UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁSrepositorio.bc.ufg.br/tede/bitstream/tede/4909/5... · 2015-11-17 · par de aprendizado. Ao Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto, pelo seu auxílio no desenvolvimento

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ELVISCLEY DE OLIVEIRA SILVA

PRODUÇÃO DE EXTRATO DE Artemisia annua L. ASTERACEAE E O USO DESTE

NA OBTENÇÃO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS

Goiânia

2015

I

ELVISCLEY DE OLIVEIRA SILVA

PRODUÇÃO DE EXTRATO DE Artemisia annua L. ASTERACEAE E O USO DESTE

NA OBTENÇÃO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SÓLIDAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade

de Farmácia da Universidade Federal de Goiás, como

requisito necessário à obtenção do título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa Freitas Bara

Co-orientador: Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição

Goiânia

2015

II

Dedico este trabalho à minha esposa, Cecília, que com

amor e paciência me apoiou durante todo o período de sua

realização. À minha mãe, Lindalva, que sempre foi minha

inspiração de trabalho com dedicação e honestidade.

III

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Profa. Dra. Maria Teresa Freitas Bara, que demonstrou admirável com-

petência e conhecimento durante todas as etapas deste trabalho, sempre oferecendo atencio-

samente seu auxílio.

Ao Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição, ao qual serei sempre muito grato pela confi-

ança depositada em mim, por me convidar para ingressar no mestrado, uma oportunidade ím-

par de aprendizado.

Ao Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto, pelo seu auxílio no desenvolvimento de partes deste

estudo e pela grata satisfação de ter sido seu aluno no curso.

Aos novos amigos do Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais (LPPN), Leandra, Rúbia,

Mariana, Marcos Túlio, Nathália, Karen, Wanessa, Mythali, Rejane, Leonardo, Maria Juíva,

entre outros, que possibilitaram que eu aprendesse ainda mais por compartilhar suas experiên-

cias.

Aos colegas e amigos do Farmatec, Letícia, André e Raphael, por terem me auxiliado com

atenção e empenho.

Aos meus amigos do Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQM), pelo

apoio e compreensão.

IV

RESUMO

A Artemisia annua é originária da China, onde é utilizada há mais de dois mil anos no

tratamento de diversas patologias, principalmente malária. O composto químico de principal

importância terapêutica é a artemisinina, uma lactona sesquiterpênica que contém um anel

endoperóxido, responsável pela potente atividade antimalárica da planta. Apenas um estudo

sobre a produção de formas farmacêuticas com extrato de A. annua foi encontrado na

literatura e não foram encontrados no mercado fitoterápicos contendo este. Desta forma, o

objetivo principal deste trabalho foi a obtenção de extrato concentrado de partes aéreas de A.

annua e utilização deste para produção de formas farmacêuticas sólidas. A droga vegetal

apresentou teor de artemisinina de 1,15 ± 0,05 %. Todos os ensaios da validação do método

analítico ficaram dentro das especificações, com LD e LQ de 1,3 µg/mL e 4,0 µg/mL de

artemisinina, respectivamente. As validações parciais para análise dos comprimidos, cápsulas

e péletes também ficaram dentro das especificações nos ensaios realizados. A droga vegetal

foi percolada e obteve-se rendimento de 80 % na extração de artemisinina. Quatro quilos de

droga vegetal deram origem a 2,5 litros de extrato concentrado, com 1,47 % (m/v) de

artemisinina e 30,78 % (m/m) de resíduo seco. Este foi utilizado para produzir péletes,

cápsulas e comprimidos, que contiveram 8,1 mg, 9,6 mg e 10,0 mg de artemisinina,

respectivamente. Todas apresentaram determinação de peso e uniformidade de conteúdo

dentro das especificações, demonstrando que sua produção foi eficiente em relação à dosagem

de artemisinina almejada. Os comprimidos apresentaram dissolução imediata somente em pH

6,8. Em pH 1,2 desintegraram em 60 min, com liberação de 85,2 % de artemisinina, contra

99,8 % das cápsulas, em 20 min, e 103,3 % e dos péletes, em 30 min. O perfil de dissolução

das cápsulas e dos péletes revelou uma dissolução imediata muito rápido em pH 1,2 e 6,8.

Logo, a eficiência de dissolução (ED) dos comprimidos foi menor que das cápsulas e dos

péletes, em ambos os pH. O valor de F2 indicou diferença entre os perfis dos comprimidos

nos diferentes valores de pH, sendo a menor dissolução em pH 1,2. As formulações

preparadas neste trabalho demonstraram como o extrato concentrado de A. annua pode ser

utilizado na fabricação de fitoterápicos com teor de artemisinina próximo do esperado e

demais propriedades físico-químicas adequadas.

Palavras-chaves: Extrato vegetal, fitoterápicos, perfil de dissolução, validação analítica.

V

ABSTRACT

Artemisia annua is originally from China, where it is used over two thousand years in the

treatment of various diseases, especially malaria. The chemical compound of main therapeutic

importance is artemisinin, a sesquiterpene lactone with an endoperoxide ring, responsible for

potent antimalarial activity of the plant. Only one study about the production of

pharmaceutical forms to A. annua extract was found in the literature. The main objective of

this work was to obtain a concentrated extract of aerial parts of A. annua and using this for

production of phytomedicines. The vegetal drug showed adequate physicochemical properties

and artemisinin content of 1.15 ± 0.05 %. All assays of the analytical method validation were

in specifications with LOD and LOQ of 1.3 mg/ml and 4.0 mg/ml of artemisinin, respectively.

The partial validations for analyze of tablets, capsules and pellets were within the

specifications in selectivity, linearity and repeatability testing. The vegetable drug was

percolated and obtained 80% yield artemisinin extraction. Four kilograms of vegetable drugs

yielded 2.5 liters of concentrated extract with 1.47% (w/v) of artemisinin and 30.78% (w/w)

of dry residue. This was used to produce pellets, tablets and capsules, which contained 8.1

mg, 9.6 mg and 10.0 mg of artemisinin, respectively. All showed determination weight and

content uniformity within specifications, demonstrating that the manufacture from the

concentrated extract was effective in relation to the desired dosage artemisinin. The tablets

showed immediate dissolution at pH 6.8 only. At pH 1.2 disintegrated in 60 minutes,

releasing 85.2% of artemisinin against 99.8% of the capsules at 20 min, and 103.3% of pellets

at 30 minutes. The dissolution profile of the capsules and pellets showed a very fast

immediate dissolution at pH 1.2 and 6.8. Therefore, the dissolution efficiency (DE) of the

tablets was lower than that of the capsules and pellets, for both pH values. The value F2

indicated a difference between the profiles of the tablets at different pH values, with the

smallest dissolution in pH 1.2. The formulations prepared in this study demonstrated how the

concentrate extract of A. annua can be used to manufacture phytomedicines content artemisinin

near the expected and other appropriate physico-chemical properties.

Keywords: Vegetal extract, phytomedicines, dissolution profile, analytical validation.

VI

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Arbusto de Artemisia annua L 13

Figura 02. Estrutura molecular da artemisinina 16

Figura 03. Aducto formado pela ligação da artemisinina ao heme 17

Figura 04. Ciclos de vida do Plasmodium falciparum no mosquito e no homem,

mostrando os estágios exo-eritrocítico e eritrocítico

19

Figura 05. Distribuição de tamanho das partículas 41

Figura 06. Varredura da artemisinina sem derivatização 41

Figura 07. Reação de derivatização da artemisinina 42

Figura 08. Varredura do Composto Q260 de Artemisia annua L. derivatizada 42

Figura 09. Valores de AUC após adição de NaOH 0,05 M sem aquecimento 43

Figura 10. Cromatograma da artemisinina antes da derivatização 43

Figura 11. Cromatograma da artemisinina após a derivatização (ampliação) 44

Figura 12. Estabilização da solução de leitura após a derivatização 44

Figura 13. Estabilidade do composto Q260 versus composto Q292 45

Figura 14. Cromatograma da artemisinina padrão sem derivatização, com fase móvel

acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6 mm, 210 nm

46

Figura 15. Cromatograma mostrando picos de compostos remanescentes da injeção da

amostra, com FM acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6

mm

46

Figura 16a. Cromatograma da Artemisia annua L. e do padrão de artemisinina sem

derivatizar, em acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min

48

Figura 16b. Cromatograma da Artemisia annua L. derivatizada, em acetonitrila:ácido

fórmico 0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min

48

Figura 17. Espectro de varredura ultravioleta de 200 a 400 nm do composto Q260 de

Artemisia annua L

49

Figura 18. Cromatogramas sobrepostos do composto Q260, em 255 nm, da Artemisia

annua L. (preto) e do padrão (azul), identificando o composto Q260

49

Figura 19. Curva analítica do padrão de artemisinina 50

Figura 20. Gráfico da linearidade e de resíduos da análise de Artemisia annua L 50

Figura 21. Quantidade de artemisinina (g) e de resíduo seco (%) em cada etapa da

extração

56

Figura 22. Eficiência de extração de artemisinina em cada fração 56

VII

Figura 23. Comparação da artemisinina na droga vegetal e extrato percolado e

concentrado

57

Figura 24. Cromatograma dos péletes e do padrão de artemisinina 58

Figura 25. Linearidade e gráfico de resíduos da análise de péletes 59

Figura 26. Cromatograma das cápsulas e do padrão de artemisinina 60

Figura 27. Linearidade e gráfico de resíduos da análise das cápsulas 61

Figura 28. Cromatograma dos comprimidos e do padrão de artemisinina 62

Figura 29. Linearidade e gráfico de resíduos da análise dos comprimidos 63

Figura 30. Formulação de péletes número 7. 66

Figura 31. Cápsulas de péletes de extrato hidroalcoólico de A. annua 66

Figura 32. Comprimidos de extrato hidroalcoólico de A. annua 67

Figura 33. Cápsulas de granulado de extrato hidroalcoólico de A. annua 67

Figura 34. Perfis de dissolução em tampão pH 1,2 71

Figura 35. Perfis de dissolução em tampão pH 6,8 71

Figura 36. Comparação entre dissolução, após 60 min, das formas farmacêuticas em

pH 1,2 e pH 6,8

72

Figura 37. Comparação entre eficiência de dissolução das formas farmacêuticas em pH

1,2 e pH 6,8

72

Figura 38. Perfis de dissolução dos comprimidos de A. annua em pH 1,2 e pH 6,8 73

VIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Composição dos péletes nas diferentes formulações testadas 35

Tabela 02. Dados da curva de calibração do padrão de artemisinina 50

Tabela 03. Dados da Linearidade da Análise de Artemisia annua L 51

Tabela 04. Resultados da repetibilidade da análise de Artemisia annua L 51

Tabela 05. Resultados da precisão intermediária da análise da droga vegetal 52

Tabela 06. Precisão obtida por outros trabalhos 52

Tabela 07. Resultados da exatidão, em três níveis, da análise de Artemisia annua

L

53

Tabela 08. Exatidão obtida por outros trabalhos 53

Tabela 09. Resultados da análise do LD e LQ 54

Tabela 10. Limites de detecção e quantificação de artemisinina obtida por outros

trabalhos

54

Tabela 11. Resultados da robustez do método analítico na análise de Artemisia

annua L

55

Tabela 12. Adequabilidade do Sistema do Cromatograma de Artemisia annua L 55

Tabela 13. Resultado da caracterização do extrato antes e após a concentração 57

Tabela 14. Adequabilidade do sistema do cromatograma de péletes 58

Tabela 15. Dados da linearidade da análise dos péletes 59

Tabela 16. Dados da linearidade da análise dos péletes 59

Tabela 17. Adequabilidade do sistema do cromatograma de cápsulas 60

Tabela 18. Dados da linearidade da análise das cápsulas 61

Tabela 19. Repetibilidade da análise do granulado das cápsulas 62

Tabela 20. Adequabilidade do sistema do cromatograma de comprimidos 62

Tabela 21. Dados da linearidade da análise dos comprimidos 63

Tabela 22. Repetibilidade na análise dos comprimidos 64

Tabela 23. Propriedades dos péletes obtidos nas diferentes formulações 64

Tabela 24. Determinação de peso das formas farmacêuticas 68

Tabela 25. Teor de artemisinina previsto para cada forma farmacêutica 70

Tabela 26. Uniformidade de conteúdo das formas farmacêuticas 70

IX

QUADROS

Quadro 01. Condições cromatográficas em HPLC-PDA testadas para doseamento

de artemisinina em Artemisia annua L

29

Quadro 02. Quantidade de solvente utilizado na percolação 33

Quadro 03. Composição do granulado dos comprimidos 37

X

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 13

1.1. Artemisia annua L. (ASTERACEAE) 13

1.2. ARTEMISININA 15

1.3. MALÁRIA 18

1.4. DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS 20

2. OBJETIVOS 27

2.1. OBJETIVO GERAL 27

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27

3. MATERIAL E MÉTODOS 28

3.1. MATERIAL VEGETAL 28

3.2. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL 28

3.3. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA

DOSEAMENTO DE ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL

28

3.3.1. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ANALÍTICOS 28

3.3.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 30

3.4. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO

DE Artemisia annua L

32

3.4.1. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE RELATIVA 33

3.4.2. DETERMINAÇÃO DA VISCOSIDADE 34

3.4.3. DETERMINAÇÃO DO RESÍDUO SECO 34

3.4.4. DETERMINAÇÃO DO PH 34

3.4.5. DETERMINAÇÃO DE ÁLCOOL 34

3.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DOS MÉTODOS DE DOSEAMENTO DE

ARTEMISININA NAS FORMAS FARMACÊUTICAS PREPARADAS

35

3.6. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PÉLETES 35

3.6.1. CÁLCULO DA ESFERICIDADE DE PÉLETES 36

3.6.2. DETERMINAÇÃO DE UMIDADE DOS PÉLETES 36

3.6.3. DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DOS

PÉLETES

36

3.7. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPRIMIDOS E CÁPSULAS 36

3.7.1. TESE DE DUREZA DE COMPRIMIDOS 37

3.7.2. TESTE DE FRIABILIDADE DE COMPRIMIDOS 38

XI

3.8. TESTE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS 38

3.9. TESTE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

38

3.10. TESTE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

39

3.11. PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS 39

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 40

4.1. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL 40

4.2. AVALIAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO DE DOSEAMENTO DE

ARTEMISININA NA DROGA VEGETAL

41

4.2.1. PREPARO DA SOLUÇÃO DE ANÁLISE POR DERIVATIZAÇÃO 41

4.2.2. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS 45

4.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE


48

4.3.1. SELETIVIDADE PARA DOSEAMENTO DE ARTEMISININA NA

DROGA VEGETAL

48

4.3.2. LINEARIDADE E INTERVALO DA ANÁLISE DE Artemisia annua

L. DROGA VEGETAL

49

4.3.3. PRECISÃO DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA

VEGETAL

51

4.3.3.1. REPETIBILIDADE DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA

VEGETAL

51

4.3.3.2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DA ANÁLISE DE Artemisia annua

L. DROGA VEGETAL

52

4.3.4. EXATIDÃO DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA

VEGETAL

53

4.3.5. LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO DA ANÁLISE

DE Artemisia annua L. DROGA VEGETAL

53

4.3.6. ROBUSTEZ DA ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA

VEGETAL

54

4.3.7. ADEQUABILIDADE DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO DA

ANÁLISE DE Artemisia annua L. DROGA VEGETAL

55

4.4. OBTENÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO DE Artemisia annua L 55

4.4.1. CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS DE Artemisia annua L 56

XII

4.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE

ARTEMISININA NOS PÉLETES

57

4.5.1. SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS PÉLETES 57

4.5.2. LINEARIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS PÉLETES 58

4.5.3. REPETIBILIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS PÉLETES 59


ARTEMISININA NAS CÁPSULAS

60

4.6.1. SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DAS CÁPSULAS 60

4.6.2. LINEARIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DAS CÁPSULAS 61

4.6.3. REPETIBILIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DAS

CÁPSULAS

61


ARTEMISININA NOS COMPRIMIDOS

62

4.7.1. SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS

COMPRIMIDOS

62

4.7.2. LINEARIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS

COMPRIMIDOS

63

4.7.3. REPETIBILIDADE DO MÉTODO PARA ANÁLISE DOS

COMPRIMIDOS

63

4.8. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PÉLETES 64

4.9. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPRIMIDOS E

CÁPSULAS

67

4.10. CARACTERIZAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS 68

4.10.1. ANÁLISE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

68

4.10.2. ANÁLISE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

69

4.10.3. ANÁLISE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

69

4.10.4. ANÁLISE DE PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

70

5. CONCLUSÕES 75

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 76

XIII

13

1. INTRODUÇÃO

1.1. Artemisia annua L. (ASTERACEAE)

A artemisia, como é conhecida popularmente, é originária da China, onde é utilizada

há mais de dois mil anos na medicina tradicional chinesa para tratamento de febres e malária

(NAEEM et al., 2014). Contudo, foi reconhecida mundialmente no final dos anos 70, após a

descoberta de que é a única fonte para isolamento e produção da artemisinina, um potente

antimalárico presente nos caules, folhas e inflorescências (FERREIRA, 1996).

