001).

Entre os fertilizantes oleofílicos podem ser utilizados uréia parafinada,

octilfosfato, octoato férrico, fosfato duplo de amônia e magnésio parafinado, os quais

podem estimular a biodegradação em diferentes ecossistemas (ATLAS; BARTHA,

1973; DIBBIE; BARTHA, 1976; HOWORITZ; OLIVIERI et al., 1976; ATLAS, 1977;

BERGSTEIN; VESTAL, 1978). Em estudos utilizando fertilizantes de lenta liberação,

como o Osmocote (Os. Scotts, Marysville, OH) e Inipol EAP-22 (Ip; ATOFINA

Chemicals, Philadelphia, PA), combinado com nutrientes inorgânicos, Ran Xu e

Obbard (2003), avaliaram a eficiência desses nutrientes na degradação dos

hidrocarbonetos de petróleo presentes nos sedimentos de praia de Singapura. A

degradação dos hidrocarbonetos alifáticos presentes nos óleos tratados com

osmocote no sedimento de praia foi de 96%. A combinação de nutrientes solúveis e

osmocote favoreceu o estímulo do metabolismo dos microrganismos indígenas, bem

como manteve a liberação dos nutrientes, aumentando, assim, a biodegradação dos

hidrocarbonetos do petróleo presentes no sedimento da praia.

O NPK e osmocote vêm sendo usados largamente como estimuladores. O

NPK, é composto de fosfato de amônia [(NH4)3PO4], sulfato de amônia [(NH4)2SO4] e

cloreto de potássio [KCl] nas proporções (N:P:K) de 10:10:10. O osmocote possui a

mesma composição, no entanto a diferença está na forma de liberação desses

nutrientes. No Osmocote a liberação é mais lenta, pois este é envolvido por uma

cápsula protetora que limita a saída dos nutrientes. São fertilizantes de plantas,

facilmente encontrados no mercado a preços reduzidos (LIMA, 2010; AGARRY,

2012).

51

Pesquisas utilizando fertilizante do tipo NPK apresentaram resultados

positivos, com a remoção de 100% dos n-alcanos compreendidos entre o decano e

o eicosano, e 40% de remoção de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos foi obtido

com o uso da combinação de cultura mista + fertilizante, na proporção de C:N de

100:10 (OLIVEIRA, 2001).

Todos esses resultados sugerem que o sucesso da biorremediação é função

das propriedades do petróleo, da natureza dos produtos de biorremediação e das

características dos ambientes contaminados. Estudos têm mostrado que a taxa de

biodegradação do petróleo depende das concentrações de nutrientes na água

intersticial dos sedimentos, o que poderia fornecer orientações importantes para

aplicações de nutrientes (BRAGG et al., 1994; VENOSA et al., 1996).

As fontes mais comuns de nutrientes são sais de fósforo e nitrogênio

encontrados em fertilizantes agrícolas, e até mesmo em subprodutos da indústria

petroquímica. A adição de nutrientes é feita de modo a se estabelecer relações

carbono e nitrogênio (C:N) e/ou carbono e fósforo (C:P) adequadas à biodegradação

(HAMDI et al., 2007). No entanto, uma adição descontrolada pode promover a

eutrofização do local, contribuindo para o desequilíbrio ambiental (SILVA, 2009).

Contudo a utilização de aditivos orgânicos naturais como folhas, galhos, raízes de

plantas indígenas do local podem contornar a situação. Segundo Oliveira (2009)

uma das etapas mais importantes da ciclagem de nutrientes é a decomposição de

folhas, galhos, flores, frutos (propágulos). A decomposição permite que parte do

carbono retorne à atmosfera como dióxido de carbono e que os outros elementos

absorvidos (principalmente N e P) sejam transformados para uma forma novamente

utilizável.

Outra técnica utilizada é a bioaumentação (Figura 11), a qual ocorre pela

adição de microrganismos específicos em regiões impactadas, adaptados em

laboratório às condições ambientais. Ao usar essa técnica, faz-se a avaliação dos

microrganismos presentes no ambiente, identificando-se os degradadores de óleo.

Em seguida, através de biorreatores, estimula-se em laboratório o crescimento

microbiano das espécies de interesse e, posteriormente, injeta-se o “pool” de

microrganismos no local contaminado, com o objetivo de aumentar a população

microbiana, responsável pela degradação do óleo (VENOSA et al., 1999; ROSA,

2006).

52

Culturas mistas são produzidas com microrganismos coletados de regiões

contaminadas, mas para isso têm-se alguns critérios para a escolha desses

microrganismos, como a habilidade de degradar a maioria dos componentes do

petróleo, boa estabilidade genética, elevado grau de atividade enzimática,

capacidade de competir com os microrganismos autóctones, manutenção da

viabilidade das células durante a estocagem, ausência de patogenicidade e

crescimento rápido no meio ambiente natural (HOFF, 1992; BAKER; HERSON,

1994; SOUZA; 2003).

Figura 11 - Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica de bioaumentação

Fonte: Modificado de LIMA, 2010

A manipulação genética de cepas de microrganismos, visando à oxidação de

hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, também tem sido estudada, principalmente

através da introdução de plasmídeos em bactérias do gênero Pseudomonas (NOUR,

1997; SOUZA, 2003). A introdução de microrganismos geneticamente modificados

requer uma avaliação criteriosa dos possíveis danos ambientais, ainda

desconhecidos pela comunidade científica (LEAHY; COLWELL, 1990).

Os microrganismos aplicados devem atuar em sinergismo com as espécies

autóctones, sem interferir nos processos biogeoquímicos naturais. Leavitt e Brown

(1994) fizeram um estudo comparativo entre a bioestimulação e o bioaumento para

um caso de tratamento de solo contaminado com óleos crus, empregando, em um

Disso lução

+

Biodegradação

Sedimentação

EspalhamentoEmulsificação

D ispersão

O xidação

Evaporação

Vento

Biodegradação usando Bioaumento

Adição de

microrganismos

Co2 + H2O

Compostos menos

tóxicos

Legenda

M icrorganismos

53

caso, microrganismos autóctones e, no outro, cultura comercial com mistura

recomendada de nutrientes. Concluíram que, para algumas aplicações, a

bioestimulação de microrganismos autóctones é a melhor escolha, considerando o

custo e desempenho (MARIANO, 2006).

Parece que na maioria dos ambientes, microrganismos indígenas

degradantes são mais do que suficiente para realizar a biodegradação de petróleo,

se os níveis de nutrientes e outras condições ambientais adversas não limitá-los.

Outra forma de tratar solos contaminados com petróleo envolve o uso de

biorreatores, procedimento utilizado em larga escala recentemente. São diversos os

fatores que fortalecem esta convergência, que é diretamente relacionado com o

movimento restrito dos microrganismos no solo, que acelera biodegradação dos

contaminantes (REICHWALD, 2011).

Os biorreatores facilitam o controle do processo de biodegradação dos

poluentes no solo, facilitando a aclimatação da microbiota e seu desenvolvimento. O

emprego dos biorreatores vem surgindo como uma tecnologia viável e decisiva para

tratamento de solos contaminados com compostos orgânicos (URURAHY, 1998).

A utilização da técnica de biorremediação pode mostrar vantagens e

desvantagens, quando comparada a outras técnicas de limpeza. O método deve ser

criteriosamente estudado, antes de ser aplicado num determinado ambiente (ROSA,

2001). O sucesso total por tratamentos de biorremediação depende de inúmeros

fatores, tais como: característica do resíduo, presença de condições microbiológicas

ótimas, seleção correta da tecnologia de biorremediação, uso de métodos analíticos

apropriados para determinar o tipo e a extensão da contaminação e capacidade de

estabelecer e manter as condições que favorecem as taxas de biodegradação de

petróleo no ambiente (HUESEMANN, 1994; EPA, 2004; DAL FORNO, 2005).

54

CAPÍTULO IV - MATERIAIS E MÉTODOS

55

IV. 4.0 TRABALHOS DE ESCRITÓRIO

Para revisão literária do presente trabalho foram utilizados livros, trabalhos

monográficos, dissertações e teses desenvolvidas local e regionalmente, utilizando o

acervo da Biblioteca da Universidade Federal da Bahia (UFBA) e de outras

Universidades. Foram utilizados artigos de sítios governamentais e do Portal de

Periódicos da CAPES relacionados com o tema do trabalho. Foi realizado

levantamento bibliográfico sobre a região, sobre métodos de tratamento de amostras

em laboratório e referenciais teóricos sobre as temáticas a serem abordadas. Tais

pesquisas serviram de embasamento para todo o desenvolvimento do Projeto.

A fim de obter uma melhor compreensão em relação aos dados obtidos em

cada etapa analítica, foram elaboradas tabelas e gráficos com o auxílio do programa

Excel 2007. Por meio do programa Estatística versão 7.0, realizou-se a análise dos

Componentes Principais (PCA) das variáveis e dos casos envolvidos nos

experimentos. Foram realizadas análises descritivas das amostras e avaliou-se a

similaridade entre as amostras através do gráfico de Cluster.

Os resultados obtidos serviram para construção da Tese a fim de obter o

Doutoramento no Curso de Pós-Graduação em Geologia da UFBA, e serão

publicados/apresentados trabalhos contendo estes resultados em Revistas Técnicas

especializadas e, em Congressos e Reuniões Científicas.

IV. 4.1 TRABALHOS DE CAMPO

Os trabalhos de campo consistiram em: a) investigação da área de estudo,

com base na avaliação geoquímica do sedimento; b) montagem de três

experimentos:

i) o experimento 1 que consistiu na avaliação geoquímica das frações

(saturados, aromáticos e NSO) do óleo da Bacia do Recôncavo em

sedimentos e na investigação de fungos específicos, degradadores de

cada fração para obtenção de consórcios (Figura 12).

56

Figura 12 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 1 de biorremediação montado no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA

Fonte: a autora

ii) O experimento 2 consistiu na avaliação dos processos geoquímicos e da

eficiência desses consórcios fúngicos na degradação de dois tipos de

óleos (Bacia do Recôncavo e Bacia de Campos) em sedimentos de

manguezal em condições laboratoriais (Figura 13 e Quadro 1).

Figura 13 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 2 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA. Onde BR- bacia do Recôncavo; BC- bacia de Campos; AQ.- aquário

Fonte: a autora

57

Quadro 1 - Descrição dos tratamentos do Experimento 2 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA

Tratamentos Descrição dos tratamentos

AQ. 1 Sedimento esterilizado

AQ. 2 Sedimento esterilizado + Óleo da bacia do Recôncavo (BR)

AQ. 3 Sedimento esterilizado + Óleo da bacia de Campos (BC)

AQ. 4 Sedimento esterilizado + óleo BR + consórcio imobilizado tipo 1 (folha de vegetação de mangue como bioestimuladores)

AQ.5 Sedimento esterilizado + óleo BR + consórcio imobilizado tipo 1 (folha de vegetação de mangue como bioestimulador)

AQ.6 Sedimento esterilizado + óleo BR + consórcio imobilizado tipo 1 (folha de vegetação de mangue como bioestimulador)

AQ.7 Sedimento esterilizado + óleo BR + consórcio imobilizado tipo 2 (fibra de coco como bioestimulador)



AQ.10 Sedimento esterilizado + óleo BC + consórcio imobilizado tipo 1 (folha de vegetação de mangue como bioestimulador)



AQ.13 Sedimento esterilizado + óleo BC+ consórcio imobilizado tipo 2 (fibra de coco como bioestimulador)

AQ.14 Sedimento esterilizado + óleo BC + consórcio imobilizado tipo 2 (fibra de coco como bioestimulador)

AQ.15 Sedimento esterilizado + óleo BC + consórcio imobilizado tipo 2 (fibra de coco como bioestimulador)

iii) O experimento 3 consistiu na avaliação dos processos geoquímicos e da

eficiência dos consórcios fúngicos na degradação do óleo da bacia do

Recôncavo em sedimentos de manguezal confinados em protótipos de

biorreatores (Figura 14).

58

Figura 14 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 3 de biorremediação montado em biorreatores no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA

Fonte: a autora

No primeiro momento foi realizada a investigação da área (Figura 15). A área

de coleta pretendida deveria estar visivelmente isenta de qualquer indício de

hidrocarbonetos e foi selecionada com base em testes piloto realizados, tendo como

suporte para determinação: equipamentos de GPS (Sistema de Posicionamento

Global); mapas topográficos para localização da área na escala de 1:25.000 e

tábuas de marés. Os mapas que representam a área estudada no âmbito regional

ou local, foram confeccionados em programa Corel draw, em escala 1:25.000, e a

fotografia aérea na escala 1:8.000 foi georeferenciada.

Para essa investigação foram selecionados três pontos de coleta, onde foram

coletadas nove amostras aleatoriamente, sendo três amostras em cada ponto.

Figura 15 - Investigação da área de manguezal localizada nas margens do estuário do rio São Paulo: (a) Área de coleta (b) Coleta do sedimento

Fonte: a autora

(a) (b)

Experimento 3

Biorreator 1

Controle

Biorreator 2

(Consórcio Imobilizado)

Biorreator 3

(Consórcio Imobilizado)

59

Os sedimentos para montagem dos experimentos foram coletados em locais

de deposição lamosa, na parte do manguezal mais próxima às zonas marginais, em

locais geralmente inundáveis. As amostras foram coletadas com auxílio de um

testemunhador (QUEIROZ; OLIVEIRA, 2012), que consta de um tubo de aço

inoxidável de 10 cm de diâmetro e capacidade para coletar testemunhos de até 30

cm (Figura 16).

Figura 16 - Coleta do sedimento de manguezal do estuário do rio São Paulo para montagem dos experimentos de biorremediação

Fonte: a autora

IV. 4.1.2 Experimento 1 (Isolamento e seleção de microrganismos)

Montagem do experimento: O experimento 1 foi desenvolvido no Laboratório de

Simulação de processos de Biorremediação localizado nas proximidades da área de

amostragem (Figura 17), tendo como unidades de simulação quatro cubas de vidro

(aquários), cada uma contendo seis provetas. As provetas foram revestidas com

sacos de algodão para evitar grande incidência de luminosidade, e nelas foram

adicionados 10cm de testemunho do sedimento limpo (sedimento sem indício de

contaminação por hidrocarbonetos). As provetas foram inseridas nos aquários de

simulação, sustentadas por um suporte de madeira. Em cada aquário foi colocada

uma bomba de oxigenação.

Testemunhador

60

Figura 17 - Montagem do experimento 1 (parte 1) de biorremediação no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) unidades de simulação; (b) provetas vasadas revestidas com sacos de algodão sustentadas por suporte de madeira; (c) aquários com bomba de oxigenação e (d) bancada montada com as unidades de simulação

Fonte: a autora

Após inserir o sedimento nas provetas vasadas o mesmo foi contaminado

com as frações (saturados, aromáticos, NSO) do óleo da Bacia do Recôncavo, o

equivalente a aproximadamente 1% em peso do substrato. O fracionamento do óleo

foi uma das etapas iniciais para montagem desse experimento e foi feito através de

cromatografia líquida a vácuo, conforme descrito no Protocolo nº1, Apêndice A . As

frações foram primeiramente adicionadas a pequenas quantidades de sedimento

contidas em placas de Petri, e após a evaporação total do solvente, esse sedimento

foi colocado na parte superior da proveta já com 10 cm de sedimento, simulando um

“derrame” (Figura 18). A água para simular a maré chegou através de um sistema de

(a) (b)

(c) (d)

61

torneira bombeada diretamente do estuário do rio São Paulo. A simulação da maré

foi diária durante 30 dias, por 2 horas/dia.

Figura 18 - Montagem do experimento 1 (parte 2) de biorremediação no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) placas de Petri com sedimento contaminado com frações; (b e c) transferência do sedimento contaminado para as provetas e (d) unidades de simulação cheias, simulando a maré alta

Fonte: a autora

Monitoramento do experimento 1: Para o Experimento 1 foi realizado: 1)

Monitoramento Geoquímico que consiste de: a) extração da fração orgânica; b)

cromatografia gasosa e; c) cromatografia gasosa-espectrometria de massas. 2)

Monitoramento químico que consiste de: análise química para determinação dos

teores de nitrogênio Total e fósforo (P). 3) Monitoramento microbiológico que

consiste na: a) avaliação quantitativa de bactérias e fungos; b) isolamento de fungos

degradadores de petróleo; c) testes de seleção de fungos degradadores e

identificação. 4) Monitoramento dos parâmetros físico-químicos, que consiste: a)

análise de salinidade; b) oxigênio dissolvido, c) pH e d) temperatura. Os parâmetros

(a) (b)

(c) (d)

62

foram mensurados na água do estuário ao chegar no aquário, e após 2 horas de

simulação. 5) Toxicologia.

Coleta das amostras: As amostras de sedimento foram coletadas com 1 dia e após

30 dias de experimento (Quadro 2).

Quadro 2 - Análises realizadas ao longo do experimento 1 no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO) e no Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

Em cada intervalo de tempo foram retiradas 3 provetas com sedimentos.

Essas amostras foram homogeneizadas em um recipiente de inox e separadas em

frações para as determinações descritas no quadro 2 .

Intervalo de

Tempo

Análises realizadas no sedimento

1º dia

Compostos Inorgânicos (nitrogênio total

e fósforo); compostos orgânicos;

toxicologia e microbiologia (fungos e

bactérias).

30º dia

Compostos Inorgânicos (nitrogênio total

e fósforo); compostos orgânicos e

microbiologia (fungos e bactérias).

63

Figura 19 - Coleta das amostras de sedimento no experimento 1 de Biorremediação montado no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) suspensão do suporte com as provetas para coleta, (b) retirada das provetas, (c) homogeneização das amostras e (d) acondicionamento das amostras

Fonte: a autora

As amostras de sedimento foram acondicionadas em recipientes de vidro e as

amostras de água foram acondicionas em frascos do tipo âmbar devidamente

etiquetados (Figura 19d).

IV. 4.1.3 Experimento 2 (aplicação em condições laboratoriais)

Montagem: O experimento 2 foi desenvolvido no Laboratório de Estudos do

Petróleo do Instituto de Geociências tendo como unidades de simulação as cubas

de vidro (aquários). O sedimento foi homogeneizado, colocado nas provetas e

posteriormente foi esterilizado por 40 minutos em autoclave a 121ºC. As provetas

foram colocadas em um suporte de madeira e revestidas com sacos de algodão

para evitar grande incidência de luminosidade (Figura 20).

(a)

(c) (d)

(b)

64

Figura 20 - Montagem do Experimento 2 (fase 1) de biorremediação no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) sedimento homogeneizado sendo colocado nas provetas; (b) provetas com sedimento; (c) sedimento esterilizado e (d) proveta sendo revestida e colocadas no suporte de madeira

Fonte: a autora

Posteriormente nas provetas foram colocados os consórcios imobilizados

(cápsulas). Em cada proveta foram colocadas 10 cápsulas. A seguir foi simulado um

“derrame” na parte superior da proveta (já com sedimento e consórcio) com

aproximadamente 3% de óleo da Bacia de Recôncavo e com 3% de óleo da Bacia

de Campos em suas respectivas unidades de simulação. Todas as unidades de

simulação foram tampadas e lacradas com papel filme para evitar contaminação.

Todos os procedimentos de montagem foram realizados em capela de fluxo lâminar.

A água para simular a maré foi armazenada em galões de 20 litros. A água foi

esterilizada em autoclave a 121º C por 20 minutos. A simulação da maré foi diária

durante 2 horas. Em cada aquário foi colocado uma bomba de oxigenação (Figura

21).

(a) (b)

(c) (d)

65

Figura 21 - Montagem do Experimento 2 (fase 2) de biorremediação no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) inserção das cápsulas com consórcios imobilizados; (b) simulação do derrame com óleo; (c) inserindo os suportes com as provetas nos aquários; (d) inserindo a tampa no aquário; (e) aquário lacrado e (f) bancada montada

Fonte: a autora

Monitoramento das unidades de simulação: Para o experimento 2 foi realizado: 1)

Monitoramento geoquímico (vide experimento 1); 2) Monitoramento químico (vide

experimento 1); 3) Monitoramento microbiológico que consiste em: a) avaliação

quantitativa de bactérias e fungos; 4) monitoramento dos parâmetros físico-químicos

(vide experimento 1). Estas medidas foram diárias durante 3 meses. Os parâmetros

foram mensurados após 2 horas de simulação. Para simulação da maré (alta e

baixa) foi desenvolvido um sistema, onde os aquários foram alimentados com água

do estuário contida em galões. A simulação da “maré alta” consistiu na abertura das

torneiras contidas nos galões a uma pequena vazão. Após chegar ao limite da

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

66

unidade de simulação, as bombas de oxigenação foram ligadas durante duas horas.

Posteriormente foi simulada a “maré baixa” que consistiu na abertura das torneiras a

uma pequena vazão, devolvendo a água para o galão (Figura 22).

Figura 22 - Sistema desenvolvido para simulação da maré no experimento 2 de biorremediação no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) sistema com galões alimentando os aquários, simulando a maré alta; (b) simulação da descida da maré

Fonte: a autora

Coleta das amostras: As amostras de sedimento e água foram coletadas com

intervalo de 1, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias (quadro 3).

(a) (b)

67

Quadro 3 - Análises realizadas ao longo do experimento 2 no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO) e no Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

Em cada intervalo de tempo foram retiradas 3 provetas com sedimentos.

Essas amostras foram homogeneizadas em recipientes (tipo “quentinhas” de

alumínio) e separadas em frações, para as determinações descritas no Quadro 3. As

amostras de sedimento foram acondicionadas em recipientes de vidro e as amostras

de água foram acondicionas em frascos de polietileno do tipo âmbar devidamente

etiquetados (Figura 23).

Intervalo de

tempo

Análises realizadas no

Sedimento

1º dia

Compostos inorgânicos (nitrogênio total, fósforo,

metais e carbono orgânico); compostos

orgânicos; e microbiologia (fungos e bactérias).

8º dia Compostos inorgânicos (nitrogênio total,

fósforo); compostos orgânicos.

15º dia Compostos Inorgânicos (nitrogênio total,


30º dia

Compostos inorgânicos (nitrogênio total,

fósforo); compostos orgânicos; e microbiologia

(fungos e bactérias).



60º dia

Compostos inorgânicos (nitrogênio total fósforo);

compostos orgânicos; e microbiologia (fungos e

bactérias).



90º dia

Compostos inorgânicos (nitrogênio total fósforo);

compostos orgânicos; granulometria; e

microbiologia (fungos e bactérias).

68

Figura 23 - Coleta das amostras de sedimento no experimento 2 de Biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador -BA: (a) aquários na capela de fluxo laminar; (b) retirada das provetas; (c) homogeneização das amostras e (d) acondicionamento das amostras

Fonte: a autora

IV. 4.1.4 Experimento 3 (Biorreatores)

Montagem do experimento: Foram construídos protótipos de biorreatores de

imersão temporária, utilizando frascos de vidro, filtros de ar e interligados por tubos

flexíveis (Figura 24). Foi colocado em cada frasco 500g de sedimento + 3% do óleo

da bacia do Recôncavo + consórcio fúngicos imobilizado 1. Maiores detalhes sobre o

protótipo de biorreatores construído foram preservados e brevemente serão

publicados em forma de patente.

(a) (b)

(c) (d)

69

Figura 24 - Esquema do protótipo de biorreator de imersão temporária desenvolvido para o experimento 3 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA

Fonte: a autora

Foram utilizados dois biorreatores para incubação dos fungos estudados e um

biorreator como controle sem fungos (Figura 25 e 26).

Figura 25 - Esquema do protótipo de biorreator de imersão temporária desenvolvido para o experimento 3 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA

Fonte: a autora

70

Figura 26 - Montagem do Experimento 3 de biorremediação montado em biorreatores no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA: (a) biorreatores com água do estuário e com sedimento esterilizado; (b) cápsulas com consórcios imobilizados; (c) simulando o derrame com óleo; (d) vista superior do biorreator e (e) protótipo montado

Fonte: a autora

Simulação do experimento: a simulação da maré nos protótipos de biorreator foi

realizada semanalmente (Figura 27).

(a) (b)

(c) (d)

(e)

71

Figura 27 – Fotografia do protótipo de biorreator de imersão temporária: (a) biorreator na fase de maré alta e (b) biorreator na fase de maré baixa.

Fonte: a autora

Retirada de amostras: As amostras de sedimento foram coletadas nos intervalo de

30, 60 e 90 dias. Em cada coleta foram retiradas 100g de sedimento. Essa amostra

foi homogeneizada em um recipiente de inox e separada em frações para

determinações dos seguintes analitos: granulometria (Figura 28), compostos

orgânicos, compostos inorgânicos, contagem de fungos e bactérias (Quadro 4).

Figura 28 - Coleta das amostras para determinações analíticas no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

Fonte: a autora

(a) (b)

72

Quadro 4 - Análises realizadas ao longo do Experimento 3 no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

Monitoramento dos biorreatores: Para o experimento 3 foi realizado: 1)

Monitoramento geoquímico (vide experimento 1); 2) Monitoramento químico (vide

experimento 1); e 3) Monitoramento microbiológico (vide experimento 2).

Intervalo de

Tempo

Análises realizadas no

Sedimento

1º dia Compostos Inorgânicos (nitrogênio total,

fósforo); compostos orgânicos; microbiologia


30º dia Compostos Inorgânicos (nitrogênio total e

fósforo,); compostos orgânicos; microbiologia








73

IV. 4.2 TRABALHOS DE LABORATÓRIO

As amostras de sedimento foram encaminhadas para o Laboratório de

Estudos de Petróleo (LEPETRO) do Núcleo de Estudos Ambientais (NEA) do

Instituto de Geociências (IGEO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) e

laboratórios específicos para análises de: Toxicologia (Laboratório de Cultivo e

Ecotoxicologia (LACE) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e

Microbiologia (Laboratório de Química dos Microrganismos (LBQM) do Instituto de

Química (IQ) da Universidade Federal da Bahia (UFBA). Essas análises foram

realizadas no contexto dos Experimentos 1, 2 e 3.

IV. 4.2.1 Investigação da área

Nas amostras coletadas para investigação da área foram realizadas análises

físicas e geoquímicas (Quadro 5 e 6).

Quadro 5 – Análises físicas realizadas na investigação da área no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)

Procedimento Metodologia

Granulometria

Foi utilizado um analisador de partículas com difração a Laser Modelo Cilas

1064 e a classificação foi feita segundo Folk e Ward (1957), usando software

estatístico

Liofilização

As amostras foram liofilizadas em um Liofilizador L101 da marca LIOTOP

com a finalidade de retirar toda umidade

74

Quadro 6 - Análises geoquímicas realizadas na investigação da área no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)


Determinação de fósforo em sedimento Foi utilizado método de Grasshoff (2009), com algumas

adaptações.

Determinação de nitrogênio total em sedimento Foi determinado de acordo com Método de Kjeldahl por via

úmida (EMBRAPA, 1989).

Determinação de matéria organica Foi determinado pelo método do dicromato (WALKEY-BLACK,

2009).

Determinação do perfil cromatográfico do

extrato total, mediante GC/FID

Foi determinado pela metodologia adaptada da indústria do

petróleo conhecida como “whole oil” ou fingerprint, usando

cromatografia gasosa com detector de ionização de chama. A

análise tem sido validada no LEPETRO/UFBA, usando uma

coluna capilar DB1-MS, de 15m*0,25mm*0,25μm. O gás de

arrastre é o He, com uma taxa de aquecimento de 10ºC/min

desde 40ºC até 300ºC, no modo splitless e volume de injeção

de 2μL. A temperatura do injetor é de 250ºC.

Extração sólido/líquido, tipo soxhlet

Foi determinada pela metodologia adaptada da indústria do

petróleo e validada no LEPETRO/UFBA. Trata-se de um

sistema tipo soxhlet com capacidade de até 25g de amostra,

usando no máximo 80mL de solvente extrator. O tempo da

análise vai depender da quantidade de material solúvel,

presente na amostra.

