Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento … · 2011-05-10 · REFERÊNCIAS Jedd M Hillegass, Arti Shukla, Sherrill A Lathrop, Maximilian B MacPherson, Naomi K Fukagawa,

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO

CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

DISCIPLINA DE ENGENHARIA TECIDUAL

PROFESSORA FERNANDA NEDEL

Carolina Ximendes

Caroline Lucas

25 de Abril de 2011

Nanomateriais e cultivo celular

1

NANOMATERIAIS

Potenciais efeitos adversos na saúde humana

Testes de toxicidade

Material é colocado em contato com a cultura

Busca de alterações celulares por diferentes mecanismos2

Introdução

CULTIVO CELULAR

3

Introdução

Células epiteliais Células mesoteliais

Confluência de 80-90%

4

Introdução

ENSAIOS IN VITRO

Citotoxicidade

Proliferação celular

Genotoxicidade

Expressão gênica

5

Introdução

AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE

Detectar o potencial de um material em produzir efeitosletais ou subletais

Importante no desenvolvimento de produtos para usoem humanos e animais

Aplicado à biomateriais

Liberação de substâncias tóxicas

Lesão celular ou redução da taxa de crescimento 6


Teste de exclusão de Trypan Blue

Microcultura de tetrazólio

Ensaio da Lactato Desidrogenase

7



8

Controle

Identifica o número de células viáveis



9

Nanopartículas Tipo celular Resultado

Amianto crocidolita Células mesoteliais Citotóxico

PLA para entrega de genes

Células epiteliaisNão citotóxico(até 4mg/mL)

Diferentes metais e nanotubos de

carbonoCélulas do pulmão

CuO - CitotóxicoFerro - Pouca toxicidade

NTCs - Citotóxicos

Hillegas et al; Bejjani et al; Karlsson et al


Microcultura de tetrazólio (MTT)

Ensaio metabólico colorimétrico

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromide]

Enzima desidrogenase

10



11

Adição do

tetrazólio

Controle: Cultivo +

tetrazólio



12


Nanopartícula para entrega de fármaco

Células mesoteliaisAumento da

citotoxicidade

PLGA + Paclitaxel Células do pulmãoDiminuição da

viabilidade celular

Hillegas et al; Fonseca et al


Lactato desidrogenase (LDH)

Enzima citosólica

Indicadora de morte celular

Integridade da membrana

13


Lactato desidrogenase (LDH)

14


Albumina e polialquilcianoacrilato

Células de pulmão Albumina – Não apresentou

aumento de LDH Polialquil – Aumento de LDH

Diferentes metais Células do fígadoDiâmetro maior – Mais

liberação de LDH

Brzoska et al; Hussain et al

AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR

Ensaios para avaliar a multiplicação celular

Métodos histoquímicos e imunohistoquímicos

15


Conteúdo de DNA

Incorporação de timidina

Ki-67

Detecção por PCNA

16


Conteúdo de DNA

Observação e contagem de células em mitose

Quantificar e identificar agentes inibidores ou indutores

Resultado: divisão do número de células em mitose pelonúmero total de células em uma população

17


Incorporação de timidina

Indicativo do número de células em proliferação

Técnica dispendiosa

Exige treinamento e instalações especiais

Longo período de incubação

18


Antígenos nucleares

Ki-67

Presente em todas as fases do ciclo celular

PCNA

Associados com síntese e reparação do DNA

19

AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE

Nanomateriais com propriedades físico-químicasdistintas.

Propriedades de superfície estão diretamenterelacionadas com o potencial genotóxico.

Análise dos efeitos diretos no DNA forneceminformações preliminares sobre o potencial degenotoxicidade.

20


Teste de Ames em Salmonella typhimurium eEscherichia coli.

Identificação de mutações no DNA por avaliação daoxidação de guanina

Análise de cariótipos- Ensaio de aberraçõescromossômicas e Teste do micronúcleo

Ensaio cometa 21


Teste de Ames

Ames e colaboradores desenvolveram uma forma desimular o metabolismo humano no sistema bacteriano.

