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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS
ENERGÉTICAS E NUCLEARES
ANÁLISE DA RADIOSSENSIBILIDADE DE HEMÓCITOS DE BIOMPHALARIA GLABRATA POR
MEIO DO TESTE DO MICRONÚCLEO
(DISSERTAÇÃO DE MESTRADO)
EDVALDO FLORÊNCIO DE ARAÚJO FILHO
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL
SETEMBRO – 2013
ANÁLISE DA RADIOSSENSIBILIDADE DE HEMÓCITOS DE BIOMPHALARIA GLABRATA POR
MEIO DO TESTE DO MICRONÚCLEO
(DISSERTAÇÃO DE MESTRADO)
EDVALDO FLORÊNCIO DE ARAÚJO FILHO
ANÁLISE DA RADIOSSENSIBILIDADE DE HEMÓCITOS DE BIOMPHALARIA GLABRATA POR
MEIO DO TESTE DO MICRONÚCLEO
(DISSERTAÇÃO DE MESTRADO)
Dissertação de mestrado submetido
ao Programa de Pós-Graduação em
Tecnologias Energéticas e Nucleares,
do Departamento de Energia Nuclear
da Universidade Federal de
Pernambuco, como parte dos
requisitos necessários para a
obtenção do título de Mestre em
Ciências. Área de Concentração:
Dosimetria e Instrumentação Nuclear.
Orientadora: Profª. Drª. Edvane Borges da Silva (CAV/DEN – UFPE)
Co-Orientadora: Profª Drª Ana Maria Mendonça De Albuquerque Melo (DRB – UFPE)
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL
SETEMBRO – 2013
ANÁLISE DA RADIOSSENSIBILIDADE DE HEMÓCITOS DE
BIOMPHALARIA GLABRATA POR MEIO DO TESTE DO
MICRONÚCLEO
Edvaldo Florêncio de Araújo Filho
APROVADA EM: 13.09.2013
ORIENTADORA: Profª. Drª. Edvane Borges da Silva
CO-ORIENTADORA: Profª Drª Ana Maria Mendonça De Albuquerque Melo
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________________________
Profº Dr. Francisco Fernandes Amâncio – DRB/UFPE
__________________________________________________
Profª Dra. Márcia Bezerra da Silva – DRB/UFPE
__________________________________________________
Profº Dr.Otacílio Antunes Santana – DRB/UFPE
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS iii
LISTA DE TABELAS iv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS v
RESUMO vi
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1. Ecotoxicologia 4
2.2. Bioindicadores 5
2.3. Radioatividade 7
2.4. Biomphalaria glabrata 11
2.5. Teste do Micronúcleo 13
3. MATERIAIS E MÉTODOS 16
3.1. Origem, Criação e Manutenção dos Moluscos 16
3.2..Seleção dos Moluscos 17
3.3. Irradiação dos Moluscos 17
3.4. Ensaio do Micronúcleo 19
3.4.1. Coleta da Hemolinfa 19
3.4.2. Preparação das lâminas para Análise do Micronúcleo 19
3.4.3. Coloração Convencional (Giemsa) 20
3.4.4. Contagem dos Micronúcleos 20
3.4.5. Análise Estatística 21
3.4.5.1.Teste Qui Quadrado 21
3.4.5.2.Coeficiente correlação de Pearson 21
4. RESULTADOS
4.1.Efeitos da radiação gama de 60Co sobre Hemócitos de B. glabrata 21
4.2. Análise da Frequência de Micronúcleo 21
5. CONCLUSÃO 30
REFERÊCIAS BIBLIOGRÁFICAS 31
Dedico este trabalho primeiramente a
Deus, pois sem a sua luz, nada seria
possível. E a minha mãe, Deise Araújo,
minha pedra preciosa, meu porto
seguro nesse mar chamado vida. Te
amo incondicionalmente!
AGRADECIMENTOS
À Trindade Santa por me abençoar e dar forças para lutar e vencer todos meus
obstáculos.
Aos meus pais, Deise Vital e Edvaldo Araújo, pela confiança, pelo apoio,
carinho e dedicação, e por me mostrarem verdadeiramente o sentido da
palavra AMOR.
À minha irmã, Maria Cândida, e seu esposo Bruno Marinho por estar sempre
presente na minha vida, acreditando em mim e orando pelo meu sucesso.
À minha avó Aline Vital, todos meus tios e tias, e a Marília, Nayane, Thaís,
Beatriz e demais primos pela admiração, força e amor familiar. Amo todos
vocês!