IV. 4.2.2 Experimento 1 (Isolamento e seleção dos microrganismos)

Nas amostras coletadas no experimento 1 foram realizadas análises físicas,

microbiológicas e geoquímicas (Quadro 7, 8, 9 e 10).

Quadro 7 - Análises físicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)


Granulometria Vide Quadro 5.

Liofilização Vide Quadro 5.

Desagregação e peneiramento Macerada, desagregada e peneirada em malha de 2mm.

75

Quadro 8 - Análises geoquímicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)


Determinação de fósforo em sedimento Vide Quadro 6.

Determinação de nitrogênio total em sedimento Vide Quadro 6.

Determinação de matéria organica Vide Quadro 6.

Fracionamento do óleo Vide protocolo nº 1 e 2 (Apêndice A).

Determinação de Hidrocarbonetos Saturados e

Aromáticos e compostos NSO (Resinas +

Asfaltenos) em sedimento, mediante

cromatografia líquida em coluna aberta

Foi detreminada pela metodologia adaptada da indústria do

petróleo e validada no LEPETRO/UFBA, no qual se usa sílica

como fase estacionária, e como fase móvel: n-hexano para

eluir os hidrocarbonetos saturados; mistura 4:1 n-

hexano:diclorometano, para os hidrocarbonetos aromáticos e,

mistura 4:1 de diclorometano:metanol, para os compostos

NOS

Determinação do perfil de n-parafinas de nC8 até

nC40 e isoprenóides (pristano e fitano), mediante

GC/FID

Vide Quadro 6.

Extração sólido/líquido, tipo soxhlet Vide Quadro 6.

Quadro 9 - Análises biológicas realizadas no experimento 1 no Laboratório Ao Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)


Toxicologia

Testes de toxicidade letal e sub-letal serão empregados

usando o copépodo Tisbe biminiensis

76

Quadro 10 - Análises microbiológicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) e Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA)


Contagem de bactérias

A contagem foi baseada na metodologia de microgotas

(DA SILVA, 2011).

Contagem e isolamento de fungos

A metodologia para contagem e isolamento dos fungos

filamentosos foi através da técnica de diluição e

revestimento (GERBA; PEPPER, 2004).

Seleção de fungos degradadores

A metodologia utilizada para selecionar os fungos foi a da

técnica que consiste na utilização do indicador redox 2,6

diclorofenol-indofenol (DCPIP). Vide protocolo nº 3 e 4

(Apêndice A).

Teste de antagonismo

A metodologia consiste em colocar os fungos isolados

para crescerem juntos e observar sua ecologia. Vide

protocolo nº 11 (Apêndice A).

Formação de consórcios fúngicos

Os consórcios foram formados a partir da junção dos

principais degradadores de saturados, aromáticos e

NSO. Vide protocolo nº 6 (Apêndice A).

Contagem de esporos

Método quantitativo realizado com auxilio de uma

Câmara de Neubauer. Vide protocolo nº 10 (Apêndice A).

Crescimento radial

Metodologia baseada no acompanhamento do

crescimento do fungo através da velocidade de

crescimento radial. Vide protocolo nº 5 (Apêndice A).

Imobilização de fungos

A imobilização dos fungos foi realizada com auxilio de

polimeros naturais.

Microcultivo

Foi realizado pela técnica de Ridell (1950). Vide protocolo

nº 9 (Apêndice A).

IV. 4.2.3 Experimento 2 (aplicação em condições laboratoriais)

Nas amostras coletadas no experimento 2 foram realizadas análises físicas,

microbiológicas e geoquímicas (vide o quadro 5, 6, 8 e 10).

IV. 4.2.4 Experimento 3 (Biorreatores)

As determinações e análises realizadas no experimento 3 seguiram as

mesmas metodologias desenvolvidas no experimento 2 e 3. Foram realizadas

análises físicas, microbiológicas e geoquímicas (Quadros 5, 6 e 8).

77

CAPÍTULO V - RESULTADOS E

DISCUSSÕES

78

V. 5.0. ANÁLISES DAS AMOSTRAS PARA INVESTIGAÇÃO DA ÁREA DE

AMOSTRAGEM

Para comprovar que o sedimento da área de amostragem selecionada estava

isento de hidrocarbonetos de petróleo e que apresentava condições ambientais

favoráveis para o desenvolvimento dos experimentos de biorremediação, foram

coletadas três amostras de sedimento (Vide pag. 55), para os quais foram obtidos

resultados de análises geoquímicas, químicas e físicas.

Os resultados geoquímicos (cromatografia) para as três amostras coletadas

se encontram ilustrados na Figura 29. Os extratos obtidos após extração por soxhlet

foram analisados por CG/FID.

Através da observação de perfis cromatográficos é possível identificar

hidrocarbonetos em amostras de óleo bruto, de óleo biodegradável, amostras

ambientais, como sedimentos, com diferentes concentrações, composições e

natureza. Os compostos analisados incluem alcanos normais (nC8-nC40),

isoprenóides, HPAs (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos) e os seus homólogos

alquilados, e biomarcadores triterpanos e esteranos (WANG et al., 1995).

Inicialmente foi injetada uma solução padrão de hidrocarbonetos, com

concentração de 2 μL/L, que consiste dos compostos C8 até C40 (Figura 29a). A

partir dos tempos de retenção fornecidos pelo padrão e dos espectros de massa

característicos dos hidrocarbonetos, foi possível identificar a ausência dos

compostos nas amostras.

Os três perfis cromatográficos (Figuras 29b, c e d) das amostras coletadas no

ponto 1, 2 e 3 demonstram, portanto, que o sedimento analisado possivelmente se

encontra limpo, onde se pode observar a ausência dos n-alcanos de baixo, médio e

alta massa molecular, quando comparados com o perfil do cromatograma padrão

(Figura 29a). Contudo, os picos que podem ser visualizados nos cromatogramas

correspondem aos picos do solvente.

79

Figura 29 - Cromatogramas das amostras coletadas no ponto 1, 2 e 3 do manguezal do estuário do rio São Paulo

Quadro verde corresponde aos picos dos solventes

Os resultados das análises químicas e físicas mostraram que os parâmetros

não limitariam as atividades de degradação em experimentos de biorremediação

(ATLAS, 1989; LIMA, 2010). Os valores dos parâmetros do sedimento obtidos foram

os seguintes:

Granulometria – Areia grossa: 7,9%; Areia média: 20,2%, Areia fina:

21,1%; Areia muito fina: 18,2%; Silte: 27,9%; Argila: 4,3%

nitrogênio total – 0,10%

fósforo – 63,0 mg/kg

(COT) carbono orgânico total - 1,57%

Padrão

Ponto 1

Ponto 2

Ponto 3

5 10 15 20 25 30 35 Minutes -74 0

100 200 300 400 500 600 700

mVolts

5 10 15 20 25 30 35 Minutes -78 0

100 200 300 400 500 600 700 800

mVolts

5 10 15 20 25 30 35 Minutes 0

100 200 300 400 500 600 700

mVolt

s

Tempo (mim)

5

10

15

20

25

30

35 Minutes

- 13

0

25

50

75

100

125

Tempo (mim)

mVolts c8 – c40

In

tensid

ade

Inte

nsid

ade

Intensid

ade

Tempo (mim)

Tempo (mim)

In

tensid

ade

80

pH - 7,17

total fungos - 1,85 x 105 ufc/mL

total de bactérias – 0,3 x 105 ufc/mL

Segundo Muteca (2012), teor de nutrientes, concentração de oxigênio,

temperatura, pH, teor de umidade, concentração e composição dos contaminantes,

dentre outros podem limitar a atividade microbiana durante o processo de

biorremediação. A etapa de caracterização do sedimento e ajuste dos parâmetros

mencionados é essencial para que o processo de biorremediação escolhido e a

técnica como um todo sejam executados com sucesso (MROZIK; SEGET, 2009).

V. 5.1. ANÁLISES DAS FRAÇÕES DOS ÓLEOS (BACIA DO RECÔNCAVO E BACIA DE CAMPOS)

Para o desenvolvimento dos experimentos de biorremediação foi realizado o

fracionamento de dois tipos de óleo, o óleo da bacia do Recôncavo e o óleo da bacia

de Campos, através do método de cromatografia a vácuo (LIMA et al., 2012). Os

resultados das amostras dos óleos e dos extratos obtidos após o fracionamento

foram analisados por CG/FID (cromatografia gasosa com detector de ionização de

chama), nas mesmas condições descritas no item análises das amostras para

investigação da área. .

Os perfis cromatográficos do óleo da bacia do Recôncavo e das frações

obtidas após o fracionamento, podem ser observados nos cromatogramas da Figura

30. O óleo da bacia de Recôncavo, Figura 30a, possui uma distribuição bimodal das

n-parafinas, que pode ser visualizada nos tempos de retenção entre 8 e 30 minutos,

com maiores abundâncias nos picos (nC14-nC17) e (nC24-nC27). Segundo Ganglione e

Trindade (1988) o óleo da bacia do Recôncavo é classificado como óleo leve (°API

superior a 29,5), do tipo parafínico (>presença de n-alcanos), com baixa proporção

de compostos NSO.

Observando-se as Figuras 30b, 30c e 30d, nota-se que os perfis

cromatográficos são distintos entre si, comprovando que cada fração possui um

perfil característico e diferenciado.

81

Figura 30 – Cromatogramas do fracionamento do óleo da bacia do Recôncavo: (a) perfil do óleo da Bacia do Recôncavo (BR); (b) perfil da fração de saturados do óleo BR; (c) perfil da fração de aromáticos do óleo BR e (d) perfil da fração de NSO do óleo BR (condições de análise vide apêndice A)

(a)

(b)

(c)

(d)

Analisando a Figura 30b pode-se perceber o perfil de um cromatograma típico

de hidrocarbonetos saturados (nC8-nC40), contendo hidrocarbonetos alifáticos

distribuídos ao longo do cromatograma de forma linear. Já a Figura 30b, apresenta o

mVolts

mVolts

mVolts

mVolts

Óleo BR

Saturados BR

Aromáticos BR

NSO BR

Tempo (mim)

Tempo (mim)

Tempo (mim)

Tempo (mim)

In

tensid

ade

Inte

nsid

ade

Inte

nsid

ade

Inte

nsid

ade

82

perfil de um cromatograma de hidrocarbonetos aromáticos, percebe-se uma

distribuição não linear e a presença de UCM, com ápice no tempo de retenção a

partir de 12 minutos. Nesse caso, além dos compostos alifáticos, têm-se uma região

de gaussiana com grande quantidade de compostos cíclicos, que podem ser

identificados a partir do espectro de massas.

Segundo Ventura (2008) em óleos, mais de 250.000 compostos não são

identificados pela cromatografia (conhecido como UCM), que indica uma enorme

quantidade de informações geoquímicas não exploradas.

No cromatograma da Figura 30c não há uma região onde se perceba

exclusivamente a eluição de compostos cíclicos. Entretanto, percebe-se que os

componentes são hidrocarbonetos mais pesados. O perfil da Figura 30d, expressa o

cromatograma dos compostos polares (NSO), que podem ser visualizados a partir

dos 16 minutos, do tempo de retenção. Essa é a fração que possui compostos mais

pesados, fato que pode ser justificado devido ao seu alto intervalo de ponto de

ebulição (450-500ºC). Assim, a GC/FID não foi suficiente para fazer uma

caracterização mais detalhada de seus constituintes.

Os perfis cromatográficos do óleo da bacia de Campos e as frações obtidas

após o fracionamento, podem ser observado no cromatograma da Figura 31. O óleo

da bacia de Campos é classificado como um óleo do tipo médio (°API < 29) com

grande quantidade de hidrocarbonetos aromáticos e compostos NSO.

O óleo da bacia de Campos (Figura 31a) possui uma distribuição bimodal das

n-parafinas, com maiores abundâncias nos picos (nC13-nC17) que podem ser

visualizados entre 3 e 28 minutos do tempo de retenção. Observando-se as Figuras

31b, 31c e 31d, nota-se a distinção entre os perfis cromatográficos. Isso comprova

que cada fração possui um perfil característico e diferenciado. Analisando-se a

Figura 31a pode-se perceber o perfil de um cromatograma típico dos

hidrocarbonetos saturados (nC8-nC40), contendo hidrocarbonetos alifáticos

distribuídos ao longo do cromatograma (entre 5 e 28 minutos do tempo de retenção).

Já na Figura 30b, perfil de um cromatograma de hidrocarbonetos aromáticos,

percebe-se uma UCM com ápice no tempo de retenção a partir de 10 minutos. Nos

cromatogramas 31c e 31d percebe-se que os componentes são hidrocarbonetos

mais pesados, caracterizados por não apresentarem uma distribuição linear.

83

Figura 31 – Cromatogramas do fracionamento do óleo da bacia de Campos: (a) perfil do óleo da bacia de Campos (BC); (b) perfil da fração de saturados do óleo BC; (c) perfil da fração de aromáticos do óleo BC e (d) perfil da fração de NSO do óleo BC. (condições de análise vide apêndice A)

(a)

(b)

(c)

(d)

Ponto 3

mVolts

mVolts

mVolts

mVolts

Óleo BC

Tempo (mim)

Tempo (mim)

Tempo (mim)

Tempo (mim)

Saturados BC

Aromáticos BC

NSO BC

In

tensid

ade

Inte

nsid

ade

Inte

nsid

ade

Inte

nsid

ade

84

V. 5.2. EXPERIMENTO 1 - ISOLAMENTO E SELEÇÃO DOS MICRORGANISMOS

Para obtenção de microrganismos degradadores do petróleo o sedimento

utilizado no experimento 1 foi contaminado com as frações (saturados, aromáticos e

NSO) do óleo da bacia do Recôncavo (condições experimentais vide pag. 57). Para

o experimento 1 foram obtidos resultados diferenciados em relação ao

monitoramento geoquímico, físico-químico, químico e microbiológico nos tempos 0 e

30 dias.

V. 5.2.1. Monitoramento geoquímico

Na Figura 32 pode-se observar os perfis cromatográficos dos extratos de

amostras de sedimento das unidades de simulação Controle (REF01), contaminados

com fração de saturados (SAT02), aromáticos (ARO03) e NSO (NSO04), coletadas

no tempo 0 e com 30 dias de experimento. A Figura 32a corresponde ao perfil da

amostra controle (referência), correspondente ao perfil da matéria orgânica natural

encontrada no sedimento de manguezal. Na Figura 32b é possível observar o perfil

de um cromatograma típico de hidrocarbonetos saturados (nC8 - nC40). Ao longo de

30 dias, os compostos saturados diminuíram. Isso não pode ser observado nos

demais cromatogramas, por se tratar de frações mais complexas, onde a

degradação provavelmente foi mais lenta (Figura 32c e 32d). A diminuição dos

compostos saturados pode ser observada através da altura dos picos (Figura 32b) e

não está necessariamente associada ao processo de biodegradação, já que esses

compostos são leves, tendo uma cadeia molecular linear e fácil de quebrar (ATLAS,

1981). Essa diminuição pode também estar associada aos processos intempéricos

(mudança de temperatura, evaporação etc.).

Os resultados são apresentados em cromatogramas onde se observa a

distribuição das parafinas e outros compostos (Figura 32 b, c e d). Geralmente os

cromatogramas apresentam picos predominantes, representando as cadeias

lineares, e picos menores, relacionados às cadeias ramificadas, cíclicas e

compostos aromáticos e compostos NSO (GROB; GROB,1981; AQUINO NETO;

NUNES, 2003), o que pode ser visualizado nos cromatogramas b, c e d. Contudo,

através da análise de cromatogramas pode-se inferir o nível de degradação dos

85

compostos encontrados em áreas impactadas por petróleo e seus derivados

(AQUINO NETO; NUNES, 2003).

Figura 32 - Cromatogramas dos extratos das unidades de simulação no tempo 0 e no tempo 30: (a) Controle (REF01); (b) saturados(SAT); (c) Aromáticos (ARO03) e (d) NSO (NSO04). Frações do óleo da bacia do Recôncavo

TEMPO 0 TEMPO 30

REF 01

SAT 02

ARO 03

NSO 04

Intensid

ade

(a)

(b)

(c)

(d)

Intensid

ade

Intensid

ade

Intensid

ade

Intensid

ade

Intensid

ade

Intensid

ade

Intensid

ade

Tempo (mim) Tempo (mim)




86

V. 5.2.2. Monitoramento físico-químico e químico

As transformações microbianas, os caminhos dos produtos de biodegradação

e a persistência dos compostos dependem principalmente dos fatores físico-

químicos do ambiente onde os microrganismos se encontram, provocando grande

impacto na população (SUTHERSAN, 1998). As características físico-químicas

determinam a acessibilidade dos compostos pelos microrganismos (LIMA et al.,

2011).

Durante o experimento 1 os valores para temperatura da água, mensurados

nas unidades de simulação, variaram entre 26,2 e 28,7ºC (Tabela 1). Na Tabela 1

pode-se observar que no T30 houve um aumento da temperatura, o que não

interfere no crescimento dos microrganismos e consequentemente na

biodegradação (ATLAS, 1981). Koning (2002) relata que temperaturas mais altas, a

princípio, são as mais vantajosas para o processo de degradação, já que a

solubilidade dos contaminantes e a biodisponibilidade dos compostos orgânicos

aumentam, facilitando o processo de degradação.

Autores relatam que com o aumento da temperatura há o aumento do

metabolismo microbiano e que a atividade enzimática apresenta um melhor

metabolismo para os hidrocarbonetos a uma temperatura máxima de 30-40ºC

(BOSSERT; BARTHA, 1984; LEAHY; COLWELL, 1990).

Tabela 1 - Tabela com a indicação dos valores de temperatura (Temp.), pH, oxigênio dissolvido (O.D.), salinidade (SAL.) e EH ao longo do experimento 1 mensurados nas unidades de simulação (REF01, SAT02, ARO02 e NSO04) no tempo 0 (T0) e após 30 dias (T30)

Os valores de pH apresentam-se compatíveis para águas estuarinas,

variando entre 6,83 e 7,64 (Tabela 1). A maior parte dos microrganismos toleram

valores de pH na faixa de 5 a 9, e preferencialmente funciona na faixa de 6,5 a 7,5

T0

T30

T0

T30

T0

T30

T0

T30

T0

T30 Unidades de simulação TEMP.(°C) TEMP.(°C) pH pH O.D.(%) O.D.(%) SAL. SAL. EH (mV) EH (mV)

REF 01 26,2 28,2 7,17 6,83 92 82 36 39 25,3 28,7

SAT 02 26,2 28,2 7,47 7,23 96 99 36 39 32,6 26,4

ARO 03 26,7 28,7 7,64 7,39 85 98 37 39 44 29,9

NSO 04 26,4 28,4 7,05 7,35 83 100 37 38 37,9 34,2

87

(SINGH, 2006). Os valores encontrados para o pH no experimento 1, portanto,

estiveram dentro dos padrões de tolerância para o crescimento dos microrganismos.

Segundo Vallejo et al. (2005) a maioria dos microrganismos desenvolve-se

melhor com pH 7,0, por isso a importância do ajuste e a manutenção desse

parâmetro durante o processo de biorremediação.

O potencial redox (EH) mede o estado de oxidação controlando a direção do

equilíbrio químico e consequentemente a redução ou oxidação do contaminante.

Este, por sua vez controla os compostos que o contaminante pode formar e a

relativa solubilidade destes no meio ambiente (HAZEN, 2010). Os valores de EH

apresentam condições oxidante, variando entre 25,3 e 44 mV (Tabela 1). O potencial

redox é condição limitante para aceleração do processo de biodegradação, o que

limita a atividade metabólica microbiana influenciando a sua atividade enzimática

(SUTHERSAN, 1999). Segundo ERD (1998), valores positivos de EH indicam

condições ótimas para a biodegradação de compostos orgânicos.

Os valores para salinidade variaram entre 36 e 39 (Tabela 1). A salinidade se

comportou de forma adequada para o desenvolvimento dos microrganismos típicos

do manguezal segundo Singh (2006); Lima (2010). A presença de sais pode retardar

ou inibir a biodegradação. Existem microrganismos, como os fungos, que se

adaptam a condições de alta salinidade, sendo fundamental a acessibilidade dos

contaminantes para os microrganismos (SINGH, 2006).

Outro fator determinante e limitante do metabolismo microbiano é a falta de

oxigênio. Nas reações de biorremediação a depleção do o oxigênio dissolvido (O.D.)

é um fator impeditivo e fator decisivo para iniciar e sustentar a biodegradação

(CHAYABUTRA; JU, 2000).

O O.D. ao longo do experimento variou entre 82% e 100% (Tabela 1). A

utilização da bomba de oxigenação teve como principal objetivo aerar e acelerar o

processo de biodegradação. A disponibilidade de oxigênio é crucial para a

biorremediação rápida, a biodegradação de hidrocarbonetos é essencialmente um

processo aeróbio sendo a limitação de oxigênio um problema potencial em um

ambiente (ZHU et al., 2004).

Todos os parâmetros físico–químicos se encontraram dentro dos padrões

necessários para o crescimento microbiano.

Dibble e Bartha (1972) indicam que concentrações de nitrogênio e fósforo

severamente limitam a extensão da degradação de hidrocarbonetos e que a adição

88

de nitrogênio e fósforo pode ser usada para estimular degradação microbiana de

hidrocarbonetos.

Segundo Vallejo et al. (2005) podem ser encontrados valores baixos de

fósforo ao longo do experimento pelo fato dos microrganismos o consumirem

rapidamente no inicio da biodegradação. Esse fato pode ser observado nesse

experimento nas unidades de simulação ARO03 e NSO04. Nas unidades de

simulação REF01 e SAT02 pode ser observado um aumento na concentração de

fósforo. Os valores de fósforo variaram de 59,30 (mínimo) e 138,58 (máximo) mg/kg

(Figura 33).

Figura 33 - Gráfico com variação dos teores de fósforo nas unidades de simulação no 1º e 30º dia de experimento

Os valores de nitrogênio total variaram de 0,08% (mínimo) e 0,12% (máximo).

Na Figura 34 pode ser observado um aumento desse nutriente após 30 dias de

experimento.

Figura 34 - Gráfico com variação dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação no 1º e 30º dia de experimento

89

O carbono orgânico (C.O.) constitui o elemento fundamental da matéria

orgânica (M.O.) dos solos, uma vez que essa M.O. é composta por cerca de 60% de

C.O., enquanto os demais elementos perfazem o restante. Quando uma molécula do

óleo chega ao solo, ela pode sofrer os processos de degradação e sorção, e os

resultados desses dois processos podem ser: a absorção da molécula pelas plantas,

a lixiviação da molécula para camadas subsuperficiais do solo (SILVA, 2009).

Em todas as unidades de simulação ocorreu uma diminuição de CO% após 30

dias de experimento (Figura 35). As concentrações em % variaram entre 1,23

(mínimo) e 1,57 (máximo).

Figura 35 - Gráfico com variação dos teores de CO% nas unidades de simulação no 1º e 30º día de experimento

Com a finalidade de analisar a integração dos dados obtidos com o

monitoramento físico-químico e químico, foi realizado tratamento estatístico

utilizando a análise de componentes principais (ACP), como ferramenta.

A análise de componentes principais (ACP) das variáveis fósforo, nitrogênio,

matéria orgânica, temperatura, pH, Eh (mV), salinidade e O.D. em amostras de

sedimento controle (REF 01), contaminados com fração de saturados (SAT 02),

contaminados com fração de aromáticos (ARO 03) e contaminados com NSO (NSO

04) e nos diferentes intervalos de tempo (casos) pode ser explicada pelas duas

primeiras componentes (PC1 e PC2) de acordo com suas composições elementares.

Juntas explicaram 88,15% de variância acumuladas dos dados (Figuras 36a e

36b).

Nessa análise, como o conjunto de dados contém oito variáveis, cada

amostra pode ser imaginada, em termos geométricos, como um ponto localizado

90

num sistema de oito dimensões. Em PC1 (com 57, 16% de variância), as amostras

NT0, NT30, MT0, MT30, PT30, O.D.T0, SAL.T0 e SAL.T30 tendem a localizarem-se

mais à direita do gráfico dos escores, e as amostras EhT0, EhT30, O.D.T30, PT0,

pHT0, pHT30, TEMP.T0 e TEMP.T30 tendem a se localizar mais a esquerda do

gráfico, mostrando que estas estão correlacionadas negativamente. Analogamente

(PC2 com 30,99% de variância), as amostra pHT30,O.D.T30, EhT30, NT0 e NT30

tende a localizar-se na parte superior, enquanto que as demais amostras tendem a

se localizarem na parte inferior. As principais variáveis que explicam a PC1 são:

nitrogênio (NT0 e NT30), matéria orgânica (MT30 e MT0), fósforo (PT30) e oxigênio

dissolvido (O.D. T0). Essa distribuição espacial das variáveis nos eixos da PC 1

versos a PC 2, pode ser melhor visualizada no gráfico de pesos representado na

Figura 36a, a seguir.

Figura 36 - Análise dos Componentes Principais (ACP). Onde: (a) – Variáveis: fósforo, nitrogênio,

matéria orgânica, temperatura, pH, Eh (mV), salinidade e O.D. aos tempos amostrais T0 e T30 e (b) – Casos - amostras de sedimento controle (REF 01), contaminados com fração de saturados (SAT 02), contaminados com fração de aromáticos (ARO 03) e contaminados com NSO (NSO 04). Círculos verdes correspondem as principais variáveis que explicam o PC1

Examinado a Figura 36b que representa o gráfico da PC 1 versos PC 2, pode-

se observar que as amostras foram separadas em três grupos distintos de acordo as

variáveis características de cada unidade de simulação analisada. A primeira

componente (57,16% da informação), pode ser interpretada como um contraste

entre, de um lado, REF01 e SAT02, e, em menor grau, ARO03 e NSO04. REF01 e

SAT02 têm pesos positivos, sendo influenciadas pelas variáveis: NT0, NT30, MT30,

MT0, PT30 e O.D. T0. As unidades de simulação ARO03 e NSO04, apresentaram

MT0

MT30

NT0

NT30

PT0

PT30

TEMP. T0 TEMP.T30

pH T0

pH T30

O.D. T0

O.D. T30

SAL.T0 SAL.T30

Eh (mV) T0

Eh (mV) T30

-1 -0.5 0 0.5 1

PC1 : 57,16%

-1

-0.5

0

0.5

1

PC

2 :

30

,99

%

REF 01

SAT 02

ARO 03

NSO 04

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6

PC1: 57,16%

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

PC

2:

30

,99

%

(a) (b)

1

2

3

91

pesos negativos, uma vez que a unidade ARO03 sofreu influência principalmente da

temperatura no tempo 0 e 30, pelo fósforo no tempo 0 e pelo EH no tempo 0.

Enquanto que a unidade de simulação NSO04 parece ser influenciada pelo EH no

tempo 30. Da mesma forma, a localização do ARO03 e NSO04 no quadrante oposto

de REF01 e SAT02, indica correlações negativas.

V. 5.2.3. Monitoramento biológico

A fim de avaliar a toxicidade das frações do óleo da bacia do Recôncavo, que

foram utilizadas para contaminar sedimentos empregados no experimento 1,

realizaram-se ensaios com o copépodo Tisbe biminiensis.

Os dados de fecundidade total das fêmeas de Tisbe biminiensis, alcançados a

partir da contagem de indivíduos produzidos, estão ilustrados na Figura 37a. No

experimento, a fecundidade apresentou as médias dos tratamentos SAT02, ARO03,

NSO04, inferiores ao controle, mas não foram diferenças estatisticamente

significativas (Figura 37a).

