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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS
EFEITO HIPOGLICÊMICO DE FORMULAÇÃO CONTENDO INSULINA E ÓLEO
DE AÇAÍ EM RATAS FISCHER APÓS ADMINISTRAÇÃO RETAL.
Lucas Andrade Ferreira
Orientador: Prof. Dr. José Mario Barichello
Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil
Novembro de 2015
LUCAS ANDRADE FERREIRA
EFEITO HIPOGLICÊMICO DE FORMULAÇÃO CONTENDO INSULINA E ÓLEO
DE AÇAÍ EM RATAS FISCHER APÓS ADMINISTRAÇÃO RETAL.
Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil
Novembro de 2015
Dissertação, como requisito parcial,
para obter o grau de mestre em
Ciências Farmacêuticas, submetida
ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Escola
de Farmácia da Universidade
Federal de Ouro Preto.
Orientador: Prof. Dr. José Mario
Barichello - UFOP
F383e Ferreira, Lucas Andrade.
Efeito hipoglicêmico de formulação contendo insulina e óleo de açaí em ratas fischer após administração retal [manuscrito] / Lucas Andrade Ferreira. - 2015.
84f.: il.: color; tabs; Figuras.
Orientador: Prof. Dr. José Mário Barichello.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração: Estudo e Desenvolvimento de Medicamentos.
1. Açaí. 2. Diabetes. 3. Insulina. I. Barichello, José Mário. II. Universidade
Federal de Ouro Preto. III. Titulo.
CDU: 616.379-008.64:634.61
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
Este trabalho contou com a colaboração de:
Profª. Dra Daniela Caldeira
Msc. Pedro Henrique de Amorim Miranda
Laboratório de Bioquímica Metabólica
Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas - ICEB
Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP
Ouro Preto, MG
Prof. Dr. Ivanildes Vasconcelos Rodrigues - UFJF
Msc. Janaína Brandão Seibert - UFOP
Laboratório de Química Orgânica
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo – USP
Ribeirão Preto, SP
Dedico este trabalho aos meus pais que nunca mediram esforços
pelos seus filhos, são nossos verdadeiros heróis.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade diária de tentar ser um pouco melhor.
Aos meus pais por todos os sacrifícios, ensinamentos de vida, amor, carinho e apoio
incondicional.
A minha irmã pelo amor e apoio de sempre e toda aquela alegria que só uma irmã
companheira pode proporcionar.
A Laís pelo amor, carinho, resiliência, apoio e dedicação incondicional, mesmo quando
distante, mas não menos presente em meu coração.
A Dindinha, Tio Dedé, Cíntia Maria, Tio Sérgio, Tio Lacir, Tia Zarinha, Tia Edirlene,
Tia Aparecida e todos os tios, por todo apoio e carinho durante todos esses anos.
A todos os primos, que sempre deixam sua dose de alegria e motivação em minha vida,
em especial, Marco Paulo, Thiago, Leandro, Suélem, Alan e Josy.
Aos amigos Tunico, Gabriel, Alisson, Dedé e Dona Tina por serem sempre presentes.
Aos amigos do Beijinho do Pato Donalds em extensão a todos os amigos do Bela Vista,
Ipatinga e Alvinópolis.
Aos amigos Luan (Aí João é nós), Fabrício (Bando de cela), Arthur (Firmeza), Déborah
(Maria) e Pedro (Como diz o João: Turco), muito importantes em minha segunda passagem
por Ouro Preto.
Aos amigos do Laboratório de Fitotecnologia (em especial, Luana, Tamires, Pedro,
Janaína, Régis, Simone, Tati, Fernanda, Eliete, Samara, Laura, Juliana, Bruna) que são
fundamentais para que tudo isso ocorra, desde toda ajuda técnica, apoio moral, incentivo,
risadas e companheirismo.
Ao Pedro por todo aprendizado que tornou possível as análises in vivo e a Janaína pela
ajuda na análise do óleo de açaí.
A Luana pela ajuda, apoio e companheirismo em todos os momentos.
A todos os amigos do CIPHARMA, em especial Tamires, Walyson, Mônica, Thaís,
Janine, Luan, Leo, Pati, Mirela, Ramon, Carlos, Naiara, Feijoada.
Ao Aldo e Jair pela acolhida e ajuda no biotério do ENUT.
A mansão Olympo pelo aprendizado de vida, comemorações e alegrias.
Aos professores da graduação e pós-graduação por toda bagagem e suporte oferecidos.
Ao professor Dr. José Mario Barichello, pela orientação e confiança depositada para
realização do trabalho.
Ao Gustavo pela amizade, fabricações de cerveja artesanal e conselhos que tornaram
meus dias mais leves em Ouro Preto.
A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização desse trabalho, mesmo
que indiretamente.
“Pessoas especiais enxergam em problemas grandes oportunidades
para mudar de vida”
Professor Evandro Guedes.
“Comece fazendo o necessário, depois faça o que for possível e
finalmente estará fazendo o impossível.”
Francisco de Assis.
“Tenha coragem de fazer uma revolução em sua vida e vá atrás do
que dita a sua alma.”
Roberto Shinyashiki.
ix
RESUMO
O tratamento do diabetes passou por profundas modificações após a descoberta da
insulina (INS) em 1921. A insulina é um peptídeo de elevado peso molecular e baixa
lipofilicidade, sendo administrado preferencialmente pela via subcutânea. Neste trabalho, uma
formulação de Pluronic® F127 (F127) contendo óleo de açaí (Euterpe oleracea) foi
desenvolvida para administrar a insulina (INS) por via alternativa a administração subcutânea.
A composição do óleo de açaí foi avaliada por cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massa enquanto a formulação foi avaliada em relação às características
físico-químicas e o efeito hipoglicêmico in vivo. A análise do óleo de açaí revelou a presença
de grande quantidade de ácidos graxos insaturados e saturados, sendo o ácido oleico (67%) o
composto majoritário. A formulação de F127 contendo óleo de açaí e INS apresentou micelas
com diâmetro médio de 373,10 ± 2,40 nm e índice de polidispersão de 0,501, sendo que o
potencial zeta foi entorno de – 43,90 ± 1,94 mV. A análise da polaridade do microambiente
das micelas da formulação contendo óleo de açaí por espectrometria de fluorescência
utilizando o pireno como sonda fluorescente revelou que a adição do óleo de açaí diminuiu
significativamente a polaridade do microambiente micelar/particular, possivelmente devido a
presença de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poli-insaturados do óleo de açaí. Esta
formulação, administrada por via retal a ratas albinas saudáveis Fischer na dose de 15 UI/Kg
do animal, em comparação com as outras formulações testadas, resultou num importante
efeito hipoglicemiante, o qual se prolongou pelo intervalo de 6 horas em que o experimento
foi realizado. O efeito hipoglicêmico da formulação contendo óleo de açaí não apresentou
diferença significativa quando comparada ao efeito hipoglicêmico da formulação contendo
ácido oleico puro contendo a mesma dose de INS (15 UI/Kg). A avaliação glicêmica da
formulação contendo óleo de açaí em ratas albinas saudáveis e diabéticas da linhagem Fischer
demonstrou uma redução mais intensa dos níveis de glicose nos animais diabéticos, mantendo
este efeito constante até o tempo de 360 min. Esses resultados abrem novas perspectivas ao
desenvolvimento de formulações que permitam o tratamento do Diabetes mellitus por vias
não invasivas utilizando recursos naturais e renováveis como o óleo de açaí.
Palavras chaves: Diabetes Mellitus; Insulina; Pluronic® F-127; Óleo de açaí; Promotores de
permeação; Ácido oleico.
x
ABSTRACT
The treatment of the diabetes went by deep modifications after the discovery of the insulin
(INS) in 1921. The insulin is a peptide of a high molecular weight and low lipophilicity, being
preferentially administered by subcutaneous injection. In this work, a formulation of
Pluronic® F127 (F127) containing açaí (Euterpe oleracea) oil was developed to administer
the insulin (INS) by a non-invasive route. The composition of açaí oil was evaluated by gas
chromatographic coupled to mass spectrometry while the formulation was evaluated in
relation to the physiochemical characteristics and hipoglycemic effects in vivo. The analysis
of açaí oil revealed the presence of great amount of unsaturated and saturated fatty acids,
being the oleic acid (67%) the majority compound. The formulation F127 containing açai oil
and INS presented micelles/particles with an average size of 373,10 ± 2,40 nm with
polydispersion index of 0,501 and the pontencial zeta of about – 43,90 ± 1,94 mV. The
analysis of microenvironment of the micelles/particles of the formulations by fluorescence
spectrometry using the pyrene as a fluorescent probe revealed that the addition of açaí oil
considerably reduced the polarity of the microenvironment, probably due to the varied
composition of fatty acids found in açaí oil. In comparison with the other tested formulations,
the rectal administration of the formulation containing açaí oil and INS at the dose of 15
IU/Kg to healthy albino female Fischer rats resulted in an important hipoglycemic effect,
which was prolonged for 6 hours. The hipoglycemic effect of the formulation containing açaí
oil did not present significant difference when compared to the hipoglycemic effect of the
formulation containing oleic acid in the same dose of INS (15 UI/Kg). The formulation
containing açaí oil rectally administered to diabetic albino female Fischer rats showed a
stronger hypoglycemic effect that was maintained constant until the end of the experiment
(360 min). Those results open new perspectives to the development of formulations that allow
the treatment of Diabetes mellitus by non-invasive routes using natural and renewable
resources as the açaí oil.
Key word: Diabetes Mellitus; Insulin; Pluronic® F-127; Açaí oil; Permeation promotion;
Oleic acid.
xi
ÍNDICE DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
DM Diabetes mellitus
DM 1 Diabetes mellitus Tipo 1
DM 2 Diabetes mellitus Tipo 2
IDF Federação Internacional de Diabetes
INS Insulina
FDA Food and Drug Administration (FDA), órgão do governo dos Estados, que
atua no controle de alimentos e medicamentos
F 127 Pluronic® F-127
SBD Sociedade Brasileira de Diabetes
CDC Centro de Prevenção e Controle de doenças, Atlanta – EUA
OMS Organização Mundial de Saúde
ADA Associação Americana de Diabetes
DCVs Doenças cardiovasculares
HLA Sistema antígeno leucocitário humano
LADA Forma de diabetes autoimune latente que ocorre no adulto
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias
INCT Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia
A/O/A Emulsão de fase aquosa em fase oleosa na fase externa aquosa
EPA Ácido eicosapentaenoico
ARA Ácido araquidônico
DHA Ácido docosahexaenóico
OE Monômero de óxido de etileno
OP Monômero de óxido de propileno
EHL Equilíbrio hidrófilo – lipófilo
F5AO15I F representa o Pluronic® F-127, AO, o ácido oleico puro, I a insulina e o
número anterior à abreviação significa a % p/p na formulação
FAÇAÍ15I F representa o Pluronic® F-127, A o óleo de açaí, I a insulina e o número
anterior à abreviação significa a % p/p presente na formulação
xii
ÍNDICE DE TABELAS
Página
Tabela 1. Classificação Etiológica do DM 7
Tabela 2. Critérios para o diagnóstico do Diabetes mellitus e seus estágios pré-
clínicos, na condição de jejum de 8 horas, 2 horas após ingesta de
75g de glicose ou situação casual.
9
Tabela 3. Preparações de insulina humana subcutânea, disponíveis no Brasil,
com seus respectivos perfis farmacocinéticos.
13
Tabela 4. Composição de ácidos graxos presentes no óleo de açaí em
porcentagem (%) e a proporção em átomos de carbono.
21
Tabela 5. Formulações utilizadas nos estudos, contendo o percentual peso por
peso (%P/P) do polímero F127, óleo de açaí (AÇAÍ) e do ácido
oleico (AO) e, a quantidade de insulina (I) em unidades por quilo
(U/Kg) de peso corpóreo dos animais utilizados.
33
Tabela 6. Ácidos graxos, tempo de retenção, área dos picos e percentagem
encontrada no cromatograma obtido do óleo de açaí.
42
Tabela 7. Diâmetro médio, índice de polidispersão e potenciais zeta das
formulações.
43
Tabela 8. Intensidade de emissão do pireno e escala “Py” (razão I1/I3). 47
Tabela 9. Análise das formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I
utilizando teste paramétrico Two-way ANOVA com teste de
comparações múltiplas de Tukey.
50
Tabela 10. Análise das formulações F, FAÇAÍ, F15I e FAÇAÍ15I utilizando
teste paramétrico Two-way ANOVA com teste de comparações
múltiplas de Tukey.
51
Tabela 11. Análise das formulações FAÇAÍ, FAO15I e FAÇAÍ15I utilizando
teste paramétrico Two-way ANOVA com Teste de comparações
múltiplas de Tukey.
54
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Representação esquemática da sequência de aminoácidos da
insulina humana.
10
Figura 2. Insulina: monômero, dímero e hexâmero. 11
Figura 3. Farmacocinética da insulina e análogos. 12
Figura 4. Açaizeiro – Família das palmáceas. 18
Figura 5. Extrativismo do fruto no açaizeiro. 18
Figura 6. Exsicata da espécie E. oleracea Martius coletada na reserva da
FUNAI em Tocantinópolis - TO.
19
Figura 7. Exsicata dos frutos da espécie E. oleracea Martius coletada na
reserva da FUNAI em Tocantinópolis – TO.
20
Figura 8. Estrutura química geral dos ácidos graxos. 22
Figura 9. Estereoquímica cis e trans representativa das cadeias insaturadas
dos ácidos graxos
23
Figura 10. Fórmula estrutural da molécula de ácido oleico. 23
Figura 11. Fórmula estrutural da molécula de ácido linoleico. 24
Figura 12. Fórmula estrutural da molécula de ácido palmítico. 24
Figura 13. Fórmula estrutural de Pluronic® F-127 – dois blocos hidrófilos de
óxido de etileno (extremidades) e um bloco hidrofóbico de oxido de
propileno (centro).
28
Figura 14. Mecanismo de agrupamento do Pluronic® F-127 em água, no
processo de formação de géis semirrígidos.
29
Figura 15. Mesofase das estruturas micelares: a) cúbica, b) hexagonal e c)
lamelar.
29
Figura 16. Reação geral de sililação utilizando o BSTFA e HR (grupo
funcional derivatizado por sililação, podendo ser: carboxilas,
hidroxilas, dentre outros pertencentes a substâncias não voláteis
como os ácidos graxos).
32
Figura 17. Fórmula estrutural da molécula do pireno 34
Figura 18. Espectro de emissão do pireno e suas bandas vibracionais. 35
Figura 19. Delineamento experimental. 36
xiv
Figura 20. Perfil cromatográfico dos constituintes do óleo de açaí com os
respectivos tempos de retenção.
38
Figura 21. Comparação do perfil cromatográfico do ácido oleico puro e do óleo
de açaí obtido por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massas.
39
Figura 22. Espectro de massas do ácido cis-octadecen-9-óico trimetilsililado do
ácido oleico puro.
40
Figura 23. Espectro de massas do ácido cis-octadecen-9-óico (ácido oleico)
trimetilsililado encontrado no óleo de açaí.
40
Figura 24. Espectro de massas do ácido hexadecanóico (ácido palmítico)
trimetilsililado encontrado no óleo de açaí.
41
Figura 25. Espectro de massas do ácido 9,12-octadecadienoico (ácido
linoleico) trimetilsililado.
