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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: Seminário Aplicado
VARIABILIDADE GENÉTICA E ANÁLISES ESTATÍSTICAS NA
CONSERVAÇÃO DOS RECURSOS GENÉTICOS DE BOVINOS
LOCAIS
Diogo Alves da Costa Ferro
Orientadora: Drª. Eliane Sayuri Miyagi
GOIÂNIA
2011
ii
DIOGO ALVES DA COSTA FERRO
VARIABILIDADE GENÉTICA E ANÁLISES ESTATÍSTICAS NA
CONSERVAÇÃO DOS RECURSOS GENÉTICOS DE BOVINOS
LOCAIS
Seminário apresentado junto à Disciplina
Seminários Aplicados do Programa de
Pós-Graduação em Ciência Animal da
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Nível: Mestrado.
Área de Concentração:
Produção Animal
Linha de Pesquisa:
Fatores genéticos e ambientais que
influenciam o desempenho dos animais
Orientadora:
Profa. Drª. Eliane Sayuri Miyagi – UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG
Drª. Raquel Soares Juliano – Embrapa Pantanal
GOIÂNIA
2011
iii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................ iv
LISTA DE QUADROS................................................................. v
1 INTRODUÇÃO............................................................................ 1
2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................... 3
2.1 Conservação dos recursos genéticos......................................... 3
2.2 Caracterização genética.............................................................. 4
2.3 Marcadores moleculares............................................................. 5
2.3.1 Microssatélites............................................................................. 6
2.4 Análises estatísticas nos estudos da variabilidade genética...... 8
2.4.1 Frequência alélica....................................................................... 8
2.4.2 Heterozigosidade........................................................................ 10
2.4.3 Conteúdo de informação polimórfica (PIC)................................. 12
2.4.4 Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)......................................... 13
2.4.5 Probabilidade de exclusão.......................................................... 16
2.4.6 Índices de fixação ou estatísticas de F....................................... 17
2.4.7 Distância genética entre populações.......................................... 18
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................ 21
REFERÊNCIAS........................................................................... 22
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphisms
EHW - Equilíbrio de Hardy-Weinberg
FIS - Coeficiente de consangüinidade intrapopulacional
FIT - Redução da heterozigosidade de um indivíduo com relação à
metapopulação
FST - Coeficiente de consangüinidade entre subpopulações
He - Heterozigosidade esperada
Ho - Heterozigosidade observada
LINES - Long interspersed elements
mtDNA - DNA mitocondrial
PCR - Reação em cadeia polimerase
PE - Probabilidade de exclusão
PEC - Probabilidade de exclusão combinada
PIC - Conteúdo de informação polimórfica
RAPD - Radom Amplified Polymorphic DNA
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
SINES - Short interspersed elements
SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms
SSR - Repetição de sequências simples
v
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 Representação esquemática da separação eletoforética
de uma proteína ou de um microssatélite com dois alelos
comuns, A e B. AA, AB e BB correspondem aos
genótipos observados em dez indivíduos, com
frequências genotípicas e alélicas......................................
9
QUADRO 2 Expressão binomial para determinação da variância da
frequência alélica................................................................
10
QUADRO 3 Determinação da Ho com apena um loco........................... 11
QUADRO 4 Determinação da Ho com todos os locos........................... 11
QUADRO 5 Cálculo da heterozigosidade média esperada.................... 12
QUADRO 6 Equação que determina a frequência de três genótipos
possíveis.............................................................................
12
QUADRO 7 Fórmula para determinação de valores de PIC.................. 13
QUADRO 8 Equação para verificação do EHW..................................... 14
QUADRO 9 Demonstração do não EHW na geração P......................... 15
QUADRO 10 Demonstração do EHW na geração 1................................ 16
QUADRO 11 Equações de obtenção da estatística F.............................. 18
QUADRO 12 Fórmulas para cálculos de distância genética.................... 20
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui um grande número de raças locais, espalhadas por
diversas regiões do país, tais como o bovino Pantaneiro localizado no Pantanal e
o bovino Curraleiro, principalmente na região do Cerrado. Essas raças encontram-
se, em sua maioria, ameaçadas de extinção, devido o surgimento de raças
especializadas para produção e pela realização de cruzamentos dessas raças
com bovinos locais. Com isso tem-se diminuído a diversidade genética de
algumas delas.
Embora essas raças locais sejam consideradas menos produtivas que
as especializadas, provocando pouco interesse para criação, elas são
perfeitamente adaptadas às nossas condições ambientais, podendo ser bastante
utilizadas nos programas de melhoramento genético, em função de sua
adaptabilidade.