Os dados do bioensaio com o copépodo T. biminiensis no experimento

indicam que a sobrevivência (efeito letal) não variou significativamente entre os

pontos amostrados. As fêmeas expostas aos sedimentos que receberam as frações

do petróleo não exibiram diferenças significativas na sobrevivência no primeiro dia

após o início do experimento (Figura 37b). Segundo a ISO 14669 (1999), nos testes

de toxicidade aguda com copépodos, uma queda na sobrevivência de no máximo

20% no controle é considerada normal, fato que pode ser observado no presente

experimento onde a diferença alcança 2% (Figura 37).

De acordo com os dados obtidos no experimento 1, a quantidade (cerca de

1%) de fração utilizada para contaminar o sedimento, não propiciou efeito letal.

As comunidades bentônicas se mostram afetadas quando expostas a grandes

taxas de poluentes. No entanto, esses tipos de estudo são muito dispendiosos e

demandam muito tempo (NASCIMENTO et al., 1998). Contudo, o uso de espécies

sensíveis, em testes com amostras de substrato, é um fator de avaliação relevante,

o qual pode fornecer informações mais favoráveis (U.S. EPA, 2001).

92

Figura 37. Médias da fecundidade total expressa em indivíduos produzidos (a) e da sobrevivência (b) da espécie Tisbe biminiensis quando exposta aos sedimentos, contaminados com frações do óleo da bacia do Recôncavo, da área do estuário do Rio São Paulo e controle (Maracaípe-PE )

V. 5.2.4. Monitoramento microbiológico

Com a finalidade de observar o crescimento microbiano nas unidades de

simulação durante o período de experimento, o monitoramento microbiológico foi

realizado através da contagem das unidades formadoras de colônia (UFCs), os

quais foram realizadas nas amostras de sedimento controle (REF01) e

contaminadas com as frações (SAT02, ARO03 e NSO04), tanto para bactérias,

como para fungos. Segundo Bisognin (2012), a técnica considera que cada colônia

tenha sido gerada a partir de uma célula individual, ou conjuntos de células.

As análises de contagem de bactérias e fungos (UFCs) são de suma

importância para processos de biorremediação, por exemplo, para se ajustar a

concentração de inóculo, para controle de crescimento relacionado à degradação, a

fim de investigar a influência dos hidrocarbonetos sobre os microrganismos.

(a) (b)

93

V.5.2.4.1 Quantificação de bactérias e fungos

No gráfico de linhas (Figura 38a e 38b), pode-se observar a quantidade de

UFCs em amostras controle (sem adição de hidrocarbonetos), amostras

contaminadas com hidrocarbonetos saturados (SAT 02), amostras contaminadas

com hidrocarbonetos aromáticos (ARO 03), e amostras contaminadas com NSO

(NSO 04), nos dois intervalos de tempo (T0 e T30).

Na Figura 38a pode-se observar que nas amostras controle, o número de

células viáveis (UFC) para fungos, se manteve inalterado após 30 dias de

experimento. Contrariamente ao que aconteceu para UFCs de bactérias, onde

houve um aumento no número de células após 30 dias de experimento. Isso pode

ser justificado pelas unidades de simulação se tratarem de sistemas abertos, o que

possivelmente pode ter permitido o aparecimento de bactérias.

Nas amostras SAT 02 ocorreu um aumento de células ao longo de 30 dias

somente em relação aos fungos. Isso pode ser atribuído à fonte de carbono

utilizada, uma vez que os n-alcanos correspondem a compostos mais fáceis de

serem quebrados, devido a sua estrutura molecular linear, o que possivelmente

facilitou o crescimento dos fungos ao longo de 30 dias. Para bactérias, não foi

possível observar modificação ao longo do experimento. Em contrapartida, as

amostras ARO 03 tiveram um aumento de células tanto para bactérias como para

fungos, sendo que o aumento foi maior para células de bactérias.

Figura 38 - Gráfico de linhas para número de células viáveis (UFCs x 105) em amostras de sedimento controle (REF01) e contaminados com frações do óleo da bacia do Recôncavo (SAT02, ARO03 e NSO04): (a) UFCs de fungos no T0 e T30, e (b) UFCs de bactérias no T0 e T30

FT 0

FT30REF 01 SAT 02 ARO 03 NSO 04

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

BT0

BT30REF 01 SAT 02 ARO 03 NSO 04

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

(a) (b)

94

Para as amostras NSO 04 o número de células viáveis de bactérias teve uma

diminuição ao longo de 30 dias de experimento, ao contrário do número de células

de fungos, que teve um leve aumento. Isso pode ser justificado pela toxicidade dos

compostos polares sobre os microrganismos (ATLAS, 1981).

V. 5.2.4.2 Isolamento dos fungos

Um total de 19 isolados fúngicos foram encontrados nas amostras da unidade

de simulação REF01, sendo 14 deles isolados no T0 e cinco no T30. O que já era

esperado em virtude dos resultados de UFCs discutidos anteriormente.

Na unidade de simulação contaminada com a fração de saturados (SAT02)

foram isolados 15 fungos (4 no T0 e 11 no T30). Também foram obtidos 19 isolados

fúngicos nas unidades de simulação contaminadas com fração de aromáticos

(ARO03) e com fração de compostos polares (NSO04), sendo que na ARO03 foram

isolados 7 no T0 e 12 no T30 (Figura 39). Foram obtidos, portanto, um total de 72

isolados fúngicos.

Figura 39 – Gráfico de barras para quantidade dos fungos isolados em amostras de sedimento do Estuário do rio São Paulo, Candeias- BA coletadas em cada unidade de simulação (REF01, SAT02, ARO03 e NSO04) no T0 e T30

95

O isolamento permitiu a visualização de várias colônias que começaram a

aparecer com aproximadamente 2 dias de incubação. A partir dessas colônias,

foram isoladas todas aquelas que apresentavam características morfológicas

visualmente distintas, como: cor, forma e textura, visando obter uma maior

diversidade de espécies.

Fungos filamentosos são agentes transformadores eficazes, face a sua

habilidade em degradar uma ampla diversidade de substâncias orgânicas,

comumente encontradas nos efluentes gerados pelas refinarias e indústrias. Por

assimilarem tais substâncias como fonte de carbono e/ou de energia, os

microrganismos vêm se apresentando como poderosa alternativa aos métodos

convencionais de tratamento, sendo cada vez mais empregados na resolução de

problemas ambientais (URURAHY, 1998). Mais de setenta gêneros microbianos,

capazes de utilizar hidrocarbonetos como fonte de carbono, foram relatados

(ATLAS, 1986). Algumas pesquisas vem sendo desenvolvidas, objetivando estimular

a atividade da microflora local que utiliza o hidrocarboneto como fonte de carbono

(HART, 1996), ou introduzir linhagens potencialmente ativas de microrganismos que

degradam hidrocarbonetos no local poluído (BADDOCK et al., 1997).

Como o petróleo, quimicamente, é considerado uma mistura complexa de

hidrocarbonetos diferentes e substâncias relacionadas, que contêm átomos de

carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre e traços de metais pesados

(IRWIN et al., 1999; CONCEIÇÃO, et al., 2005) o isolamento de 53 fungos em

amostras de sedimento de manguezal contaminado com as frações do óleo da bacia

do Recôncavo demonstra a capacidade desses fungos em metabolizar substâncias

recalcitrantes. Vale ressaltar que os fungos isolados da unidade de simulação

controle (REF01) não foram descartados, todos foram testados quanto à sua

capacidade degradadora.

De acordo com Leahy e Colwell (1990), os gêneros de fungos filamentosos

mais encontrados, tanto em ambientes terrestres como em marinhos, são

Aspergillus e Penicillium, também relatados como os mais eficientes na degradação

de hidrocarbonetos (JUHASZ; NAIDU, 2000).

Um dos primeiros estudos de biorremediação por fungos relatou que os

gêneros Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium e Cunninghamella foram isolados

de ambiente estuarino e capazes de utilizar o petróleo como fonte exclusiva de

carbono e energia (CERNIGLIA; PERRY, 1973). Na pesquisa de Lemos e Araújo

96

(2002), foi realizada a identificação de fungos filamentosos com capacidade de

degradação, isolados a partir de solo contaminado por petróleo. Os microrganismos

analisados que apresentaram capacidade de degradação de hidrocarbonetos foram

agrupados em quatro gêneros (Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces e Fusarium).

Os isolados fúngicos foram codificados de acordo com cada unidade de

simulação. Os códigos são compostos de uma letra e uma numeração. A letra

corresponde a unidade de simulação ao qual foi isolado (Tabela 2). A letra R é

referente a unidade de simulação referência (controle), a letra S a unidade de

simulação saturados (SAT02), a letra A corresponde a unidade de simulação

aromáticos (ARO03) e a letra N corresponde a unidade de simulação para resinas e

asfaltenos (NSO04). A numeração utilizada seguiu com a sequência de obtenção

dos isolados. Para os resultados e discussões subsequentes serão utilizados esses

códigos.

Tabela 2 - Códigos dos fungos isolados em cada unidade de simulação do experimento 1

Referência Saturados Aromáticos NOS

R1, R2, R8, R13, R14, R15, R15R, R16, R23, R24, R25, R26, R27, R28, R30, R31, R32, R33

S34, S35, S36, S37, S38, S39, S40, S41, S43, S45, S48, S49, S52, S53, S54

A61, A62, A63, A64, A73, A74, A74R, A75, A76, A77, A79, A79R, A81, A81R, A82, A80, A83, A84

N82, N87, N88, N89, N89R, N91, N94, N96, N97, N99, N99R, N100, N101, N102, N103, N104, N105, N106, N107

V. 5.2.4.3 Seleção dos fungos

Com o intuito de avaliar a potencialidade da eficiência fúngica em degradar

compostos do petróleo, os 72 fungos isolados foram submetidos ao teste qualitativo

baseado na oxidação biológica, evidenciado através da descoloração do meio de

cultivo contendo o Indicador redox 2,6 diclorofenol-indofenol (DCPIP) (HANSON et

al., 1993), e relacionado com a potencialidade de degradar o petróleo.

Essa técnica segue o princípio de que esse indicador consiste na verificação de

ocorrência de oxidação biológica dos hidrocarbonetos, no meio de cultura onde o

DCPIP atua como o aceptor de elétrons no processo de oxidação (GOMES, 2004).

Foram realizados dois tipos de testes oxidativos, um em placas multipoços e

outro em frascos pequenos, tipo vials (com agitação e temperatura controlada). A

97

mudança do indicador ocorreu em tempos diferentes para cada isolado, variando

entre 12h e 48h. Os isolados foram testados com as frações de dois tipos de óleos,

da bacia do Recôncavo e da bacia de Campos. Os fungos isolados nas unidades de

simulação controle (REF01) foram testados com as três frações do óleo (saturados,

aromáticos e NSO).

Seleção nº1: Teste de Oxidação em placas multipoços

No teste de seleção de fungos com potencialidade para degradar as frações

do óleo da bacia do Recôncavo (saturados, aromáticos e NSO) em placa multipoços

foram testados 72 isolados de fungos filamentosos. A leitura do teste foi realizada

com 24hs e 48hs. Quando a fração de saturados foi utilizada como fonte de carbono,

dois dos fungos filamentosos (R13 e S45) testados descoloriram o meio de cultivo

com até 24 horas, após a adição do indicador DCPIP, sendo que o R13 descoloriu

cerca de 25% e o S45 cerca de 50%. Quando utilizada a fração de aromáticos

somente um fungo descoloriu (R1) cerca de 50% com 24 horas após adição do

indicador. Em relação a fração de NSO a linhagem R31 oxidou cerca de 50% com

24 horas após adição do DCPIP, como pode ser visualizado no gráfico da Figura 40.

Souza (2005) testou 23 linhagens de fungos filamentosos com potencialidade

para degradar os petroderivados, diesel, gasolina, querosene e bunker, onde, 4%

(1/23),4 % (1/23), 23% (6/23), e 13% (3/23) dos fungos filamentosos descoloriram o

meio de cultivo com até 24 horas, após a adição do indicador DCPIP, quando

utilizado como fonte de carbono os petroderivados citados acima, respectivamente.

Quando utilizada a fração de aromáticos o R2 e A75 oxidaram cerca de 50%;

o R26, R1, R16, A76 e A81 oxidaram cerca de 75%; e R11, R33, A83, A79, A79R,

A63, A61, A84 e A62 descoloriram cerca de 100% (Figura 40b).

Em relação a fração de NSO o R13, N89 e N106 oxidaram cerca de 50%, o

N108 e N96 oxidaram cerca de 75%; e R14, R32, R26, R33, R15, R16, N85, R11,

R31, N101, N102 e N82 descoloriram cerca de 100% (Figura 40c).

Os isolados R8, R24, R23, R14, R25, R1, R15, R32, R27, R28, R30, S48,

S49, S43, S37, S34, A74, A74R, A73, A77, A82, A64, A78, N97, N91, N105, N99R,

N89, N107, N99, N100, N87, N104, N88 e N103, não apresentaram nenhuma

98

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R2

R25

R14

R32

R23

R24

R8

R26

R33

R15

R16

N85

R11

R13

R28

R30

R31

N91

N97

N106

N108

N105

N101

N99R

N89

N102

N82

N107

N99

N96

N87

N100

N104

N88

N89

N103

OX

IDA

ÇÃ

O(%

)

ISOLADOS

Fração de NSO

24hs

48hs

atividade oxidativa em relação aos testes com frações do óleo da bacia do

Recôncavo (Figura 40).

Figura 40 – Gráfico evidenciando os fungos testados quanto a sua oxidação para o óleo da bacia do Recôncavo: (a) teste com fração de saturados; (b) teste com fração de aromáticos e (c) teste com a fração de NSO

Com 48 horas após a adição do DCPIP, 19 isolados descoloriram o meio de

cultivo quando utilizada a fração de saturados, sendo que R2, R32, R26, R28, R30,

(a)

(b)

(c)

99

R31, S45 descoloriram cerca de 50%; e R16, R27, R11, R33, R13, S41, S53, S52,

S38, S36, S39 e S40 descoloriram 100% do meio de cultivo (Figura 41).

Figura 41 – Ilustração mudança de cor do indicador após 48hs para dois fungos testados quanto a sua oxidação para o óleo da Bacia do Recôncavo. (a) tempo 0 e (b) após 48hs

Fonte: a autora

Miranda (2007) testou 23 cepas, e apenas duas descoloriram completamente

o meio de cultura após 16 e 24 horas de incubação a 30°C. As outras cepas

descoloriram o meio de cultura após períodos de 48 h (8%) e 72h (84%).

Vale ressaltar que foram obtidos 34 isolados com capacidade oxidativa de

100% após 48hs. Para esse teste de seleção foi utilizado 25 µL de suspensão

fúngica e foi realizada a contagem de números de esporos contidas nas

suspensões. O número de esporos está expresso em UFC 105 e pode ser observado

na Tabela 3.

Com esse dados foi possível constatar que a potencialidade em oxidar

compostos orgânicos não está atrelada à quantidade de esporos produzidos pelos

isolados. Comparações entre os dados da Tabela 3 com a Figura 40 permite que se

observe que alguns isolados produzem poucos esporos e são capazes de oxidar

cerca de 100% do meio de cultivo. Como exemplo, o fungo A79 produz 1,0 x 105 de

esporos e oxida cerca de 100% de compostos aromáticos. Em contrapartida, o fungo

A63 que produz 310,5 x 105 de esporos, também oxida 100% do mesmo composto.

CN S41 S53 S52 CN S41 S53 S52

(a) (b)

100

Tabela 3 - Valores quantitativos da solução de esporos utilizados no teste de oxidação para óleo da bacia do Recôncavo

Foi possível observar que entre os isolados fúngicos testados, quatro foram

capazes de descolorir o meio de cultivo, após a adição do indicador DCPIP, quando

testados com as três frações. Na Figura 42 é possível observar que os isolados

fúngicos R16, R11 e R33 oxidaram 100% quando testados com as três frações. O

R26 também foi potencial, com grau de oxidação superior para a fração de NSO.

Figura 42 – Gráfico com fungos selecionados capazes de degradar as três frações presentes no óleo da bacia do Recôncavo

Para o óleo da bacia de Campos foi realizado o mesmo teste com os isolados

fúngicos. Quando a fração de saturados foi utilizada como fonte de carbono, um dos

fungos filamentosos (R33) testado descoloriu completamente o meio de cultivo com

até 24 horas, após a adição do indicador DCPIP. Na presença da fração de

SAT Esporos (UFC105)

ARO Esporos (UFC105)

NSO Esporos (UFC105)

R2 83,75 R2 83,75 R14 44,00

R32 1,25 R26 29,00 R32 1,25

R26 29,00 R1 2,50 R26 29,00

R16 269,5 R16 269,50 R33 0,00

R27 50,00 R11 169,00 R15 8,25

R11 169,00 R33 0,00 R16 269,50

R33 0,00 A83 250,00 R11 169,00

R13 25,75 A 79 1,00 R13 25,75

R28 0,00 A 79R 1,00 R31 5,25

R30 153,5 A63 310,5 N94 1,50

R31 0,00 A80 121,5 N101 57,75

S45 47,00 A76 14,75 N102 104,25

S41 44,25 A61 324,00 N82 0,00

S53 193,00 A84 89,50 N96 0,75

S52 86,50 A62 6,00 N89 56,00

S38 175,50 A81 45,25 N85 0,00

S36 134,25 A75 94,50 N106 286,25

S39 31,00 - - - -

S40 6,00 - - - -

0

101

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R2

R25

R14

R32

R23

R24

R8

R26

R33

R15

R16

R11

R13

R28

R30

R31

N108

N105

N101

N99R

N89

N102

N82

N107

N99

N96

N87

N100

N104

N88

N89

N103

N91

N97

N106

N85

Oxid

ação

(%)

Isolados

Fração de NSO

24hs

48hs

aromáticos, os fungos R32, R16, R27, A83, A64, A61, A84, A62, A81 e A75

descoloriram cerca de 50 a 75%, com 24 horas após adição do indicador. Em

relação a fração de NSO os isolados R33, R30 e N108 oxidaram cerca de 50 a 75%

com 24 horas após adição do DCPIP, como pode ser visualizado no gráfico da

Figura 43.

Figura 43 - Gráfico evidenciando os fungos testados quanto a sua oxidação para o óleo da Bacia de Campos

(a)

(b)

(c)

102

De acordo com os resultados obtidos por Souza et al. (2005), 90% das cepas

isoladas apresentaram potencialidade para degradar a gasolina. A adaptação é a

principal consequência para o aumento na capacidade de biodegradação de

hidrocarbonetos. Isso ocorre com algumas populações de microrganismos locais, em

ambientes poluídos por derivados de petróleo (SPAIN et al., 1980).

Com 48 horas após adição do DCPIP, 22 isolados descoloriram o meio de

cultivo, quando utilizada a fração de saturados, sendo que R2, R8, R23, R32, R26,

R11, S39, S40, S37 descoloriram cerca de 75%; e R16, R13, R30, R27, R33, S38,

S43, S36, S34, S41, S53 e S52 descoloriram 100% do meio de cultivo (Figura 43a).

Quando utilizada a fração de aromáticos R25, A84, A75 e A62 oxidaram cerca

de 50%; R8, R14, R16, A83, A81, A61 e A64 oxidaram cerca de 75% e R2, R32,

R27, R11, A77, A79 e A79R descoloriram cerca de 100% (Figura 43b).

Em relação a fração de NOS R13, R30, R31 e N89 oxidaram cerca de 50%;

R15, N101, N99R e N88 oxidaram cerca de 75%; e R2, R25, R14, R32, R8, R26,

R33, R11, R16, N108, N82, N96, N87, N100, N104, N89, N103, N85 e N99

descoloriram cerca de 100% (Figura 43c).

Os isolados R24, R23, R14, R25, R1, R15, S48, S49, A74, A74R, A73, A77,

A82, A61, A76, A78 N91, N97, N106, N107, N102 e N105 não apresentaram teste

positivo para oxidação das frações do óleo da bacia do Recôncavo.

Para os testes com o óleo da bacia de Campos também foi utilizado 25 µL de

suspensão fúngica, onde foi realizada a contagem de números de esporos contidos

nas suspensões que podem ser observadas na Tabela 4.

Mais uma vez foi possível observar que a potencialidade em oxidar

compostos orgânicos não está vinculada a quantidade de esporos produzidos pelos

fungos isolados. Em observação dos dados da Tabela 4 e comparando com a

Figura 43 foi possível observar que alguns fungos produzem muitos esporos e

oxidam cerca de 50 a 100% do meio de cultivo. Como exemplo, o fungo R16 produz

269,5 x 105 de esporos e oxida cerca de 100% de compostos saturados; em

contrapartida o fungo S43 que produz 4,25 x 105 de esporos também oxida 100% do

mesmo composto.

103

Tabela 4 - Valores quantitativos de esporos utilizados no teste de oxidação para frações do óleo da bacia de Campos

Para os testes com a bacia de Campos também foi possível observar isolados

fúngicos capazes de descolorir o meio de cultivo, após a adição do indicador

DCPIP, quando testadas as três frações. Os isolados R2, R8, R16, R27, R11 e R33

apresentaram capacidade oxidativa quando testados com as três frações, sendo que

o R27 e R33 são os mais potenciais e descoloriram o meio cerca de 100% (Figura

44). Com os testes realizados com os fungos isolados das amostras controle

(REF01) foi possível selecionar fungos potenciais para o processo de degradação

dos compostos orgânicos.

Figura 44 – Gráfico com fungos selecionados capazes de degradar as três frações presentes no óleo da bacia de Campos

SAT Esporos (UFC105)

ARO Esporos (UFC105)

NSO Esporos (UFC105)

R2 83,75 R2 83,75 R2 83,75 R8 56,75 R8 56,75 R25 26,50 R23 39,25 R14 44,00 R14 44,00 R32 1,25 R25 26,50 R32 1,25 R26 29,00 R32 1,25 R8 56,75 R1 2,50 R33 0,00 R26 29,00 R16 269,5 R16 269,50 R33 0,00 R27 50,00 R27 50,00 R15 8,25 R11 169,00 R11 169,00 R16 269,5 R33 0,00 A83 250,00 R11 169,00 R13 25,75 A77 0,00 R13 25,75 R30 153,5 A 79 1,00 R30 153,50 S38 175,50 A 79R 1,00 R31 5,25 S43 4,25 A63 310,50 N94 1,50 S36 134,25 A64 61,25 N101 57,75 S39 31,00 A61 324,00 N99R 124,75 S40 6,00 A84 89,50 N82 0,00 S37 282,75 A62 6,00 N99 0,00 S34 5,00 A81 45,25 N96 0,75 S45 47,00 A75 94,50 N87 51,25 S41 44,25 - - N100 1,00 S53 193,00 - - N104 11,75 S52 86,50 - - N88 8,50

- - - - N89 56,00

- - - - N103 133,75

104

Seleção nº2: Teste de oxidação com aclimatização

Todos os isolados selecionados no teste de oxidação utilizando a placa

multipoços (seleção n°1) passaram por uma segunda seleção utilizando também o

indicador DCPIP, sendo que o princípio deste método se baseia na agitação por

12hs para aclimatização dos isolados com a temperatura controlada (30°C) e

posteriormente a adição do indicador. Outra diferença entre os testes é que a leitura

se faz com 12hs e 24hs.

No teste de oxidação com as frações do óleo da bacia do Recôncavo;

realizado para cada isolado, e em duplicata, foi observado que 17 dos 19 isolados

no teste anterior, apresentaram capacidade de degradar a fração de saturados após

12hs, sendo que quatro (R2, R16, R28 e S38) oxidaram cerca de 50%; três (R27,

R31 e R33) descoloriram cerca de 25%; quatro (R11, R30, S45 e S53) oxidaram

cerca de 75%; e seis (R32, R26, S36, S39, S40 e S41) oxidaram 100% nas primeira

12hs (Figura 45a).

Com capacidade para degradar a fração de aromáticos após 12hs, 15 dos 16

isolados apresentaram capacidade de oxidar, sendo que dois (A76 e A62) oxidaram

cerca de 50%; sete (R2, R26, R1, A79, A79R, A63 e A80) descoloriram cerca de

25%; três (R11, A83, e A61) oxidaram cerca de 75%; e três (A84, A81 e A75)

oxidaram 100% nas primeira 12hs (Figura 45b).

Em relação ao isolados testados com a fração de NSO 14, dos 16 isolados,

apresentaram capacidade de oxidar, sendo que quatro (R26, N85, N82 e A96)

oxidaram cerca de 50%; um (N108) descoloriu cerca de 25%; nove (R14, R15, R16,

R11, R13, R31, N101, N102 e N89) oxidaram cerca de 75%; e nenhum fungo

apresentou a capacidade de oxidar 100% nas primeira 12hs (Figura 45c).

105

Figura 45 - Gráfico mostrando os fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da bacia do Recôncavo

Destaque em vermelho dos selecionados

A descoloração completa ocorreu após 24hs contendo os isolados R27, R11,

R30 e R53, quando testados para fração de saturados (Figura 46). Para a fração de

aromáticos e de NSO, quatro isolados descoloriram 100% após 24hs.

(a)

(b)

(c)

106

Figura 46 – ilustração mudança de cor do indicador após 24hs para dois fungos testados quanto a sua oxidação para Óleo da Bacia do Recôncavo. (a) teste com a linhagem R33 e (b) teste com a linhagem S52

Fonte: a autora

Somente os isolados fúngicos que oxidaram de 50% a 100% foram

selecionados como os mais promissores para degradar compostos orgânicos do

petróleo, como pode ser observado em destaque na Figura 46a, b e c. Todavia,

deve-se levar em consideração que os mesmos têm potencial degradador, uma vez

que foram isolados de um meio contendo óleo como única fonte de carbono, embora

tenham se mostrado menos acelerados quanto ao início da oxidação biológica,

quando comparados aos isolados selecionados (BROWN; BRADDOCK, 1990;

HANSON et al., 1993; CATTERALL 1999; GOMES, 2004).

No teste de oxidação com as frações do óleo da bacia de Campos, realizado

para cada linhagem, e em duplicata, foi observado que 19 dos 23 isolados no teste

anterior apresentaram capacidade de degradar a fração de saturados após 12hs,

sendo que três (R16, S38, S37 e S34) oxidaram cerca de 50%; três (R2, R27e R11)

descoloriram cerca de 25%; sete (R1, R33, R30, S43, S39, S52 e S53) oxidaram

cerca de 75%; e três (R8, S36 e S45) oxidaram 100% nas primeiras 12hs,

mostrando sua capacidade de adaptação a fonte de carbono (Figura 47a).

R33 R33

Controle Controle

S52 R52

107

Figura 47 - Gráfico mostrando os fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da Bacia de Campos

Destaque em vermelho dos selecionados

São três mecanismos que podem contribuir para a adaptação dos fungos a

fonte de carbono: indução de enzimas específicas, mudanças genéticas que

resultam na aquisição de novas atividades metabólicas e enriquecimento seletivo de

(a)

(b)

(c)

108

organismos capazes de transformar os compostos. É essa adaptação que resulta

em um aumento da proporção de degradação dos hidrocarbonetos (LEAHY;

COLWELL, 1990; SOUZA et al., 2005)

Com capacidade para degradar a fração de aromáticos após 12hs, treze dos

vinte isolados apresentaram capacidade de oxidar, sendo que dois (R11 e A83)

oxidaram cerca de 50%; sete (R2, R8, R27, R11 (Figura 48a), A77 (Figura 48b), A61

e A84) descoloriram cerca de 25%; dois (A62, e A81) oxidaram cerca de 75%; e dois

(A64 e A75) oxidaram 100% nas primeira 12hs (Figura 47b).

