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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
Biodestoxificação do Farelo de Mamona (Ricinus communis L.)
Karine Claudia Alessi
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação
em Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso,
Campus Universitário de Sinop, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em Zootecnia.
Área de concentração: Zootecnia.
Sinop, Mato Grosso
Fevereiro de 2015.
1
KARINE CLAUDIA ALESSI
Biodestoxificação do Farelo de Mamona (Ricinus communis L.)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Zootecnia da Universidade Federal
de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop,
como parte das exigências para a obtenção do título
de Mestre em Zootecnia.
Área de concentração: Zootecnia.
Orientador: Prof. Dr. André Soares de Oliveira
Sinop, Mato Grosso
Fevereiro de 2015.
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
2
3
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DEDICATÓRIA
Dedico este importante trabalho ao meu marido Paulo, que esteve sempre presente.
Obrigado pelo apoio e companherismo. Esta conquista também é sua.
5
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Mato Grosso/Campus Sinop, pela oportunidade de
realização do curso de mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso, Fapemat- Capes-
Cnpq pela concessão da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização
desta pesquisa.
À minha mãe Marilei pelas palavras de apoio, você é um anjo que Deus colocou
em minha vida para me mostrar o caminho certo. Ao meu pai e meu irmão meu muito
obrigada.
Ao meu marido Paulo pela paciência, amor e carinho durante toda essa etapa,
obrigada mesmo por estar ao meu lado, como pessoa maravilhosa que você é.
Ao meu orientador Pesquisador Dr. André Soares de Oliveira, pelas
contribuições, na realização do projeto, bem como oportunidade de convivência, pelos
exemplos de seriedade e profissionalismo.
À Professora Drª. Márcia Rodrigues Carvalho Oliveira pelo apoio, ensinamento
e amizade durante esses anos.
Aos membros da banca Márcia Rodrigues Carvalho Oliveira e Rafael Ferreira
Alfenas por aceitarem participar da banca de defesa desta dissertação.
Às minhas amigas queridas Márcia Cristina de Souza, Guiomar Helena Verussa,
Lidiane Staub, Daiane Caroline de Moura e Daniela Constantine obrigado por estarem
presentes neste dia tão importante e mais ainda obrigado pela sua amizade.
Ao grupo de pesquisa em bovino de leite pelo auxilio na realização deste
experimento.
Aos colegas de curso pela parceria e convivência nesses anos.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente colaboraram para realização desse
trabalho, obrigada.
6
RESUMO
ALESSI, Karine Claudia. Dissertação de Mestrado (Zootecnia), Universidade Federal
de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, fevereiro de 2015, 67 f
Biodestoxificação do Farelo de Mamona (Ricinus communis L.). Orientador: Prof.
Dr. André Soares de Oliveira. Coorientadora: Profa. Dra. Márcia Rodrigues Carvalho de
Oliveira.
A presença da proteína tóxica ricina limita o uso do farelo e torta de mamona na
alimentação animal. Assim, objetivou-se desenvolver um novo processo de
biodestoxificação da ricina, e avaliar seu efeito sobre a composição química do farelo
não tratado para uso na alimentação animal. Para desenvolver o processo de
destoxificação, 30 amostras de 1 kg de farelo de mamona não tratado (contendo ricina e
com 40% de proteína bruta, base da matéria seca) foram distribuídas em um
delineamento experimental inteiramente casualizado, com seis procedimentos de
biodestoxificação e cinco repetições. A avaliação da eficácia de destoxificação da ricina
foi realizada por meio de eletroforese em gel SDS-PAGE, utilizando colorações com
Coomassie Blue Brilhant e com nitrato de prata. Dos seis procedimentos de
biodestoxificação testados, em apenas um ocorreu o completo desaparecimento das duas
sub unidades de ricina (29 e 36 kDa, aproximadamente) do gel. Foi enviado pedido de
depósito de patente deste método ao Escritório de Inovação Tecnológica da UFMT e ao
INPI (Processo EIT: 23108.704545/14-4; Oliveira A.S. et al. 2014). Por questões de
proteção de propriedade intelectual os procedimentos de biodestoxificação não foram
apresentados. O método proposto de biodestoxificação causou perdas de apenas 2,95%
de matéria seca (P<0,001) do farelo de mamona, e reduziu (P<0,001) o pH do farelo de
mamona não tratado (de 6,0 para 4,4). Todavia, não afetou os teores de matéria seca
(P=0,913), matéria orgânica (P=0,864), fibra em detergente neutro (P=0,640), proteína
bruta (P=0,983), extrato etéreo (P=0,274), nitrogênio insolúvel em detergente neutro
(P=0,192) e nitrogênio insolúvel em detergente ácido (P=0,149) do farelo de mamona
não tratado. O tratamento de biodestoxificação desenvolvido é eficaz na inativação da
ricina e não ocasiona perdas na composição química do farelo de mamona.
7
ABSTRACT
ALESSI, Karine Claudia. Dissertação de Mestrado (Zootecnia), Universidade Federal
de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, fevereiro de 2015, 67 f. .
Biodestoxificação do Farelo de mamona (Ricinus communis L.). Adviser: Prof. Dr.
André Soares de Oliveira. Co-adiviser: Prof. Dra. Márcia Rodrigues Carvalho de
Oliveira.
The presence of toxic protein ricin limits the use of bran and castor bean meal in
animal feed. Thus, the aim was to develop a new biodestoxificação process of ricin, and
to evaluate its effect on the chemical composition of untreated meal for use in animal
feed. To develop the detoxification process, 30 samples of 1 kg of untreated castor meal
(containing ricin and 40% crude protein, dry matter basis) were distributed in a
completely randomized design with six biodestoxificação procedures and five
replicates. The efficacy of detoxification of ricin was performed by electrophoresis on
SDS-PAGE using Coomassie Blue staining and Bright silver nitrate. Biodestoxificação
procedures of the six tested occurred in only one complete disappearance of the two
bands of ricin (29 and 36 kDa approximately) the gel. Was sent patent application of
this method to deposit Innovation Office of UFMT and the INPI (Case EIT:
23108.704545 / 14-4; Oliveira AS et al 2014.). By intellectual property protection issues
biodestoxificação the procedures were not presented. The proposed method
biodestoxificação caused losses of only 2.95% of dry matter (P <0.001) of castor meal,
and reduced (P <0.001) the pH of the untreated castor meal (6.0 to 4.4 ). However, did
not affect the dry matter (P = 0.913), organic matter (P = 0.864), neutral detergent fiber
(P = 0.640), crude protein (P = 0.983), ether extract (P = 0.274), nitrogen neutral
detergent insoluble (P = 0.192) and acid detergent insoluble nitrogen (P = 0.149) of
castor meal untreated. Treatment of biodestoxificação developed is effective in the
inactivation of ricin and does not cause losses in the chemical composition of castor
meal
8
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................9
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A cultura da Mamona (Ricinus communis L.)...............................................12
2.2 Processo de extração do óleo.........................................................................14
2.3 Caracterização nutricional e tóxica do farelo de mamona............................15
2.4 Metodos de destoxificação............................................................................24
2.4.1 Metodos químicos de destoxificação...........................................25
2.4.2 Metodos físicos de destoxificação...............................................26
2.4.3 Métodos biológicos de destoxificação.........................................26
2.5 Farelo de mamona destoxificado na alimentação animal..............................28
2.6 Metodos de detecção da ricina.......................................................................30
2.7 Eletroforese em gel de poliarilamida SDS-Page...........................................31
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................36
4. Biodestoxificação do de farelo de mamona (Ricinus communis l.)
Resumo..................................................................................................................42
Palavras-chave.......................................................................................................43
Introdução..............................................................................................................45
Materiais e métodos...............................................................................................49
Resultados e Discussão..........................................................................................53
Conclusões.............................................................................................................53
Referênciasbibliográficas………………………………………………………...53
Anexo I....................................................................................................................56
9
1. INTRODUÇÃO GERAL
A alimentação representa o principal componente dos custos de produção na
pecuária. Assim, há necessidade de pesquisas que visem à diminuição dos mesmos. A
utilização de coprodutos agroindustriais na alimentação animal representa uma
alternativa para minimização de custos de produção, bem como reduzir o passivo
ambiental da produção agropecuária, pois diversos coprodutos não são eficientemente
aproveitados (Oliveira et al., 2010a).
Algumas oleaginosas não convencionais são potencialmente exploráveis para a
produção de óleo e outros fins industriais devido à maior produtividade de óleo por
unidade de superfície em determinadas condições edafoclimáticas. Entre estas, a
cultura da mamona (ricinnus communisLl.) se destaca pela adaptabilidade as condições
de clima e solo brasileiro (Conab, 2008). Os coprodutos da semente de mamona podem
ser uma alternativa de fontes tradicionais de proteína, mas atualmente o principal uso da
torta ou farelo de mamona tem sido como fertilizante orgânico controlador de
nematóides (Oliveira, 2008).
A presença de um composto tóxico (ricina), de um alcalóide (ricinina) e de
complexos alergênicos (albuminas 2S), bem como a carência tecnológica que propicie a
obtenção de um alimento seguro com preços competitivos, foram comumentes
apontados como principais fatores que impedem a sua adoção na alimentação animal
(Oliveira et al, 2010a). O principal composto tóxico que impede o uso dos coprodutos
da mamona na alimentação animal é a ricina e sua toxicidade é conhecida há mais de
um século, mas somente no final da década de 1980 seu mecanismo de ação em células
eucarióticas foi melhor elucidado (Endo & Tsuguri, 1987; Endo et al., 1987; Endo &
Tsuguri, 1988).
10
Na década de 1960, a Sociedade Algodoeira do Nordeste Brasileiro (SANDRA)
desenvolveu um processo de destoxificação aplicável em escala industrial (Matos,
1976). A partir deste estudo, outros métodos físico-químicos de destoxificação foram
desenvolvidos e com 100% de eficácia na completa desnaturação da ricina (Anandan et
al., 2005; Oliveira et al.,2007).
