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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Dissertação
Frutos da família Myrtaceae: Caracterização físico-química e potencial
inibitório da atividade das enzimas digestivas
Simone Muniz Pacheco
Pelotas, 2015
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Simone Muniz Pacheco
Frutos da família Myrtaceae: Caracterização físico-química e potencial
inibitório da atividade das enzimas digestivas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Leonardo Nora
Co-orientadora: Prof. Drª. Rejane Giacomelli Tavares
Pelotas, 2015
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Simone Muniz Pacheco
Frutos da família Myrtaceae: Caracterização físico-química e potencial inibitório da
atividade das enzimas digestivas
Dissertação aprovada, como requisito parcial, para a obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
Data da defesa: 27 de março de 2015
Banca examinadora: Prof. Dr. Leonardo Nora (orientador) Doutor em Plant Molecular Biology and Biochemistry pela Universidade East Anglia Prof. Drª. Rejane Giacomelli Tavares (co-orientadora) Doutora em Ciências Biológicas (Bioquímica) pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul Prof. Drª. Francieli Moro Stefanello Doutora em Ciências Biológicas (Bioquímica) pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul Prof. Drª. Letícia Mascarenhas Pereira Barbosa Doutora em Ciência e Tecnologia Agroindustrial pela Universidade Federal de Pelotas Pós-doutorando Dr. Rafael de Almeida Schiavon Doutor em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Pelotas
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas que de alguma forma me auxiliaram na
concretização deste trabalho. Em especial, agradeço aos meus pais, Telmo e
Zoraida, e ao meu marido, Claudio, pelo incentivo, compreensão, tolerância e
confiança na minha capacidade.
Meu reconhecimento se estende ao meu orientador, professor Leonardo
Nora, pela confiança e aporte para o desenvolvimento do trabalho. Aos meus
colegas do laboratório, principalmente, ao Mauricio Seifert, ao Rafael Schiavon, a
Fernanda Schiavon e a Bianca Camargo não só pelo auxílio técnico, mas também
por tornarem o ambiente mais alegre e divertido.
Não sei como agradecer à professora Rejane Giacomelli Tavares por toda a
sua orientação, tanto na teoria como na prática, indo inclusive para bancada; por sua
disponibilidade até nos finais de semana, mesmo tendo inúmeros afazeres. Para
mim, é um exemplo de orientadora, de professora e de pessoa.
Agradeço também ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos, à Embrapa e seu
pesquisador Dr. Rodrigo Franzon pelo fornecimento dos frutos, à Universidade
Federal de Pelotas e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos.
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RESUMO
PACHECO, Simone Muniz. Frutos da família Myrtaceae: Caracterização físico-química e potencial inibitório da atividade das enzimas digestivas. 2015. 82f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015.
As espécies vegetais Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), Eugenia uniflora (pitanga), Eugenia pyriformis (uvaia), Psidium cattleianum (araçá) e Syzygium cumini (jambolão) estão presentes na Floresta Atlântica e são utilizadas pela população, para tratar diversas patologias, especialmente o diabetes melito tipo 2. Entretanto, a eficácia destes tratamentos e o mecanismo envolvido ainda não foram totalmente elucidados. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo principal avaliar o potencial dos compostos naturais destes frutos em inibir as enzimas α-amilase e α-glicosidase que estão envolvidas no metabolismo de carboidratos. Estes frutos também foram avaliados físico-quimicamente, realizando-se dentre outras análises a quantificação dos compostos fenólicos totais e a determinação da atividade antioxidante (métodos ABTS e DPPH). Os extratos metanólicos de P. cattleianum (acesso 44), S. cumini e E. pyriformis (acessos 11 e 15) inibiram de forma significativa a atividade da α-amilase. Os extratos metanólicos de P. cattleianum (acessos 44 e 87) também inibiram a atividade da α-glicosidase, utilizando-se os substratos maltose e sacarose. Em virtude da atividade antioxidante, da elevada quantidade de compostos fenólicos e da capacidade de inibição das enzimas digestivas do metabolismo de carboidratos, os frutos de P. cattleianum (acessos 44 e 87), S. cumini e E. pyriformis (acessos 11 e 15) podem apresentar potencial uso no manejo da hiperglicemia pós-prandial.
Palavras-chave: família Myrtaceae; α-amilase; α-glicosidase; diabetes melito
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ABSTRACT
PACHECO, Simone Muniz. Fruits from the Myrtaceae family: Physicochemical characterization and inhibitory potencial of digestive enzimes activity. 2015. 82f. Dissertation (Master Degree em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015.
Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), Eugenia uniflora (pitanga), Eugenia pyriformis (uvaia), Psidium cattleianum (araçá) and Syzygium cumini (jambolão) grow in the Brazilian Atlantic Forest and their fruits are commonly used as medicine to treat diseases related to carbohydrate metabolism, such as diabetes. The effectiveness of these treatments has not been demonstrated neither the biochemical mechanism involved. Therefore this study was devised to evaluate the potential of natural compounds of these fruits to inhibit key enzymes α-amylase and α-glucosidase involved in the carbohydrate metabolism. The fruits were also subjected to physicochemical characterization, quantification of phenolics compounds and antioxidant activity (ABTS and DPPH methods). The methanolic extracts of P. cattleianum (access 44), S. cumini, E. pyriformis (accesses 11 and 15) distinctively inhibited α-amylase activity. The methanolic extracts of P. cattleianum. (accesses 44 and 87) also inhibited α-glycosidase activity, with either maltose or sucrose as substrate. By having antioxidant activities, a fairly content of phenolic compounds, and capacity to inhibit carbohydrate digestive enzymes, P. cattleianum (access 44 and 87), S. cumini and E. pyriformis (accesses 11 and 15) could be good candidates to be used in the management of postprandial hyperglycemia.
Keywords: Myrtaceae family; α-amylase; α-glucosidase; diabetes mellitus
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Classificação dos metabólitos secundários......................................... 20
Figura 2 Estrutura química básica dos flavonoides........................................... 20
Figura 3 Estruturas básicas das subclasses de flavonoides............................. 22
Figura 4 Regulação da absorção da glicose antes e depois da refeição.......... 32
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LISTA DE TABELAS
Apêndices
Tabela 1 Coloração da casca de frutos da família Myrtaceae presentes no
Rio Grande do Sul, Brasil.................................................................. 77
Tabela 2 Características físico-químicas de frutos da família Myrtaceae
presentes no Rio Grande do Sul, Brasil............................................ 78
Tabela 3 Conteúdo de vitamina C em frutos da família Myrtaceae presentes
no Rio Grande do Sul, Brasil............................................................. 79
Tabela 4 Conteúdo de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e
capacidade antioxidante em extratos metanólicos (50%) de frutos
da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil.......... 80
Tabela 5 Conteúdo de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e
capacidade antioxidante em extratos etanólicos (80%) de frutos da
família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil ......... 81
Tabela 6 Conteúdo de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e
capacidade antioxidante em extratos (acetona 80%) de frutos da
família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil............... 82
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTS 2,2’-azino-bis(3-ethilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) sal diamônio
CIE Comission Internacionale de I’Eclairage
COMT Catecol-O-metiltransferase
DCNT Doenças crônicas não transmissíveis
DM Diabetes melito
DM1 Diabetes melito tipo 1
DM2 Diabetes melito tipo 2
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
DPPH-4 Dipeptidilpeptidase-4
EAG Equivalente de ácido gálico
GLP-1 Peptídeo semelhante ao glucagon 1
GLUT2 Transportador de glicose
IDF International Diabetes Federation
SBD Sociedade Brasileira de Diabetes
SGLT1 Transportador ativo de glicose dependente de sódio
SULT Sulfotransferases
UGTs UDP-glucoronosiltransferases
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 11
2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 13
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 13
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 13
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 14
3.1 FRUTOS DA FAMÍLIA MYRTACEAE NO RIO GRANDE DO SUL ............................. 14
3.1.1 Araçá (Psidium cattleianum) ............................................................................. 14
3.1.2 Guabiroba (Campomanesia xanthocarpa) ....................................................... 16
3.1.3 Jambolão (Syzygium cumini) ............................................................................ 17
3.1.5 Pitanga (Eugenia uniflora) ................................................................................. 18
3.1.6 Uvaia (Eugenia pyriformis) ................................................................................ 19
3.2 COMPOSTOS FENÓLICOS ....................................................................................... 20
3.2.1 Funções, caracterização e extração ................................................................. 20
3.2.2 Atividade biológica dos compostos fenólicos ................................................. 27
3.2.3 Biodisponibilidade dos polifenóis .................................................................... 28
3.3 DIABETES MELITO ................................................................................................... 29
3.4 ABSORÇÃO DOS CARBOIDRATOS ......................................................................... 31
3.5 DIABETES X COMPOSTOS FENÓLICOS ................................................................. 33
4 MANUSCRITO ................................................................................................................. 35
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 64
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 65
APÊNDICES ........................................................................................................................ 73
Apêndice A ....................................................................................................................... 75
Apêndice B ....................................................................................................................... 78
Apêndice C ...................................................................................................................... 79
Apêndice D ...................................................................................................................... 80
Apêndice E ....................................................................................................................... 81
Apêndice F ....................................................................................................................... 82
Apêndice G ...................................................................................................................... 83
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1 INTRODUÇÃO
O hábito de usar plantas para o tratamento de diversas patologias,
especialmente no diabetes tipo 2 (DM2), é difundido pelo mundo todo,
principalmente em países asiáticos (ARULSELVAN et al., 2014; GIRONÉS-
VILAPLANA et al., 2014). No Brasil, também é comum o uso de espécies vegetais
para o tratamento desta patologia. No Rio Grande do Sul (RS), um estudo encontrou
81 espécies vegetais utilizadas pela população como antidiabéticos. Dentre as
citadas, encontravam-se a Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), a Eugenia
uniflora (pitanga), o Psidium cattleianum (araçá) e o Syzygium cumini (jambolão)
(TROJAN-RODRIGUES et al., 2012).
Os benefícios atribuídos aos alimentos de origem vegetal são em decorrência
da presença de vitaminas, minerais, fibras e compostos como os metabólitos
secundários (compostos fenólicos, fitoesteróis, alcaloides, carotenoides, compostos
contendo nitrogênio e compostos organosulfurados) ou, ainda, do sinergismo entre
eles. Os metabólitos secundários são compostos químicos bioativos, não nutrientes,
encontrados em alimentos de origem vegetal e que fornecem benefícios à saúde
como a diminuição do risco de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT). Estes
compostos são provenientes do metabolismo especializado das plantas e são
fundamentais em processos como a polinização, pois conferem cores e sabores
atraentes; na defesa contra patógenos, parasitas e predadores e em situações de
estresses ambientais, como o hídrico e o salino (CHEYNIER, 2005; FRAGA et al.,
2010; LIU, 2013a; LIU, 2013b).
Dentre os metabólitos secundários, os compostos fenólicos são os mais
estudados (LIU, 2013a; LIU, 2013b). Isso se deve às suas propriedades biológicas
tais como: atividade antitumoral, antioxidante, antiviral e anti-inflamatória, podendo
ter efeitos benéficos na prevenção e/ou tratamento de doenças como DM2, câncer,
doenças neurodegenerativas e doença cardiovascular (BURTON-FREEMAN, 2010;
RODRIGO et al., 2014).
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Diversas pesquisas procuram elucidar o verdadeiro potencial de plantas
nativas na prevenção e tratamento do DM2, bem como os compostos envolvidos e
os mecanismos de ação. Estudos apontam os compostos fenólicos como um
potencial agente antidiabético, principalmente em virtude de sua ação antioxidante,
uma vez que o DM2 é associado ao estresse oxidativo causado pela hiperglicemia
(DEMBINSKA-KIEC et al., 2008; HABTEMARIAM; VARGHESE, 2014).
Os compostos fenólicos também podem exercer efeitos hipoglicemiantes
através da inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase que são as responsáveis
pela absorção da glicose no sistema digestivo. Esta inibição retarda o processo de
hidrólise de polissacarídeos, oligossacarídeos e dissacarídeos, diminuindo a
absorção da glicose e a hiperglicemia pós-prandial (BAHADORAN; MIRMIRAN;
AZIZI, 2013; ARULSELVAN et al., 2014; GIRONÉS-VILAPLANA et al., 2014). A
hiperglicemia pós-prandial promove estresse oxidativo, contribuindo para o
desenvolvimento de outras doenças crônicas como obesidade, hipertensão,
aterosclerose e síndrome metabólica (BURTON-FREEMAN, 2010).
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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar frutos de plantas da família Myrtaceae, comuns na região da
Floresta Atlântica do Estado do Rio Grande do Sul, quanto a aspectos físicos,
químicos e quanto à atividade inibitória de seus compostos naturais sobre enzimas
relacionadas ao metabolismo de carboidratos em humanos e animais.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Caracterizar físico-quimicamente os frutos Campomanesia xanthocarpa,
Eugenia pyriformis, Eugenia uniflora, Psidium cattleianum e Syzygium cumini.
- Testar diferentes solventes na extração dos compostos fenólicos e na
determinação da capacidade antioxidante.
- Avaliar a ação dos extratos metanólicos dos frutos sobre a atividade das
enzimas α-amilase e α-glicosidase.
- Determinar a concentração de vitamina C dos extratos metanólicos dos
frutos testados.