41
Figura 26. Espectro de emissão de fluorescência do pireno nas formulações
estudadas.
46
Figura 27. Perfil glicêmico após administração retal das formulações
FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I em ratas albinas saudáveis da
linhagem Fischer.
49
Figura 28. Perfil glicêmico após administração retal das formulações F, F15I,
FAÇAÍ e FAÇAÍ15I em ratas albinas saudáveis da linhagem
Fischer.
51
Figura 29. Perfil glicêmico após administração retal das formulações FAÇAÍ,
FAÇAÍ15I e FAO15I em ratas albinas saudáveis da linhagem
Fischer.
53
Figura 30. Perfil glicêmico após administração retal da formulação FAÇAÍ15I
em ratas albinas saudáveis e diabéticas da linhagem Fischer.
55
xv
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................................IX
ABSTRACT ............................................................................................................................. X
ÍNDICE DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ..................................................................XI
ÍNDICE DE TABELAS ....................................................................................................... XII
ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... XIII
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 4
2.1. OBJETIVO GERAL........................................................................................................................................... 4
2.2. OS OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................................... 4
3. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 5
3.1. DIABETES MELLITUS (DM) ............................................................................................................................ 5
3.1.1. Prevalência ........................................................................................................................................... 6
3.1.2. Classificação......................................................................................................................................... 7 3.1.2.1. Diabetes mellitus tipo 1 (DM1): ......................................................................................................................7 3.1.2.2. Diabetes mellitus tipo 2 (DM2): ......................................................................................................................8 3.1.2.3. Diabetes mellitus gestacional e outros tipos: ...................................................................................................8
3.1.3. Critério diagnóstico:............................................................................................................................. 9
3.2. INSULINA .................................................................................................................................................... 10
3.3. INSULINOTERAPIA ....................................................................................................................................... 12
3.4. PERSPECTIVAS ACERCA DAS VIAS DE ADMINISTRAÇÃO ALTERNATIVAS À VIA PARENTERAL ....................... 14
3.4.1. Via Oral .............................................................................................................................................. 14
3.4.2. Via Nasal ............................................................................................................................................ 14
3.4.3. Via Pulmonar ...................................................................................................................................... 15
3.4.4. Via bucal ............................................................................................................................................. 15
3.4.5. Via Transdérmica ............................................................................................................................... 16
3.4.6. Via Ocular .......................................................................................................................................... 16
3.4.7. Via Retal ............................................................................................................................................. 17
3.5. E. OLERACEA MARTIUS ............................................................................................................................... 17
3.6. ÁCIDOS GRAXOS ......................................................................................................................................... 22
3.7. ALTERNATIVAS FARMACOTÉCNICAS .......................................................................................................... 26
3.8. MICELAS POLIMÉRICAS DE PLURONIC®
F-127 (F127) ................................................................................. 28
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 31
4.1. MATERIAL................................................................................................................................................... 31
4.2. CARACTERIZAÇÃO DO ÓLEO DE AÇAÍ. ......................................................................................................... 31
4.3. PREPARO DAS FORMULAÇÕES ..................................................................................................................... 32 4.4. DETERMINAÇÃO DO DIÂMETRO MÉDIO, ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO E POTENCIAL ZETA DAS MICELAS DAS
FORMULAÇÕES. .................................................................................................................................................. 33
4.5. AVALIAÇÃO DO MICROAMBIENTE MICELAR DAS FORMULAÇÕES POR ESPECTROFLUORIMETRIA ................. 34 4.6. AVALIAÇÃO DO EFEITO HIPOGLICÊMICO DAS FORMULAÇÕES ADMINISTRADAS POR VIA RETAL EM RATAS
ALBINAS FISCHER, SAUDÁVEIS E DIABÉTICAS. ................................................................................................... 36
4.6.1. Animais ............................................................................................................................................... 36
xvi
4.6.2. Delineamento Experimental ............................................................................................................... 36
4.6.3. Determinação da glicemia .................................................................................................................. 37
4.6.4. Indução do Diabetes ........................................................................................................................... 37
4.6.5. Análise estatística ............................................................................................................................... 37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 38
5.1. CARACTERIZAÇÃO DO ÓLEO DE AÇAÍ E DO ÁCIDO OLEICO POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A
ESPECTRO DE MASSAS. ....................................................................................................................................... 38 5.2. DETERMINAÇÃO DO DIÂMETRO MÉDIO, ÍNDICE DE POLIDISPERSÃO E POTENCIAL ZETA DAS MICELAS DAS
FORMULAÇÕES. .................................................................................................................................................. 43
5.3. AVALIAÇÃO DO MICROAMBIENTE MICELAR DAS FORMULAÇÕES POR ESPECTROFLUORIMETRIA ................. 46 5.4. AVALIAÇÃO GLICÊMICA APÓS ADMINISTRAÇÃO RETAL DAS FORMULAÇÕES DE F127 EM RATAS ALBINAS
SAUDÁVEIS E DIABÉTICAS DA LINHAGEM FISCHER. ............................................................................................ 49
6. CONCLUSÕES................................................................................................................... 57
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 59
8. ANEXO ................................................................................................................................ 69
1
1. INTRODUÇÃO
O Diabetes mellitus (DM) se constitui num importante problema de saúde pública
mundial, atingindo em 2012 cerca de 366 milhões de indivíduos segundo dados da Federação
Internacional de Diabetes (IDF).
Em 1921, com a descoberta da insulina (INS), o tratamento do DM tipo I, que era uma
doença considerada fatal tornou-se uma síndrome metabólica crônica controlável
(CORONHO et al., 2001). A obtenção da INS por engenharia genética foi possível devido à
elucidação do modelo estrutural da molécula de DNA por Watson e Crick em 1953, fato que
impulsionou as pesquisas genéticas e criou condições para avanços na área farmacêutica. Com
isso, na década de 70, a molécula de INS foi sintetizada com propriedades próximas da
molécula fisiológica e com elevado grau de pureza, a fim de se obter um controle eficaz dos
níveis glicêmicos de pacientes diabéticos (OLIVEIRA; MANTOVANI, 2009).
A terapia convencional para o tratamento da DM utiliza injeções de INS administradas
por via parenteral, principalmente por via subcutânea (CHIEN, 1996). Esse tipo de
administração da INS pode gerar alguns efeitos secundários indesejáveis nos locais de
aplicação como lipoatrofia e lipohipertrofia, além do incômodo da injeção por si só
(RAMKISSOON et al., 1999).
Diversas vias alternativas para a administração de INS veem sendo investigadas com o
objetivo de se obter terapêuticas menos invasivas que a das injeções. Dentre elas se destacam
as vias oral, nasal, pulmonar, ocular, transdérmica e retal (SANTOS, 2000; OBACH;
GUTERRES, 1999). Porém, a via pulmonar conseguiu aprovação clínica para substituir a via
subcutânea (SIEKMEIER; SCHEUCH, 2008), assim como a INS inalável (aspirada por via
oral) para ser utilizada na forma de pó para inalação, que recentemente obteve aprovação do
Food and Drug Administration (FDA), órgão do governo dos Estados Unidos, criado em
1862, que atua no controle de alimentos e medicamentos, através de diversos testes e
pesquisas (NEWS.MED.BR, 2014).
A administração de INS pela via oral seria, provavelmente, a melhor maneira de se obter
a adesão de pacientes diabéticos ao tratamento. Outro benefício desta via seria a passagem da
INS pelo fígado, que poderia evitar ou reduzir a hiperinsulinemia sistêmica comum à
aplicação subcutânea (LEE, 1991). Entretanto, o elevado peso molecular e a reduzida lipofilia
são características que dificultam uma absorção satisfatória desse hormônio em mucosas.
Além disso, a absorção da INS pela mucosa gastrointestinal sofre interferência direta de
2
enzimas proteolíticas do estômago e intestino delgado, reduzindo consideravelmente a
quantidade de INS disponível para ser absorvida (HOFFMAN; ZIV, 1997).
A via retal apresenta como vantagem a baixa concentração de enzimas, como as
proteases, presentes no trato gastrintestinal e que potencialmente degradam peptídeos como a
INS. Outro fato relevante na administração de fármacos pela via retal é que pelo menos 50%
do fluxo venoso retal possui acesso à circulação hepática e dessa forma a hiperinsulinemia
sistêmica poderia ser diminuída (CALDWELL, 1982).
Entretanto, pesquisas demonstraram que as concentrações de INS no plasma se alteram
de maneira significativa quando a administração do peptídeo é realizada em presença de
promotores de absorção (CALDWELL, 1982). O uso de surfactantes (ICHIKAWA et al.,
1980) e promotores de absorção tais como ácidos graxos insaturados e poli-insaturados
(MORISHITA et al.; SUZUKI et al., 1998) na formulação demonstraram bons resultados no
que tange ao aumento da absorção da INS, assim o uso dessas substâncias na formulação faz-
se justificável.
Ácidos graxos promotores de absorção são compostos endógenos constituintes de
biomembranas e estão presentes em quase todos os tecidos humanos, sendo amplamente
utilizados como agentes permeadores (FISCHER, 1989) em sistemas de entrega de fármacos
administrados pela via pulmonar (WANG; HANSON, 1988) e intestinal (MURANISHI,
1997; MORISHITA et al., 1998; SUZUKI et al., 1998).
Em meio ao desenvolvimento de formulações capazes de veicular a INS de maneira
eficaz destaca-se o sistema polimérico de géis aquosos de Pluronic® F-127 (F127)
(BARICHELLO et al., 1999a). Barichello e cols. (1999a) demonstraram que as propriedades
de F127 combinadas às características dos ácidos graxos insaturados e poli-insaturados,
resultaram num marcante efeito hipoglicêmico de INS após administração retal
(BARICHELLO et al., 1999a) e bucal (MORISHITA et al., 2001) em ratos normais.
O F127 é um tensoativo polimérico não iônico que em soluções aquosas na concentração
≥ 20% p/p constituem líquidos micelares a baixas temperaturas, transformando-se em géis
semi-sólidos a temperaturas superiores a 25ºC (SCHMOLKA, 1991).
Devido à existência de uma rica composição em ácidos graxos insaturados e poli-
insaturados em frutos e castanhas da biodiversidade brasileira, tal como no óleo de açaí
(Euterpe oleracea Martius.), cria-se a hipótese de que o óleo de açaí possa atuar como
potencial promotor de absorção da INS em mucosas. Esta perspectiva pode se tornar uma
alternativa inovadora no desenvolvimento de uma formulação não invasiva para a
administração de INS. Visto que o óleo de açaí, além de ser rico em ácidos graxos saturados e
3
insaturados, contem outras substâncias lipídicas e proteicas que conferem ação antioxidante,
acredita-se este que possa não apenas promover a absorção da INS, mas também, proteger a
mucosa em utilização continuada como a requerida para o tratamento do DM.
Desta forma, neste trabalho, formulações de F127, contendo INS e óleo de açaí, foram
desenvolvidas e o efeito hipoglicêmico destas formulações após administração retal em ratas
albinas saudáveis e diabéticas da linhagem Fischer foi avaliado.
4
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Desenvolver formulações de F127 contendo INS e óleo de açaí (E. oleracea) e avaliar o
efeito hipoglicêmico destas formulações em ratas albinas saudáveis e diabéticas, da linhagem
Fischer.
2.2. Os objetivos específicos
Caracterizar o óleo de açaí (E. oleracea) quanto à composição de ácidos graxos e
suas quantidades utilizando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas;
Desenvolver formulações de F127 contendo INS e óleo de açaí (E. oleracea);
Determinar o diâmetro médio das micelas das formulações, utilizando o método
do espalhamento dinâmico da luz;
Avaliar o microambiente micelar das formulações por espectrofluorimetria
utilizando o pireno como sonda fluorescente;
Avaliar o efeito hipoglicêmico das formulações após administração retal em ratas
albinas saudáveis e diabéticas, da linhagem Fischer.
5
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Diabetes mellitus (DM)
O DM é um conjunto de distúrbios metabólicos com etiologias heterogêneas,
caracterizados por um fator comum que é a hiperglicemia, podendo ocasionar outras
alterações, tais como, a modificação do metabolismo de carboidratos, proteínas e gorduras,
que são resultantes de defeitos na secreção e/ou ação da insulina (SBD, 2014).
Há indícios que remontam referências a esta doença há cerca de 1550 anos A.C em um
papiro denominado de “Papiro de Ebers” descoberto no Egito. Considerada doença rara à
época, existem autores contemporâneos que consideram o DM uma epidemia de escala global
(WILLIAMS; PICKUP, 2004).
Os fatores de risco do DM tipo 2 (DM2) contribuem muito para a crescente prevalência
da doença no mundo, dentre eles a obesidade e falta ou inadequada atividade física (FORD et
al., 1997; BJÖRNTORP, 1997). O envelhecimento da população mundial devido à
longevidade também tem contribuído de maneira significativa para a elevação dos números de
casos de DM, conforme dados do Centro de Prevenção e controle de doenças localizado em
Atlanta – EUA (CDC, 2015).
Por ser uma doença crônica e complexa, o DM exige cuidados médicos contínuos,
manutenção do controle glicêmico e algumas ações de prevenção para redução do risco de
aparecimento de outras complicações relacionadas ao DM. Além dessas ações de prevenção e
do tratamento medicamentoso, a educação e conscientização dos portadores da doença são
fundamentais para o controle e melhorias na qualidade de vida (DIABETES CARE, 2014).
Em países desenvolvidos, o DM é uma das principais causas de cegueira, insuficiência
renal e amputação de membros inferiores, sendo considerada também uma das mais
relevantes causas de morte, já que 70-80% dos doentes morrem em decorrência de doenças
cardiovasculares (OMS, 2008). Além das complicações inerentes ao decurso evolutivo da
doença, o DM traz bastante sofrimento humano e onera de sobremaneira os sistemas de saúde
pública e privados (ADA, 1997).
6
3.1.1. Prevalência
O DM acometeu aproximadamente 366 milhões de indivíduos no mundo em 2012,
conforme dados da Federação Internacional de Diabetes (IDF). A organização estima que a
prevalência da doença na América Central e América do Sul gire em torno de 26,4 milhões de
pessoas, com projeção de 40 milhões em 2030 e, no mesmo ano, valores mundiais de 552
milhões de casos aproximadamente (IDF, 2012).
O Brasil aparece na quinta posição entre os países com maior número de pessoas
diabéticas no mundo, sendo que em 2011 6,5% da população brasileira possuía a doença, o
que significa 12,4 milhões de pessoas. Estimativas apontam que em 2030 o Brasil alcance a
quarta posição com 19,6 milhões de diabéticos. O DM gerou um gasto mundial de 465
bilhões de dólares em média no ano de 2011, o que representa 11% dos gastos totais da saúde
com indivíduos adultos no mundo, no Brasil a média de gastos por diabético foi de 1038
dólares, gerando um gasto anual de mais de 10 milhões, não considerando custos
indiretamente envolvidos, como afastamentos do trabalho e diminuição da produtividade
(IDF, 2012).
No período compreendido entre 2006 e 2012 foi realizada no Brasil uma pesquisa
denominada Vigitel (Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por
Inquérito Telefônico) na qual registrou um aumento de 40% no número de pacientes
declarados diabéticos. Durante o intervalo descrito, o diagnóstico da doença nos indivíduos
portadores da síndrome metabólica aumentou de 5,3% para 7,4%, sendo que esse crescimento
foi mais pronunciado nas mulheres do que nos homens, registrando elevação de 8,1% e 6,5%,
respectivamente. O crescimento do número de pessoas diabéticas no país ocorreu em todas as
faixas etárias, sendo mais expressivo na faixa de 35 e 44 anos de idade, correspondendo a
uma elevação de 26,6% no intervalo de realização da pesquisa (BRASIL, 2012).