O farelo de mamona destoxificado por meio do tratamento alcalino com 6% CaO
desenvolvido por Oliveira et al. (2007) foi amplamente testado em ruminantes (Oliveira
(2008); Guimarães et al., 2009; Costa et al.,2009; Diniz et al., 2010; Barros et al., 2011;
Conbianchi et al., 2012). No entanto, o desenvolvimento de métodos biológicos de
destoxificação podem tornar o processo menos laborioso, mais seguro e com menor
impacto ambiental.
A utilização de processos biológicos para inativação da ricina em produtos da
mamona já foi descrito em publicação de não patentes Godoy et al., (2009) e de patentes
(WO2013020189A1), mas utilizando fungos cultivados e com adição de meios de
cultivos complexos, o que aumentam os custos operacionais para obtenção do alimento
para ração animal. Entretanto, os processos de biodestoxificação acima descritos são
laboriosos, pois exigem cultivos prévios de fungos e adoção de meios de cultivos
complexos que podem limitar a adoção no método de destoxificação na indústria de
ração animal e em propriedades rurais.
Assim, faz-se necessário desenvolver novos métodos biológicos, com outros
organismos mais facilmente cultivados e com uso de meios de cultivos mais simples.
Além disso, é necessário avaliar os efeitos dos processos de biodestoxificação sobre o
valor alimentício do farelo de mamona para uso na alimentação animal.
Considerando a importância da destoxificação completa da torta ou do farelo de
mamona para segurança no consumo pelos animais, recomenda-se uma análise rápida
11
quanto à presença de ricina que ateste a atoxicidade a cada processo de destoxificação
(Furtado et al., 2011). A eletroforese em gel (SDS-PAGE) consiste em ferramenta
analítica amplamente utilizada na separação e identificação de proteínas, devido à
relativa simplicidade, rapidez e alto valor informativo (Mandarino & Almeida, 2004).
Além disso, é um método validado que permite avaliar indiretamente a toxidade da
ricina em animais (Oliveira et al., 2010a) e microrganismos (Oliveira et al., 2010b).
Desta forma, objetivou-se avaliar a eficácia de destoxificação do farelo de mamona
por meio de novos processos de biodestoxificação (Pedido de patente, processo EIT:
23108.704545/14-4; Oliveira A.S. et al. 2015) e seu efeito sobre a composição química
do farelo de mamona.
O artigo escrito no Capítulo 2 seguirá as normas de formatação da Revista
Brasileira de Zootecnia.
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A cultura da Mamona (Ricinus communis L.)
A mamoneira (Ricinus communis L.) é uma planta pertencente à família
Euforbiácea, a mesma da mandioca, da seringueira e do pinhão manso. É originária
provavelmente da África ou da Índia, sendo atualmente cultivada em diversos países do
mundo, sendo a Índia, a China e o Brasil, em ordem decrescente, os maiores produtores
mundiais (Almeida et al.,2010).
No Brasil a mamona foi trazida pelos portugueses com a finalidade de utilizar
seu óleo para iluminação e lubrificação dos eixos das carroças. O clima tropical e
predominante no Brasil, facilitou o seu alastramento. Assim, hoje podemos encontrar a
mamoneira em quase toda extensão territorial, como se fosse uma planta nativa e em
cultivos destinados à produção de óleo.
Os frutos da mamoeira, em geral, possuem espinhos. As sementes apresentam-se
com diferentes tamanhos, formatos e grande variabilidade de coloração (Figura 1 b).
Destas, extrai-se o óleo de mamona ou rícino, que contém 90% de ácido ricinoléico, o
fato que representa uma fonte praticamente pura deste ácido graxo, fato raro na
natureza. Esse componente confere ao óleo de mamona ampla gama de aplicação
industrial, inclusive como fonte alternativa de combustível, tornando a cultura da
mamoneira importante potencial econômico e estratégico ao País ( Filho, 1995).
Existem diferentes variedades de cultivares, destacando na figura 1 a) a variedade
IAC80 cultivar de frutos deiscentes, porte alto, altura média de 2,50 a 3,50 m e ciclo
vegetativo de 240 dias.
13
Figura 1. a) Variedade IAC 80 de mamona em avaliação no Rio Grande do Sul. Fonte:
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/; b) Exemplo da diversidade de cores,
tamanhos e tipos de semente de mamona
Foto: Arquivo Embrapa Algodão, disponível em:< http://www.cnpa.embrapa.br/produtos/mamona/sementes.html>
O teor de óleo das sementes de mamona pode variar de 35 a 55% (Vieira et al.,
1998), mas a maior parte das cultivares plantadas comercialmente no
Brasil possuem teor de óleo variando entre 45 % e 50 % (Freire et al., 2006).
Os frutos semi-deiscentes, quando secos, se abrem com facilidade, porém alguns
frutos retém a casca, formando o que denominamos de “marinheiro” ou “dente de alho”.
Esses frutos se abrem facilmente, quando secos, se forem batidos com varas ou chicote
de borracha. Esse é o procedimento mais usado nos estados do nordeste, onde a colheita
e parte do descascamento é realizado de forma manual (Freire et al., 2006).
O líder na produção mundial de mamona é a Índia com mais de 1.600.000
toneladas em 2012, de acordo com dados da FAO, colocando-se bem acima da
produção chinesa de 170 mil toneladas, à moçambicana com 62 mil toneladas e da
produção brasileira que despencou após mais um ano de seca, atingindo mais de 25 mil
toneladas (Conab, 2014).
A produção de mamona no Brasil de 2005 até 2012 teve uma queda
significativa. Dados do IBGE 2012 mostram que do ano 2011 para o ano de 2012 a
b) a)
14
redução foi de 38,3 %, reduzindo de 203.513 para 125.510 hectares plantados, sendo
que as regiões centro-oeste, norte e sul não apresentaram nenhuma produção
significativa de mamona (baga). O estado com maior produção é a Bahia, com cerca de
90 % da produção nacional. O preço recebido pela saca de 60 kg da mamona variou de
R$ 90,00 a R$ 130,00 no estado da Bahia (Conab 2014).
Com a divulgação do "7º Levantamento de Avaliação da Safra 2013/14", estima-
se grande aumento, tanto na área quanto na produção de mamona. Tais valores são
puxados pela retomada de produção na Bahia, que concentra grande percentual da
produção no Brasil e que sofreu uma grande quebra na safra passada, ou seja, é mais
uma recuperação que um crescimento, propriamente dito.
2.2 Processo de extração do óleo
Os processos de extração podem ser divididos em sistemas mecânico e químico.
No sistema mecânico, as prensas hidráulicas consistiram no processo industrial pioneiro
de extração de óleo. Em razão da baixa eficiência de extração foram gradualmente
substituídas por prensas tipo expeller, desenvolvidas no final da década de 1900, os
quais constituem atualmente no processo majoritário de extração mecânico de óleo. O
processo químico utiliza solventes orgânicos que possibilita maximizar a extração de
óleo das sementes (Hayward, 1937; Gallup et al., 1950; Evangelista et al., 2004).
Denomina-se de torta o produto resultante da extração mecânica e farelo
resultante da extração química. A torta obtida da extração por prensa hidráulica
apresenta maior teor de óleo e conseqüentemente, menor teor de proteína em relação
àquela resultante da extração por prensa tipo expeller, além de maior variabilidade. O
farelo, por ser obtido de um processo mais eficiente de extração de óleo, contém menor
teor de extrato etéreo e conseqüentemente, maior teor de proteína bruta (Oliveira, 2008)
(Tabela 1).
15
Tabela 1 - Teores de extrato etéreo e proteína bruta de produtos obtidos por diversos
métodos de extração de óleo em sementes de mamona
Item Método de extração de óleo
Prensa hidráulica Expeller Solvente
Proteína bruta (% da MS) 28,5 - 30,5 33,7 - 35,0 37,3 – 40,0
Extrato etéreo (% da MS) 13,4 – 23,1 8,0 3,1
Fonte: Evangelista et al. (2004); Oliveira (2008).
A utilização de tortas de oleaginosas apresenta como principais desvantagens em
relação aos farelos, o maior risco de rancificação e maior limitação de inclusão nas
dietas (Oliveira et al., 2010a). Reconhecidamente, níveis de extrato etéreo acima de 6 %
na dieta (base da matéria seca) comprometem a digestibilidade da fibra, a ingestão de
nutrientes e o desempenho de ruminantes (NRC, 2001).
2.3 Caracterização nutricional e tóxica do farelo de mamona
O teor de óleo das sementes de mamona pode variar de 35 a 55 % (Vieira et al.,
1998), mas a maior parte dos cultivares plantados comercialmente no Brasil possui teor
de óleo variando entre 45% e 50% (Freire et al., 2006). Apesar da alta toxidade da
semente da mamona, o óleo de mamona não é tóxico, pois a ricina não é solúvel em
lipídios, permanecendo todo o componente tóxico na torta ou no farelo (Gaillard &
Pepin, 1999). O óleo de mamona é obtido da semente da planta Ricinus communis L. e
possui características químicas atípicas quando comparadas à maioria dos óleos
vegetais, pois além da presença do triglicerídeo do ácido ricinoléico, que é um ácido
graxo hidroxilado pouco freqüente nos óleos vegetais, este está presente numa faixa de
84 % a 91 % da sua composição. Na Tabela 2 é possível observar a composição média
do teor de ácidos graxos no óleo de mamona.
16
Tabela 2. Variação do teor de ácidos graxos no óleo de mamona
Ácido Graxo Teor (% AG total)
Ácido Ricinoléico 84,0-91,0
Ácido Linoléico 2,9-6,5
Ácido Oléico 3,1-5,9
Ácido Esteárico 1,4-2,1
Ácido Palmítico 0,9-1,5
Fonte: (Freire et al., 2006).
Os principais problemas encontrados no uso de óleos vegetais são a alta
viscosidade, composição ácida, quantidade de ácido graxo livre, assim como a formação
de goma devido a oxidação e polimerização durante a estocagem e combustão.
