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L(go
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
FABIANA SARCINELLI METZKER
Análise molecular da frequência dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC
em Bactérias Gram Negativas isoladas de hemoculturas de pacientes do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás
Goiânia
2013
ii
FABIANA SARCINELLI METZKER
Análise molecular da frequência dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC
em Bactérias Gram Negativas isoladas de hemoculturas de pacientes do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título de
Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Orientador:Prof. Dr. André Kipnis
Co-orientador:Profª. Drª. Maria Cláudia D. P. B. André
Goiânia
2013
iii
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluna:Fabiana Sarcinelli Metzker
Orientador:Prof. Dr. André Kipnis
Co-orientadora:Profª. Drª. Maria Cláudia D. P. B. André
Membros:
1. Prof. Dr. André Kipnis
2. Prof. Drª. Alessandra Marques
3. Prof. Drª. Juliana Lamaro Cardoso
Data:
iv
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS vi
SIGLAS E ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO/REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Antibióticos
1.2 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA 12
1.2.1 β-lactamase de espectro estendido 13
1.2.1.1 Enzima TEM
1.2.1.2 Enzima SHV 15
1.2.1.3 Enzima CTX-M 16
1.2.2 Carbapenemase 18
1.3 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
PRODUTORAS DE β-lactamase 21
1.4 MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO DE CABAPENEMASE 23
2 JUSTIFICATIVA 26
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4 MÉTODOS 28
4.1 AMOSTRAS BACTERIANAS 28
4.1.2 Confirmação fenotípica de resistência 28
4.1.3 Isolamento e identificação dos isolados 28
4.1.4 Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos 29
4.2 CONDIÇÕES DE CULTURA 29
4.3 EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO
4.4 CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA 30
4.5 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 32
4.6 PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) 32
4.7 TESTE DE HODGE MODIFICADO 33
v
4.8 ANÁLISE DE DADOS
33
5 RESULTADOS 34
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO DE ESTUDO 34
5.2 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA 35
5.2.1 Antibiograma 35
5.2.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) 36
5.2.3 Detecção genética de ESBL 39
5.2.4 Diferença entre os métodos VITEK 2 e PCR 41
5.3 ANÁLISE DA RELAÇÃO GENÉTICA ENTRE AS ESPÉCIES
BACTERIANAS PELA TÉCNICA DE PULSED FIELD GEL
ELETROPHORESIS
41
6 DISCUSSÃO 44
7 CONCLUSÃO 51
REFERÊNCIAS 51
ANEXOS
vi
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Tabela 1: Tabela de classificação de β-lactamases de acordo com Bush et al e Ambler 11
Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho dos produtos e do
PCR para detecção dos mecanismos de resistência 31
Tabela 3: Distribuição das frequências dos isolados 34
Tabela 4: Origem dos isolados bacterianos em hemoculturas do HC-UFG 36
Tabela 6: Antibiograma dos isolados de BGN-NF 37
Tabela 7: MIC dos isolados de Enterobacteriaceae 38
Tabela 8: MIC dos isolados BGN-NF 39
Tabela 9: Frequência dos genes bla CTX-M cromossomal, bla CTX-M plasmidial, bla TEM,
bla SHV e bla KPC 40
Tabela 10: Comparação entre os métodos fenotípicos e genotípicos 40
Figura 1: Estrutura geral de um antibimicrobiano β-lactâmico destacando a estrutura do
anel β-lactâmico (círculo) 4
Figura 2: Estrutura dos antimicrobianos da classe das penicilinas - benzilpenicilina-
primeira penicilina. Amoxicilina e ampicilina foram derivadas da
benzilpenicilina
5
Figura 3: Estrutura de antimicrobianos da classe de Cefalosporinas-cefalosporina de 2ª
geração: cefuroxima e de 3ª geração: ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima 6
Figura 4: Estrutura de um antimicrobiano monobactâmico 6
Figura 5: Estrutura de antimicrobianos da classe de Carbapenêmicos 7
Figura 6: Distribuição de ESBL em Enterobactérias no Brasil 18
Figura 7: Região superior: antibiótico sem associação com o ácido clavulânico (MIC
>32µg/mL). Região inferior cefalosporina associada ao ácido clavulânico
(MIC >0,25µg/mL)
21
Figura 8: Resultado positivo para ESBL onde se observa uma zona fantasma entre o
disco de amoxicilina/ácido clavulânico e cefotaxima 22
Figura 9: Lado direito: disco de cefotaxima e lado esquerdo: disco combinado de
cefotaxima e ácido clavulânico. Teste positivo para ESBL 23
Figura 10:Teste modificado de Hodge para produção de KPC. Notar a distorção do
halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela
24
vii
amostra de K. pneumoniae testada
Figura 11: Resultado do teste de Hodge modificado para isolado 27 LJ
Figura 12: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 45 LJ
Figura 13: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae.
Figura 14: Dendograma dos isolados de Escherichia coli
42
42
42
43
viii
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Tabela 1: Tabela de classificação de β-lactamases de acordo com Bush et al e Ambler 11
Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho dos produtos e do
PCR para detecção dos mecanismos de resistência 31
Tabela 3: Distribuição das frequências dos isolados 34
Tabela 4: Origem dos isolados bacterianos em hemoculturas do HC-UFG 36
Tabela 6: Antibiograma dos isolados de BGN-NF 37
Tabela 7: MIC dos isolados de Enterobacteriaceae 38
Tabela 8: MIC dos isolados BGN-NF 39
Tabela 9: Frequência dos genes bla CTX-M cromossomal, bla CTX-M plasmidial, bla TEM,
bla SHV e bla KPC 40
Tabela 10: Comparação entre os métodos fenotípicos e genotípicos 40
Figura 1: Estrutura geral de um antibimicrobiano β-lactâmico destacando a estrutura do
anel β-lactâmico (círculo) 4
Figura 2: Estrutura dos antimicrobianos da classe das penicilinas - benzilpenicilina-
primeira penicilina. Amoxicilina e ampicilina foram derivadas da
benzilpenicilina
5
Figura 3: Estrutura de antimicrobianos da classe de Cefalosporinas-cefalosporina de 2ª
geração: cefuroxima e de 3ª geração: ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima 6
Figura 4: Estrutura de um antimicrobiano monobactâmico 6
Figura 5: Estrutura de antimicrobianos da classe de Carbapenêmicos 7
Figura 6: Distribuição de ESBL em Enterobactérias no Brasil 18
Figura 7: Região superior: antibiótico sem associação com o ácido clavulânico (MIC
>32µg/mL). Região inferior cefalosporina associada ao ácido clavulânico
(MIC >0,25µg/mL)
21
Figura 8: Resultado positivo para ESBL onde se observa uma zona fantasma entre o
disco de amoxicilina/ácido clavulânico e cefotaxima 22
Figura 9: Lado direito: disco de cefotaxima e lado esquerdo: disco combinado de
cefotaxima e ácido clavulânico. Teste positivo para ESBL 23
Figura 10:Teste modificado de Hodge para produção de KPC. Notar a distorção do
halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela
amostra de K. pneumoniae testada.
24
ix
Figura 11: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 27LJ 42
Figura 12: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 45LJ 42
Figura 13: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae
Figura 14: Dendograma dos isolados de Escherichia coli
44
45
x
SIGLAS
ATP –Adenosina Trifosfato
BGN – Bactérias Gram Negativas
BGN-NF- Bactérias Gram Negativas Não fermentadoras
bla CTX-M – gene que codifica enzima não TEM e não SHV
bla KPC – gene que codifica a enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase
bla SHV –gene que codifica a enzima Sulfidril Variável
bla TEM – gene que codifica a enzima Temoniera
CIM- Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
CMT – Enzima Mutante TEM
CTX-M – Enzima Cefotaximase
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético
ESBL – Extended Spectrum β Lactamase
GES – Enzima Espectro Estendido Guiana
Gly- Glicina
HC-UFG- Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás
IMI- Enzima Imipenemase
IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
IRT – Enzima TEM resistente aos Inibidores
IS – Elemento de Inserção
KPC- Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LACEN –GO –Laboratório Central de Saúde Pública
Lys- Lisina
MBL- Metalo β-lactamase
xi
NAM – N-acetil Murâmico
NAG - N – acetilglucosamina
Pb- Pares de bases
PBP- Penicilin Bindings Proteins
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
SER – Serina
SHV- Enzima Variação Sulfidril
SME-Enzima Serratia marcescens
TEM – Enzima Temoniera
TSA- Tryptic Soy Agar (Ágar Tripcase Soja)
TSB - Tryptic Soy Broth (Caldo Tripticase Soja)
xii
RESUMO
Recentemente, as Bactérias Gram Negativas (BGN) têm atraído a atenção do corpo clínico em
todo o mundo, se tornando um problema de saúde pública. Isso se deve ao fato do crescente
aumento da frequência de espécies desse grupo serem isoladas em amostras clínicas. As BGN
tem sido apontadas como uma das principais causas de infecções nosocomiais na corrente
sanguínea. Elas apresentam muitos mecanismos de resistência intrínsecos ou adquiridos.
Dentre esses, do ponto de vista clínico, a produção de enzimas β-lactamases, tais como ESBL
e carbapenemases, é o principal. Os genes responsáveis pela produção dessas enzimas são: bla
TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC. O objetivo desse trabalho foi determinar a frequência desses
genes nas BGN, isoladas em hemoculturas de pacientes hospitalizados no Hospital das
Clínicas de Goiânia (HC-UFG), coletadas durante o período de 31 de janeiro de 2011 a 31 de
janeiro de 2012. A identificação das espécies e análise da Concentração Inibitória Mínima
(CIM) foram realizadas através do sistema automatizado Vitek 2, enquanto que, a análise
molecular foi feita através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com os respectivos
oloigonucleotídeos iniciadores para os genes supracitados. A identidade entre o isolados de
Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli foi feita pelo Pulsed Field Gel Eletrophoresis.
Nesse período, foram recuperadas 79 amostras positivas para Bactérias Gram Negativas.
Dentre essas, as mais frequentes foram Klebsiella pneumoniae (n=24, 30,37%), Escherichia
coli (n=16; 20,25%), Acinetobacter baumannii (n=13; 16,45%) e Enterobacter cloacae (n =9;
11,25%). Essas amostras foram provenientes de vários serviços do HC-UFG. Dentre esses, o
Pronto Socorro (n=23; 29,11%), Clínica Médica (n=22; 27,85%) e UTI (n=10; 12,66%) foram
as unidades que mais contribuíram com a amostra global. Klebsiella pneumoniae foi a espécie
mais frequente dentre os diversos serviços do HC-UFG. Dentre os genes responsáveis pela
resistência, o mais frequente foi bla CTX-M (n=30; 68,18%), localizado em plasmídeos seguido
do bla SHV (N=18; 40,90%). Em relação ao Vitek 2, a técnica de PCR convencional foi a que
mais detectou mecanismos de resistência nas espécies selecionadas. Finalmente, os dados
desse trabalho mostraram que o HC-UFG tem muitas espécies de BGN espalhadas por vários
serviços do mesmo e com a presença de importantes mecanismos de resistência.
xiii
ABSTRACT
Recently, Gram Negative Bacilli have become a great problem of public health because it
carries naturally many resistance mechanisms and the frequency in the clinical samples
increased very much, especially in the blood. Among the resistance mechanisms, according to
the physicians point of view, the main mechanism is production of enzymes called β-
lacatamase, for example, Extended Spectrum β-lactamase (ESBL) and carbapenemase. The
genes are more frequency bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla KPC. The goal of this project was
to calculate the frequency of these genes in the BGN from blood culture of the patients
hospitalized at Hospital das Clínicas de Goiânia (HC-UFG) from January 31th, 2011 to
January 31th, 2012. The identification and account of the MIC were done by Vitek 2 whereas
the molecular analysis was done by conventional PCR. The identity between Klebsiella
pneumoniae and Escherichia coli was made by Pulsed Field Gel Electrophoresis. At this time
were isolated 79 positive samples of BGN. The most frequent species was Klebsiella
pneumoniae (n=24; 30,37%) followed by Escherichia coli (n=16; 20,25%), Acinetobacter
baumannii (n=13; 16,45%) and Enterobacter cloacae (n =9; 11,25%). These samples came
from many departments at HC –UFG and the emergency room was the department that gave
more samples (n=23; 29,11%), followed by the medical clinic (n=22; 27,85%) and ICU
(n=10; 12,66%). The most frequent gene was bla CTX-M (N= 30; 68,18%) placed in plasmid
followed by bla SHV (N=18; 40,90). The PCR technique was the one that detected the most
resistance mechanisms. Finally, the datas of this work showed that it is necessary to take care
of the dissemination of the BGN at the hospital and there are many species and resistance
mechanisms distributed at HC-UFG in the differents departments.
1
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
Recentemente, as Bactérias Gram Negativas (BGN) tem atraído a atenção do corpo
clínico em todo o mundo. Isso se deve ao fato do crescente aumento da frequência de espécies
desse grupo apresentarem algum mecanismo de resistência antimicrobiana. As BGN são
subdivididas em Bactérias Gram Negativas fermentadoras de glicose, compreendendo as
enterobactérias, e Bactérias Gram Negativas não fermentadoras de glicose (BGN-NF)
(Stelling et al.2005, Carattoli 2009).
As enterobactérias compreendem um grupo heterogêneo de bacilos Gram-Negativos
que estão amplamente distribuídas na natureza. Elas podem ser encontradas na água, solo,
plantas e no trato gastrointestinal de seres humanos e animais. Algumas são consideradas
enteropatogênicas por causarem preferencialmente infecções gastrointestinais, como a
Salmonella sp, Shigella sp, Yersinia enterocolitica e vários sorotipos de Escherichia coli. No
homem, podem causar infecção em vários sítios e são isoladas de diferentes amostras clínicas
recebidas no laboratório. Com isso, sempre são espécies suspeitas em muitos processos
infecciosos (Murray et al. 2006). De uma forma geral, as BGN causam com maior frequência
infecções no trato respiratório inferior (31,5%), seguida do trato urinário (27,8%), sepse
(23,1%) e por último, em sítios cirúrgicos (9,3%) (Bayram & Balci 2006).
Já as bactérias Gram Negativas não fermentadoras (BGN-NF) são microrganismos
aeróbios e incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia através da fermentação,
degradando-os pela via oxidativa. A maioria é oxidase positiva e móvel. Elas apresentam
baixa atividade metabólica em relação às enterobactérias. Representam um desafio para os
laboratórios de microbiologia devido à sua difícil identificação. No entanto, apesar da baixa
frequência, são de grande importância clínica nos casos de infecções relacionadas à
assistência à saúde por apresentarem resistência intrínseca a alguns antibióticos e sere capazes
de colonizar e causar infecções graves em pacientes oriundos de Unidade de Terapia Intensiva
(UTI); submetidos a procedimentos invasivos; unidades de queimados e em infecções do trato
respiratório de pacientes com fibrose cística (Stelling et al. 2005).
Nas últimas décadas, o isolamento em amostras clínicas de BGN resistentes a duas ou
mais classes de antibióticos (multirresistentes), tem aumentado rapidamente em hospitais de
2
todo o mundo. D´Agata (2004), durante nove anos, observou a prevalência de BGN
multirresistentes em infecções nosocomiais e detectou que houve aumento na
multirresistência de 1% para 16% em Pseudomonas aeruginosa, de 4% para 13% em
Enterobacter sp., de 0,5% para 17% em Klebsiella pneumoniae, de 0% a 9% em Proteus sp. e
de 0,2% para 4% em Escherichia coli. Diante desse quadro, o tratamento de infecções
causadas pelas mesmas tem se tornado um grande desafio para os médicos e um problema de
saúde pública, visto que, há associação entre resistência e altas taxas de mortalidade.
As Bactérias Gram Negativas constituem umas das principais causas de infecções
sanguíneas nosocomiais. Infecções causadas por bactérias multirresistentes desse grupo
resultam em altas taxas de mortalidade, longas hospitalizações e altos custos de tratamento,
comparado com as infecções sanguíneas causadas por Bactérias Gram Positivas. Beach et al.
(1999), em estudo com amostras de BGN isoladas de amostras sanguíneas oriundas do
Canadá, Estados Unidos (EUA) e América Latina no ano de 1997, mostraram que estas
bactérias são predominantes na América Latina e são mais resistentes aos antibióticos testados
do que as amostras oriundas do Canadá e EUA. As BGN causam principalmente, sepse e
choque séptico em virtude da resposta inflamatória do hospedeiro à endotoxina
(lipopolissacarídeo) componente da parede celular desse grupo bacteriano (Beach et al. 1999).
A resistência antimicrobiana apresentada pelos BGN se dá principalmente contra os
antibióticos β-lactâmicos, classe de antibióticos de escolha para o tratamento de infecções
causadas por este grupo de bactérias. Esta resistência ocorre principalmente devido à presença
de enzimas β-lactamases, capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico de penicilinas,
cefalosporinas e outros antimicrobianos relacionados, tornando-os inativos. No entanto,
recentemente surgiu uma variação dessas enzimas, denominadas de β-lactamases de Espectro
Estendido (ESBL – Extended Spectrum β-Lactamase) as quais são capazes de hidrolisar
antibióticos β lactâmicos de terceira e quarta geração, restando apenas como opção
terapêutica os carbapenêmicos (Paterson & Doi 2007).