Figura 48 – Ilustração mudança de cor do indicador após 24hs para dois fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da Bacia do Recôncavo. (a) teste com a linhagem R11 e (b) teste com a linhagem A77

Fonte: a autora

Em relação ao isolados testados com a fração de NOS, 23 25 isolados

apresentaram capacidade de oxidar, sendo que cinco (R14, R8, N103, N82 e N96)

oxidaram cerca de 50%; seis (R2, R26, R16, R31, N85 e N100) descoloriram cerca

de 25%; seis (R15, R11, R13, N101, N99 e N88) oxidaram cerca de 75%; e três

(N99R, N87 e N104) apresentaram a capacidade de oxidar 100% nas primeiras 12hs

(Figura 47c).

A descoloração completa ocorreu após 24hs, contendo os isolados R26, R30,

S38 S39, S40, S37, S34 e S53 quando testados para fração de saturados (Figura

47a). Para fração de aromáticos três (A63, A84 e A64), e para fração de NSO sete

isolados (R33, R15, R11, R30, N82, N99 e N89) descoloriram 100% após 24hs

(Figura 47b e c).

Controle R11 A77 A77

Controle

(a) (b)

109

Foram selecionados somente os fungos com capacidade oxidativa de 50% a

100%, como os mais promissores para degradar compostos orgânicos do óleo da

bacia de Campos, como pode ser observados em destaque na Figura 47a, b e c.

V. 5.2.4.4 Seleção nº3: Crescimento Radial

Outra forma de selecionar os fungos com potencialidade em degradar os

compostos orgânicos do óleo da bacia do Recôncavo e da bacia de Campos foi

através do acompanhamento da velocidade do crescimento radial. O

acompanhamento foi durante cinco dias e os fungos foram incubados a 30ºC com o

intuito de observar a potencialidade dos fungos isolados em crescer na presença e

na ausência da fonte de carbono, e classificá- los quanto ao seu tipo de crescimento

(lento, moderado e rápido) em relação ao tempo.

Foram testados dois tipos de meio (1-BDA e 2-Sabouraud) em duas

condições (com e sem fração do óleo), sendo que por motivos logísticos só foi

acompanhado o crescimento radial dos fungos cultivados com a fração no meio

1(BDA). O meio Sabouraud e BDA são meios de cultivo amplamente mencionados

na literatura como hábeis na seleção e cultivo de diferentes fungos filamentosos

(RODRIGUES, 2009; BARBOSA et al., 2010; ROVEDA; HEMKEMEIER; COLLA,

2010; SCHUBER et al., 2012).

Vale ressaltar que a classificação dos isolados quanto ao tipo de crescimento

foi baseada nos estudos realizados por Suzin (1989) onde o crescimento radial foi

classificado como: crescimento muito rápido = entre 7 a 8 cm; Crescimento rápido =

4 cm; crescimento moderadamente rápido = entre 3 a 4 cm; crescimento moderado

= 2,5 cm e crescimento lento = <2,5 cm, em 7 dias de incubação. A classificação dos

fungos do presente estudo foi obtidas após cálculos da velocidade de crescimento

radial com base na classificação citada anteriormente, sendo que só foram levados

em conta os resultados de VCR na presença das frações do óleo da bacia do

Recôncavo.

Os resultados da velocidade de crescimento radial dos isolados [(VCR (cm.d -

1)], após cinco dias de incubação, estão demonstrados na Tabela 5, assim como sua

classificação. O isolado R2 apresentou o maior crescimento após cinco dias de

110

incubação nos dois tipos de meio e também quando foi adicionado dois tipos de

fonte de carbono (saturados e aromáticos). Esse fungo pode ser considerado como

de crescimento rápido. Os fungos R16, S52, A84, N102 e N82 apresentaram

crescimento rápido quando adicionada a fonte de carbono. Enquanto que o fungo

N106 não cresceu quando cultivados nos meios 1 e 2. Entretanto, foi possível

observar que a grande maioria dos fungos isolados apresentam crescimento lento

na presença da fonte de carbono do óleo da bacia do Recôncavo (Tabela 5).

Tabela 5 - Velocidades de crescimento radial em diferentes meios (BDA, Saboraud), e com as frações as do óleo da bacia do Recôncavo (Saturados, Aromáticos e NSO). Destaque em vermelho – maiores velocidades. Destaque em verde – maiores velocidades com adição das frações do óleo da bacia do Recôncavo

VCR (cm.d -1)

TIPO DE FRAÇÃO

LINHAGEM MEIO 1 MEIO 2 MEIO 1+ FRAÇÃO Classificação*

Sa

tura

do

s

R2 3,99 4,14 3,55 Crescimento rápido R32 1,23 1,33 0,70 Crescimento lento R26 0,79 1,46 0,69 Crescimento lento R16 0,90 1,02 3,72 Crescimento rápido R27 0,94 1,47 1,32 Crescimento moderado R11 0,44 2,00 0,87 Crescimento lento R13 0,68 3,72 0,39 Crescimento lento R28 0,39 0,75 0,75 Crescimento lento R30 0,75 0,75 0,75 Crescimento lento R31 0,99 0,99 0,99 Crescimento lento

R33 1,15 1,05 2,20 Crescimento moderado S38 0,80 0,93 1,27 Crescimento moderado S36 1,59 1,04 0,90 Crescimento lento S39 1,01 0,66 0,85 Crescimento lento S40 1,25 2,09 1,11 Crescimento moderado S45 1,43 2,00 0,75 Crescimento lento S41 0,81 0,84 0,68 Crescimento lento S53 0,73 1,97 1,08 Crescimento moderado S52 1,31 1,21 3,84 Crescimento rápido

Aro

máti

co

s

R2 3,99 4,14 3,55 Crescimento rápido R16 0,90 1,02 3,72 Crescimento rápido R11 0,44 2,00 0,87 Crescimento lento R33 1,15 1,05 2,20 Crescimento moderado A83 0,66 1,32 0,66 Crescimento lento

A79 0,61 0,05 0,23 Crescimento lento A79R 0,61 0,05 0,92 Crescimento lento A63 0,54 0,53 0,00 Crescimento lento** A80 0,69 0,43 0,99 Crescimento lento A76 0,25 1,38 0,62 Crescimento lento A61 0,32 0,70 0,00 Crescimento lento** A84 0,33 0,38 3,70 Crescimento rápido A62 0,59 1,41 1,11 Crescimento moderado A81 0,90 0,32 0,99 Crescimento lento A75 0,12 0,69 1,35 Crescimento moderado

NS

O

R14 3,97 3,21 3,16 Crescimento rápido R26 0,79 1,46 0,69 Crescimento lento R33 1,15 1,05 2,20 Crescimento moderado R15 0,46 0,46 0,46 Crescimento lento R16 0,90 1,02 3,72 Crescimento rápido R11 0,44 2,00 0,87 Crescimento lento R13 0,68 3,72 0,39 Crescimento lento R31 0,99 0,99 0,99 Crescimento lento

N106 0,00 0,00 2,89 Crescimento rápido

N94 0,00 0,00 0,00 Não cresceu N101 1,31 1,41 2,29 Crescimento moderado N102 1,07 1,46 3,55 Crescimento rápido N82 1,07 2,91 3,59 Crescimento rápido N96 2,27 2,43 1,03 Crescimento moderado N89 2,13 3,00 2,41 Crescimento moderado

* Classificação: VCR(cm.d-1)>2,5 = crescimento rápido; 1,0 <VCR(cm.d-1) > 2,5 = crescimento moderado;

VCR(cm.d-1)<1,0 = crescimento lento.

**Foi classificado com base no crescimento no meio 1(BDA) e 2 (Saboraud).

111

No geral, 11 fungos isolados apresentaram crescimento rápido e 12

crescimento moderado, enquanto que 26 apresentaram crescimento lento. Contudo,

esses fungos evidenciaram capacidade de crescimento na presença das fontes de

carbono, podendo, no entanto, serem potenciais na utilização em processos de

biorremediação em ambientes contaminados com esses compostos.

Muitos pesquisadores discutem sobre as diferenças de crescimento radial

entre isolados fúngicos quando submetidos ao crescimento em diferentes meios de

cultura e fontes nutricionais (BOYLE, 1998; MAKI et al., 2001; SILVA et al., 2005; DE

ANDRADE; GRACIOLLI, 2005; ANDRADE et al., 2008). Donini et al. (2005)

observaram em suas pesquisas que há diferenças significativas na interação entre

as linhagens, substratos, meios de cultura e dias de incubação. Contudo a eficiência

da biodegradação por fungos dependerá do tipo de linhagem e suas interações

(ROYSE; SANCHEZVAZQUEZ, 2000; DE ANDRADE et al., 2010).

Estatisticamente analisando, as maiores médias de crescimento radial dos

fungos ocorreram quando os mesmos foram cultivados com o meio 1(BDA) + fração.

Isso pode ser observado no gráfico de box plot da Figura 49. Os fungos cultivados

no meio 1 + fração também apresentaram valores máximos para crescimento. Em

contrapartida, as menores velocidades que apresentaram os valores mínimos foram

os isolados cultivados no meio 1 (BDA).

Figura 49 – Gráfico de box plot para crescimento radial em dois tipos de meio (BDA e Sabouraud), em duas condições (com e sem fração) para as frações (saturados, aromáticos e NSO), do óleo da bacia do Recôncavo

112

Esse fato demonstra que quando adicionadas as frações do óleo da bacia do

Recôncavo, o crescimento radial dos fungos apresentou uma variação maior quanto

a velocidade de crescimento e que a fonte de carbono acelerou o crescimento dos

fungos. Comparando o meio 1 e o meio 2, o que apresentou maiores médias para

velocidade de crescimento foram os fungos cultivados no meio 2 (Sabouraud),

mostrando que os fungos se desenvolvem melhor quando cultivados nesse tipo de

meio.

Os resultados da velocidade crescimento radial dos isolados com potencialidade

para degradar as frações (saturados, aromáticos e NSO) do óleo da bacia de

Campos [VCR (cm.d -1)] após cinco dias de incubação, estão listados na Tabela 6. O

fungo R2 apresentou o maior crescimento após cinco dias de incubação nos dois

tipos de meio e também quando foi adicionada a fonte de carbono (saturados e

NSO). Os fungos R8, R1, R16, S36, S41 (fração de saturados), R8, R14 (fração de

aromáticos) e R15, A82, R1 (fração de NSO), tiveram a velocidade aumentada

quando adicionada a fonte de carbono, classificando esses fungos como de

crescimento rápido. Enquanto que os fungos S43, A63, N88, N99R e N104, não

cresceram na presença da fonte de carbono.

Andrade et al.(2008) em seus estudos ao avaliar o crescimento micelial de duas

linhagens de L. edodes submetidas a dez tipos de meio de cultura, também

observaram que uma linhagem pode obter médias de crescimento micelial

superiores às outras linhagens, em todos os meios de cultura testados.

Contrariamente, o que ocorreu quando utilizada as frações do óleo da bacia do

Recôncavo, os fungos testados com as frações do óleo da bacia de Campos

apresentaram crescimento rápido a moderado em sua grande maioria. Com isso,

foram observadas diferentes taxas de crescimento do fungo em presença das

diferentes frações, indicando que a tolerância do fungo às frações depende da sua

capacidade de adaptação, na qual pesquisadores verificaram que a variação na

tolerância deve-se a um ou mais tipos de mecanismos de resistência (ATLAS, 1981;

SINGH, 2006). Segundo Conceição et al., (2005) o sucesso do processo de

biorremediação depende da resistência do fungo ao composto alvo e às condições

ambientais presentes.

113

Tabela 6 - Velocidades de crescimento radial em diferentes meios (BDA, Saboraud), e com as fração do óleo da bacia de Campos (Saturados, Aromáticos e NSO). Destaque em vermelho – maiores velocidades. Destaque em verde – maiores velocidades com adição das frações

* Classificação: VCR(cm.d-1)>2,5 = crescimento rápido; 1,0 <VCR(cm.d-1) > 2,5 = crescimento moderado;

VCR(cm.d-1)<1,0 = crescimento lento. **Foi classificado com base no crescimento no meio 1 e 2.

No gráfico de box plot ilustrado na Figura 50 pode ser observado que as

maiores médias de crescimento radial dos fungos ocorreram quando cultivados com

o meio 1 + frações do óleo da bacia de Campos. Os fungos cultivados no meio 1 +

fração apresentaram valores máximos para crescimento, enquanto que quando

cultivados no meio 1 apresentaram valores mínimos. No geral, observou-se que

quando adicionada a fonte de carbono, os fungos cresciam mais rapidamente, da

mesma forma que os fungos testados com as frações do óleo da bacia do

Recôncavo.

VCR (cm.d -1)

TIPO DE FRAÇÃO

LINHAGEM MEIO 1 MEIO 2 MEIO 1+ FRAÇÃO Classificação

Sa

tura

do

s

R2 3,99 4,14 3,91 Crescimento rápido R8 0,78 0,48 2,93 Crescimento rápido

R26 0,79 1,46 1,12 Crescimento moderado R1 1,06 1,53 3,12 Crescimento rápido

R16 0,90 1,02 3,81 Crescimento rápido R27 0,94 1,47 1,08 Crescimento moderado R11 0,44 2,00 2,34 Crescimento moderado R13 0,68 3,72 1,12 Crescimento moderado R30 0,75 0,75 1,53 Crescimento moderado R33 1,15 1,05 1,72 Crescimento moderado

S37 1,63 0,48 1,86 Crescimento moderado S34 1,31 1,23 0,84 Crescimento lento S43 1,59 1,04 0,00 Crescimento moderado** S38 0,80 0,93 1,20 Crescimento moderado S36 1,59 1,04 3,58 Crescimento rápido S39 1,01 0,66 2,05 Crescimento moderado S40 1,25 2,09 1,26 Crescimento moderado S45 1,43 2,00 1,66 Crescimento moderado S41 0,81 0,84 3,81 Crescimento rápido S53 0,73 1,97 2,02 Crescimento moderado S52 1,31 1,21 1,12 Crescimento moderado

Aro

máti

co

s

R8 0,78 0,48 3,50 Crescimento rápido R16 0,90 1,02 3,81 Crescimento rápido R11 0,44 2,00 1,57 Crescimento moderado

R14 3,97 3,21 3,16 Crescimento rápido R27 0,94 1,47 2,54 Crescimento rápido R33 1,15 1,05 2,33 Crescimento moderado A83 0,66 1,32 2,57 Crescimento rápido A77 0,68 0,58 2,86 Crescimento rápido A64 0,43 0,51 1,12 Crescimento moderado A63 0,54 0,53 0,00 Crescimento lento** A84 0,33 0,38 0,62 Crescimento lento A62 0,59 1,41 2,64 Crescimento rápido A81 0,90 0,32 1,92 Crescimento moderado A75 0,12 0,69 1,35 Crescimento moderado

R14 3,97 3,21 1,91 Crescimento moderado

NS

O

R32 1,23 1,33 0,70 Crescimento lento R8 0,78 0,78 0,48 Crescimento lento

R26 0,79 1,46 1,63 Crescimento moderado R33 1,15 1,05 2,47 Crescimento moderado R15 0,46 0,46 3,52 Crescimento rápido R16 0,90 1,02 3,68 Crescimento rápido R11 0,44 2,00 0,53 Crescimento lento

R13 0,68 3,72 0,39 Crescimento lento R30 0,75 0,75 0,45 Crescimento lento R31 0,99 0,99 1,38 Crescimento moderado

N101 1,31 1,41 2,29 Crescimento moderado N99R 1,37 0,50 0,00 Crescimento lento** N82 1,07 2,91 3,60 Crescimento rápido N96 2,27 2,43 0,50 Crescimento lento N87 2,36 1,38 0,68 Crescimento lento

N100 1,13 1,03 0,41 Crescimento lento N104 1,20 1,89 0,00 Crescimento moderado** N88 1,59 0,60 0,00 Crescimento lento** N89 2,13 3,00 2,41 Crescimento moderado

N103 1,58 1,90 1,59 Crescimento moderado R2 3,99 4,14 3,76 Crescimento rápido R1 1,06 1,53 3,90 Crescimento rápido

114

Figura 50 – Gráfico de box plot para crescimento radial em dois tipos de meio (BDA e Sabouraud) em duas condições (com e sem fração), para fração de saturados, aromáticos e NSO do óleo da bacia de Campos

A velocidade de crescimento radial (VCR) é o coeficiente angular da reta

obtida da regressão linear dos raios das colônias em função do tempo. Portanto,

quanto maior a inclinação da reta, maior é a velocidade de crescimento radial e

maior o potencial de crescimento do fungo (Figura 51). Mais uma vez, através do

gráfico de regressão pode-se observar que o meio1 + fração intensificou a

velocidade de crescimento dos fungos.

Figura 51 – Gráfico de regressão linear para crescimento radial dos fungos isolados para óleo da bacia do Recôncavo e óleo da bacia de Campos

Valor normal experado X valor observado

MEIO 1

MEIO 2

MEIO 1+ FRAÇÃO-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Observed Value

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Exp

ecte

d N

orm

al V

alu

e

Média

Média±SE

Média±SD

MEIO 1

MEIO 2

MEIO 1+ FRAÇÃO

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

115

5.2.4.5 Seleção nº4 Teste de antagonismo

Um dos testes de seleção realizados para formação dos consórcios potenciais

foi o teste de antagonismo in vitro direto, que tem o objetivo de confirmar se

determinado microrganismo tem ação antagônica sobre outro, assim inibindo seu

crescimento. Os testes in vitro apresentam vantagens que possibilitam a análise de

um grande número de microrganismos com ação antagonista, facilitando a

observação das interações antagonistas e ecológicas (MARIANO, 1993).

A interação ecológica entre linhagens fúngicas constitui uma importante

barreira no desempenho da biorremediação. A relação dos microrganismos

inoculados com seus “novos” ambientes bióticos e abióticos, em termos de

sobrevivência, pode ser decisiva para o resultado de qualquer estratégia utilizando o

bioaumento, especialmente quando a matriz é um sedimento ou um solo (VAN

VEEN et al., 1997; EL FANTROUSSI; AGATHOS, 2005).

Os resultados do teste de confrontação direta são apresentados na Figura 52.

Para os fungos isolados e selecionados com potencialidade em degradar fração de

saturados do óleo da bacia do Recôncavo (R11, R16, R26, R2, R28, R30, R32, R33,

S36, S38, S39, S40, S41, S45, S52 e S53) observou-se que 6% dos fungos

apresentaram atividade antagônica. Foram 16 isolados, onde 6% corresponde a

uma única linhagem com ação antagônica. O fungo que apresentou ação antagônica

foi R32. Esse fungo não conseguiu crescer junto com os demais (Figura 53).

O melhor desempenho das culturas mistas (consórcios) utilizadas em

processos de biorremediação depende tanto das relações intra-consórcio e inter-

consórcios dentro da comunidade global, o que responde a respeito das condições

de funcionamento e interação ambiental (HAMER, 1997).

Dos fungos isolados e selecionados com potencialidade para degradar a

fração de aromáticos ( R33, R16, R2, R11, A84, A83, A81, A80, A79R, A76, A75,

A63, A62, A61), cinco (36%) apresentaram ação antagônica (A63, A8, A75, A76 e

A61); e nove (64%) cresceram de forma harmônica. Já para fração de NSO foram

16 isolados (R33, R31, R26, R16, R15, R14, R13, R11, N96, N94, N89, N85, N82,

N106, N102 e N101), onde três (19%) apresentaram ação antagônica (R15, N94,

N85); enquanto que 13 (81%) não apresentaram atividade antagônica entre si.

116

Figura 52 – Teste de antagonismo dos isolados, com potencialidade em degradar frações do óleo da bacia do Recôncavo. (a) isolados da fração de saturados, (b) isolados da fração de aromáticos e (c) isolados da fração de NSO

Duas situações distintas ocorrem quando se envolve culturas mistas, em

processos de biodegradação. Uma ocorre quando envolve o emprego de uma

cultura em que as atividades catabólicas de várias cepas associadas é aproveitada,

a fim de gerar uma via única de degradação completa do poluente; e a outra envolve

o emprego de uma cultura em que as ações catabólicas são diminuídas por cepas

auxiliares associadas (HAMER, 1997).

Os resultados do teste de confrontação direta para as frações do óleo da

bacia de Campos são apresentados na Figura 53. Para os fungos isolados e

selecionados com potencialidade em degradar a fração de saturados (R1,R11, R13,

(a)

(b)

(c)

117

8; 57%

6; 43%

Fração de aromáticos

Fungo com atividadeantagônica

Fungo sem atividadeantagônica

6; 26%

17; 74%

Fração de NSO



R16, R2, R26, R27, R30, R33, R8, S34, S36, S37, S38, S39, S40, S41, S43, S45,

S52 e S53), observa-se que 14% dos isolados apresentaram atividade antagônica

(S34, S41 e S45) (Figura 53).

Figura 53 - Teste de antagonismo dos isolados com potencialidade em degradar frações do óleo da bacia de Campos. (a) isolados da fração de saturados, (b) isolados da fração de aromáticos e (c) isolados da fração de NSO

Os fungos isolados e selecionados com potencialidade para degradar a fração

de aromáticos (R8, R33, R27, R16, R14, R11, A84, A83, A81, A77, A75, A64, A63 e

A62), seis (43%) apresentaram ação antagônica e oito (57%) cresceram de forma

3; 14%

18; 86%

Fração de Saturados



(a)

(b)

(c)

118

harmônica (Figura 53b). Dos isolados com potencialidade para degradar fração de

NSO, R8, R33, R32, R31, R30, R26, R16, R15, R14, R13, R11, N99R, N99, N96,

N89, N88, N87, N85, N82, N104, N103, N101 e N100), seis (26%) apresentaram

ação antagônica (R15, N101, N85, N87, N99R e N99), enquanto que 17 (74%) não

apresentaram atividade antagônica entre si (Figura 53c).

V. 5.2.4.6 Formação dos consórcios

Dos 68 fungos isolados, 29 fungos compuseram o consórcio da bacia do

Recôncavo como pode ser visualizados na Tabela 7. Foram selecionados para

compor o consórcio os isolados que apresentaram teste de antagonismo negativo,

teste de oxidação entre 50 e 100% e com crescimento radial do tipo lento, médio e

rápido (Tabela 7 e Figura 54).

Um único microrganismo pode ter a capacidade de degradar apenas

determinados compostos do petróleo, mas uma população mista permite um nível

mais elevado de degradação. Além disso, algumas substâncias podem ser

degradadas apenas por co-metabolismo (LI et al., 2007; MARGENSIN et al., 2007).

Os consórcios microbianos podem ser utilizados como inóculos em

tratamentos biológicos, visando a redução de tempo de degradação de resíduos.

São constituídos por uma complexa população de espécies que, em sinergismo, são

potencialmente aplicados na biodegradação de poluentes derivados do petróleo

(COSTA et al., 2007).

Os fungos filamentosos são agentes transformadores eficazes, face à sua

habilidade em degradar ampla gama de substância orgânicas, utilizando-as como

fonte de carbono e energia durante seu crescimento. Devido à complexidade dos

processos metabólicos necessários à degradação do petróleo, apenas consórcios de

microrganismos com diferentes gêneros e espécies conseguem degradar as frações

e derivados desse óleo (TIBURTIUS et al., 2004). Gallego e seus colaboradores

(2007) confirmaram experimentalmente que a biodegradação pelo consórcio de

microrganismos, em especial o consórcio fúngico, apresenta-se como uma poderosa

alternativa biotecnológica, técnica e economicamente viável nos processos de

biodegradação de derivados do petróleo.

119

Testes com consórcios microbianos metabolicamente ativos desempenharam

papel chave na biodegradação de hidrocarboneto. A maior taxa de degradação foi

obtida do dia 49 até o dia 96 do experimento. Durante o experimento de

biorremediação, não foram observadas mudanças significativas nas relações entre

as populações microbianas, provavelmente porque os microrganismos já estavam

aclimatados a fonte de carbono presente no solo (MILIC et al., 2009).

Tabela 7 – Isolados que compuseram o consórcio da bacia do Recôncavo e seus principais resultados

VCR (cm.d -1) MEIO 1


VCR (cm.d -1) MEIO 1+ FRAÇÃO

Oxidação (%) Teste de Antagonismo

R2 3,99 4,14 3,55 50 NEGATIVO

R26 0,79 1,46 0,69 100 NEGATIVO R16 0,9 1,02 3,72 90 NEGATIVO R27 0,94 1,47 1,32 100 NEGATIVO R11 0,44 2 0,87 100 NEGATIVO R28 0,39 0,75 0,75 90 NEGATIVO R30 0,75 0,75 0,75 100 NEGATIVO R31 0,99 0,99 0,99 100 NEGATIVO R33 1,15 1,05 2,2 50 NEGATIVO S38 0,8 0,93 1,27 75 NEGATIVO S36 1,59 1,04 0,9 100 NEGATIVO S39 1,01 0,66 0,85 100 NEGATIVO S40 1,25 2,09 1,11 100 NEGATIVO S45 1,43 2 0,75 75 NEGATIVO S41 0,81 0,84 0,68 100 NEGATIVO S53 0,73 1,97 1,08 100 NEGATIVO

S52 1,31 1,21 3,84 75 NEGATIVO A83 0,66 1,32 0,66 100 NEGATIVO

A79 0,61 0,05 0,23 50 NEGATIVO A79R 0,61 0,05 0,92 50 NEGATIVO A80 0,69 0,43 0,99 100 NEGATIVO A84 0,33 0,38 3,7 100 NEGATIVO

A62 0,59 1,41 1,11 100 NEGATIVO R14 3,97 3,21 3,16 90 NEGATIVO N101 1,31 1,41 2,29 90 NEGATIVO

N102 1,07 1,46 3,55 90 NEGATIVO N82 1,07 2,91 3,59 75 NEGATIVO N96 2,27 2,43 1,03 90 NEGATIVO N89 2,13 3 2,41 100 NEGATIVO

Chaîneau et al. (1999), ao realizarem estudos com o isolamento de

microrganismos degradadores de hidrocarbonetos em solo de agroecossistemas

também identificaram a presença de alguns gêneros de fungos como, Aspergillus,

Penicillium, Cladosporium e Trichoderma, além de outros como Beauveria,

Acremonium e Fusarium.

No presente trabalho não foi realizada a identificação dos fungos

filamentosos, mas através da micrografia dos fungos foi possível sugerir a

identificação de dois gêneros: Aspergillus (R2) e Penicillium (S40) (Figura 55).

Lemos e Araújo (2002) identificaram 60 fungos filamentosos com capacidade

para degradar hidrocarbonetos, os quais foram agrupados em quatro gêneros:

Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces e Fusarium. Silva et al. (2009) também

verificaram, em seu estudo, a capacidade que diferentes espécies de Aspergillus e

Verticillium apresentaram para degradar HPAs, tanto de baixa massa molecular (2 e

3 anéis), quanto de alta (de 4 a 7 anéis).

120

Através da micrografia e macrocultivo foi possível observar que dos isolados

alguns são bem semelhantes entre si, a exemplo do R28, S38 e R30, do N101 e

N102 (Figura 54 e 55).

Figura 54 – Micrografia dos isolados crescidos em meio BDA, em lâmina e imagem fotográfica dos mesmos, que compuseram o Consórcio da bacia do Recôncavo. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x

Micrografia Macrocultivo Micrografia Macrocultivo

R2

R30

R16

R31

R26

R33

R27

S38

R11

S36

R28

S39

S40

S53

Fonte: a autora

121

Figura 55 – Continuação... Micrografia dos isolados fúngicas crescidos em meio BDA, em lâmina e imagem fotográfica dos mesmos, que compuseram o Consórcio da bacia do Recôncavo. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x

Micrografia Macrocultivo Micrografia Macrocultivo

S45

S52

S41

A83

A79

A84

A80

S40

A62

S45

N101

N102

N82

N89

N96

Fonte: a autora

122

Para formação do consórcio com potencialidade para degradar o óleo da

bacia de Campos, foram levados em conta os mesmos parâmetros utilizados para o

óleo da bacia do Recôncavo: teste de oxidação, crescimento radial e teste de

antagonismo. De 68 isolados, 28 fungos compuseram o consórcio da bacia do

Recôncavo (Tabela 8).