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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 FRUTOS DA FAMÍLIA MYRTACEAE NO RIO GRANDE DO SUL
O Brasil possui grande biodiversidade em sua flora distribuída pelos diversos
biomas existentes no país. A maioria dos estudos se dedica a espécies vegetais da
Amazônia e do Cerrado muito utilizadas para o consumo in natura, mas também
para utilização nas agroindústrias e nas indústrias farmacêuticas (FRANZON;
RASEIRA, 2012; PEREIRA et al., 2012).
No RS, também se encontra muitas espécies nativas e adaptadas
principalmente da família Myrtaceae. Esta família inclui frutos como Campomanesia
xanthocarpa (guabiroba), Eugenia pyriformis (uvaia), Eugenia uniflora (pitanga),
Psidium cattleianum (araçá) e Syzygium cumini (jambolão) (FRANZON; RASEIRA,
2012).
Várias destas espécies são utilizadas há algum tempo na medicina popular.
Hoje, em virtude da caracterização mais minuciosa, vários dos seus compostos
derivados do metabolismo secundário, em especial os compostos fenólicos, são
associados à prevenção de DCNT (PEREIRA et al., 2012).
Deste modo, estes frutos possuem potencial para maior comercialização de
frutos frescos, assim como para a utilização na elaboração de produtos como
iogurtes, geleias, entre outros. Além disso, seu uso também é interessante na
indústria de cosméticos e farmacêutica como citado anteriormente (PEREIRA et al.,
2012).
3.1.1 Psidium cattleianum (araçá)
O araçá possui uma ampla área de ocorrência. Estende-se pela costa
Atlântica, da Bahia ao Rio Grande do Sul. Também pode ser encontrado no nordeste
uruguaio. É conhecida como araçá-coroa, araçá-de-coroa e araçá-da-praia
(FRANZON et al., 2009; LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
15
Na sua forma natural, pode chegar até 6 metros de altura e sua floração
ocorre de outubro a novembro no sul do Brasil. Nestas condições, também pode
haver coletas de frutos entre outubro e março (LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
Os frutos de P. cattleianum são carnosos e suas sementes estão envolvidas
pela polpa, sendo que um único fruto de araçá pode possuir mais de 100 sementes.
A coloração do epicarpo pode ser amarela ou vermelha e a do endocarpo pode
variar de amarelo-claro a branco ou vermelho. Os frutos possuem tamanhos
heterogêneos, prevalecendo o diâmetro entre 2,2 cm a 5,0 cm (CASTRO; RASEIRA;
FRANZON, 2004; FRANZON et al., 2009; LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
No RS, existem duas cultivares de P. cattleianum disponíveis. Uma é
denominada de “Ya-cy” que produz frutos com epicarpo amarelo; a outra é
denominada “Irapuã” cujo epicarpo é vermelho. Ambas cultivares foram lançadas
pela Embrapa Clima Temperado de Pelotas (RS) (FRANZON et al., 2009; LISBÔA;
KINNUP; BARROS, 2011). No RS, há plantação comercial destas cultivares em
pequena escala (FRANZON et al., 2009).
O araçá possui potencial para comercialização, não só de frutos in natura,
mas também de produtos oriundos de processamento como sorvetes, geleias,
sucos, polpa concentrada e congelada e licores. A cultivar “Irapuã” possui
características importantes para a produção, por exemplo, de doce em pasta, pois
apresenta frutos médios a grandes, maior acidez e leve adstringência (FRANZON et
al., 2009; LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
A composição dos frutos interfere diretamente na qualidade dos mesmos e na
sua atividade biológica. Na comparação de araçás vermelhos e amarelos colhidos
em Pelotas/RS, percebeu-se que o conteúdo de compostos fenólicos totais e
flavonoides nos araçás vermelhos foi bastante superior. Foi encontrado média de
501,33 ± 0,01 mg EAG/100 g de amostra fresca de compostos fenólicos totais e
100,20 ± 0,07 mg equivalente de quercetina/100 g de amostra fresca de flavonoides
totais em araçás vermelhos (extrato metanólico). Analisando os mesmos compostos
nos araçás amarelos (extrato metanólico), os resultados obtidos foram 292,03 ± 0,03
mg EAG/100 g de amostra fresca e 35,12 ± 0,12 mg equivalente de quercetina/100 g
de amostra fresca de compostos fenólicos totais e flavonoides totais
respectivamente (BIEGELMEYER et al., 2011).
Os principais flavonoides encontrados foram glicosídeos derivados da
quercetina como hiperosídeo e isoquercitrina. Apenas a antocianina cianidina foi
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detectada nos araçás vermelhos (BIEGELMEYER et al., 2011). Outro estudo
também analisou araçás vermelhos e amarelos oriundos de Pelotas/RS, porém de
outras seleções, encontrando em extrato aquoso valores de compostos fenólicos
totais entre 581,02 mg EAG/100 g de amostra fresca a 632,56 mg EAG/100 g de
amostra fresca em araçás vermelhos e em araçás amarelos variou de 402,68 mg
EAG/100 g de amostra fresca a 528,30 mg EAG/100 g de amostra fresca. Entre os
fenólicos individuais majoritários em ambos araçás, foram detectados (-)-
epicatequina e ácido gálico. Em menor quantidade, foram encontrados ácido
cumárico, ácido ferúlico, miricetina e quercetina (MEDINA et al., 2011). da Silva et al.
(2014) encontrou o ácido gálico como composto majoritário.
Ainda neste estudo, os autores verificaram que os extratos de araçá tanto
vermelho quanto amarelo apresentaram atividade antimicrobiana contra a
Salmonella enteritides. O mecanismo de inibição usualmente atribuído é a reação
entre os compostos fenólicos e a membrana celular, inativando enzimas essenciais
e/ou formação de complexos com os íons metálicos, limitando seu uso no
metabolismo microbiano. Também todos os extratos reduziram a taxa de
sobrevivência de células de câncer de mama e de câncer de cólon, além de
apresentarem atividade antioxidante (MEDINA et al., 2011).
3.1.2 Campomanesia xanthocarpa (Guabiroba)
A guabiroba, também chamada de guaviroba e guabirova, ocorre em Minas
Gerais e Mato Grosso do Sul até o Rio Grande do Sul, e também, no norte do
Uruguai e no nordeste da Argentina (CASTRO; RASEIRA; FRANZON, 2004;
LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
A guabirobeira é uma árvore que pode atingir até 15 metros de altura, seus
frutos são do tipo baga, amarelos e globosos, com 2 cm a 3 cm de diâmetro
transversal. O epicarpo é liso e fino e o endocarpo é suculento, aromático e
adocicado, possuindo até 32 sementes. Baseando-se nestas características, a
guabiroba possui potencial, principalmente, para a produção de polpa concentrada e
congelada, além de geleias, licores e sorvetes (CASTRO; RASEIRA; FRANZON,
2004; KINNUP, 2007; LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
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A floração e a maturação podem ocorrer, respectivamente, de outubro a
novembro e de novembro a dezembro. Estes períodos podem ser alterados em
função da região e das diferentes espécies existentes (RASEIRA; FRANZON, 2004).
A avaliação de fitoquímicos de seis genótipos de guabiroba de três municípios
do RS indicou que o conteúdo de compostos fenólicos totais nos frutos variou de
431,6 a 813,70 mg EAG/100 g de amostra fresca e a vitamina C variou de 809,10 a
3243,30 mg ácido L-ascórbico/100 g de amostra fresca. O percentual de inibição do
radical DPPH apresentou valores de percentual de inibição entre 57,48% e 91,0%.
Nos testes in vivo, houve significativa proteção das células de Saccharomyces
cerevisae frente ao peróxido de hidrogênio. Em relação à atividade antiproliferativa,
o extrato aquoso com concentração de 100 µg/mL reduziu o número de células
viáveis de adenocarcinoma de mama (HAAS, 2011).
No mesmo estudo, os compostos fenólicos majoritários encontrados foram a
epicatequina e o ácido gálico e, em menores concentrações, o ácido elágico, o ácido
ferúlico e o p-cumárico (HAAS, 2011).
O maior número de estudos com esta espécie vegetal utiliza suas folhas. Na
avaliação do extrato de folhas de guabiroba, houve presença principalmente de
compostos como as saponinas, taninos e terpenos. Neste estudo, avaliou-se o efeito
das folhas trituradas e encapsuladas em pacientes hipercolesterolêmicos,
encontrando diminuição do colesterol total e do LDL dos pacientes, além da redução
do estresse oxidativo no plasma (KLAFKE, et al., 2010).
3.1.3 Syzygium cumini (Jambolão)
O jambolão é originário da Ásia tropical, principalmente da Índia (FARIA;
MARQUES; MERCADANTE, 2011). Hoje é encontrado em várias partes do mundo
como na América do Sul e nos Estados Unidos, sobretudo na Flórida e no Havaí
(BALIGA et al., 2011). Pode-se classificá-lo como um fruto exótico, uma vez que não
é originário do Brasil. Popularmente, o jambolão pode ser chamado de jamelão,
jambu, jambuí e azeitona-da-terra (VIZZOTTO; PEREIRA, 2008).
Os frutos possuem de 2 cm a 3 cm de comprimento, são em formato oval e
apresentam apenas uma grande semente (BENHERLAL; ARUMUGHAN, 2007;
VIZZOTO; PEREIRA, 2008). A floração acontece apenas uma vez por ano, levando
aproximadamente 2 meses até completar o desenvolvimento completo do fruto.
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Estes frutos se arranjam em cachos. Cada cacho pode ter de 4 a 20 frutos, sendo
que eles não amadurecem todos ao mesmo tempo. Assim, pode-se encontrar frutos
na coloração verde, magenta e roxo escuro. A cor roxo escuro caracteriza seu
completo amadurecimento. Neste estágio, o fruto possui sabor doce, mas é um
pouco azedo e adstringente. O jambolão pode ser consumido desidratado
(comercializado nos Estados Unidos e países da Europa) ou como suco, polpa e
geleia (BALIGA et al., 2012).
O jambolão é muito utilizado para o tratamento de doenças principalmente do
diabetes e de suas complicações. Diferentes partes desta espécie são utilizadas
como o fruto, as sementes, a casca do caule e as folhas. Em frutos da Índia, foram
encontrados compostos como o ácido gálico, a cianidina diglicosídeo, a petunidina e
a malvidina (AYYANAR; SUBASH-BABU, 2012). Compostos como delfinidina e
malvidina diglicosídeo também foram encontrados no fruto. À polpa dos frutos foram
atribuídas atividades antioxidante, hepatoprotetora e antidiabética (BALIGA et al.,
2011). Frutos oriundos de três cidades do sul do RS encontraram epicatequina,
pelargonidina e cianidina-3-glicosídeo (BARCIA et al., 2012).
3.1.5 Eugenia uniflora (Pitanga)
Ocorre da Bahia ao RS e, ainda, na Argentina, no Uruguai e no Paraguai. A
altura desta árvore pode variar de 3 até 12 metros e seus frutos são definidos como
bagas globosas, achatadas nos polos e com 7 a 8 sulcos no sentido longitudinal.
Podem apresentar coloração que varia desde laranja até roxa. A pitanga possui, em
média, 3 cm de diâmetro e 1 a 2 sementes (CASTRO; RASEIRA; FRANZON, 2004;
OLIVEIRA et al., 2006; BOURSCHEID et al., 2011; SOBRAL et al., 2014).
A pitangueira apresenta produção duas vezes no ano: uma, nos meses de
março a abril; outra, nos meses de agosto a dezembro. Entretanto, a variação do
clima de cada região é que realmente influencia tanto na floração, quanto na
frutificação. Sabe-se que seu melhor desenvolvimento ocorre em locais quentes e
úmidos (FRANZON; RASEIRA, 2004; BOURSCHEID et al., 2011).
O consumo e uso da pitanga é mais difundido que as demais espécies aqui
relacionadas. Os frutos são mais utilizados para a produção de suco e polpa
congelada. Também são produzidos sorvete, geleia e licor. O comércio do fruto in
natura fica um pouco prejudicado, pois a pitanga é muito frágil e perecível. Além dos
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frutos da pitangueira, as folhas também são aproveitadas por possuírem óleos
essenciais que são extraídos e usados na indústria de cosméticos e perfumes
(BOURSCHEID et al., 2011; SOBRAL et al., 2014).
Esta espécie vegetal é popularmente conhecida pelo uso de suas folhas para
o tratamento de problemas digestivos ou hipertensão e por ser anti-inflamatória. Em
estudo com suco de pitanga, foi avaliado o potencial anti-inflamatório frente às
doenças periodontais, verificando-se que foi reduzido um biomarcador comum na
detecção de inflamação na gengiva. Os principais compostos encontrados,
oxidoselina-1,3,7(11)-trieno-8-ona e cianidina-3-glicosídeo, quando isolados, não
foram efetivos (SOARES et al., 2014).
Outro estudo encontrou os seguintes flavonoides majoritários: cianidina 3-O-
glicosídeo, miricetina 3-O-hexosídeo, miricetina 3-O-pentosídeo, miricetina 3-O-
ramnosídeo, quercetina 3-O-hexosídeo, quercetina 3-O-pentosídeo, quercetina 3-O-
ramnosídeo e miricetina desoxihexosídeo galato. Percebe-se que estes flavonoides
são glicosilados e é importante por diminuir a reatividade e aumentar a solubilidade
dos mesmos em água, fazendo com que fiquem nos vacúolos das células. O
consumo regular destas antocianinas tem sido associado com diminuição do risco
para doenças crônicas, principalmente nos casos que envolvem estresse oxidativo
(CELLI et al., 2011).