Uma rápida e acurada identificação da resistência a antimicrobianos é decisiva para se
iniciar uma terapia apropriada. Os testes de resistência baseados no fenótipo são os mais
usados por serem mais baratos e fáceis de realizar. No entanto, não fornecem informações
sobre variantes genéticos. Esse fato limita o uso de informações sobre quais genes são
responsáveis pelo mecanismo de resistência em inquéritos epidemiológicos. Um dos
principais problemas causados pelas β-lactamases é o fato de sua produção ser induzida
durante a terapêutica antimicrobiana. Com isso, muitos laudos podem ser falsos negativos
decorrentes dessa peculiaridade e, essa é uma das principais causas de falha terapêutica. Com
3
o aumento da prevalência de isolados produtores dessas enzimas, a rápida e precisa
identificação destes isolados tem se tornado cada vez mais clinicamente significante
(Tumbarello et al. 2008)
A frequência de ESBL varia em cada região e é alta principalmente em hospitais ou
locais destinados a hospitalizações de longa duração, visto que, os pacientes nestas condições
apresentam alguns fatores de risco, tais como, sistema imune debilitado, uso de catéteres,
submissão a vários procedimentos invasivos, dentre outros (Ben-Ami et al. 2009).
O conhecimento sobre as implicações dos mecanismos de resistência em infecções
causadas por BGN multirresistentes e estudos da frequência são importantes em dois
aspectos. Num primeiro momento, os dados ajudam os profissionais de saúde a criarem
normas sobre isolamento e tomadas de decisões racionais sobre criação de programas para
escolha de antibioticoterapia. Num segundo momento, ajuda os mesmos a tomarem iniciativas
para prevenir a disseminação das mesmas (Cosgrove 2006).
A detecção rápida e específica é essencial para o tratamento eficaz de infecções
causadas por microrganismos multirresistentes. Kang et al. (2005) mostraram que o grupo de
pacientes que apresentava infecção sanguínea causada por BGN multirresistentes,
inicialmente tratado inadequadamente, apresentou uma taxa de mortalidade de 38,4%,
enquanto que, um outro grupo de pacientes com a mesma condição clínica e tratado
inicialmente com a terapia adequada tiveram taxa de mortalidade de 27,4%. Atualmente, as
técnicas de biologia molecular constituem uma importante ferramenta para os
microbiologistas a fim de detectar mecanismos de resistência nas BGN por apresentarem alto
nível de especificidade e capacidade de identificação dos mecanismos genéticos de
resistência. A rápida identificação dos mesmos é essencial para se evitar uma elevada
disseminação dos genes de resistência entre as espécies (Kang et al. 2005).
1.1 – ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos constituem uma das grandes contribuições da medicina moderna para o
combate das doenças infecciosas, sendo introduzidos há mais de 60 anos. Desde então, cepas
resistentes têm surgido em decorrência dessa nova pressão seletiva resultante do seu emprego
clínico (humano e veterinário), industrial (conservação de alimentos), comercial (engorda de
animais) e experimental. Até 1950, as infecções causadas por bactérias, principalmente
enterobactérias, eram de difícil tratamento, visto que, só tínhamos como opções terapêuticas,
a tetraciclina, cloranfenicol e estreptomicina (Bonono & Szabo 2006, Hawser et al. 2009).
4
Os antibióticos constituem substâncias químicas específicas produzidas em geral por
organismos vivos, bem como seus análogos estruturais obtidos por síntese ou semi-síntese.
São capazes de inibir, em concentrações baixas, processos vitais de uma ou mais espécies de
microrganismos. A descoberta do primeiro β-lactâmico, a penicilina, oriunda do fungo
Penicillium notatum por Alexander Fleming, em 1928, revolucionou o tratamento das
infecções bacterianas. A presença do anel β-lactâmico intacto em sua estrutura química é
essencial para a atividade biológica, ao passo que, sua cadeia lateral determina o espectro
antibacteriano, a sensibilidade aos ácidos e β-lactamases e as propriedades farmacocinéticas
(Figura 1) (Korolkovas 2007).
Figura 1: Estrutura geral de um antimicrobiano β lactâmico destacando a estrutura do anel β-lactâmico (círculo). Fonte: Grumach & Rosário (2006).
As penicilinas são substâncias derivadas do ácido β – aminopenicilânico. Sua hidrólise
permitiu a síntese de diversos β-lactâmicos por adição e/ou substituição de radicais. Por
apresentarem o anel β lactâmico (fundido com o anel tiazolidínico), são conhecidas também,
junto com as cefalosporinas, como antibióticos β-lactâmicos. As penicilinas apresentam duas
características fundamentais que fazem dela o antibiótico mais utilizado: alta eficácia e baixa
toxicidade. Sua ação antibacteriana se deve à inibição da enzima transpeptidase que catalisa a
biossíntese da última etapa da formação da parede celular. Dentre as penicilinas mais usadas
se destacam a benzilpenicilina, ampicilina e amoxicilina, conforme ilustrados na figura 2
(Goodman, 2010).
5
Figura 2: Estrutura dos antimicrobianos da classe de penicilinas – benzilpenicilina – primeira penicilina - amoxicilina e ampicilina foram derivadas da benzilpenicilina. Fonte: Grumach & Rosário (2006).
A classe de antibiótico mais utilizada para tratar infecções causadas pelas
BGN é a classe dos β-lactâmicos os quais compreendem as penicilinas associadas aos
inibidores de β-lactamases (Ácido Clavulânico, Tazobactam e Sulbactam), as cefalosporinas e
os carbapenêmicos, juntamente com os monobactâmicos. Estes exibem seu efeito bactericida
através da inibição de enzimas envolvidas na síntese da parede celular através da inibição da
biossíntese do peptídeoglicano na sua fase terminal impedindo a transpeptidação, ou seja, a
formação de ligações cruzadas entre cadeias peptídicas vizinhas recém sintetizadas. O
peptídeoglicano é um dos principais constituintes da parede celular bacteriana cujas funções
são conferir rigidez à célula e proteção contra ambientes hostis e variações osmóticas. A
biossíntese do peptídeoglicano ocorre em três fases: Fase citoplasmática onde ocorre a
formação dos precursores UDP–NAG (uridinodifosfato N-acetilglucosamina) e UDP-NAM
(uridinodifosfato N-acetilmurâmico). Na segunda fase, conhecida como fase membranar
ocorre o transporte desses precursores através da membrana citoplasmática para o espaço
periplasmático com o auxílio do lipídio membranar bactoprenol, formando as cadeias NAG-
NAM. Na última fase, ocorrem as ligações cruzadas D-alanina D-alanina NAM entre as
cadeias catalisadas pelas enzimas transpeptidases localizadas na região externa da membrana
plasmática. Esse grupo enzimático é chamado de PBP (Penicilin Binding Protein) devido à
sua grande afinidade com as penicilinas (Murray et al. 2006).
Outros grupos de β-lactâmicos foram descobertos devido à pesquisa ativa por fungos
ou actinomicetos que produzissem substâncias com ação antimicrobiana. Com isso, foi
descoberta a classe das cefalosporinas. A primeira cefalosporina descoberta foi isolada de
Cephasloporium acremonium, em 1984. As cefalosporinas são derivadas do ácido 7-
aminocefalosporânico. Seu mecanismo de ação e demais propriedades são semelhantes aos
das penicilinas. As cefalosporinas são subdivididas em primeira, segunda, terceira e quarta
geração de acordo com o espectro bacteriano. À medida que o antibiótico progride sua
classificação da primeira para a quarta geração, aumenta-se o espectro contra BGN e ocorre
6
perda de eficácia contra as Bactérias Gram Positivas, aumenta a eficácia contra bactérias
resistentes e aumenta o custo do tratamento (Figura 3) (korolkolvas 2007).
Figura 3: Estrutura de antimicrobianos da classe de Cefalosporina – cefalosporina de 2ª geração: cefuroxima e de 3ª geração: ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima. Fonte: Grumach & Rosário (2006).
Os monobactâmicos pertencem também à classe dos antibióticos β-lactâmicos (Figura
4). O aztreonam é o único dessa classe disponível no Brasil. Eles são altamente resistentes à
inativação pelas β-lactamases tendo sua principal indicação nas falências terapêuticas com
cefalosporinas de terceira geração nas infecções causadas por BGN (Goodman 2010).
Monobactâmicos
Figura 4: Estrutura de um antimicrobiano monobactâmicos. Fonte: Willian (1999).
A introdução das penicilinas sintéticas, com a presença natural do anel β-lactâmico em
sua estrutura, proporcionou um melhor tratamento das BGN, principalmente enterobactérias,
visto que, até então, os agentes disponíveis não eram tão eficazes. No entanto, em 1960, já
havia relatos de cepas resistentes a estes antibióticos devido às mutações que ocorrem em
plasmídeos, que são elementos genéticos extra cromossomais capazes de se auto replicar e
apresentar mecanismos que controlam o número de cópias e estabilidade celular. Eles também
7
promovem a transferência lateral entre bactérias de diferentes espécies, ocasionando alta
disseminação de genes, e consequentemente, da resistência (Goodman 2010).
Um dos mecanismos responsáveis pela resistência bacteriana aos antimicrobianos é a
produção de enzimas β-lactamases. A primeira descoberta foi a enzima TEM, codificada por
um gene plasmideal. Esse problema foi solucionado com o desenvolvimento das
cefalosporinas de 3ª geração, como a ceftriaxona. Logo surgiram as cepas produtoras de
ESBL as quais apresentavam resistência também àqueles novos grupos de antibióticos. A fim
de superar as ESBL, em 1990, a indústria disponibilizou os carbapenêmicos, os quais também
se tornaram importantes no combate a infecções nosocomiais causadas por bactérias
produtoras destas enzimas (Landman et al. 2007, Hawser 2009).
A classe de antibióticos carbapenêmicos contém um anel β-lactâmico, às vezes,
fundido com anel de cinco ou seis membros, mas diferindo estruturalmente das penicilinas
e/ou cefalosporinas. Essa classe compreende o imipenem, meropenem e ertapenem. Alguns
destes antibióticos são obtidos por fermentação, enquanto que, outros são preparados por
síntese parcial ou total. O imipenem tem como produtor natural Streptomyces cattleya, uma
bactéria encontrada naturalmente no solo. Seu mecanismo de ação consiste em inibir a síntese
da parede celular através de sua ligação às proteínas ligadoras de penicilina (PBP). Essa classe
é estável à hidrólise causada pelas enzimas do tipo ESBL (Figura 5) (Silva & Lincopan 2012).
Carbapenêmicos
Figura 5: Estrutura de antimicrobianos da classe de Carbapenêmicos. Fonte: Grumach & Rosário (2006).
1.2- MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
Antes do advento dos antibióticos da quimioterapia e das medidas imunossupressoras
as doenças infecciosas causadas por enterobactérias eram relativamente bem definidas Logo
após a introdução dessa conduta terapêutica na prática clínica, cepas resistentes foram
8
selecionadas, o que ocasionou o aumento de sua frequência em isolados clínicos (Murray et
al. 2006).
A resistência aos antimicrobianos apresentadas pelas bactérias ocorre devido às
características codificadas geneticamente, podendo ser intrínseca ou adquirida. A resistência
intrínseca é aquela resultante da genética, estrutura e fisiologia natural do microrganismo e
ocorre em grupos específicos sendo útil na escolha dos antibióticos para o teste de
sensibilidade. Já a resistência adquirida resulta da alteração da estrutura e fisiologia celular,
causada por mudanças no código genético do microrganismo. Pode ser adquirida por mutação
genética, aquisição de genes de outros organismos, ou uma associação de ambas (Rasmussen
& Høiby 2007).
Os principais mecanismos de resistência apresentados pelas BGN são: alteração de
porinas; sistemas de efluxo; alteração do sítio alvo e, por último; produção de enzimas
capazes de degradarem classes de antibióticos específicas, tais como, as enzimas β lactamases
e carbapenemases. A redução da expressão dos canais de porina resulta na redução da
permeabilidade bacteriana, reduzindo a entrada de antibiótico na mesma. As alterações de
permeabilidade tem alto custo metabólico para a célula bacteriana, visto que, os nutrientes são
transportados para o citoplasma por essa via. É um mecanismo regulado por genes
cromossomais, e, portanto, difícil de disseminar. Com isso, esse mecanismo não explicaria a
alta disseminação de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos (Heritage et al.
1999).
O sistema de efluxo é utilizado pela célula bacteriana para transportar substâncias do
citoplasma para o meio externo. É um sistema dependente de ATP, resultando em gasto
energético. Quando hiperexpresso, este sistema ocasiona a resistência às quinolonas,
penicilinas e cefalosporinas. No entanto, não é um sistema eficaz para a bactéria devido à
demanda de gasto energético. Portanto, não é o principal mecanismo de resistência aos
antimicrobianos (Woodford et al. 2004).
As Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBP- Penicillin Binding Proteins) são enzimas
importantes para a célula bacteriana, já que são essenciais na estruturação do peptídeoglicano
da parede celular da mesma. Com isso, constituem importantes alvos terapêuticos dos
antibióticos. Algumas bactérias produzem PBP mutantes que conservam a sua função na
célula bacteriana, porém apresentam afinidade reduzida aos β-lactâmicos. No entanto, esse
mecanismo de ação em BGN é codificado por gene cromossomal, com isso, sua disseminação
horizontal não é significativa e, portanto, também não constitui o principal mecanismo de
resistência antimicrobiana (Goodman 2010).
9
A produção de enzimas β-lactamases, do ponto de vista clínico, é o mecanismo de
resistência adquirido mais importante, devido à alta prevalência e por ocasionarem uma alta
taxa de falha terapêutica, já que, são capazes de hidrolisar os antibióticos β-lactâmicos,
inativando-os. A detecção das β-lactamases, tanto em Bactérias Gram Positivas quanto em
BGN, remonta-se ao início dos anos 40, antes do uso generalizado das penicilinas na prática
clínica. A primeira β-lactamase foi descoberta em Escherichia coli. Essas enzimas inativam
os β-lactâmicos através da quebra da ligação amida, perdendo assim a capacidade de inibir a
síntese da parede celular bacteriana. As β-lactamases podem ser encontradas em
Enterobacteriaceae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae,
Pseudomonas aeruginosa, Moraxella sp e anaeróbios, como as espécies do grupo
Bacteroides fragilis, cepas de Prevotella, Porphyromonas sp, Bilophila wadsworthia,
Fusobacterium sp e Clostridium sp. Os mecanismos de resistência aos antibióticos β
lactâmicos e carbapenêmicos surgiram antes da introdução da primeira penicilina na prática
médica. A primeira β lactamase foi descoberta em Escherichia coli e algumas espécies de
Bactérias Gram Negativas possuem naturalmente, em seu DNA cromossômico, genes que
codificam enzimas β lactamases, as quais são enzimas bacterianas que protegem os
microorganismos contra a ação letal dos antibióticos β lactâmicos. Essas surgiram devido às
diferentes pressões seletivas encontradas no ambiente (Summanen et al. 1993, Bradford
2001).
As β-lactamases clássicas são TEM-1, TEM-2 e SHV-1. Elas eram capazes apenas de
hidrolisar penicilinas e cefalosporinas de primeira e segunda geração. No entanto, mutações
genéticas nos genes responsáveis pela produção das mesmas ocasionaram a produção de
enzimas com aumento do espectro de atividade, sendo capazes de hidrolisarem cefalosporinas
de terceira e quarta geração, como cefotaxima e ceftazidima, e os monobactâmicos, como o
aztreonam. Essas enzimas foram denominadas de β lactamases de espectro estendido (ESBL).
Estudos comprovam que a pressão seletiva causada pelo uso constante de cefalosporinas nos
centros de saúde contribui para o aumento da freqüência e disseminação de microrganismos
resistentes. Monnet et al. 1997 observaram que a resistência bacteriana causada pela produção
de ESBL pode aumentar num período de 2 anos em até 57% em um único hospital.
Devido à grande importância das β-lactamases e à grande variedade das mesmas,
surgiram métodos de classificação a fim de facilitar os estudos dessas enzimas. A atividade
bioquímica e modelo de substrato de diferentes enzimas formam a base de esquemas dos
principais sistemas de classificação. Os mais utilizados são o de Ambler e o de Bush (Tabela
1). A classificação de Ambler se baseia na estrutura molecular e na homologia na sequência
10
de aminoácidos, resultando em quatro grandes grupos A, B, C e D, onde as classes A, C e D
agrupam as β-lactamases que usam o sítio catalítico serina para inativação dos β-lactâmicos,
enquanto que, a classe B agrupa as metalo enzimas que usam o zinco como cofator para a sua
atividade catalítica. Já a classificação de Bush (1989), foi a primeira a correlacionar o
substrato preferencial e propriedades inibitórias à estrutura molecular da enzima e nesta
classificação as β-lactamases se dividem em quatro grupos (1, 2, 3 e 4) e vários subgrupos.