Jacques et al. (2007), relataram que os consórcios de microrganismos

apresentam maior capacidade de utilização de um grande número de

hidrocarbonetos como fonte de carbono, podendo mineralizar completamente esses

compostos por ação metabólica.

Testes com consórcios fúngicos, em um trabalho de biorremediação utilizando

biopilhas, mostraram melhor desempenho em relação a testes com fungos

individuais (BISOGNIN, 2012).

O desenvolvimento de um consórcio dominante, ao invés de uma linhagem

dominante, durante processo de biodegradação, sugere que, em diversas culturas

mistas, interações não ocorrem entre linhagens individuais utilizando substratos

primários, somente na presença de consórcios específicos (HAMER, 1997).

Tabela 8 - Isolados que compuseram o consórcio da bacia do Recôncavo e seus principais resultados



VCR (cm.d -1) MEIO 1+ FRAÇÃO

Oxidação (%) Teste de Antagonismo

R32 1,23 1,33 0,7 75 NEGATIVO R13 0,68 3,72 0,39 90 NEGATIVO R8 0,78 0,48 2,93 100 NEGATIVO S37 1,63 0,48 1,86 100 NEGATIVO A64 0,43 0,51 1,12 100 NEGATIVO N89 2,13 3 2,41 100 NEGATIVO N100 1,13 1,03 0,41 90 NEGATIVO N88 1,59 0,6 - 90 NEGATIVO N103 1,58 1,9 1,59 75 NEGATIVO R26 0,79 1,46 0,69 100 NEGATIVO S53 0,73 1,97 1,08 100 NEGATIVO S38 0,8 0,93 1,27 75 NEGATIVO S36 1,59 1,04 0,9 100 NEGATIVO S39 1,01 0,66 0,85 100 NEGATIVO S40 1,25 2,09 1,11 100 NEGATIVO R30 0,75 0,75 0,75 100 NEGATIVO R2 3,99 4,14 3,55 50 NEGATIVO S52 1,31 1,21 3,84 75 NEGATIVO

R16 0,9 1,02 3,72 90 NEGATIVO

R27 0,94 1,47 1,32 100 NEGATIVO R11 0,44 2 0,87 100 NEGATIVO R33 1,15 1,05 2,2 100 NEGATIVO A84 0,33 0,38 3,7 100 NEGATIVO R14 3,97 3,21 3,16 90 NEGATIVO N82 1,07 2,91 3,59 75 NEGATIVO

R30 0,75 0,75 0,75 100 NEGATIVO

N96 2,27 2,43 1,03 90 NEGATIVO

R31 0,99 0,99 0,99 100 NEGATIVO

Alguns fungos compuseram tanto o consórcio 1 como o consórcio 2, sendo

possível concluir que alguns fungos podem degradar diferentes tipos de óleo, a

exemplo do R2, R33 e N96 (Figura 56 e 57).

123

Vasco et al. (2011) relatam que três espécies de fungos filamentosos foram

encontrados em três campos diferentes, Penicillium chermesinum, Penicillium

indicum e Aspergillus terreus.

Figura 56 - Micrografia e imagem fotográfica dos isolados que compuseram o consórcio da bacia de Campos. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x

Micrografia Imagem real Micrografia Imagem real

R2

R30

R16

R31

R26

R33

R27

S38

R11

S36

R32

S39

S40

S53

Fonte: a autora

124

Figura 57 – Continuação... Micrografia e imagem fotográfica dos isolados que compôs o Consórcio da bacia de Campos. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x

Micrografia Imagem real Micrografia Imagem real

R13

S52

R8

N100

*

S37

A84

N82

N103

N96

N89

R14

*Micrografia não mostrada por falta de qualidade

Fonte: a autora

Os fungos, por exemplo, apresentam uma morfologia bastante complexa com

estruturas celulares diferentes em cada etapa do seu ciclo de vida (PRASAD et al.,

2005). Para driblar sua complexidade, a estrutura morfológica desses

microrganismos pode ser imobilizada, para aplicação tanto em escala de laboratório

quanto industrial (KOURKOUTAS et al., 2004; PRASAD et al., 2005).

125

Os dois tipos de consórcio foram encapsulados com polímeros naturais a

base de dois substratos, fibra de coco e folha de manguezal em pó (Figura 58a e

58b). Além de testar a função absortiva da fibra de coco, já cientificamente

comprovada, foi testada o seu desempenho como aditivo (bioestimulados)

nutricional. A folha de manguezal é composta de fósforo e nitrogênio principalmente

nas folhas novas (OLIVEIRA et al., 1996). Sabe-se que através do processo de

degradação esses nutrientes voltam a estar disponíveis para serem consumidos

(OLIVEIRA, 2009). Por isso a aplicação da folha serviu de teste como

bioestimulador do consórcio imobilizado.

Figura 58 – Consórcios fúngicos encapsulados: (a) encapsulados à base de fibra de coco e (b) encapsulados à base de folha de manguezal em pó

Fonte: a autora

A imobilização consiste no confinamento das células em um determinado

espaço, na qual são mantidas suas atividades catalíticas em processos de operação

contínua ou descontínua. Muitos processos industriais utilizam células livres em

suspensão. Entretanto, o uso de microrganismos imobilizados pode permitir um

aumento na produtividade (FREEMAN; LILLY, 1998; COVIZZI et al., 2007).

Como resultado das cápsulas foi possível observar que aquelas a base de

fibra de coco apresentaram uma melhor consistência do que aquelas produzidas

tendo como base a folha de manguezal em pó. Isso pode ser justificado pelo tipo de

polímero utilizado para o encapsulamento, uma vez que para as cápsulas a base de

fibra de coco foi utilizado um único polímero, enquanto que para as cápsulas à base

de folha foi utilizado a mistura de dois polímeros. Maiores detalhes sobre o

(a) (b)

126

encapsulamento dos fungos foram preservados e brevemente serão publicados em

forma de patente.

Quanto a resistência das cápsulas, foi possível observar que aquela a base

de fibra possuiu maior resistência, uma vez que foi manuseada por muito mais

tempo que a cápsula a base de folha. Isso pode ser atribuído à função estruturante

que a fibra de coco apresenta. A característica principal das células imobilizadas

para o uso em processos de biodegradação em sedimentos de manguezais, é a sua

alta resistência à exposição a compostos tóxicos e ambientes hostis (JUNTER;

JOUENNE, 2004).

O encapsulamento teve a finalidade de reduzir a liberação dos esporos de

uma única vez. Além de aumentar a resistência e melhorar a forma de aplicação,

fornece melhor distribuição e uniformização. O processo de fabricação e de

aplicação do encapsulamento visa impedir que os consórcios fúngicos se

desintegrem, promovendo resistência, fornecendo melhor distribuição e

padronização. A fibra de coco em pó age como absorvente do óleo facilitando o

acesso dos fungos à fonte de carbono, além de ter a possibilidade de ser fonte de

nutrientes para o processo de biorremediação. A folha de manguezal em pó

possivelmente agiu como nutriente no processo de biorremediação podendo ser

aditivos potenciais aplicado a sedimentos contaminados por atividades petrolíferas.

Essas cápsulas podem futuramente ser melhoradas para serem aplicadas

diretamente em sedimentos contaminados por atividades petrolíferas.

127

V. 5.3 EXPERIMENTO 2 (APLICAÇÃO EM CONDIÇÕES LABORATORIAIS)

Para o experimento 2 (que consistiu em testar a eficiência dos consórcios em

degradar o óleo da bacia do Recôncavo e bacia de Campos) foram obtidos dados

em relação ao monitoramento geoquímico, físico-químico, químico e microbiológico.

Para todos os resultados obtidos foram obtidas médias entre as unidades de

simulação com o mesmo tratamento. As siglas utilizadas foram as seguintes: C

(controle), CBR (controle da bacia do Recôncavo), CBC (controle da bacia de

Campos ), BRFI (bacia do Recôncavo + fibra de coco + consórcio1), BRFO (bacia do

Recôncavo + folha + consórcio1), BCFI (bacia de Campos + fibra de coco +

consórcio2) e BCFO (bacia de Campos + folha + consórcio2).


Um dos parâmetros mais usados para o monitoramento da biodegradação de

hidrocarbonetos é o do acompanhamento das mudanças no perfil de

hidrocarbonetos totais do petróleo (HTP). Esses compostos são representados

normalmente pelos picos lineares que correspondem aos hidrocarbonetos saturados

e picos não lineares (hidrocarbonetos aromáticos e compostos NSO), registrados em

um cromatograma. Entretanto, quando o óleo se encontra em processo de

biodegradação ocorre uma redução desses compostos, alterando o perfil

cromatográfico.

A biodegradação geralmente provoca mudanças consideráveis nas

propriedades geoquímicas, e por consequência nas propriedades físicas dos óleos

derramados. A taxa e extensão com que esses processos ocorrem, variam para

cada tipo de óleo ou derivado, e são controladas também por condições ambientais

(SOUZA, 2003).

Os cromatogramas das amostras coletadas no T0, T30, T60 e T90 (dias) das

unidades de simulação controle (C), controle do óleo da bacia do Recôncavo (CBR)

e controle do óleo da bacia de Campos (CBC), podem ser verificadas nas Figuras

59, 60 e 61, respectivamente.

128

A Figura 59 mostra o cromatograma da amostra controle, que corresponde ao

sedimento limpo. No tempo zero é possível observar o perfil da matéria orgânica

encontrada no sedimento. Esses picos, que podem ser visualizados nos

cromatogramas, podem ser de carbono de origem pirogênica e biogênica. O carbono

de origem pirogênica é produto da combustão incompleta, abrangendo desde

material orgânico levemente carbonizado até fuligem e carbono pirogênico granítico,

altamente condensado e recalcitrante. Todos os componentes têm um alto conteúdo

de carbono, são quimicamente heterogêneos e predominantemente aromáticos

(MASIELLO, 2004). Essa queima pode ter sido intensificada com a esterilização do

sedimento. Os compostos orgânicos biogênicos resultam dos processos biológicos e

metabólicos dos organismos presentes no sedimentos.

Nos cromatogramas do T30 e T90 alguns picos não são visualizados, os

quais podem ser visualizados nos T0 e T60. Isso indica que o sedimento é

heterogêneo. Mesmo com a homogeneização não foi possível obter uma amostra

padrão para todas unidades de simulação (Figura 59).

O monitoramento geoquímico da degradação dos dois tipos de óleo ao longo

do experimento foi expresso pelas análises cromatográficas em diversos tempos de

amostragem. Os cromatogramas, que podem ser visualizados na Figura 60,

correspondem aos perfis do óleo da bacia do Recôncavo na unidade de simulação

controle (CBR) no T0, T30, T60 e T90. Nesses cromatogramas pode ser visualizada

a distribuição linear dos n-alcanos (nC13 - nC40), perfil típico de óleo dessa bacia. No

perfil representado no cromatograma do T30 pode ser notada a redução dos picos

dos n-alcanos nC17 – nC25 (Figura 60). Essa redução deve estar atribuída a ação

dos processos intempéricos químicos e físicos, já que nessa unidade de simulação

não houve adição de microrganismos. No T60 pode ser observado um aumento nos

picos nC23 – nC29, o que não significa que não está ocorrendo processos de

degradação. Isso pode ser justificado pela quebra de moléculas de maiores massas

moleculares, causando o enriquecimento de hidrocarbonetos com menor massa

molecular. Com 90 dias de experimento houve novamente uma diminuição dos picos

lineares nC14 – nC28, o que evidencia a maior ação dos processos intempéricos sob

os n-alcanos (BAKER; HERSON, 1994).

129

T0 T30 T60 T90

C

5 10 15 20 25 30 35 Minutes

-29

0

mVolts

5 10 15 20 25 30 35 Minutes

-28

0

mVolts

5 10 15 20 25 30 35 Minutes

-29

0

mVolts

5 10 15 20 25 30 35 Minutes

-29

0

mVolts

250

200

150

100

50

250

200

150

100

50

250

200

150

100

50

300

250

200

150

100

50

Figura 59 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação controle do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo

Área azul sugere fonte pirolítica e área verde sugere fonte biogênica

Figura 60 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação controle do óleo da bacia do Recôncavo do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo

Linha pontilhada – corresponde ao início do processo de degradação. * P-pristano e F-fitano.

In

tensid

ade

Inte

nsid

ade

Tempo (mim)

T0 T30 T60 T90

p

F p

F

F

p p

F

Tempo (mim)

130

Na Figura 61 podem ser observados os perfis cromatográficos do óleo da bacia de Campos no T0, T30, T60 e T90.

Nesses cromatogramas pode ser visualizada a distribuição linear dos n-alcanos (nC13 – nC34), com elevação da linha de base

que corresponde a presença de maior quantidade de hidrocarbonetos aromáticos e compostos NSO, perfil típico do óleo da

bacia de Campos. Ao longo do experimento foi possível notar uma redução expressiva dos picos dos n-alcanos nC13 -nC26

(Figura 61). Assim como ocorreu na unidade CBR, essa redução deve ser atribuída à ação dos processos intempéricos

geoquímicos e físicos, onde esses podem causar mudanças significativas na composição química do óleo estudado (WANG

et al , 1998; YIM et al. , 2011; WANG et al., 2011; WANG et al., 2013).

Figura 61 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação controle do óleo da bacia de Campos do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo. Linha pontilhada – corresponde ao início do processo

A perda de n-alcanos foi mais expressiva para o óleo da bacia de Campos do que para o óleo da bacia do Recôncavo.

Esse comportamento já era esperado, uma vez que o óleo BR é mais enriquecido nesta fração, o que levaria maior tempo na

redução desses compostos através da ação dos processos intempéricos.

In

tensid

ade

Tempo (mim)

T0 T30 T60 T90

131

Fato que pode ser atribuído a ação dos processos de intemperismo e

está diretamente relacionado a alguns fatores, tais como a quantidade e tipo de

óleo (EZRA et al , 2000; PRÍNCE et al., 2002; BRADDOCK et al., 2003; WANG

et al., 2013).

Nas unidades de simulação, onde foram adicionados óleo da bacia do

Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco, como aditivo nutricional, pode ser

observado no perfil cromatográfico, que ao longo de 90 dias houve redução dos

picos de n-alcanos e elevação da linha de base reconhecida como UCM

(Figura 62).

Como os microrganismos consomem compostos leves (n-alcanos)

durante progressiva biodegradação, e a redução preferencial dos

hidrocarbonetos saturados pela comunidade microbiana já foi prevista por

vários autores através de simulações laboratoriais e da análise de derrames de

óleo em ambientes costeiros (WANG; BARTHA, 1990; WOLFE et al., 1994;

BLENKINSOPP et al., 1997; ASIF et al., 2009), os resultados verificados neste

experimento já eram esperados.

Entretanto Cooney et al. (1985), relatam que a fração de saturados

apresenta as maiores taxas de degradação, mas isso não é universal, uma vez

que estudos realizados pelos autores mostram que os hidrocabonetos

aromáticos, a exemplo do naftaleno e hexanodecano, podem ser degradados

antes mesmo dos n-alcanos. No presente estudo isso pode ser observado no

cromatograma do tempo T60, onde pode ser visualizado um aumento dos n-

alcanos, fato que pode ser atribuído a degradação de compostos mais

pesados, como aromáticos e NSO. Isso pode ser observado nas três unidades

de simulação (Figura 62).

Metabolicamente, esse aumento dos n-alcanos no T60 pode ser

atribuído à cinética de crescimento dos fungos. Provavelmente os fungos no

T60 estavam em um estágio de maior atividade metabólica onde possivelmente

houve a quebra de hidrocarbonetos aromáticos e compostos NSO, seguido do

enriquecendo de n-alcanos mais leves. No T90 provavelmente os fungos

voltaram a consumir os n-alcanos. Como se tratou de adição de um “pool” de

fungos, é provável que alguns sejam responsáveis por quebrar e não utilizar

como fonte de carbono os hidrocarbonetos (cometabolismo), enquanto outros

consomem os hidrocarbonetos (SINGH, 2006).

132

Figura 62 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco, do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo

In

tensid

ade

Tempo (mim)

T0 T30 T60 T90

Redução dos n-alcanos

nC17- nC27

Aumento dos n-alcanos

nC16- nC31


nC16- nC31


nC16- nC31

Redução dos n-alcanos

nC17- nC27

133

Nos resultados acima expostos, o fato de vários microrganismos

estarem co-metabolicamente envolvidos no experimento pode estar

relacionado com o consumo de substratos preferenciais por meio de cada um

dos fungos. A habilidade dos microrganismos em consumir n-alcanos como

fonte de carbono está diretamente relacionada a ação de sistema enzimático e

das vias metabólicas especializadas em transformá-los em compostos mais

simples (WENTZEL et al., 2007; ROJO, 2009; FIORAVANTI, 2013).

Na Figura 63 estão dispostos os cromatogramas das unidades de

simulação, onde foram adicionados óleo da bacia do Recôncavo + consórcio

1+ folha de manguezal em pó como aditivo (BRFO). Em geral a degradação do

óleo seguiu o mesmo processo ocorrido nas unidades de simulação BRFI

descrito acima, sendo que visivelmente a degradação foi mais intensa nas

unidades BRFI, fato atribuído a fibra de coco ter função absortiva, o que

possivelmente facilitou o acesso dos microrganismos ao óleo.

Nos cromatogramas do tempo 30 (T30) foi possível observar a redução

dos n-alcanos (nC14-nC27). Esse fato pode ser atribuído à presença de

microrganismos adaptados, que provavelmente iniciaram o processo de

biodegradação a partir dos compostos mais leves. Nos cromatogramas do T60

houve um aumento dos compostos mais leves. Entretanto, pode-se observar

uma elevação da linha de base, fato que pode ser explicado pela quebra ou

degradação dos compostos mais complexos (HPAs e NSOs).

Outra justificativa seria através da preferência de algumas espécies de

fungos por hidrocarbonetos simples, enquanto outros devem preferir

hidrocarbonetos e compostos mais pesados, já que foi um dos critérios para

formação dos consórcios. Segundo Peters et al. (2005) os mecanismos de

biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo não são bem esclarecidos. No

entanto sabe-se que determinadas espécies microbianas degradam

preferencialmente determinados compostos. Lopez et al. (2008) relatam que a

biorremediação por bioaumento com consórcios fúngicos isolados pode

aumentar a remoção de TPH, em comparação com o tratamento utilizando

bioestímulo sozinho. Em contrapartida, a degradação completa de óleos nunca

ocorre, o resíduo complexo geralmente permanece, apesar desses compostos

apresentarem baixa toxicidade aguda (ATLAS, 1995; SINGH 2006).

134

Figura 63 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha de manguezal do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo

135

Os cromatogramas das unidades de simulação onde foram adicionados,

óleo da bacia de Campos + Consórcio 2 + fibra de coco, seguiram a mesma

tendência das unidades anteriores, sendo que pode ser observado um maior

do aumento da linha de base nas unidades com óleo da bacia de Campos que

nas unidades com óleo da BR, isso pode ser atribuído a maior quantidade de

hidrocarbonetos aromáticos e compostos NSO, presente nesse tipo de óleo. O

que provavelmente ocasionou degradação por parte dos fungos dessas

substâncias. No T90 é possível visualizar a degradação também dos n-alcanos.

Comparando as unidades que foram tratadas com fibra de coco e folha, não foi

possível visualizar a melhor eficiência (Figura 64 e 65).

Apesar de serem unidades de simulação diferentes, a rota metabólica se

repetiu de forma semelhante, que pode ser mais evidente no T60 em todas as

unidades de simulação. A ação enzimática provavelmente está aliada ao tipo e

quantidade de compostos presentes em cada tipo de óleo. Para Feng et al.

(2007) o crescimento fúngico em substratos contendo petroderivados como

fonte de carbono confirma e corrobora com a ideia da aplicação desses

microrganismos em processos industriais, e ainda na biorremediação de

ambientes contaminados. A ação dos microrganismos na degradação do óleo,

tem grande relevância quando é levado em conta o potencial desses em tornar

esses compostos substâncias menos tóxicas que o composto original (FENG et

al., 2007).

Contudo, o uso dos consórcios no presente estudo demonstrou a

eficiência desses microrganismos em degradar tanto o óleo da bacia de

Campos como o óleo da bacia do Recôncavo, apresentando potencialidade de

uso na recuperação de áreas contaminadas por esses tipos de óleo.

136

Figura 64 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo

T0 T30 T60 T90

Redução d

e n

-alc

anos

Aum

ento

de n

-alc

anos e

UC

M

Redução d

e n

-alc

anos

Dis

trib

uiç

ão inic

ial

In

tensid

ade

Tempo (mim)

137

Figura 65 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha de manguezal do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo

T0 T30 T60 T90

Redução d

e n

-alc

anos

Aum

ento

de n

-alc

anos e

UC

M

Redução d

e n

-alc

anos

Dis

trib

uiç

ão inic

ial

In

tensid

ade

Tempo (mim)

138

As razões geoquímicas dos hidrocarbonetos saturados, tais como,

pristano/n-heptadecano (PR/nC17), fitano/n-octadecano (Ph/nC18) e

pristano/fitano (Pr/Ph), têm sido usadas como ferrramentas no diagnóstico e

identificação de fontes de poluição, monitoramento de processos de

degradação por ação de processos intempéricos físicos e biológicos e

interpretação de dados químicos de derrames de petróleo (PETERS et. al.,

2005; OSUJI et al. , 2006 ; GAO; CHEN, 2008; ONYEMA et al., 2013) .

Em relação à razão Pristano/Fitano, pode ser observado que houve uma

diminuição ao longo de 90 dias (Figura 66). Isso comprova a degradação nos

dois tipos de óleo. Uma vez comparadas as unidades de simulação que

continham no óleo da bacia do Recôncavo e da bacia de Campos, pode se

perceber que a razão Pristano/Fitano é maior no óleo da bacia de Campos que

no óleo da bacia do Recôncavo. Metabolicamente, foi possível observar que os

fungos consumiram esses compostos ao longo dos 90 dias nas unidades de

simulação do óleo da bacia do Recôncavo.

Nas unidades de simulação do óleo da bacia de Campos os

microrganismos nos tempos T30 e T60 podem ter consumido esses

compostos, o que reflete um aumento desses compostos no T90.

Possivelmente os fungos quebraram mais as moléculas do que as consumiram.

O que não significa dizer que o processo de degradação parou de ocorrer, pois

possivelmente ocorreu a quebra dos hidrocarbonetos aromáticos e dos

compostos NSO.

Figura 66 – Gráfico com variação da razão Pristano/Fitano (ppb) nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento

(p

pb

)

139

A comparação entre o T0 com a média ao longo de 90 dias, confirma

que houve uma diminuição na razão, mostrando que ocorreu degradação

(Figura 67). As informações apresentadas sugerirem que provavelmente os

microrganismos têm preferência pelo pristano ao invés do fitano. Isso pode ser

justificado pelo tipo de cadeia molecular, uma vez que o pristano apresenta

uma cadeia ramificada iso (semelhante), onde existe a possibilidade do ataque

dos fungos nas duas extremidades da cadeia.

Figura 67 – Gráfico com variação da razão Pristano/Fitano nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento

Como os hidrocarbonetos normais facilmente degradados (n-C17 e n-

C18) são perdidos e os mais resistentes a degradação (pristano e fitano) são

conservados (BARAKAT et al., 2002; . WANG; FINGAS , 2003), isso pode

resultar num aumento significativo das proporções de Pr/ n-C17/ e Ph/ n-c18/

nas amostras (WANG et al., 2013) .

O aumento da razão P/nC17 e F/nC18 para valores maiores que 1,0 (um), é

uma indicação da ação de microrganismos no petróleo, uma vez que, em

processos de biodegradação, os primeiros compostos a serem degradados são

os alcanos lineares (HUNT, 1996; KILLOPS; KILLOPS, 2005).

Valores >1 para razões Pristano/nC17 e Fitano/nC18 podem indicar óleo

degradado, pois os n-alcanos são mais facilmente biodegradados que os

ramificados (COLOMBO et al., 1989). Todas as amostras apresentaram razões

(p

pb

)

140

> 1 comprovando que houve degradação ao longo dos 90 dias. No gráfico da

Figura 68 pode ser observado que nas unidades BRFO e BRFI houve um

aumento da razão Pristano/nC17 ao longo dos 90 dias. O mesmo ocorreu nas

unidades BCFO e BCFI, entretanto com maior intensidade. Isso pode ser

justificado pelo tipo de óleo. O óleo da bacia de Campos é composto por maior

quantidade de hidrocarbonetos aromáticos e compostos NSO, possivelmente

levando à quebra dessas moléculas, contribuindo para a formação do Pristano

e nC17 e consequentemente aumentando a razão desses compostos.

Okoro (2010) em testes de biorremediação com óleo residual utilizou o

índice de biomarcadores razão P/nC17 e F/nC18, como a tendência do

processo de biodegradação. Pritchard e Coaster (1991) usou o mesmo índice

para monitorar o progresso da biodegradação durante o derrame de óleo no

Alaska. Esse conceito baseia-se no princípio de que, durante o processo de

biodegradação, diminuições de resíduos totais de petróleo poderiam ocorrer

por causa de outros processos não biológicos. Assim, mudanças na

composição de hidrocarbonetos que são indicativas de biodegradação devem

ser medidas com precisão. Além disso, as relações de peso entre

hidrocarbonetos conhecidos por serem rapidamente biodegradáveis, tais como

os alcanos em C17 e C18 e aqueles que são mais lentamente biodegradados,

tais como o alcanos ramificados (pristano e fitano), podem inferir sobre o

processo de biodegradação .

Figura 68 – Gráfico com variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento

(p

pb

)

141

Comparando o T0 com a média ao longo de 90 dias verifica-se um

aumento da razão Pristano/nC17, comprovando, portanto, a degradação ao

longo de 90 dias de experimento nas unidades BRFO, BRFI, BCFO e BCFI

(Figura 69 e 70).

Figura 69 – Gráfico com variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0 e média (dias) do experimento

Figura 70– Gráfico com variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento

Comparando o T0 com a média ao longo de 90 dias, verifica-se um

aumento da razão Fitano/nC18, comprovando a degradação ao longo de 90 dias

(p

pb

)

(pp

b)

142

de experimento (Figura 71). Button et al.(1992), em seus estudos, afirmam que

o aumento da razão Fitano/n-C18 indica biodegradação.

Figura 71 – Gráfico com variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0 e média (dias) do experimento

Para a avaliação da degradação, outros parâmetros geoquímicos foram

utilizados a razão HTP/UCM. As concentrações de HTP, compreendeM o

somatório dos compostos resolvidos e não resolvidos pela cromatografia

gasosa com detector de chama ionizante. Normalmente, a perda de alcanos

lineares, neste caso com tempo de retenção até 10 minutos, acoplada a um

aumento na complexidade da fração hidrocarbonetos alifáticos, leva ao

aparecimento contínuo da UCM – unresolved complex mixture, que

corresponde a uma fração mais pesada do óleo constituída por

hidrocarbonetos ramificados e cíclicos, que nem sempre são resolvidos em

coluna capilar (BENTO, 2005).

A razão HTP/UCM diminuiu com 90 dias de experimento, o que

representa uma indicativo de degradação. Se observarmos o gráfico da Figura

72, nas unidades de simulação BRFO, BRFI, BCFO e BCFI a razão aumenta

nos tempos 30 e 60 e depois diminui. Isso pode estar atribuído a via metabólica

dos fungos. Como foi relatado, o T60 aumenta a altura dos picos e aumenta a

UCM consequentemente a razão HTP/UCM aumentará. Esse fato só não foi

possível de ser observado nas unidades controles dos óleos e na unidade

tratada com óleo BR e fibra de coco (BRFI).

