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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DE PORTO ALEGRE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEPATOLOGIA: MEDICINA
A N-ACETILCISTEÍNA (NAC) POTENCIALIZA A AÇÃO DO INTERFERON EM
CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR
NÉLSON ALEXANDRE KRETZMANN FILHO
Porto Alegre
2010
A N-ACETILCISTEÍNA (NAC) POTENCIALIZA A AÇÃO DO INTERFERON EM
CÉLULAS DE CARCINOMA HEPATOCELULAR
NÉLSON ALEXANDRE KRETZMANN FILHO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Hepatologia da
Universidade Federal de Ciências da
Saúde de Porto Alegre como requisito
para a obtenção do Grau de Doutor.
Orientador
Dr. Claudio Augusto Marroni
Coorientadora
Drª Norma Anair Possa Marroni
Porto Alegre
2010
III
“Quando verificares com tristeza que nada
sabes, terás feito teu primeiro progresso no
aprendizado”.
Jigoro Kano (1860-1938 d.C.)
Nada é impossível para aquele que persiste.
Alexandre (356-323 a.C.)
IV
DEDICATÓRIA
À professora Dra Norma Anair Possa Marroni e ao
professor Dr Claudio Augusto Marroni, minha
gratidão por terem confiado no meu trabalho e no
meu profissionalismo, abrindo um novo horizonte,
com dificuldades e criticas, mas sempre afirmando
“tem que dar certo”. Pela orientação e também pelo
carinho, meu reconhecimento e agradecimento.
V
Aos meus pais, tudo que sou devo à educação que
me foi dada por quem foi e é de suma importância
na minha formação. Com vocês, aprendi a lutar pelo
que é certo e justo. O maior desejo dos Homens é o
de encontrar na vida alguém que os faça fazer o
melhor que puderem... Não me foi necessário
procurar, encontrei-o em vocês.
VI
À minha irmã, pessoa ímpar, dotada de sentimento e
companheirismo, obrigado pela tua força e luta que
me servem como exemplo.
VII
Agradecimentos
Aos meus orientadores, professor Dr Claudio Augusto Marroni e à professora
Dra Norma Anair Possa Marroni, meu agradecimento pela perseverança neste
trabalho.
À minha mãe, sempre zelosa pelos seus, minha força nesta e em outras
caminhadas.
Aos meus avós, por acreditarem que as dificuldades da vida devem ser
superadas com muito trabalho, é assim que o verdadeiro valor aparece.
À minha tia Rita Maria e aos meus primos, agradeço o companheirismo e
carinho de sempre.
Ao professor José Luiz Mauriz, agradecimentos pelo apoio científico e
tecnológico.
À professora Úrsula da Silveira Matte, obrigado pela paciência em relação às
minhas idéias e experimentos, pela acolhida em seu laboratório e pelo carinho
nos momentos de desabafo.
Ao Dr Henrique Fillmann, um grande amigo sempre disposto a ouvir minhas
idéias, obrigado pela ajuda no meu crescimento profissional e pessoal.
Ao amigo e colaborador Eduardo Chiela, meu reconhecimento pelo apoio e
ajuda nos experimentos, sem esquecer as correções sempre muito bem
colocadas.
Ao professor Guido Lenz, agradeço a disposição na utilização do laboratório e o
apoio técnico-científico nos experimentos.
Aos colegas do Centro de Terapia Gênica, em especial, à Carolina Uribe e ao
Guilherme Baldo, que estiveram ao meu lado em boa parte dessa caminhada,
meu carinho
VIII
Aos colegas do Laboratório de Hepatologia Experimental e Fisiologia e do
Laboratório de Estresse Oxidativo pela cooperação e sugestões
Aos colegas do laboratório de Vias Aéreas e Pulmão, Luiz Alberto Forgiarini e
Luiz Felipe Forgiarini, agradeço a atenção e dedicação.
Ao Tio Sílvio e a todos os amigos da Escola de Equitação do Cristal, obrigado
pelas oportunidades de convivência, pois sem vocês nada seria igual.
À Laura, uma pequena grande mulher, meu reconhecimento, admiração e afeto
IX
SUMARIO
Resumo......................................................................................................................................... 1
Abstract......................................................................................................................................... 2
1 Introdução ................................................................................................................................. 3
2 Referencial Teórico .................................................................................................................. 6
2.1 Epidemiologia e história natural do carcinoma hepatocelular ............................................. 7
2.2 Incidência e Mortalidade ..................................................................................................... 8
2.3 Fatores Demográficos ......................................................................................................... 9
2.3.1 Idade .............................................................................................................................. 9
2.3.2 Gênero ........................................................................................................................... 10
2.3.3 Etnia ............................................................................................................................... 10
2.4 Fatores de Risco ................................................................................................................. 11
2.4.1 Vírus de Hepatite B ........................................................................................................ 11
2.4.1.1 O Vírus da Hepatite B e o CHC ................................................................................ 13
2.4.2 Vírus da Hepatite C ........................................................................................................ 15
2.4.2.1 O Vírus da Hepatite C e o CHC................................................................................. 18
2.4.3 Aflatoxina ....................................................................................................................... 20
2.4.4 Álcool.............................................................................................................................. 21
2.5 Cirrose................................................................................................................................. 22
2.6 Fator de Transcrição Nuclear kappa B (NF-kB)................................................................... 23
2.6.1 NF-kB e Câncer.............................................................................................................. 24
2.7 Interferon.............................................................................................................................. 27
2.7.1 Interferon e Câncer......................................................................................................... 29
2.7.2 Interferon e CHC............................................................................................................. 30
2.8 N-Acetilcisteína.................................................................................................................... 31
2.8.1 N-Acetilcisteína e Câncer............................................................................................... 33
2.9 Apoptose e Morte Celular.................................................................................................... 34
3 Justificativa .............................................................................................................................. 35
4 Objetivos ................................................................................................................................... 37
4.1 Objetivo Geral:..................................................................................................................... 38
4.2 Objetivos Específicos:.......................................................................................................... 38
5 Materiais e Métodos.................................................................................................................. 39
5.1 Cultivo Celular e tratamento................................................................................................ 40
5.2 Viabilidade Celular............................................................................................................... 41
5.3 Citometria de Fluxo e Apoptose........................................................................................... 42
X
5.4 Expressão Proteica.............................................................................................................. 43
5.5 Transfecção com siRNA e silenciamento da Expressão da subunidade p65 do NF-kB 44
5.6 Expressão do mRNA da subunidade p65 do NF-kB............................................................ 44
5.7 Análise Estatística................................................................................................................ 46
6. Resultados................................................................................................................................ 47
6.1 Avaliação da Viabilidade Celular......................................................................................... 48
6.2 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF no ciclo celular a na Apoptose.............................. 50
6.3 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF na Expressão da subunidade p65........................ 55
6.4 Envolvimento do NF-kB na resposta da NAC em células de CHC..................................... 56
7 Discussão.................................................................................................................................. 59
8 Conclusões................................................................................................................................ 70
9 Perspectivas Futuras................................................................................................................ 72
10 Referências Bibliográficas:.................................................................................................... 74
XI
Lista de Figuras
Figura 1. Incidência global de câncer hepático em homens ...................................................................... 9
Figura 2. A distribuição geográfica da infecção crônica pelo VHB............................................................. 12
Figura 3. Distribuição global de infecção crônica de VHC.......................................................................... 18
Figura 4. Rota de ativação do NF-B......................................................................................................... 23
Figura 5: Envolvimento do NF-B na biologia tumoral............................................................................... 26
Figura 6: Inibição do NF-kB e apoptose..................................................................................................... 27
Figura 7: Estrutura Molecular do Interferon alfa Humano.......................................................................... 28
Figura 8: Estrutura Molecular da NAC........................................................................................................ 32
Figura 9: NAC potencializa o efeito do interferon, diminuindo a viabilidade celular em ambas as
linhagens estudadas....................................................................................................................................
49
Figura 10: Avaliação da distribuição do ciclo celular através da citometria de fluxo............................... 50
Figura 11: Histograma da distribuição do Ciclo Celular.............................................................................. 51
Figura 12A: Análise de morte celular com Anexina V e com PI-HepG2.................................................... 53
Figura 12B: Análise de morte celular HepG2............................................................................................. 53
Figura 12C: Análise de morte celular com Anexina V e com PI-Huh7....................................................... 54
Figura 12D: Análise de morte celular Huh7................................................................................................ 54
Figura 12E: Análise de morte celular HepG2 24 horas.............................................................................. 55
Figura 13: Avaliação da expressão do p65 por Western Blot................................................................... 56
Figura 14A: Eficiência de transfecção com siRNA..................................................................................... 57
Figura 14B: Silenciamento da subunidade p65 do NF-kB.......................................................................... 57
Figura 15: Efeito do INF e da NAC na viabilidade das células com silenciamento da subunidade
p65...............................................................................................................................................................
58
XII
Lista de Tabelas
Tabela 1.Fatores de risco relacionados ao desenvolvimento do CHC...................................................... 11
Tabela 2 Efeito do INF, da NAC e da NAC+INF sobre a viabilidade celular das duas
linhagens estudadas em diferentes tempos...............................................................................
48
Tabela 3. Distribuição do Ciclo Celular HepG2 48 horas............................................................................ 51
Tabela 4. Distribuição do Ciclo Celular Huh7 48 horas.............................................................................. 51
Tabela 5.:Análise da Anexina V por citometria de fluxo.............................................................................. 52
XIII
ABREVIATURAS
A Adenina
AAT Alfa1 antitripsina
ADH2: Álcool desidrogenase
ALDH2: Desidrogenase aldeído
AFB1: Aflatoxina B1
AFP: Alfa- fetoproteína
AgHBs: Antígeno de superfície do VHB
AgHBe:
AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida
ADH2 Álcool desidrogenase
ALDH2 Desidrogenase aldeído
AFB1
Aflatoxina B1
33333333333 AFP
Alfa-fetoproteína
AgHBe Antígeno e do VHB
AgHBs Antígeno de superfície do VHB
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida
Anti-HBC
Anticorpo anti o CORE do VHB
Anti-VHC Anticorpo antivírus da hepatite C
AP1 Proteína ativadora 1
ATCC
American type cell collection
BCL B-Cell Lymphoma
Bcl-3 B-Cell Lymphoma 3
cDNA
DNA complementar
5-FU 5-Fluoracil
CO2 Dióxido de carbono
CHC Carcinoma hepatocelular
C282Y Citocromo p450 282Y
CYP2E1 Citocromo p450 2E1
CYP17 Citocromo p450 17 alfa
DD Domínio da morte
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DTT Detiotritol
ECL Enhancer Chemiluminescent Luminol
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EHNA Esteato Hepatite Não Alcoólica
EPHX Epóxido hidrolase
EPHX1 Epóxido hidrolase 1
EPHX2 Epóxido hidrolase2
ERO Espécies reativas de oxigênio
FGFs Fatores de crescimento de fibroblastos
G Guanina
GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
GSH Glutationa Reduzida
GST Glutationa-S-transferase
GST loci
Glutationa-S-transferase lócus
GSTM1 Glutationa-S-transferaseM1
GSTTI Glutationa-S-transferaseTI GSTPI Glutationa-S-transferase PI
GSTA4 Glutationa-S-transferase A4
HAART Terapia antiviral altamente ativa
HBX Proteína X
XIV
H2O Água
HFE Gene da Hemocromatose de Mamíferos
HH Hemocromatose hereditária
FIH Fator induzível de Hipóxia
HIF-1α Fator induzível de Hipóxia 1 alfa
HIV Vírus da imunodeficiência humana
hTERT Transcriptase reversa da telomerase humana
IARC Agência Internacional para Pesquisa sobre o
Câncer
INF Interferon
Interferon
INF-α
Interferon alfa
Bet INF-β
Interferon beta
INF-γ Interferon gamma
INF-ω
Interferon ômega
IGF-II insulin –like grown factor II
IkB
Inibidor Kappa B
IB Inibidor Kappa B alfa
IB Inibidor Kappa B beta
IB, Inibidor Kappa B gama
IB, Inibidor kappa B Epson
IKK Inibidor kappa quinase
IKK Inibidor kappa quinase alfa
IKK Inibidor kappa quinase beta
IKK Inibidor kappa quinase gama
IL-10 Interleucina 10
IL-12 Interleucina 12
Kb
Kappa B
KCL Cloreto de potássio
KH2PO4,
Dihidrogenofosfato de potássico
KD Knockdown
KDa Quilodaltons
MAPK Mitógenos ativados por kinases
MHC Complexo maior de histocompatibilidade
mRNA RNA mensageiro
MTT Metiltetrazolium
NAC N-acetilcisteína
NaCl Cloreto de sódio
Na2HPO4 Fosfato de sódio
NAT1 N-acetiltransferase 1
NAT2 N-acetiltransferase 2
NEMO Complexo de ligação NEMO
NF-B Fator de transcrição nuclear Kappa B
OMS Organização Mundial da Saúde
PAMP Padrão molecular associado ao patógeno
XV
PB Pares de base
PBS Tampão fosfato-salino
PCR Reação em cadeia polimerase
PCT Porfiria cutânea tardia
PDGF Fatores de crescimento derivado de plaquetas
PVDF Polifluoruro de Vinilideno
Pi Inibidor de protease
PI Iodeto de Propídeo
PIA Porfiria aguda intermitente
OS Fosfatidilserina
RA Receptor androgênico
RNA Ácido ribonucléico
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
Se Selênio
siRNA Small Interfere RNA
SH Grupo Tiol
SRD5A2 5- alfa-redutase
T Timina
TECs Células endoteliais tumorais
TNF Fator de necrose tumoral alfa
TNFR
Receptor do fator de necrose tumoral
TNFR1
Receptor do fator de necrose tumoral tipo 1
TOF Transplante ortotópico de fígado
VEGF Fator de crescimento epitelial vascular
VHB Vírus da hepatite B
VHC Vírus da hepatite C
1
__________RESUMO__________
O Carcinoma Hepatocelular (CHC), malignidade primária mais comum do
fígado, é complicação de doença hepática crônica avançada e representa o quinto
tumor mais frequente no mundo, com mais de 550.000 novos casos por ano, sendo
quatro vezes mais comum em homens do que em mulheres. Uma importante via de
sinalização, alterada em tumores humanos, é o módulo de sinalização IKK/NF-κB. O
NF-kB pode afetar todos os seis “hallmarks” do câncer ligados à ativação da
transcrição de genes associados com a proliferação celular, a angiogênese, as
metástases, a promoção de tumor, a inflamação e a supressão da apoptose. Devido
às suas propriedades de regulação da diferenciação e do crescimento celular, os
interferons (INFs) têm sido usados na tentativa de tratar neoplasias. Ressecção
cirúrgica, ablação por radiofrequência e o transplante de fígado são as opções no
tratamento de pacientes com CHC. A administração da N-Acetilcistenína (NAC) pode
ter papel de prevenção do câncer e uma abordagem integrada no tratamento de
algumas formas de câncer, contudo, a informação nessa área ainda é preliminar.