3.1.6 Eugenia pyriformis (Uvaia)
A uvaia, também denominada uvalha, uvaia-do-mato e azedinha, ocorre mais
intensamente de São Paulo ao RS (CASTRO; RASEIRA; FRANZON, 2004;
RASEIRA; FRANZON, 2004; LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
Esta árvore pode chegar até 15 metros de altura e seus frutos têm coloração
que varia da amarela à alaranjada. São suculentos, ácidos e aromáticos e
apresentam comprimento médio que varia de 2 cm a 2,5 cm (CASTRO; RASEIRA;
FRANZON, 2004; RASEIRA; FRANZON, 2004; LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
O período de floração e frutificação depende das regiões aonde ocorre. Na
Embrapa Clima Temperado, a floração da uvaia começa na terceira semana de
dezembro, estendendo-se até a segunda semana de fevereiro. A maturação dos
frutos começa na terceira semana de janeiro, prolongando-se até o final de fevereiro.
20
Além disso, esse período pode variar entre diferentes acessos na mesma região
(RASEIRA; FRANZON, 2004).
Poucos produtos utilizam a uvaia em sua formulação, sendo seu comércio
restrito a feiras locais. Entretanto, é um fruto que possui potencial para a produção
de sorvete, suco, iogurte, geleia, polpa concentrada e congelada, uma vez que
apresenta bastante polpa, é suculento e possui aroma agradável (KINNUP, 2007;
LISBÔA; KINNUP; BARROS, 2011).
Estudos com a uvaia são raros e, mais ainda, quando se relaciona com seus
efeitos biológicos. Estudo recente encontrou compostos fenólicos totais 115,96 ±
7,15 mg EAG/100 g de amostra fresca e como composto majoritário o ácido gálico
(DA SILVA et al., 2014). Estudos mais antigos apenas fornecem informações
agronômicas.
3.2 COMPOSTOS FENÓLICOS
3.2.1 Funções, caracterização e extração
Os compostos fenólicos ou polifenóis fazem parte do metabolismo
especializado dos vegetais. Nas plantas, podem desempenhar diversas funções
como defesa contra patógenos, parasitas e predadores, atrativo para animais
polinizadores e proteção contra raios ultravioleta (DEL RIO et al., 2013; LIU, 2013a).
São definidos como compostos bioativos (não nutrientes) presentes em espécies
vegetais, com atividade antioxidante, promovendo a redução do estresse oxidativo
que estariam envolvidos na causa das doenças crônicas como aterosclerose,
inflamação, câncer e diabetes (CORREIA, et al., 2012; LIU, 2013a; LIU, 2013b). A
classificação dos metabólitos secundários é apresentada na figura 1.
21
Figura 1 – Classificação dos metabólitos secundários Fonte: adaptado de Cardoso et al., 2009.
Estruturalmente são formados por um ou mais anéis aromáticos ligados a um
ou mais grupos hidroxila. A principal classificação encontrada divide os compostos
fenólicos em flavonoides e não flavonoides (SANDOVAL-ACUNÃ; FERREIRA;
SPEISKY, 2014).
Em relação aos flavonoides, sabe-se que possuem uma estrutura comum
entre todos os pertencentes ao grupo. Esta estrutura é caracterizada por dois anéis
aromáticos – anel A e anel B – ligados por três carbonos que, normalmente, formam
um anel heterocíclico com o oxigênio (anel C), conforme demonstrado na figura 2
(LIU, 2013a; LIU, 2013b).
Figura 2 - Estrutura química básica dos flavonoides Fonte: Pereira et al., 2009.
Metabólitos Secundários
Alcaloides e outros compostos nitrogenados
Alcaloides e outro compostos
nitrogenados
Metabólitos Secundários
22
Estes compostos estão presentes nos alimentos de origem vegetal
principalmente na forma glicosilada, podendo apresentar uma ou mais moléculas de
açúcar na estrutura, predominantemente, a glicose e a ramnose. Estão presentes
sobretudo em alimentos sem processamento. Na ausência destes, os compostos
são denominados de agliconas (HAMINIUK et al., 2012; LIU, 2013a; ZANOTTI et al.,
2015).
Podem ser subdivididos em flavonas, flavonóis, flavan-3-óis, isoflavonas,
flavanonas e antocianidinas. Diferenciam-se, principalmente, devido a diferenças na
estrutura do anel C (LIU, 2013a; LIU, 2013b). A figura 3 mostra a estrutura básica
das subclasses.
23
Flavonas
Flavonóis
Flavanonas
Flavan-3-óis
Antocianidinas
Isoflavonas
Figura 3 – Estruturas básicas das subclasses de flavonoides Fonte: adaptado de Manach et al., 2004 e Pereira et al., 2009.
R1
Luteolina = OH Apigenina = H
R1
R2
R4
R1 R2 R3 R4
Quercetina = OH OH OH OH Canferol = H OH OH OH
R1
R2
R3
R1 R2 R3
Naringenina = H H OH Hesperetina = CH3 OH H
R2
R1
R1 R2
(-)-epicatequina = OH H (+)-catequina = H OH
R2
R1
R1 R2
Pelargonidina = H H Cianidina = H OH
R1
R2
R1 R2
Genisteína = OH H Daidzeína = H H
R3
R1
24
A maioria dos compostos fenólicos encontrados em frutos pertence ao grupo
dos flavonoides especialmente da subclasse dos flavonóis (HAMINIUK et al., 2012;
LIU, 2013a; LIU, 2013b). Acumulam-se principalmente na casca dos frutos e nas
folhas, pois sua biossíntese é estimulada pela luz. Isso faz com que diferentes
partes do mesmo fruto possuam concentrações diferentes de flavonóis (MANACK et
al., 2004).
Os principais exemplos de flavonóis são a quercetina e o canferol. Nos
alimentos, estão presentes em cebola (1200 mg/Kg), chá verde (45 mg/L), chá preto
(35 mg/L), couve (600 mg/Kg), tomate (200 mg/Kg), brócolis (100 mg/Kg), mirtilo
(160 mg/Kg) e maçã (40 mg/Kg) (MANACK et al., 2004; ZANOTTI et al., 2015).
As flavonas são as menos encontradas nos alimentos de origem vegetal,
estando presentes em alimentos como a salsa, o aipo, o painço e o trigo. Exemplos
desse grupo são a luteolina e a apigenina. As flavanonas são encontradas em frutas
cítricas principalmente no albedo. Os principais exemplos são a naringenina, no
pomelo e a hesperidina na laranja, no limão e na lima. (MANACK et al., 2004;
ZANOTTI, 2015).
Outro grupo, as isoflavonas possuem uma estrutura semelhante à do
hormônio estrógeno, uma vez que têm grupos hidroxila nas posições 7 e 4’ da
estrutura. A principal fonte são as leguminosas, principalmente a soja (580 mg/Kg –
3800 mg/Kg) e derivados. As principais isoflavonas são a genisteína e a dadzeína.
Estas são sensíveis ao calor e, durante seu processamento para a produção da
bebida à base de soja, missô e tempeh, há a hidrólise dos glicosídeos com a
formação das agliconas que são bastante resistentes ao calor (MANACK et al.,
2004).
Os flavan-3-óis, ao contrário das outras subclasses de flavonoides, não estão
na forma glicosilada nos alimentos (MANACK et al., 2004). Encontram-se no
chocolate amargo (16500 mg/Kg), no chá verde (10000 mg/Kg), na erva-mate (5
g/L), na canela (81000 mg/Kg), na avelã (5000 mg/Kg) e no mirtilo (3310 mg/Kg). Os
principais flavan-3-óis são a (+)-catequina, (-)-epicatequina, galocatequina,
epigalocatequina e epigalocatequinagalato (MANACK et al., 2004; BRACESCO et
al., 2011; LIU, 2013a; LIU, 2013b; ZANOTTI et al., 2015).
As antocianidinas, que são muito instáveis, são a forma não glicosilada das
antocianinas. A adição de um monossacarídeo, normalmente a glicose, na posição
3, e a esterificação com ácidos orgânicos e ácidos fenólicos, ou a formação de
25
complexos com outros flavonoides são mecanismos que conferem estabilidade ao
composto. As antocianinas são as responsáveis pelos diversos pigmentos coloridos
das flores e dos frutos. Exemplos de antocianidinas são a cianidina, a pelargonidina,
a delfinidina e a malvidina. Estão presentes no vinho tinto (350 mg/L), no repolho
roxo (250 mg/Kg), no morango (750 mg/Kg), na cereja (4500 mg/Kg), na romã (250
mg/Kg), uva vermelha (7500 mg/Kg) e no mirtilo (5000 mg/Kg) (MANACK et al.,
2004; TSAO, 2010; LIU, 2013a; ZANOTTI et al., 2015).
Os compostos fenólicos não flavonoides incluem os ácidos fenólicos, os
estilbenos, as lignanas, as cumarinas e os taninos (HAMINIUK et al., 2012). Eles
representam cerca de 1/3 dos polifenóis presentes na dieta. Os ácidos fenólicos
podem ser subdivididos em derivados do ácido hidroxibenzoico e do ácido
hidroxicinâmico, ocorrendo na forma de complexos (HAN; SHEN; LOU, 2007; TSAO,
2010; HAMINIUK et al., 2012; DEL RIO et al., 2013; LIU, 2013a; LIU, 2013b;
SANDOVAL-ACUNÃ; FERREIRA; SPEISKY, 2014).
Os principais derivados do ácido hidroxibenzoico são o ácido gálico, o ácido
elágico e o ácido vanílico. A estrutura básica desses compostos é C6-C1. Estes
ácidos fenólicos podem ligar-se a ligninas, a taninos hidrolisáveis, a proteínas e a
açúcares. O ácido elágico, por exemplo, pode formar elagitaninos que estão
presentes em morangos (800 mg/Kg), amoras (1000 mg/Kg), framboesas (2640
mg/Kg) e romãs (750 mg/Kg) (HAMINIUK et al., 2012; DEL RIO et al., 2013; LIU,
2013a; LIU, 2013b; ZANOTTI et al., 2015).
Os ácidos fenólicos derivados do ácido hidroxicinâmico incluem o p-cumárico,
o ferúlico, o cafeico, a curcumina e o ácido clorogênico. A sua estrutura genérica é
C6-C3. A curcumina é formada pela ligação entre dois ácidos ferúlicos e o ácido
clorogênico é um éster do ácido cafeico. Normalmente encontram-se na forma ligada
com compostos como celulose, lignina, proteínas, mono, di e polissacarídeos. O
ácido ferúlico é encontrado principalmente em sementes e folhas. Já o ácido
clorogênico é presente em maçã (600 mg/Kg), mirtilo (2200 mg/Kg) e café (1750
mg/L) (HAMINIUK et al., 2012; DEL RIO et al., 2013; LIU, 2013a; LIU, 2013b;
ZANOTTI et al., 2015).
Os taninos ocorrem basicamente em forma de polímeros. Estes são
compostos adstringentes e amargos e possuem diversos pesos moleculares.
Também podem ser classificados em taninos hidrolisáveis e taninos condensados. O
ácido tânico é um tanino hidrolisável encontrado em frutos. Os taninos condensados
26
ou proantocianidinas são os responsáveis por precipitarem proteínas como as
encontradas na saliva, provocando a adstringência que alguns frutos como a uva
possuem (HAMINIUK et al., 2012).
Fraga et al. (2010) consideram os taninos como pertencentes ao grupo dos
flavonoides, uma vez que são polímeros ou oligômeros de flavonoides. Os taninos
condensados são oligômeros de flavan-3-óis e os taninos hidrolisáveis são
constituídos por uma parte central normalmente contendo um poliol (glicose,
principalmente) ou um flavonoide como a catequina e um ácido fenólico. Os taninos
hidrolisáveis ainda podem ser classificados de acordo com o tipo de ácido fenólico
como, por exemplo, galotaninos (ácido gálico) ou elagitaninos (ácido elágico).
Os estilbenos possuem uma estrutura básica composta por C6-C2-C6 (dois
anéis aromáticos unidos por uma ligação dupla entre dois carbonos). São
fitoalexinas produzidas pelas plantas em situação de estresse. O principal
representante deste grupo é o resveratrol que ocorre principalmente na forma
glicosilada na casca de uvas tintas (FRAGA et al., 2010; HAMINIUK et al., 2012;
DEL RIO et al., 2013).
A maioria das lignanas são formadas por duas estruturas de fenilpropanoides
ligadas através do C8 das suas cadeias alifáticas. Encontram-se frequentemente
como glicosídeos. A principal fonte de lignanas é a linhaça. Ocorrem em pequenas
quantidades em lentilhas, triticale, trigo, alho, ameixa e peras. As lignanas são
consideradas fitoestrógenos (MANACK et al., 2004; HAMINIUK et al., 2012).