Atualmente, novas tabelas de classificação estão sendo criadas englobando determinantes
genéticos, tais como, mediados por plasmídeos ou cromossomos, dados de estudos de foco
isoelétrico e cinética enzimática (Bush et al. 1995, Heritage et al.1999).
11
Tabela 1: Tabela de classifição das β lactamases de acordo com Bush, Jacoby, Medeiros e
Ambler
Bush et al. 1995 Ambler 1980 Classificação Grupo funciona Subgrupo
s maiores Classe Molecular
1 C Enzimas cromossômicas e plasmidiais produzidas por BGN. Conferem resistência a todos os β–lactâmicos,exceto carbapenêmicos. Não são inibidas pelo ácido clavulânico.
2 2a A Penicilinases produzidas por Staphylococcus sp. e Enterococcus sp. Conferem alto nível de resistência às penicilinas.
2b A β-lactamases de amplo espectro de BGN. Inclui TEM – 1 e SHV – 1.
2be A β–lactamases de espectro estendido. Conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos (ESBL).
2br A β–lactamases resistentes aos inibidores de β–lactamases derivadas de TEM (IRT) e uma enzima derivada de SHV.
2c A Enzimas que hidrolisam carbenicilina.
2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina). São levemente inibidas pelo ácido clavulânico
2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico
2f A Enzimas que hidrolisam carbapenêmicos. Possuem uma serina no seu sítio ativo e são inibidas pelo ácido clavulânico
3 3a,3b,3c B Metalo β – lactamase. 4 ND Penicilinases miscelâneas não
sequenciadas, não categorizadas em nenhum dos grupos detalhados.
12
1.2.1 β-lactamase de Espectro Estendido
Em 1980, na Alemanha, foi descrito pela primeira vez uma ESBL, logo após a
introdução de cefalosporinas de terceira geração, em um isolado de Klebsiella pneumoniae
(Paterson 2000). Em 1984, uma nova ESBL foi isolada na França e, posteriormente, em todo
o mundo. Desde então, a produção de ESBL entre as BGN tem crescido muito e se tornado
um problema mundial. O aumento da frequência dessas enzimas em isolados clínicos se dá
logo após a introdução de cefalosporinas de terceira geração, no uso clínico (Saladin et al.
2002). As β-lactamases de espectro estendido (ESBL) são enzimas que podem hidrolisar
oximino β lactâmicos (cefotaxime, ceftazidime e ceftriaxona) e aztreonam, inativando - os. As
ESBL são enzimas geralmente codificadas por genes localizados em plasmídeos, cujos
principais são bla TEM, bla SHV e bla CTX-M. Esses são mais facilmente encontrados em
Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli (Gutmann et al. 1989).
As enzimas ESBL são assim chamadas porque são capazes de hidrolisar antibióticos
β-lactâmicos de espectro estendido, incluindo cefalosporinas e monobactâmicos. De acordo
com o Comitê Europeu Antimicrobiano, um isolado é considerado produtor de enzima ESBL
quando apresenta resistência, a pelo menos uma cefalosporina de terceira geração, como a
ceftriaxona. Algumas ESBL conferem alto nível de resistência para todas as classes de
cefalosporinas, enquanto que, outras conferem resistência sutil ou aumenta seletivamente
dentro dos subgrupos de β-lactâmicos, como a enzima TEM que hidrolisa melhor a
ceftadizima, enquanto a enzima CTX-M a cefotaxima (Bush 2008). As BGN são responsáveis
pela maioria das infecções clínicas, tais como, infecções do trato respiratório inferior, trato
urinário e septicemia. As resistências apresentadas por elas aos antibióticos β lactâmicos
resultam da produção das enzimas penicilinases (β-lactamases que hidrolisam penicilinas)
TEM -1 e SHV-1 e cefalosporinases de espectro estendido (β-lactamases que hidrolisam
cefalosporinas), tais como, algumas variantes derivadas de mutações plasmidiais das enzimas
TEM, SHV e CTX-M (Hujer et al. 2008, Schoevaerdts et al. 2011)
O número de espécies de BGN produtoras de ESBL é provavelmente mais prevalente
do que os dados mostram. Pois, geralmente, passam despercebidas pelos testes convencionais
de rotina de identificação de bactérias, tais como, disco difusão, MIC e os automatizados. Isso
ocorre porque alguns testes só utilizam uma cefalosporina de terceira geração, o inóculo está
em quantidade insuficiente, apenas um clone está presente na análise ou variantes genotípicos
apresentam variações discretas no fenótipo (Rasheed et al. 2000).
13
Algumas estratégias têm sido adotadas a fim de conter a disseminação das enzimas
ESBL. São elas: desenvolvimento de novos antibióticos e utilização de penicilinas associadas
a inibidores de β lactamases, tais como, ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Chaibi et
al. 1999).
As principais características de mediadores de ESBL em espécies de BGN são: 1-
Resistência para amino e carboxi penicilinas, assim como às cefalosporinas de segunda
geração e poucos de terceira geração; 2- Sinergia entre antibióticos β-lactâmicos e inibidores
de β-lactamase, particularmente ácido clavulânico. Nos testes de sensibilidade, tais como,
disco difusão em ágar, determinação do MIC ou testes automatizados, alguns mecanismos de
resistência são percebidos através da redução dos valores de ponto de corte. A maioria desses
testes usa uma cefalosporina de terceira geração e um inibidor de β lactamase, com isso, o
sinergismo é percebido quando ocorre redução de MIC do antibiótico anterior na presença do
inibidor (Drieux et al. 2008).
Infecções causadas por BGN produtoras de ESBL, tais como, alguns isolados de
Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae implicam em maior tempo de hospitalização, alta
taxa de mortalidade e custos para o sistema financeiro de saúde. Esses pacientes custam em
torno de 6.000 a 30.000 dólares a mais do que pacientes infectados pelos mesmos isolados
não produtores de ESBL (Cosgrove & Carmelli 2007). Alguns fatores de risco podem
contribuir para o aparecimento de infecções no ambiente hospitalar, principalmente por
microrganismos resistentes. Entre eles, podemos citar o uso indiscriminado de antibióticos de
amplo espectro, internações prolongadas (principalmente na UTI), aumento do número de
transferências entre unidades hospitalares, gravidade da doença, intubação e ventilação
mecânica, uso de catéteres em geral e exposição prévia a qualquer classe de antibióticos
(Bradford 2004).
1.2.1.1 - Enzima TEM
Em 1960, foi descoberta a primeira β-lactamase mediada por plasmídeo. Essa foi
encontrada em isolado de Escherichia coli e foi denominada de TEM-1, proveniente de uma
paciente da Grécia, cujo nome era Temoniera. Essa enzima é codificada pelo gene bla TEM e
atualmente pode ser encontrada em várias espécies além das BGN, como Haemophillus
influenzae, Neisseria gonorrhoeae, entre outras em todo o mundo (Zeba 2005). Essa enzima é
capaz de hidrolisar penicilinas e cefalosporinas, como cefalotina e cefaloridina e
14
monobactâmicos. Geralmente, os plasmídeos que transportam o gene bla TEM também
apresentam genes de resistência para gentamicina e tobramicina (Bradford 2001, Coque
2002).
No início de 1990, o uso clínico de combinações de penicilinas e inibidores de β-
lactamases foi seguido da emergência de enzimas mutantes da TEM resistentes aos
inbibidores, as quais foram chamadas de IRT (Guibout et al 2000, Robin et al. 2007). Os
inibidores de enzimas β-lactamases também foram usados exaustivamente, especialmente na
França, por cirurgiões da cavidade abdominal a fim de prevenir infecções intra- abdominais,
visto que, possuem atividades contra enterobactérias e anaeróbios. Já em meados de 1990, um
terceiro sub-grupo de enzimas TEM surgiu, combinando características de IRT e ESBL, ou
seja, uma enzima TEM resistente aos antibióticos β lactâmicos e aos inibidores de β-
lactamases, tais como, o ácido clavulânico naturalmente encontrado em uma Bactéria Gram
Positiva que vive no solo denominada de Streptomyces clavuligerus. Essa nova enzima β-
lactamase foi denominada de complexo mutante TEM (CMT). Uma delas a enzima TEM -50
tem sido encontrada em diferentes espécies de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae e Enterobacter aerogenes (Yang 2010, Petrosino et al. 1999).
As mutações são responsáveis pelas variações das enzimas β-lactamases. A sequência
Ser-X-X-Lys, na posição 67, é essencial para a atividade catalítica dessa enzima. Com isso, as
mutações ocorrem em posições limitadas. Essas mutações resultam em alterações fenotípicas
que tornam as enzimas desse grupo mais capazes de hidrolisarem os substratos habituais ou
mesmo aquisição da capacidade de hidrolisar outros antibióticos da mesma classe ou de
classes diferentes. Mutações que resultam em substituição do aminoácido arginina para o
aminoácido serina, na posição 164, juntamente com a mutação do tipo substituição do
aminoácido arginina pelo aminoácido serina ou cisteína na posição 244, inativa a capacidade
da enzima TEM de hidrolisar ceftazidima e retém a hidrólise dos inibidores de β-lactamases
(Bradford 2001, Schroeder 2002).
O grupo de enzimas TEM, especialmente TEM-1 e TEM-2, está entre as β-lactamases
de amplo espectro mais encontradas em todo o mundo. A maioria das enzimas TEM são
encontradas em espécies de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli (Coque 2002).
15
1.2.1.2 – Enzima SHV
Em 1972 foi descrita uma nova enzima β-lactamase denominada de PIT-2, que mais
tarde foi chamada de SHV (Sulphydryl Variable), a qual é codificada pelo gene bla SHV. Esta
enzima apresenta ação apenas contra as penicilinas, ou seja, era uma β-lactamase de espectro
estreito. Foi primeiramente descrita em genes cromossomais do gênero Klebsiella (Poirel &
Nordmann 2002). Apesar do gene bla SHV ter sido descrito, a princípio, como cromossomal,
em 1979, foi demonstrada a presença do mesmo em plasmídeos em isolados de Klebsiella
pneumoniae. É possível que, pressões de antibióticos do ambiente selecionaram alguns
clusters de mutação e isolados com esse gene no cromossomo. A fim de superar as pressões
seletivas, houve a transferência desse gene para dentro de elementos móveis (plasmídeo e
transposons), onde adquiriu potencial para disseminação entre as espécies (Chaves et al.
2001).
Em 1983, logo após a introdução das cefalosporinas de terceira geração na prática
clínica, foram identificadas variantes de β-lactamases SHV com atividade hidrolítica
estendida, ou seja, contra cefalosporinas de terceira geração, especialmente em isolados
clínicos de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae e Serratia marcescens (Heritage et al.
1999). Novos genes têm surgido, através de mutações, derivados dos genes clássicos. Esses
podem ocasionar a substituição de apenas um aminoácido, fato suficiente para tornar a enzima
mais eficiente, ou até mesmo, aumentando seu perfil de hidrólise, ampliando seu espectro de
atividade. A substituição do aminoácido glicina pelo aminoácido serina, na posição 238, dá
origem à enzima SHV–2 de espectro estendido. Já uma substituição adicional na posição 240
confere à essa enzima uma hidrólise mais ativa ao ceftazidime, enquanto que, a substituição
do aminoácido serina pela glicina na posição 130 é essencial para inativar ampicilina e ácido
clavulânico (Coque 2002).
Alguns estudos tem documentado que o aumento da frequência de isolados portadores
de enzimas β-lactamases não ocorre devido apenas à expansão clonal, mas também através da
disseminação plasmidial. A sequência de inserção IS 26 também foi encontrada associada ao
gene bla SHV-12 juntamente com a estrutura DEOR um regulador transcricional. A diversidade
do contexto genético encontrado, em particular, nos genes bla localizados especificamente em
plasmídeos sugere a evolução desses através de diferentes eventos recombinantes (Diestra et
al. 2008).
16
1.2.1.3 – Enzima CTX-M
Em 1986, no Japão, foi descoberto uma enzima ESBL não TEM e não SHV a qual foi
designada de FEC -1. Essa foi isolada de Escherichia coli resistente ao cefotaxime. Na
Alemanha, início de 1989, uma enzima com as mesmas características da FEC-1 foi isolada
em Escherichia coli a qual foi denominada de CTX-M1. Essa é responsável por hidrolisar
mais cefotaxima do que ceftadizime e apresenta ponto isoelétrico alcalino. A alta atividade
cefotaximase está relacionada com a geometria única do sítio de ligação dessa β-lactamase
que se adapta melhor à estrutura química da cefotaxima do que aos demais β-lactâmicos. A
enzima CTX-M é inibida pelo ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam (Bonnet 2004,
Eckert et al. 2004).
Novos grupos com fenótipo típico de resistência ESBL não TEM e não SHV tem sido
descritos recentemente. Esses incluem as enzimas PER -1, PER-2, VEB-1, GES-1 e BES -1.
Porém, a enzima CTX-M é a de maior destaque por apresentar uma alta frequência em
isolados clínicos. Ela apresenta identidade <40% com a enzima TEM e SHV. A enzima CTX-
M tem sido encontrada em maior quantidade nos isolados de Salmonella typhimurium,
Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae (Sabaté et al. 2000).
A enzima CTX-M é codificada pelo gene bla CTX-M, o qual foi descrito primeiramente
como mediado por cromossomo em espécies de Klebsiella cryocrescens, Klebsiella ascorbata
e Klebsiella georgiana. No entanto, em isolados clínicos, o gene bla CTX-M tem sido mais
encontrado em plasmídeos que variam de 7 Kb a 160 Kb. O gene bla TEM-1 geralmente é
encontrado no mesmo plasmídeo. Esses plasmídeos podem também transportar genes de
resistência a antibióticos de classes diferentes, tais como, aminoglicosídeos, cloranfenicol,
sulfonamida, trimetoprim e tetraciclinas (Livermore et al. 2008).
Após a descoberta do gene bla CTX-M, na década de 80, novas variantes do mesmo tem
sido descritos. Eles apresentam mais de 50 variantes alélicos, subdivididos em 6 subgrupos,
os quais agrupam os genes que apresentam menor variação alélica entre si, cujos produtos
variam de 1 a poucos aminoácidos (Rossolini et al. 2008). Com isso, os membros de um
mesmo subgrupo apresentam mais que 94 % de identidade, enquanto que foi observado entre
os demais grupos similaridade menor que 90 %. De acordo com estudos filogenéticos, os
subgrupos são os seguintes: CTX-M 1 (6 enzimas); CTX-M-2 (8 enzimas); CTX-M
8(1enzima); CTX-M 9(9 enzimas) e CTX-M 25 que inclui CTX-M 26 (Bonnet 2004).
17
O gene bla CTX-M tem sido observado em diferentes isolados de BGN, principalmente,
nas enterobactérias, tais como, Escherichia coli, Shigella sonei, Proteus mirabillis,
Morganella morganii, Citrobacter freundii, Serratia marcenses e Enterobacter aerogenes. A
forma de disseminação mais prevalente desse gene entre mesmas espécies ou entre espécies
diferentes é a horizontal, via plasmídeo (Rossolini et al. 2008).
Os genes bla estão frequentemente associados a plasmídeos. Muitos desses codificam
marcadores de resistência a medicamentos e fazem parte de transposons, os quais são
frequentemente flanqueados por elementos de inserção (IS) que conferem capacidade de
mobilizar os genes. Os integrons também podem fazer parte de estruturas cassete, as quais são
capazes de captar os genes através de um evento de recombinação sítio específico entre dois
sítios de DNA. Algumas sequências de inserção têm sido associadas à mobilização de
codificadores de β-lactamases, tais com o bla CTX-M, são elas: ISE cp 1, IS 26 e IS 503
(Eldestein et al. 2003, Livermore et al. 2007).
Devido ao elevado uso de ceftazidima na prática clínica, houve a seleção de mutantes
no gene bla CTX-M com o aumento da atividade de ceftazidimase. A mutação ocorre em dois
dos elementos estruturais que delimitam o sítio de ligação β-lactâmico, chamado de parte
terminal da folha β-3, tornando o sítio ativo da enzima mais acessível à ceftadizima. A
substituição, no Ω loop (na posição 167) aparentemente modifica a forma de interação dos
antibióticos β-lactâmicos com o sítio de ligação. A substituição do aminoácido Asp 240 por
Gy tem sido associada com o aumento da atividade catalítica para a ceftazidima (Woodford et
al. 2004).
Dentre as enzimas CTX-M, a CTX-M 2 está entre os exemplares mais disseminados.
Ela tem sido isolada em humanos e animais saudáveis os quais podem ser reservatórios de
isolados produtores de enzimas CTX-M. A maioria desses isolados está associada a infecções
nosocomiais. Entretanto, em contraste com as enzimas TEM e SHV, a enzima CTX-M
emerge em isolados da comunidade, como Salmonella não tifóide e Shigella sp e Escherichia
coli. A epidemia dessa enzima está mudando a epidemiologia das ESBL e, em alguns lugares
a enzima CTX-M é a mais prevalente em isolados de Escherichia coli e Klebsiella
pneumoniae. A propensão dessa enzima se disseminar rapidamente em E. coli, se dá
principalmente porque essa é a espécie mais comumente isolada em amostras clínicas (Dutour
et al. 2002, Bonnet 2004, Livemore et al. 2007).
