UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Sindrome vestibular EM Lithobates catesbeianus associada À Ranavirus

Adriano Queiroz de Mesquita

Orientador: Prof. Dr. Romão da Cunha Nunes

Goiânia

2014

ADRIANO QUEIROZ DE MESQUITA

Sindrome vestibular EM Lithobates catesbeianus associada À Ranavirus

Tese apresentada para a

obtenção do grau de Doutor em

Ciência Animal junto à Escola

de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração:

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Linha de Pesquisa:

Ciência e Tecnologia de Alimentos

Orientador:

Prof. Dr. Romão da Cunha Nunes – UFG

Comitê de Orientação:

Profª. Drª. Cintia Silva Minafra e Rezende – UFG

Dr. Rolando Alfredo Mazzoni Romero – UFG

GOIÂNIA

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

M582s

Mesquita, Adriano Queiroz de.

Síndrome vestibular em Lithobates catesbeianus associada à Ranavirus [manuscrito] / Adriano Queiroz de Mesquita. - 2014.

80 f. : figs, tabs.

Orientador: Prof. Dr. Romão da Cunha Nunes..

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,

Escola de Veterinária e Zootecnia, 2014.

Bibliografia.

1. Ranicultura 2. Ranavírus 3. Imunohistoquímica

I. Título.

CDU: 636.95:597.82

ADRIANO QUEIROZ DE MESQUITA

Tese defendida e aprovada em 20/05/2014 pela banca examinadora constituída pelos professores:

A toda minha família, em especial ao

meu pai e eterno professor: Albenones

José de Mesquita, e minha mãe:

Sandra Queiroz Porto de Mesquita, que

dedicaram suas vidas a amar e orientar

os filhos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela paciência, perseverança e todas as oportunidades proporcionadas;

Aos meus pais Albenones José de Mesquita e Sandra Queiroz Porto de Mesquita e minha esposa Cláudia Teixeira Taveira pela paciência, amor e dedicação;

À família do meu irmão, Alessandro Queiroz de Mesquita, Selva Meirelles e minha sobrinha linda Mayara Meirelles de Mesquita pelo apoio diário e compreensão nos momentos em que eu não podia estar presente;

Ao meu orientador, Dr. Romão da Cunha Nunes, pelo qual tenho grande admiração e carinho;

À Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, pela disposição de infraestrutura e todo apoio técnico-científico;

Ao programa de pós-graduação da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás;

À CAPES pela bolsa de doutorado concedida;

Ao amigo Dr. Rolando Mazzoni pela convivência, orientação, apoio, discussões, considerações e tempo dedicado ao desenvolvimento deste trabalho;

Ao Prof. Dr. Jesiel Freitas Carvalho pela disponibilização do Laboratório Multiusuário do Instituto de Física da Universidade Federal de Goiás para a realização de análises por microscopia eletrônica de transmissão;

Ao Instituto Biológico do Estado de São Paulo pelo apoio e parceria na realização de análises;

A todos os amigos e colaboradores do Centro de Pesquisa Agroflorestal do Acre da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (CPAFAC/EMBRAPA) pelo apoio na conclusão de mais uma etapa de formação acadêmica.

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS1

REFERÊNCIAS11

CAPÍTULO 2 – Detecção de Ranavirus por PCR em tempo real em Rana catesbeiana (shaw, 1802) e em outras espécies que habitam o entorno dos ranários18

INTRODUÇÃO20

MATERIAL E MÉTODOS22

Colheita de amostras22

Técnica de PCR em tempo real23

RESULTADOS E DISCUSSÃO25

Detecção do DNA de vírus do gênero Ranavirus por PCR em tempo real25

CONCLUSÃO31

REFERÊNCIAS32

CAPÍTULO 3 – Ranavirus EM Rana catesbeiana (SHAW,1802)/Lithobathes catesbeianus COM QUADRO CLÍNICO DE SÍNDROME VESTIBULAR38

INTRODUÇÃO40

MATERIAL E MÉTODOS41

Colheita de amostras41

Técnica de Histopatologia44

Técnica de Imunohistoquímica45

Técnica de microscopia eletrônica de transmissão46

RESULTADOS E DISCUSSÃO47

Anatomohistopatologia47

Imunohistoquímica53

Microscopia eletrônica55

CONCLUSÃO60

REFERÊNCIAS61

CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS67

Sindrome vestibular em Lithobates catesbeianus associada a Ranavirus

Resumo: A ranicultura é uma atividade em expansão na América do Sul podendo ser considerada consolidada no Brasil, particularmente no Estado de Goiás. Nos últimos anos, transformou-se em uma atividade superintensiva e como consequência favoreceu o aparecimento de doenças que constituem uma ameaça para a viabilidade técnica e econômica dos criatórios de organismos aquáticos. Diversas doenças com alta morbidade e mortalidade têm sido observadas em girinos e rãs. Especialmente no estado de Goiás, duas patologias afetam o ciclo produtivo nos ranários. A primeira se manifesta em girinos de até 30 dias levando à alta taxa de mortalidade e já foi relacionada à presença de Iridovírus do gênero Ranavirus. A segunda acomete rãs em todas as fases desde a pós-metamorfose até animais no ponto de abate. Na fase pós-metamórfica os animais apresentam-se caquéticos e de 10 a 50% da população desenvolve um quadro crônico caracterizado clinicamente por sinais nervosos como falta de coordenação e posturas anormais. Apesar do quadro com sintomatologia nervosa, algumas rãs conseguem se alimentar e continuam crescendo lentamente, sendo que poucas recuperam a condição normal. Essa manifestação clínica pode ser atribuída à própria anatomia do sistema vestibular e do aparelho auditivo. Sinais aferentes vestibulares bilaterais de canal semicircular e órgãos otolíticos são essenciais para a estabilização do olhar, o controle da postura e locomoção, bem como para os aspectos cognitivos de equilíbrio, orientação espacial e homeostase vegetativa. Considerando a relevância do tema, objetivou-se com o presente estudo contribuir para elucidação da Síndrome Vestibular em Rana catesbeiana com foco na presença de Ranavirus por meio do emprego de métodos de diagnóstico como técnicas histopatológicas, PCR em tempo real, microscopia eletrônica e imunohistoquímica. No primeiro estudo, foi desenvolvido um método de detecção de Ranavirus por PCR em tempo real para diagnóstico em rãs clinicamente sadias e em rãs enfermas com sinais nervosos, com o objetivo de monitorar a disseminação desse agente para essa e outras espécies de animais que habitam o entorno dos ranários do estado de Goiás. Foram colhidas 91 amostras distribuídas aleatoriamente em ranários da zona rural do estado de Goiás. Dessas, 50 eram provenientes de rãs sem sintomatologia clínica e 41 de rãs com quadro de sequelas nervosas caracterizado por falta de coordenação, postura anormal com lordose, diversos graus de escoliose e desvio da cabeça para os lados esquerdo ou direito. Diante dos resultados obtidos, conclui-se que a frequência de Ranavirus em rãs com sintomatologia nervosa é superior à frequência de Ranavirus em rãs sem sintomatologia clínica aparente, indicando associação do quadro clínico com a presença do vírus. A detecção de Ranavirus em animais que habitam o entorno dos ranários do estado de Goiás indica que o vírus encontra-se disseminado nos ranários amostrados e a detecção em peixes revela necessidade de monitoramento da disseminação do vírus para evitar casos de mortalidade em massa em outras espécies. No segundo estudo, foram colhidas aleatoriamente amostras de 60 rãs da espécie Rana catesbeiana provenientes de ranários do estado de Goiás com o objetivo de identificar o agente envolvido nos quadros clínicos crônicos, similares à síndrome vestibular, por meio de técnicas de diagnóstico como microscopia eletrônica de transmissão, anatomohistopatologia e imunohistoquímica. Dessas, 30 apresentavam quadro clínico característico e 30 apresentavam-se assintomáticas. À anatomohistopatologia foram identificadas lesões do tipo inflamatória com necrose e infiltrado linfocitário nas regiões posteriores do encéfalo e cerebelo, com meningoencefalite e corpúsculos de inclusão, regiões de gliose, e focos necróticos com abundantes macrófagos e restos celulares associados a infiltrados inflamatórios. O plexo coroide apresentou infiltrado inflamatório abundante e lesões semelhantes às descritas anteriormente. Essas lesões também foram observadas na região dos canais semicirculares e no aparelho vestibular central e periférico aos cortes frontal e transversal. A leitura das lâminas submetidas à coloração com anticorpo específico anti-iridovírus revelou a presença de marcação positiva na região do plexo coroide. Essa constatação associada às lesões descritas na anatomohistopatologia confirma a presença de Ranavirus. Ao analisar as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão de amostras de rim e fígado foi possível visualizar partículas virais com características semelhantes à dos Ranavirus, ou seja, com simetria icosaédrica e tamanho variando de 120-300nm. Desse modo, conclui-se que as lesões do tipo inflamatórias, descritas na anatomohistopatologia, na região do sistema nervoso central posterior, com extensão para o ouvido interno e médio, associadas à sintomatologia nervosa de caráter vestibular indicam a presença de Ranavirus. Em relação à imunohistoquímica, a presença de marcação positiva com anticorpo específico anti-iridovirus em células afetadas da região do plexo coroide, associada às lesões descritas na anatomohistopatologia confirma a presença de Ranavirus e a presença de partículas virais em fígado e rim, associada às lesões de tipo inflamatórias na região do sistema nervoso central posterior, com extensão para o ouvido interno e médio, descritas no presente estudo, também confirma a presença de Ranavirus em rãs de criação de ranários do estado de Goiás.