Em função das características químicas dos diferentes metabólitos
secundários presentes nas plantas é essencial que se opte por utilizar, no processo
de extração, solventes adequados ao propósito do estudo. Segundo Vizzotto e
Pereira (2011), o uso de solventes orgânicos polares favorecem a extração de
compostos fenólicos. Neste contexto, este estudo indica o uso de acetona como
sendo o solvente mais eficiente, seguido do metanol e do etanol sem, no entanto, ter
sido observada diferença estatisticamente significativa entre os dois últimos. Metanol
e acetona também são indicados para eficiente extração de antocianinas. Já
solventes de alta polaridade, como a água, ou de baixa polaridade, como o hexano
ou diclorometano não são bons extratores. Em relação ao uso de acetona, apesar
deste ter demonstrado ser o mais eficiente, o mesmo mostra-se bastante
inconveniente em função de ser um produto de compra controlada.
27
3.2.2 Atividade biológica dos compostos fenólicos
Compostos fenólicos são abundantes em frutos, vegetais e derivados. Estes
são constantemente associados à redução no risco das DCNT. Isso se deve, em
parte, à capacidade dos compostos fenólicos em sequestrar radicais livres e metais
pró-oxidantes. Esta ação antioxidante pode ocorrer de diversas formas como
sequestrante (scavenging) direto das espécies reativas de oxigênio, inibição da
oxidação de lipídeos, quelação de metais e ativação das enzimas antioxidantes
(OLIVEIRA; BASTOS, 2011; LI et al., 2014; RODRIGO et al., 2014; SANDOVAL-
ACUNÃ; FERREIRA; SPEISKY, 2014).
Os polifenóis apresentam função direta de sequestrante em virtude da
presença do anel aromático, do número de hidroxilas ligadas a ele e da configuração
destas hidroxilas na molécula. Esta configuração permite a doação de um átomo de
hidrogênio ou um elétron para as espécies reativas, estabilizando-as. Além disso, a
estrutura do anel também permite a estabilização por ressonância. Experimentos in
vitro demonstraram que os flavonóis quercetina e miricetina se mostraram mais
efetivos na função sequestrante. Entretanto, estes mesmos polifenóis podem
exercer atividade pró-oxidante, dependendo da concentração e configuração
(FRAGA et al., 2010; RODRIGO et al., 2014; SANDOVAL-ACUNÃ; FERREIRA;
SPEISKY, 2014).
Os metais como o ferro e o cobre podem potencializar a formação de radicais
livres. Alguns compostos como a miricetina, a quercetina e o ácido gálico são
capazes de se ligar nestes metais, inativando a sua ação. Isto ocorre devido à
afinidade dos metais aos grupos funcionais catecol, hidroxil e carbonil presentes nos
polifenóis. Porém, o complexo formado precisa inativar os metais, caso contrário,
poderá funcionar como um pró-oxidante (FRAGA et al., 2010; SANDOVAL-ACUNÃ;
FERREIRA; SPEISKY, 2014).
A maioria dos compostos fenólicos possui uma parte hidrofóbica e outra
hidrofílica permitindo que interajam com a membrana plasmática. O local de ligação
dos compostos na membrana dependerá da estrutura química e da conformação
tridimensional da molécula. Estas interações podem modificar a estrutura e também
a fluidez da membrana plasmática, alterando a ligação entre o ligante e seu
receptor, o fluxo de íons ou de metabólitos e a transdução de sinal. Por outro lado,
podem exercer ação antioxidante, formando uma barreira para a entrada de radicais
(FRAGA et al., 2010).
28
Evidências sugerem que os polifenóis possam atuar por meio de outros
mecanismos como a modulação da atividade de diferentes enzimas como a
telomerase, a lipoxigenase e a cicloxigenase; interações com receptores e vias de
transdução de sinais; regulação do ciclo celular; entre outras essenciais para a
manutenção da homeostase dos organismos vivos (OLIVEIRA; BASTOS, 2011).
Atualmente, estudam-se outras atividades atribuídas aos fenólicos como a anti-
inflamatória, antiagregação plaquetária, vasodilatadora, anticarcinogênica e
antimicrobiana (SANDOVAL-ACUNÃ; FERREIRA; SPEISKY, 2014).
3.2.3 Biodisponibilidade dos polifenóis
Biodisponibilidade significa a fração da dose administrada de uma substância
que atinge a circulação sistêmica e a velocidade com que este processo ocorre. Em
relação aos alimentos, é definida como a proporção de um nutriente ou substância
do alimento que é digerida, absorvida e metabolizada, podendo ser denominada de
biodisponibilidade relativa (OLIVEIRA; BASTOS, 2011).
Esta biodisponibilidade relativa pode ser influenciada por fatores exógenos e
endógenos. Entre os exógenos, pode-se citar a complexidade da matriz alimentícia e
a forma química do composto de interesse. O tempo de esvaziamento gástrico e do
trânsito intestinal, o metabolismo do composto, interações com proteínas do sangue
e tecidos, a composição da microflora intestinal e o perfil genético do indivíduo
constituem os fatores endógenos que são responsáveis pelas variações intra e inter-
individuais (OLIVEIRA; BASTOS, 2011). Assim, não se deve atentar apenas para a
quantidade de compostos fenólicos presentes nos alimentos, mas sim o quanto
destes é efetivamente biodisponível (D’ARCHIVIO et al, 2010; VELDERRAIN-
RODRÍGUEZ et al., 2014).
O principal local de absorção dos polifenóis é no intestino delgado através dos
enterócitos. A absorção de glicosídeos, por exemplo, pode ocorrer via quebra da
molécula pela enzima lactase-floridizinahidrolase (β-glicosidase) que se encontra na
borda em escova do enterócito, possibilitando que a parte aglicona, lipofílica, possa
ser absorvida por difusão passiva. O outro mecanismo compreende o transporte do
glicosídeo através da membrana pela proteína transportadora de glicose acoplada
ao sódio SGLT1 (transporte ativo). O composto fenólico dentro do enterócito é,
então, hidrolisado pela enzima β-glicosidase citosólica. Os compostos não
29
absorvidos no intestino delgado seguem para o cólon onde serão hidrolisados pela
microflora colônica (MANACH et al., 2004; D’ARCHIVIO et al., 2010; VELDERRAIN-
RODRÍGUEZ et al., 2014; ZANOTTI et al., 2015).
No intestino delgado, podem ocorrer as chamadas reações de fase II do
metabolismo como a metilação pela enzima catecol-O-metiltransferase (COMT), a
sulfatação pelas sulfotransferases (SULT) e a glucoronidação pela UDP-
glucoronosiltransferases (UGTs) (D’ARCHIVIO et al., 2010; MARÍN et al., 2014;
ZANOTTI et al., 2015).
Os compostos fenólicos que foram absorvidos no intestino delgado e no cólon
são transportados para a veia porta por difusão passiva que os envia para o fígado,
onde acontecerão mais reações da fase II do metabolismo. Após, os compostos
entram no sistema circulatório, sendo transportados para os tecidos ou eliminados
na urina. Entretanto, alguns podem ser excretados na bile, voltando para o intestino.
Os metabólitos não absorvidos são, enfim, descartados nas fezes (D’ARCHIVIO et
al., 2010; MARÍN et al., 2014; ZANOTTI et al., 2015).
Percebe-se que os polifenóis apresentam inúmeras modificações em suas
estruturas durante o processo digestivo. Aquele composto inicial, quando chega aos
tecidos, pode ser quimicamente, biologicamente e, inclusive, funcionalmente
diferente daquele inicial (D’ARCHIVIO et al., 2010).
3.3 DIABETES MELITO
A Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD) (2014) define o diabetes como um
grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos, apresentando a hiperglicemia como
principal característica em decorrência de defeitos na ação e/ou secreção da
insulina. Atualmente esta patologia é classificada em quatro classes: diabetes melito
tipo 1 (DM1), diabetes melito tipo 2 (DM2), diabetes melito gestacional e outros tipos
de DM.
O DM1 corresponde de 5 % a 10 % dos casos e ocorre quando há destruição
das células beta do pâncreas e consequente deficiência de insulina. O DM2 é
responsável por pelo menos 90 % a 95 % dos casos e é caracterizada por
alterações na secreção e ação da insulina. O DM gestacional é definida como
qualquer intolerância à glicose, podendo ser de magnitude variável, e que seja
diagnosticada durante a gestação. Também está associado à resistência à insulina e
30
diminuição da função das células beta. Os outros tipos de DM englobam formas
menos comuns da doença, mas que possam ser identificadas. Neste grupo,
encontram-se defeitos genéticos na função das células beta, defeitos genéticos na
ação da insulina, endodrinopatias, induzido por medicamentos ou agentes químicos
e infecções (SBD, 2014).
O DM2, a classe com maior prevalência, ocorre geralmente em pessoas com
mais de 40 anos de idade com sobrepeso ou obesidade. Porém, na atualidade,
casos em jovens são vistos com maior frequência devido aos maus hábitos
alimentares, sedentarismo e estresse da vida urbana. Neste caso, a ação da insulina
é dificultada pela obesidade, sendo uma das causas da hiperglicemia crônica (rápido
e grande aumento nos níveis de glicose sanguínea). Como é uma patologia pouco
sintomática, na maioria das vezes, permanece por muitos anos sem diagnóstico e
sem tratamento, favorecendo a ocorrência de suas complicações em órgãos como o
coração e o cérebro (SBD, 2014). O International Diabetes Federation (IDF) (2013)
estima que o número de indivíduos com diabetes será de 592 milhões de pessoas
em 2035, o que corresponde a um aumento de 55%.
As recomendações para prevenir o DM2 incluem dieta saudável, exercício
físico regular e peso adequado, ou seja, mudanças no estilo de vida. Estas
mudanças são denominadas de “tratamento não farmacológico”, sendo
fundamentais para retardar futuras complicações (BAHADORAN; MIRMIRAN; AZIZI,
2013; XIAO, 2015).
O tratamento não farmacológico é fundamental para o controle da glicemia,
entretanto, se não houver melhora, deve ser associado ao tratamento farmacológico.
Os principais medicamentos e respectivos modos de ação são: (a) acarbose,
inibição da α-amilase e da α-glicosidase com prorrogação na absorção dos
dissacarídeos; (b) biguanidas (ex. metformina), diminuição da produção hepática de
glicose; (c) glitazonas (ex. pioglitazona), aumento na utilização periférica da glicose;
(d) sulfonilureias e glinidas (ex. glibenclamida), aumento na secreção pancreática de
insulina. Atualmente, também, existem os medicamentos com ação parecida ao
GLP-1 (peptídeo semelhante ao glucagon 1) cujo mecanismo está baseado no
aumento da secreção da insulina apenas quando a glicemia está elevada. Estes
medicamentos (ex. exenatida, liraglutida) controlam o aumento inadequado do
glucagon. Há também medicamentos (ex. sitagliptina, vildagliptima) que reduzem a
31
degradação do GLP-1 pela inibição da enzima dipeptidilpeptidase-4 (DPPH-4)
(LEBOVITZ, 1997; BAHADORAN; MIRMIRAN; AZIZI, 2013; SBD, 2014).
Embora em inúmeras situações o tratamento farmacológico seja
indispensável, o uso de medicamentos para o tratamento do DM2 pode provocar
reações adversas como hipoglicemia, ganho de peso, distúrbios gastrointestinais,
problemas cardiovasculares, náusea, anorexia, anemia e dor de cabeça
(ARULSELVAN, et al., 2014; CARPÉNÉ et al., 2015). Assim, a pesquisa de
substâncias com mínimo ou nenhum efeito adverso continua sendo um desafio.
Um grupo de bastante interesse são os polifenóis que se destacaram,
primeiramente, pela sua ação antioxidante. Hoje mecanismos como inibição das
enzimas digestivas, efeito anti-inflamatório, inibição de produtos de glicosilação
avançada, proteção das células betapancreáticas contra glicotoxicidade e melhora
da resistência à insulina também podem ser atribuídos a estes compostos
(DEMBINSKA-KIEC et al., 2008; HABTEMARIAM; VARGHESE, 2014; XIAO;
HÖGGER, 2015).
3.4 ABSORÇÃO DOS CARBOIDRATOS
A absorção no trato gastrintestinal consiste no transporte de macro e
micronutrientes do lúmen intestinal para as células intestinais (enterócitos) e, por
conseguinte, para os vasos sanguíneos. O intestino delgado é a principal região de
absorção devido à presença das microvilosidades que se encontram na superfície
apical do enterócito, aumentando a superfície de absorção da célula e promovendo
maior eficiência na absorção (CASPARY, 1992).
Os carboidratos são os principais constituintes da nossa dieta. Nos alimentos,
são encontrados principalmente na forma de poli (amido) e dissacarídeos (sacarose,
lactose). Porém, só podem ser absorvidos na forma de monossacarídeos (glicose,
frutose, galactose) (CASPARY, 1992; WILLIAMSON, 2013).
A hidrólise dos carboidratos e a absorção da glicose estão diretamente
ligadas ao controle da glicemia pós-prandial. Dentre as enzimas responsáveis pela
hidrólise, estão a α-amilase e a α-glicosidase que possibilitam a absorção da glicose
nos enterócitos através de transportadores específicos. A inibição destas enzimas
poderia retardar a liberação e absorção da glicose no intestino delgado, auxiliando
32
na diminuição da hiperglicemia pós-prandial (HANHINEVA et al., 2010;
WILLIAMSON, 2013).
