UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO

RAYANNE DE ARAÚJO TORRES

EFEITO PREVENTIVO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA PELE

DO FRUTO DE Syzygium cumini (L.) Skeels SOBRE ALTERAÇÕES

INDUZIDAS PELO CONSUMO DE DIETA HIPERCALÓRICA EM

RATOS

JOÃO PESSOA

2015

RAYANNE DE ARAÚJO TORRES

EFEITO PREVENTIVO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA PELE

DO FRUTO DE Syzygium cumini (L.) Skeels SOBRE ALTERAÇÕES

INDUZIDAS PELO CONSUMO DE DIETA HIPERCALÓRICA EM

RATOS

JOÃO PESSOA

2015

RAYANNE DE ARAÚJO TORRES

EFEITO PREVENTIVO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA PELE

DO FRUTO DE Syzygium cumini (L.) Skeels SOBRE ALTERAÇÕES

INDUZIDAS PELO CONSUMO DE DIETA HIPERCALÓRICA EM

RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Nutrição, Departamento de Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, da

Universidade Federal da Paraíba em cumprimento

aos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Nutrição.

Área de concentração: Clínica e Epidemiologia

aplicada à Nutrição

Orientador: Prof. Dr. Robson Cavalcante Veras

JOÃO PESSOA

2015

T693e Torres, Rayanne de Araújo. Efeito preventivo do extrato hidroalcoólico da pela do fruto

de Syzygium cumini (L.) Skeels sobre alterações induzidas pelo consumo de dieta hipercalórica em ratos / Rayanne de Araújo Torres.- João Pessoa, 2015.

93f. Orientador: Robson Cavalcante Veras Dissertação (Mestrado) - UFPB/CCS 1. Nutrição. 2. Fruto Syzygium cumini - potencial

antioxidante. 3. Compostos fenólicos. 4. Dieta hipercalórica. 5.Peso corporal. 6. Resposta vascular.

UFPB/BC CDU: 621.3(043)

RAYANNE DE ARAÚJO TORRES

EFEITO PREVENTIVO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA PELE

DO FRUTO DE Syzygium cumini (L.) Skeels SOBRE ALTERAÇÕES

INDUZIDAS PELO CONSUMO DE DIETA HIPERCALÓRICA EM

RATOS

Dissertação de Mestrado aprovada em _____ / _____ /2015.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________________________

Prof. Dr. Robson Cavalcante Veras – Programa de Pós-Graduação Em Ciências da

Nutrição/CCS/UFPB Coordenador da Banca Examinadora

Profa. Dra Jailane de Souza Aquino – Programa de Pós-Graduação Em Ciências da

Nutrição/CCS/UFPB

Examinador Interno

___________________________________________________________________________

Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros – Programa de Pós-Graduação em Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos/CCS/UFPB

Examinador Externo

___________________________________________________________________________

Prof. Dr. Alexandre Sérgio Silva – Programa de Pós-Graduação Em Ciências da

Nutrição/CCS/UFPB

Examinador Suplente Interno

___________________________________________________________________________

Profa. Dr Islania Giselia Albuquerque Gonçalves – Programa de Pós-Graduação em

Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos/CCS/UFPB

Examinador Suplente Externo

A Deus, pois tudo é permissão D’Ele;

A minha mãe, Leni, que nunca mediu

esforços para tornar real meus sonhos,

pelo amor e dedicação incondicional.

Dedico

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me conduzir de forma tão cuidadosa em mais esta etapa de minha vida, por me dar

força e coragem para seguir em busca de meus objetivos e nunca me deixar fraquejar em

nenhuma das tarefas as quais me são destinadas. Minha gratidão por mais essa vitória;

Aos meus pais, Raimundo Soares Torres e Leni Xavier de Araújo, pela educação e por serem

minha base aos quais eu devo tudo o que tenho e sou. Em especial agradeço a minha mãe por

ser esse espelho de mulher corajosa e batalhadora que nunca enxergou empecilhos na busca por

ofertar um futuro melhor aos seus filhos;

Ao meu irmão por sempre acreditar e se orgulhar de mim em cada uma de minhas conquistas;

Aos meus Avós Juvenal Batista e Antônia Natildes (in memoriam), Luzia Sores Torres e João

Batista Torres (in memoriam), pelo carinho, pelas orações e por me proporcionarem tantos

momentos felizes;

A todos da minha família, que sempre torceram, incentivaram e vibraram comigo em todos os

momentos importantes de minha vida;

Ao professor e orientador Dr. Robson Cavalcante Veras por acreditar em nosso trabalho, pela

confiança, humildade, paciência, conhecimento e amabilidade que sempre dispensou a mim

durante todo o desenvolvimento do trabalho;

Ao professor Isac Almeida de Medeiros, pela acolhida em seu laboratório pelos ensinamentos

e incentivos que agregaram valores tão relevantes para tal formação e pelas contribuições na

correção deste trabalho;

À professora Jailane de Souza Aquino do Laboratório de Nutrição Experimental, por

disponibilizar o laboratório sempre que precisei, pelas orientações e contribuições importantes

para a finalização deste trabalho;

À minha companheira de mestrado e de pesquisa Suênia Maria do Nascimento que foi muito

importante no enfrentamento do novo e desta etapa tão singular em minha vida. Obrigada pelo

apoio e por dividir o fardo comigo;

À Priscila Maciel, que passou de colega de laboratório a amiga pessoal com quem pude dividir

momentos importantes, angústias, anseios e tantos outros momentos. Obrigada pela ajuda nos

experimentos, pela amizade, pelas risadas, pelas fofocas e por tornar os dias de laboratório mais

agradáveis;

À Tays Amanda que tanto me ajudou no início dos experimentos me passando boa parte de sua

experiência e prática do laboratório e pelo auxílio nos dias de experimentos. Sua ajuda foi

essencial para execução do projeto;

A Hassler, pelo auxílio na reta final de experimentos, por se mostrar sempre disponível e

disposto a cumprir qualquer tarefa lhe destinada e pela dedicação que sempre dispensou na

execução das mesmas;

Enfim, a todos aqueles que fazem parte do Laboratório de Farmacologia Cardiovascular,

professora Islânia, Valéria, Carminha, Kívia, Natália, George, Mônica, Lorena, Mayara, Arthur,

Pablo, Fátima, Tereza e aos demais, pela colaboração e ajuda durante à pesquisa, pela acolhida,

pela generosidade, pela paciência e por todos os momentos compartilhados ao longo dessa

caminhada. A toda a equipe meu muito OBRIGADA;

Ao amigo José Crispim Duarte, pela ajuda, disponibilidade e pela paciência, por tornar o

biotério, inacreditavelmente, mais agradável com seu bom humor, suas conversas e

receptividade;

Aos queridos colegas e companheiros de mestrado, Lydiane, Vanessa Luna, Isa Gabriela,

Janilson, Vitória, Iara, Sarah, Juliana, Palloma e Vanessa Honório, pela companhia, pela troca

de experiência, por tornar o ambiente acadêmico mais descontraído e por todos os momentos

vivenciados. Voces foram parte importantíssima nessa construção. Sentirei, como já sinto

saudades;

As minhas companheiras de apartamento, Helena e Luana, por dividirem comigo uma vida, por

aturarem meus estresses, meus abusos, minhas mal criações e também por dividir as alegrias,

as besteiras, as muitas risadas e por serem tão companheiras e compreensivas. Voces são minhas

divas do coração;

Aos amigos e amigas da vida, por fazerem meus dias mais leves, pela torcida, pelo incentivo e

por dividirem comigo tantos momentos, bons e difíceis, vocês, os de longe e os de perto, são

parte disso tudo. Muito obrigada por existirem e tornarem a vida mais bonita;

Aos professores Ricardo Cartaxo, Ionaldo José e Fábio Santos, pela contribuição na execução

de alguns protocolos referentes à metodologia deste trabalho;

Aos professores do programa de Pós Graduação em Ciências da Nutrição pela contribuição na

formação acadêmica, por usarem suas competências em prol da formação de profissionais e

pessoas melhores;

A Sr. Carlos, secretário do PPGCN, pela atenção, e por esclarecer todas as dúvidas e prestar

seus serviços com bastante competência;

Ao MCTI/CNPq/MEC/Capes, pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de mestrado;

A todos que de alguma forma contribuíram para execução deste trabalho e torceram para seu

bom andamento e finalização. Muitíssimo Obrigada!

“Para ser grande, sê inteiro; nada

teu exagera ou exclui;

Sê todo em cada coisa; põe quanto és

no mínimo que fazes.”

Fernando Pessoa.

RESUMO

O fruto da S. cumini é considerado fonte de compostos fenólicos apresentando efeitos benéficos

importantes para a saúde, com destaque para seu potencial antioxidante. Dessa forma,

objetivou-se investigar os efeitos de um extrato hidroalcoólico da pele do fruto de S. cumini

(EHAPS) mediante às alterações relacionadas ao consumo de dieta hipercalórica em ratos. O

teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante total foram avaliados para padronização do

extrato. Os animais foram tratados por via oral, com o EHAPS, durante 6 semanas, em duas

doses (100 e 300 mg/Kg) e o controle das dietas normocalórica (NCT) e hipercalórica (HCT)

receberam solução salina. Foi monitorado o peso, o consumo alimentar e hídrico e a pressão

arterial ao longo do tratamento. Ao final foram tomadas medidas murinométricas, coletou-se o

plasma e alguns órgão para análises. O EHAPS apresentou elevada capacidade antioxidante,

com um teor de fenólicos totais de 5.440,86 mg EAG/ 100g de amostra e valor de CE50 de 59

µg/mL. Ao final das seis semanas de tratamento o grupo HCT apresentou um ganho percentual

de peso mais elevado em relação ao NCT, 26 ± 3,9 e 15,3 ± 1,7, respectivamente. A dieta

hipercalórica também aumentou o consumo de calorias, a circunferência abdominal, o índice

de adiposidade e os níveis glicêmicos, além de prejudicar a resposta vascular às drogas como

fenilefrina, acetilcolina, nitroprussiato de sódio, e elevar os níveis de estresse oxidativo. O

tratamento foi capaz de diminuir o ganho de peso percentual do grupo HCT de 19,7 ± 2,6 para

13,3 ± 1,1 e 12,5 ± 1,5 nos grupos H100 e H300, respectivamente, a partir da 4° semana de

tratamento. Ao final do tratamento observou-se melhora da resposta vascular e diminuição do

estresse oxidativo nos animais tratados. Não foi observada nenhuma alteração significativa dos

níveis de pressão arterial entre os grupos e não houve redução significativa do índice de

adiposidade visceral e glicemia sanguínea nos animais após o tratamento. Os resultados

sugerem que os compostos fenólicos presentes na pele do fruto de S. cumini diminuem os efeitos

deletérios de dietas hipercalóricas, prevenindo o ganho de peso corporal e melhorando a

capacidade antioxidante total e a resposta vascular em modelos animais.

Palavras Chaves: Antioxidante. Compostos fenólicos. Dieta hipercalórica. Peso corporal.

Resposta Vascular

ABSTRACT

The fruit of S. cumini is considered source of phenolic compounds with beneficial effects

important for health, especially for its antioxidant potential. This work aimed to investigate the

effects of the fruit skin hydro-alcoholic extract of S. cumini (EHAPS) compared to the changes

related to the consumption of high calorie diet in rats. The total phenolic content and total

antioxidant capacity were evaluated for standardization of the extract. The animals were treated

orally, with EHAPS, for 6 weeks, in two doses (100 and 300 mg / kg) and the control of

normocaloric diets (NCT) and hypercaloric (HCT) received saline. Was monitored weight, food

and water consumption and blood pressure during the treatment At the end, murinométricas

measures were taken, collected up the plasma and some organs for analysis. The EHAPS

showed high antioxidant capacity, with a total phenolic content of 5440.86 mg GAE / 100g and

EC50 value of 59 mg / mL. At the end of the six weeks of treatment HCT group had the highest

percentage of weight gain relative to the NCT, 26 ± 3.9 and 15.3 ± 1.7 respectively. The

hypercaloric diet also increased calorie intake, waist circumference, the adiposity index and

blood glucose levels. In addition to damage the vascular response to drugs such as

phenylephrine, acetylcholine, sodium nitroprusside, and raise levels of oxidative stress. The

treatment decreased the percentage weight gain of the group HCT of 19.7 ± 2.6 to 13.3 ± 1.1

and 12.5 ± 1.5 in groups H100 and H300, respectively, from the 4th week of treatment. The

treatment with EHAPS showed improvements in vascular response and reduction of oxidative

stress in the treated animals. There has been no significant change in blood pressure levels

between the groups and no significant reduction in visceral adiposity index and blood glucose

in animals after treatment. The results suggest that phenolic compounds present in the fruit skin

S. cumini reduce the deleterious effects of a hypercaloric diet, preventing weight gain and

improving the total antioxidant capacity and the vascular response in animal models.

Key Words: Antioxidant. Body weight. Hypercaloric diet. Phenolic compounds. Vascular

response

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Dissertação

Figura 1 – Mecanismo molecular de resistência à insulina na obesidade 20

Figura 2 – Estrutura química dos flavonoides 28

Figura 3 – Principais grupos de flavonoides 28

Figura 4 – Estrutura química dos ácidos fenólicos: hidroxibenzoicos (A) e

hidroxicinâmicos (B)

30

Figura 5 – Fruto da S. cumini 33

Figura 6 – Determinação de Fenólicos Totais 38

Figura 7 – Experimento In Vivo 41

Figura 8 – Representação da verificação da viabilidade do órgão e da integridade do

endotélio vascular. A) Presença do endotélio e B) Ausência do endotélio funcional

46

Artigo

Figura 1 – Cromatograma dos compostos fenólicos presentes no extrato

hidroalcoólico da pele do fruto de S. cumini (EHAPS)

79

Figura 2 – Consumo de ração (g/dia/animal) (A); Ingestão Calórica

(Kcal/dia/animal) (B); Consumo de água (mL/dia/animal) (C), durante 6 semanas

80

Figura 3 – Curva de ganho de peso normalizado pelo peso inicial, ao longo de 6

semanas (A); Índice de adiposidade (g/100g de peso animal) (B)

81

Figura 4 – Eficiência alimentar (g/Kcal) 82

Figura 5 – Curva concentração-resposta para FEN em aneis de artéria mesentérica

de ratos alimentados com dieta normorcalórica (A) e dieta hipercalórica (B)

84

Figura 6 – Curva concentração-resposta para ACh em aneis de artéria mesentérica

de ratos alimentados com dieta normocalórica (A) e dieta hipercalórica (B).

85

Figura 7 – Curva concentração-resposta para NPS em aneis de artéria mesentérica

de ratos alimentados com dieta normocalórica (A) e dieta hipercalórica (B)

86

Figura 8 – Medida de estresse oxidativo por citometria de fluxo em eritrócitos de

ratos.

87

LISTA DE TABELAS

Dissertação

Tabela 1 – Classificação do estado nutricional segundo o IMC 17

Tabela 2 – Circunferência abdominal e risco de complicações metabólicas

associadas com obesidade em homens e mulheres

18

Tabela 3 – Diferente tipos de dietas utilizadas e as principais alterações metabólicas

e corporais que elas induzem

26

Tabela 4 – Composição da solução de Tyrode para artéria mesentérica 44

Artigo

Tabela 1 – Média da pressão arterial sistólica dos animais, nos dias 8, 20, 30 e 42

de tratamento, normalizadas pelo dia 0.

83

Tabela 2 – Concentração plasmática de glicose, colesterol total, triglicerídeos, LDL-

C, HDL-C, cálculo da relação CT/HDL e do Índice Aterogênico dos animais, ao

final de 6 semanas de tratamento (mg/dL).

88

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

2 REVISÃO DE LITERATURA 16

2.1 OBESIDADE 16

2.1.1 Definição, Diagnóstico e Epidemiologia 16

2.1.2 Fisiopatologia e Manifestações Clínicas 18

2.2 MODELOS DE INDUÇÃO À OBESIDADE EM ANIMAIS 22

2.3 COMPOSTOS FENÓLICOS BIOATIVOS 27

2.3.1 Definição e Caracterização 27

2.3.2 Propriedades Terapêuticas 30

2.4 Syzigium cumini (L.) Skeels 33

2.4.1 Caracterização 33

2.4.2 Propriedades Terapêuticas 34

3. ABORDAGEM METODOLÓGICA 37

3.1 TIPO DE ESTUDO E CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 37

3.2 CONTEÚDO FENÓLICO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA AMOSTRA 37

3.2.1 Obtenção e Preparação da Substância Teste 37

3.2.2 Determinação de Fenólicos Totais 38

3.2.3 Determinação da Atividade Antioxidante pelo método de DPPH 39

3.2.4 Quantificação dos compostos fenólicos do EHAPS por cromatografia

líquida de alta eficiência

39

3.3 ESTUDOS IN VIVO 40

3.3.1 Composição e Preparo da Dieta Experimental 40

3.3.2 Delineamento do Estudo 40

3.3.3 Avaliação dos Parâmetros Murinométricos e Eficiência Alimentar 41

3.3.4 Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos 42

3.3.5 Pesagem de Órgãos 42

3.3.6 Medida Indireta da Pressão Arterial 43

3.4 ENSAIOS IN VITRO 43

3.4.1 Preparações dos Anéis de Artéria Mesentérica Superior Isolada de Rato 44

3.4.2 Avaliação do Tratamento com EHAPS sobre a Reatividade Vascular 47

3.5 ENSAIO MOLECULAR 47

3.5.1 Medida de Estresse Oxidativo em Eritrócitos de Ratos por Citometria de

Fluxo

47

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 47

REFERÊNCIAS 49

APÊNDICE 59

ANEXO 92

14

1 INTRODUÇÃO

A obesidade é uma doença crônica multifatorial que envolve fatores genéticos,

metabólicos e comportamentais, além de um desequilíbrio persistente do balanço energético.