A disseminação do gene bla CTX-M tem sido massiva e mundial, a qual tem sido
chamada de “pandemia CTX-M”. Ela é um bom exemplo da rápida e global disseminação de
resistência mediada por plasmídeo através de bactérias patogênicas. Temos como principais
18
causas para a alta disseminação o carreamento por plasmídeos com alta e eficiente
transferência por conjugação entre bactérias de mesma espécie ou de espécies diferentes e/ou
baixo custo do “fitness” imposto pelo gene bla CTX-M a elementos genéticos nos hospedeiros
bacterianos comparados a outros genes (Rossolini et al. 2008).
Na prática, a resistência à ceftazidima é usada como indicadora para enzimas TEM e
SHV. No entanto, não é um bom indicador para enzima CTX-M, visto que, essas são
sensíveis à mesma. No entanto, algumas enzimas CTX-M surgem resistentes a esse substrato,
causando resultados interpretativos contraditórios. Daí, a importância de associar mais de uma
cefalosporina de terceira geração nos testes de sensibilidade. Essa prática não é feita na
maioria dos laboratórios. Com isso, ela constitui a maior fonte de resistência às cefalosporinas
de terceira geração (Eldestein et al. 2003).
A distribuição das enzimas ESBL em alguns estados do Brasil está representada na
Figura 6.
Figura 6: Distribuição de ESBL em Enterobactérias no Brasil. Fonte: Silva &Lincopan (2012).
1.2.2 – Carbapenemases
Os carbapenêmicos (imipenem, meropenem e ertapenem) frequentemente são usados
como agentes mais apropriados para o tratamento de infecções causadas por BGN produtoras
de ESBL. Após a sua introdução em 1980, relatos de que tem sido crescente a frequência de
isolados clínicos produtores de enzimas carbapenemases, capazes de hidrolisar os
carbapenêmicos, tem crescido gradativamente. Essas também são codificadas por genes
19
localizados em plasmídeos. A carbapenemase que cresce em importância é a Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) codificada pelo gene bla KPC, a qual foi descrita
primeiramente nos EUA, em 2001, e confere resistência a todos os agentes β-lactâmicos,
incluindo penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos (Anderson et al.
2007, Shen et al. 2009).
Antes da introdução dos carbapenêmicos na prática clínica, a resistência aos mesmos
através das carbapenemases, era limitada a patógenos que apresentavam resistência intrínseca
aos mesmos, tais como, Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas sp, Flavobacterium sp,
Legionella gormanii, Bacillus cereus e Bacterioides fragillis. No entanto, a produção de
carbapenemases entre as espécies de BGN tem aumentado gradativamente, principalmente em
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter sp, Citrobacter freudii, Pseudomonas
aeruginosa, Serratia marcescens, Proteus mirabillis e Salmonella enterica (Gumez et al.
2008, Wallace et al. 2010).
A resistência aos carbapenêmicos pode ser mediada por três mecanismos: produção de
alta quantidade de enzima Amp C combinada com a redução da permeabilidade da droga;
modificação da afinidade do sítio alvo pelas enzimas PBL e, por último, produção de
carbapenemases, enzimas capazes de hidrolisar os antibióticos carbapenêmicos. Dentre esses
mecanismos, o principal é a produção de carbapenemase (Petrella et al. 2008, Tsakris 2010).
As carbapenemases estão divididas em três grandes grupos: Classe A serina
carbapenemase IMI, SME GES e KPC; Classe B metalo β-lactamase é composta pelas
enzimas MBL VIM e IMP, e a Classe D – oxacilinases, essa aparece em menor frequência. A
enzima Serratia marcescens (SME) é codificada pelo gene cromossomal bla SME, fato que
dificulta sua disseminação. Ela tem sido encontrada exclusivamente em espécies de Serratia
marcescens apresentando três variantes, as quais diferem entre si em apenas um ou dois
aminoácidos. Já a enzima Espectro Estendido Guiana (GES) foi encontrada primeiramente em
um paciente da Guiana em isolado de Klebsiella pneumoniae. Essa família possui nove
diferentes membros, dos quais, apenas 1, 2, 4 e 5 apresentam atividade carbapenemase. Essa
enzima tem sido encontrada em espécies de Pseudomonas aeruginosa e em outros membros
de enterobactérias. Já a enzima Imipenemase/ Não Metalocarbapenemase (IMI/NMC) forma
dois sub–grupos IMI e NMC-A ( Rasmussen & Høiby 2007, Gulmez et al. 2008).
As enzimas MBL hidrolisam todos os β-lactâmicos, com exceção dos
monobactâmicos. Elas não são inibidas pelos inibidores de β-lactamases, mas são inibidas por
agentes quelantes como EDTA. Elas são produzidas intrinsecamente pelas bactérias
Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Chryseobacterium meningosepticum,
20
Legionella gormaniie e Aeromonas sp. Ao contrário das MBL codificadas por cromossomos,
cuja frequência está ligada à frequência da espécie, a detecção e frequência de MBL
transferíveis ou adquiridas têm aumentado ultimamente (Giakkoupi et al. 2005, Cavalcanti et
al. 2012)
A carbapenemase de maior importância clínica é a KPC, devido à sua alta frequência e
associação com altas taxas de morbimortalidade. Essa é codificada pelo gene bla KPC, o qual é
carreado por plasmídeos de vários tamanhos. Estudos demonstraram que esse gene é
transponível entre diferentes elementos genéticos. Estudos sugerem a presença de um
transposon Tn 4401, o qual é responsável por intermediar a mobilização e rápida
disseminação da enzima KPC entre as diferentes espécies. Esse transposon contém uma
enzima transposase, uma resolvase, o gene bla KPC e duas sequências de inserção (IS) ISK pn
6 e ISK pn 7 ( Shen et al. 2009, Gootz et al. 2009).
As carbapenemases do tipo KPC apresentam 10 variantes (KPC -2 a KPC 11). Elas
diferem entre si em 1 ou 2 pontos de mutação. Múltiplos sequenciamentos mostraram que a
enzima possui três sítios ativos altamente conservados entre si. O primeiro elemento é a tríade
Ser–X-X-Lys, onde X representa um resíduo variável, Ser é serina e Lys - lisina. O segundo
motivo seria Ser –Asp-Arn, na posição 130. O terceiro resíduo é o aminoácido glicina na
posição 166 (Rasmussen & Høiby 2007).
Os plasmídeos que transportam o gene bla KPC também transportam genes de
resistências para várias classes de antibióticos. Isso se deve a múltiplos pontos de pressão
seletiva, principalmente no ambiente clínico, onde isolados são expostos às penicilinas,
cefalosporinas dentre outros antibióticos. Essa pressão constante favorece uma relação
endêmica com esses isolados durante muito tempo e contribui para a disseminação de
plasmídeos entre as espécies. Um estudo recente mostrou que um isolado continha o gene bla
KPC em dois diferentes plasmídeos, refletindo a habilidade do gene em se mobilizar mesmo
dentro da mesma célula (Rasmussen 1997, Gootz 2009).
Os isolados produtores de enzima KPC podem ser difíceis de detectar, visto que, a
elevação do MIC acima do valor preconizado pelo Clinical and Laboratory Standards
Institute CLSI 2011 nem sempre é evidente, ou os laboratórios usam testes rápidos cujo
procedimento implica em pequena quantidade de inóculo bacteriano, gerando um MIC dentro
da faixa de susceptibilidade. Esse fato constitui um desafio terapêutico, pois o tratamento
inadequado contribui significativamente com o aumento de mortalidade e morbidade nos
pacientes (Gaibani et al. 2011, Robledo et al. 2011).
21
1.3- MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE β-lactamase Como técnicas para detectar bactérias produtoras de ESBL os laboratórios de
microbiologia utilizam dois tipos de testes. Os primeiros são chamados de teste de triagem,
onde a presença de certas características faz com que o microbiologista suspeite da bactéria
ser produtora dessa enzima. O antibiograma tradicional, cuja interpretação segue critérios
estabelecidos pelo CLSI, o teste de diluição em caldo e os métodos de automação, como o
Vitek e MicroScan são os mais usados na rotina laboratorial. Os outros testes são chamados
de testes confirmatórios, os quais são baseados no uso de substâncias inibidoras de β-
lactamases, como o ácido clavulânico. Caso a zona de inibição sofra aumento pela adição do
inibidor de β-lactamase trata-se da presença de ESBL. Como testes confirmatórios os
laboratórios de microbiologia se utilizam do método E-Test®, método da dupla difusão ou
método de aproximação de discos e método da adição do ácido clavulânico (Santos 2009).
O método E-test® utiliza uma fita plástica que contém concentrações crescentes do
agente em estudo e é colocada sobre uma placa de ágar Müeller-Hinton semeado com o
inóculo bacteriano padronizado na escala 0,5 de Mac Farland. De um lado da fita há uma
cefalosporina (como a ceftazidima) e do outro lado a cefalosporina associada ao ácido
clavulânico numa concentração fixa. Caso haja uma diminuição da CIM em pelo menos 3
diluições o teste confirma presença de ESBL, conforme ilustrado na figura 7 (Júnior et al.
2004).
Figura 7: Região superior: antibiótico sem associação com o ácido clavulânico (MIC > 32µg/mL). Região inferior cefalosporina associada ao ácido clavulânico (MIC > 0,25µg/mL). Fonte: Swanston & Akpaka (2008)
22
O método da dupla difusão ou método de aproximação do disco é feito mediante a
sinergia de duplo disco. Realiza-se a difusão em ágar Müeller-Hinton inoculado com uma
suspensão bacteriana ajustada com o padrão de 0,5 de Mac Farland, logo após coloca – se os
discos de antibióticos com carga padronizada de cefalosporinas de terceira geração, como
cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona dispostos a uma distância de 20 mm de discos de
amoxicilina/ácido clavulânico. É considerada sinergia positiva (ESBL positiva) quando se
observa uma ampliação do halo de inibição em algumas das cefalosporinas ou o aparecimento
de uma terceira zona irregular (ghost zone) entre os discos compostos e o disco de um dos
antibióticos β-lactâmicos. É a técnica mais usada nos laboratórios de microbiologia devido à
fácil execução e baixo custo, a qual está ilustrada na figura 8 (Murray et al. 2006).
Figura 8: Resultado positivo para ESBL onde se observa uma zona fantasma entre o disco de amoxicinlina/ácido clavulânico e cefoxitina. Legenda: AMC-amoxicilina/ácido clavulânico, CAZ-ceftazidima, ATM-aztreonam, CTX-cefotaxima, CFO-cefoxitina. Fonte: Corção et al. (2009).
O método de adição do ácido clavulânico ao disco de ceftazidima baseia-se na
comparação do tamanho do halo formado em torno dos discos de ceftazidima (30µg) com o
halo do disco de ácido clavulânico/cefotaxima (10µg/30µg). Um aumento maior ou igual a 5
mm no halo de inibição do disco composto comparado ao simples indica bactéria produtora
de ESBL ( Figura 9) (Silva & Lincopan 2012).
23
Figura 9: Lado direito da figura – disco de cefotaxima e lado esquerdo disco combinado de cefotaxima e ácido clavulânico. Teste positivo para ESBL. Fonte: Corção et al. (2009).
Como alternativas aos métodos citados anteriormente, surgiram os métodos
automatizados, os quais se baseiam em painéis de microdiluição disponíveis para
comercialização, principalmente para os sistemas MicroScan e Vitek. A análise fenotípica da
bactéria por este método proporciona uma padronização e rapidez, o que garante boa
consistência dos resultados em detrimento dos testes baseados em disco com resultados após
18-24 horas. No entanto, o método automatizado apresenta algumas desvantagens quando
comparado aos de difusão em ágar, pois, certas bactérias não crescem ou o fazem pobremente
após 4-5 horas de incubação, como Proteus sp, Morganella sp, Providencia sp, Yersinia sp
dentre outras ( Júnior et al. 2004).
É de suma importância mensurar a frequência de bactérias produtoras de β-lactamases,
especialmente as ESBL, para que se possa estabelecer como rotina no laboratório de
microbiologia clínica a inclusão de antibióticos específicos nos testes de suscetibilidade. A
rápida e correta identificação de bactérias produtoras de β-lactamases é essencial para o
sucesso no tratamento terapêutico do paciente. A fim de superar as limitações dos testes
supracitados, os quais estão sujeitos à variáveis como concentração do inóculo, clones
diferentes em uma mesma colônia que dificulta a interpretação dos resultados dos testes e
induz a laudos falsos negativos, as técnicas de biologia molecular surgem como uma
ferramenta importante por não estarem sujeitas a essas variáveis.
1.4 MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO DE CARBAPENEMASE Os testes de triagem para identificação de espécies produtoras de enzimas KPC são os
mesmos utilizados na triagem de espécies produtoras de ESBL. No entanto, como teste
confirmatório é utilizado o teste de Hodge modificado. Ele é feito em uma placa com ágar
24
Müller Hinton previamente semeada com Escherichia coli (ATCC 25922) cepa sensível a
todas as classes de antibióticos, ajustada na escala 0,5 de Mac Farland. No centro da placa é
colocado um disco de antibiótico carbapenêmico, geralmente o ertapenem. Em seguida, a
placa é semeada no sentido ponta da placa até o disco de antibiótico com o isolado que se
deseja confirmar a presença de KPC e em outra reta é semeada a cepa padrão controle
positivo para KPC ATCC BAA 1705 (Figura 10). Em volta do ertapenem é formado um halo
de inibição, visto que, a Escherichia coli previamente semeada é sensível ao mesmo. Caso a
espécie a ser testada quanto à presença de KPC seja positiva, o halo de inibição sofre
alteração formando uma “seta”, visto que, o ertapenem é inibido pela enzima KPC e a
Escherichia coli consegue crescer junto com a espécie teste confirmando o resultado como
KPC positiva (Figura 10) ( Rossi et al. 2009).
Figura 10: Teste modificado de Hodge para produção de KPC. Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela amostra de K. pneumoniae testada. Fonte: Rossi et al (2009).
25
2- JUSTIFICATIVA
A emergência e disseminação de enzimas β-lactamases, especialmente as ESBL nas
Bactérias Gram Negativas tem sido descritas mundialmente como emergência clínica devido à
grande frequência desses isolados em infecções relacionadas com a assistência em saúde,
principalmente no tecido sanguíneo em pacientes hospitalizados.
As frequências entre os genes responsáveis pela produção de ESBL e carbapenemase
variam entre si e entre as espécies bacterianas. Essas variações fazem com que cada região
tenha características próprias, com algumas espécies bacterianas prevalecendo juntamente
com um determinante genético (Bayran & Balci, 2006).
Com isso, cabe a cada região fazer estudos epidemiológicos a fim de saber quais
espécies de BGN são mais frequentes quanto à presença de ESBL e KPC e dentre os genes
bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC qual é o mais responsável pela presença desses
mecanismos. Os dados epidemiológicos são importantes na criação de guias que auxiliem os
médicos na tomada de decisões acerca da melhor terapia a ser usada em cada paciente. Para
isso, a biologia molecular apresenta-se como uma ótima ferramenta, visto que, apresenta alta
sensibilidade e especificidade na detecção de mecanismos genéticos.
O laboratório de microbiologia do Hospital das Clínicas de Goiânia tem detectado um
número crescente de BGN produtoras de ESBL e carbapenemases. No entanto, a frequência
dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC e de espécies produtoras das mesmas em
amostras sanguíneas não está bem caracterizada neste serviço. Portanto, o estudo vem
contribuir para um melhor entendimento desta problemática na realidade local.
26
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Determinar a frequência dos genes de resistência à ESBL bla TEM, bla SHV, bla TEM e
carbapenemase bla KPC em Bactérias Gram Negativas isoladas de hemoculturas de pacientes
do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás durante o período de 31 de janeiro
de 2011 a 31 de janeiro de 2012.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar o perfil de suscetibilidade dos isolados no estudo;
• Determinar a frequência de ESBL e carbapenemase nas diferentes espécies de
Bactérias Gram Negativas;
• Comparar a detecção de ESBL e Carbapenemase por métodos fenotípicos e
moleculares;
• Avaliar a distribuição dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC entre as espécies
de Bactérias Gram Negativas.
• Caracterizar molecularmente os isolados bacterianos através da PFGE;
• Investigar possíveis clusters responsáveis pela infecção por isolados ESBL e KPC
positivos.
27
4 MÉTODOS
4.1 AMOSTRAS BACTERIANAS
Esse estudo faz parte do Projeto intitulado de “Epidemiologia, prevenção e controle de
infecções em hospital universitário de Goiânia” aprovado no Comitê de Ética do HC-UFG,
apresentando como número de registro 35749.
As amostras bacterianas utilizadas nesse projeto foram obtidas de hemoculturas,
coletadas em pacientes hospitalizados no Hospital das Clínicas de Goiânia (HC-UFG-
hospital de cuidados terciários, com 12.000 admissões/ano e 300 leitos). Foram utilizadas
apenas as amostras que foram positivas para a presença de BGN. As amostras de sangue
foram coletadas mediante pedido médico devido à suspeita clínica de infecção sanguínea, no
período de 31 de janeiro de 2011 a 31 de janeiro de 2012
Os controles de qualidade das reações de PCR para o gene bla KPC foram feitos
utilizando as cepas padrão Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705, como controle positivo
e Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706, como controle negativo. Já nas reações de PCR,
a fim de identificar os genes ESBL bla TEM, bla SHV e bla CTX-M, como controle positivo foi
utilizada a cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, obtidas no LACEN–GO.