Por despertar pouco interesse pela criação, proporcionando riscos de
extinção, pode ocasionar perdas definitivas de alelos de determinadas raças. Por
isso é de fundamental importância conhecer a variabilidade genética dessas raças
locais, para promover estratégias de conservação desse patrimônio genético,
auxiliando nos programas de conservação de recursos genéticos.
A conservação de recursos genéticos é realizada por Universidade,
Instituições e produtores, com o intuído de manter essa variabilidade genética.
Uma alternativa que vem vendo utilizada para otimizar e quantificar a variabilidade
genética é a adoção da caracterização genética de raças e populações
(MENEZES, 2005). Como ferramenta para caracterização genética tem-se
adotado a utilização de marcadores moleculares.
Dentre os principais marcadores moleculares estão os microssatélites,
que são abundantes e distribuídos ao acaso por todo o genoma, além de
apresentar grande polimorfismo, sendo considerados de fácil identificação e
utilização.
Auxiliando no programa de conservação de recursos genéticos estão
as análises estatísticas, como a frequência alélica, heterozigosidade observada e
esperada, conteúdo de informação polimórfica, equilíbrio de Hardy-Weinberg,
probabilidade de exclusão, estatísticas F e distâncias genéticas.
2
Nesse contexto, objetivou-se abordar a utilização da variabilidade
genética e das análises estatísticas na conservação de recursos genéticos de
bovinos locais.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Conservação dos recursos genéticos
Nos últimos anos diversos países têm se preocupado com a erosão
genética de raças e populações, ocasionada pela substituição das raças locais.
Essa substituição vem ocorrendo deste o final do século XIX, com a eliminação
desses animais, considerados menos produtivos ou pela adoção do cruzamento
absorvente (EGITO et al., 2002), principalmente com zebuínos da raça Nelore,
por serem animais altamente especializados para produção de carne (RANGEL et
al., 2004).
A perda da diversidade genética dessas raças pode ser minimizada
mantendo a variabilidade genética com a utilização de programas de
conservação, executados pelas Universidades e Institutos de pesquisa (EGITO et
al., 2002), como a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)
com o Programa Nacional de Conservação de Recursos Genéticos, coordenado
pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia
(CENARGEN), em parceria com criadores (EGITO, 2007). Segundo COSTA &
MARTINS (2008), os programas de conservação genética podem ser in situ
(manutenção do animal em seu habitat natural) e ex situ (manutenção fora do
ambiente natural, com a inclusão de bancos de germoplasma).
A conservação de recursos genéticos no Brasil tem como objetivo
realizar a identificação, caracterização fenotípica e implantação dos núcleos de
conservação, estabelecendo os centros de origem, diversidade e variabilidade
genética, além do monitoramento dos núcleos já existentes, também ameaçados
de extinção; conservação ex situ do material genético; caracterização das
populações; e conscientização da sociedade sobre a importância da conservação
(EGITO et al., 2002).
A variabilidade genética é um parâmetro de fundamental importância
para a caracterização de raça e populações (ALBUQUERQUE, 2005) e segundo
GAMA (2004), na conservação dos recursos genéticos, onde o conhecimento da
diversidade genética intra e inter-raciais pode contribuir para evitar uma erosão
genética.
4
A variabilidade sofre grande impacto do sistema de acasalamento, que
quando realizado de maneira incorreta pode aumentar a taxa de endogamia
(MALHADO et al., 2008). A endogamia é caracterizada pelo acasalamento entre
indivíduos que possuem algum grau de parentesco, aumentando a homozigose e
diminuindo a heterozigose (QUEIROZ et al., 2000), podendo haver fixação e
expressão de genes indesejáveis na população (SILVA et al., 2001).
O controle da endogamia pode ocorrer com o auxilio da dissimilaridade
genética, ou seja, pela diferença genética entre os bovinos, por meio da
caracterização genética (RON et al., 1996), com a finalidade de permitir maior
confiabilidade dos parâmetros genéticos (CURI & LOPES, 2001).
2.2 Caracterização genética
A caracterização genética, principalmente de raças locais, até o final do
século XX, baseava-se nas características morfológicas e produtivas dos animais,
sendo altamente influenciadas pelo ambiente. Nas últimas duas décadas do
século passado, foram desenvolvidas técnicas capazes de detectar variações ao
nível de DNA, ficando livres das influências do meio ambiente, auxiliando nas
decisões a serem tomadas nos programas de conservação (EGITO, 2007).
A caracterização genética é de fundamental importância para os
programas de conservação, sendo utilizado como alternativa para otimizar e
quantificar a variabilidade genética (MENEZES, 2005). Considerado por
BJORNSTAD et al. (2000), o primeiro passo para a conservação de raças locais,
com a utilização de técnicas moleculares, baseadas em polimorfismos de DNA
para a análise da variabilidade genética.