A prevalência do DM é bastante diferente entre países e grupos étnicos distintos. O estilo
de vida também influencia bastante nas diferenças percentuais do número de casos existentes
no mundo todo, como exemplo, comunidades migrantes que alteram seus hábitos em um
curto espaço de tempo. Isso foi demonstrado num estudo realizado com a comunidade
nipônica no Brasil, onde houve um aumento considerável na prevalência do DM entre os anos
de 1993 e 2000, passando de 18,3% para 34,9% nesse período. Logo, modificações no estilo
de vida associadas com uma possível susceptibilidade genética promove um impacto
considerável na prevalência da doença (SBD, 2014).
7
3.1.2. Classificação
A classificação atual para o DM segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) e a
Associação Americana de Diabetes (ADA) baseia-se em quatro classes clínicas: DM tipo 1
(DM1), DM tipo 2 (DM2), outros tipos específicos de DM e DM gestacional conforme
apresentado na Tabela 1. Existem ainda fatores de risco que podem desencadear DM e
doenças cardiovasculares (DCVs) denominados de pré-diabetes, que são a glicemia de jejum
alterada e a tolerância à glicose diminuída (SBD, 2014).
Tabela 1 – Classificação Etiológica do DM
DM1
Autoimune
Idiopático
DM2
Outros tipos específicos de DM
DM gestacional
Fonte: Adaptado de Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes, 2014.
3.1.2.1. Diabetes mellitus tipo 1 (DM1):
Forma Autoimune:
O DM1 ocorre em consequência da destruição das células β pancreáticas, o que
frequentemente gera uma deficiência absoluta na produção de INS (DIABETES CARE,
2014). Essa forma da doença está presente em 5% a 10% dos casos, sendo que na maioria das
vezes a destruição das células β pancreáticas é mediada por autoimunidade (SBD, 2014).
O elemento autoimune está muito associado ao DM1, mas a doença ainda apresenta
ligação, com certos genes do sistema antígeno leucocitário humano (HLA), tipos de alelos que
podem promover o aparecimento da doença ou mesmo proteção contra ela (TODD et al.,
1987). O processo destrutivo das células β pancreáticas é variável conforme a idade do
indivíduo, mas, em geral, apresenta-se mais rápido entre crianças. Já a forma autoimune
8
latente do adulto (LADA) ocorre de maneira mais lenta e progressiva quando comparada a
forma infantil (ERLICH et al., 2008).
Forma Idiopática:
A forma idiopática do DM1 é identificada pela ausência de marcadores de autoimunidade
contra células β pancreáticas e também por não estar associada aos haplótipos do sistema
HLA. Ela corresponde à minoria dos casos identificados de DM e seus portadores costumam
apresentar graus muito distintos de deficiência à INS, além de ser comum o aparecimento de
cetoacidose. A diferenciação do DM nas formas autoimune e idiopáticas nem sempre é viável
de ser realizada já que pesquisa e identificação de autoanticorpos em centros de saúde podem
não ocorrer devido limitação financeira e técnica, o que dificulta a determinação precisa dos
tipos de DM1 (SBD, 2014).
3.1.2.2. Diabetes mellitus tipo 2 (DM2):
O DM2 caracteriza-se por defeitos na ação e secreção da insulina, ambos são comuns
quando se manifesta a hiperglicemia, podendo em certas situações haver predomínio de um
deles. As manifestações mais comuns na DM2 são sobrepeso, obesidade e cetoacidose não
espontânea em raros casos associados a outras condições como infecções. DM2 geralmente é
diagnosticado por volta dos 40 anos de idade, mas pode ocorrer em qualquer idade, sendo
crescente o número de pessoas acometidas pela doença em idades inferiores há 40 anos (SBD,
2009).
Os subtipos de DM2 são: os tipos específicos de DM2 (defeitos genéticos na função das
células beta, defeitos genéticos na ação da insulina, doenças do pâncreas exócrino,
endocrinopatias, induzido por medicamentos ou agentes químicos, infecções e outras
síndromes genéticas distintas) e o DM gestacional (SBD, 2014).
3.1.2.3. Diabetes mellitus gestacional e outros tipos:
O DM gestacional caracteriza-se por qualquer intolerância à glicose, de magnitude
variável, com início ou diagnóstico durante a gestação. Entretanto, pacientes de alto risco e
9
que na consulta inicial de pré-natal já preenchem os critérios para diabetes fora da gestação
serão classificadas não como diabetes gestacional, mas como DM (SBD, 2014). Similar ao
DM2, o DM gestacional associa-se tanto à resistência à insulina quanto à diminuição da
função das células β pancreáticas, possuindo no Brasil incidência de casos em torno de 7%
das gestações (SCHMIDT; DUNCAN; REICHELT, 2001).
Os outros tipos de DM são assim classificados por possuírem origens diversas e serem
formas menos comum da doença, normalmente os defeitos ou fatores causadores podem ser
identificados. Estão inclusos nessa categoria os seguintes tipos: defeitos genéticos na função
das células β; induzido por medicamentos ou agentes químicos; defeitos genéticos na ação da
insulina; infecções; doenças do pâncreas exócrino; formas incomuns de DM autoimune;
endocrinopatias e outras síndromes genéticas por vezes associadas ao DM (SBD, 2014).
3.1.3. Critério diagnóstico:
Critério diagnóstico segundo a Associação Americana de Diabetes (ADA), aceito pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) e adotado também pela Sociedade Brasileira de
Diabetes (SBD). Na Tabela 2 estão indicados os valores de glicemia utilizados como
referência para o diagnóstico do DM e seus estágios pré-clínicos (SBD, 2014).
Tabela 2 – Critérios para o diagnóstico do Diabetes mellitus e seus estágios pré-clínicos, na condição
de jejum de 8 horas, 2 horas após ingesta de 75g de glicose ou situação casual.
Categoria Jejum ( 8horas ) 2 horas após ingestão
de 75g de glicose Casual
Glicemia normal < 100 < 140 ----
Tolerância à glicose
diminuída > 100 a < 126 ≥ 140 a < 200 ----
Diabetes mellitus ≥ 126 ≥ 200 ≥ 200 (com sintomas
clássicos) ***
Fonte: Adaptado de Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD, 2014).
Os sintomas clássicos de DM (***) incluem poliúria, polidipsia e perda não explicada de
peso. O diagnostico do DM deve sempre ser confirmado pela repetição do teste em outro dia,
a menos que haja hiperglicemia inequívoca com descompensação metabólica aguda ou
sintomas óbvios de DM.
10
3.2. Insulina
As células β das ilhotas de Langerhans localizadas no pâncreas sintetizam e secretam a
INS, hormônio que determina os níveis fisiológicos normais da glicose no organismo e tem
como alvo o fígado, os tecidos musculares e o tecido adiposo corpóreo. A INS, representada
na Figura 1, molécula de natureza polar com peso molecular em torno de 5734 Daltons,
possui 51 aminoácidos distribuídos nas cadeias A e B que estão unidas por pontes dissulfeto.
As INS humana, bovina e suína diferem estruturalmente na posição e no número de
aminoácidos presentes nas duas cadeias. Dentre as ações biológicas da INS humana destacam-
se a utilização e armazenamento celular da glicose, aminoácidos e ácidos graxos como
representantes dos processos anabólicos, entretanto, a degradação do glicogênio, lipídeos e
proteínas é proveniente da inibição de processos catabólicos (GOODMAN; GILMAN, 2005).
Figura 1 – Representação esquemática da sequência de aminoácidos da insulina humana.
Fonte: RASKIN, 2006.
As pontes de dissulfeto e as ligações de Van Der Waals são primordiais para a
manutenção da estrutura tridimensional da INS e conformação necessária para a atividade
hipoglicemiante. A molécula de INS, conforme representada na Figura 2, pode existir sob a
forma monomérica, onde exerce sua atividade biológica, sob a forma de dímero ou hexâmero
formado pela associação de três dímeros; sendo que as condições de pH, presença de íons
zinco, além de outros fatores fisiológicos, determinam a existência dessas formas distintas de
INS (CHIEN, 1996).
11
Figura 2 – Insulina: monômero, dímero e hexâmero.
Fonte: Adaptado de CHIEN, 1996.
A difusão de moléculas de glicose para dentro da maioria das células do organismo
humano é relativamente pequena quando na ausência de INS, excetuando-se células hepáticas
e cerebrais. Dessa maneira o fornecimento de energia para as funções normais necessárias ao
metabolismo celular não é suficiente quando encontramos apenas a molécula de glicose livre
na circulação sanguínea, que não está disponível à absorção devido à ausência e/ou redução
da concentração de INS circulante (BAZOTTE, 2010).
A glicose em níveis normais é de extrema importância, pois se trata do único substrato
utilizado pelo cérebro, pela retina e pelo epitélio germinativo das gônadas. A concentração de
glicose sanguínea deve permanecer num patamar capaz de fornecer a energia necessária, sem
comprometer outras funções e tecidos por estar em excesso na corrente sanguínea, o que
poderia levar à desidratação celular, diurese aumentada, lesões em vasos sanguíneos e
também a eliminação de glicose através da urina (GUYTON; HALL, 2006).
O DM passou a ser um distúrbio metabólico crônico controlável pela primeira vez, no
ano de 1922 através da utilização terapêutica de extratos de pâncreas bovino. No entanto,
anteriormente, já existiam formulações disponíveis comercialmente, mas de uma maneira
geral não eram puras e em alguns casos causavam reações imunológicas, além de possuir
farmacodinâmica e farmacocinética, distintas (BORGOÑO; ZIMMAN, 2012).
Atualmente existem diversas formulações ultra puras de INS e análogos, disponíveis sob
formas distintas e com características que permitem absorção subcutânea mais rápida,
resposta hipoglicêmica antecipada, elevação da INS circulante e menor duração de efeito
(CORONHO et al., 2001; WANNMACHER, 2005).
12
3.3. Insulinoterapia
A administração parenteral de INS pode ser realizada pela via intravenosa, intramuscular
e, no tratamento crônico, utiliza-se predominantemente a via subcutânea. A insulinoterapia
possui como principal objetivo restabelecer os níveis basais de INS normal, de jejum, entre as
refeições e durante as refeições (KATZUNG; WALSH, 2003).
As apresentações parenterais de INS disponíveis no mercado são classificadas segundo a
duração de seu efeito, basicamente em: ultrarrápida, rápida (curta ação), ação intermediária,
basal (longa duração) e bifásica (curta e longa duração). Outra classificação existente diz
respeito à espécie de origem da INS, sendo elas a INS humana, bovina, suína e a mistura das
formas bovina e suína respectivamente (KATZUNG; WALSH, 2003). Na Figura 3 estão
ilustrados os picos de ação das diferentes formas de INS. Na Tabela 3 estão representados
alguns tipos de preparações de INS humana subcutânea, disponíveis no Brasil para o
tratamento do DM.
Figura 3 – Farmacocinética da insulina e análogos.
Fonte: PIRES & CHACRA2008.
13
Tabela 3 – Preparações de insulina humana subcutânea, disponíveis no Brasil, com seus respectivos
perfis farmacocinéticos.
Insulina humana
subcutânea Perfil farmacocinético
Início Pico Duração
Ultra – rápida Aspart 10 – 20 min 1 – 3 h 3 – 5 h
Lispro 15 min 0,5 – 1,5 h 4 – 6 h
Glulisina 5 – 10 min 0,5 – 1,5 h 4 – 6 h
Rápida Regular 0,5 – 1,5 h 2 – 3 h 3 – 6 h
Intermediária NPH 2 – 4 h 6 – 10 h 14 – 18 h
Basal Detemir ---- ---- 12 – 24 h
Glargina ---- ---- 16 – 24 h
Bifásica NPH/Regular 0,5 h 6 – 10 h 14 – 18 h
Lispro 15 min 6 – 10 h 14 – 18 h
Aspart 10 – 20 min 6 – 10 h 14 – 18 h
Fonte: Adaptado de BAZOTTE, 2010.
Pesquisas objetivando desenvolver formulações para a administração de INS por vias
alternativas à subcutânea estão sendo realizadas. O intuito principal é proporcionar conforto
aos pacientes e melhorar a disponibilidade da INS ao fígado, para se aproximar do controle
glicêmico fisiológico. A administração de peptídeos na circulação sistêmica através de
métodos não invasivos tem sido alvo da área médica e da indústria farmacêutica, destacando-
se as vias pulmonar, oral, transdérmica, nasal, retal e ocular (BARICHELLO et al., 1999a;
OBACH; GUTERRES, 1999; SANTOS, 2000).
A via pulmonar foi à primeira via alternativa à administração subcutânea de INS humana
com aprovação clínica. Entretanto, esta via possui algumas desvantagens, tais como, a baixa
biodisponibilidade relativa (10%) de INS, além de o tratamento ser muito oneroso em
comparação a via subcutânea. Como fatores positivos desta via estão a melhor aceitação e
adesão ao tratamento pelo paciente e a redução de algumas complicações relacionadas à
administração pela via subcutânea (SIEKMEIER; SCHEUCH, 2008).
14
3.4. Perspectivas acerca das vias de administração alternativas à via parenteral
3.4.1. Via Oral
A administração de INS pela via oral é de extremo interesse, visto a facilidade de uso e a
inexistência de dor associada à administração (FADISTA, 2011). Esta via também promove
maior comodidade e adesão dos pacientes ao tratamento, reduzindo o risco de infecções e
outras complicações decorrentes da administração por via parenteral, em destaque a via
subcutânea (FADISTA, 2011; YADAV et. al., 2009).
Através da via oral, a INS passaria em elevadas concentrações no fígado após ser
absorvida pelo intestino, o que simularia a secreção fisiológica do pâncreas exercendo
também um efeito direto sobre a glicose produzida no fígado (SHAH et. al., 2010). Contudo,
diversos inconvenientes ao desenvolvimento de formulações de INS para administração oral
existem, como, por exemplo, reações de desnaturação e degradação em decorrência do baixo
pH do estômago, degradação intestinal pela ação de enzimas proteolíticas (tripsina e pepsina,
responsáveis pela degradação de aproximadamente 20% das proteínas ingeridas na dieta) e
pelas próprias características estruturais (hidrofilia e tamanho) da molécula de INS (GUPTA
et. al., 2010).
Para superar estas limitações, tem sido investigada a utilização de promotores de
absorção, biofilmes, revestimentos entéricos, inibidores de proteases e formulações de
nanopartículas, lipossomas, nanocápsulas, microesferas, dentre outras. Conquanto, não se
obteve ainda o sucesso clínico esperado no que tange as diferentes formas farmacêuticas
testadas (VAGUE; RACCAH, 2006).
3.4.2. Via Nasal
O interesse pela administração de INS pela via nasal é devido à elevada área superficial
disponível para absorção, em torno de 150 cm2, recoberta por um epitélio rico em
microvilosidades (FADISTA, 2011). Nesta via de administração, o efeito de primeira
passagem pelo fígado não está presente, isso porque o sangue venoso que circula no tecido
nasal está intimamente vinculado à circulação sanguínea sistêmica (MOELLER et al., 2008).
