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Pelotas, 2013

Neida Lucia Conrad

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Dissertação

Produção, caracterização e aplicação de anticorpos

monoclonais contra o vírus da Bronquite Infecciosa das

Galinhas

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NEIDA LUCIA CONRAD

Produção, caracterização e aplicação de anticorpos

monoclonais contra o vírus da Bronquite Infecciosa das

Galinhas

Orientadora: Ângela Nunes Moreira

Co-orientador: Fabricio Rochedo Conceição

Pelotas, 2013

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Biotecnologia da Universidade Federal de

Pelotas, como requisito parcial à obtenção

do título de Mestre em Ciências (área do

conhecimento: Imunologia).

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Dados de catalogação na fonte:

Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901

Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

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Banca examinadora:

Profª. Drª. Claudia Hartleben, Universidade Federal de Pelotas

Prof. Dr. Marcelo de Lima, Fundação Universidade Federal de Pelotas

Dr. Paulo Augusto Esteves, Embrapa Suínos e Aves

Profª. Drª. Ângela Nunes Moreira, Universidade Federal de Pelotas

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Agradecimentos

A Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realização do curso

de Pós-Graduação em Biotecnologia. A Fundação Coordenação de

Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) pela concessão da bolsa

de estudos.

Aos meus pais, Ana e Valdir Conrad, pelo incalculável apoio e investimento

de uma vida inteira, por vezes abdicando de suas vontades em detrimento dos meus

objetivos, obrigado pelo incentivo e amor incondicional.

Ao meu primeiro orientador, professor José Antônio Guimarães Aleixo, pela

oportunidade de estágio, pela confiança e ensinamentos.

À minha orientadora Ângela Moreira e ao Prof. Fabrício Conceição pela

oportunidade, ensinamentos e amizade.

Ao doutor, Marcelo Mendonça, pelos incontáveis ensinamentos e dicas, pela

paciência e amizade.

Aos colegas e amigos do Laboratório de Imunologia Aplicada, Carol, Clóvis,

Rodrigo, Carlos, Gustavo, Marcelle, Suely, Giana e a toda família do Laboratório de

Imunologia Aplicada pela convivência, pelos momentos de descontração que

tornaram esta caminhada mais agradável.

Aos demais colegas, professores e amigos da Biotecnologia obrigada pelo

convívio, apoio e amizade.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma na minha

formação e/ou realização deste trabalho.

Muito obrigada!

6

RESUMO

CONRAD, NEIDA LUCIA. Produção, caracterização e aplicação de anticorpos monoclonais contra o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas. 2013, 78 f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós Graduação em Biotecnologia.Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. A bronquite infecciosa das galinhas (BI) é uma doença aguda, altamente contagiosa, causada por um Coronavírus que infecta principalmente células dos aparelhos respiratório e genito-urinário das galinhas. A importância econômica dessa doença decorre da diminuição na produção e qualidade interna e externa dos ovos, da redução da eclodibilidade, da diminuição da eficiência alimentar e do ganho de peso e do aumento da mortalidade e da condenação de carcaças ao abate, além dos gastos com medicamentos para debelar infecções bacterianas secundárias. A confirmação do diagnóstico de BI é baseada no isolamento viral, em conjunto com a sorologia. O uso de anticorpos monoclonais (AcMs) tem colaborado e facilitado o diagnóstico desse tipo de enfermidade, porém seu uso ainda é limitado, pois os AcMs utilizados são importados, elevando o custo de tais metodologias. Este trabalho relata a produção, caracterização e aplicação de AcMs contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). Para a produção dos AcMs, camundongos Balb/c foram imunizados intraperitonealmente com o VBI clássico (M41) local ou com o variante. Foram gerados dois hibridomas secretores de AcMs anti-VBI do isotipo IgM a partir da fusão entre os linfócitos B de um camundongo imunizado com o VBI variante e células de mieloma. Foi observado, na caracterização por ELISA indireto e Western blot, que os AcMs reconhecem o VBI clássico e variante, sendo as reações com o VBI variante mais intensas. O AcM 2G4 parece ser específico para a proteína S1. A aplicabilidade dos AcMs foi avaliada através da técnica de imuno-histoquímica em tecidos de aves inoculadas experimentalmente com o VBI clássico. Os AcMs anti-VBI apresentaram o mesmo padrão de marcação que o AcM utilizado como controle positivo, ou seja, marcaram predominantemente células inflamatórias. Este resultado pode ser explicado pelo fato de que, em casos mais severos da infecção por VBI, o antígeno pode ser localizado também em células inflamatórias. Concluiu-se que os AcMs obtidos apresentam potencial para uso no imunodiagnóstico para BI. Palavras chave: imunodiagnóstico. imuno-histoquímica. VBI clássico. VBI variante.

hibridoma. Coronavírus.

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ABSTRACT

CONRAD, NEIDA LUCIA. Production, characterization and application of monoclonal antibodies against the virus of infectious bronchitis. 2013, 78 f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. The infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious disease caused by a coronavirus that infects mainly cells of the respiratory and genitourinary of chicken. The economic importance of this disease results from decreased production, such as internal and external quality of eggs, reduced hatchability, feed efficiency and weight gain, increased mortality, condemnation of carcasses at slaughter, and also with drugs spending to suppress secondary bacterial infections. The diagnosis of IB is based on virus isolation, together with serology. The use of monoclonal antibodies (MAbs) has been collaborated to diagnosis of this type of disease, but their use are still limited because the MAbs used are imported, increasing the cost of such methodologies. This work reports the production, characterization and application of MAbs against the virus of infectious bronchitis (IBV). For the production of MAbs, Balb/c mice were immunized intraperitoneally with classic IBV (M41) or variant IBV. We generated two hybridomas secreting MAbs anti-IBV (IgM isotype) from the fusion of B-lymphocytes from a mouse immunized with the variant IBV and myeloma cells. Following the characterization by ELISA and Western blot, it was observed that MAbs recognize the IBV classic and variant, showing more intense reactions with IBV variant. The AcM 2 G4 seems to be specific for protein S1. The applicability of the MAbs was assessed using the immunohistochemistry technique on histological tissues of birds inoculated experimentally with classic IBV. These MAbs anti-IBV had the same pattern of label of the MAb used as positive control, labeling predominantly inflammatory cells. This result can be explained by the fact that in severe cases of infection with IBV, the antigen may be located also in inflammatory cells. It was concluded that the MAbs obtained have potential for use in immunodiagnostic for IB. Keywords: immunodiagnosis. immunohistochemistry. classic VBI. variant VBI

hybridoma. Coronavirus.

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Figura 1.

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Figura 2.

36

Figura 3.

37

Figura 4.

39

Figura 5.

41

Figura 6.

42

Figura 7.

44

Figura 8.

49

LISTA DE FIGURAS

SDS PAGE 10 % para avaliar a qualidade e pureza das amostras virais

utilizadas na imunização dos camundongos para produção de AcMs anti-VBI .....

Western blot para avaliar a qualidade e pureza das amostras virais utilizadas na

imunização dos camundongos para produção de AcMs anti-VBI utilizando soro

de aves positivas para o VBI ........................................................................................

Determinação da diluição ideal dos soros dos animais imunizados (diluídos em

base dois de 1:100 até 1:204800 em PBS-T) para ser utilizada como controle

positivo no ELISA indireto, utilizando 250 ng dos VBI clássico ou variante como

antígeno, por cavidade. ................................................................................................

SDS PAGE 12% para a determinação do isotipo dos AcMs anti-VBI obtidos a

partir da fusão celular entre os linfócitos B do camundongo imunizado com o VBI

variante e células de mieloma. ......................................................................................

Reatividade dos AcMs anti-VBI (2G4 e 5A11) frente a diferentes vírus (VBI

variante e clássico M41, vírus da Bouba das aves e de Newcastle) por ELISA

indireto. ............................................................................................................................

Perfil eletroforético e reatividade dos AcMs anti-VBI (2G4 e 5A11) frente a

diferentes vírus (VBI variante e clássico M41, vírus da Bouba das aves e de

Newcastle) por Western blot. ........................................................................................

Imuno-histoquímica utilizando os AcMs 2G4 e 5 A11 (diluídos 1:50) em tecidos

de aves infectadas artificialmente via ocular com o VBI clássico (M41) e

coletados 4 dias após a infecção ..............................................................................

Determinação da concentração ideal de antígeno para o ELISA indireto,

utilizando 500, 250, 125 e 62,5 ng/cavidade dos VBI clássico ou variante e os

soros coletados de um animal imunizado com o VBI clássico e de outro

imunizado com o VBI variante, diluídos 1:100. .........................................................

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SUMÁRIO

1 Introdução ............................................................................................................................. 10

2 Revisão da Literatura .........................................................................................................................14

3 Materiais e Métodos ........................................................................................................... 27

4 Resultados e Discussão ..................................................................................................... 35

5 Conclusões ........................................................................................................................... 52

6. Referências ......................................................................................................................... 53

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1 INTRODUÇÃO

A avicultura é um dos setores mais importantes do agronegócio brasileiro e

também o que mais cresceu nos últimos anos. O Brasil tem conquistado um espaço

significativo na produção mundial, aumentou cerca de 1000% entre os anos de 1961

e 2003, passando de 1,4% para 10,5% da produção mundial de carne de frango

(GIROTTO, 2004).

Por se tratar de um amplo mercado em expansão, a avicultura vem crescendo

também em âmbito de tecnologias, com o surgimento de novos fármacos e vacinas

desenvolvidos com o objetivo de evitar a disseminação de enfermidades entre os

animais alojados. Dentre as doenças que acometem as aves e causam grandes

prejuízos econômicos aos produtores, está a bronquite infecciosa das galinhas (BI).

A BI é uma doença aguda, altamente contagiosa, causada por um vírus do

gênero Coronavírus que acomete a espécie Gallus gallus domesticus (KING;

CAVANAGH, 1991; SANTOS et al., 2005). A BI foi descrita pela primeira vez por

Shalk e Hawn (1931), na Cidade de Dakota do Norte, nos Estados Unidos, e o

agente da BI foi denominado de vírus da bronquite infecciosa (VBI), por Beach e

Schalm, em 1936. No Brasil, a BI foi diagnosticada pela primeira vez no ano de

1957, no Estado de Minas Gerais (HIPÓLITO; SILVA; HSIUNG, 1979). No início da

década de 1960, a BI já havia sido notificada em quase todo o mundo (MUNEER et

al., 1988).

O genoma do VBI consiste de uma fita única de RNA de sentido positivo e

contém cerca de 27600 nucleotídeos (CAVANAGH, 2007). O genoma viral é

envolvido basicamente por três proteínas: a nucleoproteína (N, uma proteína

fosforilada do nucleocapsídeo interno), e externamente, pelas glicoproteínas da

matriz (M) e da espícula (S), sendo essa última composta por duas subunidades, S1

e S2. Existe ainda uma quarta proteína (E), que é associada ao envelope viral.

(MARTINS, 1992; MURPHY et al.,1999; ROCHA, 2000; RESENDE, 2003,

McKINLEY; HILT; JACKWOOD, 2008).

O VBI infecta principalmente células dos aparelhos respiratórios e genito-

urinário das galinhas (KING; CAVANAGH, 1991; SANTOS; FARIA; RIBEIRO, 2005),

resultando na redução do ganho de peso e da produção e qualidade dos ovos

(ARIYOSHI et al., 2010). O VBI é primariamente epiteliotrópico, replicando-se nas

células epiteliais, nas células secretoras de muco e nas células dos pulmões e dos

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sacos aéreos. A replicação do vírus nos tecidos do trato respiratório causa sinais

característicos, como dificuldades para respirar, tosse e descarga nasal. A infecção

por VBI produz lesões características na traquéia, que é o órgão de eleição para sua

multiplicação (KING; CAVANAGH, 1991), sendo por isso, considerada uma doença

primária do aparelho respiratório (RESENDE, 2003).

A BI está incluída na lista da Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e

Organização para a Agricultura e Alimentação (FAO) como doença transmissível de

notificação anual, que tem importância socioeconômica e implicações sanitárias,

podendo trazer alguma repercussão a qualquer momento no comércio internacional

de produtos e animais (OIE, 2008; OECD, 2011).

A BI está amplamente disseminada entre as criações avícolas comerciais e é

uma das enfermidades virais que mais têm causado perdas econômicas na

avicultura brasileira e no mundo todo, devido à diminuição do crescimento dos

animais, redução da qualidade e da produção de ovos, mortalidade, condenação ao

abate e gastos com insumos, incluindo diagnóstico, vacinas e antimicrobianos, a fim

de eliminar infecções bacterianas intercorrentes (CAVANAGH 2007; MENDONÇA et

al., 2009)

Portanto, a rápida detecção e identificação do patógeno viral são

imprescindíveis para que medidas eficazes de controle sejam prontamente tomadas.

Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam

sensíveis, específicos, rápidos e de baixo custo.

O isolamento e a identificação do agente causal são necessários para o

diagnóstico definitivo de BI. Os métodos de diagnóstico convencionais da BI são

baseados no isolamento viral em ovos embrionados livres de patógenos específicos

(Specific Pathogen Free, SPF) (GELB, 1989; OWEN et al., 1991) ou em culturas

celulares (HOPKINS et al., 1974), seguidos da identificação antigênica dos vírus

isolados. Três ou mais passagens em ovos embrionados são geralmente

necessárias para o isolamento primário do VBI, o que torna tal procedimento

oneroso e demorado. Além disso, somente estirpes adaptadas à passagem em ovos

induzem características evidentes como nanismo e enrolamento embrionário e

alguns isolados de campo do VBI não induzem lesões embrionárias específicas

durante várias passagens (RAJ et al., 2004). Essa metodologia, além de ser

extremamente trabalhosa, requer condições rígidas de biossegurança, em virtude da

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virulência desse micro-organismo, bem como um longo tempo de análise (em média

7 a 10 dias) (GELB, 1989; OWEN et al., 1991).

Na tentativa de buscar métodos mais rápidos para detecção deste patógeno,

testes baseados em biologia molecular e ensaios sorológicos estão sendo aplicados.

Dentre esses métodos destacam-se a Transcrição Reversa associada à Reação em

Cadeia da Polimerase (RT-PCR), a análise de fragmentos genômicos gerados por

enzimas de restrição (RFLP) e o seqüenciamento dos genes mais importantes desse

patógeno viral (CAVANAGH; NAQI, 2003). E, entre as técnicas sorológicas,

destacam-se as reações de imunofluorescência, imunodifusão em ágar gel,

imunoperoxidase, inibição da hemaglutinação e os ensaios imunoenzimáticos

(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) (DE WIT, 2000).

O VBI também pode ser detectado diretamente em tecidos de aves infectadas

por meio de técnicas de imuno-histoquímica (COLISSON et al., 1990; HANDBERG

et al., 1999). A imuno-histoquímica, uma ferramenta útil para o diagnóstico da

infecção por VBI, também possibilita estudos sobre a patogênese de diferentes

estirpes de VBI. Através da técnica de imuno-histoquímica é possível investigar o

tropismo tecidual de determinada cepa do VBI, a relação entre as lesões

histopatológicas e a presença ou quantidade do vírus no tecido e acompanhar a

migração do vírus durante a infecção (MONEIM et al., 2009; BENYEDA et al.,2010;

BEZUIDENHOUT; MONDAL; BUCKLES, 2011).

O teste de imuno-histoquímica e outros testes sorológicos utilizam anti-soros

contendo anticorpos contra diferentes partes do vírus ou anticorpos monoclonais

(AcMs) contra um ou mais epítopos (DE WIT, 2000). O uso de AcMs aumenta a

confiabilidade destas metodologias, pois eles reconhecem um epítopo exclusivo do

VBI. Além disso, AcMs apresentam outras vantagens, quando comparados com

anticorpos policlonais, tais como maior especificidade, disponibilidade de quantidade

ilimitada de anticorpos, uniformidade, necessidade de uma única padronização e

estabilidade do hibridoma (CAMPBELL, 1991).

Diversos grupos de pesquisa estão trabalhando na obtenção de AcMs,

porém, devido a grande variabilidade genética entre os isolados de diferentes

regiões, um anticorpo produzido contra o isolado de determinada região não

apresenta a mesma sensibilidade em relação aos isolados de outras regiões

(CAVANAGH; ELLIS; COOK, 1997; JONES, 2010; CHEN; WANG; CHENG, 2011).

Além disso, a importação deste insumo, já que ainda não há um AcM específico

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para IBV no país, torna tais metodologias dispendiosas e inacessíveis. Diante deste

contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir e caracterizar AcMs contra o VBI para

sua utilização no imunodiagnóstico para esta enfermidade.

14

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Avicultura

No cenário mundial, a carne de frango ocupa o segundo lugar no mercado de

carnes (OECD, 2011). Segundo o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos

(USDA, 2012), a avicultura mundial produziu 81 milhões de toneladas de carne de

frango em 2011, sendo o Brasil responsável por 16 % desta produção.

No Brasil, até a década de 1960, a produção de carne de frango era realizada

de forma artesanal e destinava-se apenas ao consumo próprio. A partir de meados

dos anos 60, o setor passou a se desenvolver e ter importância econômica. O

desenvolvimento da avicultura ocorreu através da implementação de um modelo de

produção baseado em grandes produtores independentes e autônomos, em relação

à indústria, e com o uso de mão de obra assalariada. Assim, iniciou-se no Estado de

São Paulo, a fundamentação da avicultura nacional moderna. Nos anos 70, a

avicultura brasileira teve um grande crescimento, devido à implantação do modelo

de “integração sudoeste catarinense”, o qual introduziu um pacote tecnológico que

envolveu o controle pela indústria do ciclo produtivo das aves, gerando crescimentos

sucessivos da produtividade (TAVARES; RIBEIRO, 2007). As empresas passaram a

controlar todo o processo produtivo (criação das matrizes, incubação dos ovos,

produção da ração, o abate e a comercialização). Os pequenos e médios produtores

detinham-se apenas a fase de engorda das aves, ainda sob recomendações

técnicas das empresas (TAKAGI et al., 2002). Este sistema levou a uma expansão

da avicultura no país, estendendo-a aos estados do Rio Grande do Sul e Paraná e,

posteriormente, para Minas Gerais.

A avicultura brasileira encontra-se em posição de destaque, sendo a maior

exportadora de carnes de frango e a terceira maior produtora de frangos de corte

(USDA, 2012). O avanço na produção de ovos é outro fator relevante, atendendo a

toda demanda do mercado interno, com potencial para exportação (UBA, 2012).

Entretanto, as infecções virais que acometem as aves, levam a enormes perdas

econômicas na avicultura brasileira e no mundo todo, devido à diminuição do

crescimento dos animais, redução da qualidade e da produção de ovos, mortalidade,

condenação ao abate e gastos com insumos, incluindo diagnóstico, vacinas e

antimicrobianos, a fim de eliminar infecções bacterianas intercorrentes.

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Dentre os agentes com grande potencial de ocasionar as mais severas

perdas, em termos de mortalidade, estão os causadores da doença de Gumboro, de

Newcastle e da Bronquite Infecciosa das Galinhas (BI). E, dentre estas patologias, a

BI possui maior importância econômica, em razão da sua ampla disseminação e dos

enormes prejuízos que acarreta, alcançando a ordem de milhões de dólares

anualmente (JONES, 2010).

2.2 Etiologia

O vírus da bronquite infecciosa (VBI) pertence à família Coronaviridae, na

ordem Nidovirales. A família Coronaviridae é dividida em duas subfamílias:

Coronavirinae e Torovirinae). O VBI pertence à subfamília Coronavirinae e pode

infectar diversas espécies animais, incluindo seres humanos, aves, bovinos, suínos,

cães, gatos e roedores (PATTISON et al., 2008). Coronavirinae são divididos nos

gêneros: Alphacoronavirus, Betacoronavirus e Gammacoronavirus. O VBI também é

chamado de Coronavirus aviário, uma espécie do gênero Gammacoronavirus

(CAVANAGH; GELB, 2008; CAVANAGH, 2007).

O genoma do VBI consiste de uma fita única de RNA de sentido positivo e

contém cerca de 27600 nucleotídeos (CAVANAGH, 2007). O genoma viral é

envolvido basicamente por 3 proteínas: a nucleoproteína (N, uma proteína

fosforilada do nucleocapsídeo interno) e externamente, pelas glicoproteínas da

matriz (M) e da espícula (S), sendo essa última composta por duas subunidades, S1

e S2. Existe ainda uma quarta proteína (E), que é associada ao envelope viral, está

presente em pequena quantidade e possui baixa massa molecular, com cerca de

100 resíduos de aminoácidos. (MARTINS, 1992; MURPHY et al., 1999; ROCHA,

2000; RESENDE, 2003, MCKINLEY; HILT; JACKWOOD, 2008).

A proteína N é formada por 409 aminoácidos, com uma massa molecular de

cerca de 50 KDa (MACNAUGHTON; MADGE, 1977, BOURSNELL et al., 1985).

Está localizada na parte mais interna do vírion, encontrando-se diretamente

associada ao RNA genômico. Esta proteína exerce um papel importante nos

processos de replicação e montagem de novas partículas do VBI (COLLISON et al.,

1992). Usualmente, tal proteína apresenta elevada homologia entre as diferentes

cepas de VBI, sendo uma proteína bastante imunogênica e abundantemente

expressa durante o processo de infecção viral (WILLIAMS; SNEED; COLLISSON,

1992).

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A glicoproteína M interage com o nucleocapsídeo interno da partícula viral e

possui cerca de 225 aminoácidos, sendo que desses, somente 10% estão

exteriorizados no envelope viral. Essa glicoproteína apresenta variação de peso

molecular (26 a 34 KDa) devido a diferentes níveis de glicosilação que a mesma

sofre no Complexo de Golgi (KING; CAVANAGH, 1991, MARTINS, 1992, MURPHY

et al., 1999, ROCHA, 2000).

A glicoproteína S é clivada em duas subunidades: S1 (535 aminoácidos, 92

kDa) e S2 (627 aminoácidos, 84 kDa) (CAVANAGH, 1981). A função da proteína S,

dentre outras, é ligar o vírus ao receptor na célula hospedeira (S1) e induzir a fusão

das membranas da célula e do vírus, de modo que o genoma viral possa ser

libertado para dentro do citoplasma (S2) (CAVANAGH, 2007). A subunidade S2 é

muito mais conservada entre os sorotipos do que a S1 (CAVANAGH; GELB, 2008).

Já foram identificados diversos sorotipos e genótipos de VBI e novas

variantes continuam emergindo devido às mutações e recombinações no genoma

viral (JONES, 2010). O VBI protótipo é a cepa Massachusetts M41, do sorotipo

Massachusetts. O principal sítio determinante da indução de anticorpos

neutralizantes contra o VBI, que define o sorotipo, reside na subunidade S1 da

proteína S (OIE, 2008), e a evolução sorotípica do vírus parece estar relacionada

primariamente à sequência dessa subunidade (LIU et al., 2006). Uma mudança de

apenas 2-3% da sequência de nucleotídeos no gene S1, representando cerca de 10-

15 aminoácidos, podem alterar o sorotipo da estirpe (CAVANAGH, 1997).

A capacidade de mutação e recombinação do VBI e a pressão de seleção

exercida pelo uso prolongado de vacinas vivas contribuem para o aparecimento de

uma grande variedade de sorotipos e subtipos de VBI, sendo os sorotipos

Massachusetts 82828, Beaudette 66579 (cepa mutante derivada da cepa

Massachusetts), Connecticut e Arkansas os mais conhecidos (DI FABIO et al.,

2000). As mutações são aleatórias e ocorrem no VBI devido ao fato do vírus possuir

RNA como material genético. Além disso, a ausência de fita dupla pode impedir a

reparação de erros durante o processo de replicação.

2.3 Patogenia e sinais clínicos

A BI ocorre sob formas clínicas e anatomopatológicas diferentes. A patogenia

e os sinais clínicos decorrentes da infecção pelo VBI podem variar conforme o

tropismo tecidual que a cepa possui. Entretanto, independente do tropismo, o VBI é

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primariamente epiteliotrópico, replicando-se nas células epiteliais, nas células

secretoras de muco e nas células dos pulmões e dos sacos aéreos. A replicação do

vírus nos tecidos do trato respiratório causa sinais característicos, como dificuldades

para respirar, tosse e descarga nasal (CAVANAGH, 2007).

A infecção por VBI produz lesões características na traquéia, que é o órgão

de eleição para sua multiplicação (KING; CAVANAGH, 1991), sendo por isso,

considerada uma doença primária do aparelho respiratório (RESENDE, 2003). A

mucosa da traquéia torna-se edematosa com a perda de cílios e a diminuição da

atividade ciliar, e esse parâmetro tem sido usado para inferir sobre a severidade da

infecção no trato respiratório (DHINAKAR; JONES, 1997, CAVANAGH; GELB, 2008,

VILLARREAL et al., 2007b). Sacos aéreos e pulmões podem ou não ser atingidos

(CAVANAGH; GELB, 2008, ENGSTRÖM et al., 2010).

Alguns sorotipos, denominados nefropatogênicos, possuem tropismo pelos

rins e causam lesões renais incluindo inchaço, palidez e dilatação dos túbulos e

ureteres (CAVANAGH; GELB, 2008). A replicação do VBI nos rins foi demonstrada

nos túbulos proximais, distais e coletores (CHEN et al., 1996). A severidade da

infecção por estes sorotipos está relacionada com a formação e deposição de

imunocomplexos, causando nefrite, nefrose, gota e uremia (WINTERFIELD;

ALBASSAM, 1984). A deposição de imunocomplexos também ocorre pela infecção

com outros sorotipos de VBI, podendo ser observada nos capilares dos músculos

peitorais das aves, causando, nesses casos, miopatia bilateral (DHINAKAR; JONES,

1996, GOUGH; PEARSON, 1992).

