UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA … · 2018. 9. 6. · A vida sempre nos mostra que não estamos nunca sozinhos, agradeço a alguns que surgiram em minha vida

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS

NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS

ANA CAROLINE DE LIMA SILVA

Investigação da atividade espasmolítica de uma série de derivados

do lapachol em íleo de cobaia: um estudo comparativo

João Pessoa-PB

2014

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ANA CAROLINE DE LIMA SILVA

Investigação da atividade espasmolítica de uma série de derivados

do lapachol em íleo de cobaia: um estudo comparativo

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de Concentração: FARMACOLOGIA

Orientadora: Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva

Coorientadora: Profa. Dra. Fabiana de Andrade Cavalcante

João Pessoa-PB

2014

Catalogação na Publicação

Seção de Catalogação e Classificação

S586i Silva, Ana Caroline de Lima.

Investigação da atividade espasmolítica de uma série de

derivados do lapachol em íleo de cobaia: um estudo compara-

tivo / Ana Caroline de Lima Silva. - João Pessoa, 2014.

119 f. : il.

Orientadora: Bagnólia Araújo da Silva.

Coorientadora: Fabiana de Andrade Cavalcante.

Dissertação (Mestrado) - UFPB/CCS/ PgPNSB

1. Farmacologia. 2. Derivados do lapachol. 3. Nafto-

quinona. 4. Canais de potássio. 5. Ação espasmolítica.

I. Título.

UFPB/BC CDU - 615(043)

4

Dedicatória

5

Ao meu pai e ao meu avô, que hoje já não se

encontram comigo fisicamente, mas o amor de

vocês, esse levarei enquanto vida eu tiver. O

amor mais lindo e sincero.

Aos amores da minha vida, Eliene C. de Lima e

Leonízia Cordeiro, Mainha e Voinha, essa

vitória não é só minha, é também de vocês. Por

me amarem tanto e pela confiança depositada

desde sempre. Sou eternamente grata por

tanto amor e dedicação recebidos, muitas

vezes sem merecer. Sem vocês na minha vida,

nada disso faria sentido. Vocês são meus

exemplos, mulheres fortes, meu alicerce, minha

paz.

Aos que sempre estiveram comigo e acreditam

em mim.

6

Agradecimentos

7

Não conseguimos nada sozinhos, e precisamos sim da ajuda de várias

pessoas, seja com uma palavra de apoio em um momento oportuno, broncas

quando necessárias e um ombro que está sempre ali pronto a suportar as lágrimas.

Gratidão, essa é a palavra de ordem.

Ao meu Deus, por seu amor e fidelidade, fazendo-me perceber que são nos

momentos mais difíceis que os milagres acontecem, por dar-me forças pra seguir em

frente quando penso em desistir. Por colocar alguns anjos na minha vida, tornando

assim a caminhada mais leve e feliz.

À minha querida orientadora, Dra. Bagnólia Araújo da Silva, por me aceitar

como sua aluna desde a iniciação científica, um grande exemplo de pessoa,

educadora e profissional. Pela amizade, paciência, compreensão, risadas e

ensinamentos para a vida. Por sempre tentar extrair de nós o melhor que podemos

dar e por acreditar no meu potencial.

À Fabiana Cavalcante, coorientadora deste trabalho, por estar sempre

disposta a ajudar, tirando dúvidas, solucionando problemas. Sua ajuda foi muito

importante para a realização desse trabalho.

Ao Prof. Dr. Celso Camara pela gentileza em ceder os compostos testados

neste trabalho.

Aos Professores Caliandra Luna (UFPB) e Luis Fernando Marques (UFPB)

por aceitarem participar desta etapa tão importante na minha formação, pela

compreensão e pelas contribuições a este trabalho. Assim como as Professoras

Leônia Batista e Liana Clébia, por estarem dispostas à suplência e pelas

contribuições na escrita deste trabalho.

A todos os Professores que passaram na minha vida acadêmica, seja na

graduação de Farmácia ou no Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos (PPgPNSB) e que com certeza fizeram o diferencial na minha

formação, em especial a: Adalberto Coelho, Bagnólia Araújo, Demétrius Araújo, Inês

Freitas, Luis Fernando Marques e Tatjana Keesen, por me mostrar que ser

professor vai muito além de um título e sim de ter o poder de transformar pessoas,

extraindo do aluno aquilo que de melhor ele tem.

Ao coordenador do PPgPNSB, Prof. José Maria Barbosa Filho, e o

vice-coordenador, Prof. Josean Fechine Tavares, por conduzir o PgPNSB com

tamanha habilidade e competência.

8

À secretária do PPgPNSB Caroline Mangueira, pela paciência nas inúmeras

vezes que eu chegava lá aperreando, seja pra tirar dúvidas burocráticas ou pedir

papel. Por sua eficiência em conduzir seu trabalho.

A Luiz Henrique C. Vasconcelos, amigo querido que muito me ajudou na

realização desse trabalho, você foi fundamental. Serei sempre grata por tudo que

você fez para que essa dissertação saísse.

Ao meu aluno de iniciação científca, José Lucas, pela ajuda nos

experimentos, pela amizade, disposição e boa vontade em sempre me ajudar, seja

na bancada ou apenas em me ouvir.

À Rosimeire Santos pelos ensinamentos nos meus primeiros passos na vida

acadêmica, pela amizade e pelos sorrisos.

A todos os amigos e colegas que estão ou passaram pelo Laboratório de

Farmacologia Funcional Prof. George Thomas, entre eles, Alice Bezerra, Aline Brito,

Ana Carolina Correia, Anne Abreu, Cibério Macêdo, Fabiana Cavalcante, Fabio

Monteiro, Fernando Queiroga, Filipe Oliveira, Giuliana Amanda, Giulyane Moreno,

Hannah Olga, Iara Luna, Italo Martins, Joedna Cavalcante, Joelmir Silva, José Lucas

Galvãoo, Juliana Carreiro, Kimã Meira, Layanne Cabral, Luiz Henrique César, Luiz

Henrique Agra, Maria da Conceição, Milena Medeiros, Paula Benvindo, Rafael

Travassos, Renata Sampaio, Rosimeire Ferreira, Sarah Rebeca, Tamyris Freire pela

ajuda, risadas no cafezinho, discussões científicas, amizade e boa convivência.

Aos amigos que fiz na graduação em Farmácia-Bioquímica, em especial a

Ana Letícia, Anderson Moura, Filipe Rolim, Elton Falcão, Rômulo Sampaio, Fabio

Dias, Gislaine Oliveira, Waleska Viana e Lyndemberg Silveira.

A todos os amigos e colegas das turmas de Mestrado e Doutorado do

PgPNSB por dividirem as angústias, sonhos, lágrimas e muita felicidade, em

especial a Paula Benvindo, Élida Vieira, Sávio Benvindo, Tassiana Dantas, Danilo

Lemos, Milen Souza, Itamar Barbosa, Kivia Sales, Talissa Mozzini, Jacqueline Alves,

Leônidas Jr., Luciano Leite, Yuri Mangueira, Denise Leite.

A vida sempre nos mostra que não estamos nunca sozinhos, agradeço a

alguns que surgiram em minha vida para tornar a caminhada mais leve, feliz e

fazendo transbordar amor, verdadeiros encontros de alma.

À Vitória Mola, Natália Cândido, Misma Carolina e Suelen Alves amigas

queridas que sempre me apoiaram e me incentivaram. Vocês são muito importantes

nisso tudo, já pensamos em desistir, mas a força e a coragem é o que nos move.

9

A Rafael Travassos, meu anjo, amado amigo e irmão. Pela amizade,

companheirismo em dividir comigo lágrimas, sonhos e sorrisos. Por sempre acreditar

em mim, mesmo quando nem eu o fazia.

A Jailson Rocha, Ulrich Vasconcelos, Ian Porto, Sildivane Valcácia e Tatjana

Keesen, amigos amados, verdadeiros presentes que ganhei nesse último ano.

Obrigada por todo incentivo, pelos momentos deliciosos juntos, regados a cafés,

sorrisos e muita alegria.

A Italo Rossi e Paula Benvindo, amigos que muito me ajudaram na reta final

de elaboração desse trabalho, obrigada pelos bons momentos, risadas e pela

grande amizade de vocês.

Aos “legais sem futuro”; quantos momentos felizes, alguns aperriados

também mas tudo é para o nosso crescimento. Em especial a Sávio, Tassiana e

Danilo obrigada pela amizade de vocês e por tudo que passamos juntos.

Aos meus familiares, por todo o incentivo e por me apoiar em todos os

momentos, compreendendo minha ausência e vibrando com as conquistas.

Ao José Crispim Duarte, pela sua amizade, competência e auxílio técnico nos

mais variados problemas no Laboratório e no Biotério.

Ao Sr. Luís C. Silva e Adriano S. Cordeiro por trabalharem tão arduamente

para que possamos realizar nossos experimentos, por sua dedicação e cuidado no

trato dos animais no Biotério e no laboratório.

À Mônica e D. Evani pelo carinho, palavras de apoio, orações tendo sempre

uma palavra de incentivo nos momentos de estresse e serem sempre tão atenciosas

com todos.

À Sra. Luzinete, pelo trabalho realizado no laboratório, na limpeza de material

e equipamentos úteis à rotina do mesmo.

Ao Professor e Conselheiro Federal de Farmácia, Samuel Meira, pelo apoio

financeiro concedido para participação em congressos científicos.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

pelo apoio financeiro.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior

(CAPES) pelo suporte técnico-científico.

À Direção do Centro de Biotecnologia (CBiotec), na pessoa do Prof. Dr. Valdir

de Andrade Braga, pelo apoio Institucional.

10

À Universidade Federal da Paraíba, instituição responsável pela minha

formação, responsável por me fazer enxergar o mundo de um novo jeito.

A todos que, de maneira direta ou indireta, contribuíram para a produção

dessa Dissertação de Mestrado.

Ana Caroline de Lima Silva

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Resumo

12

RESUMO

As naftoquinonas são substâncias de grande interesse, pois apresentam uma variedade de atividades biológicas. Pertencente a esse grupo, destaca-se o lapachol, uma naftoquinona isolada de espécies de Tabebuia spp., conhecidas popularmente como “ipês”. Uma vez que muitas atividades farmacológicas, como a espasmolítica, são relacionadas ao lapachol e aos seus derivados naturais ou sintéticos, pesquisadores tem voltado sua atenção para esta molécula a fim de criar compostos com potencial terapêutico. Nessa perspectiva decidiu-se investigar um possível efeito espasmolítico de uma nova série de derivados do lapachol (UFRPE 15, UFRPE 17, UFRPE 31, UFRPE 114, UFRPE 115 e UFRPE 116) e do norlapachol (UFRPE 106, UFRPE 107, UFRPE 111, UFRPE 112, UFRPE 113 e UFRPE 117) em íleo isolado de cobaia, bem como investigar o mecanismo de ação do composto que apresentar uma maior eficácia. Na triagem farmacológica, os compostos derivados do lapachol apresentaram uma baixa eficácia farmacológica em inibir as contrações fásicas induzidas por carbacol e por histamina, apenas o composto UFRPE 115 inibiu as contrações fásicas induzidas por histamina de maneira dependente de concentração. Entretanto, os derivados do norlapachol mostraram-se mais promissores, uma vez que todos inibiram as contrações fásicas induzidas por carbacol e por histamina de maneira dependente de concentração, onde os compostos UFRPE 107, UFRPE 112 e UFRPE 117 apresentaram uma maior potência e eficácia relativas. O efeito relaxante destes foi avaliado no íleo pré-contraído com KCl, CCh ou histamina, e observou-se que estes 3 derivados relaxaram o íleo de cobaia de maneira dependente de concentração, sendo o derivado UFRPE 117 o que apresentou maior potência relativa, assim foi selecionado para o estudo do seu mecanismo de ação. Uma vez que UFRPE 117 inibiu as contrações induzidas por histamina, bem como relaxou o íleo pré-contraído pelo mesmo agonista, avaliou-se a participação dos receptores histaminérgicos nesse efeito. UFRPE 117 inibiu as curvas cumulativas à histamina, desviando-as para direita, de maneira não paralela e com redução do Emax, sugerindo um antagonismo do tipo não competitivo pseudo irreversível. Como a potência relaxante deste composto foi reduzida quando o íleo era pré-contraído com 40 mM de KCl, investigou-se a participação dos canais de K+ utilizando 5 mM de CsCl, um bloqueador não seletivo destes canais, onde a sua potência relaxante foi atenuada em cerca de 12 vezes na presença desse bloqueador, sugerindo a participação dos canais de K+ na ação espasmolítica de UFRPE 117. Para avaliar quais os subtipos de canais de K+ estariam envolvidos nesse efeito, utilizou-se 10-5 M de glibenclamida, um bloqueador dos KATP que não alterou a potência relaxante de UFRPE 117, descartando a participação desses canais. Entretanto na presença de 100 nM de apamina um bloqueador seletivos dos SKCa, e 1 mM de TEA+, um bloqueador seletivo dos BKCa a potência relaxante de UFRPE 117 foi atenuada em cerca de 4 e 5 vezes respectivamente, confirmando a participação destes subtipos de canais de K+. Assim o mecanismo de ação espasmolítica do derivado sintético do norlapachol, UFRPE 117 envolve a ativação/modulação positiva dos SKCa e BKCa, o que levaria a uma hiperpolarização de membrana, bloqueio indireto dos Cav, redução da [Ca2+]c e consequente relaxamento desse órgão.

Palavras-chave: derivados do lapachol, naftoquinona, canais de potássio, ação espasmolítica, íleo

de cobaia.

INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA DE UMA SÉRIE DE DERIVADOS DO LAPACHOL EM ÍLEO DE COBAIA: UM ESTUDO COMPARATIVO

SILVA, A.C.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,

Dissertação de Mestrado, CCS/UFPB (2014).