Este trabalho tem como objetivo avaliar a resposta da NAC como
potencializador do efeito antitumoral do INF em linhagens de carcinoma hepatocelular
humano e verificar o envolvimento da rota do NF-kB na via de ação da NAC. Células
de hepatocarcinoma humano HepG2 e Huh7 foram utilizadas para avaliar a resposta
da NAC (10mM), do INF(2,5 x104U/mL) e do cotratamento NAC+INF em diversos
tempos. Foi avaliada a viabilidade celular (MTT), a apoptose (Anexina V), o
envolvimento do NF-kB (siRNA p65) e a expressão da subunidade p65(western Blot)
A NAC diminuiu a viabilidade celular em 24horas em Huh7 e, em 48 horas, em
HepG2. Ao final do trabalho, demonstramos que a NAC potencializa o efeito citotóxico
do INF em cotratamento, reduzindo a viabilidade celular em ambas as linhagens
celulares (24, 48, 72, 96 horas). Ao avaliar a distribuição do ciclo celular, não
observamos alterações em ambas as linhagens celulares e tratamentos. O INF induziu
a marcação com anexina de ambas as linhagens celulares em 48 e 72 horas de
tratamento, mas em níveis mais elevados nas células Huh7. NAC induziu a marcação
com anexina em 48 horas nas células Huh7, mas não nas células HepG2, nas quais o
resultado foi antecipado para 24 horas. Demonstramos que a NAC diminui a
expressão da subunidade p65 após 72 horas de tratamento. Também demonstramos
que o cotratamento com NAC mais INF diminui a expressão da subunidade p65
significantemente em cerca de 50% em ambas as linhagens, sugerindo que o NF-kB
pode ser um modulador central da resposta das células de CHC no tratamento com
NAC + INF. Quando utilizamos o siRNA p65, observamos redução significativa em
relação ao controle siRNA. Com isso se demonstra que, quando tratamos as células
com siRNA específico para a subunidade p65 ou com a NAC, o resultado de inibição é
igual ao do siRNA com a NAC, demonstrando, assim, a especificidade de ação NAC
pela via do NF-B.
A NAC mostrou efeito potencializador na resposta antitumorall do INF,
diminuindo a viabilidade celular, aumentando a apoptose e diminuindo a expressão da
subunidade p65 do NF-kB
2
__________ABSTRACT__________
Hepatocellular Carcinoma (CHC), the most common liver primary malignancy, is
an advanced chronic hepatic complication and represents the fifth most frequent
tumour in the world, with more than 550.00 new cases per year and being four times
more common in men rather than in women. An important signalisation pathway,
altered in human tumours is the IKK/NF-κB signalisation module. An alteration in the
NF-κB regulation have been observed in lots of tumours, and the NF-κB can affect all
the six hallmarks of cancer, linked to the activation of the gene transcription associated
to the cellular proliferation, angiogenesis, metastasis, tumour promotion, inflammation
e apoptosis suppression. Due to the differentiation and growth regulation properties,
the INF have been used in the attempt of neoplasm’s treatment. Nevertheless, little is
known about the INF therapy against cancer. Surgical resection, radio frequency
ablation and liver transplant are the options in the hepatocellular carcinoma (CHC)
patient treatment. NAC administration can have a cancer prevention role and an
integrated approach in some tipes of cancer treatment, thoug the information in this
area being yet prliminar.
This work aims to evaluate the NAC response as a potentiator of the antitumoural
INF effect in human HCC cell lines and verify the implication of the NF-kB route in the
NAC`s interaction pathway. The HepG2 and Huh7 HCC cells line has been utilized to
evaluate the NAC (10mM), INF (2,5 x104U/mL) and NAC+INF co-treatment response in
different times. Cellular viability (MTT) apoptosis (Anexina V), NF-kB (siRNA p65)
involvement and the p65(western Blot) subunit expression.
NAC decrease cell viabilty already in 24h in Huh7 and 48 hours in HepG2. At the
end, it was demonstrated that the NAC potentiates the INF citoxic effect in co-
treatment, decreasing the cellular viability in both cellular strains. Cell Cycle distribution
weren’t observed any alterations in both cells lines and treatments. INF induced the
anexin staining of both cellular lines in 48 and 72 treatment hours, but in higher levels,
observed on the Huh7 cells. The NAC induced the anexin staining in 48 hours on the
Huh7cells, but not in the HepG2 cells, however the NAC induced the anexin staining
already in 24 hours. NAC decreases the p65 subunit expression after 72 treatment
hours. It was still also demonstrated that the co-treatment with NAC plus INF
decreases significantly the p65 subunit expression, around 50% and both the lines,
suggesting that the NF-kB can be a central modulator of the CHC cells response in the
NAC + INF treatment. When utilizing the specific p65 subunit siRNA, it was observed
an also significant reduction regarding the COsiRNA. Therewith, result shows that,
when treating the cells with specific p65 subunit siRNA, with the NAC the inhibition
result is the same as the COsiRNA with NAC, both leading a higher cellular viability
reduction regarding the COsiRNA, thus demonstrating the NAC action specificity by the
NF-B pathway.
The NAC demonstrated its potentiator effect in the INF antitumoral response
decreasing the cellular viability, increasing the apoptosis and decreasing the NF-kB
p65 subunit expression.
3
INTRODUÇÃO
4
1. INTRODUÇÃO
O Carcinoma Hepatocelular (CHC), malignidade primária mais comum do
fígado, é complicação de doença hepática crônica avançada e representa o quinto
tumor mais frequente no mundo, com mais de 550.000 novos casos por ano, sendo
quatro vezes mais comum em homens do que em mulheres(1).
As doenças hepáticas crônicas são fatores de risco e predispõem à ocorrência
do CHC, visto que qualquer agente ou fator que danifique lenta e cronicamente o
hepatócito, induzindo a mitoses, torna o ácido desoxirribonucleico (DNA) dessa célula
mais suscetível a alterações genéticas. A cirrose, de etiologia variada (alcoólica, vírus
da hepatite B ou C (VHB, VHC), biliar primária, deficiência de α1-antitripsina,
hemocromatose, tirosinemia), é terreno próprio para a instalação do CHC. Em
pacientes VHC positivos (grande maioria dos pacientes do Rio Grande do Sul), o CHC
surge, em média, trinta anos após a contaminação, quase que exclusivamente em
pacientes cirróticos(2).
O desenvolvimento do CHC é um processo complexo, associado ao acúmulo
de alterações genéticas e epigenéticas, que compõe as etapas de iniciação, promoção
e progressão tumoral (2). Inúmeras observações experimentais demonstraram que
produtos virais podem contribuir para a transformação maligna dos hepatócitos. Já foi
comprovada a capacidade do DNA do VHB de se integrar ao DNA do hospedeiro,
embora a mesma capacidade não tenha sido comprovada para o VHC. Tal fato
dificulta a compreensão do mecanismo de carcinogênese pelo VHC, com a
possibilidade do surgimento de um clone maligno pelos vários ciclos de regeneração e
reparo do fígado. Em pacientes cirróticos com hepatite C crônica, a incidência anual
de CHC é de 1,5-4%(3-6).
5
O estadiamento do CHC baseia-se em quatro critérios: tamanho do tumor,
presença ou não de ascite, níveis de bilirrubina e níveis de albumina. O CHC precoce
pode não apresentar manifestações clínicas distintas daquelas decorrentes da
progressão da hepatopatia de base. Dor abdominal, surgimento de massa abdominal
no quadrante superior direito, juntamente com hipoglicemia, hipercolesterolemia,
polimiosite, porfiria adquirida e criofibrinogenemia são as suas manifestações clínicas.
Em soro de pacientes, podem ser encontrados níveis elevados de fosfatase alcalina e
da alfa-fetoproteína (AFP).(7).
A ressecção cirúrgica pode, às vezes, ser curativa. Poucos pacientes,
entretanto, possuem tumores ressecáveis pela presença da cirrose subjacente e,
mesmo após a ressecção, podem surgir outros tumores no tecido remanescente.
Nesse caso, o tratamento com Inteferon (INF) pode reduzir o risco de recorrência do
CHC por VHC após a ressecção (8, 9). Em caso de tumor irressecável, o tratamento é
limitado, visto que a doença não responde à quimioterapia e o fígado não tolera altas
doses de radiação (10).
O transplante ortotópico de fígado (TOF) é a opção mais adequada para o
tratamento do CHC em cirróticos dentro de critérios restritos, embora persista a
possibilidade da recorrência e do surgimento de metástases(11).
Estudos demonstram que a progressão do carcinoma hepatocelular é
acompanhada pela ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-B), e
pesquisas de novas drogas capazes de inibir o crescimento tumoral são urgentes para
beneficiar milhares de pacientes no mundo (12-14).
6
REFERENCIAL TEÓRICO
7
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Epidemiologia e história natural do carcinoma hepatocelular
O câncer primário de fígado é o quinto câncer mais comum no mundo e a
terceira causa mais comum de morte por câncer. Cerca de 560.000 novos casos são
diagnosticados a cada ano e ocorrem 550.000 óbitos anuais. A maioria (75-90%)
corresponde ao carcinoma hepatocelular (CHC), assim, a incidência de câncer de
fígado e de mortalidade reflete a incidência e mortalidade do CHC. (15)
A cirrose hepática é o principal fator de risco para o desenvolvimento do CHC
no mundo e no Brasil, onde a infecção pelo VHC é a causa mais comum em todas as
regiões, mas, a infecção pelo VHB, ainda é uma importante causa de CHC em
algumas regiões brasileiras. No Brasil, levantamento nacional da Sociedade Brasileira
de Hepatologia sobre CHC, realizado em 2010, foram analisados 1405 casos
diagnosticados entre os anos de 2004 e 2009. Encontrou-se cirrose em 98% dos
casos, pacientes com média de idade de 59 anos e 78% eram homens. O Sudeste foi
responsável por 77% dos casos e a presença do VHC foi de 54%. No Norte, Nordeste
e no Centro Oeste, o VHB foi mais prevalente (25%) do que na região Sul e Sudeste
(15%)(16).
Estudos prospectivos demonstram que o CHC começa como um nódulo
solitário ocorrendo em qualquer parte do fígado, sendo o lobo direito mais acometido
que o esquerdo, mas isso pode estar relacionado ao seu maior volume. A forma difusa
tem sido descrita em pacientes na África, contudo estudos prospectivos não foram
executados para excluir a possibilidade de que esses tumores ainda comecem como
nódulos únicos. O CHC geralmente invade o sistema portal e venoso, produzindo
trombos tumorais na veia porta e em seus ramos (17).
8
O tempo de infecção inicial pelos vírus das hepatites B ou C para o
desenvolvimento de CHC pode variar entre duas a oito décadas. Durante esse
intervalo, muitas mudanças podem ocorrer no fígado, incluindo inflamação crônica,
fibrose, com evolução para cirrose e aumento da taxa de morte dos hepatócitos e sua
regeneração. Estudos de hepatocarcinogênese experimental em animais revelam uma
sequência de eventos que começam com focos de hepatócitos fenotipicamente
alterados, provenientes de focos displásicos e nódulos displàsicos (18). O ciclo
contínuo de morte e regeneração celular pode, eventualmente, resultar na proliferação
de células-tronco hepáticas, morfologicamente reconhecíveis como células ovais (19,
20), embora hepatócitos maduros sejam a principal fonte de substituição de células no
fígado danificado. Células ovais podem dar origem a focos fenotipicamente alterados,
entretanto, se essa célula oval é a única célula precursora do CHC não está claro (20).
2.2 Incidência e Mortalidade
Há grande variabilidade geográfica na incidência do CHC (Figura 1). A maioria
dos casos (>80%) ocorre na África subsaariana ou na Ásia Oriental. A China é
responsável por mais de 50% dos casos. Com algumas exceções, os países da
América do Norte, da América do Sul, do Norte da Europa e a Austrália tendem a ter
taxas de incidência baixas, enquanto os países do Centro e Sul da Europa tendem a
ter taxas intermediárias (21). O registro das maiores taxas de incidência de CHC
ocorre em Qidong, na China, onde a incidência no sexo masculino e feminino são,
respectivamente, 95,7/100.000 e 29,6/100.000 habitantes. Taxas elevadas também
ocorreram em Khon Kaen, nordeste da Tailândia (masculino: 88/100.000; feminino:
35,4/100.000 habitantes), mas a maioria dos tumores nessa região são
colangiocarcinomas intra-hepáticos e não CHC (22).
9
Figura 1. Incidência global de câncer hepático em homens, 2000 (15).
As taxas de sobrevivência do CHC são uniformemente ruins, tanto em áreas de
alta como de baixa incidência. A Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer
(IARC) estima que, em determinada idade para os homens, ocorra uma incidência
padronizada mundial de câncer primário do fígado, sendo de 17,4/100.000 habitantes
nos países subdesenvolvidos e 8,7/100.000 habitantes nos países desenvolvidos (15,
21).
2.3 Fatores Demográficos
2.3.1 Idade
A distribuição etária global de CHC varia de acordo com incidência, gênero, e
etiologia (22). Na grande maioria das áreas de alto ou de baixo risco, as taxas de
incidência feminina ocorrem cinco anos após as ocorridas na idade máxima dos
homens. Em populações de baixo risco, a maior incidência acontece entre pessoas
com mais de 80 anos, em contraste com o que acontece em áreas de alto risco (22-
10
24). Os diferentes padrões etários na incidência de CHC em diferentes áreas estão
relacionados ao vírus da hepatite dominante naquela população, à idade da infecção
viral e à existência de outros fatores de risco.
2.3.2 Gênero
Na maioria das áreas do mundo, a incidência do CHC entre os homens é de
duas a quatro vezes superior à das mulheres. As maiores diferenças entre as taxas
masculinas e femininas, contudo, não ocorrem entre populações de alto risco para o
CHC (15), o que levaria a supor que essas maiores diferenças ocorrem nas
populações de baixo risco, como a América do norte.
As razões pelas quais os homens têm maiores taxas de câncer de fígado do
que as mulheres não são totalmente compreendidas. Os homens são mais suscetíveis
a infecções pelos VHB e VHC, ao maior consumo de álcool, ao uso de cigarros, ao
aumento dos estoques de ferro corporais pelos hormônios androgênicos e à
susceptibilidade genética (25).
2.3.3 Etnia
Taxas de incidência de CHC podem variar muito entre as pessoas de
diferentes etnias que vivem na mesma região. Por exemplo, homens coreanos que
vivem em Los Angeles têm taxas cinco vezes maiores do que as do homem branco
que ali habita (26). Da mesma forma, em Cingapura, homens chineses têm taxas 2,7
vezes maiores do que a dos homens indianos, enquanto, em San Francisco, homens
chineses têm taxas 4,2 vezes maiores que a taxa dos não chineses brancos (15).
11
As diferenças étnicas entre os homens são igualmente verdadeiras entre as
mulheres. Essas variações podem refletir diferenças no risco de infecção pelo VHB e
VHC, apesar da suscetibilidade genética e de diferentes padrões de exposição a
outros fatores de risco (27).
2.4 Fatores de Risco
Os principais fatores de risco para o CHC são as infecções crônicas pelos VHB
ou VHC, a exposição diária à aflatoxina e o consumo de álcool. Em áreas de alta taxa
de incidência de CHC, VHB e aflatoxina são os fatores dominantes, enquanto VHC e
álcool são os fatores mais importantes nas áreas de baixa e média incidência (Tabela
1). Estima-se que as infecções pelos VHB e VHC são associadas e alcançam índice
superior a 80% do CHC no mundo(27).
2.4.1 Vírus de Hepatite B
O VHB é um hepadnavírus com dupla hélice de DNA (ácido
desoxirribonucleico) no seu interior. Sua descoberta deu-se em meados da década de
1960 (28), com a identificação do antígeno Austrália, hoje chamado de AgHBs.
Tabela 1. Fatores de risco relacionados ao desenvolvimento do CHC
Fatores maiores
Cirrose
Hemocromatose e
Tirosinemia Hereditária
VHB
VHC
Exposição a aflatoxinas
Fatores menores
Cirrose biliar primária
Doença hepática gordurosa não
alcoólica
Exposição ao thorotraste
Exposição a cloreto de vinil
Tabagismo
Estrogênios e androgênios
12
Aproximadamente 5% da população do mundo (350 milhões de pessoas) está
cronicamente infectada com o VHB, a maioria reside nas regiões de alto risco para o
CHC: Ásia e África. Áreas com altas taxas de CHC possuem também alta prevalência
de infecção crônica pelo VHB (Figuras 1 e 2) (15, 25, 29). Em regiões de alta taxa de
incidência de CHC, a cirrose está intimamente associada à hepatite B crônica,
precedendo a maioria dos casos de CHC (30). Na maioria das regiões, com exceção
do Japão, a infecção pelo VHB está associada com cirrose, sendo de 80% ou mais, o
índice dos casos de CHC. O risco de CHC em homens infectados é estimado entre 10
e 25%, enquanto o risco em mulheres infectadas é menor (31, 32).