Consequentemente, diversos estudos foram realizados procurando desenvolver o uso de
derivados de óleos vegetais que aproximam as propriedades e o desempenho ao do
diesel derivado do petróleo (Ferrari et al.,2005).
De acordo com Azevedo & Lima (2001) a torta de mamona apresenta elevado teor
protéico, e dependendo das condições de cultivo e da semente, para cada tonelada de
óleo extraída a produção é de 1,2 toneladas de torta.
A torta de mamona produzida atualmente no Brasil, grande parte, destina-se à
adubação orgânica, principalmente, para jardinagem, pois além de ser fonte de
nitrogênio, fósforo e potássio, age como controladora de nematóides do solo (Cândido
et al.,2008).
As sementes de mamona apresentam altos teores de extrato etéreo, entre 39,6 a
48,4 %, com base na matéria seca (MS). Em média, o farelo/torta corresponde por 55 %
do peso da semente, permitindo um rendimento aproximado de 1,2 toneladas de
farelo/torta para cada tonelada de óleo extraído. Ambos apresentam-se como alimentos
concentrados protéicos, correspondendo entre 70 a 80 % do teor de proteína bruta (PB)
17
do farelo de soja. Na tabela 3 observa-se a composição química do farelo solvente e
expeller de mamona. O farelo de mamona pode ter alto teor de cutina (devido à
presença de cascas e envoltórios de natureza rígida da semente), o que explica a menor
degradação ruminal da MS em relação ao farelo de soja e farelo de algodão (Oliveira et
al., 2010a).
Tabela 3. Composição química do farelo de mamona solvente e expeller
Itens
Farelo de mamona
solvente expeller
Matéria seca (MS, %) 88,09 89,00
Extrato etéreo (% da MS) 3,14 7,98
Proteína bruta (PB, % da MS) 37,32 33,70
Nitrogênio não protéico (% do NT) 22,27 29,61
Nitrogênio insolúvel em detergente neutro(% do NT) 17,60 12,49
Nitrogênio insolúvel em detergente ácido (% do NT) 4,85 6,77
FDNcp (% da MS) 46,50 48,30
Cutina (% da MS) 25,26 27,39
Lignina (% da MS) 4,52 4,29
Cinzas (% da MS) 9,82 6,92
Cálcio (% da MS) 0,78 0,72
Fósforo (% da MS) 0,68 0,84
Degradabilidade ruminal efetiva da proteína bruta (% da PB) 58,901 -
Degradabilidade ruminal efetiva da MS (% da MS) 38,241 -
Digestibilidade intestinal da proteína não degradada no rúmen
(%) 65,30 -
1/considerando taxa de passagem (kp) de 0,05 h
-1.
Fonte: Oliveira et al., 2010a
Na criação intensiva de ruminantes, os gastos com alimentação representam um
dos principais componentes do custo de produção, podendo oscilar entre 30 a 70 % dos
custos, dependendo da atividade e tipo de exploração. A busca de alimentos alternativos
18
e de baixo valor comercial, como os resíduos e subprodutos agrícolas, representa uma
forma de minimizar os gastos com alimentação (Cândido et al., 2008).
Apesar do potencial de utilização dos coprodutos da semente de mamona na
alimentação de ruminantes como substitutos de fontes tradicionais de proteína, a
presença de um composto tóxico (ricina), de um alcalóide (ricinina) e de complexos
alergênicos (albuminas 2S), bem como a carência tecnológica que propicie a obtenção
de um alimento seguro com preços competitivos, foram apontados como principais
fatores que impedem a sua adoção na alimentação animal (Severino, 2005).
A ricina é uma proteína solúvel encontrada principalmente no endosperma da
semente, não sendo detectada em outras partes da planta, como raízes, folhas e caules
(Bandeira et al., 2004). A Figura 2 apresenta a estrutura protéica em forma de fita da
ricina, onde ambas as cadeias monstran-se enoveladas. A fita A é um proteína globular
de 267 resíduos com um local de ligação, e a fita B é um haltere alongada com 262
resíduos com galactose em ambas as extremidades de ligação (Lord et al.,1994).
Figura 2. Estrutura da ricina. A cadeia A apresenta-se no canto superior direito como
uma fita trançada. O anel de adenina marca o local de fissura ativa.A cadeia B
apresenta-se como uma fita sólida. A lactose é mostrada em cada ligação extremidade
do péptido de dois domínios. Fonte: Lord et al.,1994.
A ricina se classifica como uma lecitina, componente do grupo das “proteínas
inativadoras de ribossomos”, compostas por duas subunidades de funções biológicas
19
distintas. A subunidade A inativa especificamente e irreversivelmente os ribossomos
eucarióticos, impedindo a síntese protéica. Já a subunidade B encontra-se ligada à
membrana celular e à subunidade A, e permite a entrada desta por endocitose para o
citosol (Olnes, et al., 1974; Endo & Tsurugi, 1988). Assim, se quebradas as ligações
entre as duas sub-unidades A e B, as partes resultantes não são tóxicas em células
eucarióticas (Figura 3.a) (Audi et al., 2005). Ainda na figura 3 a) observa-se o sítio
enzimático na subunidade A ( subunidade enzimaticamente ativa ) e o local de ligação
de resíduos de galactose na subunidade B. As duas subunidades são ligadas por pontes
dissulfeto.
A cadeia A inativa os ribossomos que participam do mecanismo de síntese de
proteína no interior da célula. No entanto, a cadeia A não apresenta mecanismo de
incorporação na célula e não é capaz de entrar nacélula eucariótica sozinha (Kim et al.,
2006).
Figura 3 a) Estrutura da ricina, destacando as duas subunidades (Audi et al.,2005).
Na membrana externa da célula, a subunidade B da ricina se liga aos
glicolipídeos e glicoproteínas de membrana e por endocitose por meio das vesículas de
membrana são transportadas para o interior da célula. No interior da célula a ricina (as
duas subunidades) são transportadas para os endossomos. A maior parte das moléculas
20
de ricina retornam para o exterior da célula por exocitose ou são degradadas nos
lissosomos (Figura 3 b) (Audi et al., 2005).
Figura 3 b) Esquema mostrando a entrada da ricina no meio intracelular (Audi et
al.,2005).
Algumas moléculas de ricina entram no complexo de Golgi e por transporte
retrogrado são transportadas até o retículo endoplasmático. Neste, ocorre a clivagem das
duas subunidades e apenas a subunidade A é translocada para o citosol da célula.
Destacando assim a importância da subunidade B que permite a entrada da subunidade
A da molécula de ricina até o citosol (Figura 3 c) (Audi et al., 2005).
Figura 3 c) Passagem da ricina do complexo de Golgi para o reticulo endoplasmático e
consequentemente o citosol da célula (Audi et al.,2005).
21
No citosol, a subunidade A da ricina inativa ribossomos por remoção da adenina
na posição 4324 do RNAr 28S da subnidade 60S. A depurinação do RNAr impede que
a proteína se ligue a fatores de alongamento, cessando a síntese de proteínas e causando
a morte celular. Uma única subunidade de ricina que entra no citosol pode inativar
aproximadamente 1500 ribossomos por minuto, levando a uma rápida inibição da
síntese protéica e morte celular (Figura 3 d) (Audi et al.,2005).
Figura 3 d) Ação da ricina na inativação dos ribossomos (Audi et al.,2005).
Em organismos procarióticos, a ricina nas formas intacta ou com as subunidades
isoladas não apresentaram efeitos tóxicos, mas polipeptídios ativos obtidos da hidrólise
da ricina por tripsina foram capazes de inibir a síntese protéica e o crescimento
microbiano de Escherichia coli (Hass-Kohn, 1980).
A microbiota ruminal é capaz de degradar a ricina (Oliveira et al., 2010b).
Todavia, a ricina intacta reduziu o crescimento microbioano ruminal, provavelmente
devido a presença de polipeptídios ativos obtidos da hidrólise microbiana da ricina
(Oliveira et al., 2010b). Entretanto, a ricina submetida ao tratamento alcalino com 60 g
de CaO/kg de farelo de mamona não afetou o crescimento microbiano ruminal (Oliveira
et al., 2010b). Desta forma, a completa inativação da ricina é necessária para otimizar o
uso do farelo de mamona na alimentação de animais ruminantes.
22
A quantidade de ricina presente na semente de mamona pode variar de acordo
com a glicosilação entre plantas de diferentes espécies de mamona, bem como entre
plantas da mesma espécie, como resultado da expressão multigênica (Fernandez (2010).
Em um levantamento realizado no banco de germoplasma dos Estados Unidos, foram
detectados níveis de ricina na mamona que variavam de 1,5 a 9,7 mg/g (Pinkerton et al.,
1999). As diferentes formas de ricina possuem alterações aparentes nas suas estruturas
primárias, o que pode resultar em diferentes níveis de toxicidade (Kumar et al., 2004).
Não existe na literatura casos de envenenamento por ingestão de ricina pura e
todos os casos clínicos relacionados ao envenenamento referem-se à ingestão de
mamona (Fernandez (2010). A dose média letal (DL50) em camundongos é de 30
mg/kg (8 frutos aproximadamente). No entanto, doses de ricina estimadas a partir do
número de frutos ingeridos podem dar falsas estimativas devido à variação no tamanho,
peso e umidade dos caroços, região, estação do ano e período vegetativo da planta na
época da colheita, intensidade de mastigação, idade e estado fisiológico do indivíduo
(Waller et al., 1965).
Os principais sintomas clínicos observados em ruminantes intoxicados por
sementes de mamona foram: anorexia, fraqueza muscular, salivação intensa, diarréia,
desidratação, midríase, hipotermia, recumbência, elevação dos níveis séricos de
nitrogênio-uréico, creatinina, creatina kinase e asparato aminotransferase 24-30 horas
após a ingestão e morte até 3 dias após a ingestão (Armién et al., 1996; Tokarnia &
Dobereiner, 1997; Aslani et al., 2007).