(p

pb

)

143

Figura 72 – Gráfico com variação da HTP/UCM nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento

A integração dos dados obtidos com o monitoramento geoquimico,

utilizando a análise dos componentes principais (ACP) como ferramenta,

mostrou que as duas primeiras componentes principais são suficientes para

explicar a distribuição das amostras de acordo com suas composições

elementares. Juntas, a PC 1 e PC 2, são capazes de explicar 85,40% da

variância acumulada dos dados. Sendo que a primeira componente é

responsável por explicar 64,20% da variância, e a segunda componente

contém 23,20% da variabilidade dos dados.

Os resultados de todas a unidades de simulação apresentaram sinais

negativos em relação a PC 1. As unidades de simulação CBC, CBR, BRFO e

BRFI mostraram-se com valores de pesos elevados e sinal negativo, enquanto

que as unidades BCFO e BRFI apresentaram valores de pesos positivos na PC

2 (Figura 73a).

A Figura 73b mostra o gráfico dos escores nas duas primeiras

componentes. A primeira componente (64,20% da informação) foi interpretada

de forma que podem ser observados 3 grupos. As razões de P/nC17 e F/nC18

mostraram-se com valores de pesos elevados e sinal positivo, enquanto que as

razões de HTP/UCM e P/F apresentam valores de pesos negativos na PC 1.

Essa distribuição espacial das variáveis pode ser melhor visualizada no gráfico

de pesos representado na Figura 75b a seguir. As razões P/F e HTP/UCM

estão correlacionadas negativamente com P/nC17, F/nC18, significando dizer

que as variáveis P/F e HTP/UCM não são influenciadas da mesma forma que

(p

pb

)

144

as variáveis P/nC17, F/nC18. A razão HTP/UCM influencia diretamente as

unidades de simulação CBC, CBR, BRFO e BRFI. Já a razão P/F tem

influência nas unidades de simulação BCFO e BRFI.

Figura 73 - Análise dos Componentes Principais (ACP) para as razões dos parâmetros geoquímicos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18) monitorados no experimento 2. Onde: (a) –Variáveis (unidades de simulação) e (b) – Casos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18, nos tempos 0 e 30, 60 e 90)

Quanto aos resultados do teste de Cluster, as maiores similaridades

foram encontradas entre T0 e T30. As menores similaridades foram

encontradas entre o T90 e os demais tempos, confirmando mais uma vez que

os valores encontrados no T90 se distanciaram dos demais tempos. Isso pode

ser indicativo de degradação do óleo estudado. À medida que se aumenta o

processo de degradação, as similaridades entre as variáveis tendem a se

distanciar (Figura 74).

(a) (b)

CBR

CBC

BRFO

BRFI

BCFO BCFI

-1 -0.5 0 0.5 1

PCI 1 : 64,20%

-1

-0.5

0

0.5

1

PC

2 :

23

,20

%

P/FT0

P/FT30P/FT60

P/FT90

P/nC17T0

P/nC17T30

P/nC17T60

P/nC17T90

F/nC18T0

F/nC18T30F/nC18T60

F/nC18T90

HTP/UCMT0

HTP/UCMT30

HTP/UCMT60HTP/UCMT90

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

PC1: 64,20%

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

PC

2 2

: 2

3,2

0%

145

Figura 74 – Gráfico de similaridade (Cluster) entre as variáveis dos parâmetros geoquímicos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18) monitorados no experimento 2

V. 5.3.2. Monitoramento químico e físico-químico

V.5.3.2.1 Parâmetros Físico – químicos

Os parâmetros físico-químicos temperatuta, salinidade, pH e oxigenio

dissolvido foram monitorados durante toda a fase de desenvolvimento do

experimento e seus valores variaram segundo a tabela contida na Figura 77.

A biodegradação, de hidrocarbonetos de petróleo, no ambiente, é

determinada principalmente por fatores abióticos e esses têm sido objeto de

estudos nas últimas décadas. Os fungos suportam grandes variações

ambientais. Entretanto, vários fatores podem afetar o crescimento e as

atividades enzimáticas alterando as taxas de degradação de petróleo. Um dos

fatores que interferem o metabolismo dos fungos, é a temperatura (SINGH,

2006).

Segundo Atlas (1981), a biodegradação dos hidrocarbonetos pode

ocorrer em uma ampla variação de temperatura. A temperatura é essencial

para as necessidades de crescimento dos fungos, tendo o petróleo como

substrato. Baixas temperaturas geralmente retardam as taxas de volatilização

dos hidrocarbonetos de baixo peso molecular, alguns dos quais são tóxicos

para os fungos. Fungos também mostram uma tendência para resistir a

ambientes secos e temperaturas elevadas. Os efeitos da temperatura são

T90 T60 T30 T01

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

Lin

ka

ge

Dis

tan

ce

146

também influenciados por outros fatores, tais como a qualidade da mistura de

hidrocarbonetos e a composição da população fúngica (SINGH, 2006).

Durante o experimento 2, os valores para a temperatura da água,

mensurados nas unidades de simulação variaram entre 21,74 ºC e 26,48ºC

(Figura 77). Na Figura 75 pode-se observar que no T90 houve um aumento da

temperatura em todas as unidades de simulação. No entanto, com aplicação do

teste T, onde p= 0,666622, pode-se concluir que a diferença entre as médias

do T0 e dos demais tempos de monitoramento não foram significativas, já que

p>0,05 evidencia que não existem diferenças significativas ventre duas médias.

A biodegradação de hidrocarbonetos pode ocorrer em um grande

intervalo de temperatura, de 0°C até 70°C, embora, em geral, a degradação

ótima ocorra na gama de temperaturas mesófilas (20ºC e 45ºC) (DESAI; VYAS,

2006; SONAWDEKAR, 2012). Os parâmetros mensurados mostraram que as

amostras não eram significativamente diferentes, independente do tipo de óleo,

consórcio e tratamento de bioestímulo (fibra de coco e folha) utilizado,

comprovando que durante todo o experimento não houveram grandes

variações que comprometessem o processo de biorremediação.

Figura 75 - Gráfico com a variação dos valores da temperatura do experimento 2 mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

A escolha do pH depende dos microrganismos a serem utilizados para a

degradação (SONAWDEKAR , 2012). Vários fungos crescem bem em níveis de

4-5, e são mais tolerantes a condições ácidas. Os valores de pH

apresentaram-se compatíveis para águas estuarinas, variando entre 6,52 e

147

7,64 (Figura 76). Entretanto, a maior parte dos microrganismos tolera valores

de pH na faixa de 5 a 9 e preferencialmente funcionam na faixa de 6,5 a 7,5 e

também o pH de 7 a 8 tem sido encontrado como ótimo para degradação

(YADAV; REDDY, 1993; SINGH, 2006; DESAI; VYAS, 2006), o que confirma

que os valores encontrados no experimento 2 estão dentro dos padrões de

tolerância para o crescimento dos microrganismos.

A aplicação do teste T, onde p=0,529851, mostrou que a diferença entre

as médias do T0 e dos demais tempos de monitoramento não foram

significativas, já que p>0,05 evidencia que não existe diferença significativa

entre duas médias.

Figura 76 - Gráfico com a variação dos valores do pH do experimento 2 mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

O potencial redox (EH) dos sedimentos mede o seu estado de oxidação

controlando a direção do equilíbrio químico e consequentemente a redução ou

oxidação do contaminante. Este, por sua por sua vez controla os compostos

que o contaminante pode formar e a relativa solubilidade destes no meio

ambiente (HAZEN, 2010; LIMA, 2010).

O potencial redox é condição limitante para aceleração do processo de

biodegradação. No entanto, as concentrações oxidantes ou redutora, em

especial irão afetar a atividade metabólica microbiana influenciando a sua

atividade enzimática, podendo dificultar ou acelerar o processo de

biodegradação (SUTHERSAN, 1999).

148

Em relação aos valores de EH, estes apresentaram condições oxidantes,

variando entre 22,78 e 44,91 mV (Figura 77). Segundo ERD (1998), valores

positivos de EH indicam condições ótimas para a biodegradação de compostos

orgânicos. Observando o gráfico da Figura 70 é possível observar que o EH

apresentou um aumento no T90 em relação ao T0, mas essa variação não foi

significante estatisticamente. Com a aplicação do teste T, o valor de p foi igual

a 0,576597, onde p>0,05 evidencia que não existe diferença significativa entre

duas médias.

Figura 77 - Gráfico com a variação dos valores do EH do experimento 2 mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

A influência de vários outros fatores ambientais sobre a biodegradação

de hidrocarbonetos foi estudada (ATLAS, 1981). O papel menor de fungos num

ecossistema marinho pode ser atribuído à falta de esporulação em habitats

marinhos, às características morfológicas, para a competitividade em meio

aquático e inibição da germinação de esporos pela salinidade (SINGH, 2006).

Em geral, muitos isolados do solo, de água doce e estuarinos podem

sobreviver em salinidades comparáveis a água do mar. Embora quanto maior a

salinidade menor a taxa de degradação do óleo (SALLEH et al., 2003;

SONAWDEKAR, 2012).

Segundo Atlas (1981), hidrocarbonetos foram adicionados a amostras

naturais com ampla variação de salinidade (3,3-28,4), e foi possível observar

que as taxas de metabolismo desses compostos diminuiu com aumento desse

parâmetro. Os valores para salinidade variaram entre 22 e 34,92 (Figura 78),

tendo um aumento da salinidade no T90, que pode ser justificado pelo aumento

149

da temperatura e consequentemente evaporação da água e maior

concentração de sais nas unidades de simulação. Entretanto, ao longo do

experimento, a diferença entre as médias do T0 e os demais tempos não foram

significativas (p>0,05), com p=0,112104.

Segundo Atlas (1981), microrganismos isolados não crescem bem em

salinidades inferiores a 1,5 a 2 (ATLAS, 1981). No presente experimento, a

salinidade apresentou valores maiores que 2, o que mostra que a salinidade

não foi um requisito impeditivo para o processo de biorremediação.

Figura 78 - Gráfico com a variação dos valores da salinidade do experimento 2 mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

Em processos de biorremediação de hidrocarbonetos, para que ocorra a

degradação é necessário um receptor de elétrons, e o oxigênio é o mais

comum. Embora a maior parte dos estudos tenha mostrado que processos de

biodegradação de hidrocarbonetos são aeróbios, também tem sido relatada

biodegradação anaeróbica desses compostos. Na ausência de oxigênio

molecular, o nitrato, o ferro, o bicarbonato, o óxido nitroso e o sulfato, têm sido

mostrados aceptores alternativos de elétros durante a degradação de

hidrocarbonetos (DESAI; VYAS, 2006).

Os fungos podem ser do tipo aeróbio e anaeróbio, mas crescem melhor

em condições aeróbias. O oxigênio ajuda na mineralização de hidrocarbonetos

nos sedimentos do estuário. As velocidades de degradação de hidrocarbonetos

são reduzidas com a diminuição do oxigênio (SINGH, 2006). Entretanto, Atlas

(1981) relata que existem controvérsias sobre a necessidade absoluta do

150

oxigênio para a biodegradação de hidrocarboneto, ou se esses estão sujeitos à

degradação anaeróbica.

No presente trabalho, com uso de uma bomba de oxigenação, o O.D.

ao longo do experimento, variou entre 4,66 e 6,32 (mg/L) (Figura 79). Os

passos iniciais do catabolismo de hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos e

aromáticos por fungos envolvem oxidação de substrato por oxigenases e

oxigênio. Assim, as condições aeróbias são necessárias para a oxidação de

hidrocarbonetos no meio ambiente (YADAV; REDDY, 1993). Taxas

insignificantes de biodegradação dos hidrocarbonetos ocorrem em ambientes

anaeróbicos (SINGH, 2006). Isso aponta para a necessidade de se adicionar

uma fonte de oxigênio ao experimento, a fim de melhorar os processos de

degradação ao longo de 90 dias.

Figura 79 - Gráfico com a variação dos valores de O.D. do experimento 2, mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

Através da estatística descritiva foi possível observar que as maiores

médias dos parâmetros físico-químicos monitorados ocorreram no tempo 90

(Figura 80). Esse fato confirma o que foi observado nos gráficos e temperatura,

salinidade, O.D., e EH mostrados anteriormente (Figuras 75 a 79). Os tempos

T0 e T90 apresentaram maiores variações (máximo e mínimo). Enquanto que

T60 apresentou menor variação.

151

Figura 80 – Gráfico de box plot para os parâmetros físico-químicos (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade monitorados no experimento 2

Quanto aos resultados do teste de Cluster, as maiores similaridades são

encontradas em T30 e T45. Foram formados dois principais grupos, um pelo

T90 e outro pelo T0, T8, T60, T15, T75, T30, E T45. As menores similaridades

foram encontradas entre o T90 e os demais tempos (Figura 81).

Figura 81 – Gráfico de similaridade (Cluster) entre as variáveis dos parâmetros físico-químicos (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade monitorados no experimento 2

O tratamento estatístico utilizando a análise dos componentes principais

(ACP) como ferramenta mostrou que os parâmetros físico-químicos (pH,

Média Média±SEMédia±SD

T0 T8 T15 T30 T45 T60 T75 T900

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

T90 T45 T30 T75 T15 T60 T8 T0

0

5

10

15

20

25

152

SALC

SALCBR

SALCBC

SALBRFOSALBRFISALBCFOSALBCFI

TCTCBR

TCBC

TBRFO

TBRFITBCFOTBCFI

OC

OCBR

OCBCOBRFO

OBRFIOBCFOOBCFI

EHC

EHCBR

EHCBC

EHBRFOEHBRFI

EHBCFO

EHBCFI

-1 -0.5 0 0.5 1

PC 1 : 83,12%

-1

-0.5

0

0.5

1

PC

2 : 1

5,1

5%

temperatura, EH e salinidade) monitorados no experimento 2, podem ser

explicados por 98,27 % de variância entre os dois fatores (Figuras 82a e b).

No gráfico de pesos em PC1, todas as variáveis tendem a localizar-se

mais à esquerda do gráfico dos pesos, mostrando que estas estão

correlacionadas negativamente (Figura 82a).

A Figura 82b mostra o gráfico dos escores nas duas primeiras

componentes. A primeira componente (83,12% da informação) foi interpretada

de forma que podem ser observados 3 grupos. Os tempos 0, 60 e 90 estão

correlacionados positivamente. Entretanto o tempo T90 está sendo influenciado

por todas as variáveis. Isso pode ser justificado pela variação nos parâmetros

que ocorreu nesse tempo.

Figura 82 - Análise dos Componentes Principais (ACP) para parâmetros físico-químicos (pH, temperatura, EH, salinidade monitorados no experimento 2. Onde: (a) – Variáveis (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade) e (b) – Casos (T0, T30, T60 e T90)

O gráfico de regressão linear também explica o conjunto de dados dos

parâmetros físico-químicos ao longo do experimento 2. O coeficiente angular

da reta obtida da regressão linear dos parâmetros em função do tempo, mostra

que quanto maior a inclinação da reta (T60), menor a variação dos parâmetros.

A maior variação se encontrou no tempo 90 (Figura 83).

(a) (b)

T0

T30

T60

T90

-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6

PC 1: 83,12%

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

PC

2:

15

,15

%

153

Figura 83 – Gráfico de regressão linear para parâmetros físico-químicos (pH, temperatura, EH, salinidade, monitorados no experimento 2

V.5.3.2.2 Parâmetros químicos

Os macronutrientes como carbono, oxigênio, nitrogênio, potássio, cálcio,

magnésio, fósforo e enxofre são os compostos solicitados pelas células

microbianas (RISER-ROBERT, 1998). Para avaliar o processo de

biodegradação, é indispensável o monitoramento dos nutrientes, em especial

fósforo, nitrogênio e carbono (TÉCNICO, ARTIGO, 2005; SILVA 2009).

Pouco se sabe sobre a degradação de petróleo na presença de

nutrientes e fungos. Baixos níveis de nitrogênio, baixo pH, alto teor de umidade

e escassez de nutrientes não favorecem o desenvolvimento de fungos.

Contudo, o nitrogênio e fósforo são essenciais para o aumento da biomassa

fúngica, quando na presença de hidrocarbonetos (SINGH, 2004).

A degradação de hidrocarbonetos pode ser acelerada pela adição de

uréia, fosfato, e fertilizantes com NPK. As células fúngicas geralmente contêm

menos nitrogênio que as células bacterianas e, portanto, os fungos podem

atuar favoravelmente em ecossistemas que têm um baixo teor de nitrogênio

(BENTO; GAYLARDE, 2001). No entanto, a composição das células fúngicas

pode ser representada empiricamente por C10H17O6N (SINGH, 2006).

T0

T8

T15

T30

T45

T60

T75

T900 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

154

No gráfico 84 pode ser observada a variação dos teores de fósforo nas

unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias. Os

valores variaram entre 134,21 a 258,86 mg/kg. O tempo zero apresentou os

maiores valores, mostrando que ao longo do experimento o fósforo foi

consumido. No gráfico 96 também podem ser observado que houve uma

queda dos teores do fósforo nos T8 e T15 com aumento no T30, o qual se

manteve no T45 e T60, apresentando uma diminuição no T75 e T90.

As concentrações dos hidrocarbonetos devem estar intimamente

atreladas aos nutrientes, e estes devem ser suficientes para suportar a taxa de

crescimento máximo dos microrganismos (NRT, 2000).

Em teoria, aproximadamente é necessário 30mg de fósforo para

conversão de 1g de hidrocarbonetos e materiais celulares (ROSEMBERG;

RON, 1996). Segundo Vallejo et al.(2005) foram encontrados valores baixos de

fósforo ao longo de experimentos realizado com microrganismos o consumirem

rapidamente no início da biodegradação. Isso pode ser observado

moderadamente neste experimento, que pode ser atribuído à presença de

aditivos nutricionais (fibra de coco e folha em pó). Provavelmente os fungos

não utilizaram o fósforo encontrado no sedimento e consumiram o fósforo

encontrado no aditivo, já que esses aditivos (bioestimulantes) foram

imobilizados juntos com os consórcios.

Figura 84 - Gráfico com variação dos teores de fósforo nas unidades de simulação, nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

155

Observando o gráfico 85 onde é mostrada a média dos teores de fósforo

ao longo de 90 dias, pode ser observado que as unidades do óleo da bacia de

Campos com fibra de coco (BCFI) apresentaram a maior média em relação às

demais. A unidade de simulação do óleo da bacia de Campos com folha

(BCFO) em pó apresentou a segunda maior média. Isso pode estar

correlacionado ao nível de degradação diretamente associado com o consumo

do fósforo para a realização do processo, uma vez que o óleo da bacia do

Recôncavo é composto principalmente por hidrocarbonetos saturados,

justificando o consumo desse nutriente no processo inicial da degradação.

Figura 85 - Gráfico com média dos teores de fósforo nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

Tipo de tratamento x teores de fósforo (mg/kg)

A bioestimulação leva à ativação metabólica de alguns fungos

degradadores de petróleo, que na ausência de nutrientes, podem responder

lentamente ao tratamento (ZUCCHI et al., 2003; NWADINIGWE; ONYEIDU;

2012).

Segundo Rosemberg e Ron (1996) são necessários 150g de nitrogênio

para a conversão de 1g de hidrocarbonetos e materiais celulares. Venosa et al.

(1996) constatou que a manutenção de uma concentração de nitrogênio limiar

de 1-2mg N/L na água intersticial dos poros resultaria em máxima

biodegradação de hidrocarbonetos.

Os valores de nitrogênio total variaram de 0,21 (mínimo) e 0,52

(máximo) (%). Na Figura 86 pode ser observado que ocorreu aumento desse

156

nutriente com 75 dias de experimento, seguido de uma diminuição progressiva

até o final do experimento.

Figura 86 - Gráfico com variação dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação, nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

O gráfico 87 mostra a média dos teores de nitrogênio ao longo de 90

dias e pode ser observado que a unidade de simulação com óleo da bacia do

Recôncavo e folha (BRFO) apresentarou a maior média em relação aos

demais. A unidade de simulação do óleo da bacia de Campos com fibra de

coco (BCFI) apresentou a segunda maior média. Em relação à unidade

controle foi possível observar que houve consumo do nitrogênio ao longo de 90

dias. Esse fato pode ser justificado pelo processo de biodegradação atuante.

Figura 87 - Gráfico com média dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

157

As concentrações de carbono orgânico (CO) variaram entre 5,53%

(mínimo) e 10,11% (máximo). No gráfico da Figura 88 pode ser observada a

variação dos teores de CO ao longo de 90 dias. O teor de CO aumentou nos

primeiros 15 dias, seguido de uma diminuição no tempo 30, com posterior

diminuição no T60. No T75 houve um aumento seguido novamente de uma

diminuição.

Figura 88 - Gráfico com variação dos teores de CO% nas unidades de simulação simulação, nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

Observando o gráfico da Figura 89 é mostrada a média dos teores de

CO ao longo de 90 dias. Pode ser observado que as unidades do óleo da bacia

do Recôncavo com folha (BRFO) apresentaram a maior média em relação às

demais. A unidade de simulação do óleo da bacia de Campos com fibra de

coco (BCFI) apresentou segunda maior média, assim como o ocorrido para

concentrações de nitrogênio. Em relação à unidade controle, ocorreu um

enriquecimento de CO, que pode ser justificado pelo aumento da biomassa de

fungos ao longo de 90 dias de experimento. Segundo Wagener (1995),

elevados teores de carbono orgânico em sedimentos, podem estar

relacionados à elevada produtividade biológica.

158

Figura 89 - Gráfico com média dos teores de CO (%) nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

Tipo de tratamento x teores de CO%

A análise dos componentes principais (ACP) dos parâmetros químicos

(fósforo, nitrogênio e CO) monitorados no experimento 2, pode ser explicada

por 98,87 % de variância entre os dois fatores (Figuras 90a e 90b).

No gráfico de pesos em PC1, todas as variáveis tendem a localizar-se

mais à esquerda do diagrama, mostrando que essas estão correlacionadas

negativamente (Figura 90a). Analogamente no PC2, T0 està correlacionado

negativamente com as variáveis T8, T15, T30, T45, T60 , T75 e T90, pois estas

variáveis tendem a localizar-se na parte inferior, enquanto que T0 tende a se

localizar na parte superior do gráfico.

A Figura 90b mostra o gráfico dos pesos nas duas primeiras

componentes. A primeira componente (97,39% da informação) pode ser

interpretada de forma que podem ser observados 3 grupos. Os parâmetros:

nitrogênio e CO, que correspondem ao primeiro grupo são os que apresentam

maior peso positivo em relação ao fósforo. O grupo 2 representado pelo fósforo

na unidade de simulação com folha e óleo da bacia do Recôncavo (PBRFO),

está correlacionado negativamente com nitrogênio e CO. O grupo 3 apresentou

correlação negativa com os grupos 1 e 2 em relação ao PC2. De modo geral

foi possível observar que no grupo 1, as concentrações de nitrogênio e CO não

influenciaram as variáveis (T0, T30, T60 e T90) ao contrário das concentrações

de fósforo.

159

Figura 90 - Análise dos Componentes Principais (ACP) parâmetros químicos (fósforo, nitrogênio e CO) monitorados no experimento 2. Onde: (A) –Variáveis (T0, T30, T60 e T90) e (B) – Casos (fósforo, nitrogênio e CO)


A quantificação de células microbianas e a sua diversidade são

informações importantes para avaliar o potencial dos processos de

biorremediação, assim como a taxa de contaminação do local (MPHEKGO;

CLOETE, 2004)


No gráfico das Figuras 91 e 94 pode-se observar o número de células

viáveis bacterianas e fúngicas (UFC) em amostras controle (C) (sem adição de

hidrocarbonetos); em amostras controle contaminadas com óleo da bacia do

Recôncavo (CBR); em amostras controle contaminadas com óleo da bacia de

Campos (CBC); em amostras contaminadas com óleo da bacia do Recôncavo

+ consórcio 1+ fibra de coco (BRFI); em amostras contaminadas com óleo da

bacia de Campos+ consórcio 2 + fibra de coco (BCFI); e em amostras

contaminadas com óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha (BRFO),

amostras contaminadas com óleo da bacia de Campos + consórcio 2 + folha

(BRFO) nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias.

T0

T8

T15 T30

T45 T60 T75 T90

-1 -0.5 0 0.5 1

Factor 1 : 97,39%

-1

-0.5

0

0.5

1

Fa

cto

r 2

:

1,4

8%

NC NCBR

NCBC

NBRFO

NBRFI

NBCFO NBCFI

CC

CCBR CCBC

CBRFO

CBRFI

CBCFO

CBCFI MC

MCBR MCBC

MBRFO MBRFI

MBCFO

MBCFI

PC

PCBR

PCBC

PBRFO

PBRFI PBCFO

PBCFI

-9

-8 -7 -6 -5

-4 -3

-2 -1

0 1 2 3 4

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

(a) (b)

1

2

3

PC1:

P

C1

:

160

Na Figura 91 pode-se observar que nas amostras controle, o número de

células viáveis (UFC) bacterianas, foi zero, mostrando que o sedimento foi

esterilizado adequadamente. Após 8 dias de experimento cresceram células

bacterianas nas unidades de simulação CBR, CBC e BCFI. O maior pico de

células bacterianas foi encontrado no T15. Tendo posteriormente uma

diminuição brusca no T30. O aparecimento de células bacterianas pode estar

relacionado ao manuseio nas unidades de simulação. uma vez que para as

coletas das amostras foi preciso abrir as unidades de simulação. Deve ser

destacado que mesmo que em fluxo lâminar, o processo não isenta a

possibilidade de contaminação.

Figura 91 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de bactérias nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

As maiores médias para quantificação de células bacterianas ocorreram

no tempo 15, comprovando o que já foi observado no gráfico da Figura 93. O

gráfico box plot da Figura 92 mostra que o T8 e T15 apresentaram as maiores

variações (máximo e mínimo, respectivamente), enquanto que T30 apresentou

menor variação.

161

Figura 92 – Gráfico de box plot de células bacterianas (UFC) monitorados no experimento 2

Os resultados do teste de similaridade (Cluster) seguem descritos na

Figura 93. A Figura 93 mostra o dendograma relativo à similaridade das células

bacterianas (UFC) monitoradas no experimento 2. As maiores similaridades,

são encontradas em T30 e T0, e as menores similaridades foram observadas

entre o T15 e T8.

Figura 93 – Gráfico de similaridade (Cluster) de células bacterianas (UFC) monitorados no experimento 2

Média

Média±SE

Média±SD

T0 T8 T15 T30 T45 T60 T75 T90

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

T15 T8 T45 T60 T75 T90 T30 T0

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

162

O diferencial dos fungos em relação aos demais grupos microbianos se

deve à maior dispersão das hifas, resultando em maior área efetiva de atuação

e produção de enzimas extracelulares (SILVA, 2009).


células viáveis (UFC) fúngicas foi inferior ao demais tempos. Após 8 dias de

experimento cresceram células fúngicas nas unidades de simulação BRFO,

BCFO e BCFI. O número dessas células aumentou, tendo seu pico no tempo

T75. Nos tempos T30 e T60 ocorreu uma diminuição em relação ao tempo

anterior. Na Figura 94 pode ser observado que até o final do experimento foram

encontradas células fúngicas acima do T0, mostrando que os consórcios

fúngicos se mantiveram ativos até o final do experimento. Entretanto com 90

dias essas células diminuíram.

Figura 94 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de fungos nas unidades de simulação simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias

As maiores médias de células fúngicas ocorreram no tempo 75. O

gráfico box plot da Figura 95 mostra que o T60 apresentou maiores variações

(máximo e mínimo). Enquanto que T0 apresentou menor variação. A segunda

maior média encontrada foi no tempo T45 (Figura 95).