O polimorfismo de DNA pode propiciar um estudo de grandes números
de marcadores e técnicas, gerando uma maior acurácia da distância genética
entre indivíduos ou populações. Com estas informações de distância genética, é
possível promover o direcionamento de acasalamento, visando à manutenção da
variabilidade genética, por meio da escolha de indivíduos menos similares
genotipicamente (EGITO, 2007; MARIZ, 2010).
5
Para a determinação da caracterização genética e da variabilidade
genética, podem ser utilizados marcadores moleculares, entre eles os marcadores
microssatélites (MENEZES, et al., 2006), que permitem avaliar a variabilidade
genética dentro de uma população além de estimar a relação genética entre os
indivíduos (MENEZES, 2005).
2.3 Marcadores moleculares
O estudo da variabilidade genética progrediu nos últimos anos com os
avanços de técnicas moleculares, com o surgimento de diversos tipos de
marcadores de DNA (ROCHA, 2009). Segundo MENEZES (2005), a variabilidade
genética pode ser detectada mediantes marcadores moleculares como RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom Amplified
Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms), SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms), mtDNA (DNA mitocondrial) e os
microssatélites.
Marcadores moleculares são polimorfismos resultantes de adições,
substituições ou deleções de pares nitrogenadas na molécula de DNA (CURI,
2000). Pode ser definido, segundo FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998), como
todo e qualquer genótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um
segmento específico de DNA, sendo considerado como um marcador genético.
O estudo da utilização dos marcadores moleculares tem avançado ao
longo dos anos devido o desenvolvimento da aplicação enzimática de segmentos
do DNA via PCR (Reação em Cadeia Polimerase). Os marcadores moleculares
são loci que apresentam características detectáveis que podem diferir entre
indivíduos, apresentando variações nas sequências de DNA (MENEZES, 2005).
Pode ser utilizado para identificação de paternidade, diagnóstico
genético precoce, mapeamento genético, estudos evolucionários, seleção, na
conservação dos recursos genéticos animais, caracterização genéticas, entre
outros. Apresentando algumas vantagens como a necessidade de pequenas
amostras de DNA, fácil interpretação e elevada heterozigosidade (EGITO, 2007).
Entretanto, cada marcador molecular possui suas especificidades,
6
mostrando algumas vantagem e desvantagens em sua utilização, como o RFLP,
obtido pelo corte da fita dupla de DNA, foi à primeira técnica utilizada para
detectar o polimorfismo de DNA na caracterização do genoma, ainda vem sendo
bastante utilizada, mas é considerada cara e lenta. O RAPD, baseado na
amplificação do DNA genômico, é considerado simples e de fácil execução, mas
possui baixo conteúdo de informação genética por locus, onde apenas um alelo é
detectado. A técnica de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos
Amplificados (AFLP), utilizado para construção de mapa genético, possuem
grande números de fragmentos de restrição, mas são considerados menos
informativos por não diferenciar heterozigoto e homozigoto. Também na formação
de mapas genéticos estão os SNPs, considerados mutações pontuais distribuídos
uniformemente pelo genoma e presentes em regiões codificantes, em locais que
flanqueiam os genes, além de possuir técnica de detecção bastante simples
(MENEZES, 2005).
O marcador molecular mtDNA é formado por uma fita simples de DNA
circular, localizados no citoplasma celular, dentro da mitocôndria, considerado de
fácil amplificação e permite mostrar a distância genética entre indivíduos por meio
da diferença de nucleotídeos entre genomas mitocondriais, mas não e capaz de
detectar o fluxo gênico mediado pelo macho devido à sua herança materna
(EGITO, 2007).
Quando se trabalha com a conservação dos recursos genéticos
animais, na formação dos mapas genéticos, tem-se utilizado preferencialmente os
marcadores microssatélites, existentes em abundância no genoma e por estarem
amplamente reportados, sendo facilmente automatizados, além de permitir a
análise de vários locos de uma única vez. Considerados altamente sensíveis a
seleção, com a diversidade observada como consequência da deriva genética e
da mutação (BRUFORD et al., 2003).
2.3.1 Microssatélites
O DNA dos mamíferos é constituído em sua grande maioria, de 50 a
60% por DNA não-repetitivo (LODISH et al., 1999). De acordo com ARAÚJO
7
(2004), a fração de DNA repetitivo é composta de sequências de DNA presentes
em mais de uma cópia do genoma, podendo ser dividido em DNA
moderadamente repetido e DNA altamente repetitivo, de acordo com a frequência
de repetição. Sendo a fração moderadamente repetida composta por elementos
móveis como transposons, LINES (long interspersed elements) e SINES (short
interspersed elements), além de famílias gênicas muito duplicadas. O DNA
altamente repetitivo também é conhecido como DNA satélite ou DNA com
repetição de sequências simples (SSR) (LODISH et al., 1999).