Trata-se de um importante fator de risco para várias doenças crônicas, tais como o diabetes,

doenças vasculares e cânceres, a prevenção e tratamento da obesidade vem sendo considerada

crucial em políticas públicas de saúde (HEYNE et al., 2009; TIAN et al., 2013). As mudanças

no estilo de vida, observadas nas últimas décadas, principalmente, o consumo excessivo de

alimentos calóricos e o sedentarismo, são fatores relacionados à gênese da obesidade, dessa

forma, a adoção de dietas hipercalóricas vem se constituindo como um modelo de indução de

obesidade em animais, devido a sua semelhança com a origem e as respostas metabólicas

decorrentes da obesidade em humanos (ROSINI;SILVA;MORAES, 2012).

Alguns modelos de dietas são amplamente utilizados para induzir alterações

relacionadas à obesidade em animais. Tradicionalmente, estas dietas consistem em uma simples

troca de calorias derivadas de carboidratos por calorias derivadas de gorduras (High Fat Diets

– HFD), quando comparadas com dietas de baixo teor de gordura (Low Fat Diets – LFD) ou

dietas padrão. Além dessas, existem modelos de dietas com oferta de alimentos altamente

palatáveis e de elevada densidade energética, que predominam no cardápio da sociedade

ocidental e estão intimamente relacionados à pandemia de obesidade, são as chamadas “dietas

de cafeteria” (CAF) (KENNEDY et al., 2010; SAMPEY et al., 2011).

Em contrapartida, o potencial protetor de algumas dietas e seus constituintes vem se

difundido e o interesse por substâncias ou nutrientes que possam atuar na prevenção ou

tratamento de doenças crônicas, como a obesidade, vem crescendo consideravelmente. Ratos

alimentados com dieta hipercalórica tiveram menor ganho de peso, diminuição do acúmulo de

gordura visceral, além de melhora de parâmetros do estresse oxidativo e anti-inflamatórios,

quando tratados com os polifenois do chá verde (LU et al., 2012; TIAN et al., 2013). Estrunch

et al., (2013) demonstraram o potencial cardioprotetor da dieta do mediterrâneo rica em azeite

de oliva e frutas secas. Outros estudos, sugerem uma eficiente atividade de frutos comestíveis

na melhora dos fatores de risco de doenças cardiovasculares e no tratamento de doenças

crônicas não transmissíveis, como a obesidade (STOCLET et al., 2004;

BASU;RHONE;LYONS, 2010; AUGER et al., 2011).

A ação protetora destes alimentos se dá, principalmente, pela presença de compostos

fitoquímicos com ação antioxidante, com destaque para os fenólicos, produtos do metabolismo

secundário de plantas, com pelo menos 8.000 membros conhecidos que encontram-se divididos

15

em várias classes, segundo o esqueleto carbônico dos fitoquímicos, dentre as quais se destacam

a dos ácidos fenólicos e a dos flavonoides (BRAVO, 1998; DEL RIO et al., 2013). A capacidade

antioxidante desses compostos atribui-se, principalmente, a sua capacidade redutora, cuja

intensidade está relacionada, fundamentalmente, ao número e posição das hidroxilas presentes

na molécula (RICE-EVANS;MILLER;PAGANGA, 1996; MELO et al., 2008).

Diante de tais evidências, o Syzygium cumini L., fruto pertencente à família Myrtaceae,

e originário da Índia, que se adaptou aos climas tropicais, e amplamente encontrado em algumas

partes da América (FARIA;MARQUES;MERCADANTE, 2011) vem sendo estudado frente

algumas doenças metabólicas devido sua composição química e atividade antioxidante,

mostrando um excelente potencial redutor e sequestrador de radicais livres, sendo essas

características atribuídas, principalmente, a presença de importantes compostos fenólicos

(BENHERLAL;ARUMUGHAN, 2007; AQIL et al., 2012). Algumas propriedades terapêuticas

como estimulação hepática, digestiva, carminativa e hipoglicemiantes, assim como,

propriedades antioxidantes, anti-hiperlipidêmica, anti-ulcerogênica, anti-alérgica, anti-

bacteriana e hepatoprotetora vem sendo relatadas na literatura e relacionados a diferentes partes

da planta de S. cumini (MOHAMED;ALI;EL-BAZ, 2013; SRIVASTAVA;CHANDRA, 2013).

O número crescente de pessoas obesas mundialmente impulsiona cada vez mais estudos

em busca de terapias que auxiliem no tratamento e prevenção dessa doença e de suas

complicações, apontadas como principais causas de morte em todo o mundo. Diante disso, e

das evidências que o S. cumini possui compostos fenólicos com potencial ação frente à doenças

metabólicas, torna-se necessário investigar os possíveis efeitos sobre alterações relacionadas à

obesidade, semelhantes àquelas de populações obesas, em modelos animais alimentados com

dieta hipercalórica, a fim de oferecer maiores evidências sobre a eficácia de terapias nutricionais

a base de polifenois e seus impactos para a saúde.

O presente estudo tem como objetivo geral avaliar o efeito do extrato da pele do fruto

de S. cumini sobre aspectos metabólicos e vasculares relacionados ao consumo de dieta

hipercalórica em modelos animais e como objetivos específicos determinar os fenólicos totais

e capacidade antioxidante total do extrato de S. cumini, avaliar parâmetros murinométricos,

bioquímicos, bem como os efeitos do tratamento sobre o estresse oxidativo, pressão arterial e

reatividade vascular em artéria mesentérica superior isolada de ratos.

16

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 OBESIDADE

2.1.1 Definição, Diagnóstico e Epidemiologia

A obesidade é uma doença crônica multifatorial que se desenvolve a partir de uma

interação entre genótipo e ambiente, basicamente, caracteriza-se por um aumento do índice de

massa corporal e um alto teor de gordura corporal, sendo decorrente de um balanço energético

positivo persistente (GINTER;SIMKO, 2008). A compreensão de como e por que a obesidade

se desenvolve é incompleta, porém, sabe-se que envolve a interação de vários fatores como

sociais, culturais, comportamentais, fisiológicos, metabólicos e genéticos (HEYNE et al.,

2009).

O diagnóstico correto da obesidade requer que se identifique níveis de risco e necessita

de algumas formas de quantificação. Recentemente, técnicas de imagem como ressonância

magnética, tomografia computadorizada e absorciometria com raios-X de dupla energia

(DEXA) têm sido alternativas classificadas como padrão-ouro para avaliação da composição

corporal, porém, o alto custo e a escassez desses equipamentos impedem sua utilização na

prática clínica, métodos alternativos como medida de pregas cutâneas, ultrassonografias,

análise de bioimpedância e espectroscopia por raios infravermelhos encontram-se disponíveis

e são relativamente mais baratas (ABESO, 2009).

As medidas antropométricas juntamente com a classificação do índice de massa

corporal (IMC) são amplamente utilizadas no diagnóstico da obesidade. A utilização do peso

isolado, ou ajustado para a altura, aliado a combinação de massa corporal e distribuição de

gordura, que isoladamente tem se mostrado como uma importante medida preditiva de saúde,

constituem uma boa opção para preencher a necessidade de avaliação clínica (ABESO, 2009).

No entanto, não há consenso sobre o método mais eficaz para diagnóstico da obesidade, a

combinação de diferentes avaliações continua sendo a forma mais eficaz para seu diagnóstico

e classificação.

A classificação mais utilizada de indivíduos obesos, segundo o IMC, é a adaptada pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) baseada em padrões internacionais desenvolvidos para

pessoas adultas descendentes de europeus, e o ponto de corte para adultos tem sido identificado

17

com base na associação entre IMC e o risco de comorbidades, conforme apresentado na Tabela

1.

Tabela 1 - Classificação do estado nutricional segundo o IMC

Classificação IMC (kg/m²) Risco de comorbidades

Peso Normal 18,5 – 24,9 Médio

Sobrepeso 25 – 29,9 Aumentado

Obesidade Grau I 30 – 34,9 Moderado

Obesidade Grau II 35 – 39,9 Grave

Obesidade Grau II ≥40 Muito Grave

FONTE: Adaptado de OMS, 1998.

O IMC, apesar de ser um bom indicador, não está totalmente correlacionado com a

gordura corporal e possui algumas limitações como não distinguir massa gorda de massa magra,

não refletindo assim, a distribuição da gordura corporal. Em indivíduos mais velhos é pouco

estimado devido à perda de massa magra decorrente do processo de envelhecimento e

consequentemente diminuição do peso, além de ser superestimado em indivíduos com elevada

carga de atividades físicas e musculatura bem desenvolvida (DEURENBERG et al., 1999;

CERVI;FRANCESCHINI;PRIORE, 2005).

A medida de distribuição da gordura para diagnóstico de sobrepeso e obesidade é

importante porque a gordura visceral (intra-abdominal) contribui como um fator de risco

potencial para o desenvolvimento de doenças, independentemente, da gordura corporal total

(REXRODE et al., 1998; ROSITO et al., 2008). Dessa forma, alguns métodos de avaliação de

gordura corporal e sua distribuição são muito utilizados na prática clínica, dentre os quais

destacam-se medição da espessura das pregas cutâneas, bioimpedância, ultrassonografia,

tomografia computadorizada, ressonância magnética e ainda a relação circunferência

abdominal/quadril e medida isolada da circunferência abdominal (ABESO, 2009).

A medida isolada de circunferência abdominal reflete melhor o conteúdo de gordura

visceral que a relação cintura-quadril, e também está intimamente associada ao conteúdo de

gordura corporal total, sendo considerado fator de risco isolado para o desenvolvimento de

doenças cardiovasculares (POULIOT et al., 1994; ROSITO et al., 2008). Dessa forma, a OMS

sugere pontos de corte para o risco cardiovascular aumentado e muito aumentado considerando

a medida de circunferência da cintura, com base em indivíduos caucasianos (Tabela 2).

18

Tabela 2 - Circunferência abdominal e risco de complicações metabólicas associadas com

obesidade em homens e mulheres

Circunferência abdominal (cm)

Risco de complicações metabólicas Homem Mulher

Aumentado ≥94 ≥80

Muito Aumentado ≥102 ≥88

FONTE: Adaptado de OMS, 1998.

O local de aferição da circunferência abdominal ainda é motivo de confusão entre os

avaliadores. Sugeriram-se vários locais para avaliar a circunferência abdominal, porém, com

base nas recomendações da OMS, pode-se realizar a medida no maior perímetro abdominal

entre a última costela e a crista ilíaca. A I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da

Síndrome Metabólica recomenda que a aferição seja realizada no ponto médio entre o rebordo

costal inferior e a crista ilíaca.

Segundo dados da World Health Organization (WHO, 2008) a obesidade quase dobrou

desde 1980 em todo o mundo. Em 2008, mais de 1,4 bilhão de adultos, acima de 20 anos,

estavam acima do peso. Destes, mais de 200 milhões de homens e mais de 300 milhões de

mulheres eram obesos. No geral, 35% da população adulta, com 20 anos ou mais, tinha

sobrepeso e 11% era obesa.

O sobrepeso e obesidade estão levando a sérios riscos de mortes globais, cerca de 3,4

milhões de adultos morrem a cada ano como resultado do excesso de peso ou obesidade. Além

disso, 44% dos casos de diabetes, 23% dos casos de doenças isquêmicas do coração e entre 7 e

14% dos casos de câncer estão atribuídos ao excesso de peso e à obesidade (WHO, 2008).

No Brasil, conforme os dados da Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF), o

percentual de obesos entre homens e mulheres acima de 20 anos aumentou de 8,9% e 13,1%,

em 2002-2003 (IBGE, 2006) para 12,5% e 16,9% em 2008-2009, respectivamente (IBGE,

2010).

2.1.2 Fisiopatologia e Manifestações Clínicas

A obesidade é um dos principais contribuintes para alterações metabólicas que

envolvem lipídeos e glicose, exercendo influência na disfunção de órgãos e podendo ocasionar

alteração das funções cardíacas, hepáticas, hormonais, pulmonares, intestinais e reprodutivas.

Além disso, o excesso de células adipócitas secretam numerosas citocinas que contribuem para

19

disfunções vasculares na hipertensão e dislipidemia, que se manifestam na forma de

hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia (REDINGER, 2007).

O tecido adiposo é metabolicamente ativo e capaz de produzir e secretar inúmeras

substâncias como fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucinas (IL), inibidor de

plasminogênio ativado-1 (PAI-1), angiotensinogênio, fator de transcrição ativado por ligantes

(PPAR-γ), visfatina, resistina, leptina e adiponectinas (GUIMARÃES et al., 2007). Essas

substâncias são denominadas adipocinas ou adipocitocinas, produzidas pelo tecido adiposo

branco, e agem no controle do mecanismo da fome/saciedade implicando em funções da

regulação da ingestão de alimentos, na sinalização da insulina, nos níveis séricos de lipídios, na

coagulação, na inflamação e na aterogênese (LAU et al., 2005; PEREZ-ECHARRI et al., 2009;

FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011).

Muitos estudos apontam à obesidade como um estado de inflamação crônica tendo em

vista que sua gênese ocasiona maior produção de citocinas pró-inflamatórias. O aumento de

tamanho do tecido adiposo é considerado ponto chave para o início do processo inflamatório,

uma vez que a hipóxia, gerada pelo aumento do tamanho do tecido adiposo, resulta em uma

maior produção de citocinas (TNF α; IL-6; IL-1β) que em quantidades elevadas adiquirem

caráter pró-inflamatório, favorecendo o processo de resistência à insulina (RI) e estresse

oxidativo (GUIMARÃES et al., 2007; BRESSAN et al., 2009).

O consumo de gorduras, principalmente as saturadas, também favorece esse processo

inflamatório ao ativar a sinalização de receptores do tipo TLR4 (Toll-like receptors) no

hipotálamo (TSUKUMO et al., 2007). O TLR-4 é um receptor pertencente ao sistema imune

inato e sua ativação leva ao aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α,

IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12, que ocasiona apoptose de neurônios que atuam no mecanismo de

controle da fome/saciedade acarretando um desequilíbrio na regulação da homeostase

energética (MILANSKI et al., 2009; MORAES et al., 2009). O aumento de citocinas pró-

inflamatórias, também comprometem a sinalização da insulina dando início ao processo de RI

e surgimento do diabetes mellitus, umas vez que a perpetuação do processo inflamatório pode

levar a apoptose das células β pancreáticas (HANSEL et al., 2004).

Outra importante característica da obesidade que contribui para o seu agravamento,

refere-se ao elevado número de ácidos graxos livres (AGL) circulantes, resultante do elevado

estoque de gordura armazenada na forma de triglicerídeos, que facilmente são quebrados e

liberados na circulação na forma de AGL (MOLLER;KAUFMAN, 2005; REDINGER, 2007).

O elevado número de AGL circulantes acarreta o armazenamento dessa gordura em tecidos

periféricos, incluindo, principalmente, o musculo esquelético e o fígado, podendo levar a RI

20

nesses tecidos. As citocinas liberadas nesta situação contribuem não só para o processo

inflamatório mas reforçam o quadro de RI sistêmico (RASK-MADSEN;KAHN, 2012).

Há fortes evidências de que o excesso de gordura intra-abdominal visceral esteja

intimamente ligado à RI, sendo um ponto chave para o desenvolvimento de uma série de

complicações relacionadas à obesidade e síndrome metabólica, com elevados riscos para a

saúde cardiovascular. A RI é acompanhada por um estado hiperglicêmico persistente, bastante

comum em obesos, decorrente, principalmente, da incapacidade de captação de glicose pelas

células, do aumento da produção de glicose pelo fígado (gliconeogênese) e da diminuição da

utilização da glicose muscular, culminando, em alguns casos, em falência das células β do

pâncreas (GINSBERG, 2000; MUNIYAPPA et al., 2007). Mecanismos moleculares

importantes de RI e intolerância à glicose induzidos pela obesidade podem ser observados na

Figura 1.

Figura 1 - Mecanismo molecular de resistência à insulina na obesidade

FONTE: Adaptado de MOLLER e KAUFMAN, 2005.

O aumento de tecido adiposo também é considerado um fator de risco independente para

a produção do estresse oxidativo, uma vez que, a produção irregular de adipocinas, associa-se

21

a uma elevada produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), gerando um processo de

estresse oxidativo sistêmico, que pode causar danos diretos e indiretos em diferentes órgãos

(ESPOSITO et al., 2006; KHAN;NAZ;YASMEEN, 2006). Alguns mecanismos de produção

de radicais livres ocorrem, normalmente, nas mitocôndrias, membranas celulares e no

citoplasma. A mitocôndria é a principal fonte geradora de ROS, por meio da cadeia de

transporte de elétrons, onde há um excesso do consumo de oxigênio e através de reações de

oxidação de ácidos graxos. Dietas ricas em lípidos, principalmente ácidos graxos saturados, e

hidratos de carbono, também são capazes de gerar ROS porque podem alterar metabolismo do

oxigênio (BARBOSA et al., 2010; FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011).

Outra importante fonte geradora de radicais livres são as enzimas NADPH oxidases

(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidases). Essas se referem à proteínas

transmembrana que tem a função de transferir os elétrons através das membranas celulares.

Geralmente, o aceptor de elétrons é o oxigênio e, dessa forma, em decorrência desse processo,

gera-se o radical O2•. O tecido adiposo secreta angiotensina II, a qual estimula a NADPH

oxidase, que compreende a principal via para a produção de ROS em adipócitos (MORROW,

2003; BARBOSA et al., 2010). O TNF-α também aumenta a interação de elétrons com o

oxigênio para gerar ânions superóxido, através da inibição da atividade da proteína-C reativa

(PCR) (FONSECA-ALANIZ et al., 2007).