Palavras-chave: diagnóstico, imunohistoquímica, ranicultura, microscopia eletrônica.

VESTIBULAR SYNDROME IN Lithobates catesbeianus ASSOCIATED TO Ranavirus

Abstract: Frog farming is an expanding activity in South America. In Brazil it can be considered consolidated, especially in the state of Goiás. In the last few years it turned into a superintensive activity and consequently favored the emergence of diseases that pose a threat to the technical and economic viability of farms of aquatic organisms. Several diseases with high morbidity and mortality have been observed in tadpoles and frogs. Especially in the state of Goiás, two diseases affect the production cycle in the frog farms. The first manifests itself in 30 days tadpoles leading to high mortality and has been associated to the presence of Ranavirus. The second affects frogs in all stages from post-molt to the point of slaughtering. In post-metamorphic phase the animals are cachectic and 10-50 % of the population develops nervous signs such as incoordination and abnormal postures chronic condition. Despite the board's neurological symptoms, some frogs are able to feed and continue to grow slowly, with few recovering normal condition. This clinical manifestation may be attributed to the anatomy of the vestibular system and hearing. Afferent bilateral vestibular signals from semicircular canal and otolith organs are essential for the stabilization of gaze, the control of posture and locomotion as well as the cognitive aspects of balance, spatial orientation and vegetative homeostasis. Considering the relevance of the topic, the objective of this study is to contribute to the elucidation of Vestibular Syndrome in Rana catesbeiana focusing in the presence of Ranavirus through the use of methods of diagnosis and histopathological techniques , real-time PCR , immunohistochemistry and electron microscopy. In the first study, we developed a method of detecting Ranavirus by real-time PCR for diagnosis of clinically healthy and diseased frogs with nerve signals in order to monitor the spread of this agent for this and other species of animals that inhabit the frog farms around the state of Goiás 91 samples were collected randomly frog farms in the countryside of the state of Goiás of these, 50 were from frogs without clinical symptoms and 41 box of frogs with nerve sequelae characterized by lack of coordination , posture with abnormal lordosis, scoliosis and various degrees of head tilt to the left or right side. Based on these results, it is concluded that the frequency of ranavirus frogs with neurological symptoms is higher than the frequency of ranavirus frogs without apparent clinical symptoms, indicating association of clinical findings with the presence of the virus. The detection of ranavirus in animals living near the frog farms in the state of Goiás indicates that the virus is spread in the sampled detection in fish and frog farms reveals need for monitoring the spread of the virus to prevent cases of mass mortality in other species. In the second study, samples were collected randomly from 60 bullfrogs from frog farms in the state of Goiás in order to identify the agent involved in chronic, vestibular syndrome similar to clinical problems through diagnostic techniques such as transmission electron microscopy, histopathology and immunohistochemistry. Of these, 30 bullfrogs had typical clinical picture and 30 bullfrogs had become asymptomatic. At histopathology, inflammatory type of lesions with necrosis and lymphocytic infiltration were seen in the posterior regions of the cerebrum and cerebellum, with meningoencephalitis and inclusion bodies, areas of gliosis, and necrotic foci with abundant macrophages and cellular debris associated with inflammatory infiltrates. The choroid plexus showed abundant inflammatory infiltrates and lesions similar to those described above. These lesions were also observed in the region of the semicircular canals and the central and peripheral vestibular apparatus to the front and cross cuts. These specimens subjected to staining with specific anti - iridovirus revealed the presence of positive staining in the choroid plexus region. This finding associated with the lesions described in anatomohistopatologia confirms the presence of Ranavirus. When analyzing the images obtained by electron microscopy transmission of samples from kidney and liver of bullfrog it was possible to visualize viral particles with similar characteristics to that of ranavirus, with icosahedral symmetry and size ranging from 120 - 300nm . Thus, it is concluded that the lesions of inflammatory type, described in anatomohistopatologia in the posterior central nervous system bullfrogs region, extending to the middle and inner ear, nervous symptoms associated with vestibular character indicate the presence of Ranavirus. Regarding immunohistochemistry, the presence of positive staining with specific anti- Iridovirus in the affected cells of the choroid plexus of bullfrog, associated to lesions described in anatomohistopatologia region confirms the presence of ranavirus and the presence of viral particles in the liver and kidney bullfrog, associated with inflammatory lesions in the posterior type central nervous system region, extending to the middle and inner ear, described in the present study also confirms the presence of Ranavirus in frog farms of the state of Goiás.

Keywords: diagnosis, immunohistochemistry, raniculture, electron microscopy.

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CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS

No ano de 2011, a aquicultura teve participação expressiva no mercado nacional de produção de carnes com aproximadamente 1,25 milhão de toneladas de pescado. Desse total, 475 mil toneladas foram produzidas no sistema de cultivo, o que gerou um Produto Interno Bruto (PIB) de R$ 5 bilhões. Historicamente, a aquicultura enquadrou-se entre as atividades de produção de carnes que mais cresceu entre os anos de 2007 e 2009 com 43,8% de aumento, demonstrando que o setor respondeu prontamente às políticas de fomento do governo federal (BRASIL, 2011).

No âmbito dos órgãos de referência internacional, a Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda o consumo anual de pescado de pelo menos 12 quilos por habitante/ano, sendo que a média de consumo brasileiro no ano de 2009 era de 9,03 kg por habitante/ano. De acordo com a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), a previsão é de que até 2030 a demanda internacional de pescado aumente em mais 100 milhões de toneladas por ano, ressaltando o potencial de crescimento desta atividade econômica. No que se refere ao mercado de trabalho, a atividade mobiliza 800 mil profissionais entre pescadores e aquicultores e proporciona 3,5 milhões de empregos diretos e indiretos (BRASIL, 2011).

Dada a importância do setor econômico e as respostas às políticas de fomento, em 29.06.2009 foi publicada a Lei nº11.958, que transformou a antiga Secretaria Especial de Aquicultura e Pesca da Presidência da República em Ministério da Pesca e Aquicultura. Suas principais atividades envolvem o desenvolvimento da política nacional pesqueira e aquícola, abrangendo todas as etapas desde a produção, transporte, beneficiamento, transformação, comercialização, abastecimento e armazenagem dos produtos (BRASIL, 2009).

Didaticamente, podem-se classificar as principais atividades da aquicultura em: maricultura (cultivo de animais aquáticos de água salgada), piscicultura (cultivo de peixes, principalmente de águas doces), algicultura (cultivo de macro ou microalgas), carcinicultura (cultivo de camarões) e ranicultura (cultivo de rãs). Entre estas, a ranicultura pode ser definida como a prática do cultivo de rãs em sistemas intensivos dispostos em fazendas de criação para fins científicos ou culinários que se destaca pela produção de carne de alto valor biológico e baixo teor de gordura (MILES et al., 2004).

A ranicultura é uma atividade em expansão na América do Sul podendo ser considerada consolidada no Brasil, particularmente no Estado de Goiás. Nos últimos anos, transformou-se em uma atividade superintensiva e como consequência favoreceu ao aparecimento de doenças que constituem uma ameaça para a viabilidade técnica e econômica dos criatórios de organismos aquáticos (BONDAD-REANTASO & Subasinghe, 2008).