É comumente conhecida como wormwood (em inglês), ou qinghao (do chinês, “erva

verde”). Na medicina tradicional chinesa, as partes aéreas secas são a parte mais utilizada para

tratamento da malária, tuberculose, e outros tipos de febre (WHO, 2006).

É uma planta herbácea anual, aromática, que pode chegar a 2 metros de altura,

dependendo da região onde é produzida e de aspectos agronômicos (Figura 01). Possui folhas

aromáticas e bem dissecadas, medindo de 2,5 a 5 cm de comprimento por 1 a 3 cm de largura.

As flores são pequenas e amarelas com tamanho entre 2 e 3 mm. Naturalmente é polinizada

por insetos e pelo vento (WHO, 2006).

Figura 01. Arbusto de Artemisia annua L.

Fonte:

http://webdrm.cpqba.unicamp.br/cpma/banco_de_dados/index.php?centro=select&N_ENTR

ADA=842

14

Apresenta boa adaptabilidade em clima tropical por meio da seleção de sementes e

híbridos, pois cresce em diferentes tipos de solo (FERREIRA et al., 1995; QUITÉRIO, 2006).

Poucos países a cultivam em larga escala, como a China, o Quênia, a República Unida da

Tanzânia e o Vietnã. Cultivares em pequena escala estão presentes na Índia, sul da Europa, e

América do Sul (WHO, 2006).

Sua composição química é constituída de constituintes voláteis e não-voláteis. Os

voláteis são principalmente os óleos essenciais, em torno de 0,2 a 0,25 %, compostos em sua

maior parte por canfeno, beta-canfeno, cânfora, beta-cariofileno e beta-pineno. Os não-

voláteis são, principalmente, sesquiterpenoides, flavonoides, cumarinas, proteínas e

esteroides. O composto químico de principal interesse terapêutico é a artemisinina (WHO,

2006). Contém aproximadamente 8,3 % de carboidratos, 6,1 % de lipídios e 14,2 % de fibras

(IQBAL et al., 2012).

Várias outras atividades farmacológicas da Artemisa annua L. vêm sendo estudadas e

demonstradas, como anti-hipertensiva (extrato aquoso), antimicrobiana (óleo essencial), anti-

inflamatória e antioxidante (extrato aquoso), imunossupressora (extrato etanólico),

parasiticida, antiviral (extrato aquoso), anticâncer e antimalárica (planta inteira), sendo esta

última a principal devido à quantidade presente de artemisinina e flavonoides (SADIQ, 2014).

Na droga vegetal a artemisinina não é o único composto com atividade antimalárica,

mas é o principal, sendo que ainda outros compostos presentes aumentam sinergicamente sua

atividade (KLAYMAN, 1985; ELFORD, 1987). Vários flavonoides, por exemplo, podem

promover o aumento da reação da artemisinina com o grupo heme, aumentando a potência

antimalárica da droga vegetal (BILIA et al., 2006). De forma geral, a biodisponibilidade da

artemisinina no sangue é aumentada em cerca de 40 vezes em ratos quando alimentados com

a planta inteira em comparação à administração do fármaco puro (ELFAWAL et al., 2012).

O teor de flavonoides na A. annua pode variar entre 9 % e 11 % e também já

demonstraram atividade antimalárica e antioxidante (OGWANG et al., 2011). Estes e outros

compostos presentes na droga vegetal, como glicosídeos e saponinas, melhoram a

solubilidade da artemisinina (ATEMNKENG et al., 2009) e auxiliam sinergicamente sua

atividade, o que é uma vantagem do extrato em relação ao fármaco purificado (ELFORD,

1987).

A introdução de genótipos superiores provenientes do Vietnã e o desenvolvimento de

novas técnicas realizadas na Suíça tornou possível o desenvolvimento de híbridos adaptados

às condições brasileiras (MAGALHÃES, 2004). As plantas tinham, antes do processo de

15

melhoramento, cerca de 0,01 % de artemisinina, e passaram a uma concentração maior que 1

%, por peso de matéria seca, após o processo adaptativo (FOGLIO, 2005).

Diversos fatores podem alterar a composição e a quantidade dos metabólitos

secundários em plantas medicinais, como sazonalidade, ritmo circadiano, temperatura,

disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, nutrientes disponíveis no solo, altitude, poluição

atmosférica, condições de coleta, estabilização e estocagem, entre outros. O valor terapêutico

da droga vegetal pode ser alterado se as condições críticas para aquela espécie não forem

devidamente controladas (GOBBO-NETO, 2007).

Tem sido observado que o uso de A. annua na forma de infusão apresenta eficácia

significativa no desaparecimento dos sintomas da malária e na redução da parasitemia

(MUELLER et al., 2000), inclusive em concentrações muito baixas de artemisinina, o que

indica que outras substâncias presentes no infuso podem apresentar atividade antimalárica e

agir sinergicamente (DONNO et al., 2012).

A Farmacopeia da República Popular da China lista oficialmente a droga seca A.

annua L. como um medicamento para febre e malária. A dose diária usual varia entre 4,5 e 9

gramas, preparado por infusão, utilizando água fervente (RATH et al., 2004).

Van der Kooy (2013) destaca que a A. annua é uma planta que aparentemente não

apresenta toxicidade, ao passo que possui pronunciada atividade em estudos in vitro. Em

trabalhos realizados por Weathers et al. (2014), pacientes tratados com comprimidos de folhas

secas de A. annua obtiveram resultados terapêuticos iguais ou superiores aos dos pacientes

tratados com artemisinina pura.

No Brasil, as pesquisas com artemísia foram adaptadas à condição tropical por meio

do estudo da reprodução, seleção de genótipos de florescimento tardio e seleção de híbridos

com boa produção de biomassa e artemisinina (MAGALHÃES, 1996). Estes estudos foram

desenvolvidos no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

(CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas/SP (Unicamp) onde, em uma área de 8.000

m² e um campo experimental de 40 hectares, cultiva diversas espécies e híbridos de artemisia

annua (CPQBA, 2014).

1.2. ARTEMISININA

A artemisinina é uma lactona sesquiterpênica, contendo um anel endoperóxido em sua

estrutura (Figura 02), que lhe confere potente atividade antimalárica, possuindo ação contra os

protozoários parasitas em concentrações nanomolares (MESHNICK, 1996). Apresenta-se

16

como um pó cristalino branco, possui peso molecular de 282,33 g/mol e fórmula molecular

C15H22O5. A faixa de fusão descrita em sua monografia é de 151 a 154 ºC (WHO, 2014).

Apresenta degradação térmica a aproximadamente 207 ºC (DONG et al., 2007).

Sua molécula possui baixa absorção no ultravioleta, por não conter grupamentos

cromóforos em sua estrutura. Desta forma, para análise em equipamento provido de detector

ultravioleta é necessário realizar uma derivatização por meio de reação com hidróxido de

sódio, em que o anel endoperóxido é clivado e um composto com maior absorção no

ultravioleta é formado (Zhao, 1986).

Figura 02. Estrutura molecular da artemisinina.

Fonte: Meshnick (1996).

Vários métodos foram descritos para análise de doseamento de artemisinina em A.

annua utilizando métodos cromatográficos, como cromatografia em camada delgada (CCD),

HPLC-ECD (Detecção eletroquímica), HPLC-ELSD (Detector de espalhamento de luz

evaporativo), HPLC-PDA (Detector ultravioleta de arranjo de diodos), GC-FID (Detector por

ionização em chama), GC-MS (Detector por espectrometria de massa), entre outros. Isso

ocorre principalmente devido à sua baixa absorção no ultravioleta, o que torna os métodos

com uso de detector ultravioleta menos sensíveis (PENG et al., 2006).

Foi isolada primeira vez em 1972 a partir da planta A. annua (Asteraceae) e, desde

então, sua eficácia contra malária tem sido amplamente demonstrada, tanto em relação a sua

forma pura quanto aos seus derivados semissintéticos artesunato, arteméter, arteéter,

diidroartemisinina, entre outros (MUELLER et al., 2000).

17

Seu único meio de obtenção é por meio da extração a partir da A. annua. Em 1983 o

primeiro processo de síntese foi registrado, contudo o método envolvia várias etapas e o

rendimento era baixo (DELABAYS, 2001).

Seu mecanismo de ação antimalárico é por meio da reação com o grupo heme presente

nos parasitas em grande quantidade, derivado da proteólise da hemoglobina realizada por

estes. Como a captação de artemisinina pelos eritrócitos é aumentada em mais de cem vezes

quando estes estão infectados por P. falciparum, sua atividade antiparasitária é aumentada.

Um radical livre altamente reativo é formado, a partir da clivagem da ponte endoperóxido, e

exibe alta toxicidade aos parasitas (MESHNICK et al., 1991).

Um dos modos de clivagem da ponte endoperóxido ocorre por redução pelo complexo

heme-Fe2, o que gera um radical que sofre rearranjo estrutural e se liga covalentemente ao

heme formando um aducto (Figura 03). Este reage com grupos tióis das proteínas de

membrana formando, entre outros compostos, oxigênio ativo em níveis tóxicos aos parasitas

(MESHNICK, 1996).

Figura 03. Aducto formado pela ligação da artemisinina ao heme.

Fonte: Cazelles (2001).

A ação da artemisinina é maior durante o estágio sanguíneo do desenvolvimento do

plasmódio. Logo, os trofozoítos, do ring stage, e os gametócitos do parasita são mais

sensíveis a esta droga do que os esquizontes do estágio que se desenvolvem no fígado. O

estágio hepático do P. vivax e do P. falciparum não é afetado pela artemisinina (MESHNICK,

1996).

Efeitos adversos da artemisinina são raros (BREWER et al., 1994), assim como em

pacientes tratados com os seus derivados e são seguros para uso em mulheres grávidas

(MESHNICK, 2002). Contudo, em experimentos in vitro têm demonstrado neurotoxicidade

18

em altas dosagens (MESHNICK, 2002). Também demonstrou neurotoxicidade contra células

neuronais por um mecanismo similar ao de seu efeito antimalárico, com o heme

potencializando sua toxicidade (FISHWICK, 1998).

Uma das limitações do uso das artemisininas é o seu curto tempo de meia-vida (3 a 5

h), que faz com que seu uso em esquemas monoterapêuticos tenha uma capacidade de cura

muito baixa, requerendo sempre o acompanhamento de um segundo fármaco antimalárico

com tempo de meia-vida maior (WOODROW, 2005). Isso faz com que o tratamento seja

mais eficaz, com menor tempo de duração e, consequentemente, diminui a possibilidade de

surgimento de parasitas resistentes (SILVA, 2006).

Alguns fatores que podem contribuir para o desenvolvimento de resistência do parasita

já foram identificados, como tempo de meia-vida plasmática curto, em relação à droga, e

mutações genéticas que alteram proteínas do vacúolo celular do parasita (MESHNICK, 2002).

Resistência do Plasmodium falciparum à artemisinina, determinada geneticamente, emergiu

entre Birmânia e Tailândia nos últimos oito anos e vem aumentando substancialmente (PHYO

et al., 2012).

1.3. MALÁRIA

Todos os dias, cerca de três mil pessoas morrem no mundo vítimas de doenças

tropicais negligenciadas como malária, leishmaniose visceral, dengue, doença de Chagas e

outras. Por ano são mais de um milhão de óbitos (PONTES, 2009).

Estas doenças ocorrem principalmente em regiões de pobreza e contribuem para a

manutenção da desigualdade socioeconômica, já que representam forte entrave ao

desenvolvimento dos países (BRASIL, 2010). Evidências tem demonstrado que o controle das

doenças negligenciadas pode reduzir significativamente os índices de morbidade, de exclusão

social e de mortalidade (WHO, 2011).

Dentre as doenças negligenciadas, a malária se destaca na região da Amazônia Legal

Brasileira, por ser uma das doenças de maior ocorrência. Em 2009, em uma tentativa de

reduzir significativamente o número de internações e de novos casos, foi criada a Rede

Malária, com o objetivo de agregar diferentes competências científicas, de regiões distintas do

país, para o enfrentamento da malária (BRASIL, 2010).

A quantidade de casos de malária no Brasil, mesmo que em declínio no decorrer dos

últimos anos, ainda é preocupante. Segundo dados do Programa Nacional de Controle da

Malária (PNCM), em 2005 foram registrados 607.827 casos, em 2007, foram 457.659 casos,

19

uma redução de 24,7% (BRASIL, 2008). Em 2009 foram registrados mais de 300.000 casos,

uma redução de aproximadamente 34%, sendo 99,8% transmitidos nos estados da Amazônia

Legal (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2010). Em 2012, o número de casos reduziu para 243

mil, com 61 óbitos e 3.328 internações (OPAS, 2013).

A malária é uma doença transmitida por vetores (Mosquitos do gênero Anopheles)

usualmente causada por quatro espécies do parasita Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P.

ovale e P. malariae). Trata-se de uma doença considerada atualmente como um dos maiores

flagelos da humanidade, que continua a desafiar a ciência e a tecnologia médica, com um

número estimado de 300 milhões de pessoas no mundo que a ela sucumbem todos os anos

(NAEEM et al., 2014).

No Brasil, as infecções causadas pelo Plasmodium vivax predominam sobre as

provocadas pelos outros parasitas comumente encontrados no país (P. falciparum e P.

malariae) (BRASIL, 2008).

No combate a estes parasitas, a resistência aos antimaláricos utilizados atualmente é

uma preocupação mundial constante. O antimalárico cloroquina, por exemplo, considerado

um dos principais medicamentos para o controle da malária, é atualmente ineficaz em muitas

áreas de prevalência do P. falciparum e a resistência a outros medicamentos antimaláricos

vem aumentando rapidamente (RIDDER, 2008).

Figura 04. Ciclos de vida do Plasmodium falciparum no mosquito e no homem, mostrando os

estágios exo-eritrocítico e eritrocítico.

Fonte: Naeem et al. (2014).

20

O uso de A. annua na forma de infusão, como automedicação, preparada com drogas

vegetais de origens diversas, pode resultar em falha do tratamento e ocorrência de

recrudescência elevada da malária. Isso pode ocorrer devido à alta variação do teor de

artemisinina entre diferentes cultivares, de 0,01 % a 1,5 %, dependendo das condições de

altitude, clima, nutrientes, pH do solo, duração do dia, entre outros fatores (ATEMNKENG et

al., 2009). Além disso, o armazenamento em condições inadequadas também pode reduzir o

teor de artemisinina na droga vegetal. Por estas razões, em 2012, a Organização Mundial de

Saúde se posicionou contra o uso de plantas cultivadas em domicílio para tratamento e

prevenção da malária, inclusive na forma de infusão (WHO, 2012).

1.4. DESENVOLVIMENTO DE FITOTERÁPICOS

Atualmente, o desenvolvimento de resistência dos parasitas também às artemisininas,

já observado em alguns países, é uma grande preocupação, pois ainda não há outros

antimaláricos disponíveis no mercado com o mesmo nível de eficácia e tolerabilidade (WHO,

2012). A obtenção das artemisininas é também um problema, pois requer um alto gasto

financeiro, o que eleva o preço dos medicamentos disponíveis no mercado e dificulta o acesso

da população mais carente (FLEMING, 2007).

O uso de extratos de A. annua em substituição ao uso de artemisinina pura reduziria os

custos de produção, pois não seria necessária a realização das etapas de purificação que

normalmente são utilizadas no isolamento do fármaco. O processo de purificação envolve o

uso de solventes orgânicos tóxicos para os manipuladores envolvidos e para o meio ambiente,

como éter etílico, éter de petróleo, benzeno, tolueno, diclorometano e acetonitrila (FLEMING,

2007).