15
Desta forma, menores doses precisam ser administradas para que os níveis terapêuticos de
INS sejam alcançados mais rapidamente.
Entretanto, esta via de administração apresenta alguns inconvenientes, como, por
exemplo, a barreira mucociliar que dificulta o contato do fármaco com a mucosa, a presença
de enzimas proteolíticas, além de fatores físico-químicos associados à formulação
administrada (dosagem, tempo e frequência de administração, volume e concentração de INS
e presença de promotores de absorção) (SIEKMEIER; SCHEUCH, 2008). Todavia, a via
nasal ainda se configura como potencial via alternativa para administração de INS, mas
necessita de estudos que possam garantir maior segurança e eficácia clínica (GUPTA et. al.,
2010).
3.4.3. Via Pulmonar
A via pulmonar oferece uma elevada área superficial para absorção de fármacos de ação
sistêmica, como peptídeos e proteínas (FADISTA, 2011). A área superficial é de
aproximadamente 140 m2 com elevada vascularização e a pouca espessura do epitélio alveolar
permite rápida absorção de fármacos e consequente antecipação do início de ação, além da
ausência dos efeitos de degradação enzimática e metabolismo de primeira passagem (AGU et
al., 2001; CUNHA, 2009).
Entretanto, uma ação mais eficaz de uma formulação de INS administrada pela via
pulmonar é limitada pelos mecanismos de defesa pulmonar, como macrófagos alveolares e
certa atividade enzimática (FADISTA, 2011). O tamanho das partículas (2 a 3 μm) da
formulação, assim como a densidade e outras propriedades aerodinâmicas (podem provocar
deposição e compactação de partículas) das mesmas devem possuir um valor ótimo de modo
que possa haver absorção adequada e ausência de reações imunológicas, protegendo a INS e
garantindo sua absorção sistêmica (CRYAN, 2005; ROGUEDA; TRAINI, 2007).
3.4.4. Via bucal
Trata-se de uma via de administração ainda pouco estudada quando comparada às outras
vias de administração de peptídeos e proteínas. Uma provável explicação para o pequeno
número de estudos relacionados a essa via, é a de que a área não queratinizada do epitélio
bucal é pequena (cerca de 100 cm2), isso dificulta a absorção de macromoléculas como a INS.
16
Apesar da pequena área de absorção, a via bucal permite utilização de formulações mais
simples, além de evitar o metabolismo de primeira passagem pelo fígado (CUNHA, 2009;
GONDA, 2000).
A utilização de promotores de absorção e inibidores enzimáticos em formulações para
administração de INS pela via bucal permite elevação na absorção do fármaco, entretanto, a
ocorrência de efeitos adversos relacionados a essa via é frequente, tais como reações alérgicas
e irritação da mucosa local (MOELLER et al., 2008).
3.4.5. Via Transdérmica
A via de administração transdérmica possui boa adesão dos pacientes, permite o controle
de liberação da INS da formulação, além de evitar a degradação enzimática e o efeito de
primeira passagem pelo fígado (CUNHA, 2009). Entretanto, macromoléculas como a INS não
são bem absorvidas por essa via de administração devido ao elevado tamanho e peso
molecular e a baixa lipofilia. Outro fator limitante é o grau de hidratação da pele, já os efeitos
adversos mais comuns à via transdérmica, são a irritação e o dano cutâneo provenientes de
uma terapia crônica (KHAFAGY et al., 2008).
3.4.6. Via Ocular
A via ocular possui uma elevada taxa de absorção, tão rápida quanto à via parenteral,
entretanto, possui elevada sensibilidade, o que propicia o surgimento de um espectro de
reações imunológicas mais pronunciadas quando comparadas às outras vias de administração
(CUNHA, 2009). Diante do exposto, a via ocular continua sendo uma alternativa terapêutica
de caráter mais teórico à administração de INS. Fatores relacionados à formulação ocular de
INS interferem de maneira significativa na eficácia terapêutica, dentre eles, o tamanho das
partículas, a solubilidade dos excipientes e características inertes dos mesmos (CUNHA,
2009; MOELLER et al., 2008).
Uma vantagem relacionada à administração da INS por via ocular diz respeito à ausência
do efeito de primeira passagem a nível hepático, e também degradações enzimáticas que
poderiam ocorrer a nível gastrointestinal (CRYAN, 2005; KHAFAGY et al., 2008).
17
3.4.7. Via Retal
Nos últimos anos houve um grande crescimento nas pesquisas relacionadas à
administração de INS por via retal, por se tratar de uma via de administração com
características mais próximas das obtidas pela fisiologia normal do peptídeo (ROSEN;
ABRIBAT, 2005; SUDHAKAR et al., 2006).
Em comparação as outras vias de administração de INS, a maior vantagem dessa via diz
respeito à redução dos efeitos do metabolismo de primeira passagem quando comparada à via
subcutânea (CUNHA, 2009; KHAFAGY et al., 2008). A via retal oferece a vantagem da
independência da motilidade intestinal e do tempo de esvaziamento gástrico e da dieta. Outra
vantagem significativa desta via é a de que a presença de enzimas que promovem degradação
da INS diminui à medida que se aproxima da porção distal do intestino delgado e da região
retal (BARICHELLO et al., 1999a; MORISHITA et al., 2001).
3.5. E. oleracea Martius
O naturalista alemão Carl Von Martius no período compreendido entre 1817 e 1820
participou de uma expedição pelo interior brasileiro realizando um levantamento de espécies
de plantas ainda não catalogadas. Ao fim da viagem as descrições das espécies encontradas
foram reunidas e deram origem à obra Flora brasiliensis, o maior documento a respeito da
flora de um país, na história da botânica mundial (LEITMAN et al., 2015). Entre suas
descobertas está a E. oleracea Martius (identificada nas exsicatas das Figuras 6 e 7), palmácea
que produz os frutos do açaí, os quais originam diversos produtos, tais como bebidas, doces,
nutracêuticos, vitaminas, cosméticos, óleos e insumos farmacêuticos.
O açaizeiro (E. oleracea), representado na Figura 4, natural da região amazônica
brasileira, é uma palmácea presente principalmente no Estado do Pará. Frequentemente
encontrado também nos Estados do Amapá, Maranhão, Mato Grosso e Tocantins. A maior
parte da reserva nativa ocorre em solos de várzeas e igapós, constituindo ecossistemas de
floresta natural e maciços (açaizais), totalizando uma área de aproximadamente um milhão de
hectares (EMBRAPA, 2006).
De acordo com a Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias (EMBRAPA), a
espécie E. oleracea destaca-se por ser importante fonte de alimento para as populações da
região amazônica e constituir a principal fonte de matéria-prima para a agroindústria
brasileira de palmito, atingindo também diversificado mercado interno de consumo da polpa
18
do açaí, bem como a exportação de produtos in natura, acabados e semiacabados para vários
países. A extração de frutos do açaizeiro no Estado do Pará passou de 92.021 toneladas em
1997, para 122.322 no ano de 2002, obtendo um crescimento na ordem de 33%. Cerca de
80% da produção de frutos do açaizeiro origina-se do extrativismo, conforme observamos na
Figura 5, já os 20% remanescentes são oriundos do manejo e cultivo em várzea e terra firme
(TINOCO, 2005).
Figura 4 – Açaizeiro – Família das palmáceas.
Fonte: Associação Brasileira de Assistência Técnica e Extensão Rural, Novembro de 2012.
Figura 5 – Extrativismo do fruto no açaizeiro.
Fonte: Associação Brasileira de Assistência Técnica e Extensão Rural, Novembro de 2012.
19
Figura 6 – Exsicata da espécie E. oleracea Martius coletada na reserva da FUNAI em
Tocantinópolis - TO.
Fonte: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) – Herbário Virtual das Flores e Fungos.
20
Figura 7 – Exsicata dos frutos da espécie E. oleracea Martius coletada na reserva da FUNAI em
Tocantinópolis – TO.
Fonte: Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) – Herbário Virtual das Flores e Fungos.
O óleo de açaí oriundo dos frutos do açaizeiro (E. oleracea) é um líquido viscoso com
coloração verde, rico em antocianinas (substâncias antioxidantes), fitoesteróis (β-sitosferol,
stigmasterol e campesterol, substâncias que promovem metabolismo celular e reduzem
processos inflamatórios) e ácidos graxos, principalmente os ácidos oléico e linoléico. Estudo
realizado por He e colaboradores demonstrou que o β-sitosterol se encontrava em maior
concentração dentre os esteróis totais quantificados a partir de um extrato etéreo do óleo de
açaí liofilizado. O extrato em questão também evidenciou atividade antioxidante, por meio do
ensaio de capacidade de eliminação total de radicais livres de oxigênio (HE et al, 2014).
Na Tabela 4 estão representados os tipos e as concentrações de ácidos graxos presentes
no óleo de açaí, segundo NASCIMENTO, 2008. É relevante salientar que as proporções de
ácido oleico presentes no óleo de açaí, segundo as análises realizadas por Nascimento e cols.
21
(2008) e Schauss e cols. (2006), foram próximass, alcançando respectivamente 52,54% e
56,2% do total de ácidos graxos da amostra.
Tabela 4 – Composição de ácidos graxos presentes no óleo de açaí em porcentagem (%) e a proporção
em átomos de carbono.
Ácidos Graxos
Átomos de carbono Composição (%)
Láurico
Mirístico
Palmítico
Palmitoléico
Esteárico
Oléico (cis 9)
Vacênico (cis 11)
Linoléico
Linolênico
Arâquico
Não identificados
Ácidos graxos saturados
Ácidos graxos insaturados
12:00
14:00
16:00
16:10
18:00
18:10
18:10
18:20
18:30
20:00
0,04
0,11
25,93
4,88
1,86
52,54
3,39
9,72
0,64
0,12
0,77
28,06
71,17
Fonte: NASCIMENTO, 2008
22
3.6. Ácidos Graxos
Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos geralmente representados pela fórmula química
genérica RCO2H e na maioria das vezes, o grupamento R é uma cadeia carbônica longa, não
ramificada com número par de átomos de carbono, aparecendo na forma saturada ou
insaturada (BRUICE, 2006).
Os ácidos graxos saturados possuem fórmula geral conforme a primeira estrutura
representada pela Figura 8 e apresentam-se sólidos a temperatura ambiente porque possuem
pontos de fusão elevados (COULTATE, 2004). Os ácidos graxos insaturados são
denominados monoinsaturados quando possuem uma única dupla ligação e poli-insaturados
quando possuem duas ou mais duplas ligações (Fig. 8) (VOET; PRATT, 2008).
Figura 8 – Estrutura química geral dos ácidos graxos.
Na cadeia carbônica insaturada, a posição dos hidrogênios determina as configurações cis
e trans (cis, hidrogênio no mesmo plano espacial ou trans, em planos distintos) da molécula
de ácido graxo, conforme ilustrado na Figura 9. As moléculas que possuem a configuração
trans são mais rígidas e lineares, enquanto a isomeria cis determina uma dobra na cadeia
dificultando a agregação e gerando estruturas não tão rígidas. As diferenças isoméricas das
estruturas conferem propriedades físicas distintas, fato que condiciona ponto de fusão mais
elevado da conformação trans em comparação à forma cis (PADOVESE; MANCINI, 2002).
23
Figura 9 – Estereoquímica cis e trans representativa das cadeias insaturadas dos ácidos graxos.
Na Figura 10 é representada a fórmula estrutural do ácido oleico. O ácido oleico, ou ácido
cis-octadecen-9-óico, é o ácido graxo mais abundante em óleos e gorduras. Trata-se de um
ácido graxo não essencial (o organismo é capaz de sintetizá-lo a partir de outros ácidos
graxos) de cadeia longa, amplamente conhecido como ômega 9. Possui papel importante na
síntese de hormônios e é sintetizado a partir da hidrólise da gordura animal e de certos
vegetais (KARLESKIND, 1996).
Figura 10 – Fórmula estrutural da molécula de ácido oleico.
.
O ácido oleico tem sido usado como aditivo na indústria farmacêutica e química na
preparação de sabões, sabonetes, cremes, emulsões, bronzeadores, lubrificantes,
desengraxantes e plastificante (KARLESKIND, 1996).
O ácido linoleico (ômega 6) ou ácido 9-12-octadecadienoico, representado na Figura 11,
é um ácido graxo de 18 carbonos e duas duplas ligações (C 18:2), sendo encontrado
principalmente em óleos vegetais como os de soja, cártamo, milho, açaí e canola. O ácido
24
linoleico e o linolênico são considerados ácidos graxos essenciais, pois não podem ser
sintetizados pelo organismo humano, além de atuarem em diversas funções fisiológicas
(MOSHFEGH et al., 2005).
Figura 11 – Fórmula estrutural da molécula de ácido linoleico.
O ômega 6 é precursor de outros ácidos graxos essenciais como o ácido araquidônico
(ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA) e docosahexaenóico (DHA), presentes em membranas
biológicas. Possui emprego diverso na indústria farmacêutica, relatado no tratamento de
doenças como dermatites, atuando também como “agente protetor” na prevenção do câncer de
próstata, degeneração muscular, isquemias e epilepsias (WHIGHAN et al., 2000).
O ácido palmítico ou hexadecanóico (C 16:0) é um ácido graxo saturado, normalmente
encontrado como constituinte majoritário dos ácidos graxos totais em óleos oriundos de
vegetais, sendo também encontrado em animais e microrganismos. Como representante dos
ácidos graxos saturados, o ácido palmítico se encontra em estado sólido à temperatura
ambiente (SCHWARTZ et al., 2008). É composto por átomos de carbono ligados através de
ligações simples mais um grupo carboxílico, conforme representado pela fórmula estrutural
da Figura 12.
Figura 12 – Fórmula estrutural da molécula de ácido palmítico.
O ácido palmítico é utilizado na produção de sabonetes, cosméticos em geral, como
agente co-surfactante ou biossurfactante (ácidos graxos, geralmente aniônicos e neutros) em
sua maioria, atuando como um tensoativo que auxilia no controle da liberação de fármacos,
25
conforme ocorreu recentemente com o Sustenna®, medicamento antipsicótico de ação
prolongada utilizado no tratamento da esquizofrenia (ZEMDESG et al., 2010).
A princípio, qualquer substância inerte farmacologicamente, que consegue hidratar as
camadas epiteliais das mucosas, constitui-se num potencial promotor de absorção de
fármacos. Diante do conceito de Fator de Hidratação Natural (FHN), destacam-se os
umectantes naturais presentes na pele, a qual é composta por: 40% de ácidos graxos livres,
12% de ácido carboxílico-pirrolidona, 7% de uréia, 5% de sódio, 1,5% de cálcio, 4% de
potássio, 12% de lactose, dentre outros constituintes (BARRY, 1983). Como visto, os ácidos
graxos são constituintes naturais presentes nas membranas biológicas, sendo esperada uma
boa interação e aceitação do organismo na sua utilização como promotor de absorção.
Aungst e cols. (1986) descreveram a utilização do ácido oleico como promotor de
absorção de fármacos com características polares e apolares. Posteriormente pesquisas
revelaram que a utilização do ácido oleico como promotor de absorção de fármacos de
natureza polar foi mais eficaz comparado aos de natureza apolar (TANOJO, 1996).