13

Abstract

14

ABSTRACT The naphthoquinones are substances of great interest, since they have a variety of biological activities. Belonging to this group, there is lapachol, an isolated naphthoquinone species of Tabebuia spp., popularly known as "ipê". Many pharmacological activities, such as spasmolytic, are related to lapachol and its natural or synthetic derivatives. Researchers have turned their attention to this molecule in order to create compounds with therapeutic potential. From this perspective it was decided to investigate the spasmolytic effect of a new series of lapachol derivatives (UFRPE 15, UFRPE 17, UFRPE 31, UFRPE 114, UFRPE 115 e UFRPE 116) and norlapachol (UFRPE 106, UFRPE 107, UFRPE 111, UFRPE 112, UFRPE 113 e UFRPE 117) in the isolated guinea pig ileum, as well as investigate the mechanism of action of the compound which show a better efficacy. In the pharmacological screening, the lapachol derivatives showed low efficacy in inhibiting the phasic contractions induced by carbachol (CCh) and histamine. Only UFRPE 115 inhibited the phasic contractions induced by histamine in a concentration-dependent manner. However, derivatives from norlapachol were more promising, since all of them inhibited the phasic contractions induced by CCh and histamine in a concentration-dependent manner, where UFRPE 107, UFRPE 112 and UFRPE 117 compounds showed a better potency and efficacy. The spasmolytic effect of these has been reported in the ileum pre-contracted with KCl, CCh or histamine, and it was noted that these three derivatives relaxed guinea pig ileum in a concentration-dependent manner, and in special the UFRPE 117 showed the highest relative potency, thus, it was selected to study its mechanism of action. Once UFRPE 117 inhibited histamine-induced contractions and relaxed the ileum pre-contracted by the same agonist, we evaluated the involvement of histamine receptors in this effect. UFRPE 117 inhibited the cumulative curves to histamine, shifting them to right and in a nonparallel manner with Emax reduction, suggesting a noncompetitive antagonism pseudo irreversible type. Since the spasmolytic potency of this compound was reduced when the ileum was pre-contracted with 40 mM KCl, we investigated the involvement of K + channels using 5 mM CsCl, a non-selective blocker of these channels, where its relaxing power was attenuated by approximately 12 folds in the presence of this blocker, suggesting the involvement of K+ channels in spasmolytic action UFRPE 117. To assess which of K+ subtypes channels were involved in this effect, we used 10-5 M glibenclamide, a KATP blocker, whose did not alter the relaxing potency of UFRPE 117, discarding the involvement of these channels. However, in the presence of 100 nM apamin, a selective blocker of SKCa and 1 mM TEA+, a selective blocker of BKCa, The UFRPE 117 relaxant potency was attenuated around 4 to 5 folds, respectively, confirming the involvement of SKCa and BKCa. Thus, the mechanism of spasmolytic action of the synthetic derivative of norlapachol, UFRPE 117, involves activation/positive modulation of SKCa and BKCa, which would lead to a hyperpolarization of the membrane, indirect blocking Cav, reduction of [Ca2+]c and consequent relaxation of this organ.

Keywords: lapachol derivatives, naftoquinone, potassium channels, spasmolytic action, guinea pig

ileum

INVESTIGATION OF SPASMOLYTIC ACTIVITY OF A SERIES DERIVATIVE OF LAPACHOL IN GUINEA PIG ILEUM: A COMPARATIVE STUDY SILVA, A.C.L.

Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Dissertação de Mestrado, CCS/UFPB (2014).

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Tabebuia avellanedae Lorentz e Griseb........................................... 28

Figura 2 –. Estruturas químicas do lapachol (1) e de seus derivados naturais, -

lapachona (2) e -lapachona (3)............................................................................30

Figura 3 – Reação de Hooker para obtenção do norlapachol (4) a partir do lapachol (1) .........................................................................................................................32

Figura 4 (A) – Estrutura química dos derivados do núcleo fenazina obtidos a partir do lapachol.............................................................................................................33

Figura 4 (B) – Estrutura química dos derivados do núcleo fenazina obtidos a partir do norlapachol........................................................................................................34

Figura 5 – Esquema do mecanismo fármaco-mecânico da contração no músculo liso pela ativação da via Gq/11-PLCβ1...............................................................................................................37

Figura 6 – Esquema do mecanismo de manutenção da contração no músculo liso pela ativação da via G12/13-ROCK...........................................................................39

Figura 7 – Estrutura dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP)............................42

Figura 8 – Estrutura das subunidades α e β1 dos canais de K+ ativados por Ca2+ de grande condutância (BKCa) (A); associação das quatro subunidades dos BKCa

(B)............................................................................................................................43

Figura 9 – Estrutura dos canais de K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa) (A); mecanismo de ativação do canal pela ligação do Ca2+ à CaM

(B)............................................................................................................................44

Figura 10 – Esquema do mecanismo fármaco-mecânico do relaxamento no músculo liso pela ativação da via Gs -AC-PKA e NO-GCs-PKG............................................45

Figura 11 –.Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 112 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-5 M de carbacol (B) em íleo de cobaia......................................................................................................................72 Figura 12 –. Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 107 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de histamina (B) em íleo de cobaia....................................................................................................................74 Figura 13 –. Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de histamina (B) em íleo de cobaia..........................................................................................................76

Figura 14 –. Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 5 mM de CsCl em íleo de cobaia.................... ............................................79

16

Figura 15 –. Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 10-5 M de glibenclamida em íleo de cobaia................................................82 Figura 16 –. Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 100 nM de apamina em íleo de cobaia.......................................................84

Figura 17 –. Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 1 mM de TEA+ em íleo de cobaia..............................................................86

Figura 18 –. Proposta de mecanismo de ação espasmolítica para o derivado sintético do norlapachol UFRPE 117 em íleo isolado de cobaia...........................99

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Efeito do derivado UFRPE 31 frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de carbacol (A) e de histamina (B) em íleo de cobaia....................................59



Gráfico 4 – Efeito do derivado UFRPE 114 frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de carbacol (A) e de histamina (B) em íleo de cobaia..............................62









Gráfico 13 – Efeito de UFRPE 112 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (■) e 10-5 M de CCh (□) em íleo de cobaia..............................................73

Gráfico 14 – Efeito de UFRPE 107 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl () e 10-6 M de histamina (○) em íleo de cobaia.....................................75

Gráfico 15 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl () e 10-6 M de histamina () em íleo de cobaia...................................77

Gráfico 16 – Curvas concentrações-resposta cumulativas à histamina na ausência (controle) () e na presença de UFRPE 117 nas concentrações de 3 x 10-6(□); 10-5

(); 3 x 10-5 (○); 10-4 () e 3 x 10-4 M () em íleo de cobaia...................................78

18

Gráfico 17 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 5 mM de CsCl, em íleo de cobaia....................................................................................................................80

Gráfico 18 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 10-5 M de glibenclamida em íleo de cobaia.......................................................................................................83

Gráfico 19 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 100 nM apamina em íleo de cobaia..............................................................................................................................85

Gráfico 20 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 1 mM de TEA+ em íleo de cobaia....................................................................................................................87

Gráfico 21 – Valores de CE50 (M) de UFRPE 117 na ausência (controle) e na presença de bloqueadores de canais de K+ em íleo de cobaia.................................88

19

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição da solução de Krebs modificado por Sun e Benish (1994) ...................................................................................................................................50

Tabela 2 - Valores de Emax (%) e de CI50 (M) dos derivados do lapachol frente às

contrações fásicas induzidas por carbacol ou por histamina em íleo de

cobaia.........................................................................................................................71

Tabela 3 - Valores de Emax (%) e de CI50 (M) dos derivados do norlapachol frente às


cobaia.........................................................................................................................71

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LISTA DE ABREVIATURAS

[(Ca2+)4-CaM] complexo cálcio-calmodulina

[Ca2+] concentração de Ca2+

[Ca2+]c concentração de Ca2+ citosólico

[K+]e concentração extracelular de potássio

4-AP 4-aminopiridina

AC ciclase de adenilil

ACh acetilcolina

AMPc monosfofato cíclico de adenosina

ANOVA análise de variância

ATP trifosfato de adenosina

BKCa canais de potássio ativados por cálcio de grande condutância

CaM calmodulina

CaV canais de cálcio dependentes de voltagem

CaV1 canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo 1

CaVL canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L

CCh carbacol

CE50 concentração de uma substância necessária para produzir 50%

de seu efeito máximo

CPI-17 inibidor da fosfatase da miosina potencializado pela PKC

CsCl cloreto de césio

DAG diacilglicerol

e.p.m. erro padrão da média

Emax efeito máximo

Gq/11 proteína Gq ou proteína G11

21

Gq subunidade α da proteína Gq

G12/13 proteína G12 ou proteína G13

GCs ciclase de guanilil solúvel

GMPc monofosfato cíclico de guanosina

GPCR receptor acoplado à proteína G

GTP trifosfato de guanosina

IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol

IP3 R receptor de IP3

KATP canais de potássio sensíveis ao ATP

KCa canais de potássio ativados por cálcio

MLC cadeia leve da miosina

MLCK cinase da cadeia leve da miosina

MLCP fosfatase da cadeia leve da miosina

MYPT1 subunidade 1 condutora da fosfatase da miosina

PA ácido fosfatídico

PC fosfatidilcolina

PIP2 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol

PKA proteína cinase dependente de AMPc

PKG proteína cinase dependente de GMPc

PLC fosfolipase C

PLD fosfolipase D

PMCA Ca2+-ATPase da membrana plasmática

RhoA pequena proteína G ligante de GTP

ROCK cinase dependente de RhoA

RyR receptor de rianodina

RS retículo sarcoplasmático

22

SERCA Ca2+-ATPase do retículo endo-sarcoplasmático

SKCa canais de potássio ativados por cálcio de pequena condutância

SUR receptor para sulfonilureia

TEA+ íon tetraetilamônio

Vm potencial de membrana

ZIPK proteína cinase de interação zíper

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................26

2 OBJETIVOS........................................................................................................47

2.1 Geral.................................................................................................................47

2.2 Específicos.......................................................................................................47

3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................49

3.1 MATERIAL.......................................................................................................49

3.1.1 Produto-teste.................................................................................................49

3.1.2 Animais..........................................................................................................49

3.1.3 Drogas e Reagentes......................................................................................49

3.1.4 Solução Nutritiva............................................................................................50

3.1.5 Aparelhos......................................................................................................51

3.2 MÉTODOS.......................................................................................................51

3.2.1 Preparação da solução-estoque....................................................................51

3.2.2 Triagem farmacológica .................................................................................52

3.2.2.1 Efeito dos derivados sintéticos frente às contrações fásicas induzidas por carbacol

ou por histamina em íleo de cobaia........................................................................52

3.2.2.2 Efeito de UFRPE 112, UFRPE 107 e UFRPE 117 sobre as contrações tônicas

induzidas por KCl, CCh ou histamina.....................................................................53

3.2.3 Investigação do mecanismo de ação relaxante de UFRPE 117 em íleo de

cobaia.....................................................................................................................53

3.2.3.1 Caracterização do bloqueio da contração induzida por

histamina................................................................................................................53

24

3.2.3.2 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante de UFRPE

117........................................................................................................................54

3.2.3.2.1 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por histamina na

presença de cloreto de césio (CsCl).....................................................................54

3.2.3.2.2 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por histamina na

presença de glibenclamida, apamina ou tetraetilamônio......................................54

3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................. 55

4 RESULTADOS....................................................................................................56

4.1 Triagem farmacológica.....................................................................................57

4.1.1 Efeito dos derivados sintéticos frente às contrações fásicas induzidas por CCh ou

por histamina em íleo de cobaia.............................................................................57

4.1.2 Efeito dos derivados sintéticos, UFRPE 112, UFRPE 107 e UFRPE 117, sobre as

contrações tônicas induzidas por KCl, por carbacol ou por

histamina................................................................................................................71

4.2 Investigação do mecanismo de ação relaxante de UFRPE 117 em íleo de

cobaia.....................................................................................................................77

4.2.1 Caracterização do bloqueio da contração induzida por

histamina................................................................................................................77

4.2.2 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante de UFRPE

117 em íleo de cobaia............................................................................................78

4.2.2.1 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por histamina na

presença de cloreto de césio..................................................................................78

4.2.2.2 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por histamina na

presença de glibenclamida, apamina ou tetraetilamônio........................................80

5DISCUSSÃO......................................................................90

6CONCLUSÃO..................................................................101

REFERÊNCIAS.................................................................103

ANEXO................................................................................................................119

1 Introdução

26

Silva, A.C.L. Introdução

1.1 Produtos naturais: fonte para a descoberta de substâncias bioativas

Durante a maior parte da história, a natureza, em especial as plantas, tem

sido fonte de compostos potencialmente ativos usados para o tratamento de um

amplo espectro de doenças (CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2014). Os produtos

de origem natural desempenham um papel importante nos processos de descoberta

e desenvolvimento de medicamentos, seja como produtos diretos ou a partir de

substâncias fornecidas por eles, desempenhando um papel fundamental na

pesquisa farmacológica e na proteção à saúde (NEWMAN e CRAGG, 2012). Além

de serem usados pela população como fonte de remédios, os produtos naturais têm

servido como fonte e inspiração para uma grande fração da atual farmacopeia

(KINGSTON, 2011), fornecendo um vasto arsenal terapêutico contra inúmeras

enfermidades compreendendo, assim, uma fonte de inestimável valor às

necessidades medicinais da humanidade.

Diversas razões são apresentadas para explicar o sucesso dos produtos

naturais na descoberta de drogas: alta diversidade química, criação de moléculas

biologicamente ativas através da evolução e a semelhança estrutural com alvos

proteicos em muitas espécies (FEHER; SCHMIDT, 2003), além disso, eles são

tradicionalmente empregados na identificação, classificação de receptores e

investigação de funções fisiopatológicas e de sítios de ação de fármacos, atuando,

assim, como ferramentas farmacológicas. Exemplos clássicos incluem a nicotina,

muscarina, pilocarpina e atropina utilizadas no estudo de receptores nicotínicos e

muscarínicos (SIMMONDS, 2003).

Os produtos naturais e seus derivados representam mais de 50% de todas as

drogas em utilização clínica no mundo, com as plantas contribuindo com 25% desse

total (GURIB-FAKIM, 2006). Em um estudo publicado por Newman e Cragg (2012),

são descritos diversas novas moléculas originárias de produtos naturais durante um

período de 30 anos (1981-2010), e utilizando uma definição bastante ampla do que

constitui uma “droga derivada de produto natural” indicou que quase 50% das novas

drogas introduzidas neste período eram originadas de produtos naturais com os

agentes antineoplásicos, antibacterianos, antivirais, anti-hipertensivos e anti-

inflamatórios correspondendo a, aproximadamente, 45% dessas novas substâncias.

Adicionalmente, 13 drogas relacionadas aos produtos naturais foram aprovadas

27


entre 2005 e 2007, das quais 05 destas são mencionadas como sendo o primeiro

representante (protótipo) de novas classes de drogas (HARVEY, 2008).

Dessa forma, a natureza é uma fonte de compostos com potencial para servir

de base e inspiração para gerar novos fármacos, seja diretamente, por semissíntese

ou síntese total e que ainda mostra-se uma alternativa bastante interessante e viável

uma vez que muitos produtos naturais, e derivados de produtos naturais

sinteticamente modificados, tem sido desenvolvidos com sucesso para uso clínico e

para o tratamento de inúmeras doenças humanas.

1.2 A família Bignoniaceae, a espécie Tabebuia avelanedae e as naftoquinonas

Muitas famílias botânicas são fornecedoras de produtos naturais para

obtenção de novas drogas, nesse contexto pode-se destacar a família Bignoniaceae

onde esta possui cerca de 120 gêneros e 800 espécies arbóreas, arbustivas e

trepadeiras com uma distribuição pantropical, e pronunciada ocorrência nos

neotrópicos, o Brasil apresenta alguns táxons endêmicos o também é o país onde a

maior diversidade desta família é encontra da, apresentando cerca de 32 gêneros e

350 espécies ocorrendo em vários tipos de ambiente, desde o cerrado até florestas

úmidas perenifólias (GENTRY, 1980; SILVA; QUEIROZ, 2003; SOUZA; LORENZI,

2008). As plantas pertencentes a essa família apresentam diferentes classes de

metabólitos secundários, incluindo saponinas, taninos, flavonoides, quinonas, ,

alcaloides, terpenos e etc (CHOUDHURY et al., 2011); várias espécies da família

Bignoniaceae são utilizadas na medicina popular, por exemplo, Jacaranda

cuspidifolia Mart. como um agente antibacteriano (ARRUDA et al., 2011) Tecoma

stans (L.) Juss. ex Kunth como hipoglicemiante(AGUILAR-SANTAMARIA et al.,

2009) e Arrabidaea brachypoda (DC.) por apresentar atividade anti-inflamatória e

antinociceptiva, entre outras (DA ROCHA et al., 2011).