A α-amilase possui duas isoformas em humanos: uma produzida pelas
glândulas salivares e outra produzida pelo pâncreas. É responsável por hidrolisar
apenas as ligações glicosídicas α-1,4 da amilose e da amilopectina presentes no
amido. As ligações α-1,6 que formam as ramificações da amilopectina não são
hidrolisadas, resultando malto-oligossacarídeos – duas ou mais unidades de glicose
com ligação α-1,4 – e dextrinas – unidades de glicose com ligação α-1,6 mais
algumas unidades ligadas por α-1,4. A maltose, menor estrutura resultante, é
hidrolisada pela maltase/α-glicosidase, liberando duas moléculas de glicose. Esta
enzima também pode ser chamada de maltase-glicoamilase, pois possui dois
centros catalíticos, permitindo a hidrólise de pequenos α-1,4-oligossacarídeos
(WILLIAMSON, 2013).
A sacarase/α-glicosidase hidrolisa o dissacarídeo sacarose. Também pode
ser chamada de sacarase-isomaltase, pois hidrolisa não só as ligações α-1,4, mas
também as ligações α-1,6 de oligossacarídeos como a isomaltose. A sacarase-
isomaltase possui dois centros catalíticos como a maltase-glicoamilase e encontram-
se na região apical dos enterócitos que contém as microvilosidades (WILLIAMSON,
2013).
A etapa seguinte do processo é a absorção destes monossacarídeos
formados, sendo a glicose o principal produto das hidrólises. A glicose não consegue
atravessar a membrana plasmática do enterócito, pois é hidrofílica, necessitando de
transportadores. Os principais transportadores de glicose no intestino delgado são
SGLT1 e GLUT2. O SGLT1, presente na parte apical do enterócito, permite o co-
transporte da glicose com o íon sódio. Dois íons sódio se ligam ao transportador
SGLT1, produzindo uma mudança conformacional que permite a ligação da glicose.
Esta ligação da glicose, por conseguinte, promove nova mudança conformacional,
fazendo com que a glicose e o íon sódio entrem na célula. O transporte de glicose só
é possível quando o sódio está a favor do gradiente de concentração que é mantido
dentro da célula pela Na+/K+ATPase (CASPARY, 1992; HANHINEVA et al., 2010;
WILLIAMSON, 2013).
A glicose também pode ser absorvida através do transporte facilitado mediado
pelo GLUT2. Quando há principalmente elevada concentração de glicose no lúmen,
o GLUT2 é translocado para a região apical do enterócito, realizando o chamado
33
transporte facilitado da glicose (figura 4) (KELLETT; BROT-LAROCHE, 2005;
WILLIAMSON, 2013).
Figura 4 – Regulação da absorção da glicose antes e depois da refeição H – hidrolase (α-glicosidase) Fonte: adaptado de Kellet; Brot-Laroche, 2005.
3.5 DIABETES X COMPOSTOS FENÓLICOS
As enzimas α-amilase e α-glicosidase são fundamentais para a hidrólise e
absorção de carboidratos. Alterações em sua atividade provocarão mudanças no
padrão absortivo. Atualmente, têm-se inúmeros estudos avaliando a relação entre
compostos fenólicos e a inibição destas enzimas principalmente pelo número cada
vez maior de indivíduos portadores de DM. Os flavonoides por estarem presentes
em uma grande variedade de espécies vegetais são os compostos estudados com
maior ênfase (TADERA et al., 2006).
As antocianinas foram relacionadas a propriedades antidiabéticas através de
múltiplos efeitos, incluindo a inibição das enzimas digestivas. O mecanismo
responsável por esta inibição não está completamente elucidado, entretanto é
Antes da refeição Depois da refeição
Enterócito Enterócito Sangue
Membrana basolateral
glicose
glicose
Junções apertadas
Membrana apical
Lúmen ↑ concentração de carboidratos
↑↑glicose
↑↑glicose
maltose
↑glicose
↑glicose
vesículas
Sangue
Membrana basolateral
Membrana apical
Junções apertadas
Lúmen ↓ concentração de carboidratos
↓↓ glicose
vesículas
glicose
Metabolismo
34
provável que ocorra de modo competitivo assim como a acarbose. Cogita-se esta
hipótese pela semelhança entre a estrutura do substrato original das enzimas e a
das antocianinas ligadas a açúcares que, no sítio ativo, não seriam hidrolisadas.
Outra hipótese seria a interação entre os grupos hidroxila das antocianinas com os
grupos polares do sítio ativo, modificando sua estrutura e promovendo uma
mudança na atividade das enzimas (SANCHO; PASTORE, 2012).
Outra classe de flavonoides apresentou resultados positivos em relação à
inibição da α-glicosidase. Experimento in vitro com a flavanona naringenina mostrou
que esta inibiu de forma dose-dependente tanto a α-glicosidase de levedura como a
de ratos, sugerindo que a inibição ocorreu de forma competitiva. Neste mesmo
estudo, realizou-se experimento in vivo com ratos diabéticos, percebendo-se que
com a dose 25mg/Kg foi possível retardar o aumento do nível de glicose sanguínea
após a administração do substrato (PRISCILLA et al., 2014).
Análise de extrato etanólico (75%) de folhas de goiabeira revelou a presença
de quercetina, canferol, guaijaverina, avicularina, miricetina, hiperina e apigenina em
sua constituição. Avaliando-se os efeitos em relação às enzimas digestivas, foi
encontrada inibição do extrato, na concentração de 1,5 mg/mL, de 38,3 ± 4,2% em
relação à sacarase, de 33,4 ± 6,3% em relação à maltase e de 31,7 ± 3,1% frente à
α-amilase. Quando os compostos foram isolados, a inibição demonstrou-se
significativa para miricetina, quercetina e canferol em todas as enzimas.
Observando-se as características destes compostos, percebe-se que um flavonoide
com hidroxila no carbono 3 promove maior inibição que um flavonoide glicosilado e
este maior inibição que um flavonoide sem a hidroxila no carbono 3 (WANG; DU;
SONG, 2010).
É importante destacar que uma efetiva inibição das enzimas digestivas pelos
compostos fenólicos depende de vários fatores como seu local de ação, seu
mecanismo e sua afinidade de ligação. Além disso, o sinergismo ou o antagonismo
entre os diversos polifenóis pode aumentar ou diminuir a inibição (BOATH;
STEWART; MCDOUGALL, 2012).
35
4 MANUSCRITO
Avaliação do potencial inibitório de frutos da família Myrtaceae em enzimas
relacionadas com o diabetes tipo II
Inhibition of diabetes related glucosidases (enzymes) by the methanolic
extract of fruits from Myrtaceae plants that grows in the Atlantic Forest region in
Brazil
Este manuscrito será submetido à revista LWT – Food Science and
Technology.
36
Abstract
A great diversity of plants that produce edible small fruit grows in the Atlantic Forest
region in Brazil. Local populations for their primarily health care use several of these
plants, but so far scientific studies supporting the use of these plants in traditional
medicine remain poor. Therefore the present study was undertaken to evaluate the
fruit of some of these plants (Psidium cattleianum, Syzygium cumini, Campomanesia
xanthocarpa, Eugenia uniflora and Eugenia pyriformis), all from Myrtaceae family, for
their potential as adjuvants in the management of postprandial hyperglycemia. The
evaluation was based on their inhibitory activity on α-glycosidase and α-amylase,
antioxidant activity (ABTS and DPPH methods) and content of phenolic and flavonoid
compounds. The methanolic extracts of P. cattleianum (access 44), S. cumini, E.
pyriformis (accesses 11 and 15) distinctively inhibited α-amylase activity. The
methanolic extracts of P. cattleianum (accesses 44 and 87) also inhibited α-
glycosidase activity, with either maltose or sucrose as substrate. By having
antioxidant activities, a fairly content of phenolic compounds, and capacity to inhibit
carbohydrate digestive enzymes, P. cattleianum (access 44 and 87), S. cumini and
E. pyriformis (accesses 11 and 15) could be good candidates to be used in the
management of postprandial hyperglycemia.
Keywords: phenolic compounds, α-glucosidase, α-amylase, hyperglycemia.
37
Resumo
O bioma Mata Atlântica possui uma grande variedade de espécies vegetais que
produzem pequenos frutos. Muitos destes foram utilizados para o tratamento de
diversas patologias, entretanto, estudos científicos sobre o assunto permanecem
insuficientes. Assim, o presente trabalho foi realizado com o intuito de avaliar se
pequenos frutos da família Myrtaceae (Psidium cattleianum, Syzygium cumini,
Campomanesia xanthocarpa, Eugenia uniflora e Eugenia pyriformis) poderiam
apresentar potencial adjuvante na terapêutica da hiperglicemia pós-prandial. A
metodologia utilizada englobou análises de inibição das enzimas α-amilase e α-
glicosidase, atividade antioxidante (métodos DPPH e ABTS) e conteúdo de
compostos fenólicos e flavonoides totais. Os extratos metanólicos de P. cattleianum
(acesso 44), S. cumini e E. pyriformis (acessos 11 e 15) inibiram significativamente a
atividade da α-amilase. Os extratos de P. cattleianum (acessos 44 e 87) também
inibiram a atividade da α-glicosidase com os substratos maltose e sacarose. Por
apresentarem atividade antioxidante e capacidade de inibição de enzimas do
metabolismo de carboidratos, P. cattleianum (acessos 44 e 87), S. cumini e E.
pyriformis (acessos 11 e 15) poderiam ser bons candidatos ao uso no manejo da
hiperglicemia pós-prandial.
Palavras-chave: compostos fenólicos, α-glicosidase, α-amilase, hiperglicemia.
38
1. Introdução
A hiperglicemia crônica, decorrente de alterações no metabolismo de
carboidratos, é a principal característica do diabetes melito tipo 2 (DM2). Na maioria
das vezes, é pouco sintomática, podendo permanecer por muitos anos sem
diagnóstico e tratamento, favorecendo a ocorrência de complicações (Sociedade
Brasileira de Diabetes, 2014). As recomendações para prevenir a doença ou retardar
suas complicações incluem mudanças no estilo de vida com dieta saudável,
exercício físico regular e peso adequado (Bahadoran, Mirmiran e Azizi, 2013; Xiao,
2015).
Existem diversos medicamentos que são indicados para o tratamento do
DM2, incluindo os inibidores de α-amilase e α-glicosidase como a acarbose
(Bahadoran, Mirmiran e Azizi, 2013; Lordan et al., 2013). O tratamento
farmacológico, indispensável em inúmeras situações, pode provocar reações
adversas como hipoglicemia, ganho de peso, distúrbios gastrintestinais, problemas
cardiovasculares, entre outros (Arulselvan et al., 2014; Carpéné et al., 2015).
A pesquisa de substâncias com mínimo ou nenhum efeito adverso continua
sendo um desafio. Dentro deste enfoque, destaca-se os compostos fenólicos que
estão presentes em espécies vegetais. Estes compostos têm mostrado atividade
inibitória de enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos (Correia et al.,
2012; Podsędek et al., 2014).
As principais enzimas neste processo são a α-amilase pancreática [EC
3.2.1.1] e a α-glicosidase [EC 3.2.1.20]. A primeira é responsável pela hidrólise do
amido em maltose e maltotriose; a segunda, hidrolisa oligossacarídeos e
dissacarídeos, liberando glicose. Assim, inibidores destas enzimas interferem no
influxo da glicose através do trato intestinal para a corrente circulatória, retardando a
39
absorção da mesma e diminuindo a hiperglicemia pós-prandial (Kazeen et al., 2013;
Lordan et al., 2013; Miao et al., 2014).
Uma vez que o consumo de frutos é associado a efeitos benéficos para a
saúde humana, e, lembrando que são fonte de compostos fenólicos, esses poderiam
atuar na prevenção e no tratamento da hiperglicemia e, consequentemente, da DM2.
Evidências mostram que extratos de vários frutos foram capazes de inibir as
enzimas digestivas do metabolismo de carboidratos (Boath et al., 2012; Correia et
al., 2012).
Extratos de morango e framboesa, por exemplo, foram mais eficientes em
inibir a α-amilase e os extratos de mirtilo e de groselha foram mais efetivos na
inibição da α-glicosidase. Este estudo sugere que as antocianinas e os taninos
solúveis estão relacionados à inibição da α-glicosidase e da α-amilase,
respectivamente (McDougall et al., 2005). Outro estudo mostrou que extratos de
groselha e de sorva inibiram a α-glicosidase de forma similar à acarbose. Os
principais compostos encontrados na groselha foram as antocianinas e na sorva foi
o ácido clorogênico (Boath, Stewart e McDougall, 2012). Resíduos de frutos tropicais
inibiram ambas enzimas, sendo que os principais fenólicos encontrados foram
cianidina, quercetina, ácido elágico e proantocianidinas (Correia et al., 2012). Todos
estes estudos foram realizados in vitro.
Existem poucas pesquisas que avaliem o potencial inibitório de frutos
regionais brasileiros na atividade da α-amilase e da α-glicosidase. Entretanto, muitos
destes frutos e outras espécies vegetais são utilizados de forma empírica para tratar
a hiperglicemia. Assim, este trabalho busca caracterizar os frutos Psidium
cattleianum (araçá), Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), Eugenia pyriformis
(uvaia), Eugenia uniflora (pitanga) e Syzygium cumini (jambolão) quanto à atividade
40
antioxidante, composição de compostos fenólicos e flavonoides totais, bem como
avaliar o seu potencial inibitório na atividade das enzimas α-amilase e α-glicosidase.