Essas sequências repetidas em tandem, que permitem um alinhamento
imperfeito durante o pareamento dos cromossomos, são divididas em
minissatélites e microssatélites (MENEZES, 2005). Os minissatélites são
repetições ao acaso em sequências de 10 a 60 pares de base (pb), altamente
polimórficos e com elevada taxa de heterozigosidade nas populações (JEFFREYS
et al., 1985). Segundo TAUTZ (1989), os microssatélites são segmentos curtos de
DNA de 1 a 6 pb, repetidos aleatoriamente ao acaso por todo o genoma, sendo
altamente polimórficos (devido ao número de repetições de determinada
sequência) e suas repetições específicas por loci de microssatélites são
facilmente detectadas com utilização de PCR.
A técnica de PCR é considerada rápida e versátil que engloba a
síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de
DNA na presença de enzima DNA polimerase. Essa técnica se baseia no
anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos,
correspondendo a 17-25 pb, utilizados como iniciadores (primers) (MENEZES,
2005), que segundo (ALBUQUERQUE, 2005), flanqueiam a sequência repetitiva.
Essa técnica envolve a desnaturação da fita dupla de DNA, o reanelamento e a
nova síntese de DNA (MENEZES, 2005).
Os loci de microssatélites podem ser utilizados para estabelecer grupos
de ligação, mapear cromossomos, identificação de indivíduos em uma população
e determinar a probabilidade de parentesco entre dois indivíduos (ARAÚJO,
2004), com isso têm sido bastante utilizados na genética de populações (ROCHA,
2009), além de permitir estimar os níveis de variabilidade genética dentro das
populações e analisar as relações genéticas existentes entre elas, permitindo
estimar a diversidade genética entre as populações de animais domésticos
8
ameaçados de extinção. Estes marcadores permitem a identificação de alelos por
locus e cálculos da frequência alélica, o que permite estimar a distância genética
entre populações e indivíduos (MENEZES, 2005).
Os microssatélites podem ser utilizados para a caracterização de
rebanhos e segundo a FAO devem ser utilizados no mínimo 25 loci de
microssatélites para o estudo da distância genética. Na escolha desses loci
devem utilizar alguns critérios como escolher marcadores de domínio público,
previamente reportado em publicações científicas; não ligados; exibir herança
Mendeliana; cada microssatélite deve conter no mínimo quatro alelos;
microssatélites devem possuir homologia em várias espécies relacionadas; e
possível de ser usado em qualquer sequenciador automático e de fácil
reprodutibilidade (KUMAR, 2000).
2.4 Análises estatísticas nos estudos da variabilidade genética
As análises de polimorfismos de microssatélites vêm sendo bastante
utilizadas em estudos de variabilidade genética para verificar a variação genética
intra e inter-populacionais, também sendo utilizado para determinar a distância ou
similaridade genética entre populações (MENEZES, 2005).
Para este estudo tem-se utilizado as frequências alélicas, a
heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He), conteúdo de informação
polimórfica (PIC), desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), probabilidade
de exclusão (PE), índices de fixação ou estatísticas de F e distâncias genéticas
(ROCHA, 2009).
2.4.1 Frequência alélica
Ao se conhecer a frequência alélica, os loci de microssatélites
altamente polimórficos podem ser úteis para identificar os indivíduos em uma
população e para determinar a probabilidade de parentesco dentre dois indivíduos
(ARAÚJO, 2004).
9
O número médio de alelos é considerado uma medida alternativa
bastante útil para caracterizar a variabilidade genética. Na determinação do
número de alelos conta-se em cada locus o número de alelos detectados, com
posterior soma dos valores obtidos e divisão pelo total de loci estudado, obtendo
assim a frequência alélica. Para tal determinação faz-se necessário conhecer o
resultado da análise de um conjunto de indivíduos de uma determinada população
para uma proteína ou para um microssatélite (Quadro 1) (PEREIRA & ALMEIDA,
2005).
Frequência genotípica
f(AA) = 4/10 = 0,4 f(AB) = 4/10 = 0,4 f(BB) = 2/10 = 0,2
Frequência alélica
f(A) = 12/20 = 0,6 ou 60% f(B) = 8/20 = 0,4 ou 40%
QUADRO 1 – Representação esquemática da separação eletoforética de uma proteína ou de um microssatélite com dois alelos comuns, A e B. AA, AB e BB correspondem aos genótipos observados em dez indivíduos, com frequências genotípicas e alélicas.