Diversas doenças com alta morbidade e mortalidade têm sido observadas em girinos e rãs. No entanto, os estudos dessas doenças são escassos, os produtores não tem conhecimento dos agentes etiológicos envolvidos e, consequentemente, das medidas profiláticas e terapêuticas apropriadas. Existe ainda, grande incerteza em relação às características dessas patologias em anfíbios devido aos sinais clínicos inespecíficos (CRAWSHAW, 1994); a etiologia pouco clara revelando a presença de diversos agentes oportunistas que atuam de forma conjunta, sendo que, na maioria das vezes, habitam o ambiente dos animais afetados; às condições particulares de manejo e alimentação artificial que, muito provavelmente, constituem causas predisponentes para transformação de um eventual agente comensal em um patógeno; e à falta de pesquisas sobre o tema dando continuidade aos estudos de casos (HIPÓLITO & BACH, 2002). Dentre as principais doenças diagnosticadas nos ranários comercias, encontram-se as produzidas por Ranavirus (Mazzoni et al., 2009).

Em um panorama mundial, desde o ano de 1980, as populações de anfíbios têm diminuído em escala global sendo que, em 2004, pelo menos 32% de todas as espécies foram classificadas como ameaçadas de extinção pela União Internacional para Conservação da Natureza (IUN) (Collins & Storfer, 2003; Stuart et al., 2004). Além de vários fatores bióticos e abióticos, vírus do gênero Ranavirus têm sido implicados nesta crise ecológica (Daszak et al., 1999).

No Reino Unido as epidemias de Ranavirus proporcionaram um declínio em longo prazo das populações de rãs da espécie Rana temporaria (TEACHER et al., 2010). Esses vírus já foram identificados em outras espécies como Bufo bufo (Hyatt et al., 2000; Duffus & Cunningham, 2010), Alytes obstetricans e Lissotriton vulgaris (Duffus & Cunningham, 2010). Além dos declínios em longo prazo, casos de mortalidade em massa têm sido registrados em diversos países. O primeiro caso comprovado de mortalidade em massa associado à Ranavirus na Europa continental ocorreu na Espanha no ano de 2007, em Alytes obstetricans (Balseiro et al., 2009).

Em Portugal, o primeiro caso de mortalidade em massa associada à Ranavirus foi reportado em 2003 em tritões das espécies Triturus marmoratus e T. boscai (Alves de Matos et al., 2008). Outros eventos foram relatados na Croácia (Fijan et al., 1991), Dinamarca (Ariel et al., 2009), Itália (Ariel et al., 2010) e Holanda (KIK et al., 2011). No Brasil, o primeiro caso de mortalidade em massa associada à Ranavirus foi diagnosticado em 2005 em fazendas de criação de rãs da espécie Rana catesbeiana no estado de Goiás (MAZZONI et al., 2009).

A ocorrência de mortalidade em massa associada à Ranavirus é provavelmente, causada pela interação de vários fatores como a cepa viral, a espécie afetada, a imunidade do hospedeiro, fatores de estresse antropogênico e a introdução de cepa viral (GRAY et al., 2009). Entre os fatores de estresse antropogênico, pode-se citar a perda e degradação do habitat, o aumento no número de espécies invasoras, a poluição, a utilização intensiva de terras para fins agropecuários, a chuva ácida e o aquecimento global (GAHL & CALHOUN, 2010).

A ameaça de disseminação do Ranavirus para animais aquáticos resultou na exigência de sua notificação obrigatória pelos países membros da Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e, caso ocorra algum diagnóstico, há que se implementar as normas da OIE para limitar a sua propagação (BAYLEY et al., 2013).

Os Ranavirus são membros da família Iridoviridae, consistem em grandes vírus (120-300nm) icosaédricos cujo genoma é organizado em forma de DNA de fita dupla de tamanho variável de acordo com a espécie (102 a 212 Kb) com 55% de G+C que codifica de 92 a 211 proteínas. O vírion é constituído por três estruturas concêntricas: uma cápside proteica externa, uma membrana polipeptido-lipídica intermediária e um núcleo central contendo um complexo de DNA e proteínas (Figura 1). A família Iridoviridae é composta atualmente por cinco gêneros: os que infectam uma grande variedade de vertebrados (Ranavirus, Megalocytivirus, Lymphocystivirus) e os que infectam invertebrados (Chloriridovirus, Iridovirus) (Chinchar et al., 2005; Jancovich et al., 2011).

Figura 1 - Estrutura celular das partículas virais das espécies do gênero Ranavirus.

Fonte: http://viralzone.expasy.org/ (adaptado). Acesso em: 20/01/2014.

Todos os gêneros da família Iridoviridae expressam a proteína principal da cápside (MCP) que possui peso molecular de aproximadamente 50 kDa, cujas propriedades moleculares são utilizadas para caracterização e identificação de espécies (CHINCHAR et al., 2005).

De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV), atualmente existem 6 espécies relacionadas ao gênero Ranavirus: Ambystoma tigrinum virus, Bohle iridovirus, Epizootic haematopoietic necrosis virus, European catfish virus, Santee-Cooper ranavirus e Frog Virus 3 (FV3) (ICTV, 2014). O FV3 foi isolado primeiramente na América do Norte a partir de um tumor renal de uma rã-leopardo (Rana pipiens) assintomática (Granoff et al., 1966). Sabe-se até o momento, que o FV3 possui temperatura de replicação ótima variando de 26 a 30ºC, com máxima de 33ºC apesar de já ter sido diagnosticado em diversos países em condições adversas e, em alguns casos, levando à mortalidade de até 90% em populações de rã touro americanas (Gravell & Granoff, 1970). Os vírions do FV3 podem existir em duas formas distintas: não envelopada com 120-180nm de diâmetro e envelopada, a qual o adquire a partir da membrana plasmática da célula do hospedeiro. Além do envelope, alguns iridovírus expressam fibrilas que se estendem a partir das subunidades do capsídeo (DEVAUCHELLE et al., 1985; WILLIAMS, 1996).

Os vírions não envelopados são compostos por três camadas distintas, um capsídeo externo formado por múltiplas cópias de MCP, uma membrana lipídica interna derivada de retículo endoplasmático e uma membrana nuclear que envolve o genoma viral e proteínas associadas (DEVAUCHELLE et al., 1985; YAN, et al., 2009). Apesar de o conteúdo proteico do vírion ser composto por aproximadamente 40% de MCP, outras 36 proteínas já foram identificadas por meio da análise de vírions purificados (JANCOVICH et al., 2011). Destas, três proteínas desempenham papel importante quanto à estabilização viral: as proteínas “finger”, “zip” e “anchor” (YAN et al., 2011). As proteínas “finger” e “zip” atuam promovendo ligação entre os capsômeros e as proteínas “anchor” são transmembrânicas se estendendo até a membrana lipídica interna. Além destas três proteínas, uma suposta proteína de ácido mirístico localizada na fase de leitura aberta 53R do FV3 interage com fragmentos da membrana celular do hospedeiro e desempenha papel importante na replicação viral nas fases de síntese das cápsulas proteicas e produção das unidades virais (WHITLEY et al., 2010).

Apesar de ambas as formas envelopada e não envelopada apresentarem infectividade, os vírus envelopados são mais específicos (Braunwald et al., 1979; Braunwald et al., 1985). Em relação à forma de entrada na célula do hospedeiro, partículas virais envelopadas entram por endocitose mediada por receptores e uma proteína fibrosa denominada clatrina. A clatrina confere estabilidade à vesícula que é formada por depressão na membrana plasmática e transportada para o interior da célula. Por outro lado, as formas não envelopadas entram na célula hospedeira por meio de fusão da membrana plasmática (Gendrault et al., 1981; Braunwald et al., 1985).

Após o desencapsulamento, o genoma viral é transportado ao núcleo da célula hospedeira onde ocorre a primeira etapa do processo replicativo. Os primeiros transcritos virais denominados “precoces imediatos” têm como molde o próprio DNA do vírion e utilizam a enzima RNA polimerase II do hospedeiro. Já os transcritos “precoces tardios” utilizam apenas o DNA do vírion como molde (GOORHA et al., 1978; WILLIS et al., 1984). Um dos produtos dos transcritos precoces imediatos é a DNA polimerase viral, a qual catalisa a síntese de genoma viral no interior do núcleo (GOORHA, 1982).