4.1.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
As hemoculturas foram coletadas mediante critério médico e processadas no sistema
automatizado Bactec (Biomerieux) utilizando frascos Bactec Plus Aerobic, Bactec Plus
Anaerobic e Bactec Plus F. Os frascos permaneceram incubados à 37 °C sob agitação e
monitorização contínua por 5 dias. As amostras que apresentaram crescimento tiveram uma
alíquota retirada para proceder à coloração de Gram e análise no microscópio óptico. As
culturas positivas para bactérias Gram negativas foram semeadas em ágar Mac Conkey e
colocadas em estufa à 37 °C durante 24 horas.
Após o período de incubação, a cultura foi preparada para análise pelo sistema
automatizado Vitek 2 (bioMérieux®) que baseia-se em dois testes simultâneos o de
identificação e suscetibilidade aos antimicrobianos. Para isso, foram feitas duas diluições
seriadas, onde a primeira foi feita da seguinte forma: em um tubo é colocado solução salina
estéril e uma quantidade de bactérias suficientes para atingir a concentração de 0,5 de Mac
Farland para avaliação do MIC e uma segunda diluição para os testes bioquímicos e posterior
28
identificação da espécie bacteriana. Após três horas, o teste de identificação é determinado
pelo aparelho.
4.2.1 Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos
Os painéis utilizados no VITEK 2 contêm os antibióticos preconizados pelo CLSI-
2011 para pesquisa de mecanismos de resistência nas espécies presentes nas amostras, assim
como também, os pontos de corte utilizados para determinar o perfil de sensibilidade aos
mesmos. Para os testes fenotípicos das BGN foram utilizados os seguintes antibióticos:
Ceftriaxone, Cefepime, Ceftadizime, Cefoxitina, Aztreonam, Amoxacilina com Ácido
Clavulânico, Imipenem, Meropenem, Ertapenem.
Os testes de identificação primária foram feitos no laboratório de microbiologia do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás.
4.2.2 Condições de armazenamento
Após identificação e determinação do perfil de suscetibilidade, as amostras foram
enviadas ao Laboratório de Bacteriologia Molecular do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública (IPTSP-UFG).
Todos os isolados, assim como as cepas padrões, foram re-semeadas em ágar Mac
Conkey no Laboratório de Bacteriologia Molecular do Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública (IPTSP-UFG) e colocadas em estufa a 37°C, durante 24 horas. Em seguida, toda a
massa bacteriana foi removida com swab estéril e armazenada em solução de (Trypitic Soy
Broth- caldo tripticaseina de soja) TSB acrescido de 20% de glicerol e estocadas em freezer –
70°C para preservação das mesmas. A partir desses congelados foram feitas as extrações de
DNA.
4.3- Extração de DNA Bacteriano
As amostras congeladas em TSB a 20 % de glicerol, foram reativadas em 3 mL de
caldo TSB, o qual foi incubado em estufa a 37°C, durante 24 horas. Foram feitas extrações de
DNA cromossomal e plasmidial. Para a extração de DNA cromossomal 1mL de cultura
crescida do TSB foi transferido para tubos de microcentrífuga (tipo eppendorf) centrifugado à
5000g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento re-ssuspendido em 400µL
de tampão TE (10 mM TrisHCl, 0,1 mM EDTA pH 8,0) contendo de 3µL de lisozima e a
suspensão foi incubada em banho maria à 37ºC por 1h30min. Posteriormente, foi
29
acrescentado 70µL de SDS (10%) e 12µL de proteinase K (20mg/mL) e incubado a 56ºC por
10 min. Em seguida, foi adicionado 100µL de NaCl (5,0M) e 80mL de solução CTAB/NaCl
(10 % CTAB e 0.73M NaCl), agitado lentamente até atingir aspecto leitoso e incubado a 65ºC
por 10 minutos. 650µL de clorofil (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1, v/v) foi acrescentado,
seguido de agitação por 30 segundos. A solução foi centrifugada a 12000g por 5 min. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo, onde houve a adição de 400µL de isopropanol
gelado e o sistema foi homogeneizado. Após homogeneização, foi incubado a -20ºC por 24
horas, centrifugado a 18000g a 4ºC por 20 minutos e o sedimento foi lavado com 1mL de
álcool etílico a 70% gelado. O DNA foi re-ssuspendido em 50µL de água miliQ. Uma
alíquota do DNA foi analisada em gel de agarose a 0,8% e corada com brometo de etídeo
após corrida eletroforética;
A extração de DNA plasmidial foi feita pelo método de lise alcalina. Um mL da
cultura crescida em TSB foi transferido para cada tubo do tipo eppendorf e centrifugado a
5000g por 10 min. O sobrenadante foi descartado. O sedimento foi re-ssuspendido
completamente com 210µL de solução I (150mM TrisHCl, 10 mM EDTA pH 8,0- contendo
10µg de RNAse em cada amostra). Em seguida, foram acrescentados 210µL da solução
alcalina II (200mM NaOH, 1% de SDS). O tubo foi misturado lentamente por inversão de
tubos e incubado a temperatura ambiente por 5 min. Depois foram adicionados 280µL da
solução III (acetato de sódio 3M, ácido acético 2M, pH 4,8-5,0 ) e misturado imediatamente
por inversão por 10 vezes e centrifugado por 10 minutos a 12.000g. O sobrenadante foi
transferido para um novo eppendorf e foram adicionados 560µL de isopropanol gelado,
homogeneizado por inversão e incubado por 10 min a temperatura ambiente. Em seguida, foi
centrifugado por 15 min a 12.000g. O sedimento foi lavado com 500µL de etanol a 70%
gelado e deixado secar. O mesmo foi re-ssuspendido com 30µL de água miliQ.
4.2.4 Condições de amplificação do DNA
As amplificações do DNA foram realizadas para os seguintes genes: bla TEM, bla SHV,
bla CTX-M e bla KPC. Os oligonucleotídeos iniciadores para cada alvo estão descritos na tabela
2. O método de PCR utilizado foi o convencional.
30
As condições para amplificação dos genes bla:
Desnaturação inicial: 94°C por 3 minutos, seguidos de 30 ciclos de:
ü Desnaturação a 95°C por 30 segundos;
ü Anelamento de acordo com o alvo descrito na tabela 2, 1 minuto;
ü Extensão a 72°C por 1 minuto; extensão final a
72°C final por 4 minutos
Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho dos produtos e do PCR para detecção de mecanismos de resistência.
Fonte: gene bla TEM, bla SHV e bla CTX-M Jiang et al, 2006 e bla KPC. Fonte: Tenover et al.2006.
Os reagentes do mix e devidas quantidades utilizadas estão descritas a seguir:
ü Água mili Q: 7,8µL
ü Primer forward: 2µL
ü Primer reverse: 2µL
ü Tampão concentração 5X: 4µL
ü dNTPs: 2µL
ü Enzima Taq polymerase: 0,2µL
ü DNA: 2µL
Oligonucleotídeos Gene alvo Sequências dos oligonucleotídeos (sentido 5´-3´)
Tamanho dos produtos
em pares de bases
Temperatura de Anelamento
ESBL
TEM Fw bla TEM
GGGGAGCTCATAAAATTCTTGAAGAC 861 pb 51
TEM Rv GGGGGATCCTTACCAATGCTT SHV Fw bla SHV ATGCGTTATATTCGCCTGTG 862 pb 49 SHV Rv GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG CTX-M Fw bla CTX-M CGCTTTGCGATGTGCAG
550 pb 51 CTX-M Rv ACCGCGATATCGTTGGT
Carbapenemase
KPC Fw bla KPC
TGTCACTGTATCGCCGTC 1009 bp 58
KPC Rv CTCAGTGCTCTACAGAAAACC
31
4.2.5 Eletroforese em Gel de Agarose
Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
1,5 %, contendo 0,5 µg/ mL de brometo de etídeo, durante aproximadamente 2 horas a 120
volts. No gel foi aplicado marcador de peso molecular de DNA 1KB plus (Invitrogen) para
ser usado de padrão de comparação dos tamanhos esperados das amplificações. Em seguida,
o gel foi fotografado no fotodocumentador (Biorad) para posterior análise.
4.3PULSED FIELD GEL ELETROPHORESIS (Ribot et al. 2006)
A bactéria foi inoculada em placas com meio de cultura TSA durante 14-16 horas. Em
seguida, com auxílio de swab umedecido com Tampão de Suspensão (100mM Tris, 100mM
EDTA pH 8.0),as colônias foram transferidas para tubos do tipo Falcon contendo 2mL de
tampão de suspensão. A concentração de células foi ajustada para 1.3 -1.4 em comprimento
de onda de 610nm em espectrofotômetro.
A suspensão de bactérias foi então utilizada para confecção dos blocos de agarose
(plugs). Os plugs foram preparados com 200µL da suspensão de bactérias, 10µL de proteinase
K (20mg/mL) e 200µL de agarose de corrida para PFGE 1,0% preparada em tampão TE
(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0) e 1,0% de SDS. Os plugs foram submetidos à lise e
desproteinização em 5mL de tampão de lise [50mM Tris, 50mM EDTA pH 8,0; 1,0%
sarcosil] e 0,1mg/mL de proteinase K com incubação a 54°C durante 1,5 a 2 horas em banho-
maria com agitação ou shaker (150-175 rpm). Após incubação, os plugs foram lavados
inicialmente com 10-15mL de água Tipo I esterilizada pré aquecida a 50oC em banho-maria
com agitação ou shaker por 10-15´/50oC. Depois, foram lavados quatro vezes com 10-15mL
de tampão TE (10mMTris, 1mM EDTA, pH 8.0) esterilizado e pré-aquecido a 50oC, em
banho-maria com agitação ou shaker por 10-15´/50oC. Após a última lavagem, os plugs foram
estocados em Tampão TE sob refrigeração.
O DNA contido no plug foi digerido com 40-50U de enzima de restrição XbaI
(Invitrogen®) a 37oC durante 2h e a separação dos fragmentos de DNA foi feita em gel de
agarose 1,0% em 2L de tampão TBE 0,5X (Tris 90mM, ácido bórico 90mM e EDTA 2mM),
por eletroforese em gel em campo pulsado no sistema CHEF DRII (Bio-Rad Laboratories,
CA, EUA) nas seguintes condições:
32
- E. coli: 19h; 6,0V/cm; 14oC; switch – 2.16 – 55.17s;
- K. pneumoniae: 20h; 6,0 V/cm; 14oC; switch – 5 – 55s.
Em seguida o gel foi corado com brometo de etídeo (0,5mg/mL) durante 30minutos),
descorado em H2O destilada durante 15minutos, visualizado em fotodocumentador sob
iluminação ultravioleta e capturados com o sistema Molecular Imager GelDoc XR (Bio-
Rad®). As fotos foram digitalizadas e salvas como arquivo TIF para análise posterior. Foi
utilizado como padrão de peso molecular Lambda DNA ladder PFGE (Bio-Rad®)
posicionado na primeira e última coluna de cada gel.
Os isolados bacterianos que apresentaram semelhança de 100% foram consideradas
como clones bacterianos, enquanto que, aqueles que apresentaram entre 80 % e 99% foram
considerados do mesmo cluster.
4.7 - Teste de Hodge Modificado
O teste de Hodge modificado foi realizado da seguinte forma: uma placa de com ágar
Müller Hinton previamente semeada com Escherichia coli (ATCC 25922) cepa sensível a
todas as classes de antibióticos, ajustada na escala 0,5 de Mac Farland. No centro da placa foi
colocado um disco de meropenem. Em seguida, a placa foi semeada no sentido ponta da placa
até o disco de antibiótico com o isolado 27LJ e em outra placa foi feito o mesmo
procedimento para o isolado 45LJ.
4.8-Análise de Dados
A análise de dados foi feita de forma prospectiva a fim de calcular a frequência de
genes responsáveis pela produção de β-lactamases e frequência de Bactérias Gram Negativas.
A análise do perfil dos fragmentos de macrorrestricção resultantes do PFGE foi
inicialmente realizada por inspeção visual segundo os critérios sistematizados por Tenover et
al. (1995). Adicionalmente, os géis de PFGE foram utilizados como imagens preto e branco
invertidas de 8 bits e processados pelo programa BioNumerics (versão 5.0; Applied Maths,
Ghent, Belgium). O processo de normalização intra e inter géis foi padronizado com o
marcador de peso molecular Lambda DNA ladder PFGE (Bio-Rad®). A construção do
dendrograma, para avaliar a relação genética entre as cepas foi realizada utilizando-se o
coeficiente de similaridade de Dice, baseado na posição e presença das bandas e no algoritmo
de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method). Os parâmetros de
otimização e tolerância foram utilizados com os respecticos valores, 0,7 e 1,0%. Cada cluster
33
de isolados foi definido como um grupamento de perfis (n ≥2) apresentando um coeficiente de
similaridade acima de 80% (Carriço et al. 2005).
34
5 RESULTADOS
5.1-Caracterização dos isolados
Foram obtidos 79 isolados de Bactérias Gram Negativas, a partir de hemoculturas, no
período proposto. Essas foram provenientes de vários serviços do Hospital das Clínicas de
Goiânia, tais como, clínica médica, UTI e pronto socorro. Desses, a espécie mais frequente foi
a Klebsiella pneumoniae (n=24), seguida de Escherichia coli (n=16) e Acinetobacter
baumannii (n=13). Do total de isolados analisados, 57 isolados foram de enterobactérias e 22
foram BGN-NF. Esses estão descritos na tabela 3.
Tabela 3: Distribuição das frequências de Bactérias Gram Negativas a partir de hemocultura.
Espécies Número de Isolados
Frequência
k. pneumoniae 24 30,38% E. coli 16 20,25%
A.baumannii 13 16,45% E. cloacae 9 11,39%
P. aeruginosa 8 10,13% S. marcescens 3 3,80% C. freundii 2 2,53% E. aerogenes 1 1,26% E. asburiae 1 1,26% P. mirabilis 1 1,26% S. maltophila 1 1,26%
Total 79 100,00%
Com relação à origem das amostras, foi verificado que o serviço de pronto socorro (n=
23), foi o que mais contribuiu com isolados na amostra geral seguida pela clínica médica
(n=22) e UTI (n=10) como descritos na tabela 4. Dentre as espécies de BGN, as mais bem
distribuídas entre os serviços foram Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter
baumannii e Enterobacter cloacae.
35
Tabela 4: Origem dos isolados bacterianos em hemoculturas do HC-UFG
Espécies P S C M UTI UTI Neo PED C G UTI C TRS MO ORT
k. pneumoniae 5 10 2 2 1 1 1 2 0 0
E. coli 9 3 0 0 0 2 1 0 1 0 A.Baumanii 2 4 4 2 0 0 0 0 0 1 E. cloacae 2 2 2 0 1 1 0 1 0 0
P. aeruginosa 3 0 1 0 2 0 0 0 2 0
S. marcensens 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0
C. freundii 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 E. aerogenes 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E. asburinae 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 P. mirabilis 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 S. maltophilia 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Total 23 22 10 6 5 4 3 3 3 1 Legenda:OS: Pronto Socorro; CM: Clínica Médica; UTI- C: UTI cirúrgica, UTI neo: UTI Neonatal; PED: Pediatria; CG: Cirurgia Geral; TRS: Terapia Renal Substitutiva, MO: Maternidade e Obstetrícia; ORT- Ortopedia.
5.2 -Avaliação da suscetibilidade antimicrobiana
Os isolados do grupo das Enterobactérias foram avaliados quanto à sua suscetibilidade
aos antimicrobianos, de acordo com o CLSI (2011). De acordo com o suplemento M100-S21,
dentre as enterobactérias são consideradas suspeitas de ESBL aquelas que apresentam
resistência a um dos seguintes antibióticos ou mais de um: cefpodoxime, ceftaxima,
ceftazidima, aztreonam e ceftriaxona. Dos 59 isolados obtidos, o Vitek 2 identificou 18
isolados (31,57%). Esses apresentaram resistência a mais de uma classe de antibióticos em
relação aos isolados não ESBL, apresentando 44,44% (n=8) de resistência à gentamicina e
44,44% (n=8) ciprofloxacina, enquanto que, dentre os isolados não ESBL apenas dois
isolados eram resistentes à ciprofloxacina e à gentamicina. Entre as amostras consideradas
ESBL, 94,44% (n=17) eram resistentes à cefotaxima, ceftazidima, cefepime e aztreonam.
Todos esses isolados eram sensíveis à colistina e tigeciclina. Considerando o Aztreonam,
entre as ESBL 100% dos isolados eram resistentes ao mesmo. Em relação aos
carbapenêmicos, apenas uma amostra mostrou resistência ao mesmo. Na tabela 5 estão
apresentados os dados do antibiograma para os isolados de enterobactérias ESBL. O isolado
que está em destaque na tabela também é KPC.