Certas cepas possuem a capacidade de sobreviver, tanto na presença de pH

baixo, quanto na presença de enzimas digestivas e sais biliares, característica

relevante para a replicação entérica. As cepas enterotrópicas de VBI podem causar

diarréia aquosa nas aves infectadas (DHINAKAR; JONES, 1996).

Em fêmeas, a infecção por VBI leva ao declínio da produção de ovos.

Entretanto, a severidade varia de acordo com o período de postura, a virulência das

cepas envolvidas e outros fatores não específicos (CAVANAGH, 2003). A produção

de ovos pode aumentar após duas ou três semanas, mas atinge apenas níveis

subótimos. Fêmeas infectadas com menos de duas semanas de idade podem ter

danos permanentes ao desenvolvimento do trato reprodutivo (DHINAKAR; JONES,

1997). Em galos o VBI pode causar lesões no testículo e levar a infertilidade

(VILLARREAL et al., 2007b).

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O longo período em que o VBI pode permanecer incubado (até 50 dias)

facilita que, durante este período, ocorram infecções bacterianas e virais

secundárias, o que é um fator importante na patogenia do VBI (CAVANAGH, 2003).

Vários patógenos respiratórios como Mycoplasma gallisepticum, M. sinoviae,

Escherichia coli, Haemophilus paragallinarum, vírus da doença de Newcastle e vírus

da doença de Gumboro, podem interagir sinergicamente com o VBI ou com os vírus

vacinais, aumentando a severidade e duração da doença (KING; CAVANAGH, 1991,

ROCHA, 2000; MATTHIJS et al., 2009). Estas infecções podem resultar em lesões

nas células do oviduto, levando à redução da produção e comprometimento da

qualidade interna e externa dos ovos. Além disso, estas infecções também podem

causar pericardite, aerossaculite, perihepatite e peritonite (SANTOS; FARIA;

RIBEIRO, 2005).

Em relação à morbidade e mortalidade causada pelo VBI, todas as aves de

um plantel podem ser acometidas, mas a mortalidade é variável, dependendo da

estirpe viral, idade, estado imunológico do lote, fatores ambientais estressantes e

infecções bacterianas secundárias. Em aves jovens a doença se manifesta com

maior severidade. Com o aumento na idade, diminui a taxa de mortalidade e

aumenta a ocorrência das lesões renais e do oviduto (HIPÖLITO; SILVA; HSIUNG,

1979, KING; CAVANAGH, 1991, RESENDE, 2003).

2.4 Epidemiologia

O VBI está distribuído por quase todo o globo, exceto na Albânia, na Geórgia,

na Groenlândia, na Letônia, na Mongólia, em St. Kitts e Nevis, em São Vicente e

Granadinas, no Tajiquistão e em Trinidad e Tobago (OIE, 2008). No Brasil, há

evidências de que o VBI ocorra em todo o país, pois isolados do VBI já foram

identificados em São Paulo, Paraná, Rio de Janeiro, Rondônia (DI FABIO et al.,

2000), Minas Gerais (ABREU et al., 2006) e no Distrito Federal (OIE). Os últimos

surtos foram registrados no ano de 2007. Quatro deles ocorreram no Estado da

Bahia, um no Estado de Pernambuco e um no Estado de Santa Catarina (OIE). Isto

é um indicativo de que os sorotipos vacinais autorizados atualmente não conferem

proteção cruzada contra os vírus circulantes no Brasil (GELB et al., 2005).

Aves de todas as idades são suscetíveis a infecções por VBI. Entretanto os

sinais clínicos são mais severos em aves jovens. Linhagens resistentes e sensíveis

são igualmente suscetíveis à infecção inicial por VBI, no entanto, a recuperação é

19

mais rápida nas primeiras (CAVANAGH; NAQI, 2003; DI FÁBIO, 1993; DI FÁBIO et

al., 2000).

O período de incubação é de 18-36 horas (CAVANAGH; GELB, 2008;

ENGSTRÖM et al, 2010). Após este período, o vírus pode ser excretado via muco,

secreções conjuntival e/ou nasal, por um período superior a quatro semanas. As

fezes também caracterizam-se como uma via de disseminação do agente, porém,

por essa via, o VBI pode ser eliminado por um período de até 20 semanas após a

infecção (KING; CAVANAGH, 1991; DI FÁBIO, 1992).

O VBI pode persistir por longos períodos no trato intestinal, possivelmente nas

tonsilas cecais, sem causar lesões, e essa permanência é um fator importante na

epidemiologia das infecções pelo VBI. Tem sido demonstrado experimentalmente,

em pintos de 1 dia de idade, que a re-excreção pode ocorrer intermitentemente a

partir do início da postura (COOK, 1990). Em geral, os portadores podem transmitir o

vírus por até dois meses após a infecção natural, permanecendo as aves

recuperadas suscetíveis à infecção por outro sorotipo (KING; CAVANAGH, 1991; DI

FÁBIO, 1993; ROSSINI; MONTEIRO, 2004). A transmissão também pode ocorrer

através de objetos contaminados, equipamentos e manipuladores (ENGSTRÖM et

al., 2010).

2.5 Controle

O controle da BI tem sido realizado através de práticas higiênico-sanitárias,

juntamente com programas imunoprofiláticos realizados por meio da vacinação.

Práticas básicas de manejo, como acesso limitado e controlado ao local, uso de

calçados e equipamentos separados para cada lote minimizam o risco da introdução

do VBI. Para prevenir infecções, deve-se realizar a limpeza do local, incluindo a

remoção e descarte de todo o material orgânico do criadouro. É indicado o uso de

um desinfetante adequado para reduzir a infectividade de qualquer partícula viral.

Produtos contendo formaldeído, agentes que liberam cloro ou compostos de amônia

quaternária são adequados. Nos locais onde há animais de diversas idades é

necessário um rígido controle do movimento do pessoal e de equipamentos entre os

aviários (DI FABIO, 1993).

A prevenção do VBI através da imunização das aves já vem sendo praticada

há mais de meio século. A vacinação é feita tanto com vacinas inativadas quanto

vivas, ambas elaboradas a partir da cepa Massachussets. As vacinas vivas são

20

compostas de estirpes atenuadas de VBI, sendo que a atenuação é feita por meio

de múltiplas e seriadas passagens em ovos embrionados de galinha. As vacinas

vivas destinam-se mais ao uso em aves jovens ou em período de crescimento

(frangos de corte, poedeiras e reprodutoras em fase de recria), em uma ou duas

administrações, com intervalos de 20-30 dias, devendo ser aplicadas

preferencialmente por meio de aerossol a um grande número de aves (MENDONÇA

et al., 2009, MONTASSIER et al., 2008).

As vacinas vivas atenuadas conferem melhor imunidade local no trato

respiratório. Entretanto, há o risco de patogenicidade residual, reversão de virulência

e persistência (BIJLENGA et al., 2004; MCKINLEY; HILT; JACKWOOD., 2008).

Dentre as vacinas atenuadas, citam-se a H52 e a H120, derivadas da amostra

nefrotóxica Holland (H). A H120 é possivelmente a mais usada globalmente devido à

sua capacidade de promover proteção cruzada contra VBIs de diferentes sorotipos

(BIJLENGA et al., 2004). O uso da H52 tem declinado devido ao surgimento de

vacinas inativadas altamente eficazes e seguras (BIJLENGA et al., 2004). Em

regiões avícolas densamente povoadas e sem possibilidade de vazio sanitário, há o

risco do uso inadequado das vacinas vivas, com oportunidade de escape de vírus

entre lotes e entre granjas próximas, o que torna esse tipo de vacinação uma prática

de risco, além do seu alto custo, especialmente em frangos de corte. Entretanto, em

poedeiras, a relação custo benefício poderá ser favorável, além do menor risco de

escape de vírus virulento na adoção da vacinação nesse tipo de plantel (MCKINLEY;

HILT; JACKWOOD, 2008).

As vacinas inativadas contem estirpes de VBI tratadas com agentes químicos

inativantes e são acrescidas de adjuvantes (emulsões oleosas). As vacinas

inativadas oleosas destinam-se mais ao uso em aves de ciclo longo de vida, como

galinhas de postura e reprodutoras e devem ser aplicadas de um a dois meses antes

da puberdade e recomenda-se que sejam administradas após a aplicação prévia de

vacinas atenuadas (CAVANAGH; NAQI, 2003).

As vacinas inativadas estão disponíveis no mercado brasileiro,

exclusivamente para BI (algumas contendo mais de um sorotipo de VBI), ou

associadas a vacinas contra outras doenças, como a doença de Newcastle. A vacina

atenuada denominada H120 tem sido amplamente utilizada no Brasil desde 1979.

Resultados parciais de testes de proteção confirmaram que a vacina H120 confere

alta proteção contra o VBI do genótipo M (PEREIRA et al., 2006).

21

Na imunização contra o VBI, a atenção primária foi direcionada para a

glicoproteína S1, uma vez que ela contém os principais sítios antigênicos alvos de

anticorpos neutralizantes desse vírus. No entanto, esta proteína está sujeita a sofrer

uma enorme variabilidade na composição de aminoácidos de algumas de suas

regiões, o que faz com que as variantes do VBI escapem do processo de

neutralização por anticorpos contra S1. A proteína N, por sua vez, não induz a

formação de anticorpos neutralizantes, é mais conservada e parece estar envolvida

na indução de respostas imunes humorais, como a ação das células T citotóxicas.

Porém esta resposta ainda está sendo estudada (SEO; COLLISSON, 1997).

A multiplicidade de sorotipos identificados na área representa um desafio na

elaboração de um programa de vacinação eficaz. A relação genética entre os

isolados brasileiros e as cepas estrangeiras, especialmente aquelas utilizadas na

produção de vacinas, ainda é escassamente conhecida e são necessários mais

estudos para caracterizar as mudanças causadas por mutações e/ou recombinações

na proteína S1 desses isolados. Além disso, deve-se verificar o grau de proteção

dessas vacinas contra infecções causadas por cepas brasileiras (MONTASSIER et

al., 2008).

Apesar de diversos estudos terem demonstrado a presença de linhagens de

VBI divergentes da cepa Massachusetts no Brasil (VILLARREAL, 2007a;

VILLARREAL, 2007b; SANDRI et al., 2008; VILLARREAL et al., 2010) e do fato de

que a vacinação com mais de uma cepa tenha demonstrado aumentar o nível de

proteção para VBI (COOK et al., 1999; GANAPATHY et al., 2009), no Brasil, o

Ministério da Agricultura permite o uso de vacina viva apenas da cepa

Massachusetts, devido ao risco de entrada de novas variantes no país. Assim,

devido a restrição da vacinação, a indústria avícola brasileira têm uma significativa

desvantagem no controle da BI.

2.6 Diagnóstico

A confirmação do diagnóstico do VBI é baseada no isolamento viral, sempre

em conjunto com a sorologia (DI FABIO et al., 2000). Para o diagnóstico virológico

da forma respiratória clássica, devem ser coletadas amostras da mucosa traqueal e

dos pulmões. Para as outras formas de VBI, rins, ovidutos, tonsilas cecais do trato

intestinal ou tecidos do proventriculo, dependendo da patogenia da doença, são

fontes mais indicadas para o isolamento do vírus (OIE, 2008).

22

Os métodos de diagnóstico convencionais do VBI são baseados no

isolamento viral em ovos embrionados livres de patógenos específicos (SPF) (GELB,

1989; OWEN et al., 1991) ou em culturas celulares (HOPKINS, 1974), seguidos da

identificação antigênica dos vírus isolados. Três ou mais passagens em ovos

embrionados são geralmente necessárias para o isolamento primário do VBI, o que

torna tais procedimentos onerosos e demorados. Além disso, somente estirpes

adaptadas à passagem em ovos induzem características evidentes como nanismo e

enrolamento embrionário. Alguns isolados de campo do VBI não induzem lesões

embrionárias específicas durante várias passagens (RAJ et al., 2004).

Outra alternativa é o isolamento do VBI a partir da inoculação em anéis

traqueais de embriões SPF, a qual se revelou uma técnica bastante sensível

(COOK; DARBYSHIRE; PETERS, 1976), mas também muito laboriosa e demorada.

Esse método pode ser associado à reação de imunofluorescência direta em culturas

de órgão traqueal, permitindo a detecção mais rápida do VBI (BHATTACHARJEE;

NAYLOR; JONES, 1994).