Na forma de infusão, comumente utilizada por populações carentes em áreas de risco,

os principais flavonoides da A. annua, crisoplenetina, casticina, eupatina e artemetina

(BARALDI et al., 2008), são extraídos fracamente, o que faz com que o uso da infusão esteja

relacionado com a redução do efeito dos flavonoides (WEATHERS, 2013). A atividade

antimalárica de extratos de A. annua, no entanto, tem se mostrado similar à atividade da

artemisinina pura, mesmo com quantidades consideravelmente inferiores de artemisinina. O

valor de IC50 in vitro para a planta, relatado por Wright et al. (2010), foi 6 a 18 vezes menor

que para a artemisinina pura. Diawara et al. (2012) realizaram testes antiplasmódio in vitro

com diversos extratos de A. annua e revelaram uma atividade do extrato hidroalcoólico 50:50

21

(IC50 = 2,85 μg/mL) muito próxima da atividade do padrão de artemisinina (IC50 = 2,73

μg/mL).

Em um estudo de Meshnick (1996), pacientes tratados com 600 mg/dia de

artemisinina pura atingiram um grau de recrudescência igual ou menor que 10 %, ao passo

que, com uma dose de 11,1 mg de artemisinina em comprimidos de A. annua, mais apenas 7,4

mg de artemisinina pura, pesquisadores do International Centre of Insect Physiology and

Ecology (ICIPE) obtiveram uma taxa de 9,1 % de recrudescência da doença. Logo, o uso de

comprimidos de folhas de A. annua com alto teor de artemisinina foi considerado um

tratamento seguro e eficaz contra a malária “não complicada” provocada pelo P. falciparum

(ICIPE, 2005).

Estes resultados estimulam os estudos sobre formulações contendo extrato de A.

annua, com o objetivo de desenvolver um medicamento fitoterápico com aceitável grau de

eficácia, segurança e de baixo custo. São fitoterápicos os produtos obtidos a partir de matéria-

prima ativa vegetal, sem adição de ativos sintéticos ou isolados, com finalidade profilática,

curativa ou paliativa (BRASIL, 2014). A qualidade e a fonte das matérias-primas vegetais têm

um papel central na padronização de medicamentos fitoterápicos, pois, devem possuir

composição constante e propriedades terapêuticas que possam ser reprodutíveis. A

domesticação e o melhoramento genético são ferramentas que auxiliam na obtenção de

matérias-primas vegetais com estas características (GOBBO-NETO, 2007).

Um dos principais desafios na produção de um medicamento fitoterápico é a

complexidade da composição da planta medicinal, que depende de fatores climáticos,

geográficos, condições de cultivo, secagem e armazenamento (CALIXTO, 2000). Grande

parte destes desafios foi contornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo CPQBA/UNICAMP,

por meio da seleção de híbridos com mais alta produção de artemisinina (MAGALHÃES,

1996).

Atualmente, medicamentos fitoterápicos com extrato de A. annua não estão

disponíveis no mercado brasileiro. Um único estudo sobre a produção de um granulado

utilizado como pó para suspensão oral e cápsulas a partir de extrato de Artemisia annua L. foi

encontrado na literatura (DIAWARA, 2012).

Os granulados são o produto intermediário de comprimidos e cápsulas. Tratam-se de

agregados sólidos de resistência e porosidade variadas, formados a partir de pós, cristalinos

ou amorfos. Possuem vantagens sobre simples misturas de pós, como maior densidade,

melhor escoamento, maior compressibilidade, melhor conservação da homogeneidade dos

componentes e resistência mecânica superior (LE HIR, 1997). As principais razões para

22

utilização de granulados na fabricação de formas sólidas de uso oral são para prevenir a

segregação dos constituintes de uma mistura de pós; melhorar as propriedades de fluxo da

mistura e melhorar as características de compactação da mistura (AULTON, 2005).

As principais técnicas de granulação são a seca, por desagregação, e a úmida, por

desagregação ou agregação (COUTO, 2000). Na granulação por via seca a pressão aumenta a

densidade dos pós misturados. Após a formação da massa aglomerada, esta passa por um

processo de redução no qual se formam grânulos densos e irregulares. Na via úmida, utiliza-se

um líquido de umedecimento volátil, que pode ou não conter substâncias aglutinantes. Após a

molhagem, a massa homogeneizada é submetida à secagem e calibração do tamanho das

partículas por meio de tamisação (COUTO, 2000).

Os granulados formados devem possuir propriedades adequadas de fluxo e

coesividade (CURY et al., 2007). A granulação úmida é o método mais adequado quando o

componente ativo se apresenta parcialmente dissolvido no líquido extrator, como no caso de

extratos vegetais líquidos, além de possuir estabilidade térmica para resistir à exposição ao

calor na durante a secagem (COUTO, 2000).

Os comprimidos são formas farmacêuticas sólidas que contêm um ou mais princípios

ativos, com ou sem excipientes, obtidos pela compressão de volumes uniformes de partículas

granuladas (BRASIL, 2010) até que o sistema se rearranje e se deforme formando uma massa

compacta de contornos definidos (MARSHALL, 2001). As propriedades físico-químicas das

substâncias que o compõem são decisivas no comportamento da formulação após a

compactação (NARAYAN, 2003).

As principais vantagens dos comprimidos são a grande aceitação pela população;

maior estabilidade química e física dos ativos; maior precisão da dosagem dos ativos; fácil

manuseio e versatilidade da obtenção; robustez da produção em larga escala e baixo custo.

Sua principal desvantagem está relacionada à biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis

em água (AULTON, 2005).

Comprimidos de A. annua, sem adição de adjuvantes, foram desenvolvidos por

Weathers et al. (2014), porém, o objetivo não foi a obtenção de uma formulação, mas avaliar

a variação dos constituintes presentes na droga vegetal e na formulação final. Concluíram que

não se pode afirmar que todos os constituintes presentes na droga vegetal são os mesmos das

formulações de cápsulas ou comprimidos, contudo, o teor de artemisinina é um dos

componentes que se mantiveram constantes.

As cápsulas são formas farmacêuticas preparadas pela encapsulação de materiais como

granulados ou péletes (AULTON, 2005). Em relação aos comprimidos, são de mais fácil

23

desenvolvimento, utilizam menos excipiente, passam por menos etapas de fabricação, a

formulação é mais flexível, mascaram sabores ruins com mais facilidade, entre outras

vantagens. Suas desvantagens são a mais lenta produção, o custo um pouco mais elevado, a

necessidade de embalagens maiores, unidades com maior variação de peso, a forma e o

tamanho limitados, entre outras (COLE, 1998).

Pó para reconstituição oral e cápsulas gelatinosas duras, contendo extrato de A. annua,

foram desenvolvidos por Diawara et al. (2012), que obtiveram um granulado utilizando o

extrato hidroalcoólico, alcançando resultados satisfatórios em relação à uniformidade de

conteúdo, estabilidade e propriedades microbiológicas.

O uso de um sistema multiparticulado, na forma de péletes, pode ser uma opção para

alcançar propriedades tecnológicas melhoradas em relação aos grânulos (BERINGHS et al.,

2012). São principalmente utilizados no preparo de produtos destinados à liberação controlada

de fármacos (AULTON, 2005).

A produção de péletes consiste na aglomeração de ativos e excipientes de modo a

formar pequenas unidades esféricas. Estas unidades apresentam características físicas

diferentes dos granulados tradicionais (SANTOS et al., 2004) e com diâmetro entre 0,5 e 2

mm, possuem maior densidade e têm maior superfície de contato do que estes, podendo

melhorar a taxa de dissolução, diminuir possível irritação do trato gastrointestinal e aumentar

a dosagem dos ativos incorporados (BERINGHS et al., 2012).

Os péletes oferecem grande flexibilidade para o desenvolvimento de formas

farmacêuticas sólidas, pois, a facilidade do seu fluxo facilita a etapa de envase, resultando em

cápsulas e comprimidos com peso uniforme e de fácil reprodutibilidade (ALLENKI et al.,

2009).

Várias técnicas podem ser utilizadas para obtenção de péletes, como extrusão-

esferonização, criopeletização, freeze peletização e extrusão hot melt. O processo de

peletização comumente utilizado na indústria farmacêutica é a extrusão-esferonização,

composto basicamente por quatro etapas: mistura dos ingredientes secos, malaxagem,

extrusão, esferonização e secagem. Por meio deste processo é possível obter péletes densos,

com alto teor de ativo utilizando o mínimo de excipientes (ALLENKI et al., 2009).

Os excipientes e ativos secos são previamente homogeneizados e na etapa de

malaxagem são molhados com o líquido de granulação para obtenção de uma massa

umidificada. Esta deve possuir consistência ideal para as etapas de extrusão e esferonização

seguintes. A secagem pode ser feita em temperatura ambiente ou elevada, em leito estático ou

dinâmico (SANTOS et al., 2004).

24

Tanto cápsulas quanto comprimidos devem ser submetidos a um controle de qualidade

e apresentar características apropriadas de peso, desintegração, teor do princípio ativo,

uniformidade de doses unitárias e dissolução. Os comprimidos devem também possuir

características de resistência mecânica bem estabelecidas, como dureza e friabilidade

(BRASIL, 2010). Na formulação de péletes, estes devem possuir características de

esfericidade e tamanho adequadas (AULTON, 2005).

O teor do princípio ativo de fitoterápicos usualmente é realizado sobre um marcador

químico, que pode se tratar de uma substância ou um grupo de substâncias que estejam

presentes em maior quantidade, de preferência responsável pela sua atividade farmacológica

(BRASIL, 2010). No caso da A. annua, a artemisinina é o marcador principal, e é também a

principal substância responsável pela atividade antimalárica.

Os métodos analíticos de determinação de teor de ativo devem ser validados antes de

serem adotados na rotina laboratorial (BRASIL, 2010), pois dados analíticos não confiáveis

podem conduzir a decisões desastrosas e levar a prejuízos financeiros irreparáveis (RIBANI et

al., 2004). A validação do método analítico é um componente essencial das medidas

realizadas em um laboratório, permitindo que este produza resultados confiáveis (IUPAC,

2002). O objetivo da validação é demonstrar que um método analítico é adequado para o seu

propósito (BRITO et al., 2003).

Segundo a RDC nº 17 (BRASIL, 2010), validação é o ato documentado que atesta que

um determinado equipamento, processo ou procedimento, consistentemente, leva aos

resultados esperados. Sendo assim, antes da utilização de um método analítico, este deve ser

submetido aos ensaios de validação para atestar a confiabilidade nos resultados por ele

obtidos. Os ensaios de seletividade, linearidade e intervalo, precisão (níveis repetibilidade e

intermediária), exatidão, limite de quantificação, limite de detecção e robustez fazem parte da

validação analítica (BRASIL, 2003).

Seletividade é a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto

em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e

componentes da matriz (BRASIL, 2003). Em métodos cromatográficos, é a garantia de que

um determinado pico de interesse seja exclusivamente do composto analisado (RIBANI et al.,

2004).

É importante não confundir o termo “seletividade” com “especificidade”, utilizado

como sinônimos por diversos autores. Um teste específico é aquele que ocorre somente com a

substância de interesse, enquanto que um teste seletivo ocorre também na presença de outras

25

substâncias, porém, exibe um grau de preferência pela substância de interesse (IUPAC, 2001).

Portanto, o termo seletividade será utilizado neste trabalho.

Linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os

resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro

de um intervalo especificado (BRASIL, 2003). É recomendado que sejam realizadas análises

estatísticas para demonstrar que o modelo linear de correlação é o adequado, descartando

outros modelos, como o quadrático, o exponencial e outros (BRASIL, 2010).

É recomendado que a linearidade seja determinada pela análise de, no mínimo, cinco

concentrações diferentes da amostra. O intervalo dessas determinações deve contemplar de 80

% a 120 % da concentração central do método quando este tiver o objetivo de quantificar o

analito em matérias-primas ou em formas farmacêuticas, de 70 % a 130 % quando objetivar

realização da análise de uniformidade de conteúdo em produtos acabados e de até 50 % a 150

% quando o mesmo for utilizado em análise de teste de dissolução (BRASIL, 2003).

O teste de uniformidade de conteúdo é utilizado quando a quantidade de fármaco de

cada unidade é menor que 25 mg ou a proporção do fármaco na dose é menor que 25 %. O

objetivo é avaliar duas características independentes de um lote de medicamento: a

proximidade do conteúdo de fármaco de cada unidade com a quantidade declarada e a

uniformidade entre os conteúdos de cada unidade. Para isto, utiliza o ensaio de doseamento

em unidades individuais de um mesmo lote (BRASIL, 2010).

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de

medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra (BRASIL, 2003) e pode ser

calculada em três níveis, Repetibilidade, Precisão Intermediária e Reprodutibilidade. Não se

deve confundir a repetibilidade com a precisão instrumental, que é medida pela análise

repetida da injeção de uma mesma solução e também é expressa em DPR (RIBANI et al.,

2004).

A repetibilidade da injeção foi avaliada e resultou em um DPR de 0,2 %, menor que o

recomendado de até 2 % (BRASIL, 2010). A precisão intermediária (Precisão Inter-corridas)

representa a concordância entre os resultados no mesmo laboratório, mas obtidos em dias

diferentes e com analistas diferentes (BRASIL, 2003). É útil na determinação da variação

sofrida pelo método dentro de um laboratório devido a mudanças no dia ou no analista que

realiza a análise (RIBANI et al. 2004).

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo

método em estudo em relação um valor verdadeiro. Deve ser determinada após o

26

estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da seletividade do mesmo (BRASIL,

2003).

O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma amostra

que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições

experimentais estabelecidas. É estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações

conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável (BRASIL, 2003).

O limite de quantificação (LQ) é a menor quantidade do analito em uma amostra que

pode ser determinada, com precisão e exatidão aceitáveis, sob as condições experimentais

estabelecidas (BRASIL, 2003).

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a

pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante seu

uso cotidiano (BRASIL, 2003).

Os testes de adequabilidade do sistema cromatográfico fazem parte de todos os

métodos de cromatografia líquida e devem ser utilizados para avaliação da eficácia da

separação do pico de interesse. Avaliam a resolução e a reprodutibilidade do sistema

cromatográfico. De acordo com os resultados destes testes, as condições de trabalho podem

ser alteradas para se ajustar às suas especificações (BRASIL, 2010).

O fator de capacidade (K) mede onde o pico de interesse está alocado em relação ao

“volume morto” da coluna. A resolução (R) demonstra quão bem dois picos próximos são

separados. A separação eficiente é fundamental para a quantificação exata da substância. O

fator de cauda (T) mede a largura da cauda de um pico. Quanto maior a cauda, menor a

exatidão dos cálculos quantitativos realizados. O número de pratos teóricos (N) é uma medida

da eficiência da coluna, ou seja, quantos picos podem ser alocados por unidade de tempo do

cromatograma (FDA, 1994).

De acordo com dados da ANVISA (BRASIL, 2014), a causa mais frequente de

indeferimento de registros de medicamentos fitoterápicos são problemas relacionados com a

validação de métodos analíticos. Portanto, esta é uma etapa crítica no desenvolvimento destes

produtos.

Diante do exposto, em face da reconhecida atividade antimalárica de extratos de A.

annua e da indisponibilidade no mercado de produtos fitoterápicos a partir destes, foi

estudada neste trabalho a possibilidade de produção de formas farmacêuticas sólidas contendo

extrato padronizado de A. annua, de forma a obter produtos de baixo custo, priorizando a

população mais carente, de acesso limitado aos medicamentos de custo mais elevado.

27

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Produção de extrato hidroalcoólico concentrado de partes aéreas de Artemisia annua

L. (Asteraceae) padronizado em artemisinina e investigação de seu uso na produção de formas

farmacêuticas sólidas.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar a droga vegetal.

Validar o método analítico em HPLC-UV de doseamento de artemisinina na droga

vegetal.

Caracterizar um extrato hidroalcoólico concentrado de A. annua.

Desenvolver péletes e granulados contendo o extrato hidroalcoólico concentrado de

Artemisia annua.

Formular comprimidos e cápsulas gelatinosas duras a partir dos granulados e de

cápsulas gelatinosas duras a partir de péletes.

Realizar validação parcial do método de doseamento de artemisinina para análise das

formas farmacêuticas obtidas.

Realizar caracterização física e físico-química das formas farmacêuticas obtidas.

28

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

As amostras de partes aéreas de A. annua (Asteraceae) foram provenientes do campo

experimental de plantas medicinais do CPQBA/UNICAMP. Foram coletadas no ano de 2012

e disponibilizadas já rasuradas e dessecadas. Foram reduzidas a pó em triturador tipo

liquidificador com copo de aço inoxidável monobloco Siemsen, e acondicionadas em saco

plástico ao abrigo da umidade e da luz.