Figura 2. A distribuição geográfica da infecção crônica pelo VHB, Departament of Health and
Human Services, 2006 (33)
A transmissão perinatal é a principal via de aquisição do vírus nos locais de
alta prevalência, seguida pela transmissão horizontal nos dois primeiros anos de vida
(34, 35). Nos locais de menor prevalência, as principais maneiras de disseminação do
VHB são as práticas sexuais sem proteção ou o compartilhamento de seringas no uso
de drogas intravenosas. Estima-se que, no Brasil, a prevalência do VHB seja
intermediária. Dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, em doadores de
sangue, mostram que 0,33 a 1,14% da população é AgHBs positivo (7, 34). O risco da
hepatite B tornar-se crônica varia com a idade da infecção. Menos de cinco por cento
dos adultos imunocompetentes que adquirem a infecção evoluirão para a forma
crônica, enquanto mais de 90% das crianças que adquirem o vírus no primeiro ano de
13
vida e cerca de 30% daquelas infectadas entre o primeiro e o quinto ano de vida terão
a forma crônica (22, 36).
2.4.1.1 O Vírus da Hepatite B e o Carcinoma Hepatocelular
Existe uma forte associação epidemiológica entre o VHB e o CHC, havendo
superposição das áreas onde o VHB é endêmico e onde há maior incidência do CHC.
A China e o Sudeste Asiático são os locais em que o CHC alcança mais de 150 casos
por 100.000 habitantes (22, 23, 37).
Os mecanismos pelos quais o VHB possibilita o desenvolvimento do CHC
ainda não estão claros. A lesão hepática crônica com infecção, a inflamação, a
regeneração e a fibrose desencadeiam a cirrose e, em consequência, indiretamente o
CHC. Entretanto, sem que haja uma explicação fisiopatológica adequada (37,38) em
até 40% os CHC ligados ao VHB podem não estar associados à cirrose.
O VHB integra o seu DNA ao genoma do hepatócito. O sítio de integração do
VHB-DNA circular é variável, contudo envolve frequentemente longas e repetidas
sequências. Esse DNA integrado é, muitas vezes, incompleto ou danificado, podendo,
assim, conter deleções, rearranjos, inversões ou duplicações da sequência genética
normal. Essas integrações ocorrem em locais adjacentes aos genes, com conhecidos
efeitos no desenvolvimento e crescimento de tumores como o insulin-like growth factor
II (IGF-II) e a ciclina-A, que têm sido associados a alterações na expressão de
oncogenes(38).
O VHB parece ter propriedades carcinogênicas intrínsecas, pois a proteína X
(HBX), sintetizada a partir do gene X do VHB, com 465 pares de bases (pb), funciona
como transativador transcripcional e ativa genes relacionados ao crescimento tumoral
(39). Há relatos de que a HBX liga-se ao gene supressor tumoral p53, reduz a sua
transcrição e, consequentemente, reduz a inibição do crescimento celular e a entrada
14
da célula em apoptose (39, 40). Um estudo de ZHANG mostra que a HBX aumenta a
regulação, a expressão e a atividade da transcriptase reversa da telomerase humana
(hTERT) em células hepáticas infectadas pelo VHB, elevando o potencial
carcinogênico (41, 42).
Elementos que participam na carcinogênese hepática são os radicais livres.
Esses radicais, produzidos pela inflamação hepática, podem ser carcinogênicos por
causarem quebras na molécula de DNA e substituição ou rearranjos nas suas bases.
Tais modificações no sistema redox podem desencadear alterações enzimáticas,
afetando moléculas reguladoras, oncogenes e crescimento tumoral (22, 38).
Evidências mais importantes do papel primordial do VHB no surgimento do
CHC decorrem, entretanto, de estudos realizados em Taiwan (43), onde o programa
de vacinação em massa contra a hepatite B em recém-nascidos reduziu
significativamente a incidência e a mortalidade por CHC em crianças. Em dez anos,
coincidiu com o declínio da infecção crônica pelo VHB nos indivíduos vacinados, o que
demonstra claramente causa/efeito.
O estabelecimento de uma relação causal direta entre a incorporação do DNA
do VHB e o surgimento do CHC tem sido difícil, e o mais provável é que essa
integração não deva ser o gatilho para o surgimento do tumor. O ciclo contínuo de
inflamação e regeneração certamente tem papel relevante na patogênese tumoral com
a ativação contínua dos mecanismos da síntese de DNA e seus mecanismos de
reparo que formam o terreno ideal para a ocorrência de mutações adquiridas(18).
Nem todos os pacientes com infecção crônica pelo VHB têm o mesmo risco de
desenvolver CHC. Os indivíduos com inflamação mais ativa ou com disfunção
hepatocelular mais avançada parecem apresentar maior risco de desenvolvimento da
neoplasia, enquanto os portadores compensados do AgHBs apresentam menor risco
de desenvolver o CHC (44, 45).
15
É duvidoso estabelecer se o tratamento do VHB com INF alfa reduz a
incidência do CHC. Os pacientes com infecção crônica pelo VHB, quando tratados
com INF alfa, têm taxa de desaparecimento do AgHBe (antígeno e) e VHB-DNA do
soro de 25 a 40%(44). É lícito acreditar que o tratamento precoce do VHB, levando à
sua erradicação do soro, determinaria a redução na taxa do desenvolvimento do CHC.
Um estudo de OON e colaboradores mostra essa associação, porém a maior parte
dos estudos é limitada a este respeito(46). É possível que, no decorrer da infecção
viral, haja a incorporação precoce do genoma do VHB no DNA do hepatócito do
hospedeiro e mesmo o tratamento eficaz com desaparecimento do VHB-DNA sérico
provavelmente não seja suficiente para erradicar o potencial oncogênico do VHB. Fato
que pode corroborar essa possibilidade é a descrição da infecção críptica pelo VHB,
relatada em pacientes com cirrose hepática e CHC(45, 47), em que o AgHBs é
negativo e, por vezes, o anti-HBc também é negativo. Além disso, corroboram também
os estudos de hibridização ou por técnicas de PCR (polymerase chain reaction), pelos
quais se detecta o VHB-DNA sérico em níveis baixos e a sua presença no hepatócito
(44).
Outro fator importante na gênese do CHC parece ser a concomitância das
infecções pelo VHB e VHC, fato não incomum, pois ambos dividem a mesma via de
aquisição parenteral. A concomitância poderia determinar uma evolução mais grave, e
as lesões histopatológicas hepáticas seriam predominantemente causadas pelo VHC,
com raras lesões características do VHB. Evidências sugerem que o CHC é mais
comum quando ocorre essa dupla infecção. (44, 48).
2.4.2 Vírus da Hepatite C
O VHC é um vírus de RNA (ácido ribonucleico) da família dos Flaviridae. O
VHC foi identificado, em 1989, em soros de símios infectados com soro humano de
indivíduos com hepatite não-A, não-B (49). Uma das principais características do VHC
é a sua heterogeneidade genética, com seis genótipos maiores (de 1 a 6) e mais de
16
cem subtipos (50). Além disso, a variabilidade do genoma viral, presente no mesmo
indivíduo, resultante das mutações no decorrer do tempo da infecção, facilita o
aparecimento das quasi-especies (51). Dessa heterogeneidade decorrem as principais
dificuldades em se encontrar um tratamento eficaz, com altas taxas de cura e,
principalmente, o desenvolvimento de uma vacina eficaz para evitar a infecção do
VHC.
Em 1994, a IARC passou a classificar o VHC como um carcinógeno humano,
assim como o VHB(52). A evidência mais forte para um nexo de causalidade entre o
VHC e o CHC é proveniente do Japão, onde, antes da identificação do vírus, Okuda e
colaboradores (1987) elaboraram a hipótese de que o vírus de natureza não A não B
causava uma proporção significativa de CHC (53, 54). A hipótese baseava-se na
incidência de CHC ter, no período entre 1966 e1983, mais do que duplicado, enquanto
a proporção de CHC relacionado ao VHB diminuíra de 50% a 30%. Quando os testes
para detecção de anticorpos do VHC tornaram-se disponíveis, a hipótese foi
comprovada (55). Posteriormente, os dados sobre o risco de CHC, no Japão, foram
relatados em estudo com 2890 pacientes afetados pelo VHC (56). A incidência anual
de CHC em pacientes com cirrose concomitante com VHC foi de 7,9%, enquanto a
incidência entre os pacientes sem cirrose é de apenas 0,5%.
Outra característica importante do VHC é a sua capacidade de causar infecção
crônica. Cerca de 80 a 90% dos indivíduos infectados com o VHC desenvolvem a
forma crônica (57, 58). A icterícia surge em menos de 20% dos infectados e parece
haver correlação com níveis séricos elevados de cópias do RNA viral (57). No Brasil,
a prevalência de infecção pelo VHC alcança cerca de 1,6% (59), sendo uma das
principais causas de cirrose e de indicação de transplante hepático em nosso país. A
principal via de transmissão do VHC é a parenteral, através de hemoderivados
contaminados, ou o uso compartilhado de seringas e agulhas contaminadas,
geralmente em usuários de drogas intravenosas. A transmissão sexual é incomum,
sendo responsável por pequena parcela dos casos de aquisição do VHC.
17
Em outras áreas do mundo, estudos de pacientes com hepatite crônica e / ou
cirrose confirmaram que o CHC pode resultar de infecção pelo VHC, em longo prazo.
A proporção de pacientes que desenvolvem CHC, no entanto, varia conforme o país, o
tempo de seguimento e a prevalência de cirrose. Em quase todos os casos, a cirrose
precede o diagnóstico de CHC(31).
Ao sintetizar dados clínicos e estudos de base populacional, Alter e
colaboradores (1992) propuseram um modelo de história natural da infecção pelo
VHC. Entre as pessoas com infecção aguda, 20% recuperaram-se espontaneamente e
80% desenvolveram infecção persistente. Entre aqueles com infecção persistente,
30% desenvolveram hepatite progressiva grave e 70% desenvolveram hepatite crônica
estável ou doença no fígado lentamente progressiva. Essas projeções são
semelhantes às da Organização Mundial da Saúde (OMS), a qual afirma que 20% dos
indivíduos infectados com VHC desenvolvem cirrose e que 2 a 4% atingem CHC (57).
Vários fatores influenciam a progressão da doença hepática crônica entre os
indivíduos infectados. No VHB, os homens parecem estar em maior risco de
desenvolver CHC, pois são mais propensos a comportamento de risco para a
aquisição de coinfecções com VHB e HIV (Human Immunodeficiency Virus), o que
também pode aumentar o risco de CHC (27).
Cerca de 170 milhões de pessoas (3% da população mundial) estão
cronicamente infectadas com VHC. Além desse dado, estima-se que 3 a 4 milhões de
pessoas são anualmente infectadas e sete a nove milhões dos 170 milhões
provavelmente irão morrer de CHC. A infecção crônica pelo VHC é menos comum que
a infecção pelo VHB, e a distribuição mundial da infecção crônica pelo VHC (Figura 3)
é diferente da distribuição de mortalidade pelo CHC (Figura 1).
18
Figura 3. Distribuição global de infecção crônica de VHC, World Health Organization, 2001 (60).
2.4.2.1 O Vírus da Hepatite C e o Carcinoma Hepatocelular
Existem evidências que relacionam o VHC ao desenvolvimento do CHC, há
elevada prevalência do anti-VHC em pacientes com CHC e, em alguns países
europeus e no Japão, cerca de 50 a 75% dos pacientes com CHC têm anti-VHC
detectável no soro (61, 62). Isso é confirmado pela detecção do VHC-RNA sérico e no
tecido hepático. Além disso, muitos desses pacientes têm o vírus identificado no tecido
tumoral. Ainda hoje não sabemos exatamente o mecanismo pelo qual a infecção pelo
VHC resulta no CHC. Dados sugerem que o núcleo viral do VHC desregula a apoptose
celular através da depleção de cálcio no retículo endoplasmático celular e que
proteínas truncadas do núcleo viral poderiam ter papel importante na indução do CHC.
Tais constatações trazem novos elementos ao conhecimento da carcinogênese
vinculada ao vírus (58, 63). A grande maioria de tais indivíduos tem cirrose hepática
associada ao CHC, o que sugere que a sequência de eventos de infecção, de
inflamação, de lesão e de regeneração é fundamental para a ativação contínua da
síntese celular de DNA e seus mecanismos de reparo, o que forma o terreno ideal
para o surgimento de mutações e do CHC. Ao contrário do VHB, o VHC não integra o
seu genoma ao genoma do hospedeiro, apesar de já ter ocorrido identificação do VHC
no tecido tumoral. Entretanto, há evidências de que uma proteína do núcleo viral do
19
VHC tem propriedades carcinogênicas diretas, ao menos in vitro (64), e que
camundongos modificados para expressarem a proteína do core viral possuem altas
taxas de desenvolvimento de CHC (65). A proteína do core do VHC pode ainda alterar
a sinalização intracelular e ativar o fator nuclear Kappa-B (66). Essas interações, ainda
que não expliquem o surgimento do CHC, comprovadamente levam a alterações na
apoptose e à redução da eficiência do sistema imunológico. Futuramente, tais estudos
-em animais- terão importância crítica no conhecimento sobre a gênese do CHC.
Em relação aos genótipos virais, apesar de controverso, parece que o genótipo
1b está associado à doença hepática mais grave e ao CHC(67, 68). Se isso reflete
propriedades intrínsecas deste genótipo ou se deve à menor taxa de resposta obtida
pelo tratamento com o INF alfa é uma questão ainda não resolvida pela comunidade
científica.
A utilidade do INF alfa em pacientes com hepatopatia crônica pelo VHC deve-
se às propriedades antivirais do fármaco, ao efeito antifibrótico e anticarcinogênico. Há
fortes evidências de que o tratamento com INF alfa, principalmente naqueles em que
observamos resposta (bioquímica ou viral), tem significativo efeito em reduzir a
incidência do CHC. O CHC, ligado ao VHC, ocorre quase que exclusivamente
naqueles com cirrose associada, com incidência anual de 3 a 5% (69-71). O INF alfa
reduziu a incidência do CHC em 13% na mortalidade e, em 16%, em pacientes com
cirrose hepática ligada ao VHC. Esses fatos reforçam a ideia de que o tratamento de
pacientes com cirrose ligada ao VHC, desde que compensada, pode, além de retardar
a progressão da doença, reduzir significativamente a incidência do CHC a pacientes
que respondem ao tratamento.
Outros fatores associados à infecção pelo VHC têm importância no surgimento
do CHC, como o consumo excessivo de álcool e a coinfecção pelo VHB. O maior
efeito na redução dos casos de CHC ligados ao VHC talvez se obtenha, como
observado na hepatite B, com o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o vírus.
Recentes avanços na biologia molecular, no uso de novos adjuvantes e no
20
desenvolvimento de vacinas de DNA, podem ser a chave para o surgimento de
métodos que garantam a imunidade protetora contra o VHC.
2.4.3 Aflatoxina
Aflatoxina B1 (AFB1) é uma micotoxina sintetizada por fungos da espécie
Aspergillus flavus e Aspergillus parasitivus. Os fungos crescem facilmente em
alimentos, como milho e amendoim, quando armazenados em condições de calor e
umidade. Apesar de existirem quatro principais aflatoxinas, B1, B2, G1 e G2, AFB1 é o
mais potente em estudos com animais. Em 1987, a aflatoxina foi classificada, pela
IARC, como cancerígeno humano (72).
Uma vez ingerida, a AFB1 é metabolizada em um intermediário ativo, AFB1-
exo-8,9-epóxido, que é detoxicado através de uma variedade de processos
metabólicos. O epóxido intermediário demonstra ligação a danos no DNA,
principalmente na posição N7 da guanina(73). A alteração genética característica
associada a AFB1 é uma transversão de G (Guanina) para T (Timina) na terceira base
do códon 249 do gene p53. A mutação p53 249ser foi observada em 30-60% dos
tumores decorrentes de pessoas que vivem em zonas de altas taxas de aflatoxinas
(74).