Em seguida, o DNA viral sintetizado é transportado para o citoplasma, onde é metilado por uma metiltransferase codificada pelo vírus e serve de molde para a transcrição e tradução das proteínas estruturais para a formação dos vírions descendentes. Posteriormente ocorre a montagem dos vírions que podem sair da célula por gemulação através da qual adquirem um invólucro derivado do hospedeiro, ou por lise, podendo também acumular-se no citoplasma em arranjos paracristalinos (Goorha, 1978; Goorha et al., 1982) (Figura 2).

FIGURA 2 – Replicação viral do Frog Vírus 3.

Fonte: CHINCHAR et al. (2011) (adaptado).

Apesar do genoma do FV3 possuir um intervalo curto de fases de leitura aberta, algumas regiões não codificam proteínas virais. A maioria dessas regiões são sequências de repetições de “TAAT” e “CAAT” que se localizam antes ou depois das fases de leitura aberta. No entanto, o genoma não possui regiões de íntrons e já foram identificadas 98 fases de leitura aberta que codificam mais de 50 aminoácidos. Dessas, 84 possuem homologia com outros iridovirus que infectam vertebrados ou insetos, 14 são exclusivas de FV3 (6R, 7R, 13R, 18L, 30R, 42 L, 43R, 44R, 54L, 61L, 64R, 65L, 66L, e 98R) e apenas 2 (54L, 64R) demonstram domínios conservados com homologia a proteínas já conhecidas (Figura 3) (TAN et al., 2004).

FIGURA 3 – Representação linear das fases de leitura aberta do genoma do FV3.

Fonte: TAN et al. (2004) (adaptado).

Além do FV3, outras espécies de Ranavirus reconhecidas pelo ICTV têm sido implicadas como responsáveis por epidemias em anfíbios na Europa, Américas e Ásia (Wolf et al., 1968, Cunningham et al., 1996; Zupanovic et al., 1998; Weng et al., 2002). Além de sua importância epidemiológica, esta espécie vem sendo utilizada como padrão nos estudos dos iridovírus, uma vez que possui o genoma completo sequenciado (TAN et al., 2004).

A infecção por Ranavirus pode manifestar-se sob a forma de morte súbita ou diversos sinais clínicos podendo ainda variar de acordo com a espécie animal afetada e com o estágio de desenvolvimento dessa espécie. Em salamandras adultas, já foram relatados anorexia, dermatite vesicular e ulcerativa, hemorragias na pele, edema intramuscular e subcutâneo, úlceras e hemorragias gastrintestinais e necrose em tecidos hepáticos, renais, linfoides e hematopoiéticos (Bollinger et al., 1999; Docherty et al., 2003; Pasmans et al., 2008).

Em um estudo de infecção experimental em anfíbios adultos do gênero Xenopus, após a injeção de 5107 UFP (unidades formadoras de placa) da espécie FV3, os animais desafiados apresentaram baixa mortalidade (10% em 2 meses) acompanhada de edema e hemorragias difusas em diversos órgãos. Os sobreviventes à dose testada demonstraram sinais temporários de perda de apetite, eritema cutâneo nas pernas e troca de pele com desaparecimento dos sintomas em algumas semanas (GANTRESS et al., 2003).

Em maio de 2006, os girinos de uma fazenda de produção de rã localizada nos Estados Unidos sofreram mortalidade em massa e as alterações patológicas em todos os animais pós-metamorfose foram semelhantes. Foram relatadas alterações macroscópicas como manchas irregulares cinzentas na pele, eritema cutâneo e entérico, coração e rins tigrados, fígados pálidos e friáveis e vesículas biliares dilatadas. O exame histológico mostrou depleção linfóide e necrose no timo e em outros tecidos linfoides, necrose do fígado, baço e epiderme. Corpúsculos de inclusão citoplasmáticos dispersos foram observados no baço e degeneração epitelial nos túbulos renais. Algumas bactérias estavam presentes nas lesões dérmicas, glomérulos e vasos renais e, raramente, no baço ou sinusóides hepáticos (MILLER et al., 2007).

No Brasil, MAZZONI et al. (2009), estudando rãs da espécie Rana catesbeiana relataram diminuição no consumo de ração, letargia, perda da habilidade de nadar, movimentos erráticos na parte superior dos tanques, caquexia, palidez e distensão abdominal frequente. A autópsia de girinos com distensão abdominal revelou a presença de fluidos preenchendo toda a cavidade, fígado pálido, rins congestos e hemorragias distribuídas em outros órgãos. A análise histológica possibilitou identificar graus variados de danos nos tecidos e necrose celular sobre grandes áreas de tecido danificado principalmente nos rins, fígado e baço. Os rins foram os órgãos mais afetados com grandes áreas de necrose evidenciando picnose e cariorrexe associada a infiltrado inflamatório difuso, na sua maioria composta de linfócitos e eosinófilos. O fígado também apresentou necrose com picnose e cariorrexe, áreas de esteatose, hepatócitos vacuolizados e infiltrado linfocitário. No baço, o mesmo padrão de lesões foi observado. Não foram identificadas bactérias ou fungos nas lesões histológicas.

Especialmente no estado de Goiás, existem duas patologias que atualmente afetam o ciclo produtivo nos ranários. A primeira se manifesta em girinos de até 30 dias levando a alta taxa de mortalidade e já foi relacionada à presença de Iridovírus do gênero Ranavirus (MAZZONI et al., 2009). A segunda acomete rãs em todas as fases desde a pós-metamorfose até animais no ponto de abate. Na fase pós-metamórfica os animais apresentam-se caquéticos e de 10 a 50% da população desenvolve um quadro crônico caracterizado clinicamente por sinais nervosos como falta de coordenação e posturas anormais. Apesar do quadro com sintomatologia nervosa, algumas rãs conseguem se alimentar e continuam crescendo lentamente, sendo que poucas recuperam a condição normal. As rãs apresentam perda de peso que pode variar de moderada a intensa, com a consequente perda econômica. Apesar de a doença ter sido reportada em quase todos os ranários do Brasil (MAZZONI, 2006), até o momento não há um estudo que consiga demonstrar as causas, patogenia e possíveis formas de profilaxia e tratamento.

As infecções virais são conhecidas por desempenhar um papel direto ou indireto na causa de inúmeros distúrbios do equilíbrio. Em humanos, a infecção por Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV) já foi associada a disfunções do aparelho vestibular levando à manifestação clínica de sintomas como vertigem e falta de coordenação. Essa manifestação clínica pode ser atribuída à própria anatomia do sistema vestibular e do aparelho auditivo. Como exemplo, a cóclea e o órgão vestibular constituem o labirinto membranoso onde compartilham os mesmos fluidos denominados endolinfa e perilinfa. Além disso, suas fibras nervosas juntas constituem o VIII par de nervos cranianos (vestibulococlear) (HEINZE et al., 2011).

Em gatos, Parzfall et al. (2010) analisaram 50 amostras da região vestibular e do labirinto por PCR em tempo real e identificaram 14% de amostras positivas para herpes virus felino tipo 1, indicando associação do vírus com o quadro clínico de disfunção vestibular.

O aparelho vestibular é o conjunto de órgãos do ouvido interno dos vertebrados e, em anfíbios, é composto por três canais semicirculares, três órgãos sensoriais da mácula (utrículo, lagena e sáculo), e dois órgãos papilares (papila basilar e papila anfíbio) de cada lado (Straka & Dieringer, 2004).

Diferente do que ocorre em mamíferos, em anfíbios estes órgãos sensoriais não estão localizados em um labirinto ósseo, mas em um espaço cartilaginoso com todos os órgãos claramente visíveis ao microscópio. Tal como em todos os outros animais vertebrados estes órgãos labirínticos são inervados por fibras aferentes do VIII par de nervos cranianos (vestibulococlear) (DE Burlet, 1929).