3.2. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL

A avaliação de granulometria foi realizada em granulômetro BecTel, com cinco

tamises diferentes (abertura de malha de 710, 355, 250, 180 e 125 μm). O pó foi então

classificado de acordo com a recomendação da Farmacopeia Brasileira (2010).

A análise de perda por dessecação foi realizada em balança de infravermelho Ohaus

MB35, de acordo com método da Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010). O equipamento

foi programado para que indicasse o final da secagem quando a perda de massa da amostra se

tornasse constante. Aproximadamente 1,0 g da droga vegetal foi transferido, em triplicata,

para o recipiente da balança e espalhado sobre esta formando uma fina camada. Em seguida a

balança foi acionada e aguardou-se que a mesma indicasse (em porcentagem) a quantidade

das substâncias voláteis presentes.

O teste de doseamento de artemisinina foi realizado com o método analítico validado

(DIAWARA et al., 2011).

3.3. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE


3.3.1. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS ANALÍTICOS

Dois métodos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com detector de

absorção no ultravioleta foram testados, um sem pré-derivatização da artemisinina (BRIARS,

2013) e outro com pré-derivatização (DIAWARA et al., 2011).

29

O quadro 01 resume as condições cromatográficas que foram testadas para a escolha

do método analítico. Ao todo foram 08 condições e apenas na condição “1” foi feita análise de

artemisinina. Nas condições de “2” a “8” houve derivatização desta para o composto Q260. A

temperatura da coluna foi mantida em 30 ºC e o volume de injeção foi de 20 μL.

Quadro 01. Condições cromatográficas testadas para doseamento de artemisinina em

Artemisia annua L.

n Composição da

Fase Móvel

Proporção da

Fase Móvel

Fluxo da

Fase Móvel

(mL/min)

Coluna C18

1 Acetonitrila:Água 50:50 1,0 250 x 4,6 mm

(5 μm)

2 Acetonitrila:Ácido

Fórmico 0,2 % (v/v) 50:50 1,0

250 x 4,6 mm

(5 μm)


Fórmico 0,2 % (v/v) 60:40 1,0

250 x 4,6 mm

(5 μm)


Fórmico 0,2 % (v/v) 50:50 1,0

150 x 4,6 mm

(5 μm)


Fórmico 0,2 % (v/v) 40:60 1,0

150 x 4,6 mm

(5 μm)


Fórmico 0,2 % (v/v) 30:70 1,2

150 x 4,6 mm

(5 μm)


Fórmico 0,2 % (v/v) 35:65 1,2

150 x 4,6 mm

(5 μm)


Fórmico 0,2 % (v/v)

35:65 (0-8 min)

60:40 (10-15 min)

35:65 (17-20 min)

1,2 150 x 4,6 mm

(5 μm)

A derivatização da artemisinina consistiu na adição, em balão volumétrico de 10 mL,

de 4 mL de hidróxido de sódio 0,05 M (ou 0,2 %) a 1 mL da solução do padrão de

artemisinina ou de A. annua, aquecimento em banho-maria a 50 ºC durante 30 minutos,

resfriamento por 10 minutos e, em seguida, completou-se o volume do balão com ácido

acético 0,2 M (ZHAO, 1986; MARCHESE, 2001; ERDEMOGLU, 2007). Esta reação foi

testada em relação à necessidade de aquecimento a 50 ºC, ao uso de diferentes concentrações

de hidróxido de sódio (0,10 mol/L, 0,05 mol/L e 0,025 mol/L) e à necessidade de adição de

ácido acético 0,2 mol/L.

30

Foi utilizado cromatógrafo líquido Waters com módulo de separação e2695, detector

ultravioleta de arranjo de diodos Waters 2998, software Empower®, coluna Zorbax (Agilent)

Eclipse XDB-C18 de 150 x 4,6 mm (5 µm), pré-coluna C18 SecurityGuard Phenomenex.

Filtro em PVDF de 0,45 µm Millex®, 13 mm de diâmetro, foi utilizado para filtração das

soluções antes da injeção.

As soluções de análise foram preparadas pela pesagem de cerca de 1.250 mg da droga

vegetal seca foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL, aproximadamente 20 mL de

etanol 95 % PA foi adicionado e, em seguida, foi levado ao banho de ultrassom durante 40

minutos. Posteriormente, o volume foi completado com o mesmo solvente, homogeneizado e

filtrado, obtendo-se concentração de 50 mg/mL de A. annua. Esta foi derivatizada, filtrada em

0,45 μm e 20 μL foram injetados no sistema cromatográfico.

3.3.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

O método analítico foi validado segundo os parâmetros da Resolução Especial (RE) da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) nº 899 de 2003 (BRASIL, 2003), que

traz o Guia de Validação de Métodos Analíticos, ainda vigente e recomendado pela Resolução

RDC nº 26 de 2014, que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Os ensaios de

seletividade, linearidade e intervalo, precisão (níveis repetibilidade e intermediária), exatidão,

limite de quantificação, limite de detecção e robustez foram realizados.

A seletividade foi determinada pela análise do tempo de retenção do pico de interesse

em comparação ao tempo de retenção apresentado no cromatograma de análise do padrão.

Também foi feito a varredura no ultravioleta, de 190 a 400 nm, do pico de interesse em cinco

pontos diferentes, para verificação de sua pureza, e comparado com a varredura do pico de

análise do padrão de artemisinina (Sigma Aldrich, 2011).

A análise de linearidade foi realizada em um intervalo de 50 % a 150 % da

concentração central do método (50 mg/mL). Foi feito o preparo de uma solução principal e

posterior diluição desta para obter um mínimo de cinco soluções de análise. A partir da

análise cromatográfica destas soluções foi montada a curva de linearidade de concentração

versus AUC (Área Sob a Curva). Foram calculados o coeficiente de correlação linear (r), o

coeficiente de determinação ajustado (r²), o coeficiente angular (a) e o coeficiente linear (b),

com seus respectivos intervalos de confiança.

Uma solução de artemisinina padrão foi preparada pela pesagem e transferência para

balão volumétrico, onde foi solubilizado em etanol 95 % após 40 minutos de agitação em

31

banho de ultrassom. A partir da diluição desta, cinco soluções de concentrações decrescentes

foram obtidas e analisadas e a curva foi construída com valores de AUC versus concentração

(μg/mL).

Foi feito tratamento estatístico dos dados utilizando-se o software Action® 2.7 em que

foram realizados os testes de significância da regressão, por análise de variância (ANOVA),

teste de falta de ajuste linear (Lack of Fit), de normalidade dos resíduos, pelo método de

Anderson-Darling e teste de homocedasticidade dos resíduos, pelo método de Breush-Pagan.

Todos estes foram calculados com intervalo de confiança de 95 %.

A análise de precisão foi realizada nos níveis de repetibilidade e precisão

intermediária. A repetibilidade foi calculada após análise de, no mínimo, seis soluções da

droga vegetal. Todas as soluções foram preparadas pelo mesmo analista e em um único dia.

Para a análise da precisão intermediária o mesmo número de soluções foram analisadas,

porém, por um outro analista e em um dia diferente. O mesmo equipamento foi utilizado,

visto ser o único no laboratório. Foi calculada a média de cada nível e o desvio padrão

relativo (DPR) entre as determinações. A RE nº 899 recomenda que o valor de DPR seja de,

no máximo, 5 % (BRASIL, 2003) para quantificações de compostos em macro quantidades. A

Instrução normativa nº 04 (BRASIL, 2014) recomenda que o valor de DPR não seja superior

a 15 %.

A exatidão foi calculada pelo método de adição de padrão (BRASIL, 2010), em que

uma solução com quantidade conhecida de padrão de artemisinina foi adicionada a uma

solução contendo a droga vegetal (A. annua + Padrão de artemisinina), em triplicata. Tanto o

padrão quanto a droga vegetal foram analisados, individualmente, e após a adição do padrão a

solução resultante foi também analisada. Foi realizado um total de nove determinações, em

três diferentes concentrações (baixa, média e alta, em triplicata), contemplando o intervalo do

método. O valor da exatidão foi obtido pela relação entre a concentração do padrão

adicionado na amostra e a concentração do padrão antes da adição, em porcentagem.

Exatidão = [ (A. annua + Padrão artemisinina) - A. annua] x 100

Padrão artemisinina

Para o cálculo dos limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) foram construídas

três curvas analíticas com soluções de A. annua em concentrações baixas, próximas dos

supostos limites. A primeira solução continha 10 mg/mL de A. annua e foi diluída para

obtenção de, no mínimo, cinco concentrações diferentes e decrescentes da droga vegetal.

Foram calculados os coeficientes angular e linear de cada curva construída para calcular os

limites, conforme as equações da RE nº 899 de 2003.

32

LD = DPa x 3

IC

LQ = DPa x 10

IC

Em que DPa é o desvio padrão entre os coeficientes lineares das três curvas analíticas

e IC é a média dos coeficientes angulares das três curvas analíticas.

Para a análise da robustez do método, vários parâmetros foram variados com o

objetivo de reproduzir alterações que poderiam ocorrer na rotina analítica e interferir nos

resultados, como estabilidade da solução de leitura, comprimento de onda de leitura,

concentração de ácido fórmico na fase móvel, temperatura da coluna e fluxo da fase móvel.

Foi realizada a análise da condição central do método e uma variação para mais e para menos

de cada alteração, sendo obtidos três resultados em cada parâmetro. O resultado foi expresso

como DPR entre estes três valores.

Por se tratar de um método que utiliza sistema cromatográfico de separação, a

adequabilidade do sistema foi calculada em relação ao pico de interesse (BRASIL, 2010).

Foram calculados os parâmetros Fator de Capacidade (K), Resolução (R), Fator de Cauda (T)

e Pratos Teóricos (N) pelo software Empower® do equipamento cromatográfico. As

especificações foram referenciadas do guia de validação de métodos cromatográficos do Food

and Drug Administration (FDA, 1994).

3.4. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO DE Artemisia

annua L

No processo de extração foi utilizado álcool etílico PA 95 % como líquido extrator por

ser um solvente de baixa toxicidade, o que é importante devido à possibilidade de

administração oral, e por possuir boa capacidade de extração de artemisinina a partir de A.

annua (FLEMING, 2007).

Após o estabelecimento das condições mais favoráveis para extração de artemisinina

com maior eficiência, no procedimento de otimização, foi montado um sistema de percolação

no qual foi utilizado 2,0 kg de A. annua em pó em dois percoladores de capacidade de 10

litros cada. A percolação foi realizada de forma a extrair a quantidade máxima possível de

artemisinina.

O etanol 95 % foi adicionado em partes, sendo que cada uma foi mantida em contato

com a droga por 12, 24, 48 e 72 horas, em maceração estática (Quadro 02). Após cada período

de tempo os percoladores foram abertos em fluxo máximo e a fração foi coletada e juntada em

um recipiente único. Após cada coleta, uma nova fração de etanol 95 % era adicionada aos

33

percoladores, a massa de droga vegetal era ressuspendida manualmente com o auxílio de uma

espátula e deixada em maceração pelo tempo seguinte.

Quadro 02. Quantidade de solvente utilizado na percolação.

Etapas de

Extração

Frações de Etanol 95

% utilizadas (mL)

Tempo de contato com 2,0

kg de droga vegetal

1 4.000 12 horas

2 6.000 12 horas

3 5.000 24 horas

4 5.000 24 horas

TOTAL 20.000 72 horas

O teor de artemisinina e de resíduo seco foi calculado para cada fração e para o extrato

total, no qual ainda foram realizados ensaios de pH e de densidade relativa, conforme

Farmacopeia Brasileira (2010). O final da percolação foi determinado pelos resultados da

análise do teor de artemisinina e de resíduo seco de cada fração coletada.

As frações reunidas foram concentradas, sob pressão reduzida, a uma temperatura de

40º C e rotação de 70 rpm, em evaporador rotativo Buchi R-220 SE, até ser observada a

ocorrência de precipitação no balão do equipamento. O extrato concentrado foi caracterizado

quanto ao teor de artemisinina, densidade relativa, viscosidade, resíduo seco, pH e teor

alcoólico (BRASIL, 2010).

3.4.1. DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE RELATIVA

A determinação da densidade relativa foi realizada, em triplicata, pelo método do

picnômetro (BRASIL, 2010). Este foi limpo e seco e sua massa foi determinada. Em seguida,

água a 20 °C foi utilizada para preencher todo o conteúdo do picnômetro e sua massa foi

registrada. O picnômetro foi seco novamente, preenchido com amostra a 20 °C, limpado

externamente, e sua massa foi registrada.

A densidade foi calculada pela fórmula abaixo:

Densidade relativa = 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑐𝑜𝑚 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑔)− 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 (𝑔)

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑐𝑜𝑚 á𝑔𝑢𝑎 (𝑔)−𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑛ô𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 (𝑔)

34

3.4.2. DETERMINAÇÃO DA VISCOSIDADE

A viscosidade foi determinada, em triplicata, em viscosímetro de Brookfield DV-I+,

que mede a viscosidade em função da força necessária para o equipamento girar o spindle no

líquido (BRASIL, 2010).

Uma amostra do extrato foi colocada em um béquer de vidro e a velocidade de rotação

e o tipo dos spindles foram alterados até se obter um torque maior do que 20 %. O spindle foi

mergulhado na amostra e a rotação foi acionada. Após estabilização do valor no display, este

foi registrado, em unidades de cP (centiPoise).

3.4.3. DETERMINAÇÃO DO RESÍDUO SECO

O resíduo seco foi determinado, em triplicata, em balança de infravermelho Ohaus

MB35 em 1 g da droga vegetal a 105 ºC até peso constante. A balança calcula e mostra no

visor o valor de voláteis, em porcentagem. Em seguida, este foi subtraído de “100” para

obtenção do valor do resíduo.

3.4.4. DETERMINAÇÃO DO PH

O pH foi determinado, em triplicata, em potenciômetro (pHmetro) Tecnal Tec-3MP.

Previamente ao uso, foi realizada a calibração do equipamento utilizando soluções padrão de

pH 7,0 e 4,0.

3.4.5. DETERMINAÇÃO DE ÁLCOOL

O teor alcoólico foi determinado, pelo método de destilação, pois é o recomendado

para análise de extratos (BRASIL, 2010).

Uma quantidade de 35 mL do extrato foi adicionada em balão de vidro contendo

pérolas de vidro, para evitar ebulição violenta. Igual volume de água destilada foi adicionado

e o conjunto foi destilado até ser coletado cerca de 33 mL de líquido límpido. A densidade do

líquido foi determinada a 20 °C e o teor de álcool etílico foi determinado por meio de consulta

à tabela alcoométrica, que relaciona o teor alcoólico à sua densidade em solução (BRASIL,

2010).

35

3.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DOS MÉTODOS DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA

NAS FORMAS FARMACÊUTICAS PREPARADAS

Para realizar o doseamento de artemisinina nas formas farmacêuticas preparadas, o

método validado para análise da droga vegetal foi utilizado apenas após ser realizada a

verificação do método por meio da validação parcial do mesmo. Para isso, foram feitos os

ensaios de linearidade, seletividade e repetibilidade (BRASIL, 2003) na análise de cada forma

farmacêutica, péletes, comprimidos e cápsulas. Os parâmetros de adequabilidade do sistema

cromatográfico também foram calculados. Esta verificação do método se tornou necessária

para avaliar a influência dos resultados pelos constituintes adicionados na fabricação das

formas farmacêuticas.

3.6. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PÉLETES

Foi utilizado extrusor de bancada Caleva Extruder 20 e esferonizador de bancada

Caleva MBS 250 (Caleva®, UK). A malaxagem consistiu em misturar os adjuvantes e o

extrato concentrado em batedeira planetária, para a obtenção de uma massa sólida úmida

(Tabela 01). A extrusão foi feita em extrusor de rolos 30 rpm, com placa estática com

orifícios de 0,8 mm. A esferonização foi realizada em aparelho contendo uma placa rotatória

de esferonização com ranhuras perpendiculares, com velocidade de 1.500 rpm durante 1 min.

A secagem foi feita em leito fluidizado Hüttlin Mycrolab, com temperatura do ar a 60 ºC e

fluxo de 30 L/min.