Inserida na família Bignoniaceae, podemos destacar a espécie Tabebuia

avellanedae Lorentz ex Griseb (Figura 1) conhecida na medicina popular como “ipê-

roxo”, “pau-d'arco”, “lapacho”, entre outros nomes. Durante várias décadas,

preparações obtidas a partir dessa planta foram utilizadas na América do Sul e do

Norte como antineoplásico, antifúngico, antiviral, antimicrobiano, antiparasitário e

anti-inflamatório(SANTANA et al., 1968; UEDA et al., 1994;; MIRANDA et al., 2001;

RIFFEL et al., 2002; MACHADO et al., 2003; PEREIRA et al., 2006). A sua

entrecasca é utilizada como analgésico, antineoplásico, anti-inflamatória e diurética

28


pela população em alguns lugares do norte do Brasil e as atividades farmacológicas

relacionadas a essa espécie se deve a presença de flavonoides, saponinas,

cumarinas e quinonas, onde em estudos para avaliar o perfil químico nas atividades

relatadas, as quinonas são as principais subtâncias ativas encontradas. (MIRANDA

et al., 2001; MACHADO et al., 2003 HUSSAIN et al., 2007). Portanto, Tabebuia

avellanedae é digna de atenção devido aos seus efeitos terapêuticos altamente

promissores e deve ser extensamente investigada como um importante recurso

medicamentoso (YAMASHITA et al., 2007).

Figura 1: Tabebuia avellanedae Lorentz e Griseb.

Fonte: www.bibvirt.futuro.usp.br/imagens/enciclopedia_de_plantas_flores/ipe_roxo.

As quinonas representam uma variada classe de metabólitos secundários que

possuem participação em alguns processos bioquímicos vitais, além de

apresentarem cada vez mais um maior destaque em estudos farmacológicos O

interesse nessas substâncias tem aumentado com o passar dos anos principalmente

pelo seu envolvimento em etapas importantes do ciclo de vida dos seres vivos,

29


principalmente a nível de cadeia respiratória, fotossíntese e coagulação sanguínea

(MAHLER et al 1971., GOODWIN et al., 1972; SILVA et al., 2003).

Com base na sua estrutura molecular as quinonas são divididas em diferentes

grupos, utilizando-se como critério o tipo de sistema aromático que sustenta o anel

quinonoídico: (1) benzoquinonas – um anel benzênico; 2) naftoquinonas– um anel

naftalênico e 3) antraquinonas – um anel antracênico linear ou angular. (SILVA et al.,

2003)

As naftoquinonas representam uma grande classe de compostos naturais e

são encontradas em uma ampla variedade de famílias botânicas, fungos e bactérias

exemplos notáveis de naftoquinonas de origem natural incluem a juglona, a

plumbagina e a vitamina K, que desempenha um importante papel no processo de

coagulação sanguínea ,o lapachol (1), a -lapachona (2) e a -lapachona (3) (Figura

2), sendo a -lapachona e a -lapachona análogos naturais do lapachol. Esses três

isômeros constitucionais estão presentes nas plantas da família Bignoniaceae,

principalmente as pertencentes ao gênero Tabebuia, sendo o lapachol a

naftoquinona mais abundante entre as três. O lapachol também já foi relatado em

muitas espécies de outras famílias, como por exemplo, Verbenaceae, Proteaceae,

Leguminosae, Sapotaceae, entre outras (EPIFANO et al., 2014; FONSECA; BRAGA;

SANTANA, 2003).

Derivados de naftoquinonas têm apresentado efeitos farmacológicos valiosos,

como citotóxico, antibacteriano, antiviral, antifúngico, anti-inflamatório e anti-

protozoário (GROLIG AND WAGNER, 2005) e o mecanismo de ação desses efeitos

observados envolve a inibição das topoisomerases que desencadeia a apoptose

celular e a capacidade de formar radicais semiquinonas e espécies reativas de

oxigênio dentro da célula (SILVA, 2003), nessa perspectiva de importância

farmacológica das naftoquinonas ou seus derivados, um medicamento contendo um

derivado do lapachol, Atovaquone® , foi aprovado para ser utilizado no tratamento

da pneumocistose, toxoplasmose e malária (EYONG et al. 2008).

30


Figura 2 – Estruturas químicas do lapachol (1) e de seus derivados naturais, -lapachona

(2) e -lapachona (3) (CAVALCANTE, 2008).

Neste contexto, o lapachol [2-hidroxi-3-prenil-1,4-naftoquinona] é um dos

melhores exemplos de substância com potencial para estudos fitoquímicos e

farmacológicos, pois é uma molécula biologicamente ativa versátil e que pode ser

encontrada em várias espécies de diferentes famílias (HUSSAIN, et al, 2007). Foi

isolado pela primeira vez da árvore Tabebuia avellanedae Lorentz ex Griseb.

(Bignoniaceae) pelo químico italiano Emanuele Paternò em 1882, primeiramente

recebeu o nome de ácido lapáchico devido as suas propriedades ácidas e o termo

“lapachol” foi atribuído por Hooker (HOOKER, 1936).

Espécies que contêm o lapachol e várias naftoquinonas são extensamente

usadas na medicina popular para o tratamento de câncer, lupus, infecções,

ferimentos e muitas outras doenças (DUKE, 1985), o lapachol já foi comercializado

no Brasil como coadjuvante no tratamento de diversos tipos de tumores (RAO;

McBRIDE; OLESON, 1968; SANTANA et al., 1968), não sendo mais disponível no

mercado (SILVA; FERREIRA; SOUZA, 2003) devido a restrições no seu uso clínico

uma vez que foram observados diversos efeitos colaterais, como problemas

gastrintestinais, anemia e aumento no tempo de coagulação (OLIVEIRA et al.,

1990).Dessa maneira, alterações químicas na estrutura da molécula do lapachol

podem ser realizadas visando a obtenção de novas substâncias, onde estas

modificações podem minimizar possíveis efeitos colaterais preservando a atividade

farmacológica, levando ao surgimento de novoss efeitos biológicos e também a

diminuição de uma atividade.

As naftoquinonas têm sido alvo de muitos estudos, uma vez que diversas

atividades biológicas são relacionadas a este grupo de substâncias e muitas dessas

são atribuídas ao lapachol e aos seus derivados naturais ou sintéticos, tais como

anti-inflamatória (MOON et al., 2007; SITÔNIO et al., 2013; TSENG et al, 2013)

(2)

O

O

O

6

7

5

8

1

4

2

3 2 ' 1 '

3 '

4 '

5 ' O

O

O

5' 4'

3'

1'

2'

3

2

4

1

8

5

7

6

(3)

OH

O

O

4'

5'

3'1'

2'3

2

4

1

8

5

7

6

(1)

31


atividade antibacteriana e antifúngica ( MACHADO et al., 2003; PARK et al., 2005;

ANTUNES et al., 2006 ; PEREIRA et al., 2006; PINTO e CASTRO, 2009, SOUZA et

al., 2013).; antimalárica (FONSECA, BRAGA E SANTANA 2003; HUSSAIN et al.,

2007).); leishmanicida (TEIXEIRA et al., 2001 SOUZA-SILVA et al., 2014);

moluscicida (CAMARA et al., 2008) antineoplásica (RAO, 1974; HUSSAIN, et al.,

1994; LI et al., 1999; SILVA-JÚNIOR et al., 2007; EYONG et al., 2008;

SALUSTIANO et al., 2010; COSTA et al., 2011); inibição das topoisomerases I e II (

NEDER et al., 1998; KRISHNAN; BASTOW, 2000; COELHO-CERQUEIRA et al.,

2014) e citotoxicidade em células cancerosas (BALASSIANO et al., 2005;

SUNASSEE et al., 2013; FIORITO et al, 2014).

Dentre as diversas atividades biológicas apresentadas pelas naftoquinonas,

várias apresentaram atividade espasmolítica, como exemplos de naftoquinonas,

tem-se a juglona em artérias coronárias de coelho, útero de rata e intestino de rato

(AUYONG; WESTFALL; RUSSELL, 1963) as vitaminas K1 (2-metil-3-fitil-1,4-

naftoquinona) e K3 (3-metil-1,4-naftoquinona) em vasos coronários (LIDER;

SHISHKIN; FEOFILAKTOVA, 1987); o lapachol, -lapachona e -lapachona em íleo

de cobaia (CAVALCANTE et al., 2008), -lapachona em corpos cavernosos (BAE et

al, 2011). Outras quinonas apresentaram efeito espasmolítico em íleo isolado de

cobaia como, por exemplo p-benzoquinona, 2-metilbenzoquinona, e 2-

etilbenzoquinona (MOUSSATCHE et al., 1967) e os derivados sintéticos do lapachol:

norlapachol, -norlapachona, -norlapachona e hidro-hidroxi-norlapachol

(CAVALCANTE et al., 2010).

Uma vez que muitas atividades farmacológicas são relacionadas ao lapachol

e aos seus derivados naturais ou sintéticos, pesquisadores tem voltado sua atenção

para esta molécula a fim de criar compostos com potencial farmacológico. Tendo a

molécula do lapachol e do norlapachol que é um derivado sintético do lapachol como

ponto de partida, pesquisadores utilizaram diferentes aminas primárias para reagir

com o lapachol e o norlapachol a temperatura ambiente e sem solvente, e essa

reação forneceu novos compostos identificados como derivados do núcleo fenazina

(Santos et al., 2011) (Figura 4). Ainda não há relatos na literatura de atividades

farmacológicas relacionadas a estes novos compostos derivados do lapachol e do

norlapachol. A reação forneceu 6 compostos derivados do lapachol (A) codificados

como UFRPE 15, UFRPE 17, UFRPE 31, UFRPE 114, UFRPE 115 e UFRPE 116 e.

32


6 compostos derivados do norlapachol (B) codificados como UFRPE 106, UFRPE

107, UFRPE 111, UFRPE 112, UFRPE 113 e UFRPE 117

Figura 3 – Reação de Hooker para obtenção do norlapachol (4) a partir do lapachol (1)

(CAVALCANTE, 2008).

OH

O

O

4'

5'

3'1'

2'3

2

4

1

8

5

7

6

(1)

KMnO4

NaOH6

7

5

8

1

4

2

3 2'

1'

3'

4'OH

O

O

(4)

(35 %)

33


Figura 4 .(A) – Estrutura química dos derivados do núcleo fenazina obtidos a partir do

lapachol

N

N

O

OH

OH

N

N

O

OH

OH

UFRPE 15 UFRPE 17

N

N

O

OH

N

N

O

OH

OH

UFRPE 31 UFRPE 114

N

N

O

OH

OH

N

N

O

OH

OH

UFRPE 115 UFRPE 116

34


Figura 4 .(B) – Estrutura química dos derivados do núcleo fenazina obtidos a partir

do norlapachol

N

N

O

OH

OH

N

N

O

OH

OH

UFRPE 106 UFRPE 107

N

N

O

OH

N

N

O

OH

OH

UFRPE 111 UFRPE 112

N

N

O

OH

OH

N

N

O

OH

OH

UFRPE 113 UFRPE 117

35


1.3 Regulação da contração e do relaxamento do músculo liso

A regulação da contratilidade do músculo liso é um mecanismo biológico

crucial para entender funções fisiológicas como a manutenção da pressão arterial,

responsividade aérea e a motilidade gastrointestinal (STOTT, JEPPS,

GREENWOOD, 2014). Além disso, a desregulação da contração desse músculo

acarreta em várias desordens clínicas e doenças como hipertensão, asma,

dispepsia, diarreia, cólicas intestinais e uterinas, incontinência urinária, trabalho de

parto prematuro e disfunção erétil (KIM et al., 2008; STOTT, JEPPS,

GREENWOOD, 2014). O interesse em investigar substâncias com atividade sobre a

musculatura lisa reside no fato de que substâncias espasmolíticas têm uma

importante aplicação nesses processos fisiopatológicos. Dessa forma, os ensaios

farmacológicos utilizando como modelo experimental a musculatura lisa contribuem

para o desenvolvimento de fármacos candidatos a ser utilizados no tratamento das

diversas patologias que acometem esse músculo (CORREIA, 2013).

Bioquimicamente, a entrada de íons Ca2+ nas células é responsável por iniciar

numerosos eventos intracelulares, incluindo contração, secreção, transmissão

sináptica, regulação enzimática, fosforilação e desfosforilação de proteínas e

transcrição gênica (CATTERALL, 2011) e na busca por substâncias que interfiram

na sinalização intracelular do Ca2+, o músculo liso se tornou uma alternativa para o

desenvolvimento de técnicas que possibilitem essa investigação (KARAKI et al.,

1997).

Para que ocorra a contração no músculo liso, é necessário o aumento na

concentração citosólica de Ca2+ e esse aumento na [Ca2+]c é o fator primordial para

a produção da contração. Esta elevação no conteúdo citosólico de Ca2+ também

está envolvido na proliferação celular do músculo liso (HILL-EUBANKS et al., 2011).

A regulação funcional da [Ca2+]c, para dar início a uma resposta contrátil no músculo

liso depende de dois estímulos que levam a dois tipos de acoplamentos: o

acoplamento eletromecânico, que está envolvido com a mudança do potencial de

membrana (Vm) e o acoplamento fármaco-mecânico, que acontece quando a

contração promovida por um agonista é maior que a observada só com a mudança

do Vm (REMBOLD, 1996).

36


Os mecanismos que podem levar a contração a partir do acoplamento

eletromecânico é resultante de uma despolarização de membrana diretamente

associada ao aumento da concentração extracelular de potássio ([K+]e) ou

indiretamente pela ligação dos agonistas aos seus receptores levando à abertura de

canais de cálcio dependentes de voltagem (Cav), na membrana plasmática,

causando aumento de Ca2+ no citosol e, consequentemente, a contração

(REMBOLD, 1996).

Os mecanismos fármacomecânicos da contração do músculo liso (Figura 5)

envolvem a ligação de um agonista como carbacol (CCh) ou histamina a seus

receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e ativam a cascata do inositol, através

da proteína Gq ou G11, cujas suas subunidades ativam a fosfolipase C β1 (PLCβ1)

e, consequentemente, promovem hidrólise do 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol

(PIP2), produzindo o 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3) e o diacilglicerol (DAG)

(BERRIDGE, 2008; BILLINGTON; PENN, 2003). O retículo sarcoplasmático (RS)

representa a principal fonte de Ca2+ intracelular. O IP3 se liga aos receptores (IP3R),

e libera Ca2+ do RS. Além disso, no RS há os receptores de rianodina (RyR), que

são canais de Ca2+ ativados pelo próprio Ca2+ e são sensíveis à cafeína, eles são

ativados pelo Ca2+ previamente liberado via IP3R num processo denominado de

liberação de Ca2+ induzida pelo Ca2+ (CICR). Ambos os receptores permitem a

liberação de Ca2+ do RS para o citosol aumentando a [Ca2+]c (MCHALE et al., 2006;

DELLIS et al., 2006). A liberação de Ca2+ do RS induz a translocação da proteína

cinase C (PKC) para a membrana plasmática, onde é ativada quando entra em

contato com o DAG. Várias isoformas de PKC já foram encontradas no músculo liso,

onde a ativação dessa cinase leva a fosforilação de proteínas-alvo específicas,

como os CaV presentes na membrana plasmática ativando-os, promovendo o influxo

de Ca2+ (BERRIDGE, 2009a).