Ao Departamento de Biofísica e Radiobiologia, em especial o Laboratório de
Radiobiologia.
À minha amiga e primeira orientadora, Prof.ª Dr.ª Ana Mendonça, por sempre
me acolher com seu jeito meigo e feliz, disposta e paciente. Minha eterna
gratidão.
À minha amiga e segunda orientadora, Prof.ª Edvane Borges, por não me
deixar desistir, me dando força e confiança.
Ao Departamento de Energia Nuclear – DEN por gentilmente ceder seus
equipamentos.
À minha amiga e instrutora Luanna Ribeiro pela disponibilidade de passar seus
conhecimentos e de toda ajuda neste trabalho, e aos demais componentes do
Laboratório Williams Siqueira, Felipe Tiago, Mariana Santos, Hianna Fagundes,
Juanna Pessoa, Laila Lacerda e Luis Sá, minha gratidão.
À minha amiga e mestre Claudia Patrícia pelo apoio nas aulas, listas de
exercícios e provas, sem você meu mestrado não seria o mesmo. E aos
demais componentes da minha turma do mestrado.
Aos meus amigos, em especial Isabelle Priscila, Tatiane Dias, Paulo Couto,
Alessandra Carmo, Jessica Santos, Anderson Kleiton e Marcondes Filho, pela
descontração e apoio na minha vida.
Aos meus amigos de Fortaleza que sempre me recebem de braços abertos.
Gilberto Pereira, Graça Queiroz, Mariza Gaklik, Mallika Queiroz, Patricia
Amorim, Rebeca Barros e Adele. Amo vocês!
Aos meus futuros colegas de profissão: Mel, Gabi, Eucaé, Tata, Riva, PM,
Karol, Augusto, Amandinha, Klécia, Dani e demais componentes da turma
odontologia 2011.1, pela companhia e motivação. Vamos à luta!
Ao mestre desconhecido. Aquele que se tornou verdadeiramente um obstáculo
na minha vida me fazendo pensar em desistir, trazendo um sentimento tão ruim
que não sei nem explicar. Meu muito obrigado. Agora sei que tenho um Deus
maravilhoso e que está acima de você e de todos os meus piores problemas.
Com ele, eu venço sempre!
A todos que não citei, mas contribuíram de alguma forma, direta ou
indiretamente, para a conclusão do meu mestrado. Meu muito obrigado!
"Não precisa correr tanto; o que tiver de ser
seu às mãos lhe há de ir."
Machado de Assis
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Classificação taxonômica do molusco B. glabrata. ........................ 11
Figura 2 – Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melânico. Fonte: DBR – UFPE
.......................................................................................................................... 11
Figura 3 – Hemócito de B. glabrata. Microscopia óptica de fluorescência,
aumento de 1000x. Foto cedida por Luanna Ribeiro da Silva.......................... 13
Figura 4 – Micronúcleo em célula de B. glabrata. Microscopia óptica, aumento
1000x. Fonte: LBR - UFPE.................................................................................. 14
Figura 5 – Criadouro dos moluscos Biomphalaria glabrata............................. 16
Figura 6 – A= Recipientes individuais. B= Paquímetro utilizado para medir o
diâmetro da concha. ........................................................................................ 17
Figura 7 – Fonte Gammacell® 220 Excel-MDS Nordion................................. 18
Figura 8 – Tubos Falcon onde os B. glabrata foram irradiados....................... 18
Figura 9– Coleta da hemolinfa......................................................................... 20
Figura 10 – Gráfico da variação do número de celúlas de B. glabrata
irradiados.......................................................................................................... 25
Figura 11 – Hemócito de Biomphalaria glabrata com deformidade após receber
dose de 60 Gy. Aumento de 1000x.................................................................. 26
Figura 12 – Hemócitos morfologicamente alterados. Aumento de 1000x......27
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Testes de toxicidade para avaliação de amostras líquidas. Zagatto
& Bertoletti, 2008................................................................................................ 6
Tabela 2 – Interpretação dos coeficientes de Pearson. Fonte: MORETTIN et
al., 2010............................................................................................................ 22
Tabela 3 – Número total de Hemócitos originários dos moluscos irradiados e
não irradiados .................................................................................................. 23