163

Figura 95 – Gráfico de box plot de células fúngicas (UFC), monitorados no experimento 2

Os resultados do teste de similaridade (Cluster) seguem descritos na

Figura 96. A Figura 96 mostra o dendograma relativo à similaridade das células

fúngicas (UFC) monitoradas no experimento 2. As maiores similaridades, são

encontradas em T8 e T90, E as menores similaridades foram observadas entre

o T75 e T48, e T60 e os demais tempos.

Figura 96 – Gráfico de similaridade (Cluster) de células fúngicas (UFC), monitoradas no experimento 2

Mean

Mean±SE

Mean±SD

T0 T8 T15 T30 T45 T60 T75 T90-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

T75 T45 T60 T15 T90 T8 T30 T00.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

164

V. 5.3.4. Integração de dados biogeoquímicos do experimento 2

Com a finalidade de melhor interpretar os resultados obtidos, foi feita

uma integração dos dados geoquímicos, microbiológicos e químicos dos

tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento.

Na Figura 97 estão plotados os dados da unidade de simulação BRFO.

As taxas de nitrogênio, fósforo e em menor proporção de CO, decaíram com 30

dias de experimento. Em contrapartida a quantidade de UFC de fungos se

manteve praticamente constante. Mais uma vez, esse fato pode ser justificado

pela rota metabólica dos consórcios fúngicos, pois provavelmente estes

estiveram na fase de consumo de nutrientes sem proliferação (aclimatação). As

razões P/F e HTP/UCM tiveram um leve aumento no tempo 30, mostrando que

provavelmente a biodegradação foi mínima, o que pode ser justificado pelos

fungos estarem se adaptando à fonte de carbono disponível no sedimento.

Figura 97 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BRFO

Nitrogênio

(%)

P/F

(ppb)

CO

(%)

P/nC17

F/nC18

(ppb)

P

(mg/kg)

HTP/UCM

(ppb)

UFC

(FUNGOS)

(ufc/mL 10-5)

165

No T60 foi verificado um aumento de UFC com elevação ao teor de

nitrogênio e fósforo. Isso pode ser atribuído à aceleração do processo de

degradação, fato que pode ser observado através dos valores da razão P/F

(que diminuiu). No T90 as UFC diminuíram levemente, o que coindiu com a

redução dos teores de nitrogênio, fósforo, da razão P/F e HTP/UCM, sendo

portando indicativo de biodegradação (Figura 97).

Integrando os dados para unidades de simulação BRFI foi possível

observar que com 30 dias de experimento a quantidade de UFC de fungos

aumentou seguida de diminuição da quantidade nitrogênio e fósforo, tendo o

mesmo acontecido com a unidade de simulação BRFI, comprovando que o

consórcio fúngico provavelmente segue a mesma rota metabólica (Figura 98).

Figura 98 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BRFI

As razões P/F e HTP/UCM ao longo dos 90 dias diminuíram, sugerindo a

ocorrência do processo de biodegradação. Em contrapartida as razões P/nC17

Nitrogênio

(%)

P/F

(ppb)

CO

(%)

P/nC17

F/nC18

(ppb)

P

(mg/kg)

HTP/UCM

(ppb)

UFC

(FUNGOS)

(ufc/mL 10-5)

166

e F/nC18 aumentaram, sendo indicativo de biodegradação também. Com 90

dias observou-se um decaimento da UFC. No entanto, isso não significa que

processo de biorremediação foi interrompido, pois provavelmente a quantidade

de UFC foi o suficiente para dar continuidade ao processo de biodegradação.

As unidades de simulação BCFI e BCFO se comportaram de forma

similar ao longo de 90 dias de experimento. Com 30 dias de experimento

observou-se aumento da UFC e diminuição dos teores de nitrogênio e fósforo.

Segundo Xia et al. (2006), o potencial microbiano em degradar compostos

polares está relacionado à presença do carbono, nitrogênio e fósforo. Estes

compostos são importantes para o metabolismo microbiano, e cada organismo

requer concentrações diversificadas desses compostos, sendo a investigação

destas condições ideais, essencial para a potencialização do processo de

biorremediação (XIA et al. 2006; MACIEL et al., 2011).

Também observou-se diminuição da razão P/F e o aumento das razões

P/nC17 e F/nC18. Com 90 dias esse processo se manteve aumentando (Figura

99 e 100).

167

Figura 99 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BCFI

Nitrogênio

(%)

P/F

(ppb)

CO

(%)

P/nC17

F/nC18

(ppb)

P

(mg/kg)

HTP/UCM

(ppb)

UFC

(FUNGOS)

(ufc/mL 10-5)

168

Figura 100 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BCFO

Nitrogênio

(%)

P/F

(ppb)

CO

(%)

P/nC17

F/nC18

(ppb)

P

(mg/kg)

HTP/UCM

(ppb)

UFC

(FUNGOS)

(ufc/mL 10-5)

169

V. 5.4 EXPERIMENTO 3 (BIORREATORES)

Para o experimento 3 foram obtidos novos resultados em relação ao

monitoramento geoquímico, químico e microbiológico. As siglas utilizadas

foram as seguintes: BIO1 (controle BR), BIO2 (óleo + consórcio 1+ fibra de

coco) e BIO3 (óleo + consórcio 1+ fibra de coco).

Segundo Singh (2006) os biorreatores têm sido usados para a remoção

de vários poluentes. Quando se usa fungos nos biorreatores estes podem ser

denominados de micorreatores. Estes podem ser de dois tipos: (1) sistemas

com fungos imobilizados e (2) de crescimento suspenso. Os micorreatores

podem ser operados em condições aeróbias ou anaeróbias.

Vários fungos imobilizados são usados em reatores para facilitar a

biodegradação rápida. As características físicas, químicas e biológicas são

parâmetros que afetam os bioprocessos e são importantes no monitoramento

e controle de desempenho dos biorreatores e na sua melhoria (CROGNALE et

al., 2002).


Os cromatogramas das amostras coletadas no T0, T30, T60 e T90 do

biorreator 1 (BIO1), biorreator 2 (BIO 2) e biorreator 3 (BIO3), podem ser

verificados na Figura 101.

Os cromatogramas para o BIO1, que correspondem aos processos

ocorridos no biorreator controle com óleo, no qual não foi adicionado nenhum

tipo de aditivo nutricional e nem células fúngicas, mostram que quase não

houve processo de degradação. No BIO 2, onde foram adicionadas cápsulas

com fungos imobilizados à base de fibra de coco, visivelmente foi possível

observar a redução de compostos lineares com consequente elevação da linha

de base. O mesmo aconteceu no BIO 3 (duplicata do BIO2), com diferença que

no T60 foi possível observar uma redução dos n-alcanos mais expressiva do

que no bio 2.

170

Figura 101 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados dos biorreatores (BIO1, BIO2 e BIO3) nos períodos T0, T30, T60 e T90

Tempo Biorreator - BIO1 Biorreator - BIO2 Biorreator - BIO3

T0

T30

T60

T90

Intensidade (Volts) X Tempo em minutos

Apesar da degradação ter sido menos expressiva no BIO 1, fato já

esperado, foi possível servar um aumento dos n-alcanos ao final de 90 dias, o

que pode ser atribuído à quebra de moléculas de maior massa molecular. Os

cromatogramas do BIO 2 e BIO 3 inferem degradação expressiva ao longo de

90 dias, com redução dos n-alcanos (C13-C34) com aumento da UCM.

A utilização de fungos em teste de biorremediação de hidrocarbonetos

de petróleo em biorreator apresentou remoção de HTP durante um

experimento realizado com sedimento de manguezal (LI; LI, 2011).

http://www.scientific.net/author/Yu_Ying_Li_1

http://www.scientific.net/author/Bing_Li_16

171

Perez-Armendáriz et al. (2004) em um estudo sobre remoção do

petróleo em solos do México, comprovaram a presença microbiana indígena no

solo contaminado, que foi utilizado em bioreatores. No biorreator testado com

bioestimuladores (nitrogênio e fósforo), houve remoção de 61,5% de HTP. No

biorreator onde foram realizados procedimentos de bioaumento, devido ao

efeito sinérgico do fungo filamentoso Cladosporium sporium e microbiota

indígena foi observada maior remoção de HTP (78,5%). A menor remoção de

HTP foi observada no biorreator estéril, mostrando que a ausência da

microbiota indígena reduziu a remoção de HTP.

A remoção do HTP pode ser melhor observada no cromatograma do

biorreator 2, no T90, onde pode ser notada a redução dos n-alcanos (nC12-

nC33) de forma mais expressiva, do que no BIO3 e no BIO1. Na Figura 101 a

redução do n-alcanos se encontra em destaque.

Em relação à razão Pristano/Fitano, pode ser observado que houve uma

diminuição ao longo de 90 dias. Isso comprova a degradação do óleo da bacia

do Recôncavo. Sendo que quando se compara os resultados do processo

ocorrido no biorreator 1 com os demais, pode se perceber que a razão

Pristano/Fitano foi maior (Figura 102).

Figura 102 – Variação da razão Pristano/Fitano nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento 3

Todas as amostras apresentaram razões Pristano/nC17 maior no T90,

comprovando que houve degradação ao longo dos 90 dias. No gráfico da

p

pb

172

Figura 103 pode ser observado que no biorreator 2 e 3 houve um aumento da

razão Pristano/nC17 ao longo dos 90 dias, ao contrário do ocorrido no BIO 1

indicando uma redução desses valores.

Figura 103 – Variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento 3

Comportamento similar foi observado em todos os biorreatores para a

razão Fitano/nC18. Verificou-se que mesmo no biorreator controle ocorreu

processo de degradação (Figura104).

Figura 104 – Variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento 3

p

pb

pp

b

173

A razão HTP/UCM diminuiu com 90 dias de experimento, sendo indicativo de

degradação. Observando-se o gráfico da Figura 105, no biorreator 2 (BIO2) a

razão aumenta no tempo 60 e depois diminui. Esse fato pode ser atribuído à via

metabólica dos fungos (Figura 105).

Figura 105 – Variação da razão HTP/UCM nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de experimento 3

V. 5.4.2. Monitoramento químico

Para González e colaboradores (2008), uma característica distintiva e

vantajosa do uso de biorreatores está na manipulação e controle das condições

ambientais que leva à otimização da biodegradação e melhor desempenho do

processo. A este respeito, diversas variáveis operacionais podem ser

monitoradas e controladas, tais como: pH, oxigênio dissolvido, concentração de

nutrientes inorgânicos. Ressalta-se que o pH normalmente deve ser mantido

no intervalo entre 6,75-7,25 (GONZÁLEZ et al.,2008).

A biodegradação de compostos orgânicos por Penicillium chrysosporium

foi testado em sistemas de reatores biológicos, onde as taxas de degradação

por fungos imobilizados foi duas ordens de magnitude maior do que em

agitação (PAL, LEWANDOWSKI; ARMENANTE , 1995). As taxas de

degradação podem ser afetadas pela concentrações de fontes de carbono e

nitrogênio, pH e tensão de cisalhamento de fluidos (BUSWELL, 2001).

p

pb

174

Concentrações de nitrogênio e sais de fósforo podem ser usadas como

fonte de nutriente inorgânico, a fim de garantir que não ocorra nenhuma

limitação de nutrientes.

No gráfico da Figura 106 pode ser observada a variação dos teores de

fósforo nos biorreatores ao longo de 90 dias. Os valores variaram entre 144,28

a 210,78 mg/kg. No tempo 90 foram observados os maiores valores, mostrando

que ao longo do experimento, o fósforo se manteve em concentrações ideais

para o processo de degradação. Nessa Figura verifica-se ainda uma queda dos

teores do fósforo nos tempos T30 e T60. Isso pode ser justificado pelo aumento

da população fúngica no biorreator.

Figura 106 - Variação dos teores de fósforo nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas unidades de biorreator

Os valores de nitrogênio total variaram de 0,21% (mínimo) a 0,29%

(máximo). Na Figura 107 pode ser observado um aumento desse nutriente com

30 dias de experimento, seguido de uma diminuição discreta ao final do

procedimento.

175

Figura 107 - Variação dos teores de nitrogênio nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas unidades de biorreator

As concentrações de CO variaram entre 4,02% (mínimo) e 7,78%

(máximo). No gráfico da Figura 108 pode ser observada a variação dos teores

de CO ao longo de 90 dias. O teor de CO aumentou nos primeiros 30 dias

seguido de uma diminuição no tempo 60 e posterior diminuição no T90.

Figura 108 - Variação dos teores de CO% nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas unidades de biorreator

Em geral, os parâmetros químicos não se mostraram fatores limitantes

para o processo de biodegradação em biorreatores.

176



Foi realizada a quantificação de bactérias com o objetivo de testar a

eficiência do biorreator quanto à contaminação de microrganismos

indesejáveis.


células viáveis (UFC) de bactérias foi zero, mostrando que o sedimento foi

esterilizado adequadamente. Após 60 dias de experimento cresceram células

bacterianas no biorreator 1. O maior pico de células bacterianas foi encontrado

no T90 no biorreator 3. O aparecimento de células bacterianas pode estar

relacionado ao manuseio nas unidades de simulação. Uma vez que para as

coletas das amostras foi necessário abrir os biorreatores, mesmo que em fluxo

lâminar, não isentando a possibilidade de contaminação.

Figura 109 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de bactérias nas unidades de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias

Na Figura 110 pode-se observar que nas amostras controle (BIO1), o

número de células viáveis (UFC) fúngicas foi inferior àquele dos demais

tempos. Após 30 dias de experimento cresceram células fúngicas nos

177

biorreatores 2 e 3. As células fúngicas foram aumentando, até alcançar o maior

pico no T90.

Estudiosos tem recomendado o uso de protocolos para a produção de

consórcios aclimatados aeróbicos, com base em lodo ativado em biorreatores.

Nesse estudo foi observado que após 30 dias de operação, o consórcio se

encontra aclimatado e capaz de utilizar o poluente como energia e fontes de

carbono (BARBEAU et al., 1997).

O aumento da quantidade de fungos heterotróficos viáveis em

solos poder ser reflexo das habilidades adaptativas desses isolados fúngicos,

mesmo em caso de descargas antropogênicas deliberadas em grandes

quantidades (OBAYAGBONA; ENABULELE, 2013). Isso pode ser comprovado

no presente estudo, pois observando o gráfico da Figura110 é possível verificar

que ocorreu um aumento progressivo ao longo dos 90 dias de experimento.

Figura 110 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de fungos nas unidades de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias

No gráfico da Figura 111 pode-se observar o número de células viáveis

(UFC) nas amostras nos intervalos de tempo (T0, T30, T60 e T90).

Pode-se notar que nas amostras do BIO1, o número de células viáveis

(UFC) para fungos, teve um aumento após 30 dias de experimento. Ao

contrário do que aconteceu para UFC de bactérias que não houve aumento no

número de células após 30 dias de experimento. Com 90 dias, o número de

178

células aumentaram para fungos e para bactérias, sendo que o crescimento

das bactérias foi bem menos expressiva.

O aumento na população microbiana correspondeu à diminuição na

concentração de TPH durante o mesmo tempo. O aumento da população

microbiana deve-se provavelmente à disponibilidade de três nutrientes

principais, a saber: P, N, e C. No entanto, este aumento não se traduz

necessariamente nas diferenças significativas em termos de degradação de

TPH, para o qual sugere-se a existência de um certo limiar de nutrientes. Essa

suplementação pode ser capaz de acelerar a degradação de hidrocarbonetos

durante as fases iniciais de biorremediação (SARKAR et al., 2005).

Figura 111 - Gráfico de linhas para número de células viáveis (UFC) nas unidade de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90

T0

T30

T60

T90FBIO1 FBIO2 FBIO3 BBIO1 BBIO2 BBIO3

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

179

CAPÍTULO VI - CONSIDERAÇÕES

FINAIS E RECOMENDAÇÕES

PARA TRABALHOS FUTUROS

180

VI. 6.0 Considerações Finais

Os microrganismos cada vez mais vêm sendo utilizados na área da

biotecnologia industrial. Os processos de biodegradação, em particular a

biorremediação, integrados à microbiologia e aplicados à biotecnologia

provavelmente serão um dos grandes progressos de pesquisas nos próximos

anos, principalmente quando aliados aos bioestimuladores naturais.

São de grande interesse da indústria do petróleo o desenvolvimento de

técnicas e bioprodutos que ajudem na recuperação de áreas afetadas pelos

danos causados por esse combustível fóssil.

Buscando conhecer a eficiência de microrganismos e aditivos naturais

como estimulantes na aceleração da degradação do óleo total em sedimento

de manguezal, esta pesquisa baseada em estudos já realizados

internacionalmente, obteve resultados satisfatórios e promissores, os quais

provavelmente melhorarão as técnicas aplicadas na recuperação de áreas

contaminadas com óleo.

O sedimento utilizado no presente experimento, coletado nas

proximidades do rio São Paulo, São Francisco do Conde-Bahia, apresentou

características com predominância de areia muito fina, do tipo polimodal e

moderadamente selecionada, com textura classificada como areia lamosa. Em

relação aos parâmetros biogeoquímicos, os resultados se encontraram dentro

dos padrões necessários para os processos de biorremediação.

A metodologia desenvolvida para fracionamento do óleo da bacia do

Recôncavo e bacia de Campos se mostrou bastante eficiente na separação

das principais frações do óleo (saturados, aromáticos e NSO). O método a

vácuo em coluna cromatográfica aberta nos permitiu que fossem obtidas

frações puras com maior eficiência e rapidez.

No presente trabalho foram realizados 3 experimentos. Em relação aos

resultados obtidos no experimento 1, o monitoramento geoquímico mostrou

que ao longo de 30 dias houve degradação dos n-alcanos o que não pôde ser

observado nas demais frações do óleo da bacia do Recôncavo. Os parâmetros

físico-químicos e químicos foram favoráveis para o processo de

biodegradação. Os dados toxicológicos mostraram que a contaminação do

181

sedimento com cerca de 1% das frações de óleo (saturados, aromáticos e

NSO) da BC e BR, não apresentaram efeitos letais ao copépodo T. biminiensis.

Os resultados microbiológicos demonstraram que os fungos estão

presentes no sedimento e que provavelmente se adaptaram mais rapidamente

à fração de saturados, já que a maior quantidade de UFC foi encontrada na

unidade de simulação contaminada com esses hidrocarbonetos mais leves.

Em relação aos resultados obtidos com o isolamento dos fungos, foi

possível observar que no total foram isoladas 72 fungos, sendo que a menor

quantidade de isolados foi obtida da unidade de simulação contaminada com

fração de saturados. Integrando os dados de quantificação com o de

isolamento foi possível concluir que apesar da unidade de simulação com

saturados ter apresentado maior quantidade de células, apresentou também

menor diversidade de fungos.

Com os dois testes de oxidação, utilizando o indicador DCPIP, foi

possível selecionar fungos com potencialidade para degradar as três principais

frações do óleo da bacia do Recôncavo e do óleo da bacia de Campos. Foi

possível observar que fungos isolados do sedimento limpo foram capazes de

oxidar as três frações dos dois tipos de óleo. Também foi possível concluir que

alguns isolados oxidam mais rapidamente e com maior eficiência do que

outros.

Os resultados do crescimento radial dos fungos selecionados demonstrou

que os fungos são classificados como de crescimento lento, médio e rápido, e

que a depender do tipo do meio de cultivo, a velocidade do seu crescimento

pode variar. A velocidade do crescimento das colônias não está atrelado à

rapidez na oxidação dos compostos orgânicos. As maiores médias de

crescimento radial ocorreram quando cultivados com o meio 2. Os fungos

cultivados no meio 1 mais fração apresentaram variação maior entre valores

máximos e mínimos para crescimento e maior velocidade de crescimento radial

(VCRs).

O teste de antagonismo mostrou que alguns fungos podem conviver de

forma harmônica e que outros podem inibir o crescimento, gerando assim uma

forma de competição. Para os fungos isolados e selecionados com

potencialidade em degradar o óleo da bacia do Recôncavo, dos 16 isolados

capazes de degradar a fração de saturados apenas 1 apresentou ação

182

antagônica. Para a fração de aromáticos, cinco apresentaram ação similar e

nove cresceram de forma harmônica. Já para a fração de NSO foram 16

isolados, onde três apresentaram ação antagônica, enquanto 13 não

apresentaram atividade antagônica entre si.

No teste de confrontação direta para as frações do óleo da bacia de

Campos, dos fungos isolados e selecionados com potencialidade em degradar

fração de saturados, 3 fungos apresentaram atividade antagônica. Para a

fração de aromáticos, seis apresentaram ação antagônica e oito cresceram de

forma harmônica. E para a fração de NSO seis apresentaram ação antagônica

enquanto 17 não apresentaram atividades antagônicas entre si. De forma geral,

a maioria dos fungos, é capaz de viver de forma harmônica.

O consórcio 1 (com potencialidade para degradar o óleo da bacia do

Recôncavo) foi composto por 29 fungos; e o consórcio 2 (com potencialidade

para degradar o óleo da bacia de Campos), por 28 fungos. Os consórcios são

compostos por fungos que apresentaram teste de oxidação das frações dos

óleos estudados acima de 50%, teste de antagonismo negativo e por fungos

que têm os três tipos de velocidade de crescimento radial (lento, médio e

rápido). Quanto à imobilização dos consórcios, visivelmente a imobilização a

base de fibra de coco se mostrou mais eficaz que a imobilização a base de

folha.

Com os resultados do microcultivo, foi possível observar que entre os

isolados alguns apresentam estruturas potencialmente similares, e típicas de

gêneros dos fungos Aspergillus e Penicillium, já conhecidos por suas

potencialidades em degradar hidrocarbonetos do petróleo, e que ainda são

largamente utilizados em processos de biorremediação.

A aplicação dos consórcios imobilizados com potencialidade em degradar

os dois tipos de óleo estudados (experimento 2) em condições laboratoriais,

apresentou resultados promissores para o entendimento do processo de

biorremediação em sedimentos de manguezal.

Os resultados do monitoramento químico e físico-químico se mostraram

dentro dos padrões necessários para a ocorrência do processo de

biorremediação. Em relação ao processo de bioestimulação utilizando a fibra

de coco e folha de manguezal em pó imobilizada, não foi possível observar

uma diferença significativa na eficiência em relação à liberação de nutrientes.

183

Em contrapartida, pôde ser observado que de alguma forma foram mantidos os

teores de nutrientes adequados ao longo de 90 dias de experimento, o que não

ocorreria se não tivesse sido adicionado nenhum tipo de aditivo nutricional.

Em relação ao bioaumento foi possível observar aceleração na

biodegradação em relação ao controle, no qual foi observada a atenuação

natural. Os microrganismos provavelmente seguem a mesma rota metabólica,

mesmo que em unidades de simulação diferentes.

A partir da visualização dos cromatogramas referentes ao óleo total, foi

possível observar que o óleo da bacia do Recôncavo sofreu uma modificação

no perfil ao longo dos 90 dias. Houve redução dos n-alcanos mais leves com

aumento da linha de base, mostrando que também ocorreu degradação das

frações mais pesadas.

Os cromatogramas que mostram a modificação do perfil do óleo da bacia

de Campos levam à conclusão que os fungos contidos no consórcio têm a

habilidade de reduzir os hidrocarbonetos saturados (n-alcanos), mas parecem

ter maior habilidade em degradar os compostos aromáticos e NSO.

Em relação à razão Pristano/Fitano, pôde ser observado que houve uma

diminuição ao longo de 90 dias. Isso comprova a degradação nos dois tipos de

óleo. O aumento da razão P/nC17 e F/nC18 e a diminuição na razão HTP/UCM

também foram uma indicação da ação de microrganismos no petróleo.

Os dados obtidos para o experimento em um protótipo de biorreator

apresentou melhores resultados quando comparado ao experimento 2. A

redução de n-alcanos do óleo da bacia do Recôncavo foi bem mais expressiva.

As razões Pristano/Fitano, P/nC17, F/nC18 e HTP/UCM também foram indicações

da ação de microrganismos no petróleo. Isso mostra que sedimentos

contaminados, quando tratados em locais confinados, os resultados tendem a

ser melhores. Os parâmetros químicos se encontraram dentro do padrão. Em

relação ao parâmetro microbiológico, apesar de ter ocorrido contaminação por

bactérias, foi possível observar que nos protótipos de biorreatores a presença

de bactérias foi mais bem controlada quando comparada aos resultados

encontrados no experimento 2.

Os resultados, no geral, apontam que os consórcios fúngicos são

promissores para o processo de biorremediação, sendo necessário ainda uma

maior atenção para a interação entre os fungos.

184

VI. 6.1 Recomendações para trabalhos futuros

A partir das análises dos resultados obtidos e em função da

complexidade do controle do processo de biorremediação em ambiente de

manguezal, recomenda-se para futuras pesquisas:

Aprofundar os estudos em relação à fibra de coco e a folha de

manguezal, como estimulantes para o processo de biorremediação;

Realizar microexperimentos onde devem ser testadas várias

concentrações da fibra de coco e da folha de manguezal, com a finalidade

de se observar a forma e concentração de nutrientes liberados por esses

aditivos;

Realizar experimentos com consórcios imobilizados e livres para verificar

a eficiência da forma de imobilização produzida;

Realizar experimentos com os consórcios separadamente para cada tipo

de fração do óleo, a fim de se proceder uma observação mais detalhada

das interações entre os fungos;

Realizar testes de sinergismo entre os fungos isolados;

Formar consórcios com os fungos que foram mais visivelmente,

frequentes ao longo do presente experimento;

Realizar maiores investigações sobre o metabolismo e produção de

enzimas, aliados aos estudos de degradação;

Aprofundar os estudos no protótipo de biorreator desenvolvido, para que

esse possa ser utilizado em outras pesquisas com intuito de obter a

degradação dos componentes do petróleo (Saturados, Aromáticos e

NSO), na sua totalidade.

Avaliar os efeitos dos consórcios no processo de biodegradação em

condições naturais (próximas as que ocorrem no ambiente natural de

manguezal).

Fazer a identificação clássica e molecular dos fungos antes de montar

os consórcios.

185

CAPÍTULO VII - REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICA

186

VII. 7.0 Referências bibliográficas

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AGARRY, S. E. Enhanced bioremediation of soil artificially contaminated with kerosene: optimization of biostimulation agents through statistical experimental design. Journal of Petroleum & Environmental Biotechnology, 2012. ALLINGER, Norman L. et al. 2ª Edição. Química Orgânica, 1976. ALMEIDA, T. da C. de. Ecossistemas de Manguezal: Aspectos Gerais e principais Estressores. 2001. 65 f. Monografia (Graduação em Ciências Biológicas) - Departamento de Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Católica do Salvador, Salvador, 2001. ANDRADE, Meire Cristina Nogueira de et al. Yield of four Agaricus bisporus strains in three compost formulations and chemical composition analyses of the mushrooms. Brazilian Journal of Microbiology, v. 39, n. 3, p. 593-598, 2008. APRIL, Trevor Marc; FOGHT, J. M.; CURRAH, R. S. Hydrocarbon-degrading filamentous fungi isolated from flare pit soils in northern and western Canada. Canadian journal of microbiology, v. 46, n. 1, p. 38-49, 1999. AQUINO NETO, F. Radler; NUNES, D. S. S. Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins. Interciência: Rio de Janeiro, 2003.