2. Materiais e Métodos
2.1 Reagentes
Acetona intestinal em pó obtida de ratos (catálogo nº I1630), α-amilase de
Bacillus licheniformis (catálogo nº A3403), sacarose (Bioextra ≥99,5%; catálogo nº
A7903), D-(+)-maltose monoidratada de batata (≥99%; catálogo nº M5885), ácido
ascórbico (catálogo nº A7506), ácido 3,5-dinitrosalicílico (p.a. 99%; catálogo nº
V001025; Vetec), 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH; catálogo nº D9132), 2,2’-azino-
bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) sal diamônio (ABTS; ≥98% HPLC;
catálogo nº A1888), catequina (≥98% HPLC; catálogo nº C1251) ; ácido gálico
monoidratado (ACS reagente, ≥98%; catálogo nº 398225) (Sigma-Aldrich). Demais
reagentes utilizados foram amido solúvel p.a. ACS (Synth), kit comercial para
determinação de glicose (Labtest), Reativo de Folin (Proton Química), acarbose
(Glucobay – Bayer) e demais reagentes (ácido tricloroacético, álcool metílico, álcool
etílico, acetona) todos p.a., adquiridos da Sigma-Aldrich.
2.2 Material vegetal
Os frutos utilizados neste trabalho foram Psidium cattleianum acessos 44 e 87
(vermelhos) e acesso bicudo (amarelo); Campomanesia xanthocarpa; Eugenia
uniflora acesso 156; e Eugenia pyriformis acessos 3, 4, 11 e 15. Estes frutos
pertencem ao banco ativo de germoplasma mantido pela Embrapa Clima
Temperado (Pelotas/RS). O fruto Syzygium cumini também foi utilizado, sendo
oriundo do Campus Capão do Leão da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
41
Foram colhidos 3 Kg de frutos maduros no período de novembro de 2013 até março
de 2014.
Para as análises, utilizou-se apenas a parte normalmente comestível dos
frutos – fruto inteiro C. xanthocarpa e P. cattleianum; a casca e a polpa para S.
cumini, E. uniflora e E. pyriformis. Os frutos foram armazenadas a −20 °C para
análises posteriores.
Todo o trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Pós-colheita de
Frutos e Hortaliças – Metabolismo Secundário – do Departamento de Ciência
Agroindustrial, da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, UFPel.
2.3 Extratos
Os extratos foram preparados segundo método de Alothman, Bhat e Karim
(2009) com algumas modificações. Utilizou-se solvente metanol 80% em proporção
de massa 1:3 (solvente: fruto fresco macerado e congelado). As amostras, então,
permaneceram 3 horas em banho-maria com agitação, a 40 °C. Após a extração,
foram filtradas em funil de Buchner, rotaevaporadas (La Borota 4000 Heidolph,
condensador refrigerado) e armazenadas em freezer −80 °C. Em seguida, foram
liofilizadas (Enterprise 2, Terroni).
2.4 Determinação de compostos fenólicos totais
A determinação de compostos fenólicos dos extratos foi realizada segundo
protocolo adaptado de Swain e Hillis (1959). Cada extrato ou padrão (250 µL) foi
diluído em 4mL de água destilada. Após, foi adicionado o reagente Folin-Ciocalteau
0,25 N (250 µL). Aguardou-se 3 min para a adição do Na2CO3 1 N (500 µL),
mantendo-se as amostras no escuro durante 2 horas. A leitura da absorbância foi
realizada em espectrofotômetro UV/Vis (Spectrophotometer UV/VIS 6705 Jenway)
42
em comprimento de onda de 725 nm. Os resultados foram expressos em mg de
equivalente de ácido gálico/100 g de matéria fresca (mg EAG/100 g mf).
2.5 Determinação de flavonoides totais
Os flavonoides totais foram determinados de acordo com o método de
Zhishen et al. (1999). Foram adicionados 500 µL de extrato ou padrão e 150 µL de
NaNO2 a 2,0 mL de água destilada, aguardando-se 5 minutos. Após, 150 µL de AlCl2
(6.H2O) foram adicionados, aguardando-se 6 minutos. Por fim, acrescentou-se 1,0
mL de NaOH 1 mol/L e 1,2 mL de água destilada. A leitura da absorbância (510 nm)
foi realizada em espectrofotômetro. O resultado foi expresso em mg de equivalente
de catequina/100 g de matéria fresca (mg EC/100 g mf).
2.7 Determinação da atividade antioxidante
A atividade antioxidante dos extratos foi determinada por dois métodos: DPPH
(2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e ABTS (2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfônico). Para o DPPH, o método utilizado foi o de Brand-Williams et al. (1995)
com algumas modificações. Foi adicionado 3,9 mL da solução de DDPH diluída a
100 µL de extrato ou padrão. As amostras foram mantidas no escuro por 24 horas,
realizando-se leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 515 nm. Os
resultados foram expressos em percentual de inibição.
O método ABTS utilizado foi baseado no descrito por Re et al. (1999). Foi
adicionado 3,9 mL de solução diluída de ABTS a 100 µL de extrato ou padrão.
Aguardou-se 6 minutos, realizando leitura em espectrofotômetro em comprimento de
onda de 734 nm. Os resultados também foram expressos em percentual de inibição,
seguindo a fórmula abaixo.
% inibição = Abs controle – Abs amostra / Abs controle x 100
43
2.8. Inibição da enzima α-amilase
A determinação da inibição da atividade da α-amilase foi realizada segundo
método de Yu et al. (2011) com algumas modificações. Primeiramente, 20 µL de α-
amilase de Bacillus licheniformis (40 unidades/mL em água destilada) foram
incubados com 10 µL do extrato em diferentes concentrações (0,1; 0,25; 0,5; 1,0;
2,5; 5,0; 10,0 mg/mL) durante 15 min, em banho-maria a 25 ºC. Em seguida,
adicionou-se solução de amido solúvel 1 % em tampão fosfato pH 6,9 (500 µL),
permanecendo em banho-maria durante 5 min a 37,5 ºC. Após, adicionou-se 500 µL
do reagente DNS (1% de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 12% de tartarato de sódio e
potássio, hidróxido de sódio 0,4 mol/L), sendo incubado em banho-maria (100 ºC)
durante 15 min. O controle positivo utilizado foi a acarbose (3,2 mg/L) (Jockovic et al.
2013). A absorbância foi medida a 540 nm, em temperatura ambiente, no leitor de
microplacas (Spectramax 190 Molecular Devices). Os resultados foram expressos
em percentual de inibição, seguindo a fórmula abaixo.
% inibição = Abs controle – Abs amostra / Abs controle x 100
2.9. Inibição da α-glicosidase
A determinação da inibição da α-glicosidase foi realizada segundo método de
Adisakwattana et al. (2012) com algumas modificações. Inicialmente, 25 mg da
enzima intestinal de rato liofilizada foi homogeneizada com 750 µL de solução de
cloreto de sódio 0,9%. Incubou-se 30 µL de maltose (86 mM) ou 40 µL de sacarose
(400 mM) juntamente com 10 µL do extrato nas concentrações de 1,0; 2,5; 5,0; 10,0
mg/mL e tampão fosfato pH 6,9 até um volume final de 100 µL. Esta reação ficou em
banho-maria a 37 ºC por 30 min (maltose) ou 60 min (sacarose). Após, foi finalizada
com a adição de 20 µL de ácido tricloroacético 10%. O controle positivo utilizado foi
a acarbose (3,2 mg/L) (Jockovic et al. 2013). A concentração de glicose da reação
44
foi determinada pelo método da glicose oxidase por espectrofotometria a 510 nm em
leitor de microplaca (Spectramax 190 Molecular Devices). Os resultados foram
expressos em percentual de inibição, seguindo a fórmula abaixo.
% inibição = Abs controle – Abs amostra / Abs controle x 100
2.10. Análise estatística
Os dados foram analisados e expressos como média ± erro-padrão. O teste
estatístico empregado foi a Análise de Variância (ANOVA) seguida do Teste de
Tukey, com nível de significância de P < 0,05. O programa estatístico utilizado foi o
GraphPad Prism® versão 5.0. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
3. Resultados e Discussão
3.1. Composição fitoquímica e capacidade antioxidante dos extratos
O conteúdo total de compostos fenólicos e de flavonoides, e da capacidade
antioxidante dos frutos analisados estão demonstrados na Tabela 1. O conteúdo de
fenólicos variou de 181,48 a 541,15 mg de EAG/100 g de matéria fresca. Dentre
eles, o S. cumini apresentou o maior conteúdo, seguido da C. xanthocarpa e do P.
cattleianum (todos os acessos). O P. cattleianum acessos 44, 87 e bicudo, e o S.
cumini também apresentaram maior conteúdo de flavonoides. Assim, todos estes
frutos podem ser classificados como pertencentes ao grupo de médio (100 a 500 mg
EAG/100g matéria fresca) e alto (> 500 mg EAG/100g matéria fresca) conteúdo de
compostos fenólicos (Rufino et al., 2010).
Entretanto, os valores encontrados neste estudo foram diferentes daqueles
descritos na literatura. Em estudo com P. cattleianum vermelho e amarelo,
encontrou-se valores que variaram de 632,56 a 581,02 mg EAG/100 g de matéria
fresca e 402,68 a 528,30 mg EAG/100 g de matéria fresca, respectivamente (Medina
45
et al., 2011). Um outro estudo encontrou valores mais baixos para fenólicos em
extrato metanólico (80%) de P. cattleianum amarelo (103,10 mg EAG/100 g de
matéria fresca) (da Silva Azevedo et al., 2014). Para E. pyriformis, esta variação foi
menor em dois estudos. No primeiro, o valor obtido foi em torno de 127 mg EAG/100
g matéria fresca (Rufino et al., 2009) e no segundo o valor foi de 115 mg EAG/100 g
matéria fresca (da Silva et al., 2014).
Estas diferenças podem ser atribuídas a vários fatores como a umidade, o
tipo de solo, o clima durante o desenvolvimento (Pepato et al., 2005; Djeridane et al.,
2013), variação na maturidade (Biegelmeyer et al., 2011), diferenças genéticas e
condições de armazenamento na pós-colheita (Pinto et al., 2010). Além disso, o
método de preparo do extrato (Crozier, Jaganath e Clifford, 2009) e o método usado
para determinar os fenólicos tem grande interferência também.
O método colorimétrico de Folin-Ciocalteu é muito utilizado para determinar o
conteúdo de compostos fenólicos, mas vários compostos não fenólicos (ácido
ascórbico, alguns açúcares e aminoácidos) podem apresentar alto poder redutor o
que poderia prejudicar sua quantificação (Georgé et al., 2005). Os fenólicos também
podem estar na forma livre ou ligada nas espécies vegetais, mas apenas os
compostos livres podem ser extraídos com água ou solventes orgânicos e aquosos
(Su et al., 2014).
P. cattleianum acessos 44, 87 e bicudo, e S. cumini também apresentaram as
maiores atividades antioxidantes verificadas através do percentual de inibição dos
radicais DPPH e ABTS. Importante salientar que o tipo de composto presente e sua
estrutura parece estar mais relacionado com a atividade antioxidante dos frutos do
que a quantidade total destes compostos (da Silva Pinto et al., 2010). Como
observado para os compostos fenólicos, os valores de inibição encontrados na
46
literatura foram variados, uma vez que também são afetados pelos mesmos fatores.
Além disso, os resultados são expressos de diferentes formas, prejudicando as
comparações entre os estudos.
Trabalho com P. cattleianum amarelo e vermelho (extratos de acetona 100%)
encontrou percentual de inibição do radical DPPH que variou de 19,7% a 34,6% e de
35,3% a 45,3%, respectivamente (Medina et al., 2011). Estudo com pitanga obteve
valor de inibição em torno de 35,5% (Celli, Pereira-Neto e Beta, 2011).
3.2. Efeito inibitório na atividade das enzimas α-amilase e α-glicosidase
Os fármacos disponíveis atualmente para o controle da hiperglicemia são
eficientes, entretanto é de grande interesse a busca de alternativas que
desencadeiem menos efeitos colaterais. Assim, neste contexto, extratos de frutos do
RS foram avaliados quanto ao seu potencial inibitório na atividade das enzimas α-
amilase e α-glicosidase que estão diretamente ligadas à absorção da glicose. É
descrito que extratos de origem vegetal ricos em compostos fenólicos totais inibem
ambas enzimas (Manaharan et al., 2012).
Os extratos de P. cattleianum acesso 44, S. cumini e E. pyriformis acessos 11
e 15 inibiram de forma significativa (P < 0,05) a atividade da α-amilase in vitro como
pode ser observado na figura 1. O extrato de P. cattleianum acesso 44 inibiu a
enzima apenas quando utilizado na concentração 2,5 mg/mL (15,25 ± 5,02%).
Quanto ao S. cumini, as inibições foram observadas nas concentrações 0,1 mg/mL
(60,50 ± 1,37%); 0,25 mg/mL (49,46 ± 1,78%); 0,5 mg/mL (48,41 ± 2,25%) e 1,0
mg/mL (13,16 ± 3,28%).
