UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA ... Mariangela... · L864 Desenvolvimento de procedimentos e sistemas automatizados para controle de qualidade de carnes e produtos

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

MARIANGELA VIEIRA LOPES

DESENVOLVIMENTO DE PROCEDIMENTOS E SISTEMAS AUTOMATIZADOS

PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS

Salvador 2005

MARIANGELA VIEIRA LOPES

DESENVOLVIMENTO DE PROCEDIMENTOS E SISTEMAS AUTOMATIZADOS

PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutora em Química.

Orientador: Prof. Dr. Mauro Korn

Salvador 2005

Lopes Mariangela Vieira.

L864 Desenvolvimento de procedimentos e sistemas automatizados para controle de qualidade de carnes e produtos cárneos. / Mariangela Vieira Lopes. - Salvador 2005.

173 f.

Orientador: Prof. Dr. Mauro Korn Tese (Doutorado em Química) Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, 2005. 1. Carne - Controle de Qualidade. 2. FIA - Método de Análise. 3. Nitrato, Nitrito, Sulfito - Análise de Substância. I. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Química. II. Korn, Mauro. III. Título. CDU: 543.6: 664.91

CDD: 664.907

Dedico A Carlos Roberto Aos meus pais, Antônio e Lira

AGRADECIMENTOS

São tantos e tão significativos... Ao Professor Dr. Mauro Korn, pela orientação no desenvolvimento desta tese e por ter me ensinado que para se trabalhar em pesquisa não é necessário grandes recursos financeiros, contudo é fundamental ter boas idéias, criatividade e muita, mas muita dedicação. A Profa. Maria das Graças A. Korn (Gal), pelo incentivo nos primeiros passos a caminho deste doutorado. Aos colegas de doutorado Sivanildo Borges, Fábio Oliveira e Josué Carinhanha, pela colaboração nos momentos de dúvida e por tantas idéias compartilhadas. Aos alunos de iniciação científica, Rommel Borges, Semirames Motta, Luciana Higino, Eliziane Pedra e Andréa Cordeiro pela colaboração direta no desenvolvimento desta tese e com eles compartilho o mérito deste trabalho. A Madson Pereira pela contribuição nas discussões no decorrer deste trabalho. Aos colegas do laboratório GPQA (Grupo de pesquisa em química analítica), especialmente a Márcia Bispo pelo apoio na realização das análises no ICP. Aos colegas do Laboratório SonoFia, Soledad, Denílson, Lílian, Vitória, Manoel, Daniel, Daniela, Márcia, Bruno, Sapé, Eduardo, pelo convívio alegre e bem humorado e pela companhia, muitas vezes, até altas horas. Ao Departamento de Ciências da Vida da Universidade do Estado da Bahia pelo apoio e incentivo. Aos colegas do Laboratório Central de Saúde Pública Professor Gonçalo Moniz (LACEN), pela amizade e apoio no decorrer deste trabalho. Ao grupo de Instrumentação Analítica do Instituto de Química da Universidade de Campinas, pelo apoio nas atividades com o NIR. Aos meus alunos, que sempre foram incentivadores na escalada por novos conhecimentos. A Carlos Roberto, meu grande companheiro, pelo seu apoio e incentivo ao longo desta jornada. O seu amor foi o bálsamo nos momentos de desânimo. A minha família, irmãos, sobrinhos, cunhados e sogra, pelo incentivo e em especial aos meus pais Antônio e Lira pelo exemplo de vida que sempre foram para mim. Agradeço com o coração.

O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis.

Fernando Pessoa

RESUMO

Neste trabalho, foram desenvolvidos procedimentos e sistemas automatizados para o controle de qualidade de carnes e produtos cárneos quanto à presença de aditivos (NO2

- e NO3-), degradação (evolução de H2S), presença de adulterante (SO3

-) e riscos de contaminação pela capacidade sortiva de metais. O desenvolvimento destes procedimentos vem contrapor as metodologias clássicas recomendadas pelos órgãos oficiais brasileiros. Os métodos e procedimentos aqui desenvolvidos obedecem às recomendações da Química Analítica moderna, as quais priorizam precisão, exatidão, sensibilidade, custos operacionais, versatilidade, robustez, rastreabilidade, minimização de resíduos e produtividade analítica. O sistema de analise por injeção em fluxo (FIA), para análise seletora e discriminatória de H2S evoluído pela carne, foi desenvolvido baseado no método do azul de metileno. O emprego da multicomutação, associado à câmara de pervaporação, conferiu versatilidade ao sistema com produtividade analítica de 30 determinações h-1. Paralelo a isto, foi realizada uma avaliação da degradação de carnes empregando a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) para averiguação das condições de conservação de carnes. Os resultados foram concordantes para as duas metodologias (NIR e FIA), sendo possível detectar indícios de deterioração após 30 min de exposição da carne à atmosfera em temperatura ambiente. O desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de NO2

- e NO3-, em

produtos cárneos, utilizando câmara de tubos concêntricos (CTC) foi baseado no método de Greiss. A CTC proporcionou a divisão da zona da amostra, facilitando as determinações seqüenciais de NO2

- e NO3-. A subzona da amostra que passava pelo

tubo central da CTC resultava apenas na determinação do NO2-. A amostra que

passava pelo tubo externo (coroa) da CTC, percolava grãos de cádmio coperizado, resultando na redução do NO3

- existente à NO2-. Este sistema ofereceu boa

sensibilidade para a quantificação dos analitos, apresentando limites de detecção de 0,018 e 0,036 mg L-1 para NO2

- e NO3-, respectivamente. O procedimento proposto

atingiu produtividade analítica de 120 determinações h-1. O desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito em carnes foi baseado no método da p-rosanilina. Foi empregado câmara de permeação gasosa, onde o SO3

- presente na amostra, permeava através de membrana de PTFE para a reação com o reagente cromogênico. O sistema foi satisfatório para screening analysis, com produtividade analítica de 12 determinações h-1. A capacidade sortiva de metais pela carne bovina foi também avaliada. Foi avaliado o contato estático da carne com soluções de referência de Cd e Pb, preparadas com água de torneira, a pH 6. Foi empregada válvula multiportas, com oito canais para execução dos experimentos, enquanto que metais foram determinados por ICP OES. Os resultados indicaram um elevado poder sortivo, cerca de 80% para ambos os metais, evidenciando risco potencial de contaminação para as carnes submetidas a práticas inadequadas de abate e comercialização.

Palavras – chave: Carnes; FIA, sulfeto, nitrito e nitrato, sulfito, sorção de metais.

ABSTRACT

In the present work automated systems and procedures to control the quality of meats and meat products had been developed, in concern to the additive presence (NO2

- and NO3-), degradation (H2S evolution) and presence of adulterating species

(SO32-). Also the metal sorption capacity on meat was evaluated. The development of

these methods comes to oppose classical methods recommended by brazilian official agencies. The developed procedures follow the recommendations of the modern Analytical Chemical, which prioritizes the precision, exactness, sensitivity, traceability, robustness, reduced operational costs, lesser production of residue and raised analytical productivity. The flow analysis (FIA) procedure to discriminate H2S in meat sample was developed based on methylene blue method. Multicommutation, associated to gas permeation conferred versatility to the system with analytical throughput of 30 determinations h-1. Parallel to this, the spectroscopy in the near infrared region (NIR) was carried out to evaluate meat degradation. A flow system for sequential NO2

- and NO3- analysis in meat products, using concentric tubes chamber

(CTC) was based on the Greiss method. The CTC provides the division of sample zone, permitting the sequential analysis. The sample sub zone that passed for the central pipe of the CTC resulted in the determination of the NO2

-. The sample that passed through external CCP pipe, percolated the cadmium column, allowing the reduction of the NO3

- to NO2-. This system offers sensitivity in the quantification of

anilities with detection limits of 0.036 for NO3- and 0.018 mg L-1 for NO2

-, reaching 120 determinations h-1. The flow system for the screening analysis of SO3

2- in meat sample was based on p-rosanilne method. Chamber for gas permeation was employed. The system revealed efficient for screening analysis with analytical throughput of 12 determination h-1. The metal sorption capacity on meat was evaluated. The investigated species comprised Cd and Pb from solutions prepared with tap water at pH 6. In the experimental set, it was employed an eight channels multiport valve in order to prepare part of the samples, while the metal determinations was carried out by using ICP OES technique. The results obtained demonstrated an expressive retention capacity of meat for Cd2+ and Pb2+ ions with percentages ca. 80% (m/m) for both metals, indicating the potential risks related to the consumption of meat submitted to inappropriate conditions of abattoir, handling, storage and commercialization. Keywords: Meat, FIA, sulphide, nitrite, nitrate, sulphite, metal sorption.

i

LISTA DE FIGURAS

Número Figuras

Página

2.1 Reação de formação do azul de metileno

35

2.2 Diagrama do sistema de análise em fluxo empregado para detecção de H2S

40

2.3 Diagrama eletrônico para o acionamento das válvulas solenóides

41

2.4 Câmara de pervaporação/degradação para detecção de H2S em carnes

42

2.5 Amostras de carne para análise no NIR

46

2.6 Variação do sinal analítico em função da vazão do sistema proposto para uma solução de referência de sulfeto de 1 mg L-1

47

2.7 Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B1 para mistura dos reagentes DMPD e Fe3+

48

2.8 Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B2 para formação do azul de metileno

49

2.9 Variação do sinal analítico em função do número de pulsos para abertura das válvulas (V1 e V2) dos reagentes DMPD e Fe3+

50

2.10 Variação do sinal analítico em função do tempo de interrupção do fluxo

52

2.11 Fiagrama mostrando o perfil do sinal analítico obtido no sistema com o fluxo parado

53

2.12 Fiagrama de 11 replicatasde solução de sulfeto 1 mg L-1

54

2.13 Registro do sinal analítico referente à detecção de H2S

56

2.14 Registro da avaliação da degradação de carnes pelo motitoramento da liberação de gás sulfídrico

56

2.15 Coleção de espectros NIR das amostras de carne

57

2.16 Análise dos componentes principais de 26 amostras de carne

58

2.17 PCA para as amostras dos grupos A e B

58

ii

Número Figuras

Página

2.18 PCA para as amostras dos grupos B e C 59

2.19 PCA para as amostras dos grupos C e D 59

2.20 PCA para as amostras dos grupos A e D 60

2.21 PCA para uma única amostra de carne fresca em função do tempo

61

3.1 Reação de Greiss 73

3.2 Visão frontal (a) e lateral (b) do aparato câmara de tubos concêntricos

77

3.3 Diagrama de fluxo para análise de nitrato e nitrito 78

3.4 Fluxograma da determinação de NO2- e NO3

- segundo normas do Ministério da Agricultura

83

3.5 Fiagrama obtido pela injeção de solução mista de referência de NO2

- e NO3 1 mg L-1 no sistema proposto acoplado a câmara de tubos concêntricos

84

3.6 Efeito da vazão nos perfis dos sinais transientes

85

3.7 Variações dos sinais transientes do primeiro e segundo picos obtidos para alças de amostragem de 20 cm (a) e 40 cm (b) em função da vazão

86

3.8 Variação dos sinais analíticos (pico 1 e pico 2) em função da variação do percurso analítico

88

3.9 Variação dos sinais analíticos em função da variação da alça de amostragem

89

3.10 Variação dos sinais analíticos para soluções simples de NO2- e

NO3- após passagem na coroa da CTC contendo deferentes

massas de Cd

93

3.11 Porcentual de NO3- reduzido a NO2

- pela passagem de solução de referência na coroa do tubo concêntrico, em função do tempo de utilização do sistema

95

3.12 Sinais analíticos para soluções mistas de NO2- e NO3

- obtidos pelo sistema em fluxo acoplado a CTC nas condições otimizadas

97

iii

Número Figuras

Página

4.1 Ação inibitória do sulfito nas reações de escurecimento não enzimático

107

4.2 Reação de descoloração da antocianinas pela ação do sulfito 108

4.3 Reações de dissociação de SO2 e sulfitos 110

4.4 Inativação da tiamina na presença de sulfito 111

4.5 Reações de oxidação da mioglobina 113

4.6 Reações da p-rosanilina com o sulfito 118

4.7 Sistemas para aplicação do método de Monnier-Williams 119

4.8 Diagrama de fluxo para análise de sulfito 121

4.9 Esquema simplificado da câmara de permeação 122

4.10 Esquema da válvula rotatória indicando os canais e a alça na posição de amostragem e injeção

122

4.11 Efeito da razão (R) entre a vazão do carregador e a vazão da solução do coquetel de reagentes sobre o sinal

125

4.12 Variação do sinal analítico em relação ao comprimento da alça de amostragem

126

4.13 Efeito da concentração do HCl no sinal analítico para solução de referência de SO3

- igual a 32 mg L-1 127

4.14 Variação do sinal analítico com o percurso analítico para a parte inferior do sistema de análise em fluxo (B1)

130

4.15 Variação do sinal analítico com o percurso analítico para a parte superior do sistema de análise em fluxo (B2)

131

5.1 Abate clandestino de bovino no sertão baiano 143

5.2 Comercialização de carne fresca e de miúdo de bovinos, em feiras-livres do interior baianao

144

5.3 Comercialização da carne bovina em mercado municipal do interior baiano

145

iv

Número Figuras

Página

5.4 Esquema do módulo SIA empregado para os testes de contaminação das amostras de carne

153

5.5 Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne deteriorada (B) com mudança da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora.

157

5.6 Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne deteriorada (B) sem substituição da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora

159

5.7 Esquema simplificado da desnaturação protéica 162

5.8 Representação esquemática do provável mecanismo de ligação do chumbo e do cádmio com os grupos sulfidrila e amino da proteína

163

5.9 Influência da acidez na dessorção (A) e retenção (B) de Cd2+ e Pb2+ em amostras de carne bovina

168

v

LISTA DE TABELAS

Número Tabelas

Página

1.1 Composição centesimal de carnes bovina magra e gorda 3

1.2 Panorama evolucionário das metodologias empregadas para controle de qualidade de carnes e produtos cárneos comparadas com as metodologias recomendadas pelo MAPA

19

2.1 Parâmetro da rotina de trabalho do programa controlador do sistema em fluxo.

42

2.2 Configuração do sistema em fluxo após otimização para determinação de sulfeto

51

2.3 Resultados para H2S nas amostras de carnes 55

3.1 Sinais referentes às diferentes concentrações de soluções mistas de nitrito e nitrato de sódio

90

3.2 Absorbâncias obtidas pelas soluções simples de NO2- e NO3- após a passagem na coroa da CTC com diferentes massas de cádmio

93

3.3 Parâmetros referentes à otimização do sistema em fluxo 96

3.4 Figuras de mérito para o procedimento em fluxo proposto 96

3.5 Concentrações de NO2- e NO3

-(mg kg-1) em amostras de salsichas (S) e jerked beef (JB) obtidos pelo método oficial (MO) e pelo sistema proposto (FIA)

98

3.6 Concentração de NO2- e NO3- em, amsotras de água mineral

99

4.1 Relação massa/massa entre os agentes de sulfitação e SO2 disponível

109

4.2 Agentes de sulfitação permitidos pela legislação brasileira

111

4.3 Grupos de alimentos nos quais é permitido o uso de

agentes de sulfitação 112

vi

Número Tabelas

Página

4.4 Presença de sulfito livre em amostras de carnes frescas 133

5.1 Parâmetros operacionais utilizados na determinação de Cd e Pb

149

5.2 Passos envolvidos no experimento de retenção de Cd e Pb no sistema SIA proposto

153

5.3 Efeito da esterilização na % de retenção de Cd e Pb em carnes frescas e deterioradas

160

5.4 Efeito da esterilização na retenção de cádmio e chumbo (%) em carnes moídas frescas e deterioradas

164

5.5 Perfil do deslocamento dos íons metálicos Cd2+ e Pb2+ para amostras de carne frescas e deterioradas

165

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC – Association of Official Analytical Chemists

CODECON – Coordenadoria do consumidor

CTC – Câmara de tubos concêntricos

DENA – Dietilnitrosamina

DMNA – Dimetilnitrosamina

DMPD – N, N – dimetilfenil – 1 – 4 diamina

DOU – Diário Oficial da União

EDTA – ácido etilenodiaminotetracético

FDA – Food and Drug administration

FIA – Flow injection analisys

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

ICP OES – Inductudy coupled plasma optcal emission spectroscopy

IN – Instrução Normativa

LACEN – Laboratório Central

LD – Limite de detecção

MAPA – Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento

MO – Método oficial

MS – Ministério da Saúde

NED – Naftil etilenodiamina

NIR –Near infrared

NIRS – Near infrared spectroscopy

OTMA – Óxido de trimetilamina

PCA – Principal component analysis

PCRC – Programa de controle de resíduos em carnes

PLS – Partial least square

PROCON – Procuradoria do consumidor

PTFE – politetrafluoretileno

viii

PVC – Cloreto Polivinil

RDC – Resolução da diretoria colegiada

RMN – Ressonância magnética nuclear

RSD – Relative standard deviation

SI – Sistemas inteligentes

SIA – Sequencial injection analysis

SIMCA – Soft independent modelling of class analogy

VIS – Visível

ix

SUMÁRIO

Lista de Figuras

i

Lista de Tabelas

v

Lista de Abreviaturas

vii

Capítulo 1 – Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos aplicados no controle de qualidade de produtos cárneos

1

1.1. Introdução

1

1.2. Processos envolvidos na transformação do músculo em carne

6

1.3. Deterioração da carne

9

1.4. Metodologias inovadoras 10

1.4.1. Automação e inteligência artificial 10

1.4.2. Automação em sistemas em fluxo 13

1.4.3. Espectroscopia na região do infravermelho próximo – NIRS 15

1.5. Considerações complementares 18

1.6. Objetivos

20

1.7. Referências bibliográficas 20

Capítulo 2 – Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico em carnes integrado a uma câmara de pervaporação

31

2.1. Introdução 31

2.2. Metas 39

2.3. Materiais e métodos 39

2.3.1. Equipamentos 39

2.3.2.Reagentes e soluções 43

2.3.3. Procedimentos 44

x

2.4. Resultados e discussão

47

2.4.1. Otimização do sistema 47

2.4.2. Influência da interrupção do fluxo no sistema 52

2.4.3. Figuras de mérito 53

2.4.4. Aplicação do sistema na análise de carnes 54

2.5. Aplicação do NIR para avaliação da degradação da carne 57

2.6. Conclusões 63


Capítulo 3 – Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato em produtos cárneos, utilizando câmara de tubos concêntricos

69


3.2. Metas 75



3.3.2. Reagentes e soluções 79


3.4. Resultados e discussão 84

3.4.1. Perfis dos sinais analíticos empregando a CTC 84

3.4.2. Efeito da vazão 85

3.4.3. Otimização do sistema 86

3.4.3.1. Efeito do volume amostrado e da vazão 86

3.4.3.2. Percurso analítico 88

3.4.3.3. Avaliação da capacidade de conversão de nitrato a nitrito 89

3.4.3.4. Estudo da massa de cádmio 92

xi

3.4.3.5. Avaliação do tempo de vida útil da coluna de Cd.

94

3.4.3.6. Figuras de mérito 96

3.4.4. Aplicação do sistema para a determinação de NO2- e NO3

- em amostras de produtos cárneos

97

3.5. Conclusões 100


Capítulo 4 – Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito em carnes empregando o método da p-rosanilina por difusão gasosa.

106


4.2. Metas 120

4.3. Material e métodos 120


4.3.2. Reagentes e soluções 123



4.4.1.Otimização do sistema 124

4.4.1.1. Efeito da vazão 125

4.4.1.2. Alça de amostragem 126

4.4.1.3. Concentração do HCl 127

4.4.1.4. Percurso analítico 129

4.4.2. Figuras de mérito 131

4.4.3. Aplicação do sistema em amostras de carne expostas ao consumo 132



xii

Capítulo 5 – Avaliação da capacidade sortiva da carne bovina por íons metálicos

141


5.2. Metas 148



5.3.2. Reagentes, soluções e amostras 150

5.3.3. Procedimento 151

5.3.3.1. Automação do experimento de retenção de metais pela carne empregando válvula multiportas de oito vias

151

5.3.3.2. Retenção em batelada dos metais pela carne 154


5.4.1. Retenção dos metais em sistema automatizado 155

5.4.2. Retenção de metais pela carne pelo método em batelada 160

5.4.2.1. Experimento com a carne fresca e deteriorada, submetida a esterilização ou não

160

5.4.2.2. Experimento com a carne moída fresca e deteriorada, submetida a esterilização ou não

163

5.4.2.3. Avaliação do deslocamento dos metais retidos 165

5.4.2.4. Avaliação da acidez na sorção dos metais 167



Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos

1

CAPÍTULO 1

Panorama atual e novas tendências dos processos

analíticos aplicados no controle de qualidade de produtos

cárneos.

1.1 – Introdução

O consumo de carnes pelo homem acompanha a raça humana desde seu

início. Os primeiros grupamentos nômades caçavam e os alimentos eram

abundantes. Não havia tecnologia disponível para a produção em massa, e nem era

necessário, pois a oferta era maior que a procura. A busca pelo alimento era

primariamente instintiva e não estava atrelada ao conhecimento da necessidade de

ingestão de nutrientes, muito menos à ingestão de alimentos com qualidade

garantida. Hoje, vive-se o paradoxo de que a raça humana (pequenos grupos)

detém conhecimento e tecnologia para produção, melhoramento e controle de

alimentos, mas não apresenta poder aquisitivo (a grande maioria) para adquiri-los.

A produção de carnes no Brasil, somente no primeiro semestre de 2004, foi

de aproximadamente 3x109 kg de carne bovina, 3,5x109 kg de frango e 9,5x108 kg

de carne de porco (IBGE, 2004), considerando-se apenas os estabelecimentos sob


2

inspeção sanitária. Sabe-se que grande parte desta produção se destina ao

consumo externo. O Brasil tem aproximadamente 172 milhões de habitantes (IBGE,

2004), e se considerássemos que toda a produção de carnes fosse consumida

internamente, seria possível atender as recomendações diárias de proteína.

(BRASIL, 1998).

Evidentemente, estas considerações são utópicas, pois estão além das

condições de consumo da população brasileira. Contudo, estes dados demonstram

o potencial produtivo do país e permitem observar nossa auto-suficiência.

Entende-se por carne todo o tecido muscular de animais utilizado como

alimento (PARDI, 2001). Em termos gerais, as carnes podem ser classificadas em

vermelhas e brancas. Carnes vermelhas são aquelas que possuem maior teor de

mioglobina, entre 0,4 e 2% (m/m), e são provenientes de bovinos, bubalinos, suínos,

ovinos, caprinos, coelhos e avestruzes. Por sua vez, carnes provenientes de aves

domésticas são denominadas de carnes brancas, devido à baixa concentração de

mioglobina (ca 0,1%, m/m) (SGARBIERI, 1996).

Pela composição da carne, mostrada na Tabela 1.1, pode ser observada a

riqueza nutricional deste alimento (PHILIPPI, 2001). De maneira geral, as carnes

disponibilizam nutrientes essenciais à vida. A carne é, por excelência, um alimento

protéico e, por conter todos os aminoácidos essenciais, deve ser considerada uma

importante fonte de proteínas de elevada qualidade biológica. Ademais apresenta

alta digestibilidade e biodisponibilidade de seus nutrientes (CHEFTEL et al., 1989).


3

Tabela 1.1: Composição centesimal de carnes bovina magra e gorda.

Nutriente Carne bovina magra 100g

Carne bovina gorda 100g

LipídiosTotais (g) 5,72 18,42

Gordura Polins.(g) 0,18 0,73

Gordura Monos.(g) 2,43 8,26

Gordura Saturada (g) 2,08 7,69

Proteínas (g) 29,03 27,42

Colesterol (mg) 69,07 90,08

Na (mg) 62,060 62,060

Ca (mg) 5,010 11,010

Mg (mg) 27,030 28,020

Zn (mg) 4,75 5,74

Mn(mg) 0,020 0,020

K (mg) 395,4 395,31

P (mg) 226,23 218,19

Fe (mg) 1,96 3,010

Cu (mg) 0,1 0,14

Se( g) 27,13 21,82

Vit. B1 (mg) 0,09 0,11

Vit. B2 (mg) 0,170 0,260

Vit. B6 (mg) 0,380 0,400

Vit. B12( g) 2,18 2,67

Niacina (mg) 3,750 3,860

Folato (g) 7,01 9,010

Pantotenato (mg 0,460 0,350

Vit.D ( g) 0,300 0,300

Vit.E (mg) 0,200 0,480

Programa Virtual Nutri (PHILIPPI, 2001)

As metodologias oficiais indicadas para o controle de qualidade de produtos

cárneos pelos órgãos governamentais brasileiros são fundamentalmente baseadas

na aplicação de métodos gravimétricos, volumétricos e espectrofotométricos. Em

sua maioria, estas metodologias de controle são divulgadas nos compêndios da

AOAC (Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical

Chemists), da FDA (Food and Drug Administration) e no Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater, enquanto que os procedimentos aplicados no

Brasil são divulgados pelos órgãos oficiais de imprensa, como Ministério da Saúde


4

(MS) ou Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) através do

Diário Oficial da União (DOU).

Entre as determinações físico-químicas para o controle de qualidade de

produtos cárneos, preconizadas pelo Ministério da Agricultura, tem-se a pesquisa de

espécies conservantes (ácidos benzóico, salicílico e bórico, formaldeído), corantes,

gás sulfídrico; pH, acidez, nitratos, nitritos, sulfitos e bases voláteis totais, entre

outras.

As instruções normativas 20 e 42 do MAPA (BRASIL,1999), indicam

procedimentos para as análises físico-químicas que devem ser empregados no

controle de qualidade de produtos cárneos e traça o Plano de Controle de Resíduos

(medicamentos, metais e agrotóxicos) em carnes, respectivamente, sendo que

nessa última (IN 42/99) são apresentados os quatro laboratórios oficiais e o

laboratório de referência para receberem e executarem essas análises demandadas

pelos serviços de inspeção de todo o território nacional. Deve ser ressaltado que no

Brasil, para as análises físico-químicas gerais, foram habilitados 26 laboratórios

centrais de saúde pública (LACEN), além dos laboratórios subordinados ao MAPA.

Considerando a produção nacional, deve ser questionada a capacidade dos

cinco laboratórios oficiais em assumirem e responderem às demandas de controle

de resíduos em amostras de carne, mesmo sendo esta realizada por rígidos critérios

estatísticos de amostragem. Tendo em vista a relevância desse controle para a

saúde da população, há que se esperar uma atuação mais enérgica e sistemática

por parte dos órgãos fiscalizadores e, para tanto, a estrutura laboratorial é peça

chave para fornecer as informações químicas necessárias.

Pelo texto da Instrução Normativa 20/1999 ficou estabelecido que “as

metodologias analíticas seriam atualizadas, sempre que a inovação tecnológica


5

assim recomendasse”. Contudo, as normas oficiais de controle de produtos

alimentícios para o território nacional, não foram e nem estão em fase de

atualização, como se não existissem inovações, nem pudessem ser observadas

tendências de modernização dos procedimentos e técnicas de análise, seguindo os

rumos apontados pela Química Analítica. Desta forma, pode ser, mais uma vez,

constatado o distanciamento entre a produtiva Química Analítica brasileira e as

necessidades e demandas da sociedade.

Como anteriormente mencionado, a predominância de métodos clássicos de

análise no controle de qualidade de carnes pode ser explorada para demonstrar a

dualidade da situação atual. Assim, há que se admitir que os métodos clássicos

podem ser instalados em laboratórios de pequeno porte, visto que se baseiam em

técnicas que utilizam equipamentos simples e de fácil manuseio, salvo raras

exceções. Porém, os procedimentos “indicados” para o controle de qualidade

apresentam baixa produtividade analítica, a qual deve ser associada, neste cenário

sombrio, tanto à escassez de recursos humanos minimamente qualificados para

executar as análises, como à elevada demanda existente. Nesta abordagem, a

qualificação profissional é uma meta a ser atingida, embora seja morosa, quando

são aplicados modelos profissionalizantes convencionais. Por outro lado, mesmo

que o contingente de recursos humanos fosse qualificado e numericamente

suficiente, as estruturas laboratoriais não estão projetadas para suportarem um

grande número de técnicos. Desta forma, independentemente das políticas

estaduais e nacionais para qualificação profissional, os procedimentos oficiais de

análise qualitativa e quantitativa de parâmetros de qualidade em amostras de carne

precisam ser revistos.