Niazy (1991) demonstrou que a presença do ácido oleico (10% p/p) na formulação
aumentou cerca de 50 vezes mais a permeação da ergotamina em pele de coelhos em
comparação a formulação controle, 24 horas após a aplicação da formulação.
Morishita e cols. (1998) demonstraram que ácidos graxos, principalmente o ácido oleico
e linoleico, poderiam ser utilizados como potenciais agentes promotores de absorção intestinal
de INS formulada em emulsão múltipla A/O/A.
O uso do ácido linoleico em micelas mistas permitiu evitar possíveis danos à mucosa de
cães após a administração endoscópica, o que não ocorre quando sais biliares puros nas
mesmas concentrações foram administrados. Esse ácido graxo também demonstrou aumentar
a permeabilidade da INS presente em soluções micelares mistas administradas no duodeno e
jejuno médio e distal dos animais (SCHILLING, MITRA, 1990).
Em outro estudo, ácido palmítico foi incorpado em um sistema micelar misto contendo
glicolato de sódio, em substituição ao ácido linoleico. A promoção de absorção de INS
utilizando o ácido palmítico foi, comparativamente, mais eficiente do que usando ácido
linoleico. Tal fato foi justificado devido à formação de uma camada micelar pouco rígida
quando ácido linoleico (ácido graxo insaturado) foi utilizado, a qual não aderia de maneira tão
eficiente nas mucosas e membranas quanto aquele contendo ácido palmítico (MESIHA,
PLAKOGIANNIS, VEJOSOTH, 1994).
Tais características dos ácidos graxos justificam seu uso em sistemas de entrega e
liberação de fármacos tais como micelas, nanoesferas, nanocápsulas, lipossomas, etc..., pois
26
além de permitirem a veiculação de fármacos de natureza polar e apolar, podem auxiliar no
processo de proteção e permeação destes fármacos através de mucosas e membranas, fato que
não seria possível a estas moléculas em sua forma livre devido ao elevado peso molecular e
hidrofilia que apresentam.
As palmeiras se constituem numa fonte importante de frutos ricos em ácidos graxos
monoinsaturados e poli-insaturados, representados pelos ácidos oleico e linoleico,
respectivamente, além de ácidos graxos saturados, como o ácido palmítico (MARTIN et al.
2006). Os ácidos graxos monoinsaturados com potencial para utilização no controle de
processos inflamatórios são encontrados em óleos de origem vegetal, tais como no azeite de
oliva, óleo de canola, oleaginosas (tais como nozes, amêndoas, castanhas) e abacate. Já os
ácidos graxos poli-insaturados como o ácido linoleico, presentes em óleos vegetais, hortaliças,
cereais, leguminosas, animais marinhos, algas e fitoplâncton (NOVAIS, 2000), diminuem o
risco de doenças cardiovasculares, por promoverem a redução dos níveis de colesterol LDL
no organismo (ROBBERS et al., 1997). Os óleos e gorduras são muito importantes para a
nutrição humana, pois fornecem calorias, atuam como veículo para vitaminas do tipo
lipossolúveis (vitaminas A, D, K e E), além de serem fonte de ácidos graxos essenciais, como
ácido linoleico, linolênico e araquidônico (GURR; HARWOOD, 1996).
3.7. Alternativas Farmacotécnicas
A nanotecnologia tem proporcionado às ciências farmacêuticas instrumentos que
permitem a veiculação de fármacos de diversas naturezas, visando à diminuição de efeitos
adversos, entrega eficiente da substância ativa, problemas na absorção e disponibilidade do
princípio ativo, dentre outras dificuldades (SAKATA et al.,2007).
As nanoestruturas estão presentes numa escala intermediária entre o nível atômico e
microscópico, sendo caracterizadas normalmente por estruturas de tamanho na faixa de 1 a
1000 nanômetros aproximadamente, possuindo valores de tamanho médio em torno de 100
nm. Sistemas micelares, lipossomas, nanoemulsões, nanopartículas, soluções
macromoleculares, fulerenos, nanotubos, nanoagulhas e sistemas biométricos, são alguns dos
tipos de nanoestruturas existentes (XIA et al.,2003).
Sistemas micelares possuem ampla aplicação na indústria farmacêutica como
transportadores de fármacos ou adjuvantes farmacotécnicos (ARMSTRONG et al., 1986).
Sistemas micelares são estruturas formadas por agregados moleculares (fosfolipídeos,
27
polímeros, dentre outras substâncias de caráter tensoativo) constituídos por regiões
hidrofílicas e hidrofóbicas, que espontaneamente se associam em solução de acordo com a
concentração micelar crítica (CMC) e temperatura de micelização crítica (TMC) gerando
agregados moleculares com dimensões coloidais (nanométricas) (HINZE, 1979). Quando a
CMC é atingida, ocorre solubilização das diversas substâncias nos sistemas micelares, sendo
que a elevação da solubilidade é proporcional ao aumento da concentração de surfactante e do
número de micelas no volume total do sistema (KORNAHRENS et al.,1982).
As nanoemulsões são estruturas compostas por dois ou mais constituintes imiscíveis, de
maneira que um é a fase dispersa e o outro a fase dispersante. As nanoemulsões apresentam
partículas com diâmetros inferiores a 100 nm e com aspecto transparente, possuindo como
vantagem farmacotécnica a possibilidade de administração por diversas vias (parenteral, retal,
oral e tópica), a e perspectiva de direcionamento de fármacos com redução da resposta imune
(SANTOS, 2011).
As nanopartículas são sistemas coloidais com diâmetro médio menor do que 1 µm e
constituídas por polímeros sintéticos ou naturais (REIS et al., 2006). As nanopartículas
dividem-se em nanoesferas e nanocápsulas. As nanoesferas são matrizes poliméricas contendo
o fármaco homogeneamente disperso ou adsorvido na superfície da matriz, enquanto as
nanocápsulas constituem-se em sistemas reservatórios onde o fármaco está presente no
interior de cavidade aquosa e/ou oleosas, sendo revestida por uma camada polimérica externa,
dando origem às cápsulas (NAGARWAL et al., 2009).
Os lipossomas são as estruturas mais estudadas e difundidas. Lipossomas são vesículas
constituídas por fosfolipídios como a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,
fosfatidilglicerol e/ou esfingomielina, os quais se organizam em bicamadas concêntricas
contendo um meio aquoso central. Lipossomas podem encapsular substâncias de caráter
hidrofílico ou lipofílico em seus microambientes aquosos ou em sua membrana lipídica
(EDWARDS, BAEUMNER, 2006). Lipossomas são classificados como unilamelares ou
multilamelares, de acordo com a quantidade de bicamadas lipídicas, entretanto, são também
divididos em: lipossomas convencionais, de longa circulação, sítio-específicos e polimórficos
(FRÉZARD et. al., 2005).
Existem outras nanoestruturas sendo estudadas, cada qual com suas peculiaridades e
propostas de atuação, abrangendo uma diversidade de sistemas que surgem com o intuito de
contribuir em problemas farmacotécnicos existentes na área da saúde (DURÁN et. al., 2006).
28
3.8. Micelas poliméricas de Pluronic® F-127 (F127)
Pluronic F-127 (F127) é uma denominação comercial do copolímero anfifílico tri-bloco
poloxâmero 407, formado a partir de duas cadeias de 95-105 unidades de monômeros de
óxido de etileno (OE) nas extremidades e uma cadeia de 54-60 unidades de óxido de
propileno (OP) no centro da cadeia. A fórmula estrutural está representada na Figura 13. F127
apresenta peso molecular de aproximadamente 12.600 Daltons e caráter não iônico, possuindo
equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) igual a 22 na temperatura de 22 °C (TAKÁTS et al., 2001;
KABANOV et al., 2002). É comercializado também com os nomes Synperonic®, Tetronic®,
dentre outros, os quais estão descritos nas farmacopéias americana e europeia (ROWE et al.,
2005; KABANOV et al., 2002).
Figura 13 – Fórmula estrutural de Pluronic® F-127 – dois blocos hidrófilos de óxido de etileno
(extremidades) e um bloco hidrofóbico de oxido de propileno (centro).
Fonte: Adaptado de KABANOV et al. 2002.
F127 possui como característica peculiar, a formação de soluções aquosas a baixas
temperaturas e géis semirrígidos em temperaturas acima de 25ºC, quando em concentração
superior a 20% p/p (SCHMOLKA, 1991). A transição sol-gel é dependente da temperatura e
concentração do polímero, assim como das interações existentes nos diferentes segmentos do
copolímero tri-bloco (JUHASZ et al., 1989). Esse fenômeno ocorre quando há elevação da
temperatura, promovendo a agregação das moléculas em micelas através da aproximação das
partes hidrofóbicas (OP) das cadeias de F127 promovidas pela desidratação. O centro é então
circundado pela porção hidrofílicas (OE) da cadeia (DUMORTIER et al., 2006) conforme
representado na Figura 14.
29
Figura 14 – Mecanismo de agrupamento do Pluronic® F-127 em água, no processo de formação de
géis semirrígidos.
Fonte: DUMORTIER et al., 2006
Wanka e cols. (1990) propuseram que o processo de gelificação das soluções de F127
ocorre pelo empacotamento das micelas em mesofases (fases intermediárias) cristalinas
cúbicas, hexagonais ou lamelares, de acordo com a forma das micelas, conforme representado
na Figura 15. Copolímeros constituídos de polioxietileno são considerados termoreversíveis,
visto que, à medida que a temperatura se eleva, a viscosidade aumenta conferindo rigidez ao
gel, sendo que a concentração polimérica determinante para a ocorrência de tal fenômeno é
denominada concentração crítica de formação de gel (CHAIBUNDIT et al., 2007).
Figura 15 - Mesofase das estruturas micelares: a) cúbica, b) hexagonal e c) lamelar.
Fonte: Adaptado de Pinho (2006).
Um fator de extrema importância nos géis formados a partir de F127, diz respeito à
capacidade destes géis formarem matrizes que promovem estabilidade a proteínas e peptídeos
presentes na formulação (STRATTON et al., 1997). Adicionalmente, a transição sol-gel é um
fator muito relevante para a indústria farmacêutica, pois se aplicadas formulações em solução
podem transformar-se em gel semirrígido quando em contato com o organismo, permitindo
30
assim uma maior adesão às membranas da pele (LEE et al., 1997) e intestino (CHOI et al.,
2006), com consequente controle de liberação do fármaco (ALTINOK et al., 1999).
Dumorter e cols. (2006) relataram a utilização do F127 em formulações que objetivavam
a veiculação de fármacos sob as formas de administração retal, oftálmica, tópica, injetável e
oral. Mesiha e cols. (2002) demonstraram que soluções que continham ácido palmítico (ácido
graxo saturado), em sua composição promoveram absorção de INS pela via subcutânea, com
consequente efeito hipoglicêmico em coelhos saudáveis.
Barichello e cols. (1999) demonstraram que as peculiaridades de F127 combinadas às
características dos ácidos graxos insaturados e poli-insaturados, resultaram num marcante
efeito hipoglicêmico de INS após administração retal (BARICHELLO et al., 1999a) e bucal
(MORISHITA et al., 2001) em ratos normais.
Atualmente, a descoberta de novos fármacos não tem sido suficiente para garantir o
sucesso no tratamento de diversas doenças, isso ocorre devido a problemas relacionados à
baixa solubilidade e permeabilidade dos fármacos, assim como rápido metabolismo,
problemas na eliminação, dentre outros fatores. Tais problemas têm impulsionado o
desenvolvimento de sistemas poliméricos coloidais, tais como as micelas, candidatos a
carreadores desses fármacos, sendo esses sistemas de liberação nanoestruturados formados
por diferentes tipos de polímeros, mas com uma característica em comum, seu
tamanho/diâmetro inferior a um micrômetro (<1 μm) (MÄDER; MEHNERT, 2001).
Diante de todas as características descritas, propomos neste trabalho, desenvolver uma
formulação não invasiva de F127 contendo óleo de açaí (Euterpe oleracea) e INS, que
permita a efetiva absorção deste fármaco após administração da formulação pela via retal,
alcançando assim um efeito hipoglicêmico.
31
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material
Ácido oleico, Pluronic®
F-127 (F127) e Pireno foram adquiridos da Sigma Aldrich®,
EUA. Dihidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfatodissódico anidro e cloreto de sódio
(NaCl) foram adquiridos da Merck®, Alemanha. O óleo de açaí foi adquirido da Beraca
®,
Brasil. As soluções titulantes de ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH) foram
adquirida da Synth®, Brasil, e da Cromoline
®, Brasil, respectivamente. A insulina humana
(INS) utilizada no desenvolvimento deste trabalho foi cedida cordialmente pela
Novonordisk®, Brasil.
4.2. Caracterização do óleo de açaí.
Para realizar a caracterização química do óleo de açaí (Beraca® Brasil, Lote: 03124410R;
Código: RF4410) e padrão do ácido oleico foi realizada a derivatização das amostras para
torná-las volátil, permitindo dessa maneira, a identificação e quantificação das substâncias
presentes nas mesmas através da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.
O procedimento de derivatização foi realizado adicionando 20 µl das amostras, 50 µl de
piridina e 50 µl de bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSTFA) com 1% de TMCS,
mantidos em aquecimento na temperatura de 60ºC por 4 horas. Por fim, o volume final da
solução foi ajustado para 1 ml com hexano (BLAU; HALKET, 1993). A reação geral que
representa a sililação de compostos orgânicos utilizando o BSTFA está exemplificada na
Figura 16, caracterizada por uma substituição nucleofílica (SN2) com o TMCS atuando como
agente desprotonante (catalisador da reação).
32
Figura 16 – Reação geral de sililação utilizando o BSTFA e HR (grupo funcional derivatizado por
sililação, podendo ser: carboxilas, hidroxilas, dentre outros pertencentes a substâncias não voláteis
como os ácidos graxos).
Fonte: PAIVA, 2013
A Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (Shimadzu, modelo
QP2010 com coluna capilar de sílica fundida DB-5MS com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de
espessura de filme) foi realizada no laboratório de Química Orgânica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP). As amostras
foram injetadas sob as seguintes condições de uso: temperatura do injetor: 250 ºC; gás de
arraste: Hélio; temperatura inicial do forno: 200 ºC por 12 minutos atingindo a temperatura de
290 ºC a uma velocidade linear de 38,7 cm/s e permanecendo nessa temperatura por 35
minutos. O banco de dados utilizado foi o “Wiley Mass Spectral Database”.
4.3. Preparo das formulações
F127 foi pesado e adicionado continuamente a um Becker contendo tampão fosfato pH
7,4, e mantido sob agitação magnética moderada e em banho de gelo (4-8ºC) até completa
dispersão do polímero (BARICHELLO et al., 1999b). A solução do polímero foi mantida em
repouso em geladeira por aproximadamente 12 horas antes da adição do óleo de açaí e
mantido em agitação vigorosa utilizando agitador magnético em banho de gelo (4-8ºC) por 10
minutos. A formulação foi então homogeneizada em Ultra Turrax (IKA®
T25) por 30 minutos a
5000 RPM em banho de gelo (4-8ºC). A formulação contendo ácido oleico foi preparada
seguindo o mesmo procedimento. A INS, devidamente pesada, foi solubilizada em 100μL de
HCl 0,1M e incorporada à formulação de F127, seguido de neutralização pela adição de
33
100μL de NaOH 0,1M diretamente à formulação. As formulações desenvolvidas e testadas
neste trabalho estão descritas na Tabela 5.