No que se refere aos danos à região do ouvido interno ou ao sistema vestibular, esses tipos de lesão podem resultar em uma síndrome complexa que se correlaciona com os quadros clínicos de falta de coordenação, postura anormal e desvio da cabeça para os lados esquerdo ou direito diagnosticado nas rãs dos ranários do estado de Goiás. Sinais aferentes vestibulares bilaterais de canal semicircular e órgãos otolíticos são essenciais para a estabilização do olhar, o controle da postura e locomoção, bem como para os aspectos cognitivos de equilíbrio, orientação espacial e homeostase vegetativa. A perda unilateral de entradas sensoriais vestibulares pode fazer com que ocorra uma atividade desequilibrada ao longo das vias centrais e em circuitos que estão envolvidos no processamento de sinal vestibular. Como consequência desse desequilíbrio, aparecem sintomas comportamentais como nistagmo, assimetria postural e instabilidade do olhar (Olabi et al., 2009; Dutia, 2010; Smith et al., 2010).

Isto posto e considerando a relevância do tema, objetivou-se com o presente estudo contribuir para elucidação da síndrome vestibular em Rana catesbeiana/Lithobates catesbeianus associada à Ranavirus – patologia que acomete rãs de criação na fase de pós-metamorfose – por meio do emprego de métodos de diagnóstico como técnicas histopatológicas, PCR em tempo real, microscopia eletrônica e imunohistoquímica.

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CAPÍTULO 2 – Detecção de Ranavirus por PCR em tempo real em Rana catesbeiana (shaw, 1802) e em outras espécies que habitam o entorno dos ranários

Resumo: O gênero Ranavirus é pertencente à família Iridoviridae, reconhecido por infectar uma variedade de animais vertebrados. Desde o ano de 2009, faz parte das doenças de notificação obrigatória dos países membros da OIE. Segundo a OIE, são métodos para diagnóstico de Ranavirus: microscopia, isolamento e identificação, métodos imunoenzimáticos associados à histopatologia e métodos moleculares. O presente estudo teve o objetivo de propor um método de detecção de Ranavirus por PCR em tempo real e monitorar sua disseminação para outras espécies que habitam o entorno dos ranários de Goiás. Foram colhidas 91 amostras em ranários da zona rural do estado de Goiás sendo 50 de rãs sem sintomatologia clínica e 41 de rãs com sequelas nervosas. Do total, 63/91 (69,2%) foram positivas e 28/91 (30,8%) negativas. Das 41 provenientes de rãs com alteração de postura, 34 (83%) foram positivas e 7 (17%) negativas. Por outro lado, de 50 amostras de rãs sem sinais clínicos, 29 (58%) foram positivas e 21 (42%) negativas. Quanto aos pontos de colheita, ocorreu maior frequência de positividade em cérebro (100%), fígado (85,7%), baço (85,7%) e rim (72,55%). Diante dos resultados obtidos, conclui-se que a frequência de Ranavirus em rãs com sintomatologia nervosa é superior à frequência em rãs sem sintomatologia clínica, indicando associação do quadro clínico com a presença do vírus. A detecção de Ranavirus em animais que habitam o entorno dos ranários do estado de Goiás indica que o vírus encontra-se disseminado nos ranários amostrados e a detecção em peixes revela necessidade de monitoramento da disseminação do vírus.

Palavras-chave: Diagnóstico, Alteração de postura, Sintomatologia nervosa.

CHAPTER 2 - Ranavirus detection by real-time PCR in Rana catesbeiana and other species surrounding frog farms

Abstract: Viruses of the genus Ranavirus belong to the family Iridoviridae and are recognized by infecting a variety of vertebrates. It is part of the mandatory reporting of OIE member countries diseases since 2009. According to the OIE, Ranavirus diagnostic methods comprise direct microscopy, isolation and identification, immunoenzymatic methods associated with histopathology and molecular methods. This study aimed to propose a method for detecting Ranavirus by real-time PCR and to monitor its spread to other living species near the frog farms of Goiás. In this study, 91 samples were collected from frog farms in the countryside of the state of Goiás and examined for the presence of Ranavirus. Of these, 50 frogs were without clinical symptoms and 41 with nerve sequelae characterized by lack of coordination, abnormal posture with lordosis, varying degrees of scoliosis and head tilt to the left or right. Of the total, 63/91 (69.2%) were positive and 28 /91 (30.8%) negative. Of the 41 frogs with nerve sequelae, 34 (83%) were positive, and 7 (17%) negative. Moreover, of 50 samples without clinical signs, 29 (58%) were positive and 21 (42%) negative. A higher frequency of positivity was detected in brain (100 %), liver (85.7%) , spleen (85.7%) and kidney (72.55%). This findings reveal that the frequency of ranavirus in frogs with neurological symptoms is higher than in frogs without clinical symptoms, indicating association of clinical findings with the presence of Ranavirus. The detection of Ranavirus in animals living near the frog farms in the state of Goiás indicates that the virus is spread in the environment and Ranavirus detection in fish samples reveals the need for monitoring the spread of the virus.

Keywords: Diagnostics, Posture change, Nerve Symptoms.

INTRODUÇÃO

O gênero Ranavirus é um dos cinco pertencentes à família Iridoviridae reconhecido por infectar uma grande variedade de animais vertebrados (Chinchar et al., 2005; Jancovich et al., 2011). São vírus grandes e icosaédricos que estão relacionados a inúmeros casos de mortalidade em massa em diversos países, especialmente em anfíbios (Green et al., 2002; Jancovich et al., 2003; Johnson et al., 2008; Miller et al., 2011).

Desde o ano de 2009, em virtude da possibilidade de disseminação de Ranavirus para animais aquáticos, a notificação de surtos por esse agente é obrigatória nos países membros da Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e, caso ocorra alguma notificação, há que se implementar as medidas de contenção dispostas nas normas oficiais para limitar a sua propagação (BAYLEY et al., 2013).

No Brasil, o primeiro caso de mortalidade em massa associado a Ranavirus foi diagnosticado no ano de 2006 no estado de Goiás (Galli et al., 2006). Posteriormente, a origem do vírus foi associada à importação de rãs-touro norte-americanas no início das atividades de ranicultura devido à alta semelhança genética entre as cepas isoladas e a cepa americana (MAZZONI, et al., 2009). Desde então, poucos estudos foram desenvolvidos no sentido de monitorar a presença e disseminação do vírus tanto no ambiente dos ranários quanto nos seus arredores. MAZZONI, (2006) relatou que em ranários do Brasil animais na fase pós-metamórfica desenvolvem um quadro crônico caracterizado clinicamente por sinais nervosos como falta de coordenação e posturas anormais, mas sem relação comprovada com vírus do gênero Ranavirus.

De acordo com o manual de doenças de animais aquáticos da OIE, há diversos métodos para detecção de vírus do gênero Ranavirus: detecção direta por microscopia, isolamento e identificação em cultura celular, detecção por métodos imunoenzimáticos associados à histopatologia e métodos moleculares. Entre os métodos moleculares, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é um dos métodos oficiais que pode ser utilizado isoladamente ou em associação com análise por enzimas de restrição para diferenciar Ranavirus que infectam peixes e anfíbios (Harp & Petranka, 2006). Como é considerada uma metodologia rápida, a PCR está substituindo progressivamente outros métodos de screening e até mesmo testes confirmatórios para vários agentes infecciosos (Jaramillo et al., 2012).

A PCR em tempo real é capaz de monitorar a reação à medida que ela acontece e já foi demonstrado que sua sensibilidade supera a convencional em até 100 vezes, desempenhando papel importante na identificação de estágios subclínicos de diversas doenças (Getchell et al., 2007; Pallister et al., 2007). Vários trabalhos foram realizados com o objetivo de padronizar técnicas de PCR em tempo real para detecção de Ranavirus em diferentes espécies (Picco et al., 2007; Jaramillo et al., 2012; Rimmer et al., 2012; Allender et al., 2013). No entanto, até o momento não se padronizou nenhuma técnica para detecção de Ranavirus em amostras de rã da espécie Rana catesbeiana no Brasil. Entre os protocolos disponíveis, pode-se apontar melhorias na escolha dos iniciadores por repetição de bases nitrogenadas, posição 5' com bases de ligação fraca como adenina ou timina (Picco et al., 2007; Allender et al., 2013), e protocolos baseados na utilização de SYBR® Green (Jaramillo et al., 2012; Rimmer et al., 2012) que podem ser melhorados pela escolha de sondas específicas.