6

Neste cenário, faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias

alternativas, discriminatórias, de resposta rápida e de simples manipulação que

possam ser aplicados nas rotinas laboratoriais, o que poderia favorecer o aumento

do número de laboratórios prestadores destes serviços. No Brasil, a exportação é

um grande motivador para o incremento e a modernização dos processos de

controle de qualidade de carnes.

Dentro deste contexto, o presente capítulo apresenta uma revisão sobre a

química e bioquímica da carne e traça um panorama quanto aos métodos oficiais

para o controle de qualidade de produtos cárneos, estabelecendo um paralelo entre

estes e os recentes avanços da Química Analítica, quanto a tendência de

implantação e implementação de sistemas automatizados para o controle de

qualidade na indústria da carne. Exibindo assim, um paradoxo entre as metodologias

oficiais e a versatilidade deste cenário futurista.

1.2 - Processos envolvidos na transformação do músculo em carne

A indústria da carne enfrenta a necessidade permanente do desenvolvimento

de novas metodologias para avaliação da qualidade do produto. A expectativa do

consumidor em adquirir um produto de qualidade cresce continuamente, o que induz

à necessidade do controle e garantia, principalmente da qualidade desde a criação

do animal até a chegada do produto à mesa do consumidor.

Após o abate, o músculo sofre transformações bioquímicas e biofísicas,

sendo considerado carne (PARDI, 2001). No processamento da carne para

consumo, esta é submetido a etapas de limpeza, desossa, armazenamento e

distribuição. Além do mais há a possibilidade da adição à carne de substâncias


7

químicas, as quais podem conservar ou fraudar um produto exposto à

comercialização, podendo induzir a aquisição de produto de boa aparência, mas de

qualidade duvidosa. Deve ser ressaltado que a adição de qualquer substância à

carne fresca resfriada, ou congelada, é proibida pelo MAPA. Portanto, é necessário

desenvolver e aplicar processos de análise para a monitoração da qualidade

também nestas etapas.

As primeiras mudanças ocorridas no processo de transformação do músculo

em carne se dão na etapa do rigor mortis, o qual é caracterizado pelo enrijecimento

do músculo do animal, pela interrupção da circulação sanguínea. Assim, o músculo,

privado de oxigênio, sofre glicólise anaeróbia. Nestas condições, o glicogênio

transforma-se em ácido láctico, o que inibe progressivamente a atividade de enzimas

glicolíticas. Por fim, a glicólise é interrompida e, a actina e a miosina (proteínas

miofibrilares) são irreversivelmente combinadas, levando a produção de actomiosina,

a qual confere rigidez à carne (CHEFTEL e CHEFTEL, 1986).

O ácido láctico produzido no rigor mortis cria um ambiente favorável para a

ação de enzimas proteolíticas e bactérias, que decompõem as proteínas em

peptídeos e aminoácidos. A fragmentação das proteínas miofibrilares torna a carne

macia e o odor agradável, pela liberação de substâncias voláteis (nucleotídeos, NH3,

acetaldeído, H2S, diacetilo e acetona), até que esta maturação evolua para um

processo predominantemente microbiano que é a deterioração (RIEDEL, 1992).

O processo de maturação da carne ocorre quando a dureza é atenuada.

Nesta fase ocorre um processo autolítico, com produção de substâncias

nitrogenadas solúveis, aumento de suculência e pequeno grau de lipólise, a qual

leva à rancificação de ácidos graxos. Todos esses fenômenos contribuem para o

sabor e aroma da carne maturada (SALINAS, 2002).


8

Para sua conservação após o abate, a carne deve ser submetida a baixas

temperaturas até atingir ao consumidor final pela manutenção da cadeia do frio

(JAMES, 1996). As baixas temperaturas necessárias para conservação de carnes

atuam, diminuindo ou paralisando o crescimento e a atividade microbiana, além de

retardar as reações enzimáticas e químicas.

Os atributos sensoriais da carne mais estudados são a cor, relacionada à

quantidade de mioglobina presente; a textura, relacionada com o frescor da carne ou

capacidade de retenção da água (CRA); e a dureza (COSTA, 2002).

Em 1996, Gerrard e colaboradores sugeriram o emprego de um sensor para

avaliação da cor de bifes de carne. O processador de imagem foi adequado para

acompanhar a descoloração da carne durante a exposição ao consumo no varejo.

As vantagens deste processador residem no fato de ser um processo não invasivo,

não ser necessário qualquer contato entre o equipamento e a amostra sob

investigação, além de poder utilizar amostras empacotadas, e poder aplicar a lotes

inteiros de carne, assegurando que nenhum defeito potencial ou visível para o

consumidor seja negligenciado. Tan (2004) apresentou uma avaliação dos atributos

de qualidade sensorial da carne, como cor do músculo, marmorização, maturidade e

textura, empregando o método de análise de imagem.

Villarroel et al. (2003) realizaram estudo sobre o efeito do tempo de transporte

de animais sobre os aspectos das qualidades sensoriais de carnes. Concluíram que

o tempo de transporte afeta significantemente a dureza e sabor da carne. Este efeito

é explicado devido ao estresse sofrido pelo animal. Animais sensíveis ao estresse

apresentam temperaturas elevadas e queda rápida do pH, devido ao acúmulo de

ácido láctico e a instalação precoce do rigor mortis (Pardi et al., 2001).


9

1.3. – Deterioração da carne

A deterioração da carne segue imediatamente à maturação, sem que possa

ser observado um limite nítido entre elas. A facilidade com que os diferentes tecidos

são degradados varia com uma série de fatores, como teor de água e de sangue. A

deterioração da carne caracteriza-se pela ação indesejável de microrganismos com

formação e evolução de gases que apresentam odores desagradáveis e, segundo

Reidel (1992), apresenta as seguintes fases:

a) Destruição por hidrólise das substâncias colágenas, do tecido conjuntivo,

caracterizando-se por superfície pegajosa, muita umidade, coloração cinza ou

esverdeada.

b) Destruição das proteínas por hidrólise; intervenção de enzimas bacterianas;

formação de polipeptídeos, reação alcalina.

c) Destruição dos aminoácidos com produção de NH3, H2S, indol, escatol e de

aminas como a cadaverina e a putrescina.

As práticas inadequadas de transporte, armazenamento e comercialização de

carnes, interrompendo ou até mesmo, não cumprindo a obrigatoriedade da cadeia

do frio, altera a qualidade da carne causando sua inevitável deterioração. A evolução

de H2S é um indicador do estado de decomposição da carne. O teste de Eber é

recomendado pelo MAPA para a pesquisa de H2S e se baseia na reação com

acetato de chumbo.


10

1.4 – Metodologias inovadoras

1.4.1 – Automação e inteligência artificial

A inteligência artificial e, em particular, sistemas inteligentes estão

representando papel importante em estabelecer inteligência à maioria dos

equipamentos analíticos, nos quais a maioria dos métodos empregados em análises

de alimentos é baseada (PERIS, 2002).

A primeira vez que o paradigma “inteligência artificial” foi introduzido no meio

cientifico trouxe consigo o conceito de processamento de dados que poderia

mimetizar o raciocínio para a solução de problemas (McCarthy apud LINKO,1998). A

aplicação no controle da qualidade de alimentos como controle de processos

fermentativos, controle de produtos extrusados e diagnósticos de defeituosos, são

alguns exemplos de aplicação da inteligência artificial na indústria de alimentos.

Segundo Peris (2002), a substituição do homem por sistemas automatizados

em laboratórios de controle de qualidade na indústria de alimentos apresenta

algumas vantagens: (a) muitas cópias de um sistema inteligente (SI) podem ser

facilmente feitas; (b) os SI nunca esquecem; (c) os SI, sendo manipulado da mesma

maneira, fazem recomendações comparáveis para situações similares, enquanto

que o homem é influenciado pelos primeiros efeitos e respostas (as informações

novas dominam o julgamento); (d) fraudes ou erros podem ser prevenidos, pois as

informações são logo processadas para as tomadas de decisão; e, finalmente (e) as

múltiplas experiências do homem podem ser combinadas nos SI.

Apesar das vantagens citadas, Peris (2002), ponderou que os SI ainda não

substituem o analista pela criatividade, experiência sensorial e aprendizagem. O


11

homem se adapta automaticamente às mudanças ambientais, enquanto que o SI

deve ser atualizado. A base do aprendizado e a rede neural são métodos que

podem incorporar aprendizado.

O emprego de algoritmos para análise multivariada e os modelos

matemáticos são ferramentas poderosas para a classificação de alimentos de

acordo com a variedade, origem geográfica, composição, identificação de fraudes,

características sensoriais entre outros atributos (SCHALLER, et al.,1998; FERREIRA

et al., 2002; ARVANITOYANNIS et al., 2003; HATEM et al., 2003; DU e SUN, 2004;

BROSNAN e SUN, 2004).

O emprego de “nariz eletrônico” para a avaliação dos compostos voláteis

constituintes do flavor da carne foi proposto por Haugen e Kvaal (1998). O sistema

utiliza tecnologia com sensor do estado gasoso, combinado com processamento de

análise multivariada (rede neural), para análise não destrutiva de compostos voláteis

constituintes do flavor em carnes. O sistema pode ser utilizado para o controle da

qualidade da carne crua ou na produção de produtos cárneos. Contudo, esta técnica

não pode substituir completamente os métodos de referência os quais utilizam

materiais certificados para validação. O emprego do nariz eletrônico no controle de

qualidade de alimentos também foi elucidado por Winquist e colaboradores (1993),

Eklov e outros (1998), Schaller e outros (1998), Blixt e Broch (1999), Boothe e

Arnold, (2002) e Haugen (2001).

Há poucos anos, os primeiros trabalhos sobre língua eletrônica foram

publicados (VLASOV et al., 1996 e 1997; SANGODKAR et al., 1996; DI NATALE et

al., 1996; WINQUIST et al., 1997; LEGIN et al., 1997). Este sistema constitui-se de

uma rede de sensores, geralmente potenciométricos, voltamétricos, condutimétricos

ou amperométricas, associados algoritmos de análise multivariada, classificam e


12

diferenciam grupos, bem como permitem a determinação de espécies de interesse

em amostras de alimentos líquidos. Atualmente, a língua eletrônica está sendo

empregada para diversas finalidades, como para a caracterização e classificação de

vinhos (BURATTI et al., 2004; LEGIN et al., 2003), monitoração de processos

fermentativos (LEGIN et al., 2004; TURNER et al., 2003); classificação de bebidas

não alcoólicas (CIOSEK et al., 2004); determinação de nitrato na presença de cloreto

(GALLARDO et al., 2004); classificação de leites (SIM et al., 2003).

São escassas, até o momento, pesquisas que fazem uso de língua eletrônica

para o controle da qualidade de carnes. Kaneki e colaboradores (2004) utilizaram

sensores potenciométricos de Pt, CuS e Ag2S para detectar compostos orgânicos

sulfurados (putrescina e dimetilsulfeto – DMS).

Arjona e colaboradores (1998) propuseram um método completamente

automatizado para determinar os parâmetros mais comuns em produtos cárneos

curados como concentração de NO2-, NO3

- e NaCl. A proposta para a completa

automação foi baseada no acoplamento de uma estação robotizada para as

operações preliminares (medida da massa de amostra, homogeneização, lixiviação,

filtração e transporte para a zona de aspiração), associada a sistema em fluxo

contínuo para a monitoração espectrofotométrica dos produtos das reações. A

implementação desta proposta eliminaria o congestionamento nos laboratórios de

controle de qualidade de produtos cárneos. No entanto, nos laboratórios oficiais,

onde a demanda para análise destes produtos cárneos depende de programas e

ações de inspeção sanitária, a instalação de sistema robotizado, altamente

especializado, apesar de toda a sua modernidade, seria pouco utilizado.


13

1.4.2 – Automação em sistemas em fluxo

A automação de procedimentos analíticos envolve o emprego de sistemas

onde não haja interferência humana, ou seja, há a combinação de aparatos

eletromecânicos para substituir, aprimorar e/ou suplementar o desempenho e a

inteligência humana (VALCARCEL e LUQUE DE CASTRO, 1987). Logo, a

automação permite a obtenção de um grande número de informações químicas pela

análise de um elevado número de amostras.

A automação de procedimentos analíticos tem incrementado parâmetros de

qualidade como, exatidão, precisão, sensibilidade, seletividade, estabilidade e custo

de análise destes métodos (PINTO, 2002).

Os sistemas de análises por injeção em fluxo (FIA) foram primeiramente

descritos por Ruzicka e Hansen (1975, 1980). A analise em sistema FIA, baseia-se

na inserção de uma alíquota da amostra, na forma líquida, cujo volume é definido em

função das dimensões da alça de amostragem, no percurso analítico onde poderá

ser combinada com outros reagentes enquanto é transportada por uma solução

carregadora para o sistema de detecção. A inserção da amostra no percurso

analítico pode ser feita empregando injetor comutador proporcional, válvula rotativa

ou válvula solenóide. Hipoteticamente, a amostra desloca-se no percurso analítico

em regime de fluxo laminar, dispersando-se fisicamente de forma reprodutível e

produzindo uma zona de amostra bem definida capaz de ser detectada sob a forma

de um sinal transiente (RUZICKA e HANSEN, 1989).

Segundo Valcarcel e Luque de Castro (1987), as principais características dos

sistemas em fluxo (FIA) são: (a) o fluxo não deverá ser segmentado por bolhas de

ar; (b) a amostra deve ser inserida diretamente no fluxo; (c) a alíquota da amostra


14

injetada é transportada no sistema, podendo sofrer processos físico-químicos como

diálise, extração líquido-líquido e reações químicas durante o transporte; (d) a

dispersão ou diluição parcial do analito no transporte até o detector pode ser

manipulada, variando a geometria e as condições hidrodinâmicas do sistema; (e) a

detecção deve ser realizada por sistema de detecção contínua, o qual deve produzir

sinal transiente correspondente a uma das propriedades da espécie química sob

investigação; os sinais transientes devem ser apropriadamente registrados; (f) nem o

equilíbrio físico (o qual envolveria a homogeneização), nem o equilíbrio químico

(onde haveria a reação completa) têm sido alcançado quando do registro do sinal; e,

(g) os intervalos de tempo das operações envolvidas no sistema em fluxo deverão

ser reprodutíveis, visto que as medidas são feitas sob condições de não-estabilidade

e pequenas variações poderão acarretar em alterações no resultado.

Nos últimos anos foi intensificado o emprego de sistemas de análise em fluxo

no campo da análise de alimentos, como demonstrado nos trabalhos de Agater e

Jewsbury (1997). Neste trabalho, era descrito um sistema FIA para a determinação

de vitamina C em amostras de sucos de frutas e suplementos alimentares por

quimioluminescência. Martelli e colaboradores (2001), descreveram um sistema para

determinação de ácido láctico em iogurte. Nogueira e colaboradores (1998)

empregaram sistema de análise em fluxo para a determinação de iodo em amostras

de leite, baseado na ação catalítica do iodo na diminuição da cor do complexo

FeSCN2+. A determinação de NO2- e NO3

- em amostras de produtos cárneos foi

demonstrada no trabalho de Kazemzadeh e Ensafi (2001), no qual o sistema FIA

proposto era baseado na reação do nitrito e nitrato com safranina-O.

Sistemas engenhosos para análises discriminatórias foram propostos por

Gonzalez e outros (2002) e Mannino e outros (1999) para a caracterização de


15

corantes naturais e artificiais em amostras de alimentos e de antioxidantes em

amostras de azeite de oliva, respectivamente. Lima e colaboradores (1999)

apresentaram um sistema de análise por injeção em fluxo, com detecção

potenciométrica equipado com eletrodo tubular seletivo à amônia e unidade difusora

de gás para determinação de nitrogênio total e conseqüentemente proteínas em

amostras de leite e derivados. Uma excelente revisão sobre sistemas de análise

discriminatória em sistema de análise em fluxo foi reportada por Valcárcel e

colaboradores (2002).

Na grande maioria das vezes, as análises em sistema de fluxo apresentam

inúmeras vantagens quando comparada com aquelas em batelada, empregadas

pelos laboratórios oficiais. O baixo consumo de reagentes e amostras, diminuição da

produção de resíduos químicos, o aumento da produtividade analítica, o emprego de

aparatos de pequenas dimensões e, em geral, desenvolvidos nos próprios

laboratórios, foram algumas das muitas vantagens apresentadas (CHRISTIAN e

RUZICA, 1987; RUZICKA e HANSEN, 1987; 1989). Outra vantagem que deve ser

ressaltada nos sistemas em fluxo é a substituição das vidrarias comumente

utilizadas em laboratórios (béqueres, pipetas, buretas, etc) por tubos, bombas e

válvulas, os quais refletem no contato mínimo entre o operador e reagentes tóxicos

além de protegê-los dos gases da atmosfera e de possíveis contaminações

(VALCARCEL e LUQUE DE CASTRO, 1987).

1.4.3 – Espectroscopia na região do infravermelho próximo – NIRS

A indústria de alimentos ocupa o segundo lugar, perdendo para a agricultura,

na qualidade de usuária da espectroscopia na região do infravermelho próximo –


16

NIRS, como técnica aplicada ao controle de qualidade dos alimentos. Isto porque,

segundo McClure (1994), a NIRS apresenta vantagens sobre as outras técnicas

espectroscópicas como:

a) Rapidez, os espectros podem ser tirados em torno de 30 s, sem contar que a

amostra não necessita sofrer pré–tratamentos, economizando tempo e

reagentes, sendo considerada uma técnica limpa. A amostra poderá ser

analisada e devolvida ao conjunto de amostras ou ser analisada em linha.

b) É uma técnica não destrutiva. A mesma amostra poderá ser utilizada para

outros procedimentos analíticos ou retornar à população.

c) Mais de um analito poderá ser determinado a partir de um único espectro.

d) O instrumento é de fácil operação, não sendo necessário pessoal altamente

qualificado.

Apesar de tantas qualidades, o trabalhoso processo de calibração, ainda é um

fator limitante na espectroscopia NIR. Para tanto, é necessário que um grande

número de amostras sejam analisadas pelo método de referência e pelo NIR. Tempo

e esforço consideráveis têm que ser gastos para se determinar os comprimentos de

onda ótimos a serem selecionados na análise. A partir desse estudo são

desenvolvidas e testadas equações que relacionam as reflectâncias e/ou

absorbâncias medidas com o valor do analito em questão (SKOOG et al., 2002).

A espectroscopia no infravermelho próximo é uma das técnicas mais

promissoras para avaliação da qualidade da carne em larga escala. Técnicas

rápidas de screening para determinar a qualidade da carne são de grande interesse

para a indústria e os consumidores (GEESINK et al.; 2003).


17

A espectroscopia NIR tem sido utilizada como uma ferramenta versátil para a

análise de alimentos, ainda mais quando associada à análise multivariada, como

descrito nos trabalhos de Naes et al. (1996) e Dstefanis et al. (2000).

Para o grupo de carnes e produtos cárneos, a espectroscopia NIR tem sido

explorada para avaliação de parâmetros de qualidade como coloração, maciez, teor

de gordura, teor de proteínas, umidade e flavor, tanto em processos na linha de

produção, quanto em análises discretas (TOGERSEN et al., 1999; BRONDUM et al.;

2000; LIU et al., 2003, GEESINK et al., 2003).

Isaksson e colaboradores (1996) determinaram a concentração de gordura,

umidade e proteína por espectroscopia NIR diretamente em carnes moída saídas de

um moinho e concluíram que a utilização do NIR on line forneceu resultados

compatíveis para a proteína, umidade e gordura. Estudo semelhante foi realizado

por Togersen e outros (2003), que determinaram o teor de umidade, proteína e

gordura em lotes de carnes congeladas durante a moagem, utilizando NIR on line.

Este trabalho focava o desenvolvimento e implementação de um sistema NIR on line

sem contato com a amostra. A carne crua semicongelada, depois de moída, passava

pelos furos do moedor, onde eram registrados os espectros.

Byrne e colaboradores (1998) propuseram a aplicação da espectroscopia de

reflectância NIR entre 750 e 1098 nm, para avaliar os atributos sensoriais da carne

como a maciez, textura, flavor e aceitabilidade. A identificação de fraudes, como, por

exemplo, mistura de carnes de diferentes espécies, também pôde ser avaliada por

NIRS, como demonstrado no trabalho de Cozzolino e Murray (2004), no qual, carnes

de frango, boi, porco e cordeiro foram homogeneizadas e seus espectros foram

tirados na região de 400 – 2500 nm (VIS/NIR). O modelo criado classificou mais de

80% das amostras de carnes de acordo as respectivas espécies.


18

Alomar e colaboradores (2003) utilizaram o NIR para diferenciar tipos de

músculos e as categorias de cruzamento das raças FRIESIAN e HEREFORD de

acordo com os padrões chilenos para carcaças bovinas, além da realização da

composição centesimal das carnes. A composição foi feita pela determinação do

extrato seco, gordura, proteínas, cinzas e colágeno. As análises discriminatórias por

regressão parcial dos mínimos quadrados (PLS) identificaram corretamente as raças

e os três tipos de músculos estudados. As concentrações de cinzas e colágeno, não

foram realizadas com sucesso pelo NIR.

1.5 – Considerações Complementares

A Tabela 1.1 mostra um panorama das metodologias recomendadas pelo

MAPA e as metodologias alternativas disponibilizadas na literatura para os diversos

analitos investigados em carnes e produtos cárneos.

Enfim, considerando as tendências da Química Analítica moderna, há que se

admitir que as metodologias oficiais empregadas para o controle da qualidade de

carnes e derivados se constituem, em sua maioria, em técnicas morosas e

dispendiosas. Os sistemas automatizados, dotados ou não de inteligência artificial,

muitas vezes montados na própria linha da indústria, apresentam-se como sistemas

alternativos e verifica-se que a tendência é de que estes sistemas sejam divulgados,

multiplicados e utilizados tanto nos laboratórios de controle de qualidade quanto nos

laboratórios oficias e credenciados do sistema de fiscalização.


19

Tabela 1.2: Panorama evolucionário das metodologias empregadas para controle de qualidade de carnes e produtos cárneos comparadas com as metodologias recomendadas pelo MAPA

Analíto Técnica/método

analítico MAPA

Técnica analítica alternativa Referência

Acidez Volumetria (neutralização)

FIA / biossensores Bergann et al .,1999

Amido Volumetria (Método de Lane-Eynon)

Método enzimático (amilase e amiloglicosidase)

Skrede, G. 1983

Nitrito e nitrato

Espectrofotometria FIA / espectrofotometria Cromatografia líquida

Ahmed et. al., 1996; Ferreira et. al. 1996; Arjona et al., 1998; Kazemzadeh e Ensafi, 2001 Siu e Henshall, 1998 Tanaka et al.; 1982 Dennis et al, 1990

pH Potenciometria (eletrodo de vidro combinado)

Sondas Espectrofotometria no infra vermelho próximo NIR RMN - ressonância magnética do P

Monin ,1998 Andersen,1999 Monin, 1998

Lipídios Extração por Soxhlet, e hidrólise ácida

Extração com fluídos supercríticos Espectrofotometria no infra vermelho próximo (NIR)

Giuseppe et al., 2004 Togersen et al., 1999; Brondum et al.; 2000; Liu et al., 2003, Geesink et al., 2003. Isaksson et.al.,1996.

Cloreto Calcinação seguida de titulação

FIA / sistema robotizado FIA / potenciometria FIA / espectrofotometria

Arjona et al., 1998 Ferreira et al., 1994

Ferreira et al., 1996

N total -Proteínas

Digestão ácida seguida de destilação e posterior titulação (Kjeldahl)

Espectroscopia no infravermelho próximo (NIR)

Togersen et al., 1999; Brondum et al.; 2000; Liu et al., 2003, Geesink et al., 2003. Isaksson et.al.,1996.

Umidade Gravimetria

Espectroscopia no infravermelho próximo (NIR)

Togersen et al., 1999; Brondum et al.; 2000; Liu et al., 2003, Geesink et al., 2003. Isaksson et.al.,1996.


20

Apesar do avanço no desenvolvimento de novas metodologias, ainda há

muito que fazer nesta área, pois a cada dia surgem tecnologias inovadoras e limpas.

Enfim, um cenário futurista onde fosse priorizado o desenvolvimento de

procedimentos precisos, exatos, sensíveis, robustos, confiáveis, com custos

operacionais reduzidos, menor produção de resíduo e com elevada produtividade

analítica.

1.6 – Objetivos

Os objetivos desta tese são:

Desenvolvimento de sistema automatizado para avaliação da degradação e

produção de gás sulfídrico em carnes empregando câmara de pervaporação;

Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitritos e

nitratos em produtos cárneos, utilizando câmara de tubos concêntricos;

Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória

de sulfito em carnes empregando o método da p-rosanilina por difusão gasosa;

Avaliação da capacidade sortiva da carne bovina por íons metálicos.

1.7 – Referências Bibliográficas

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Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico

31

CAPÍTULO 2

Sistema automatizado para avaliação da produção de gás

sulfídrico em carnes integrado a uma câmara de

pervaporação


A carne e os produtos cárneos, quando em processo de deterioração, liberam

H2S, oriundo do enxofre desprendido das pontes dissulfídicas das estruturas

protéícas (cisteína, metionina), ou proveniente do metabolismo de bactérias

contaminantes da carne. O H2S confere à carne um odor característico de

putrefação, o qual torna-se um indicador do processo de degradação. Estas

modificações ocorrem, pois a carne está sujeita a alterações ocasionadas pelas

próprias enzimas tissulares e pela atividade microbiana, devido à natureza perecível

de sua matéria (PARDI et al.; 2001).

Entre as bactérias que colonizam a carne, as que causam danos às

propriedades organolépticas, são encontradas no grupo das não patogênicas, como

as Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas, Aeromonas putrefaciens e


32

Lactobacillus. Já no grupo considerado de elevada patogenicidade para o homem

podem ser citadas a Escherichia coli O157:H7, Salmonela sp, Listeria

monocitogenes, Compilobacter, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,

Stafilococcus aureus, Aeromonas hydrofila e Bacillus cereus (HUFFMAN, 2002).

Nicol e colaboradores (1970) isolaram grupos de bactérias produtoras de H2S

em amostras de carnes resfriadas e entre estes, as Pseudomonas se apresentaram

em maior número. McMeekin e outros (1978), em trabalho semelhante, identificaram

grupos de bactérias formadoras de H2S em carcaças de frangos resfriados e entre

os grupos isolados as Pseudomonas também, foram encontradas em maior número.

A produção de H2S em carnes, além de conferir odor desagradável, pode levar a

produção da sulfomioglobina, pigmento esverdeado que descaracteriza a coloração

vermelha de carnes e é formado, durante o armazenamento, pela ligação de sulfetos

com a mioglobina (pigmento que confere coloração vermelha à carne). Geralmente,

para que isso ocorra é necessário uma atmosfera com baixa pressão de oxigênio (~

1%, v/v) e que o pH seja superior a 6,0 (NICOL et al., 1970).

Lapin e Koburger (1974) avaliaram a produção de H2S por Pseudomonas

putrefaciens em camarões embalados em atmosfera modificada com N2. Esses

camarões desenvolveram odor fétido, diferentemente daqueles que foram

armazenados em atmosfera oxigenada, pois a população microbiana desenvolvida

em atmosfera de N2 produziu maior concentração de H2S do que aqueles

desenvolvidos em atmosfera aeróbia. Observaram também que, a bactéria

Pseudomonas putrefaciens esteve presente nas amostras de camarões frescos, em

pequeno número, quando armazenado em atmosfera aeróbia e em grande número

nos camarões em N2. Por outro lado, este estudo revelou que, os aminoácidos


33

cistina e cisteína foram os prováveis substratos, utilizados pelos microrganismos,

para a produção de H2S.