Fonte: Adaptado de PEREIRA & ALMEIDA (2005).
Pode-se notar que se trata de um locus polimórfico com dois alelos (A
e B), com a existência de três genótipos (AA, AB e BB), apresentando frequências
genotípicas (0,4; 0,4; 0,2). Com isso pode-se estimar as frequências de alelos (A
e B) nessa população. Observa-se um valor de 12 genes A no total de 20 genes
da amostra correspondendo a 60% de frequência alélica A e uma soma de oito
genes B, representando uma frequência alélica de 40% (PEREIRA & ALMEIDA,
2005).
10
Assumindo o pressuposto do EHW, pode-se determinar a frequência
alélica ou frequência gênica, onde a variância de uma frequência alélica pode ser
descrita pela expressão binomial, conforme o Quadro 2 (MENEZES et al., 2006).
Onde:
x = frequência alélica
n = número de indivíduos da amostra
QUADRO 2 – Expressão binomial para determinação da variância da frequência alélica.
Fonte: MENEZES et al. (2006)
2.4.2 Heterozigosidade
A heterozigosidade pode ser considerada uma medida de variabilidade
genética (MENEZES, 2005), sendo a heterozigosidade de um locus definida como
a probabilidade de um indivíduo ser heterozigoto naquele locus, em uma
população (ARAÚJO, 2004).
Considera-se um locus polimórfico quando o alelo mais comum
apresenta uma frequência inferior a 95% e, um marcador é considerado altamente
informativo com heterozigosidade maior que 70%. Onde a heterozigosidade de
um marcador é a probabilidade de um indivíduo ser heterozigoto no locus
marcador, sendo dependente do número de alelos e da frequência destes alelos
na população (OTT, 1992).
A He e a Ho, juntamente com o número médio de alelos, são os
parâmetros mais utilizados para verificar a diversidade genética dentro de uma
raça, onde os índices de diversidade genética, como a heterozigosidade média de
uma população pode ser utilizada para verifica o nível de endocruzamento do
rebanho (EGITO, 2007).
11
A Ho é a proporção de indivíduos heterozigotos observados em uma
população estudada (ROCHA, 2009). Segundo MENEZES (2005), pode ser
calculado diretamente a partir dos genótipos encontrados na população para
todos os loci por intermédio do programa informático GENETIX v. 4.0.4, proposto
por BELKHIR (1999).
A determinação da Ho para apenas um loco (Quadro 3) ou para todos
os locos pode ser realizada de acordo com o Quadro 4 (McMANUS et al., 2011).
Ho = Nº de heterozigotos em cada loco
Nº total de indivíduos pesquisados
Exemplo:
Ho = 25 heterozigotos = 0,25
100 indivíduos
QUADRO 3 – Determinação da Ho com apena um loco. Fonte: McMANUS et al. (2011).
Exemplo com 5 locos Onde Ho =
Loco 1 25/100 = 0,25
Loco 2 0/100 = 0,00
Loco 3 10/100 = 0,10
Loco 4 5/100 = 0,05
Loco 5 25/100 = 0,25
Ho = (0,25 + 0 + 0,10 + 0,05 + 0,25)/5 = 0,13
QUADRO 4 – Determinação da Ho com todos os locos. Fonte: McMANUS et al. (2011).
A heterozigosidade média esperada de um locus pode ser calculada
pela fórmula (Quadro 5) proposta por NEI (1973), quando este parâmetro for
equivalente à heterozigosidade observada, considerando-se apenas que as
populações estão em completo equilíbrio (MENEZES, 2005).
12
Onde:
xi = frequência de alelo i
k = número de alelos
QUADRO 5 – Cálculo da heterozigosidade média esperada. Fonte: NEI (1973).
A He pode ser definida como uma fração estimada de todos os
indivíduos que poderiam ser heterozigótico de um loco. Diferindo da Ho, por ser
uma previsão baseada na frequência alélica, sendo que o desvio observado entre
a He e Ho, pode ser um indicativo da dinâmica populacional. Então a He é
calculada com base na frequência de alelos, como por exemplo, para uma
simples característica gênica com dois alelos, A e a, com frequências expressas
em p(A) e q(a), onde p + q = 1, determinado pela equação observada no Quadro
6 (McMANUS et al., 2011).
Nº de indivíduos
observados com
cada genótipo
Frequência de genótipos
observados
Frequência de
genótipos
esperado
Nota que:
p² + 2pq + q² = 1
Homozigotos = p² + q²
Heterozigotos = 2pq
AA = 10 A = {(2x10) + 10)}/(2x80)
A = 0,1875
a = 1 – 0,1875 = 0,8125
p² = 0.0352
Aa = 10 2pq = 0,3046
aa = 60 q² = 0,6602
Total = 80 indivíduos amostrados = 160 alelos
QUADRO 6 – Equação que determina a frequência de três genótipos possíveis. Fonte: Adaptado de McMANUS et al. (2011).