36
Tabela 5: Antibiograma dos isolados de Enterobacteriaceae
Antibióticos/ Isolados
AMP/ SUB
CFX
CTX
CFZ
CEP
ATZ
ERT
IMI
MER
AMK
GNT
CPR
TIG
COL
01 LJ R S R R R R S S S S S R S S 04 LJ R S R R R R S S S S R R S S 12 LJ R I - R R R S S S S S S S S 19 LJ R S R R R R S S S S R R S S 21 LJ R R R R R R S S S S R S S S 22 LJ R S R R R R S S S S S S S S 24 LJ R S R R R R S S S S S R S S 25 LJ R I R R R R S S S S S R S S 27 LJ R R R R R R R R R R R R S S 28 LJ R R R R R R S S S S R S S S 30 LJ R S R R R R S S S S R R S S 33 LJ - S R - R R S S S S R R S S 36 LJ R S R R R R S S S S S S S S 39 LJ R S R R R R S S S S S S S S 46 LJ R S R R R R S S S S S S S S 48 LJ R S R R R R S S S S I S S S 56 LJ R S R R R R S S S R R S S S 58 LJ R S R R R R S S S S S R S S
Legenda: AMP/SUB – Ampicilina/Sulbactam, CFX-Cefoxitina, CTX-Cefotaxima, CFZ-Ceftazidima, CEP-Cefepime, ATZ-Aztreonam, ERT- Ertapenem, IMI-Imipenem, MER-Meropenem, AMK – Amicacina, GNT-Gentamicina, CPR- Ciprofloxacina, TIG-Tigeciclina e Col-Colistina. Ífen – significa que o antibiótico não foi testado para aquele antibiótico.
No grupo das BGN-NF (22 isolados), 54,54% (n=12) eram resistentes à
ciprofloxacina, ceftazidima, cefepime, imipenem e meropenem, enquanto que, 31,81 (n=7)
isolados apresentaram resistência à ciprofloxacina, ceftazidima, cefepime, imipenem,
meropenem e ao aztreonam. 22,72% (n=5) eram resistentes à amicacina. Na tabela 6 estão
apresentados os dados do antibiograma dos 22 isolados de BGN-NF.
37
Tabela 6: Antibiograma dos isolados BGN-NF.
Amostras/Antibióticos
CFZ CEP
ATZ IMI MER
AMK
GNT CPR COL
01 FM S R I S S S R S S 02 FM S S S S S S S S S 08 FM S S S S S S S S S 14 FM S S S S S S S S S 16 FM S S S S S S S S S 21 FM S S S S S S S S S 05 FM R R R R R S S R S 07 FM S S R S S S S S S 09 FM R R R R R R R R S 10 FM R R R R R R R R S 11 FM R R R R R R R R S 12 FM R R R R R R R R S 13 FM R R R R R S S R S 15 FM R R R R R R R R S 17 FM - - - - - - - - - 18 FM R R - R R S S R S 19 FM R R - R R S S R S 20 FM R R - R R S S R S 22 FM R R - R R I R R S 23 FM R R - R R S I R S 24 FM I S - S S S S S S Legenda:CFZ-Ceftazidima, CEP-Cefepime, ATZ-Aztreonam, IMI-Imipenem, MER -Meropenem,AMK – Amicacina, GNT-Gentamicina, CPR - Ciprofloxacina e Col-Colistina.R- resistente; I-intermediário e S – sensível; Ífen – significa que o antibiótico não foi testado paraaquele antibiótico. 5.2.2- Concentração Inibitória Mínima (CIM) De acordo com o Vitek 2, dos 57 isolados de enterobactérias, apenas 18 (31,58%)
foram considerados produtores de ESBL. Dentre esses, três isolados não apresentaram
nenhum dos genes pesquisados. Dentre as cefalosporinas usadas no teste, considerando o MIC
da cefoxitina, apenas 3 (16,67%) amostras apresentaram perfil de resistência com CIM maior
ou igual a 32. Em relação à cefotaxima, 14 (77,78%) amostras apresentaram perfil de
resistência com CIM maior ou igual a 4. No entanto, a CIM das BGN-NF foi variável entre 8
e 64 µg/mL. Na tabela 7 estão apresentados os dados do MIC dos 18 isolados de
enterobactérias ESBL.
38
Avaliando o ponto de corte preconizado pelo CLSI (2011) dos antibióticos utilizados
no teste confirmatório fenotípico, a cefotaxima foi o substrato que mais detectou isolados
produtores de ESBL. O fato do perfil da CIM ser variável para um mesmo antibiótico frente
aos isolados ESBL sugere a ocorrência de variações enzimáticas dentro do mesmo grupo. O
isolado que está em destaque na tabela também é KPC.
Tabela 7: MIC dos isolados Enterobacteriaceae
S≤8/4; R≥32/16
S≤8; R≥32
S≤1; R≥4
S≤4; R≥16
S≤8; R≥32
S≤4; R≥16
S≤0,25; R≥1
S≤1; R≥4
S≤1; R≥4
S≤16; R≥64
S≤4; R≥16
S≤1; R≥4
Número Isolados
AMP/ SUB
CFX CTX
CFZ CEP ATZ ERT IMI MER
AMK GNT CPR
01 LJ ≥ 32 ≤ 4 ≥64 4 2 16 ≤0,5 ≤ 1 0,25 8 ≤ 1 ≥ 4 04 LJ ≥ 32 ≤ 4 ≥64 16 8 ≥ 64 ≤0,5 ≤ 1 0,25 ≤ 2 ≥ 16 ≥ 4 12 LJ ≥ 32 16 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1 ≤0,5 ≤ 1 0,25 ≤ 2 ≤ 1 0,25 19 LJ 4 ≥ 64 ≥64 ≥ 64 ≥ 64 ≥ 64 ---- ≤ 1 1 ≤ 2 4 ≥ 4 21 LJ ≥ 32 ≥ 64 8 16 2 4 ≤0,5 ≤ 1 0,25 16 ≥ 16 0,25 22 LJ ≥ 32 ≤ 4 8 ≤ 1 2 2 ≤0,5 ≤ 1 0,25 ≤ 2 ≤ 1 0,25 24 LJ ≥ 32 4 1 1 1 1 0,5 1 0,25 16 16 2 25 LJ ≥ 32 16 8 ≥ 64 32 64 0,25 ≤ 1 0,25 2 1 4 27 LJ ≥ 32 ≥ 64 ≥64 32 ≥ 64 ≥ 64 ≥ 8 ≥16 ≥16 ≥ 64 ≥ 16 ≥ 4 28 LJ ≥ 32 8 ≥64 ≤ 1 32 16 ≤0,5 ≤ 1 0,25 16 ≥ 16 0,5 30 LJ ≥ 32 ≤ 4 ≥64 16 ≥ 64 ≥ 64 ≤0,5 ≤ 1 0,25 ≤ 2 ≥ 16 ≥ 4 33 LJ ≥ 32 ≤ 4 ≥64 ≥ 64 4 ≥ 64 ≤0,5 ≤ 1 0,25 ≤ 2 ≥ 16 ≥ 4 36 LJ ≥ 32 ≤ 4 ≥64 4 ≥ 64 ≥ 64 ≤0,5 ≤ 1 0,25 ≤ 2 ≤ 1 0,25 39 LJ ≥ 32 ≤ 4 ≥64 4 ≥ 64 ≥ 64 ≤0,5 ≤ 1 0,25 4 ≤ 1 0,25 46 LJ 32 4 1 1 1 1 0,5 2 0,25 2 1 0,25 48 LJ 32 4 4 1 1 1 0,5 1 0,25 16 8 1 56 LJ 32 4 8 1 2 2 0,5 1 0,25 16 16 1 58 LJ 32 4 64 16 2 16 0,5 1 0,25 8 1 4
Legenda: AMP/SUB: Ampicilina/Sulbactam; CFX: cefoxitina; CTX: cefotaxima; CFZ: ceftazidima; CEP: cefepime; ERT: ertapenem; IMI: imipenem; MER: meropenem; AMK: amicacina; GNT: gentamicina; TIG: Tigeciclina e COL: colistina. Ífen – significa que o antibiótico não foi testado para aquele antibiótico.
Em relação à CIM das BGN-NF foi constatada uma alta frequência de resistência às
múltiplas classes de antibióticos. A maioria dos isolados era resistente à ceftazidima,
cefepime, aztreonam, imipenem, meropenem e ciprofloxacina. No entanto, todos os isolados
eram sensíveis à colistina (Tabela 8). O isolado 17 FM, uma Stenotrophomona maltophilia foi
testado apenas para os antibióticos levofloxacina, trimetoprim e sulfametoxazol, sendo
sensível a todos eles.
39
Tabela 8 – MIC dos isolados BGN-NF.
Ponto de Corte
S≤8; R≥32
S≤8; R≥32
S≤8; R≥32
S≤4; R≥16
S≤4; R≥16
S≤16; R≥64
S≤4; R≥16
S≤1; R≥4
S≤2; R≥8
Isolado CFZ
CEP ATZ IMI MER AMK GNT CPR COL
01 FM 4 64 16 1 1 2 16 0,25 2 02 FM 2 2 4 2 1 2 1 0,25 1 04 FM 4 4 - - 0,25 2 1 0,25 - 05 FM 32 64 32 16 16 2 4 4 0,5 07 FM 8 8 64 1 1 2 1 0,5 1 08 FM 1 1 2 2 1 2 1 1 2 09 FM 64 64 64 16 16 16 16 4 0,5 10 FM 64 64 64 8 16 64 16 4 0,5 11 FM 64 64 64 8 16 64 16 4 0,5 12 FM 64 64 64 16 16 16 16 4 0,5 13 FM 64 64 64 16 16 2 4 4 0,5 14FM 2 1 2 2 0,25 2 1 0,25 0,5 15 FM 4 32 64 8 16 64 16 4 2 16 FM 1 1 2 1 2 4 1 0,25 2 17 FM - - - - - - - - - 18 FM 64 64 - 16 16 2 4 4 0,5 19 FM 64 64 - 16 16 2 4 4 0,5 20 FM 64 64 - 16 16 2 2 4 0,5 21 FM 8 8 8 4 4 16 4 1 2 22 FM 64 64 - 16 16 16 16 4 0,5 23 FM 64 64 - 16 16 2 8 4 0,5 24 FM 16 8 - 1 1 2 1 1 0,5
LEGENDA: CFZ-Ceftazidima; CEP-Cefepime; ATZ-Aztreonam; IMI-Imipenem; MER-Meropenem; AMK-Amicacina; GNT- Gencitabina; TIG- Tigeciclina e COL-colistina. I-intermediário, R –resistente e S- sensível; Ífen – significa que o antibiótico não foi testado paraaquele antibiótico.
5.2.3- Detecção Genética de ESBL A produção de ESBL foi confirmada através da PCR convencional na maioria dos
isolados das enterobactérias. Dentre as enterobactérias, a espécie mais frequente foi a
Klebsiella pneumoniae (n=24; 42,10%), seguida de Escherichia coli (n=16; 28,07%) e
Enterobacter cloacae (n=9; 15,78%). Além de K. pneumoniae ser a espécie mais frequente
dente as enterobactérias foi também a que mais apresentou diversidade genética entre os
mecanismos de resitência pesquisados. A tabela 9 apresenta as frequências de cada espécie de
enterobactérias para a produção de ESBL e as respectivas frequências de cada gene bla
pesquisado.
40
Tabela 9: Frequência dos genes bla CTX-M cromossomal, bla CTX-M plasmideais, bla TEM, bla
SHV e bla KPC
Espécies Frequência ESBL CTX-M p
CTX-M c TEM SHV KPC
k. pneumoniae 24 23 13 2 3 18 1 E. coli 16 10 9 3 5 0 0 E. cloacae 9 6 4 0 2 0 1 S. marcensens 3 2 1 0 2 0 0 C. freundii 2 1 1 0 1 0 0 E. asburinae 1 1 1 0 1 0 0 P. mirabilis 1 1 1 0 0 0 0
Legenda: CTX-Mc – gene bla CTX-M cromossomal, CTX-Mp: gene bla CTX-M plasmidial, TEM: gene bla TEM, SHV: gene bla SHV e KPC: gene bla KPC
Dentre os principais genes que codificam as enzimas ESBL, o mais frequente foi o
gene bla CTX-M (n=35; 79,54%). Esse pode ser encontrado no gene cromossomal ou
plasmidial. No entanto, foi mais encontrado em plasmídeo (n= 30; 68,18%) que cromossomal
(n=5; 11,36%). Esse gene também foi o mais encontrado nas diferentes espécies isoladas,
seguido pelo gene bla SHV (N= 18, 40,90%) e bla TEM (n=14, 31,81) conforme descritos na
tabela 9. Dentre as espécies de Klebsiella pneumoniae, seis apresentaram os genes bla CTX-M
plasmideal e bla SHV, um apresentou o gene bla CTX-M cromossomal e bla SHV e um apresentou
o gene bla CTX-M plasmideal o bla SHV e bla KPC. Dentre as espécies de Escherichia coli, três
apresentaram os genes bla CTX-M plasmidias e bla TEM, dois apresentaram o gene bla CTX-M
cromossomal e plasmideal e um apresentou gene bla CTX-M cromossomal e plasmideal e bla
TEM . Um isolado de Enterobacter cloacae apresentou os genes bla CTX-M plasmideal e bla KPC.
5.2.3- Carbapenemase Em relação ao gene bla KPC, apenas dois isolados o apresentaram. Um deles foi
Klebsiella pneumoniae (27LJ), cujo teste de Hodge modificado está demonstrado na figura
14. Esse isolado também apresentou os genes bla SHV e bla CTX-M plasmidial. O segundo
isolado foi Enterobacter cloacae (45LJ), além de apresentar o gene bla KPC, também
apresentou o gene bla CTX-M plasmidial. O teste de Hodge modificado para esse isolado foi
negativo assim como também o Vtek 2 também não detectou presença de carbapenemase. O
teste de Hodge para esse isolado está demonstrado na figura 15.
41
Figura 11: Resultado do teste de Hodge modificado para isolado 27 LJ.
Figura 12: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 45LJ.
5.2.4- Diferenças entre os resultados do Vitek 2 e o PCR
O Vitek 2 conseguiu identificar apenas 18 isolados como ESBL, enquanto que, a
técnica de PCR tradicional identificou 44. Dentre os isolados identificados pelo Vitek 2 três
não apresentaram os mecanismos estudados os quais estão descritos na tabela 10.
42
Tabela 10: Comparação entre os métodos fenotípicos e genotípicos
Isolados VITEK Positivo
PCR positivo
k. pneumoniae 8 23 E. coli 9 10 E. cloacae 0 6 S. marcescens 0 2 C. freundii 0 1 E. aerogenes 1 0 E. asburiae 0 1 P. mirabilis 0 1 Total 18 44
5.3- Análise da Relação Genética entre as Espécies Bacterianas A técnica de Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE) foi realizada a fim de avaliar a
relação entre as espécies isoladas nos diferentes serviços. Essa técnica foi aplicada para
comparar os isolados de Klebsiella pneumoniae (Figura 12) e Escherichia coli (Figura 13) por
serem as espécies mais frequentes nesse estudo.
Dentre os isolados de K. pneumoniae, observamos alta diversidade genética entre os
mesmos. Somente três clusters (>80% de similaridade) agruparam dois isolados com 100% de
similaridade entre si (isolados 02 e 03; 06 e 10; 48 e 56). Os quatro primeiros são
provenientes da clínica médica, enquanto que o isolado 48 é oriundo do pronto socorro e o
isolado 56 da UTI Neo Natal.
43
Figura 13: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae
Dentre os isolados de Escherichia coli a diversidade genética foi ainda maior. Nenhum
isolado apresentou identidade de 100% com outro. No entanto, os isolados 25 e 26 e os
isolados 7 e 43 foram agrupados em dois clusters (>80% de similaridade), mostrando-se
relacionados. O isolado 25 é proveniente da clínica cirúrgica e o 26 do pronto socorro e os
isolados 07 e 43 foram oriundos do pronto socorro.
44
Figura 14: Dendograma dos isolados de Escherichia coli
45
6 DISCUSSÃO
As infecções causadas por bactérias multirresistentes, principalmente as produtoras de
β-lactamases ou carbapenemases, tais como as BGN, estão aumentando exponencialmente ao
longo do mundo. Para alguns pesquisadores, podemos estar próximos da era pré – antibiótica,
visto que, a velocidade de surgimento de isolados resistentes aos novos antibióticos, supera a
velocidade de criação dos mesmos. Esse fato tem alto impacto na morbimortalidade dos
pacientes e nos custos com o tratamento, visto que, implicam em maior tempo de
hospitalização e uso de antibióticos mais caros e com maior potencial de toxicidade (Paterson
et al. 2000).
Muitos programas de controle de infecções para bactérias resistentes têm sido
desenvolvidos. São exemplos desses, o SENTRY e o MYSTIC. Segundo dados dos mesmos,
as bactérias produtoras de ESBL são, entre as Gram Negativas, as maiores responsáveis pela
ocorrência e disseminação mundial de resistência, especialmente, no ambiente hospitalar.
Desde sua descoberta, essas enzimas tiveram disseminação rápida, tanto em ambiente
hospitalar como também há casos, apesar de poucos, na comunidade (Bradford 2004 &
Livermore 2008).