Além do H2S, outros compostos sulfurados podem ser desenvolvidos durante o

processo de deterioração de alimentos protéicos. Chinivasagam e colaboradores

(1998) monitoraram a formação de compostos voláteis em lagostas, associados à

deterioração microbiana e ao período de armazenamento. Observaram a presença

de metildissulfeto e metilssulfeto nas amostras de lagosta após um dia de

armazenamento. Acima de oito dias de armazenamento o número de compostos

voláteis aumentou e, além dos compostos citados anteriormente, detectaram a

presença de CS2 e de outros sulfetos orgânicos.

Como já elucidado, a causa do odor não característico em produtos cárneos

e/ou protéicos deve-se principalmente à formação de compostos voláteis que podem

ser produzidos por bactérias ou pela hidrólise de aminoácidos, especialmente a

cistina, cisteína e metionina. Contudo, processos tecnológicos empregados na

conservação destes produtos também podem levar à produção de compostos

voláteis indesejados. A irradiação tem sido considerada um processo tecnológico

efetivo na inativação de microrganismos patogênicos em carnes cruas e cozidas. No

entanto, a irradiação poderá levar à formação de compostos voláteis oriundos tanto

da fração lipídica, quanto da protéica. Esta fração protéica é a principal responsável

pela produção de compostos voláteis sulfurados nestes produtos (FAN et al., 2002).

Várias técnicas analíticas empregadas para determinação de H2S e compostos

voláteis sulfurados em produtos cárneos têm sido reportadas na literatura. Entre

estas, podem ser citadas a cromatografia (CHINIVASAGAM et al., 1998; FAN et al.,

2002) e a espectrofotometria, pela reação do H2S com acetato de zinco (LAPIN e

KOBURGER, 1974).


34

Segundo Grassi e outros (2002), a pervaporação pode ser caracterizada

como a integração da evaporação com a difusão gasosa em um único módulo,

sendo uma alternativa viável à difusão gasosa. A separação por pervaporação pode

ser utilizada em amostras líquidas ou em suspensões.

A pervaporação comparada a outros modelos baseados em separação por

membranas (difusão gasosa, diálise, permeação) apresenta vantagens relacionadas

ao poder coligativo da membrana, o qual facilita a aderência de componentes de

elevada massa molar na superfície da membrana; e a deterioração da membrana,

com conseqüente diminuição de sua vida útil, pelo contato direto com a amostra. A

maior vantagem citada quando se compara pervaporação com difusão gasosa, por

exemplo, é o fato da amostra não entrar em contato direto com a membrana,

possibilitando o uso de matrizes complexas (VALLEJO et al., 2001).

A determinação de sulfeto por pervaporação em amostras líquidas e sólidas,

empregando sistema em fluxo foi otimizada por Vallejo e outros, (2001). Grassi e

outros (2002) empregaram pervaporação para determinar carbonato em amostras de

solo em sistema de análise em fluxo. Neste contexto, a pervaporação aponta como

um protocolo viável e exeqüível para determinação de sulfeto em amostras de carne.

No Brasil, o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento – MAPA,

oficializa métodos físico-químicos para o controle de qualidade de produtos cárneos

pela Instrução Normativa 20/99 (BRASIL, 1999). Para a determinação do H2S, o

Ministério recomenda o método fundamentado na liberação do H2S da carne para

impregnação deste em papel embebido com acetato de chumbo, formando uma

mancha escura, característica do PbS. Júnior e Paneta (1992), contestaram a

eficiência deste método e apontaram interferentes e limitações como presença de

temperos e especiarias, além do rígido controle da temperatura que se deve ter. Em


35

geral, as metodologias recomendadas pelos órgãos oficiais brasileiros apresentam

baixa produtividade analítica e consumo excessivo de reagentes.

Lawrence e outros (2000) apresentaram uma revisão sobre estratégias analíticas

para determinação de sulfeto, apontando vantagens e desvantagens de cada

método descrito. A determinação de sulfeto pelo método do azul de metileno foi

citada como a mais usual, e esta envolve a reação, em meio ácido, do sulfeto com o

N,N-dimetilfenil-1-4-diamina (DMPD) que, na presença de Fe3+, resulta na formação

do corante tiazol heterocíclico – azul de metileno. O azul de metileno formado pode

ser facilmente determinado por espectrofotometria no visível, alcançando limite de

detecção da ordem de 0,01 mg L-1.

Emil Fischer em 1886 foi quem primeiro descreveu a reação de produção do

azul de metileno (Figura 2.1) e este teste guarda até hoje, significante valor analítico

em termos de simplicidade, seletividade e sensibilidade (FISCHER apud

LAWRENCE et al., 2000).

Figura 2.1: Reação de formação do azul de metileno

O método do azul de metileno associado à análise em fluxo tem sido empregado

em procedimentos analíticos para determinação de sulfeto em amostras de água e

efluentes, como reportado por Leggett e outros (1981), Cassella e outros (2000) e

Lei e Dasgupta (1989). Contudo, são raras as referências deste método para análise

de sulfeto em alimentos.

N(CH3)2

NH2

H3O+

S

N

(CH3)2N N(CH

3)22S2- +

Fe3+

+

sulfeto DMPD Azul de Metileno


36

Neste contexto, desenvolveu-se um sistema automatizado em fluxo para análise

discriminatória de H2S oriundo de produtos cárneos, para avaliar o grau de

conservação e/ou deterioração destes produtos expostos ao consumo. O sistema foi

baseado na multicomutação. O conceito da multicomutação tem sido bastante

discutido e empregado em sistema de análise em fluxo, incrementando a

versatilidade e o potencial do sistema para automação (MARTELLI et al., 1995;

VIEIRA et al., 1998; ROCHA et al., 2002; ICARDO et al., 2002).

A multicomutação pode ser entendida como um mecanismo de introdução de

amostras e reagentes no percurso analítico de sistemas em fluxo. Estes reagentes e

amostras podem ser submetidos a diversas operações, como: fracionamento,

fatiamento, mistura seqüencial e aprisionamento sob diferentes condições. Um

número de alíquotas, de diferentes soluções miscíveis, pode ser introduzido no

sistema pelo emprego de um comutador, neste caso, válvulas solenóides

controladas por computador. Este fluxo singular pode ser visto como alíquotas

discretas de soluções que rapidamente se misturam enquanto são transportadas no

percurso analítico em direção ao detector. A mistura das alíquotas de amostra e

reagente é mais eficaz com a diminuição do volume das alíquotas das soluções.

Logo, a inserção de n pares de alíquotas da amostra/reagente resultará em 2n – 1

interfaces, onde a mistura irá ocorrer por dispersão axial (ROCHA et al., 2002).

Icardo e colaboradores (2002) descreveram algumas vantagens da

multicomutação, que são abaixo descritas:

(i) Miniaturização da montagem dos sistemas em fluxo devido ao pequeno

tamanho das válvulas solenóides e das interfaces eletrônicas, permitindo

o desenvolvimento de sistemas integrados compactos e equipamentos

portáteis, inclusive para emprego de análises in situ;


37

(ii) Consumo reduzido de reagentes e amostras devido a pequenos volumes

dispensados, podendo alcançar níveis de microlítros;

(iii) Aumento de reprodutibilidade, pois as válvulas solenóides requerem o

mínimo de intervenção do operador. A inserção de comandos liga /

desliga para cada válvula solenóide pode ser controlado por computador,

neste caso a multicomutação facilita o desenvolvimento de métodos

analíticos completamente automatizados;

(iv) Economia e simplicidade. As válvulas solenóides podem ser acionadas

por um simples pulso elétrico, geralmente 12 V e 100 mA, não

necessitando de suprimento adicional de energia. Ademais, esta

operação pode ser controlada por um software desenvolvido numa

linguagem comum de programação como o QuickBasic;

(v) Flexibilidade. A multicomutação permite a inserção de reatores com

diferentes comprimentos, variação no volume de amostras e reagentes.

Mudanças podem ser feitas, simplesmente, trocando a duração dos

pulsos elétricos que ligam as válvulas solenóides ou alterando a

seqüência de comutação.

As aplicações analíticas da multicomutação são bastante diversificadas,

podendo ser empregada para detecção do ponto final de titulações (KORN et al.,

1995), análise espectrofotométrica de ferro e sulfato em digeridos de plantas (REIS

et al., 1994; VIEIRA et al., 1998), determinação espectrofotométrica de níquel, ferro

e cromo em ligas metálicas (MARTELLI et al., 1995), determinação

espectrofotométrica de amônio e fosfato em digeridos de plantas (KRONKA et al.,

1996), especiação de nitrogênio inorgânico em água (ROCHA e REIS, 2000) e

determinação de nitrito, nitrato, cloreto e fosfato (ROCHA et al., 2001).


38

Apesar do sistema proposto nesta etapa, poder quantificar a concentração de

H2S, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de análise qualitativa

para gás sulfídrico em amostras de produtos cárneos, uma vez que, a liberação de

H2S pela carne, já é indicador do processo de degradação da mesma.

Outrossim, na tentativa de traçar um paralelo entre o monitoramento da

deterioração de carnes, pela detecção de gás sulfídrico, em sistema de fluxo e o

perfil de espectros na região do infravermelho próximo (NIR) é que, também foram

realizados, experimentos empregando espectroscopia na região do infravermelho

próximo.

Fraudes em carne bovina, por adição de carnes de outras espécies, como

carneiro e canguru, também já foram estudadas por espectroscopia NIR, e está

documentada nos trabalhos de Ding e Xu (1999) e McElhinney e colaboradores

(1999).

Downey e outros (1997) tentaram diferenciar por espectroscopia NIR carnes

congeladas e descongeladas sucessivas vezes, utilizando o algoritmo SIMCA para

classificação. Liu e Chen (2001) diferenciaram amostras de carnes oriundas de

frangos saudáveis e doentes pela análise dos espectros obtidos de 400 a 2500 nm.

A avaliação do processo de deterioração de carnes por espectroscopia NIR, tem

sido discutida na literatura e está reportada nos trabalhos de Ellis e colaboradores

(2004) e Lin e outros (2004), os quais abordaram o emprego do NIR, em paralelo ao

monitoramento do desenvolvimento microbiano, em frango e carne,

respectivamente. Considerando as vantagens que a espectroscopia NIR apresenta e

o longo tempo gasto na aplicação dos métodos microbiológicos clássicos, faz-se

necessário o desenvolvimento de calibração para este tipo de avaliação. Neste


39

contexto foi realizado um estudo preliminar de monitoramento da deterioração de

carnes pelo emprego da espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo.

2.2 – Metas

De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas desta etapa do

trabalho são:

Desenvolvimento de sistema em fluxo para determinação de sulfeto, pelo

método do azul de metileno, em amostras de carnes.

Otimização do sistema considerando a faixa de concentração do analito na

matriz de estudo.

Monitoramento do processo de degradação de carnes pela liberação do gás

sulfídrico empregando o sistema em fluxo proposto.

Monitoramento do processo de degradação de carnes pelo emprego da

espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo.

2.3 – Materiais e métodos

2.3.1 – Equipamentos

Para as determinações de sulfeto pelo método do azul de metileno em

sistema FIA foi empregado espectrofotômetro Femto 432 (Brasil) equipado com

cubeta de vidro com 10 mm de caminho óptico e volume interno de 200 L, acoplado

a um registrador Ross 101- A 1898 (EUA); bomba peristáltica de oito vias Gilson

MiniPlus 3 (França), para a propulsão dos líquidos; válvulas solenóides de três vias


40

161T031 NResearch; linhas de transmissão em polietileno (diâmetro interno 0,8

mm); tubos peristálticos de Tygon e agitador magnético Fisaton (Brasil).

Microcomputador equipado com interface PCL 711S (Advantech) foi empregado

para aquisição dos dados a uma freqüência de 20 Hz. Um software desenvolvido em

linguagem QuickBasic 4.5 foi empregado para controle de todas as etapas do

processo de análise. O diagrama de tempo e do sistema FIA são apresentados na

Figura 2.2.

Figura 2.2: Diagrama do sistema de análise em fluxo empregado para detecção de H2S: A.

câmara de pervaporação com amostra, D. detector ( = 665 nm), W. descarte. Rc: reciclo, V1 a V6.

válvulas solenóides, C. carregador (H2O), Fe(III). solução de Fe3+, DMPD. Solução de DMPD, S2-.

solução de referência de sulfeto, NaOH. solução receptora, B1. bobina para mistura binária de DMPD

e Fe+3 (50 cm), B2. bobina para a reação de formação do azul de metileno (150 cm), x, y e z.

confluências. Vazão do sistema: 3,0 mL min-1

Diagrama de tempo: LS. Lavagem do sistema, DMPD + Fe(III). Amostragem binária de DMPD

e Fe+3. B1. mistura de DMPD e Fe+3 em B1. AMB SReferência. amostragem binária da solução de

referência. B2. mistura de DMPD e Fe+3 e a solução de referência em B2, D. detector 665 nm, AMB

SReceptora. amostragem binária da solução receptora da amostra. LSR. Lavagem da linha da

solução receptora.

V6

D

C

Fe(III)

DMPD

S-2 referência

NaOH

A

W

V5

V4

V2

V1

V3

x y z

B1 B2

Rc

RcRc

Rc

Rc

V6

D

C

Fe(III)

DMPD

S-2 referência

NaOH

A

W

V5

V4

V2

V1

V3

x y z

B1 B2

Rc

RcRc

Rc

Rc

AMB

SReferência

B1DMPD +

Fe(III)

D

V2

V3

V1

V4

V5

LS

V6

B2 AMB

SReceptora

B1DMPD +

Fe(III)D

LS

B2

LSR


41

As válvulas solenóides foram fixadas em suporte de polietileno. O

acionamento das válvulas foi monitorado por dispositivo eletrônico construído no

laboratório, seguindo as recomendações de Reis e colaboradores (1994). A figura

2.3 mostra o circuito eletrônico para acionamento das válvulas solenóides.

Figura 2.3: Diagrama eletrônico para o acionamento das válvulas solenóides. V0 a V3:

válvulas solenóides. T0 a T3: transistores (BC547). D0 a D3: diodo (1N4002). Od0 a Od3:

saída digital para a interface PCL 711. (Adaptado de Reis et al, 1994)

A seqüência para a inserção das alíquotas da amostra e reagentes no

sistema foi controlada, segundo os parâmetros descritos na Tabela 2.1.

A câmara de degradação/pervaporação foi construída pelo acoplamento de

dois blocos de acrílico: (i) bloco com câmara central nas seguintes dimensões: 2,0 x

2,0 x 3,0 cm e (ii) tampa com sulco, de capacidade de 100 L. Estes dois blocos

foram separados por uma membrana de PTFE. Foi colocada uma tira de borracha


42

de 1 mm de espessura entre a tampa e o bloco central, para melhor aderir à

membrana de PTFE. A tampa foi fixada com parafusos ao corpo. O esquema e as

dimensões da câmara de degração/pervaporação são apresentados na Figura 2.4.

Tabela 2.1: Parâmetros da rotina de trabalho do programa controlador do sistema em fluxo.

Parâmetro

Tempo de abertura da válvula (V3) Carregador (s)

Tempo de abertura da válvula (V1) sol. reagente cloreto de ferro (*0,1s)

Tempo de abertura da válvula (V2) sol. reagente DMPD (*0,1s)

Tempo de espera: aciona a válvula da amostra (s)

Tempo de abertura da válvula (V5) amostra (0,1s)

Tempo de abertura da válvula (V4) solução de referência (0,1s)

Número de pulsos das válvulas (V1 a V5)

Tempo para iniciar o stop flow (s)

Tempo em stop flow (s)

Número de leituras

Número de replicatas

Figura 2.4: Câmara de pervaporação/degradação para detecção de H2S em

carnes. A: corpo central da câmara, B: tampa, vista frontal. C tampa vista lateral

Saída para limpeza

da câmara

AB

Entrada para

limpeza da câmara

Entrada de solução

de NaOH

Micro-bagueta

magnética

2 cm

2 cm

3 cm

2 cm

2 cm

1 cm C

NaOH

Membra PTFE


43

O monitoramento da deterioração da carne empregando espectroscopia de

reflectância no infravermelho próximo foi realizado pela medida dos espectros no

espectrofotômetro infravermelho, ABB Bomem – MB série NIR-MID (Alemanha). Os

parâmetros do equipamento foram: comprimento de onda de 4000 a 14000 cm-1;

alinhamento com ganho de 74%. O equipamento foi calibrado com padrão de

referência de 99% de refletância. Os ensaios com o espectrômetro no NIR foram

realizados no Laboratório de Instrumentação e Automação em Química Analítica do

Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

Para a realização do ensaio analítico de referência foi empregada balança

analítica Mettler (Alemanha); banho térmico Quimis - Q334 (Brasil).

2.3.2 - Reagentes e soluções

Todas os reagentes utilizados foram de grau analítico de pureza e suas

soluções preparadas com água recentemente destilada.

A solução reagente de DMPD na concentração de 1 g L-1 foi preparada,

tomando-se 25 mg de N,N’ - dimethyl-p-fenilenodiamina (Merck) em água contendo

2,8 mL de H2SO4 concentrado (Reagen) até 25 mL. A solução de Fe3+ 3,2 g L-1 foi

preparada, dissolvendo 81 mg de FeCl3 (ECIBRA), em água contendo 2,8 mL de

H2SO4 até 25 mL, seguindo as recomendações de Cassella e outros (2000).

As soluções de referência eram diariamente preparadas, a partir de Na2S.9H2O

(Merck). A solução de 100 mg L-1 de S2- foi preparada, tomando 0,0749 g do sal e

dissolvendo em solução de NaOH 2,5 mmol L-1 até 100 mL. A partir desta solução

foram preparadas as soluções de referência por diluição. As soluções de referência

de sulfeto foram determinadas por iodimetria.


44

Para a realização do ensaio de referência (Teste de Eber) foi preparada uma

solução de acetato de chumbo (VETEC) a 5 % (m/v), tomando 5 g de acetato de

chumbo em solução 1% (v/v) em ácido acético.

As amostras de carne bovina, para os ensaios em sistema FIA, foram adquiridas

em mercados e açougues de Salvador. As amostras de carne adquiridas para os

ensaios empregando espectroscopia NIR, foram oriundas de açougues de

Campinas.

2.3.3 – Procedimento

O sistema FIA para análise discriminatória de sulfeto em carnes (Figura 2.2)

foi baseado no método do azul de metileno (MARKZENKO,1976). A propulsão dos

fluídos no sistema foi feita por aspiração à vazão de 3 mL min-1.

Para a análise discriminatória de H2S em carnes, 100 mg de amostra de

carne, previamente homogeneizada em multiprocessador, e 300 L de água eram

inseridos na câmara de pervaporação, e mantidas sob agitação. Inicialmente as

válvulas V1 e V2 eram acionadas (4 pulsos de 0,1 s - 5L) para inserção de Fe3+ e

DMPD, respectivamente. De forma que 20 L de cada reagente fossem introduzidos

no percurso analítico. A mistura destes reagentes ocorria na bobina (B1, 50 cm).

O H2S liberado pela amostra, saturava a câmara e permeava através da

membrana de PTFE, onde era recolhido em 100 L de solução 2,5 mmol L-1 em

NaOH. Alíquotas da solução receptora, contendo o sulfeto permeado, eram inseridas

no percurso analítico, por amostragem binária, acionando a válvula V5 (10 pulsos de

0,1 s), misturando com os reagentes DMPD e Fe3+ na confluência Y. Em seguida, a


45

zona de amostra era endereçada à bobina de reação (B2, 150 cm), para a produção

do azul de metileno. A mistura seguia para o detector (665 nm).

A válvula V6 foi disposta para possibilitar alteração do fluxo, permitindo o

aprisionamento da string (amostra + DMPD + Fe3+) dentro da cubeta de fluxo,

possibilitando leituras em stopped flow. A válvula V6 também foi empregada para a

limpeza da linha da solução receptora da câmara de permeação, a qual era

acionada por 20 s (1 mL), e o fluxo era enviado para o descarte sem passar pelo

detector. Quando o objetivo era o preparo da curva analítica, o processo era similar,

porém substituindo o acionamento da válvula V5 pela V4.

Para o monitoramento da degradação da carne em função do tempo, cerca de

100 mg de amostra era colocada na câmara de pervaporação. Em intervalos de

tempos previamente estabecidos (1 h), a válvula V5 era acionada (10 pulsos de

0,1s) e alíquotas da solução receptora eram injetadas no sistema. As alíquotas eram

tomadas a cada hora até o aparecimento do primeiro sinal analítico.

Para a tomada dos espectros NIR, 1,5 kg de carne (patinho) foram fatiados

em 26 pedaços, medindo 1 cm de espessura. Os pedaços de carne foram

envolvidos em filme de PVC, então levados ao espectrofotômetro para a medida dos

espectros de varredura. O preparo das amostras está ilustrado na figura 2.5. Os

espectros foram tirados nas primeiras horas e nas horas finais da jornada de

trabalho em 2 dias consecutivos, correspondendo, aos intervalos de tempo de 0, 8,

24 e 32 h. As amostras foram identificadas de acordo o intervalo de tempo em t 0 =

grupo A, t 8 = grupo B, t 24 = grupo C e t 32 = grupo D. As amostras foram

armazenadas à temperatura ambiente. No primeiro dia, as amostras apresentavam

características organolépticas normais. Já no segundo dia, apresentavam aspecto


46

de carne em decomposição. Para cada pedaço da carne foi considerada a média de

três espectros.

Figura 2.5: Amostras de carne para análise no NIR

Em um segundo experimento, os pedaços de carne foram monitorados em

intervalos de tempo, variando de 0 a 6 h. Os espectros foram registrados a cada 30

min (T1 a T12). Os dados obtidos foram submetidos à análise multivariada,

empregando análise e componentes principais (PCA). Um tratamento preliminar dos

dados foi realizado calculando as médias móveis a cada cinco pontos.

O método de referência foi o Teste de Eber, recomendado pelo MAPA

(BRASIL, 1999). Assim, 20 g da amostra previamente homogeneizada foi inserida

em erlenmeyer de 250 mL e adicionado 25 mL de água. O erlernmeyer foi coberto

com papel de filtro embebido na solução de acetato de chumbo e vedado com fita

adesiva. Em seguida, o erlenmeyer foi aquecido em banho-maria (70ºC) por 15 min.

A mancha produzida pela amostra indicava a presença de H2S.


47

2.4 - Resultados e discussão

2.4.1 - Otimização do sistema

Para otimização do sistema FIA foram avaliadas a vazão, dimensão do

percurso analítico, número de pulsos e intervalo de tempo de abertura das válvulas

de amostra e reagentes. A solução de referência de sulfeto na concentração de 1

mg L-1 foi utilizada nos testes para otimização univariada do sistema.

O estudo da vazão levou em consideração a vazão total do sistema, uma vez

que os fluidos eram aspirados. Foram testadas vazões entre 3 e 10 mL min-1. Os

sinais transientes gerados podem ser visualizados na figura 2.6.

Figura 2.6: Variação do sinal analítico em função da vazão do sistema proposto para uma

solução de referência de sulfeto de 1 mg L-1.

Observou-se que para menores vazões havia aumento do sinal analítico. Com

a diminuição da vazão, a tendência é a diminuição do efeito de dispersão da

amostra (REIS et al., 1989). Deve-se levar em consideração que para os sistemas

em fluxo que utilizam permeação e/ou pervaporação, o máximo do analito deverá

2 4 6 8 10

0,030

0,035

0,040

0,045

0,050

0,055

0,060

A,

66

5n

m

Vazão, mL min-1


48

estar em condições de ser separado da matriz. Neste caso, implica numa saturação

da câmara de pervaporação pelo H2S e, conseqüente, aumento de permeação

através da membrana. Também, deve-se considerar que, a cinética da reação de

produção do azul de metileno pode ser favorecida para baixas vazões. Portanto,

adotou-se vazão de 3 mL min-1.

O grau de dispersão da zona da amostra e mistura da mesma com reagentes no

sistema FIA é influenciado diretamente pela variação do comprimento percurso

analítico, existindo uma estreita relação deste parâmetro com a freqüência analítica

e sensibilidade. Desta forma, procurou-se otimizar a dimensão dos percursos

analíticos, levando em consideração: (i) a mistura efetiva dos reagentes DMPD e

Fe3+; e, (ii) o tempo de reação necessário para produção do azul de metileno.

O efeito do comprimento da bobina (B1) no sinal analítico foi avaliado para B1

entre 20 e 100 cm. Neste estudo fixou-se B2 em 100 cm. A variação dos sinais

obtidos com a dimensão de B1 pode ser observada na Figura 2.7.

Figura 2.7: Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B1 para mistura

dos reagentes DMPD e Fe3+. Vazão 3 mL min-1.Solução de referência de sulfeto de 1 mg L-1.

20 40 60 80 100

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

Altu

ra d

e p

ico

, cm

percurso analítico, cm


49

Com o aumento do comprimento de B1 de 20 até 50 cm, foi observado

aumento do sinal analítico (~ 50%). Já, para as bobinas de reação maiores que 70

cm, foi observada diminuição da magnitude do sinal analítico, possivelmente devido

à oxidação do DMPD pelo O2 dissolvido, na presença de Fe3+. Assim, o

comprimento de 50 cm para B1 foi selecionado para os testes posteriores.

Para avaliação do comprimento de B2, onde ocorria a mistura de DMPD, Fe3+ e

amostra, para a produção de azul de metileno, foram utilizadas bobinas de 20 a 200

cm. Os sinais analíticos correspondentes a estas avaliações são apresentados na

Figura 2.8.

Figura 2.8: Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B2 para formação do

azul de metileno. Vazão 3 mL min-1, bobina de reação B1: 50 cm. Solução de referência de

sulfeto de 1 mg L-1.

Pela Figura 2.8 pôde ser observada discreta variação do sinal com o aumento

da bobina B2 de 0,2 a 1,5 m. Já para B2 maior que 1,5 m, houve queda do sinal. A

provável causa deste comportamento poderia estar relacionada ao aumento da

dispersão do azul de metileno produzido para percursos mais longos. O

comprimento de 1,5 m para B2 foi selecionado para os testes futuros.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

Altu

ra d

e p

ico

, cm

Percurso analítico, m


50

A influência do número de pulsos correspondentes ao acionamento das

válvulas V1 e V2, referentes à inserção das alíquotas dos reagentes DMPD e Fe3+

no sinal analítico foi analisada. Para tanto, foram realizados testes com número de

pulsos variando de 1 a 10, mantendo o intervalo de tempo de abertura das válvulas

em cada pulso em 0,1 s. Os sinais analíticos obtidos são mostrados na Figura 2.9.

Figura 2.9: Variação do sinal analítico em função nº de pulsos para abertura das válvulas

(V1 e V2) dos reagentes DMPD e Fe3+. Vazão 3 mL min-1, bobinas de reação. B1: 50 cm e

B2: 150 cm. Sol. de referência de sulfeto de 1 mg L-1.

Para avaliação do número de pulsos de abertura das válvulas levou-se em

consideração que cada válvula solenóide atuaria como um comutador independente.

Na introdução dos reagentes por amostragem binária as frações de alíquotas são

transportadas até o detector, ocorrendo dispersão mútua entre as interfaces desses

líquidos e a tendência é que a mistura se torne homogênea rapidamente durante o

transporte por B1.

Logo, de acordo com os dados da Figura 2.9, observou-se que à medida que o

número de pulsos aumentava, o sinal analítico também aumentava, alcançando um

0 2 4 6 8 10

5,6

6,0

6,4

6,8

7,2

altura

do p

ico,

cm

nº de pulsos (*0,1 s)


51

valor máximo entre 2 e 4 pulsos. A explicação para isto reside no fato do diminuto

tamanho das alíquotas dos reagentes DMPD e Fe3+, favorecer a homogeneização

efetiva e levar a um aumento do sinal analítico. Portanto, para acionamento das

válvulas V1 e V2, foram escolhidos 4 pulsos, correspondendo a 20 L de cada

reagente.