Depósitos de gordura são vulneráveis a sofrer reações de oxidação, se a produção de

ROS excede a capacidade antioxidante da célula, o estresse oxidativo resulta em peroxidação

lipídica podendo contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose

(KHAN;NAZ;YASMEEN, 2006). Biomarcadores do estresse oxidativo, como o

malondialdeído (MDA) e F-2 isoprostanos (F2 IsoPs), produtos da peroxidação de ácidos

graxos poli-insaturados, tem mostrado relação significativa com IMC, além disso, estudos

demonstram relação positiva entre o nível de peroxidação lipídica e concentração de colesterol

plasmático (BLOCK et al., 2002; FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ et al., 2011).

A sensibilidade da PCR (proteína C reativa) e outros biomarcadores de dano oxidativo

é maior nos indivíduos com obesidade e se correlacionam diretamente com o IMC e o

percentual de gordura corporal, a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL), e os

níveis de triglicerídeos (TG) (PIHL et al., 2006). Em contraposição, marcadores de defesa

antioxidantes, como as enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), e

glutationa peroxidase (GPx), são mais baixos de acordo com a quantidade de gordura corporal

e obesidade central (CHRYSOHOOU et al., 2007; HARTWICH et al., 2007).

22

Finalmente, a alta produção de ROS e a diminuição da capacidade antioxidante leva a

várias anormalidades, entre as quais encontramos disfunção endotelial, que é caracterizada por

uma redução na disponibilidade de vasodilatadores, particularmente o óxido nítrico (NO), e um

aumento de fatores contráteis derivados do endotélio, consequentemente o relaxamento

dependente do endotélio se encontra prejudicado, quando em resposta a agonistas como

acetilcolina, bradicinina, ou tensão de cisalhamento, além disso, a disfunção endotelial inclui

um estado específico de ativação endotelial caracteristicamente pró-inflamatório, proliferativo

e pró-coagulante, favorecendo a doença aterosclerótica e hipertensão arterial sistêmica

(HADI;CARR;AL SUWAIDI, 2005; GONZALEZ et al., 2014).

O NO apresenta papel fundamental no desenvolvimento da disfunção endotelial, pois

atua opondo-se aos efeitos vasoconstritores derivados do endotélio tais como a angiotensina II

e a endotelina 1, e ainda protege as células endoteliais contra danos induzidos por citocinas, tais

como o TNF-α. Assim, alterações na produção ou na biodisponiblidade de NO promove as

características principais de disfunção endotelial, como a vasoconstrição, agregação de

plaquetas, proliferação de células de músculo liso, migração e adesão de leucócitos e estresse

oxidativo (BADAL;DANESH, 2012).

Todas essas alterações relacionadas ao estresse oxidativo que culminam em disfunção

endotelial tem ganhado atenção como um dos principais mecanismos responsáveis para

instalação de hipertensão arterial sistêmica. Uma vez que, o aumento de ROS e

biodisponibilidade reduzida de NO e antioxidantes endógenos e exógenos, constituem-se como

fatores chaves para alterações relacionadas a hipertensão em modelos animais e humanos

(GONZALEZ et al., 2014).

Em suma, o aumento do tecido adiposo e consequente aumento da inflamação e do

estresse oxidativo, podem ser considerados pontos chaves para o surgimento de anormalidades

como RI, dislipidemias, hipertensão arterial, doença arterial coronariana e disfunções

endotelias, contribuindo para o aumento do risco cardiometabólico, principal causa de morte

em todo o mundo (VAN GAAL;MERTENS;CHRISTOPHE, 2006).

2.2 MODELOS DE INDUÇÃO À OBESIDADE EM ANIMAIS

A grande similaridade e homologia entre os genomas dos roedores e dos humanos

tornam esses modelos animais uma importante modelo para o estudo de condições que afetam

os humanos e que podem ser simuladas em ratos. Além disso, o estudo com animais permite a

obtenção de respostas em curto espaço de tempo, já que dez dias na vida de um rato é o

23

equivalente a aproximadamente um ano de seres humanos, quando comparada a variação de

ganho de peso corpóreo (VON DIEMEN;TRINDADE;TRINDADE, 2006).

A obesidade pode ser induzida em animais por alterações neuroendócrinas, dietéticas

ou genéticas. Os modelos mais utilizados para indução de obesidade em ratos são lesão do

núcleo hipotalâmico ventromedial (VMH) através da administração de glutamato monossódico

(MSG) ou lesão elétrica direta, ooforectomia, manipulação genética para obesidade e

alimentação com dietas hipercalóricas (CHU et al., 1999; NAKAGAWA et al., 2000; XU et al.,

2004; VON DIEMEN;TRINDADE;TRINDADE, 2006).

Há duas formas de desenvolver obesidade através da lesão hipotalâmica, uma delas é a

administração de MSG para ratos recém-nascidos, que provoca a destruição ventromedial do

hipotálamo e núcleos arqueadas, levando os ratos a desenvolver obesidade devido à falta de

controle entre a absorção e gasto energético, o mecanismo pelo qual a lesão hipotalâmica leva

a obesidade não é bem esclarecido, porém sabe-se que ocorre um aumento significativo do

consumo alimentar do animal (BUNYAN;MURRELL;SHAH, 1976; NAKAGAWA et al.,

2000).A administração de MSG mostrou um série de alterações relacionadas com a falta de

controle do eixo hipotálamo-hipófise, de acordo com curva dose-dependente, incluindo

hipofagia, hipoatividade, obesidade, redução do peso dos ovários, puberdade tardia e altos

níveis de corticosteroides (LORDEN;CAUDLE, 1986; MORENO et al., 2006).

A lesão do tipo VHM é a elétrica, com algumas modificações daquela realizada por

Saito e cols. (1985), pode ser utilizada para induzir obesidade. Através de uma corrente de 1,2

mA com duração de 4 segundos por 3 repetidas vezes em intervalos de 30 segundos após o

posicionamento dos eletrodos, pode causar destruição bilateral dos núcleos hipotalâmicos,

levando à obesidade. A ponta do nariz do animal deve ser posicionada 5 milímetros acima da

linha interaural de um instrumento estereotáxico, e a ponta do eletrodo é colocado 0,6

milímetros lateral do bregma e 9 milímetros abaixo do crânio (SHIMIZU et al., 2003).

Paradoxalmente, este tipo de indução provoca obesidade por hiperfagia, diferente daquela

provocada pelo MSG (VON DIEMEN;TRINDADE;TRINDADE, 2006).

Outro modelo de indução de obesidade é através da ooforectomia ou ovarectomia, este

modelo é usado para alcançar uma melhor compreensão de modificações em mulheres pós-

menopausa e também para estudar intervenções que poderiam atenuar o impacto da redução do

hormônio nessas mulheres. O procedimento consiste na remoção das gônodas de ratas, fazendo

com que cesse a produção de estradiol, nestas condições observa-se uma diminuição dos níveis

de leptina, correlacionando-se com um período de hiperfagia e ganho de peso acentuado, porém

24

após um período de tempo, esses níveis de leptina sobem significativamente (CHU et al., 1999;

KIMURA et al., 2002)

Os modelos genéticos para estudar a obesidade começaram a ser usados cada vez mais

na década de 1990 por causa da clonagem e identificação de cinco genes diferentes que

causariam a obesidade. Além disso, nos últimos anos, animais geneticamente modificados ou

knockout tem sido produzidos para estudar novos genes que são candidatos por influenciar na

taxa de obesidade (MARQUES-LOPES et al., 2004) Existem mais de 50 tipos diferentes de

modelos genéticos de obesidade em roedores (GOOD, 2005).

Em sua maioria, em animais de laboratório, a gênese da obesidade está relacionada, com

mutações genéticas, porém esse modelo é muito distante do encontrado nos humanos. A adoção

de dietas hipercalóricas ou hiperlipídicas vem sendo utilizada como modelo de indução da

obesidade em animais, devido à sua semelhança com a gênese e às respostas metabólicas

decorrentes da obesidade em seres humanos (ROSINI;SILVA;MORAES, 2012).

A indução de obesidade através de dieta é o modelo mais simples de indução à esta

patologia, e possivelmente aquele que mais se assemelha a realidade da obesidade em seres

humanos. Existem vários tipos de dietas para induzir obesidade, que se revelaram eficazes.

Algumas dietas atingem valores hipercalóricas por adição de hidratos de carbono e outras por

gorduras, e a maioria delas variam entre 3,7 Kcal/g e 5,4 Kcal / g (VON

DIEMEN;TRINDADE;TRINDADE, 2006).

Tradicionalmente, algumas dietas consistem em uma simples troca de calorias derivadas

de carboidratos por calorias derivadas de gorduras, quando comparadas com dietas de baixo

teor de gordura ou dietas padrão. Além dessas, existem modelos de dietas com oferta de

alimentos altamente palatáveis e de elevada densidade energética, que predominam no cardápio

da sociedade ocidental e estão intimamente ligados a pandemia de obesidade, são as chamadas

“dietas de cafeteria” (KENNEDY et al., 2010; SAMPEY et al., 2011).

Algumas medidas relacionadas ao ambiente onde o animal é mantido podem ser

tomadas a fim de aumentar a eficácia da indução da obesidade através da dieta. Dentre elas

pode-se destacar o número de animais por caixa que não deve ultrapassar o número de quatro,

pequenos aumentos na temperatura do biotério, quando possível e no tempo do ciclo escuro.

Além disso, a idade do animal também deve ser considerada, uma vez que animais mais jovens

tem o metabolismo diferenciado que favorece maior ganho de massa magra, por isso é

aconselhável que se utilize animais mais velhos, com aproximadamente 100 dias, para indução

da obesidade por dieta (TSCHOP;HEIMAN, 2001).

25

Entretanto há estudos em que animais mais jovens alimentados com dietas

hipercalóricas por um longo período de tempo aumentaram o peso corporal em relação ao grupo

controle (NASCIMENTO et al., 2008) . Isso sugere que o tipo de dieta utilizada é outro fator

interveniente no ganho de peso em animais de idades diferentes, animais com idade e peso

semelhantes no início do período experimental apresentaram resultados diferentes quanto ao

ganho de peso corporal, ora mostrou maior ganho ponderal (ESTADELLA et al., 2004;

GUERRA et al., 2007), ora não havia alterações relacionadas ao peso quando comparados ao

grupo controle (BURNEIKO et al., 2006; ZAMBON et al., 2009), mostrando que o tipo de dieta

pode influenciar na gênese da obesidade, independentemente da idade.

Uma linha de estudo bastante relevante, porém ainda escassa, refere-se àquela que

compara modelo de indução à obesidade com dietas tradicionalmente utilizadas, ricas em

gorduras, com aquelas dietas de alta palatabilidade, com alimentos processados geralmente

consumidos pela população, as chamadas dietas de cafeteria, com alto teor de sódio, de gordura,

pobre em fibras e rica em alimentos altamente energéticos como biscoitos, batatas fritas e carnes

processadas (HIGA et al., 2014).

Neste modelo de dietas de alta palatabilidade ou cafeteria os animais tem livre acesso a

água e ração padrão enquanto simultaneamente são oferecidos alimentos de elevada densidade

energética e altamente palatáveis ad libitum. Este tipo de dieta promove hiperfagia involuntária

que resulta em ganho de peso rápido, aumento de massa gorda e de parâmetros pré-diabéticos,

como intolerância à glicose e RI (MORRIS et al., 2008; HEYNE et al., 2009).

Em revisão sistemática, Rosini e cols. (2012) mostraram estudos realizados com

diferentes tipos de dietas para indução da obesidade em animais, com idades variadas, e seus

respectivos efeitos quanto ao ganho de peso, glicemia de jejum, níveis de leptina, insulina e

capacidade dislipidêmica, avaliada pelos níveis de triglicerídeos, conforme pode ser observado

na Tabela 3.

26

Tabela 3 – Diferentes tipos de dietas utilizadas e as principais alterações metabólicas e corporais

que elas induzem

M, macho; F, fêmea; GLI, glicose; INS, insulina; LEP, leptina; TG, triglicerídeos; +, aumento com relação aos

controles; -, sem diferença com relação aos controles; 0, não quantificado.

Sampey et al. (2011) investigaram as consequências obesogênicas e inflamatórias de

uma dieta de cafeteria (CAF) em comparação com um modelo de HFD, 45% a base de banha

de porco, e uma dieta padrão em ratos Wistar machos, durante 15 semanas. O peso corporal

aumentou dramaticamente e permaneceu significativamente elevado em ratos alimentados CAF

comparação as outras dietas. Testes de glicose e de tolerância à insulina revelaram-se piores

nos ratos alimentados CAF comparados aos controles e ratos HFD-alimentados. Apesar de

ambas as dietas ricas em gordura resultarem em aumento da adiposidade e esteatose hepática,

27

ratos alimentados com CAF exibiram notável inflamação na gordura branca, gordura marrom

e fígado em comparação com HFD e controles. Dessa forma, dietas do tipo CAF, oferecem um

modelo robusto de síndrome metabólica em comparação à HFD e oferece um fenótipo de

obesidade exacerbada com intolerância à glicose, resistência à insulina e inflamação.

Diante de tais evidências e muitos estudos demonstrarem a possibilidade de indução de

uma série de alterações metabólicas em roedores através de dieta, há um número cada vez maior

de pesquisadores que utilizam esse meio para estudar alterações relacionadas à obesidade e suas

co-morbidades, uma vez que se constitui como um modelo relativamente simples de indução à

obesidade e que reproduz alterações semelhantes àquelas observadas em humanos.

2.3 COMPOSTOS FENÓLICOS BIOATIVOS

2.3.1 Definição e Classificação

Plantas tropicais e seus frutos são grandes fontes de compostos fenólicos e que

apresentam um caráter protetor para o vegetal (BALASUNDRAM;SUNDRAM;SAMMAN,

2006). Estes compostos são produtos secundários do metabolismo de plantas, normalmente

derivado de reações de defesa contra agressões do ambiente ou mesmo contra insetos e

pequenos animais. Sua estrutura química básica contém um anel aromático com uma ou mais

hidroxilas, constituindo um amplo e complexo grupo de fitoquímicos com mais de 8000

estruturas conhecidas que agem como antioxidantes, não somente pela sua habilidade em doar

hidrogênio ou elétrons, mas também em virtude de seus radicais intermediários estáveis, que

impedem a oxidação de vários ingredientes do alimento, particularmente de lipídios (BRAND-

WILLIAMS;CUVELIER;BERSET, 1995; MARTÍNEZ VALVERDE;PERIAGO;ROS, 2000;

LEE et al., 2005).

A diversidade estrutural dos compostos fenólicos se deve a grande variedade de

combinações que ocorre na natureza, sendo divididos em várias classes de acordo com o

esqueleto carbônico dos fitoquímicos, dentre os quais se destacam a dos ácidos fenólicos,

flavonoides e estilbenos, como o resveratrol, por serem facilmente encontrados e os mais

comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural (SOARES, 2002; GARCÍA-VILLALBA et al.,

2010). Estes compostos encontram-se amplamente distribuídos no reino vegetal, englobam

desde moléculas simples até aquelas com elevado grau de polimerização e estão presentes nos

vegetais nas formas livres e complexados com açúcares e proteinas e comumente são chamados

28

de polifenois, já que a grande maioria apresenta uma ou mais hidroxilas ligadas a um anel

aromático (BORGUINI, 2006)

Dentre os mais estudados, destacam-se os flavonoides que têm em comum a estrutura

fenilbenzopirona (C6–C3–C6), onde as duas partes da molécula com seis carbonos são aneis

aromáticos, denominados anel A e B, unidos por três carbonos que formam um anel γ pirano,

denominado de anel C (Figura 2). Dentre os aproximados 4000 flavonoides já descritos as

classes mais conhecidas são flavonóis, flavanonas, flavan-3-ols, flavonas, antocianinas e

isoflavonas, categorizados de acordo com a substituição que ocorre no anel C (Figura 3)

(TAPAS;SAKARKAR;KAKDE, 2008; DEL RIO et al., 2013).

Figura 2 – Estrutura química dos flavonoides

FONTE: BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN (2006)

Figura 3 – Principais grupos de flavonoides

Flavonol Flavona

29

Isoflavona Antocianidinas

FONTE: Adaptado de TAPAS; SAKARKAR; KAKDE, 2008.

Dentre as principais subclasses, os flavonois como kampferol, miricetina e quercetina

são amplamente encontrados nos alimentos e em maior concentração ocorrem em especiarias,

frutas e cacau. As flavononas tem como compostos principais a naringenina e hesperetina e são

encontrados em frutas cítricas. Os Flavan-3-ols que incluem epicatequina , galocatequina ,

epigalocatequina , epicatequinagalato , epigalocatequinagalato e procianidina, estão presentes

em grandes quatidades nos chás verdes e preto. As antocianinas consistem principalmente de

antocianina e antocianidina, e são proeminentes em alimentos de cores vermelho e roxo, tais

como frutas escuras e vinho tinto. As isoflavonas são únicos que se assemelham ao estrogênio

em estrutura e, por isso, são classificados como fitoestrogénos, esses compostos são

encontrados em produtos de soja, como tofu e grãos de soja torrados

(TANGNEY;RASMUSSEN, 2013).

Os ácidos fenólicos estão divididos em dois grupos (Figura 4) e podem ser encontrados

em quantidades apreciáveis em café, nozes, ameixas e amoras. O primeiro, derivado dos ácidos

hidroxibenzoicos, constituídos por sete átomos de carbono (C6-C1). Estes compostos

apresentam grupo carboxílico ligado ao anel aromático, destacando-se os ácidos

protocatecuíco, vanílico, siríngico, gentísico, salicílico e gálico como os mais comuns. No

segundo grupo encontram-se os derivados dos ácidos hidroxicinâmico, constituídos por nove

átomos de carbono (C6-C3), dos quais três formam uma cadeia lateral. Os ácidos p-cumárico,

cafeico, ferúlico e sináptico são os derivados dos ácidos hidroxicinâmico mais comumente

encontrados no reino vegetal. A ciclização da cadeia lateral do acido p-cumárico dá origem a

um terceiro grupo de fenólicos denominados cumarinas (SOARES, 2002;

TANGNEY;RASMUSSEN, 2013).