Muitos estudos ecológicos de contaminação de alimentos por AFB1, realizados
nas décadas de 1970 e 1980, eram compatíveis com um papel para o agente
cancerígeno no CHC. Forte evidência de uma ligação AFB1-CHC foi fornecida
posteriormente por estudos baseados na detecção de marcadores de AFB1 em
amostras biológicas. Além disso, a interação entre AFB1 e infecção por VHB sobre o
risco de desenvolvimento do CHC foi demonstrada em estudos de curto prazo, em
Xangai, na China (75). A partir desse estudo, estimou-se que a AFB1 aumentou o
risco de CHC quatro vezes, o VHB aumentou o risco em sete vezes, e a combinação
de AFB1 e o VHB aumentou o risco 60 vezes. Estudos mais recentes em área de alta
21
contaminação para a AFB1 em Qidong, China, relataram resultados semelhantes (76,
77).
2.4.4 Álcool
A associação positiva entre o consumo de álcool e o CHC levou a IARC a
concluir, em 1988, que havia uma relação causal entre eles, embora o mecanismo
pelo qual o álcool aumente o risco de CHC não esteja bem compreendido. Outras
questões não resolvidas incluem o risco comparativo entre homens versus mulheres e
o efeito combinado do álcool e VHB versus o efeito do álcool e VHC (78).
Evidências demonstram que o álcool é fator de risco importante em áreas de
baixa incidência de CHC, diferente de áreas de alta incidência. Isso pode ocorrer
devido ao fato de a média de consumo de álcool em população de alto risco ser menor
e/ou devido ao efeito dominante da hepatite B crônica, mascarando qualquer risco
adicional ao consumo de álcool. Alguns estudos em populações endêmicas de VHB
demonstram associação positiva entre consumo de álcool e CHC, outros estudos não
têm, entretanto, esses mesmos achados (79). Na maioria dos estudos em populações
em que o VHC é o vírus dominante, o álcool é relatado como um fator de risco
significativo. Estudos recentes relataram pouca diferença entre o risco imposto pelo
álcool e VHC, em comparação com o álcool e VHB. Os dados sugerem também que o
álcool está associado ao CHC, na ausência de qualquer infecção pelo VHB ou VHC,
embora, na ausência de infecção viral (80) sejam necessários níveis mais elevados de
consumo para o desenvolvimento do CHC.
A associação do álcool com CHC está mais fortemente relacionada ao gênero
feminino do que ao masculino, o que a torna difícil de estudar, uma vez que as
mulheres têm menor probabilidade de beber compulsivamente e menor probabilidade
de desenvolver CHC do que os homens. O maior efeito do álcool sobre as mulheres
foi postulado com base em diferenças na atividade da álcool desidrogenase e na
evidência de maior associação entre álcool e cirrose entre as mulheres (80). Alguns
22
dos mecanismos pelos quais o álcool pode aumentar o risco de CHC incluem a
produção de acetaldeído e radicais livres durante o metabolismo do álcool, a indução
do citocromo p4502E1 (CYP2E1), a modulação de regeneração celular, a promoção
ou a exacerbação de deficiências nutricionais e alterações do sistema imunológico
(81). O envolvimento desses mecanismos relaciona o consumo de álcool à cirrose,
entretanto, se o álcool está relacionado ao CHC independente da cirrose é o que não
está completamente definido (82).
2.5 Cirrose
A grande maioria dos CHCs estão associados à cirrose, que é doença hepática
crônica, a qual se caracteriza por graus variados de inflamação e fibrose. O grau ou
estádio de fibrose correlaciona-se com melhor ou pior prognóstico. Embora várias
classificações de fibrose tenham sido propostas, há consenso de que a cirrose é a
fase mais avançada de fibrose, e caracteriza-se histopatologicamente por nódulos e
hepatócitos rodeados por bandas de tecido fibroso denso (83).
A cirrose é definitivamente diagnosticada por biópsia hepática. Devido a isso,
um pequeno número de estudos prospectivos está sendo realizado para demonstrar a
taxa em que se desenvolve o CHC em fígados cirróticos. Exceção é o estudo
Dionysos em que 6917 pessoas, no norte da Itália, foram registradas em um estudo
populacional baseado em doença hepática (84). De 78 pessoas identificadas com
cirrose no início do estudo, oito desenvolveram CHC no seguimento de nove anos
(85). Entre as 81 pessoas infectadas com o vírus VHB, nenhum desenvolveu CHC,
enquanto cinco pessoas que tinham cirrose e eram VHC positivos desenvolveram
CHC. Entre as 1349 pessoas sem VHB ou VHC que consumiram mais de 30g de
álcool por dia, dois desenvolveram CHC.
23
2.6 Fator de Transcrição Nuclear kappa B
O Fator de Transcrição Nuclear kappa B (NF-B) é fator de transcrição que
desempenha importante e determinante papel, tanto em situações normais como na
coordenação de respostas imunes adaptáveis, regulando a expressão de muitos
mediadores celulares (86). Esse fator foi primeiramente descrito, em 1986, por Sen e
Baltimore como capaz de ligar-se a sítios específicos kappa, como enhancer nas
regiões promotoras dos genes das imunoglobulinas em células B (87). Reconhece-se
também que o NF-B é expresso na maioria dos tipos celulares, sendo constituído por
um dímero composto dos membros da família da Rel.
A família do NF-B/Rel compreende cinco subunidades, chamadas p50, p52,
p65 (RelA), c-Rel, e RelB. Essas subunidades formam homodímeros e heterodímeros
em várias combinações. Geralmente o NF-B é constituído de dois polipeptídeos: um
de 50 kDa (p50) e um de 65 kDa (p65) (Figura 4). Em células em homeostase, o NF-
kB mantém-se no citoplasma em sua forma inativa, associado com as proteínas
inibidoras do sítio kB, denominadas inibidores kB (IB). Sete espécies de IBs são
descritas: IB, IB, IB, IB, Bcl-3, p100, e p105. O NF-B pode ser ativado por
uma variedade de sinais relevantes, conforme a etiologia e a fisiopatologia
inflamatórias (86).
Radicais Livres e Oxidantes
IBBp65p65p50p50
p50p50 p65p65
p50p50 p65
p65
IBB P
IBB
DegradaDegradaçção 26São 26S
CitocinasCitocinas e outros e outros
mediadores mediadores
inflamatinflamatóóriosrios
AtivaAtivaçção ão LeucocitLeucocitááriariaDano Tecidual
IKKIKK
Figura 4: Rota de ativação do NF-B(88).
24
Para ativar o NF-B, são necessários estímulos intracelulares e/ou
extracelulares, podendo ser desencadeados pelos seguintes agentes: produtos
bacterianos (endotoxinas, peptideoglicanos), vírus e componentes virais, protozoários,
citocinas (fator de necrose tumoral (TNF-), interleucinas), radicais livres e/ou
oxidantes (86).
A ativação do NF-B requer a fosforilação de seus inibidores fisiológicos
(particularmente o IB) em resíduos específicos de Serina (Ser-32 e Ser-36). Tal
fosforilação é mediada por um complexo proteico, o complexo kinase kappa B (IKKs).
O complexo IKK é composto de três subunidades, duas unidades catalíticas IKK-,
IKK-, e uma unidade reguladora IKK (NF-B essential modulator, NEMO). Após a
fosforilação, ocorre a subsequente degradação das IBs através das ubiquitinas,
formando um proteossoma 26S (89). A degradação proteolítica dos IKBs permite a
translocação do NF-B ao núcleo, onde ele regula a expressão de centenas de genes
que são importantes na resposta imune inflamatória.
2.6.1 NF-kB e Câncer
O Câncer é uma das maiores causas de morte nos países industrializados(90).
A taxa de mortalidade por câncer tem decaído nos últimos anos devido ao diagnóstico
precoce e às terapias eficazes, entretanto muitas formas de câncer ainda são
incuráveis. É importante ressaltar que ele não é uma, e sim muitas doenças, cada uma
com diferentes características, exigências e opções terapêuticas diferentes. A
progressiva sequência de mutações e alterações epigenéticas nos oncogenes
promove a transformação maligna das células progenitoras do câncer, alterando
processos-chave envolvidos no controle da multiplicação celular normal e na
homeostase dos tecidos (91). Além disso, a instabilidade genômica é uma
característica comum, senão universal, dos tumores avançados.
25
Distinguir as mutações causadoras de câncer das alterações irrelevantes é o
maior desafio dos pesquisadores. Além dessas mudanças intrínsecas das células
malignas, o desenvolvimento e a progressão são também dependentes do
microambiente que as circunda, sendo este, em muitos casos, de natureza
inflamatória. (92). O papel do microambiente inflamatório na história natural e na
progressão da maioria dos tumores oferece novas oportunidades de intervenção
baseadas no apontamento dos componentes inflamatórios do tumor em vez das
células malignas propriamente ditas, que apresentam rápida mutação e adquirem
resistência às drogas (93, 94).
O atual arsenal da oncologia médica inclui muitos agentes ativos anticâncer
que são aplicados em vários tipos de tumores. Nenhuma dessas drogas anticâncer
largamente ativas é uma cura ideal. A maioria das drogas tem pequeno valor
terapêutico e não consegue distinguir as células malignas das células normais,
problema que é amplificado pela inevitável resistência e a subsequente ocorrência do
tumor. Ultimamente, o foco das novas terapias moleculares busca rotas específicas
que levem ao impedimento da multiplicação e da sobrevivência celular, oferecendo a
promessa de maior especificidade, associada com a redução da toxicidade sistêmica.
Essas estratégias baseiam-se em novas abordagens para o estudo da genética do
câncer, como o perfil da expressão gênica utilizando “microarrays”, sequenciamento
do DNA e o “screeening” do genoma em busca de um gene alterado. O êxito do
desenvolvimento de uma terapia racionalmente designada e molecularmente orientada
para o tratamento de um tumor específico é mais bem ilustrado pelo lançamento de
terapias baseadas em anticorpos para o tratamento de câncer de mama, como
Herceptina (95, 96), e o uso de Gleevee (ST1571/Imatinibe) como um inibidor de
quinase no tratamento de mieloma crônico.(97)
Na validação e seleção de alvos moleculares e rotas para uma intervenção
terapêutica no câncer, a frequência com que um alvo particular ou uma rota sofre
mutação ou desregula é um indicador valioso e tem crucial importância no processo de
malignidade e no uso potencial de uma droga que age nesse alvo ou rota. Uma
importante via de sinalização alterada em tumores humanos é o módulo de sinalização
IKK/NF-κB. Uma alteração na regulação do NF-κB tem sido observada em muitos
26
tumores, e o NF-kB pode afetar todos os seis “hallmarks” do câncer ligados à ativação
da transcrição de genes associados com a proliferação celular, a angiogênese, as
metástases, a promoção de tumor, a inflamação e a supressão da apoptose (Figura 5)
(98-103). Em vários modelos de câncer em ratos, nos quais a ativação da IKK/NF-κB
foi bloqueada por meios genéticos, destacou-se o papel fundamental do NF-κB como
importante promotor de cânceres ligados à inflamação. (104-106)
Figura 5. Envolvimento do NF-B na biologia tumoral.
Uma das funções do NF-κB é a sua habilidade de promover a sobrevivência
celular devido à indução de genes específicos, cujos produtos inibem a maquinaria
apoptótica tanto em células normais quanto em malignas. (101, 107, 108) O NF-κB
também impede a necrose programada por induzir genes codificantes de proteínas
antioxidantes (107). Já que células tumorais frequentemente usam o NF-κB para
alcançar a resistência a drogas e a radiações, a inibição no NF-κB parece ser uma
promissora opção na melhoria da eficácia das terapias anticâncer convencionais (109,
110). Todavia, apenas recentemente a investigação genômica do câncer mostrou-se
aplicável para demonstrar o papel importante do NF- κB na carcinogênese e para
identificar os passos críticos que levam a essa ativação (Figura 6).
27
Figura 6: Inibição do NF-kB e apoptose, modificado de Nakanishi 2005 (109).
O NF-kB está frequentemente alterado no câncer. Na maioria dos casos, a
ativação do NF-kB em células malignas, como resposta a um estímulo inflamatório
originado no microambiente tumoral, não ocorre devido a mutações intrínsecas e sim
em genes regulados pela modulação do NF-kB (111).
2.7 Interferon (INF)
O sistema imune é constituído por um complexo de células diferentes que
recebem e emitem diversos sinais dirigidos às células leucocitárias, regulando, assim,
os mecanismos de defesa do organismo. Os mediadores dessa interação são
proteínas, peptídeos e outras substâncias que, por sua atividade, recebem o nome de
imunomoduladores. Os Interferons (INFs) são glicoproteínas que possuem diversas
ações biológicas, dentre elas, efeitos antivirais, imunomoduladores e antiproliferativos
complexos (Figura 7). Sua produção e liberação endógena ocorrem em resposta a
vírus e a outros indutores, com exceção de exotoxinas bacterianas, poliânions, alguns
compostos de baixo peso molecular e micro-organismos com crescimento intracelular
(112).
28
Além de inibir a proliferação celular em uma série de tumores, o INF possui
importantes funções imunomodulatórias tais como o aumento da atividade das células
natural killer, o estímulo para liberação de outras citocinas e o aumento da expressão
de antígenos de histocompatibilidade na superfície das células (113, 114).
Figura 7: Estrutura Molecular do INF alfa Humano
Uma grande gama de vírus ARN e ADN é sensível ao Interferon, porém o
mecanismo e o grau do efeito são variáveis com o vírus. A sua atividade antiviral está
baseada no fato de se combinarem aos receptores superficiais celulares específicos e
inibirem a penetração, a proliferação e a liberação dos vírus; sendo o principal efeito a
inibição da síntese proteica viral. Os INFs com potencial antiviral relativamente alto
são denominados INF antivirais ou tipo I e não são encontrados em tecidos ou no
soro, mas podem ser rapidamente sintetizados pela maioria das células em resposta a
infecções por vírus, bactérias ou protozoários, ou pela exposição a certas citocinas.
Existem três formas principais de INF do tipo I: INF-α, INF-β e INF-ω. O INF-α consiste
em pelo menos quatorze glicoproteínas e é o principal INF produzido por leucócitos.
Os fibroblastos e a maioria das outras células não leucocitárias expressam
primariamente o INF-β, uma citocina apenas 30% idêntica ao INF-α, o INF- ω possui
60-70% de homologia com o INF-α e pode ser liga tanto aos receptores do INF-α
quanto do INF- β (115).
Os INFs do tipo I ligam-se a um único receptor de múltiplas cadeias, o qual
está estruturalmente relacionado ao receptor da IL-10 e é expressado em quase todos
os tipos celulares. Essa ligação leva à expressão aumentada de, aproximadamente,
trinta proteínas diferentes na célula-alvo, entre elas as proteínas do Complexo Maior
de Histocompatibilidade (MHC) de classe I. Essas proteínas permitem a apresentação
de antígenos virais pela célula infectada, a qual é, então, destruída por Linfócitos T
Citotóxicos. O INF-α também possui a capacidade de estimular a produção de INF-γ
29
independentemente da IL-12, o que aumenta a função das células T e dos macrófagos
(112, 114).
O mecanismo pelo qual o Interferon exerce sua atividade antitumoral não é
bem compreendido. Acredita-se, no entanto, que exerça ação antiproliferativa em
células tumorais e modulação da resposta imune do hospedeiro, que possui papel
importante na atividade antitumoral (116).
2.7.1 Interferon e Câncer
Devido às suas propriedades de regulação da diferenciação e do crescimento
celular, os INFs têm sido usados na tentativa de tratar neoplasias.(114). Várias formas
de leucemia e tumores sólidos têm sido tratadas com INF com algum sucesso; pouco
se sabe, porém, sobre a terapia com INF contra o câncer. Mesmo antes que os INFs
recombinantes estivessem disponíveis, remissões eram publicadas com o uso de INF-
α em pacientes com “hairy-cell” leucemia(117), geralmente uma forma rara de
leucemia de células B com progressão lenta. Algum sucesso também foi atingido no
tratamento de mieloma, forma mais comum da doença nas células B(115). Em ambos
os tipos de leucemia, formas mais efetivas de terapia foram descobertas dado ao
rápido avanço no conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na geração
e progressão de algumas formas de câncer. Como consequência, os INFs não são
mais utilizados na linha de frente das terapias no tratamento dessas leucemias(118).