Considerando vazão de 3 mL min-1, adotou-se o número de pulsos de

abertura das válvulas V4 e V5 referentes a soluções de referência e solução

receptora da amostra, igual a 10. Logo a alíquota da solução de referência e da

amostra a ser introduzida no sistema correspondeu a 50 L. Apesar do volume da

solução receptora (volume armazenado na tampa da câmara de pervaporação) ser

de ca. 100 L, os 50 L iniciais injetados no percurso analítico foram suficientes para

produzir os sinais transientes referentes às amostras sob investigação.

As condições otimizadas para o sistema FIA são descritas na Tabela 2.2.

Tabela 2.2: Configuração do sistema em fluxo após a otimização para determinação de

sulfeto.

Parâmetros Valor

Vazão (mL min-1) 3

Bobina de reação B1 (cm) 50

Bobina de reação B2 (cm) 150

Nº de pulsos das válvulas V1 e V2 (DMPD e

Fe3+): (* 0,1 s)

4

Nº de pulsos das válvulas V4 e V5 da amostra e

da solução de referência: (* 0,1 s)

10

Tempo de acionamento da válvula V6 para

limpeza da linha da solução receptora (s)

20


52

2.4.2- Influência da interrupção do fluxo no sistema.

Foi avaliada a influência do modo de interrupção de fluxo sobre a cinética da

reação de formação do azul de metileno. Para isto, foram testados intervalos de

tempos de interrupção de fluxo que variaram de 0 a 180 s. Os resultados são

mostrados na Figura 2.10.

Figura 2.10: Variação do sinal analítico em função do tempo de interrupção do fluxo

O intervalo de tempo zero correspondia ao sinal no momento inicial da parada

do fluxo. Observou-se discreta variação do sinal analítico em função do tempo de

interrupção de fluxo. Com um tempo de 180 s houve um aumento do sinal de 0,06

unidades de absorbância. A Figura 2.11 ilustra o perfil do sinal analítico obtido no

sistema em stopped flow, para 12 replicatas do branco e da solução de sulfeto de 1

mg L-1, referente a 180 s.

0 30 60 90 120 150 180

0,20

0,21

0,22

0,23

0,24

0,25

0,26

A (

665 n

m)

t (s)


53

Figura 2.11: Fiagrama mostrando o perfil do sinal analítico obtido no sistema com o fluxo

parado por 180 s. B. branco, solução de S2- 1 mg L-1.

Portanto, considerando que houve discreta variação do sinal analítico e o

comprometimento da produtividade analítica, optou-se por não utilizar o modo de

interrupção de fluxo para as análises discriminatórias de sulfeto em amostras de

carne.

2.4.3 - Figuras de mérito

Apesar da proposta deste trabalho ser pautada no desenvolvimento de

sistema para análise discriminatória e avaliação da degradação de carnes, foram

realizados ensaios quantitativos e o sistema poderá ser empregado para a

determinação da concentração de H2S.

Para a faixa de S2- entre 0,2 e 0,6 mg L-1 foi obtida a equação A = 0,33 + 4,4C

(0,997). O limite de detecção estimado foi de 0,016 mg L-1 e desvio padrão relativo

de 0,96% (n=11), para a concentração de 0,4 mg L-1. Nestas condições, o sistema

desenvolvido apresentou freqüência analítica de ca. 30 determinações por hora.

Para testar a precisão do sistema foram injetadas 11 replicatas de solução de

referência de sulfeto na concentração de 1 mg L-1, representada na Figura 2.12.

t


54

Figura 2.12: Fiagrama de 11 replicatas de solução de sulfeto 1 mg L-1.

2.4.4 - Aplicação do sistema na análise de carnes

Confirmada a capacidade do sistema FIA para detecção de sulfeto, foram

realizados dois tipos de análises: (i) análise discriminatória de H2S em amostras de

carnes frescas e (ii) avaliação da degradação de carnes em função do tempo pela

monitoração da liberação de H2S.

Cinco amostras de carne bovina in natura, adquiridas em mercados e açougues

locais, foram submetidas à análise e os resultados do estágio e do período de

degradação são apresentados na Tabela 2.3. Para validação dos resultados foi

realizado o teste de Eber, segundo normas do MAPA.


55

Tabela 2.3: Resultados para H2S nas amostras de carne.

Amostras de

carne

Presença de

H2S (FIA)

t0

Presença de H2S

segundo o teste

de Eber

Produção de H2S

(FIA)

(t, min)

1 + + <30

2 - - 280 - 300

3 - - 460 - 480

4 + + <30

5 + + <30

De acordo a Tabela 2.3, observou-se que três amostras de carne

apresentaram evolução de gás sulfídrico em menos de 30 min. Duas amostras não

apresentaram evolução de H2S. Os resultados obtidos pelo sistema proposto foram

concordantes com o teste de Eber.

Vale a pena ressaltar, a relevância deste tipo de controle, pois das 5 amostras

analisadas 3 indicaram presença de H2S. Este fato deve ser visto como um forte

indicador das condições inadequadas de armazenamento e comercialização que a

carne está exposta, favorecendo a proliferação de microrganismos produtores de

gás sulfídrico e/ou o aparecimento de reações enzimáticas que conduzam à hidrólise

de aminoácidos sulfurados e conseqüentemente formação de H2S.

A Figura 2.13 apresenta o registro de amostra de carnes pelo sistema de

detecção de gás sulfídrico. Observa-se que após o sinal do branco, pelo

acionamento da válvula da amostra V5, foi obtido um pico referente ao gás sulfídrico

liberado pela carne.


56

Figura 2.13: Registro do sinal analítico referente à detecção de H2S. B. branco, A. amostra.

Para o acompanhamento da degradação da carne, cerca de 0,1 g da amostra

homogeneizada foi inserida da câmara de pervaporação. Em intervalos de tempo

regulares, uma alíquota da solução receptora era injetada no sistema para detecção

de H2S. A Figura 2.14 ilustra os resultados obtidos.

Figura 2.14: Registro da avaliação da degradação de carnes através do monitoramento da

liberação de gás sulfídrico. A: amostra; B: branco.

30 0 t (min)

t (h)

0 4 5 6 9 8


57

Foi observado que o primeiro pico pôde ser registrado para intervalo de 4 h.

Notou-se também, que a partir de 5 h houve saturação da câmara de pervaporação

e o sinal registrado ultrapassou a escala do registrador. Após injeções sucessivas da

amostra o sinal começou a cair, provavelmente devido à diminuição da pressão do

H2S na câmara de pervaporação. Assim, para o acompanhamento da degradação

da carne em função do tempo, observou-se, para esta amostra, que a partir de 4 h

houve evolução de H2S. Contudo, não se pode afirmar a origem do H2S.

2.5 – Aplicação do NIR para avaliação da degradação da carne

A coleção de espectros das 26 amostras de carne analisadas é apresentada

na Figura 2.15. Estes espectros referem-se às amostras de carne frescas.

Figura 2.15: Coleção de espectros NIR das amostras de carnes

Assim as amostras (n = 26) do grupo A (t =0), grupo B (t = 8 h), grupo C (t =

24 h) e grupo D (t = 32h), foram levadas ao NIRS para registro dos espectros.

Submetendo os dados à análise dos componentes principais (PCA), observou-se

que com apenas dois componentes principais foi possível classificar corretamente

4000 6000 8000 10000 12000 14000

0

4

8

12

16

20

A

Número de onda cm-1


58

88% das amostras do grupo D dentro dos limites selecionados. O resultado está

ilustrado na Figura 2.16.

Figura 2.16: Análise dos componentes principais de 26 amostras de carne.

Para melhor visualização dos resultados, os dados foram combinados a cada

dois grupos AB, BC, CD e AD, correspondendo ao intervalo de tempo de 0-8 h, 8-24

h, 24-32 h e 0-32h, respectivamente. Os grupos foram submetidos à análise dos

componentes principais e são mostradas a nas Figuras 2.17 a 2.20.

Figura 2.17: PCA para as amostras dos grupos A e B


59

Figura 2.18: PCA para as amostras dos grupos B e C

Figura 2.19: PCA para as amostras dos grupos C e D


60

Figura 2.20: PCA para as amostras dos grupos A e D

A análise dos componentes principais dos grupos AB (Fig. 2.17), não

apresentou separação nítida entre os grupos, ou seja, as amostras de carne

analisadas no tempo 0 (A) e após 8 h (B), não apresentaram diferenças espectrais

ao NIR, embora as amostras tenham sido mantidas à temperatura ambiente e já

eram perceptíveis mudanças em seus caracteres organolépticos. As amostras dos

grupos BC (Figura 2.18) referente aos espectros obtidos com 8 h e 24 h,

apresentaram comportamento semelhante, não sendo possível separar os grupos.

O gráfico obtido por PCA do grupo CD (Fig. 2.19), referente aos espectros

registrados com 24 e 32 h, apresentou separação mais definida. Com dois

componentes principais foi possível classificar corretamente 84% das amostras dos

grupos C e D. Estas amostras apresentavam os caracteres de carne em processo de

deterioração.

Dentre a análise dos componentes principais, o grupo que apresentou melhor

separação foi AD (Fig. 2.20), referentes a amostras de carne fresca (A, t0) e as

amostras de carne visivelmente deterioradas (D, t32). Os dois componentes

principais conseguiram descrever corretamente, 92% das amostras do grupo D e

100% das amostras do grupo A. De fato, as características destes dois grupos de


61

amostras são bastante diferentes. A amostra de carne fresca, apresentava-se hígida,

vermelha, sem presença de exsudato, odor próprio de carne fresca. Já a carne

deteriorada, apresentava-se com coloração esverdeada, presença de exsudato e

odor forte de carne podre.

Diante dos resultados apresentados pode-se inferir que pela análise por

espectroscopia NIR, não foi possível monitorar o momento em que começaram a

aparecer os primeiros sinais de deterioração nas amostras de carne. A análise da

carne por NIR não apresentou diferenças espectrais capazes de indicar o início do

processo de deterioração da carne. Foi possível discriminar, claramente, os grupos

de amostras de carne fresca (A) e o grupo de carnes deterioradas (D), bem como os

grupos (C) e (D), ambos de amostras deterioradas.

No segundo experimento foram registrados espectros de uma única amostra

de carne fresca no intervalo de tempo de 6 horas. Os espectros foram registrados a

cada 30 min, a partir de t=0 até t=6 h (13 espectros).Durante o intervalo de tempo do

experimento a amostra foi mantida em temperatura ambiente.Os resultados do PCA

estão mostrados na Figura 2.21.

Figura 2.21: PCA para uma única amostra de carne fresca em função do tempo.


62

O gráfico obtido por PCA mostrou que com dois componentes principais foi

possível classificar dois grupos. O grupo 1 e 2 (correspondendo a carne fresca, t=0 e

30 min) e os grupos 11, 12 e 13 (correspondendo a carne no t= 5, t= 5,5 e t= 6 h).

Ao final do intervalo de tempo de 6 h, à temperatura ambiente, a amostra de carne

apresentava mudanças discretas no odor e na coloração da carne originalmente

fresca. Portanto, os grupos foram diferenciados em carne fresca até 30 min (1 e 2)

em temperatura ambiente e carne com caracteres organolépticos comprometidas, ao

final de 6 h (11,12,13). Para o intervalo de tempo compreendido entre 1 e 4,5 h

(correspondendo aos grupos 3 a 10), não foi possível a separação em grupos.

Os resultados obtidos no experimento em fluxo para monitoração da

degradação da carne (Tabela 2.3) foram comparados com os resultados obtidos por

espectroscopia NIR. Foram observados resultados concordantes, porque nas duas

metodologias foi possível detectar indícios de deterioração somente após 30 min de

exposição da carne à temperatura ambiente.

Apesar da correlação entre liberação de H2S e mudanças no espectro NIR, os

experimentos até aqui realizados não são suficientes para concluir qual a forma mais

eficiente para monitorar o processo de degradação da carne. Contudo, pelos

resultados apresentados, pode-se inferir que 30 min foi o intervalo de tempo mínimo

para uma amostra de carne fresca, mantida à temperatura ambiente, apresentar

modificações espectrais no infravermelho próximo. Esta modificação espectral

resultou na separação de grupos, quando realizada a análise dos componentes

principais. As primeiras modificações químicas, caracterizadas pela liberação de H2S

pôde ser observada num intervalo de tempo compreendido entre 30 min.

Quanto ao método oficial (Reação de Eber para H2S), pôde ser observado

que o mesmo apresenta desvantagens em relação ao método proposto e ao NIR. A


63

geração de resíduos tóxicos para o meio ambiente, além da exposição ocupacional

pelo uso de solução de acetato de chumbo. A reação de Eber é feita em batelada,

apresentando baixa produtividade analítica, como pode ser visto pelo intervalo de

tempo de 15 min recomendado só para evolução do H2S da amostra.

2.6 – Conclusões

Os resultados obtidos na determinação seletora e discriminatória de sulfeto

em amostras de carnes, baseado na formação do azul de metileno, por análise em

fluxo empregando amostragem binária, confirmaram suas potencialidades. A

exatidão, por comparação dos resultados com os obtidos na metodologia de

referência e a precisão dos resultados foram satisfatórias.

A robustez e versatilidade foram observadas de forma a conseguir um

sistema confiável e preciso para monitoração do estado de conservação de carnes,

a um ritmo de amostragem razoável.

Embora o sistema tenha sido idealizado para análise seletora e

discriminatória de sulfeto em carnes, com ênfase no aspecto qualitativo, o mesmo

oferece versatilidade na quantificação do analito, com limite de detecção de 0,0158

mg L-1, apresentando, desta forma, sensibilidade aceitável.

O sistema desenvolvido se mostrou adequado para a avaliação do estado de

conservação e degradação de carnes. A versatilidade do sistema foi caracterizada

uma vez que a mesma câmara de reação pode ser empregada para outras matrizes.

Na análise por espectroscopia de reflectância na região do infravermelho

próximo, de amostras de carnes observou-se que houve diferenças espectrais claras

para a carne fresca e a carne visivelmente deteriorada, porém esta diferença é tão


64

obvia que não seria admissível utilizar uma ferramenta analítica como o NIR para

diferenciar carnes frescas de carnes deterioradas.

Contudo, a análise por espectroscopia de reflectância na região do

infravermelho próximo, de amostras de carne, em função do tempo, para a

monitoração do processo de deterioração, apresentou diferenças espectrais,

podendo-se inferir que a partir de 30 min a carne bovina, mantida a temperatura

ambiente, começa a apresentar os primeiros sinais de deterioração.


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Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato

69

CAPÍTULO 3

Desenvolvimento de Sistema em Fluxo para Análise

Seqüencial de Nitrito e Nitrato em Produtos Cárneos,

Utilizando Câmara de Tubos Concêntricos.


Há séculos que nitrato, nitrito e cloreto de sódio vêm sendo usados no

processo de cura para a conservação de carnes e pescados (EVANGELISTA, 2001),

visando preservar o produto, desenvolver e fixar a coloração, sabor e aroma (FARIA

et al., 2001). A ação conservadora nos produtos cárneos deve-se ao nitrito, que em

condições anaeróbias, é produzido pela ação de microrganismos associada a nitrato

redutase. Na dieta, o nitrato pode ser reduzido a nitrito por bactérias presentes no

muco salivar e às vezes no estômago.

No alimento, o nitrito desempenha basicamente três funções: (i) contribui com

o desenvolvimento do flavor em produtos curados; provavelmente pela inibição do

surgimento de odores rançosos não desejáveis; (ii) reage com a mioglobina

produzindo o nitrosoemocromo, característico das carnes curadas (FARIA et al.,


70

2001); e, (iii) inibe o crescimento de bactérias patogênicas, principalmente o

Clostridium botulinum, o qual produz neurotoxina (CAMMACK et al., 1999).

Vale ressaltar que o nitrato e o nitrito ocorrem naturalmente em diferentes

vegetais como fontes de nitrogênio. Entre os vegetais que podem apresentar

elevado teor de nitrato (≥ 1000 mg kg-1) destacam-se a alface, o espinafre, a

beterraba, o rabanete, a berinjela, o aipo, o nabo e a couve (CAMMACK et al., 1999;

JAWORSKA, 2005; RATH et al., 1994).

O consumo de produtos alimentícios contendo conservantes químicos é

motivo de preocupação para a população. A utilização de nitritos e nitratos, em

produtos cárneos, deve obedecer a limites preconizados pelo Ministério da Saúde,

pelo qual os limites máximos para nitrato e nitrito são de 300 e 150 mg kg-1,

respectivamente (BRASIL, 1998). No entanto, ao consumir alguns dos vegetais

acima citados, pode-se estar ingerindo concentrações de nitrato superiores aos

limites preconizados pelo órgão regulador brasileiro.

Contudo, estes conservantes, quando adicionados aos produtos cárneos,

devem cumprir funções específicas, e obedecerem, rigorosamente aos limites

estabelecidos pela Legislação. Daí, a relevância da verificação da concentração

destes aditivos, em produtos cárneos, pelos órgãos de vigilância sanitária,

objetivando monitorar a qualidade dos alimentos expostos ao consumo. Ademais, a

fiscalização é necessária para coibir o uso indiscriminado destes aditivos, bem como

a adição de concentrações superiores ao limite máximo permitido.

O nitrito apresenta maior toxicidade que o nitrato. O nitrito causa

metaemoglobinemia e pode até mesmo, levar à morte quando consumido em doses

relativamente altas (Weekly, 2002). Peixes expostos a concentrações de 150 mg kg-1

de NO2- apresentaram metaemoglobinemia (SCARANO e SAROGLIA, 1984). Além


71

disso, o nitrito pode reagir com aminas presentes nas carnes, levando a produção de

nitrosaminas, as quais são responsáveis por efeitos neuro e nefrotóxicos, além de

serem agentes mutagênicos e carcinogênicos (BINSTOK et al., 1996; RYWOTYCKI,

2003). A presença de aminas biogênicas e poliaminas em carnes e produtos cárneos

foi investigada por Jover e outros (1997) e Rywotycki (1997).

As nitrosaminas podem ser formadas pela reação, denominada de nitrosação,

a qual ocorre na presença de ácido mineral diluído a frio, como no estômago (MIDIO,

2000), gerando o ácido nitroso que uma vez protonado leva ao íon nitrosônio (NO+),

após perda de água (ALLINGER et al., 1978).

HNO2 H+

+ H2NO2

+ H2O NO++

As aminas secundárias alifáticas e aromáticas reagem com ácido nitroso,

levando à produção de compostos amarelos e neutros – as nitrosaminas.

HNO2R1-NH-R2 + R1-N-R2

NO

Compostos nitrosos apresentam papel relevante na carcinogênese em

humanos e animais. Certas condições geofísicas e ambientais, podem atuar como

catalizadores na formação destes compostos. Práticas inadequadas na agricultura,

como uso exagerado de fertilizantes e agrotóxicos e acidificação do ecossistema,

são fatores que favorecem a formação de nitrosaminas no meio ambiente (solo e

plantas). Assim, as nitrosaminas formadas no meio ambiente, estarão disponíveis

para entrar na cadeia trófica (RYWOTYCKI, 2003).

O teor de nitrosaminas (dimetilnitrosamina – DMNA e dietilnitrosamina –

DENA) foi determinado em carnes frescas de diferentes espécies (porco, boi, búfalo,

cabra, cavalo e carneiro), em função das práticas ecológicas e antiecológicas de


72

produção/criação. Os resultados mostraram teores significativamente maiores de

aminas para as amostras oriundas de animais submetidos à condição

antiecológicas. Dentre as espécies estudadas, os bovinos e porcinos apresentaram

maiores níveis para DMNA e DENA (RYWOTYCKI, 2003).

Sofos e Busta (1980) apresentaram alternativas para o uso do NO2- em

produtos cárneos, a exemplo de NaCl, agentes acidificantes, ascorbato e

isoascorbato, açúcares e xaropes, parabens e sorbato. Apesar de alguns destes

compostos apresentarem características redutoras, estas alternativas não são

eficazes na substituição do NO2- como agente antibotulínico.

O método clássico para determinação espectrofotométrica de NO2- deve-se a

Greiss que avaliou a reação deste íon com ácido sulfanílico e -naftilamina em meio

sulfúrico. Posteriormente Ilosvay, propôs modificação ao método original,

substituindo o ácido sulfúrico por ácido acético. Porém, já no século XX, Rider e

Mellon concluíram que a reação deveria ser realizada em meio fortemente ácido

(VOGUEL, 1960). Reagentes como -naftol e -naftilamina, por serem

carcinogênicos, têm sido substituídos por outros reagentes principalmente por

dicloridrato de N-(1-naftil) etilenodiamina – NED (DUARTE, 1997).

O método de Greiss é seletivo para NO2-, não apresentando resposta para

nitrato. Para que o NO3- possa ser determinado pela mesma reação, é necessário

que este seja reduzido a nitrito para, em seguida, sofrer diazotação com ácido

sulfanílico e complexação com NED em meio ácido, produzindo o ácido -

naftilamino-p-azobenzeno-p-sulfônico. O produto formado de coloração rósea pode

ser determinado espectrofotometricamente a 540 nm (MARCZENKO 1976;

BRASIL,1999). As reações envolvidas no método de Greiss são ilustradas na Figura

3.1.


73

Figura 3.1: Reações do método de Greiss

Teores de NO2- e NO3

- têm sido determinados em alimentos pelo emprego de

diversas técnicas analíticas. Entre estas, as mais citadas são a espectrofotometria

(FERREIRA et al., 1996; WANG, 1998; AHMED, 1996; ARJONA et al., 1998;

ZATAR, 1999), cromatografia iônica (MATTEO e ESPOSITO, 1997; SIU, 1998;

BILAL BUTT et al., 2001; BOSCH et al., 1994) e potenciometria com eletrodo íon

seletivo (BADEA et al., 2001). Ademais, muitas dessas técnicas de detecção estão

associadas a sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA) ou de análise por

injeção seqüencial (SIA) (FERREIRA et al., 1996; ARJONA et al., 1998; ROCHA e

REIS, 2000; PETSUL et al., 2001; HAGHIGHI e TAVASSOLI, 2002).

Deve-se levar em consideração que, para as determinações de NO2- e NO3

-

em produtos cárneos, o tratamento da amostra é considerado como a etapa crítica.

As metodologias descritas na literatura apresentam divergências quanto à forma de

extração do NO2- e NO3

-. Algumas referências recomendam apenas extração

aquosa, à quente (temperatura de ~80°C) (AOAC, 2003), enquanto que outras,


74

recomendam a desproteinização prévia da amostra (INSTITUTO ADOLFO LUTZ,

1985).

Binstok e colaboradores (1996) compararam oito diferentes procedimentos

para determinação de NO2- em produtos cárneos. Os autores desenvolveram

protocolo de análise baseado na melhoria da desintegração e dispersão de resíduos

da matriz (gordura), adicionando previamente areia à amostra. Os resultados

evidenciaram recuperação de 93% do NO2-, além de boa precisão (RSD = 8%).

Ferreira e outros (1996), realizaram ensaios simultâneos para NO2-, NO3

- e

NaCl em produtos cárneos, empregando sistema FIA. O cloreto foi determinado,

empregando detecção potenciométrica (eletrodo tubular íon seletivo a cloreto, com

uma membrana cristalina homogênea de Ag2S/AgCl). Após a passagem pelo

eletrodo, a zona da amostra era dividida em dois percursos analíticos para prevenir

mudanças no fracionamento, uma vez que cada percurso pôde ser adequado para

responder às concentrações médias de nitrito e nitrato nas amostras de carne

analisadas. Em uma das linhas, era acoplada coluna contendo cádmio, para a

redução do nitrato. Como o tempo de residência em cada canal era diferente, eram

obtidos dois sinais transientes característicos do NO2- e do NO3

- + NO2-.

Sistema em fluxo regido pela estratégia de multicomutação foi proposto para

determinação de NO3-, NO2

- e NH4+ (ROCHA e REIS, 2000). A determinação de

NO3- e NO2

- foi baseada na reação de Greiss e a determinação de NH4+ na reação

de Berthelot. O sistema desenvolvido pelos autores apresentou elevada

produtividade analítica (60 determinações por hora) e reduzido consumo de

reagentes.

Dentro deste cenário, a presente etapa do trabalho objetivou o

desenvolvimento de um sistema analítico em fluxo para determinação de nitrato e


75

nitrito em amostras de produtos cárneos, baseado no método de Greiss,

empregando um dispositivo denominado câmara de tubos concêntricos, com o qual

foi possível desenvolver um sistema FIA de linha única.

3.2 – Metas

De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas desta etapa

foram:

Desenvolver um sistema em fluxo, acoplado a uma câmara de tubos

concêntricos para determinação seqüencial de nitrito e nitrato em amostras de

produtos cárneos.

Otimizar o sistema considerando as faixas de concentração do analito na

matriz de estudo.

Determinar a concentração de NO3- e NO2

- em diferentes amostras de

produtos cárneos.

Validar o procedimento pela comparação com método de referência.


76

3.3 – Material e métodos


Para as determinações seqüenciais de nitrito e nitrato pelo método de Greiss

em sistema de fluxo acoplado à câmara de tubos concêntricos (CTC) foi empregado

espectrofotômetro FEMTO 432 (Brasil), equipado com cela de fluxo com caminho

ótico de 10 mm e volume de 200 L; registrador Cole-Parmer, modelo Ross 101–A

1898 (EUA); bomba peristáltica de quatro vias Gilson MiniPlus 3 (França); linhas de

transmissão em polietileno (diâmetro interno 0,8 mm); tubos peristálticos de Tygon

para a propulsão dos líquidos; e, injetor comutador proporcional 2:3:2.

Para obtenção de água purificada foi empregado o purificador de água

EASYpure RF (Barnstead, USA).

Para as medidas de pH foi empregado o milivoltímetro Digimed DM 21

(Brasil). Também foi empregado banho-maria Quimis Q-334 (Brasil); agitador

magnético Quimis 221 (Brasil) e agitador horizontal para erlenmeyer da Ética

(Brasil).

A descrição completa da câmara de tubos concêntricos (CTC), foi

apresentada por Borges (2005). O dispositivo foi construído pela associação de três

blocos de Perspex; um para a entrada do fluxo, um corpo central e outro para a

saída do fluxo. O corpo central apresentava dimensões de 85 x 21 x 12 mm e um

orifício central de 6 mm de diâmetro feito a partir de uma das faces menores (21 x 12

mm). Este orifício correspondeu ao tudo externo (coroa) da CTC, cuja capacidade

era de 2,2 mL. O tubo interno da CTC foi feito pela conexão de um segmento de

tubo de polietileno de 1,5 mm de diâmetro externo, 0,8 mm de diâmetro interno e 88


77

mm de comprimento com capacidade para 44 L. Este tubo, tubo central da CTC, foi

inserido, de forma concêntrica, no orifício de 6 mm feito no bloco de Perspex,

previamente usinado, e fixado em duas máscaras, removíveis, de borracha com

dimensões de 22 x 13 x 1 mm. As máscaras foram projetadas para, além de suportar

o tubo interno da CTC, permitir o acesso e a divisão da zona da amostra pelos

compartimentos da CTC (tubo interno e coroa). Finalmente, dois blocos em Perspex,

de mesmas dimensões, foram acoplados ao corpo central da CTC, para fixação do

dispositivo. Em cada um destes blocos foi feita uma cavidade para evitar a obstrução

dos acessos à coroa e ao tubo interno da CTC e, a partir da cavidade foi perfurado

um orifício com 0,8 mm de diâmetro para permitir o acesso das soluções pelos tubos

(tubo interno + coroa) que compunham a CTC. As tampas foram fixadas com

parafusos de aço inoxidável de 3 mm de diâmetro por 30 mm de comprimento ao

corpo central da CTC, como mostrado na Figura 3.2a a 3.2e.