Tabela 01. Composição dos péletes nas diferentes formulações testadas.

n Celulose(g)-Extrato(g)-PVP(g)

1 40 - 45 - 0,00

2 40 - 70 - 0,00

3 40 - 70 - 5,04

4 40 - 70 - 3,15

5 40 - 70 - 1,26

6 40 - 65 - 1,23

7 40 - 58 - 0,00

A caracterização foi realizada para avaliar os parâmetros de esfericidade, umidade e

distribuição de tamanho nas formulações e, após a encapsulação, foram avaliados os

36

parâmetros de desintegração, determinação de peso, uniformidade de conteúdo e doseamento

de artemisinina e perfil de dissolução.

3.6.1. CÁLCULO DA ESFERICIDADE DE PÉLETES

A esfericidade projetada (PS) dos péletes foi calculada por meio do programa de

análise processamento de imagens ImageJ versão 1.47v (8 de julho de 2013).

Fotomicrografias foram obtidas com lupa de aumento Leika MZ 6 e analisadas no software de

imagens LAS EZ versão 1.3.0. Cada determinação foi realizada com um mínimo de 300

péletes.

O programa calculou os parâmetros das imagens, que foram utilizadas no cálculo da

esfericidade projetada, segundo fórmula abaixo (SANTOS et al., 2004).

PS = 4𝐴

𝜋.𝑑2

Em que A = área do péletes; e d = maior distância da partícula (ou diâmetro Feret).

3.6.2. DETERMINAÇÃO DE UMIDADE DOS PÉLETES

Após a secagem dos péletes em leito fluidizado, estes foram avaliados quanto ao seu

conteúdo de umidade, ou teor de voláteis, em balança de determinação de umidade a uma

temperatura de 105 ºC até peso constante. Este ensaio foi realizado em triplicata e seu

resultado foi dado em porcentagem de voláteis ± desvio padrão.

3.6.3. DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DOS PÉLETES

O ensaio de distribuição de tamanho foi realizado em analisador de tamanho de

partículas por difração a laser Beckman Coulter LS I3 320. Uma quantidade de 20 g de

péletes foi submetida à análise. Foram calculados os valores do tamanho médio e dos

diâmetros d10 e d90, que representam os diâmetros abaixo dos quais se situam

respectivamente 10 % e 90 % das partículas. Em seguida foi calculada a amplitude de

tamanho dos péletes (d90/d10), parâmetro que revela a dispersão da distribuição. Quanto

menor o seu valor, menor será a dispersão de tamanho entre as partículas (JEREMIAS, 2012).

3.7. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPRIMIDOS E CÁPSULAS

37

O método utilizado para a obtenção dos granulados foi o de via úmida, em que o

extrato líquido concentrado de A. annua foi adicionado à mistura de excipientes contendo

celulose microcristalina 102 (Mintgai Chemical), lactose monohidratada (DFE Pharma) e

glicolato de amido sódico (Embrafarma). Após homogeneização, a mistura foi granulada em

tamis de 2 mm e submetida à secagem em estufa com circulação e renovação de ar, Solab

NO35/5, a 40 °C, por 24 h. Em seguida foram adicionados os lubrificantes estearato de

magnésio (Magnesita, lote 11677105) e silicato de magnésio hidratado (Mapric) e a mistura

foi novamente homogeneizada (Quadro 03).

Quadro 03. Composição do granulado dos comprimidos

Composição Proporção

Extrato líquido concentrado 42,3 %

Celulose microcristalina 102 39,5 %

Lactose monohidratada 13,2 %

Glicolato de amido sódico 1,0 %

Estearato de magnésio 2,5 %

Silicato de magnésio hidratado 1,5 %

A formulação foi submetida à compressão em prensa hidráulica Carver Laboratory

Press, com força de uma tonelada, durante 10 s, utilizando punção côncavo de 11 mm de

diâmetro.

Para encapsulação, foi adicionado ao granulado dos comprimidos o lubrificante

dióxido de silício coloidal (Cabot). Foram utilizadas cápsulas de tamanho n° 00 em

encapsulador manual de 180 poços.

Os granulados foram submetidos à análise de umidade e de teor de artemisinina. Os

comprimidos foram caracterizados quanto à dureza e friabilidade e, assim como as cápsulas,

foram submetidos aos testes de desintegração, determinação de peso, uniformidade de

conteúdo, doseamento de artemisinina e perfil de dissolução.

3.7.1. TESTE DE DUREZA DE COMPRIMIDOS

O ensaio de dureza foi realizado em durômetro de bancada Nova Ética 298 DGP. O

resultado foi expresso em Newtons (N). Foram utilizadas 10 unidades no teste. O resultado do

teste é informativo (BRASIL, 2010).

38

3.7.2. TESTE DE FRIABILIDADE DE COMPRIMIDOS

O teste de friabilidade foi realizado em equipamento Nova Ética, modelo 300. Foram

utilizados 20 comprimidos no teste. Todos foram pesados antes do teste, colocados no

aparelho e submetidos a 100 rotações. Em seguida, os comprimidos foram retirados, limpos e

pesados novamente. Nenhuma unidade deve estar quebrada, lAUCada, partida ou rachada e a

diferença de peso entre o peso inicial e o peso após o teste não deve ser superior a 1,5 % do

peso inicial (BRASIL, 2010).

3.8. TESTE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

O teste de desintegração foi realizado em desintegrador Nova Ética 301 AC. Foram

utilizados 6 unidades de cada forma farmacêutica no teste, com utilização de disco em cada

tubo da cesta, exceto para cápsulas. Foram utilizados água purificada e tampão pH 1,2 como

líquido de imersão, mantidos a 37 ± 1,0 ºC. Ao final do teste todas as unidades devem estar

completamente desintegradas (BRASIL, 2010).

3.9. TESTE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

Para os comprimidos, vinte unidades foram pesadas individualmente (Pn). O peso

médio (Pm) foi calculado dividindo-se a soma do peso de todas as unidades por 20. A partir

de então foi calculado a variação do peso de cada comprimido (Vn) em relação ao peso

médio, em porcentagem.

Vn (%) = Pn− Pm

Pm x 100

Para as cápsulas, vinte unidades cheias foram pesadas individualmente. O conteúdo de

cada cápsula foi retirado e a cápsula vazia foi pesada. O peso do conteúdo de cada unidade

(Pcn) foi calculado pela diferença entre o peso da cápsula cheia e da cápsula vazia. O peso

médio do conteúdo (Pmc) foi calculado dividindo-se a soma do peso do conteúdo de todas as

unidades por 20. A partir de então foi calculado a variação do peso do conteúdo de cada

unidade (Vcn) em relação ao peso médio do conteúdo, em porcentagem.

Vcn (%) = Pcn− Pmc

Pmc x 100

39

A variação permitida foi de até ± 7,5 %. Até duas unidades podem estar acima desta

especificação, porém, nenhuma pode ser maior que ± 15,0 % (BRASIL, 2010).

3.10. TESTE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

O teste de doseamento foi aplicado em 10 unidades, individualmente. A partir dos 10

resultados obtidos, foi calculada a média do teor (Tm), o desvio padrão (DP) e o Valor de

Aceitação (VA) pela equação abaixo.

VA = |M - Tm| + k.DP

Em que M é o valor de referência, podendo ser de 98,5 a 101,5, dependendo do valor

da média (Tm) das unidades. k é a constante de aceitabilidade, igual a 2,4 para 10 unidades

testadas na primeira etapa, e igual a 2,0 na segunda etapa, em que mais 20 unidades são

testadas e o cálculo é feito sobre 30 unidades. Logo, a equação fica da seguinte forma.

VA = |M - Tm| + 2,4.DP

O valor de aceitação não deve ser superior a 15,0 (BRASIL, 2010).

3.11. PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

O perfil de dissolução foi realizado em dissolutor Vankel, modelo VK 7000, com cuba

de 1000 mL, utilizando pá como aparato. Para degaseificação dos meios de dissolução foi

utilizado banho de ultrassom Unique USC 1400 e bomba de vácuo Tecnal TE-058. O teste foi

feito em dois meios de dissolução diferentes, todos mantidos a 37 ± 0,5 ºC por banho

termostatizado Vankel, modelo VK750D: tampão HCl pH 1,2 e tampão pH fosfato 6,8,

ambos a 100 rpm, preparados de acordo com a Farmacopeia Americana (USP, 2007).

Cada unidade testada foi adicionada à cuba com a rotação da pá desligada. O teste foi

feito em triplicata para cada forma farmacêutica e foram utilizadas seringas individualizadas

de coleta das alíquotas em cada cuba. A coleta foi feita a uma distância de 1 cm da parede da

cuba e na região intermediária entre o topo do meio de dissolução e o topo da pá, sendo que o

meio não foi reposto após cada coleta.

Foram coletadas alíquotas nos tempos de 5, 10, 20, 30, 40 e 60 minutos, que foram

imediatamente filtradas em filtro de 0,45 μm. Em cada alíquota foi feito o doseamento de

artemisinina, pelo método verificado, e foi construída a curva de dissolução (tempos de coleta

versus porcentagem dissolvida), com extrapolamento da curva para t=0. A porcentagem

40

dissolvida foi calculada sobre a quantidade esperada para cada forma farmacêutica,

considerada como a média obtida na análise de uniformidade de conteúdo.

Foi calculada a eficiência de dissolução (ED%), em porcentagem, de cada perfil de

dissolução, pela relação entre a AUC do gráfico e a área total do retângulo ATR, definido pela

ordenada em 100 % de dissolução e a abcissa em 60 min (BRUM et al., 2012).

ED% = AUC

ATR x 100

Foram comparados os valores de ED% e os valores da dissolução em 60 minutos entre

cada forma farmacêutica em um mesmo meio de dissolução, e entre a mesma forma

farmacêutica em diferentes meios de dissolução.

Os cálculos estatísticos foram feitos por meio do teste F de variância e do teste t de

comparação entre médias, ambos com nível de confiança de 95 %, utilizando o software

Action® versão 2.7, instalado no software Excel® 2010.

O fator de semelhança (F2) entre perfis de dissolução foi calculado segundo equação

descrita na RDC da ANVISA nº 31 (BRASIL, 2010):

F2 = 50 x log{[1 +1

𝑛∑ (%𝐿1 − %𝐿2)]𝑛

𝑡=1-0,5

x100}

Em que, n = número de pontos de coleta, %L1 = porcentagem liberada em um tempo t

de uma das formas farmacêuticas, %L2 = porcentagem liberada em um tempo t da forma

farmacêutica a ser comparada.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. CARACTERIZAÇÃO DA DROGA VEGETAL

No teste de perda por dessecação, foi obtido um resultado de 8,17 ± 0,16 %, próximo

ao encontrado por Rodrigues et al. (2006), de 9 % em amostras de A. annua provenientes do

CPQBA. Na Farmacopeia Brasileira 5ª edição o teor máximo aceitável nas diferentes

monografias é de 6 a 15 % (BRASIL, 2014).

Na análise granulométrica (Figura 05) quase a totalidade das partículas do pó passou

pelo tamis de 710 µm (98,2 %) e menos de 40 % (18,8 %) passou pelo tamis de 250 µm. No

total, 86,6 ± 0,46 % das partículas tinham entre 180 µm e 710 µm, o que classificou o pó

como moderadamente grosso.

41

Figura 05. Distribuição de tamanho das partículas

Fonte: Próprio autor.

O teor de artemisinina foi de 1,15 ± 0,05 %, próximo ao relatado por outros autores

para a A. annua proveniente da UNICAMP, de 1,21 % (Celeghini, 2009; Rodrigues et al.,

2006), 1,16 % (BILIA et al., 2006) e 1,13 % (SILVA et al., 2012).

4.2. AVALIAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA

NA DROGA VEGETAL

4.2.1. DERIVATIZAÇÃO DA AMOSTRA

A varredura no ultravioleta entre 200 e 400 nm de uma solução de artemisinina

resultou em um espectro com máximos de absorbância em comprimentos de onda próximos a

200 nm (Figura 06). Pilkington (2012) encontrou uma absorção máxima de artemisinina (1

mg/mL) em 192 nm. Contudo, análise cromatográfica de artemisinina neste comprimento de

onda aumenta o ruído da linha de base e o limite de detecção em até 4 vezes em relação, por

exemplo, a 210 nm, valor recomendado por Lapkin (2009).

Figura 06. Varredura da artemisinina sem derivatização


13,216 Peak 1

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

nm

200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00

42

Pela ausência de grupos cromóforos na molécula, o método de CLAE com detector

eletroquímico é recomendado por Acton (1985) e Charles et al. (1990), pois a análise com

detector ultravioleta em comprimento de onda baixo é uma desvantagem do método, visto que

várias outras substâncias podem absorver nesta faixa de radiação, reduzindo a seletividade do

método e aumentando o erro nas análises de quantificação (MARCHESE, 2001).

Um método de análise proposto por Zhao e Zeng (1986) que realiza pré-derivatização

da artemisinina, com hidróxido de sódio, aquecimento e ácido (Figura 07), é uma alternativa

para gerar uma substância com maior absorção no ultravioleta, o composto Q260, e vem

sendo utilizado em várias pesquisas para aumentar a sensibilidade do método tradicional

(HAO, 2002; DIAWARA et al., 2011; SUBERU, 2013). O composto Q260 recebeu este

nome devido ao seu máximo de absorção, em aproximadamente 260 nm.

Figura 07. Reação de derivatização da artemisinina

Fonte: Zhao (1986).

A derivatização levou à formação do composto Q260, com máximo de absorção

claramente definido, em 255 nm, assim como o obtido por Erdemoglu et al. (2007). A figura

08 mostra o gráfico de varredura ultravioleta de 200 a 400 nm, onde fica evidenciada a

formação do composto Q260, diferentemente do espectro ultravioleta da artemisinina,

demonstrado na figura 06.

Figura 08. Varredura do Composto Q260 de Artemisia annua L. derivatizada


6,101 Extracted

6,151 Extracted

6,200 Extracted

6,242 Extracted

6,297 Extracted

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

nm

200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00 400,00

43

Foi verificado que o uso de NaOH a 0,025 M resultou em valores de AUC reduzidos,

o que indicou uma provável derivatização ineficiente. Quanto ao uso de NaOH 0,1 M, os

valores de AUC foram iguais aos obtidos com NaOH 0,05 M. Logo, foi mantido na reação o

uso de NaOH 0,05 M, como preconizado.

Foi também investigado se o aquecimento era necessário para a reação. Foi verificado

que, após a adição de NaOH 0,05 M, ocorreu um aumento progressivo da AUC que atingiu

um platô em torno de 50 min (Figura 09), após o qual começou a reduzir. Foram comparados

os cromatogramas de artemisinina e do composto formado, sem aquecimento, e foi

demonstrado o desaparecimento do pico de artemisinina (Figuras 10 e 11), o que indicou que

esta reagiu totalmente.

Figura 09. Valores de AUC após adição de NaOH 0,05 M sem aquecimento


Figura 10. Cromatograma da artemisinina antes da derivatização


AU

-0,004

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

Artemisinina

44

Figura 11. Cromatograma da artemisinina após a derivatização (ampliação)


Após a reação com NaOH, a derivatização seguiu com a adição de ácido acético. Foi

observado que os valores de AUC reduziram a partir da adição do ácido, até se estabilizar

após aproximadamente 35 min (Figura 12). Este comportamento ocorreu com ou sem

aquecimento, e poderia resultar em erro de quantificação do método caso a injeção fosse feita

em momentos distintos deste intervalo.

Portanto, tendo em vista estes resultados, foi determinado que fosse aguardado um

tempo de estabilização de, no mínimo, 40 min após a adição de ácido para injetar no sistema

cromatográfico.

Figura 12. Estabilização da solução de leitura após a derivatização


Com aquecimento, após a estabilização, os valores de AUC foram 14,6 % menores do

que sem aquecimento. Logo, para aumentar os limites de detecção e quantificação do método

e, como foi visto que a derivatização foi completa sem aquecimento, este não foi utilizado nas

derivatizações. Liu et al. (2008) utilizaram a derivatização pós-coluna para quantificação do

45

composto Q292, formado após a adição de NaOH, sem uso de ácido acético, pois julgaram o

método insatisfatório devido à instabilidade do composto Q260.

Existem referências de que o composto Q292 seja também instável (MARCHESE,

2001; ZHAO, 1986). Neste trabalho foi observado que a sensibilidade do composto Q292 foi

cerca de vinte vezes maior que a do composto Q260, devido a uma maior capacidade de

absorção no ultravioleta. Contudo, sua instabilidade foi consideravelmente alta (Figura 13),

assim como referenciado por Marchese (2001). A redução do valor de AUC, no período de 8

horas, chegou a ser aproximadamente dez vezes maior (-26,99 % versus -2,63 %) para o

composto Q292.