Em melanoma cutâneo com metástases de linfonódos locais, pode haver
beneficio com a diminuição da mortalidade e da taxa de recorrência, com melhora na
qualidade de vida, quando o INF alfa é usado em altas doses. Devido à toxicidade
associada ao uso de altas doses de INF em um intervalo longo de tempo, estudos
europeus com doses menores de INF foram utilizados. Apesar disso, nenhum dos
regimes com baixa dose resultou em sobrevivência livre de recorrência tumoral(116).
30
A propriedade antiangiogênica do INF tem sido empregada no tratamento de
hemangiomas extensos e perigosos em crianças. Esses hemangiomas geralmente
respondem a tratamentos com corticóides. Quando esse tratamento não é efetivo o
uso de INF-α por várias semanas ou meses é, todavia, eficiente (119). Na prática
clínica, o uso mais corriqueiro de INF é como agente antiviral, principalmente em
hepatites B e C. Além disso, o INF-α isolado ou em combinação com outras drogas
anticâncer, como o 5-Fluoracil, tem sido utilizado no tratamento de outras doenças
malignas, incluindo leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica, linfoma
cutâneo de células T, linfoma não-Hodgkin, câncer renal, melanoma e CHC avançado
(114, 115, 117).
Apesar de ser uma droga de eleição no tratamento das doenças hepáticas
virais, o INF apresenta resposta limitada ou até nula em alguns pacientes. Sabe-se
que sua resposta pode ser limitada pelo tipo e prognóstico da doença. Maior
entendimento do comportamento celular frente à exposição ao INF pode ajudar na
escolha de terapias para doenças hepáticas tais como o carcinoma hepatocelular.
2.7.2 Interferon e Carcinoma Hepatocelular
Ressecção cirúrgica, ablação por radiofrequência e transplante de fígado são
as opções no tratamento de pacientes com carcinoma hepatocelular (CHC), entretanto
o prognóstico é limitado devido à alta incidência de recorrência pós-operatória e
metástases (120, 121). Terapias pós-operatórias efetivas são, portanto, muito
importantes na melhoria das taxas de sobrevivência dos pacientes com CHC. Por ser
um tumor altamente vascularizado, o CHC é um forte candidato ao tratamento com
antiangiogênicos. Estudos mostram que o INFα diminui a metástase e a recorrência de
CHC devido ao seu efeito antiangiogênico, que é mediado pela baixa regulação da
expressão do VEGF(122). Estudos clínicos randomizados comprovaram a redução da
recorrência e o aumento na sobrevida dos pacientes que tiveram tratamento pós-
31
operatório com INFα, embora o mecanismo base, especialmente a reação das células
endoteliais tumorais (TECs) com o tratamento com o INFα, não esteja elucidado (122).
A metástase tumoral envolve a comunicação entre as células tumorais e as
células endoteliais. Onde a ativação das células endoteliais tem papel muito
importante durante a indução “angiogenic switch”. Ativadores de TEC, originados pelas
células tumorais ou no estroma, são receptores e ligantes de tirosina quinase como
VEGF, fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) e fatores de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF), os quais podem exercer o papel importante na
revascularização do tumor. Enquanto isso, as alterações das células endoteliais
ativadas também são muito importantes durante esse processo recíproco (122).
Recentemente foram identificados alguns genes supra-expressos em TECs de
CHC altamente metastático, o que pode ser utilizado como marcador de prognóstico
ou alvo terapêutico. Quando combinado com o Imatinibe, uma proteína tirosina
quinase inibidora de um desses genes, o efeito antitumoral do INFα foi
significativamente aumentado (123). Mudanças na expressão gênica em TECs que
recebem tratamento com INFα podem contribuir essencialmente para o efeito anti-
angiogênico e para a subsequente inibição da progressão do tumor. Estudos mostram
que INFα induz diretamente a apoptose de TECs, interfere na função homofílica de
adesão (adesão celular mediada por proteínas idênticas) e normaliza os vasos
sanguíneos do tumor. As mudanças na expressão gênica em TECs podem ser as
bases moleculares desse efeito antitumoral (122).
2.8 N-acetilcisteína
A N-acetilcisteína (NAC), que é precursora da glutationa reduzida (GSH), é
utilizada clinicamente há mais de trinta anos como mucolítico. Além da ação
mucolítica, a NAC tem sido estudada e utilizada em condições caracterizadas por um
decréscimo de GSH (Glutationa) ou estresse oxidativo, tais como HIV, câncer e
doenças cardíacas. Devido à sua atividade hepato-protetora, a NAC vem sendo
usada, via intravenosa ou oral, como tratamento do envenenamento por
acetaminofeno (124).
32
A NAC é um composto tiólico, cuja fórmula é C5H9NO3S, e seu peso molecular
é 163,2 (Figura 8). Ela é rapidamente absorvida quando administrada oralmente.
Entretanto o extensivo metabolismo de primeira pasasgem feito pelas células do
intestino delgado e do fígado resulta na incorporação da NAC em cadeias peptídicas
proteicas e na formação de uma variedade de metabólitos da NAC. Apenas uma
pequena porcentagem de moléculas de NAC intactas chega ao plasma e aos tecidos
subsequentes(125).
SH OH
NH CH3
O
O
Figura 8: Estrutura Molecular da NAC
Apenas 3% da NAC radioativamente marcada é eliminada nas fezes após a
administração oral da droga, o que indica a absorção quase completa dela e de seus
metabólitos. O pico de concentração no plasma aparece em menos de uma hora após
a administração oral. A meia-vida da NAC livre no plasma é estimada em 2,15 horas e,
virtualmente, nenhuma NAC é detectada 10-12 horas pós-administração (126).
O grupo tiol (SH) é responsável por grande parte da atividade metabólica da
NAC, enquanto o grupo ”amino acetil-substituído” torna a molécula mais estável contra
a oxidação. Resultados experimentais indicam que a maioria dos compostos contendo
o grupamento tiol no fluido gástrico é relativamente instável, mas apenas dezesseis
por cento da NAC encontrada no fluido intestinal é oxidada, enquanto a oxidação dos
outros compostos tiólicos está entre 70-75% (127).
Pesquisadores estimam que a biodisponibilidade da molécula da NAC intacta
via oral está entre quatro e dez por cento, todavia, as ligações bissulfídicas com
proteínas e a desacetilação da NAC na mucosa intestinal e no lúmen são,
provavelmente, os maiores fatores que contribuem para a aparente baixa
33
biodisponibilidade da NAC(125). Em uma administração oral, a maior parte da NAC
parece ser metabolizada em outros compostos, já que, além dos níveis de NAC total e
livre, existe um concomitante acréscimo nos níveis de compostos tiólicos proteicos e
não proteicos e de proteínas com baixo peso molecular, ligadas a tióis, encontradas no
plasma. (125, 127-129).
Os mecanismos de ação da NAC estão intimamente ligados à sua habilidade
em reduzir a cistina extracelular em cisteína, aumentar a atividade da glutationa-S-
transferase, promover a desintoxicação, agir diretamente sobre espécies reativas de
oxigênio, além de ser uma fonte de metabólitos SH e, com isso, estimular a síntese de
GSH(128).
2.8.1 N-Acetilcisteína e o Câncer
A administração de NAC pode ter um papel importante na prevenção do câncer
e na abordagem integrada do tratamento de algumas formas de câncer, contudo, a
informação nessa área ainda é preliminar. De Flora e colaboradores (1996)
investigaram o efeito da NAC no metabolismo e na biotransformação de compostos
carcinogênicos e/ou mutagênicos. In vitro, a NAC combate a mutagenicidade de
compostos de ação direta e, em altas concentrações, inibe completamente a
mutagenicidade de procarcinógenos. In vivo, a NAC pode também inibir tanto a
mutagenicidade de um grande número de compostos quanto inibir a indução de
tumores por alguns carcinógenos. Reportam ainda que, em várias condições
experimentais, o tratamento combinado doxorubicina e NAC apresentou resultados
favoráveis, de modo aparente agindo sinergicamente para reduzir a formação de
tumor e prevenir metástases (130).
Estudos, tanto in vitro quanto em in vivo, com animais têm demonstrado que a
NAC pode proteger células normais, mas não células malignas, dos efeitos tóxicos da
34
radioterapia e da quimioterapia (131). Evidências experimentais sugerem que o pré-
tratamento com a NAC diminui drasticamente a toxicidade cardíaca da doxorubicina
em camundongos. Evidências também indicam que, embora a NAC possa ajudar a
proteger contra a toxicidade resultante de raios-x ou tratamentos quimioterápicos, ela
não interfere na ação antiproliferativa do raio-x e da bleomicina (130).
2.9 Apoptose e Morte Celular
O desenvolvimento de tumores envolve um desequilíbrio nas vias de
sobrevivência e de morte celular. Muitos fármacos têm como finalidade induzir a morte
celular tanto por necrose quanto por apoptose, objetivando inibir o crescimento celular
descontrolado.
A fisiología normal e a fisiopatología, envolvidas no mecanismo de
carcinogênese hepática, apresentam mecanismos similares para iniciar a apoptose
através da ativação da via intrínseca, em resposta aos sinais intracelulares de
estresse e/ou dano ou da via extrínseca, responsável pelos acontecimentos
extracelulares. A via extrínseca inicia com a implicação de alguns dos numerosos
receptores de morte situados na superfície celular quando, sobre eles, atua o ativador
correspondente. A grande maioria dos receptores de morte envolvidos nessa via
pertencem à superfamilia do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR),
caracterizada por conter o domínio de morte (DD) (132), um domínio citoplasmático
implicado nas interações proteína-proteína.
Os receptores de morte mais conhecidos são o receptor de TNF do tipo 1
(TNFR1) e uma proteína relacionada denominada Fas. A apoptose é uma via muito
rápida e de escassa sofisticação, baseada no recrutamento de moléculas adaptadoras
através de seus DD, cuja única função é aproximar e ativar uma caspase iniciadora, a
caspase 8 ou a caspase 10 (133, 134), as quais, por sua vez, ativam (por proteólise)
as caspases executoras ou efetoras, tais como as caspases 3 e 7. Essa via de
apoptose pode ser inibida por uma proteína denominada FLIP, que se une com a pró-
35
caspase-8. Alguns vírus e células produzem FLIP e utilizam este inibidor para proteger
as células infectadas e normais da apoptose (135).
JUSTIFICATIVA
36
3 JUSTIFICATIVA
Os CHCs são tumores heterogêneos tanto em relação ao fenótipo quanto ao
genótipo. Ocorrem em fígados com doenças crônicas e a maioria evolui para cirrose
que, juntamente com a progressão do tumor, determina a morte dos pacientes sem
tratamento eficaz que não o transplante hepático. Nesse panorama de difícil manejo, a
possibilidade de uso de drogas que modulem e alterem a fisiopatologia do
desenvolvimento do CHC, utilizadas como terapêutica, oferece possibilidades
alternativas promissoras para o futuro.
Tendo em vista essas considerações, propusemo-nos a avaliar o uso da NAC,
por seu efeito hepatoprotetor, associada ao Interferon e seus efeitos anticancer, em
células tumorais de Carcinoma Hepatocelular.
37
OBJETIVOS
38
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo geral avaliar a resposta da NAC como
potencializador do efeito antitumoral do INF em linhagens celulares de carcinoma
hepatocelular humano e verificar o envolvimento da rota do NF-kB na via de ação da
NAC.
4.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar a resposta da NAC e do INF na viabilidade celular
através do metiltetrazolium (MTT) nos tempos de 24, 48, 72, 96 horas.
2. Verificar a ação potencializadora da NAC em cotratamento com
o INF na viabilidade celular através do MTT nos tempos de 24, 48, 72,
96 horas.
3. Verificar alterações no Ciclo Celular nos diferentes tratamentos
através da análise por Citometria de Fluxo com marcação de Iodeto de
Propídeo.
4. Identificar alterações na morte celular nos diferentes tratamentos
através da análise por Citometria de Fluxo com a marcação da Anexina
V e o Iodeto de Propídeo.
5. Avaliar a expressão da subunidade p65 do NF-kB nos diferentes
tratamentos.
6. Identificar o papel da via do NF-kB na ação e na resposta da
NAC através do Knock Down da subunidade p65.
39
MATERIAIS E MÉTODOS
40
5 MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização deste trabalho foram firmadas parcerias entre os laboratórios:
Centro de Terapia Gênica HCPA (Cultivo Celular e Biologia Molecular); Laboratório de
Hepatologia Experimental HCPA (Bioquimica); Laboratório do Professor Guido Lenz
Departamento de Biofísica UFRGS (Citometria de Fluxo). Este trabalho obteve
aprovação ambos os centros nos comitês de ética correspondentes em que os
experimentos foram realizados (UFCSPA - UFRGS-HCPA).
5.1 Cultivo Celular e tratamento
Este trabalho foi submetido e aprovado pelo comitê de ética e pesquisa da
UFCSPA utilizando células de hepatocarcinoma humano HepG2 (p53 +) e Huh7
(p53mutado), que foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC,
Manassas, VA, E.U.A.). Rotineiramente as células foram cultivadas como culturas de
monocamada em meio Dulbecco's Eagle, modificado suplementado com 10% de soro
fetal bovino, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), glutamina (4 mm) e
piruvato (100 lg / mL) em ambiente umidificado com 5% de CO2, a 37 º C. O meio foi
trocado a cada dois dias. As células foram mantidas em frascos de cultura T75
(75cm2) e a subcultura foi realizada uma vez por semana em um volume total de 10
mL de meio completo. Os reagentes utilizados para cultura de células são da marca
Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.) e os frascos de cultura e placas utilizados, da
marca TPP (produtos Techno Plastic, Suíça).
As Células HepG2 e Huh7 cresceram em meio completo e foram plaqueadas
nas condições adequadas para os experimentos em placas de seis poços, contendo
INF alfa 2A (BLASIEGELIND Ltda, SP-Brasil) em concentrações que variaram de 0 a
105 UI/ml e de NAC (Sigma, Brasil) em concentrações de 5mM, 10mM e de 20mM
adicionadas ao meio. O RNA de interferência para o p65 na concentração de 250mm
41
(Cell Signaling Biotechnology, Danvers, MA) foi utilizado para suprimir a via do NF-kB.
As células foram analisadas após 24, 48, 72 e 96 horas de tratamento. As células
controle (não tratadas) foram incubadas apenas com meio de cultura e com veículo.
Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
5.2 Viabilidade Celular
Para avaliar a viabilidade celular, utilizamos o reagente Metiltetrazolium (MTT-
3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide). As células foram
semeadas em placas de 96 poços na densidade de 3x104 células por poço, em um
volume total de 200L de meio.
Para determinar a viabilidade celular, as células foram tratadas com INF alfa 2A
(Blasiegelind Ltda, SP-Brasil) em concentrações que variaram de 0 a 105 IU/mL e NAC
nas concentrações de 5mM, 10mM e 20mM. As doses finais utilizadas neste trabalho,
INF 2,5x104 IU/mL e NAC 10mM, foram obtidas através de curvas de dose e tempo-
resposta previamente estabelecidas. Essas combinações de drogas foram avaliadas
por 24, 48, 72 e 96 horas através do MTT.
O MTT foi realizado conforme descrito por Denizot e Lang (1986) (136). Após a
exposição das células aos tratamentos INF, NAC, NAC+INF e siRNA, o meio foi
trocado por meio sem soro fetal bovino. O MTT foi adicionado em cada poço na
concentração de 5mg/mL. Após a adição do MTT, as células foram incubadas por
quatro horas e, ao final desse intervalo, o meio contendo MTT foi descartado e foi
adicionado DMSO para solubilizar o precipitado formado pela reação. As densidades
ópticas foram analisadas em espectro-fotômetro a 492 nm, utilizando um leitor de
placas (Zenyth 200rt Microplate Reader; Anthos, Áustria).