Figura. 3.2: Visão frontal (a e b) do aparato câmara de tubos concêntricos – CTC. C. vista frontal da tampa. d = Vista frontal da CTC sem a tampa; e = Vista frontal de máscara de borracha com 4 orifícios (entrada 4 furos, saída 8 furos). FONTE: adaptado de Borges (2005).


78

O diagrama do sistema de análise em fluxo empregado para as determinações

de nitrito e nitrato está representado na Figura 3.3.

Figura 3.3: Diagrama de fluxo para análise de nitrato e nitrito. A. amostra, C. transportador

(tampão borato pH 7,25),BP. Bomba peristáltica, IC. Injetor comutador (posição de injeção),

L. Alça de amostragem (200 l), CTC. câmara de tubos concêntricos com coroa preenchida

com Cd coperizado, R. coquetel de reagentes (sulfanilamida e NED), B. bobina de reação

(150 cm), D. detector (540 nm), W. descarte.

O sistema em fluxo (Fig. 3.3) foi construído de forma que as operações e

reagentes utilizados no procedimento de análise em fluxo fossem os mesmos do

procedimento em batelada, seguindo as etapas envolvidas no método de Griess

(MARCZENKO 1976). Para evitar a obstrução dos orifícios e a perda do Cd, foram

adaptados dois discos de tela de aço inoxidável com diâmetro de 6 mm e orifício

central de 1,5 mm, visando a passagem do tubo interno da CTC pela tela.


79

3.3.2 – Reagentes e soluções

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico de pureza. As soluções

foram preparadas com água purificada e fresca, com condutância sempre inferior a

18,2 S cm-1.

As soluções de referência foram preparadas a partir de NaNO3 e NaNO2

(Merck). A solução estoque de 100 mg L-1 em nitrato foi preparada tomando-se

0,0137 g do sal e diluindo com água até 100 mL. A solução de nitrito, com

concentração 100 mg L-1, era diariamente preparada, pela dissolução de 0,015 g de

NaNO2 em 100 mL de água. As soluções de nitrito eram preparadas diariamente

para evitar perdas de nitrito pela oxidação. As soluções de trabalho eram soluções

mistas (nitrato + nitrito), preparadas diariamente em tampão tetraborato (pH 7,25).

Uma solução contendo o coquetel de reagentes foi preparada em 0,5 mol L-1 de

H3PO4 (Merck) de forma a responder as concentrações de 2,0% (m/v) em

sulfanilamida (Reagen) e 0,1% (m/v) em NED – bicloridrato de n-naftilamina

(Reagen). A solução do coquetel de reagentes foi armazenada em frasco âmbar, sob

refrigeração, por até 30 dias.

A solução transportadora foi preparada nas seguintes proporções: 2% (m/v)

de tetraborato de sódio (Vetec), 0,1% (m/v) de EDTA (Reagen) e 10% (m/v) em

NH4Cl (Merck), seguindo as recomendações de Giné e outros (1980). O pH da

solução transportadora foi ajustado para 7,25 com solução 1,0 mol L-1 em HCl

(Merck).

Utilizou-se cádmio metálico granulado (Isofar) e solução 5% (m/v) em CuSO4

(Reagen) para o preparo do cádmio coperizado.


80

Soluções de tetraborato de sódio a 5 % (m/v), solução de ferrocianeto de

potássio (Ecibra) a 15 % (m/v) e solução 30 % (m/v) em acetato de zinco (Vetec)

foram empregadas para o tratamento das amostras.

As soluções reagentes preparadas para uso no ensaio do método de

referência preconizado pelo MAPA (BRASIL, 1999), foram: solução tampão

(estoque) de NH4OH em HCl (pH 9,6) e solução tampão diluída (1:9); solução de

sulfanilamida a 0,5 % (m/v) em HCl (1:1); e, solução aquosa de cloreto de -

naftiletilenodiamina a 0,5 % (m/v). A solução contendo os reagentes cromogênicos

foi estocada em frasco âmbar sob refrigeração.

3.3.3 – Procedimentos

O tratamento das amostras seguiu as recomendações da Instrução Normativa

nº 20, de 21 de julho de 1999 do Ministério da Agricultura (Brasil, 1999).

As amostras de produtos cárneos foram homogeneizadas em liquidificador

doméstico. Às alíquotas de 10 g de amostra homogeneizada foram adicionadas 100

mL de H2O aquecida 80oC e 5 mL de solução 0,5 % (m/v) em tetraborato de sódio. A

mistura era aquecida em banho maria (100 ºC) por 15 min, sob agitação. Após

resfriar até temperatura ambiente, o conteúdo do béquer era quantitativamente

transferido para balão volumétrico de 250 mL. A seguir eram adicionados 5 mL de

solução 15% (m/v) em ferrocianeto de potássio e 5 mL de solução de acetato de

zinco a 30% (m/v). A mistura era submetida à agitação e o volume completado com

água. Por fim, a mistura era filtrada e o filtrado utilizado para as dosagens de NO2- e

NO3-.


81

No processo para determinação seqüencial em sistema de análise em fluxo

de NO2- e NO3

-, 200 L do filtrado era inserido no percurso analítico e transportado

pela solução carregadora (tampão borato - pH 7,25) até a câmara de tubos

concêntricos – CTC, a vazão de 4,5 mL min-1. A câmara de tubos concêntricos foi

posicionada verticalmente em relação à bancada e, a propulsão dos fluidos na CTC

foi conduzida no sentido ascendente, pelo bombeamento da solução transportadora.

Após atravessar a CTC, as zonas de amostra misturavam-se com o coquetel de

reagentes, quando eram endereçadas ao detector ( = 540 nm). A subzona da

amostra que passava pelo tubo central da CTC, ao reagir com a sulfanilamida e o

NED, resultava apenas na reação do NO2- presente. A sub-zona da amostra que

passava pela coroa da CTC, percolava a coluna de cádmio coperizado, resultando

na redução do NO3- existente a NO2

- mais o NO2- presente na amostra (nitrito +

nitrato). O diazocomposto formado, de coloração rósea, era encaminhado até o

detector, gerando dois sinais transientes, correspondendo as duas sub-zonas de

amostra. O primeiro pico estava relacionado à concentração de NO2- e o segundo à

concentração de NO2- + NO3

-.

Soluções mistas de referência de nitrito e nitrato, nas faixas de concentração

de 0,5 a 5 mg L-1, foram preparadas em tampão de tetraborato (pH 7,2). Quando

submetidas à análise no módulo de análise em fluxo (Fig. 3.5) eram originadas duas

curvas de trabalho. Uma primeira referente à variação do máximo do sinal transiente,

expresso em absorbância, com a concentração de NO2- e a segunda referente à

soma das concentrações de nitrito e nitrato. As faixas de concentração estudadas

para nitrito e para a soma das concentrações de nitrito e nitrato foram de 0,5 a 2,5

mg L-1 e de 1 a 5 mg L-1, respectivamente. A concentração do nitrato na amostra foi

obtida pela diferença entre as concentrações calculadas de nitrito referente ao


82

segundo sinal transiente, ou seja, aquele que migrou para o detector pela coroa da

CTC (nitrato + nitrito), e de nitrito originalmente presente na alíquota da amostra

inserida no percurso analítico e que migrou pelo tubo interno da CTC

(correspondente ao primeiro pico). Finalmente, foi aplicado um fator de correção, de

1,348, para conversão da diferença entre as concentrações de nitrito calculadas nos

dois picos para determinar a concentração (mg L-1) de nitrato na amostra original.

Este fator de correção (1,348) foi obtido pela razão entre as massas molares de

nitrato e nitrito (62/46).

Para a determinação de NO2-, seguindo metodologia estabelecida pelo MAPA

(BRASIL, 1999), 10 mL do filtrado, resultante do tratamento da amostra, era

transferido para balão volumétrico de 50 mL e adicionados 5 mL de solução 0,5%

(m/v) de sulfanilamida. Após agitação a solução era mantida 3 min em repouso, para

então adicionar 3 mL da solução 0,5% (m/v) em NED. A absorbância era medida

após 30 min a 540 nm e registrado o valor. A curva analítica foi preparada de forma

semelhante, com faixa de concentração variando de 0,05 a 0,5 mg L-1.

Nas condições do método oficial para a determinação de NO3-, 20 mL do

filtrado desproteinizado (resultante da amostra tratada), eram transferidos para

erlenmeyer de 125 mL e adicionados 5 mL da solução tampão (diluída) pH 9,7 e ca.

20 g do cádmio coperizado. Em seguida a mistura era submetida à agitação por 15

min, deixando em repouso para decantação. Por fim, a solução sobrenadante era

filtrada e recolhida diretamente em balão volumétrico de 100 mL. O Cd restante no

erlenmeyer, era lavado com H2O e agitado por 2 min, quando era feita a filtração

para balão de 100 mL. Desta solução final, era, então, retirada alíquota de 10 mL

para um balão volumétrico de 50 mL e adicionados 5 mL da solução tampão pH 9,7.


83

Os passos seguintes seguiram da mesma maneira anteriormente descrita para

determinação de nitrito.

Soluções de referência foram preparadas para a construção de curva analítica

na faixa de concentração de 0,05 a 0,5 mg L-1. O resultado obtido referia-se ao teor

de nitrato + nitrito. A concentração de NO3-, era obtida por diferença.

A Figura 3.4 ilustra o esquema do procedimento acima descrito.

Figura 3.4: Fluxograma da determinação de NO2- e NO3

- segundo normas do Ministério da

Agricultura.

Sol. Tampão

Cádmio esponjoso

Avolumar

5ml tetraborato de sódio

5ml ferrocianeto de potássio

5ml de acetato de zinco

Amostra tratada

10 g

amostra

Banho maria 15’

Det. NO2-

Det. NO3-

20 ml da amostra

Agitador 15’

10ml da amostra tratada

5ml tampão

5ml sulfanilamida

3 ml NED

Detector

540nm

Balão

25 mL

Balão

250 mL

Balão

25 mL

Balão

100 mL


84

3.4 - Resultados e discussão

3.4.1 – Perfis dos sinais analíticos empregando a CTC

Foram realizados estudos preliminares para confirmação das expectativas

quanto ao comportamento dos sinais transientes no sistema em fluxo equipado com

a CTC. Para tanto, alíquota de solução mista de NO2- e NO3

- na concentração de 1

mg L-1 foi injetada no sistema em fluxo proposto. O perfil dos sinais analíticos é

ilustrado na Figura 3.5.

Figura 3.5: Fiagrama obtido pela injeção de solução mista de referência de NO2- e NO3

- 1

mg L-1 no sistema proposto acoplado à câmara de tubos concêntricos.

Dada às características da câmara e o tempo de permanência da solução

mista na CTC, pode-se deduzir que as subzonas da amostra apresentavam

dispersões diferenciadas, a depender do caminho que passavam pela CTC (interno

ou externo). Desde que a capacidade do tubo externo da CTC (2,2 ml) era 50 vezes

maior que a capacidade do tubo interno (44 l), o primeiro sinal transiente, referente

à subzona da amostra que passava pelo tubo interno, revelava menor efeito de

t t


85

dispersão, como pode ser observado pelas larguras dos picos FIA na Figura 3.5. Por

outro lado, o segundo pico apresentavam-se mais largos, devido à alta dispersão da

zona da amostra na coroa da CTC.

3.4.2 – Efeito da vazão

O efeito da vazão sobre o perfil dos picos foi testado, pela inserção de um

corante (azul de metileno) no sistema proposto. Para este estudo preliminar foram

avaliadas vazões entre 0,75 a 4,5 mL min-1. Os registros dos perfis dos sinais

transientes são apresentados na Figura 3.6.

Figura 3.6: Efeito da vazão nos perfis dos sinais transientes. = 665 nm. (n=2)

Além do esperado aumento no intervalo de tempo entre os máximos dos

sinais transientes (pico 1 e pico 2) com a diminuição da vazão, pôde ser observado

que, para vazões menores a interpenetração das frações era mais evidente, o que

em certas circunstâncias poderia levar a total perda da capacidade de monitoração

de ambos os picos.


86

3.4.3 - Otimização do sistema

Para otimização do sistema em fluxo proposto foram realizados testes de

volume amostrado e vazão, percurso analítico e massa de cádmio coperizado. A

capacidade redutora e a vida útil do cádmio também foram avaliadas. A solução

mista de referência contendo NO2- e NO3

- na concentração de 1 mg L-1 foi utilizada,

na maioria dos testes, para otimização do sistema.

3.4.3.1– Efeito do volume amostrado e da vazão

Foram testadas alças de amostragem de 20 (100 l) e 40 cm (200 l) e

vazões entre 0,5 e 7 mL min-1. Na Figura 3.7 são apresentadas as variações dos

valores máximos dos sinais transientes do primeiro e segundo picos obtidos para

alças de amostragem de 20 cm (Fig. 3.7a) e 40 cm (Fig. 3.7b) em função da vazão.

Figura 3.7: Variações dos sinais transientes do primeiro e segundo picos obtidos para alças

de amostragem de 20 cm (a) e 40 cm (b) em função da vazão. Solução mista de NO2- e NO3

-

1 mg L-1 = 540nm.

PICO 1

PICO 2

PICO 2

PICO 1


87

Em relação ao volume amostrado, pôde-se constatar que, o pico 1 apresentou

aumento do sinal analítico na ordem de 50%, para 200 L de amostra injetada. Já,

para o pico 2, não foram verificadas diferenças significativas de sinais com a

variação do volume amostrado. Contudo, aumentando o comprimento da alça de

amostragem foi possível obter sinais mais elevados, permitindo determinar

concentrações menores, fornecendo ao método a sensibilidade necessária. Desta

forma, para os estudos que se seguiram foi escolhida a alça de amostragem de 40

cm.

Para o estudo da vazão, foi observado que a partir de 2 mL min-1, não houve

variação do sinal transiente para o pico 1. Já para o pico 2, observou-se um aumento

do sinal analítico proporcional à vazão. Este fato pode ser explicado, pois maiores

vazões implicaria na menor dispersão da zona da amostra na coroa do CTC, com

conseqüente aumento de sinal.

A vazão otimizada foi a da solução transportadora, uma vez que o coquetel de

reagentes foi injetado no percurso analítico, após a passagem pela câmara de tubos

concêntricos (Fig 3.3). A vazão do coquetel de reagentes foi estabelecida de forma

que não houvesse um consumo exagerado de reagentes. Vazão de 1,5 ml min-1 foi

selecionada para a solução do coquetel de reagentes.

Logo, pelos dados apresentados na figura 3.7 e levando-se em consideração

a produtividade analítica sem perda da qualidade dos resultados, optou-se por uma

vazão do transportador de 4,5 mL min-1.


88

3.4.3.2 - Percurso analítico

Para os ensaios realizados na otimização do percurso analíticos da bobina de

reação – B (Fig 3.3), foram avaliados percursos que variaram de 50 a 200 cm. A

Figura 3.8 mostra o comportamento dos sinais analíticos dos picos 1 e 2 em função

da variação do comprimento do percurso analítico.

Figura 3.8: Variação dos sinais analíticos (pico 1 e pico 2) em função da variação do

percurso analítico. Vazão 4,5 mL min-1 Solução mista de NO2- e NO3

- 1 mg L-1, =540nm,

(n=3).

Pelos resultados mostrados na Figura 3.8, pode-se observar que com o

aumento do percurso analítico não houve aumento significativo no sinal,

notadamente para o pico 2, pois a zona da amostra era bastante diluída na coroa da

CTC. Contudo, para o pico 1 houve discreto ganho de sinal para o percurso de 150

cm. Portanto optou-se pelo percurso analítico de 150 cm.

Para avaliar o aumento de sensibilidade do sistema, foi observado o perfil dos

sinais analíticos, fixando o percurso analítico em 150 cm e variando a alça de

50 100 150 200

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Pico 2

Pico 1

A

Percurso analítico, cm


89

amostragem. Para tanto foi considerada a alça de amostragem variando de 10 a 100

cm. Na Figura 3.9, são observados os sinais analíticos registrados.

Figura 3.9: Variação dos sinais analíticos em função da variação da alça de amostragem.

PA. 150 cm. Vazão 4,5 mL min-1 Solução mista de NO2- e NO3

- 1 mg L-1, =540nm (n=3)

Como esperado, os dados apresentados na Figura 3.9 permitiram observar

que o aumento do tamanho da alça de amostragem pode ser utilizado como recurso

para aumento da sensibilidade.

3.4.3.3 - Avaliação da capacidade de conversão de nitrato a nitrito

Para avaliar a capacidade de conversão de nitrato a nitrito pelo cádmio

coperizado inserido na coroa externa da CTC, foi realizado um planejamento fatorial

com ponto central (2n + 1), variando-se as concentrações de nitrato e nitrito de 0,5 a

5 mg L-1. Esse teste permitiu também verificar possíveis interações (sinergismos)

entre os ânions, visto que conhecendo o comportamento de ambos quando em

misturas, equivaleria ao comportamento dessas espécies em soluções separadas.

0 20 40 60 80 100

0,00

0,15

0,30

0,45

0,60

Pico 2

Pico 1

A

Alça de amostragem, cm


90

Em outras palavras, este estudo visava observar possíveis efeitos proporcionados

pela coexistência das espécies aniônicas no sistema proposto, como ocorre nas

amostras de produtos cárneos. Os dados obtidos estão listados na Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Sinais referentes às diferentes concentrações de soluções mistas de nitrito e

nitrato de sódio.

Solução mista

de referência [NO2

-], mg L-¹ [NO3-], mg L-¹ SINAL 1 SINAL 2

P1 5,0 5,0 0,640 0,290

P2 5,0 0,5 0,640 0,160

P3 0,5 5,0 0,060 0,140

P4 0,5 0,5 0,050 0,020

P5 2,75 2,75 0,350 0,160

Com o auxílio do software (STATISTICA), pôde-se encontrar duas equações

relacionadas aos sinais. Foi preciso converter as concentrações de mg L-1 para mol

L-1, pelo fato do nitrito e nitrato possuírem massas molares distintas (49 e 64 g mol-¹,

respectivamente). As equações encontradas foram:

A1 = 59,80 [NO2-] + 0,69 [NO3

-] - 0,12 (pico 1)

A2 = 14,82 [NO2-] + 17,22 [NO3

-] - 0,11 (pico 2)

Os valores encontrados para as equações acima se referem aos coeficientes

relacionados com o NO2- e o NO3

-. Nota-se que a inclinação da curva referente ao

NO2- (pico 1) é maior que para o pico 2 devido a dispersão da zona da amostra. E


91

que, para o pico 2, onde houve redução do NO3- a NO2

-, o coeficiente para nitrato

não tende a zero, neste caso assumindo o valor igual a 17,22.

Ao colocarmos estas duas equações na forma genérica, temos:

A = a [NO2-] + b [NO3

-] + c

Onde:

A = absorbância

a = coeficiente relacionado à sensibilidade (só diz respeito a fração de amostra que

passa pelo tubo interno)

b = coeficiente relacionado à sensibilidade, ao fator de dispersão e à taxa de

conversão de nitrato em nitrito (só diz respeito à fração que passa pelo tubo externo)

c = sinal do branco.

Sendo assim teremos:

A1 = a1 [NO2-] + b1 [NO3

-] + c1, onde b1 0* (I)

A2 = a2 [NO2-] + b2 [NO3

-] - c2 (II)

Neste caso, b1 tende a zero, pois esta equação diz respeito a subzona da

amostra que passa pelo tubo interno da CTC. Logo só o nitrito presente participará

da reação de Greiss. A resposta para o nitrato presente tenderá a zero.

Pela equação II, se a taxa de conversão de NO3- a NO2

- fosse 100%, b2 seria

igual ao coeficiente a2. Logo, para se determinar à taxa de conversão do NO3- a NO2

-

foi obtida a seguinte equação:

* Lembrando que a reação de Griess só é positiva para nitrito e a1 corresponde ao sinal do analito que transita pelo tubo interno, no qual não ocorrerá a conversão de nitrato a nitrito.


92

% conversão = b2 . 100 / a2

De acordo com os dados da equação correspondente (17,22x100/14,82) ao

máximo do segundo sinal transiente, obtivemos conversão (de NO3- para NO2

-) de

até 116%. Deste modo, foi observado que, para o sistema proposto, a presença do

NO2- não interferiria na redução do NO3

-.

3.4.3.4 - Estudo da massa de cádmio

Para o estudo da massa de cádmio, utilizada na coroa da CTC, para a

redução de NO3- a NO2

-, foram tomadas massas de cádmio granulado coperizado

que variaram de 0,4 a 2,5 g. Foram usadas soluções simples de NO2- e NO3

-, na

concentração de 2 mg L-1.

Os valores de absorbância obtidos pelas soluções simples de NO3- e NO2

-

foram registrados. Foi possível avaliar a eficiência da conversão de NO3- a NO2

-

fazendo a correção da equivalência destes ânions (NO3- = 0,7419 NO2). Para vazão

do transportador de 4,5 mL min-1, percurso analítico de 150 cm, alça da amostra de

40 cm, os resultados dos sinais analíticos obtidos estão apresentados na Figura

3.10.


93

Figura 3.10: Variação do sinal analítico para soluções simples de NO2- e NO3

- após

passagem na coroa do CTC, contendo diferentes massas de Cd.

Observou-se que para a massa de Cd de ca. 2 g houve a equivalência dos

sinais analíticos para ambas as soluções de NO3- e NO2

-.

Na tabela 3.2 são apresentados os porcentuais de conversão de nitrato a

nitrito para diferentes massas de Cd adicionadas na coroa da CTC.

Tabela 3.2 : Absorbâncias obtidas pelas soluções simples de NO2- e NO3

- após a passagem

pela coroa da CTC com diferentes massas de cádmio.

Massa de Cd (g)

NO2-

A

NO3-

A

Fator de conversão de NO3

- para NO2-

(0,7419)

NO2- produzido

(%)

0,4304 0,154 0,046 0,062 40

0,8599 0,176 0,082 0,110 62

1,3149 0,159 0,107 0,144 90

1,8584 0,137 0,106 0,143 102

2,3895 0,136 0,110 0,148 109

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

NO3

-

NO2

-

A

m Cd, g


94

Observou-se que à medida que aumentava a massa de cádmio na coroa da

CTC, o porcentual de redução também aumentava, alcançando 100% para massa

de Cd igual a 1,85 g. Esta massa de cádmio era suficiente para ocupar o quarto

inferior da coroa externa do tubo. Não seria adequada a utilização de uma massa de

cádmio superior a 2 g, pois haveria probabilidade de impedimento espacial do fluxo

na coroa externa. Isto poderia elevar o tempo de residência da zona da amostra na

coroa externa da CTC, retardando o aparecimento do segundo pico.

Logo, de acordo com o estudo realizado, adotou-se 2 g de cádmio coperizado

na coroa externa da CTC, por esta massa proporcionar 100% de redução do nitrato

a nitrito.

3.4.3.5 – Avaliação do tempo de vida útil da coluna de cádmio

A fim de avaliar quanto tempo poderia se utilizar o sistema sem a reposição

de nova massa de cádmio na CTC, foi observada a capacidade redutora da coluna

de cádmio em função do tempo de operação. Para tanto, foi considerada a utilização

do sistema por 8 horas diárias, durante sete dias. A vazão do transportador foi de 4,5

mL min-1, o percurso analítico foi de 150 cm, a alça da amostra foi de 40 cm e a

coroa externa do CTC foi preenchida com 2 g de cádmio coperizado.


95

A Figura 3.11 mostra o perfil da redução do NO3- a NO2

- pelo cádmio em

função do tempo.

Figura 3.11: Porcentual de NO3

- reduzido a NO2- pela passagem de solução de referência

na coroa do tubo concêntrico, em função do tempo de utilização do sistema.

Observou-se que ao longo de sete dias houve diminuição da eficácia redutora

do cádmio, tendo como referência, a utilização do sistema para determinação de

NO2- e NO3

- em amostras de alimentos, numa jornada de trabalho de 8 horas diárias.

Considerando que a regeneração do cádmio é um procedimento relativamente

simples, necessitando de uma lavagem em meio ácido e posterior contato com

solução de CuSO4 para haver a coperização, e tendo em vista os dados da Fig 3.11,

optou-se por regenerar a coluna de cádmio a cada 4 dias de uso.

Após a otimização destes parâmetros o sistema apresentou a configuração

apresentada na Tabela 3.3.

1 2 3 4 5 6 7

80

85

90

95

100

%

t, dias


96

Tabela 3.3: Parâmetros referentes à otimização do sistema em fluxo.

Parâmetro Valor

Vazão transportador (mL min-1) 4,5

Vazão reagentes cromogênicos (mL min-1) 1,5

Alça de amostragem (cm) 40

Percurso analítico (cm) 150

Massa de cádmio (g) 2

Vida útil da carga de Cd na CTC (dias) 4 (93%)

3.4.3.6 – Figuras de mérito

Após a otimização do sistema de análise em fluxo para determinação

seqüencial de NO2- e NO3

-, foram avaliadas as figuras de mérito para o

procedimento analítico proposto. Os resultados estão apresentados na Tabela 3.4.

Tabela 3.4: Figuras de mérito para o procedimento em fluxo proposto

Analito Faixa (mg L-1) Equação (r) LD (3), mg L-1 RSD (%) (n=10)

NO2- 0,5 – 2,5 A = 0,00144+0,11814C

(0,99934)

0,018 0,54

NO3- 1 – 5 A = -0,0026 + 0,05842C

(0,99934)

0,036 0,55

A produtividade analítica do sistema foi de aproximadamente 120

determinações por hora (60 de NO2- e 60 de NO2

- + NO3-). Uma vez estabelecidas

as figuras de mérito do sistema e visando a determinação de nitrito e nitrato foram

realizadas análises em amostras de salsichas e jerked beef (carne bovina salgada,

curada e dessecada).


97

3.4.4 - Aplicação do sistema para a determinação de NO2- e NO3

- em amostras

de produtos cárneos.

Como já mencionado anteriormente o perfil dos sinais analíticos obtidos no

sistema em fluxo se configura em dois picos distintos. A Figura 3.12 ilustra o perfil

dos sinais analíticos obtidos na curva de calibração para NO2- e NO3

-.

Figura 3.12: Sinais analíticos para soluções mistas de NO2

- e NO3- obtidos pelo sistema em

fluxo acoplado a CTC nas condições otimizadas (n=3).

Sete amostras de salsicha e dez de jerked beef foram adquiridas em mercados

locais e analisadas empregando o sistema em fluxo proposto e o método oficial

recomendado pelo Ministério da Agricultura (Brasil, 1999) para validação dos

resultados. Os resultados obtidos por ambos os procedimentos estão apresentados

na Tabela 3.5.

0 500 1000 1500 2000

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

c, mgL-1

2,5

2,0

1,5

1,0

0,7

0,5

B

A,

540nm

t,s


98

Tabela 3.5: Concentrações de NO2- e NO3

- (mg kg-1) em amostras de salsichas (S) e

jerked beef (JB) obtidas pelo Método Oficial (MO) e pelo sistema proposto (FIA).