Testes baseados em biologia molecular são úteis para fazer o diagnóstico

direto e/ou a genotipagem do VBI. Dentre esses métodos destacam-se a

Transcrição Reversa associada à Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), a

análise de fragmentos genômicos gerados por enzimas de restrição (RFLP), e o

seqüenciamento dos genes mais importantes desse patógeno viral (CAVANAGH;

NAQI, 2003).

Técnicas sorológicas também são amplamente aplicadas no diagnóstico do

VBI, tais como as reações de imunofluorescência, imunodifusão em ágar gel,

imunoperoxidase, inibição da hemaglutinação e os ensaios imunoenzimáticos

(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay) (DE WIT, 2000).

Os ensaios de vírus neutralização e de inibição da hemaglutinação (IH) são

técnicas amplamente utilizadas no diagnóstico e também podem ser usadas para

monitorar a grande variabilidade que ocorre entre as estirpes do VBI, possibilitando

a classificação das mesmas em diferentes sorotipos. A técnica de vírus

neutralização geralmente é realizada em ovos embrionados, ou em anéis traqueais,

mas tem como desvantagens a necessidade de adaptação do vírus ao sistema de

cultivo, além de que, a infectividade do vírus é avaliada com base nas lesões que

ocorrem no embrião e para isso é necessário uma grande quantidade de ovos

(COWEN; HITCHNER, 1975). Ademais, deve-se considerar que são necessárias

23

sucessivas passagens para a adaptação do vírus à propagação em ovos

embrionados. Esta etapa pode provocar alterações nas características genéticas e

antigênicas no VBI (OTSUKI; TAGAWA; TSUBOKURA, 1982). O método de cultivo

do VBI em anéis de traquéia de embriões de galinha não requer adaptação prévia

desse vírus, porém a dificuldade reside no processo de preparação dos anéis

(CHERRY; TAYLOR , 1970, DARBYSHIRE et al., 1980).

A IH é uma prova sorológica qualitativa utilizada para o diagnóstico do vírus e

também para a identificação sorológica. A identificação sorológica é feita por meio

da IH de uma amostra viral por um soro padrão. Para realizar este teste, é

necessário um tratamento prévio do vírus com a enzima fosfolipase tipo C, para a

exposição das hemaglutininas (DI FABIO; ROSSINI, 2000), já que o VBI não é

naturalmente hemaglutinante. Entretanto, devido às múltiplas infecções e

vacinações, o soro das aves contém anticorpos que apresentam reações cruzadas,

e o resultado do teste de IH não pode ser utilizado com alto grau de confiança, além

de ser laborioso e de difícil padronização (DI FABIO; ROSSINI, 2000; OIE, 2008).

O ELISA é utilizado para o monitoramento sorológico da resposta vacinal e

para o monitoramento dos desafios de campo. No entanto, em alguns casos são

observados problemas relacionados ao desenvolvimento de reações inespecíficas,

baixa sensibilidade, subjetividade da análise dos resultados, além da impossibilidade

de discriminação entre as diferentes estirpes do VBI (IGNJATOVIC; ASHTON, 1996;

WANG et al., 2002). Entretanto, foi comprovado que os ensaios imunoenzimáticos,

quando realizados com padrões apropriados, indicam, com elevada acurácia, as

concentrações de anticorpos específicos anti-VBI e podem facilitar o monitoramento

do estado imunitário em criações com grande número de aves (MARQUARDT;

SNYDER; SCHLOTTHOBER,1981; SNYDER et al. , 1983).

Atualmente, kits de ELISA para o diagnóstico de VBI já estão disponíveis no

mercado. Nestes kits, uma suspensão de partículas do VBI, purificada por ultra-

centrifugação, é usada para ser adsorvida, na primeira etapa da reação, ao suporte

sólido (superfície da cavidade da microplaca). A purificação destas partículas requer,

por sua vez, a propagação frequente desse vírus em sistemas de células

eucarióticas, no caso específico, em ovos embrionados SPF, e torna bastante difícil

e oneroso para um vírus envelopado e com elevada labilidade no que tange à

conservação da estrutura nativa dos seus antígenos, especialmente as

glicoproteínas das espículas de superfície (NDIFUNA et al., 1998). O VBI também

24

pode ser detectado diretamente em tecidos de aves infectadas por meio de técnicas

de imuno-histoquímica (IHQ) ou por hibridização “in situ” (COLISSON et al., 1990;

HANDBERG et al., 1999). A IHQ é uma ferramenta útil para o diagnóstico de

infecção por VBI e também possibillita estudos sobre a patogênese de diferentes

estirpes de VBI. Através da técnica de IQH é possível investigar o tropismo tecidual

de determinada cepa do VBI, a relação entre as lesões histopatológicas, a presença

ou quantidade do vírus no tecido e acompanhar a migração do vírus durante a

infecção.

Em um estudo realizado por Mahdavi et al. (2007), trinta pintos SPF com 20

dias de idade foram inoculados via intratraqueal (n = 15) ou oral (n = 15) com o VBI

sorotipo 793 / B, isolado no Irã. A IQH revelou que os antígenos virais foram

detectados nas células da traquéia, rins, intestino e pulmão. Os resultados deste

estudo indicam que o VBI (sorotipo 793 / B), é capaz de causar lesões em diferentes

tecidos, entretanto atinge mais severamente os rins. No rim, o antígeno viral foi

localizado principalmente nas células epiteliais, mais proeminentemente nos túbulos

renais onde também foram encontradas lesões histopatológicas. Os antígenos virais

eram aparentes antes do desenvolvimento de lesões e foram detectados no

citoplasma das células epiteliais por 3 dias após a infecção com VBI independente

da via de infecção (MAHDAVI et al., 2007).

O objetivo do estudo de Benyeda et al. (2010) foi comparar

experimentalmente a patogenicidade e distribuição tecidual de diferentes cepas de

VBI: a cepa emergente QX, a M41 (protótipo do VBI) e sorotipos 793 / B. Métodos

histopatológicos e imuno-histoquímicos foram empregados para definir os principais

locais de replicação de cada estirpe viral. Os animais foram monitorados durante 42

dias pós-infecção. Todos os frangos infectados apresentaram lesões traqueais, o

que confirma a capacidade de todas as estirpes testadas de induzir doença

respiratória. A replicação dos isolados no trato alimentar foi detectada, mas a

infecção não causou no intestino significativas lesões. Quatro das cinco estirpes QX

induziram lesões renais graves (BENYEDA et al., 2010).

Os métodos de diagnóstico citados anteriormente, que visam à detecção do

antígeno, utilizam anti-soros contendo anticorpos contra diferentes partes do vírus

ou AcMs, contra um ou mais epítopos (DE WIT, 2000). Os AcMs possuem diversas

vantagens, comparando com os anticorpos policlonais, por serem produzidos por

clones híbridos derivados de células progenitoras linfoides únicas, secretando

25

anticorpos homogêneos. A produção e seleção dos hibridomas podem ser

controladas para se obter especificidade, afinidade e funções efetoras desejadas.

Além disso, esse método de produção apresenta enorme reprodutibilidade, não

somente em meio de cultivo, mas também no fluido extraído das ascites, que

proporciona uma quantidade ilimitada de anticorpos específicos (CAMPBELL, 1991).

Os AcMs desempenham um importante papel no desenvolvimento de

técnicas de diagnóstico para BI desde a década de 1980. Estudos iniciais

baseavam-se na detecção de diferentes classes de anticorpos na resposta imune

desenvolvida por frangos infectados e a confirmação da importância de IgM no início

da resposta imune. AcMs específicos para IgM proporcionaram o desenvolvimento

de um ELISA de captura específico para IgM (KARACA; NAQI; GELB, 1992). A

aplicação de diferentes AcMs no diagnóstico da BI pode ser exemplificado pelo

trabalho desenvolvido por Ignjatovic e McWater (1991), onde foram utilizados AcMs

dirigidos contra as três principais proteínas estruturais do VBI para detectar e

diferenciar as variantes do VBI encontradas na Austrália. Em um outro estudo,

desenvolvido por Koch et al. (1986), foram produzidos uma série de AcMs anti-VBI

e com base na sua reatividade com um painel de AcMs específicos para a proteína

S, foi possível a diferenciação entre as estirpes VBI de campo, proporcionando um

método muito mais rápido do que os testes de neutralização.

O grupo de Chen, Wang.e Cheng (2011) desenvolveu um AcM contra a

proteína S1 que demonstrou especificidade para estirpes de VBI de Taiwan e

nenhuma reatividade cruzada com a estirpe vacinal H120. Desta forma, este AcM

foi utilizado em um ELISA de bloqueio para detecção do VBI em isolados locais. Os

resultados demonstraram 98,0% de sensibilidade e especificidade de 97,2%

(n=390). O teste detectou todos os sorotipos de VBI de Taiwan, mas não três

isolados de outros sorotipos, nem soros contra a gripe aviária e outros patógenos.

Este AcM tem potencial para servir como um método rápido e confiável para

diagnóstico de infecções do VBI de isolados de campo em Taiwan (CHEN, WANG;

CHENG, 2011).

O estudo de Bezuidenhout, Mondal e Buckles (2011) utilizando os AcMs

produzidos por Karaca, Naqi e Gelb (1992) comparou através da técnica de IHQ a

evolução precoce de lesões do saco aéreo em aves que foram inoculadas com uma

estirpe do vírus vacinal ou de uma estirpe de campo mais virulenta. Este estudo

26

demonstra o êxito desta técnica de imunodiagnóstico utilizando AcMs

(BEZUIDENHOUT; MONDAL; BUCKLES; 2011).

Diversos grupos de pesquisa estão trabalhando na obtenção de AcMs, porém,

devido à grande variabilidade genética entre os isolados de diferentes regiões, um

anticorpo produzido contra o isolado de determinada região não apresenta a mesma

sensibilidade em relação aos isolados de outras regiões (BEZUIDENHOUT;

MONDAL; BUCKLES; 2011). Além disso, a importação deste insumo, já que ainda

não há um AcM específico para VBI no país, torna tais metodologias mais caras e

inacessíveis.

27

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Vírus e anticorpos

As amostras do VBI e do fluido alantóico foram preparados e gentilmente

cedidos pelo Centro Nacional de Pesquisa em Suínos e Aves (CNPSA) da Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) de Concórdia – SC. Os vírus da

Bouba das Aves e de Newcastle foram obtidos a partir de vacinas comerciais

gentilmente cedidas pelo Laboratório de Virologia da Faculdade de Veterinária da

Universidade Federal de Pelotas.

Foram utilizadas duas amostras do VBI: uma denominada “VBI clássico (M41)

local”, constituída da cepa Massachusetts M41, obtida a partir de isolados locais,

cepa padrão utilizada em vacinas para BI e responsável pelos primeiros e maiores

surtos da BI, e outra denominada “VBI variante”, constituída de uma cepa de VBI

que sofreu mutações e se diferenciou da cepa clássica (M41). Nos últimos anos esta

última tornou-se prevalente nos surtos de BI na região, sendo obtida a partir de

isolados locais. Para obtenção dos vírus, foram utilizados ovos livres de patógenos

específicos (SPF) com 9 dias de incubação. Estes ovos foram inoculados com as

amostras virais e incubados a 37ºC. Após 48h, foram colhidos o fluido alantóico

(LCA) e as membranas (MCA). As MCA foram trituradas, lavadas e centrifugadas a

1400 g durante 10min por 3 vezes em solução salina fosfatada tamponada (PBS). O

sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido em uma solução

contendo 10mM de Tris, 1mM de EDTA e 100mM de NaCl (Tampão TNE). O LCA foi

centrifugado somente uma vez. O LCA e as MCA foram centrifugados em tubos de

ultra centrífuga com um colchão de sacarose a 30% e centrifugados a 140000 g

durante 3h. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados ressuspendidos

em tampão TNE.

Todo o processo de multiplicação, purificação e quantificação das amostras

foi realizado na Embrapa. As concentrações das amostras do VBI clássico (M41) e

VBI variante, utilizadas na imunização dos animais, corresponderam a 30mg/mL e

84mg/mL respectivamente.

Foram gentilmente cedidos também, pela CNPSA-Embrapa, um painel de

soros positivos (utilizados como controles positivos nos testes) e negativos para BI

(utilizados como controles negativos). Como controles positivos foram utilizados

também o soro do animal imunizado com o VBI variante antes da fusão celular e

28

uma ascite policlonal anti-VBI. Para a produção de ascite policlonal anti-VBI, três

camundongos da linhagem BALB/c com 8 semanas de vida foram imunizados 6

vezes, intraperitonealmente, com 100μg da vacina contra a BI, utilizando-se

adjuvante de Freund completo na primeira dose, e incompleto nas doses

subsequentes. As imunizações ocorreram a intervalos de uma semana entre elas,

exceto entre a primeira e a segunda imunizações, quando os animais receberam

uma dose de 500μL de pristane. Aproximadamente 8 dias após a última imunização,

fluido ascítico foi puncionado a partir dos camundongos, centrifugado a 1500g por

10min e estocado a 4°C.