30

Figura 4 - Estrutura química dos ácidos fenólicos: hidroxibenzoicos (A) e hidroxicinâmicos

(B)

FONTE: Adaptado de TAPAS; SAKARKAR; KAKDE, 2008.

2.3.2 Propriedades terapêuticas

Compostos fenólicos de plantas estão entre os agentes bioativos alimentares mais

desejáveis, porque eles são capazes de expressar atividade antioxidante e, potencialmente,

reduzir o nível de estresse oxidativo, que estaria envolvido em doenças crônicas inflamatórias

e metabólicas como, obesidade, aterosclerose, inflamação, câncer e diabetes (KRIS-

ETHERTON et al., 2002; MEYDANI;HASAN, 2010). Estudos epidemiológicos sugerem que

os vegetais de elevada qualidade alimentar, como ervas, especiarias e frutos exercem um efeito

protetor contra doenças crônicas, devido à presença de compostos com efeitos relevantes em

termos de saúde, independente dos nutrientes e micronutrientes bem conhecidos (ZAMORA-

ROS et al., 2010). Portanto, compostos fenólicos antioxidantes podem ser apontados como

fontes promissoras de ingredientes funcionais de suporte à saúde.

A eficiência antioxidante destes compostos depende principalmente da sua estrutura e

da sua concentração no alimento, já que sua estrutura molecular e, mais especificamente, a

posição e o grau de hidroxilação do anel aromático tem influência direta sobre a atividade

antioxidante destes compostos, bem como sobre o seu mecanismo de ação (RICE-

EVANS;MILLER;PAGANGA, 1996; MELO et al., 2008).

Estudos recentes têm demonstrado o papel dos polifenois da dieta na prevenção de

obesidade e doenças crônicas a ela relacionadas. Em estudos moleculares utilizando animais

A)

B)

31

obesos tratados com polifenois demonstraram uma diminuição da viabilidade dos adipócitos e

proliferação dos pré-adipócitos, suprimindo a diferenciação dessas células e o acúmulo de

triglicérides, estimulando a lipólise e β-oxidação de ácidos graxos, com redução significativa

na inflamação (LU et al., 2012; TIAN et al., 2013). Outros estudos sugerem que o tratamento

com polifenois, exercem um efeito pronunciado sobre a obesidade, demonstrada pela

diminuição do ganho de peso corporal, diminuição da massa gorda, e triglicérides através do

aumento do gasto energético e a utilização de gordura, e modulando a homeostase da glicose

(WANG et al., 2014).

Meydani e Hasan (2010) destacam a atividade de importantes compostos fenólicos

como resveratrol, catequinas e antocianinas na prevenção da obesidade de alguns modelos

animais, demonstrando os efeitos benéficos desses compostos na modulação da adiposidade e

distúrbios relacionados, com diminuição do ganho de massa gorda, melhora do metabolismo

glicídico, lipídico e dos níveis de leptina, demonstram, ainda, a sua influência na regulação do

metabolismo energético.

O impacto benéfico dos polifenois na saúde é diversificado, mas entre as suas principais

atividades, destaca-se o seu papel no combate à inflamação aguda e crônica (LIBBY, 2002).

Vários mecanismos explicam a atividade anti-inflamatória dos polifenois, especialmente dos

flavonoides, entre as mais citadas, destacam-se a atividade antioxidante e de eliminação de

radicais livres, regulação de atividade celular de células pró-inflamatórias e seus alvos

moleculares, incluindo melhoras na estrutura e funcionamento endotelial

(TANGNEY;RASMUSSEN, 2013).

A atividade antioxidante dos polifenois, em grande parte, é atribuída ao seu grupo

hidroxila fenólico. A capacidade antioxidante está mediada pela habilidade em sequestrar

espécies reativas de oxigênio e nitrogênio livres, que anula a atividade pró-inflamatória dessas

espécies reativas, geradas por enzimas, tais como ciclo-oxigenase (COX), a lipoxigenase

(LOX), e óxido nítrico sintase induzível (iNOS), Além disso, contribuem para a defesa

antioxidante de células endoteliais através da redução direta da expressão e atividade da enzima

NADPH-oxidase. Os polifenois ainda estimulam atividades antioxidantes dos outros enzimas

como a catalase (STEFFEN et al., 2008).

Testes realizados in vitro, com resveratrol, estilbeno encontrado no vinho tinto, e outros

fenóis, demonstraram proteção contra a oxidação da LDL induzida pela produção de

peroxinitrito, formado na reação do ânion superóxido com o NO. Essa reação que resulta na

formação de ROS na luz do vaso, funciona como um gatilho primário para a lesão endotelial,

(BORRIELLO et al., 2010). O endotélio é um regulador chave da homeostase vascular

32

principalmente através da liberação de vários fatores vasoativos potentes que controlam o tônus

vascular, a fluidez do sangue, inflamação e a proliferação de células do músculo liso (KHODJA

et al., 2012).

Desde a década passada, os primeiros estudos realizados por Fitzpatrick et al., (1993)

com alimentos como vinhos, suco de uva e extratos da pele de frutos, importantes fontes de

fenólicos, demonstraram eficiência desses compostos de induzir relaxamento em aneis de aorta

via endotélio-dependente. Tais alimentos causam relaxamento dependente do endotélio,

prejudicado na presença de inibidores competitivos da eNOS e guanilil ciclase, pode-se inferir

que esses compostos modificam a formação e aumentam a biodisponibilidade do NO.

Evidências sugerem que fatores hiperpolarizantes dependentes do endotélio (EDHF) também

estejam envolvidos (NDIAYE et al., 2005; SCHINI-KERTH et al., 2010).

Alguns alimentos, tais como chás, vinho e cacau, extremamente ricos em polifenóis, se

mostram altamente eficazes como agentes dietéticos de defesas antioxidantes para a saúde

cardiovascular. Experimentos clínicos e com animais mostraram a capacidade desses polifenois

em diminuir os níveis cardíacos de ROS e malondialdeído (MDA), um metabólito que se forma

quando ROS e LDL oxidadas reagem com os ácidos graxos que compõem a membrana celular

(FENERCIOGLU et al., 2010). Flavonoides como as catequinas ou quercetinas tem capacidade

de capturar diretamente ROS, tal como O2 H2O2 ou HClO (KORKINA;AFANAS'EV, 1997;

BINSACK et al., 2001).

Vários efeitos benéficos desses compostos fenólicos relacionados ao aumento da

proteção contra doenças cardiovasculares são relatadas como melhora do perfil lípidico e menor

oxidação de lipoproteínas de baixa densidade, efeito antiaterogênico e antitrombótico,

diminuindo a formação de trombos com diminuição dos riscos de acidentes vasculares cerebrais

(AVE) e infarto do miocárdio, e modulação de processos apoptóticos no endotélio vascular

(QUINONES;MIGUEL;ALEIXANDRE, 2013).

Historicamente, as ações biológicas de polifenóis têm sido atribuídas à atividades anti-

inflamatórias e antioxidantes, no entanto, evidências recentes sugerem que propriedades

imunomoduladoras e vasodilatadoras também possam contribuir para a redução do risco de

doenças cardiovasculares, além daquelas relacionadas a sua gênese

(TANGNEY;RASMUSSEN, 2013). Dessa forma, tem-se sugerido que os compostos fenólicos

tem outras vias de ação que precisam ser elucidadas afim de melhorar a compreensão quanto

ao papel benéfico na saúde desses componentes e ampliar suas indicações no tratamento e

prevenção de patologias crônicas relacionadas com a obesidade e ao aumento do risco

cardiometabólico.

33

2.4 Syzigium cumini (L.) Skeels

2.4.1 Caracterização

Syzygium cumini L. é uma angiosperma da família Myrtaceae, originária da Ásia

Tropical, principalmente da Índia, Malásia e China, com capacidade de desenvolvimento em

diversos tipos de solo. Adaptou-se bem aos climas tropicais e pode ser amplamente encontrada

em todo o continente americano, inclusive no Brasil. Trata-se de uma árvore de grande porte

(até 10 metros de altura), com folhas simples e frutos de cor roxo–escura, popularmente

conhecida como Jamun ou Jambolão, cientificamente também possui como sinônimos Eugenia

jambolana e Eugenia cumini (FARIA;MARQUES;MERCADANTE, 2011;

AYYANAR;SUBASH-BABU, 2012).

Os frutos da S. cumini são pequenos, com 2-3 cm de comprimento, forma ovoide, com

uma cor vermelho-púrpura e negros cor púrpura quando maduros apresentando um alto teor de

antocianinas, contêm uma polpa carnosa rosada ou quase branco com sabor adstringente, mas

de sabor agradável e amplamente consumida (Figura 5) (BENHERLAL;ARUMUGHAN,

2007; CHAUDHARY;MUKHOPADHYAY, 2012). De acordo com nutricionistas, o fruto é

rico em carboidratos, minerais e vitaminas, com glicose e frutose como açúcares principais, e

quanto aos micronutrientes, destacam-se o manganês, zinco, ferro, cálcio, sódio e potássio

(MOHAMED;ALI;EL-BAZ, 2013).

Figura 5 – Fruto da S. cumini

Fonte: AUTOR, 2015.

34

A planta em estudo apresenta uma grande diversidade fitoquímica como taninos,

alcalóides, esteróides, flavonóides, terpenos, ácidos graxos, além de vitaminas e minerais, que

variam conforme a parte analisada. Srivastava e Chandra, (2013), relatam os principais

componentes de diferentes parte de S. cumini. No fruto encontra-se o ácido málico, com traços

de ácido oxálico, ácido gálico e taninos que conferem adstringência ao fruto, além de

antocianinas responsáveis pela sua cor roxa, com destaque para as cianidinas di-glicosideos.

Nas sementes encontra-se a clorofila, ácidos graxos insaturados, resina, albúmen, taninos e

compostos fenólicos tais como o ácido elágico, ácido gálico, ácido caféico e ácido ferúlico,

além de rutina e quercetina. Nas cascas do caule ácido betulínico, β-sitosterol, friedelina, epi-

friedelanol e um éster de epifriedelanol, os principais flavonoides são kampferol-3-glucosido,

quercetina, miricetina, e ainda o ácido gálico. Vários flavonóides, terpenóides e compostos

fenólicos, como sitosterol, ácido betulínico, quercetina, miricetina, kampferol foram relatados

por estar presentes nas folhas da planta.

Ainda em relação a composição de seus frutos, o teor de polifenois é uma de suas

principais características, com destaque para as antocianinas, isoquercetina, ácido elágico,

glicosídeos, canferol e miricetina, o ácido málico, ácido oxálico, ácido gálico

(AYYANAR;SUBASH-BABU, 2012). Shrikanta et al. (2015) analisou a capacidade

antioxidante, e o conteúdo total de fenólicos na pele, polpa e semente do fruto da S. cumini e

observou que dentre os polifenóis analisados (ácido gálico; ácido caféico; (+)- catequina; (−)-

epicatequina; ácido p-cumarico ) o ácido gálico é o mais abundante fitoconstituinte do fruto da

S. cumini.

2.4.2 Propriedades Terapêuticas

A presença de compostos fenólicos na dieta propicia uma melhora significativa na

saúde, além de diminuir a incidência de doenças crônicas não-transmissíveis (DCNT), devido

ao potencial antioxidante proporcionado por essas estruturas. A composição química e a

atividade antioxidante do fruto de S. cumini tem sido bastante estudada, demonstrando

importante relação entre os compostos presentes e suas propriedades antioxidantes. Os frutos

maduros do jambolão demonstram um importante potencial terapêutico podendo-se destacar

efeitos como estimulação hepática, digestiva, carminativas e hipoglicemiante

(MOHAMED;ALI;EL-BAZ, 2013).

Devido ao seu importante conteúdo de fitoquimicos, os quais são responsáveis pelo

efeito farmacológico, tanto o consumo da fruta como a utilização chás, infusões, xaropes e

35

extratos das demais partes da planta, tem sido fonte de importantes pesquisas (MIGLIATO et

al., 2006). Estudos realizados por Srivastava e Chandra (2013) relataram efeitos benéficos de

diferentes partes da planta de S.cumini com destaque para seu potencial antidiabético,

antioxidante, antihiperlipidemico, antiulcerativo, atividades hepatoprotetora, antialérgicos,

anti-inflamatórios, anti-artríticos, antibacterianas e radioprotetora.

Muitos estudos têm constatado o efeito hipoglicemiante de S. cumini, em diferentes

tipos de extratos (SCHOSSLER et al., 2004; SINGH;GUPTA, 2007;

SARAVANAN;LEELAVINOTHAN, 2012). Anandharajan e cols. (2006) demonstraram in

vitro que o extrato metanólico de S. cumini é capaz de aumentar a captação de glicose em células

musculares L6 por aumentar as expressões do transportador de glicose (GLUT–4), do receptor

ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PPARγ) e da fosfatidil-inositol 3-quinase (PI

3–quinase).

A eficácia do S. cumini foi comparada com a metformina, uma droga hipoglicemiante

considerada padrão na sensibilização à insulina e eficaz tanto como monoterapia como em

combinação com quase todos os outras terapia para diabetes tipo 2. A eficácia de S. cumini

mostrou-se superior ou equivalente na redução da glicemia, quando comparado a tais agentes

orais utilizados para tratar a diabetes, como a metformina (MONAMI et al., 2008; SHARMA

et al., 2012) .

O efeito hipolipemiante de S. cumini tem sido analisado em alguns trabalhos. Silva

(2006) utilizou ratos Wistar, e tratou com o extrato hidroalcóolico das folhas do jambolão,

durante 180 dias, foi observado diminuição significativa dos níveis séricos de lipídeos, na dose

de 0,25 g/kg. A administração oral do extrato de sementes do jambolão reduziu os níveis de

LDL e lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e aumentou os de lipoproteína de alta

densidade (HDL) em ratos diabéticos, devido ao controle na hidrólise de lipoproteínas e da

absorção e metabolismo no fígado e rim (RAVI;RAJASEKARAN;SUBRAMANIAN, 2005).

França (2010) avaliou o efeito do extrato hidroalcoólico das folhas de S. cumini em ratos obesos

dislipidêmicos, e observou que o extrato apresentou ações hipolipemiantes e hipoglicemiantes.

Atale et al. (2013) analisaram o efeito cardioprotetor de um extrato metanólico

elaborado com sementes de S. cumini em mioblastos cardíacos submetido ao estresse oxidativo

induzido pelo conteúdo excessivo de glicose, para mimetizar células cardíacas de pacientes

diabéticos. E observou que o extrato suprimiu a produção de ROS, melhorou o metabolismo de

enzimas antioxidantes e promoveu proteção às células cardíacas frente ao estresse induzido pelo

excesso de glicose. Herculano (2014) observou que o extrato hidroalcóolico da fruta da S.

cumini promoveu hipotensão em ratos hipertensos (SHR) possivelmente pela diminuição da

36

resistência periférica mediada pelo endotélio, além da redução da pressão arterial média, após

4 -6 horas da administração do extrato via oral.

As propriedades terapêuticas de S. cumini são atribuídas, principalmente, à presença de

vários flavonóides e alcalóides em diferentes partes da planta. Estes compostos são prontamente

absorvidos pelos seres humanos. Entretanto, estudos mais sistemáticos são necessários para

descrever detalhes de seus mecanismos de ação sobre a maquinaria enzimática direta ou

indiretamente envolvida na defesa antioxidante e anti-inflamatória, principalmente. Alguns

estudos descrevem efeitos benéficos de extratos de diferentes partes da planta de S. cumini e

quanto a sua caracterização fitoquímica apresentam, predominantemente, flavonóides e

fenólicos. Diante disto, especula-se que os efeitos benéficos de S. cumini já relatado em

roedores, precisam ser melhor elucidados para que possam, então, ser extrapolados para seres

humanos se funcionarem como alternativa para o tratamento e prevenção de algumas doenças,

principalmente àquelas de caráter crônico (SRIVASTAVA;CHANDRA, 2013).

37

3 ABORDAGEM METODOLÓGICA

3.1 TIPO DE ESTUDO E CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Farmacologia Cardiovascular no

Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), Campus I, João Pessoa.

Tratou-se de um estudo experimental com ensaios farmacológicos e moleculares utilizando

técnicas in vivo e in vitro. Para execução da referida pesquisa, o projeto foi submetido à análise

e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais, da Universidade Federal da Paraíba,

sob protocolo n° 1001/14 (Anexo 1).

3.2 CONTEÚDO FENÓLICO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA AMOSTRA

3.2.1 Obtenção e preparo da substância teste

As frutas utilizadas (S. cumini) foram provenientes da Empresa Paraibana de

Abastecimento e Serviços Agrícolas (EMPASA) do município de João Pessoa - PB. Foram

utilizados 30 Kg do fruto, obtidos de uma mesma safra entre os meses de Janeiro e Fevereiro

de 2014, apresentando um mesmo grau de maturação. As frutas passaram por um processo de

seleção, onde foram descartadas aquelas com aparentes danos físicos, presença visível de

sujidades e sinais de infecção. Após esta seleção, foi realizado o processo de higienização de

acordo com a legislação vigente (BRASIL, 2004), e posteriormente destinou-se amostras da

fruta juntamente com outras partes da planta para identificação botânica, realizada pelo prof.

Dr. Ionaldo José Lima Diniz Basílio.