Ao avaliarem a relação entre a ingestão de ricina com toxidade sub-clínica,
reduções consumo, digestibilidade e sistema microbiano ruminal de ovinos, Oliveira et
al., 2010a não observaram sintomas clínicos de intoxicação nos animais apesar do maior
consumo de ricina para os ovinos que receberam dietas com farelo de mamona ou torta
23
de mamona sem tratamento alcalino. Assim, animais recebendo dietas contendo 15 %
de farelo de mamona (FM) ou torta de mamona (TM) não tratado não apresentaram
sintomas clínicos de intoxicação por ricina (correspondendo a 3g/kg peso corporal e
3,1g/kg de peso corporal de FM e TM). No entanto, há indícios de efeitos negativos no
consumo, digestibilidade e crescimento microbiano ruminal, mas sem alteração na
função hepática de ovinos recebendo farelo e torta de mamona não tratado. Os efeitos
negativos sobre o consumo pode estar relacionado com efeitos subclínicos sobre os
animais que receberam maiores doses de ricina (Oliveira et al., 2010a).
Em estudos com camundongos, a ricina ingerida na dose de 1 dose média letal
foi absorvida em um período de duas horas através do sistema linfático sanguíneo,
acumulando principalmente no fígado e baço. Após 24 horas de ingestão foram
detectadas alterações relacionadas à necrose de hepatócitos e congestão do parênquima
renal (Kumar et al., 2004). Alterações intestinais com lesão hemorrágica, bem como
apoptose celular são encontradas em humanos e animais após a morte (Challoner &
Mccarron, 1990).
Os níveis séricos de alanina amino transferase (ALT) e aspartato amino
transferase (AST) constituem em indicadores de função hepática, os quais se elevam na
ocorrência de lesão neste orgão e estão associados com ocorrência de intoxicação por
ricina em ratos e ovinos (Kumar et al., 2003; Aslani et al., 2007).
A ricinina é um alcalóide encontrado em todas as partes da planta, podendo ser
detectado desde as fases iniciais de desenvolvimento. Seu teor varia em função dos
componentes da planta, sendo maior nas folhas. As características genéticas, estresses
ambientais e teor de ricina nas sementes, esta negativamente correlacionado com o teor
de ricinina (Severino, 2005). Assim, em razão da baixa atividade tóxica associado à
24
pequena concentração nas sementes a ricinina não é considerado fator limitante para o
uso de farelos ou tortas de mamona na alimentação animal (Anandan et al., 2005).
As albuminas 2S compreendem classe distinta de proteínas de reserva
amplamente distribuídas em sementes de espécies oleaginosas (Youle et al., 1981).
Além da função de reserva de nutrientes para a semente, apresentam atividade inibitória
sobre enzimas α-amilase salivar humana e de insetos, propriedades antifúngicas e
alergênicas em humanos (Nascimento & Machado, 2006). Para o uso do farelo na
alimentação animal, as propriedades alergênicas, até o momento, não representam
grande entrave, pois somente se manifestam quando estes compostos são injetados ou
absorvidos pela respiração, o que só acontece se houver exposição a grandes
quantidades do produto em ambiente pouco ventilado (Bandeira et al., 2004).
Diante do que foi apresentado a ricina é considerado o principal fator limitante
para o uso dos co-produtos da extração de óleo de sementes de mamona na alimentação
animal (Anandan et al., 2005).
Os coprodutos da mamona apresentam potencial para uso na alimentação
animal. A torta e o farelo apresentam valor nutritivo superior ao da casca de mamona,
no entanto, apresentam maior risco de toxidez e alergenicidade. Deste modo faz-se
necessário desenvolver novos métodos de destoxificação de fácil aplicabilidade e baixo
custo (Oliveira (2008).
2.4 Métodos de destoxificação
O farelo e/ou torta de mamona podem ser utilizados na alimentação de
ruminantes desde que seja eliminado o efeito tóxico da ricina. O desenvolvimento de
métodos para inativação da ricina são estudados por décadas. Os métodos físicos,
químicos e atualmente métodos biológicos de destoxificação apresentaram-se como
eficazes no desaparecimento da ricina.
25
2.4.1 Métodos químicos de destoxificação
Tratamentos que possibilitem transformar o farelo de mamona num produto
destoxificado foram estudados, tendo-se obtido alguns resultados, embora não
conclusivos, utilizando-se vapor, etanol e hidróxidos (Borchers, 1949; Kodras et al.,
1949; Gardner et al., 1960).
Anadan et al. (2005) compararam a eficácia de diferentes químicos (tratamento
com hidróxido de cálcio, hidróxido de sódio, amônia, cloreto de sódio, formaldeído ou
tanino) na destoxificação da ricina em farelo de mamona. Dos métodos avaliados,
somente o tratamento com hidróxido de cálcio (40 g/kg de farelo de mamona)
provocaram completa desnaturação da toxina. O método consiste em incorporar uma
solução aquosa de hidróxido de cálcio ao farelo de mamona na dose de 40 g/kg, base da
matéria natural. Após permanecer por uma noite (12-18 horas) para ocorrer o processo
de destoxificação o material tratado é seco para posterior armazenamento e utilização.
Oliveira et al. (2007), utilizaram óxido de cálcio (CaO) no tratamento alcalino
do farelo de mamona devido ao menor custo e menor poder de corrosão quando
comparado ao hidróxido de cálcio utilizado por Anadan et al., (2005), visto que em
solução aquosa o oxido de cálcio de transforma em hidróxido de cálcio.
Ao avaliarem a eficácia de destoxificação da ricina por meio do tratamento do
farelo de mamona com hidróxido de cálcio nas doses de 20, 40 ou 60 g/kg, diluído ou
não em água e com óxido de cálcio nas dosagens de 20, 40 ou 60 g/kg, diluído ou não
em água, Oliveira et al. (2007) concluíram que o tratamento alcalino na dose de 60 CaO
gramas/kg de farelo, mostrou-se eficaz em desnaturar a ricina.
Fernandes (2011) testou 20 diferentes métodos de destoxificação química do
farelo de mamona utilizando hidróxido de Sódio, água e diferentes tempos de reação.
26
Ele concluiu que o hidróxido de sódio utilizado na proporção 1:34:84 de
NaOH:farelo:água é eficiente no processo de destoxificação do farelo de mamona.
2.4.2 Métodos físicos de destoxificação
Na década de 1960, a Sociedade Algodoeira do Nordeste Brasileiro (SANBRA)
desenvolveu processo de destoxificação do farelo de mamona, aplicável em escala
industrial, que proporcionou a obtenção de produto considerado seguro para a
alimentação animal (Matos, 1976). Este produto, apresentado como “Lex Protéico”, era
resultante do aquecimento do farelo de mamona em autoclave especial, com
temperatura máxima de processamento de 125 oC e pressão máxima de 2 kg/cm
2
(Matos, 1976).
Anadan et al. (2005) testaram ainda métodos físicos (autoclave, cozimento,
aquecimento, fervura e embebição) como metodos de destoxificação do farelo de
mamona. O uso da autoclave em 15 psi durante 60 minutos foi eficaz em desnaturar
100% da ricina do farelo de mamona.
Em trabalho de Oliveira et al. (2007) testando métodos físicos de destoxificação
do farelo de mamona concluíram que o tratamento proposto por Anadan et al., 2005
com autoclave em 15 psi durante 60 minutos ou com hidróxido de cálcio na dose de 40
g/kg de farelo não se confirmou no presente estudo. Os autores indicaram que somente
o tratamento com autoclave a 1,23 kg/cm2 (15 psi) durante 90 minutos foi eficaz no
desaparecimento da ricina. Fatores relacionados aos genótipos de mamona, processos de
extração de óleo, pureza dos agentes alcalinizantes, entre outros, podem explicar as
diferenças, embora esses fatores não estejam totalmente especificados em ambos os
trabalhos.
2.4.3 Métodos biológicos de destoxificação
27
O desenvolvimento de métodos biológicos de destoxificação dos coprodutos da
extração do óleo da mamona apresentam-se como uma alternativa menos onerosa e com
menor impacto sobre o meio ambiente quando comparado aos métodos físicos e
químicos.
A utilização de processos biológicos para inativação da ricina em produtos da
mamona já foi descrito em publicação de não patentes (Godoy et al. 2009) e de patentes
(WO2013020189A1), mas utilizando fungos cultivados e com adição de meios de
cultivos complexos, o que aumenta os custos operacionais para obtenção do alimento
para ração animal. Na publicação da patente WO2013020189A1 é descrito um processo
de fermentação em meio sólido de torta de mamona, com adição do fungo Paecilomyces
variotii e meio de cultivo à base de KH2PO4, NH4NO3; MgS04.7H20; 0,02 de
CaCI2.2H20; 0,004 de MnCI2.4H20; 0,002 de Na2Mo04.2H20 e 0,0025 de FeS04.7H20; e
10% de ácido tânico. Antes da fermentação, o fungo deve ser mantido em meio Batata
dextrose Agar (BDA) com suplemento de 0,2 % de ácido tânico e incubados em estufa a
30°C durante 72 horas.
Godoy et al. (2009) observaram que o cultivo do fungo filamentoso Penicillium
simplicissimum em estado sólido no farelo de mamona (com adição de meio de cultura à
base de carboidratos, proteínas, ácidos graxos e minerais) foi capaz de inativar a ricina e
reduzir os componentes alergênicos. Fernandez et al. (2010) utilizaram a fermentação
em estado sólido para destoxificar a torta de mamona, sendo este substrato utilizado
para o Aspergillus niger e com produção simultânea de lipases, concluiram que a torta
fermentada após ser testada para toxicidade em cultura de células Vero, foi eficiente
para a redução da ricina no material, alem de agregar valor através da produção de
lípases.
28
No entanto, os processos de biodestoxificação acima descritos são laboriosos
pois exigem cultivos prévios de fungos e adoção de meios de cultivos complexos, que
podem limitar a adoção no método de destoxificação na indústria de ração animal e em
propriedades rurais.