A PCR tem sido utilizada para avaliar a ocorrência de Ranavirus em anfíbios (Brunner et al., 2004; Pallister et al., 2007). No entanto, os resultados dependem, entre outros fatores, da quantidade de DNA viral circulante no anfíbio hospedeiro e do tipo de tecido testado (Greer & Collins, 2007; St-Amour & Lesbarrères, 2007). Sabe-se que com a evolução do quadro de infecção por Ranavirus os anfíbios apresentam necrose tecidual em órgãos como o fígado. Por esse motivo, amostras de fígado são comumente usadas nos testes para avaliar a presença de Ranavirus (St-Amour & Lesbarrères, 2007; Green et al., 2010).

Alguns estudos têm investigado a frequência de resultados positivos de PCR para ranavirus quando amostras são coletadas por métodos letais ou não letais (Greer & Collins, 2007; St-Amour & Lesbarrères, 2007). Entre os métodos de coleta não letais sugeridos encontram-se a amostragem de dedos (St-Amour & Lesbarreres, 2007), que pode levar à inflamação e necrose tecidual diminuindo a expectativa de vida e a colheita de aspirado hepático ou sanguíneo que, apesar de ser um método invasivo, não é letal (Cunningham et al., 2008). Apesar do avanço no sentido de inovar os métodos de coleta de amostras, até o momento nenhum estudo correlacionou a sintomatologia clínica nervosa com a presença de ranavirus.

O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de propor um método rápido de detecção de Ranavirus - baseado na técnica de PCR em tempo real – em rãs clinicamente sadias e em rãs enfermas com sinais nervosos, bem como de monitorar a disseminação desse agente para outras espécies de animais que habitam o entorno dos ranários do Estado de Goiás.

MATERIAL E MÉTODOS

Colheita de amostras

Foram colhidas 91 amostras de rãs adultas da espécie Rana catesbeiana distribuídas aleatoriamente em 2 ranários localizados nas zonas rurais de Hidrolândia – GO e de Anápolis – GO. Dessas, 50 eram provenientes de rãs sem sintomatologia clínica e 41 de rãs com quadro de sequelas nervosas caracterizado por falta de coordenação, postura anormal com lordose, diversos graus de escoliose e desvio da cabeça para os lados esquerdo ou direito.

Para avaliar a possibilidade de disseminação de Ranavirus para outras espécies animais habitantes do entorno dos ranários, foram colhidas, aleatoriamente, 57 amostras provenientes de pererecas, cobra, lagartixa, sapos, peixes, outros girinos e rã manteiga (Leptodactylus ocellatus) sem sintomas clínicos aparentes. Rãs da espécie Rana catesbeiana, bem como os animais de outras espécies foram sacrificados mediante o emprego de clorofórmio (SPEARE, 1989) ou insensibilizados por concussão craniana e sacrificados por meio de corte da medula cervical (AVMA, 1993). Amostras de pulmão, fígado, rim , baço, intestino, cérebro, estômago, gônadas, pele e sangue foram preservadas em álcool 97ºGL em temperatura ambiente e encaminhadas ao Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (LBM/CPA/EVZ/UFG) para pesquisa de Ranavirus por PCR em tempo real.

Técnica de PCR em tempo real

As amostras foram processadas para extração de DNA seguindo o protocolo para tecidos do High Pure PCR Template Preparation Kit® (ROCHE Diagnostics). Todos os procedimentos foram realizados em cabine de fluxo laminar vertical classe II após higienização e pré-esterilização com luz ultravioleta por 30 minutos. De cada amostra de tecido, uma porção de 50mg foi retirada com auxílio de tesoura e pinça esterilizada e colocada em tubo de polipropileno de 1,5 mL. Adicionou-se 200µL da solução Tissue Lysis Buffer (Uréia 4M, Tris 200mM, NaCL 20mM, EDTA 200mM, pH=7,4) e 40µL de proteinase K (25mg) reconstituída com 4,5 mL de água destilada e incubou-se a 55ºC por 1 hora.

Em seguida, foram adicionados 200µL de Binding Buffer (Guanidina-HCl 6M, Uréia 10mM, Tris-Hcl 10mM, Triton 20%, pH=4,4) e homogeneizou-se vigorosamente incubando-se a 70ºC por 10 minutos. Adicionou-se 100µL de isopropanol e transferiu-se todo o conteúdo do tubo de polipropileno para um novo tubo composto por um microtubo com filtro e um tubo coletor. Posteriormente, centrifugou-se os tubos por um minuto a 8.000 x g. Descartou-se a porção inferior do tubo e o microtubo com filtro foi recolocado em um novo tubo coletor adicionando-se 500µL de Inhibitor Removal Buffer (Guanidina HCl 5M, Tris-Hcl 20mM, pH=6,6). Repetiu-se a centrifugação por um minuto a 8.000 x g. Descartou-se a porção inferior do tubo e o microtubo com filtro foi recolocado em um novo tubo coletor adicionando-se 500µL de Wash Buffer (NaCl 20mM, Tris-Hcl 2mM, pH=7,5). Repetiu-se a centrifugação por um minuto a 8.000 x g. Descartou-se a porção inferior do tubo e o microtubo com filtro foi recolocado em um novo tubo coletor adicionando-se 500µL de Wash Buffer. Repetiu-se a centrifugação por um minuto a 8.000 x g. Descartou-se a porção inferior do tubo e o microtubo com filtro foi recolocado em um novo tubo de polipropileno de 1,5mL adicionando-se 200µL de Elution Buffer (Tris-Hcl 10mM, pH=8,5). Repetiu-se a centrifugação por um minuto a 8.000 x g.

Após a extração, uma alíquota de 1 μL do DNA de cada amostra foi submetido à avaliação da concentração e qualidade do DNA extraído utilizando equipamento NanoPhotometer® (IMPLEN) que realiza leitura nos comprimentos de onda de 260 e 280nm. As amostras com DNA foram diluídas com tampão T.E (Tris-Hcl 10mM, EDTA, 1mM) para atingir concentração máxima de 50ng/µL.

Para detecção específica do DNA do gênero Ranavirus foram desenhados os iniciadores FVF 5' GAGCGTCACCCTCTCATTC 3' e FVR 5' GCGTCCAGGTATGCCGTG e a sonda FVP 5' FAM-CGACATCAGCGCCCAGTC-MGB 3' que anelam entre as posições 345 e 407 do gene MCP que codifica a proteína principal da cápside (número de acesso GenBank DQ897669.1) e fornecem um produto de amplificação de 63 pb. Atualmente existem 3 protocolos para detecção de vírus do gênero Ranavirus por PCR em tempo real, sendo que os iniciadores e as sondas foram desenhados entre as posições 157 e 210 (ALLENDER et al., 2013), 1214 e 1307 (JARAMILLO et al., 2012) e 1298 e 1367 (PICCO et al., 2007) do gene MCP. A MCP é atualmente a proteína mais estudada e que tem sido utilizada para comparação de distâncias genéticas entre os ranavírus isolados (Chinchar et al., 1997; Hyatt, et al., 2000) devido a existência de um número de nucleotídeos aparentemente estável entre os vírus (Tidona et al., 1998).

Os iniciadores e a sonda foram desenhados com auxílio do software Primer express® (Applied Biosystems) e testados in silico quanto a especificidade utilizando as ferramentas Primer BLAST / Nucleotide BLAST do National Center for Biotechnology Information (NCBI). O protocolo de PCR em tempo real foi padronizado para reação com volume final de 20µL utilizando-se sempre 4 controles negativos (2 controles com IPC DNA e 2 Block), controle positivo interno (IPC) em todas as reações, TaqMan® Universal Master Mix 1x (Applied Biosystems), primers a 900mM, sonda a 250 nM e 2µL de DNA total. O protocolo de amplificação seguiu as recomendações dispostas no Quadro 1 utilizando-se o equipamento StepOne Plus® (Applied Biosystems).

QUADRO1 – Protocolo de amplificação utilizado nas reações de PCR em tempo real.

Etapa

Tempo

Temperatura

Pré-PCR

1 minuto

60ºC

Desnaturação Inicial

10 minutos

95ºC

40X

Desnaturação

15 segundos

95ºC

Anelamento

1 minuto

60ºC

Pós-PCR

1 minuto

60ºC

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Detecção do DNA de vírus do gênero Ranavirus por PCR em tempo real

Os dados de amplificação foram obtidos e analisados por meio do equipamento “StepOne Plus” da Applied Biosystems. Após o término da reação, o gráfico emitido pelo software foi analisado em conjunto com o controle positivo interno (IPC) da reação (Figura 1). A inclusão do IPC nas reações confirma o rendimento de todos os reagentes e previne a ocorrência de resultados falsos negativos decorrentes da possível presença de inibidores

FIGURA 1 – Curva de amplificação da reação de detecção de DNA de Ranavirus.