A pele das frutas foram removidas manualmente e previamente congeladas em Freezer

- 80°C, em depósitos de vidro devidamente identificados e protegidos da luz, por um período

mínimo de 24h. Em seguida, submetida ao processo de liofilização sob pressão de vácuo de

0,024 mBar e tempertaura de -45°C em liofilizador Free Zone® Liter Benchtop Freeze Dry

Systems LABCONCO® por 24h (DE TORRES et al., 2010), após o processo de secagem foi

armazenada sob temperatura de congelamento em freezer comum à -22 C.

Os produtos liofilizados foram submetidos a um processo de trituração, utilizando

inicialmente um “mixer” comercial seguido de trituração em gral de porcelana, para finalmente

se obter um produto final com tamanho de partículas homogêneo abaixo de 0,35 mm peneirado

em Tamis. Com o material homogeneizado foi realizado o processo de extração usando como

38

solvente uma mistura de etanol-água (50:50) em ultrasson com frequência de 42 kHz por 16

minutos, a proporção de pó seco em relação ao volume de solvente foi de 5% (m:v) (SHI et al.,

2003; CARRERA et al., 2012). Após a extração, o material foi filtrado à vácuo em papel de

filtro comum para retirada do material particulado, restando o extrato solubilizado no solvente

extrator.

Para a obtenção do extrato seco a solução extrativa foi levada a rota evaporação para

evaporação do etanol a 45°C até que o volume fosse reduzido à metade do volume inicial da

mistura de extração. Em seguida, o extrato livre de etanol foi congelado em freezer – 80°C por

24h e posteriormente levado a liofilização 0,024 mBar por 48h, obtendo-se por fim o extrato

seco, caracterizado como extrato hidroalcoólico da pele do fruto de S.cumini (EHAPS),

conservado em freezer comum à – 22°C para utilização nos experimentos.

3.2.2 Determinação de fenólicos totais

O teor de fenólicos totais (TPC) foi medido, de acordo com Slinkard e Singleton (1977),

com algumas adaptações. Uma alíquota de 150 µL do extrato (5 µg/mL) foi misturada com 60

µL do reagente Folin-Ciocalteu e 2.610 µL de água destilada. A mistura foi agitada durante 1

minuto e logo após adicionou-se 180 µL de solução saturada de carbonato de sódio a 15%

(Na2CO3). O conteúdo da mistura foi agitado, sob proteção da luz, durante 30 minutos em estufa

a 45°C. A absorbância foi medida a 760 nm num espectrofotômetro de UV-Vis (Shimadzu UV-

2550, Kyoto, Japão). O teor de compostos fenólicos totais foi determinado por interpolação da

absorbância da amostra vs uma curva de calibração construída com os padrões de ácido gálico

(0,001 – 0,020 mg/mL, em etanol) e o resultado expresso em miligramas de equivalentes de

ácido gálico por cem gramas da amostra (mgEAG/100g) (Figura 6).

Figura 6 – Determinação de Fenólicos Totais

FONTE: Autor, 2015.

60 µL Folin-

Ciocalteu

150 µL

extrato

Agitação

180 µL Solução

saturada

Na2CO

3 (20%)

Banho-maria

45°C/ 30min

2610 µL

H2O

destilada

39

3.2.3 Determinação da Atividade Antioxidante pelo método de DPPH

A atividade de eliminação do radical livre 2,2-difenil-b-picrilhidrazil-DPPH-é um dos

métodos mais utilizados para a avaliação da capacidade antioxidante, o ensaio da atividade

antioxidante do EHAPS, foi adaptado de acordo com Brand-Williams et al. (1995). Este radical

é estável para um comprimento de onda na extensão de 515-520 nm de absorbância, o que

facilmente sofre redução na presença de antioxidantes, com a correspondente diminuição da

absorção. O percentual da atividade antioxidante total (AAT %), ou a atividade de eliminação

de radicais livres, corresponde à quantidade de DDPH consumida pelo antioxidante. Com base

em um estudo preliminar, quantidades apropriadas da solução de DPPH• (23,6 µg/mL de EtOH)

foram adicionados às soluções aquosas dos diferentes EHAPS, com o objetivo de se obter

concentração final de 200 μg/mL do extrato. Em triplicata, as alíquotas (separadamente) foram

misturadas com etanol e 2.700 µL da solução de DPPH•. Após 30 minutos, a leitura foi realizada

a 517 nm em espectrofotómetro modelo Shimadzu modelo 2550- UV-UV-vis. As leituras

permitiram determinar o percentual de atividade antioxidante AAT% (Eq 1.) e a CE50 do

EHAPS, através da seguinte equação obtida na reta:

%𝐴𝐴𝑇 = 100 × (𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎

𝐴𝑏𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙) (Eq. 1)

Em que, Abscontrol é a absorvância da solução de etanol DPPH • radical e Absamostra é a absorção

da amostra, na presença do radical DPPH.

3.2.4 Quantificação dos compostos fenólicos do EHAPS por cromatografia líquida de alta

eficiência

A análise por HPLC foi realizada em um cromatógrafo a líquido de alta eficiência da

marca Thermo Scientific®, modelo Surveyor® com injetor automático de modelo Thermo

Scientific Surveyor Autosampler Plus®, utilizando um Alliance 2695 250 × 4,6 mm

Phenomenex (Torrence, CA, EUA) C18 Aqua e monitorizado com um dispositivo de varredura

de arranjo de diodos de modelo ThermoScientific® PDA Plus. A concentração do extrato foi

de 5 mg/mL em solução de água e ácido fórmico (99:1), e o padrão ácido gálico (Sigma-

Aldrich®) foi diluído em MeOH/ácido fórmico (9:1), na concentração de 0,85 mg/mL. A análise

por HPLC-PDA foi realizada utilizando um sistema de gradiente de solvente de 1% de ácido

fórmico (A) e acetonitrila (B) como se segue: 90 % a 75 % de A ao longo de 30 min; 75 % a

40

40 % de A 30-45 min a uma velocidade de fluxo de 1 mL/min (REYNERTSON et al., 2008).

Os resultados foram monitorizados 210-600 nm. A área do pico de cada composto quantificado

nas amostras de teste foi integrado a partir do cromatograma de HPLC-PDA em 254 nm,

utilizando o software ChromQuest® versão 5.0. A área do pico do padrão foi utilizada para

cálculo da concentração do ácido gálico na amostra.

3.3 ESTUDOS IN VIVO

Para o tratamento dos animais foram utilizadas amostras que apresentaram conteúdo

fenólico acima de 5.440,86 mg EAG/ 100g de amostra, atividade antioxidante mínima de 59

µg/mL, além disso, todas as amostras apresentavam concentração de 67 µg/mL de ácido gálico.

3.3.1 Composição e Preparo da Dieta Experimental

A composição da dieta foi baseada na proposta por Estadella et al. (2004) em estudos

prévios, sendo uma dieta do tipo de cafeteria, hipercalórica e hiperlipídica, capaz de induzir

obesidade em animais. Os ingredientes utilizados foram ração comercial padrão (Presence®),

chocolate ao leite, amendoim torrado, e biscoito de amido de milho, em uma proporção de

3:2:2:1, todos os ingredientes foram triturados, com exceção do chocolate que foi ralado em

ralador de aço inoxidável, peneirados, pesados e misturados manualmente sob baixa intensidade

de luz por aproximadamente 5 minutos. Uma pequena quantidade de água quente foi

adicionada, até se atingir a consistência ideal para a granulação. Após isso, a dieta foi disposta

em formas, aplanadas com rolo e peletizada. A secagem foi realizada em estufa com circulação

de ar (AL 102/250, America Lab), por aproximadamente 24 h. As dietas eram preparadas a

cada 15 dias, armazenadas em sacos plásticos sob temperatura de refrigeração (5 °C) até serem

administradas aos animais. O grupo dieta normocalórica recebeu ração comercial padrão

(Presence®) durante todo o período experimental.

3.3.2 Delineamento do Estudo

Foram utilizados um total de 48 ratos machos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus)

em todos os experimentos, com 12 semanas de idade, pesando entre 300-350g provenientes do

Biotério Prof. George Thomas, da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), mantidos sob

condições controle de temperatura (21 1º C), ciclo claro-escuro de 12 horas (6 – 18 horas) e

41

tendo livre acesso à água e alimentação (ad libitum). Os animais foram acomodados em gaiolas

plásticas micro-isoladoras de dimensão 49x34x16 (CxLxA, em cm), cada uma com no máximo

4 animais. Todos os protocolos foram submetidos a avaliação e aprovados pela Comissão de

Ética no Uso de Animais do Centro de Biotecnologia (CEUA-CBiotec) da Universidade

Federal da Paraíba, protocolo n° 1001/14.

Os animais foram randomizados em seis grupos experimentais (n=8/grupo): dieta

normocalórica + solução salina (NCT); dieta normocalórica + EHAPS, 100 mg/Kg de peso

(N100); dieta normocalórica + EHAPS, 300 mg/Kg de peso (N300); dieta hipercalórica +

solução salina (HCT); dieta hipercalórica + EHAPS, 100 mg/Kg de peso (H100) e dieta

hipercalórica + EHAPS, 300 mg/Kg de peso. A administração do extrato foi realizada por via

oral (i.g.), nas respectivas doses, os grupos controles, receberam por via oral solução salina

(0.9%) durante todo o experimento, todos os animais receberam um volume total de 0,5 mL

para cada 100g de peso, do extrato e placebo. O tratamento teve duração total de 6 semanas,

sendo a administração do extrato e da dieta iniciada concomitantemente. O esquema do estudo

pode ser observado na Figura 7.

Figura 7 – Protocolo de execução do experimento in vivo

NCT: grupo normocalórico controle; N100: grupo normocalórico dose 100mg/Kg; N300: grupo normocalórico

dose 300mg/Kg; HCT: grupo hipercalórico controle; H100: grupo hipercalórico dose 100mg/Kg; H300: grupo

hipercalórico dose 300mg/Kg.

3.3.3 Avaliação dos Parâmetros Murinométricos e Eficiência Alimentar

Foram tomadas as medidas de peso, circunferência abdominal e comprimento do

animal. As medidas de peso foram realizadas a cada três dias, em balança AND. A

Experimento in vivo (modelo animal)

GRUPO

NORMOCALÓRICO

NCT N100 N300

GRUPO

HIPERCALÓRICO

HCT H100 H300

42

circunferência abdominal e o comprimento do animal foram mensuradas ao final do tratamento

com os animais anestesiados com cetamina (60 mg/kg) e xilasina (15 mg/Kg) via

intraperitoneal. O comprimento do animal foi realizado a partir da narina até a base caudal

(junção pélvica-cauda); a circunferência abdominal foi aferida no ponto imediatamente anterior

as patas traseiras; o índice de massa corporal foi determinado dividindo-se o peso do animal (g)

pelo quadrado do seu comprimento (cm). Utilizou-se uma fita inelástica para todas as medições

(NOVELLI et al., 2007).

A ingestão de água e consumo de ração foi monitorado diariamente. O coeficiente

eficiência alimentar foi calculado dividindo-se o ganho de peso total do animal (g), pela energia

total ingerida em (Kcal), durante o período experimental, com o objetivo de analisar a

capacidade de conversão da energia alimentar em peso corporal (NOVELLI et al., 2007;

WONG et al., 2012).

3.3.4 Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos

Ao final do período experimental, os animais foram submetidos a um jejum noturno de

12 horas, e cada animal foi anestesiado com cetamina (60 mg/kg) e xilasina (15 mg/Kg) via

intraperitoneal. O sangue foi coletado por punção cardíaca e transferidos para tubos

heparinizados, os quais foram centrifugados a 1750 x g por 10 minutos, para obtenção do

plasma. O plasma foi transferido para eppendorfs codificados e armazenados a -80 °C para

posterior análise. Os parâmetros analisados foram glicemia de jejum, colesterol total,

triglicerídeos, LDL-C e HDL-C, todas as análises foram obtidas por meio de leituras

espectroscópicas automatizadas (Labtest, Brasil) por meio de reações com Kits comerciais

(PANCHAL et al., 2011). O cálculo do índice aterogênico foi dado pelo Log (TG/HDL)

(NWAGHA et al., 2010).

3.3.5 Pesagem de Órgãos

Após a coleta sanguínea os animais foram eutanasiados por decaptação em guilhotina,

após a realização da laparotomia, foram retirados os seguintes órgãos coração, fígado e rins,

lavados com solução transporte, dispostos em gases para absorver o excesso de líquido e então

Coeficiente de Eficiência Alimentar = Ganho de peso corporal

Consumo diário de energia (Kcal)

43

pesados. Após isso, foram transferidos para tubos criogênicos codificados, congelados em

nitrogênio líquido, e armazenados a -80 ° C. A gordura abdominal, epididimal e retroperitoneal,

foi dissecada, lavada, disposta em papel absorvente para retirada do excesso de líquido, e

pesada. O cálculo do índice de adiposidade foi mensurado pela soma dos depósitos de gordura

abdominal (tecido retroperitoneal e epididimal) normalizada pelo peso corporal final

multiplicado por 100 (FREIRE et al., 2014).

3.3.6 Medida Indireta de Pressão Arterial

Para realizar as medidas indiretas de pressão arterial, os animais foram colocados num

restritor de acrílico, por aproximadamente 10 min, ficando apenas a cauda exposta, onde foi

acoplado o tail cuff e o sensor piezo elétrico para a medida de pulso. Os animais foram

previamente aclimatados, durante sete dias, a fim de aumentar a fidedignidade dos resultados

ao se tomarem as medidas durante o tratamento. Caso, durante a aferição da pressão arterial

indireta fossem notados sinais de desconforto, o procedimento era interrompido e retomado

minutos depois.

Ao tail cuff conectava-se uma pêra de borracha através de um arranjo de válvulas de

admissão e de escape que permitem a inflação e deflação de uma membrana de látex a uma taxa

constante. Os sensores de pulso captavam os estímulos mecânicos, e os transformava em um

estímulo elétrico, tendo a medida do pulso. Ao observar que o sinal do pulso apresentava-se

estável a medida era então realizada. Ao inflar a bomba, uma interrupção do fluxo sanguíneo

na artéria caudal ocorria e o sinal de pulso era captado pelo sensor, quando o pulso do animal

retornava, dessa forma, a pressão arterial era caracterizada, através da pressão sistólica e o

posterior retorno do pulso a sua amplitude total caracterizava a pressão diastólica

(FRITZ;RINALDI, 2008).

Os sinais a partir dos sensores de pressão e sensores de pulso foram amplificados e

digitalizados em um software (Labchart7) onde se podia visualizar as medidas de pulso, pressão

e frequência cardíaca, para posterior análise. Para cada determinação indireta da pressão

sistólica, as leituras de inflação e deflação eram registradas, assim como o intervalo de

compressão.

3.4 ENSAIOS IN VITRO

Soluções Fisiológicas e Substâncias

44

Para o preparo das soluções nutritivas, utilizadas nos protocolos in vitro, foram

utilizadas as seguintes substâncias: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto

de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O), cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O),

glicose (C6H12O6) bicarbonato de sódio (NaHCO3) e fosfato de sódio mono-hidratado

(NaH2PO4.H2O), conforme demonstrado na Tabela 4. Todos estes sais foram obtidos da

empresa VETEC. Durante a realização dos experimentos foram utilizadas as seguintes

substâncias: cloridrato de L (-) fenilefrina (FEN); cloridrato de acetilcolina (ACh);

nitroprussiato de sódio (NPS). Todas obtidas da Sigma-Aldrich Brasil Ltda (São Paulo-SP,

Brasil).

Tabela 4 – Composição da solução de Tyrode para artéria mesentérica

SAIS CONCENTRAÇÃO (mM)

NaCl 158,3

KCl 4,0

CaCl2.2H2O 2,0

MgCl2.6H20 1,05

NaHCO3 10,0

NaH2PO4.H2O 0,42

Glicose 5,6

Fonte: TANAKA et al., 1999

3.4.1 Preparações dos Anéis de Artéria Mesentérica Superior Isolada de Rato

Após identificação, a artéria mesentérica superior foi retirada através de uma

laparotomia e seccionada em anéis de 1 - 2 mm. Os anéis livres de tecido conectivo e adiposo

foram mantidos em cubas contendo 10 mL de solução de Tyrode (TANAKA et al., 1999), a 37

ºC e gaseificada com uma mistura carbogênica (95 % de O2 e 5 % de CO2). Os aneis foram

suspensos por linhas de algodão fixadas a um transdutor de força (MLT020, ADInstruments,

Austrália), acoplado a um sistema de aquisição (ML870/P com LabChart versão 7.0,

ADInstruments, Austrália) para o registro das tensões isométricas. Cada anel era submetido a

uma tensão constante de 0,75 g por um período de estabilização de 60 minutos. Durante este

tempo, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos para prevenir a interferência de

metabólitos indesejáveis (ALTURA;ALTURA, 1970).

45

Em todos os protocolos experimentais, após o período de estabilização de 60 minutos,

a viabilidade do tecido e a integridade do endotélio foram verificadas através de uma pré-

contração do tecido com fenilefrina (FEN) 10 µM, um agonista dos receptores α1-adrenérgicos

(BYLUND, 1992; BUSCHER et al., 1999). No componente tônico desta contração, foi

adicionado um agonista não seletivo dos receptores muscarínicos, acetilcolina (ACh) 10 μM

com o intuito de avaliar a integridade do endotélio vascular (FURCHGOTT;ZAWADZKI,

1980). Os tecidos nos quais a ACh reverteu o tônus induzido pela FEN mais que 90% foram

designados com endotélio funcional (Figura 7A) e nos tecidos no qual a ACh causou reversão

menor que 10% foram designados com endotélio desnudo (Figura 7B)

(BROCHET;LANGTON, 2006). Os anéis sem endotélio eram obtidos mecanicamente por

meio do atrito entre as paredes internas do vaso com uma haste de metal. Os anéis com

relaxamentos entre 10 e 90% foram descartados.