2.5 Farelo de mamona destoxificado na alimentação animal
Em razão da elevada oferta de “Lex Protéico”, nas décadas de 1960 e 1970
desenvolveram-se diversos trabalhos sobre a utilização do farelo de mamona
destoxificado na alimentação de vacas em lactação com produção abaixo de 10 kg/dia
de leite (Assis et al., 1962a; Assis et al., 1962b; Robb et al., 1974; Matos, 1976),
novilhas leiteiras (Miranda et al., 1961) e de bovinos de corte em confinamento
(Marion, 1967; Albin et al., 1968; Albin et al., 1969; Albin et al., 1970). No entanto,
observa-se, no presente momento, escasses de pesquisas sobre o uso do farelo de
mamona destoxificado na alimentação animal.
Desde então, a partir da década de 90, não foi mais possível encontrar dados de
trabalhos na literatura com a utilização da torta de mamona para alimentação animal no
Brasil. O motivo pelo qual a torta de mamona deixou de ser utilizada ainda não é
conhecido, mas provavelmente, ela tenha se tornado pouco competitiva em relação à
torta de algodão. Esta última estava disponível no mercado em grande quantidade e
apresentava um custo de produção mais baixo, já que não exigia tratamento prévio para
destoxificação (Severino, 2005).
Em razão da eficácia de destoxificação comprovada, do menor custo e da
facilidade operacional de destoxificação do farelo de mamona com 60 g de óxido de
cálcio/kg desenvolvido por Oliveira et al. (2007), foram realizados uma série de
experimentos com o objetivo de determinar níveis adequados de farelo/torta de mamona
destoxificado em dietas de ruminantes.
29
O farelo de mamona destoxificado por meio do tratamento alcalino com 6%
CaO desenvolvido por Oliveira et al. (2007) foi amplamente testado em ruminantes
Quadro 1.
Quadro 1. Recomendações sobre o uso do farelo de mamona destoxificado com 6%
CaO desenvolvido por Oliveira et al. (2007).
Autor Animal Recomendação
Guimarães et al.,2009 Novilhas leiteiras em
confinamento
Substituição total da mistura
de farelo de soja e o farelo de
trigo (72,6 % e 27,4 %) com
ganho de peso diário 800 g/dia
Costa et al.,2009 Vacas leiteiras em
confinamento
até 5 % na dieta (1/3 de
substituição do farelo de soja)
Diniz et al.,2010 Bovinos de Corte em
Confinamento
até 9 % na dieta (substituição
total à proteína do farelo de
soja)
Barros et al.,2011 Bovinos de Corte em Pastejo até 50 % no suplemento
concentrado (substituição total
do farelo de soja)
Cobianchi et al.,2012 Vacas leiteiras Substituição de até um terço
do farelo de soja em dietas
para vacas leiteiras com
produção de 20 kg/dia
Diniz et al. (2010) avaliaram o efeito da substituição do farelo de soja pelo farelo
de mamona tratado com óxido de cálcio (60g/kg) (FMT) ou pelo farelo de mamona não
30
tratado (FMNT) sobre o desempenho de bovinos de mestiços (Holandês:Zebu)
terminados em confinamento e concluíram que para bovinos de corte em confinamento
o farelo de mamona tratado com 60g/kg de CaO pode ser usado até 9% na dieta em
substituição total à proteína do farelo de soja.
Na avaliação do efeito de substituição do farelo de soja por farelo de mamona
tratado com 60 g/kg de CaO sobre o desempenho produtivo e os componentes do leite,
Cobianchi et al., 2012, concluíram que o farelo de mamona tratado pode substituir até
um terço do farelo de soja em dietas para vacas leiteiras com produção de 20 kg/dia sem
afetar o consumo, o desempenho animal e os componentes do leite.
2.6 Metodos de detecção da ricina
Considerando a importância da destoxificação completa da torta de mamona
para segurança no consumo da torta de mamona por animais, recomenda-se uma
análise rápida quanto à presença de ricina que ateste a atoxicidade da torta a cada
processo de destoxificação, visto que o procedimento pode não ter sido
satisfatoriamente realizado e quantidades mínimas da proteína são suficientes para
conduzir animais a óbito. Dentre as técnicas utilizadas para a identificação da ricina
pode-se destacar os métodos sorológicos, cromatográficos e eletroforéticos (Furtado et
al., 2011).
Em estudo objetivando definir a técnica mais acurada para quantificar ricina na
semente de mamona, conduzido por Wannemacher Jr. et al. (1992), comparou-se a
detecção de ricina em extrato de sementes de mamona por métodos de diferentes
sensibilidades (a sensibilidade é informada entre parênteses): toxicidade em ratos (0,4
ppm), citotoxidade em células “Vero” (0,01 ppm), ELISA (0,002 ppm), HPLC (5 ppm),
eletroforese em gel (20 ppm) e eletroforese capilar de alta performance (25 ppm); cujos
resultados obtidos foram: 4,1 ppm pela toxidez de ratos, 4,9 ppm pela citotoxidade em
31
células “Vero”, 1,3 ppm por ELISA, 9,3 ppm por HPLC, 3,3 ppm por eletroforese em
gel e 2,9 ppm por eletroforese capilar. Os autores concluíram que todos os métodos
podem ser utilizados para detectar ricina em um extrato bruto de ricina, mas os
resultados obtidos podem ter grande variação (Wannemacher Jr. et al., 1992).
Demant et al., (2008) utilizaram Estirpes (AB1 e N2) do nematóide
Caenohabitis elegans, o qual tem sido utilizados na indústria farmacêutica para avaliar
toxidez de medicamentos e produtos, para avaliar a quantidade de ricina e medir a
toxidez da mesma. Estes nematóides foram expostos a ricina por 18 horas em placas de
petri. Os resultados demonstraram potencial para utilização deste teste de toxicidade,
apresentando alta correlação entre a concentração de ricina e o percentual de
nematódeos mortos (Demant et al., 2008).
A eletroforese em gel (SDS-PAGE) consiste em ferramenta analítica
amplamente utilizada na separação e identificação de proteínas, devido à relativa
simplicidade, rapidez e alto valor informativo (Oliveira, 2008). O princípio da técnica
consiste na separação de frações protéicas de diferentes massas moleculares,
previamente carregadas negativamente, mediante migração em campo elétrico
desenvolvido em géis de poliacrilamida (Mandarino & Almeida, 2004). A quantificação
de proteínas separadas por eletroforese pode ser realizada mediante análise
densitométrica das imagens do gel (SDS-PAGE) e dosagem de proteína total (Oliveira
et al., 2010ab). A vantagem desta técnica é além da simplicidade, sua elavada
correlação com a atividade tóxica da ricina (Oliveira et al. 2010a,b). O desaparecimento
da ricina no gel SDS-PAGE indica inativação da ricina
2.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-Page
O termo eletroforese foi criado por Michaelis, em 1909, para descrever a
migração de colóides sob a influencia de um campo elétrico (Sargent e George, 1975).
32
Eletroforese representa a migração de íons submetidos a corrente elétrica. Onde seu
principio se baseia em: moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo, e
moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo. A eletroforese visa a
separação de moléculas em função de suas cargas elétricas, de seus pesos moleculares e
de suas conformações, em suportes porosos e tampões apropriados, sob influencia de
um campo elétrico contínuo (Brune & Alfenas 2006).
A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica-gel,
membranas de acetato de celulose e géis de agarose, de amido e de poliacrilamida. A
escolha do meio de suporte depende dos objetivos, mas para proteínas, géis de
poliacrilamida têm sido preferidos por seu maior poder de resolução graças à ampla
variação controlável no diâmetro de seus poros, alem disso, géis de poliacrilamida são
muito translúcidos, o que possibilita quantificar a atividade enzimática por
densitometria (Brune & Alfenas 2006).
Os géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e
bisacrilamida na presença de persulfato de amônio e tetrametilenodiamina (Temed). A
concentração de acrilamida dos géis depende do peso molecular dos componentes que
se deseja analisar. Na tabela 4 é possível observar os diferentes pesos moleculares
correlacionando com a concentração de acrilamida do gel.
33
Tabela 4. Faixa de concentração de acrilamida (T%) em relação ao peso molecular das
peroteinas a serem separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
Concentração de acrilamida (T%) Faixa ótima de peso molecular (kDa)
3-5
5-12
10-15
>15
>100
20-150
10-80
<15
Adaptado de Andrews (1988).
O temed tem como objetivo catalisar a liberação de radicais livres de perfulfato
que por sua vez, iniciam a polimerização. O sistema riboflavina-temed exige
fotoenergia para iniciar a polimerização. A fotodecomposição da riboflavina libera
radicais livres que promovem a polimerização (Hames, 1988).
O sistema de eletroforese pode ser classificado quanto a posição do gel em
vertical (figura 1) e horizontal (figura 2) e quanto aos tampões e valores de pH em
contínuo e descontínuo.
Figura 4. a) Suporte para componentes de uma cuba vertical; b) Cuba vertical; c) Cuba
horizontal. Fonte:a) e b) ALESSI, 2015; c)
http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/cubas-de-
eletroforese/cuba-de-eletroforese-horizontal-25x20cm
O sistema de eletroforese contínuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampão
usado na preparação da amostra e do gel é o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos.
A escolha da solução-tampão e de seu valor de pH depende da estabilidade e
a) b) c) b) a)
34
solubilidade, e sua separação depende da força iônica, da composição e do pH do meio.
O preparo do gel em sistema continuo é simples e rápido, a composição da solução-
tampão e o respectivo valor de pH são uniformes durante a separação (Andrews, 1988).
No sistema descontínuo os íons tamponantes do gel (Tris-HCl) são diferentes
daqueles dos eletrodos (Tris-glicina). O sistema descontínuo, introduzido
independentemente por Davis (1964) e Ornstein (1964), fornece melhor resolução que o
contínuo. Ele é aplicado a maioria das misturas protéicas. O sistema descontínuo
consiste de géis formados por fases de diferentes porosidades e valores de pH (Alfenas e
Brune, 2006).