O soro pré-imune do camundongo imunizado e um soro contra as proteínas

presentes na amostra de fluido alantóico, produzido através da imunização de três

camundongos com o fluido alantóico de um cultivo não infectado, foram utilizados

como controles negativos. Para a isotipagem dos AcMs através de SDS PAGE 12%,

foram utilizados como controles dois AcMs, um anti-Listeria spp. do isotipo IgM (3F8)

e outro anti-internalina A (InlA) de Listeria monocytogenes do isotipo IgG (2D12). E

como controle positivo na Imuno-histoquímica (IHQ) foi utilizado um AcM comercial

anti-VBI específico para a proteína N de VBI.

3.2 Análise das amostras virais

Para verificar a pureza das amostras, realizou-se uma análise das proteínas

virais através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE) a 10% e

Western blot. As amostras foram preparadas adicionando-se 450μg dos vírus

diluídos em 15µL de PBS, 15µL de tampão de amostra (0,92g de SDS, 2mL de

glicerol, 0,3g de Tris Base, 20mL de água) e 5µL de azul de Bromofenol. As

amostras foram aquecidas a 100°C por 20 min. Foram aplicados 15µl de cada

amostra às cavidades de dois géis e estes foram então submetidos à eletroforese a

100V por 90min. Um dos géis foi corado com a solução de Comassie blue para a

visualização das bandas correspondentes as proteínas virais. As amostras do outro

gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare), para a

realização do Western blot utilizando-se soro de galinha positiva para BI. A

transferência foi realizada por 2h a 100V, a temperatura de 4°C. As membranas

foram bloqueadas por 1h com 5% de leite em pó desnatado em PBS. O soro de ave

positivo para BI foi diluído 1:200 em PBS e adicionado a membrana. Após período

de incubação e lavagens, foi adicionado à membrana o anticorpo secundário anti-

29

imunoglobulina (Ig) de galinha conjugado a peroxidase (diluído 1:6000 em PBS). A

incubação de cada etapa foi realizada sob agitação, por 1h, a temperatura ambiente.

Entre cada etapa a membrana foi lavada 4 vezes com PBS contendo 0,05% de

Tween 20 (PBS-T). A reação antígeno-anticorpo foi revelada utilizando-se uma

solução de substrato contendo tetrahidrocloreto de diaminobenzedina (DAB).

3.3 Imunização dos animais

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com

os princípios éticos de experimentação animal do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA). Para a produção dos AcMs, camundongos da

linhagem Balb/c com 6 semanas de idade (2 grupos compostos de 3 animais cada)

foram imunizados 10 vezes com 100µg do VBI clássico (M41) local ou do VBI

variante, via intraperitoneal. Na primeira imunização, os vírus foram emulsificados

com o mesmo volume de adjuvante de Freund Completo e, nas demais (duas

semanas após a primeira e, semanalmente, a partir da 2ª imunização), em adjuvante

de Freund Incompleto. Três dias antes da fusão celular, o camundongo selecionado

recebeu uma nova dose do VBI em adjuvante incompleto, via intraperitonial, e outra

dose do VBI puro, via intravenosa.

3.4 Preparo das células de mieloma

Células de mieloma da linhagem celular Sp2/O foram retiradas do nitrogênio

líquido, descongeladas em banho-maria a 37°C, centrifugadas em meio de Eagle

modificado por Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM, Sigma)

incompleto (MI) a 1000g por 8min, e cultivadas em frascos de cultivo celular com

meio DMEM completo (MC). Após cinco dias de cultivo e sucessivas trocas de meio,

as células foram expandidas para frascos de cultivo maiores até a obtenção de três

frascos de 75cm².

3.5 Fusão Celular

Sete dias após a décima imunização dos camundongos, o soro dos animais

foi coletado por punção do plexo retro-orbital e o título de anticorpos foi determinado

por ELISA indireto utilizando o VBI variante como antígeno e o fluido alantóico como

controle negativo. O camundongo com maior título de anticorpos contra o VBI e

30

menor título contra o fluido alantóico foi selecionado para ser utilizado na fusão

celular.

No dia da fusão, o animal imunizado foi sacrificado e teve o baço removido

em ambiente estéril. O baço foi macerado em meio de cultivo MI, centrifugado a

1000g por 8min e as células ressuspendidas em MI, sendo novamente

centrifugadas. Ao final de três centrifugações para a remoção dos grumos maiores

do baço, as células foram ressuspendidas em 10mL de MI.

As células SP2/O cultivadas em MC foram retiradas dos frascos de cultivo e

centrifugadas a 1000g por 8min. Apos três lavagens com MI, as células foram

ressuspendidas em 10mL de MI e contadas em câmara de Neubauer. As células do

baço foram misturadas com 4x107 células SP2/O e centrifugadas a 1000g por 8min,

o sobrenadante foi desprezado e 1mL de uma solução de polietilenoglicol (PEG) a

50% em MI foi adicionado durante 1min. Esta suspensão foi agitada durante 1min e,

em seguida, 9mL de MI foram adicionados durante 5min. As células foram

centrifugadas a 1000g por 10min, ressuspendidas em 50mL de meio DMEM

contendo hipoxantina (1x10-6M), aminopterina (4x10-9M) e timidina (1,6x10-7M) (HAT)

e 20% de soro fetal bovino e distribuídas em 5 placas de cultivo celular

(0,1mL/cavidade). As placas foram incubadas a 37°C em estufa contendo 5% de

CO2.

3.6 Padronização do ELISA indireto para avaliar a soroconversão dos animais

e para fazer a triagem dos hibridomas e posterior caracterização dos AcMs

Para padronizar o teste, visando estabelecer a diluição ideal do antígeno e do

soro a serem utilizados como controle positivo, para avaliar a soroconversão dos

animais e para fazer a triagem dos hibridomas e posterior caracterização dos AcMs,

inicialmente, determinou-se a concentração ideal do antígeno a ser utilizada no

ELISA. Uma placa de poliestireno de 96 cavidades foi sensibilizada com 500, 250,

125 e 62,5ng/cavidade do VBI clássico ou variante, e da amostra de fluido alantóico

(utilizada como controle negativo) diluídos em tampão carbonato bicarbonato

(0,05M, pH 9,6). A placa foi sensibilizada com 100µL/cavidade e incubada por 16 a

18h a 4°C. Os soros coletados dos animais foram diluídos 1:100 em PBS-T,

aplicados em triplicata e incubados por 1h a 37°C. Como controle positivo foi

utilizada a ascite policlonal anti-VBI. O anticorpo de cabra anti-Ig de camundongo

conjugado a peroxidase foi diluído 1:4000 em PBS-T e adicionado a placa, e após

31

período de incubação de 1h e lavagem, a revelação da reação antígeno-anticorpo foi

realizada com a adição de ortofenilenodiamina (OPD) diluída em tampão citrato-

fosfato (0,2M, pH 4,0), contendo 0,01% de peróxido de hidrogênio. Após o período

de incubação de 15min, no escuro, a temperatura ambiente, a leitura foi realizada

em espectofotômetro a 450nm. Entre cada etapa a placa foi lavada 4 vezes com

200μL de PBS-T.

Para determinar a diluição ideal dos soros dos animais imunizados para ser

utilizada como controle positivo no ELISA indireto, uma placa de poliestireno de 96

cavidades foi sensibilizada com 250ng/cavidade do VBI clássico (M41) local ou

variante. A mesma concentração de amostra de fluido alantóico foi utilizada como

controle negativo. Os soros dos camundongos imunizados com o VBI clássico ou

com o VBI variante foram diluídos em base dois de 1:100 até 1:204800 em PBS-T.

Todas as diluições dos soros foram avaliadas em triplicata. As demais etapas do

ELISA foram realizadas conforme descrito anteriormente.

3.7 Triagem dos hibridomas e clonagem celular

As cavidades com crescimento de células ocupando mais de 50% da

superfície da cavidade foram testadas através de um ELISA indireto utilizando

250ng/cavidade do VBI variante e do fluido alantóico como antígeno. As células que

demonstraram secreção de anticorpos específicos para o VBI foram selecionadas

para a realização da clonagem e posteriormente reclonagem pela técnica da diluição

limitante (CAMPBELL, 1991). Após a reclonagem e subsequente triagem, uma parte

das células secretoras dos AcMs anti-VBI foram expandidas e congeladas em

nitrogênio líquido, em uma solução contendo soro fetal com 10% de dimetilsulfóxido

(DMSO), e a outra, injetada em camundongos para a produção de ascites.

3.8 Produção de ascite e purificação dos AcMs

Camundongos BALB/c com 6-8 semanas de idade foram sensibilizados com

0,5mL de Pristane (2, 6, 10, 14-tetra-metil-pentadecano, Sigma), e após 10 dias,

5x106 células de hibridomas em MI foram inoculadas intraperitonealmente nestes

animais. Quatorze dias após, os camundongos foram puncionados para retirada do

fluido ascítico que foi centrifugado a 1500g por 10min.

Os AcMs foram purificados em coluna de proteína A de acordo com as

instruções do fabricante (Amersham, MS). Alíquotas de 1mL foram coletadas em Tris

32

pH 9 e dialisadas contra PBS (500 x o volume total das frações). A concentração dos

anticorpos foi determinada por espectrofotometria (280nm) e o cálculo foi realizado

através do coeficiente de extinção. Os anticorpos foram armazenados a -18°C.

3.9 Caracterização dos AcMs

3.9.1 Isotipagem

A isotipagem dos AcMs anti-VBI foi realizada, inicialmente, através de ELISA,

onde uma placa de poliestireno de 96 cavidades foi sensibilizada com 1μg/mL dos

AcMs diluídos em tampão carbonato-bicarbonato e incubada por 1h a 37°C. A placa

foi lavada 4 vezes com 200μL de PBS-T, e em seguida foi adicionado 100μL dos

anticorpos de cabra anti-isotipo específicos (Sigma, EUA) diluídos 1:4000 em PBS-

T. Posterioremente, foram adicionados a placa 100μL de anticorpo de coelho anti-

IgG de cabra conjugado a peroxidase (1:5000 em PBS-T). A revelação foi realizada

com uma solução substrato-cromógeno contendo OPD. A leitura foi realizada em

espectrofotômetro a 450nm. A isotipagem dos AcMs foi confirmada através de SDS

PAGE 12%, utilizando como controles outros dois AcMs (anti-Listeria) já

caracterizados, um deles do isotipo IgM (3F8) e o outro do isotipo IgG (2D12). As

amostras foram preparadas a partir de 20μL dos AcMs adicionados de 5μL de

tampão de amostra com redução (2β-mercaptoetanol), e então submetidas a

tratamento térmico (100°C por 10min) em termociclador. Foram aplicados 12μL de

cada amostra.

3.9.2 Avaliação da capacidade dos AcMs reconhecerem a proteína na

sua conformação nativa e da sua especificidade através de ELISA indireto

A placa foi sensibilizada com 250ng/cavidade do VBI clássico local e variante,

vírus da Bouba das Aves, vírus de Newcastle e amostra de fluido alantóico (utilizada

como controle negativo) diluídos em tampão carbonato bicarbonato. Os AcMs foram

diluídos 1:200 em PBS-T, e aplicados 100μL/cavidade em triplicata. Como controle

positivo foi utilizado o soro do animal imunizado antes da fusão celular (1:12800). O

soro pré-imune do camundongo imunizado e o soro produzido contra as proteínas

presentes na amostra de fluido alantóico diluídos 1:200 foram utilizados como

controles negativos. A incubação das placas foi de 1h a 37°C e entre as etapas

deste ELISA, as placas foram lavadas 4 vezes com PBS-T. O anticorpo de cabra

33

anti-Ig de camundongo conjugado a peroxidase foi diluído 1:4000 em PBS-T e

adicionado a placa. Posteriormente as reações foram reveladas conforme descrito

anteriormente.

3.9.3 Avaliação da capacidade dos AcMs reconhecerem a proteína na

sua conformação nativa e da sua especificidade através de Western blot

Quatrocentos e cinquenta microgramas de cada uma das amostras avaliadas

(VBI variante, VBI clássico, vírus de Newcastle, vírus da Bouba das Aves e fluido

alantóico, como controle negativo) contidas em 15µL de PBS foram adicionados de

15µL de tampão de amostra e 5µL de azul de Bromofenol. A transferência e bloqueio

foram realizados conforme descrito anteriormente. Os AcMs foram diluídos 1:200 em

PBS-T e adicionados às membranas. Após período de incubação e lavagem, foi

adicionado à membrana anticorpo de cabra anti-Ig de camundongo conjugado a

peroxidase diluído 1:4000 em PBS-T. A reação antígeno-anticorpo foi revelada

utilizando-se uma solução de substrato contendo DAB. Todas as reações foram

realizadas a temperatura ambiente e entre cada etapa a membrana foi lavada 4

vezes por 5min com PBS-T.