42
5.3 Citometria de Fluxo: Ciclo Celular e Apoptose
A análise em citometria de fluxo foi realizada para verificação da redistribuição
do ciclo celular. Células das linhagens HepG2 e Huh7 foram cultivadas a 70% de
confluência e foram tratadas com INF, NAC e NAC+INF para 48 e 72 horas. As células
foram lavadas duas vezes com tampão fosfato gelado (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM
KCl, 4,3 Na2HPO4 mM e 1,5 mM KH2PO4, pH 7,4) e tripsinizadas durante cinco
minutos. Após esse tempo, as células foram centrifugadas a 1000 rpm durante cinco
minutos. A tripsina foi aspirada, e as células foram lavadas à temperatura ambiente
com PBS duas vezes. As células foram ressuspensas e fixadas em etanol gelado, a
70%, durante uma hora a 4°C. O etanol foi aspirado e os precipitados foram lavados
com PBS gelado duas vezes. As células foram incubadas em 0,1 ml de solução de
Iodeto de Propídeo (PI, 100 mg / ml PI, EDTA 0,1 mM e 10 mg/ml RNase em PBS) no
escuro, a 4°C, durante trinta minutos. A distribuição do ciclo celular foi, então,
analisada por citometria de fluxo, usando o citômetro GUAVA. (GE Healthcare,
Piscataway, NJ, USA) utilizando GUAVA EasyCyte Software (Buckinghamshire, UK).
A apoptose foi avaliada segundo Vermes (1995), utilizando a anexina V, uma
proteína que se liga a resíduos da fosfatidilserina (PS), os quais são expostos na
superfície das células apoptóticas (137). As células foram tratadas com INF (2,5 X 104
IU/ml), NAC (10mM) e NAC+INF (10mM e 2,5 X 104 IU/ml, respectivamente), para 24,
48 e 72 horas em placas de seis poços, na densidade de 10.0000 células por poço.
Após o tratamento, as células HepG2 e Huh7 foram lavadas duas vezes com PBS e
coradas com PI e anexina V marcada com isotiocianato de fluorosceina (Apoptose e
Necrose Quantificação Kit, Biotium Hayward, CA E.U.A.) durante quinze minutos, no
escuro. As células foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo para células
PI+, PI-, anexina V + e anexina V-.
43
5.4 Expressão Proteica
A técnica utilizada para detecção da expressão da subunidade p65 foi a de
Western blot, sendo utilizado o sistema descrito por Laemmli (1970) (138) para a
eletroforese e, para o blotting, a técnica descrita por Towbin e colaboradores (1979)
(139).
Foi selecionada uma quantidade de amostra equivalente a 10 µg de proteína,
adicionou-se a solução (H2O, tris/HCl 0,5 M, DTT 1% e azul de bromofenol),
incubando-a durante cinco minutos, a 100 ºC. Posteriormente, realizou-se a
eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em tampão de eletroforese (Tris 25 mM,
glicina 0,2 M, SDS 3,5 mM; pH 8,8). Depois de separadas, as proteínas foram
transferidas para uma membrana de Polifluoruro de Vinilideno (PVDF) a fim de permitir
a sua exposição aos anticorpos. Para realizar a transferência, uma vez extraído o gel,
este foi equilibrado num tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 0,2 M e metanol
20). A transferência foi feita a 13 volts, durante 25 minutos. Para comprovar que a
transferência estava correta, introduziu-se a membrana de PVDF numa solução de
vermelho Ponceau para visualizar as proteínas totais. A membrana foi lavada com
agitação durante cinco minutos com PBS (0,14 M NaCl, 1,4 mM KH2PO4, 8 mM
Na2HPO4, 2,7 mM KCl). Depois disso, foi colocada, durante trinta minutos, em
solução de bloqueio (5% de leite em pó desnatado em PBS-Tween) em temperatura
de 37ºC.
A membrana de PVDF foi, então, incubada toda a noite a 4º C com os
anticorpos primários policlonais específicos para p65 (65 kDa) e B-Actina (42kDa).
Após esse período, ela foi lavada cinco vezes com PBS-Tween 20. Posteriormente, foi
incubada durante uma hora e meia com um anticorpo anti-imunoglobulina de coelho,
unido a HRP (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Transcorrido esse tempo, foi
novamente lavada cinco vezes em PBS-Tween 20.
44
A detecção das proteínas foi realizada por quimiluminescência utilizando um kit
comercial ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Grã-Bretanha),
imergindo a membrana durante dois minutos nesta mistura comercial. Posteriormente,
foi introduzida em um cassete junto com o filme de revelação (Amersham Hyperfilm
ECL, UK) durante, aproximadamente, dois minutos.
Depois de revelado, o filme foi secado e foram quantificadas as bandas por
densitometria, utilizando o programa Scion Image 4.02 para Windows (Scion
Corporation, Frederick, USA). Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias.
5.5 Transfecção com siRNA e silenciamento da expressão da subunidade p65 do
NFkB
Small Interference RNAs (siRNA, RNA de interferência pequeno) específicos
para o mRNA do gene p65, foram comprados da empresa Cell Signaling Biotecnology
(CA,USA) e transfectados nas células HepG2 e Huh7. Para isso, utilizamos uma
solução de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Um siRNA com o
conteúdo equivalente de nucleotídeos GC% foi utilizado como controle. As células
foram analisadas 24 horas após a transfecção siRNA através de microscopia de
fluorescência para o siRNA marcado com FTIC, para avaliar a eficiência de
transfecção. O efeito da supressão de p65 foi monitorado pela expressão dos níveis
de p65 mRNA.
5.6 Expressão do mRNA da subunidade p65 do NF-kB
Utilizamos a metodologia de PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo
real, segundo Kubista (2006), para quantificar a concentração de RNAm (140).
45
Primeiramente, foi realizada a extração e purificação do RNA da amostra,
mediante uso de um kit comercial (Promega Corporation, Madison, USA). Em seguida,
foi medida a quantidade de RNA nas amostras, mediante utilização de
espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Products, Wilmington, USA) e,
posteriormente, realizou-se a conversão a cDNA através do sistema Superscript III
cDNA Archive Kit (Invitrogen), baseado na capacidade da transcriptase reversa de
sintetizar uma cadeia complementar de DNA a partir de uma sequência molde de
RNA.
Após essa etapa, foi realizada a técnica de PCR em tempo real, de acordo com
o descrito por Mullis e Faloona, em 1987, e por Saiki e colaboradores, em 1988,
baseando-se no processo natural de replicação do DNA com amplificação cíclica. O
método consta de três etapas, sendo elas: desnaturação, anelamento e alongamento,
efetuadas de forma sucessiva em condições controladas de temperatura e tempo.
O cDNA foi amplificado, utilizando Sybr Green PCR Master mix (Applied
Biosystems, Foster City, USA) no termociclador Step One Plus (Applied Biosystems).
Em cada ensaio, foi incluído um controle vazio e um controle negativo. O número de
ciclos transcritos detectados foi normalizado com o número de ciclos para detecção do
gene constitutivo GAPDH, utilizado como housekeeping, que codifica para a Glicose-6-
fosfato desidrogenase.
Foram utilizados primers para a subunidade p65 (Forward Primer 5’-
TTGAGGTGTATTTCACGGGACC-3’ e Reverse Primer 5’-
GCACATCAGCTTGCGAAAAGG-3’) e para o GAPDH (Forward Primer 5’-
CCCATCACCATCTTCCAGG-3’ e Reverse Primer 5’-GAGATGATGACCCTTTTGGC-
3’). Esses genes foram avaliados através de ensaios de expressão Syber Green
(Applied Biosystems, Foster City, USA).
A amplificação foi realizada em termociclador StepOne Plus, real-time PCR
system (Applied Biosystems, Foster City, USA). As mudanças relativas aos níveis de
46
expressão gênica foram determinadas mediante o cálculo de 2 –ΔΔCt, tal como foi
descrito por Livak (2001) (141).
5.7 Análise estatística
Após a determinação de todos os parâmetros experimentais, foi realizada a
análise estatística através de métodos adequados ao tamanho e ao tipo da amostra,
os resultados serão expressos como média e desvio padrão para cada um dos grupos
do experimento.
O teste utilizado para análise de variância dos dados paramétricos foi o
ANOVA, para medidas repetidas de um mesmo grupo e entre grupos diferentes, a fim
de comparar as diferenças observadas em cada parâmetro estudado, seguido do teste
Student-Newman-Keuls. Para análise dos dados não paramétricos, foi utilizado o teste
de Mann Whitney. Para análises de apenas dois grupos, foi utilizado o teste “t” de
Student.
Consideramos diferença estatisticamente significativa entre as variáveis
estudadas o nível de significância de pelo menos 5% (p<0,05).
47
RESULTADOS
48
6 RESULTADOS
6.1 Avaliação da Viabilidade Celular
Analisando a tabela 2 e as figuras 9 A/B, mostramos que o INF reduziu
significativamente a viabilidade somente após 72 horas em ambas as linhagens
testadas, sendo a linhagem Huh7 mais sensível do que a linhagem HepG2. A NAC
mostrou-se mais citotóxica do que o INF, diminuindo a viabilidade celular já em 24h
em Huh7 e, 48 horas, em HepG2. Apesar dessa sensibilidade diferencial tempo-
específica, o efeito final da NAC (em 72 e 96h) foi semelhante para as duas linhagens.
Tabela 2: Efeito do INF, da NAC e da NAC+INF sobre a viabilidade celular das duas linhagens estudadas em diferentes tempos
Horas 24 48 72 96
HepG2 Huh7 HepG2 Huh7 HepG2 Huh7 HepG2 Huh7
CO 100 100 100 100 100 100 100 100
INF (2,5x104) 98 98 97 94 83
a 82
a 81
a 74 ª
NAC (10mM) 98 85 93b 83
b,d 82
b 82
b 70
b 63
b
NAC+INF 94 94 78c 71
c 74
c 57
c,d 58
c 58
c
Resultados expressos em média da porcentegem em relação ao controle. INF (2,5x104), NAC (10mM)
a-INF x CO p<0,05
b- NAC x CO p<0,01
c- NAC+INF x INF p<0,05
d-HepG2 X Huh7 p<0,05
49
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96
hours
% o
f via
bilit
y ce
lls
CO
IFN
NAC
NAC+IFN
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96
hours
% o
f vi
abili
ty c
ells
CO
IFN
NAC
NAC+IFN
Figura 9 - NAC potencializa o efeito do Interferon, diminuindo a viabilidade celular em ambas as
linhagens estudadas. Células HepG2 (A) Huh7 (B), tratadas com IFN ou NAC (2.5x104 IU/mL e 10mM,
respectivamente), diminuição significativa da viabilidade celular em 48, 72, e 96 horas de tratamento. O
tratamento da NAC+IFN reduz significativamente a viabilidade celular em 48, 72 e 96 horas de
tratamento.
a-IFN x CO p<0,05
b- NAC x CO p<0,01
c- NAC+IFN x IFN p<0,05
a,b,c a,b,c
b,c
a,b,c a,b,c
b,c
A
B
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
horas
horas
50
6.2 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF no Ciclo Celular e na Apoptose
Ao avaliar a distribuição do Ciclo celular, não observamos alterações em
ambas as linhagens celulares e tratamentos (Figuras 10 e 11, Tabelas 3 e 4).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
CO INF NAC NAC+INF
G2
S
G1
Sub-G1
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
CO INF NAC NAC+INF
G2
S
G1
Sub-G1
Figura 10: Avaliação da distribuição do ciclo celular através da citometria de fluxo. Células HepG2
(A) Huh7 (B) foram tratadas com INF NAC e NAC+INF (2,5x104 e 10mM, respectivamente) por 48 e 72
horas. A distribuição do ciclo celular foi então analisada por citometria de fluxo usando o citômetro
GUAVA. Resultados expressos em média e erro padrão da média.
A
B
51
Figura 11: Histograma da distribuição do Ciclo Celular As células foram tratadas com INF(I), NAC (N)
e NAC+INF (2,5x104
e 10mM, respectivamente, N+I) por 48 horas. A distribuição do ciclo celular foi,
então, analisada por citometria de fluxo usando o citômetro GUAVA.
Tabela 4: Distribuição do Ciclo Celular Huh7 48 horas
MÉDIA Sub-G1 G1 S G2
CO 3,5 45,6 11,6 39,3
INF 8,4 44,7 13,4 33,5
NAC 6,0 42,0 10,0 42,0
NAC+INF 4,8 45,9 13,4 36,0 Desvio Padrão Sub-G1 G1 S G2
CO 3,5 3,4 3,0 2,3
INF 9,6 8,2 5,9 4,5
NAC 1,8 2,2 1,2 2,7
NAC+INF 3,4 4,0 2,5 3,1
Tabela 3: Distribuição do Ciclo Celular HepG2 48 horas
MÉDIA Sub-G1 G1 S G2
CO 1,1 54,0 7,6 37,2
INF 2,9 50,9 9,6 36,6
NAC 8,2 47,5 7,8 36,5
NAC+INF 9,1 47,8 10,1 33,1 Desvio Padrão Sub-G1 G1 S G2
CO 1,4 12,0 4,4 7,8
INF 4,5 5,2 3,7 3,0
NAC 4,0 1,4 2,3 4,3
NAC+INF 15,0 10,4 2,9 8,1
52
As tabelas 3 e 4 sumarizam as porcentagem de células distribuídas em cada
faze do ciclo celular Os resultados acima são expressos em média e desvio padrão da
média, sendo os experimentos realizados em triplicata.
Avaliamos o envolvimento da indução de apoptose pela marcação com anexina
V. O INF induziu a marcação com anexina de ambas as linhagens celulares em 48 e
72 horas de tratamento (Figuras 12A e 12C, Tabela 5), mas em níveis mais elevados
observados nas células Huh7, fato que apresentou um ligeiro aumento da
sensibilidade também no MTT (Figura 9 e Tabela 2).
Tabela 5: Análise da Anexina V por citometria de fluxo
HepG2 Huh7
LL LR UL UR LL LR UL UR
CO 82,5 9,6 7,7 0,24 CO 85,3 12,1 2,5 0,1
48 hours INF 38,2 8,9 42,8 4,04 INF 21,3 11,3 55,4 2,0
NAC 83,2 9,2 6,9 0,81 NAC 49,9 15,9 32,1 2,2
NAC+INF 38,4 8,7 49,4 3,51 NAC+INF 28,4 17,0 53,0 1,6
CO 87,0 8,4 4,3 0,33 CO 79,4 10,6 9,6 0,4
72 hours INF 53,2 11,7 34,4 0,81 INF 32,5 12,0 54,0 1,5
NAC 78,8 8,3 11,9 0,92 NAC 33,3 11,9 38,7 0,7
NAC+INF 40,1 10,7 46,4 2,85 NAC+INF 40,4 15,4 43,3 0,9
Quadrante LL, Low Left; esquerdo inferior, (PI – Anexina -), quadrante LR, Low Right; direito
inferior, (PI + Anexina -), quadrante UL, Up Left; esquerdo superior, (anexina V+), quadrante
UR, Up Right; direito superior, (PI+Anexina V+). Os resultados acima são expressos em média e
correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em
triplicata.
A NAC induziu a marcação com anexina em 48 horas nas células Huh7, mas
não nas células HepG2 (Figuras 12A, 12B, 12C, 12D e 12E), entretanto a NAC
induziu a marcação com anexina já em 24 horas (Figuras 12A e 12E). Embora a NAC
potencialize o efeito do INF, reduzindo a viabilidade celular, ela não aumentou a
marcação com a anexina em relação ao INF (Figuras 12B e 12D).
53
Figura 12 A: Análise de morte celular com marcação para apoptose com Anexina V (Fluorescência
verde, eixo Y) e morte com PI (Fluorescência vermelha, eixo X) nas células HepG2, Quadrante LL,
Low Left; esquerdo inferior, (PI – Anexina -), quadrante LR, Low Right; direito inferior, (PI + Anexina -),
quadrante UL, Up Left; esquerdo superior, (anexina V+), quadrante UR, Up Right; direito superior,
(PI+Anexina V+). – HepG2.