Tabela 5 – Formulações utilizadas nos estudos, contendo o percentual peso por peso (%P/P) do
polímero F127, óleo de açaí (AÇAÍ) e do ácido oleico (AO) e, a quantidade de insulina (I) em
unidades por quilo (U/Kg) de peso corpóreo dos animais utilizados.
Formulação F127 (% P/P) Óleo de açaí
(% P/P)
Ácido oleico
(AO) (%P/P)
I = U/Kg
F 16 --- --- ---
F15I 16 --- --- 15
FAÇAÍ 16 10 --- ---
FAÇAÍ5I 16 10 --- 5
FAÇAÍ10I 16 10 --- 10
FAÇAÍ15I 16 10 --- 15
FAO15I 16 --- 5 15
F: Formulação contendo 16% P/P de F127; F15I: Formulação contendo 16% P/P de F127 + 15 U/Kg de INS;
FAÇAÍ: Formulação contendo 16% P/P de F127 + 10% P/P de óleo de açaí; FAÇAÍ 5I: Formulação contendo
16% P/P de F127 + 10% P/P de óleo de açaí + 5 U/Kg de INS; FAÇAÍ 10I: Formulação contendo 16% P/P de
F127 + 10% P/P de óleo de açaí + 10 U/Kg de INS; FAÇAÍ 15I: Formulação contendo 16% P/P de F127 + 10%
P/P de óleo de açaí + 15 U/Kg de INS e FAO15I: Formulação contendo 16% P/P de F127 + 5% P/P de ácido
oleico + 15 U/Kg de INS.
4.4. Determinação do diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta das
micelas das formulações.
As análises de diâmetro das micelas das formulações foram realizadas utilizando a
técnica de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light Scattering, DLS), a qual permite
medir o diâmetro de micelas e moléculas pela difusão das mesmas no meio aquoso através de
seu movimento browniano, convertendo os valores pela relação física de movimentos de
Stokes-Einstein (TEIXEIRA et al., 2007).
O potencial zeta das micelas presentes nas formulações foi mensurado utilizando a
técnica de microeletroforese Doppler a laser, na qual um campo elétrico é aplicado a uma
solução de moléculas ou a uma dispersão de partículas, que passarão a se mover com uma
velocidade relacionada ao seu potencial zeta e essa velocidade é medida por uma técnica
interferométrica a laser patenteada, denominada M3 PALS (espalhamento de luz com análise
de fases) conforme definição por Fu-Qiang Hu e cols. (2005).
34
Amostras das formulações foram diluídas em água ultra-pura Mili-Q®, na proporção de
1:500 partes, e lidas no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern®, Reino Unido). Para as
análises de diâmetro de micelas foram utilizadas cubetas de poliestireno (DTS 0112) com
volume de 3 mL, já para as análises de potencial zeta foi utilizado o medidor Green de mesma
capacidade. As leituras foram realizadas em triplicata, com três leituras cada medida.
4.5. Avaliação do microambiente micelar das formulações por espectrofluorimetria
A espectrofluorimetria é uma técnica analítica, que permite a realização de determinações
com grande sensibilidade (limites de detecção na faixa de ng mL-1) e seletividade, sendo
muito usada quantitativamente e qualitativamente em diversas áreas do conhecimento
(BERNARDES, 2009). O pireno é um hidrocarboneto aromático policíclico com peso
molecular de 202,26 e fórmula molecular C16H10. O pireno, representado na Figura 17, é
frequentemente utilizado como sonda fluorescente de diversas substâncias, dentre essas
proteínas e DNA, e também utilizado em análises ambientais de temperatura, pressão
atmosférica e pH, bem como para avaliar alterações no microambiente de sistemas micelares
pelo seu elevado rendimento quântico quando excitado pela radiação ultravioleta (PERRY et
al, 2011).
Figura 17 – Fórmula estrutural da molécula do pireno
Para as análises espectrofluorimétricas foi preparada uma solução de pireno a 0,1% P/V
em metanol, sendo a mesma adicionada às formulações na concentração de 0,6 μM. Para a
obtenção dos espectros de emissão do pireno, as amostras das formulações foram lidas em
Espectrofluorímetro RF-5301PC (Shimadzu®, Kyoto, Japão). Foram utilizadas cubetas de
quartzo com capacidade para 3 ml e os espectros de emissão foram tomados entre os
comprimentos de onda de 350 a 500 nm e a excitação foi realizada em 335 nm, a uma
35
temperatura de 25 ± 1ºC. Para viabilidade da leitura dos espectros e pela sensibilidade do
equipamento, o tamanho do feixe de luz foi fixado no valor 15 nm para a excitação e 5 nm
para a emissão.
O espectro de fluorescência do pireno retrata suas características físico-químicas no meio
que o circunda, de maneira que sua sensibilidade às alterações que ocorrem no microambiente
que o circunda interfere diretamente na intensidade e localização de suas bandas de emissão
de fluorescência. A forma monomérica do pireno permite a coexistência de cinco bandas
vibrônicas principais bem resolvidas na faixa de emissão entre 370 – 400 nm, denominadas
bandas I, II, III, IV e V que estão representadas na Fig. 18.
Figura 18 – Espectro de emissão do pireno e suas bandas vibracionais.
Fonte: Adaptado de Silva, 2002.
Para determinar a mudança de estrutura vibracional do pireno, é necessário calcular a
escala “Py”, uma medida indireta das alterações físico-químicas do meio, mensurada pela
razão entre intensidades I1/I3. Entretanto, a razão I1/I3 é diretamente dependente da
polaridade do microambiente micelar, sendo que o aumento dessa razão é sinal de elevação da
polaridade do meio, ou vice versa (TURRO; KUO, 1986).
36
4.6. Avaliação do efeito hipoglicêmico das formulações administradas por via retal em
ratas albinas Fischer, saudáveis e diabéticas.
4.6.1. Animais
Foram utilizadas ratas albinas da linhagem Fisher, com idade aproximada de 120 dias e
peso médio de 250 g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de
Nutrição (ENUT) da Universidade Federal de Ouro Preto. Todos os animais permaneceram
durante o estudo em gaiolas com luminosidade, temperatura e umidade controladas e
receberam água e ração comercial para rato “ad libitum”. Os procedimentos adotados e
utilizados no estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), com número de protocolo 2014/33 (ANEXO).
4.6.2. Delineamento Experimental
Os animais foram divididos em 7 grupos de cinco animais cada e submetidos a jejum de
48 horas. Uma dose única de 0,2 ml de cada formulação foi administrada por via retal a cada
rata do grupo correspondente. Para evitar que a formulação fosse expelida foi utilizado um
“clip” vedando a região do ânus. A dose de insulina utilizada foi de 5U/Kg, 10U/Kg e
15U/Kg de peso corpóreo respectivamente, de acordo com a formulação avaliada.
A Figura 19 abaixo demonstra os grupos utilizados no estudo de acordo com as
formulações avaliadas.
Figura 19 – Delineamento experimental.
40 Ratas Fisher,
16 semanas (120 dias),
Peso médio 250 g
Grupos avaliados (n) = 5
Administração: 0,2ml das formulações
Via: retal
Período de tratamento: Administração única
F
n = 5
FAÇAÍ
n = 5
F15I
n = 5
FAÇAÍ5I
n = 5
FAÇAÍ10I
n = 5
FAÇAÍ15I
n = 5 (saudáveis)
n= 5 (diabéticos)
FAO15I
n = 5
37
4.6.3. Determinação da glicemia
Os níveis de glicose em mg/dl foram determinados nos tempos de 0, 1, 3 e 6 horas após
administração retal das formulações, sendo o tempo 0 determinado em no máximo 5 minutos
antes da administração. Para o monitoramento dos níveis de glicose foram coletadas amostras
sanguíneas obtidas da veia caudal dos ratos, depositadas em fitas glicêmicas a serem
analisadas por meio do glicosímetro. Os níveis de glicose foram quantificados por meio do
glicosímetro Contour TS® (Bayer, Brasil).
4.6.4. Indução do Diabetes
Após 8 horas de jejum, os animais receberam, dose única intraperitoneal de aloxano
(135mg/Kg de peso corpóreo) (Sigma Aldrich®, EUA) dissolvido em 0,2mL de NaCl a 0,9%.
Após a indução os animais receberam solução de glicose 10% como única fonte hídrica,
por aproximadamente 4 horas, para evitar hipoglicemia fatal, ocasionada por liberação
excessiva de insulina após a destruição das células beta-pancreáticas (MAZZANTI et al.,
2003).
A confirmação do estado diabético foi realizada três dias após indução, por meio da
avaliação dos níveis de glicose plasmática após jejum de 8 horas, utilizando-se uma gota de
sangue coletada da veia caudal dos animais. Os níveis de glicose em mg/dl foram
quantificados por meio de glicosímetro Contour TS® (Bayer, Brasil). Os animais com
glicemia de jejum superior a 250 mg/dL (~13mmol/L) foram considerados diabéticos e
selecionados para o experimento.
4.6.5. Análise estatística
Teste paramétrico Two-way ANOVA com teste de comparações múltiplas de Tukey foi
utilizado na análise estatística do efeito hipoglicêmico. O intervalo de confiança adotado foi
de 90% e foram consideradas significativas as diferenças quando P<0,01. Para a realização da
análise estatística foi utilizado o software Graph Pad Prism® 6, versão 2014.
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização do óleo de açaí e do ácido oleico por cromatografia gasosa acoplada
a espectro de massas.
A Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas é uma técnica eficiente
para a separação e análise do perfil de ácidos graxos de diversas fontes, devido à rapidez,
resolução e sensibilidade. Entretanto, a amostra deve ser convertida em derivados voláteis
como os ésteres metílicos, para viabilizar a análise de ácidos graxos nas amostras, visto que os
requisitos para a separação e análise dos compostos são a estabilidade térmica e volatilidade
(KOUREMENOS et al., 2010). Os principais tipos de derivatização usados na cromatografia
gasosa são: a acilação, alquilação e sililação (DROZD, 1981). A derivatização utilizando a
sililação deve ocorrer com controle de temperatura e tempo de reação, para que os produtos
formados estejam nas concentrações esperadas, e inexista formação de contaminantes.
O perfil cromatográfico dos constituintes do óleo de açaí obtido por cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas está representado na Figura 20.
Figura 20 – Perfil cromatográfico dos constituintes do óleo de açaí com os respectivos tempos de
retenção.
Condições de análise: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de massas; Coluna capilar de sílica
fundida DB-5MS com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura de filme; Temperatura do injetor: 250 ºC; Gás de
arraste: Hélio; Temperatura inicial do forno: 200 ºC por 12 minutos atingindo a temperatura de 290 ºC a uma
velocidade linear de 38,7 cm/s e permanecendo nessa temperatura por 35 minutos.
39
Os perfis cromatográficos do ácido oleico puro e do óleo de açaí estão representados na
Figura 21. É possível observar na Figura 21 a semelhança dos tempos de retenção do pico do
composto majoritário do ácido oleico puro com o pico do composto majoritário do óleo de
açaí.
Figura 21 – Comparação do perfil cromatográfico do ácido oleico puro e do óleo de açaí obtido por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
Condições de análise: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de massas; Coluna capilar de sílica
fundida DB-5MS com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura de filme; Temperatura do injetor: 250 ºC; Gás de
arraste: Hélio; Temperatura inicial do forno: 200 ºC por 12 minutos atingindo a temperatura de 290 ºC a uma
velocidade linear de 38,7 cm/s e permanecendo nessa temperatura por 35 minutos.
A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permite a identificação
qualitativa e quantitativa dos ésteres metílicos de ácidos graxos, sendo que os espectros de
massas dos mesmos apresentam fragmentos específicos, que determinam sua correta
identificação. Os ésteres metílicos de ácidos graxos possuem cadeias maiores que os ácidos
graxos não esterificados, o que propicia íons moleculares com intensidades mais elevadas e
razão massa/carga (m/z) acima de 200 (SILVERSTEIN, et al. 2007). Os espectros de massas
do pico principal do ácido oleico puro e dos ácidos graxos majoritários do óleo de açaí foram
comparados com dados da literatura (BUDZIKIEWICZ et al., 1967) e confirmados pelos
espectros de massas padrões nas bibliotecas WILEY7.LIB, MASSPEAKS, NIST12.LIB e
NIST62.LIB do software Wiley Mass Spectral Database.
40
A Figura 22 representa o espectro de massas obtido do pico majoritário do ácido oleico
puro no tempo de retenção de 10,664 min. O composto foi identificado como sendo o ácido
cis-octadecen-9-óico, ou ácido oleico, o qual se encontrou na concentração de 94,73%.
Figura 22 – Espectro de massas do ácido cis-octadecen-9-óico trimetilsililado do ácido oleico puro.
A Figura 23 representa o espectro de massas do composto majoritário do óleo de açaí
com tempo de retenção de 10,664. O composto foi identificado também como sendo o ácido
cis-octadecen-9-óico, ou ácido oleico.
Figura 23 – Espectro de massas do ácido cis-octadecen-9-óico (ácido oleico) trimetilsililado
encontrado no óleo de açaí.
Na Figura 24 é apresentado o espectro de massas do segundo composto majoritário
encontrado no óleo de açaí com tempo de retenção de 9,790 min. O segundo composto
majoritário foi identificado como sendo o ácido hexadecanóico, ou ácido palmítico.
41
Figura 24 – Espectro de massas do ácido hexadecanóico (ácido palmítico) trimetilsililado encontrado
no óleo de açaí.
Na Figura 25 é apresentado o espectro de massas do terceiro composto majoritário
encontrado no óleo de açaí com tempo de retenção de 10,576. Este composto foi identificado
como sendo o ácido 9,12-octadecadienoico, ou ácido linoleico.
Figura 25 – Espectro de massas do ácido 9,12-octadecadienoico (ácido linoleico) trimetilsililado
encontrado no óleo de açaí.
Alcanos de cadeia linear possuem íons com m/z 41, 55 (C2O2H3+), 57 e 73 (C3H6O2+)
característicos, assim como os íons com m/z 41, 73 (C3H6O2+), e 117 (C5H10O2+) que são
comuns aos ésteres metílicos de ácidos graxos saturados e insaturados, corroborando com os
espectros de massas dos ácidos graxos trimetilsililados (REBOUÇAS et al., 1999),
representados nas Figuras 22, 23, 24 e 25.
Os espectros de massas característicos de ácidos graxos insaturados, como o ácido oleico
e o linoleico, possuem íons com m/z 222, 264, 339, 354, comuns entre eles, sendo que o
fragmento m/z 264 (C19H34O+) representa a presença de dupla ligação nos carbonos C-9 e C-
10 (SARAIVA, 2008; REBOUÇAS et al., 1999) indicando que os espectros referentes às
Figuras 21, 22 e 23 são característicos de ácidos graxos com instauração entre os carbonos C-
9 e C-10. Além disso, o ácido linoleico (Fig. 25) possui os íons com m/z 84 (C6H9+)
originário da quebra de ligações C-C em 185 (C11H20O2+), correspondente à porção epóxido
42
da molécula, o que difere dos espectros de massas dos ésteres de ácido oleico e ácido
palmítico, respectivamente.
O ácido palmítico (Fig. 24) apresenta um pico com m/z 57, que lhe é peculiar,
diferenciando-o dos demais, além da presença dos íons com m/z 201, 313 (C18H37O2Si+) e
328 (M+ 328, íon molecular) (SILVERSTEIN et al., 2007).