Amostras [NO2-] (FIA) [NO2

-] (MO) [NO3-](FIA) [NO3

-] (MO)

S1 4,67 0,02 4,330,03 4,420,03 3,20,3

S2 4,8 0,2 4,850,09 51 4,00,4

S3 4,470,01 4,350,02 4,20,2 3,50,4

S4 2,30,1 2,30,1 3,30,1 2,50,2

S5 0,900,01 1,000,01 5,80,2 4,20,4

S6 2,050,02 2,110,03 4,00,4 3,50,4

S7 0,910,01 1,020,01 4,60,4 3,10,3

JB1 0,360,01 0,300,02 3,40,2 2,160,03

JB 2 1,80,1 1,810,04 10,700,01 4,10,1

JB 3 0,390,01 0,360,03 5,70,3 4,40,1

JB 4 0,370,03 0,370,01 4,270,07 1,860,05

JB 5 0,610,06 0,560,01 0,6040,002 0,4820,004

JB 6 0,490,04 0,500,01 10,40,1 7,70,9

JB 7 0,540,06 0,530,002 1,050,3 0,50,6

JB 8 1,450,09 1,590,06 2,80,2 1,80,1

JB 9 0,480,07 0,470,05 8,50,3 5,00,7

JB 10 0,650,03 0,640,02 3,90,2 3,30,3

Os teores de NO2- medidos por ambos os procedimentos foram concordantes

de acordo o teste t-pareado. Contudo, isto não ocorreu para o NO3-. Os teores de

NO3- determinados pelo método oficial foram sempre menores do que aqueles

obtidos pelo sistema em fluxo. Este fato, deve-se provavelmente, à ineficiência da

agitação da solução da amostra com o cádmio metálico, o que pode ter levado a

pouca interação entre o cádmio e o NO3-, existente na solução da amostra,

dificultando a redução. Além disso, a excessiva manipulação da amostra, a qual


99

sofre três diluições e duas filtrações antes da etapa de determinação, pode ser outro

fator promotor de perdas do analito em questão.

Adicionalmente, é importante frisar que o método oficial do Ministério da

Agricultura é aquele seguido pelos Laboratórios Oficiais de controle de alimentos em

todo o pais, mesmo que os fatores aqui descritos contribuam para maiores erros nos

resultados obtidos.

Ademais o método oficial apresenta elevado consumo de reagentes. A massa

de sulfanilamida usada (25 g) por determinação no MO é ca. do dobro daquela

empregada pelo sistema proposto (15 g) . Já a massa de NED empregada no MO

(25 g )é cerca de 30 vezes maior que no sistema em fluxo (0,75 g). O elevado

consumo de reagentes pelo MO resulta na geração de grandes quantidades de

resíduos.

Segundo a Portaria 1004/98 da ANVISA – MS (BRASIL, 1998), o limite

máximo permitido para produtos cárneos curados é de 150 mg kg-1 pra NO2- e 300

mg kg-1para NO3-, sendo que a soma das concentrações das duas espécies no

alimento não deve ultrapassar o limite máximo de nenhum deles, ou seja, 300 mg kg-

1. Todas as amostras analisadas estavam de acordo com a legislação vigente

quanto à concentração de NO2- e NO3

-.

Tendo em vista que os ensaios pelo método oficial não foram concordantes

para NO3-, adicionalmente foram feitas determinações de NO3

- e NO2- em amostras

de água mineral, nas quais é declarada a concentração de nitrato presente. Os

resultados das análises, para três marcas distintas de água mineral encontram-se na

Tabela 3.6.


100

Tabela 3.6: Concentração de NO2- e NO3

- em amostras de água mineral

Amostras

H2O

Conc. no rótulo, mg L-1 Conc. encontrada, mg L-1

NO3- NO2

- NO3- NO2

-

A 1 Não declarado 1,035 0,009 < 0,018 mg L-1

B 1 Não declarado 1,008 0,007 < 0,018 mg L-1

C 1 Não declarado 0,923 0,009 < 0,018 mg L-1

Os resultados encontrados para nitrato foram concordantes com os valores

declarados nos rótulos, indicando a exatidão do procedimento em fluxo proposto nas

condições otimizadas.

3.5 – Conclusões

Os resultados obtidos na determinação de NO2- e NO3

- em amostras de

produtos cárneos, baseados na reação de Greiss, empregando a análise em fluxo

acoplada à câmara de tubos concêntricos confirmaram suas potencialidades. A

exatidão e precisão, por comparação dos resultados com os obtidos na metodologia

de referência, para NO2- em produtos cárneos foram satisfatórias. Contudo, as

concentrações de NO3- apresentaram um desvio sistemático quando comparado

com o método oficial.

A robustez e versatilidade do sistema foram observadas de forma a conseguir

um sistema confiável e preciso para determinação de NO2- e NO3

- em produtos

cárneos, com elevada produtividade analítica.

O sistema oferece sensibilidade na quantificação do analito, com limite de

detecção de 0,018 e 0,036 mg L-1 para NO2- e NO3

-, respectivamente.


101

A versatilidade do sistema foi caracterizada uma vez que o mesmo sistema

pôde ser empregado para outras matrizes.

A automação de métodos de análise é um campo amplo e relevante de

investigação, devido à grande demanda por análises e a redução dos custos

operacionais. A análise de NO2- e NO3

- em produtos cárneos empregando sistema

em fluxo com câmara de tubos concêntricos acoplada apresentou elevada

produtividade (120 determinações h-1) com redução no gasto de reagentes e na

geração de resíduos, sem perda na qualidade dos resultados.

3.6 - Referências bibliográficas

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Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito

106

CAPÍTULO 4

Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para

análise discriminatória de sulfito em carnes empregando o

método da p-rosanilina por difusão gasosa.

4.1– Introdução

O dióxido de enxofre, sulfitos, bissulfito, metabissulfito de sódio e de potássio,

são empregados como agentes inibidores de bolores, leveduras e bactérias numa

infinidade de produtos alimentícios, tais como, frutos e vegetais desidratados, vinhos

e pescados (SIMÃO, 1985). Além de inibidores de microrganismos, os sulfitos

apresentam ação antioxidante, anti-fermentativa e inibidora do escurecimento

enzimático e não-enzimático; ação redutora e clarificante (BRAGAGNOLO et al.,

2001; ARAÚJO, 1995). O mecanismo da ação inibitória de reações de

escurecimento não-enzimático, provavelmente envolve a interação do sulfito com

grupos carbonílicos ativos, impedindo a formação de pigmentos escuros, as

melanoidinas, como apresentado na Figura 4.1 (ARAÚJO, 1995). Segundo

Pizzoferrato e outros (1998), estas reações ocorrem devido a nucleofilicidade do


107

sulfito, levando-o a participar de reações de adição com compostos insaturados,

quinonas e compostos nitrogenados heterocíclicos.

C

OH

S

ONa

OH

OC

OH

H S

ONa

OO

H O SONa

O

C

OH

+

+

+ +

Glicose Sulfito Hidroxissulfonato

Figura 4.1: Ação inibitória do sulfito nas reações de escurecimento não enzimático.

As espécies de sulfito presentes nos alimentos podem estar na forma livre ou

associada. Desta forma o teor de sulfito total corresponde à soma das

concentrações de sulfito na forma livre e associada. (PIZZOFERRATO et al., 1998)

Os sulfitos são largamente empregados na industrialização de frutas, tanto na

produção de sucos, como no armazenamento de frutas antes da esterilização. Por

exemplo, para a produção de frutas em calda, e no processo de desidratação. Neste

caso, o sulfito evita o escurecimento enzimático, o desenvolvimento de odores

desagradáveis, bem como a perda de vitamina C e de carotenóides

(HOLDSWORTH, 1988).

Depois de adicionados aos alimentos, podem ocorrer perdas de sulfito

durante o processamento, armazenamento e na preparação doméstica. O cozimento

reduz a quantidade de sulfito, porém não o elimina do alimento (BRAGAGNOLO et

al., 2001).

Pina e outros (2003) estudaram a conservação de manga em pedaços, por

métodos combinados (tratamento térmico, osmótico e adição de conservantes), por

120 dias à temperatura ambiente. Realizaram dois experimentos, utilizando

respectivamente, 600 e 900 ppm (v/v) de SO2. Observaram que para ambos os


108

experimentos, houve uma acentuada perda de SO2 ao longo do período investigado

(ca. 60%), demonstrando a influência do tempo de armazenamento na perda de

SO2.

A análise do resíduo de sulfito em alimentos é delicada pelo fato de ocorrerem

rápidas interações entre o sulfito e os vários componentes do alimento. O sulfito

reage prontamente com açúcares redutores, aldeídos, cetonas, antocianinas (Figura

4.2), além de proteínas, levando a uma grande variedade de sulfitos orgânicos

combinados. A extensão da reação é dependente do pH, temperatura, concentração

de S(IV) e dos compostos reativos presentes no produto. Em face da rápida reação

do sulfito com os constituintes do alimento, baixas concentrações de sulfito livre no

produto devem estar presentes no momento do consumo (ARAÚJO, 1995).

Figura 4. 2: Reação de descoloração da antocianina pela ação do sulfito

O sulfito utilizado a bordo de navios para a prevenção de melanose (manchas

pretas) em crustáceos, quando usado em excesso, proporciona a decomposição do

óxido de trimetilamina (OTMA) em dimetilamina (DMA) e formaldeído,

comprometendo, desta forma, a qualidade do pescado, principalmente no que se

refere ao endurecimento da carne após o cozimento. Neste contexto é que Cintra e

outros (1999) realizaram um estudo e verificaram um acentuado aumento dos níveis


109

de DMA e formaldeído após o uso de metabissulfito de sódio a 2%, por 10 min, em

camarões brancos.

Na qualidade de fortes agentes redutores, as espécies de S(IV) podem ser

incorporadas aos alimentos na forma de gás (SO2) ou de sais de sulfito, bissulfito ou

metabissulfito, os quais liberam o sulfito nas condições de uso. O dióxido de enxofre

é utilizado na preservação de frutas e hortaliças desidratadas, enquanto as soluções

de sulfito são utilizadas em alimentos líquidos (ARAÚJO, 1995). A Tabela 4.1

apresenta a relação mássica entre os agentes de sulfitação e a liberação de SO2.

Ademais, os sulfitos podem ser encontrados nos alimentos, em virtude da redução

microbiológica do SO42- para SO3

2-. Podem ocorrer perdas por exposição ao ar,

oxidação para SO42- e por cozimento (ARAÚJO, 1995).

Tabela 4.1: Relação massa/massa entre os agentes de sulfitação e SO2 disponível.

Agentes de sulfitação SO2 (%)

Dióxido de enxofre (SO2) 100

Sulfito de sódio anidro (Na2SO3) 50,82

Sulfito de sódio heptahidratado (Na2SO37 H2O) 25,41

Bissulfito de sódio (NaHSO3) 61,56

Metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 67,39

Metabissulfito de potássio (K2S2O5) 57,6

Bissulfito de potássio (KHSO3) 57,32

Adaptado de ARAÚJO, 1995.

Os vários sais, assim como o dióxido de enxofre, quando dissolvidos em

água, resultam em uma mistura de íons sulfito e bissulfito, sendo a proporção

relativa de cada forma dependente do pH do meio, da força iônica e da

concentração (Figura 4.3). Desta maneira, a escolha do sal, ou do gás, para ser


110

adicionado aos alimentos é uma questão de conveniência, já que todas as formas

são quimicamente equivalentes. Na faixa normal de pH dos alimentos, a forma

predominante será HSO3-. (ARAÚJO, 1995).

SO2 + H2O SO2 . H2O (solução)

SO2 . H2O H+ + HSO3- pKa = 1,81

HSO3- H+ + SO3

2- pKa = 7,18

Figura 4.3: Reações de dissociação de SO2 e sulfitos.

A adição de espécies S(IV) não é recomendada em alimentos considerados

como fontes de vitamina B1 – tiamina, pois aquelas causam a sua destruição (Figura

4.4), resultando perda da atividade biológica, com formação de tiazol e pirimidina

substituídos (BOBBIO e BOBBIO, 1992; BELITZ, 1997). Pizzoferrato e outros (1998)

citam a possibilidade de interação com a piridoxina, nicotinamida e ácido fólico,

levando a diminuição do valor nutricional do alimento tratado com S(IV).


111

Tiamina Pirimidina Tiazol

Figura 4.4: Inativação da Tiamina na presença de sulfito.

A legislação brasileira permite o uso de sulfitos em diversos grupos de

alimentos. A Tabela 4.2 traz os agentes de sulfitação permitidos e seus respectivos

códigos. A Tabela 4.3 apresenta os grupos de alimentos, o limite máximo, e a

legislação referente ao uso destes agentes.

Tabela 4.2 : Agentes de sulfitação permitidos pela legislação brasileira

Aditivo INS

Dióxido de enxofre 220

Sulfito de sódio 221

Bissulfito de sódio 222

Metabissulfito de sódio 223

Metabissulfito de potássio 224

Sulfito de potássio 225

Sulfito de cálcio 226

Bissulfito de cálcio 227

Bissulfito de potássio 228


112

Tabela 4.3: Grupos de alimentos nos quais é permitido o uso de agentes de sulfitação.

Grupos de alimentos Limite máximo (como SO2) g % (m/m)

Legislação

Bebidas não alcoólicas prontas para o consumo à base de soja

0,004 RDC 25/2005 . ANVISA

Preparações culinárias industriais prontas para consumo (congeladas ou não)

0,02 RDC 34/2001 ANVISA

Xarope de glicose

0,004 RDC 27/2000 ANVISA

Bebidas não alcoólicas gaseificadas e não gaseificadas

0,004 Resolução 389/99 ANVISA

Cereais e Produtos de ou a base de Cereais:.farinha com adição de aditivos para uso industrial:


Produtos de panificação: pães, biscoitos, bolos, tortas, doces e massas de confeitaria,

0,005

Resolução 383/99 ANVISA

Molhos e condimentos (vinagre)


Vinho

250* IN 2/2005 MAPA

Suco de caju

33,3* (no produto a ser consumido)

RDC 12/2002 ANVISA

Suco de caju concentrado (dil1:9) 300* (no produto concentrado)

RDC 12/2002 ANVISA

Nota: * mg L-1

A presença de sulfito em carnes in natura desrespeita a legislação (BRASIL,

1952), pois não é permitida a adição de quaisquer compostos em carnes desta

natureza. A exemplo de práticas fraudulentas, o sulfito, quando adicionado à carne

fresca, mascara o início do processo de deterioração, pois realça a coloração

vermelha da carne. O potencial redutor do sulfito mantém os íons ferro da

mioglobina no estado Fe2+, conferindo a coloração vermelha viva, característica de

carnes frescas.


113

A transição de Fe2+ para Fe3+ está relacionada à mudança da coloração da

mioglobina (Fig. 4.5) de vermelho para parda (metamioglobina), a qual ocorre

quando a carne está deteriorada (BELITZ e GROSCH, 1997).

Figura 4.5: Reações de oxidação da mioglobina

Quando adicionado à carne, diretamente, na forma de sal, ou pulverizado, em

solução, o sal não fica aparente aos consumidores, não sendo possível sua

visualização. Por ser um sal inodoro, também não é possível perceber sua presença

pelo olfato. Assim, somente a análise química pode ser empregada para a

caracterização da presença, ou ausência, de sulfitos na carne. Portanto, faz-se

necessário, que os órgãos fiscalizadores (Vigilância Sanitária, PROCON,

CODECON), executem inspeções nos mercados varejistas, associadas à coleta de

amostras, a fim de monitorar a presença de sulfito, como um indicador de fraude e

de práticas inadequadas de higiene.

Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NO

globina

Fe

N

N

N

NH2O

globina

OMioglobina

(vermelho púrpura)

Oxigenação

Oximioglobina

(vermelho brilhante)Oxidação

Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

2+globina Fe

N

N

N

NO

globina Fe

N

N

N

NO

globina

Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

globina

OMioglobina

(vermelho púrpura)

Oxigenação

Oximioglobina


2+

3+

Redução

Mioglobina

Vermelho púrpura

Oximioglobina

Vermelho vivo

Metamioglobina

Parda

Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NO

globina Fe

N

N

N

NO

globina

Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

globina

OMioglobina

(vermelho púrpura)

Oxigenação

Oximioglobina


Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

2+globina Fe

N

N

N

NO

globina Fe

N

N

N

NO

globina

Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

globina

OMioglobina

(vermelho púrpura)

Oxigenação

Oximioglobina


Fe

N

N

N

NH2O

globina Fe

N

N

N

NH2O

globina

OMioglobina

(vermelho púrpura)

Oxigenação

Oximioglobina


2+

3+

Redução

Mioglobina

Vermelho púrpura

Oximioglobina

Vermelho vivo

Metamioglobina

Parda


114

Uma das dificuldades encontradas pelos órgãos fiscalizadores é a

morosidade na resposta do diagnóstico, quanto às análises solicitadas aos

laboratórios da rede oficial, referentes às amostras coletadas, fruto da prática de

vigilância à saúde. Neste sentido, a análise discriminatória apresenta-se como uma

alternativa viável e de resposta rápida para pesquisa de analitos indicadores de

fraudes. Uma vez que não é permitida a presença destes sais em carnes, pode ser

assumido que basta a execução de um teste indicador da presença do referido

analito, para verificar se este está ou não ausente da amostra sob investigação. Vale

a pena ressaltar que, nem todos os métodos discriminatórios necessariamente têm

elevada produtividade analítica, haja vista que, a característica da maioria dos

métodos oficiais não condiz com aquelas previamente citadas para análises

discriminatórias. Outros aspectos relacionados aos métodos oficiais já foram

discutidos no primeiro capítulo desta tese.

O sulfito associado a outras espécies no alimento pode ser recuperado in vitro

pela acidificação e aquecimento da solução da amostra, enquanto que in vivo, esta

espécie é liberada no trato digestivo. Deve ser considerado que o sulfito liberado no

trato digestivo pode causar irritações gástricas, intoxicação para pessoas com

reduzida atividade de sulfito oxidase, além de ser um dos precursores de asma

brônquica (LECLERCQ et al., 2000). Bragagnolo e outros (2001), descreveram

sintomas ou reações relacionadas com a ingestão de sulfitos, a exemplo de

vermelhidão, urticária, pressão sanguínea baixa, problemas respiratórios, distúrbios

gastrintestinais, dermatite, náusea, diarréia, choque anafilático, ataque asmático

agudo e perda de consciência.

Segundo Pizzoferrato e outros (1998), desde 1959 os agentes de sulfitação

foram classificados pelo CFR (Code of Federal Regulations – EEUU) como agentes


115

GRAS, do inglês: generally recognised as safe – geralmente reconhecido como

seguros, quando usados em obediência às boas práticas de fabricação. No entanto

o FDA (Food and Drug Administration) registrou algumas mortes (27 até abril de

1988) atribuídas ao consumo de alimentos contendo sulfito e estabeleceu que

alimentos contendo mais de 10 mg L-1 de agentes sulfitantes tenham seus teores

declarados no rótulo. A ingestão diária aceitável de dióxido de enxofre, para o

homem é de 0,7 mg Kg-1 de massa corpórea (LECLERCQ et al., 2000).

No Brasil, é estabelecido o limite máximo de agentes sulfitantes para os

diversos grupos de alimentos, como ilustrado na Tabela 4.3. Portanto, é necessário

conhecer a distribuição nos alimentos das espécies de S(IV) associado e livre. Esta

necessidade levou ao desenvolvimento de processos analíticos capazes de

identificar e quantificar sulfito em matrizes complexas (FAZIO e WARNER, 1990).

Os métodos para a determinação de sulfitos em alimentos variam desde

análises muito simples até alguns métodos indiretos complexos. As técnicas

empregadas são baseadas, entre outras, em espectrofotometria visível,

espectrofluorimetria e quimioluminescência (BRAGAGNOLO et al., 2001; MANA e

SPOHN, 2001; YANG et al., 2002; YAMADA, et al., 1983), eletroforese capilar

(JANKOVSKIENE et al., 2001) e métodos eletroanalíticos (AZEVEDO et al., 1999;

WEEVER e KRAAK, 1997). Outrossim, estas técnicas podem associar sistemas,

como a sistemas de análise em fluxo (LINARES et al., 1989; SEGUNDO e RANGEL,

2001; MELO et al., 2003), biorreatores (FATIBELLO-FILHO e VIEIRA, 1997),

sistemas de microdestilação (MAQUIEIRA et al., 1993), a microcomputadores para

aplicação de algoritmo de redes neurais (SAFAVI et al., 2004), além de sistema de

difusão gasosa (SEGUNDO e RANGEL, 2001; AZEVEDO et al., 1999; MELO et al.,

2003; MANA e SPOHN, 2001; LINARES et al., 1989).


116

Em geral, as principais limitações para os métodos, visando a detecção ou

determinação do teor de sulfito, estão relacionadas às etapas de preparo da amostra

e à pureza dos reagentes, principalmente se o procedimento for baseado em método

enzimático. Estes fatores corroboram com o fato da determinação de sulfito

geralmente estar associada a uma etapa de separação (extração, difusão ou

destilação). Neste sentido, é interessante que os métodos propostos possam

simplificar esta etapa, visando incrementar o ritmo de análise, sem comprometer o

nível da confiabilidade dos resultados. Este efetivamente é um dos motivos que

tornam atraentes o emprego de sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA) para

o desenvolvimento de procedimentos analíticos (SANTOS, 2004).

Dentre os mais variados protocolos de análise apresentados na literatura para

a determinação de sulfito em alimentos, aqueles baseados em analise por injeção

em fluxo (FIA) associado a dispositivo de permeação gasosa através de membrana

semi-permeável, encontram-se em maior proporção, pois atendem ao desejável

quesito de simplicidade no tratamento da amostra. Vale a pena ressaltar que a

grande maioria dos trabalhos é direcionada para a determinação de sulfito livre e

associado em amostras de vinhos.

A utilização do recurso da permeação gasosa em sistemas FIA pode ser

efetivada pela incorporação ao módulo de análise em fluxo de um dispositivo que

permita a permeação de gases e que duas correntes (uma da amostra e uma da

solução receptora) fluam independente e separadamente pelo seu interior. A

inserção em uma das correntes de fluxo da amostra líquida ocorre em condição tal

que permita a conversão do analito em uma espécie volátil capaz de se difundir

através da membrana. A solução receptora deverá fluir em linha independente da

primeira, sendo capaz de converter a espécie derivada do analito original em uma


117

forma estável no meio líquido. Este, por sua vez, poderá ser separado da matriz e,

se necessário, pré-concentrado (SANTOS, 2004).

Em muitos casos, as soluções são separadas por membrana hidrofóbica

semipermeável e a transferência do analito para o percurso analítico ocorre

geralmente em um único módulo (RUZICKA e HANSEN, 1988). Esta característica

possibilita a criação e fabricação de protótipos de sistemas e aparatos criativos que

podem ser associados a módulos FIA para a determinação de diferentes analitos.

O método da p-rosanilina é empregado para determinação de sulfitos, tendo

sido exaustivamente reportado na literatura (KASS e IVASAKA, 2001;LINARES et

al., 1989; MARCZENKO, 1976; MATAIX e LUQUE DE CASTRO, 1998; RICHTER et

al., 1993; SEGUNDO e RANGEL, 2001). A determinação de sulfito pelo método da

p-rosanilina fundamenta-se no princípio de que em meio ácido a p-rosanilina sofre a

perda da conjugação entre os anéis, tornando-se incolor. Na presença de sulfito, o

formaldeído presente no reagente origina o ácido hidroxisulfônico que reestrutura a

conjugação máxima da molécula, e é responsável pela coloração rósea original da p-

rosanilina . Este conjunto de reações pode ser observado na Figura 4.6.


118

NH2

NH2

NH2

Cl

Cl

NH3

NH3

NH3

Cl

Cl

Cl

HCOH SO3

2 -HOCH

2SO

3H

Cl

NH3

NH3

NH3

Cl

Cl

Cl HOCH2SO

3H

NH2

NH2

NHCH2SO

3H

Cl

+

Rosa

+ 3HCl+ +

Incolor

+

+

+

+

+

Rosa

+

Figura 4.6: Reações da p-rosanilina com o sulfito.

Pela legislação brasileira, o método oficial para monitorar sulfito em amostras

de alimentos é o método Monnier-Williams (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985).

Muitos dos métodos empregados são, essencialmente, oriundos de modificações do

primeiro procedimento de Monnier-Williams, desenvolvido em 1927 e revisado em

1986 para obtenção de níveis 10 mg Kg-1 de alimento (WANER et al., 1986 apud

BRAGAGNOLO, 2001). Este método se baseia na destilação em meio ácido do

S(IV), como SO2, o qual é transportado por um gás de arraste inerte, normalmente

N2, para uma solução oxidante, onde o SO2 é convertido a SO42-. O sulfato

produzido é, então, determinado por método volumétrico ou gravimétrico. Assim,

para cada 1 mol de S(IV) presente na amostra sob destilação, será produzido 1 mol

de SO2 que, por sua vez, será convertido na presença de oxidante em 1 mol de

sulfato. Apesar deste método ser adequado para a maioria das amostras de


119

alimentos, foram reportados resultados falso-positivos para amostras de vegetais do

gênero Allium e Brassica, bem como para proteína isolada de soja (SU e TAYLOR,

1995). Deve ser salientado que este método envolve muitas etapas e manipulação

da amostra, acarretando em baixa produtividade analítica, além do uso de aparatos

de vidros específicos para a sua execução.

Na Figura 4.7 tem-se o sistema empregado para análise de sulfito pelo

método de Monnier-Williams, o qual é descrito nos manuais nacionais de análise de

alimentos (BRASIL, 1987).

Figura 4.7: Sistema para a aplicação do método de Monnier-Williams, (adaptado de Brasil,

1987).

Neste contexto, o objetivo desta etapa do trabalho foi desenvolver um sistema

FIA para análise discriminatória de sulfito livre em carnes, utilizando uma câmara de


120

permeação, empregando o método da p-rosanilina (MARKZENKO,1976). Tendo em

vista que a presença de sulfito na carne é proibida, optou-se pela análise

discriminatória, objetivando a construção de um sistema que apresentasse resposta

rápida, produtividade analítica elevada e baixo custo.

4.2 – Metas

De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas envolvidas nesta

etapa foram:

Desenvolvimento de módulo de análise em fluxo equipado com câmara de

permeação para análises discriminatórias de sulfito livre em amostras de

carnes.

Otimização do sistema de análise prévia de sulfito, considerando as faixas de

concentração do analito na matriz.

Validação do procedimento pela comparação com método de referência.

4.3 – Material e métodos


Para as determinações de sulfito pelo método da p-rosanilina no sistema FIA

equipado com câmara de permeação foi empregado espectrofotômetro Femto 700

plus (Brasil), equipado com cubeta de vidro com 10 mm de caminho óptico e volume

interno de 200 L e bomba peristáltica Gilson MiniPuls 3 (França) de quatro 4 vias,

para a propulsão dos líquidos. Microcomputador equipado com interface PCL 711S

(Advantech) foi empregado para a aquisição de dados a freqüência de 20 Hz; linhas


121

de transmissão em polietileno (diâmetro interno de 0,8 mm) e tubos peristálticos de

Tygon® foram também empregados no módulo de análise em fluxo. O diagrama do

sistema FIA é apresentado na Figura 4.8.

Figura 4.8: Diagrama de fluxo para análise de sulfito. A. amostra, C. carregador (H2O), R.

solução de reagentes (p-rosanilina e formaldeído), PP. bomba peristáltica, Y1 e Y2.

confluências, B1: bobina de mistura da amostra com HCl (1,0 m), B2. bobina de reação (2,5

m), D. detector (580 nm), CP. câmara de permeação, W. descarte.

A câmara de permeação foi construída pelo acoplamento de dois blocos de

acrílico, os quais foram usinados para a confecção de sulcos, de forma que as vias

de passagem dos líquidos fossem separadas por uma membrana de PTFE. Os dois

blocos em acrílico foram unidos por parafusos, de forma a não permitirem

vazamentos. O esquema e as dimensões da câmara de permeação estão descritos

na Figura 4.9.

DW

C

A

HCl

CPR

B2

PP

B1

W

y1

y2


122

Figura 4.9: Esquema simplificado da câmara de permeação. A. visão lateral, B. Visão

frontal, C. (carregador + amostra + HCl), R. coquetel de reagentes, D. detector, W. descarte.

A amostra foi inserida no percurso analítico por válvula rotatória de seis vias

(Rheodine) e seu funcionamento nas etapas de amostragem e injeção está

esquematizado na Figura 4.10.

Figura 4.10: Esquema da válvula rotatória, indicando os canais e a alça nas posições de

amostragem e injeção.