HepG2
0
20
40
60
80
100
CO INF NAC NAC+INF CO INF NAC NAC+INF
% d
e C
élu
las
IP/An -
An +
IP+ e IP/An+
Figura 12 B: Análise de morte celular HepG2. Marcação para apoptose com Anexina V e morte com PI
em 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média e
correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em
triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância:
a-INF x CO p<0,05
b- NAC x CO p<0,05
c- NAC+INF x CO p<0,05
d- NAC x INF e NAC+INF p<0,05
48 horas 72 horas
a
b,d
c
a
d
c
54
Figura 12 C: Análise de morte celular com marcação para apoptose com Anexina V (Fluorescência
verde, eixo Y) e morte com PI (Fluorescência vermelha, eixo X) nas células Huh7, Quadrante LL,
Low Left; esquerdo inferior, (PI – Anexina -), quadrante LR, Low Right; direito inferior, (PI + Anexina -),
quadrante UL, Up Left; esquerdo superior, (anexina V+), quadrante UR, Up Right; direito superior,
(PI+Anexina V+). – Huh7.
Huh7
0
20
40
60
80
100
CO INF NAC NAC+INF CO INF NAC NAC+INF
% d
e C
élu
las
IP/An -
An +
IP+ e IP/An+
Figura 12 D: Análise de morte celular Huh7. Marcação para apoptose com Anexina V e morte com PI
em 48 e 72 horas de tratamento. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média e
correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados em
triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância:
a-INF x CO p<0.05
b- NAC x CO p<0.05
c- NAC+INF x CO p<0.05
48 horas 72 horas
a
b
c a b
c
55
HepG2 24h
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CO INF NAC NAC+INF
% d
e C
élu
las
IP/An -
An +
IP+ e IP/An+
Figura 12 E: Análise de morte celular HepG2 24 horas. Marcação para apoptose com Anexina V e
morte com PI 24 horas de tratamento. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da
média e correspondem à porcentagem de células em cada quadrante, sendo os experimentos realizados
em triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância:
a- NAC x CO e INFp<0,05
b- NAC+INF x CO e INF p<0,05
6.3 Avaliação dos efeitos da NAC e do INF na expressão da subunidade p65
Na figura 13, demonstramos que a NAC, mas não o INF, diminui
significativamente a expressão da subunidade p65 após 72 horas de tratamento. O co-
tratamento com NAC mais INF diminui a expressão da subunidade p65
significantemente em ambas as linhagens.
a b
56
0
20
40
60
80
100
120
CO INF NAC NAC+INF
% d
o c
on
tro
le
HepG2
Huh7
Figura 13: Avaliação da expressão do p65 por Western Blot. (A) Para a análise por immunoblotting:
105 células foram em placas de 6 poços. As células foram tratadas por 72 horas (INF 2,5 x10
4 U / mL e
NAC 10mM). (B) A densidade das bandas. Resultados representativos de três experimentos
independentes. Os resultados acima são expressos em média e erro padrão da média, sendo os
experimentos realizados em triplicata. As notações sobrescritas têm a seguinte significância:
a- NAC x CO p<0,05
b- NAC+INF x CO x INF x NAC p<0,01
6.4 Envolvimento do NF-kB na resposta da NAC em células de CHC
Para avaliar o envolvimento do NF-B na via de ação da NAC nas linhagens
estudadas, através do silenciamento da subunidade p65 do NF-B, utilizamos siRNA
para o p65 com eficiência de transfecção, por meio de microscopia de fluorescência de
85-95% (Figura 14A) . Ao final de 24 horas, após a transfecção, mais de 95% das
células apresentaram silenciamento do mRNA p65, observado por PCR em tempo
real. (Figura 14B).
a
b
A
B
57
Figura 14A: Eficiência de transfecção com siRNA. Marcação do siRNA com FTC, 24 horas após a
transfecção. Aumento de 100X
0
20
40
60
80
100
1 2
Qu
an
tifi
cação
Rela
tiva (
dR
N)
CO siRNA
siRNA p65
Figuras 14B: Silenciamento da subunidade p65 do NF-kB. Expressão do mRNA da subunidade p65
por PCR em tempo real nas células HepG2 e Huh7, 24 horas após a transfecção. Resultados expressos
em média e erro padrão da média. As notações sobrescritas têm a seguinte significância:
a-siRNA p65 x COsiRNA p<0,01 (HepG2)
b- siRNA p65 x COsiRNA p<0,01 (Huh7)
O tratamento de 24 horas com NAC e INF, após uma exposição por 24 horas
com siRNA não específico, resultou em diminuição significativa da viabilidade celular.
Quando utilizamos o siRNA específico para a subunidade p65, observamos uma
redução também significativa em relação ao controle. Quando tratamos as células com
HepG2 Huh7
a b
58
siRNA específico para a subunidade p65 com a NAC, o resultado de inibição é igual
ao do siRNA não específico com a NAC, ambos levando à maior redução da
viabilidade celular em relação ao controle (Figura 15), demonstrando, assim, a
especificidade de ação NAC pela via do NF-B.
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CO siRNA CO siRNA+NAC siRNAp65 siRNA p65+INF siRNA p65+NAC
10mM
siRNA
p65+NAC20mM
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CO siRNA CO siRNA+NAC siRNAp65 siRNA p65+INF siRNA p65+NAC
10mM
siRNA
p65+NAC20mM
% d
e cé
lula
s vi
ávei
s
Figura 15: Efeito do INF e da NAC na viabilidade das células com silenciamento da subunidade
p65. Células HepG2 (A) Huh7 (B) foram tratadas 24 horas após a transfecção (INF 2,5x104 U/mL and
NAC 10 e 20mM). A viabilidade celular foi determinada após 24 horas de tratamento. Resultados
expressos em média e erro padrão da média. As notações sobrescritas têm a seguinte significância:
a- COsiRNA+NAC x COsiRNA x siRNAp65 p<0,01
b- siRNAp65 x COsiRNA x siRNAp65+IFN p<0,05
c- siRNAp65+IFN x COsiRNA x COsiRNA +NAC x siRNAp65 x siRNAp65+NAC (10 and 20mM) p<0,05
c
b a
c
b
a
59
DISCUSSÃO
60
7 DISCUSSÃO
O CHC é uma doença de múltiplas etapas que pode levar anos para evoluir da
iniciação até a metástase. Como consequência, existem várias etapas em que a
prevenção desses mecanismos fisiopatológicos pode bloquear a progressão
neoplásica. Alguns mecanismos propostos para quimioprevenção do CHC incluem a
inibição de crescimento celular e a indução de apoptose, como demonstrado em nosso
trabalho.
O INF é uma molécula capaz de reduzir a incidência de focos pré-neoplásicos
e cânceres em modelos experimentais de câncer hepático (142, 143). Em
experimentos in vitro, tem-se relatado o uso do INF para inibir o crescimento de uma
variedade de células cancerosas, incluindo as do mieloma múltiplo, câncer de ovário e
câncer de fígado (112, 116). Um dos mecanismos envolvidos no efeito inibitório do INF
nessas células envolve as cascatas de apoptose, onde a elucidação, até o momento,
inclui a indução da proteína p53 e, consequentemente, a ativação da via das caspases
(122, 144). Em contrapartida, outros relatos demonstram que o crescimento das
células tumorais do fígado não foi afetado e que, com a adição de diversas doses de
INF (142, 145, 146), não se observou aumento na apoptose. Esses resultados
conflitantes sobre a sensibilidade das células tumorais de fígado ao INF podem ocorrer
devido a diferentes condições experimentais, tais como diferenças na sensibilidade
das linhagens celulares ou diferenças nos protocolos de tratamento.
Na tabela 2 e na figura 9 em nossos resultados, verificamos que após 24 horas
de experimento nenhum dos tratamentos foi capaz de diminuir a viabilidade celular,
porem as células tratadas com NAC esboçaram diminuir a viabilidade celular nas
linhagens estudadas, o que se confirma logo na avaliação seguinte após 48 horas de
tratamento. Estes achados podem corresponder aos efeitos moduladores da NAC em
curto período de exposição, relacionados a sinais mitogênicos, ou longo período de
61
exposição.relacionados a reguladores de diferenciação celular e também de processos
imunomediados (147).
Nossos resultados, ilustrados na figura 9, com IFN na dose de 2,5 x 104 U/mL,
mostraram uma estreita relação com a resposta clínica, em que os pacientes que
realmente respondem ao tratamento são cerca de 30% (148). Esses dados ilustram
uma resposta limitada nessas células, já que o INF reduziu a viabilidade celular,
através do MTT, somente 72h após o tratamento. Em ambas as linhagens celulares
obtivemos um perfil similar de resposta, apesar de que nas células Huh7 houvesse
ligeiro aumento na sensibilidade. Ainda na figura 9, como citado anteriormente,
podemos observar que a NAC reduz a porcentagem das células viáveis, através do
MTT, 48 horas após o tratamento em ambas as linhagens celulares com um perfil
similar, observamos novamente que nas células Huh7 houve um ligeiro aumento na
sensibilidade, demonstrando, mesmo que não significativa, uma pequena diferença já
24 horas após o tratamento.
A diminuição na viabilidade celular representada na figura 9 pelo cotratamento
da NAC com o INF demonstra como os tratamentos agindo em tempos diferentes
podem favorecer a diminuição da viabilidade celular, sendo o tratamento com a NAC
responsável pela antecipação da resposta no cotratamento e manutenção deste efeito
com concomitância com o INF nos demais tempos de experimento.
Alisi e colaboradores (2009) demonstraram que dependendo da dose, tanto o
H2O2, que é um metabólito do oxigênio extremamente deletério e conhecido indutor de
apoptose, quanto a NAC induzem respostas celulares diferentes em duas diferentes
linhagens de hepatoma. O H2O2 foi capaz de parar resposta proliferativa
proporcionalmente à sua concentração, considerando que a apoptose foi induzida
somente quando utilizado em uma dosagem de 5 mM. No entanto a NAC aumentou a
síntese de DNA mas também com um aumento significativo da apoptose em doses de
6 mM. Não é surpreendente que, embora a NAC seja precursora da glutationa e
varredora de radicais livres, alguns estudos mostrem que concentrações distintas de
NAC podem agir como pró-oxidantes induzindo estresse oxidativo, desequilíbrio redox
e apoptose Por outro lado, a capacidade antiproliferativa da NAC ainda não está
documentada em hepatócitos(147, 149). Para este fenômeno biológico, a capacidade
regenerativa do fígado é estritamente ligada ao equilíbrio entre a proliferação celular e
a apoptose, e vários agentes (ácido retinóico, por exemplo) em momentos e
62
concentrações específicas podem atuar como agentes citostáticos para manter este
equilíbrio (150).
Estudos demonstraram tratamentos que agem como facilitadores e como
potencializadores de outras drogas no combate ao CHC (5-FU, Ribavirina, INF,
Sorafenib). Um exemplo clínico é o uso da Ribavirina (151), que possui uma rota de
ação diferente do INF, facilitando e aumentando a resposta ao tratamento com o INF
em pacientes infectados com o VHC. O efeito sinérgico de drogas, como um análogo
de pirimidina o 5-fluoracil (5-FU) e o INF, já foi demonstrado, a resposta, entretanto, é
limitada e as consequências do uso de quimioterapia tornam-no apenas razoável,
devido às complicações dessa associação (152). Em nosso estudo, foi demonstrada
uma resposta aditiva e potencializadora da NAC com o INF, sugerindo que NAC e INF
possuam rotas de ação diferentes, sendo a NAC mais eficiente que o INF nessas
doses e nessas linhagens celulares como observado na tabela 2 e na figura 9.
Como descrito em estudos relacionados com o papel antiproliferativo de
compostos com propriedade antioxidantes, como a NAC, a capacidade de suprimir o
crescimento de células cancerosas pode estar associada ao bloqueio da progressão
do ciclo celular nos checkpoints (153). Os checkpoints do ciclo celular e a apoptose
possuem importante papel na patogênese molecular do câncer e podem influenciar
diretamente o resultado das quimio e radioterapias (154). A indução da morte celular e
a modulação do ciclo celular são potenciais vias para combater o desenvolvimento das
células cancerígenas (155).
Diferentemente de outras linhagens celulares e de outros estudos, em nosso
trabalho (figuras 10 A/B e 11 e tabelas 3 e 4) não foram observadas alterações
significativas na distribuição do ciclo celular em ambas as linhagens celulares e
tratamentos (149, 156). Ao observar a figura 10 nos deparamos com um pequeno
aumento na fase de Sub-G1, fase na qual evidenciaríamos aumento na fragmentação
do conteúdo de DNA nas células analisadas por citometria de fluxo, o que nos levaria
a relacionar esse achado com aumento de células em processo de apoptose.
Observando as tabelas 3 e 4 nos deparamos com os dados que demonstram um
tendência em aumentar o numero de células na fase Sub-G1, na linhagem HepG2
melhor ilustrado pelos tratamentos com NAC e na linhagem Huh7 pelo tratamento com
IFN, ambos após 48 horas de experimento, porem não significativos.
63
Menon e colaboradores (2007) demonstraram que a NAC pode modular o ciclo
celular em fribroblastos NIH3T3, todavia na dose de 20mM. Neste trabalho, assim
como no de Kim e colaboradores (2001), observamos como o estado redox celular
pode regular o ciclo celular (156, 157). As Espécies Reativas do Oxigênio (ERO) são
geradas pelo metabolismo celular e por agentes exógenos. Embora as ERO possam
promover diminuição no crescimento celular, elas também podem atuar como
moléculas sinalizadoras para processos que conduzam à proliferação celular (156).
Para proliferar e expandir em um ambiente com nutrientes limitados, as células
cancerosas cooptam por vias celulares regulatórias que facilitam a adaptação e,
assim, mantêm o crescimento do tumor e o potencial de sobrevivência. A modulação
do estado redox celular pode regular as cascatas que envolvem o controle do ciclo
celular. A utilização da NAC como antioxidante ou antiproliferativo, em diversas
concentrações e ou formulações, faz com que a modulação do estado redox celular
possa ser regulado pela NAC em diferentes situações experimentais já propostas por
diversos autores (38, 142, 153, 157-160).
Sendo a NAC uma molécula varredora de radicais livres e moduladora da
ativação de fatores de transcrição, envolvida na manutenção do ciclo celular,
constatamos nas figuras 10 A/B e 11 e tabelas 3 e 4 que não foi encontrada alteração
na distribuição das fases que compreendem o ciclo celular em qualquer uma das
condições experimentais analisadas, o que pode estar relacionado com o mecanismo
de morte celular envolvido na inibição da viabilidade celular pela NAC e pelo Interferon
nas condições experimentais analisadas. Há, entretanto, necessidade de outros
estudos para confirmar o envolvimento da NAC na regulação do ciclo celular, já que a
meia-vida dos oxidantes e antioxidantes pode variar de acordo com o metabolismo
celular e assim interferir nos mecanismos proliferativos regulados pelo ciclo celular
(156, 161).
A NAC é amplamente utilizada nas ciências básicas para manipular uma
grande variedade de reações de oxi-redução (redox) e processos de sinalização
sensíveis ao estado redox celular, incluindo a ativação e a inibição de fatores de
transcrição redox-sensíveis como o NF-kB, a proteína ativadora (AP-1) e os mitógenos
ativados por kinases (MAPK) (157). Embora haja uma suposição geral que permeia
64
essas rotas redutoras, a NAC afeta estados redox intracelulares, mas os mecanismos
exatos da ação redutora da NAC não estão completamente compreendidos.
A resistência à apoptose é uma das fundamentais características do câncer,
sendo a indução seletiva de apoptose em células de câncer uma excitante
possibilidade para o desenvolvimento seletivo de futuras terapias para o tratamento do
CHC (162-164). Em nosso trabalho, como demonstrado na tabela 5 e na figura 12 A-
D, o INF foi capaz de induzir apoptose em 48 e em 72 horas, porem na avaliação de
48 horas observamos que a porcentagem média de células marcadas com anexina é
maior que a marcação em 72 horas, demonstrado que o INF na dose de 2,5 x104
possui tempo de resposta específico, com diminuição gradual em ambas as linhagens.