Sistemas de eletroforese contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) são usados na
separação de cadeias polipeptídicas. A proteína é desnaturada por aquecimento a 100ºC,
na presença de beta-mercaptoetanol e do detergente SDS. O mercaptoetanol reduz as
ligações dissulfidricas por ruptura e os polipeptídios adquirem carga negativa do SDS
(figura 5). A organização da cadeia peptídica na sua estrutura terciária é deteriorada, em
virtude da ação do detergente.
Figura 5. Esquema mostrando a ruptura das ligações disulfídricas dos polipeptídios com
carga negativa.
Na eletroforese, as cadeias polipeptídicas providas de acentuada carga negativa,
proporcional ao comprimento da cadeia peptídica, migrarão com velocidade definidas
apenas por diferenças de seus tamanhos moleculares. Proteínas marcadoras, ou seja,
35
aquelas com peso molecular conhecido, podem ser usadas para se determinar o tamanho
das moléculas de proteína da amostra (Alfenas e Brune, 2006).
A revelação das proteínas, em géis é frequentemente feita à base de comassie. Os
fragmentos polipeptídicos azuis de proteína contrastam-se com a transparência do gel
(Chambach e Rodbard, 1971). O comassie é um reagente comumente utilizado e
apreciado para identificação de proteínas graças a sua intensa capacidade de coloração,
sua distinção entre proteínas e aminoácidos, sua facilidade de manejo, sua elevada
solubilidade em géis de poliacrilamida e agarose, sua estabilidade em forma sólida e seu
preço módico. A coloração azul é o resultado da reação entre a função sulfona de
comassie com a função amina das proteínas (Reisner et al.,1975).
A identificação de proteínas e ácidos nucléicos pode ser feita também por meio
do nitrato de prata, um reagente específico para identificação desses compostos. O
método é de alta sensibilidade e pode oferecer vantagens em baixas concentrações de
proteínas (Gifford, 1988). Esse método baseia-se no potencial de oxidação mais
elevado do íon prata, complexado ou livre, que o da função dissulfidrica, tal como
ocorre em proteinas. Deve-se salientar que o mecanismo preciso da revelação pó prata
não está esclarecido (Merril, 1986).
A documentação de resultados do gel pode ser feita por meio de fotografia
convencional ou por meio de escaneamento. Para fazer a fotografia é necessário uma
câmara fotográfica munida de objetiva de aproximação. Para géis coloridos são
indicados filmes ou películas com ASA 64 ou 100.
36
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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42
Artigo - Biodestoxificação do Farelo de Mamona (ricinus communis L.)
Resumo – A presença da proteína tóxica ricina limita o uso do farelo e torta de mamona
na alimentação animal. Assim, objetivou-se desenvolver um novo processo de
biodestoxificação da ricina, e avaliar seu efeito sobre a composição química do farelo
não tratado para uso na alimentação animal. Para desenvolver o processo de
destoxificação, 30 amostras de 1 kg de farelo de mamona não tratado (contendo ricina e
com 40% de proteína bruta, base da matéria seca) foram distribuídas em um
delineamento experimental inteiramente casualizado, com seis procedimentos de
biodestoxificação e cinco repetições. A avaliação da eficácia de destoxificação da ricina
foi realizada por meio de eletroforese em gel SDS-PAGE, utilizando colorações por
Coomassie Blue Brilhant e po nitrato de prata. Dos seis procedimentos de
biodestoxificação testados, em apenas um (Tratamento 5) ocorreu o completo
desaparecimento de dois fragmentos de ricina (29 e 36 kDa, aproximadamente) no gel.
Foi enviado pedido de depóstito de patente deste método ao Escritório de Inovação
Tecnológica da UFMT e ao INPI (Processo EIT: 23108.704545/14-4; Oliveira A.S. et
al. 2014). Por questões de proteção de propriedade intelectual os procedimentos de
biodestoxificação não foram apresentados. O método proposto de biodestoxificação
causou perdas de apenas 2,95 % de matéria seca (P<0,001) do farelo de mamona, e
reduziu (P<0,001) o pH do farelo de mamona não tratado (de 6,0 para 4,4). Todavia,
não afetou os teores de matéria seca (P=0,913), matéria orgânica (P=0,864), fibra em
detergente neutro (P=0,640), proteína bruta (P=0,983), extrato etéreo (P=0,274),
nitrogênio insolúvel em detergente neutro (P=0,192) e nitrogênio insolúvel em
detergente ácido (P=0,149) do farelo de mamona não tratado. O tratamento de
biodestoxificação desenvolvido é eficaz na inativação da ricina e não ocasiona perdas na
composição química do farelo de mamona.
43
Palavras-chave: coproduto, ricina, eletroforese
Introdução
Os produtos da extração do óleo de sementes de mamona (farelos e tortas)
apresentam composição química que permite o uso como ingredientes concentrados
proteicos em dietas para animais (Oliveira et al., 2010a). Todavia, a presença de
ricina,uma proteína tóxica que inativa irreversivelmente os ribossomos eucarióticos
(Endo & Tsuguri, 1987; Endo et al., 1987; Endo & Tsuguri, 1988) e inibe o crescimento
microbiano ruminal (Oliveira et al.,2010b), representa a principal limitação do uso de
farelo e torta de mamona na alimentação animal.
Na década de 1960, a Sociedade Algodoeira do Nordeste Brasileiro desenvolveu
processo de destoxificação do farelo de mamona, aplicável em escala industrial, que
proporcionou a obtenção de produto considerado seguro na época para a alimentação
animal (Matos, 1976). Mais receentemente, outros métodos físico-químicos de
destoxificação foram desenvolvidos e com 100% de eficácia na completa desnaturação
da ricina. Os tratamentos com autoclave (15 psi, 60 min), com hidróxido de cálcio (40
g/kg de farelo de mamona) (Anandan et al., 2005), com autoclave (15 psi) por 90
minutos, e com hidróxido de cálcio ou óxido de cálcio diluídos em água (1:10), na dose
de 60 g/kg base matéria natural do farelo (Oliveira et al., 2007) foram eficazes na
destoxificação do farelo de mamona. Além disso, o farelo de mamona destoxificado por
meio do tratamento alcalino (60 g CaO/kg) desenvolvido por Oliveira et al. (2007), foi
amplamente testado em ruminantes (Oliveira, 2008; Guimarães et al., 2009; Costa et
al.,2009; Oliveira et al., 2010a; Diniz et al., 2010; Barros et al., 2011; Conbianchi et al.,
2012). No entanto, o desenvolvimento de métodos biológicos de destoxificação podem
tornar o processo menos laborioso, mais seguro e com menor impacto ambiental.
44
A utilização de processos biológicos para inativação da ricina em produtos da
mamona já foi descrito em publicação de não patentes (Godoy et al. 2009) e de patentes
(WO2013020189A1). Nestes processos, inoculam-se ao farelo de mamona fungos
filamentosos previamente cultivados por diversos dias, além de meios de cultivos
complexos (contendo fontes de nitrogênio, carbono, vitaminas e minerais), o que
aumenta os custos operacionais para obtenção do alimento para ração animal e limita a
adoção do método de destoxificação pela indústria de ração animal e pelos produtores
rurais.
Destarte, faz-se necessário desenvolver novos métodos biológicos para
inativação da ricina com uso de outros organismos mais facilmente cultivados e com
uso de meios de cultivos mais simples. Além disso, é necessário avaliar os efeitos dos
processos de biodestoxificação sobre o valor nutricional do farelo de mamona não
tratado para uso na alimentação animal.
Diante disso, objetivou-se desenvolver um novo processo de biodestoxificação
da ricina, e avaliar seu efeito sobre a composição química do farelo não tratado para
uso na alimentação animal.
45
Material e métodos
Farelo de mamona e desenho experimental
O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Pecuária de Leite da
UFMT/Campus Sinop, no período de 30/08/2013 a 31/01/2015.
O farelo de mamona não tratado utilizado no experimento foi adquirido da
empresa Azevedo Óleos Vegetais com sede em São Paulo, da safra 2012/2013. Foram
retiradas 30 amostras de 1 kg cada totalizando 30 kg de farelo de mamona não tratado
para a realização do experimento. As 30 amostras de 1 kg foram distribuídas em um
delineamento experimental inteiramente casualizado, com seis procedimentos de
biodestoxificação e com cinco repetições.
Foi enviado um pedido de patente do procedimento eficaz de biodestoxificação
ao Escritório de Inovação Tecnológica da UFMT e ao INPI (Processo EIT:
23108.704545/14-4; Oliveira A.S. et al. 2014). Assim, em razão da necessidade de
proteção de propriedade intelectual os procedimentos de biodestoxificação não serão
apresentados.
Análise de ricina
A avaliação da concentração de ricina na semente de mamona selvagem in natura
(padrão analítico), no farelo de mamona não tratato (controle) e biodestoxificado pelos
seis métodos foi realizada por meio do procedimento descrito por Oliveira et al.
(2010a). A extração da ricina do farelo foi feito com tampão Tris HCL 0,5 M, pH 3,8.
Para identificação das frações A (36 kDa) e B (29 kDa) da ricina procedeu-se a
eletroforese em gel de 15% de acrilamida/bisacrilamida (29:1) em condição
desnaturante (SDS-PAGE), de acordo com o método proposto por Laemmli (1970).
Inicialmente, 250 mg de semente ou farelo foram colocados em microtubos de 2
mL, adicionados 1 mL de tampão de extração TRIS 0,5 M (pH 3,8 ajustado com ácido
46
clorídrico), centrifugados a 9800 rpm durante 20 minutos. Retirou-se o sobrenadante,
adicionou em outro microtubo o qual foi armazenado a 4oC para análise imediata,
sendo este denominado de extrato bruto protéico. Para realizar a corrida eletroforética,
foram retirados alíquotas de 30 µL do extrato bruto protéico, colocados em microtubos
e adicionado 10µL de tampão de amostra (4X), composto por tampão Tris HCl 60 mM
pH 6,8, 10% de glicerol, 2% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,025% de azul de
bromofenol e 0,025% de β-mercaptoetanol. Logo em seguida procedeu-se fervura por 5
minutos a 100OC, sendo então aplicado 20 µL desta mistura em cada orifício do gel
(Oliveira et al., 2010a).