46

Figura 8 - Representação da verificação da viabilidade do órgão e da integridade do endotélio

vascular. A) Presença do endotélio e B) Ausência do endotélio funcional

A)

B)

47

3.4.2 Avaliação do Tratamento com EHAPS sobre a Reatividade Vascular

Após a verificação da integridade do órgão e da funcionalidade endotelial, como

descrito no item acima. Foram obtidas curvas concentração-resposta para FEN (1nM a 1 µM),

para NPS (1 µM a 100mM) ou para Ach (1nM a 1 µM). A potência e eficácia do

vasorrelaxamento dos agonistas foram avaliadas por meio dos valores de CE50 ou pD2 e Emáx,

respectivamente.

3.5 ENSAIO MOLECULAR

3.5.1 Medida de estresse oxidativo em eritrócitos de ratos por citometria de fluxo

As amostras de sangue total foram centrifugadas a 990 x g por 10 minutos e os eritrócitos

incubados com DCFH-DA (10 µM) por 30 minutos ao abrigo da luz. Em seguida foram levadas

ao citômetro FACS Canto-II equipado com laser de argônio com 15mW e λ = 488nm para

leitura das amostras e análise no software DIVA 6.0 (BD, Santa Mônica, CA, EUA). Um total

de 10.000 eventos foram adiquiridos, com exclusão de debris e restos celulares definidos pelo

“threshold” do FSC (Forward scatter), e sinais de fluorescência foram captados no seguinte

comprimento de onda: 515-545 para o FITC. Mudanças na fluorescência (F1) serão

normalizadas com a fluorescência obtida na amostra de animais com dieta normocalórica e

tratados com placebo. O DCFH-DA é uma das sondas mais comumente utilizadas para detecção

da formação de ROS intracelular (KOOY;ROYALL;ISCHIROPOULOS, 1997;

WANG;JOSEPH, 1999), após sua absorção, é clivado por esterases intracelulares a 2', 7'-

dichlorofluorescin (DCFH), aprisionado no interior das células, e oxidado para a molécula

fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceína (DCF) por uma variedade de ROS.

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Para a

análise dos grupos controle e tratados foi utilizado o teste ANOVA one way (quando havia

apenas uma variável) ou two way (quando havia duas variáveis) com medidas repetidas,

utilizando o pós-teste Bonferroni para determinação de significância. Curvas concentração-

resposta foram construídas por regressão não-linear para análise dos resultados de reatividade

48

vascular. Os valores foram considerados significantes quando p < 0.05. Para as análises foi

utilizado o programa estatístico GraphPad Prism versão 6.0®.

49

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59

APÊNDICE

60

APÊNDICE

ARTIGO ORIGINAL

EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA PELE DO FRUTO DE Syzigium cumini (L.)

DIMINUI GANHO DE PESO, MELHORA RESPOSTA VASCULAR E ESTRESSE

OXIDATIVO EM RATOS ALIMENTADOS COM DIETA HIPERCALÓRICA

Periódico: Food Research International

ISSN: 0963-9969

FI: 3.050

QUALIS: A1 na área de Nutrição

(ANO-BASE 2013)

61

EXTRATO HIDROALCOÓLICO DA PELE DO FRUTO DE Syzigium cumini (L.) DIMINUI

GANHO DE PESO, MELHORA RESPOSTA VASCULAR E ESTRESSE OXIDATIVO EM

RATOS ALIMENTADOS COM DIETA HIPERCALÓRICA

Rayanne de Araújo Torres a, Suênia Maria do Nascimento a, Priscila Maria Pereira Maciel b,

Tays Amanda Felisberto da Silva c, Hassler Clementino Cavalcante d, Ricardo Cartaxo

Ramalho c, Isac Almeida de Medeiros b, Robson Cavalcante Veras a*

a Programa de Pós-Graduação em Ciências da Nutrição, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal da Paraíba (UFPB), Campus I, 58059-900, João Pessoa, Paraíba –

Brasil

b Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Centro de

Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba (UFPB), Campus I, 58059-900, João

Pessoa, Paraíba – Brasil

c Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade

Federal da Paraíba (UFPB), Campus I, 58059-900, João Pessoa, Paraíba – Brasil

d Departamento de Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba

(UFPB), Campus I, 58059-900, João Pessoa, Paraíba – Brasil

* Autor correspondente: Robson Cavalcante Veras

Universidade Federal da Paraíba – Campus I, 58059-900

Centro de Ciências da Saúde

Pós-Graduação em Ciências da Nutrição

João Pessoa, Paraíba, Brasil

Tel.: +55 (83) 3216-7417

E-mail: rayanne2901.nutri@gmail.com

62

RESUMO

O fruto da S. cumini é considerado importante fonte de compostos fenólicos com efeitos

benéficos para a saúde, atribuído principalmente ao seu potencial antioxidante. No entanto,

poucos estudos evidenciam sua atividade frente às alterações provocadas pelo consumo de dieta

hipercalórica em animais. Assim sendo, o presente estudo objetivou investigar os efeitos do

extrato da pele do fruto de S. cumini (EHAPS), administrado por via oral, em doses repetidas

(100 e 300 mg/Kg de peso) em modelos animais alimentados com dieta hipercalórica durante

seis semanas. O teor de fenólicos totais foi de 5.440,86 mg EAG/ 100g de amostra e valor de

CE50 de 59 µg/mL de EHAPS. O grupo controle da dieta hipercalórica apresentou um ganho de

peso significativamente maior, a partir da terceira semana de tratamento, aumento da ingestão

calórica, circunferência abdominal, índice de adiposidade e níveis glicêmicos em relação ao

controle da dieta padrão, além de um aumento significativo da quantidade de espécies reativas

de oxigênio (ROS) e diminuição da resposta contrátil e vasorrelaxante em aneis de artéria

mesentérica isolada dos animais. O tratamento, em ambas doses, foi capaz de diminuir

significativamente o ganho de peso, a partir da 4° semana de tratamento, diminuir os níveis de

ROS e melhorar a resposta do vaso as drogas FEN e ACh. No entanto não houve mudanças

significativas nos níveis de pressão arterial, índice de adiposidade e glicemia plasmática dos

animais. Os resultados sugerem que os compostos fenólicos presente no EHAPS diminuem os

efeitos deletérios do consumo de dietas hipercalóricas em ratos, constituindo-se como uma

possível alternativa para a prevenção e tratamento de alterações relacionadas à obesidade.

Palavras Chave: Dieta hipercalórica. Estresse Oxidativo. Peso corporal. Reatividade Vascular.

Syzigium cumini

63

1. INTRODUÇÃO

A obesidade é apontada como um grave problema de saúde no mundo e sua prevalência

tem aumentado, dramaticamente, nas últimas décadas (Xu et al., 2015). Há uma estrita relação

entre a obesidade e o estresse oxidativo, uma vez que, a expansão do tecido adiposo visceral

eleva a produção de adipocinas que induzem o aumento dos níveis de espécies reativas de

oxigênio (ROS) e eleva a expressão e secreção de citocinas inflamatórias (Keaney et al., 2003;

Otani, 2011). O estresse oxidativo, por sua vez, aumenta a resistência à insulina no tecido

adiposo e em tecidos periféricos favorecendo o desenvolvimento de outras comorbidades, como

a hipertensão (Aroor & DeMarco, 2014; Sowers, Whaley-Connell, & Hayden, 2011).

Mudanças no estilo de vida como o elevado consumo energético e sedentarismo, observado nas

últimas décadas, impulsionou a adoção de dietas hipercalóricas e hiperlipídicas como modelo

de indução de obesidade em animais, tendo em vista sua semelhança com a gênese e as

respostas metabólicas decorrentes da obesidade em humanos (Rosini, Silva, & Moraes, 2012).

Vários tipos de dietas têm se mostrado eficazes em provocar alterações relacionadas ao

excesso de peso como resistência à insulina, intolerância à glicose, dislipidemias, disfunções

endoteliais e hipertensão em modelos animais (Lehnen, Rodrigues, Irigoyen, De Angelis, &

Schaan, 2013). Tradicionalmente, essas dietas atingem valores hipercalóricos pela adição de

hidratos de carbono ou pela simples troca de calorias derivadas de carboidratos por calorias

derivadas de gorduras (High Fat Diets – HFD), quando comparadas à dietas padrão (Kennedy,

Ellacott, King, & Hasty, 2010; Sampey et al., 2011).

Em contrapartida, estudos epidemiológicos sugerem que algumas espécies vegetais e

de frutos exercem um efeito protetor contra doenças crônicas, devido a presença de compostos

fitoquímicos (Zamora-Ros et al., 2010). Dentre esses compostos, os polifenois, destacam-se

pela relevante atividade antioxidante, atribuída, principalmente, a sua capacidade redutora, cuja

intensidade está relacionada ao número e posição das hidroxilas presentes na molécula (Melo,

Maciel, de Lima, & do Nascimento, 2008; Rice-Evans, Miller, & Paganga, 1996). O potencial

antioxidante destes compostos fenólicos está relacionado a redução nos níveis de estresse

oxidativo, e por conseguinte, vários efeitos benéficos a saúde, tais como: anti-inflamatórios,

redução da pressão arterial, disfunção endotelial, glicemia, lipídios séricos e índice de massa

corporal (IMC) (Eilat-Adar, Sinai, Yosefy, & Henkin, 2013; Meydani & Hasan, 2010).

Diante de tais evidências, o Syzygium cumini L., fruto pertencente à família Myrtaceae,

e originário da Índia, vem sendo estudado frente algumas doenças metabólicas devido sua

composição química e atividade antioxidante, mostrando um excelente potencial redutor e

64

sequestrador de radicais livres, sendo essas características atribuídas a presença de importantes

compostos fenólicos (Benherlal & Arumughan, 2007). Algumas propriedades terapêuticas

como: estimuladora hepática, digestiva, carminativa, hipoglicemiante, anti-hiperlipidêmica,

anti-ulcerogênica e hipotensora estão sendo relatadas na literatura e relacionados a diferentes

partes da planta de S. cumini, tais como: folhas, casca do caule e fruto (Mohamed, Ali, & El-

Baz, 2013; Srivastava & Chandra, 2013).

A pele do fruto de S. cumuni L., apesar de sua elevada concentração de compostos

antioxidantes, tem sido descartada frequentemente na produção de sucos e outros produtos, seja

em uma produção caseira ou industrial. Os estudos com a pele deste fruto são escassos,

principalmente demonstrando sua ação sobre modelos animais alimentados com dieta

hipercalórica. Diante disso, o estudo tem como objetivo avaliar o efeito do extrato

hidroalcoólico da pele do fruto de S. cumini sobre parâmetros murinométricos, bioquímicos,

bem como, sobre o estresse oxidativo, reatividade vascular e pressão arterial de ratos

alimentados com dieta hipercalórica.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Preparo do extrato

As frutas foram obtidas da Empresa Paraíba de Abastecimento e Serviços Agrícolas

(EMPASA), João Pessoa, Paraíba, Brasil. As frutas que apresentavam um mesmo grau de

maturação foram selecionadas e previamente higienizadas, logo após, a pele das frutas foi

removida manualmente, em ambiente protegido da luz, e congeladas em freezer a -80°C. Após

24 h de congelamento, realizou-se ao processo de liofilização sob pressão de vácuo de 0,024

mBar e temperatura de – 45 ºC em liofilizador Free Zone® Liter Benchtop Freeze Dry Systems

LABCONCO® por 24 h. O produto liofilizado foi triturado e padronizado, em tamanhos de

partículas homogêneo, abaixo de 0,35 mm em Tamis. A partir do material homogeneizado,

realizou-se a extração através de mistura de etanol-água (50:50) em ultrasson com frequência

de 42 kHz por 16 minutos, a proporção de pó seco em relação ao volume de solvente foi de 5%

(m:v), (Carrera, Ruiz-Rodriguez, Palma, & Barroso, 2012; Shi et al., 2003). Após a extração o

material foi filtrado à vácuo em papel de filtro comum restando o extrato solubilizado no

solvente extrator. Para a obtenção do extrato seco a solução extrativa foi levada a rota

evaporação a 45°C e o extrato livre de etanol foi congelado em freezer – 80°C por 24h e

posteriormente liofilizado a 0,024 mBar por 48h. O extrato seco (EHAPS – extrato

65

hidroalcóolico da pele de S. cumini) foi armazenado em freezer comum a -22°C para ser

utilizado nos experimentos.

2.2 Determinação de fenólicos totais e capacidade antioxidante

O teor de fenólicos totais foi medido de acordo com Slinkard and Singleton (1977),

usando o reagente Folin-Ciocalteu, em espectrofotômetro de UV-Vis (Shimadzu UV-2550,

Kyoto, Japão). Os resultados foram expressos em miligramas de equivalentes de ácido gálico

por cem gramas do extrato (mg EAG /100 g). A atividade antioxidante foi medida pela

capacidade de sequestro de radicais livres pelo EHAPS, com base na metodologia de Brand-

Williams et al. (1995). A leitura foi realizada a 517 nm, após 30 minutos, em espectrofotômetro

Shimadzu modelo 2550- UV-UV-vis. A porcentagem de atividade antioxidante AAT% e a CE50

do EHAPS, foram determinadas a partir da equação obtida na reta.

2.3 Análise por HPLC

Para obtenção do cromatograma, a concentração do extrato foi de 5 mg/mL em solução

de água e ácido fórmico (99:1), e o padrão ácido gálico foi diluído em MeOH/ácido fórmico

(9:1), na concentração de 0,85 mg/mL. A análise por HPLC-PDA foi realizada utilizando um

sistema de gradiente de solvente de 1% de ácido fórmico (A) e acetonitrila (B) como se segue:

90 % a 75 % de A ao longo de 30 min; 75 % a 40 % de A 30-45 min a uma velocidade de fluxo

de 1 mL/min (Reynertson, Yang, Jiang, Basile, & Kennelly, 2008). Os resultados foram

monitorizados a 210-600 nm. A área do pico do padrão foi utilizada para cálculo da

concentração do ácido gálico na amostra.

2.4 Animais e dieta

Foram utilizados 48 ratos machos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus) em todos

os experimentos, com idade de 12 semanas, pesando entre 300-350g, provenientes do Biotério

Prof. George Thomas, da Universidade Federal da Paraíba, mantidos sob condições controle de

temperatura (21 1º C), ciclo claro-escuro de 12 horas e tendo livre acesso à água e alimentação

(ad libitum). Todos os protocolos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais

do Centro de Biotecnologia (CEUA-CBiotec) da Universidade Federal da Paraíba, protocolo

n° 1001/14.

66

Os animais foram randomizados em seis grupos (n=8/grupo): dieta normocalórica +

solução salina (NCT); dieta normocalórica + EHAPS, 100 mg/Kg de peso (N100); dieta

normocalórica + EHAPS, 300 mg/Kg de peso (N300); dieta hipercalórica + solução salina

(HCT); dieta hipercalórica + EHAPS, 100 mg/Kg de peso (H100) e dieta hipercalórica +

EHAPS, 300 mg/Kg de peso (H300). O extrato foi administrado por via oral (i.g.), os grupos

controles receberam solução salina (i.g.) como placebo, durante todo o período experimental.

O tratamento teve duração total de 6 semanas, sendo a administração do extrato e da dieta

iniciada simultaneamente.

A dieta hipercalórica foi adaptada de Estadella et. al., (2004), composta por ração

comercial, amendoim, chocolate ao leite e biscoito de amido de milho na proporção de 3: 2: 2:

1. Todos os componentes foram triturados, misturados, peletizadas e secos em estufa com

circulação de ar, por aproximadamente, 24h.

2.5 Avaliação dos Parâmetros Murinométricos e Eficiência Alimentar

Foram tomadas as medidas de peso, circunferência abdominal e comprimento animal.

As medidas de peso foram realizadas a cada três dias, em balança AND. A circunferência

abdominal e o comprimento animal foram mensuradas ao final do tratamento com os animais

anestesiados com cetamina (60 mg/kg) e xilasina (15 mg/Kg) via intraperitoneal. O índice de

massa corporal foi determinado dividindo-se o peso do animal (g) pelo quadrado do seu

comprimento (cm). Utilizou-se uma fita inelástica para todas as medições (Novelli et al., 2007).

A ingestão de água e consumo de ração foi monitorado diariamente. A eficiência

alimentar foi calculada com base no coeficiente de eficiência alimentar, dado pela relação entre

o ganho de peso total (g) e a média de ingestão calórica diária (Kcal) de cada animal, durante o

período experimental (Novelli et al., 2007; Wong, Poudyal, Ward, & Brown, 2012).

2.6 Medida Indireta de Pressão Arterial

O efeito do tratamento sobre os níveis de pressão arterial foi avaliado através da medida

de pressão arterial indireta por plestimografia, com registro dos níveis de pressão arterial

sistólica (PAS) nos dias 0, 8, 20, 30 e 42. As medidas foram tomadas usando um transdutor de

pulso MLT1010 Piezo-elétrico (ADInstruments, Sydney, Austrália) que captava os estímulos

mecânicos, e os transformava em um estímulo elétrico, e um “tail cuff” inflável ligado a um

transdutor de pressão fisiológica MLT844 (ADInstruments) e unidade de aquisição de dados

67

PowerLab (ADInstruments). Os sinais a partir dos sensores de pressão e de pulso foram

amplificados e depois digitalizados em software (Labchart7) (Fritz & Rinaldi, 2008).