Figura 13. Estabilidade do composto Q260 versus composto Q292


Durante a validação para análise do composto Q292, a exatidão do método foi quase

10 % menor em relação ao método validado para o Q260 e, no ensaio de robustez, o teste de

estabilidade da solução de leitura demonstrou perda de cerca de 2,2 % a cada 40 min, o que

além de interferir na quantificação de artemisinina, dificulta demasiadamente a rotina

laboratorial, pois seria necessário preparar cada solução de leitura imediatamente antes de

cada injeção. Portanto, optou-se pelo método de análise do composto Q260.

A derivatização da artemisinina foi então realizada com adição de 4 mL de hidróxido

de sódio 0,05 M a 1 mL da amostra, em balão volumétrico de 10 mL, aguardou-se em repouso

por 50 min em temperatura ambiente, e completou-se o volume do balão com ácido acético

0,2 M. Foram aguardados, no mínimo, 40 min para injeção no sistema cromatográfico.

4.2.2. DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

46

A condição número 1, sem derivatização, obteve resultado similar ao desenvolvido por

Stringham (2009) para análise de matéria-prima, com cromatograma em 210 nm. O padrão de

artemisinina (1,0 mg/mL) foi dissolvido em acetonitrila e eluiu em aproximadamente 16,5

minutos, com pico de baixa intensidade (Figura 14) na concentração utilizada. Stringham

(2009) injetou a artemisinina 5,0 mg/mL, concentração em que obteve melhor estabilidade da

linha de base do cromatograma.

Visto que a A. annua proveniente do CPQBA/UNICAMP, utilizada neste trabalho,

possui aproximadamente 1,2 % (m/m) de artemisinina (CELEGHINI et al., 2009;

RODRIGUES et al., 2006), uma concentração superior a 400 mg/mL seria necessário para

obter um pico com resolução tão boa quanto a do padrão a 5 mg/mL. Esta concentração se

mostrou impraticável devido ao volume que ocuparia na vidraria volumétrica utilizada.

Figura 14. Cromatograma da artemisinina padrão sem derivatização, com fase móvel

acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6 mm, 210 nm.


Na injeção de solução de A. annua a 50 mg/mL foi observado nas injeções posteriores

o surgimento de picos de compostos remanescentes na coluna (Figura 15). Isso evidenciou a

necessidade do uso de um gradiente para limpeza da coluna, como feito por Pilkington

(2012), Briars (2013) e Suberu (2013), com aumento da proporção de acetonitrila durante um

curto período de tempo.

Figura 15. Cromatograma mostrando picos de compostos remanescentes da injeção da

amostra, com FM acetonitrila:água (50:50), 1 mL/min, coluna C18 5 µm, 250 x 4,6 mm


AU

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00

47

A partir da condição 2 a artemisinina foi derivatizada e a fase móvel foi alterada para

acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) (50:50), com detecção do composto Q260 em 255 nm.

Nesta condição pico do composto Q260 eluiu em 5,2 min, muito próximo das demais

substâncias presentes na droga vegetal, prejudicando a seletividade do método. Isso também

ocorreu na condição 3, com 60 % de acetonitrila. Com a coluna de 150 mm, nas condições 4 e

5, o pico de interesse também eluiu juntamente com outras substâncias, utilizando fase móvel

nas proporções de 50:50 e 40:60, respectivamente.

Erdemoglu (2007) obteve boa separação e boa sensibilidade do método com

acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) (50:50), porém, extraiu a artemisinina da droga vegetal

com n-hexano e, por isto, o cromatograma continha menos picos interferentes. Baraldi et al.

(2007) conseguiram separar tanto a artemisinina (210 nm) quanto os flavonoides (270 nm e

350 nm) presentes em A. annua com esta fase móvel, com o fluxo de 1,3 mL/min, porém, sem

derivatizar.

Para aumentar o tempo de retenção e melhorar a separação do composto Q260, a

acetonitrila foi reduzida para 30 % na condição 6, com fase móvel de 1,2 mL/min. Essa

condição resultou em uma boa separação do pico de interesse e com tempo de retenção de

10,9 min. Na condição 7, com 35 % de acetonitrila o tempo de retenção reduziu para 6,3 min,

sendo obtida uma boa separação, resultado similar ao obtido por Peng et al. (2006) com

CLAE/ELSD, em que utilizaram a mesma fase móvel, com um fluxo menor e obtiveram boa

separação de artemisinina, com tempo de retenção de 7,8 min.

Na última condição testada foi aplicado um gradiente de fluxo da fase móvel,

iniciando em acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) 35:65 até 8 min, aumentando a

acetonitrila para 60 % durante 5 minutos, retornando para 35 % em seguida e finalizando com

20 min de corrida. Este gradiente retirou as substâncias retidas na coluna mais rapidamente,

reduzindo o tempo de análise. Desta forma, o método foi fixado nestas condições, com

detecção em 255 nm.

O sinal analítico do composto Q260 foi aproximadamente sessenta vezes maior do que

o da artemisinina devido ao surgimento de grupos cromóforos após a derivatização (Zhao,

1986). A figura 16a mostra o fraco sinal analítico da artemisinina tanto no padrão quanto na

droga vegetal e fica claro na figura 16b o aumento da absorção do composto Q260, o que

permitiu o uso de menores concentrações de artemisinina nas soluções de análise.

48

Figura 16a. Cromatograma da Artemisia annua L. e do padrão de artemisinina sem

derivatizar, em acetonitrila:ácido fórmico 0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min.

Figura 16b. Cromatograma da Artemisia annua L. derivatizada, em acetonitrila:ácido fórmico

0,2 % (v/v) gradiente, 1,2 mL/min.


Foi possível observar a importância do gradiente no cromatograma, pois, vários outros

picos surgiram no intervalo do gradiente. Uma corrida de 60 minutos demonstrou que

nenhuma outra substância ficou na coluna após os 20 min de corrida do método. Uma injeção

apenas dos solventes e reagentes utilizados (Etanol 95 %, hidróxido de sódio 0,05 M e ácido

acético 0,2 M) foi realizada e demonstrou que estas substâncias eluíram em torno de 1,6

minutos, não influenciando a resolução do pico de interesse.

4.3. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE


4.3.1. SELETIVIDADE

Os espectros de varredura no ultravioleta do pico de A. annua (Figura 17)

demonstraram que o pico é de uma única substância. A Figura 18 mostra a sobreposição dos

cromatogramas da A. annua e do padrão de artemisinina e demonstrou que o tempo de

retenção do composto Q260 de ambos são similares, em torno de 6,3 min, o que também

demonstrou adequada seletividade do método analítico.

49

Figura 17. Espectro de varredura ultravioleta de 200 a 400 nm do composto Q260 de

Artemisia annua L.


Figura 18. Cromatogramas sobrepostos do composto Q260, em 255 nm, da Artemisia annua

L. (preto) e do padrão (azul), identificando o composto Q260.


4.3.2. LINEARIDADE E INTERVALO

A curva analítica do padrão de artemisinina (Figura 19) construída antes da análise da

linearidade da droga vegetal, foi o primeiro indício de que o método apresenta linearidade

entre concentração do analito e resposta do detector. Ela foi utilizada para a realização dos

cálculos de quantificação de artemisinina nas demais análises da validação. Este método de

quantificação é denominado “padronização externa” (RIBANI et al., 2004).

Figura 19. Curva analítica do padrão de artemisinina


50

Tabela 02. Dados da curva analítica do padrão de artemisinina

Coeficiente de

correlação linear

(r)

Coeficiente de

determinação

ajustado (r²)

Faixa de

Concentração

(μg/mL)

Intervalo de

confiança de

“a”

Intervalo de

confiança de

“b”

0,9999 0,9996 247,9 a 743,8 1.214,20 a

1.241,26

-32.440,56 a

-18.264,24

O valor do coeficiente de correlação linear (0,9999) atendeu à especificação proposta

pela RE nº 899 de 2003, de maior que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável

linearidade entre os valores de AUC e as concentrações analisadas. O teste de ANOVA

demonstrou significância da regressão linear (p = 0,00), o teste de falta de ajuste indicou

ausência de falta de ajuste dos pontos da curva analítica (p = 0,11) e o teste de Anderson-

Darling indicou normalidade dos resíduos da curva (p = 0,47).

Na análise da linearidade da artemisinina em amostras de A. annua, o valor do

coeficiente de correlação linear (0,9997) atendeu à especificação proposta pela RE nº 899 de

2003, de maior que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável linearidade entre os valores

de AUC e as concentrações analisadas. O teste de ANOVA demonstrou significância da

regressão linear (p = 0,00), ou seja, o modelo linear de regressão representa

significativamente os valores. O teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste dos

pontos na curva analítica (p = 0,78). O teste de Anderson-Darling indicou a distribuição

normal dos resíduos (p = 0,99) no intervalo avaliado. O teste de Breush-Pagan indicou

presença de homocedasticidade, ou seja, variância similar entre os erros (p = 0,22) nas

diferentes concentrações do intervalo avaliado. Os gráficos de linearidade e de resíduos estão

plotados na figura 20.

Figura 20. Gráfico da linearidade e de resíduos da análise de Artemisia annua L.


51

Tabela 03. Dados da Linearidade da Análise de Artemisia annua L.

Coeficiente de

correlação

linear (r)

Coeficiente de

determinação

(r²) ajustado

Faixa de

Concentração

(mg/mL)

Intervalo de

confiança de

“a”

Intervalo de

confiança de

“b”

0,9997 0,9925 25,0 a 75,0 12.701,87 a

14.045,43

-74.531,98 a

3.575,72

Diversos dos trabalhos encontrados sobre validação de método analítico para análise

de artemisinina em A. annua descrevem apenas os parâmetros obtidos na análise do padrão de

artemisinina e não da droga vegetal (CELEGHINI, 2009; MARCHESE, 2001;

ERDEMOGLU, 2007; LIU, 2007). Desta forma, a linearidade do método utilizado na análise

da droga vegetal não é determinada. O padrão possui pureza maior que 98 %, enquanto que a

droga vegetal possui apenas de 0,01 a 1,5 % de artemisinina (FOGLIO, 2005), logo, trata-se

de amostras muito diferentes. Todas as demais substâncias presentes na matriz complexa da

droga vegetal podem interferir na linearidade do método no intervalo verificado, sendo assim,

se faz importante a avaliação da linearidade na análise da droga vegetal, para qual o método

se destinará.

4.3.3. PRECISÃO

4.3.3.1. REPETIBILIDADE

O DPR calculado foi de 3,0 % (Tabela 04), o que demonstra que o método é preciso

ao nível de repetibilidade.

Tabela 04. Resultados da repetibilidade da análise de Artemisia annua L

n

Concentração

A. annua

(mg/mL)

AUC

Teor de

artemisinina

(%)

Média

(%)

DPR

(%)

1 49,9923 685.860,0 1,16

1,11 3,0

2 49,9555 659.909,5 1,12

3 49,8086 643.043,0 1,09

4 49,9555 631.820,0 1,07

5 50,0290 672.993,0 1,14

6 50,0290 629.585,5 1,07

7 49,8821 652.763,5 1,11

8 49,9923 646.466,5 1,10

52

4.3.3.2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA

O DPR calculado entre as determinações dos dois analistas foi de 4,5 % (Tabela 05), o

que atende ao especificado (BRASIL, 2014), demonstrando que o método é capaz de obter o

mesmo resultado com precisão dentro de um mesmo laboratório, com variâncias

significativamente iguais (p = 0,79, ANOVA, IC = 95 %).

Tabela 05. Resultados da precisão intermediária da análise da droga vegetal.

n

Concentração

A. annua

(mg/mL)

AUC

Teor de

artemisinina

(%)

Média

(%)

DPR

(%)

An

ali

sta 1

– D

ia 1

1 49,99 685.860,0 1,16

1,15 4,5

2 49,95 659.909,5 1,12

3 49,81 643.043,0 1,09

4 49,95 631.820,0 1,07

5 50,03 672.993,0 1,14

6 50,03 629.585,5 1,07

7 49,88 652.763,5 1,11

8 49,99 646.466,5 1,10

An

ali

sta 2

– D

ia 2

9 50,18 703.686,5 1,19

10 50,21 687.218,0 1,16

11 50,10 723.574,5 1,22

12 50,40 715.031,0 1,20

13 50,21 698.185,5 1,18

14 50,36 731.997,0 1,23

15 50,14 685.090,5 1,16

16 50,18 685.591,0 1,16

Os resultados de DPR de 3,0 % para repetibilidade e de 4,5 % para precisão

intermediária foram similares e até inferiores aos obtidos em outros trabalhos, utilizando

diferentes métodos (Tabela 06).

Tabela 06. Precisão obtida por outros trabalhos.

Autores Rehder et

al. (2002)

Liu

(2007)

Celeghini et

al. (2009)

Diawara et

al. (2011)

Suberu et

al. (2013)

Método CLAE/IR CLAE/ELSD CLAE/IR CLAE/UV CLAE/EM

Repetibilidade 9,1 % 1,0 a 4,7 % 0,66 % 2,7 % 7,3 %

Intermediária - 1,8 a 4,5 % 0,66 % 7,0 % 7,9 %

53

IR: Detector de Índice de Refração; ELSD: Detector de Espalhamento de Luz Evaporativo; UV: Detector de

Ultravioleta; EM: Detector de Espectroscopia de Massas.

4.3.4. EXATIDÃO

Os resultados obtidos foram muito próximos do ideal, de 100,0 % (Tabela 07), com

exatidão média de 100,1 ± 4,5 %. Este método foi mais exato do que o obtido por outros

trabalhos, utilizando diferentes métodos (Tabela 08).

Tabela 07. Resultados da exatidão, em três níveis, da análise de Artemisia annua L.

A. annua

(mcg/mL)

Padrão de

Artemisinina

(mcg/mL)

A. annua +

Artemisinina

(mcg/mL)

Exatidão (%) Média

(%)

DPR

(%)

Baixa 250,63 126,31

370,07 94,6

100,1 4,5

372,13 96,2

371,81 95,9

Média 552,98 126,31

688,55 107,3

685,43 104,9

684,88 104,4

Alta 793,83 136,54

928,56 98,7

927,76 98,1

931,80 101,0

Tabela 08. Exatidão obtida por outros trabalhos.

Autores Rehder et al.

(2002)

Liu

(2007)

Celeghini et

al. (2009)

Diawara et al.

(2011)

Suberu et al.

(2013)

Método CLAE/IR CLAE/ELSD CLAE/IR CLAE/UV CLAE/EM

Exatidão 95,24 ± 8,7% 97,9 ± 3,8% 103,17 ± 0,6% 102,3 ± 16,8% 103,59 ± 8,4%


Ultravioleta; EM: Detector de Espectroscopia de Massas.

4.3.5. LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO

Foram encontrados os limites descritos na tabela 09. A precisão ficou entre 3,5 % e 5,6

% e a exatidão ficou entre 80,5 % e 98,5 %, sendo aceitos valores de precisão de até 15 % e

de exatidão de 80 % a 120 %, em baixas concentrações do analito (RIBANI et al., 2004). A

54

curva analítica nesta concentração não demonstrou falta de ajuste linear (p = 0,90) e os

resíduos obtiveram distribuição normal (p = 0,62), com intervalo de confiança de 95 %.

Tabela 09. Resultados da análise do LD e LQ

Parâmetros Resultados

LD 1,3 μg/mL de artemisinina

LQ 4,0 μg/mL de artemisinina

Concentração 0,5 a 10,0 mg/mL de A. annua

r² ajustado 0,9951

Como podem ser observados na tabela 10, os limites calculados aqui foram menores

que o obtido em vários trabalhos que também utilizaram cromatografia, porém, com outros

detectores acoplados. Diawara et al. (2011) são o único exemplo que, além do detector de

ultravioleta, também realizaram derivatização da artemisinina na análise. Estes resultados

demonstraram a eficiência da derivatização da artemisinina que, ao gerar o composto Q260,

aumentou sua absorção e, consequentemente, aumentou os limites de detecção e quantificação

do método.

Tabela 10. Limites de detecção e quantificação de artemisinina obtida por outros trabalhos.

Autores Rehder et al.