A corrida eletroforética foi inicialmente conduzida a 50 Volts, até o corante da
amostra atingir a superfície do gel de separação, quando foi submetida a 140 Volts,
permanecendo assim até o final da corrida, definido quando o corante se aproximou da
extreimidade inferior do gel. Foram confeccionados dois géis para cada repetição, sendo
um corado com solução à base de Coomassie Brilhant Brue G e outro corado com
nitrato de prata.
Para coloração com Commassie Brilliant Blue G, os géis foram colocados em
solução corante (0,015 % de Coomassie Brilliant Blue G, 9 % de ácido acético glacial,
45 % de metanol e 46 % de água deionizada) por 24 horas e logo depois em solução
descorante (10 % de ácido acético glacial, 50 % de metanol e 40 % de água destilada)
por 12 horas.
O procedimento de coloração de nitrato de prata foi realizada em diferentes
etapas. Primeiro os géis foram incubados em solução fixadora ( 50 % metanol, 12 %
ácido acético e 38 % de água destilada) por duas horas. Depois os géis foram lavados
em solução de etanol 50 % por 10 minutos, lavados por um minuto em solução de
tiossulfato de sódio 0,02 % e submetidos à três lavagens com água destilada por 20
47
segundos (ou até eliminar a cor amarela do gel). Os géis então foram incubados em
solução de nitrato de prata 0,2 % e 37 µl de formaldeido a 37 % por 30 minutos. Os géis
foram lavados por três vezes com água destilada por 20 segundos e logo em seguida
mantidos em solução reveladora (2 g de carbonato de sódio, 1 mL de solução de
tiossulfato 0,02g, 25 µl de formaldeideo 37 %) até o aparecimento dos fragmentos e
3mL ácido acético glacial foi utilizado para paralizar a reação de revelação.
Após a descoração dos géis corados com Comassie B. e coloração dos géis com
prata, esses foram scaneados (impressora HP3050). A identificação das frações de ricina
A (aproximadamente 36 KDa) e B (aproximadamente 29 KDa) foi realizada utilizando-
se marcadores de massa molecular entre 14 a 66 KDa (Sigma, USA). Foi considerado
eficaz para inativação da ricina somente aquele processo que causou completo
desaparecimento das duas frações de ricina em todas as repetições de ambos sistemas de
coloração (Oliveira et al., 2007). Os procedimentos estão ilustrados nas Figuras 1 a 5.
Análise química e perdas
Nas amostras do farelo de mamona não tratado e do farelo de mamona submetido
ao processo de biodestoxificação eficaz, foram analisadas as concentrações de matéria
seca (método No 934.01), matéria orgânica (MO, método N
o 942.05), proteína bruta
(PB, método No 954.01) e extrato etéreo (EE, método N
o 920.39) de acordo com a
AOAC (1990). Para análise da concentração de fibra em detergente neutro (FDN), as
amostras foram tratadas com alfa amilase termo-estáveis sem uso de sulfito de sódio,
corrigidas para o resíduo de cinzas (Mertens, 2002) e para o resíduo de compostos
nitrogenados (Licitra et al., 1996).
As análises de FDN forão realizadas em sistema Ankon , utilizando sacos de
TNT (tecido-não-tecido), com dimensões de 5cm x 5cm, mantendo-se relações média
de 14 mg de MS /cm2 de tecido e 100 mL de detergente neutro/g de amostra seca ao ar.
48
As perdas de matéria seca durante o processo de biodestoxificação foram
determinadas quantitativamente com base nas diferenças gravimétricas.
Análise estatística
Os resultados de composição química, pH e perdas de matéria seca do farelo de
mamona não tratado e submetido ao procedimento eficaz de destoxificação, foram
submetidos à ANOVA, ao nível de 0,05 de probabilidade para o erro tipo I, utilizando-
se o seguinte modelo:
Yij=µ + ti + eij
Em que:
Yij = resposta experimental medida na unidade experimental j submetida ao
tratamento i, sendo j (1 a 10) e i (1 e 2).
µ = média geral do experimento para variável
ti = efeito relativo ao tratamento i, sendo i 1 e 2.
eij = erro aleatório
49
Resultados e discussão
A avaliação da presença de ricina na semente de mamona selvagem in natura e
no farelo de mamona não tratado encontra-se na Figura 6. Verifica-se a presença das
duas sub-unidades (29 e 36 KDa, aproximadamente) nos dois materiais, indicando que o
farelo de mamona não tratado utilizado no experimento é tóxico, necessitando de
procedimentos para destoxificação.
Figura 6 – Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para avaliação da semente de mamona
(dois géis) e do farelo de mamona não tratado (dois géis). A cadeia A com 36
KDa e a cadeia B com 29 KDa da ricina estão identificados com a seta). MM
= marcador de massa molecular (14 a 66 KDa).
A avaliação da eficácia dos seis procedimentos de biodestoxificação corados
com comassie blue e nitrato de prata encontra-se nas Figuras 7 e 8. Observa-se que
apenas no processo de biodestoxificação T5 provocou completo desaparecimento das
sub-unidades de ricina no farelo de mamona em todas as cinco repetições e em ambos
sistemas de coloração, indicando precisão e eficácia do método desenvolvido na
inativação da ricina. O desaparecimento da ricina no gel SDS-PAGE está relacionado
com a degradação da proteína e consequentemente inativação dos efeitos tóxicos da
ricina em animais e microrganismos ruminais (Oliveira et al. 2010a,b). Salienta-se que o
mecanismos de ação do processo de biodestoxificação não pode ser apresentado em
razão da necessidade de proteção de propriedade intelectual.
Ricina
A
B
Sementes de
mamona
66
45
36
29
24
20
14
MM
Farelo de mamona
não tratado
50
Figura 7. Cinco géis de poliacrilamida (SDS-PAGE) corados com Comassie Blue para
avaliação da eficácia de seis processos de biodestoxificação do farelo de
mamona. MM = marcador de massa molecular (14 a 66 Kda). Controle =
farelo de mamona não tratado. Semente = semente de mamona in natura. Cada
gel representa uma repetição (R) dos tratamentos: T1, T2, T3, T4, T5 e T6. As
dois fragmentos de ricina (A com 36 Kda e B com 29 Kda, aproximadamente)
estão identificadas com a seta.
51
Figura 8. Cinco géis de poliacrilamida (SDS-PAGE) corado com nitrato de prata para
avaliação da eficácia de seis processos de biodestoxificação do farelo de
mamona. MM = marcador de massa molecular (14 a 66 Kda). Controle =
farelo de mamona não tratado. Semente = semente de mamona in natura. Cada
gel representa uma repetição (R) dos tratamentos: T1, T2, T3, T4, T5 e T6. As
dois fragmentos de ricina (A com 36 Kda e B com 29 Kda, aproximadamente)
estão identificadas com a seta.
52
O efeito do processo de biodestoxificação eficaz (5) sobre as perdas de matéria seca
(MS) e composição química do farelo de mamona não tratado é apresentado na Tabela
1. O método proposto de biodestoxificação causou perdas de apenas 2,95 % de matéria
seca (P<0,001) do farelo de mamona, e reduziu (P<0,001) o pH do farelo de mamona
não tratado (de 6,0 para 4,4). A redução provavelmente foi consequência da produção
de ácidos orgânicos durante o processo de biodestoxificação. Todavia, o valor de pH
(4,4) não é um fator de impedimento para uso na alimentação animal, pois é valor
normalmente encontrado em alimentos conservados comumente utilizados em dietas de
ruminantes de alto desempenho produtivo (Oliveira et al, 2011).
Tabela 1. Efeito do processo de biodestoxificação sobre as perdas de matéria seca, pH e
composição química do farelo de mamona não tratado
Item Farelo de mamona CV
1
(%)
Valor-P2
Não
Tratado Biodestoxificado
Perdas de matéria seca, % 0,00 2,95 33,04 <0,001
pH 6,00 4,40 2,93 <0,001
Matéria seca (MS), % 69,46 69,39 1,41 0,913
Matéria orgânica, % MS 89,22 89,50 2,86 0,864
Extrato etéreo, % MS 1,61 1.79 13,22 0,274
Proteína bruta (PB), % MS 40,03 39,97 9,17 0,983
PB insolúvel em detergente neutro, % PB 6,98 6,13 13,33 0,192
PB insolúvel em detergente ácido, % PB 5,24 4,32 18,94 0,149
Fibra detergente neutro, % MS 58,35 58,62 1,50 0,640
1coeficiente de variação.
2Teste F
O método desenvolvido de biodestoxificação não afetou os teores de matéria seca
(P=0,913), matéria orgânica (P=0,864), fibra em detergente neutro (P=0,640), proteína
bruta (P=0,983), extrato etéreo (P=0,274), nitrogênio insolúvel em detergente neutro
(P=0,192) e nitrogênio insolúvel em detergente ácido (P=0,149) do farelo de mamona
53
não tratado. A fração de nitrogênio insolúvel em detergente neutro representa fração de
compostos nitrogenados (N) associado à hemicelulose, celulose e lignina e apresenta
lenta degradação ruminal. A fração de nitrogênio insolúvel em detergente neutro
representa fração de N associado somente à celulose e lignina e apresenta fração
praticamente indisponível de N para a microbiota ruminal e intestinal (Van Soest,
1994).
Conclusões
O processo de biodestoxificação desenvolvido é eficaz na inativação da ricina do
farelo de mamona. Além disso, o tratamento não ocasiona perdas na composição
química do material. Assim, apresenta-se como um processo alternativo para permitir
uso do farelo de mamona destoxificado na alimentação animal.
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1994. 476p.