37


Figura 5 – Esquema do mecanismo fármaco-mecânico da contração no músculo liso pela

ativação da via Gq/11-PLCβ1.

(Fonte: adaptado de CORREIA, 2013)

(1) O agonista se liga ao seu receptor do tipo GPCR na membrana plasmática; (2) As proteínas Gq/11 troca GDP por GTP na sua subunidade α (não mostrado na figura), tornando-se ativa; (3) A subunidade αq/11-GTP ativa a enzima PLCβ1; (4) A PLCβ1 cliva o lipídio de membrana PIP2 em IP3 e DAG; (5) O IP3 migra pelo citoplasma e ativa o IP3R presente na membrana do RS, liberando o Ca2+ dos estoques; (6) O Ca2+ liberado ativa o RyR, fazendo com que mais Ca2+ seja liberado para o citoplasma; (7) O Ca2+ que foi liberado, juntamente com o DAG ativam a PKC; (8) A PKC ativada fosforila os CaV1 promovendo o influxo de Ca2+ através dos mesmos; (9) O aumento da [Ca2+]c aumenta a afinidade pela CaM formando o complexo 4Ca2+ - CaM e ativando a MLCK; (10) A MLCK ativada fosforila a MLC e esta se torna ativa e interage com os filamentos de actina, desencadeando a contração do músculo liso. As definições das abreviaturas estão presentes na lista de abreviaturas e no texto.

Independente da fonte proveniente, o Ca2+ quando em quantidades elevadas

no citosol liga-se a CaM formando um complexo [(Ca2+)4-CaM] que ativa a cinase da

cadeia leve da miosina (MLCK). O complexo [(Ca2+)4-CaM-MLCK] constitui a forma

ativa da MLCK, que tem como função fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC) e

esta fosforilação permite o desencadeamento do mecanismo de ciclização das

pontes cruzadas entre os filamentos de actina e miosina favorecendo um

deslizamento entre estes filamentos, com o consequente desenvolvimento da

contração (SOMLYO; SOMLYO, 1994 e 2003).

38


A redução da concentração de Ca2+ citoplasmáticos para os níveis basais

desativa a MLCK. O relaxamento do músculo liso ocorre através da ação da fosfatase

da cadeia leve da miosina (MLCP), que desfosforila a MLC. Esta reação é

relativamente lenta, por isso as contrações do músculo liso são tipicamente mais

sustentadas e se dissipam mais lentamente que as do músculo estriado (GARRET;

GRISHAM, 1995).

A diferença fundamental entre a contração do músculo liso inicial e a

manutenção dessa contração é o equilíbrio entre MLCK e a atividade da MLCP,

esse balanço age como um mecanismo regulador reversível de

fosforilação/desfosforilação que integra a contração no músculo liso (WATTERSON;

RATZ; SPIEGEL, 2005). A MLCP consiste em 3 subunidades: uma catalítica, PP1c;

uma regulatória, MYPT1 e outra de 20 kDa de função ainda desconhecida

(SOMLYO; SOMLYO, 2003). A ROCK, uma cinase de serina/treonina, fosforila a

subunidade de ligação da miosina da MLCP, inibindo a sua atividade e, assim,

promovendo o estado fosforilado da MLC. Inibidores farmacológicos da ROCK,

como o Y-27632, bloqueiam a sua atividade por competir com o sítio de ligação do

nucleotídio trifosfato de guanosina (GTP) na enzima (CHITALEY; WEBER; WEBB,

2001; UEHATA et al., 1997).

Os mecanismos que levam a inibição da MLCP (Figura 6) são iniciados pela

ativação da pequena proteína G ligante de GTP (RhoA), dependente das proteínas

G heterotriméricas G12/13 e Gq/11, via uma pequena proteína G associada a um fator

de troca de nucleotídios de guanina (RhoGEFs). A RhoGEFs faz com que a RhoA

troque nucleotídios difosfato de guanosina (GDP) por GTP, sendo translocada para

a membrana, e uma vez RhoA-GTP ligado estimula a sua cinase associada (ROCK)

(EXTON, 1997; MURTHY, 2006). Embora a ROCK fosforile diretamente a MLC

(TOTSUKAWA et al., 2000), sua ação principal na sensibilização ao cálcio parece

ser a inibição da MLCP, esta ação se dá pela fosforilação direta dos resíduos de

Thr696 e Thr853 da MYPT1, causando a sua dissociação e inibição da PP1c da MLCP

(MURTHY, 2006; SOMLYO; SOMLYO, 2003). A ROCK também pode ativar uma

proteína cinase independente de Ca2+, mais conhecida como proteína cinase de

interação zíper (ZIPK). A ZIPK pode fosforilar diretamente a MLC, no entanto seu

alvo principal é o resíduo de Thr696 da MYPT1 o qual é fosforilado inibindo a ação da

MLCP (MURTHY, 2006).

39


Figura 6 – Esquema do mecanismo de manutenção da contração no músculo liso pela ativação da via G12/13-ROCK.


.

(1) O agonista se liga ao seu receptor do tipo GPCR na membrana plasmática; (2) As proteínas G12/13 troca GDP por GTP na sua subunidade α (não mostrado da figura), tornando-se ativa; (3) A subunidade α12/13-GTP ativa o RhoGEF; (4) O RhoGEF faz com que a RhoA troque GDP por GTP, sendo deslocada para a membrana; (5) A RhoA-GTP ligado estimula a sua cinase ROCK; A ROCK possui vários alvos: (6) Inibe a MLCP; (7) Fosforila a MLC; (8) Ativa a ZIPK; (9) A ZIPK fosforila diretamente a MLC; (10) A ZIPK fosforila a MLCP, inibindo-a; (11) A RhoA-GTP ligado estimula a PLD; (12) A PLD cliva o lípídio de membrana PC em PA; (13) O PA é desfosforilado a DAG pela ação da enzima fosfo-hidrolase; (14) O DAG ativa a PKC, de maneira sustentada; (15) A PKC fosforila a CPI-17, ativando-a; (16) A CPI-17 inibe a ação da MLCP. Todos esses mecanismos favorecem o estado fosforilado a MLC e sua interação com os filamentos de actina, mantendo o músculo liso contraído. As definições das abreviaturas estão presentes na lista de abreviaturas e no texto.

A RhoA-GTP também estimula a fosfolipase D (PLD), essa enzima está

principalmente associada a membranas intracelulares, mas também é encontrada na

membrana plasmática e é específica para fosfatidilcolina (PC), liberando ácido

fosfatídico (PA) que através da ação da enzima fosfo-hidrolase é desfosforilado a

DAG levando a ativação sustentada da PKC (BERRIDGE, 2009a). A ativação da

PKC também pode ser dependente de Gq/11, da PLC que forma DAG a partir da

hidrólise do PIP2. A PKC pode fosforilar o resíduo de Thr38 da proteína inibitória

40


endógena da MLCP (CPI-17), aumentando assim sua potência inibitória sobre a

PP1c por mais de 1000 vezes, inibindo assim a ação da MLCP (MURTHY, 2006;

SOMLYO; SOMLYO, 2003).

Sendo o aumento na [Ca2+]c o sinal que leva à contração,

consequentemente o relaxamento ocorre por diminuição dos níveis deste íon no

citosol do músculo (SOMLYO; SOMLYO, 1994). Esta diminuição na [Ca2+]c pode

ocorrer por um mecanismo eletromecânico, caracterizado pela repolarização (ou

hiperpolarização) da membrana, ou pelo mecanismo fármaco-mecânico, que se dá

pela ativação de receptores de membrana e inibição das vias bioquímicas que levam

a contração (WOODRUM; BROPHY, 2001).

O acoplamento eletromecânico de relaxamento também envolve a abertura

de canais de K+, que desempenham um papel chave na regulação do potencial de

repouso da membrana e na excitabilidade celular, sendo que a contração no

músculo liso depende do balanço entre o aumento da condutância ao K+, levando a

uma repolarização/hiperpolarização, enquanto a diminuição de sua condutância

levaria a uma despolarização (KNOT; BRAYDEN; NELSON, 1996). Os canais de K+

conduzem íons K+ através da membrana plasmática a favor do seu gradiente

eletroquímico, que normalmente constitui uma corrente de saída, no sentido do meio

intracelular para o meio extracelular (MACKINNON, 2003). Estas correntes são

produzidas porque a concentração de K+ no interior da célula (140 mM) é maior do

que no meio extracelular (2-5 mM), havendo o efluxo desse íon pelos canais

seletivos ao K+. Portanto, mantendo o potencial de membrana das células no estado

de repouso para valores mais negativos, aproximando-se do potencial de equilíbrio

de K+ (cerca de -90 mV) (VOGALIS, 2000).

Dessa forma, a abertura dos canais de K+ está associada com a

manutenção do potencial de repouso e de inibição da atividade contrátil (VOGALIS,

2000). Além de vários outros processos celulares incluindo controle do volume

celular, secreção hormonal e controle da formação e propagação de sinais elétricos

em células excitáveis (MACKINNON, 2003). Sua atividade pode ser regulada por

voltagem, Ca2+ ou por neurotransmissores e, consequentemente, as vias de

sinalização que eles estimulam (ALEXANDER; MATHIE; PETERS, 2011).

Os canais de cálcio e os de potássio estão intimamente relacionados com a

regulação do tônus do músculo liso (WATTERSON; RATZ; SPIEGEL, 2005). O

41


movimento dos íons K+ através de canais localizados na membrana celular regula o

influxo de Ca2+ através dos CaV (THORNELOE; NELSON, 2005).

Os canais de potássio são um dos maiores e mais diversos grupos de canais

iônicos, com mais de 75 genes que codificam subunidades de canais de K+

identificados em humanos, uma família de proteínas de membrana diversa e

extensamente distribuída em células excitáveis e não excitáveis (STOTT, JEPPS,

GREENWOOD, 2014). Membros dessa família de canais exercem papel crítico em

processos intracelulares, regulando a secreção de hormônios e de

neurotransmissores, frequência cardíaca, secreção de insulina, excitabilidade

neuronal, transporte epitelial de eletrólitos, regulação do volume celular e contração

muscular lisa (SHIEH, et al., 2000) e sua atividade pode ser regulada por voltagem,

por Ca2+ ou por neurotransmissores e, consequentemente, as vias de sinalização

que eles estimulam (ALEXANDER; MATHIE; PETERS, 2011).

O músculo liso gastrointestinal pode ser regulado e expressa vários subtipos

de canais de K+, entre eles: os canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP); os canais de

K+ ativados por Ca2+ (KCa) e os canais de K+ dependentes de voltagem (KV);

(VOGALIS, 2000; SENDERS, 2012).

Os KATP (Figura 7) são complexos existentes na forma de hetero-octâmeros

contendo dois tipos distintos de subunidades proteicas. Os canais consistem de

quatro subunidades dos canais de K+ retificadores de entrada (Kir), chamadas de Kir

6.1 ou Kir 6.2, cada uma contendo dois domínios (TM1 e TM2), ligados a uma região

de formação do poro extracelular (H5). Cada subunidade de Kir está associada com

uma porção regulatória que é um receptor para sulfonilureia (SUR)

(BABENKO; AGUILAR-BRYAN; BRYAN, 1998, QUAN, et al., 2011). Cada

subunidade SUR tem 17 regiões transmembranares agrupados em três domínios:

TMD0 (TM1-5), TMD1 (TM 6-11), e DTM2 (TM 12-17). Cada subunidade SUR

também tem dois domínios de ligação ao ATP (NBD) (QUAN, et al., 2011). A

diversidade molecular dos KATP nos diversos tecidos e espécies é decorrente da

presença de múltiplas isoformas do SUR (SUR1, SUR2A, SUR2B) (BRAYDEN,

2002).

42


Figura 7 – Estrutura dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP).

Fonte: adaptado de QUAN, et al., 2011.

Uma característica primária deste canal é ser inativado pelo aumento de

ATP intracelular, por sulfonilureias como a glibenclamida e a tolbutamida, e por uma

baixa concentração de Ba2+ extracelular (FLAGG et al., 2010; SANBORN, 2000;

STANDEN et al., 1989). Porém hoje se sabe que existem subtipos de KATP que são

relativamente insensíveis a níveis basais de ATP, mas são bloqueados

seletivamente pela glibenclamida do mesmo modo que os demais (FLAGG et al.,

2010).

Outra família de canais de K+ existente é a dos KCa, a qual é amplamente

expressa em tecidos neuronais e não neuronais, como epitélios, células sensoriais e

músculos lisos onde estes podem responder a estímulos vindos de alterações do

potencial de membrana, e também por alterações da [Ca2+]c, contribuindo para a

repolarização do potencial de ação (BERKEFELD; FAKLER; SCHULTE, 2010;

PETERSEN; MARUYAMA, 1984; VERGARA et al., 1998).

Esta família de canais de K+ é dividida em três grandes grupos com base em

sua condutância, cinética e farmacologia (SAH; FABER, 2002): 1) canais de K+

ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa), bloqueados pela apamina; 2)

canais de K+ ativados por Ca2+ de condutância intermediária (IKCa), bloqueados pelo

clotrimazol e 3) canais de K+ ativados por Ca2+ de grande condutância (BKCa) que

são bloqueados por toxinas, como caribdotoxina e iberiotoxina, ou por baixas

concentrações do íon tetraetilamônio (TEA+). Os canais do tipo SKCa e IKCa são

insensíveis à voltagem e ativados por baixa concentração de Ca2+ citoplasmático

43


(< 1,0 M), em contraste aos BKCa que são ativados tanto por voltagem como por

Ca2+ (WEI et al., 2005).

Os canais KCa foram subdivididos da seguinte forma: no grupo dos BKCa são

chamados de KCa1.1, enquanto que no grupo dos SKCa estão incluídos os KCa2.1,

2.2 e 2.3, e os IKCa passaram a ser chamados de KCa3.1. Três outros membros deste

grupo, KCa4.1, 4.2 e 5.2, foram incluídos no grupo dos KCa, uma vez que todos

apresentam uma semelhança estrutural, apesar de não serem ativados por Ca2+. Os

canais KCa4.1 e KCa4.2 são ativados por Na+ e Cl- intracelular, enquanto o KCa5.1 é

sensível ao pH (ALDRICH et al., 2009).