Ao analisar os dados dispostos na Tabela 01 relativos ao resultado da PCR em tempo real para o gênero Ranavirus verifica-se que das 41 amostras provenientes de rãs com alteração de postura testadas, 34 (83%) foram positivas e apenas 7 (17%) negativas. Por outro lado, de 50 amostras oriundas de rãs sem sinais clínicos aparentes, apenas 29 (58%) foram positivas e 21 (42%) negativas. Estes resultados dão suporte à suspeita de MAZZONI, (2006) de que em Goiás existe uma doença severa, que cursa com alta morbidade e mortalidade, e que acarreta significativos danos econômicos à ranicultura.

TABELA 01 – Frequência de Ranavirus em amostras de rãs com ou sem sintomatologia clínica nervosa.

Resultados PCR em tempo real

Amostras

Positivos

Negativos

Total

Rãs sem sinais clínicos

29a (58%)

21a (42%)

50

Rãs com alteração de postura

34b (83%)

7b (17%)

41

Total

63 (69,2%)

28 (30,8%)

91

*Letras diferentes na mesma coluna representa diferença estatística significativa (p<0,05).

Nota-se também na Tabela 1 que há uma maior frequência de positividade para Ranavirus em amostras provenientes de rãs com alteração de postura para o lado esquerdo ou direito e com sintomatologia nervosa, do que em amostras de rãs sem sinais clínicos aparentes, ao teste não paramétrico do Qui-quadrado (p<0,05). Estes resultados reforçam a suspeita de associação do Ranavirus com a sintomatologia clínica nervosa relatada por MAZZONI (2006) e revelam que o gênero Ranavirus encontra-se disseminado nos animais provenientes dos ranários amostrados e, provavelmente, em estágios diferentes de infecção viral nos animais estudados. Do total de amostras analisadas, 63/91 (69,2%) foram positivas para o gênero Ranavirus e apenas 28/91 (30,8%) negativas. Provavelmente, a disseminação do vírus está associada à alta densidade populacional nas baias onde as rãs são alimentadas durante a fase de crescimento e engorda (Figura 2).

FIGURA 2 – Baia de engorda de rãs em um ranário do estado de Goiás com superlotação.

Da análise dos dados contidos na Tabela 2 depreende-se que há disseminação do Ranavirus para outras espécies animais que habitam o entorno dos ranários. De 56 amostras analisadas, 11 (19,29%) foram positivas ao Ranavirus e 45 (80,71%) negativas, o que reforça a preocupação dos países membros da OIE em se tomar medidas preventivas para evitar a disseminação de Ranavirus para outros animais que podem atuar como reservatório do vírus (Gray et al., 2009). Nota-se que entre os 11 animais positivos, encontram-se espécies como pererecas (9/23), lagartixa (1/3) e peixe (1/20). Até o ano de 1982 foram notificadas infecções por iridovírus apenas em peixes e anfíbios. Desde então Ranavirus têm sido detectado em várias espécies de répteis. Várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas no sentido de esclarecer se anfíbios servem como fonte de infecção ou se répteis com infecção sem sintomatologia clínica e o ambiente servem como reservatório (LATNEY & KLAPHAKE, 2013).

Por sua vez, FORZÁN & WOOD (2013) em um estudo epidemiológico de Ranavirus em sapo da espécie Lithobates clamitans do Canadá, analisaram diferentes amostras, tais como, fígado, rim, sangue e extremidade distal dos dedos, mas nenhuma foi positiva, sugerindo que estes animais não são indicadores sentinelas da presença ou ausência da doença em uma determinada área.

Entre os animais que compuseram o universo amostral do presente estudo, a presença do vírus em uma amostra proveniente de tilápia é preocupante, uma vez que a mortalidade em massa de peixes poderia afetar seriamente a piscicultura goiana. Apesar de esses dados serem preocupantes, Ranavirus têm sido isolados em outros países de animais aparentemente assintomáticos (TAPIOVAARA et al., 1998) ou até mesmo causando baixa mortalidade (WHITTINGTON et al., 1994).

TABELA 02 – Frequência de Ranavirus em amostras de animais que habitam os arredores dos ranários.

Resultados PCR em tempo real

Amostras

Positivos

Negativos

Total

Perereca

9 (47,3%)

14 (52,7%)

23

Cobra

0 (0,0%)

2 (100%)

2

Lagartixa

1 (33,33%)

2 (66,67%)

3

Sapo

0 (0,0%)

3 (100%)

3

Peixe

1 (5,0%)

19 (95,0%)

20

Rã Manteiga

0 (0,0%)

5 (100%)

5

Total

11 (19,29%)

45 (80,71%)

56

RICHTER et al. (2013) detectaram Ranavirus em 70% de salamandras da espécie Notophthalmus viridescens nos Estados Unidos e chamam a atenção para a participação dessa espécie na epidemiologia da doença pois possuem o hábito de se movimentar entre zonas de alta umidade o que pode levar a disseminação do vírus para outros anfíbios ou animais suscetíveis (Porej et al., 2004; Hunsinger & Lan-noo, 2005; Hoverman et al., 2011).

DUFFUS et al. (2013) avaliaram a presença de Ranavirus em diferentes estágios de desenvolvimento de sapos comuns da espécie Rana temporaria revelando que no Reino Unido a infecção afeta predominantemente adultos (26%) e raramente girinos (0,3%).

Em um estudo realizado em lagos de New Jersey, MONSEN-COLLAR et al. (2013) detectaram Ranavirus em 24/114 (21,05%) dos girinos testados utilizando-se a técnica de PCR convencional. Quando esses autores compararam os resultados da PCR convencional com os resultados da técnica de PCR em tempo real, verificaram que a PCR em tempo real conseguiu detectar 32/114 (28,07%) girinos positivos para Ranavirus, sugerindo que a PCR em tempo real seja a técnica de escolha quando se espera baixa quantidade de DNA.

No ano de 2011, STOHR et al. (2013), associaram casos de mortalidade em massa, anorexia e ulcerações na pele de 11 tritões importados da região do lago Úrmia no Irã com infecção por Ranavirus. Estes resultados reforçam a necessidade de se preocupar com a disseminação de Ranavirus para ambientes silvestres e de se identificar os diferentes hospedeiros e lesões associadas para evitar casos futuros de mortalidade em massa.

Em relação aos diferentes pontos de colheita de amostras para a pesquisa de Ranavirus por PCR em tempo real, verifica-se na Tabela 3 que há maior frequência de amostras positvas em cérebro (100%) seguido de fígado (85,7%), baço (85,7%) e rim (72,55%). Este é o primeiro relato da presença de Ranavirus em cérebro de rã reforçando a suspeita de seu envolvimento com a sintomatologia clínica de falta de coordenação e posturas anormais identificada nos animais dos ranários do estado de Goiás como foi relatado por MAZZONI (2006).

TABELA 03 – Frequência de Ranavirus de acordo com o ponto de colheita das amostras nas rãs.

Resultados PCR em tempo real

Amostras

Positivos

Negativos

Total

Rim

10 (72,55%)

4 (28,5%)

14

Fígado

18 (85,7%)

3 (14,3%)

21

Baço

12 (85,7%)

2 (14,3%)

14

Cérebro

8 (100%)

0 (0,0%)

8

Testículo

2 (40,0%)

3 (60,0%)

5

Ovário

0 (0,0%)

5 (100%)

5

Sangue

5 (31,2%)

11 (68,8%)

16

Pulmão

2 (100%)

0 (0,0%)

2

Intestino

1 (100%)

0 (0,0%)

1

Estômago

3 (100%)

0 (0,0%)

3

Perna e Pele

2 (100%)

0 (0,0%)

2

Total

63 (69,2%)

28 (30,8%)

91

CONCLUSÃO

· A frequência de Ranavirus em rãs com sintomatologia nervosa é superior à frequência de Ranavirus em rãs sem sintomatologia clínica aparente, indicando associação do quadro clínico com a presença do vírus;

· Vírus do gênero Ranavirus encontram-se disseminados nos ranários amostrados e em diferentes animais que habitam os arredores desses ranários;

· A detecção de Ranavirus em peixes revela necessidade de monitoramento da disseminação do vírus para evitar casos de mortalidade em massa em outras espécies.