2.4.3 Conteúdo de informação polimórfica (PIC)
O PCI surgiu para quantificar o valor da informação do polimorfismo de
um locus marcador, sendo considerado um parâmetro que apresenta uma
dependência do número de alelos e de suas frequências. As classificações dos
13
marcadores com valores de PIC, são considerados muito informativo,
mediamente informativo e pouco informativo, com valores superiores a 0,5, entre
0,25 e 0,50 e, inferiores a 0,25 respectivamente (BOLSTEIN et al., 1980).
De acordo com MENEZES (2005) eles podem ser calculados de
acordo com a seguinte fórmula (Quadro 7).
QUADRO 7 – Fórmula para determinação de valores de PIC. Fonte: BOLSTEIN et al. (1980).
2.4.4 Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW)
A lei de Hardy-Weinberg é uma teoria extremamente útil para
possibilitar o entendimento do que acontece ás frequências gênicas e genotípicas
de populações reais, onde a lei pode ser deduzida pela observação das
frequências em qualquer população de animais que transpõe uma geração de
cruzamentos ao acaso. Quando isso acontece, tornam-se evidentes algumas
conclusões como as frequências genotípicas na prole são determinadas
exclusivamente pelas frequências gênicas nos genitores, de modo que a
frequência de homozigotos é igual ao quadrado da frequência de gene relevante e
a frequência de heterozigoto é igual ao dobro do produto das frequências dos
genes relevantes; e as frequências gênicas e genotípicas permanecem
constantes de uma geração para a seguinte, quando isso acontece é dito que
está em EHW. Isso é observado em uma população de cruzamento ao acaso, em
que não há seleção, mutação, migração ou deriva genética (NICHOLAS, 2011).
A seleção, migração, mutação e deriva genética são os quatro fatores
que podem interferir no EHW de uma população, interferindo então na
variabilidade genética da população. A seleção atua de maneira negativa na
variabilidade genética, pois promove a fixação de genes na mesma, com a
utilização de poucos indivíduos para o acasalamento. A migração está
14
relacionada com a entrada de novos genes em uma determinada população,
podendo contribuir para a erosão genética da população local, com a utilização de
cruzamentos absorventes. Mutação é uma variação brusca e hereditária, que
pode ocorrer em algum gene. A deriva genética é uma alteração natural na
frequência de alelos que ocorre em populações pela perpetuação de genes por
meio da reprodução, podendo ocasionar rápida redução da variabilidade genética
e aumento de homozigosidade (MARIZ, 2010).
Segundo MENEZES (2005), qualquer desvio significativo no EHW
indicará que a população está subdividida, que existe uma endogamia ou fluxo de
genes de outra população. Para verificar esses desvios pode-se utilizar teste de
qui-quadrado, teste exato de Fisher, entre outros.
O EHW pode ser matematicamente demonstrado com uma equação
binominal simples (para dois alelos) ou multinominal (alelos múltiplos) e na
distribuição de frequência gênica, como mostra a Quadro 8 (McMANUS et al.,
2011).
p² + 2pq + q²
QUADRO 8 – Equação para verificação do EHW. Fonte: McMANUS et al. (2011).
O EHW é testado entre gerações, como foi exemplificado por
REZENDE (2010), utilizando animais da raça Angus. Foram determinadas as
frequências alélicas e genotípicas destes animais e realizou-se um acasalamento
ao acaso e mesma frequência genotípica para machos e fêmeas. Após o primeiro
ciclo de acasalamento ao acaso, foi observado que as frequências gênicas
mantiveram-se, porém as frequências genotípicas alteraram-se, mostrando que a
geração P não se encontrava em equilíbrio ao se comparar com a geração 1
(Quadro 9). No segundo momento foi estimado o acasalamento ao acaso e
mesma frequência genotípica entre machos e fêmeas na geração 1. Após o
acasalamento, pode-se afirmar que a geração 1 encontrava-se em EHW, pois as
frequência gênicas e genotípicas permaneceram constantes (Quadro 10).
15
Como saber se uma população está em EHW?