Muitos estudos realizados em nível mundial evidenciaram que a frequência das
espécies produtoras de ESBL, assim como também os genes envolvidos na codificação das
mesmas, variam de região para região (Ben- Ami et al. 2009). De acordo com a literatura, as
espécies isoladas em maior frequência de amostras clínicas hospitalares são Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli e Enterobacter cloacae (Moland et al. 2003). Essa frequência
também foi encontrada em nossa amostra global, visto que, dos 79 isolados estudados de
BGN previamente identificadas pelo Vitek 2, 24 foram Klebsiella pneumoniae, 16 foram
Escherichia coli, 13 foram Acinetobacter baumanii e 9 foram Enterobacter cloacae. Esse
achado é importante, visto que, evidencia quais espécies a equipe hospitalar precisa ter mais
atenção, criando medidas preventivas, a fim de conter a sua disseminação, já que, são espécies
tradicionais na transmissão de mecanismos de resistência.
Em relação à origem das amostras, as unidades de Pronto Socorro, Clínica Médica,
UTI adulto e UTI neo natal foram as que mais contribuíram com isolados para a amostra
global. Isso se deve ao fato dos pacientes hospitalizados nesses serviços estarem mais
expostos aos fatores de risco que favorecem ao desenvolvimento de infecções causadas por
bactérias multirresistentes. Entre eles podemos citar o tempo de internação longo, submissão a
46
muitos procedimentos invasivos, e utilização de antibiótico de terapia prolongada e com
várias classes de antibióticos, além de apresentarem um sistema imunológico debilitado. Com
exceção da unidade de Pronto Socorro, as demais unidades são tradicionais em apresentarem
uma maior freqüência de pacientes infectados. (Bradford 2001). Isso torna o Pronto Socorro
peculiar em nosso estudo. A contribuição de mais isolados dentre as demais unidades se deve
ao fato de funcionar como porta de entrada no HC-UFG para pacientes que necessitam de
hospitalização e que não encontram vaga em outros hospitais ou na própria unidade. Com
isso, esses pacientes ficam no pronto socorro até conseguirem vaga de internação na unidade
apropriada. No nosso estudo, o Pronto Socorro contribuiu com 23 amostras (29,11%), seguida
da Clínica Médica (n=22; 27,84%), UTI (n=10; 12,66%) e UTI neo natal (n=6; 7,60%).
Houve uma distribuição das espécies BGN entre os diferentes serviços do HC-UFG.
Isso se deve às pressões seletivas distintas que os diferentes serviços exercem sobre as
mesmas, tais como, utilização de diferentes classes de antibiótico como medidas preventivas
ou de tratamento. Com isso, a pressão seletiva excessiva causada pelos antimicrobianos,
favorece fenótipos resistentes dentro de um grupo de isolados não relacionadas, ocasionando
um problema endêmico de resistência em diferentes espécies de bactérias (Tosin et al 2003).
No HC-UFG, não foi diferente, houve uma distribuição das espécies entre as unidades do
mesmo. No Pronto Socorro, E. coli, K. pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa foram as
mais frequentes. Já na Clínica Médica, K. pneumoniae foi a espécie mais freqüente, seguida
por Acinetobacter baumanii e E. coli, enquanto que na UTI adulto a espécie predominante foi
A.baumannii. Esses dados mostram que os vários serviços do HC-UFG estão colonizados por
pelo menos três espécies de BGN, cada um com uma espécie diferente se destacando. No
entanto, as espécies mais comuns nos diferentes serviços são E. coli, K. pneumoniae, A.
baumannii, P. aeruginosa e E. cloacae. Esse fato é extremamente preocupante, visto que, são
as espécies que mais carreiam genes de resistência a várias classes de antibióticos.
Um dos grandes problemas de bactérias que apresentam mecanismos de resistência do
tipo ESBL, é que carreiam consigo resistência a outras classes de antibióticos não β-
lactâmicos, tais como, ciprofloxacina e gentamicina, fato que caracteriza multirresistência
(Ben-Ami et al. 2009). Essa característica também foi constatada nos isolados provenientes do
HC-UFG, o qual foi evidenciado também através do antibiograma. Dentre as enterobactérias,
considerando os 44 isolados positivos para ESBL, a resistência à ciprofloxacina foi igual a
27,27%, enquanto que, 45,45 % dos isolados se mostraram resistentes cefotaxima,
ceftazidima, cefepime e aztreonam. Esse padrão de multirresistência a várias classes
diferentes de antibióticos, se deve especialmente, à alta pressão seletiva existente no ambiente
47
hospitalar. Já no grupo das BGN-NF, os isolados se mostraram mais resistentes a um maior
grupo de antibióticos. Esse fato já era esperado, visto que, as espécies pertencentes a esse
grupo transportam intrinsecamente vários genes de resistência. O fato das bactérias
apresentarem resistência à várias classes de antibióticos reflete a promiscuidade de vários
genes em um mesmo local, geralmente carreados em plasmídeos. Dois isolados se mostraram
resistentes à tigeciclina e um apresentou sensibilidade intermediária, enquanto que, quatro
isolados foram resistentes à colistina. Esse achado é preocupante, pois a colistina e tigeciclina
são antibióticos de escolha para tratar algumas bactérias resistentes aos carbapenêmicos. As
análises de dados microbiológicos indicam que isolados bacterianos de enterobactérias
provenientes de amostras hospitalares são mais resistentes para alguns antibióticos e
acumulam resistências a vários antibióticos da mesma classe ou de classes diferentes
(Nordmann 1998).
A escolha do antibiótico adequado para o tratamento das infecções causadas por
bactérias multirresistentes deve se basear nos testes de suscetibilidade, evitando assim
escolhas precipitadas através da introdução de antibióticos antes dos resultados laboratoriais.
A seleção ocasionada pelos antimicrobianos favorece a eventos que criam um ambiente para
amplificação biológica da resistência e compensação genética do custo do fitness que pode
favorecer a persistência da resistência nas espécies bacterianas (Sundsfjord et al. 2004).
Diante desse cenário, é indicada a prescrição de um antibiótico β-lactâmico junto com
um inibidor de β-lactamase. No entanto, essa prática já não é mais tão eficaz. Considerando as
concentrações inibitórias mínimas (CIM) preconizadas no CLSI (2011), 18 isolados de
enterobactérias ESBL se mostraram resistentes aos inibidores de β-lactamase –ampicilina
associado ao sulbactam e piperacilina associado ao tazobactam. Isso pode ter ocorrido porque
a atividade inibitória pode variar de acordo com o inibidor de β-lactamase utilizado. O
tazobactam geralmente é mais eficaz na inibição da enzima CTX-M em comparação com o
ácido clavulânico. No entanto, esses dois agentes apresentam atividade inibitória melhor do
que o sulbactam frente às enzimas TEM e SHV.
As BGN-NF são tradicionalmente conhecidas por apresentarem perfil de resistência à
antibióticos de classes diferentes. Os nossos isolados também apresentaram o mesmo perfil.
Em relação ao antibiograma, 54,54% das BGN-NF eram multirresistentes porque
apresentaram resistência à ciprofloxacina, ceftazidima, cefepime, imipenem, meropenem e ao
aztreonam. Ao avaliarmos as CIMs das mesmas isoladas do HC-UFG, o perfil de resistência
foi o dobro do limite superior para ceftazidima (R≥32; n=11; 50,0%) e cefepime (R≥32). No
entanto, todos os isolados foram sensíveis à colistina e a concentração mínima inibitória
48
esteve bem abaixo do limite inferior (S≤2) em 68,18% dos isolados. A sensibilidade à
colistina sugere que as mesmas ainda não apresentaram mecanismos extremos de resistência,
ou seja, ainda apresentam opção terapêutica para o tratamento das infecções causadas pelas
mesmas.
A redução da suscetibilidade da maioria dos isolados frente às classes de antibióticos
disponíveis, para o tratamento dos mesmos, também ocorre nos países europeus, tais como,
Bélgica, Portugal, França e Espanha. Com isso, faz – se necessário evitar a antibioticoterapia
empírica tratamento iniciado antes do laudo do laboratório sobre a espécie ou perfil de
suscetibilidade da espécie envolvida na infecção, visto que, causa aumento no tempo de
internação do paciente ou mesmo o óbito do mesmo caso o antibiótico usado seja ineficaz
contra a espécie em questão (Cosgrove 2006).
A triagem de bactérias ESBL e carbapenemase foi feita através do Vitek 2, enquanto
que, como teste confirmatório foi utilizado a PCR convencional. Dentre as enterobactérias, o
Vitek 2 identificou 18 isolados como produtores de ESBL dentre os quais, 3 isolados não
apresentaram nenhum dos mecanismos de resistência pesquisado, fato que sugere a presença
de outros mecanismos de resistência. Já a técnica de PCR identificou 44 isolados. A diferença
entre os dois métodos pode ser explicada de acordo com alguns fatores como: pequenas
mutações nos genes bla podem conferir baixos níveis de resistência, os quais não podem ser
detectados nos testes de sensibilidade in vitro, como exemplo a enzima TEM com apenas uma
substituição de aminoácido (TEM-12) que apresenta baixo nível de hidrólise das
cefalosporinas; a degradação do β-lactâmico também é dependente do tamanho do inóculo,
com isso, a quantidade de inóculo padronizada para os testes de suscetibilidade pode não ser
suficiente para a detecção de resistência, ou em uma mesma cultura podemos ter clones
sensíveis e clones produtores de ESBL, ou presença de outros mecanismos de resistência.
Também foi observado que o Vitek 2 varia em sensibilidade diante das diferentes espécies,
por exemplo, para E.coli e K. pneumoniae ele é mais sensível para detectar ESBL do que para
espécies Amp C indutoras, como Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii e Providencia
stuartii (Jacoby & Han 1996, Bosshard et al. 2004).
A literatura relata que o gene responsável pela produção de ESBL que mais se
dissemina entre as BGN é o bla CTX-M, principalmente após a introdução na prática clínica de
cefotaxima e ceftriaxona (Paterson et al. 2000). Ele pode ser codificado por gene
cromossomal ou plasmidial. Esse último constitui o principal vetor de propagação do mesmo.
Dentre os isolados produtores de ESBL, o gene bla CTX-M foi o mais frequente (n=35; 79,54),
dos quais, 30 foram encontrados em plasmídeos e 5 em cromossomos. Além de ser a espécie
49
mais frequente, Klebsiella pneumoniae também foi a espécie que mais apresentou
mecanismos de resistência (Schoevaerdts et al. 2011). A alta produção de ESBL
principalmente por essas espécies é um fato que preocupa as autoridades de saúde pública,
visto que, há relatos recentes também da disseminação de enterobactérias produtoras de ESBL
na comunidade, constituindo verdadeiros reservatórios das mesmas. Espécies dessas bactérias
produtoras de ESBL foram inicialmente reportadas como causas de surtos e se tornaram
endêmicas nos últimos anos (Giske et al. 2008).
A enzima CTX-M confere maior resistência à cefotaxima do que à ceftazidima. A
CIM de ceftazidima, às vezes, está dentro dos limites de suscetibilidade nos testes
convencionais. Entretanto, a detecção de ESBL, na maioria dos laboratórios de microbiologia,
é feita baseado na ceftazidima. Este argumento é a favor da revisão da conduta desses
laboratórios, a fim de detectar e conter a disseminação da enzima CTX-M. Estudos no Canadá
também demostraram que isolados produtores da enzima CTX-M eram significativamente
mais resistentes à ciprofloxacina e outras classes de antibióticos, do que outras espécies
produtoras de ESBL não CTX-M (Bonnet 2004, Pitout et al. 2005).
Em relação à presença de carbapenemase, apenas dois isolados apresentaram o gene
bla KPC. A espécie de Klebsiela pneumoniae foi detectada também pelo Vitek 2, ao contrário
do segundo isolado, Enterobacter cloacae, que foi laudado como não KPC pelo aparelho.
Esse laudo falso negativo pode ter ocorrido pelo fato de em uma mesma cultura apresentar
diferentes clones ou devido à concentração do inóculo.
Ao analisarmos a semelhança genética entre os isolados de Klebsiella pneumoniae e
Escherichia coli a fim de avaliarmos a ocorrência de clones associados à maior ou mais
frequente produção de ESBL, utilizando a técnica de PFGE, foi mostrado que seis isolados de
Klebsiella pneumoniae eram 100% idênticos, dois a dois. Destes, quatro originaram-se da
clínica médica, enquanto que um originou-se do pronto socorro e outro da UTI Neo Natal.
Alguns estudos mostraram que o principal meio de transporte de bactérias entre pacientes de
uma determinada instituição entre os diferentes serviços dessa mesma instituição ocorre
através das mãos dos profissionais de saúde (Widmer et al. 2010). Em relação às espécies de
Escherichia coli não houve isolados que fossem 100% idênticos entre si. No entanto, quatro
isolados agruparam em dois clusters, 25 e 26 (o isolado 25 é proveniente da clínica cirúrgica e
o 26 do pronto socorro) e os isolados 07 e 43 (oriundos do pronto socorro). Não foi
evidenciada a presença de clones associados à resistência antimicrobiana.
Os dados apresentados evidenciam a necessidade do uso consciente dos antibióticos β-
lactâmicos, assim como também de medidas de contenção de disseminação das BGN.
50
Medidas eficientes de detecção das mesmas e dos mecanismos de resistência são essenciais
para que o paciente tenha disponível o tratamento mais adequado para sua infecção
contribuindo para o sucesso do tratamento. As técnicas moleculares constituem ferramentas
importantes para os microbiologistas nesse processo.
Um constante monitoramento se faz necessário para as bactérias multirresistentes, no
ambiente hospitalar visto que, o tratamento de infecções causadas pelas mesmas pode
contribuir para adversidades na terapia dos pacientes, pois apresentam decréscimo da
efetividade, aumento da toxicidade dos antimicrobianos disponíveis para tratamento; demora
do tratamento e aumento da necessidade de cirurgias para remoção do sítio infectado
(Cosgrove 2006).
51
7 CONCLUSÕES
7.1 - O perfil de multirresistência foi encontrado na maioria dos isolados foi ESBL;
7.2 - Foram identificados três mecanismos principais para produção de ESBL que foram as
enzimas TEM, SHV e CTX-M;
7.3 – A enzima CTX-M foi a mais frequente, sendo que, o melhor vetor de disseminação foi
via plasmídeo;
7.4 - Houve diferença significativa de detecção de ESBL entre os métodos Vitek 2 e PCR
convencional;
7.5 - As técnicas moleculares constituem uma excelente ferramenta na detecção de
mecanismos produtores de ESBL assim como também na prevenção da disseminação das
mesmas.
7.6 - Dois isolados apresentaram gene blaKPC.
7.7 – Não foi identificado nenhum clone associado à produção de β-lactamase ou
multirresistência, sugerindo a ampla disseminação dos genes responsáveis pela resistência
antimicrobiana entre e dentro das diferentes espécies de BGN.
52
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59
ANEXOS
Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
60
Anexo 2: MANUSCRITO FREQ UENCIA DOS GENES bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC EM BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS ISOLADAS DE HEMOCULTURAS DE PACIENTES DE HOSPITAL ESCOLA DE GOIÁS Fabiana Metzker Renato Beilner Adriana Guilarde André Kipnis Afiliação: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública-Universidade Federal de Goiás Laboratório de Microbiologia do Hospital das Clínicas de Goiás Palavras –chave: Bactérias Gram Negativas, β-lactamases, carbapenemase.
Resumo
Recentemente, as Bactérias Gram Negativas (BGN) têm atraído a atenção do corpo
clínico em todo o mundo, se tornando um problema de saúde pública. Isso se deve ao
crescente aumento da frequência de espécies desse grupo serem isoladas em amostras clínicas.
As BGN tem sido apontadas como uma das principais causas de infecções nosocomiais na
corrente sanguínea. Elas apresentam muitos mecanismos de resistência intrínsecos ou
adquiridos. Dentre esses, do ponto de vista clínico, a produção de enzimas β-lactamases, tais
como ESBL e carbapenemases, é o principal. Os genes responsáveis pela produção dessas
enzimas são: bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC. O objetivo desse trabalho foi determinar a
frequência desses genes nas BGN, isoladas em hemoculturas de pacientes hospitalizados no
Hospital das Clínicas de Goiânia (HC-UFG), coletadas durante o período de 31 de janeiro de
2011 a 31 de janeiro de 2012. A identificação das espécies e análise da Concentração
Inibitória Mínima (CIM) foram realizadas através do sistema automatizado Vitek 2, enquanto
que, a análise molecular foi feita através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com os
respectivos oloigonucleotídeos iniciadores para os genes supracitados. A identidade entre o
isolados de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli foi feita pelo Pulsed Field Gel
Eletrophoresis. Nesse período, foram recuperadas 79 amostras positivas para Bactérias Gram
Negativas. Dentre essas, as mais frequentes foram Klebsiella pneumoniae (n=24, 30,37%),
Escherichia coli (n=16; 20,25%), Acinetobacter baumannii (n=13; 16,45%) e Enterobacter
61
cloacae (n =9; 11,25%). Essas amostras foram provenientes de vários serviços do HC-UFG.