Em relação a sua estrutura, os BKCa (Figura 8) são compostos por quatro

subunidades formadoras de poro, onde cada uma dessas é formada por 7

segmentos transmembranares (S0-S6) e uma grande região citoplasmática

carboxiterminal (SALKOFF et al., 2006). S1-S4 formam o domínio sensor de

voltagem primário e S5 e S6 juntos irão formar o principal domínio de permeação

para os íons (JIANG et al., 2002). A subunidade β é composta por dois domínios

transmembranares com uma grande alça extracelular, e as caudas NH2 e COOH

terminais localizadas no citoplasma (BOYLE; TOMASIC; KOTLIKOFF, 1992;

FLEISCHMANN; WASHABAU; KOTLIKOFF 1993; LEE; CUI, 2010). As propriedades

fisiológicas dos BKCa, incluindo a sensibilidade ao Ca2+, são moduladas pelas

subunidades acessórias. As estimativas da sua densidade média, em músculo liso

variam entre 1 a 4 canais/m2 (BENHAM; BOLTON, 1986; SINGER; WALSH, 1987).

Figura 8 – Estrutura das subunidades α e β1 dos canais de K+ ativados por Ca2+ de grande condutância (BKCa) (A); associação das quatro subunidades dos BKCa (B).

Fonte: adaptado de LEDOUX et al., 2006.

44


Os SKCa (Figura 9 ) são formados por quatro subunidades, cada uma delas

constituídas por seis domínios transmembranares (S1-S6), com caudas NH2 e

COOH terminais intracelulares. A região do poro (S5-S6) é a única região homóloga

das outras famílias de canais de K+. A CaM está presa a região COOH terminal de

cada subunidade do canal e a sensibilidade ao Ca2+ citoplasmático depende da

CaM. A ligação do Ca2+ à CaM induz a alteração conformacional do complexo

proteico levando à abertura do poro do canal (LEDOUX, et al., 2006).

Figura 9 – Estrutura dos canais de K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa) (A); mecanismo de ativação do canal pela ligação do Ca2+ à CaM (B).

Fonte: adaptado de LEDOUX et al., 2006.

Os mecanismos de relaxamento do músculo liso que estão envolvidos no

acoplamento fármaco-mecânico (Figura 9) incluem a fosforilação, via PKA ou PKG,

de vários substratos, ocasionando: (1) o aumento na atividade da Ca2+-ATPase tanto

do RS (SERCA) como da membrana plasmática (PMCA), aumentando, assim, o

sequestro e a extrusão de Ca2+, respectivamente, diminuindo a [Ca2+]c; (2) a

inativação IP3R, pela PKG, reduzindo sua capacidade de liberar o Ca2+ do RS; (3) a

diminuição da formação do IP3, levando à diminuição da liberação de Ca2+ dos RS;

(4) a inibição da MLCK, reduzindo sua afinidade pelo complexo 4Ca2+-CaM,

causando uma redução nos níveis de rMLC fosforilada e, dessa forma, do processo

contrátil; (5) a inibição direta dos CaV, causando uma redução da [Ca2+]c por diminuir

o influxo de Ca2+ e (6) a ativação de canais de K+ que, por repolarização ou por

hiperpolarização, causam o bloqueio dos CaV (WOODRUM; BROPHY, 2001;

DANILA; HAMILTON, 2004).

45


Figura 10 – Acoplamento fármaco-mecânico do relaxamento muscular liso.


(1) O agonista se liga ao seu receptor do tipo GPCR na membrana plasmática; (2) a

proteína Gs troca GDP por GTP na sua subunidade α (não mostrado na figura), tornando-se

ativa; (3) a subunidade αs-GTP ativa a AC; (4) a AC converte o ATP em cAMP; (5) o NO

gerado tanto dos nervos como das células musculares lisas estimula a atividade da sGC;

a sGC converte o GTP em cGMP; (6) os nucleotídios cíclicos, (7) cAMP e cGMP, ativam

suas respectivas proteínas cinases, PKA e PKG. Ambas as proteínas cinases fosforilam

vários substratos: (8) ativam os canais de K+; (9) inibem os CaV; (10) aumentam a atividade

da SERCA e da PMCA; (11) ativam do trocador Na+/Ca2+. Todos esses mecanismos

diminuem a [Ca2+]c; (12) inibem a MLCK, reduzindo sua afinidade pelo complexo 4Ca2+-

CaM. Todos esses mecanismos impedem a ativação da rMLC e, consequentemente, a

interação dos filamentos de miosina com os de actina, promovendo o relaxamento do

músculo liso. As definições das abreviaturas estão presentes na lista de abreviaturas e no

texto.

2 Objetivos

47

Silva, A.C.L. Objetivos

2.1 Gerais

Contribuir com o estudo farmacológico das naftoquinonas em nível

funcional, especificamente de uma série de novos compostos derivados do

lapachol e do norlapachol em íleo de cobaia.

2.2 Específicos

Investigar a atividade espasmolítica desses compostos em íleo isolado

de cobaia.

Determinar e comparar a potência farmacológica dos compostos

testados com base nos valores de CI50 (concentração de uma substância que

inibe 50% do efeito máximo de um agonista) ou de CE50 (concentração de uma

substância que produz 50% de seu efeito máximo).

Determinar e comparar a eficácia farmacológica dos compostos com

base nos valores de Emax (efeito máximo).

Elucidar o mecanismo de ação espasmolítica em íleo isolado de cobaia

avaliando:

A característica do antagonismo da contração induzida por

histamina;

A modulação dos canais de potássio pelo composto;

Determinar quais os subtipos desses canais estão envolvidos;

3 Material e Métodos

49

Silva, A.C.L. Material e Métodos

3.1 MATERIAL

3.1.1 Produto-teste

A série de compostos sintéticos derivados do lapachol e do norlapachol

codificados como UFRPE 15, UFRPE 17 UFRPE 31, UFRPE 106, UFRPE 107,

UFRPE 111. UFRPE 112, UFRPE 113, UFRPE 114, UFRPE 115, UFRPE 116,

UFRPE 117 foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Celso de Amorim Camara

do Departamento de Ciências Moleculares da Universidade Federal Rural de

Pernambuco.

3.1.2 Animais

Eram utilizados cobaias (Caviaporcellus) de ambos os sexos, pesando

entre 300 e 500 g, provenientes do Biotério Prof. Thomas George do Centro de

Biotecnologia (CBiotec) da UFPB.

Antes dos experimentos, os animais eram mantidos sob rigoroso

controle alimentar com uma dieta a base de ração tipo pellets (Labina®) com

livre acesso a água, ventilação e temperatura (21 1 C) controladas e

constantes, submetidos diariamente a um ciclo claro-escuro de 12 h, sendo o

período claro das 6 h às 18 h. Os experimentos eram realizados no período das

8 às 20 h. Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo

os princípios de cuidados com animais, submetidos e aprovados pela

Comissão de Ética no Uso de Animais do CBiotec (CEUA/CBiotec) sob Nº de

certidão 0805/13.

3.1.3 Drogas e reagentes

O cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O), e o sulfato de magnésio

hepta-hidratado (MgSO4.7H2O) foram adquiridos da Vetec (Brasil). O

bicarbonato de sódio (NaHCO3), o cloreto de sódio (NaCl), o cloreto de

potássio (KCl) e o álcool etílico absoluto foram adquiridos da Fmaia (Brasil). A

glicose, o fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4), o fosfato de sódio dibásico

(Na2HPO4), o hidróxido de sódio (NaOH) e o ácido clorídrico (HCl) foram

adquiridos da Nuclear (Brasil). Estas substâncias, exceto a glicose, o

bicarbonato de sódio e o cloreto de sódio, eram dissolvidas e diluídas em água

50


destilada para obtenção de cada solução-estoque, que era mantida sob

refrigeração.

O cloridrato de carbamilcolina (CCh) e o diidrocloridrato de histamina

foram adquiridos da Merck (Brasil). Estas substâncias foram dissolvidas e

diluídas em água destilada para obtenção de suas soluções-estoque (10-2 M),

que eram mantidas a 0 °C em refrigerador. Tais soluções eram diluídas em

água destilada para obtenção de concentrações apropriadas a cada protocolo

experimental.

O cloreto de césio (CsCl), o tetraetilamônio (TEA+), a glibenclamida, a

apamina, a 4-aminopiridina (4-AP) e o óleo de castor (Cremophor), foram

obtidos da Sigma-Aldrich (Brasil). Estas substâncias eram mantidas em um

“freezer” à temperatura de -20° C, dissolvidas e diluídas em água destilada,

exceto a glibenclamida, que era dissolvida em álcool etílico absoluto.

A mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2)foi adquirida da White

Martins (Brasil).

3.1.4 Soluções nutritivas

Era utilizada a solução nutritiva de Krebs modificado, sendo a mesma

ajustada ao pH 7,4 com NaOH ou HCl(1 N), aerada com carbogênio e mantida

a 37° C, cuja composição está discriminada a seguir:

Composição Concentração (mM)

NaCl 117,0

KCl 4,7

MgSO4 1,3

NaH2PO4 1,2

CaCl2 2,5

NaHCO3 25,0

Glicose 11,0

Tabela 1 - Composição da solução de Krebs modificado por Sun e Benish (1994).

51


3.1.5 Aparelhos

Para o registro das contrações isotônicas os órgãos eram suspensos

em cubas de 5 mL e conectados a uma alavanca isotônica de inscrição frontal

em cilindros esfumaçados de um quimógrafo (DTF, Brasil). As contrações

isométricas eram registradas utilizando transdutores de força isométricos

FORT-10 conectados a um amplificador modelo TMB4M, ambos da World

PrecisionInstruments, Sarasota, FL, EUA), os quais estavam conectados a uma

placa conversora analógico/digital instalada em um microcomputador contendo

o programa BioMed© versão Rv2 (BioData, João Pessoa, PB, Brasil). A

temperatura das cubas era controlada com uma bomba termostática modelo

(POLYSTAT 12002 - Cole-Palmer, EUA).

Os valores de pH eram aferidos através de um pHmetro digital modelo

PG2000 (GEHAKA, São Paulo, SP, Brasil).

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Preparação da solução-estoque

Os compostos eram solubilizados em Cremophor (3%) e diluídos em

água destilada para obtenção da solução estoque a 10-2 M. Essa solução era

estocada a 0° C. A concentração final de Cremophor nas cubas nunca excedia

0,01% (v/v); nessa concentração, o Cremophor não apresenta efeito relaxante

ou contrátil significante em íleo de cobaia, de acordo com dados obtidos em

experimentos anteriores realizados em nosso laboratório.

No momento da realização dos experimentos, esta solução era diluída

de acordo com a exigência do protocolo. As concentrações das substâncias

para a realização dos experimentos foram escolhidas de acordo com o padrão

estabelecido no Laboratório de Farmacologia Funcional, onde estas são as

concentrações de 3 x 10-5 e 10-4 M consideradas concentrações submáxima e

máxima respectivamente para os testes in vitro. Se houver atividade

espasmolítica nessas concentrações numa potência superior a 50% de efeito

os experimentos serão realizados com diferentes concentrações das

substâncias, de modo a achar a concentração inicial que promove 0% de

52


relaxamento e a concentração final que promove o efeito máximo de

relaxamento, sendo adicionadas as cubas em incrementos de 3.

3.2.2 Triagem farmacológica

3.2.2.1 Efeito dos derivados sintéticos do lapachol e norlapachol frente às


cobaia

O íleo de cobaia era preparado de acordo com Daniel et al. (2001). Os

cobaias eram mantidos em jejum por um período de 18 horas (dando-lhe

somente água nesse período). Após este período os animais eram

eutanasiados por deslocamento cervical seguido de secção dos vasos

cervicais. O abdômen era aberto e um segmento do íleo de aproximadamente

15 cm de comprimento era retirado e colocado em uma placa de Petri contendo

solução nutritiva de Krebs modificado a 37 C sob aeração com carbogênio.

Após a dissecação, o segmento do íleo era seccionado em fragmentos de 2-3

cm de comprimento, suspensos individualmente em cubas de vidro (5 mL) e

deixados em repouso por 30 minutos, durante este período a solução nutritiva

era trocada a cada 15 minutos. Após o período de estabilização, era induzida

uma contração isotônica com KCl 40 mM para verificar a funcionalidade do

órgão. A preparação era lavada e após 15 minutos, eram induzidas duas

contrações isotônicas de magnitude similares com 10-6 M de CCh ou de

histamina. Os derivados sintéticos eram incubados por 15 minutos em

preparações diferentes e em diferentes concentrações, e na presença dos

mesmos era induzida uma terceira contração utilizando um dos agonistas. A

inibição da resposta submáxima de CCh e de histamina era avaliada por

comparação das respostas antes (controle) e após a adição dos derivados à

cuba. Os valores da CI50 eram obtidos por regressão não linear.

53


3.2.2.2 Efeito de UFRPE 112, UFRPE 107 e UFRPE 117 sobre as

contrações tônicas induzidas por KCl, CCh ou histamina

O íleo era montado como descrito no item 3.2.2.1. Após o período de

estabilização, uma contração submáxima, registrada utilizando transdutores

isométricos acoplados a um sistema de aquisição digital era obtida com 40 mM

de KCl, 10-5 M de CCh ou 10-6 M de histamina e durante a fase tônica

sustentada os compostos eram adicionados de maneira cumulativa à cuba e

em preparações diferentes. O relaxamento produzido pelos derivados sintéticos

que apresentaram maior potência frente às contrações fásicas foi expresso

como a porcentagem reversa da contração inicial produzida pelos agentes

contráteis. Os valores de CE50 foram expressos como a média erro padrão da

média (e.p.m.) dos valores individuais calculados pelo uso da regressão não

linear.

3.2.3 Investigação do mecanismo de ação relaxante de UFRPE 117 em íleo

de cobaia

3.2.3.1 Caracterização do bloqueio da contração induzida por histamina

Após o período de estabilização, era induzida uma contração isotônica

com KCl 40 mM para verificar a funcionalidade do órgão. A preparação era

lavada e, após 15 minutos, eram induzidas duas curvas concentrações-

resposta cumulativas similares à histamina (10-9 - 10-4 M). Em seguida, na

ausência da histamina, UFRPE 117 era incubado por 15 minutos em diferentes

concentrações e em experimentos independentes. Após este período, na

presença do composto, uma nova curva concentração-resposta cumulativa à

histamina era obtida. Os resultados foram avaliados comparando-se a

percentagem da resposta contrátil na presença do composto com aquela obtida

pela média das amplitudes máximas obtidas das curvas controle (100%), na

ausência do composto. O tipo de antagonismo exercido por UFRPE 117 foi

avaliado com base na análise dos valores da CE50 e dos valores do efeito

máximo (Emax) da histamina calculados a partir das curvas concentrações-

resposta, na ausência (controle) e na presença de UFRPE 117.

54


3.2.3.2 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito

relaxante de UFRPE 117

3.2.3.2.1 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por

histamina na presença de cloreto de césio (CsCl)


estabilização do órgão,era adicionado à cuba 5 mM de CsCl, um bloqueador

não seletivo dos canais de K+ (CECCHI et al., 1987), após 20 minutos na

presença do bloqueador era induzida uma contração com 10-6 M de histamina

e sob o componente tônico dessa contração era adicionado o composto

UFRPE 117 de forma cumulativa. O relaxamento produzido por UFRPE 117 foi

expresso como a percentagem reversa da contração inicial induzida pelo

agonista. Os valores de CE50 de UFRPE 117 foram calculados a partir das

curvas concentrações-resposta na presença do bloqueador e comparados com

os valores de CE50 de UFRPE 117 na ausência do bloqueador.