Na Tabela 6 estão descritos os ácidos graxos, os seus tempos de retenção, a área dos
picos e a percentagem encontrada no óleo de açaí.
Tabela 6 – Ácidos graxos, tempo de retenção, área dos picos e percentagem encontrada no
cromatograma obtido do óleo de açaí.
Ácidos graxos Tempo de
retenção (min.)
Área dos
picos
Composição
(%)
Não identificado 7,716 85568 0.31
Ácido palmitoleico 9,686 602222 2.19
Ácido hexadecanóico (palmítico) 9,790 4161908 15.14
2,6,10,15,19,23-hexametil 10,439 268406 0.98
Ácido 9,12-octadecadienóico (linoleico) 10,576 1279677 4.65
Ácido cis-octadecen-9-óico (oleico) 10,664 18330094 66.60
Ácido octadecanóico 10,773 268145 0.98
n-docosano 11,818 389040 1.41
Não identificado 11,865 106200 0.39
Ácido 2,3-bis hexadecanóico 12,282 263837 0.96
2 – monoestearina 12,977 267679 0.97
Mono-oleil glicerol 13,189 852031 3.10
2,6,10,14,18,22 Hexametil-tetracosano 13,656 248740 0.90
n-Octacosano 14,205 177245 0.64
1 – bromo nonadecano 14,319 193724 0.70
Condições de análise: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de massas; Coluna capilar de sílica
fundida DB-5MS com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura de filme; Temperatura do injetor: 250 ºC; Gás de
arraste: Hélio; Temperatura inicial do forno: 200 ºC por 12 minutos atingindo a temperatura de 290 ºC a uma
velocidade linear de 38,7 cm/s e permanecendo nessa temperatura por 35 minutos.
Dentre os ácidos graxos presentes no óleo de açaí, destacaram-se os ácidos cis-
octadecen-9-óico (acido oleico), 9,12-octadecadienoico (acido linoleico) e hexadecanóico
(acido palmítico) como constituintes majoritários. O ácido oleico foi o ácido graxo encontrado
43
em maior concentração, representando 66,60% da composição total do óleo de açaí utilizado.
Este valor está acima da concentração relatada por Rogez (2000) em estudo da composição do
óleo de açaí, onde foi relatada a existência de uma concentração de ácido oleico de cerca de
60%. O ácido palmítico e o ácido linoleico foram encontrados nas concentrações de 15,14% e
4,65%, respectivamente, dados que diferem dos relatado por Rogez (2000) no qual foram
encontrados 26% de ácidos graxos saturados e 14% de ácidos graxos poli-insaturados.
5.2. Determinação do diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta das
micelas das formulações.
Os resultados da análise do diâmetro médio, do índice de polidispersão e do potencial
zeta das formulações desenvolvidas são apresentados na Tabela 7.
Tabela 7 – Diâmetro médio, índice de polidispersão e potenciais zeta das formulações.
Formulação de
Pluronic® F127
Diâmetro médio (nm) ± % DPR
Índice de
polidispersão
Potencial Zeta (mV) ± % RSD
F 553,00 ± 14,90 0,556 -13,50 ± 52,70
F15I 1133,00 ± 27,90 0,735 -20,00 ± 12,10
FAÇAI 455,60 ± 2,26 0,579 - 39,80 ± 1,76
FAÇAI5I 703,30 ± 2,75 0,653 - 49,20 ± 3,58
FAÇAI10I 585,50 ± 37,50 0,697 -45,60 ± 11,50
FAÇAI15I 373,10 ± 2,40 0,501 - 43,90 ± 1,94
FAO15I 727,50 ± 9,66 0,551 -36,60 ± 5,52
Condições de análise: Zetasizer Nano ZS (Malvern®, Reino Unido). Diluição das amostras em água ultra-pura
Mili-Q®, na proporção de 1:500 partes. Foram utilizadas cubetas de poliestireno (DTS 0112) e medidor Green,
ambos de 3 mL. As leituras foram realizadas em triplicata, com três leituras cada medida.
É possível observar na Tabela 7 que as formulações avaliadas apresentaram valores de
diâmetro médio das micelas inferiores a um micrômetro (1000 nm), com exceção da
formulação F15I (constituída de F127 e INS) a qual apresentou um diâmetro médio de
1133,00 ± 27,90 nm.
Assim, pode-se inferir que a formulação F, que continha apenas o polímero F 127, tinha
micelas com diâmetro médio inferior à formulação F15I e, em contrapartida, a presença do
44
óleo de açaí na formulação FAÇAÍ diminuiu o diâmetro médio das micelas comparativamente
a formulação F.
As formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I obtiveram diâmetro médio das
micelas de 703,30 ± 2,75 nm, 585,50 ± 37,50 nm e 373,10 ± 2,40 nm, respectivamente. Visto
que da formulação F para F15I houve elevação dos valores de diâmetro médio das micelas
pela presença de 15U de INS, era de se esperar que o mesmo acontecesse com FAÇAÍ5I,
FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I, já que a INS presente nessas formulações sobe de 5U para 10U e por
fim 15U. Entretanto, na presença do óleo de açaí o efeito mostrou-se contrário, sendo que à
medida que a concentração de INS aumentou mantendo-se constante a concentração de óleo
de açaí em 10% p/p, os valores de diâmetro de micelas diminuíram.
Por outro lado, a formulação FAO15I contendo ácido oleico 5% p/p e INS 15U,
apresentou micelas com diâmetro médio de 727,50 ± 9,66 nm, relativamente maior que as
formulações F, FAÇAÍ, FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I. Dentre todas as formulações,
FAO15I só apresentou valores de diâmetro médio de micelas menores que F15I, tal
característica demonstra que o ácido oleico também influenciou na redução do diâmetro, na
presença de 15U de INS.
Assim, quando avaliamos FAO15I e FAÇAÍ15I observamos que a primeira formulação
possui diâmetro de micela superior à segunda, o que pode ser explicado pelo fato do óleo de
açaí ser constituído por maior número de ácidos graxos, tanto saturados quanto insaturados
(ácido oleico é majoritário), proporcionando uma diminuição mais pronunciada quando
comparada àquela causada pela presença do ácido oleico puro em F5AO15I, que mesmo
contendo 15U de INS concomitantemente ao ácido oleico, não foi suficiente para uma
redução tão pronunciada quanto em FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I.
Alguns autores sugeriram existir algum tipo de interação eletrostática entre polímeros e
fármacos em sistemas carreadores de fármacos, o qual pareceu afetar diretamente o diâmetro
médio das partículas formadas (CHASTEIGNER et al., 1996; ALONSO et al., 1991).
Em relação ao índice de polidispersão, todas as formulações apresentaram valores entre
0,501 e 0,735, de forma que as distribuições de tamanho/diâmetro médio destas formulações
podem ser consideradas polidispersas, pois apresentaram índices de polidispersão maiores do
que 0,3, que é o valor considerado como ideal pela literatura para definir um sistema como
sendo monodisperso (KÜLKAMP et al., 2009).
Na Tabela 7 é observado que o potencial zeta diminui seguindo a ordem F > F15I>
F5AO15I > FAÇAÍ > FAÇAÍ15I > FAÇAÍ10I > FAÇAÍ5I. É importante notar que as
formulações contendo óleo de açaí apresentaram os valores mais baixos de potencial zeta,
45
sendo que dentre elas, a redução da concentração de INS na formulação foi diretamente
proporcional à redução no valor do potencial zeta.
Calvo e cols. (1997) observaram que valores de potencial zeta relativamente altos (+) ou
baixos (-) foram um indicativo de boa estabilidade físico-química dos sistemas poliméricos
coloidais, pois grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação das partículas, sendo que
a definição destes valores dependeu diretamente da constituição e concentração dos
componentes da formulação. Desta forma, em relação à estabilidade física das formulações
contendo ácido oleico ou óleo de açaí e INS, os valores negativos elevados de potencial zeta
sugerem a existência de adequada repulsão entre as micelas das formulações.
Analisando conjuntamente os resultados do diâmetro médio e do potencial zeta das
formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I, observa-se que ambos os parâmetros foram
reduzidos com o aumento da concentração de INS. Observação semelhante foi feita por
Alonso e cols. (1991) quando o fármaco foi adicionado em quantidade crescente a sistema
carreador polimérico, ocorrendo redução, em módulo, do potencial zeta com consequente
elevação da concentração de fármaco associado ao sistema carreador.
Desta forma, os resultados da análise do diâmetro médio, índice de polidispersão e
potencial zeta permitem inferir que as alterações podem ter ocorrido devido a melhor
acomodação da INS no sistema micelar e a uma distribuição mais homogênea entre os
diâmetros médios, de maneira que a INS, tenha forte interação pela interface das micelas,
podendo organizar a sua parte hidrofóbica e hidrofílica da molécula entre as cadeias OE e OP
do polímero, e do núcleo hidrofóbico (OP) preenchido pelas substâncias lipofílicas (ácidos
graxos, os quais possuem cabeça polar, assumindo com isso características tensoativas),
permitindo uma maior acomodação de cargas, e a consequente redução do volume total das
micelas, e que naturalmente implicaria na redução do diâmetro.
46
5.3. Avaliação do microambiente micelar das formulações por espectrofluorimetria
Na produção de formulações micelares é de extrema importância avaliar o
microambiente micelar, visto que o ambiente micelar influencia no perfil de liberação do
fármaco a partir da formulação (PERRY et al, 2011).
As alterações físico-químicas causadas pela composição de formulações e/ou do meio em
que estão inseridas as micelas promovem modificações na estrutura vibracional do pireno,
modificando assim a forma e a intensidade das bandas vibrônicas existentes no espectro de
emissão do mesmo. Os espectros de emissão de fluorescência do pireno nas formulações F,
F15I, FAO15I e FAÇAÍ15I com a identificação dos picos I1 e I3 estão representados na
Figura 26.
Figura 26 – Espectro de emissão de fluorescência do pireno nas formulações estudadas.
Condições de análise: Espectrofluorímetro RF-5301PC (Shimadzu, Japão). Cubetas de quartzo (3 ml) Faixa de
comprimentos de onda de emissão: 350 a 500 nm. Excitação realizada em 335 nm, a uma temperatura de 25 ±
1ºC. Sensibilidade 15 nm para a excitação e 5 nm para a emissão.
Os valores da razão I1/I3 que caracteriza a polaridade do microambiente micelar das
formulações avaliadas está representada na Tabela 8. A razão I1/I3 é diretamente proporcional
47
à polaridade do microambiente micelar (TURRO; KUO, 1986). Na Tabela 8 é possível
observar que a razão I1/I3 para as formulações F (1,031) e F15I (1,050) foram semelhantes e
levemente acima de 1,000, indicando que o microambiente das micelas permanece hidrofílico
após a adição de INS, possivelmente devido à característica pouco lipofílica da molécula de
INS (SILVA, 2002).
Tabela 8 – Intensidade de emissão do pireno e escala “Py” (razão I1/I3).
Formulação I1 I3 I1/I3
F 777,87 754,16 1,031
F15I 734,47 699,54 1,050
FAO15I 344,23 375,61 0,916
FAÇAÍ15I 62,25 90,29 0,689
Para a formulação FAO15I o valor da razão I1/I3 foi 0,916 enquanto que para a
formulação FAÇAÍ15I o valor da razão I1/I3 foi 0,689. As formulações FAO15I e FAÇAÍ15I
apresentaram valores de razão I1/I3 inferiores comparativamente às formulações F e F15I.
Sugere-se que a redução no valor de I1/I3 para a formulação FAO15I seja devido à presença
de ácido oleico na formulação que possui características hidrofóbicas / hidrofílicas, tendo a
capacidade de alterar o microambiente micelar pela inserção da cauda hidrofóbica no núcleo
da micela, expulsando as moléculas de água que hidratam a porção OP (hidrofóbica) do
polímero, e diminuindo assim, a polaridade do meio (BOOTH; ATTWOOD, 2000).
Por outro lado, a expressiva redução do valor de I1/I3 para a formulação FAÇAÍ15I
sugere que a complexa composição de ácidos graxos do óleo de açaí, sendo o ácido oleico e
palmítico os ácidos graxos insaturados e saturados majoritários na composição do óleo,
elevaram consideravelmente as características hidrofóbicas das micelas desta formulação.
PERRY e cols., 2011, determinaram que o microambiente micelar, altera as
características de liberação dos fármacos nas formulações. Assim, soluções micelares de F127
para veiculação da INS contendo do óleo de açaí, possuem grande relevância para o
desenvolvimento de formulações alternativas à via de administração subcutânea da INS.
Adicionalmente, as características físico-químicas encontradas no estudo da
fluorescência da formulação FAÇAÍ15I demonstrou que a presença do óleo de açaí teve um
48
papel fundamental na redução da polaridade do ambiente micelar, mesmo na presença de INS,
uma molécula pouco lipofílica de elevado peso molecular e de difícil permeação natural em
mucosas e membranas biológicas. Diante dessas informações, a formulação FAÇAÍ15I
apresenta-se com peculiaridades que a tornam uma boa alternativa para estudos que avaliem a
veiculação da INS por outras vias de administração, distintas da subcutânea, levando em conta
fatores como o aumento da hidrofobicidade das micelas (controle de liberação simultânea e
dos ácidos graxos), permitindo uma a absorção eficiente da INS a partir de diversas
formulações em diferentes mucosas (TANOJO, 1996).
49
5.4. Avaliação glicêmica após administração retal das formulações de F127 em ratas
albinas saudáveis e diabéticas da linhagem Fischer.
Inicialmente foi investigada a dose de INS no efeito hipoglicêmico da formulação
contendo 10% de óleo de açaí, a fim de se determinar a dosagem de INS para o ensaio
comparativo com a formulação contendo ácido oleico a 5%. Na Figura 27 está representado o
perfil glicêmico das formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I administradas por via
retal em ratas albinas saudáveis da linhagem Fischer.
Figura 27 – Perfil glicêmico após administração retal das formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e
FAÇAÍ15I em ratas albinas saudáveis da linhagem Fischer.
Condições do ensaio: Níveis de glicose (mg/dl) determinados nos tempos 0, 1, 3 e 6 horas após
administração retal das formulações, por meio do glicosímetro Contour TS® (Bayer, Brasil).
Na Figura 27 é possível observar que a formulação FAÇAÍ15I, que continha 15 U/Kg
corpóreo de INS, proporcionou maior redução dos valores de glicemia plasmática nos
animais, entre as formulações testadas.
A análise estatística dos resultados de glicemia obtidos pela administração das
formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I em ratas albinas saudáveis da linhagem
Fischer está representada na tabela 9.
50
Tabela 9 – Análise das formulações FAÇAÍ5I, FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I utilizando teste paramétrico
Two-way ANOVA com teste de comparações múltiplas de Tukey.
Teste de Tukey
Diferença média
Índice de confiança
90%
Significância
FAÇAÍ5I x FAÇAÍ10I 0,10 -13,2 – 13,22 Não
FAÇAÍ5I x FAÇAÍ15I 23,99 10,87 – 37,10 Sim
FAÇAÍ10I x FAÇAÍ15I 23,89 10,77 – 37,00 Sim
Houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre as formulações
FAÇAÍ5I e FAÇAÍ15I, assim como entre as formulações FAÇAÍ10I e FAÇAÍ15I. Já entre
FAÇAÍ5I e FAÇAÍ10I não houve diferença estatisticamente significativa. Esse resultado
demonstra que a formulação que possui a maior concentração de INS alcançou melhor efeito
hipoglicêmico in vivo. Diante disso, a formulação escolhida para comparação do efeito
hipoglicêmico com as formulações controle e a formulação que possuía ácido oleico puro em
sua composição foi a FAÇAÍ15I.