(2002)

Liu

(2007)

Celeghini

et al. (2009)

Diawara et

al. (2011)

Suberu et

al. (2013)

Método CLAE/IR CLAE/ELSD CLAE/IR CLAE/UV CLAE/MS

LD 25 mg/mL A. annua 40 μg/mL 2,2 μg/mL 2,7 μg/mL 0,13 ng/mL

LQ 85 mg/mL A. annua 100 μg/mL 7,5 μg/mL 10,0 μg/mL 0,41 ng/mL


Ultravioleta; MS: Detector de Espectroscopia de Massas.

4.3.6. ROBUSTEZ

Os resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 11. Todos os valores de DPR

ficaram abaixo de 2,4 %, demonstrando que o método pode ser considerado robusto para os

parâmetros avaliados. Alguns trabalhos afirmam que o método é robusto, utilizando esta

palavra de maneira genérica, sem ter sido avaliada nenhuma alteração no método (REHDER,

2002; SUBERU, 2013), o que vai a desencontro com o significado analítico da palavra

(RIBANI et al., 2004; BRASIL, 2003).

55

Tabela 11. Resultados da robustez do método analítico na análise de Artemisia annua L.

Parâmetro avaliado Condição alterada DPR (%)

Estabilidade da solução Entre 0 e 210 minutos 0,58

Comprimento de onda ± 2 nm 0,90

Concentração de ácido fórmico na fase móvel ± 10 % (v/v) 0,50

Temperatura da coluna ± 2 ºC 0,40

Fluxo da fase móvel ± 0,03 mL/min 2,40

4.3.7. ADEQUAÇÃO DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO

Os valores obtidos, em triplicata, estão listados na tabela Tabela 12 e todos ficaram

dentro das especificações recomendados pelo FDA (1994), certificando a adequada separação

do pico de interesse.

Tabela 12. Adequabilidade do Sistema do Cromatograma de Artemisia annua L.

Parâmetros Especificação Resultado ± DP

Fator de Capacidade (K) > 2,0 5,23 ± 0,04

Resolução (R) > 2,0 6,27 ± 0,06

Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 1,08 ± 0,00

Pratos Teóricos (N) > 2.000 9.246,7 ± 113,80

4.4. OBTENÇÃO DO EXTRATO CONCENTRADO DE Artemisia annua L

O tempo total de maceração foi de 72 horas e a proporção droga/solvente utilizada foi

de 1:10. Bilia et al. (2006) e Baraldi et al. (2008) trabalharam com as mesmas condições para

obtenção de extrato hidroalcoólico a partir de A. annua. A utilização de quatro etapas de

extração é comumente utilizada no processo tradicional de extração (RODRIGUES et al.,

2006).

A quantidade de artemisinina extraída em cada etapa da extração (figura 21)

demonstrou que na quarta fração seu teor foi quase vinte vezes menor do que na primeira. A

sua coloração visivelmente mais clara também auxiliou na determinação do final da

percolação. Vinte litros de etanol 95 % foram utilizados para cada 2 kg de A. annua pó. Como

a percolação foi realizada em dois percoladores, foram obtidos 40 litros de extrato.

56

Figura 21. Quantidade de artemisinina (g) e de resíduo seco (%) em cada etapa da extração


A artemisinina extraída a partir da droga vegetal seca foi de 0,92 %, o que resultou em

uma eficiência de 80 % (Figura 22), em relação ao conteúdo de artemisinina determinado na

análise de precisão intermediária (1,15 ± 0,05 %). Como a eficiência da extração

normalmente relatada está em torno de 60 % a 80 % (BRIARS, 2013), o resultado obtido aqui

foi considerado satisfatório já na terceira etapa, resultando em uma proporção droga/solvente

de 1:7,5.

Figura 22. Eficiência de extração de artemisinina em cada fração, com indicação do DPR em

cada etapa.


Rodrigues et al. (2006) propuseram uma extração de dois lotes de droga vegetal em

paralelo, utilizando cada fração obtida na extração do primeiro lote, após filtração, como

líquido extrator do segundo, resultando em uma proporção droga/solvente de 1:7,6. Contudo,

a eficiência de extração foi de 73 %, menor do que a alcançada aqui na terceira fração, com

proporção droga/solvente de 1:7,5.

Cinco litros de extrato foram concentrados por vez, durante cerca de 4 horas, sendo

necessários 32 horas (4 h x 8) para redução do volume inicial a 2,5 litros finais.

57

4.4.1. CARACTERIZAÇÃO DOS EXTRATOS DE Artemisia annua L

O extrato foi caracterizado antes e depois da concentração e foram obtidos os

seguintes resultados apresentados na tabela 13. O resíduo seco é aparentemente composto

principalmente por material graxo.

Na figura 23 é possível observar que o extrato concentrado possui 27,8 % mais

artemisinina que a droga vegetal e 75,0 % mais que o extrato percolado, o que demonstra a

importância da etapa de extração e concentração, em relação ao aumento da quantidade de

artemisinina.

Tabela 13. Resultado da caracterização do extrato antes e após a concentração.

Parâmetros Extrato

Percolado

Extrato

Concentrado

Volume 40.000 mL 2.500 mL

Teor de Artemisinina 0,84 ± 0,01 % 1,47 ± 0,05 %

Teor de Resíduo Seco 2,09 ± 0,05 % 30,78 ± 0,43 %

Densidade relativa 0,85 ± 0,00 g/mL 0,93 ± 0,00 g/mL

pH 6,75 ± 0,05 6,3 ± 0,00

Viscosidade - 3,13 ± 0,06 cP

Teor de Etanol 95,0 % 23,5 %

Figura 23. Comparação da artemisinina na droga vegetal e extrato percolado e concentrado.


4.5. VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE ARTEMISININA

NOS PÉLETES

58

4.5.1. SELETIVIDADE

O tempo de retenção do composto Q260 foi o mesmo do padrão e os espectros de

varredura no ultravioleta também apresentaram máximos de absorção semelhantes, o que

indica que o pico obtido no cromatograma da amostra foi isolado dos interferentes da matriz

(Figura 24).

Figura 24. Cromatograma dos péletes e do padrão de artemisinina


Os parâmetros de adequabilidade do sistema ficaram dentro dos parâmetros

recomendados (FDA, 1994).

Tabela 14. Adequação do sistema do cromatograma de péletes

Parâmetros Especificação Resultado


Resolução (R) > 2,0 2,9 ± 1,0

Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 1,0 ± 0,0


4.5.2. LINEARIDADE

O ensaio de linearidade foi realizado por meio da análise de cinco soluções de péletes,

em triplicata, conforme recomendação do IUPAC (2002). Aproximadamente 400 mg foram

transferidos para balão volumétrico de 10 mL, adicionado etanol 95 % e agitado em ultrassom

durante 10 minutos. O volume foi completado com o mesmo solvente, homogeneizado e 1

mL do sobrenadante foi retirado para derivatização e análise. O método analítico utilizado foi

AU

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

59

o mesmo validado para a análise da droga vegetal, mantendo-se as condições cromatográficas

e de derivatização da amostra.

O valor do coeficiente de correlação linear (0,9995) atendeu à especificação de maior

que 0,99 (ANVISA, 2003), o que indica provável linearidade entre os valores de AUC e as

concentrações analisadas. O teste de ANOVA demonstrou significância da regressão linear (p

= 0,00) e o teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste na curva analítica (p =

0,41). Em relação aos resíduos, o teste de Anderson-Darling indicou sua normalidade (p =

0,53) e o teste de Breush-Pagan indicou homocedasticidade (p = 0,14). Os gráficos de

linearidade e de resíduos estão plotados na figura 25.

Figura 25. Linearidade e gráfico de resíduos da análise de péletes.


Tabela 15. Dados da linearidade da análise dos péletes

Coeficiente de

correlação

linear (r)

Coeficiente de

determinação

(r²) ajustado

Faixa de

Concentração

(mg/mL)

Intervalo de

confiança de

“a”

Intervalo de

confiança de

“b”

0,9995 0,9958 15,6 a 39,2 19.685,46 a

21.223,48

-65.288,30 a

21.277,30

4.5.3. REPETIBILIDADE

Seis soluções de péletes foram analisadas e os resultados estão dispostos na tabela 16.

O resultado demonstrou adequabilidade à recomendação de DPR < 15 % para medicamentos

fitoterápicos (BRASIL, 2014), o que demonstra que o método analítico apresenta confiável

repetibilidade.

Tabela 16. Repetibilidade na análise dos péletes

mg Péletes Concentração

(mg/mL) AUC

Artemisinina

(mg/mL) DPR (%)

60

470 45,8250 952772 17,17

1,9

400 39,0000 798079 16,90

405 39,4875 809563 16,93

Tabela 16. Repetibilidade na análise dos péletes (Continuação)

402 39,1950 783935 16,51

400 39,0000 785536 16,63

401 39,0975 821366 17,35


NAS CÁPSULAS

4.6.1. SELETIVIDADE

O tempo de retenção do composto Q260 foi o mesmo do padrão e os espectros de

varredura no ultravioleta também apresentaram máximos de absorção semelhantes, o que

indica que o pico obtido no cromatograma da amostra foi isolado dos interferentes da matriz

(Figura 26).

Figura 26. Cromatograma das cápsulas e do padrão de artemisinina




Tabela 17. Adequabilidade do sistema do cromatograma de cápsulas



Resolução (R) > 2,0 6,7 ± 0,1

Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 0,9 ± 0,0


AU

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

61

4.6.2. LINEARIDADE




= 0,00) e o teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste da curva analítica (p =




Figura 27. Linearidade e gráfico de resíduos da análise das cápsulas.


Tabela 18. Dados da linearidade da análise das cápsulas

Coeficiente de

correlação

linear (r)

Coeficiente de

determinação

(r²) ajustado

Faixa de

Concentração

(mg/mL)

Intervalo de

confiança de

“a”

Intervalo de

confiança de

“b”

0,9997 0,9938 7,4 a 22,5 20.362,1 a

22.306,1

-34.733,0 a -

3.701,2





repetibilidade.

62

Tabela 19. Repetibilidade da análise do granulado das cápsulas

Massa

(mg)

Concentração

(mg/mL) AUC

Artemisinina

(mg/mL)

DPR

(%)

1.124,2 15,06 294345 16,5

2,3 1.126,0 15,09 306988 17,2

1.127,0 15,10 307366 17,2

1.125,1 15,08 313608 17,6

1.126,5 15,10 313840 17,6

1.125,6 15,08 306651 17,2


NOS COMPRIMIDOS

4.7.1. SELETIVIDADE

O tempo de retenção do composto Q260 foi o mesmo do padrão (Figura 28) e os

espectros de varredura no ultravioleta também apresentaram máximos de absorção

semelhantes, o que indica que o pico obtido no cromatograma da amostra foi isolado dos

interferentes da matriz.



Figura 28. Cromatograma dos comprimidos e do padrão de artemisinina


Tabela 20. Adequabilidade do sistema do cromatograma de comprimidos



Resolução (R) > 2,0 2,4 ± 0,3

AU

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

Minutes

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

63

Fator de Cauda (T) ≤ 2,0 0,9 ± 0,0


4.7.2. LINEARIDADE




= 0,00) e o teste de falta de ajuste indicou ausência de falta de ajuste da curva analítica (p =




Figura 29. Linearidade e gráfico de resíduos da análise dos comprimidos.


Tabela 21. Dados da linearidade da análise dos comprimidos

Coeficiente de

correlação

linear (r)

Coeficiente de

determinação

(r²) ajustado

Faixa de

Concentração

(mg/mL)

Intervalo de

confiança de

“a”

Intervalo de

confiança de

“b”

0,9995 0,9948 7,4 a 22,5 20.494,5 a

22.269,7

-34.516,4 a

-6.172,4





repetibilidade.

64

Tabela 22. Repetibilidade na análise dos comprimidos

mg

Cápsulas

Concentração

(mg/mL) AUC

Artemisinina

(mg/mL)

DPR

(%)

1.125,0 15,08 299371 16,82

2,9 1.127,0 15,10 321209 18,01

1.126,0 15,09 304487 17,09

1.124,0 15,06 321366 18,07

1.124,0 15,06 309286 17,39

1.128,0 15,12 309573 17,34

4.8. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PÉLETES

O PVP foi solubilizado no extrato, aos poucos, sob agitação constante em agitador tipo

vórtex a 750 rpm durante 10 min. Após a adição do extrato à celulose microcristalina,

misturou-se até a obtenção de uma massa homogênea, com propriedades de aglutinação

adequadas para a etapa seguinte de extrusão. A capacidade aglutinante foi avaliada por meio

da compressão manual da mistura. Quando observou-se a formação de uma massa resistente,

sem extravasamento de líquido por entre os dedos, a mesma foi submetida à extrusão e

esferonização. As formulações obtidas estão resumidas na tabela 23.

Tabela 23. Propriedades dos péletes obtidos nas diferentes formulações.

n

Celulose(g)-

Extrato(g)-

PVP(g)

Perda por

Dessecação

(%)

Esfericidade Tamanho

médio (μm)

Amplitude

de tamanho

Artemisinina

(%)

1 40 - 45 - 0,00 - - - - -

2 40 - 70 - 0,00 2,16 ± 0,11 0,78 ± 0,09 540 2,3 2,03 ± 0,2

3 40 - 70 - 5,04 - - - - -

4 40 - 70 - 3,15 2,57 ± 0,05 0,79 ± 0,09 1.340 1,9 1,89 ± 0,03

5 40 - 70 - 1,26 2,49 ± 0,11 0,77 ± 0,09 1.465 1,8 1,86 ± 0,09

6 40 - 65 - 1,23 2,26 ± 0,05 0,82 ± 0,08 705 2,3 1,74 ± 0,05

7 40 - 58 - 0,00 2,28 ± 0,13 0,82 ± 0,08 551 2,8 1,49 ± 0,02

65

A malaxagem foi realizada em recipiente de batedeira planetária, onde a celulose

microcristalina foi molhada com o extrato concentrado (adicionado ou não de PVP) que agiu

como líquido de granulação e, portanto, não foi utilizado água. A celulose microcristalina

confere a plasticidade necessária à massa para extrusão e esferonização, podendo chegar a

corresponder de 40 a 60 % da massa dos pós secos das formulações de péletes (SANTOS et

al., 2004).

A formulação 1 apresentou elevada formação de pós durante a esferonização e a

formulação 3 ficou excessivamente aglutinada e, por isso, não foram caracterizadas. A

porcentagem de PVP foi calculada sobre o total aproximado de sólidos finais resultantes da

soma da celulose (g) e do extrato (g), considerando o teor de resíduo seco deste de 30,78 %.

A esfericidade dos péletes é um parâmetro importante para sua propriedade de fluxo,

que terá grande influência em uma posterior etapa de enchimento de cápsulas ou de

compressão. Neste trabalho foi calculada a esfericidade projetada, onde valores mais

próximos de 1,0 indicam melhor esfericidade e valores acima de 0,6 já são considerados

satisfatórios (SANTOS et al., 2006).

Os PVPs disponíveis no mercado possuem diferentes graus de viscosidade, sendo esta

diretamente proporcional ao seu peso molecular. São identificados pela letra “K” seguido pelo

valor da sua viscosidade aproximada em uma solução a 1 %. Por exemplo, K30, K60 e K90.

Quanto maior o valor de número, maior a capacidade de aumentar a viscosidade de uma

solução aquosa (ISP, 2014), o que faz aumentar a aglutinação da massa umidificada durante a

malaxagem.

O PVP K30 foi testado e permitiu a obtenção de extrusados com satisfatórios para

formação de péletes após a esferonização. Logo, o uso de outro polímero de maior

viscosidade foi descartado. Na literatura, o uso de até 10 % como aglutinante para obtenção

de péletes foi relatado (FERRAZ et al., 2014).

Na formulação número 2, com maior quantidade de extrato e sem adição de

aglutinante, foi possível obter péletes com propriedades adequadas, contudo, sua

reprodutibilidade não foi possível devido à grande perda de solvente durante o tempo de

malaxagem.

Com o uso de PVP, as formulações 4 e 5 resultaram em péletes com menor amplitude

de tamanho, porém, com tamanho demasiadamente grande. As demais propriedades foram

similares apesar de possuírem diferentes quantidades de aglutinante.

Na formulação 6 a redução de extrato e o uso de aglutinante possibilitou obtenção de

péletes com propriedades adequadas, esfericidade e tamanho um pouco maiores do que na

66

formulação 2, e com a mesma amplitude de tamanho. O teor de artemisinina 14 % menor foi

uma desvantagem desta formulação.