2.7 Avaliação do tratamento com o EHAPS sobre a reatividade vascular

Para medidas de tensão isométrica, anéis (2 - 3 mm) de artéria mesentérica superior

isolada dos ratos tratados foram suspensos em cubas de órgãos isolados contendo solução de

Tyrode (pH 7.4) a 37ºC e aeradas com carbogênio (95 % O2: 5 % CO2) (Veras et al., 2013). Os

anéis foram estabilizados por uma hora a uma tensão ideal de 0,75g, previamente determinada

por experimentos de relação comprimento vs tensão. A presença funcional do endotélio foi

confirmada quando apresentava relaxamento superior a 90% após a adição de Acetilcolina

(Ach, 10 µM) em anéis pré-contraídos com fenilefrina (FEN) (10 µM) (Queiroz et al., 2011).

Anéis com relaxamento inferior foram submetidos à remoção mecânica do endotélio e

novamente submetidos ao teste de funcionalidade endotelial citado, os anéis com reversão igual

ou inferior a 10%, foram considerados com endotélio desnudo. Após a verificação da

integridade do órgão e da funcionalidade endotelial. Foram construídas curvas concentração-

resposta para FEN (1nM a 1 µM), para Ach (1nM a 1 µM) e NPS (1 µM a 100mM). A potência

e eficácia do vasorrelaxamento dos agonistas foram avaliadas por meio dos valores de CE50 ou

pD2 e Emáx, respectivamente.

2.8 Medida de estresse oxidativo em eritrócitos de ratos, por citometria de fluxo

As amostras de sangue total foram centrifugadas a 990g por 15 minutos e os eritrócitos

incubados com DCFH-DA (10 µM) por 30 minutos ao abrigo da luz. Em seguida foram levadas

ao citômetro FACS Canto-II equipado com laser de argônio com 15mW e λ = 488nm para

leitura das amostras e análise no software DIVA 6.0 (BD, Santa Mônica, CA, EUA). Um total

de 10.000 eventos foram adiquiridos, com exclusão de debris e restos celulares definidos pelo

“threshold” do FSC (Forward scatter), e sinais de fluorescência foram captados no seguinte

comprimento de onda: 515-545 para o FITC. Mudanças na fluorescência (F1) foram

normalizadas com a fluorescência obtida na amostra de animais com dieta normocalórica e

tratados com placebo.

2.9 Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos

68

Ao final do período experimental, os animais foram submetidos a um jejum de 12 horas,

e os animais previamente anestesiados tiveram o sangue coletado, por punção cardíaca e

transferidos para tubos heparinizados, para obtenção do plasma. Os parâmetros analisados

foram glicemia de jejum, colesterol total, triglicerídeos, LDL-C e HDL-C, todas as análises

foram obtidas por meio de leituras espectroscópicas automatizadas por meio de reações com

Kits comerciais Labtest (Panchal et al., 2011). O cálculo do índice aterogênico foi dado pelo

Log (TG/HDL) (Nwagha, Ikekpeazu, Ejezie, Neboh, & Maduka, 2010)

2.10 Pesagem de Órgãos

Os órgãos coração, fígado, rins, e a gordura abdominal, epididimal e retroperitoneal,

foram dissecados, lavados em solução transporte e dispostos em gases para absorção do excesso

de líquido e logo após, pesados. O cálculo do índice de adiposidade foi mensurado pela soma

dos depósitos de gordura abdominal (retroperitoneal e epididimal) multiplicado por 100 e

normalizado pelo peso corpóreo final (g/100g animal) (Freire et al., 2014).

2.11 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Os

resultados foram submetidos à análise de variância (one-way ou two-way ANOVA) e o pós-

teste Bonferroni foi utilizado para determinação de significância. Curvas concentração-resposta

foram construídas por regressão não-linear para análise dos resultados de reatividade vascular.

Valores foram significativos quando p < 0.05. Foi utilizado o programa estatístico GraphPad

Prism versão 6.0®.

69

3. RESULTADOS

Padronização do EHAPS

O valor médio de fenólicos totais foi de 5.440,86 ± 77,10 mg EAG/100 g de extrato. A

atividade antioxidante foi determinada a partir de diferentes concentrações do EHAPS (30, 50,

70, 100 µg/mL), e os resultados foram de 31,53; 49,26; 62,78 e 83,43%, respectivamente. Com

base nestes resultados, obteve-se um valor de CE50 de 59 µg/mL do EHAPS. A concentração

de ácido gálico no extrato foi de 67 µg/mL (pico3), com base em análise cromatográfica dos

compostos fenólicos do extrato (Figura 1).

Consumo de água e ração, parâmetros corporais e eficiência alimentar

A ingestão de ração foi maior nos animais que consumiram dieta normocalórica. No

entanto, a elevada densidade energética da dieta hipercalórica promoveu uma ingestão calórica

significativamente maior nos grupos HCT, H100 e H300 em relação ao grupo controle com

ingesta normocalórica. O grupo H300 apresentou uma redução significativa do consumo

alimentar e ingestão calórica em relação aos grupos HCT e H100 (Figura 2A e 2B). O consumo

de água também foi menor nos grupos com dieta hipercalórica, sendo significativamente menor

nos animais do grupo H100 em relação ao HCT e H300. Já no grupo dieta normocalórica, N300

teve um consumo de água significativamente menor em relação ao NCT e N100 (Figura 2C).

O ganho de peso total foi significativamente maior nos animais do grupo controle que

consumiram dieta hipercalórica em relação aos demais grupos experimentais. De acordo com a

Figura 3A, pode-se observar o aumento de peso percentual ao longo do tratamento. A média de

ganho de peso percentual do grupo HCT, a partir da 3° semana de tratamento, foi

significativamente mais elevado em relação ao NCT, com valores de 14.7% ± 1.7 e 7.1% ± 0.9,

respectivamente. O tratamento com EHAPS mostrou-se eficaz na redução de ganho de peso em

percentual dos animais alimentados com dieta hipercalórica, em ambas doses, a partir da 4°

semana de tratamento, com valores de 13.3% ± 1.1 e 12.5 ± 1.5 para os grupos H100 e H300,

em relação a 19.7% ± 2.6 do grupo HCT. Nenhuma diferença significativa foi observada entre

os grupos da dieta normocalórica ao longo do tratamento. O índice de adiposidade abdominal

demonstrou a eficiência da dieta hipercalórica em induzir um acúmulo de gordura abdominal

nos animais do grupo HCT comparado aos animais do grupo dieta normocalórica. Já o

tratamento com o EHAPS, em ambas doses, mostrou-se eficiente em diminuir o acúmulo de

70

gordura abdominal comparado ao grupo HCT, levando a valores semelhantes aqueles de

animais alimentados com dieta normocalórica (Figura 3B).

O grupo HCT apresentou uma maior eficiência alimentar em relação aos grupos que

consumiram dieta normocalórica. O tratamento diminuiu a eficiência alimentar da dieta, apenas

nos animais que receberam a dose de 100mg/Kg de EHAPS, já os animais tratados com a dose

de 300mg/Kg não apresentaram diferenças significativas em relação ao seu grupo controle.

Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos alimentados com dieta

normocalórica (Figura 4).

Medida da pressão arterial sistólica

Os valores de PAS foram expressos em médias referentes as medidas dos dias 8, 20, 30

e 42 de tratamento, e os dados foram normalizados a partir da primeira medida realizada no dia,

imediatamente, anterior ao início do estudo (medida 0), conforme observado na Tabela 1.

Nenhuma diferença significativa dos níveis de PAS foi observada entre os grupos ao longo do

tratamento.

Efeito do EHAPS sobre a reatividade vascular

A reatividade vascular foi avaliada com base nos valores de efeito máximo (Emáx) e

potência (pD2) frente às drogas FEN, ACh e NPS em anéis de artéria mesentérica isolada dos

animais ao final do período experimental. O tratamento com EHAPS, nos animais alimentados

com dieta normocalórica, diminuiu de forma significativa a resposta contrátil do vaso a doses

crescentes e cumulativas de FEN (10-8 – 10-5 M) no grupo N300 em relação ao NCT, de acordo

com os valores de Emáx. Quanto ao pD2, nenhuma diferença significativa foi observada entre os

grupos da dieta normocalórica (Figura 5A). Os animais do grupo HCT apresentaram uma

diminuição significativa da resposta contrátil a doses crescente e cumulativas de FEN, em

relação ao grupo NCT. Já o tratamento com o EHAPS, dos animais alimentados com dieta

hipercalórica, melhorou de forma significativa a resposta contrátil do vaso, sendo

significativamente maior no grupo H100, com base nos valores de Emáx. Não houve diferenças

significativas quanto aos valores de pD2 entre os grupos (Figura 5B).

A resposta em aneis de artéria mesentérica com endotélio funcional, pré-contraídos com

FEN, a doses crescentes e cumulativas de ACh (10-10 – 10-4 M) mostrou-se semelhante quanto

ao Emáx entre os grupos que consumiram dieta normocalórica. No entanto, o tratamento com

71

EHAPS, em ambas doses, potencializou o vasorelaxamento, endotélio-dependente, em relação

ao NCT, sendo significativamente maior no grupo N100 (Figura 6A). O vasorrelaxamento,

endotélio-dependente, foi semelhante quanto ao efeito máximo e potência, nos animais do

grupo HCT e NCT. No entanto, o tratamento com EHAPS dos animais alimentados com dieta

hipercalórica, potencializou o vasorrelaxamento em relação ao HCT, sem diferenças

significativas entre os grupos tratados (H100 e H300) (Figura 6B).

O vasorrelaxamento de aneis de artéria mesentérica sem endotélio funcional, pré-

contraídos com FEN, a doses crescentes e cumulativas de NPS (1010– 10-4 M) demonstrou efeito

máximo e potência semelhante entre os grupos que consumiram dieta normocalórica ao longo

do tratamento (Figura 7A). Nos animais que consumiram dieta hipercalórica, o

vasorrelaxamento, independente de endotélio, foi semelhante quanto aos valores de Emáx, entre

os grupos. Porém, houve diminuição da potência do vasorrelaxamento no grupo HCT em

relação ao NCT. Já o tratamento com EHAPS mostrou-se eficaz em potencializar a resposta

vasorrelaxante, em ambas doses, sendo os valores de pD2 significativamente maiores em

relação ao NCT (Figura 7B).

Medida de estresse oxidativo em eritrócitos de ratos

Houve um aumento significativo da fluorescência em células de animais do grupo

controle dieta hipercalórica (HCT). Já o tratamento com EHAPS, em ambas doses, mostrou ser

capaz de normalizar o elevado nível de estresse oxidativo existente em eritrócitos de ratos

alimentados com dieta hipercalórica, demonstrando que o tratamento durante 6 semanas possui

uma significativa influência sobre a produção de espécies reativas com caráter oxidante a nível

sistêmico. Os valores observados nos grupos tratados com EHAPS foram semelhantes àqueles

observados no grupo NCT, conforme observado na Figura 8.

Análise bioquímica

A análise de parâmetros bioquímicos dos animais demonstrou aumento significativo nos

níveis de glicemia de jejum nos animais do grupo HCT em relação ao grupo NCT, porém, o

tratamento com o EHAPS não foi capaz de reduzir de forma significativa as concentrações

plasmáticas de glicose ao final de seis semanas de tratamento. Não foram observadas diferenças

significativas entre os grupos quanto ao perfil lipídico, o índice aterogênico e relação CT/HDL

conforme demonstrado na Tabela 2.

72

4. DISCUSSÃO

Os produtos naturais ricos em fitoconstituíntes têm se mostrado eficazes contra os

efeitos deletérios de dietas hipercalóricas, ricas em gordura e hidratos de carbono,

principalmente pelo importante papel antioxidante e anti-inflamatório que desempenham frente

às disfunções que tais dietas ocasionam, como a exemplo da obesidade que possui sua gênese

e progressão apoiadas, basicamente, em desequilíbrios do estresse oxidativo e processo

inflamatório (Joseph, Edirisinghe, & Burton-Freeman, 2015).

O teor de polifenóis totais já foi identificado em diferentes partes da planta S. cumini

como semente, folha e fruto, nos quais foram obtidos valores de conteúdo fenólico de 44.700 ±

150, 14.300 ± 210, 185 ± 3,8 mg EAG/100g amostra, respectivamente (Eshwarappa, Iyer,

Subbaramaiah, Richard, & Dhananjaya, 2014; Peixoto & Freitas, 2013; Rufino et al., 2010).

Veigas et al. (2007) observaram um teor de fenólicos totais de 560 mg EAG/100 g de amostra,

em extrato metanólico da casca do fruto de S. cumini, estando abaixo do valor encontrado no

presente estudo, de 5.440,86 mg EAG/100 g de EHAPS. Quanto a atividade antioxidante,

estudos que utilizaram a pele do fruto de S. cumini obtiveram diferentes valores de CE50.

Banerjee et al. (2005) avaliou o extrato obtido a partir da infusão da pele do fruto em água

quente, com valor de CE50 = 168 µg/mL, demonstrando menor atividade que a encontrada em

nosso extrato, em contrapartida, um extrato metanólico da pele do fruto de S. cumini apresentou

um valor de CE50 = 1,39 µg/mL, demonstrando elevada atividade antioxidante desse extrato, o

estudo ainda sugere que o processo de secagem e aquecimento pode conduzir à perda de

substâncias bioativas termolábeis como antocianinas e outros polifenóis (Veigas et al., 2007).

Extratos hidrolisados da polpa e da semente do fruto de S. cumini também apresentaram

diferentes valores de CE50, variando de 79 µg/mL a 19.8 µg/mL, respectivamente (Aqil et al.,

2012).

A quantificação dos compostos fenólicos por HPLC, demonstrou a presença

significativa de ácido gálico. Srivastava & Chandra, (2013) também detectaram a presença

deste composto fenólico em extrato de S. cumini. Com base em outros cromatogramas de

extratos semelhantes ao do presente estudo, pode-se sugerir a presença de compostos fenólicos

como ácido quínico e dihidroquercetina diglucosideo (FARIA et al., 2011; MARAN et al.,

2014). Shrikanta et al. (2015) observaram a presença de diversos polifenois no fruto de S.

cumini, entre os principais componentes encontrados na pele do fruto destacou-se a presença

do ácido gálico. Outro estudo analisou o potencial antioxidante de ácidos fenólicos oriundos de

plantas, entre eles o gálico, caféico, clorogênico, isoclorogênico e protocatecuico, foi

73

constatado que o ácido gálico apresentou maior atividade de sequestro de peróxido de

hidrogênio (90±0.1%) e do radical DPPH (75±2%), com elevada atividade de inibição da

peroxidação lipídica (96±2 %), demonstrando assim o elevado potencial antioxidante do ácido

gálico (Sroka & Cisowski, 2003).

O consumo de dieta hipercalórica pelos animais, ao longo de seis semanas de

tratamento, acarretou alterações corporais importantes que demonstram a ação deletéria do

consumo de dietas hipercalóricas em animais e sua capacidade de induzir um maior ganho de

peso. O aumento significativo do ganho de peso corporal e da gordura abdominal nos animais

alimentados com dieta hipercalórica em relação àqueles alimentados com dieta normocalórica,

corroboram com outros estudos que utilizaram o mesmo tipo de dieta a fim de induzir obesidade

em ratos Wistar, nos quais, observou-se um aumento significativo no ganho de peso corporal e

dos depósitos de gordura corporal nos aimais (Eguchi et al., 2008; Estadella et al., 2011;

Estadella et al., 2004).

Apesar da menor ingestão de ração do grupo hipercalórico, a elevada densidade

energética da dieta justifica o ganho de peso mais expressivo no grupo controle, uma vez que o

tratamento com EHAPS, em ambas doses, foi capaz de minimizar o ganho de peso, de forma

significativa, a partir da 4° semana de tratamento. A diminuição do ganho de peso dos animais

do grupo H300 pode estar relacionada ao menor consumo alimentar e ingestão calórica

observada nestes animais. Porém, o mesmo não foi observado no grupo H100, no qual a

diminuição do peso ocorreu independentemente da ingestão alimentar, uma vez que o consumo

alimentar neste grupo foi semelhante ao grupo HCT, demonstrando a capacidade do extrato em

minimizar o ganho de peso independente do consumo alimentar. Tais dados podem ser

observados com base no coeficiente de eficiência alimentar, demonstrando que o tratamento na

dose de 100 mg/Kg de peso, foi capaz de diminuir a capacidade de converter as calorias da dieta

em ganho de peso corporal.

Estudos avaliaram os efeitos da suplementação de dietas hipercalóricas com frutas ricas

em compostos fenólicos, sobre o desenvolvimento de obesidade e demonstraram que a

suplementação de tais dietas com extratos ricos em antocianinas, flavonoide amplamente

encontrado nos frutos da família do S. cumini (Myrtaceae), é capaz de diminuir de forma

significativa o ganho de peso corporal nos animais suplementados (Jayaprakasam, Olson,

Schutzki, Tai, & Nair, 2006; Prior et al., 2008; Tsuda, Horio, Uchida, Aoki, & Osawa, 2003).

Outros estudos com polifenois extraídos do chá verde sugerem um efeito supressor desses

compostos em aumentar o peso corporal e o acumulo de gordura em ratos alimentados com

dieta hipercalórica, durante seis semanas (Xu et al., 2015). Outros estudos sobre o efeito da

74

suplementação com catequinas do chá verde em modelos animais de obesidade induzida por

dieta hipercalórica, demonstraram uma redução significativa no ganho de peso e dos depósitos

de gordura corporal, sugerindo uma atividade modulatória de polifenois sobre genes

relacionados à obesidade e sobre os níveis de adiponectinas circulantes (Lu, Zhu, Shen, & Gao,

2012; Tian et al., 2013).