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CAPÍTULO 3 – Ranavirus EM Lithobathes catesbeianus COM QUADRO CLÍNICO DE SÍNDROME VESTIBULAR

Resumo: Os Ranavirus pertencem a um grupo de vírus emergentes da família Iridoviridae caracterizados por infectar vários hospedeiros suscetíveis como peixes, anfíbios e répteis. No Brasil, rãs na fase pós-metamórfica desenvolvem um quadro clínico nervoso caracterizado por falta de coordenação e posturas anormais. Até o momento, esse quadro clínico não possuía relação comprovada com Ranavirus. Foram colhidas 60 amostras de rãs da espécie Rana catesbeiana de ranários do estado de Goiás sendo 30 de rãs com quadro clínico similar à síndrome vestibular e 30 assintomáticas, com o objetivo de identificar o agente por meio de técnicas de diagnóstico como microscopia eletrônica de transmissão, anatomohistopatologia e imunohistoquímica. À anatomohistopatologia foram identificadas lesões inflamatórias com necrose e infiltrado mononuclear linfocitário nas regiões posteriores do encéfalo, cerebelo e plexo coroide, com meningoencefalite, regiões de gliose, e focos necróticos com abundantes macrófagos e restos celulares associados a infiltrados inflamatórios. As mesmas lesões foram observadas nos canais semicirculares e aparelho vestibular. A imunohistoquímica revelou a presença de marcação positiva na região do plexo coroide. As imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão de amostras de rim e fígado demonstraram partículas virais com características semelhantes à dos Ranavirus. A partir destes resultados, conclui-se que as lesões descritas na anatomohistopatologia, associadas à sintomatologia nervosa de caráter vestibular indicam fortemente a presença de Ranavirus. À imunohistoquímica, a presença de marcação positiva na região do plexo coroide, associada às lesões descritas na anatomohistopatologia, confirma a presença de Ranavirus. A presença de partículas virais em amostras de fígado e rim, associada às lesões de tipo inflamatória na região do sistema nervoso central posterior, com extensão para o ouvido interno e médio, também confirmam a presença de Ranavirus em rãs de criação de ranários do estado de Goiás, Brasil.

Palavras-chave: anatomohistopatologia, microscopia eletrônica de transmissão, imunohistoquímica.

CHAPTER 3 – Ranavírus IN Lithobathes catesbeianus WITH VESTIBULAR SYNDROME

Abstract: Ranaviruses belong to a group of emerging virus characterized by infect susceptible hosts such as fish, amphibians and reptiles. In Brazil, frogs in post metamorphic phase develop a nervous clinical condition characterized by lack of coordination and abnormal postures. To date, this clinical symptoms had no proven relationship with Ranavirus. In this study, 60 samples of bullfrogs from frog farms in the state of Goiás were collected in order to identify the agent by transmission electron microscopy, histopathology, and immunohistochemistry. Of these, 30 frogs were asymptomatic and 30 were clinically similar to vestibular syndrome. At histopathology, inflammatory lesions with necrosis and mononuclear lymphocytic infiltrate in the posterior regions of the brain, cerebellum and choroid plexus with meningoencephalitis, regions of gliosis, and necrotic foci with abundant macrophages and cellular debris associated with inflammatory infiltrates were identified. The same lesions were observed in the semicircular canals and the vestibular apparatus. Immunohistochemistry showed the presence of positive staining in the choroid plexus region. The images obtained from kidney and liver samples by transmission electron microscopy showed viral particles with similar characteristics to that of ranavirus.This findings reveal that the lesions described in histopathology, associated with neurological vestibular symptoms strongly indicate the presence of ranavirus. For immunohistochemistry, the presence of positive staining in the choroid plexus, associated with the lesions described in histopathology confirms the presence of Ranavirus. The presence of viral particles in liver and kidney samples, associated with inflammatory lesions in the posterior type contral nervous system region extending to the middle and inner ear, also confirm the presence of Ranavirus in frogs from frog farms of the state of Goiás, Brazil.

Keywords: anatomohistopathology, transmission electron microscopy, immunohistochemistry..

INTRODUÇÃO

O gênero Ranavirus pertence a um grupo de vírus emergentes da família Iridoviridae caracterizado por infectar uma variedade de hospedeiros suscetíveis como peixes, anfíbios e répteis (CHINCHAR, 2002; CHINCHAR et al., 2005). São reconhecidos como patógenos de grande importância por serem agentes das doenças notificáveis aos países membros da Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE). De acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV), 6 espécies compreendem o gênero Ranavirus: Ambystoma tigrinum virus, Bohle iridovirus, Epizootic haematopoietic necrosis virus, European catfish virus, Santee-Cooper ranavirus e Frog Virus 3 (FV3) (ICTV, 2014). Consistem em grandes vírus (120-300nm) icosaédricos cujo genoma é organizado em forma de DNA de fita dupla de tamanho variável de acordo com a espécie (102 a 212 Kb) com 55% de G+C que codifica de 92 a 211 proteínas. (JANCOVICH et al., 2011).

De acordo com o manual de doenças de animais aquáticos da OIE, há diversos métodos para diagnóstico de vírus do gênero Ranavirus. Entre os presuntivos, pode-se citar o estudo epidemiológico da doença com suspeita de mortalidade em massa associada à sintomatologia clínica (hemorragias, úlceras na pele ou necrose distal dos membros).Pode-se citar também, a histopatologia. Nesse método, amostras de rim, fígado ou tecido hematopoiético podem ser coletadas para análise. Em lâminas coradas por Hematoxilina-eosina podem ser observadas: presença de hiperplasia epidermal com necrose, necrose focal e presença ou ausência de inclusões intracitoplasmáticas. Entre os métodos confirmatórios, podem ser utilizados os métodos moleculares (PCR), a imunohistoquímica e a microscopia eletrônica. Nesta, busca-se evidenciar vírions no citoplasma de células infectadas (OIE, 2007)

A utilização de microscopia eletrônica de transmissão para o estudo de microrganismos teve seu auge entre os anos de 1970-1980 quando vários novos vírus foram identificados (CURRY et al., 2006). Essa técnica revolucionou, em vários aspectos, os estudos da microbiologia, uma vez que sua resolução permitiu um aumento de até 1000 vezes em termos de resolução em relação ao microscópio de luz branca comum (Kruger et al., 2000). A técnica foi utilizada em diversos estudos de Iridovírus com a finalidade de avaliar o efeito dos vírus em linhagens de células (MA et al., 2013), assim como a caracterização estrutural e dos efeitos citopáticos (ALLENDER et al., 2013; CHEN et al., 2013) e identificação viral (CHEN et al., 2013).

Doenças causadas por Ranavirus estão frequentemente associadas a eventos de mortalidade em massa e já foram notificadas em diversos países do mundo (Gray et al., 2009). Apesar de fatores relacionados a mudanças climáticas terem maior probabilidade de serem a mais importante ameaça para as populações de anfíbios, doenças infecciosas também desempenham um papel importante no seu declínio (Daszak et al., 1999).

No Brasil, o primeiro caso de mortalidade em massa associado a Ranavirus foi diagnosticado no ano de 2006 no estado de Goiás (Galli et al., 2006). Posteriormente, a origem do vírus foi associada à importação de rãs-touro norte-americanas. Devido à alta semelhança genética entre as cepas isoladas e a cepa americana (MAZZONI et al., 2009), MAZZONI (2006) relata que em ranários do Brasil, animais na fase pós-metamórfica desenvolvem um quadro crônico caracterizado clinicamente por sinais nervosos como falta de coordenação e posturas anormais. No entanto, para o autor, esse quadro não possuía relação comprovada com vírus do gênero Ranavirus.

Objetivou-se com o presente estudo identificar – por meio do emprego das técnicas de microscopia eletrônica de transmissão, anatomohistopatologia e imunohistoquímica – o agente envolvido nos quadros clínicos crônicos, similares à síndrome vestibular, caracterizada por sinais nervosos como falta de coordenação e postura anormal que afetam rãs na fase pós-meta