3.10 Aplicação dos AcMs em Imuno-histoquímica (IHQ)

Seis aves SPF adultas foram infectadas experimentalmente via ocular com

103,5 EID50 de uma amostra do VBI clássico M41. Após 2, 4 e 6 dias da infecção os

animais foram sacrificados e necropsiados. Na necropsia foram coletados

fragmentos da traquéia, pulmão, rins e fígado para a análise histopatológica e de

IHQ. Estes fragmentos foram fixados por um período de 24 a 48 h em formol

tamponado a 10%. Posteriormente os tecidos foram processados pela técnica de

histopatologia de rotina. As lâminas foram coradas com Hematoxilina e Eosina para

observação das lesões. Lâminas dos mesmos tecidos foram utilizadas para a

técnica de IHQ para observar a reação dos AcMs produzidos com os antígenos

contidos nas seções de tecido selecionadas.

A reação de IHQ foi realizada com amplificação pelo Sistema HRP Dako

Cytomation LSAB (Dako). Lâminas tratadas com Poly-lisina foram utilizadas para

IHQ. Inicialmente as lâminas com os tecidos foram desparafinados com xilol por

10min a temperatura ambiente por duas vezes. Em seguida, os cortes foram

hidratados com álcool etílico absoluto (10min), álcool 96%, 80% e 70%

34

respectivamente, por 5min em cada. Após, as lâminas foram incubadas em PBS-T

por 4min. A recuperação antigênica foi realizada através de uma técnica de micro-

ondas. Para isso, as lâminas foram incubadas em tampão citrato (10mM, pH 6,0)

aquecido a 100°C e submetidas ao tratamento no micro-ondas, na potência 7, por

5min, duas vezes, com intervalo de 5min. Após o resfriamento da solução, as

lâminas foram retiradas e incubadas em uma solução de PBS contendo 3% H2O2 por

5min para o bloqueio da peroxidase endógena. Posteriormente, foi realizado o

bloqueio das reações inespecíficas através da adição aos cortes de uma solução de

bloqueio contendo 2% de leite em pó diluído em PBS, por 10min. Os AcMs anti-VBI

produzidos neste estudo e o AcM anti-VBI específico para a proteína N de VBI

(controle positivo) foram diluídos em PBS (1:100) e adicionados aos cortes que

foram incubados primeiramente a temperatura ambiente por 30min e após a 4°C por

18h. Como controle negativo utilizou-se PBS em substituição aos AcMs. A seguir, as

lâminas foram imersas em PBS por 5min. Posteriormente, adicionou-se o anticorpo

biotinilado de cabra anti-Ig de camundongo e as lâminas foram incubadas a 37°C em

câmara úmida por 30min. Após, adicionou-se o anticorpo conjugado com

estreptavidina + peroxidase e as lâminas foram incubadas por mais 30min nas

mesmas condições. Após nova etapa de lavagem, a revelação foi realizada com

solução de substrato contendo aminoetil-carbazole (AEC). As lâminas foram

cobertas com a solução cromógena de AEC e incubadas em câmara úmida, a

temperatura ambiente por 5min. A seguir, a lavagem foi realizada em água destilada

corrente por 5min. Os cortes foram contra-corados com hematoxilina de Mayer por

2min. Após a contra-coloração, os cortes foram submersos em uma cuba com água

destilada por 5min. As lamínulas foram fixadas nas lâminas com uma gota de

solução glicerol-gelatina a 42°C e posteriormente foram analisadas por microscopia.

35

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a produção dos AcMs, inicialmente três camundongos foram imunizados

com o VBI clássico (M41) local e três com o VBI variante (cepa emergente na

região). Antes da imunização dos animais, para avaliar a qualidade e determinar a

pureza das proteínas virais, amostras dos VBIs e do fluido alantóico foram avaliadas

através de SDS PAGE e Western blot com soro de aves positivas para BI (Fig. 1 e 2,

respectivamente). Foi observada nas amostras de VBI, através de ambas as

técnicas, a presença de uma banda de aproximadamente 50 kDa, correspondente a

proteína N, e de bandas sugestivas das proteínas S1 e S2 (92 kDa e 84 kDa,

respectivamente). Observou-se também, através de SDS PAGE (Fig. 1), diversas

bandas em comum entre as amostras virais e a amostra de fluido alantóico. Como

estas bandas não correspondem ao peso molecular das proteínas do VBI e estão

presentes também na amostra de fluido alantóico, sugere-se que elas sejam

proteínas do fluido alantóico que não foram eliminadas durante a purificação do VBI.

Embora as amostras virais não tenham apresentado o grau de pureza ideal,

estas foram utilizadas para a imunização dos animais, pois os hibridomas secretores

de anticorpos específicos para o VBI foram selecionados posteriormente, utilizando

as amostras de VBI e de fluido alantóico como antígenos.

Figura 1. SDS PAGE 10 % para avaliar a qualidade e pureza das amostras virais utilizadas

na imunização dos camundongos para produção de AcMs anti-VBI 1. VBI clássico (M41) local; 2.VBI variante; 3. Amostra de fluido alantóico.

36

Figura 2. Western blot para avaliar a qualidade e pureza das amostras virais utilizadas na imunização dos camundongos para produção de AcMs anti-VBI utilizando soro de aves positivas para BI. 1. VBI clássico (M41) local; 2. VBI variante; 3. Amostra de fluido alantóico; 4. Marcador de massa molecular (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder).

Paralelamente ao processo de imunização dos animais, padronizou-se um

ELISA indireto para estabelecer a diluição ideal do antígeno e do soro a serem

utilizados como controle positivo, para verificar o processo de soroconversão dos

animais imunizados e para a triagem dos hibridomas e posterior caracterização dos

AcMs. Inicialmente, determinou-se a concentração ideal do antígeno a ser utilizada

no ELISA. O ensaio foi realizado utilizando-se como antígeno diferentes

concentrações (500, 250, 125 e 62,5ng/cavidade) das duas amostras do VBI

(clássico local e variante) utilizadas na imunização dos animais, e como anticorpo, o

soro de um animal imunizado com o VBI clássico local e de outro imunizado com o

VBI variante (diluídos 1:100). Como controle negativo, as cavidades das placas

foram sensibilizadas com as mesmas concentrações da amostra de fluido alantóico.

E como controle positivo, a ascite policlonal anti-VBI produzida com a amostra

vacinal para BI foi utilizada.

Foi observado, através do ELISA indireto, que as absorbâncias das reações

decresceram proporcionalmente à redução das concentrações dos antígenos (Fig.

3). E, como esperado, ocorreram reações entre os soros e a amostra de fluido

alantóico, pois, apesar das amostras virais produzidas experimentalmente em ovos

não embrionados terem sido purificadas, a fim de eliminar as proteínas presentes no

fluido alantóico, uma quantidade relevante destas proteínas ainda permaneceu na

amostra (Fig. 1), as quais foram, inevitavelmente, inoculadas junto com o VBI.

Proteína S

Proteína N

37

Devido a isso, os animais desenvolveram uma resposta imune contra proteínas

presentes na amostra de fluido alantóico, ou seja, produziram anticorpos contra o

VBI e essas proteínas. Assim, na triagem dos sobrenadantes dos cultivos dos

hibridomas, para avaliar se os hibridomas estavam produzindo anticorpos contra o

antígeno viral e se os anticorpos produzidos reconheceriam a proteína na sua forma

nativa, as placas foram sensibilizadas também o fluido alantóico.

Independente da concentração do antígeno utilizada na sensibilização, a

diferença entre as absorbâncias das reações dos soros com os VBIs e com as

amostras de fluido alantóico (controle negativo) se manteve.

Figura 3. Determinação da concentração ideal de antígeno para o ELISA indireto, utilizando 500, 250, 125 e 62,5 ng/cavidade dos VBI clássico local ou variante e os soros coletados de um animal imunizado com o VBI clássico local e de outro imunizado com o VBI variante, diluídos 1:100. As mesmas concentrações de amostras de fluido alantóico foram utilizadas como controle negativo. Como controle positivo, foi utilizada a ascite anti-VBI. A. Reações entre diferentes concentrações dos antígenos e o soro de um animal imunizado com o VBI clássico. B. Reações entre diferentes concentrações dos antígenos e o soro de um animal imunizado com o VBI variante. O ponto mais elevado de cada barra representa a densidade óptica (D.O., 450 nm) média de triplicatas.

38

Pode-se observar também que as absorbâncias das reações utilizando ambos

os soros foram muito semelhantes, sendo as melhores reações obtidas utilizando o

VBI variante como antígeno, nas concentrações de 500 e 250ng/cavidade, tanto

quando este reagiu com o soro do animal imunizado com o VBI clássico (Fig. 3A),

quanto com o do imunizado com o VBI variante (Fig. 3B). Além disso, a diferença

entre as absorbâncias destas reações e das reações dos soros com as amostras de

fluido alantóico foi maior. Sendo assim, a concentração ideal do antígeno viral a ser

utilizada no ELISA indireto é de 250ng/cavidade e o antígeno que apresentou as

melhores reações foi o variante. O ELISA com os soros dos outros animais de cada

grupo e com o controle positivo apresentaram resultados muito semelhantes (dados

não demonstrados).

Para determinar a diluição ideal do soro a ser utilizada como controle positivo

no ELISA, para a triagem dos hibridomas e posterior caracterização dos AcMs, e

para avaliar a soroconversão dos animais imunizados, ao final do processo de

imunização, utilizou-se como antígeno 250ng dos VBI clássico local ou variante, e

como anticorpo, o soro de um animal imunizado com a VBI clássica e de outro

imunizado com o VBI variante (diluídos em base dois de 1:100 até 1:204800 em

PBS-T). Como controle negativo, cavidades das placas foram sensibilizadas com a

mesma concentração da amostra de fluido alantóico e como controle positivo, foi

utilizado como anticorpo primário a ascite policlonal anti-VBI.

Na Fig. 4 são demonstrados os resultados do ELISA indireto para a

determinação da diluição ideal do soro. Pode-se observar que as absorbâncias das

reações decresceram proporcionalmente ao aumento da diluição dos soros e,

novamente, as melhores reações foram obtidas utilizando o VBI variante como

antígeno, tanto quando este reagiu com o soro do animal imunizado com o VBI

clássico (Fig. 4A), quanto com o do imunizado com o VBI variante (Fig. 4B).

39

Figura 4. Determinação da diluição ideal dos soros dos animais imunizados (diluídos em base dois de 1:100 até 1:204800 em PBS-T) para ser utilizada como controle positivo no ELISA indireto, utilizando 250 ng dos VBI clássico local ou variante como antígeno, por cavidade. A mesma concentração de amostra de fluido alantóico foi utilizada como controle negativo. Como controle positivo, foi utilizada a ascite anti-VBI. A. Reações entre os antígenos e diferentes diluições do soro de um animal imunizado com o VBI clássico; B. Reações entre os antígenos e diferentes diluições do soro de um animal imunizado com o VBI variante. Cada ponto representa a D.O (450 nm) média de triplicatas.

As absorbâncias das reações dos soros com a amostra do fluido alantóico

foram, muitas vezes, maiores do que as obtidas entre os soros e a amostra viral

clássica. Entretanto, embora os camundongos tenham produzido anticorpos contra

as proteínas presentes na amostra de fluido alantóico, quando ambos os soros

avaliados foram diluídos 12800 e 25600 vezes, a diferença entre as absorbâncias

das reações dos soros com o VBI variante e das reações dos soros com as

amostras de fluido alantóico foi maior. Sendo assim, a diluição ideal do soro a ser

utilizada no ELISA indireto é de 1:12800. As absorbâncias das reações obtidas com

a ascite policlonal anti-VBI produzida com a vacina comercial, utilizada como

controle positivo, foram um pouco superiores com o VBI clássico (M41), o que pode

ser explicado pelo fato da vacina ser constituída por esta cepa. O ELISA com os

soros dos outros animais de cada grupo apresentaram resultados muito

semelhantes (dados não demonstrados).

Como os soros dos animais imunizados com o VBI variante apresentaram as

melhores reações, utilizando tanto o VBI variante como antígeno, quanto o VBI

clássico local, e as absorbâncias das reações dos soros destes animais com os dois

VBI foram superiores as das reações dos mesmos soros com as amostras de fluido

40

alantóico, optou-se por produzir AcMs utilizando animais imunizados com o VBI

variante. Outro fator que contribuiu para a escolha deste vírus como antígeno para a

produção dos AcMs foi o aumento da incidência de cepas do VBI diferentes da

clássica (M41), incluindo os genótipos brasileiros, diferentes dos descritos em outros

países (ABREU et al., 2006; CHACÓN et al., 2007; D'ARCE et al., 2008; DI FABIO et

al., 2000; MONTASSIER et al., 2006; VILLARREAL et al., 2006-2007b). Neste

contexto, é necessário um método de diagnóstico sensível às novas variantes, o que

poderia não ser proporcionado se os AcMs fossem produzidos a partir do

camundongo imunizado com o VBI clássico, pois pequenas diferenças no genoma

do VBI poderiam impedir que os AcMs reconhecessem as variantes.