Realizado em presença ou ausência de sistema demetabolização exógeno (mistura S9).

Incorporação de enzimas do fígado de mamífero nosistema de teste em bactérias.

22


Teste de Ames

Ocorrência de uma mutação genética que não causaexigência a um determinado nutriente, que antes eraindispensável ao microrganismo.

S. typhimurium- histidina

E. coli- triptofano

23


Teste de Ames

Salmonella typhimurium

24


Teste de Ames

Nanopartículas Bactérias Resultado

Partículas de UF·TiO2

S. typhimurium cepas TA98,TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli

cepaWP2uvrA

Não mutagênica

Fulerenos

S. typhimurium strains TA98,TA100, TA1535, e TA1537 e E. coli

cepaWP2uvrA

Não mutagênica

Amianto crocidolitaferro dependente

S. typhimurium TA102 Mutagênica25


Teste de Ames

Possíveis diferenças na captação celular das nanopartículase complexidade genômica entre procariontes e eucariontes.

O ensaio de Ames deve ser complementado por outrosestudos.

26


Identificação de mutações no DNA por avaliação daoxidação de guanina

Mutações pontuais podem ser identificadas mediante aanálise da oxidação de guanina.

Formação de (8-OHdG) e (oxo-dG).

Potencial do nanomaterial para gerar ROS.

27


Identificação de mutações no DNA por avaliação da oxidação de guanina

Nanopartícula Tipo celularNíveis de (8-OHdG) e

(oxo-dG)

Liga de cromo-cobalto (∼30 nm)Fibroblastos

humanosNão ocorreu aumento de

(8-OHdG)

Sílica luminescente (∼50 nm)Células de

adenocarcinoma de pulmão (A549)

Mesmo níveis de (oxo-dG) no grupo exposto e no

controle.

28


Ensaio de aberrações cromossômicas (CA)

Avalia efeitos no número e na integridade doscromossomos através da análise de cariótipos.

Técnicas de coloração e microscopia.

Tratamento durante a fase S.

29

AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE

Ensaio de aberração cromossômica (CA)

Nanopartícula Concentração (μg/mL)

CA e aumento no número de

cromossomos

UF·TiO2 (≤60 nm) 209.7 a 5000 Não

UF·TiO2 (∼140 nm) 25 to 2500 Não

Fulerenos 5000 5% das células testadas

30


Teste do micronúcleo

Micronúcleos se formam pela extrusão de cromossomosinteiros ou seus fragmentos durante a divisão celular.

Permite identificar eventual aumento na frequência demutações em células.

31


Teste do Micronúcleo

Nanopartículas Linhagem celularFormação de micronúcleos

UF·TiO2 (≤20 nm)Fibroblastos de embriões de

hamster sírio.Aumentou

UF·TiO2

(<100 nm)Linfócitos humanos do sangue

periférico.Aumentou

UF·TiO2 (<100 nm) WIL2-NS Aumentou

TiO2, liga cobalto-cromo (∼30 nm)

Fibroblastos humanos Aumentou 32


Ensaio Cometa

Identificação de quebras simples e duplas no DNA.

Células com maior quantidade de danos no DNAapresentam migração mais rápida do material genético.

Extensão do dano avaliada pelo deslocamento do materialgenético (cauda do cometa formada) em relação ao núcleo.

33

AVALIAÇAO DE GENOTOXICIDADE

Ensaio cometa

34


Ensaio Cometa

Nanopartículas CélulasTempo de exposição

OTM

TiO2 (<100 nm)Linfócitos humanos do

sangue periférico 0-24 h

Aumento dose e tempodependente

UF·TiO2 (<100 nm WIL2-N - Aumento de 5 vezes

Fulereno C60 - - Aumentou

Liga de cobalto-cromo (∼30 nm)

Fibroblastos humanos 24 h Aumentou

Silica luminescente (∼50 nm)

A549 -Não ocorreu mudança

significativa35

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

Técnicas para avaliação da expressão gênica

Northern blotting

Ensaio de proteção à ribonuclease (RPA)

Ensaios de PCR- RT-PCR e Real-Time PCR

Microarrays

36


Northern blotting

Analisa a localização e a quantidade de mRNA.