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APÊNDICE A - PROTOCOLOS

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Protocolo nº 1 para Fracionamento do óleo da bacia do Recôncavo

Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: PI11120000900

OBJETIVO: Este método possibilita o fracionamento do óleo da bacia do Recôncavo

nos principais componentes (compostos saturados, compostos aromáticos e compostos polares), através da cromatografia liquida a vácuo.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: A cromatografia é um método de separação físico-

químico. Está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária (DEGANI, 1998; IUPAC, 1993). A cromatografia líquida a vácuo - Ou fracionamento por cromatografia líquida – líquido a vácuo consiste em um método por via seca e a bomba de vácuo é utilizada como acelerador do processo. Utilizou um sistema de bomba a vácuo com funil em vidro c/ placa perfurada, junta esmerilhada cônica, c/ saída p/ vácuo em boro acoplado a um balão de fundo redondo (Figura 1). Figura 1 - Aparato do processo que consta de uma coluna de vidro utilizado no fracionamento

Fonte: a autora

Essa metodologia consiste em um método por via seca, onde a bomba de vácuo é utilizada como acelerador do processo. Para eluição dos compostos saturados (F1) é utilizado o solvente n-hexano; para eluir os compostos aromáticos (F2) utiliza-se uma mistura dos solventes hexano e diclorometano na proporção 4:1 e para eluir os compostos polares é utilizada uma mistura dos solventes diclorometano e metanol também na proporção 4:1. Para evitar a mistura foi adicionado um volume adicional para retirar possíveis resquícios de compostos que poderiam ficar retidos na fase estacionária. Essa metodologia diminui o tempo de fracionamento e aumenta a qualidade do fracionamento além de ter a possibilidade de fracionar maiores quantidades de óleo.

MATERIAL

Extrator aberto em vidro com placa perfurada Ø 1 mm e junta esmerilhada cônica com saída para vácuo em boro (Figura 2);

Balão de fundo redondo; Bomba a vácuo; Gel de sílica 0,063- 0,200mm; Fibra de vidro com diâmetro 47mm; Algodão; Lã de vidro; Solventes: n-hexano, diclorometano e metanol.

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PROCEDIMENTO

Montagem do aparato (Figura 2): Ao funil deposita-se na sua extremidade inferior um chumaço de lã de vidro com a finalidade de vedar os furos e impedir a passagem de partículas da fase estacionária (gel de sílica 0,063- 0,200mm). Coloca-se uma membrana fibra de vidro com diâmetro 47mm. Adiciona-se aproximadamente 50g de gel de sílica. Posteriormente transfere-se 0,2g de amostra (a amostra é misturada com um pouco de sílica antes de ser transferida para o sistema), e para que esta não crie caminhos preferenciais durante a eluição do solvente, utiliza-se um chumaço de algodão sobre a amostra.

Figura 2 - Sistema utilizado para o fracionamento de óleo através de um sistema a vácuo

Fonte: a autora

Eluição dos compostos (Figura 3): Aos poucos e de forma contínua são adicionados 120 ml de n-hexano ao sistema para eluir os compostos saturados (F1), sendo que inicialmente coloca um pouco do solvente no sistema, liga a bomba de vácuo para que os compostos desçam uniformemente e posteriormente adiciona o restante do solvente. Entre a primeira fração e a segunda fração eluiu-se pela coluna 100 ml de n-hexano a fim de remover possíveis resquícios de compostos saturados que estariam retidos na sílica, intitulada de fase “morta’.

Posteriormente são eluidos os compostos aromáticos (F2) com uma mistura de dois solventes, 120 ml de hexano + DCM na proporção de 4:1. O processo de fracionamento segue o mesmo padrão da fração de saturados (F1). Entre a F2 e a F3 eluiu-se pela coluna 60 ml da mistura de n-hexano e DCM a fim de remover possíveis resquícios de compostos aromáticos que estariam retidos na sílica, evitando assim a contaminação da próxima fração.

E para eluir os compostos polares (F3) (NSO) foram utilizados uma mistura de 120 ml de DCM + metanol com uma proporção de 4:1 utilizando o mesmo procedimento descrito acima.

Algodão

Amostra Sílica

Lã de vidro e fibra

de vidro

Bomba a

vácuo Balão de fundo

redondo

Coluna aberta

210

Figura 3 - Fracionamento de óleo. a) eluição dos compostos saturados; b) eluição dos compostos aromáticos; c) eluição dos compostos polares

Fonte: a autora

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO,P.S. Introdução a métodos cromatográficos. 5ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993. DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. “Cromatografia, Um breve Ensaio”. Química Nova na Escola, n° 7, p. 21 – 25, 1998. TARGETT, N. M.; KILCOYNE, J. P.; GREEN, B. Vacuum liquid chromatography: an alternative to common chromatographic methods. The Journal of Organic Chemistry, v. 44, n. 26, p. 4962-4964, 1979.

211

Protocolo nº 2 para Fracionamento do óleo da bacia de Campos

Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: PI11120000900

OBJETIVO: Este método possibilita o fracionamento do óleo da bacia de Campos,

através da Cromatografia liquida a vácuo.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: vide protocolo nº1

MATERIAL

Vide protocolo nº1. PROCEDIMENTO

Montagem do aparato: vide protocolo nº1. Eluição dos compostos (Figura 1): o procedimento de eluição foi o mesmo

utilizado no protocolo nº1 o que diferencia é o volume de cada solvente. Foi utilizados 70 ml de n-hexano para eluição da fração de saturados, 20 ml de n-hexano a fim de remover possíveis resquícios de compostos, 180 ml de hexano + DCM (144HEX+36DCM) na proporção de 4:1, 60 ml da mistura de n-hexano e DCM para fase morta e 160 ml de DCM + metanol com uma proporção de 4:1.

Figura 1 - Fracionamento de óleo. a) eluição dos compostos saturados; b) eluição dos compostos aromáticos; c) eluição dos compostos polares

Fonte: a autora

(a) (b) (c)

212

Protocolo nº 3 para seleção de fungos degradadores Teste de oxidação em placas multipoços

OBJETIVO: Este método possibilita a seleção de fungos degradadores de frações

de petróleo.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: Hidrocarbonetos são substratos que requerem um

receptor de elétrons para a etapa inicial da oxidação altamente reduzido (Atlas, 1984). Uma técnica de rastreio rápida é a que utiliza um corante indicador redox 2,6 Diclorofenol indofenol. O método do indicador redox DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) foi proposto para avaliar o potencial que os microrganismos apresentam para degradar hidrocarbonetos usando-os como substrato (Hanson et al., 1993). Esta é uma reação de oxirredução que pode ser sinalizada pela mudança de cor do indicador DCPIP de azul (forma oxidada) para incolor (forma reduzida). A capacidade de um dado microrganismo em degradar o hidrocarboneto é inversamente proporcional ao tempo de virada do DCPIP. O tempo de ensaio geralmente é de 24 a 48h. Para a realização do experimento foi adicionado a cada poço da placa suspensão microbiana, padronizada em 108UFC/mL, meio BH, fonte de carbono (fração de saturados, aromáticos e NSO) e indicador redox DCPIP. Foi feito um controle negativo. Nos poços abióticos (controle negativo) foi adicionada água esterelizada, substituindo a suspensão microbiana. As placas foram incubadas a 30°C e observadas visualmente, no tempo 0 hora e nos intervalos de 24 e 48 horas. Para os fungos que apresentarem a capacidade de utilizar hidrocarbonetos como substrato espera-se a descoloração do meio.

MATERIAL Placas multipoços (24 poços) Meio BH Indicador redox DCPIP Suspensão de fungos em tubos Fração de petróleo (saturados, aromáticos e NSO) Papel filme Ponteira de 1000, 200 e 10 µL Pipetador automáticos de 1000, 200 e 10 µL

PROCEDIMENTO

Etiquetar as placas multipoços com numeração de fungos e tipo de fração em triplicata (Figura 1); todas as placas terão um controle negativo onde não será adicionada a suspensão de fungo;

Adicionar em cada poço 10μL da fonte de carbono (fração) e deixar evaporar o solvente;

Posteriormente adicionar 250μL de meio BH em cada poço; Adicionar 25μL de suspensão microbiana nos poços, com exceção dos poços

controles; Adicionar em cada poço 5μL do indicador redox DCPIP; Passar o papel filme nas bordas das placas; • Incubar a 30º C; • Observar se houve a descoloração nas primeiras 24 horas e após 48 horas; • Classificar a descoloração comparando com o controle, em porcentagem

(25%, 50%, 75% e 100%) (Figura 2).

213

Figura 1 - Esquema para seleção dos fungos em placas multipoços

Fonte: a autora

Figura 2 - Classificação da descoloração em %

Fonte: a autora

PREPARO DO INDICADOR

Dissolver 50 mg de 2,6-dicloroindofenolsódico em 50 mL de água com 42 mg de bicarbonato de sódio. Agitar vigorosamente. Após dissolução, completar com água a 200 mL. Filtrar.

Conservação

Recipientes de vidro âmbar, bem fechados.

Estabilidade

Usar em no máximo 3 dias e padronizar imediatamente antes do uso PREPARO DO MEIO BH

214

Suspender 3,27g do pó do meio BH em 1 L de água purificada . Aquecer frequente

com agitador e deixar ferver por 1 minuto. Depois levar para autoclave a 121ºC por 15

minutos.

PREPARO DA SUSPENSÃO DE FUNGOS

O preparo da suspensão consiste em pegar um fragmento de 0,6 cm com a pipeta de pauster (Figura 3), transferir para um tubo de ensaio com 5 mL de solução salina e agitar no vórtex, retirar 25μL de suspensão de esporos para colocar no experimento e para fazer a contagem. Figura 3. Esquema do preparo da suspensão

Fonte: a autora


GOMES, E. B. Biodegradabilidade de querosene de aviação movimentado pelo Terminal

Portuário de Suape-PE. Pernambuco. 109 p. 2004. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia

de Produtos Bioativos), Universidade Federal de Pernambuco, 2004.

HANSON, K. G.; DESAI, Jitendra D.; DESAI, Anjana J. A rapid and simple screening technique

for potential crude oil degrading microorganisms. Biotechnology techniques, v. 7, n. 10, p.

745-748, 1993.

SOUZA, Cynthia S. et al. Isolamento e seleção de microrganismos degradadores de derivados

de petróleo. In: Congresso Brasileiro de P&D em Petróleo e Gás. 2005

SPAIN, Jim C.; PRITCHARD, P. H.; BOURQUIN, A. W. Effects of adaptation on biodegradation rates in sediment/water cores from estuarine and freshwater environments. Applied and Environmental Microbiology, v. 40, n. 4, p. 726-734, 1980.

5 mL solução salina

esterilizada

215

Protocolo nº 4 para seleção de fungos degradadores Teste de oxidação com agitação

OBJETIVO: Este método possibilita a seleção e confirmação da capacidade oxidativa de

fungos degradadores de frações de petróleo.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: Hidrocarbonetos são substratos que requerem um

receptor de elétrons para a etapa inicial da oxidação altamente reduzido (Atlas, 1984). Uma técnica de rastreio rápida é a que utiliza um corante indicador redox 2,6 Diclorofenol indofenol. O método do indicador redox DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) foi proposto para avaliar o potencial que os microrganismos apresentam para degradar hidrocarbonetos usando-os como substrato (Hanson et al., 1993). Esta é uma reação de oxirredução que pode ser sinalizada pela mudança de cor do indicador DCPIP de azul (forma oxidada) para incolor (forma reduzida). A capacidade de um dado microrganismo em degradar o hidrocarboneto é inversamente proporcional ao tempo de virada do DCPIP. Os experimentos foram realizados em frascos de 20mL com meio de Bushnell Haas, fonte de carbono (fração de saturados, aromáticos e NSO) e suspensão microbiana. Após 48 horas de aclimatação, sob agitação de 200 rpm e a 30°C ± 1°C foi adicionado indicador redox DCPIP para avaliar o tempo gasto para a oxidação biológica da fração testada (Figura 1).

MATERIAL

Vial de 20mL Meio BH Indicador redox DCPIP Suspensão de fungos em tubos Fração de petróleo (saturados, aromáticos e NSO) Papel filme Ponteira de 1000, 200 e 10 µL Pipetador automático de 1000, 200 e 10 µL

PROCEDIMENTO

Etiquetar vials de 20 mL com numeração de fungos e tipo de fração; Adicionar ao vial 0,025 mL da fração e deixar evaporar o solvente; Posteriormente adicionar ao vial 1,85 mL de meio BH; Adicionar 0,75 mL de inoculo do fungo ao vial; Colocar o vial para agitar a 200 rpm e 30º C por 10 horas; Após o período de agitação adicionar ao vial 0,002 mL do indicador redox

DCPIP; Incubar a 30º C; Observar se houve a descoloração nas primeiras 12 horas e após 24 horas; Classificar a descoloração comparando com o vial controle, em porcentagem

(25%, 50%, 75% e 100%) (Figura 2).

216

Figura 1 - Fluxograma para montagem do teste de seleção

Fonte: a autora

Figura 2 - Classificação da descoloração em %

Fonte: a autora

PREPARO DO INDICADOR

Vide protocolo nº3

PREPARO DO MEIO BH

Vide protocolo nº3

PREPARO DA SUSPENSÃO DE FUNGOS

Vide protocolo nº3


BRADDOCK, Joan F.; CATTERALL, Peter H. A simple method for enumerating gasoline-and diesel-degrading microorganisms. Bioremediation Journal, v. 3, n. 2, p. 81-84, 1999. BROWN, Edward J.; BRADDOCK, Joan F. Sheen screen, a miniaturized most-probable-number method for enumeration of oil-degrading microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, v. 56, n. 12, p. 3895-3896, 1990.

CN

Frascos de vidro de 20 ml

(74% do meio) 1,85 mL

do meio Bushnell Haas

25% do inoculo (0,625

mL do inoculo)

Aclimatação (agitação de 200 rpm e a 30° C) Por 12 horas

0,002 mL do indicador redox DCPIP

1% de fração (0,025 mL

de fração)

Controle

25%

50%

75%

90%

100%

217

GOMES, E. B. Biodegradabilidade de querosene de aviação movimentado pelo Terminal Portuário de Suape-PE. Pernambuco. 109 p. 2004. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Produtos Bioativos), Universidade Federal de Pernambuco, 2004. HANSON, K. G.; DESAI, Jitendra D.; DESAI, Anjana J. A rapid and simple screening technique for potential crude oil degrading microorganisms. Biotechnology techniques, v. 7, n. 10, p. 745-748, 1993.

218

Protocolo nº 5 para seleção de fungos degradadores

Crescimento radial OBJETIVO: Este método possibilita o acompanhamento do crescimento radial de

fungos filamentosos, com o intuito de selecionar fungos filamentosos, através da velocidade de crescimento radial.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: Algumas espécies microbianas isoladas de sedimento

são capazes de metabolizar parcialmente os compostos orgânicos (BEKHI & KHAN, 1986; BEKHI et al., 1993). A mineralização total desses compostos pode ser realizada por consórcios microbianos ou culturas mistas com 2 ou mais microrganismos (LEVANON, 1993). Selecionar os microrganismos isolados quanto à capacidade de crescimento em meio de cultivo foi mais uma fonte de informação para formação de consórcios fúngicos. 1ª ETAPA: Preparo das placas MATERIAL

Placas de Petri esterilizada Meio de cultura BDA e Sabouraud Placas com culturas de fungos diversos Papel filme Pipeta de Pasteur esterilizada Paquímetro digital

PROCEDIMENTO

Preparar placas de Petri com os meios a serem utilizados (BDA e Sabouraud); Com auxilio de uma pipeta de Pasteur retirar um disco de micélio (5 mm de

diâmetro) e inocular no centro de uma placa de Petri contendo meio de cultura (Figura 1a);

Repetir para os demais fungos. Cada pipeta de Pasteur deve ser usada individualmente para cada tipo de fungo;

Fazer 4 linhas pontilhadas no fundo das placas (Figura 1b); Incubar a 28º C; As medidas são feitas em intervalos de 2 horas com auxilio de um paquímetro

digital durante 5 dias; Todo o procedimento deve ser feito em condições assépticas.

Figura 1 - (a) Pedaço do fungo transferido para o centro de uma placa contendo meio de cultura. (b) linhas pontilhadas no fundo das placas

Fonte: a autora

219

2ª ETAPA – Biometria dos fungos MATERIAL

Paquímetro digital Placa com o fungo Planilha para anotar os dados

PROCEDIMENTO

O crescimento fúngico foi monitorado medindo o diâmetro do micélio em função do tempo;

A primeira medida é feita logo após o preparo das placas; As demais medidas foram iniciadas após 12 horas de incubação; São tomadas quatro medidas ortogonais entre si; As medidas são feitas a cada 2 horas, durante o dia, por um período de 4 dias.

Figura 2 - Biometria de fungo. (a) Placas com fungos em meios diferentes. (b) Fungo crescido e

paquímetro digital, (c) Aferindo uma das medidas

Fonte: a autora

A velocidade de crescimento radial foi calculada através de regressão linear dos raios das

colônias, utilizando-se a Equação 1, onde r é o raio (mm), t é o tempo (d) e VCR é a

velocidade de crescimento radial (cm.d-1).

Os resultados de VCR dos fungos foram avaliados através de Análise de variância e

Teste de Tukey, para comparação de médias.


ANDRADE, Meire Cristina Nogueira de et al. Yield of four Agaricus bisporus strains in three

compost formulations and chemical composition analyses of the mushrooms. Brazilian Journal of

Microbiology, v. 39, n. 3, p. 593-598, 2008.

(a) (b) (c)

220

DE ANDRADE, Meire Cristina Nogueira; GRACIOLLI, Luiz Antônio. Controle de fungos contaminantes no cultivo do cogumelo comestível shiitake em toros de eucalipto. Acta Scientiarum. Biological Sciences, v. 27, n. 2, p. 293-299, 2005. MAKI, Cristina Sayuri et al. Analyses of genetic variability in Lentinula edodes through mycelia responses to different abiotic conditions and RAPD molecular markers. Brazilian Journal of Microbiology, v. 32, n. 3, p. 170-175, 2001. SILVA, E. M.; MACHUCA, A.; MILAGRES, A. M. F. Effect of cereal brans on Lentinula edodes growth and enzyme activities during cultivation on forestry waste. Letters in applied microbiology, v. 40, n. 4, p. 283-288, 2005.

221

Protocolo nº 6 para Formação e crescimento dos consórcios

OBJETIVO: Este método possibilita a formação e crescimento dos consórcios fúngicos.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: A habilidade em degradar hidrocarbonetos não é restrita a apenas alguns gêneros de microrganismos, pois, vários grupos de bactérias, fungos, algas e algumas cianobactérias têm mostrado possuir essa capacidade (KATAOKA, 2001 apud MARIANO, 2006). Para que ocorra a biodegradação total faz se necessário uma assembleia ou pool de microrganismos capazes de degradar todos os compostos contidos no mesmo e com isso várias pesquisas internacionais têm proposto a utilização de culturas mistas para fins de biorremediação (RAMBELOARISOA et al., 1984; CHHATRE et al., 1996; TANO-DEBRAH et al., 1999; VENOSA et al., 1999; COOKSON, 1995). Os fungos selecionados no ensaio de oxidação (protocolo nº 3 e 4) foram agrupados em consórcios fúngicos, levando-se em consideração os resultados obtidos, com o proposito de avaliar o potencial de degradação dos fungos.

Formação dos consórcios Os consórcios foram formados a partir dos testes realizados para seleção dos fungos degradadores. No teste 1 foram selecionados fungos degradadores para cada fração do petróleo, no teste 2 foram comprovados a potencialidade dos fungos selecionados no teste 1. Os fungos com resultado acima de 50% de oxidação foram selecionados para o consórcio. Para finalizar a formação do consórcio foram analisados os resultados de antagonismo entre os fungos. Aqueles que apresentaram algum tipo de inibição no crescimento foram retirados do consórcio. Foram formados dois tipos de consórcio: Consórcio 1 – para degradar o óleo da Bacia do Recôncavo formado por 34 isolados; Consórcio 2 – para degradar óleo da Bacia de Campos formado por 30 isolados. Crescimento dos consórcios MATERIAL

Frascos de Erlenmeyer de 250 mL Solução salina proporção de 1:100 Placas com os fungos Pipeta de Pasteur esterilizada

PROCEDIMENTO (Figura 1)

Prepara-se 250mL de solução salina, onde pesa-se 2,25g de NaCl e acrescentar 250mL de agua destilada;

Esterilizar a solução salina em autoclave a 120 ºC por 20 minutos; Retirar com auxilio do fundo da pipeta de Pasteur um pequeno pedaço dos

fungos que compôs o consórcio e colocar na solução salina; Incubar Erlenmeyers a 30ºC por 7 dias;

222

Figura 1 - (a) Pedaço do fungo transferido para o Erlenmeyer contendo solução salina. (b)

consórcio para degradar óleo da bacia de Campos

Fonte: a autora


CHHATRE, Suneel et al. Bacterial consortia for crude oil spill remediation. Water Science and

Technology, v. 34, n. 10, p. 187-193, 1996

MARIANO, A. P. Avaliação do potencial de biorremediação de solos e de águas

subterrâneas contaminados com óleo diesel. 162 f. 2006. Tese (doutorado) – Universidade

Estadual Paulista, Instituto de Geociências e Ciências Exatas – Rio Claro, SP.

RAMBELOARISOA, E. et al. Degradation of crude oil by a mixed population of bacteria isolated from sea-surface foams. Marine Biology, v. 83, n. 1, p. 69-81, 1984.

VENOSA, A. D.; STEPHEN, J.R.; MACNAUGHTON, S.J.; CHANG, Y. ; WHITE D.C. Microbial population changes durin g bioremediation of an experimental oil spill. In: proceedings of the 8th international symposium on microbial ecology, Canada. Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Halifax, Canada, 1999.

TANO-DEBRAH, Kwaku et al. An inoculum for the aerobic treatment of wastewaters with high

concentrations of fats and oils. Bioresource technology, v. 69, n. 2, p. 133-139, 1999.

(a) (b)

223

Protocolo nº 7 para Microcultivo

OBJETIVO: Este método possibilita a obtenção de estruturas em boas condições para o

estudo morfológico detalhado.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: O microcultivo se baseia na cultura do fungo em

pequenos pedaços de meio de cultura, entre lâmina e lamínula, onde o crescimento do fungo se desenvolve e fixa na porção inferior da lamínula e na lâmina abaixo do meio de cultura, este método mantém o corpo de frutificação intacta, o que facilita melhor identificar as características dos fungos. 1ª ETAPA: Preparo do microcultivo MATERIAL

1 placa de Petri 1 pedaço de algodão 2 lâminas de vidro 1 lamínula de vidro Placas com ágar BDA com culturas de fungos diversos Placa de Petri pequena com BDA esterilizado 1 pinça esterilizada Lâmina de bisturi com suporte 1 tubo de ensaio com 5mL de água destilada esterilizada

PROCEDIMENTO

Corta um quadrado de aproximadamente 1cm, de BDA esterilizada e colocar sobre a lâmina da placa de microcultivo.

Com auxílio da lâmina de bisturi, retirar quatro pedaços de fungo e semear num dos lados do quadrado de BDA.

Cobrir o BDA semeado com lamínula. Colocar 5mL de água destilada na placa de Petri, embebendo algodão. Tampar a aplaca de Petri. Incubar a 370 C, durante o período necessário (aproximadamente 1 semana).

Figura 1 - Montagem do microcultivo

Fonte: a autora

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

224

2ª ETAPA - Coloração do Microcultivo MATERIAL

1 placa de microcultivo crescida 1 lâmina de vidro 1 lamínula de vidro 1 pinça 1 frasco com formol a 10% 1 frasco conta-gotas com azul de metileno

PROCEDIMENTO

Após as colônias estarem crescidas, acrescentar 10 mL de formol a 10% na placa de microcultivo. Aguardar 24 horas: todos os fungos estarão mortos;

Numa lâmina de vidro limpa, colocar 1 gota de azul de metileno. Com cuidado e utilizando a pinça, retirar a lamínula da placa de microcultivo e depositá-la, com a face onde cresceram as colônias de fungos, sobre a gota azul de metileno;

Retirar o quadrado com BDA; Colocar 1 gota de azul de metileno sobre a lâmina de vidro onde estava o

quadrado de BDA. Cobrir com lamínula. Temos, então, duas lâminas com as colônias crescidas;

Observar ao microscópio na objetiva de 10 e 40X e tirar fotos.

Figura 2 - Lâminas coradas e prontas para visualização no microscópio

Fonte: a autora


JORGE, Antonio Olavo Cardoso. Microbiologia: atividades práticas. Santos, 2008. Fonte: MICROBIOLOGIA Atividades Práticas http://www3.fsa.br/localuser/Biologia/arquivos%20pdf/micro%20-%202006%20 %20pr%C3%A1tica.pdf RIDDEL, RW. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42: 265-270, 1950

225

Protocolo nº 8 para Contagem de esporos

OBJETIVO: Este consiste em um método quantitativo em que o resultado é expresso em

numero de esporos por volume de uma suspensão.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: Tem como base a preparação de suspensão de esporos de

fungos filamentosos e contagem do número de esporos com auxilio de uma Câmara de Neubauer ao microscópio óptico.

Material Tubos de ensaio de 25 mL; Estante para tubos de ensaio; Agitador de tubo de ensaio; Micropipeta de 10 mL e 1000 μL; Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 μL; Camara de Neubauer; Microscópio óptico.

Procedimento

Pegar um fragmento de 0,6 cm com a pipeta de Pauster, transferir para um tubo de ensaio

com 5 mL de solução salina e agitar no vórtex.

Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de uma micropipeta;

Colocar a suspensão na caneleta da câmara de Neubauer, já coberta com a lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de Neubauer;

Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a contagem e reduzindo erros;

Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou 400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados (subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).

Figura 1 - Figura esquemática da câmara de Neubauer. Campos de contagem: E1, E2, E3, E4 e E5

Fonte: EMBRAPA, 2012

Para determinar o numero de ESPOROS utilizou-se a formula a seguir para cada repetição: ESPOROS/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}

E1

E3

E4 E5

226

Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5

Figura 2 - Tubos de ensaio com suspensão de fungos.

Fonte: a autora


EMBRAPA MEIO AMBIENTE. Avaliação da qualidade de produtos à base de Trichoderma. IV Curso Teórico e Prático. Disponível em: http://www.cnpma.embrapa.br/down_site/forum/2012/trichoderma/Apostila_Trichoderma_2012.pdf.

MARTINS, L. R. Avaliação do potencial biotecnológico de fungos brasileiros em reações de fungos brasileiros em reações de biotransformação e biorremediação. 2009. 203 f . Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Química. 2009.

227

Protocolo nº 9 para Teste de antagonismo

OBJETIVO: Este método consistiu em testar a ecologia e as interações dos fungos

selecionados.

TEORIA E SIGNIFICÂNCIA: Na antibiose ocorre a interação entre organismos, onde um metabólito produzido por um deles tem um efeito prejudicial sobre o outro. A produção de metabólitos pode resultar na completa lise e dissolução da estrutura celular e independe do contato físico entre os microrganismos. Grande parte dos microrganismos envolvidos em controle biológico atua através de antibiose (BETTIOL e GHINI, 1995).

Material

Placa de Petri com meio BDA Placas com os fungos Pipeta de Pasteur esterilizada

Procedimento

Para a realização do teste de antagonismo microbiano utiliza-se placas de Petri com meio BDA.

Posteriormente, retira-se um pequeno pedaço circular (6mm Ø) do fungo contido no meio de cultura em que este estava inoculado e colocar em outra placa de Petri.

Foram montados 3 testes de antagonismo. Em uma placa foram testados os fungos que oxidaram 100%, em outra placa os fungos que oxidaram de 50 a 90% e uma terceira placa com todos os fungos selecionados. Isso para cada tipo de óleo separadamente.

Incubar o material a 30°C por 5 dias e durante esse período, observar a formação de halos de inibição do crescimento de alguns fungos, indicativa da presença de antagonismo.

Figura 1 - Placas com consórcio 1. (a) placa após a montagem do consórcio, (b) placa com 24horas e, (c) placa com 7 dias

Fonte: a autora

(a) (b) (c)

228


.

Fonte: a autora


Fonte: a autora


BETTIOL, W.; GHINI, R. Controle Biológico. In: BERGAMIN, A. F.; KIMATI, H.; AMORIN, L. Manual de Fitopatologia. Princípios e Conceitos. 3.ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1995. p.717-728.

(a) (b) (c)

(a) (b) (c)

229

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