Pôde-se perceber que o extrato de S. cumini na menor concentração (0,1
mg/mL) foi responsável pelo maior percentual de inibição da atividade da α-amilase.
47
Esta mesma tendência foi observada nos demais extratos, ou seja, os maiores
percentuais de inibição ocorreram com as menores concentrações dos extratos.
O S. cumini é tradicionalmente utilizado como hipoglicemiante pela população
(Trojan-Rodrigues et al., 2012). Barcia et al. (2012) encontraram como compostos
fenólicos majoritários do fruto a epicatequina, o ácido gálico, o ácido cafeico, a
cianidina-3-glicosídeo, a pelargonidina, os taninos condensados e os taninos
hidrolisáveis. Os taninos podem inibir a atividade tanto da α-amilase quanto da α-
glicosidase, sendo capaz de se ligar no sítio ativo da enzima ou em algum outro sítio
secundário (de Souza et al., 2012).
Flores et al. (2013) consideram que a concentração de taninos é diretamente
relacionada com a atividade inibitória da α-amilase. Estudo demonstrou que os
taninos solúveis e hidrolisáveis de frutos vermelhos foram capazes de inibir a α-
amilase, pois, ao serem removidos, a inibição cessou (McDougall et al., 2005). Além
disso, há a possibilidade da presença de antocianinas incrementar a inibição
promovida por estes taninos (Grussu, Stewart e McDougall, 2011).
Os acessos 11 e 15 de E. pyriformis também inibiram a enzima nas mesmas
concentrações do S. cumini com exceção da concentração 0,5 mg/mL no acesso 15.
Entretanto, os percentuais de inibição foram menores (25 a 38%) como também
observado no estudo de Grussu, Stewart e McDougall (2011) com framboesas
amarelas. Os principais compostos fenólicos encontrados em E. pyriformis foram o
ácido gálico e seus derivados como HHDP-bis-hexosídeo (elagitanino) (da Silva et
al., 2014).
Estudo verificou o efeito inibitório de seis grupos de flavonoides em relação à
enzima α-amilase pancreática de porco. A miricetina (64%) foi o composto que
proporcionou maior percentual inibitório, seguida da luteolina (61%) e da quercetina
48
(50%). A partir destes resultados, encontrou-se uma relação entre o número de
hidroxilas no anel B e a inibição enzimática: compostos com mais hidroxilas no anel
B inibiram mais a enzima (Tadera et al., 2006).
A inibição da α-amilase também foi atribuída às catequinas. Estas foram
capazes de se ligar às cadeias laterais do sítio ativo, formando um complexo que
impediu a ligação do substrato (inibição não competitiva). A variação na estrutura da
catequina pode afetar seu poder de inibição. Quando se adiciona o grupo galoil, o
composto formado é capaz de exercer uma potente inibição (Miao et al., 2014).
Entretanto, uma elevada inibição da α-amilase não seria muito interessante
em virtude de possíveis efeitos adversos como distensão e desconforto abdominal
em decorrência da presença de amido não digerido no cólon (da Silva Pinto et al.,
2010) com consequente fermentação (Rubilar et al., 2011).
Uma dificuldade encontrada para a discussão dos resultados foi a
variabilidade dos métodos utilizados. O tipo de enzima e o substrato escolhidos
podem interferir nos resultados. Estudo verificou que ao se utilizar amido como
substrato, a epigalocatequina galato e a cianidina inibiram de forma importante a
atividade da α-amilase pancreática. Porém, ao se utilizar um substrato sintético (p-
nitrofenil maltoheptaosídeo), estes dois compostos foram capazes apenas de inibir
fracamente a mesma enzima (Tadera et al., 2006).
Para avaliação da atividade da α-glicosidase, utilizou-se como substratos a
maltose e a sacarose. A escolha dos mesmos foi em virtude da enzima comercial
utilizada no experimento possuir várias α-glicosidases com maior prevalência da
maltase e da sacarase.
Apenas a espécie P. cattleianum acessos 44 e 87 foi capaz de promover
inibição significativa (P < 0,05) da atividade da maltase, sendo que o acesso 44
49
inibiu nas concentrações 2,5 mg/mL (35,43 ± 5,26%); 5,0 mg/mL (61,77 ± 3,39%) e
10,0 mg/mL (55,86 ± 1,61%). Já o acesso 87 inibiu somente nas concentrações 5,0
mg/mL (38,44 ± 6,28%) e 10,0 mg/mL (30,65 ± 11,33%) como pode ser observado
na figura 2. Os acessos 44 e 87 também foram responsáveis pela inibição da
sacarase nas concentrações 5,0 mg/mL e 10,0 mg/mL cujos percentuais foram
37,58 ± 3,75% e 36,70 ± 6,92% (acesso 44) e 18,45 ± 6,23% e 15,83 ± 6,83%
(acesso 87) (Figura 3).
Neste experimento, observou-se que apenas as maiores concentrações dos
extratos foram capazes de inibir tanto a maltase quanto a sacarase, diferentemente
do que foi observado na inibição da α-amilase. Além disso, o P. cattleianum acesso
44 foi capaz de inibir a atividade da maltase em mais de 50%. Estudo com frutos
vermelhos de P. cattleianum determinou seus compostos fenólicos majoritários,
encontrando cianidina-3-glicosídeo, malvidina-3-glicosídeo e cloreto de cianidina
(Nora et al., 2014).
Pesquisadores avaliaram o efeito da fração rica em compostos fenólicos do
extrato de Davidson’s plum, fruta nativa da Austrália, na atividade da α-glicosidase,
sendo encontrada também uma inibição dose-dependente. Elagitaninos foram os
principais compostos encontrados neste fruto, seguido de antocianinas e flavonoides
como miricetina (Sakulnarmrat, Srzednicki e Konczak, 2014). As antocianinas
glicosiladas podem inibir de forma competitiva esta enzima (Flores et al., 2013).
A framboesa (cultivares vermelhas) também foi capaz de inibir a atividade da
α-glicosidase. Os compostos encontrados responsáveis pela inibição foram ácido
elágico, cianidina-diglicosídeo, pelargonidina-3-rutinosídeo e catequina (Zhang et al.,
2010). Em outro estudo, fração rica em antocianinas de framboesa foi capaz de inibir
a α-glicosidase (McDougall et al., 2005). Entretanto, as atividades dos extratos que
50
contêm antocianinas ou antocianidinas podem ser prejudicadas pela liofilização e
reidratação devido à possibilidade de degradação do pigmento (Flores et al., 2013).
Da mesma forma como observado para a enzima α-amilase, enzimas com
diferentes origens apresentaram resultados diferentes. Ao se avaliar a inibição da α-
glicosidase de levedura, a cianidina (99%), a miricetina (94%) e a genisteína (93%)
foram os principais inibidores. Quando se utilizou α-glicosidase de intestino de ratos,
os principais inibidores foram a epigalocatequina galato (32%), a miricetina (29%) e
a quercetina (28%) (Tadera et al., 2006).
Algumas características se mostraram importantes para a inibição como a
hidroxilação nas posições 3, 5 do anel B e 6 do anel A; e a galoilação na posição 3
do anel C. A hidrogenação da dupla ligação e a glicosilação do grupo hidroxila no
anel C, ao contrário, a prejudicaram. Entretanto, glicosídeos de cianidina
apresentaram maior inibição quando comparados com a cianidina. Isto pode ocorrer
em virtude do local de ligação e do tipo de açúcar (Xiao et al., 2013b).
Os extratos de P. cattleianum (acesso bicudo), E. uniflora, E. pyriformis
acessos 3 e 4 não inibiram significativamente as enzimas α-amilase e α-glicosidase
em nosso estudo. Alguns estudos como os de da Silva Pinto et al. (2010), Djeridane
et al. (2013) e Podsędek et al. (2014) relatam que a inibição da atividade das
enzimas α-amilase e α-glicosidase parece não depender do conteúdo total de
compostos fenólicos e sim das características dos compostos individuais presentes
como concentração, estrutura e interação entre eles (Grussu, Stewart e McDougall,
2011; Podsędek et al., 2014). Estas características acabam por contribuir para a
estabilidade, solubilidade e a capacidade de ligação destes compostos com as
enzimas alvo (Podsędek et al., 2014).
51
4. Conclusão
As espécies vegetais avaliadas neste estudo podem ser classificadas como
frutos que possuem de médio a alto conteúdo de compostos fenólicos, apresentando
percentuais elevados de inibição do radical DPPH. Além disso, os extratos
metanólicos de P. cattleianum acessos 44 e 87, S. cumini e E. pyriformis acessos 11
e 15 foram efetivos em inibir a atividade das enzimas α-amilase e/ou α-glicosidase in
vitro.
Várias evidências sugerem que os polifenóis estão envolvidos na prevenção
de doenças crônicas não transmissíveis, incluindo o DM2. Assim, os resultados aqui
descritos estimulam a continuação do estudo através da determinação dos
compostos majoritários e avaliação destes na forma isolada, tanto in vitro como in
vivo, para que se possa determinar os responsáveis pelas atividades relatadas. A
caracterização de substâncias que possam auxiliar no controle da hiperglicemia pós-
prandial é de fundamental importância na prevenção e/ou tratamento do DM2.
Agradecimentos
Ao CNPq pelo suporte financeiro e à Embrapa Clima Temperado pelo
fornecimento dos frutos.
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60
Tabela 1 – Compostos fenólicos totais, flavonoides totais e capacidade antioxidante
de extratos metanólicos (80%) de frutos do Rio Grande do Sul, Brasil.
Frutos Fenólicos
Totais1
Flavonoides
Totais2
Atividade Antioxidante
DPPH3 ABTS4
Pisidium cattleianum acesso 44 435,81b 82,51a 95,62a 66,12a
Psidium cattleianum acesso 87 439,33b 85,37a 93,95a 65,18a
Psidium cattleianum acesso bicudo 445,64b 100,07a 94,51a 71,95a
Campomanesia xanthocarpa 495,86b 52,61b 95,13a 55,32b
Syzygium cumini 541,15a 86,75a 94,53a 64,14a
Eugenia uniflora acesso 156 293,48c 12,65c 67,10c 21,78c
Eugenia pyriformis acesso 3 399,01c 43,67b 87,20b 25,99c
Eugenia pyriformis acesso 4 181,48c 14,35c 40,78d 18,32c
Eugenia pyriformis acesso 11 240,25c 20,50c 47,02d 21,37c
Eugenia pyriformis acesso 15 211,93c 21,84c 41,60d 24,13c
* Médias de tratamento (n = 3) na mesma coluna, seguidas por letras distintas, diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p < 0,05). 1 Compostos fenólicos totais expressos em miligrama de equivalente de ácido gálico por 100 g de matéria fresca (mg EAG/100 g mf). 2 Flavonoides totais expressos em miligrama de equivalente de catequina por 100 g de matéria fresca (mg EC/100 g mf). 3 Expresso em % de inibição do radical DPPH. 4 Expresso em % de inibição do radical ABTS.
61
Figura 1 - Potencial inibitório de frutos do Rio Grande do Sul, Brasil, na atividade da enzima α-amilase. * Indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) (ANOVA seguida do Teste de Tukey) em relação ao controle (0% de inibição). # Indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) entre diferentes
concentrações do mesmo grupo. ** Dados representam a média das triplicatas ± erro padrão.
0 20 40 60 80 100
Control
Acarbose
P. cattleianum access 44
P. cattleianum access 87
P. cattleianum access bicudo
C. xanthocarpa
S. cumini
E. uniflora access 156
E. pyriformis access 3
E. pyriformis access 4
E. pyriformis access 11
E. pyriformis access 15
% de inibição da atividade da -amilase
Acarbose
0,1 mg/mL
0,25 mg/mL
0,5 mg/mL
1,0 mg/mL
2,5 mg/mL
a
a
a
a
a
b
a
a
a
a
a
a
a
a
5,0 mg/mL
10,0 mg/mL
E. pyriformis acesso 15
E. pyriformis acesso 11
E. pyriformis acesso 4
E. pyriformis acesso 3
E. uniflora acesso 156
S. cumini
P. cattleianum acesso bicudo
P. cattleianum acesso 87
P. cattleianum acesso 44
Controle
Acarbose
C. xanthocarpa
*
*
* #
* *
* *
* *
* * *
*
62
Figura 2 – Potencial inibitório de frutos do Rio Grande do Sul, Brasil, na atividade da enzima α-glicosidase com substrato maltose. * Indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) (ANOVA seguida do Teste de Tukey) em relação ao controle (0% de inibição). # Indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) entre
diferentes concentrações do mesmo grupo. ** Dados representam a média das triplicatas ± erro
padrão.
020 40 60 80 10
0
ControlAcarbose
P. cattleianum access 44
P. cattleianum access 87
P. cattleianum access bicudo
C. xanthocarpa
S. cumini
E. uniflora access 156
E. pyriformis access 3
E. pyriformis access 4
E. pyriformis access 11
E. pyriformis access 15
% de inibição da atividade da -glicosidase
1,0 mg/mL
5,0 mg/mL
2,5 mg/mL
10,0 mg/mL
Acarbose
a
aa b
a b
aa
E. pyriformis acesso 11
E. pyriformis acesso 4
E. pyriformis acesso 3
E. pyriformis acesso 15
E. uniflora acesso 156
S. cumini
C. xanthocarpa
P. cattleianum acesso bicudo
P. cattleianum acesso 87
P. cattleianum acesso 44
Acarbose
Controle *
* *
* #
#
* *
63
Figura 3 – Potencial inibitório de frutos do Rio Grande do Sul, Brasil, na atividade da enzima α-glicosidase com substrato sacarose. * Indica diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) (ANOVA seguida do Teste de Tukey) em relação ao controle (0% de inibição). ** Dados representam a média das triplicatas.