Amostra Amostra

C

D R

W

Teflon

Parafusos

2 cm

1 mm

13,5 cm

2 cm

10 cm

3 mm

A. Visão Lateral

B. Visão Frontal


123

4.3.2 – Reagentes e Soluções

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico de pureza. A água

utilizada para o preparo das soluções era purificada e fresca, com condutância

sempre <18,2 S cm-1.

As soluções de referência eram diariamente preparadas, a partir de NaSO3

(Merck,). A solução de 100 mg L-1 de SO3- foi preparada, tomando 0,0157 g do sal e

diluindo com solução de EDTA (Reagen) (sal sódico) 0,1 mmol L-1 até 100 mL. A

partir desta solução foram preparadas as soluções de referência por diluição.

O coquetel de reagentes foi preparado, pela mistura de 10 mL de solução

alcoólica (2:10) de p-rosanilina (Merck) 0,1% (m/v), 16 mL de HCl (Merck)

concentrado e 250 L de formaldeído (Merck) a 37% (m/m) e completando o volume

para 500 mL, seguindo as recomendações de Segundo e Rangel (2001). A solução

do coquetel de reagente foi armazenada em frasco âmbar sob refrigeração por até 5

dias.


O sistema FIA para análises discriminatórias de sulfito foi baseado no método

da p-rosanilina (MARKZENKO,1976). Como apresentado na Figura 4.8, a alíquota

de amostra injetada (250 µL) no percurso analítico era transportada até a

confluência Y1, por onde era inserida solução de HCl 0,2 mol L-1. A mistura da

amostra à solução de HCl ocorria na bobina de mistura (B1) para, então, ser

transportada pela solução carregadora (H2O) em direção à câmara de permeação a

vazão de 1 mL min-1, onde o SO2 produzido pela reação permeava através da


124

membrana de PTFE para reagir com a p-rosanilina (B2) presente na solução de

coquetel de reagentes (p-rosanilina e formaldeído), sendo, em seguida, endereçada

ao detector (D). A informação do sinal gerado pelo detector a 580 nm era transmitido

pela interface PCL711S para um programa desenvolvido no laboratório.

Para a aplicação da análise discriminatória de sulfito em carnes empregando

o módulo de análise proposto, primeiramente 50 g de amostra de carne eram

fatiadas em pequenos cubos. O volume de 50 mL de solução de EDTA dissódico 0,1

mmol L-1 era, então, adicionado à amostra para extração do sulfito, sendo mantido

em contato, sob agitação, por 3 min. Após este período a mistura era mantida em

repouso e a solução do sobrenadante era levada para o módulo FIA de análise.

Para a comparação do desempenho do procedimento FIA proposto foi

empregado o método iodométrico, segundo Mataix e Luque de Castro (1998),

visando à validação dos resultados obtidos.

4.4 – Resultados e Discussão

4.4.1 – Otimização do sistema

As vazões do carregador e da solução de reagentes, tamanho da alça de

amostragem, a concentração de HCl e percurso analítico (dimensões de B1 e B2),

foram as variáveis do sistema FIA selecionadas para otimização. Para realização

destes testes foram preparadas soluções de referência de sulfito em EDTA dissódico

0,1 mmol L-1 nas concentrações entre 10 e 32 mg L-1.


125

4.4.1.1 – Efeito da vazão

Para o estudo das vazões foram avaliadas as seguintes vazões do carregador

e da solução reagente: (i) vazão do carregador igual a vazão da solução reagente –

razão entre as vazões igual a 1; (ii) vazão do carregador duas vezes maior que a da

solução do reagente – razão entre as vazões igual a 2; e, (iii) vazão da solução

reagente duas vezes maior que a do carregador – razão entre as vazões igual a 0,5.

Os sinais transientes gerados podem ser observados na Figura 4.11.

Figura 4.11: Efeito da razão (R) entre a vazão do carregador e a vazão da solução do

coquetel de reagentes sobre o sinal. Solução de SO32- 16 mg L-1 (250 L); HCl 0,5 mol.L-1.

Pela Figura 4.11 pôde ser observado que com a diminuição da vazão da

solução do reagente ocorria aumento do sinal analítico (razão entre as vazões igual

a 2). Não foram observadas variações significativas de sinais nos casos em que as

razões entre as vazões foram 0,5 e 1. Provavelmente, com a diminuição da vazão da

solução reagente, a reação de formação da p-rosanilina era favorecida pelo tempo,

levando, desta forma, a um aumento de sinal analítico.

0,5 1,0 1,5 2,0

0,024

0,028

0,032

0,036

A (

580 n

m)

R


126

Para os ensaios subseqüentes optou-se pelas respectivas vazões, carregador

igual a 1 mL min-1 e solução de reagentes igual a 0,5 mL min-1, visando minimizar as

perdas de SO2 após a mistura com o ácido e ao mesmo tempo favorecer a reação

com a p-rosanilina.

4.4.1.2 – Alça de amostragem

O comprimento da alça de amostragem define a alíquota da amostra a ser

injetada no percurso analítico. Usualmente, o aumento da alça de amostragem

apresenta certo grau de linearidade com o sinal gerado. A curva apresentada na

Figura 4.12 mostra a variação do sinal analítico com o aumento do comprimento da

alça de amostragem de 0,2 a 1 m (volume injetado de 100 a 500 µL).

Figura 4.12: Variação do sinal analítico em relação ao comprimento da alça de

amostragem. Solução de SO3- 32 mg L-1, HCl 0,5 mol L-1, vazão do carregador: 1mL min-1,

vazão da solução reagente: 0,5 mL min-1.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0,02

0,04

0,06

0,08

A (

580 n

m)

Alça de amostragem (m)


127

Para os ensaios subseqüentes optou-se por alça de amostragem de 0,5 m, o

que corresponde a 250 µL de volume injetado da solução amostra no percurso

analítico.

4.4.1.3 – Concentração do HCl

O HCl foi inserido por confluência para a conversão do S(IV) à sua forma

gasosa – SO2. O processo foi avaliado para solução de referência de sulfito com

concentração de 32 mg L-1 e para concentrações de HCl entre 0,05 e 0,5 mol L-1. A

variação do sinal analítico com a concentração de HCl é apresentada na Figura

4.13.

Figura 4.13: Efeito da concentração do HCl no sinal analítico para solução de referência de

SO32- igual a 32 mg L-1.

Pela Figura 4.13 pôde ser observado que para solução de referência de SO32-

32 mg L-1 (0,4 mmol L-1) ocorria aumento do sinal analítico com o aumento da

concentração de HCl até concentração do ácido igual a 0,2 mol L-1. Para

concentrações mais elevadas de HCl não foram observadas variações significativas

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0,036

0,042

0,048

0,054

0,060

A (

58

0 n

m)

C, mol L-1


128

nos sinais analíticos gerados. Assim, foi selecionada a concentração de HCl igual a

0,2 mol L-1.

Pela relação estequiométrica, para a conversão de 1 mol de SO32- a 1 mol de

SO2 seriam necessários 2 moles de H3O+. Pelos testes de otimização univariada da

concentração de HCl visando a determinação de S(IV) pelo módulo FIA foi

encontrada proporção 250 vezes maior que a necessária para atender a relação

estequiométrica. Deve ser ressaltado que na literatura são reportadas concentrações

de HCl para produção de SO2 muito superiores a 0,2 mol L-1, para aplicação do

mesmo método da p-rosanilina (SEGUNDO e RANGEL, 2001; RICHTER et al.,

1993).

Contudo, uma vez selecionada a concentração de HCl em 0,2 mol L-1, a qual

mostrou ser adequada para a garantir a produção e permeação do SO2 a partir de

solução de referência de sulfito 32 mg L-1, ao mesmo tempo pode ter sido

estabelecida a concentração máxima de sulfito nas soluções amostra capaz de ser

convertida a SO2, visto que possivelmente para a produção de SO2 com o mesmo

rendimento a partir de soluções mais concentradas em sulfito seja necessário o

emprego de soluções mais concentradas do ácido. Desta forma, assumindo para

sulfito concentração máxima igual a 32 mg L-1 e, como descrito anteriormente que a

amostra de carne submetida a análise foi tratada com 50 mL de solução de EDTA, a

quantidade máxima de sulfito que o procedimento terá capacidade de quantificar

será de 1600 µg. Apesar desta restrição, é necessário ressaltar que o procedimento

foi desenvolvido para análises discriminatórias da presença de sulfito em amostras

de carne e, portanto, o limite máximo de concentração de sulfito na amostra não

deve ser entendido com um fator de restrição ao procedimento, visto que pela sua


129

característica este é necessária e forçosamente relacionado ao limite mínimo de

sulfito que o processo é capaz de discriminar para caracterização de fraude.

4.4.1.4 – Percurso analítico

Para todos os sistemas FIA a variação no comprimento do percurso analítico

influencia diretamente na dispersão da zona de amostra. Outrossim, podem ser

estabelecidas relações estreitas deste parâmetro com a freqüência analítica e a

sensibilidade. Desta forma, procurou-se otimizar o comprimento do percurso

analítico, levando-se em consideração: (i) a mistura efetiva do ácido com amostra

(B1 – Fig. 4.8) e (ii) o tempo de reação necessário para produção da p-rosanilina (B2

– Fig. 4.8).

Para avaliação do percurso analítico na parte inferior do sistema, variou-se o

comprimento da bobina de mistura da amostra com a solução de HCl 0,2 mol L-1

entre 0,3 e 1,0 m. Os resultados para esta avaliação são apresentados na Figura

4.14.


130

Figura 4.14: Variação do sinal analítico com o percurso analítico para a parte inferior do

sistema de análise em fluxo (B1). Vazão do coquetel de reagentes de 0,5 mL min-1. Vazão do

carregador 1,0 mL min –1. Solução SO32- 16 mg L-1.

Observou-se uma variação pouco significativa do sinal analítico com o

aumento do percurso analítico da bobina de mistura (B1). Esta informação indicava

que, apesar da maior dispersão da zona de amostra com o aumento do percurso

analítico – dispersão esta que levaria à diminuição do sinal analítico – a produção de

SO2 a partir do sulfito não ocorria imediatamente após a mistura com a solução de

HCl. Apesar da pequena variação, optou-se por um percurso analítico de 1,0 m para

B1.

Para a avaliação do efeito da variação do percurso analítico na bobina (B2),

foram testados percursos analíticos que variaram de 0,8 a 2,5 m e os resultados

podem ser observados na Figura 4.15. Pôde ser observado que, para a injeção de

uma solução de referência de 16 mg L-1 em sulfito houve aumento do sinal analítico

com o aumento do percurso analítico. Desta forma, pode ser assumido que para o

percurso analítico de 2,5 m a reação entre o SO2 permeado e a p-rosanilina não é

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0,01

0,02

0,03

0,04

A (

580 n

m)

Percurso analítico (m)


131

imediata. Logo, este foi o percurso analítico adotado para o sistema. Este dado foi

concordante com o apresentado por Linares e outros (1989).

Figura 4.15: Variação do sinal analítico com o percurso analítico para parte superior do

sistema de analise em fluxo (B2). Vazão do coquetel de reagentes de 0,5 ml min-1. Vazão do

carregador 1,0 mL min –1. Solução SO32- 16 mg L-1.

4.4.2 – Figuras de mérito

Apesar da proposta deste trabalho ser pautada no desenvolvimento de

sistema para análise discriminatória, foram realizados ensaios quantitativos e o

sistema poderá ser empregado para a determinação da concentração de SO32.

Então, após a otimização do sistema de análise em fluxo para análise

discriminatória de sulfito, foram avaliadas as figuras de mérito para o procedimento

analítico proposto.

Para a faixa analítica de trabalho de 4 a 32 mg L-1 de SO32- foi obtida a

seguinte linearidade entre a absorbância e a concentração: A = 0,000320 +

0,00271C (R = 0,9992). O limite de detecção estimado foi de 0,455 mg L-1 e desvio

0,8 1,2 1,6 2,0 2,4

0,021

0,028

0,035

0,042

A (

540 n

m)

Percurso analítico (m)


132

padrão relativo de 2,8% (n=10), para a concentração de 16 mg L-1. Nestas

condições, o sistema desenvolvido alcançou freqüência analítica de ca. 12 amostras

por hora.

Apesar do limite de detecção calculado ter sido de 0,455 mg L-1, foi admitido

para confirmação da presença de sulfito pelo procedimento em fluxo de análise

discriminatória o limite mínimo de concentração da faixa analítica de trabalho, o qual

correspondeu a 4 mg L-1. A opção por este critério, não fundamentado em regras da

probabilidade e/ou estatística, foi selecionada, visto que, embora os ruídos

apresentados nas medidas tenham sido imperceptíveis, os sinais analíticos obtidos,

mesmo para a concentração de sulfito igual a 4 mg L-1, foram muito baixos (da

ordem de 0,009 unidades de absorbância).

4.4.3 – Aplicação do sistema em amostras de carnes expostas ao consumo

Confirmada a capacidade do sistema de análise em fluxo para análise

discriminatória de sulfito livre, por permeação gasosa do SO2, foram determinados

os teores de sulfito livre em amostra de carnes frescas adquiridas em mercados de

Salvador. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4.4.

Apesar do método de Monnier – Willians, ser preconizado pelos órgãos

oficiais nacionais como referencial para as determinações de sulfito em amostras de

alimentos, optou-se por realizar a titulação iodométrica para avaliar a presença de

sulfito livre nas amostras de carne. Assim, a uma alíquota de 50 mL da água de

lavagem das amostras de carne foram adicionados 2,5 mL de solução de amido 1%

(m/v), 30 mg de EDTA e 3 mL de H2SO4 (1+9). Esta mistura foi imediatamente

titulada com solução de triiodeto 0,05 mol L-1, previamente padronizado com


133

tiossulfato de sódio. Para os cálculos foi assumido que o iodo consumido era

proporcional à quantidade de SO2 livre na amostra.

Aleatoriamente, uma das amostras de carne foi propositadamente fraudada

pela adição de 1 mg de SO32- em 10 g da amostra de carne, para a realização dos

testes. Somente após as análises é que se identificou qual das amostras estava

fraudada (amostra 5).

Tabela 4.4: Presença de sulfito livre em amostras de carnes frescas

Amostra de carne fresca

Sistema proposto

Método controle

1 Não detectado Não detectado




5 * Presença

(19,6 0,5 mg L-1)

Presença

(19,62 0,2 mg L-1)

Nota: *amostra fraudada propositalmente

4.5 – Conclusões

Os resultados obtidos na análise discriminatória de sulfito em amostras de

carnes, baseado no método da p-rosanilina, em sistema FIA por permeação,

confirmou sua potencialidade. A robustez e versatilidade do sistema foram

observadas de forma a conseguir um sistema confiável e preciso para monitorização

de fraudes em carnes pela adição de agentes de sulfitação, a um ritmo de

amostragem razoável.


134

Embora o sistema tenha sido idealizado para análise discriminatória de sulfito

em carnes, o mesmo oferece versatilidade da quantificação do analito, com limite de

detecção de 0,455 mg L-1.

A versatilidade do sistema foi caracterizada, pois com o uso da câmara de

permeação, não são necessárias as longas e complicadas etapas no tratamento de

amostra. Além do mais, o mesmo sistema pode ser empregado para a determinação

de sulfito em outras matrizes.

A automação e miniaturização de métodos analíticos levam à redução dos

custos operacionais, e eleva a produtividade analítica. A análise discriminatória de

sulfito livre em amostras de carnes frescas apresentou relativa produtividade

analítica (12 determinações por hora) com redução no gasto de reagentes e na

geração de resíduos, sem perda na qualidade dos resultados.


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Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos

141

CAPÍTULO 5

Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons

metálicos.


A carne e os produtos cárneos contém elementos, os quais, em certas

circunstâncias e em proporções inadequadas apresentam efeitos negativos à saúde

humana. Alguns destes são constituintes naturais ou presentes no tecido vivo, por

exemplo, gorduras como o colesterol, resíduos de contaminantes ambientais e de

drogas veterinárias. Outros são adicionados ao produto durante o processamento

tecnológico (sal, nitrito, nitrato, fosfato, etc.). Há um terceiro grupo de elementos que

são produzidos durante o tratamento tecnológico, incluindo contaminantes de

detergentes e desinfetantes, compostos tóxicos produzidos durante a cocção, etc. E

finalmente, existem aqueles que são desenvolvidos durante as fases de

armazenamento e comercialização, notadamente como o desenvolvimento de

bactérias patogênicas, formação de produtos oriundos das reações de oxidação

lipídica, e migração de compostos originários de embalagens (COLMENERO et al.,

2001).

O Ministério da Agricultura divulgou, recentemente, o resultado das atividades

do Programa de Controle de Resíduos em Carnes – PCRC (BRASIL, 2004). No que


142

diz respeito à contaminação por metais, o PCRC monitora a concentração de

chumbo, cádmio e arsênio em aves, suínos, eqüídeos e bovinos. Os resultados

apontaram duas amostras de bovino e duas amostras de aves com concentração de

cádmio acima do limite máximo estabelecido. Apesar deste monitoramento ser feito

por amostragem, o quantitativo investigado de 319 carcaças é muito pequeno diante

da produção pecuária no Brasil (seis milhões de toneladas/ano), o que torna este

fato ainda mais preocupante, haja vista a elevada toxicidade de muitos dos

contaminantes metálicos.

Ademais a estes efeitos nocivos, pode-se mencionar a retenção de metais

pesados durante as etapas de abate e limpeza de carcaças. Esse tipo de situação

pode ocorrer em abates clandestinos e na comercialização de carnes em feiras

livres, onde águas não tratadas podem ser utilizadas para remoção de resíduos de

sangue das carcaças expostas para o consumo, tudo ocorrendo longe dos olhos da

fiscalização sanitária.

No Brasil, principalmente nas cidades do interior e nas áreas rurais, a prática

do abate clandestino é uma triste realidade. Os animais são abatidos em condições

sanitárias inadequadas. Usualmente o animal é abatido no solo, com pancadas na

cabeça, pelo uso de marretas e, a carcaça é dividida e levada para feiras-livres de

vilas circunvizinhas, para comercialização. Geralmente o abate é feito próximo a um

manancial (rio, fonte, lago, açude), onde a carcaça e os miúdos são lavados, para

retirada de sangue e de rejeitos.

Na Figura 5.1 pode ser observada a prática do abate clandestino no sertão

baiano, na qual pode-se perceber a presença de aves, rondando a área em busca

de alimento - restos do abate.


143

Figura 5.1: Abate clandestino de bovino no sertão baiano.

O abate clandestino é uma prática condenável e representa um dos mais

graves fatores de risco, pela exposição coletiva a agentes infecciosos, como aqueles

que são transmitidos ao homem pelo contato com animais, pela ingestão de

alimentos de qualidade sanitária suspeita e pela contaminação do meio ambiente

(FREITAS et al., 2001). Além disso, acarreta em prejuízos aos produtores e em

sonegação fiscal. Práticas desta natureza ocorrem freqüentemente nos países em


144

desenvolvimento e estão amplamente documentadas no trabalho de Joshi e

colaboradores (2003).

Na Figura 5.2 são apresentados registros da comercialização de carne bovina

e miúdos em feiras-livres de municípios do interior da Bahia. Percebe-se que não há

o mínimo cuidado com práticas higiênicas, bem como com as condições adequadas

de armazenamento durante a comercialização. Na Figura 5.3, tem-se o registro de

uma área, num mercado municipal, onde pode ser observada a existência de pia e

bancada de mármore. Porém, também é possível notar a inexistência de balcão

frigorífico para o armazenamento da carne, a qual fica geralmente exposta durante

todo o dia, numa jornada de aproximadamente oito horas.

Figura 5.2: Comercialização de carne fresca (A) e de miúdos de bovinos (B), em feiras-

livres do interior baiano.

A

B


145

Figura 5.3: Comercialização da carne bovina em mercado municipal do interior baiano.

É prática comum em alguns países da América Latina, África e Ásia a reunião

de famílias para abater animais e compartilhamento de suas carcaças (JOSHI et al.,

2003).

Outrossim, o abate clandestino é um crime contra o meio ambiente, pois para

que a carne seja destinada para consumo, é necessária a obediência às normas de

aspecto sanitário e humanitário, as quais são regulamentadas, no Brasil, pelo

Ministério da Agricultura (BRASIL, 1952). Consumir carne clandestina pode significar

o risco de contrair tuberculose, brucelose, erisipela, cisticercose, teníase,

leptospirose e raiva, dentre outras doenças (PARDI, 2001).

No conjunto destas práticas impróprias à vida humana, destaca-se a

possibilidade de contaminação por metais. Ao lavar a carcaça do animal abatido com

água de mananciais, além de elevar o nível de matéria orgânica lançado neste

manancial, é possível a contaminação da carcaça por espécies orgânicas e

inorgânicas, entre estas pelos íons metálicos.

Diante da possível contaminação da carne por metais, o cádmio e o chumbo

merecem atenção especial, devido as suas reconhecidas toxicidades. Entre as

conseqüências dos efeitos tóxicos de ambas espécies para a saúde humana pode-

se citar: anemia, osteomalácia, colapso renal, infertilidade e vários tipos de câncer,


146

além de desordens neurológicas. (MENA et al., 1996; LIU e JAN, 2000; JONHSON,

1998; GURER; ERCAL, 2000; SOLÉ et al., 1998).

A literatura apresenta uma variedade de trabalhos que abordam a

contaminação e presença de metais pesados em alimentos. O nível de Cd e Pb em

leite de vaca foi analisado por Okada e outros (1997), com o objetivo de avaliar o

grau de contaminação do leite produzido na região do vale do Paraíba - SP, devido à

possível ingestão, pelo gado, de gramíneas e águas contaminadas, encontrando, em

43 amostras, teores de Pb acima de 0,05 mg Kg-1, o qual é o limite estabelecido pela

Legislação brasileira. Diversos alimentos (carnes, cereais, laticínios, frutas e

verduras, ovos e leguminosas) consumidos pela população brasileira foram

avaliados quanto ao teor de Cu e está documentado no trabalho de Ferreira e

colaboradores (2005), onde foram encontrados elevados níveis em feijões, frutas,

hortaliças e cereais. A contaminação por mercúrio, cádmio e chumbo em pescados

foi relatada por Endo e outros (2004), bem como por Joyeux e colaboradores (2004).

A contaminação dos alimentos por metais tem sido motivo de preocupação

por parte da comunidade científica internacional. Assim, a monitoração do nível de

Cd, Pb e Hg em bezerros em algumas áreas da República Tcheca foi realizado por

Cibulka e outros (1989), enquanto Alonso e colaboradores (2001), realizaram estudo

similar na Espanha. A concentração de Cd, Pb e Zn em músculo de ovinos e bovinos

produzidos no centro e no oeste do Kazaquistão, foi avaliada por Farmer e Farmer

(2000).

No Rio de Janeiro, a ingestão diária de metais, pela população adulta, foi

monitorada, analisando Al, Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, U e Zn em grupos de alimentos

que compõem a dieta rotineira desta população (SANTOS et al., 2004).


147

Outros trabalhos que também visavam monitorar a contaminação por metais

foram realizados em amostras de café solúvel, onde a maioria das amostras

analisada encontrava-se dentro dos níveis aceitáveis para o consumo humano

(SANTOS e OLIVEIRA, 2001), hortaliças e vegetais cultivados próximo a mananciais

urbanos da Tanzânia, apresentaram elevados níveis de Pb, Cd, Cu e Zn

(BAHEMUKA e MUBOFU, 1999). Trabalhos semelhantes foram realizados em

cogumelos (DEMIRBAS, 2001).

Por outro lado, a característica sortiva dos metais em diferentes materiais tem

sido estudada, apresentada e debatida na literatura. Estudos a respeito da adsorção

e dessorção de Cd, Cu e Pb em amostras de solo foi discutido por Pierangeli e

outros, (2004). Na mesma linha, o emprego do resíduo da carbonização de ossos e

carne para remoção de Pb de efluentes foi elucidado por Deydier e outros (2003).

Algas, fungos e a biomassa de microorganismos, em geral, têm sido

apresentada como alternativa para sorção de metais, devido as suas elevadas

capacidades sortivas. Devido à habilidade de adsorção ou absorção de metais de

transição, a biomassa de microrganismos pode ser potencialmente utilizada como

bio-sorvente para o tratamento de resíduos. Esta característica, geralmente está

relacionada aos polipeptídeos produzidos por estes microrganismos que promovem

um verdadeiro “clean up” dos metais pesados, sem produzir poluentes secundários

(HUANG, et al., 2003). O emprego de microrganismos como bio-sorvente foi

satisfatoriamente elucidado na literatura (CHANG e HUANG, 1998; CHANG et

al.,1997; MEJARE e BULOW, 2001; KURODA et al., 2001)

Tendo em vista que a carne, na qualidade de um alimento protéico, pode se

apresentar como um poderoso bio-sorvente e, considerando a possibilidade da

contaminação desta por práticas inadequadas de higiene e limpeza durante o abate,


148

armazenamento e comercialização é que nesta etapa do trabalho foi avaliada a

capacidade de retenção de Cd e Pb pela carne bovina. Desta forma as amostras de

carne foram submetidas ao contato estático com soluções de Cd e Pb em diferentes

procedimentos experimentais para simulação das condições de comercialização e

de consumo de carnes em feiras livres, bem como de carnes oriundas de abate

clandestino.

5.2 – Metas

De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas desta etapa

foram:

Avaliar a capacidade de sorção de Cd e Pb pela carne bovina;

Identificar as variáveis (estado de conservação da carne, acidez, superfície de

contato e temperatura) que influenciam na capacidade sortiva da carne;

Avaliar os teores de Cd e Pb sorvidos na carne por espectroscopia de

emissão ótica com plasma de argônio indutivamente acoplado (ICP OES);

Sugerir possíveis mecanismos de sorção de Cd e Pb nas amostras de carne.

5.3 – Materiais e Métodos


O espectrômetro de emissão ótica (ICP OES), ARL 3410 (USA), seqüencial,

equipado com minitocha e leitura radial foi empregado para determinação de Cd e

Pb. As linhas de emissão de 214,439 e 220,353 nm foram selecionadas para as


149

determinações, respectivamente, de Cd e Pb no sobrenadante. Na Tabela 5.1 são

apresentados os parâmetros operacionais utilizados na determinação de Cd e Pb.

Tabela 5.1: Parâmetros operacionais utilizados na determinação de Cd e Pb.

Parâmetros Operacionais

Potência incidente 650 W

Potência refletida < 10 W

Nebulizador Vidro tipo Meinhard

Vazão do gás refrigerante 7,5 L min –1

Vazão do gás auxiliar 0,8 L min –1

Vazão de gás arraste 0,8 L min –1

Vazão da amostra 2,5 mL min –1

Tempo de Integração 5 s

Nº de integrações 3

Purificador de água EasyPure RF (Barnstead, USA) foi utilizado para

obtenção de água desionizada de alta pureza (18,2 M cm).

As medidas de pH foram realizadas empregando o milivoltímetro DM 21

(Digimed, Brasil). Autoclave Fabbe (Brasil) foi empregada para a esterilização das

amostras de carne.

Válvula multiportas de oito vias (VICI USA), controlada por computador, foi

empregada em algumas etapas do experimento, para automatização do sistema,

pela aspiração e bombeamento das soluções em módulo SIA. Bomba peristáltica de

quatro vias Minipuls 3 (Gilson França) foi empregada para propulsão das soluções.


150

5.3.2 – Reagentes, soluções e amostras

Todas as soluções foram preparadas com reagentes de grau analítico de

pureza (Merck, Alemanha, ou similar) e água desionizada de alta pureza.

Todas as vidrarias eram previamente descontaminadas com HNO3 10% (v/v)

por 24 horas e, posteriormente, enxaguadas com água desionizada.