No entanto, a repetição da formulação 6 resultou em péletes excessivamente grandes,

como nas formulações 4 e 5, provavelmente devido ao menor tempo gasto na etapa de

malaxagem.

A diferença entre os tempos de malaxagem resultou em diferentes umidificações

devido à evaporação de etanol. A perda de umidade durante esta etapa deve ser minimizada

(SANTOS et al., 2004) e é ainda mais crítico devido ao conteúdo de etanol no extrato

concentrado.

Com o tempo de malaxagem reduzido, a formulação 6 resultou em péletes tão grandes

quanto nas formulações 3, 4 e 5, pois a quantidade de etanol do extrato sofreu menor

evaporação, ficando em excesso. Para reduzir o tamanho das unidades o PVP não foi utilizado

na formulação 7 (Figura 30). O volume de extrato não foi reduzido para não diminuir ainda

mais o teor de artemisinina na formulação.

Figura 30. Formulação de péletes número 7.

Sem PVP, a formulação número 7 resultou em péletes com teor de artemisinina menor

que nas formulações anteriores e maior amplitude de tamanho, porém, com melhor

esfericidade e reprodutibilidade. Foi, então, encapsulada em cápsulas de tamanho número 00

(Figura 31).

Figura 31. Cápsulas de péletes de extrato hidroalcoólico de A. annua.

67

4.9. FORMULAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS COMPRIMIDOS E CÁPSULAS

Após a secagem, o granulado presentou 2,69 ± 0,17 % de umidade e 17,84 ± 0,17

mg/g de artemisinina.

O teste de dureza dos comprimidos (Figura 32) indicou valores muito diferentes entre

as unidades testadas porque elas não quebraram durante o teste, mas deformaram sob a

pressão aplicada. Isto pode ter ocorrido devido à característica graxa do resíduo seco do

extrato. No teste de friabilidade, os comprimidos apresentaram perda de massa de 0,0 % e

todas as unidades permaneceram íntegras. A largura e a altura foram, respectivamente, 11,45

± 0,03 mm e 6,32 ± 0,11 mm.

Figura 32. Comprimidos de extrato hidroalcoólico de A. annua.

Para o preparo do granulado para encapsulação foi adicionado 0,5 % de dióxido de

silício coloidal ao granulado utilizado no preparo de comprimidos. Isso foi necessário para

melhorar a fluidez do granulado no encapsulador. O teor de artemisinina do granulado das

cápsulas foi de 17,96 ± 0,27 mg/g. Em seguida, foi encapsulado em cápsulas número 00

(Figura 33).

Figura 33. Cápsulas de granulado de extrato hidroalcoólico de A. annua.

68

Diawara et al. (2012) prepararam granulados a partir do extrato hidroalcoólico de A.

annua e, em seguida, os utilizaram na forma de pó para suspensão e cápsulas. Obtiveram

nesta última bons resultados para os testes de determinação de peso e uniformidade de

conteúdo, porém, os valores não foram mostrados, incluindo do teor de artemisinina no

granulado.

4.10. CARACTERIZAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

4.10.1. ANÁLISE DE DETERMINAÇÃO DE PESO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

O teste se aplica a formas farmacêuticas sólidas em dose unitária (comprimidos não

revestidos, comprimidos revestidos, pastilhas, cápsulas duras e moles e supositórios, entre

outras) e avalia se a massa de cada unidade posológica testada está próxima da massa média

das unidades amostradas. Como a média de todas as formas testadas ficou acima de 300 mg, a

especificação para todas é de ± 7,5 % de variação permitida de cada unidade em relação à

média. Para médias inferiores a 300 mg, a variação permitida pode ser de até 10 % (BRASIL,

2010).

A tabela 24 traz os valores das médias do peso e os respectivos valores mínimos e

máximos obtidos na análise de cada forma farmacêutica. Como pode ser observado, todos os

valores ficaram dentro das especificações recomendadas, demonstrando que o processo de

fabricação foi eficiente na distribuição de massa de cada unidade.

Tabela 24. Determinação de peso das formas farmacêuticas.

Forma farmacêutica Peso médio

(mg)

Variação

máxima

permitida

Variação

mínima

Variação

máxima

69

Comprimidos 606,2 Até 2 unidades

acima de ± 7,5 %,

porém, menor que

o dobro.

-2,0 % 1,2 %

Cápsulas 553,1 -6,8 % 4,8 %

Péletes 605,6 -4,2 % 6,5 %

As cápsulas apresentaram menor peso médio, provavelmente devido à menor

densidade do granulado. Os comprimidos apresentaram a menor variação de massa, assim

como relatado como vantagem para esta forma farmacêutica por Cole (1998).

Os valores obtidos na análise de determinação de peso podem influenciar diretamente

o resultado da análise de uniformidade de conteúdo, que avalia a variação de fármaco entre as

diferentes unidades.

4.10.2. ANÁLISE DE DESINTEGRAÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

O teste de desintegração verifica se comprimidos ou cápsulas desintegram dentro do

tempo especificado. Para comprimidos não revestidos o tempo recomendado é de até 30 min e

para cápsulas gelatinosas duras de até 45 min, mas a monografia de cada produto pode alterar

este tempo (BRASIL, 2010).

As cápsulas e péletes se desintegraram em menos que 5 min, tanto em água purificada

quanto em tampão fosfato pH 1,2. Os comprimidos precisaram de quase 30 min para

desintegração completa em água. Em tampão pH 1,2 os comprimidos levaram quase 60 min

para desintegração completa. Esses tempos de desintegração dos comprimidos foi

consideravelmente superior ao apresentado por comprimidos de artemisinina pura. Em um

trabalho de desenvolvimento de comprimidos de artemisinina, a formulação final desintegrou

em aproximadamente 1 min (HOA, 1997).

Isso pode ter ocorrido devido à característica graxa hidrofóbica do extrato

concentrado, que aumentou visivelmente em pH 1,2, formando grânulos insolúveis neste. O

material insolúvel demonstrou pronunciada adesividade, o que o fez aderir às partes do

equipamento, fazendo com que a desintegração fosse ainda mais lenta, principalmente dos

comprimidos, cujo conteúdo é compactado.

4.10.3. TESTE DE UNIFORMIDADE DE CONTEÚDO E DOSEAMENTO DAS FORMAS

FARMACÊUTICAS

70

A tabela 25 resume os valores calculados do valor de aceitação (VA) para cada forma

farmacêutica. O teor previsto foi calculado relacionando o teor de artemisinina dos granulados

e os pesos médios de cada forma farmacêutica.

Tabela 25. Teor de artemisinina previsto para cada forma farmacêutica

Forma

farmacêutica

Teor de

artemisinina do

granulado (mg/g)

Peso médio

(g)

Teor

previsto

(mg)

Comprimidos 17,84 ± 0,17 0,6062 10,81

Cápsulas 17,96 ± 0,27 0,5531 9,93

Péletes 14,90 ± 0,20 0,5674 8,45

Tabela 26. Uniformidade de conteúdo das formas farmacêuticas.

Forma

farmacêutica

Teor

médio,

Tm (%)

Desvio

padrão,

DP (%)

Valor de

referência,

M (%)

Equação para

cálculo do VA VA

Comprimidos 92,3 2,6 98,5

|M - Tm| + k.DP

12,5

Cápsulas 97,2 4,4 98,5 11,8

Péletes 95,8 4,7 98,5 14,0

Todas ficaram abaixo do valor máximo recomendado, de 15,0, na primeira etapa do

teste, o que indica que o conteúdo de artemisinina nas três formas ficou próximo do teor

previsto e que o conteúdo entre as diferentes unidades está satisfatoriamente uniforme. O DP

dos comprimidos foi o menor, reflexo da menor variação de massa obtida para estes na

análise de determinação de peso.

4.10.4. ANÁLISE DE PERFIL DE DISSOLUÇÃO DAS FORMAS FARMACÊUTICAS

A solubilidade da artemisinina em água é muito baixa (WHO, 2014), tendo sido

relatados valores de 49,7 μg/mL (CARBONARA et al., 2012), 44,7 μg/mL (BALDUCCI et

al., 2013), 30,1 μg/mL (SAHOO et al., 2011), entre outros, dependentemente ainda da forma

cristalina em que se encontra, pois a artemisinina apresenta polimorfos (CHAN et al., 1997).

No entanto, no extrato vegetal sua solubilidade é aumentada devido à presença,

principalmente, de compostos fenólicos (CARBONARA et al., 2012).

71

Os estudos de dissolução foram realizados em meios tampão de pH 1,2 e 6,8,

abrangendo o valor mínimo e máximo do pH fisiológico (BRASIL, 2010), com 900 mL de

meio de dissolução a uma velocidade de 100 rpm, assim como realizado por HOA et al.

(1996) e Balducci et al. (2013), para estudos em artemisinina pura. Não foram encontrados

estudos de dissolução feitos em formas farmacêuticas com extrato de A. annua.

Nas condições fixadas, cerca de 10 mg de artemisinina em cada forma farmacêutica

foram dissolvidos em tampão pH 1,2 e pH 6,8, resultando em uma concentração de 11,1

μg/mL. Em água, a 37 ºC, HOA (1996) encontrou uma concentração de saturação de

artemisinina de 113 μg/mL. Para avaliar se haveria saturação nos tampões a 11,1 μg/mL de

artemisinina, testes preliminares com cada forma farmacêutica foram realizados, em

concentrações de 20 e 40 μg/mL de artemisinina e, em ambos os meios, foi observada total

solubilização e adequação à condição sink.

As figuras 34 e 35 mostram os perfis de dissolução de cada forma farmacêutica nos

tampões pH 1,2 e pH 6,8, respectivamente. As cápsulas e péletes apresentaram liberação

imediata com dissolução muito rápida em ambos os meios, por terem dissolvido mais que 85

% em até 15 min. Os comprimidos apresentaram liberação imediata apenas em pH 6,8, onde

dissolveram mais que 75 % de artemisinina em 45 min. (BRASIL, 2010). Em pH 1,2 a

dissolução dos comprimidos foi mais lenta, reflexo da sua desintegração mais lenta nesse pH,

tendo liberado após 60 min apenas 85,2 % de artemisinina, menos do que as cápsulas, que

chegaram a 99,8 % em 20 min, e do que os péletes, que alcançaram 103,3 % em 30 min.

Figura 34. Perfis de dissolução em tampão pH 1,2.


Figura 35. Perfis de dissolução em tampão pH 6,8.

72


A figura 36 mostra a quantidade de artemisinina liberada pelas diferentes formas

farmacêuticas, após 60 min, nos dois diferentes meios de dissolução. Em geral, a artemisinina

liberada foi menor no tampão pH 1,2 (p = 0,02), com média de 89,4 %, contra 99,0 % em pH

6,8.

Figura 36. Comparação entre dissolução, após 60 min, das formas farmacêuticas em pH 1,2 e

pH 6,8.

Fonte: Próprio autor. Letras iguais entre as colunas indicam dissolução em 60 min

significativamente iguais, com 95 % de significância.

A figura 37 mostra os valores da eficiência de dissolução (ED) das diferentes formas

farmacêuticas nos dois diferentes meios de dissolução. Este parâmetro é diretamente

proporcional à área sob a curva de cada perfil. E esta, por sua vez, está relacionada à

velocidade de dissolução. Quanto mais rápida for a dissolução, maior será a área sob a curva

e, consequentemente, maior a eficiência de dissolução.

Figura 37. Comparação entre eficiência de dissolução das formas farmacêuticas em pH 1,2 e

pH 6,8.

73

Fonte: Próprio autor. Letras iguais entre as colunas indicam eficiências de dissolução

significativamente iguais, com 95 % de significância.

Os comprimidos apresentaram ED significativamente menor (p < 0,05) do que as

cápsulas e os péletes, e estes não demonstraram diferença significativa entre si (p > 0,05), em

ambos os meios de dissolução. Os comprimidos também apresentaram diferença (p < 0,05)

nos diferentes meios, tendo apresentado a menor eficiência de dissolução em pH 1,2 (41,5 ±

0,9 %).

Outra forma de avaliar a diferença entre perfis de dissolução é a utilização do fator de

semelhança “F2”, descrito na RDC nº 31 como método de comparação para fins de

comprovação de equivalência farmacêutica entre medicamentos. É normalmente utilizado

para comparação entre perfis de dissolução de mesmas formas farmacêuticas e perde seu valor

discriminativo quando os perfis apresentam dissolução muito rápida (BRASIL, 2010),

portanto, foi utilizado neste trabalho apenas para comparação entre os perfis dos

comprimidos.

Para considerar que perfis são equivalentes, o valor de F2 deve estar compreendido

entre 50 e 100 (BRASIL, 2010). Kakran et al. (2013), Balducci et al. (2013) e Sahoo et al.

(2010) também compararam diferentes perfis de dissolução de artemisinina utilizando, além

dos dados da eficiência de dissolução, o fator de semelhança F2.

A figura 38 mostra como os perfis dos comprimidos se comportaram diferentemente

em função do pH do meio. Após 60 min de dissolução, em pH 1,2 foi liberado 85,2 % contra

95,1 % em pH 6,8. O valor de F2 calculado entre os perfis dos comprimidos foi de 30,2 (<

50,0), o que corroborou a diferença também obtida pela comparação da eficiência de

dissolução.

Figura 38. Perfis de dissolução dos comprimidos de A. annua em pH 1,2 e pH 6,8.

74


O perfil de liberação muito rápido obtido pelas cápsulas e péletes pode fazer com que

estes apresentem eficaz atividade antimalárica devido à presença dos compostos sinérgicos da

droga vegetal presentes no extrato, que aumentam a atividade da artemisinina, porém em um

curto intervalo de tempo.

As formulações preparadas neste trabalho demonstraram como o extrato concentrado

de A. annua pode ser utilizado na fabricação de fitoterápicos com teor de artemisinina

próximo do esperado e demais propriedades físico-químicas adequadas. Uma alteração

qualitativa ou quantitativa dos adjuvantes utilizados no preparo dos comprimidos poderá, por

exemplo, modificar sua velocidade de dissolução.

A atividade antimalárica das formulações deve ainda ser avaliada, contudo a alta

quantidade de artemisinina presente na droga vegetal utilizada pode prever uma eficácia

satisfatória, quando comparado com outros trabalhos. Diawara et al. (2012), por exemplo,

com uma droga vegetal contendo apenas 0,23 % (p/p) de artemisinina, obtiveram uma

atividade antiplasmódio do extrato hidroalcoólico semelhante a da artemisinina padrão, com

IC50 de 2,85 μg/mL e 2,73 μg/mL, respectivamente.

Frente ao apresentado, para conclusão da formulação de fitoterápicos, torna-se

necessária, além da avaliação da eficácia antiplasmódio de cada forma farmacêutica e a

realização do estudo de estabilidade físico-químico e microbiológico. A partir destas

informações será possível realizar alterações que se fizerem necessárias para obtenção de

fitoterápicos eficazes no combate à malária.

75

5. CONCLUSÕES

A droga vegetal foi caracterizada, apresentando teor de artemisinina próximo ao

relatado por outros autores.

Os resultados da validação do método de doseamento de artemisinina na droga vegetal

permaneceram dentro das especificações para todos os parâmetros avaliados.

A extração de artemisinina da droga vegetal com solução hidroalcoólica 95 %

alcançou eficiência de 80 %, dentro do esperado.

O extrato foi concentrado e caracterizado, resultando em teor de artemisinina

aumentado em relação à droga vegetal e propriedades físico-químicas adequadas.

Foram produzidos péletes e granulados com propriedades adequadas para obtenção de

formas farmacêuticas sólidas, como comprimidos e cápsulas.

Os resultados das validações parciais do método analítico ficaram dentro das

especificações, o que demonstra confiabilidade para o uso na análise dos péletes, cápsulas e

comprimidos.

Os comprimidos e cápsulas foram caracterizados em relação aos testes farmacopeicos

recomendados para formas farmacêuticas sólidas e apresentaram-se dentro das especificações

para todos os parâmetros avaliados.

Os resultados deste estudo demostraram que é possível obter formulações sólidas

contendo extrato hidroalcoólico de A. annua, que atendam às especificações exigidas, e

poderão servir de referência para o desenvolvimento de medicamentos de baixo custo para o

combate à malária.

76

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁSrepositorio.bc.ufg.br/tede/bitstream/tede/4909/5... · 2015-11-17 · par de aprendizado. Ao Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto, pelo seu auxílio no desenvolvimento