O aumento de tecido adiposo também é considerado um fator de risco independente para

a produção do estresse oxidativo, uma vez que, a produção irregular de adipocinas, associa-se

a uma elevada produção de ROS (Esposito et al., 2006). O DCFH-DA é considerado um

indicador geral de ROS, reagindo com o H2O2, ONOO-, hidroperóxidos de lípidos, e, em menor

grau com O2•-, (Dikalov, Griendling, & Harrison, 2007), dessa forma é possível medir os níveis

de espécies reativas de oxigênio a partir da fluorescência emitida em células marcadas com este

tipo de sonda. O aumento da fluorescência observado no grupo HCT, demonstrou que o

consumo da dieta hipercalórica elevou os níveis de estresse oxidativo, já o tratamento com o

EHAPS, promoveu uma diminuição significativa da fluorescência, demonstrando uma

eficiência do extrato em diminuir a quantidade de ROS no interior da célula, atribuída,

principalmente, a sua elevada capacidade antioxidante mediada pela habilidade em sequestrar

espécies reativas de oxigênio. Tais resultados mostram-se promissores, tendo em vista que a

elevada produção de ROS contribui para patologias intimamente relacionadas com a obesidade

como o desenvolvimento de processos ateroscleróticos e de disfunção endotelial (Gonzalez,

Valls, Brito, & Rodrigo, 2014; Rask-Madsen & Kahn, 2012).

Além de elevar os níveis de estresse oxidativo, o consumo de dieta hipercalórica

provocou disfunção vascular nos animais. Alguns estudos demonstraram relação entre o

consumo de dietas hipercalóricas e diminuição da resposta contrátil de vasos a agonistas α1-

adrenérgicos (Panchal & Brown, 2013a; Poudyal, Panchal, Waanders, Ward, & Brown, 2012).

Panchal et al. (2013b) observaram resposta contrátil prejudicada à noradrenalina (NA), e

diminuição do vasorrelaxamento aos agonistas ACh e NPS em aneis de aorta de ratos

alimentados com dieta hipercalórica. Já o tratamento com o ácido elágico, importante polifenol

amplamente encontrado em frutos, demonstrou eficiência em melhorar a resposta contrátil e

vasorrelaxante destes animais, após 8 semanas. No presente estudo, observou-se resultados

semelhantes, uma vez que, o tratamento com o EHAPS foi capaz de melhorar a resposta

contrátil do vaso e o vasorrelaxamento. Efeitos benéficos semelhantes na resposta

vasorrelaxante foram observados em grupos de animais suplementados com polifenois

derivados da uva e do vinho, com melhora do efeito máximo e potencialização da resposta do

vaso às drogas agonistas (Khodja, Chataigneau, Auger, & Schini-Kerth, 2012; Khodja, Di

75

Marco, Farhat, Geny, & Schini-Kerth, 2013; Lassaletta et al., 2012). Desde a década passada,

extratos de frutas ricos em compostos fenólicos demonstram eficiência em induzir a resposta

relaxante vascular em aneis de artérias de ratos (Fitzpatrick, Hirschfield, & Coffey, 1993).

Diante disso, o efeito benéfico do EHAPS na prevenção da disfunção vascular ocasionada pelo

consumo de dieta hipercalórica, pode ser atribuído a presença de importantes compostos

fenólicos e elevada capacidade antioxidante apresentada pelo extrato de S. cumini.

Apesar da diminuição significativa dos níveis de ROS e melhora da resposta vascular

nos animais tratados com o EHAPS, não se observou alterações significativas nos níveis de

pressão arterial sistólica, entre os grupos. O tratamento com EHAPS, durante seis semanas, não

diminuiu de forma significativa os níveis de glicemia plasmática nos animais do grupo dieta

hipercalórica. Além disso, nenhuma alteração significativa em relação ao perfil lipídico foi

observada entre os grupos. Estes dados são controversos, uma vez que estudos realizados por

Estadella et al. (2004) e Musial (2013), utilizando o mesmo tipo de dieta hipercalórica, não

observaram alterações significativas na glicemia dos animais, porém, um aumento significativo

dos níveis plasmáticos de triglicerídeos e de colesterol total foi observado nos animais

alimentados com a dieta hipercalórica.

5. CONCLUSÃO

Os resultados sugerem que o tratamento com o EHAPS promove uma ação benéfica na

prevenção de alterações deletérias relacionadas ao consumo de dietas hipercalóricas, atribuída,

principalmente, ao elevado potencial antioxidante do extrato e sua capacidade em reduzir o

número de espécies reativas de oxigênio, o ganho de peso, e melhorar a resposta vascular em

ratos, oferecendo indícios de que extratos de frutos ricos em compostos fenólicos podem ser

aliados na prevenção e tratamento de patologias relacionadas com o consumo de dietas com

elevada densidade energética.

AGRADECIMENTOS

Nossos agradecimentos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível

Superior (CAPES) pelo suporte financeiro necessário ao desenvolvimento da pesquisa.

76

REFERÊNCIAS

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79

Figura 1: Cromatograma dos compostos fenólicos presentes no extrato hidroalcoólico da pele do fruto de S. cumini (EHAPS).

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

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20

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U

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20

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11

14

1

2,3

8

0,0

0

88

,65

94

75

1

2,7

2

0,9

5

33

11

,29

70

87

0

2,8

8

0,8

6

28

02

,8

57

10

96

3,6

2

0,9

5

44

25

,8

13

07

7

4,0

3

0,0

0

25

,0

59

54

4,9

1

0,0

0

12

,3

49

7

5,3

8

0,0

0

2

,1

10

29

5,9

0

0,0

0

2

,7

22

07

6,3

5

0,0

0

4

,4

47

41

6,6

9

0,0

0

11

,5

45

09

7,0

5

0,0

0

10

,03

00

4

7,2

7

0,0

0

8

,5

88

8

7,6

1

0,0

0

2

,9

28

89

7,9

9

0,0

0

8

,83

67

8

8,1

8

0,0

0

9

,21

39

6

8,4

0

0,0

0

6

,2

46

97

8,9

9

0,0

0

9

,1

17

85

9,6

6

0,0

0

3

,9

Detector 1-254nm

POLIFENOIS 12-01-15 005

Area

Retention Time

Peak purity

S/N (ASTM)

80

Co

ns

um

o d

e R

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ão

(g

/dia

)

NC

T

N100

N300

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T

H100

H300

0

1 0

2 0

3 0

* ** #

A

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)

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T

N100

N300

HC

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H100

H300

0

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1 5 0

**

*#

B

Co

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mL

/dia

);

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T

N1

00

N3

00

HC

T

H1

00

H3

00

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

***#

#

C

Figura 2: Consumo de ração (g/dia/animal) (A); Ingestão Calórica (Kcal/dia/animal) (B); Consumo de água

(mL/dia/animal) (C), durante 6 semanas. NCT:Controle normocalórico; N100:Normocalórico + EHAPS

(100mg/Kg); N300:Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); HCT:Controle hipercalórico; H100:Hipercalórico +

EHAPS (100mg/Kg); H300:Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg). Barras representam média ±erro padrão (n=8).

Os dados foram analisados pela ANOVA seguido do pós-teste Tukey para análise de significância (p<0.05).

*indica diferença estatística em relação grupo dieta normocalórica #indica diferença estatística do tratamento com

EHAPS vs o grupo controle da dieta.

81

Ga

nh

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ali

za

do

pe

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es

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nic

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0

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01

Sem

02

Sem

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Sem

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Sem

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1 1 2 .5

1 2 5 .0

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H C T

H 100

H 300

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N 100

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NC

T

N100

N300

HC

T

H100

H300

0

2

4

6

8*

##

Figura 3: Curva de ganho de peso normalizado pelo peso inicial, durante 6 semanas; Índice de adiposidade (g/100g

de peso animal) (B). NCT:Controle normocalórico; N100:Normocalórico + EHAPS (100mg/Kg);

N300:Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); HCT:Controle hipercalórico; H100:Hipercalórico + EHAPS

(100mg/Kg); H300:Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg). Os dados foram analisados pela ANOVA seguido do

pós-teste Bonferroni para análise de significância (p<0.05). Barras representam média ±erro padrão. Foi utilizado

o teste t student não pareado para comparação entre os grupos (p<0.05). * vs NCT; # HCT vs H100 e H300.

B

A

82

NC

T

N100

N300

HC

T

H100

H300

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

Co

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cie

nte

de

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nc

ia

A

lim

en

tar

(g/K

ca

l)

*

#

Figura 4: Eficiência alimentar (g/Kcal). NCT: Normocalórico controle; N100:Normocalórico + EHAPS

(100mg/Kg); N300:Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); HCT:Controle hipercalórico; H100:Hipercalórico +

EHAPS (100mg/Kg); H300:Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg). Barras representam a média ± erro padrão

(n=8). Foi utilizado o teste t student não pareado para comparação entre os grupos (p<0.05). * vs NCT; # HCT vs

H100 e H300.

83

Tabela 1 – Média da pressão arterial sistólica dos animais, nos dias 8, 20, 30 e 42 de tratamento,

normalizadas pelo dia 0. PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA (mmHg)

GRUPOS Dia 8 Dia 20 Dia 30 Dia 42

HCT 102 ± 3.7 108 ± 4.0 106 ± 3.8 109 ± 3.4

H100 107 ± 4.0 106 ± 3.4 104 ± 2.5 113 ± 2.4

H300 101 ± 3.5 109 ± 3.9 104 ± 2.7 110 ± 5.3

NCT 104 ± 2.5 112 ± 2.9 110 ± 2.9 104 ± 2.7

N100 102 ± 1.9 106 ± 4.3 110 ± 5.9 109 ± 5.3

N300 103 ± 2.0 107 ± 1.2 108 ± 2.0 108 ± 1.0

NCT:Controle normocalórico; N100:Normocalórico + EHAPS (100mg/Kg); N300:Normocalórico + EHAPS

(300mg/Kg); HCT:Controle hipercalórico; H100:Hipercalórico + EHAPS (100mg/Kg); H300:Hipercalórico +

EHAPS (300mg/Kg).

84

-8 -7 -6 -5

0

3 0

6 0

9 0

1 2 0N C T

N 1 0 0

N 3 0 0

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Co

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)

E m á x = 1 0 0 ,0 8 ,0 %

p D 2 = 6 ,1 7 ± 0 ,1 2 M

E m á x = 8 4 ,7 1 2 ,0 %

p D 2 = 6 .0 7 ± 0 .2 3 M

E m á x = 7 4 ,5 8 ,8 %#

p D 2 = 6 .1 1 ± 0 ,2 0 M

-8 -7 -6 -5

0

4 0

8 0

1 2 0

1 6 0H C T

H 1 0 0

H 3 0 0

L o g [F E N ] M

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Co

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)

E m á x = 9 1 ,1 8 ,5 %

p D 2 = 6 ,0 7 ± 0 ,1 3 M

E m á x = 1 3 8 ,3 1 3 ,6 % *#

p D 2 = 6 ,1 5 ± 0 ,1 9 M

E m á x = 1 0 7 ,1 1 2 ,1 % *

p D 2 = 6 ,0 4 ± 0 ,1 9 M

N C T

E m á x = 1 0 0 ,0 8 ,0 % *

p D 2 = 6 ,1 7 ± 0 ,1 2 M

Figura 5: Curva concentração-resposta para FEN (10-8 – 10-5M) em aneis de artéria mesentérica de ratos

alimentados com dieta normorcalórica (A) e dieta hipercalórica (B). HCT: Controle hipercalórico; H100:

Hipercalórico + EHAPS (100mg/Kg); H300: Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg); NCT: Controle normocalórico;

N100:Normocalórico + EHAPS (100mg/Kg); N300:Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); Valores significativos

* p<0.05 vs HCT; # p<0.05 vs NCT; + p<0.05 Tratado vs Tratado.

A

B

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-1 0 -8 -6 -4

0

3 0

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N C T

N 1 0 0

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)

E m á x = 1 0 0 ,0 , 5 ,4 %

p D 2 = 6 ,7 4 ± 0 ,4 6 M

E m á x = 1 0 4 ,1 1 ,7 %

p D 2 = 8 ,5 1 ± 0 ,0 8 M# +

E m á x = 1 0 6 ,4 4 ,2 %

p D 2 = 7 ,5 7 ± 0 ,1 4 M *

-1 0 -8 -6 -4

0

3 0

6 0

9 0

1 2 0

H C T

H 1 0 0

H 3 0 0

L o g [A C h ] M

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ela

xa

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(N

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ali

za

do

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Co

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ole

)

E m á x = 1 0 0 ,8 3 ,6 %

p D 2 = 6 ,2 5 ± 0 ,3 7 M

E m á x = 1 0 5 ,0 2 ,5 %

p D 2 = 7 ,4 1 ± 0 ,2 4 M *

E m á x = 1 0 6 ,2 3 ,2 %

p D 2 = 7 ,3 3 ± 0 ,1 8 M *

N C T

E m á x = 1 0 0 ,0 , 5 ,5 %

p D 2 = 6 ,9 ± 0 ,4 M

Figura 6: Curva concentração-resposta para ACh (10-10 – 10-4M) em aneis de artéria mesentérica de ratos

alimentados com dieta normocalórica (A) e dieta hipercalórica (B). HCT: Controle hipercalórico; H100:

Hipercalórico + EHAPS (100mg/Kg); H300: Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg); NCT: Controle normocalórico;

N100:Normocalórico + EHAPS (100mg/Kg); N300:Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); Valores significativos

* p<0.05 vs HCT; # p<0.05 vs NCT; + p<0.05 Tratado vs Tratado.

A

B

86

-1 0 -8 -6 -4

0

3 0

6 0

9 0

1 2 0

N C T

N 1 0 0

N 3 0 0

L o g [N P S ] M

% R

ela

xa

me

nto

(No

rm

ali

za

do

vs

Co

ntr

ole

)

E m á x = 1 0 0 ,0 2 ,5 %

p D 2 = 7 ,8 8 ± 0 ,0 4 M

E m á x = 1 0 0 ,6 2 ,8 %

p D 2 = 7 ,9 5 ± 0 ,0 6 M

E m á x = 9 3 ,9 3 ,6 %

p D 2 = 7 ,8 1 ± 0 ,0 9 M

-9 -8 -7 -6 -5 -4

0

3 0

6 0

9 0

1 2 0

H C T

H 1 0 0

H 3 0 0

L o g [N P S ] M

% R

ela

xa

me

nto

(N

orm

ali

za

do

vs

Co

ntr

ole

) E m á x = 9 3 ,8 3 ,0 %

p D 2 = 7 ,3 0 ± 0 ,0 9 M

E m á x = 9 7 ,8 2 ,6 %

p D 2 = 8 ,0 9 ± 0 ,0 4 M *#

E m á x = 9 8 ,3 2 , ,0 %

p D 2 = 8 ,0 7 ± 0 ,0 4 M *#

N C T

E m á x = 1 0 0 ,0 2 ,5 %

p D 2 = 7 ,9 2 ± 0 ,0 5 M *

Figura 7: Curva concentração-resposta para NPS (10-10 – 10-4M) em aneis de artéria mesentérica de ratos

alimentados com dieta normocalórica (A) e dieta hipercalórica (B). HCT: Controle hipercalórico; H100:

Hipercalórico + EHAPS (100mg/Kg); H300: Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg); NCT: Controle normocalórico;

N100:Normocalórico + EHAPS (100mg/Kg); N300:Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); Valores significativos

* p<0.05 vs HCT; # p<0.05 vs NCT; + p<0.05 Tratado vs Tratado.

A

B

87

DC

FH

Flu

ore

sc

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no

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ali

ze

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%)

HC

T

H100

H300

NC

T

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

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5 0 0

*

#

#

Figura 8: Medida de estresse oxidativo por citometris de fluxo em eritrócitos de ratos. NCT: Normocalórico

controle; HCT:Controle hipercalórico; H100:Hipercalórico + EHAPS (100mg/Kg); H300:Hipercalórico + EHAPS

(300mg/Kg). Barras representam a média ± erro padrão. Os dados foram analisados pela ANOVA seguido do pós-

teste Bonferroni para análise de significância. *indica diferença estatística em relação grupo NCT (p<0.05) #indica

diferença estatística do tratamento em relação ao grupo controle da dieta (p<0.05).

88

Tabela 2 – Concentração plasmática de glicose, colesterol total, triglicerídeos, LDL-C, HDL-C, cálculo da relação CT/HDL e do Índice Aterogênico

dos animais, ao final de 6 semanas de tratamento (mg/dL).

GRUPOS

HCT

H100

H300

NCT

N100

N300

GLICEMIA DE JEJUM 202.3 ± 10.3* 176.9 ± 14.3 193.6 ± 16.9 157 ± 6.8 184 ± 15 170.6 ± 13,7

COLESTEROL TOTAL 53.6 ± 3.8 51.5 ± 3.7 50.8 ± 4.8 52.5 ± 2.3 51.2 ± 5.3 44.8 ± 2.3

TRIGLICERÍDEOS 60.5 ± 4.7 56.7 ± 5.9 64 ± 10.3 62.7 ± 6.7 44.4 ± 4.3 36.4 ± 7.8

LDL-C 13.2 ± 6.8 8.3 ± 6.4 4.7 ± 3.6 5.7 ± 4.9 9.8 ± 4.8 10.2 ± 6.5

HDL-C 35.8 ± 2.6 43 ± 9.4 36.2 ± 1.3 36.1 ± 2 34.6 ± 4.7 29.6 ± 4.2

CT/HDL 1.55 ± 0.12 1.49 ± 0.06 1.39 ± 0.08 1.50 ± 0.15 1.54 ± 0.14 1.60 ± 0.17

ÍNDICE

ATEROGÊNICO

0.29 ± 0.04 0.23 ± 0.05 0.27 ± 0.07 0.28 ± 0.1 0.12 ± 0.08 0.07 ± 0.1

Valores em média ± erro padrão (n=8). NCT: Controle normocalórico; N100: Normocalórico + EHAPS (100mg/Kg); N300: Normocalórico + EHAPS (300mg/Kg); HCT:

Controle hipercalórico; H100: Hipercalórico + EHAPS (100mg/Kg); H300: Hipercalórico + EHAPS (300mg/Kg). *p <0.05 vs NCT.

89

ANEXO

90