Ex: Cor da pelagem em bovinos da raça Angus
BB ou Bb vermelho, bb preto
400 animais BB, 400 animais Bb e 200 animais bb
Frequência alélica f(B) = (800+400)/2000 = 0,60 f(b) = (400+400)/2000 = 0,40
Frequência genotípica
f(BB) = 400/1000 = 0,40
f(Bb) = 400/1000 = 0,40
f(bb) = 200/1000 = 0,20
Frequência dos acasalamentos Fêmeas (geração P)
BB (0,40) Bb (0,40) bb (0,20)
Machos (geração P)
BB (0,40) 0,16 0,16 0,08
Bb (0,40) 0,16 0,16 0,08
bb (0,20) 0,08 0,08 0,04
Geração P Geração 1
Acasalamento Frequência BB Bb Bb
BB x BB 0,16 0,16 0 0
BB x Bb 0,32 0,16 0,16 0
BB x bb 0,16 0 0,16 0
Bb x Bb 0,16 0,04 0,08 0,04
Bb x bb 0,16 0 0,08 0,08
bb x bb 0,04 0 0 0,04
Total 1 0,36 0,48 0,16
Geração P Geração 1
Frequência genotípica
f(BB) = 0,40 f(BB) = 0,36
f(Bb) = 0,40 f(Bb) = 0,48
f(bb) = 0,20 f(bb) = 0,16
Frequência alélica f(B) = 0,60 f(B) = 0,60 f(b) = 0,40 f(b) = 0,40
QUADRO 9 – Demonstração do não EHW na geração P. Fonte: Adaptado de REZENDE (2010).
16
Frequência dos acasalamentos Fêmeas (geração 1)
BB (0,36) Bb (0,48) bb (0,16)
Machos (geração 1)
BB (0,36) 0,1296 01728 0,0576
Bb (0,48) 0,1728 0,2304 0,0768
bb (0,16) 0,0576 0,0768 0,0256
Geração 1 Geração 2
Acasalamento Frequência BB Bb bb
BB x BB 0,1296 0,1296 0 0
BB x Bb 0,3456 0,1728 0,1728 0
BB x bb 0,1152 0 0,1152 0
Bb x Bb 0,2304 0,0576 0,1152 0,0576
Bb x bb 0,1536 0 0,0768 0,0768
bb x bb 0,0256 0 0 0,0256
Total 1 0,36 0,48 0,16
Geração 1 Geração 2
Frequência genotípica
f(BB) = 0,36 f(BB) = 0,36
f(Bb) = 0,48 f(Bb) = 0,48
f(bb) = 0,16 f(bb) = 0,16
Frequência alélica f(B) = 0,60 f(B) = 0,60 f(b) = 0,40 f(b) = 0,40
QUADRO 10 – Demonstração do EHW na geração 1. Fonte: Adaptado de REZENDE (2010).
2.4.5 Probabilidade de exclusão (PE)
A PE representa a probabilidade de um animal escolhido
aleatoriamente, não ser o pai ou a mãe de uma determinada cria (ROCHA, 2009).
Segundo ARAÚJO (2004), a fórmula de exclusão de paternidade é baseada na
probabilidade teórica de exclusão dos pais escolhidos incorretamente.
A PE 1 estima a chance de exclusão quando conhecido o genótipo do
filho e de um dos possíveis pais. A PE 2, é quando se tem o genótipo do filho e o
genótipo de um dos verdadeiro pais. Podendo também ser calculada a
probabilidade de exclusão combinada (PEC), quando de trabalha com todos os
locos, sendo calculada pela formula PEC = 1 – (1-PEn)k, onde n representa o
número de alelos e k a probabilidade de exclusão de cada marcador. Mas
independente do tipo de PE, todas podem ser calculadas por programas
informáticos como o Cervus v. 2 (ROCHA, 2009).
17
2.4.6 Índices de fixação ou estatísticas de F
As variações genéticas existentes podem ser quantificadas pela
estatística F, descrita pela teoria de Sewall Wright nas décadas de 40 e 50, que
introduziu os parâmetros FST, FIT e FIS, podendo fornecer de maneira sumarizada
a estrutura da população estudada (ARAÚJO, 2004; MENEZES, 2005).
FST é o índice de fixação ou coeficiente de consangüinidade entre
subpopulações, onde seu valor é utilizado para medir a distância entre
subpopulações, assumindo valores entre zero e um e, quanto maior for esse
valor, maior será a diferenciação entre as subpopulações estudadas. FIS refere-se
ao coeficiente de consangüinidade intrapopulacional, ou seja, a redução da
heterozigosidade do indivíduo com relação a sua subpopulação, ela expressa a
ocorrência de acasalamentos aleatórios dentro da subpopulação. Onde valores de
FIS maior que zero, significa ocorrência de endogamia, quando o FIS for menor
que zero, mostra a ocorrência de acasalamento entre indivíduos não aparentados.
Já o FIT indica redução da heterozigosidade de um indivíduo com relação à
metapopulação (BARROS, 2009).