3.2.3.2.2 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por

histamina na presença de glibenclamida, apamina ou tetraetilamônio

(TEA+)


estabilização, era adicionado à cuba 10-5 M de glibenclamida, um bloqueador

seletivo dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP) (SUN; BENISHN, 1994),

100 nM de apamina, um bloqueador seletivo de canais de K+ ativados pelo

Ca2+ de pequena condutância (SKCa) (ISHII; MAYLIE; ADELMAN, 1997; VAN

DER STAAY et al., 1999) ou 1 mM de TEA+, que nessa concentração é um

bloqueador seletivo dos canais de K+ ativados pelo Ca2+ de grande condutância

(BKCa) (KNOT, BRAYDEN, NELSON, 1996), após 20 minutos na presença dos

bloqueadores, em preparações diferentes, uma contração com 10-6 M de

histamina era obtida. Em seguida o derivado UFRPE 117 era adicionado

cumulativamente sob o componente tônico da contração. O relaxamento

produzido por UFRPE 117 e seus valores de CE50 foram calculados a partir das

55


curvas concentrações-resposta na presença dos bloqueadores e comparados

com os valores de CE50 de UFRPE 117 na ausência do bloqueador.

3.3 Análise estatística

Todos os resultados obtidos foram expressos como média ± e.p.m. e

analisados estatisticamente empregando-se o teste t (não-pareado) ou análise

de variância (ANOVA) one-way seguido do pós-teste de Bonferroni e as

diferenças entre as médias foram consideradas significantes quando os valores

de p < 0,05. Como parâmetro de eficácia foi utilizado o efeito máximo (Emax) e

como parâmetro de potência foram utilizados as CE50 ou CI50. Os valores de

CE50 e CI50 foram calculados por regressão não linear para todos os

experimentos realizados(NEUBIG et al., 2003). Todos os resultados foram

analisados com auxílio do programa GraphPadPrism® versão 5.01 (GraphPad

Software Inc., San Diego CA, EUA).

4 Resultados

57

Silva, A.C.L. Resultados

4.1 Triagem farmacológica

4.1.1 Efeito dos derivados sintéticos do lapachol e norlapachol frente às

contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina em íleo de cobaia

O derivado UFRPE 31 (Gráfico 1A) não inibiu as contrações fásicas induzidas

por 10-6 M de CCh nas concentrações utilizadas (3x10-5 M e 10-4 M), já os compostos

UFRPE 15(Gráfico 2A), UFRPE 17 (Gráfico 3A), UFRPE 114 (Gráfico 4A), UFRPE

115 (Gráfico 5A), e UFRPE 116 (Gráfico 6A), inibiram as contrações fásicas

induzidas por 10-6 M de CCh apenas na concentração de 10-4 M, apresentando

Emax de 25,4 ± 5,3; 30,7 ± 6,7; 39,6 ± 4,5; 25,9 ± 2,7 e 30,7 ± 2,9% respectivamente

(n = 3);resultado semelhante foi observado para os derivados UFRPE 31(Gráfico

1B), UFRPE 15 (Gráfico 2B), UFRPE 114(Gráfico 4B), e UFRPE 116 (Gráfico 6B),

nas contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina com Emax de 35,6 ± 6,0,

37,6 ± 6,6; 39,7 ± 1,9 e 37,8 ± 2,9%, respectivamente (n = 3).

O derivado UFRPE 17 na concentração de 3x10-5 M, inibiu as contrações

fásicas induzidas por 10-6 M de histamina com Emax= 38,8 ± 6,2%, (n = 3) (Gráfico

3B). Já o derivado UFRPE 115 (Gráfico 5B), inibiu as contrações fásicas induzidas

por 10-6 M de histamina de maneira significante e dependente de concentração (10-5

M – 3x10-4 M) com CI50 = 8,3 ± 0,8 10-5 M e Emax= 93,4 ± 1,3 % (n = 5). Todos os

valores de CI50 e Emax dos derivados do lapachol são expressos na Tabela 2

Por sua vez, os compostos UFRPE 106 (Gráfico 7A) e UFRPE 107 apenas na

concentração de 10-4 M, inibiram as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de CCh

apresentando Emax de 36,4 ±4,4 e 29,8 ± 5,2 %, respectivamente (Gráfico 8A). O

composto UFRPE 113 (Gráfico 9A), inibiu as contrações fásicas induzidas por 10-6 M

de CCh nas concentrações de 3x10-5 M e 10-4 M apresentando Emax= 28,1 ± 2,8%

(n=3). Já os derivados UFRPE 111 (Gráfico 10A), UFRPE 112 (Gráfico 11A) e

UFRPE 117(Gráfico 12A), inibiram as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de

CCh de maneira dependente de concentração (3x10-6 M – 10-4 M) apresentando CI50

de 9,5 ± 0,08 x 10-5 ; 2,7 ± 0,4 x 10-5 e 4,2 ± 0,6 x 10-5 M e Emax de 89,9 ± 4,3; 97,2 ±

1,3 e 99,6 ± 0,4% respectivamente (n = 5).

O composto UFRPE 106 (Gráfico 7B), inibiu as contrações fásicas induzidas

por 10-6 M de histamina apenas na concentração de 10-4 M apresentando

Emax de 19,9 ± 2,2% (n = 3). Já os derivados UFRPE 107 (Gráfico 8B), UFRPE 111

58


(Gráfico 10B), UFRPE 112 (Gráfico 11B), UFRPE 113 (Gráfico 9B) e UFRPE 117

(Gráfico 12B) inibiram as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina de

maneira significante e dependente de concentração (10-5 - 3 x 10-4 M) apresentando

CI50 de 4,4 ± 0,6 x 10-5; 1,0 ± 0,02 x 10-4; 8,8 ± 0,02 x 10-5;8,1 ± 0,6 x 10-5 e 4,6 ± 0,6

x 10-5 M (n = 5) respectivamente. Todos os valores de CI50 e Emax dos derivados do

norlapachol são expressos na Tabela 3.

59


Gráfico 1- Efeito de UFRPE 31 frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de carbacol (A) e de histamina(B) em íleo de cobaia.

As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 3). ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. *p < 0,05 (controle vs.UFRPE 31).

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

UFRPE [31] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

*

[UFRPE 31] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

60



As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 3). ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. *p < 0,05 e **p < 0,01 (controle vs. UFRPE 15).

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

*

[UFRPE 15] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

**

[UFRPE 15] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

61


Gráfico 3- Efeito de UFRPE 17 frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de

carbacol (A) e de histamina(B) em íleo de cobaia.

As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 3). ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p < 0,001(controle vs. UFRPE 17).

Contr

ole-5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

**

[UFRPE 17] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

*

[UFRPE 17] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

62


Gráfico 4- Efeito de UFRPE 114 frente às contrações fásicas induzidas por 10-6 M de carbacol (A) e de histamina(B) em íleo de cobaia

As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 3). ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. ***p < 0,001 (controle vs. UFRPE 114).

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

[UFRPE 114] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

***

[UFRPE 114] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

63



carbacol (A) e de histamina(B) em íleo de cobaia

As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (A) n = 3 e (B) n = 5. ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. **p < 0,01 e ***p < 0,001 (controle vs. UFRPE 115).

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

**

[UFRPE 115] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

10-5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

[UFRPE115] M

***

***

***

B

Co

ntr

ação

(%

)

64





Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

[UFRPE 116] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

***

[UFRPE 116] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

65





Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

[UFRPE 106] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

***

[UFRPE 106] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

66




As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (A) n = 3 e (B) n = 5. ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. **p < 0,01 e ***p < 0,001 (controle vs. UFRPE 107).

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

[UFRPE 107] M

**

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

10-5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

***

***

[UFRPE 107] M

***

B

Co

ntr

ação

(%

)

67




As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (A) n = 3 e (B) n = 5.ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p < 0,001 (controle vs. UFRPE 113).

Contr

ole -5

3 x

10-4

10

0

25

50

75

100

**

***

[UFRPE 113] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

10-5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

[UFRPE 113] M

*

***

***

B

Co

ntr

ação

(%

)

68




Contr

ole -5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

[UFRPE 111] M

***

***

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

***

[UFRPE111] M

***

B

Co

ntr

ação

(%

)

69




As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 5). ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. *p < 0,05 e ***p < 0,001 (controle vs. UFRPE 112).

Contr

ole -6

3 x

10-5

10-5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

*

***

***

***

[UFRPE 112] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

[UFRPE 112] M

******

B

Co

ntr

ação

(%

)

70




As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 5). ANOVA one-way seguido do pós-teste de Bonferroni. **p < 0,01 e ***p < 0,001 (controle vs. UFRPE 117).

Contr

ole -5

10-5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

***

***

***

[UFRPE117] M

A

Co

ntr

ação

(%

)

Contr

ole -5

10-5

3 x

10-4

10-4

3 x

10

0

25

50

75

100

***

***

***

[UFRPE 117] M

B

Co

ntr

ação

(%

)

71


Tabela 2- Valores de Emax (%) e de CI50 (M) dos derivados do lapachol frente às contrações

fásicas induzidas por carbacol ou por histamina em íleo de cobaia.

Composto Carbacol Histamina

CI50 (M) Emax (%) CI50 (M) Emax (%)

UFRPE 15 Nd 25,5 ± 5,3 Nd 37,6 ± 6,6

UFRPE 17 Nd 30,7 ± 6,7 Nd 38,8 ± 6,2

UFRPE 31 Nd 0,0 Nd 35,6 ± 6,0

UFRPE 114 Nd 39,6 ± 4,5 Nd 39,7 ± 1,9

UFRPE 115 Nd 25,9 ± 2,7 8,3 ± 0,8 x 10-5 93,4 ± 1,3

UFRPE 116 Nd 30,7 ± 2,9 Nd 37,8 ± 2,9

Teste t, **p< 0,01 e ***p< 0,001 (CCh vs. histamina). Nd: não determinado. Fonte: Autor, 2014.

Tabela 3- Valores de Emax (%) e de CI50 (M) dos derivados do norlapachol frente às

contrações fásicas induzidas por carbacol ou por histamina em íleo de cobaia.

Composto Carbacol Histamina

CI50 (M) Emax (%) CI50 (M) Emax (%)

UFRPE 106 Nd 36,4 ± 4,4 Nd 19,9 ± 2,2

UFRPE 107 Nd 29,8 ± 5,2 4,4 ± 0,6 x10-5 95,8 ± 1,6

UFRPE 111 9,5 ± 0,08 10-5 89,9 ± 4,3 1,0 ± 0,02 x 10-4** 92,7 ± 4,4

UFRPE 112 2,7 ± 0,4 x 10-5 97,2 ± 1,3 8,8 ± 0,02 x 10-5 *** 96,3 ± 1,4

UFRPE 113 Nd 28,1 ± 2,8 8,1 ± 0,6 x10-5 97,5 ± 1,2

UFRPE 117 4,2 ± 0,6 x 10-5 99,6 ± 0,4 4,6 ± 0,6 x10-5 99,6 ± 0,4

Teste t, **p< 0,01 e ***p< 0,001 (CCh vs. histamina). Nd: não determinado. Fonte: Autor, 2014.

4.1.2 Efeito dos derivados sintéticos, UFRPE 112, UFRPE 107 e UFRPE 117,

sobre as contrações tônicas induzidas por KCl, por carbacol ou por histamina

O composto UFRPE 112 (10-7- 3x10-4 M, n = 5) relaxou de maneira

dependente de concentração e significante o íleo de cobaia (Figura 11)

pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50= 3,4 ± 0,2 x 10-5 M e Emax = 90,5 ± 1,2%) e

com 10–5 M de CCh (CE50 = 4,7 ± 1,1 x 10-6 M e Emax = 100%)(Gráfico 13). De

maneira semelhante, o composto UFRPE 107 (10-7 - 3 x 10-4 M, n = 5) relaxou de

maneira dependente de concentração e significante o íleo de cobaia (Figura 12)

pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50= 3,9 ± 0,5 x 10-5 M e Emax= 93,8 ± 2,0%) e

por 10–6 M de histamina (CE50 = 1,5 ± 0,5 x 10-5 M e Emax= 99,6 ± 0,4%) (Gráfico 14).

De maneira semelhante, o composto UFRPE 117 (10-8- 10-4 M, n = 5)

relaxou de maneira significante e dependente de concentração o íleo de cobaia

(Figura 13) pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50= 3,3 ± 0,8 x 10-5 M e

72


Emax = 91,6± 3,7%) e por 10–6 M de histamina (CE50= 4,2 ± 0,9 x 10-6 M e

Emax = 100%) (Gráfico 15).

Figura 11 - Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 112 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-5 M de carbacol (B) em íleo de cobaia.

CCh = carbacol e as setas para baixo representam as concentrações cumulativas de

UFRPE 112, respectivamente.

Fonte: Autor, 2014.

A

B

B

73


Gráfico 13 – Efeito de UFRPE 112 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (■) e 10-5 M de CCh (□)em íleo de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, n = 5.

-7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 112] M

Rela

xam

en

to (

%)

74


Figura 12 - Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 107 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de histamina (B) em íleo de cobaia.

hist = histamina e as setas para baixo representam as concentrações cumulativas de UFRPE 107, respectivamente. Fonte: Autor, 2014.

A

B

75


Gráfico 14 – Efeito de UFRPE 107 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl () e 10-6 M de histamina (○)em íleo de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente(n = 5).

-7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 107] M

Rela

xam

en

to (

%)

76


Figura 13 - Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6M de histamina (B) em íleo de cobaia.

Hiist = histamina e as setas para baixo representam as concentrações cumulativas de UFRPE 117, respectivamente. Fonte: Autor, 2014.

A

A

B

B

77


Gráfico 15 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl () e 10-6 M de histamina () em íleo de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5.)

4.2 Investigação do mecanismo de ação relaxante de UFRPE 117 em íleo de

cobaia

4.2.1 Caracterização do bloqueio da contração induzida por histamina

O composto UFRPE 117 (10-5,3 x 10-5, 10-4 e 3 x 10-4 M, n = 5) inibiu de

maneira significante e dependente de concentração as contrações induzidas por

histamina (Gráfico 16). As curvas cumulativas à histamina foram desviadas para a

direita de forma não paralela e com redução do Emax de 100% (controle) para70,0 ±

6,8; 52,4 ± 10,2; 26,9 ± 6,3 e 5,5 ± 2,2% respectivamente. Os valores de CE50 da

histamina passaram de 2,9 ± 0,5 x 10-7 M (controle) para 5,8 ± 1,1,8,2 ± 1,3 e 3,9 ±

0,8 x 10-7M, nas concentrações de 10-5,3 x 10-5e 10-4 M respectivamente.

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 117] M

Rela

xam

en

to (

%)

78


Gráfico 16 –Curvas concentrações-resposta cumulativas à histamina na ausência (controle)

() e na presença de UFRPE 117 nas concentrações de 3 x 10-6(□);10-5();3 x 10-5(○);

10-4() e 3 x 10-4 M () em íleo de cobaia.