Dentre esses, o Pronto Socorro (n=23; 29,11%), Clínica Médica (n=22; 27,85%) e UTI (n=10;
12,66%) foram as unidades que mais contribuíram com a amostra global. Klebsiella
pneumoniae foi a espécie mais frequente dentre os diversos serviços do HC-UFG. Dentre os
genes responsáveis pela resistência, o mais frequente foi bla CTX-M (n=30; 68,18%), localizado
em plasmídeos seguido do bla SHV (N=18; 40,90%). Em relação ao Vitek 2, a técnica de PCR
convencional foi a que mais detectou mecanismos de resistência nas espécies selecionadas.
Finalmente, os dados desse trabalho mostraram que o HC-UFG tem muitas espécies de BGN
espalhadas por vários serviços do mesmo e com a presença de importantes mecanismos de
resistência.
Introdução
Bactérias que apresentam mecanismo de resistência aos antimicrobianos continuam
sendo um grande desafio para o corpo clínico de uma forma mundial. Isso se deve ao fato dos
médicos terem poucas opções terapêuticas de tratamento para infecções causadas por esses
microrganismos, assim como também, a dificuldade de evitar a transmissão cruzada entre
pacientes de uma mesma instituição. Dentre esses microrganismos, o grupo que tem ganhado
destaque em âmbito mundial é o das Bactérias Gram Negativas (BGN), por apresentarem
aumento de frequência de isolados oriundos de amostras clínicas e por carrearem diversos
mecanismos de resistência intrínsecos ou adquiridos. Elas são importantes causas de
pneumonias, infecções no trato urinário, intra-abdominal e principalmente sanguíneas
(Stelling et al.2005, Carattoli 2009).
Os diferentes mecanismos de resistência aos antimicrobianos podem ser classificados
em quatro grandes grupos: inativação ou modificação da droga; alteração do sítio alvo;
inibição da entrada da droga na célula e, por último, bombas de efluxo. Eles surgiram antes
mesmo da introdução do uso de antibióticos na prática clínica. Os genes responsáveis pela
codificação desses mecanismos podem estar localizados em cromossomos ou plasmídeos. Do
ponto de vista clínico, o mecanismo de resistência mais importante e mais frequente é o de
inativação da droga ocasionado por enzimas denominadas de β-lactamases, cujas principais
são TEM-1, TEM-2 e SHV-1. Elas são assim chamadas por inativarem, via hidrólise,
penicilinas e cefalosporinas de primeira e segunda geração. Essas enzimas deram origem a
outro grupo de β-lactamases denominadas de Extended Spectrum β-lactamases (ESBL- β-
Lactamase de Espectro Estendido) resultado de mutações nos genes produtores de β-
lactamases, responsáveis pela inativação dos β-lactâmicos de terceira e quarta geração e
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aztreonam. Os grupos principais são TEM, SHV e uma outra enzima não correlacionada a
essas denominada de CTX-M. Esses mecanismos surgiram antes mesmo da introdução do
antibiótico na prática clínica, o aumento de sua freqüência, principalmente em hospitais, é
resultado das pressões seletivas provocadas pelos β-lactâmicos utilizados nesse ambiente
(Heritage et al. 1999, Woodford et al. 2004)
A maioria dos laboratórios de microbiologia utiliza testes de detecção de ESBL e
carbapenemase que se baseiam em características fenotípicas por serem de fácil realização e
mais baratos. No entanto, esses testes não fornecem informações sobre variantes genéticos,
fato que limita estudos epidemiológicos. Um dos principais problemas causados pelas β-
lactamases é o fato de sua produção ser induzida durante a terapêutica antimicrobiana. Com
isso, são produzidos laudos falsos negativo, sendo essa uma das principais causas de falhas
terapêuticas. A frequência de ESBL varia em cada região e é alta principalmente em hospitais
porque os pacientes presentes nessas instituições apresentam alguns dos principais fatores de
risco, tais como, sistema imune debilitado, uso de cateteres, submissão à vários
procedimentos invasivos, dentre outros (Tumbarello et al. 2008, Bem – Ami et al. 2009).
A rápida detecção e específica é essencial para o tratamento eficaz de infecções
causadas por microrganismos que apresentam algum mecanismo de resistência. Kang et al.
(2005) mostraram que um grupo de pacientes que apresentava infecção sanguínea causada por
BGN que apresentava mecanismo de resistência inicialmente tratado inadequadamente,
apresentou uma taxa de mortalidade de 38,4%, enquanto que, um outro grupo de pacientes
com as mesmas características clínicas do anterior, quando tratados adequadamente,
apresentaram uma taxa de mortalidade de 27,4%.
O laboratório de microbiologia de um hospital escola de Goiás tem detectado um
número crescente de Bactérias Gram Negativas produtoras de ESBL e carbapenemase. No
entanto, há poucos estudos sobre a característica molecular dessa população. Com isso, esse
projeto teve como objetivo mensurar a frequência dos principais genes produtores de ESBL e
carbapenemase e quais espécies foram mais frequentes nos departamentos dessa instituição.
Métodos
Foram isolados 79 amostras de hemocultura de pacientes hospitalizados em um
hospital universitário de Goiânia no período de 31 de janeiro de 2011 à 31 de janeiro de 2012
no laboratório de Microbiologia do HC-UFG e laboratório de bacteriologia molecular do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP-UFG).
A amostra de sangue foi coletada mediante pedido médico e colocada diretamente em
meios de cultura próprios para o aparelho BACTEC, sistema automatizado de detecção de
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fluorescente e não evasivo para o monitoramento contínuo e simultâneo de amostras de
sangue, para detecção de bactérias e fungos.
A identificação e a sensibilidade a antibióticos foram feitas simultaneamente pelo
aparelho de automação VITEC 2 (Biomerieux) usando guidelines e pontos de cortes
preconizados CLSI 2011. Os antibióticos utilizados pelos painéis do aparelho foram os
seguintes: Ceftriaxona, Cefepime, Ceftadizime, Cefoxitina, Aztreonam, Amoxaxilina com
Clavulanato, Imipenem , Meropenem e Ertapenem.
Após a análise do VITEK, os isolados que pertenciam ao grupo de Bactérias Gram
Negativas (BGN) foram semeados em Agar Mac Conkey e transportados para o IPTSP a fim
de serem submetidos às análises moleculares. As bactérias foram congeladas em meio TSB à
20% de glicerol e estocadas em freezer – 20º C. A partir desses congelados foram feitas as
extrações de DNA cromossomal e plasmidial.
Os testes moleculares foram feitos para identificação da presença dos genes bla TEM,
bla SHV, bla CTX-M e bla KPC de acordo com Jiang et al. (2006) e Tenover et al. (2006). A
técnica de Pulsed Field gel Electrophoresis foi realizada para avaliar a semelhança entre os
isolados de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, os quais foram feitos de acordo com
Ribot et al. (2006).
Resultados
Dos 79 isolados de Bactérias Gram Negativas estudadas, 57 isolados foram de
enterobactérias e 22 de Bactérias Gram Negativas não fermentadora. A distribuição de
frequência entre elas está descrita na tabela 1
Tabela 2: Distribuição de frequências de Bactérias Gram Negativas a partir de hemoculturas.
Espécies Número de Isolados
Frequência
k. pneumoniae 24 30,38% E. coli 16 20,25%
A.baumannii 13 16,45%
E. cloacae 9 11,39% P. aeruginosa 8 10,13%
S. marcescens 3 3,80% C. freundii 2 2,53%
E. aerogenes 1 1,26% E. asburiae 1 1,26% P. mirabilis 1 1,26%
S. maltophila 1 1,26% Total 79 100,00%
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Com relação à origem das amostras, foi verificado que o serviço de pronto socorro foi
o que mais contribuiu com a amostra global (n=23), seguido pela clínica médica (n= 22) e
UTI adulta (n=10). Dentre as espécies de BGN, as mais bem distribuídas entre os serviços foi
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii e Enterobacter cloacae.
O Vitek 2, através do antibiograma identificou 17 isolados como produtores de ESBL
e 1 isolado como produtor de carbapenemase. Já a técnica de PCR convencional detectou 44
isolados e dois isolados como produtores de carbapenemase que foram Klebsiella pneumoniae
e Enterobacter cloacae. Os isolados ESBL apresentaram resistência a mais de uma classe de
antibióticos em relação aos isolados não ESBL, apresentando 27,27% de resistência à
gentamicina e 27,27% de resistência à ciprofloxacina, enquanto que, nos isolados não ESBL
apenas dois isolados eram resistentes à ciprofloxacina e à gentamicina. Entre as espécies
ESBL, 45,45% eram resistentes à cefotaxima, ceftazidima, cefepime e aztreonam; 6,8%
resistentes à colistina e 4,54% resistentes à tigeciclina.
Em relação à frequência dos genes pesquisados, o gene bla CTX-M plasmidial foi o
mais frequente seguido pelo gene bla SHV. A distribuição dos mesmos está ilustrada na
tabela 2.
Espécies Frequência ESBL CTX-M
p CTX-M c TEM SHV KPC k.pneumoniae 24 23 13 2 3 18 1 E. coli 16 10 9 3 5 0 0 E. cloacae 9 6 4 0 2 0 1 S.marcensens 3 2 1 0 2 0 0 C. freundii 2 1 1 0 1 0 0 E. asburinae 1 1 1 0 1 0 0 P. mirabilis 1 1 1 0 0 0 0 Legenda: CTX-Mc – gene bla CTX-M cromossomal, CTX-Mp: gene bla CTX-M plasmidial, TEM: gene bla TEM, SHV: gene bla SHV e KPC: gene bla KPC
Dentre os isolados de K. pneumoniae, observamos alta diversidade genética entre os
mesmos. Somente três clusters (>80% de similaridade) agruparam dois isolados com 100% de
similaridade entre si (isolados 02 e 03; 06 e 10; 48 e 56). Os quatro primeiros são
provenientes da clínica médica, enquanto que o isolado 48 é oriundo do pronto socorro e o
isolado 56 da UTI Neo Natal. O PFGE está ilustrado na figura 1.
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Figura 1: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae
Dentre os isolados de Escherichia coli a diversidade genética foi ainda maior. Nenhum
isolado apresentou identidade de 100% com outro. No entanto, os isolados 25 e 26 e os
isolados 7 e 43 foram agrupados em dois clusters (>80% de similaridade), mostrando-se
relacionados. O isolado 25 é proveniente da clínica cirúrgica e o 26 do pronto socorro e os
isolados 07 e 43 foram oriundos do pronto socorro. Esse PFGE está ilustrado na figura 2.
Figura 2: Dendograma dos isolados de Escherichia coli
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Discussão Muitos estudos realizados em nível mundial evidenciaram que a frequência das
espécies produtoras de ESBL, assim como também os genes envolvidos na codificação das
mesmas, variam de região para região (Ben- Ami et al. 2009). De acordo com a literatura, as
espécies isoladas em maior frequência de amostras clínicas hospitalares são Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli e Enterobacter cloacae (Moland et al. 2003). Essa frequência
também foi encontrada em nossa amostra global, visto que, dos 79 isolados estudados de
BGN previamente identificadas pelo Vitek 2, 24 foram Klebsiella pneumoniae, 16 foram
Escherichia coli, 13 foram Acinetobacter baumanii e 9 foram Enterobacter cloacae. Esse
achado é importante, visto que, evidencia quais espécies a equipe hospitalar precisa ter mais
atenção, criando medidas preventivas, a fim de conter a sua disseminação, já que, são espécies
tradicionais na transmissão de mecanismos de resistência.
Em relação à origem das amostras, as unidades de Pronto Socorro, Clínica Médica,
UTI adulto e UTI neo natal foram as que mais contribuíram com isolados para a amostra
global. Isso se deve ao fato dos pacientes hospitalizados nesses serviços estarem mais
expostos aos fatores de risco que favorecem ao desenvolvimento de infecções causadas por
bactérias multirresistentes. Entre eles podemos citar o tempo de internação longo, submissão a
muitos procedimentos invasivos, e utilização de antibiótico de terapia prolongada e com
várias classes de antibióticos, além de apresentarem um sistema imunológico debilitado. Com
exceção da unidade de Pronto Socorro, as demais unidades são tradicionais em apresentarem
uma maior freqüência de pacientes infectados. (Bradford 2001). Isso torna o Pronto Socorro
peculiar em nosso estudo. A contribuição de mais isolados dentre as demais unidades se deve
ao fato de funcionar como porta de entrada no hospital universitário de Goiânia para pacientes
que necessitam de hospitalização e que não encontram vaga em outros hospitais ou na própria
unidade. Com isso, esses pacientes ficam no pronto socorro até conseguirem vaga de
internação na unidade apropriada. No nosso estudo, o Pronto Socorro contribuiu com 23
amostras (29,11%), seguida da Clínica Médica (n=22; 27,84%), UTI (n=10; 12,66%) e UTI
neo natal (n=6; 7,60%).
Um dos grandes problemas de bactérias que apresentam mecanismos de resistência do
tipo ESBL, é que carreiam consigo resistência a outras classes de antibióticos não β-
lactâmicos, tais como, ciprofloxacina e gentamicina, fato que caracteriza multirresistência
(Ben-Ami et al. 2009). Essa característica também foi constatada nos isolados provenientes do
HC-UFG, o qual foi evidenciado também através do antibiograma. Dentre as enterobactérias,
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a resistência à ciprofloxacina foi igual a 27,27%, enquanto que, 45,45 % dos isolados se
mostraram resistentes cefotaxima, ceftazidima, cefepime e aztreonam. Esse padrão de
multirresistência a várias classes diferentes de antibióticos, se deve especialmente, à alta
pressão seletiva existente no ambiente hospitalar. Já no grupo das BGN-NF, os isolados se
mostraram mais resistentes a um maior grupo de antibióticos. Esse fato já era esperado, visto
que, as espécies pertencentes a esse grupo transportam intrinsecamente vários genes de
resistência. O fato das bactérias apresentarem resistência à várias classes de antibióticos
reflete a promiscuidade de vários genes em um mesmo local, geralmente carreados em
plasmídeos. Dois isolados se mostraram resistentes à tigeciclina e um apresentou
sensibilidade intermediária, enquanto que, quatro isolados foram resistentes à colistina. Esse
achado é preocupante, pois a colistina e tigeciclina são antibióticos de escolha para tratar
algumas bactérias resistentes aos carbapenêmicos. As análises de dados microbiológicos
indicam que isolados bacterianos de enterobactérias provenientes de amostras hospitalares são
mais resistentes para alguns antibióticos e acumulam resistências a vários antibióticos da
mesma classe ou de classes diferentes (Nordmann 1998).
A escolha do antibiótico adequado para o tratamento das infecções causadas por
bactérias multirresistentes deve se basear nos testes de suscetibilidade, evitando assim
escolhas precipitadas através da introdução de antibióticos antes dos resultados laboratoriais.
A seleção ocasionada pelos antimicrobianos favorece a eventos que criam um ambiente para
amplificação biológica da resistência e compensação genética do custo do fitness que pode
favorecer a persistência da resistência nas espécies bacterianas (Sundsfjord et al. 2004).
Diante desse cenário, é indicada a prescrição de um antibiótico β-lactâmico junto com
um inibidor de β-lactamase. No entanto, essa prática já não é mais tão eficaz. Considerando as
concentrações inibitórias mínimas (CIM) preconizadas no CLSI (2011), 18 isolados de
enterobactérias ESBL se mostraram resistentes aos inibidores de β-lactamase –ampicilina
associado ao sulbactam e piperacilina associado ao tazobactam. Isso pode ter ocorrido porque
a atividade inibitória pode variar de acordo com o inibidor de β-lactamase utilizado. O
tazobactam geralmente é mais eficaz na inibição da enzima CTX-M em comparação com o
ácido clavulânico. No entanto, esses dois agentes apresentam atividade inibitória melhor do
que o sulbactam frente às enzimas TEM e SHV.
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Conclusões
• O perfil de multirresistência foi encontrado na maioria dos isolados foi ESBL;
• Foram identificados três mecanismos principais para produção de ESBL que foram as
enzimas TEM, SHV e CTX-M;
• A enzima CTX-M foi a mais frequente, sendo que, o melhor vetor de disseminação foi
via plasmídeo;
• Houve diferença significativa de detecção de ESBL entre os métodos Vitek 2 e PCR
convencional;
• As técnicas moleculares constituem uma excelente ferramenta na detecção de
mecanismos produtores de ESBL assim como também na prevenção da disseminação
das mesmas.
• Dois isolados apresentaram gene blaKPC.
• Não foi identificado nenhum clone associado à produção de β-lactamase ou
multirresistência, sugerindo a ampla disseminação dos genes responsáveis pela
resistência antimicrobiana entre e dentro das diferentes espécies de BGN.
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![Jorge Luiz Mello Sampaio - USP€¦ · blaVEB, blaBEL, blaTLA e blaSFO [14]. As carbapenemases mais prevalentes em enterobactérias são codificadas por genes dos grupos bla KPC ,](https://img.document.onl/doc/110x75/5f9757415ededf4cb6423ad2/jorge-luiz-mello-sampaio-blaveb-blabel-blatla-e-blasfo-14-as-carbapenemases.jpg)