Na Figura 28 são apresentados os resultados do efeito hipoglicêmico obtido após
administração retal da formulação FAÇAÍ15I, e das formulações controle F, F15I e FAÇAÍ.
A análise estatística dos resultados obtidos está representada na tabela 10.
51
Figura 28 – Perfil glicêmico após administração retal das formulações F, F15I, FAÇAÍ e FAÇAÍ15I
em ratas albinas saudáveis da linhagem Fischer.
Condições do ensaio: Níveis de glicose (mg/dl) determinados nos tempos 0, 1, 3 e 6 horas após
administração retal das formulações, por meio do glicosímetro Contour TS® (Bayer, Brasil).
Na Figura 28 é possível observar que a formulação FAÇAÍ15I promoveu importante
efeito hipoglicêmico no intervalo de tempo de 6 horas, com redução constante da glicemia até
o tempo de 3 horas, e manutenção de seus valores até o tempo de 6 horas.
Tabela 10 – Análise das formulações F, FAÇAÍ, F15I e FAÇAÍ15I utilizando teste paramétrico Two-
way ANOVA com teste de comparações múltiplas de Tukey.
Teste de Tukey
Diferença média
Índice de confiança
90%
Significância
F x FAÇAÍ15I 31,77 6,302 – 57,23 Sim
F15I x FAÇAÍ15I -28,68 -54,14 – -3,22 Sim
FAÇAÍ x FAÇAÍ15I 27,76 2,294 – 53,22 Sim
F x FAÇAÍ 4,01 -21,46 – 29,47 Não
F15I x F 3,08 -22,38 – 28,55 Não
F15I x FAÇAÍ -0,92 - 26,39 – 24,54 Não
A partir dos valores de glicemia obtidos após administração retal das formulações foi
realizada a análise estatística. Desta forma, podemos inferir que a formulação FAÇAÍ15I
promoveu um efeito hipoglicêmico estatisticamente significante em comparação às
formulações F, F15I e FAÇAÍ utilizadas como controle. Adicionalmente, não foi encontrada
52
diferença estatisticamente significativa entre os valores de hipoglicemia obtidos das
formulações usadas como controles.
O efeito de ácidos graxos isolados utilizados em diferentes formulações como
promotores de absorção de INS nas mucosas bucal e intestinal já foram descritos na literatura
(MORISHITA et al., 1998; BARICHELLO et al., 1999a; MORISHITA et al., 2001).
Entretanto, o efeito de óleos naturais compostos de misturas de ácidos graxos e obtidos da
flora nativa em promover absorção de INS em mucosas é inédito. Cabe salientar que o efeito
hipoglicêmico só acontece se a INS for absorvida na mucosa do intestino e alcançar a
circulação sistêmica ou o fígado.
O ácido oleico, principal ácido graxo promotor de permeação em pele e mucosas e
reconhecido desestabilizante de fosfolipídios de membrana (ONGPIPATTANAKUL et al.,
1991), foi o ácido graxo majoritário encontrado no óleo de açaí, e acredita-se, ter sido o
principal responsável pelo marcante efeito hipoglicêmico observado após administração retal
da formulação nos animais.
Além de ter sido um dos três constituintes majoritários presentes no óleo de açaí, o ácido
linoleico é um dos ácidos graxos insaturados essenciais dentre os constituintes naturais da
pele. Diversos trabalhos relataram a importância do ácido linoleico na regulação das funções
da barreira da pele e mucosas (FORSLIND et al.,1998). Essas propriedades do ácido linoleico
podem ter um papel importante e auxiliar ao ácido oleico no mecanismo de permeação da INS
através da mucosa retal.
Além do mais, outro ácido graxo presente no óleo de açaí que pode ter contribuindo para
a absorção da INS na mucosa retal após administração da formulação FAÇAÍ15I foi o ácido
palmítico. Este ácido é muito empregado em formulações transdérmicas por ser considerado
um dos ácidos graxos com menor potencial irritante para as membranas por não desnaturar
proteínas da pele e mucosas (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Tal característica
pode ser importante para atuação da formulação na mucosa retal.
Morishita e cols. (1998) observaram que concentrações elevadas de ácido oleico puro em
emulsões A/O/A, assim como a utilizada na formulação FAO15I ocasionava irritação à
mucosa retal dos animais utilizados no estudo. Entretanto, resultados positivos foram obtidos
com a utilização de misturas ácidos graxos insaturados e poli-insaturados (ácido oleico e
linoleico, respectivamente) como promotores de absorção intestinal de INS.
Isso demonstra que a adição do óleo de açaí à formulação, além de aumentar a
hidrofobicidade do microambiente micelar, permitindo uma melhor acomodação da molécula
53
de INS nas micelas, pode proporcionar um efeito sinérgico de promoção de permeação e
prolongamento do efeito hipoglicêmico da INS (BOOTH & ATTWOOD, 2000).
Na Figura 29 são apresentados os resultados do efeito hipoglicêmico das formulações
FAÇAÍ, FAÇAÍ15I e FAO15I após administração retal das formulações em ratas albinas
saudáveis da linhagem Fischer. A análise estatística da comparação dos valores de glicemia
das formulações está descrita na tabela 11.
Figura 29 – Perfil glicêmico após administração retal das formulações FAÇAÍ, FAÇAÍ15I e
FAO15I em ratas albinas saudáveis da linhagem Fischer.
Condições do ensaio: Níveis de glicose (mg/dl) determinados nos tempos 0, 1, 3 e 6 horas após
administração retal das formulações, por meio do glicosímetro Contour TS® (Bayer, Brasil).
É importante salientar que, muito embora ambas as formulações FAO15I e FAÇAÍ15I
tenham causado um marcante efeito hipoglicêmico in vivo. A administração do ácido oleico
puro e do óleo de açaí gerou perfil glicêmico com características distintas. A administração da
formulação de FAÇAÍ15I resultou num efeito hipoglicêmico menor que o da formulação
FAO15I no tempo de 60 minutos. Por outro lado, o efeito hipoglicêmico desta formulação se
manteve marcante e contínuo de 60 a 360 minutos, enquanto que o efeito hipoglicêmico da
formulação FAO15I foi reduzindo lentamente até o tempo de 360 min. Este efeito mais
prolongado observado pela formulação FAÇAÍ15I demonstra que a mistura de ácidos graxos
prolongou o efeito de permeação e da ação de insulina na glicose plasmática. Este efeito, em
54
comparação ao efeito de permeação do ácido oleico utilizado puro sugere a existência de
sinergismo entre os ácidos graxos do óleo de açaí no que tange o efeito de permeação de INS.
Tabela 11 – Análise das formulações FAÇAÍ, FAO15I e FAÇAÍ15I utilizando teste paramétrico Two-
way ANOVA com Teste de comparações múltiplas de Tukey.
Teste de Tukey Diferença média Índice de confiança
90%
Significância
FAÇAÍ x FAO15I 24,31 -1,15 – 49,77 Não
FAÇAÍ15I x FAO15I -3,45 -28,91 – 22,02 Não
FAÇAÍ x FAÇAÍ15I 27,76 2,294 – 53,22 Sim
A partir dos resultados da glicemia e da análise estatística podemos observar que não
houve diferença estatisticamente significativa entre as formulações FAÇAÍ e FAO15I, assim
como ocorre também entre as formulações FAÇAÍ15I e FAO15I.
Na Figura 29, a formulação FAO15I evidencia um efeito biológico de valores de
glicemia com perfil diferente da formulação FAÇAÍ15I contendo óleo de açaí, mostrando que
o ácido oleico presente nas formulações foi o principal responsável pela absorção de INS, e
pelo importante efeito hipoglicêmico observado in vivo. Entretanto, a presença dos outros
ácidos graxos na formulação FAÇAÍ15I desempenhou um papel fundamental na modulação
do efeito hipoglicêmico observado para o ácido oleico puro atingido em aproximadamente 1
hora, prolongando-o até o período de 6 horas.
A presença dos ácidos graxos em sua totalidade foi importante para o controle da
liberação de INS da formulação FAÇAÍ15I no ensaio in vivo, assim como para a absorção e
efeito hipoglicêmico da mesma. Todavia, estudos utilizando ácido palmítico em soluções
micelares contendo INS obtiveram êxito na promoção de absorção do fármaco em questão,
devido à formação de uma camada micelar rígida, a qual aderiu de maneira eficiente nas
mucosas e membranas (MESIHA, PLAKOGIANNIS, VEJOSOTH, 1994). Outro ponto diz
respeito ao diâmetro das partículas/micelas que segundo alguns autores é muito importante
para a permeação de fármacos em mucosas e membranas biológicas (MÄLKIÄ et al., 2004).
As características de diâmetro das micelas apresentados anteriormente demonstraram que
FAÇAÍ15I possui diâmetro de partícula menor em comparação às outras formulações, o que
pode ter influenciado positivamente na permeação de INS e na consequente redução
55
glicêmica in vivo, corroborando assim com constatações obtidas por Morishita e cols. (2004).
Eles perceberam que partículas pequenas nas matrizes poliméricas (carreadoras de INS)
permitiam melhor adesão à mucosa do intestino, possivelmente pelo aumento da superfície de
contato proporcionando também uma eficiente absorção no intestino delgado e
consequentemente melhorando a biodisponibilidade da INS.
Os ácidos graxos atuaram de maneira positiva na formulação FAÇAÍ15I de maneira que
suas características, tais quais: serem componentes estruturais das membranas biológicas e
atuarem como precursores de mensageiros intracelulares, que por ação de mecanismos ainda
não elucidados na literatura agem aumentando a absorção de fármacos hidrofílicos como a
INS presentes em sistemas poliméricos micelares como são as formulações de F127 (CURI et
al., 2002).
No intuito de comparar o efeito hipoglicêmico das formulações FAÇAÍ15I em ratas
albinas saudáveis e diabéticas da linhagem Fischer, a DM foi induzida nos animais saudáveis
por injeção intraperitoneal de aloxano, com posterior confirmação dos valores glicêmicos
(superiores a 300 mg/dl). O efeito hipoglicêmico da formulação FAÇAÍ15I nos animais
diabéticos e saudáveis está representado na Figura 30.
Figura 30 – Perfil glicêmico após administração retal da formulação FAÇAÍ15I em ratas albinas
saudáveis e diabéticas da linhagem Fischer.
Condições do ensaio: Níveis de glicose (mg/dl) determinados nos tempos 0, 1, 3 e 6 horas após
administração retal das formulações, por meio do glicosímetro Contour TS® (Bayer, Brasil).
Na Figura 30 podemos observar que o perfil glicêmico após a administração retal da
formulação FAÇAÍ15I em ratas albinas diabéticas da linhagem Fischer teve um pico
56
hipoglicêmico entorno de 180 min enquanto em ratas albinas saudáveis da linhagem Fischer,
o pico hipoglicêmico foi entorno de 120 min. Por outro lado, a intensidade da redução
glicêmica foi mais acentuada nos animais diabéticos do que nos animais saudáveis, mas em
ambas, o perfil glicêmico se manteve constante até o tempo de 360 min.
A atuação da formulação FAÇAÍ15I nos animais diabéticos demonstra que sua eficácia
não foi afetada na presença da doença, pelo contrário, demonstrou resultados de redução
glicêmica superiores aos obtidos com os animais saudáveis, o que comprova a ação sinérgica
dos ácidos graxos presentes no óleo de açaí na absorção retal de INS, e na sua posterior ação
na circulação sistêmica, atuando de maneira significativa para a homeostase glicêmica no
organismo dos modelos animais utilizados nos experimentos. Sendo assim, a hipoglicemia
observada tanto nos animais saudáveis, quanto nos diabéticos, ratifica o potencial do óleo de
açaí como agente promotor de permeação de INS formulado em F127 na mucosa retal.
57
6. CONCLUSÕES
Neste trabalho, formulação de Pluronic®
F127 (F127) contendo óleo de açaí (Euterpe
oleracea) foi desenvolvida para administração de insulina (INS) por via não invasiva. A
composição do óleo de açaí foi avaliada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massa, sendo encontrada grande quantidade de ácidos graxos saturados e insaturados. Os
ácidos graxos majoritários foram o ácido oleico (66,6%), o ácido palmítico (15,1%) e o ácido
linoleico (4,7%).
A formulação contendo óleo de açaí e INS apresentou micelas com diâmetro médio de
373,10 ± 2,40 nm e índice de polidispersão de 0,501, sendo o potencial zeta em torno de –
43,90 ± 1,94 mV.
A análise da polaridade do microambiente das micelas da formulação contendo óleo de
açaí por espectrometria de fluorescência, utilizando o pireno como sonda fluorescente revelou
que a presença do óleo de açaí diminui significativamente a polaridade do microambiente
micelar/goticular, possivelmente devido a quantidade variada de ácidos graxos saturados,
monoinsaturados e poli-insaturados que o óleo de açaí possui.
A avaliação do efeito hipoglicêmico em ratas albinas saudáveis e diabéticas, da linhagem
Fischer, após administração retal da formulação contendo óleo de açaí e INS na dose de 15
UI/Kg do animal, resultou num importante efeito hipoglicemico, o qual se prolongou pelo
intervalo de 6 horas em que o experimento foi realizado. O efeito hipoglicêmico da
formulação contendo óleo de açaí não diferiu estatisticamente do efeito hipoglicêmico da
formulação contendo ácido oleico utilizando a mesma dose de INS (15 UI/Kg).
Podemos esperar que novos estudos sobre essa formulação, avaliando outros parâmetros
como a permeação in vitro da INS, possa evidenciar seu mecanismo de absorção na mucosa
retal e possíveis alterações morfológicas nas células e tecido dessa região, de maneira que
adaptações farmacotécnicas possam permitir a utilização da formulação por longo período de
tempo.
Finalmente, esses resultados abrem novas perspectivas ao desenvolvimento de
formulações para administração da INS por vias alternativas à via subcutânea, como exemplo,
a via retal e oral. Dessa forma, a formulação que desenvolvemos torna-se uma importante
ferramenta na pesquisa por um tratamento eficaz, sem maiores complicações, com custos
reduzidos em relação aos tratamentos medicamentosos existentes, que permitam o tratamento
do Diabetes mellitus utilizando recursos naturais e renováveis como o óleo de açaí. Esta
58
formulação também pode trazer benefícios não só aos pacientes portadores da patologia,
como também econômicos e sociais, por se tratar de uma pesquisa que relaciona recursos
naturais oriundos da flora brasileira.
59
7. REFERÊNCIAS
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69
8. ANEXO
Comprovante do Comitê de Ética Animal
70
![Farsa dicha Turquesana contra el Turco muy galana.parnaseo.uv.es/Lemir/Textos/FarsaTurquesana/... · 2002-09-12 · Farsa dicha Turquesana contra el Turco muy galana. [imagen] Obra](https://img.document.onl/doc/110x75/5e7210dace36ec7512662f29/farsa-dicha-turquesana-contra-el-turco-muy-2002-09-12-farsa-dicha-turquesana-contra.jpg)