4.2.2 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante de

UFRPE 117 em íleo de cobaia

4.2.2.1 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por

histamina na presença de cloreto de césio

O composto UFRPE 117 relaxou o íleo de cobaia pré-contraído por 10-6 M de

histamina na ausência (10-8- 10-4 M, n = 5) e na presença (10-8- 3 x 10-4 M, n = 5) de

5 mM de CsCl, um bloqueador não seletivo dos canais de potássio (Figura 14). A

potência relaxante de UFRPE 117 (CE50 = 5,1 ± 0,7 x 10-5 M ) na presença de CsCl

foi reduzida em 12 vezes quando comparada ao relaxamento produzido por UFRPE

117 na ausência de CsCl (CE50 = 4,2 ± 0,9 x 10-6 M), bem como sua eficácia foi

atenuada na presença de CsCl (Emax= 90,9 ± 2,5%) (Gráfico 17).

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0

25

50

75

100

Log [histamina] M

Co

ntr

ação

(%

)

79


Figura 14 – Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 5 mM de CsCl em íleo de cobaia.

‘

Hist = Histamina e as setas para baixo representam a adição cumulativa de UFRPE 117. Fonte: Autor, 2014.

A

B

80


Gráfico 17 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 5 mM de CsCl, em íleo de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 5).

4.2.2.2 Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por

histamina na presença de glibenclamida, apamina ou tetraetilamônio (TEA+)

O composto UFRPE 117 (10-8- 3 x 10-4 M) relaxou o íleo de cobaia pré-

contraído por 10-6 M de histamina de maneira significante e dependente de

concentração tanto na ausência (controle) como na presença (10-8 - 3 x 10-4 M) de

diferentes bloqueadores seletivos de canais de potássio.

Na presença de 10-5 M de glibenclamida (bloqueador seletivo dos KATP) a

curva de relaxamento não foi atenuada quando comparada a curva controle (Figura

15 e Gráfico 18). Diferentemente na presença de 100 nM de apamina (bloqueador

seletivo dos SKCa) e de 1 mM de TEA+ (nessa concentração, bloqueador seletivo dos

BKCa) as curvas controle do UFRPE 117 foram desviadas para a direita de maneira

significante (Figuras 17 e 18, Gráficos 19 e 20, respectivamente).

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 117] M

Rela

xam

en

to (

%)

81


Observa-se que a potência relaxante de UFRPE 117

(CE50 = 4,2 ± 0,9 x 10-6 M, n = 5) não foi reduzida na presença de 10-5 M de

glibenclamida, bloqueador seletivo dos KATP (CE50 = 4,6 ± 0,8 x 10-6 M) , enquanto

que, na presença de 100 nM de apamina, bloqueador seletivo dos SKCa,

(CE50 = 1,7 ± 0,06 x 10-5 M, n = 4) ou 1 mM de TEA+, (CE50 = 2,0 ± 0,4 x 10-5 M

n = 4), a potência relaxante reduzida em cerca de 4 vezes na presença de apamina

e cerca de 5 vezes na presença de 1 mM de TEA+, bem como sua eficácia

farmacológica também foi reduzida na presença desses bloqueadores(Gráfico 21).

82


Figura 15 – Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 10-5 M de glibenclamida em íleo de cobaia

.

Hist = Histamina e Glib = glibenclamida, as setas para baixo representam a adição

cumulativa de UFRPE 117

Fonte: Autor, 2014.

A

B

83


Gráfico 18 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 10-5 M de glibenclamida em íleo de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente, (n = 5).

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 117] M

Rela

xam

en

to (

%)

84


Figura 16 – Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 100 nM de apamina em íleo de cobaia.

Hist. = Histamina e as setas para baixo representam a adição cumulativa de UFRPE 117.

Fonte: Autor, 2014.

A

B

85


Gráfico 19- Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por

10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 100 nM apamina em íleo de

cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente.

Controle (n = 5) e apamina (n = 3).

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 117] M

Rela

xam

en

to (

%)

86


Figura 17 – Registros típicos do efeito relaxante de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença (B) de 1 mM de TEA+ em íleo de cobaia.

Hist. = Histamina e as setas para baixo representam a adição cumulativa de UFRPE 117

Fonte: Autor, 2014.

A

B

87


Gráfico 20 – Efeito de UFRPE 117 sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 1 mM de TEA+ em íleo de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente.

Controle.(n = 5) e TEA+ (n = 4).

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

25

50

75

100

log [UFRPE 117] M

Rela

xam

en

to (

%)

88


Gráfico 21 – Valores de CE50 (M) de UFRPE117 na ausência (controle) e na presença de bloqueadores de canais de K+ em íleo de cobaia.

CsCl = cloreto de césio, TEA+ = íon tetraetilamônio. Teste t, **p < 0,01; ***p < 0,001 (controle

vs. presença de bloqueadores de canais de potássio)

hista

min

a

CsC

l

gliben

clam

ida

apam

ina

1 m

M

+

TEA

0

1.010-5

2.010-5

3.010-5

4.010-5

5.010-5

6.010-5

Histamina

***

***

**

CE

50

(M)

5 Discussão

90

Silva, A.C.L. Discussão

O modelo do músculo liso intestinal é um meio importante para se investigar o

efeito e os mecanismos de ação de substâncias que possam ser utilizadas em

processos fisiopatológicos, como diarréias e cólicas intestinais. Neste trabalho foi

descrito pela primeira vez o efeito espasmolítico de uma nova série de derivados

sintéticos tendo como moléculas precursoras o lapachol e e o norlapachol.

Tanto o lapachol, quanto os seus derivados naturais e sintéticos, tem sido

alvo de constante interesse farmacológico devido à variedade de atividades

biológicas que essas substâncias apresentam. Uma vez que já é relatado na

literatura que o lapachol e alguns derivados tanto naturais quanto sintéticos

apresentam efeito espasmolítico em diferentes modelos de músculo liso (BAE et al.,

2011) inclusive em íleo de cobaia, fomos investigar neste trabalho se esta nova série

derivados do lapachol e do norlapachol chamados de derivados do núcleo fenazina,

apresentariam efeito espasmolítico em íleo de cobaia, uma vez que em estudos

realizados anteriormente em nosso laboratório neste modelo de músculo liso

(CAVALCANTE et al., 2008; CAVALCANTE et al., 2010), um de seus precursores, o

lapachol, apresentou efeito espasmolítico e o norlapachol que é um derivado

sintético do lapachol não apresentou este efeito.

Em íleo de cobaia, vários agentes contráteis, como os agonistas

muscarínicos, a histamina (TRIGGLE et al., 1989) e o KCl (TRIGGLE; TRIGGLE,

1976; HURWITZ et al., 1980), causam uma resposta contrátil bifásica que consiste

em uma contração inicial transiente, chamada componente fásico onde este dura

menos que 30s, seguido de uma contração sustentada denominada componente

tônico, onde este se desenvolve lentamente ao longo de 15 minutos e é mantido

durante o período de exposição ao agente contrátil (TRIGGLE; TRIGGLE, 1976;

BOLTON, 1979; VAN BREEMEN; AARONSON; LOUTZENHISER, 1979).

Esta resposta bifásica observada é devido à fonte dual de Ca2+ no músculo

liso. É sugerido que a contração fásica é causada por liberação de Ca2+ dos

estoques intracelulares mediados por IP3 (ABDELLATIF, 1989; KOBAYASHI et al.,

1989), enquanto que a contração tônica é atribuída ao influxo de Ca2+ através dos

canais para cálcio dependentes de voltagem (CaV), uma vez que a contração tônica

é suprimida pelo bloqueador de CaV, verapamil (JIM et al., 1981).

Diante dessas premissas, primeiramente realizou-se uma triagem

farmacológica, onde foi investigado se os derivados sintéticos do lapachol (UFRPE

91


15, UFRPE 17, UFRPE 31, UFRPE 114, UFRPE 115 e UFRPE 116) e do

norlapachol (UFRPE 106, UFRPE 107, UFRPE 111, UFRPE 112, UFRPE 113 e

UFRPE 117) inibiriam as contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina no

íleo de cobaia.

Em estudos realizados anteriormente (CAVALCANTE et al., 2008) observou

que o lapachol apresentou atividade espasmolítica em íleo de cobaia, onde esse

composto foi capaz de inibir tanto as contrações fásicas induzidas por CCh (CI50 =

1,5 ± 0,2 x 10-4 ) quanto por histamina (CI50 = 3,6 ± 0,5 x 10-5 ). Na triagem

farmacológica realizada, os resultados obtidos mostraram que quando as contrações

eram induzidas por carbacol, todos os novos derivados sintéticos do lapachol

apresentaram efeito inibitório com baixa eficácia espasmolítica, resultados

semelhantes foram observados para os compostos derivados do lapachol UFRPE

31, UFRPE 15, UFRPE 17, UFRPE 114 e UFRPE 116 frente às contrações fásicas

induzidas por histamina, onde os mesmos apresentaram efeito espasmolítico

significante em inibir estas contrações, no entanto não ultrapassaram 40% de

inibição mesmo nas maiores concentrações utilizadas (Tabela 2), mostrando

novamente que as modificações estruturais realizadas na molécula do lapachol

levaram a uma diminuição do efeito espasmolítico do lapachol em inibir as

contrações fásicas induzidas por histamina.

Interessantemente, o composto UFRPE 115 inibiu as contrações induzidas

por histamina (CI50= 8,3 ± 0,8 x 10-5 M) porém com uma potência farmacológica

cerca de 2 vezes menor, comparado ao efeito do lapachol em inibir as mesmas

contrações (CI50= 3,6±0,5 x 10-5 M; CAVALCANTE, 2008). Sugerindo assim que as

modificações estruturais realizadas na molécula do lapachol para formar novos

compostos nitrogenados, levaram a uma diminuição do efeito espasmolítico

apresentado pelo lapachol anteriormente, e isso pode ser atribuído a presença de

dois grupos prenila que estão posicionados próximos a cadeia lateral alifática que

está ligada ao núcleo fenazina. A presença desses dois grupos prenila que são

volumosos, pode resultar em um impedimento estérico, levando assim, a uma

possível diminuição da interação da cadeia lateral alifática com o alvo receptor e

consequente diminuição da atividade farmacológica. .

Em se tratando dos novos compostos derivados do norlapachol, que é um

derivado sintético não nitrogenado do lapachol, os derivados nitrogenados UFRPE

92


106, UFRPE 107 e UFRPE 113 apresentaram efeito espasmolítico significante em

inibir as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de CCh, porém com baixa eficácia

farmacológica, uma vez que seus efeitos não ultrapassaram 40% de inibição mesmo

em altas concentrações, de maneira interessante foi observado que apenas os

derivados UFRPE 111, UFRPE 112 e UFRPE 117 inibiram as contrações fásicas

induzidas por 10-6 M de CCh de maneira dependente de concentração com Emax

superior a 90% de inibição, e ao analisar os valores de CI50 para estes 3 compostos

(Tabela 3) pode-se observar que os compostos UFRPE 112 e UFRPE 117 foram os

mais potentes em inibir as contrações frente ao agonista carbacol, comparado aos

outros dois compostos.

Quando as contrações eram induzidas por 10-6 M histamina, o derivado

UFRPE 106 apresentou uma baixa eficácia farmacológica, diferentemente, os

demais compostos (UFRPE 107, UFRPE 111, UFRPE 112, UFRPE 113 e UFRPE

117) inibiram as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina de maneira

dependente de concentração e com Emax superior a 90% de inibição, ao analisar os

valores de CI50 para estes 5 compostos (Tabela 3) observa-se que os compostos

UFRPE 107 e UFRPE 117 foram os mais potentes em inibir essas contrações,

mostrando que as modificações estruturais no norlapachol foram essenciais para o

aumento na potência relativa destes derivados, e este é um achado muito

importante, uma vez que em estudos anteriores realizados por CAVALCANTE et al.,

2010, o norlapachol inibiu fásicas induzidas tanto por CCh quanto por histamina em

íleo de cobaia com uma eficácia farmacológica baixa, inferior a 35%.

Ao analisarmos as estruturas dos derivados do norlapachol, podemos notar

que a perda de um carbono dos grupamentos prenila torna esses substituintes

menos volumosos, fazendo com que a cadeia lateral alifática ligada ao núcleo

fenazina , ficasse mais exposta. A ausência de um possível impedimento estérico

levou a uma possibilidade maior de interação dessa cadeia com o alvo receptor,

resultando em uma maior potência farmacológica desses derivados em relação ao

seu precursor, o norlapachol.

Dessa forma, ao final da triagem farmacológica, analisando os valores de CI50

pode-se observar que os compostos UFRPE 107, UFRPE 112 e UFRPE 117

apresentaram-se como os de maior potência farmacológica em inibir as contrações

fásicas induzidas por CCh e/ou histamina em íleo isolado de cobaia em relação a

93


série testada (Tabela 3) e ainda que o UFRPE 107 apresentou uma maior

seletividade e potência em inibir as contrações induzidas por histamina, que o

UFRPE 112 inibiu as contrações fásicas induzidas tanto por CCh quanto por

histamina, sendo o mais potente em inibir as contrações induzidas por CCh e que o

UFRPE 117 demonstrou ser equipotente em inibir as contrações induzidas pelos

dois agonistas. Ao analisar a estrutura química dos três compostos, observou-se que

os 3 possuem a cadeia lateral alifática mais extensa que os outros compostos, além

da presença da hidroxila, sugerindo assim que esse grupamento é importante para o

efeito observado. Diante desses resultados prosseguimos com a avaliação do efeito

relaxante desses 3 compostos no íleo de cobaia pré-contraído por agentes

diferentes agentes contráteis.

No músculo liso de íleo de cobaia, tanto a contração fásica como a tônica são

dependes do Ca2+ extracelular, uma vez que ambas as contrações foram inibidas na

ausência de Ca2+ extracelular (HONDA; TAKANO; KAMIYA, 1996). A remoção de

íons Ca2+ do meio externo bloqueia totalmente a resposta contrátil tanto a agentes

despolarizantes como a agonistas em poucos segundos, sugerindo que as fontes

intracelulares de Ca2+ não contribuem significativamente para o nível de tensão

atingido (NOUAILHETAS et al., 1985). No entanto, a influência do Ca2+ extracelular é

relativamente maior na resposta contrátil tônica comparado com a fásica (TRIGGLE

et al., 1979).

O íleo é um órgão totalmente dependente de variação do potencial de

membrana (NOUAILHETAS et al., 1985) e como o componente tônico da contração

induzida por agonistas de acoplamento misto (UNNO; KOMORI; OHASHI, 1995;

BOLTON et al., 1981) ou por um agente despolarizante (KCl) é mantido quase que

exclusivamente por influxo de cálcio através dos CaV (BOLTON, 1979; REMBOLD,

1996; BOLTON et al., 2006), nos questionamos se estes compostos poderiam estar

agindo por bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV, ou se estes poderiam estar

levando a uma ativação de canais de K+ promovendo hiperpolarização resultando

em um bloqueio indireto dos Cav.

Como os mecanismos envolvidos na manutenção da fase tônica da contração

diferem daqueles da fase fásica em íleo isolado (ABDELLATIF, 1989; KOBAYASHI

et al., 1989; HONDA; TAKANO; KAMIYA, 1996), resolveu-se verificar se os

94


compostos UFRPE 107, UFRPE 112 e UFRPE 117 além de promover efeito

espasmolítico em inibir as contrações fásicas, ainda promoveriam o relaxamento do

íleo isolado de cobaia pré-contraído com KCl, um agente despolarizante que age

levando o músculo liso a contração por um mecanismo eletromecânico, por carbacol

ou por histamina, ambos agindo por um acoplamento do tipo misto (BOLTON et al.,

1981).