Após as etapas de fusão celular entre os linfócitos B do camundongo

imunizado com o VBI variante e células de mieloma (SP2) e de cultivo, triagem e

clonagem dos hibridomas, foram obtidos dois hibridomas secretores de AcMs anti-

VBI, denominados 2G4 e 5 A11. Os AcMs foram classificados em isotipos e

caracterizados frente a capacidade de reconhecer o VBI clássico local e variante e

quanto a especificidade frente a outros vírus aviários.

O isotipo dos AcMs foi determinado através da utilização de um kit de

isotipagem. Neste teste, os AcMs demonstraram absorbâncias maiores frente ao

isotipo IgM, porém também apresentaram reações frente aos demais isotipos.

Assim, para confirmar o isotipo dos AcMs obtidos foi realizado um SDS PAGE 12%,

utilizando outros dois AcMs (anti-Listeria), um do isotipo IgG (2D12) e outro do

isotipo IgM (3F8) como controles. Como observado na Fig. 5 os AcMs 2G4 e 5 A11,

assim como o AcM 3F8 (controle, IgM) apresentaram uma banda de

aproximadamente 75 kDa, correspondente a cadeia pesada, e outra de 25 kDa,

correspondente a cadeia leve, características do isotipo IgM quando reduzido,

enquanto que o AcM 2D12 (controle, IgG) apresentou uma banda de 50 kDa e outra

de 25 kDa, correspondentes as cadeias pesadas e leves, respectivamente,

características de um anticorpo IgG.

As imunoglobulinas IgM, IgD e IgE são mais fortemente glicosiladas, sendo

que os carboidratos presentes nestes isotipos correspondem a 12-14% do seu peso.

Várias são as funções desta glicosilação: ligação a lectinas do soro, como a lectina

ligadora de manose (mannose binding lectina, MBL); manutenção da solubilidade e

da conformação; facilitação do transporte subcelular, secreção e manutenção das

funções efetoras, garantindo a ligação da porção Fc aos seus receptores. (RAMOS,

41

2007). Este padrão de glicosilação pode variar em diferentes anticorpos e isso pode

explicar a pequena diferença entre o padrão apresentado pelo AcM do isotipo

utilizado como controle e o apresentado pelos AcMs obtidos neste estudo.

Figura 5. SDS PAGE 12% para a determinação do isotipo dos AcMs anti-VBI obtidos a partir da fusão celular entre os linfócitos B do camundongo imunizado com o VBI variante e células de mieloma. 1. AcM 2D12 (Controle, IgG); 2. AcM 3F8 (Controle, IgM); 3. AcM 2G4; 4. AcM 5 A11; 5. Marcador de massa molecular (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder). A IgM é uma imunoglobulina geralmente pentamérica, predominante no início

das respostas imunitárias. A maioria dos AcMs obtidos em estudos relacionados

pertencem aos isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b. Nestes estudos, os animais recebiam

de 3 a 4 doses e a imunização dos animais para obtenção de AcMs anti-VBI era

realizada a intervalos maiores, de no mínimo 14 dias entre cada dose (MOCKETT;

CAVANAGH; BROWN, 1984, CARDOZO et al., 2001; SOUZA et al., 2001;

IGNJATOVIC; MCWATERS.,1991; KARACA; NAQI, 1992; CHEN; WANG; CHENG,

2011). Já o protocolo de imunização utilizado para a produção dos AcMs obtidos no

presente estudo e do AcM 3F8, também do isotipo IgM e utilizado como controle no

SDS PAGE, consistiu de 10 doses semanais.

Após a confirmação da isotipagem, a concentração dos anticorpos foi

determinada por espectrofotometria (280nm) e o cálculo foi realizado através do

coeficiente de extinção de IgM (1,18). O AcM 2G4 obteve a concentração de 0,828

mg/mL e o AcM 5 A11 de 0,454 mg/mL.

Na caracterização dos dois AcMs (2G4 e 5 A11) quanto a capacidade de

reconhecerem a proteína na sua conformação nativa, através de ELISA indireto, foi

observada uma forte reação dos AcMs com o VBI variante, apresentando

absorbâncias de 0,815 e 0,891, respectivamente. Entretanto, quando testados com o

VBI clássico, ambos AcMs tiveram um decréscimo acentuado na reação (0,441 e

42

0,337, Fig. 6), a qual foi semelhante a obtida contra o vírus da Bouba das aves, mas

2 vezes maior do que a obtida com a amostra de fluido alantóico.

Figura 6. Reatividade dos AcMs anti-VBI (2G4 e 5A11) frente a diferentes vírus (VBI variante e clássico M41 local, vírus da Bouba das aves e de Newcastle) por ELISA indireto. Amostra de fluido alantóico foi utilizada como controle negativo. Como controle positivo foi utilizado o soro do animal imunizado antes da fusão celular (1:12800) e como soros controles negativos, o soro pré-imune do camundongo utilizado na fusão e o soro produzido contra as proteínas presentes na amostra de fluido alantóico (1:200). O ponto mais elevado de cada barra representa a densidade óptica (D.O., 450 nm) média de triplicatas.

Os AcMs obtidos também não foram detectados através de um Kit ELISA

comercial para diagnóstico de BI (IDEXX Corporation, Westbrook, ME, USA),o qual

vem sensibilizado com o VBI clássico. Esses resultados sugerem que os AcMs

obtidos não reagem com o VBI clássico ou reagem muito levemente (dados não

demonstrados), o que pode ser explicado, primeiramente, pelo fato da imunidade

induzida por inoculação com um sorotipo (no caso com o VBI variante) não induzir

proteção eficaz a sorotipos heterólogos (CAVANAGH, 2003). Além disso, diferenças

mínimas na subunidade S1 podem contribuir para a diminuição da proteção cruzada

em experimentos de desafio em frangos (CAVANAGH; ELLIS; COOK, 1997). E,

como um determinado sorotipo tem pouca capacidade de induzir proteção à infecção

por outros sorotipos, as galinhas podem ser infectadas várias vezes, em um curto

período de tempo (CAVANAGH et al., 1999).

O soro coletado do camundongo ao final das imunizações, antes da fusão

celular, foi utilizado como controle positivo. Este soro apresentou absorbância

superior a obtida com os AcMs, não somente quando foi testado com o VBI variante

43

e clássico, mas também frente a amostra de fluido alantóico (Fig. 6). E todos os

anticorpos avaliados reagiram inespecificamente com a amostra de fluido alantóico,

exceto o soro pré-imune do camundongo utilizado na fusão.

Como soros controles negativos foram utilizados também o soro pré-imune do

camundongo utilizado na fusão (dia 0), o qual praticamente não apresentou reação

frente a nenhum dos antígenos testados e o soro produzido contra as proteínas

presentes na amostra de fluido alantóico. Essa amostra de soro controle negativo,

obtida através da imunização de camundongos com a amostra de fluido alantóico,

apresentou reação com todos os antígenos testados. Com exceção da reação com o

VBI variante, as absorbâncias das reações deste soro com os outros antígenos

foram semelhantes ou até mesmo superiores às obtidas com os AcMs, o que

confirma a presença de grande quantidade de proteínas de fluido alantóico nas

amostras virais. Além disso, estes resultados também podem sugerir que a amostra

de fluido alantóico foi contaminada com o VBI, justificando desta forma as reações

dos AcMs com essas proteínas.

Os resultados obtidos no Western blot (Fig. 7) corroboram com os obtidos no

ELISA indireto (Fig. 6). Observa-se que os dois AcMs reconheceram fortemente o

VBI variante, sugerindo novamente que tenham maior especificidade para esta cepa.

Ambos também reconheceram, embora com menos intensidade, o VBI clássico.

44

Figura 7. Perfil eletroforético e reatividade dos AcMs anti-VBI (2G4 e 5A11) frente a diferentes vírus (VBI variante e clássico M41 local, vírus da Bouba das aves e de Newcastle) por Western blot. A) SDS PAGE 12 % corado com Comassie Blue das diferentes amostras virais; B) Western blot das diferentes amostras virais com o AcM 2G4; C) Western blot das diferentes amostras virais com o AcM 5 A11. 1. Amostra de fluido alantóico (controle negativo); 2. VBI clássico M41 local; 3. VBI variante, 4. Vírus de Newcastle, 5. Vírus da Bouba das Aves; 6. Marcador de massa molecular (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder).

Na figura 7B observa-se a reação do AcM 2G4 com uma proteína de

aproximadamente 90 a 84 kDa, peso molecular correspondente as subunidades da

proteína S (S1 e S2). Como seus pesos moleculares são muito semelhantes, não foi

possível determinar, através desta técnica, a subunidade que é reconhecida pelo

AcM.

AcMs gerados contra a subunidade S1 são, geralmente, sorotipo-específicos

(MOCKETT et al, 1984;. KOCH et al, 1990), embora um AcM contra um local

conservado na subunidade S1 tenha sido obtido (NIESTERS et al., 1987).Isso sugere

que os AcMs obtidos no presente estudo sejam específicos a proteína S1, pois além

de um deles (2G4) reagir com uma banda de peso molecular correspondente a esta

subunidade, eles também demonstram ser sorotipo-específicos, pois reconhecem

mais fortemente o VBI variante (Fig. 6 e 7).

AcMs específicos contra S1 podem ser ferramentas úteis para o estudo das

relações antigênicas entre amostras do VBI. No trabalho de CARDOZO et al., (2001)

foram produzidos e caracterizados um painel de 12 AcMs específicos para as

proteínas S1, S2, N e M do VBI amostra M41. Segundo os autores, o AcM anti-S1

poderá ser utilizado para a detecção de M41 e amostras relacionadas

antigenicamente. Mockett; Cavanagh e Brown (1984) caracterizaram AcMs

específicos contra S1, evidenciando serem estes amostra-específicos, ou seja, com

capacidade neutralizante específica apenas contra M41. Dessa forma AcMs anti-S1

podem expressar atividade neutralizante e inibidora da hemaglutinação

exclusivamente contra esse sorotipo, as quais são atividades biológicas

relacionadas com S1. (MOCKETT; CAVANAGH; BROWN, 1984, CARDOZO et al.,

2001). O AcM 2G4 demonstrou maior especificidade a proteína S1 do VBI variante.

Dessa forma, ensaios utilizando este AcM poderão ser desenvolvidos com a

finalidade de detecção e estudo de amostras antigenicamente relacionadas com o

VBI variante em tecidos e material experimentalmente ou naturalmente infectados,

assim como a discriminação das relações antigênicas entre as amostras de campo

45

com a amostra M41. Além disso, o AcM também tem potencial para ser utilizado

como ferramenta para monitorar as mutações que ocorrem nesta cepa.

Neste mesmo ano, no país, foram produzidos AcMs contra as proteínas N

(53kDa) e S2 (84kDa) do VBI amostra M41 (SOUZA et al., 2001). O AcM contra S2

comportou-se como uma boa ferramenta de diagnóstico do VBI e pode ser aplicado

em ensaios de rotina laboratorial independentemente do sorotipo, especialmente no

diagnóstico das doenças que se confundem com a BI nas galinhas, enquanto o AcM

contra N demonstrou reconhecer uma região menos conservada entre as estirpes de

VBI e pode ser útil em estudos comparativos entre isolados de VBI (SOUZA et al.,

2001).

O epítopo que foi reconhecido na subunidade S1 pelo AcM desenvolvido por

Ignjatovic e McWaters (1991) foi conservado em todas as estirpes isoladas do VBI

na Austrália entre 1962 e 1988. Utilizando o AcM anti-S1 em conjunto com outros

dois AcMs, um anti-N e outro anti-M, produzidos neste mesmo trabalho, foi possível

avaliar o grau de semelhança antigênica entre os isolados de VBI, a identificação de

mutações no VBI variante e a diferenciação entre as estirpes de vírus dos sorotipos

iguais ou diferentes, o que não era anteriormente possível. Estes AcMs foram

testados por um ELISA direto para diferenciar antigenicamente estirpes do VBI

(IGNJATOVIC; MCWATERS, 1991). Posteriormente, os AcMs produzidos por

Ignjatovic e McWaters (1991) foram testados em um ELISA de Captura, o qual

demonstrou ser um método sensível para a detecção e diferenciação antigênica dos

vírus utilizados nas vacinas com as estirpes de campo. O tipo antigênico do VBI

determinado no ELISA de captura corroborou com a tipificação antigênica obtida por

vírus neutralização (VN), permitindo determinar rapidamente se a estirpe do VBI

identificada é uma variante ou re-isolamento de um vírus da vacina. Este teste foi

capaz de detectar o vírus na fase aguda da infecção, porém não conseguiu detectar

a infecção com baixa dose de vírus (IGNJATOVIC; ASHTON, 1996).