56
ANEXO I
Procedimentos para análise de Ricina por Eletroforese
Desenvolvido pela Profa. Márcia Rodrigues Carvalho de Oliveira
UFMT/Campus Sinop
1. Preparo das soluções
Solução estoque ( Bis/Acrilamida)-30% acrilamida e 8% bisacrilamida
150 g de acrilamida
40 g de bisacrilamida
Completar volume para 500 ml
OBS: material muito tóxico, filtrar em papel filtro e estocar em vidro escuro a 4ºC. Usar
máscara e óculos para pesagem do material.
Tampão de Gel separador (1,5M) – pH 8,6
36,32 g Tris/HCl
Acertar o pH com HCl concentrado e completar o volume para 200 ml, armazenar a
4ºC.
Tampão de gel empilhador (0,5M) – pH 6,8
12,08 g de Tris/HCl
Acertar o pH com HCl e completar o volume para 200 ml, armazenar a 4ºC.
SDS 10%
5 g de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio)
50 ml de água destilada completar em balão.
Homogeneizar em agitador e estocar em temperatura ambiente.
PA (Persulfato de Sódio)-10%
100 mg de PA
100 ml de água
Aliquotar em microtubo e congelar em temperatura de -20ºC.
Tampão de amostra
( 0,06 M Tris/Hcl; 2% SDS; 10% Glicerol; 0,025% de Azul de bromofenol)
4,8 ml de água destilada
1,2 ml de Tris/HCl
2 ml de SDS 10%
1 ml de glicerol
57
0,5 % de azul de bromofenol
Homogeneizar bastante e estocar a 4ºC.
OBS: No momento do uso adicionar o βmercapetanol na seguinte proporção:
950 µL de Tampão da Amostra p/ 50 µL de β-mercapetanol (Utilizar sempre em capela
de exaustão) – muito tóxico.
Tampão de Corrida pH 8,3
3 g de Tris-HCl
14 g de Glicina
10 ml de SDS 10%
Completar o volume para 1 Litro.
Armazenar em temperatura ambiente e pode ser armazenado em vidro transparente.
Solução corante (Comassie Blue Brilhante)
1,5 g de CBB
90 ml de acido acético glacial
450 ml de etanol
Completar o volume para 1 litro
Solução descorante
75 ml de acido acético glacial
250 ml de etanol
Completar o volume para 1 litro.
Solução de Nitrato de Prata
Solução fixadora: 50% metanol, 12% ácido acético e 38% de água;
Solução de etanol 50%;
Solução de tiossulfato de sódio 0,02%;
Solução de nitrato de prata 0,2% e 37 µl de formaldeideo a 37%;
Solução reveladora: 2 g de carbonato de sódio, 1 mL de solução de tiossulfato de Sódio
0,02g (feita na etapa 3), 25 µl de formaldeideo 37% , 3mL ácido acético glacial,
completar o volume de um balão de 100 mL com água destilada.
2. Material necessário
Microtubos de 2 mL;
Pipetas de 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
Ponteiras para pipetas de 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
Banho Maria com temperatura de 100 ºC;
58
Balão de 100 mL;
Balão de 1000 mL;
Capela com exaustor;
Geladeira para guardar reagentes prontos;
Balança analítica;
Centrífuga refrigerada;
Equipamento para análise de eletroforese ( cuba vertical, pentes, placas de vidro,
suporte para confecção dos géis)
3. Extração da ricina
Pesar 250 mg de farelo ou torta de mamona, colocar em minitubos de 2 mL,
devidamente enumerados. Adicionando-se 1 mL de tampão de extração TRIS 0,5 M
(pH 3,8 ajustado com ácido cloridrico)* e centrifugar a 9.800 rpm durante 20
minutos.
*TRIS 0,5 Molar: Pesar 60,57 gramas de Tris para preparar 1 litro de solução.
Modo de preparo: Homogeneizar o tris em 800 ml de água destilada. Corrigir o pH
com solução de HCl até o pH chegar a 3,8 a 4,0. Após a correção do pH completar o
volume com água para 1 litro. Acondicionar em vidro âmbar e em temperatura de 4ºC.
4. Eletroforese
É retirado o sobrenadante de cada microtubo, adicionando em outro microtubo o
qual será armazenado entre 2 a 6oC para análise imediata, sendo este denominado de
extrato bruto protéico.
O equipamento para realizar a eletroforese deverá ser limpo com álcool de uma
forma que não reste nenhum resíduo de sujidades.
59
Placas de vidro onde o gel ficara Suporte para confecção do gel
Cuba para eletroforese vertical
Suporte para géis com placas de vidro devidamente montadas. Destaque para os pentes
Preparo dos géis.
Pentes
60
Os géis de eletroforese são confeccionados no dia da corrida eletroforética. Nas
placas de vidro onde os géis serão confeccionados é preciso fazer uma marcação para
separar o gel de cima do gel de baixo. Essa marcação é feita com caneta sobre as placas
de vidro, e é feita com o uso dos pentes, onde cada dente do pente será um poço que
ficara a amostra, então cada gel comporta 10 amostras.
São confeccionados 2 géis:
- Gel de Cima:
- Gel de Baixo:
O gel de cima é chamado de gel empilhador e é nas cavidades deste gel que a
amostra é aplicada. Sob eletroforese, as moléculas migram da parte mais porosa (gel
empilhador) para a menos porosa gel separador (gel de baixo). A polimerização dos géis
ocorre por meio das soluções de Temed e persulfato de amônio que após adicionadas,
causam a geleificação dentro de poucos minutos*.
*Ou observa o Becker onde é feita a solução do gel de baixo: quando observar que
a solução endureceu, pode-se preparar o próximo gel.
O gel empilhador é confeccionado após a polimerização do gel separador em
temperatura ambiente. A seguir o pente é inserido nessa solução. Após a polimerização
do gel empilhador, o pente é removido e as cavidades são lavadas com água. O gel e o
Cada dente do pente
será um poço para
aplicar a amostra
Marcação de
separação do gel
de baixo com o de
gel de cima
61
pente são retirados do suporte. O gel ficará dentro das duas placas de vidro durante toda
a corrida eletroforética.
Preparo da amostra e do padrão:
- Amostra: São aliquotados 30 µL de amostra (extrato bruto protéico) em
microtubos enumerados + 10 µL de tampão da amostra. É necessário adicionar o
βmercapetanol à solução de tampão da amostra nas seguintes proporções:
950 microlitro de Tampão da Amostra= 50 µL de βmercapetanol
Ex: 10 amostras * 10 µL de TA= 100 µL de TA
100 µL de TA*50 µL de β/950 µL de TA= 5,2 µL de β.
Dica: Para ficar fácil de manusear as amostras e o tampão de amostra, coloca-se a
quantidade a ser usada em um único microtubo e depois adiciona o
βmercapetanol, homogeneíza a solução e adiciona nos tubos das amostras 10 µL do
TA+β
Cuidado com o βmercapetanol= extremamente tóxico e carcinogênico!!!
Padrão:
As amostras+padrão são aquecidas a 100ºC em banho Maria por 5 minutos. Com
auxilio de uma pipeta com ponteiras descartáveis, é aliquotado 20 µL da
amostra+tampão da amostra e aplicado em cada poço de gel, sendo reservado o
primeiro poço de cada gel para o marcador molecular padrão com massa molecular
conhecida.
62
Na cuba de eletroforese será colocada a solução de Tampão de Corrida. O tampão
de corrida é colocado até a marca da cuba para 2 géis e 4 géis.
Com as amostras aplicadas e a cuba fechada com a solução de tampão de corrida,
o aparelho é ligado e a corrida inicia-se em 50 volts, até a amostra atingir a marca do gel
de baixo, e então aumenta-se a voltagem para 140, mantendo-a até o final da corrida.
A corrida eletroforética é interrompida quando a linha frontal do azul de
bromofenol sair do gel. O gel é retirado das placas, lavado com água destilada e a parte
do gel empilhador é removida restando o gel separador que é corado para detecção dos
compostos.
5. Coloração dos géis
Para coloração com Commassie Brilliant Blue:
Amostras
Tampão
de Corrida
63
1º Colocar os géis em solução corante (1,5 g de Coomassie Brilliant Blue G, 90
mL de ácido acético glacial, 450 mL de metanol e 460 mL de água deionizada) por 24
horas;
2º Lavar os géis com água destilada até a completa remoção da solução corante.
Colocar os géis corados em solução descorante (100 mL de ácido acético glacial, 500
mL de metanol e 400 mL de água deionizada) por 12 horas.
Para coloração com nitrato de prata:
O procedimento de coloração de nitrato de prata é realizada em diferentes
etapas:
1º Incubar em solução fixadora ( 50% metanol, 12% ácido acético e 38% de água) por
duas horas (recomenda-se uma noite);
2º Lavar em solução de etanol 50% por 10 minutos (não exceder esse tempo);
3º Lavar por 1 minuto em solução de tiossulfato de sódio 0,02%;
4º Lavar por 3 vezes com água destilada por 20 segundos (ou até eliminar a cor amarela
do gel);
4º Incubar em solução de nitrato de prata 0,2% e 37 µl de formaldeideo a 37% por 30
minutos;
5º Lavar novamente por 3 vezes com água destilada por 20 segundos;
6º Adiciona-se a solução reveladora (2 g de carbonato de sódio, 1 mL de solução de
tiossulfato 0,02g (feita na etapa 3), 25 µl de formaldeideo 37% , 3mL ácido acético
glacial, completar o volume de um balão de 100 mL com água destilada).
6. Revelação dos géis
Após a descoração os géis são scaneados (impressora HP3050) e as imagens são
salvas como arquivos de imagem para posterior quantificação.
7. Quantificação da ricina
64
A quantificação das pronteinas do gel podem ser realizadas por meio de sofwares.
As imagens devem ser salvas no formato de imagem (Jpeg.) no momento do
escaneamento. As imagens são importados para o sofware de análise, os parâmetros a
serem analisados são selecionados assim como as faixas desejadas do gel.