Soluções de referência de Cd e Pb, utilizadas para a construção das curvas

de trabalho e para a simulação dos testes de sorção, foram preparadas na faixa de

concentração entre 1,0 e 10,0 mg L-1, a partir de solução estoque 1000 mg L-1 em

Cd e Pb, a qual, por sua vez, foi preparada pela dissolução de Pb(NO3)2 e cádmio

metálico em ácido nítrico 0,16 e 16 mol L-1, respectivamente. As soluções mistas

com concentração 10 mg L-1, empregadas nos experimentos de sorção de metais,

foram obtidas, diluindo a solução estoque com água da rede de abastecimento

(água da torneira). O pH dessas soluções de referência foi ajustado para 6,0, com a

adição de gotas de solução de NaOH ou HNO3 0,1 mol L-1.

As amostras de carne bovina (fresca e moída) foram adquiridas no comércio

de Salvador, enquanto que, as carnes deterioradas foram obtidas pela estocagem

da carne fresca, à temperatura ambiente (25 a 30C) por 12 h. Amostras de carne

também foram esterilizadas em autoclaves, a 121°C por 30 min.

Todo o planejamento experimental foi realizado com o objetivo de simular as

condições praticadas em feiras livres e no comércio clandestino de carnes.


151


Os experimentos realizados para avaliação do poder sortivo da carne por

metais foram baseados no contato estático das amostras de carne com a solução de

cádmio e chumbo em função do tempo.

O procedimento foi dividido em duas etapas: (i) empregando automação com

um sistema de injeção seqüencial e (ii) desenvolvendo experimentos em batelada.

Então, foi observada a influência do estado de conservação da carne no

poder sortivo. Neste caso, as amostras se constituíram em carne fresca e

deteriorada. A superfície de contato também foi avaliada e os testes foram

realizados com amostras fatiadas e moídas de carne. A autoclavação consistiu num

procedimento para observar, não só a influência da carga microbiana sobre a sorção

dos metais como a influência da desnaturação protéica na capacidade sortiva. Por

fim, a influência da acidez no poder sortivo da carne também foi avaliada, utilizando-

se soluções de ácido acético. A massa de carne utilizada, em todos os

experimentos, foi padronizada em 1g. Todos os experimentos foram feitos em

triplicata. Cada um destes procedimentos está descrito a seguir.

5.3.3.1. Automação do experimento de retenção de metais pela carne

empregando válvula multiportas de oito vias

Para realização deste experimento, o mesmo protocolo foi aplicado à carne

fresca e deteriorada. As massas de 1,0 g de seis amostras de carne foram medidas

diretamente em béqueres de 10 mL, os quais foram conectados a seis canais

(números 3 – 8) da válvula multicanal, como apresentado na Figura 5.4. Numa


152

segunda etapa, 2,5 mL da solução mista 10 g mL-1 de Cd e Pb foram aspirados

pelo canal 2, em direção à bobina de amostragem, seguida da transferência, das

alíquotas das solução mista para cada um dos seis béqueres. As amostras de carne

foram mantidas em contato com a solução dos íons metálicos por diferentes

intervalos de tempos (1, 2, 4 e 8) horas. Para o intervalo de tempo de 8 h, dois

procedimentos foram executados: (i) substituição das alíquotas da solução mista a

cada hora até completarem as 8 h produzindo um total de 8 soluções sobrenadantes

e (ii) a tomada do sobrenadante após 8 h.

Após os intervalos de tempo de contato estabelecidos, alíquotas dos

sobrenadantes foram aspiradas pelo canal 1 da válvula SIA. Em seguida, as

alíquotas foram submetidas à digestão ácida para eliminação de resíduos orgânicos.

O sobrenadante foi digerido a 70 °C com 2 mL de HNO3 16 mol L-1 e 1 mL de

H2O2 30% (v/v) e evaporado próximo à secura. Este processo foi repetido por três

vezes e a solução final foi diluída com água desionizada para balão volumétrico de 5

mL, para posterior determinação dos metais por ICP – OES. Na Tabela 5.2 estão

descritos os passos envolvidos no sistema SIA, empregando a válvula multicanal.

A massa de metal adsorvida pela carne foi calculada, pela diferença entre a

massa do metal contida na solução mista sobrenadante, adicionada à carne, e a

massa do metal remanescente na solução de equilíbrio.


153

Figura 5.4: Esquema do módulo SIA empregado para os testes de contaminação das

amostras de carne. FA1 a FA3 (solução de Cd e Pb em contato com a amostra submetida à

renovação da alíquota a cada 1 h durante 8 h); FA4 a FA6 (solução do metal em contato com

1 g da amostra de carne durante 8 h); BP (bomba peristáltica); C (Carregador – água

desionizada); B1 (bobina) e FC (frasco coletor), F (filtro).

Tabela 5.2: Passos envolvidos no experimento de retenção de Cd e Pb no sistema SIA

proposto.

Passo Canal da

válvula

Vazão / mL

min-1 *

Tempo / s

Tomada da alíquota 2 -4.0 37,5

Enviando para frasco 4 6 +4,2 37,5

Parada de fluxo 6 0 90

a...

b... ... ...

Tomada de alíquota da solução

sobrenadante do frasco 1 após 1 hora de

contato

3 -4,2 37,5

Envio para o frasco de coleta 1 +4,3 37,5

c...

Reposição da solução de Cd/Pb ao frasco 1 2 -4 37,5

Envio para o frasco 1 3 + 4,2 37,5

d...


154

Vazões positivas indicam bombeamento e negativas indicam aspiração. a o procedimento foi

repetido enviando uma alíquota para os canais 7, 8, 3, 4, e 5. b início da contagem do tempo

de contato entre a solução mista e a amostra de carne no respectivo frasco. c o

procedimento foi repetido para os canais 4 e 5. d estes passos foram repetidos para os

frascos 2 e 3 a cada hora.

5.3.3.2 – Retenção em batelada dos metais pela carne

Os experimentos realizados em batelada incluíram a etapa de esterilização da

amostra, bem como o uso de amostras de carne moída. Para as amostras de carne

moída os teste de contaminação não foram realizados com a válvula SIA, devido aos

pequenos fragmentos da carne que interrompiam o fluxo pelas linhas de transmissão

do módulo de injeção seqüencial.

Para estes ensaios as amostras foram mantidas em contato com solução

mista de Cd e Pb e com soluções individuais 10 mg L-1 de Cd e 10 mg L-1 em Pb por

2 e 4 h. Ao final de cada período, o sobrenadante era submetido à digestão ácida,

filtrado e diluído para 5 mL em balão volumétrico com água desionizada. Este

procedimento foi realizado tanto para amostras de carne fresca como de carne

deteriorada, considerando as variáveis: carne fatiada ou moída; submetidas, ou não,

a esterilização.

Num outro experimento, a massa de carne (fatiada e moída, fresca e

deteriorada, autoclavada ou não) permanecia em contato por 8 h com 2,5 mL de

solução 10 mg L-1 de Cd ou Pb.

Em um novo ensaio, as amostras de carne previamente contaminadas por 8 h

em solução 10 mg L-1 de Cd, foram separadas, enxaguadas com água desionizada e

inseridas em 2,5 mL de solução 10 mg L-1 em Pb por 1 h. Também, amostras de

carne primeiramente imersas em solução 10 mg L-1 de Pb, foram separadas e


155

lavadas com 50 mL de água desionizada para posterior exposição por 1 h em

solução 10 mg L-1 em Cd. Estes ensaios foram realizados para avaliar possíveis

efeitos de deslocamento das espécies metálicas no processo de sorção e dessorção

de íons metálicos de amostras de carne.

Os efeitos da acidez do meio nos processos de sorção e dessorção de Cd e

Pb também foram avaliados. Para esta série de ensaios foram utilizadas amostras

de carne fresca e fatiada.

Nos ensaios para avaliação da dessorção dos íons metálicos em meio de

ácido acético, as amostras de carne foram primeiramente imersas, por 4 h, em 2,5

mL da solução mista 10 mg L-1 de Cd e Pb. Após este intervalo, a amostra de carne

contaminada era lavada com 50 mL de água desionizada. Em seguida, a amostra

era imersa em solução de ácido acético com concentração até 4% (v/v) e aquecida a

60oC. Para avaliação do efeito da acidez no processo de sorção de metais, as

amostras de carne foram imersas por 5 min em solução de ácido acético, em

concentração até 4% (v/v); seguida da lavagem da amostra com água desionizada e

posterior contato com 2,5 mL de solução mista de Cd e Pb. Antes da determinação

dos teores de Cd e Pb na solução do sobrenadante, estas foram submetidas à

digestão, como descrito anteriormente.

5.4 – Resultados e Discussão

5.4.1 – Retenção de metais em sistema automatizado

Os perfis de retenção de Cd e Pb em amostras de carne fresca e deteriorada

obtidos pela mudança da alíquota de solução mista a cada hora, durante 8 horas,


156

são apresentados nas Figuras 5.5A e 5.5B, respectivamente. Uma vez que, mesmo

substituindo a cada hora a solução sobrenadante por uma nova alíquota da solução

mista 10 mg L-1 de Cd e Pb, a mesma fatia de carne estava sendo exposta à

contaminação, pôde ser observado um aumento contínuo da sorção de Pb,

principalmente para as amostras de carne fresca (Fig. 5.5A), após sucessivas

adições das alíquotas de 2,5 mL de solução mista, correspondendo a 25 g de Cd e

de Pb.

Para o Cd, pôde ser observado comportamento inverso na retenção nas

amostras de carne (Fig. 5.5A e 5.5B), ou seja, diminuição da quantidade de Cd

retido na mesma amostra de carne com as sucessivas substituições do

sobrenadante pelas alíquotas da solução mista de Cd e Pb. Este perfil de retenção

sugeriu que os processos ou sítios relacionados com as retenções de Cd2+ e Pb2+

não eram os mesmos. Uma das hipóteses levantadas foi da retenção do Pb2+ na

superfície da carne e a retenção preferencial do Cd2+ ocorrer no interior das

amostras. Desta forma, a explicação para o fenômeno seria a obstrução dos poros

da carne causada pela retenção dos íons Pb na superfície da mesma, o que

perturbaria a migração dos íons Cd para a porção interna do músculo bovino.


157

Figura 5.5: Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne

deteriorada (B) com mudança da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora. (n=3)

Pôde ser observada, para as amostras de carne deteriorada (Figura 5.5B), a

partir da terceira troca da solução do sobrenadante por uma nova alíquota da

solução dos contaminantes, uma tendência para saturação dos sítios responsáveis

pela retenção do Cd. Já para o Pb, não foram observadas variações significativas na

quantidade retida de metal nas amostras para as trocas seguintes do sobrenadante.

Neste caso a carne deteriorada apresentou elevada afinidade pelo Pb.

Uma hipótese que pode ser lançada para a explicação dos fenômenos

observados está relacionada com o fato da adsorção de Pb na carne ser

dependente do oxigênio, enxofre ou nitrogênio derivados da clivagem de grupos

carboxila, hidroxila, amina e sufidrilas por processo oxidativo e clivagem da proteína

durante o processo de putrefação da carne; enquanto que os grupos amina podem

ser considerados os sítios responsáveis pela sorção do cádmio. Esta última

consideração está fundamentada no comportamento de ambos os metais em

diferentes matrizes, tais como, solos, sedimentos e resinas (GANJALI et al., 2003),

0 2 4 6 8

9

12

15

18

21

24

0 2 4 6 8

9

12

15

18

21

24

BA

Carne fresca

Cd

Pb

C, (g

g-1)

t (h)

Carne deteriorada

Pb

Cd

C,

g g

-1


158

bem como na grandeza das constantes dos equilíbrios relacionadas à formação de

complexos e de precipitados destes íons (HARRIS, 2003).

Os resultados obtidos sem a substituição da solução mista de Cd e Pb, a

cada hora, para as amostras de carnes frescas e deterioradas, podem ser

observados nas Figuras 5.6A e 5.6B, respectivamente.

Para ambos os íons na carne deteriorada (Figura 5.6A e 5.6B) a condição de

saturação foi obtida após a primeira hora de contato, enquanto que para a carne

fresca a saturação somente pôde ser observada após as primeiras 4 h de contato

(Figura 5.6A). O efeito de saturação mostrado nas Figuras 5.6A e 5.6B não podem

ser comparados com aqueles ilustrados nas Figuras 5.5A e 5.5B, onde a solução

mista de Cd e Pb eram substituídas a cada hora. Neste experimento, a mesma

alíquota da solução mista foi mantida em contato com a amostra da carne durante os

intervalos de tempo pré-estabelecidos, ou seja, 1, 2, 4, e 8 h.


159

Figura 5.6: Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne

deteriorada (B) sem substituição da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora. (n=3).

A quantidade de íons Pb retidos na carne deteriorada (Figura 5.6B) foi maior

do que aquela observada para a carne fresca (Figura 5.6A). Este comportamento

poderia ser explicado pelo elevado número de grupos sulfidrila (–SH) encontrados

na estrutura de carnes deterioradas de bovinos. Contudo, os resultados até agora

apresentados não são suficientes para um completo entendimento sobre os sítios

responsáveis pela sorção do cádmio e do chumbo, bem como quanto ao efeito

relacionado com a presença da população microbiana na amostra. Todavia, há que

se considerar o elevado número de microrganismos produtores de gás sulfídrico na

carne deteriorada, o que seria mais uma fonte produtora de gás sulfídrico, como já

elucidado no capítulo 2 desta tese.

0 2 4 6 8

10

15

20

25

0 2 4 6 8

10

15

20

25Carne fresca

BA

Cd

Pb

C, (

g g-1

)

t (h)

Carne deteriorada

Pb

Cd

C,

g g

-1


160

5.4.2. – Retenção de metais pela carne pelo método em batelada

5.4.2.1 – Experimentos com a carne fatiada fresca e deteriorada, submetidas à

esterilização ou não

Para elucidar se a carga microbiana elevaria o potencial de retenção de

chumbo, uma porção da amostra de carne fresca e deteriorada foi previamente

esterilizada e submetida ao teste de sorção, enquanto que outra porção permaneceu

sem esterilizar. Os resultados obtidos destas novas amostras, em triplicata,

expressos em %Pb e %Cd sorvido nas amostras de carne, com e sem esterilização

podem ser observado na Tabela 5.3.

Tabela 5.3: Efeito da esterilização na % de retenção de Cd e Pb em carnes frescas e

deterioradas (n=3).

Tempo

de

contato

(h)

Cd (%) Pb (%)

Carne fresca Carne deteriorada Carne fresca Carne deteriorada

S NS S NS S NS S NS

2 75 1 81 2 84.0 0.4 72 8 55 4 53 4 71.2 0.4 72 8

4 86 2 53 4 95 1 69 4 76 3 72 4 84 1 72 6

S = Esterilizada. SN = Não esterilizada.

Desde que a população microbiana presente na amostra de carne foi

destruída com a esterilização, a sorção ocorreu na ausência dos grupos sulfidrilas de

origem bacteriana. Observou-se que, para ambos os metais, houve uma sorção

crescente no intervalo de tempo considerado (2 e 4 h), independente da variável

analisada.


161

Comparando-se a sorção do cádmio no tempo de 4 h, observou-se que a

proporção do metal sorvido na carne submetida à esterilização foi maior (86% e

95%) do que na carne não esterilizada (53% e 69%) para as carnes frescas e

deterioradas, respectivamente.

Para o chumbo, houve um aumento da sorção apenas para a carne

previamente deteriorada e esterilizada (84%), quando comparada com a carne

fresca (76%). Para as amostras não esterilizadas, não houve variação na proporção

do Pb sorvido.

Após o tratamento térmico, o qual é responsável pela paralisação da geração

dos grupos tióis de origem bacteriana, a sorção do Pb se deu em menor proporção

que a do Cd (76 e 86% - carne fresca; 84 e 95%- carne deteriorada,

respectivamente). Outra característica interessante da sorção do Pb compreende

sua independência com o aumento da área superficial da carne após esterilização,

reforçando, desta forma, a predominância de sítios externos no mecanismo de

adsorção de Pb. Por outro lado, o aumento efetivo da retenção de Cd na carne

esterilizada (principalmente pelo contato de 4 h), confirmou, como anteriormente

comentado, a adsorção preferencial deste metal por grupos internos (provavelmente,

grupos amina da proteína) mais expostos após o tratamento térmico.

Sabe-se que a desnaturação de proteínas da carne aumenta a sua

digestibilidade, devido à exposição da estrutura primária, às enzimas digestivas

(SGARBIERI, 1996). O aquecimento é apontado como um dos principais fatores de

desnaturação das proteínas da carne. De maneira análoga, a exposição da estrutura

primária também pode ser considerado um fator facilitador na interação com os íons

metálicos.


162

A Figura 5.7 mostra um esquema simplificado do mecanismo de ação da

desnaturação protéica. Neste fenômeno, há um desdobramento e rearranjo das

estruturas quaternárias, terciárias e secundárias sem o rompimento das ligações

peptídicas (SACKHEIM e LEHMAN, 2001). Percebe-se que a estrutura da proteína

se desdobra, deixando a estrutura primária vulnerável a interações químicas e

enzimáticas diversas, como sugerido por Belitz e Grosch (1997).

Figura 5.7: Esquema simplificado da desnaturação protéica (Adaptado de Belitz e Grosch,

1997).

A Figura 5.8 ilustra a representação esquemática do possível mecanismo de

ligação do Pb e do Cd aos radicais sulfidrila, hidroxila e amino da proteína,

considerando a desnaturação protéica como fator facilitador destas ligações.

Desnaturação

protéica

= H2O


163

Figura 5.8: Representação esquemática do provável mecanismo de ligação do chumbo e do

cádmio com os grupos sulfidrila e amino da proteína

5.4.2.2 – Experimentos com a carne moída fresca e deteriorada, submetida a

esterilização ou não

A exposição das amostras de carne moída à solução de Cd e Pb por 2 e 4

h demonstrou a tendência à saturação para períodos próximos a 2 h, como

ilustrado na tabela 5.4. O aumento da superfície de contato pode ter abreviado o

período de saturação para as amostras de carnes frescas, pois para as amostras

de carnes deterioradas intervalos de 2 h eram suficientes para alcançar a

saturação, como discutido anteriormente (Figura 5.6A).

A Tabela 5.4 mostra o efeito da esterilização na sorção do Cd e Pb em

amostras de carne moída. A pequena quantidade retida de Pb foi inesperada, 47 e

42% para as carnes frescas e deterioradas, respectivamente. Uma possível razão

S

S

S

S

S S

SH

SH SH

Desnaturação

(autoclavação)

Pb2+Pb2+

Pb 2+

NH2

NH2

NH2

NH2

OH

OH

OH

NH2NH2NH2

NH2

NH2

OH OH

OH

Cd2+

Cd2+

Cd2+

Cd2+

HOOC

H2N

HOOC

Pb2+

Pb2+

Pb2+


164

para este fato é a elevada quantidade de água existente nas amostras de carne

moída, resultando, em massas de carnes menores que as obtidas para as carnes

em pedaços. Outra possibilidade para explicar este fato, é a elevada exposição da

gordura, a qual prejudica o processo de retenção dos íons Pb2+ na superfície da

amostra.

Tabela 5.4: Efeito da esterilização na retenção de cádmio e chumbo (%) em carnes

moídas frescas e deterioradas (n=3)

Tempo

de

contato

(h)

Cd (%) Pb (%)

Carne fresca Carne deteriorada Carne fresca Carne deteriorada

S* NS** S NS S NS S NS

2 76 5 78 3 74 5 80 2 48 5 41 1 52 3 38 6

4 74 1 84 1 73 7 85 0.3 47 5 48 5 42 5 54 2

S = Esterilizada. SN = Não esterilizada.

Quanto ao Cd, a esterilização não influenciou significativamente na

sorção, 74 e 73% para as carnes frescas e deterioradas, respectivamente.

Diferentes comportamentos da sorção do Cd foram observados quando

comparadas as Tabelas 5.3 e 5.4. Com as amostras de carne moída, a

esterilização foi menos efetiva na sorção de Cd. Há que se considerar, outra vez,

que a umidade da carne moída seja uma possível responsável por esta

discrepância.


165

5.4.2.3 – Avaliação do deslocamento dos metais retidos

Com o objetivo de caracterizar possíveis efeitos de deslocamento, bem como

indicar sítios específicos para o Cd e o Pb, fez-se a imersão das amostras de carne

por 8 h em 2,5 mL de solução 10 mg L-1 de Cd, equivalente a massa de 25 g Cd. A

amostra de carne foi separada, enxaguada com água desionizada e imersa por 1 h.

em 2,5 mL de solução de Pb 10 mg L-1 Repetiu-se o experimento invertendo a

ordem das soluções. A Tabelas 5.5 mostra a massa de Cd (g) deslocado pelo Pb e

vice-versa, em amostras de carnes frescas e deterioradas.

Tabela 5.5: Perfil do deslocamento dos íons metálicos Cd2+ e Pb2+ para amostras de carne

frescas e deterioradas (n=3)

Carne

(variável)

Carne fresca Carne deteriorada

Cd deslocado

pelo Pb (g)

Pb deslocado

pelo Cd (g)

Cd deslocado

pelo Pb (g)

Pb deslocado

pelo Cd (g)

Fatiadas 0,19 0,054 0,77 0,0 0,41 0,16 1,0 0,008

Moída 1,34 0,35 1,1 0,13 1,29 0,58 0,85 0,33

Moída e

autoclavada

3,26 0,77

1,6 0,12

3,05 0,98

1,51 0,39

Os resultados obtidos indicaram que, nas amostras fatiadas, a massa de Pb

deslocada pelo Cd foi bastante acentuada, cerca de 4 e 2,5 vezes maior para as

carnes frescas e deterioradas, respectivamente, quando comparada com a massa

de Cd deslocada pelo Pb, sugerindo que sítios diferentes (ou específicos) podem

estar relacionados com a retenção de Cd e Pb, de acordo o mecanismo sugerido na

Figura 5.8.


166

Por sua vez, para as amostras de carne moída, não foram observadas

variações significativas na massa de Cd deslocado pelo Pb, ou vice-versa, apesar de

poder ser constatado um leve aumento na massa de Cd deslocado pelo Pb.

Entretanto, para as amostras de carnes moídas e autoclavadas, a quantidade de Cd

deslocada pelo Pb foi aproximadamente o dobro, quando comparada com a massa

de Pb deslocada pelo Cd. Este mecanismo, provavelmente foi favorecido pela

desnaturação protéica ocorrida durante a esterilização da carne, expondo os sítios

ativos preferencialmente para o Pb, de acordo o modelo apresentado na Figura 5.8.

Resultados semelhantes foram apresentados por Huang e colaboradores (2003), em

testes realizados com misturas binárias de Pb, Cd e Cu, para avaliação da

competitividade por sítios existentes em biossorventes (peptídeos). Neste estudo de

Huang e outros, os resultados indicaram que na presença de Pb e Cu a adsorção do

Cd era fortemente inibida.

Todavia, observou-se que a proporção do deslocamento do Cd pelo Pb

ocorrida na carne moída, quando comparada com as amostras de carne fatiada, foi

muito mais acentuada, cerca de 700 e 300% para as amostras frescas e

deterioradas, respectivamente. Em analogia, quanto à proporção de deslocamento

do Cd pelo Pb ocorrido nas amostras de carne moída autoclavadas, quando

comparadas com as amostras fatiadas, houve um aumento da ordem de 1700%

para a carne fresca e de 700% para a carne deteriorada.

Em relação ao Pb deslocado pelo Cd, a proporção não foi tão acentuada.

Cerca de 140% e 85%, para as carnes moídas frescas e deterioradas,

respectivamente, quando comparadas com as amostras fatiadas. Já para as carnes

moídas e autoclavadas, a proporção de deslocamento foi de 200 e 150%, para as

amostras frescas e deterioradas, respectivamente. Por estes resultados, pode-se


167

inferir que o aumento da superfície de contato da carne moída não garantiu um

aumento proporcional do deslocamento dos íons. Porém, para as amostras de carne

moídas autoclavadas (fresca e deteriorada), o aumento no deslocamento, de ambos

os íons foi bastante significativo. Neste caso, a desnaturação protéica ocorrida pelo

aquecimento, expôs ainda mais os sítios, favorecendo as trocas entre Cd2+ e Pb2+.

Outrossim, estes dados reiteram que a retenção do Pb se dá preferencialmente na

superfície das amostras de carne.

5.4.2.4 – Avaliação da acidez na sorção dos metais

Para avaliação da dessorção, dos íons metálicos em meio de ácido acético,

as amostras de carne em fatias foram primeiramente imersas, por 4 h, em 2,5 mL da

solução mista de Cd e Pb 10 mg L-1. Após este intervalo, a amostra de carne

contaminada era lavada com 50 mL de água desionizada. Em seguida, a amostra

era imersa em solução de ácido acético com concentração até 4% (v/v) e aquecida a

60oC. Para avaliação do efeito da acidez no processo de sorção de metais, as

amostras de carne foram imersas por 5 min em solução de ácido acético, em

concentração até 4% (v/v); seguida da lavagem da amostra com 50 mL de água

desionizada e posterior contato com 2,5 mL de solução mista de Cd e Pb. Antes da

determinação dos teores de Cd e Pb na solução do sobrenadante, estas foram

submetidas à digestão, como descrito anteriormente.

Os resultados dos testes referentes ao efeito da acidez na retenção e

dessorção dos metais estão ilustrados na Figura 5.9A e 5.9B. Foi observado que,

apesar do aumento da acidez, não houve mudança expressiva no perfil adsortivo

dos metais na carne, para Cd2+ a partir da concentração de 0,5 % (v/v) em ácido


168

acético. Já, para a adsorção do Pb2+, o ácido acético não apresentou influência para

quaisquer valores de concentração, de acordo a figura 5.9B.

Figura 5.9: Influência da acidez na dessorção (A) e retenção (B) de Cd2+ e Pb2+ em

amostras de carne bovina.

Quanto à avaliação da acidez na dessorção dos metais, observou-se que,

com o aumento da concentração de ácido acético, os metais foram deslocados da

carne para a solução sobrenadante. Este efeito foi mais evidente para Cd2+. Estes

resultados estão ilustrados na Figura 5.9A. Pela análise dos resultados pode-se

caracterizar a ocorrência de mecanismo de troca do Cd2+ pelo próton. Efeito de

deslocamento desta magnitude não foi observado para Pb2+. Estes resultados são

preocupantes, frente à possibilidade de contaminação alimentar favorecida pelas

práticas culinárias, usuais no preparo de carnes, previamente contaminadas com Cd.

0 1 2 3 4

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4

0

5

10

15

20

25

Pb

Cd

mass

a (g

)

BA

Dessorção Retenção

Pb

Cd

% Ácido acético (V/V)

C,

g g

-1


169

5.5 – Conclusões

Pela avaliação dos resultados pode-se demonstrar o risco potencial associado

com contaminação da carne pela sorção de metais, pela elevada massa de Cd e Pb

retida na carne fresca e deteriorada. Mais de 20 g de cada metal foram retidos em

1 g de carne após poucos minutos de contato com soluções de referência.

O aquecimento da carne e a conseqüente desnaturação da proteína

favoreceram a interação entre os metais e os sítios ativos da proteína, notadamente

para o Pb.

A carne deteriorada apresentou maior afinidade para retenção do Pb, ao

passo que a elevação da acidez favoreceu a dessorção do Cd.

O possível mecanismo de interação entre a carne e os metais se baseia na

existência de diferentes sítios (internos e externos) responsáveis pela sorção do Cd

e do Pb.

É preciso que os órgãos fiscalizadores sejam rígidos na cobrança das normas

higiênicas e das boas práticas, desde o abate até o consumo da carne, a fim de

coibir o abate clandestino e conseqüentemente diminuir o risco potencial da

população em consumir carnes contaminadas.


ALONSO, M. L.; BENEDITO, J. L.; MIRANDA M.; et al. Arsenic, cadmium, lead,

copper, and zinc in cattle from Galicia, NW Spain. Science of the total

Enviromental. v. 246, n. 2 – 3, p. 237 – 248. 2000.


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BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria 21, de 5 de abril de 2004. Divulgar o

sumário das atividades do Programa de Controle de Resíduos em Carne e o

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