AcMs específicos a determinado sorogrupo são ferramentas importantes para

determinar anticorpos específicos a determinado sorotipo no soro dos animais

infectados, possibilitando monitorar os sorotipos prevalentes nos surtos e infecções

(KARACA; NAQI, 1993; CHEN; WANG; CHENG, 2011). O ELISA de bloqueio

apresentando no trabalho de Karaca e Naqi (1993), utilizando AcMs sorotipo-

específicos desenvolvidos pelos mesmos pesquisadores no ano anterior (KARACA;

NAQI, 1992), demonstrou ter a sensibilidade do teste de ELISA indireto e

46

especificidade em relação ao sorotipo proporcionado pelo teste de VN. Os

resultados do ELISA de bloqueio e VN indicam que os anticorpos produzidos

durante a resposta primária são fortemente sorotipo-específicos, enquanto aqueles

produzidos durante a resposta secundária reagem mais fortemente com o vírus

homólogo, mas apresentam reatividade cruzada com antígenos heterólogos

(KARACA; NAQI, 1993).

Utilizando os mesmos AcMs anti-S1 sorotipo específicos citados

anteriormente (KARACA; NAQI, 1992) também foi desenvolvido um ELISA de

captura para a detecção e identificação do VBI dos sorotipos Arkansas, Connecticut

e Massachusetts. O ensaio obteve melhores resultados quando o AcM anti-S1, o

antígeno e o soro teste eram do mesmo sorotipo. O ELISA de captura descrito neste

trabalho contorna o problema de reatividade cruzada que ocorre utilizando somente

o soro das aves. Neste ensaio, o AcM sorotipo-específico parece capturar

principalmente a glicoproteína S1 da amostra infectada, mas não o vírus inteiro, ou

as proteína S2, M ou N, pois os componentes que não participam da reação são

removidos por lavagem antes da adição do soro de galinha. Este teste foi eficaz para

detectar o vírus em fluido alantóico após passagem do VBI em ovos embrionados,

porém diretamente em tecidos infectados homogeneizados não teve poder de

detecção.

O grupo de Chen; Wang e Cheng, (2011) desenvolveu um AcM contra a

proteína S1 que demonstrou especificidade para estirpes de VBI de Taiwan e

nenhuma reatividade cruzada com a estirpe vacinal H120. Desta forma, este AcM foi

utilizado em um ELISA de bloqueio para detecção do VBI em isolados locais. Os

resultados demonstraram 98,0% de sensibilidade e especificidade de 97,2%

(n=390). O teste detectou todos os sorotipos de VBI de Taiwan, mas não três

isolados de outros sorotipos, nem soros contra a gripe aviária e outros patógenos.

Este AcM tem potencial para ser utilizado em um método rápido e confiável para

diagnóstico de infecções do VBI de isolados de campo em Taiwan (CHEN; WANG;

CHENG, 2011). Da mesma forma, os AcMs 2G4 e 5 A11, por demonstrarem maior

reação com o VBI variante, podem ser utilizados para o diagnóstico de isolados

locais.

A especificidade dos AcMs em reconhecer somente o VBI foi avaliada

testando-os com dois outros vírus aviários: vírus da Bouba das Aves e vírus de

Newcastle. Os AcMs reagiram fracamente com estes vírus. A reação dos AcMs 2G4

47

e 5 A 11 obtida com o vírus da Bouba das Aves (0,567 e 0,322 respectivamente) e

com vírus de Newcastle (0,269 e 0,031 respectivamente) é muito inferior à obtida

com o VBI variante (0,815 e 0,891, respectivamente). (Fig. 6). No Western blot (Fig.

7) observa-se que os AcMs obtiveram reações fracas com o vírus de Newcastle e

Bouba das Aves, sendo que o AcM 5 A11 (Fig. 6C) demonstrou reações ainda

menos intensas.

O teste de especificidade ao VBI foi realizado com estes dois vírus, pois

ambos possuem genoma constituído de RNA, não têm relação filogenética com o

VBI, também acometem o sistema respiratório de aves e, frequentemente, após a

infecção por VBI ocorrem infecções secundárias por estes agentes, levando ao

aumento da severidade e duração da doença (HIPÖLITO; SILVA; HSIUNG, 1979,

KING; CAVANAGH, 1991, RESENDE, 2003). Diversos estudos relacionados

utilizaram somente o vírus de Newcastle como antígeno negativo para avaliar a

especificidade dos AcMs (IGNJATOVIC; WATERS, 1991; CARDOZO et al., 2001;

SOUZA et al., 2001). Os testes também foram realizados com a amostra de fluido

alantóico. As absorbâncias obtidas da reação dos AcMs frente as proteínas

presentes na amostra de fluido alantóico foram semelhantes às obtidas frente aos

vírus da Bouba das Aves e de Newcastle.

No trabalho desenvolvido por lgnjatovic e Waters (1991) nenhum dos AcMs

obtidos reagiu com o líquido alantóico não infectado ou com o vírus de Newcastle.

Neste estudo, a purificação das amostras virais utilizadas para imunização dos

animais foi realizada por centrifugação a 95.000 g durante 16 h em gradientes de

sacarose (25% a 55% de sacarose w / v em Tampão NET) diferente do processo de

purificação realizado em nosso trabalho, onde as amostras foram purificadas por

centrifugação a 140868g durante 3 horas contra um gradiente de sacarose de 30%.

No trabalho desenvolvido por Chen; Wang e Cheng (2011), o AcM obtido

apresentou reações baixas, mas não inexistentes com a amostra SPF, sendo que as

amostras virais foram submetidas a um processo de purificação semelhante ao

descrito por Ignjatovic e Waters (1991). Apesar desta pequena reação inespecífica,

o desempenho do AcM não foi comprometido e sua possível aplicação foi

confirmada com altos índices de sensibilidade e especificidade através de um ELISA

de bloqueio (CHEN; WANG; CHENG, 2011). Estes dados sugerem que, apesar dos

nossos AcMs apresentarem uma pequena reação com a amostra de fluido alantóico,

48

esta reação pode ser considerada inespecífica e não irá influenciar na aplicabilidade

dos AcMs.

As absorbâncias das reações obtidas com os dois AcMs foram, de maneira

geral, semelhantes. Entretanto, como podemos verificar na Fig. 6, o AcM 5 A11

demonstrou absorbâncias mais elevadas quando testado com o VBI variante e mais

baixas quando testado com as demais amostras, sugerindo ser mais específico do

que o AcM 2G4. Os resultados obtidos no Western blot (Fig. 7) também sugerem a

maior especificidade do AcM 5 A11.

Comparando os resultados obtidos nesta caracterização inicial dos AcMs 2G4

e 5 A11 com os resultados e aplicações dos AcMs produzidos e caracterizados em

trabalhos semelhantes, acredita-se no potencial dos nossos AcMs para uso como

ferramenta em testes de imunodiagnóstico para o VBI.

No presente trabalho, a aplicação dos AcMs foi avaliada através de IQH. A

técnica de IQH detecta moléculas (antígenos) teciduais, baseando-se no

reconhecimento do antígeno por um anticorpo (Ac primário) associado a diversos

tipos de processos de visualização. Esta técnica traz diversos benefícios para o

diagnóstico rápido pois não requer processo de isolamento viral e o antígeno pode

ser detectado diretamente dos tecidos de aves infectadas.

Os AcMs foram testados em tecidos da traquéia, pulmão, rins e fígado de

aves inoculadas experimentalmente via ocular. Ambos os AcMs marcaram

principalmente células inflamatórias (Fig. 8), havendo pouca marcação de células

epiteliais. O VBI é um vírus primariamente epiteliotrópico, replicando-se nas células

epiteliais, nas células secretoras de muco e nas células dos pulmões e dos sacos

aéreos (MENDONÇA et al., 2009). Sendo assim, as marcações características do

VBI ocorrem preferencialmente nestas células. Entretanto, a visualização das células

epiteliais marcadas em nosso teste foi dificultada devido ao background concentrado

principalmente nesta região.

49

Figura 8. Imuno-histoquímica utilizando os AcMs 2G4 e 5 A11 (diluídos 1:50) em tecidos de aves infectadas experimentalmente via ocular com o VBI clássico (M41) local e coletados 4 dias após a infecção. A) Tecido de pulmão marcado com o AcM 2G4. Objetiva de 1000 vezes; B) Tecido de traquéia marcado com o AcM 5 A11; Objetiva de 40 vezes. C) Tecido de pulmão marcado com o AcM 5 A11. Objetiva de 40X; D) Tecido de pulmão marcado com o anticorpo comercial (AcM anti-VBI específico para a proteína N, controle positivo). Objetiva de 40 vezes; E) Tecido de pulmão no teste com PBS (controle negativo). Objetiva de 20 vezes

Um AcM anti-VBI específico para a proteína N, já testado no trabalho de

Mahdavi et al. (2007), foi utilizado em nossos testes como controle positivo. No

trabalho desenvolvido por Mahdaviet et al.(2007), o antígeno viral foi detectado no

50

citoplasma de células epiteliais do pulmão e em células das glândulas mucosas

alveolares. Na traquéia, o antígeno foi localizado na camada epitelial descamada.

Neste mesmo estudo, o VBI também foi detectado em células epiteliais dos túbulos

renais e da cápsula de Bowman. Contudo, em nosso estudo as marcações obtidas

por este AcM foram predominantes em células inflamatórias. O padrão de marcação

apresentado pelo AcM anti-N foi similar ao dos AcMs 2G4 e 5 A11 (Fig. 8).

No estudo de Moneim et al. (2009), além das marcações características do

epitélio, o VBI também foi detectado em macrófagos no baço e em Células de

Kupffer no fígado. Da mesma forma, no estudo de Benyeda et al. (2010), além das

marcações no epitélio das células da mucosa traqueal, o VBI também foi detectado

em células inflamatórias. O estudo relata que em casos mais severos da infecção

por VBI o antígeno pode ser localizado também em células inflamatórias (MONEIM

et al., 2009; BENYEDA et al.,2010).

O estudo de Bezuidenhout, Modal e Buckles (2011), utilizando os AcMs

produzidos por Karaca; Naqi e Gelb (1992), comparou a evolução precoce de lesões

do saco aéreo em aves que foram inoculadas com uma estirpe do vírus vacinal ou

uma estirpe de campo mais virulenta. Através deste estudo observou-se que durante

a infecção inicial, as primeiras células a responder são macrófagos e linfócitos, com

neutrófilos prevalentes após significativo dano epitelial. O envolvimento inicial do

epitélio respiratório pode ser justificado porque células inflamatórias concentraram-

se neste tecido no início da infecção (BEZUIDENHOUT; MODAL; BUCKLES, 2011),

o que pode justificar a marcação de células inflamatórias.

Este ensaio foi realizado com tecido de aves SPF adultas imunizadas

experimentalmente com VBI clássico M41 local. Nos testes de ELISA indireto (Fig. 6)

e Western blot (Fig. 7) os AcMs reagiram com mais intensidade com o VBI variante,

demonstrando maior especificidade a esta cepa. Dessa forma, acredita-se que o

desempenho dos AcMs poderá ser melhor em testes utilizando tecidos de aves

imunizadas com o VBI variante.

Para verificar se as marcações não estavam ocorrendo devido a ligações

inespecíficas entre os próprios reagentes utilizados na técnica, o teste foi realizado

substituindo os AcMs por PBS (Fig. 8E). Neste ensaio não houve nenhuma reação,

demonstrando que não há marcação devido a ligações inespecíficas entre os outros

reagentes.

51

Além da aplicação na técnica de imuno-histoquimica, os AcMs apresentam

potencial para uso como ferramenta de diagnóstico em outros testes baseados na

reação antígeno-anticorpo. A aplicabilidade dos AcMs será avaliada também através

de técnicas já estabelecidas por outros grupos, como ELISA de Captura

(IGNJATOVIC; MCWATERS 1991; NAQI et al., 1993) e ELISA de Bloqueio

(KARACA; NAQI, 1993; CHEN; WANG; CHENG, 2011).

52

5 CONCLUSÕES

- Foram obtidos dois hibridomas estáveis secretores de anticorpos do isotipo

IgM contra o VBI;

-Os AcMs reconheceram o VBI clássico M41 local e variante, sendo as

reações com o VBI variante mais intensas;

-Os resultados sugerem que o AcM 2G4 seja específico para a proteína S1;

-No teste de IHQ os AcMs anti-VBI apresentaram o mesmo padrão de

marcação que o AcM utilizado como controle positivo, ou seja, marcaram o antígeno

principalmente em células inflamatórias;

-Os AcMs obtidos apresentam potencial para uso no imunodiagnóstico para

BI.

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