Compara padrão de expressão gênica entre duas amostras.

Desnaturação do RNA e corrida em gel de agarose.

Trasferência para membrana por ação capilar.

Sondas de RNA ou DNA para hibridizar.

37

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICAEnsaio de proteção a ribonuclease (RPA)

Detecta e quantifica transcrições específicas de mRNA.

38


Real-time PCR

Método quantitativo para detecção do número decópias do fragmento alvo.

Quantificação realizada a cada ciclo, baseada nadetecção e quantificação de fluorescência emitidadurante a reação.

Detecção específica e não específica

39

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICART-PCR

Reação da transcriptase reversa, seguida pela PCR.

A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetizauma cadeia de DNA complementar (cDNA).

Amplamente utilizada para verificar a expressão gênica.

40

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Microarrays

Arranjo pré-definido de moléculas de DNAquimicamente ligadas à uma superfície sólida.

Detecção e quantificação de ácidos nucleicos (mRNA naforma de cDNA ou DNA genômico) provenientes deamostras biológicas.

41

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA

Ensaio Células Resultado

Partícula magnética coberta por ferritina x tratamento sem

partícula magnética

Fibroblasto Humano

Diferença de expressão de 1718 mRNA , genesresponsáveis pela organização do citoesqueleto esinalização celular

PLA-PEGCélulas

hepáticas de camundongos

Super expressão de transportadores ABC e baixaexpressão de Glutationa-S-transferase P1

Inalação de TiO2 -Efisema e indução da expressão de genesrelacionados com o ciclo celular, apoptose eexpressão de quimiocinas.

TiO2 revetido por BSA -Expressão do fator inibidor da migração demacrógafos (MIF)

Partículas submicrométricasde titânio

-Indução do fator estimulador decolônia de macrófago (M-CSF) em osteoblasto.s

Nanopartículas de carbono A549 Aumento da transcrição da heme oxigenase-1

Nanopartículas de cobaltoFibroblastos de camundongos

Ativação de vias celulares de defesa e demecanismos de reparo. 42

CONCLUSÃO

As técnicas podem ser utilizadas para avaliar a toxicidade dasnanopartículas, porém um número significativo de falsossinais positivos são gerados.

Mais de um ensaio e tipo celular devem ser empregados.

Realizar completa caracterização da variação de tamanho,área superficial e composição química dos nanomateriais.

Utilizar novas tecnologias, sistemas e métodos emergentes.

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REFERÊNCIAS

Jedd M Hillegass, Arti Shukla, Sherrill A Lathrop,Maximilian B MacPherson, Naomi K Fukagawa, Brooke TMossman. Assessing nanotoxicity in cells in vitro. Wileyinterdisciplinary reviews Nanomedicine andnanobiotechnology, 2010.

S.M. Hussain, K.L. Hess, J.M. Gearhart, K.T. Geiss, J.J.Schlager. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A ratliver cells. Elsevier, 2005.

Arora S, Jain J, Rajwade JM, Paknikar KM. Inter- actionsof silver nanoparticles with primary mouse fibroblastsand liver cells. Toxicol Appl Pharmacol, 2009. 44

REFERÊNCIAS

Bejjani RA, BenEzra D, Cohen H, Rieger J, Andrieu C, etal. Nanoparticles for gene delivery to retinal pigmentepithelial cells. Mol Vis, 2005.

Shukla A, Macpherson MB, Hillegass J, Ramos-Nino ME,Alexeeva V, et al. Alterations in gene expression inhuman mesothelial cells correlate with mineralpathogenicity. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009.

Eva Herzog, Alan Casey, Fiona M. Lyng, GordonChambers, Hugh J. Byrne, Maria Davoren. A newapproach to the toxicity testing of carbon-basednanomaterials—The clonogenic assay. Elsevier, 2007. 45

OBRIGADA!

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