Observou-se que os três derivados, UFRPE 112 (Gráfico 13), UFRPE 107

(Gráfico 14) e UFRPE 117 (Gráfico 15) relaxaram o íleo de cobaia pré-contraído com

KCl, com CCh ou com histamina. Entretanto, ao analisar os valores de CE50

observou-se que os três compostos foram menos potentes em relaxar o órgão pré-

contraído com KCl comparados com os agonistas (CCh ou histamina).

Tendo em vista que um dos objetivos desse estudo foi comparar as eficácias

e potências dos compostos testados, evidenciou-se que o derivado UFRPE 117

apresentou os melhores parâmetros farmacológicos o qual além de inibir as

contrações fásicas induzidas por histamina (CI50= 4,6 ± 0,6 x10-5 M), relaxou o órgão

pré-contraído com o mesmo agonista com uma maior potência (CE50= 4,2 ± 0,9x10-6

M) e apresentou sua potência relaxante diminuída quando o íleo era pré-contraído

com 40mM de KCl (CE50 = 3,3 ± 0,8 x 10-5 M), assim decidiu-se prosseguir com o

estudo utilizando esse composto para se elucidar seu possível mecanismo de ação

envolvido na atividade espasmolítica, com a finalidade de descobrir drogas com um

maior potencial terapêutico ou que venham a servir como ferramenta farmacológica

para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nos processos

fisiopatológicos envolvendo a musculatura lisa intestinal. ,

Como UFRPE 117 apresentou uma maior potência em relaxar o órgão pré-

contraído por histamina e o mesmo também inibiu as contrações induzidas por esse

agonista, levantou-se a hipótese de que o mesmo estaria agindo nos receptores

histaminérgicos (H1) para promover sua ação espasmolítica. Para verificar essa

hipótese, decidiu-se caracterizar o tipo de antagonismo exercido pelo composto

frente às curvas concentrações-respostas cumulativas induzidas por histamina.

Nesse protocolo experimental, observou-se um desvio para direita das curvas

controle cumulativas à histamina, de forma não paralela e com redução do Emax

(Gráfico 16), caracterizando dessa forma, um antagonismo do tipo não competitivo.

95


O antagonismo do tipo não competitivo pode ocorrer quando existe a ligação

do antagonista ao mesmo sítio de ligação do agonista (antagonismo

pseudo-irreversível) ou em um sítio distinto (antagonismo alostérico)

(BLUMENTHAL, GARRISON, 2011). O perfil do Gráfico 16 representa um

antagonismo pseudo-irreversível, uma vez que a inibição da resposta contrátil da

histamina na presença do UFRPE 117 não atingiu um valor limitante, característica

observada no antagonismo alostérico.

Os canais de K+ são reguladores chave do tônus do músculo liso e da

atividade , e o aumento na sua atividade resulta em hiperpolarização da membrana

da célula, além disso onde o fluxo dos íons por canais presentes na membrana

plasmática regulam o influxo de Ca2+ através dos CaV e consequentemente a

contração do músculo liso (THORNELOE; NELSON, 2005).

Substâncias espasmolíticas podem promover seus efeitos por mecanismos

dependentes da abertura de canais para K+, onde essa abertura causa uma

hiperpolarização da membrana e leva à inibição dos canais de cálcio dependentes

de voltagem (Cav), diminuindo o influxo de cálcio e reduzindo a [Ca2+]c levando o

músculo ao relaxamento (WESTON; EDWARDS, 1992). É relatado na literatura que

substâncias ativadoras de canais para K+ são menos potentes em relaxar o músculo

liso quando o músculo se encontra estimulado por altas [K+]e, enquanto que as

substâncias bloqueadoras de canais para Ca2+ são mais potentes quando este

músculo está estimulado por altas [K+]e (GURNEY, 1994) e que ativadores de

canais de K+ são substâncias que incluem um grupo de diversas moléculas com um

largo potencial terapêutico (QUEST, 1992; EMPFIELD; RUSSELL; TRAINOR, 1995).

Diante dessas premissas e associado ao fato de que UFRPE 117 foi menos

potente em relaxar o íleo pré-contraído por 40 mM de KCl, hipotetizou-se que este

composto estaria modulando positivamente os canais de K+ para exercer seu efeito

relaxante. Para comprovar essa possibilidade, utilizou-se como ferramenta

farmacológica um bloqueador não seletivo desses canais, o CsCl (KNOT;

BRAYDEN; NELSON, 1996). Ao analisarmos o resultado, observou-se que o efeito

relaxante do composto UFRPE 117 foi atenuado na presença de 5 mM de CsCl,

tendo a sua potência relaxante diminuída em cerca de 12 vezes (Gráfico 17).

Sugerindo assim, a participação desses canais na atividade espasmolítica do

composto UFRPE 117 em íleo de cobaia.

96


Uma vez que o tônus do músculo liso gastrintestinal pode ser regulado por

vários subtipos de canais de K+, entre eles: os KCa, os KATP, e os KV (VOGALIS,

2000), decidiu-se investigar quais subtipo(s) de canais de K+ que estariam sendo

modulados por esse derivado do norlapachol.

Os KATP, canais de K+ ativados por uma diminuição na concentração

intercelular de ATP, foram inicialmente identificados em miócitos ventriculares

(NOMA, 1983). Posteriormente, os KATP com características semelhantes foram

demonstrados em outros tecidos, tais como, células β-pancreáticas, músculo

esquelético, neurônios e músculos lisos (TERAMOTO, 2006). Esse canal tanto pode

ser inibido por ATP intracelular como por sulfonilureias como, por exemplo, a

glibenclamida e a tolbutamida, e por baixa concentração de Ba2+ extracelular

(STANDEN et al., 1989; SANBORN, 2000). Sun e Benishin (1994) mostraram que os

KATP estão presentes em músculo longitudinal de íleo de cobaia, pois a cromacalina,

nicorandil e pinacidil, ativadores desses canais, foram capazes de inibir as

contrações tônicas induzidas por histamina (0,5 M) ou por KCl (30 mM).

Para verificar a hipótese de que o composto UFRPE 117 poderia estar

ativando os canais KATP para exercer seu efeito relaxante em íleo de cobaia, avaliou-

se a atividade espasmolítica do mesmo na ausência e na presença de

glibenclamida, um bloqueador seletivo desses canais (SUN; BENISHIN, 1994).

Como o efeito relaxante de UFRPE 117 não foi alterado na presença de

glibenclamida, (Gráfico 18), essa hipótese foi descartada, demonstrando a não

participação dos KATP neste efeito.

Outra família de canais de K+ existente é a dos canais para K+ ativados por

Ca2+ (KCa). Estes contribuem para a repolarização do potencial de ação e são

divididos em três grandes famílias com base em suas condutância, cinética e

farmacologia: 1) canais de K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa), são

bloqueados por apamina; 2) canais de K+ ativados por Ca2+ de condutância

intermediária (IKCa) bloqueados pelo clotrimazole, e 3) canais de K+ ativados por

Ca2+ de larga condutância (BKCa) que são bloqueados por toxinas, como

caribdotoxina e iberiotoxina, ou por baixas concentrações de TEA+(SAH; FABER,

2002).

Os KCa estão presentes no músculo liso gastrintestinal e uma vez ativados,

pelo aumento da [Ca2+]c, dão início ao efluxo dos íons K+ que via

97


repolarização/hiperpolarização do potencial de membrana restabelece as [Ca2+]c

através da limitação do influxo do íon Ca2+ seja pela desativação dos CaV ou pelo

aumento da atividade do trocador Na+/Ca2+ (FAKLER; ADELMAN, 2008).

Os canais KCa1.1 ou BKCa são encontrados em cérebro, cóclea, músculo

esquelético e músculo liso. Já os KCa2.1; 2.2 e 2.3 ou SKCa são largamente

encontrados em cérebro, coração e alguns tipos de músculo liso. Os canais de K+

ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa) estão constitutivamente

associados a CaM, que medeia a abertura do canal através da ligação com o

Ca2+(BERKEFELD; FAKLER; SCHULTE, 2010). Os SKCa geram uma corrente

hiperpolarizante em células excitáveis após a geração do potencial de ação, e assim

levam ao relaxamento do músculo liso (BERKEFELD; FAKLER; SCHULTE, 2010;

BRAINARD; KOROVKINA; ENGLAND, 2007).

Assim, com o objetivo de investigar se UFRPE 117 estaria modulando

positivamente os SKCa para relaxar o íleo de cobaia, utilizou-se a apamina, um

bloqueador seletivo desses subtipos de canais (ISHII; MAYLIE; ADELMAN, 1997;

VAN DER STAAY et al., 1999), como ferramenta farmacológica. A curva de

relaxamento de UFRPE 117 (CE50 = 4,2 ± 0,9 x 10-6 M) foi deslocada para a direita

na presença de 100nM de apamina (CE50 = 1,7 ± 0,06 x 10-5 M) com redução da

potência relaxante em cerca de 4 vezes (Gráfico 18). Confirmando assim, a

participação dos canais SKCa na atividade espasmolítica do composto UFRPE 117

(Gráfico 19).

Em processos fisiológicos, a ativação dos BKCa provê um mecanismo de

feedback que limita a contração por causar hiperpolarização e redução da duração

do potencial de ação no músculo liso, limitando a entrada de Ca2+ através dos CaV

(PONTE et al., 2012). Romero et al. (1998), utilizando a técnica de patch-clamp,

caracterizaram uma população de BKCa que são indiretamente ativados pela

angiotensina II, um agonista contrátil que induz dessensibilização do componente

tônico da contração em íleo de cobaia. Posteriormente, Silva, Nouailhetas e

Aboulafia (1999) demonstraram que a dessensibilização do componente tônico

induzida pela angiotensina II era devido à abertura dos BKCa, levando a uma

repolarização e, consequentemente, fechando os CaV responsáveis pelo influxo de

Ca2+ que sustenta o componente tônico da contração em íleo de cobaia.

98


Então diante dessas premissas, passamos a investigar se o composto

UFRPE 117 estaria agindo sobre os canais BKCa, ativando-os e consequentemente

levando a uma repolarização de membrana o que levaria a um bloqueio indireto dos

CaV. Em presença de 1 mM de TEA+, uma concentração específica para bloquear

apenas os BKCa (LATORRE et al., 1989; KNOT; BRAYDEN; NELSON, 1996), a

curva de relaxamento de UFRPE 117 (CE50 = 4,2 ± 0,9 x 10-6 M) foi deslocada para a

direita na presença de 1 mM de TEA+(CE50 = 2,0 ± 0,4 x 10-5 M), e sua a potência

relaxante foi reduzida cerca de 5 vezes na presença do bloqueador, indicando assim

a participação dos BKCa, no efeito relaxante de UFRPE 117 em íleo de cobaia

(Gráfico 20).

Outros subtipos de canais de K+ não investigados neste trabalho, como os

Kv, podem estar envolvidos nesse efeito relaxante, bem como outras vias de

sinalização relacionadas ao relaxamento do músculo liso, com a dos nucleotídeos

cíclicos ou RhoA/RhoK, que podem estar envolvidas nesse mecanismo de ação

espasmolítica do composto.

Diante dos resultados expostos, neste trabalho foi descrito pela primeira vez

o efeito espasmolítico de uma nova série de derivados sintéticos do lapachol e do

norlapachol. Um dos resultados mais relevantes desse estudo, mostrou que as

modificações estruturais nas moléculas do lapachol e norlapachol foi fundamental

para a diminuição ou aumento dessa atividade espasmolítica. Além disso, foi

possível comparar as potências e eficácias farmacológicas dos 12 compostos,

mostrando quais os mais potentes, permitindo inferir pela análise das estruturas

químicas das moléculas, os possíveis grupamentos responsáveis por esse efeito.

Evidenciou-se que o mecanismo de ação espasmolítica de UFRPE 117, um

novo derivado sintético do norlapachol, em íleo de cobaia se dá através de um

antagonismo não-competitivo dos receptores de histamina e da modulação positiva

dos canais de K+, em especial dos subtipos SKCa e BKCa, o que ocasiona uma

hiperpolarização de membrana com consequente fechamento dos CaV e provável

redução da [Ca2+]c que leva ao relaxamento da musculatura lisa intestinal(Figura 18),

mostrando que os derivados do norlapachol são moléculas promissoras para serem

utilizadas em doenças associadas a alterações na motilidade intestinal, sendo

necessários mais estudos para confirmar o seu uso.

99


Figura 18 – Proposta de mecanismo de ação espasmolítica para o derivado sintético

do norlapachol UFRPE 117 em íleo isolado de cobaia.

N

N

O

OH

OH

O mecanismo de ação espasmolítica de UFRPE 117em íleo de cobaia, envolve um antagonismo do tipo não competitivo dos receptores histaminérgicos (1) e uma modulação positiva dos canais de K+, particularmente os dos subtipos SKCa e BKCa (2) hiperpolarizando as células intestinais, resultando em um bloqueio indireto dos Cav1 (3), resultando na redução da [Ca2+]c (4) e, consequentemente, relaxamento desse órgão. As definições das abreviaturas estão presentes na lista de abreviaturas e no texto. Fonte: Autor, 2014.

UFRPE 117

6 Conclusão

101

Na investigação do efeito espasmolítico de novos derivados

sintéticos do lapachol e do norlapachol em íleo isolado de cobaia

concluímos que:

Os derivados do lapachol (UFRPE 15, UFRPE 17, UFRPE 31, UFRPE

114, UFRPE 115 e UFRPE 116) apresentaram efeito antiespasmódico,

porém com baixa eficácia farmacológica com relação ao seu precursor.

Os derivados do norlapachol (UFRPE 106, UFRPE 107, UFRPE 111,

UFRPE 112, UFRPE 113 e UFRPE 117) apresentaram efeito

antiespasmódico com uma maior potência e eficácia farmacológicas

quando comparados ao seu precursor

Os compostos UFRPE 107, UFRPE 112 e UFRPE 117 relaxaram o íleo

de cobaia de maneira dependente de concentração.

O composto UFRPE 117 mostrou ser o mais promissor dos derivados

testados, apresentando uma maior potência e eficácia farmacológica

No estudo do mecanismo de ação espasmolítica do composto

UFRPE 117 em íleo de cobaia, concluiu-se que:

Exerce um antagonismo do tipo não competitivo pseudo-

irreversível dos receptores histaminérgicos

Envolve a modulação positiva dos canais de K+

Havendo a participação dos subtipos de canais de potássio

envolvidos SKCa e BKCa

Referências

103

Silva, A.C.L. Referências

ABDEL-LATIF, A. A. Calcium mobilizing receptors, polyphospholinositides, generation of second messengers and contraction in mammalian smooth muscle: historical perspectives and current status. Life Science,v. 45, p. 757 – 786, 1989.

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Anexo

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Silva, A.C.L. Anexo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA … · 2018. 9. 6. · A vida sempre nos mostra que não estamos nunca sozinhos, agradeço a alguns que surgiram em minha vida