Os valores de FIT e FIS quando se apresentam negativos ou próximos
de zero, significa que há variabilidade genética na população, uma vez que existe
maior número de heterozigotos e valores distantes de zero indicam maiores
valores de homozigotos (OLIVEIRA, 2007).
A estatística F pode ser determinada com base na heterozigosidade
obtida com marcadores genéticos, por meio de equações, descritas no Quadro 11
(ROCHA, 2009).
18
Onde:
HI = heterozigosidade observada obtida pela média de todos os
fragmentos populacionais
HS = heterozigosidade esperada de Hardy-Weinberg obtida pela média de
todos os fragmentos populacionais
HT = heterozigosidade esperada de Hardy-Weinberg para a população
total
QUADRO 11 – Equações de obtenção da estatística F. Fonte: ROCHA (2009).
2.4.7 Distância genética entre populações
A determinação da distancia genética por meio de marcadores
moleculares entre populações, permite a tradução entre o grau de parentesco
desses animais, verificando a variabilidade genética entre eles. Sendo de
fundamental importância para a conservação de recursos genéticos, pois permite
definir características únicas de algumas raças ou populações (PEREIRA &
ALMEIDA, 2005).
A distância genética entre raças ou populações pode ser determinada
por meio de fórmulas matemáticas que medem a distância genética entre
indivíduos, possibilitando a construção de árvores filogenéticas ou dendrogramas
(MARIZ, 2010).
19
Se a distância genética entre populações for obtida com valor igual a
zero, significa que não há diferença entre as duas populações, mas se as
populações não apresentarem alelos em comum nos loci, significa que os valores
de distância genética deve apresentar valor máximo. Com a utilização das
distâncias genéticas pode-se realizar medidas de diversidade genética ou
variabilidade genética. Atualmente para os cálculos de distâncias genéticas tem-
se utilizado fórmulas propostas por Nei (estima o número de substituições gênicas
que ocorrem em genes de duas populações desde sua divergência a partir de um
ancestral comum) e Reynolds (divergência entre populações é em função da
deriva genética) (ARAÚJO, 2004).
Independente do tipo de fórmula escolhida para estudar a variabilidade
genética de uma população, todos os dados utilizados devem conter informações
sobre as frequências alélicas ou genotípicas, sendo está considerada a base de
qualquer que seja o método (MARIZ, 2010).
As funções matemáticas devem apresentar algumas propriedades para
ser considerada com distância. Onde a distância entre uma população (X) e ela
mesmo dever ser igual a zero {d (X,X) = 0)}; a distância entre duas populações
deve ser positiva {d (X,Y) ≥ 0} e simétrica {d (X,Y) = d (X,Y)}; se a distância
satisfaz as duas anteriores, denomina-se semimétrica, apresentando uma
desigualdade triangular {d (X,Y) ≤ [d (X,Z) + d (Y,X)]}, sendo assim chamada de
distância métrica (ARAÚJO, 2004). Segundo MENEZES (2005), a distância
métrica é a mais utilizada no estudo das populações.
Para o cálculo das distâncias genéticas podem ser utilizados algumas
fórmulas descritas no Quadro 12, onde xi e yi são frequência de alelo ith traçados
nas respectivas populações X e Y. As fórmulas das distâncias são dadas para um
loco, mas para calcular vários locos, tem-se uma soma a mais de locos e dividi-se
pelo número de locos onde a somatória aparece nas expressões (ROCHA, 2009).
20
QUADRO 12 – Fórmulas para cálculos de distância genética. Fonte: ROCHA (2009).
A distância padrão de Nei é a medida mais utilizada e sua distância
tem se mostrado proporcional ao tempo de divergência. A distância mínima de
Nei (Dm) mede o número mínimo de alelos diferentes por locus. A distância de Nei
(DA) é linear com o tempo, mais apresenta um problema com dados de
microssatélites de populações divergentes, devido à alta proporção de mutação e
grande número de alelos. E a distância de Reynolds (DReynolds) assume que não
existe mutação e que todas as mudanças observadas nas frequências são
oriundas de deriva genética (MENEZES, 2005).
21
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com a perda da variabilidade e da diversidade genéticas das raças
locais, ao longo dos anos, surgiram programas de conservação de recursos
genéticos, visando à preservação de alelos dessas raças para futuros programas
de melhoramento genético.
A quantificação da variabilidade genética de raças locais vem sendo
realizadas por meio da caracterização genética, com o auxilio de marcadores
moleculares, com maior frequência de utilização de microssatélites e por meio de
análises estatísticas, sendo consideradas ferramentas fundamentais nos
programas de conservação de recursos genéticos.
22
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