Por outro lado, a NAC (10mM) induziu a marcação com anexina em 48 horas nas
células Huh7, mas não nas células HepG2, nas quais ocorreu em período menor de
tratamento, pois a NAC induziu a marcação com anexina já em 24 horas. Isso sugere
a ação por diferentes mecanismos de morte celular e também a inibição de
crescimento nessas linhagens celulares, e que esses mecanismos têm relação
concentração e tempo/resposta diretamente envolvidos com o metabolismo
proliferativo celular.
Sabendo que citotoxidade é um parâmetro importante em relação à utilização
de drogas, devemos salientar a utilização da NAC em células não tumorais. A NAC é
conhecida por induzir a apoptose em fibroblastos embrionários transformados, mas
não em fibroblastos embrionários normais de camundongos. Essa especificidade de
células transformadas torna-se extremamente relevante quando observamos o
microambiente tumoral, onde possuímos células adjacentes ao tumor e que são de
suma importância para funcionalidade do fígado e em conseqüência para todo o
organismo. Estes dados também têm sido observados em células de origem humana,
embora o mecanismo subjacente dos efeitos anticancerígenos da NAC não esteja
totalmente compreendido (149, 153). A interação da NAC com as células tumorais e
não tumorais pode estar relacionada com o metabolismo celular característico e
distinto entre estas células.
A NAC possui o grupamento tiol como antioxidante, sendo capaz de induzir
apoptose em fibroblastos transformados e também em linhagens de células tumorais,
mas não em fibroblastos normais ou em queratinócitos. Em células HeLa, o RNA do
65
gene que regula a cascata de apoptose, o p53 é expresso, mas não encontramos a
sua proteína, o que demonstra que a NAC é capaz de induzir apoptose
independentemente da presença ou ausência da proteína p53, que é uma
característica da grande maioria dos tumores (165). Dentre as linhagens celulares
utilizadas, a HepG2 tem a característica de possuir a p53 funcional, mas a linhagem
Huh7 apresenta uma mutação no gene p53, possuindo, assim, uma proteína
defeituosa. Geralmente se acredita que a presença do p53 facilitaria a indução da
apoptose pela NAC (149, 166). Contudo, em nosso estudo, demonstramos que o
tratamento com NAC leva à apoptose tanto em células HepG2 como em células Huh7.
Podemos observar os dados brutos na tabela 5, os plots gerados pela análise do
citômetro de fluxo e os histogramas com as respectivas barras de erro padrão da
média na figura 12 A-E.
Observamos ainda, nas figuras 12 A-D, que o INF possui resposta similar a
encontrada nos experimentos com MTT na figura 9, sugerindo que, onde constatamos
diminuição da viabilidade celular apenas após 72 horas de experimento, seja uma
conseqüência do aumento da apoptose em 48 horas de experimento. Da mesma
forma encontramos nas figuras 12 A-E resultados que corroboram os experimentos da
figura 9 para o tratamento com a NAC, onde o aumento da apoptose já em 24 horas
na linhagem HepG2 se reflete na diminuição da viabilidade celular em 48 horas após o
tratamento na figura 9. Dados estes que vão ao encontro com outros estudos onde a
diminuição do numero de células é acompanhado pelo aumento de apoptose (144,
147, 167, 168). Embora a NAC potencialize o efeito do INF reduzindo a viabilidade
celular (figura 9), ela não aumentou a marcação com a anexina em relação ao INF,
sugerindo que esses compostos possam agir em momentos diferentes, 24 e 48 horas,
e não exerçam efeito direto através da morte de células apoptóticas (figura 12),
envolvendo reguladores da proliferação e morte celular com o NF-kB.
Sabe-se que vários carcinógenos e promotores tumorais agem pela ativação
do NF-kB, que a expressão constitutiva do NF-kB é frequentemente encontrada em
células neoplásicas, que a ativação do NF-kB induz à resistência das células
neoplásicas a agentes quimioterápicos e radiação, que vários genes envolvidos na
iniciação, promoção e progressão tumoral são regulados pelo NF-kB e que a ativação
do NF-kB pode suprimir a apoptose e promover a proliferação celular (169). Baseados
nestas premissas buscamos avaliar a expressão do NF-kB nos tratamentos estudados
66
Por meio dos dados obtidos em nosso estudo na figura 13, confirmamos achados de
trabalhos anteriores que demonstraram diminuição na expressão da subunidade p65
em estudos in vitro e in vivo, utilizando tratamentos com NAC(170-172). Por outro lado
na dose de 2,5x104 utilizada em nosso estudo e ilustrada na figura 13 A/B, o INF não
diminuiu a expressão da subunidade p65 do NF-kB, em contraponto com a literatura
(14, 34, 70, 77, 104, 130, 173, 174). Podemos constatar ainda que o cotratamento da
NAC com o INF diminuiu mais a expressão da subunidade p65 do NF-kB após 72
horas de experimento que nos tratamentos individuais, como demonstrado na figura
13 A/B. Estes resultados possivelmente estão relacionados com envolvimento da NAC
na modulação de mediadores inflamatórios responsáveis pela regulação da resposta
imune (128, 175).
O método que utilizamos nesta análise foi a expressão da subunidade p65 do
NF-kB pela técnica de Western Blot, que possibilita a extrapolação dos resultados da
figura 13 A/B relacionando a diminuição da expressão com a inativação deste fator de
transcrição. Muitos estudos demonstram o envolvimento do NF-kB com o
desenvolvimento tumoral, contudo é controverso o papel da NAC e também do INF na
resposta de células tumorais. Estes estudos, porem, são realizados em condições
experimentais distintas o que dificulta a compreensão destes mecanismos que são
simultâneos, pois a biodisponibilidade da NAC esta relacionada com o metabolismo
celular e em diferentes respostas frente ao período de exposição, curto ou longo (114,
122, 147).
Como já foi citado anteriormente, nas situações de mobilização da viabilidade
celular, o NF-kB encontra-se ativado, dissociado da sua proteína inibitória, o IkB,
transduzindo ao núcleo e ativando inúmeros genes de sobrevivência celular e
inflamatórios. Para elucidar os mecanismos de ação envolvidos na resposta da NAC
nas células de CHC e no efeito potencializador envolvido na resposta do cotratamento
com o INF, utilizamos um RNA de interferência, responsável pela degradação do RNA
gene específico para a subunidade p65 do NF-kB. Avaliações essas sugeridas como
rota de ação por estudos que relataram a NAC como inibidor da via do NF-kB,
possivelmente devido à sua ação na inativação da via do NF-kB, sensível ao estresse
oxidativo e à resposta inflamatória (171, 176). A utilização desta ferramenta dá suporte
para o teste de hipóteses envolvendo um rota ou mobilização gene específica.
Inúmeros são os estudos que utilizam a ferramenta de silenciamento gênico para
67
elucidar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos em determinadas doenças(149,
177, 178).
Em nosso estudo, após transfectar as células com siRNA para a subunidade
p65 do NF-kB e realizar a confirmação das transfecções por microscopia de
fluorescência, como demonstrado na figura 14A, avaliamos a expressão dos níveis de
RNA mensageiro da subunidade p65 através da reação em cadeia de polimerase em
tempo real, 24 horas após as linhagens celulares serem transfectadas com o siRNA,
na figura 14B. Com a confirmação do silenciamento (Knock down) da subunidade p65,
inviabilizamos a utilização desta via de transcrição pelas células utilizadas no estudo.
Trabalhos relacionam a NAC com a inibição do NF-kB e realizam a expressão
das proteínas relacionadas com a ativação do fator de transcrição, não confirmando e
não refletindo uma relação direta com a resposta da utilização da NAC (150, 179,
180). Em nossos experimentos, na figura 14 A/B, obtivemos o silenciamento da
subunidade p65 do NF-kB em ambas as linhagens celulares. Recentemente Wu e
colaboradores (2010) descreveram o envolvimento da subunidade p65 na proliferação
de células da linhagem HepG2, demonstrando que nas células tumorais de fígado a
subunidade p65 tem sua expressão aumentada comparada à células normais da
linhagem LO2. Neste mesmo estudo foi utilizado siRNA para a subunidade p65 do NF-
kB e a avaliação da expressão no mesmo período de tratamento de nosso estudo.
Esses dados vão ao encontro dos resultados da figura 13 A/B obtidos tanto em células
da linhagem HepG2 quanto em células da linhagem Huh7 e tratadas com a NAC.
Outro resultado de Wu (2010) com siRNA pode ser corroborado com os experimentos
realizados em nosso estudo. O silenciamento da subunidade p65 confirmado pela
diminuição da expressão da subunidade p65 do NF-kB vai ao encontro dos dados
obtidos no tratamento com a NAC, nas figuras 13 A/B e 14 A/B, onde foi demonstrada
uma diminuição da expressão da subunidade p65 do NF-kB concomitante com
aumento da apoptose (177).
A fim de avaliar se a NAC tinha a mesma resposta e a mesma via de ação das
células silenciadas para a subunidade p65, tratamos, então, essas células com a NAC
e observamos que apresentaram a mesma resposta, como demonstrado nas figuras
15 A/B. Para esta avaliação salientamos os seis tratamentos utilizados nas células
68
transfectadas; dois utilizando o controle de transfecção, com o siRNA não específico e
quatro com o siRNA alvo.
Demonstramos que a transfecção com o siRNA para a subunidade p65 diminui
a viabilidade celular na mesma proporção que as células transfectadas com o controle
de transfecção e tratadas com a NAC. Por outro lado, na figuras 15 A/B, quando
tratamos as células transfectadas com o siRNA para a subunidade p65 com a NAC,
seja na dose de 10mM ou 20mM, não observamos diferença em relação às células
transfectadas com o siRNA para a subunidade p65 sem os tratamentos com a NAC.
Esses resultados sugerem que se o RNA mensageiro está silenciado e,
consequentemente, a proteína da subunidade p65 do NF-kB não está expressa, a
NAC não teria alvo ação, indicando necessariamente mobilização desta via para ação
da NAC nas linhagens celulares estudas.
Neste panorama a utilização de um composto como a NAC na modulação de
um fator de transcrição, como o NF-kB, traz a possibilidade de combinar os
mecanismos envolvidos no desenvolvimento tumoral com alvos moleculares.
Quando analisamos, nas figuras 15 A/B, a viabilidade das células transfectadas
com o siRNA para a subunidade p65 e tratadas com INF, fomos confrontados com o
aumento da resposta, ou seja, diminuição da viabilidade celular, sendo esta a mesma
resposta observada para o cotratamento da NAC com INF em células não
transfectadas. Estudos demonstram o envolvimento do NF-kB na resposta celular
frente ao tratamento com o INF. A modulação, contudo, não é específica, podendo,
assim, outras vias estarem envolvidas nas interações com o INF (14, 178, 181-185).
Essas interações explicariam por que o INF é um imunomodulador que se relaciona
com o NF-kB através da resposta imune (14, 178, 181-184). Assim, nas figuras 9 e 12
A-E, o efeito aditivo na supressão do crescimento celular, através da diminuição da
viabilidade celular e o aumento da apoptose demonstrado pelo nosso estudo usando o
cotratamento da NAC com o INF, é atribuível à inibição da via do NF-kB, já que possui
relação direta com a presença da proteína subunidade p65 do heterodímero do NF-kB.
O balanço entre a proliferação e a morte celular é fator determinante na
progressão ou inibição do processo de carcinogênese. Uma grande variedade de
mecanismos pode ser ativada ou inativada para induzir apoptose (149, 161, 163, 186).
Moléculas antioxidantes, como a NAC, apresentam a capacidade de desencadear
69
vários desses mecanismos em diferentes tipos de linhagens de tumores humanos
(171, 187). Um desses mecanismos refere-se à hiper-regulação de genes pró-
apoptóticos aliado à hiporregulação de genes inibidores de apoptose, muitas vezes
acompanhado do aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial e da
liberação do citocromo c, ativando a cascata das caspases. Todos esse eventos são
regulados pela ativação ou inativação do NF-kB (150, 163, 186).
Em nosso estudo, ilustrado nas figuras 12 A-E, utilizou-se a NAC como um
potencial regulador da morte celular, tendo em vista que ela demonstrou ser capaz de
induzir apoptose em algumas linhagens tumorais(188). O seu papel e o seu efeito
associado ao INF em células de câncer hepático eram até então desconhecidos. A
principal observação do nosso estudo foi que a NAC pode inibir a viabilidade das
células de carcinoma hepatocelular humano, HepG2 e Huh7, através do bloqueio da
via do NF-kB, demonstrado no ensaio de MTT (figura 9), marcação com anexina V
(figura 12 A-E), down regulation da expressão proteica da subunidade p65 (figura13
A/B) e do silenciamento da subunidade p65 (figura 14 A/B). Além disso, mostramos
que a NAC foi mais eficiente em reduzir a viabilidade celular que o INF, de acordo com
o perfil das linhagens celulares testadas e das doses utilizadas. Finalmente, como
demonstrado na figura 9, o crescimento celular foi inibido em torno de 55% após o
cotratamento com a NAC e com o INF em 96 horas de tratamento nas duas linhagens
celulares, resultados estes mais expressivos que os compostos individuais, o que
sugere um efeito aditivo potencializador.
Tendo e vista nossos resultados consideramos de grande valia a realização de
estudos futuros para identificar e elucidar ainda mais o exato envolvimento do INF, da
NAC e do NF-kB em células de CHC.
70
CONCLUSÕES
71
8 CONCLUSÕES
A NAC mostrou efeito potencializador na resposta antitumoral do INF,
diminuindo a viabilidade celular, aumentando a apoptose e diminuindo a
expressão da subunidade p65 do NF-kB.
1. A NAC e o INF diminuem a viabilidade celular através do MTT
nos diferentes tempos de experimento, a partir de 48 horas.
2. A NAC possui ação potencializadora na redução da viabilidade
celular, em cotratamento com o INF na viabilidade celular, através do
MTT, nos diferentes tempos de experimento.
3. Os diferentes tratamentos utilizados não apresentaram
alterações significativas através da avaliação do Ciclo Celular.
4. Os diferentes tratamentos utilizados induzem a morte celular,
constatada através da análise em Citometria de Fluxo.
5. Os diferentes tratamentos com a NAC modulam a expressão da
subunidade p65 do NF-kB.
6. A resposta da NAC e sua ação estão implicadas na mobilização
da via do NF-kB
72
PERSPECTIVAS
73
9 PERSPECTIVAS FUTURAS
Há interesse crescente da comunidade científica nos mecanismos fisiológicos e
fisiopatológicos do envolvimento do NF-kB no CHC.
Ainda pouco se sabe sobre o papel de antioxidantes como a NAC na regulação
dos mecanismos que envolvem o CHC, principalmente por alguns resultados
encontrados em situações experimentais distintas. A NAC mostra grande potencial
terapêutico em diversas doenças e pode auxiliar o entendimento dos mecanismos das
vias de carcinogênese em situações experimentais e clínicas. A partir dos resultados
obtidos, verificamos que a NAC mostra efeitos benéficos na inibição da viabilidade
celular e aumento de apoptose envolvendo a via do NF-kB. Essas evidências
despertam grande interesse e abrem perspectivas para investigar de forma mais
aprofundada os efeitos sobre a ativação de cascatas moleculares antitumorais, tanto
em linhagens celulares humanas como no fígado de ratos com CHC.
Nossas perspectivas focam a continuidade de estudos, investigando os
mecanismos que envolvem o estresse oxidativo, a ativação da rota do NF-kB e a
transcrição de proteínas inflamatórias relacionadas com imunomodulação das células
tumorais no fígado de ratos com CHC. Esse objetivo é condizente com a aplicabilidade
terapêutica da NAC, pois ela se mostrou muito eficaz na inibição do crescimento
celular in vitro.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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