0 20 40 60 80 100
ControlAcarbose
P. cattleianum access 44
P. cattleianum access 87
P. cattleianum access bicudo
C. xanthocarpa
S. cumini
E. uniflora access 156
E. pyriformis access 3
E. pyriformis access 4
E. pyriformis access 11
E. pyriformis access 15
aa
a
a
1,0 mg/mL
Acarbose
2,5 mg/mL
5,0 mg/mL
10,0 mg/mL
a
% de inibição da atividade da -glicosidase
E. pyriformis acesso 15
E. pyriformis acesso 11
E. pyriformis acesso 4
E. pyriformis acesso 3
E. uniflora acesso 156
S. cumini
C. xanthocarpa
P. cattleianum acesso bicudo
P. cattleianum acesso 87
P. cattleianum acesso 44
Acarbose
Controle
* *
* *
*
64
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A observada inibição in vitro das enzimas α-amilase e α-glicosidase por ação
de extratos dos frutos araçá vermelho (P. cattleianum), jambolão (S. cumini) e uvaia
(E. pyriformis) evidencia o potencial de utilização dos mesmos no manejo da
hiperglicemia. As características físico-químicas e atividades antioxidantes, a
semelhança da capacidade inibitória sobre glicosidases foram distintas entre os
diferentes frutos analisados, ainda que pertencentes a uma mesma família botânica
(Myrtaceae).
O conjunto de resultados obtidos destaca a possibilidade de utilização destes
frutos como alimentos diferenciados nutricionalmente, especialmente pela elevada
atividade antioxidante e pela capacidade de inibição de enzimas do metabolismo de
carboidratos.
Cabe destacar que a avaliação completa e detalhada dos metabólitos
secundários na forma isolada, bem como a determinação de constantes cinéticas e
do mecanismo de inibição enzimática surgem como perspectivas para a
continuidade deste trabalho.
65
REFERÊNCIAS
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73
APÊNDICES
74
APRESENTAÇÃO
Os resultados aqui elencados na forma de Apêndice referem-se àqueles que
foram executados em cumprimento aos objetivos específicos e necessários para a
obtenção e avaliação dos dados relatados no manuscrito componente desta
dissertação. Neste contexto, os mesmos serão utilizados para elaboração de um
segundo artigo, versando sobre a caracterização dos frutos.
75
Apêndice A
Métodos Analíticos
Cor
A determinação da cor das frutas foi realizada através do método objetivo
definido pela Comission Internacionale de I’Eclairage (CIE). Este método consiste
em expressar a cor, baseando-se no espaço CIE L*a*b*. O L* indica luminosidade e
varia L* = 0 (preto) e L* = 100 (branco). As coordenadas cromáticas variam de +a* =
vermelho a -a* = verde; e de +b* = amarelo a -b* = azul. A análise foi realizada,
utilizando-se o colorímetro da marca Minolta, modelo CR-300. Avaliou-se 10
unidades de cada espécie de fruta (em triplicata) em dois pontos distintos (Apêndice
B).
Tamanho e Peso
O tamanho foi avaliado através da verificação do diâmetro longitudinal e
transversal de 10 unidades de cada espécie frutífera (em triplicata). A análise foi
realizada com o auxílio de um paquímetro digital (King Tools). Estas mesmas frutas
também foram pesadas. Nas análises, utilizou-se a fruta inteira (Apêndice C).
Sólidos Solúveis (SS)
A determinação de sólidos solúveis foi realizada com o auxílio de um
refratômetro digital marca ATAGO, modelo PAL-1. Análise realizada em triplicata. O
resultado foi expresso em ºBrix (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008, p. 583)
(Apêndice C).
Potencial Hidrogeniônico (pH)
O pH foi determinado através de método eletrométrico adaptado, utilizando-se
pHmetro (Hanna Instruments HI 2221 calibration check) (INSTITUTO ADOLFO
LUTZ, 2008, p. 104). Análise também realizada em triplicata (Apêndice C).
Acidez Total Titulável (ATT)
Determinada através da titulação com hidróxido de sódio 0,1 N padronizado
até pH 7,0 (ZAMBIAZI, R. C., 2010, p. 95) (Apêndice C).
76
Extratos
Extratos foram preparados, segundo método de Alothman, Bhat e Karim
(2009) com algumas modificações, com quatro solventes diferentes: metanol 50%
(50:50 v/v, metanol: água) (Apêndice E), metanol 80% (80:20 v/v, metanol: água)
(manuscrito), etanol 80% (80:20 v/v, etanol: água) (Apêndice F) e acetona 80%
(80:20 v/v, acetona: água) (Apêndice G). Adicionou-se os solventes aos frutos
macerados (1:3) em moinho de bola (Marconi MA 350) e congelados. As amostras,
então, permaneceram 3 h em banho-maria com agitação, a 40°C. Após, foram
filtradas em funil de Buchner e rotaevaporadas (La Borota 4000 Heidolph,
condensador refrigerado) e, em seguida, liofilizadas (Enterprise 2, Terroni).
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78
Apêndice B
Tabela 1 - Coloração da casca de frutos da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil
Frutos Coloração
L* a* b* Hue
Araçá 44 40,54b 24,44b 20,54b 41,09b
Araçá 87 36,98c 25,74ª 13,48c 27,64c
Araçá bicudo 71,03a -9,04c 53,69a 99,55a
Guabiroba 56,46 8,86 40,13 77,56
Jambolão 23,13 2,18 0,46 12,34
Pitanga 156 37,19 37,10 21,02 29,85
Uvaia 3 67,67ª 4,98ª 58,60ª 85,10b
Uvaia 4 68,88ª -0,57c 54,77ab 90,60ª
Uvaia 11 65,09ª 1,33b 50,18b 88,49ª
Uvaia 15 66,34ª 3,74ª 56,66ab 86,21b
*Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p < 0,05).
**Valores são médias da triplicata.
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Apêndice C
Tabela 2 - Características físico-químicas de frutos da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil
Frutos Peso (g)
Dimensões (mm) pH
SST (ºBrix)
ATT Relação SST/ATT Equatorial Longitudinal
Araçá 44 7,76b 24,27ª 22,79ª 3,58b 10,78b 1,56ª 9,39ª
Araçá 87 8,99c 22,69b 23,97ª 3,98ª 11,97ª 1,17b 10,27ª
Araçá bicudo 7,35a 24,93ª 23,87ª 3,59b 9,30c 0,99c 6,89b
Guabiroba 4,79 16,38 17,68 3,84 14,52 0,59 24,68
Jambolão 5,27 17,17 26,69 3,61 14,93 0,54 28,38
Pitanga 156 6,07 24,80 17,32 3,38 12,9 1,50 8,59
Uvaia 3 6,79c 25,05c 19,18c 3,23ª 8,37ª 1,50ª 5,56b
Uvaia 4 12,47b 31,66b 25,21b 3,21ab 5,17c 1,14b 4,58b
Uvaia 11 18,46ª 35,82ª 26,68ab 3,35ª 5,80bc 0,70c 8,32ª
Uvaia 15 21,94ª 37,67ª 28,62a 3,09b 6,67b 1,57ª 4,25b
* Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p < 0,05).
** Valores são médias das triplicatas. *** Acidez Total Titulável (ATT) expressa em % de ácido cítrico.
80
Apêndice D
Tabela 3 - Conteúdo de vitamina C em frutos da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil
Frutos Vit. C (mg/100 g)
Psidium cattleianum acesso 44 27,27 ± 0,5
Psidium cattleianum acesso 87 4,92 ± 0,43
Psidium cattleianum acesso bicudo 24,18 ± 0,66
Campomanesia xanthocarpa 1029,93 ± 1,35
Syzygium cumini 43,98 ± 0,73
Eugenia uniflora acesso 156 26,15 ± 2,02
Eugenia pyriformis acesso 4 27,35 ± 0,64
* Valores expressos em média ± desvio-padrão (n = 4) ** Valores expressos em mg de vitamina C/100 g matéria fresca.
81
Apêndice E
Tabela 4 - Conteúdo de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e capacidade antioxidante em extratos metanólicos (50%) de frutos da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil
Frutos Fenólicos
Totais1
Flavonoides
Totais2
Capacidade Antioxidante
DPPH3 ABTS4
Psidium cattleianum acesso 44 439,6c 80,3c 91,3b 43,5b
Psidium cattleianum acesso 87 504,8f 77,5c 93,3b 24,2ª
Psidium cattleianum acesso bicudo 450,6c 79,6c 93,1b 36,5c
Campomanesia xanthocarpa 955,1b 52,6b 93,3b 53,8b
Syzygium cumini 811,4e 90,5c 92,7b 54,7b
Eugenia uniflora acesso 156 268,9a 12,6ª 62,0ª 17,0ª
Eugenia pyriformis acesso 3 376,3c 43,6b 89,4b 27,7c
Eugenia pyriformis acesso 4 166,9d 14,3ª 41,2c 12,3ª
Eugenia pyriformis acesso 11 226,5ª 20,5ª 59,2ª 24,2ª
Eugenia pyriformis acesso 15 201,5a 21,8a 47,2c 18,5a
* Médias de tratamento (n = 3) na mesma coluna, seguidas por letras distintas, diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p < 0,05). 1 Compostos fenólicos totais expressos em miligrama de equivalente de ácido gálico por 100 g de matéria fresca (mg EAG/100 g mf). 2 Flavonoides totais expressos em miligrama de equivalente de catequina por 100 g de matéria fresca (mg EC/100 g mf). 3 Expresso em % de inibição do radical DPPH. 4 Expresso em % de inibição do radical ABTS.
82
Apêndice F
Tabela 5 - Conteúdo de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e capacidade antioxidante em extratos etanólicos (80%) de frutos da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil
Frutos Fenólicos
Totais1
Flavonoides
Totais2
Capacidade Antioxidante
DPPH3 ABTS4
Psidium cattleianum acesso 44 412,4e 84,4b 95,1b 40,7 ± 2,90c
Psidium cattleianum acesso 87 417,2e 89,2d 95,0b 41,6c
Psidium cattleianum acesso bicudo 418,4e 106,6e 95,1b 33,7d
Campomanesia xanthocarpa 2529b 72,5b 95,2b 57,4b
Syzygium cumini 500,4d 94,7d 95,3b 56,5b
Eugenia uniflora acesso 156 274,5a 12,9ª 65,6ª 13,1ª
Eugenia pyriformis acesso 3 350,7ª 48,3c 91,6b 26,9d
Eugenia pyriformis acesso 4 191,8c 16,9ª 41,6c nd5
Eugenia pyriformis acesso 11 257,4ª 24,0ª 57,6ª nd5
Eugenia pyriformis acesso 15 206,1a 20,3a 43,5c nd5
* Médias de tratamento (n = 3) na mesma coluna, seguidas por letras distintas, diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p < 0,05). 1 Compostos fenólicos totais expressos em miligrama de equivalente de ácido gálico por 100 g de matéria fresca (mg EAG/100 g mf). 2 Flavonoides totais expressos em miligrama de equivalente de catequina por 100 g de matéria fresca (mg EC/100 g mf). 3 Expresso em % de inibição do radical DPPH. 4 Expresso em % de inibição do radical ABTS. 5 Não determinado.
83
Apêndice G
Tabela 6 - Conteúdo de compostos fenólicos totais, flavonoides totais e capacidade antioxidante em extratos (acetona 80%) de frutos da família Myrtaceae presentes no Rio Grande do Sul, Brasil
Frutos Fenólicos
Totais1
Flavonoides
Totais2
Capacidade Antioxidante
DPPH3 ABTS4
Psidium cattleianum acesso 44 807,2e 111,1b 94,8b 23,1b
Psidium cattleianum acesso 87 509,8d nd5 94,6b 34,0ª
Psidium cattleianum acesso bicudo 508d nd5 94,8b 26,4b
Campomanesia xanthocarpa 2644b 135,0b 95,4b 38,6ª
Syzygium cumini 529,8d 131,0b 93,7b 61,5c
Eugenia uniflora acesso 156 348,3ª 38,0ª 87,8ª 46,7ª
Eugenia pyriformis acesso 3 514,4d 130,8b 95,2b 27,7b
Eugenia pyriformis acesso 4 336,5ª 69,4c 88,2ª 54,6c
Eugenia pyriformis acesso 11 412,2c 94,5b 92,2b 73,5c
Eugenia pyriformis acesso 15 397,7c 79,9c 94,6b 67,5c
* Médias de tratamento (n = 3) na mesma coluna, seguidas por letras distintas, diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p < 0,05). 1 Compostos fenólicos totais expressos em miligrama de equivalente de ácido gálico por 100 g de matéria fresca (mg EAG/100 g mf). 2 Flavonoides totais expressos em miligrama de equivalente de catequina por 100 g de matéria fresca (mg EC/100 g mf). 3 Expresso em % de inibição do radical DPPH. 4 Expresso em % de inibição do radical ABTS. 5 Não determinado.