Tabela 4- Frequência de MN de hemócitos de B. glabrata expostos a radiação
gama de 60Co.....................................................................................................28
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
B. glabrata Biomphalaria glabrata
60Co Cobalto-60
CNEN Comissão Nacional de Energia Nuclear
DBR Departamento de Biofísica e Radiobiologia
DEN Departamento de Energia Nuclear
eV Eletrovolts
Gy Gray
MN Micronúcleo
Nm Nanômetros
RADIOSSENSIBILIDADE DE HEMÓCITOS EM BIOMPHALARIA GLABRATA PELO TESTE DO
MICRONÚCLEO
AUTOR: EDVALDO FLORÊNCIO DE ARAÚJO FILHO
ORIENTADORA: PROFª. DRª. EDVANE BORGES DA SILVA
CO-ORIENTADORA: PROFª DRª ANA MARIA MENDONÇA DE ALBUQUERQUE MELO
RESUMO
Com o crescimento demográfico resulta um aumento da poluição e consequentemente liberação de agentes mutagênicos no meio ambiente. É nessa problemática que a ecotoxicologia, com o uso de bioindicadores, vem contribuindo para a melhoria da qualidade de vida da população. O molusco Biomphalaria glabrata tem recebido destaque como bioindicador ambiental para agentes químicos e físicos por possuir características como: curto ciclo de reprodução, fácil manejo no laboratório e baixo custo de manutenção. O teste do micronúcleo têm se mostrado um ótimo ensaio para identificar os efeitos mutagênicos provocados por tais agentes. Avaliando a frequência de micronúcleos em hemócitos de Biomphalaria glabrata expostos a altas dose de radiação gama de 60Co, esperamos contribuir para uma padronização deste ensaio como indicador de contaminação radioativa em ambientes aquáticos. Moluscos adultos jovens de Biomphalaria glabrata melânicos e sexualmente maduros foram divididos em grupos e submetidos as dose controle (0 Gy), 35, 40, 45, 50, 55 e 60 Gy de radiação gama de 60Co (DEN-UFPE, taxa de dose: 5.255 kGy/h). Após 48 horas da irradiação, a hemolinfa dos moluscos foi coletada e posteriormente analisada quanto ao número de hemócitos e frequência de micronúcleos. A análise estatística foi realizada por meio do
Teste do 2 com α= 5%. Os resultados mostraram que moluscos irradiados com 55 e 60 Gy apresentaram um aumento do número de hemócitos, quando comparado com os demais grupos experimentais. Já os animais expostos as doses de 35, 40, 45 e 50 Gy mostraram uma diminuição da quantidade destas células nas lâminas observadas. Quantitativamente os hemócitos não apresentaram um comportamento dose-dependente e que as diferenças não
são estatisticamente significativas nas doses estudas, para o teste do 2, já na comparação individual de cada dose com o controle houve diferença estatisticamente significativa. Pode-se concluir que a análise de micronúcleos é mais rápida que a de aberrações cromossômicas instáveis, o que sugere sua utilização numa avaliação preliminar em casos de suspeita de exposição à radiação ionizante.
Palavras-Chaves: Bioindicadores, agentes mutagênicos e Radiação gama.
RADIOSENSITIVITY B. GLABRATA HEMOCYTES IN THE TEST MICRONUCLEUS
AUTHOR: EDVALDO FLORÊNCIO DE ARAÚJO FILHO
ADVISER: PROFª. DRª. EDVANE BORGES DA SILVA
CO-ADVISER: PROFª DRª ANA MARIA MENDONÇA DE ALBUQUERQUE
ABSTRACT
The increase of waste from human activities has contributed to increased pollution and environmental degradation. Indiscriminate use of chemical and physical agents has been a constant concern for environmental regulators due to serious damage to ecosystems, especially aquatic. In this context, ecotoxicology, through the use of biomarkers, has contributed significantly to improving the quality of life and to reduce risks to human and environmental health. Aquatic organisms are exposed to a variety of noxious agents, such as physical agents. The mollusk Biomphalaria glabrata is considered a good environmental bioindicator for chemical and physical agents, as it has a short life cycle, reproduction set, besides being easy to collect, maintain and inexpensive laboratory. Besides bodies biomarkers, tests such as micronucleus, has proven applicable in identifying mutagenic effects caused by chemical and physical agents. This research aims to standardize the micronucleus assay in haemocytes of B. glabrata exposed to high doses of gamma radiation of 60Co, aiming to use it as a biomarker of radioactive contamination in aquatic environments. The young adult snails of B. glabrata were divided into groups and subjected to a dose of 0 (control), 35, 40, 45, 50, 55 and 60 Gy of gamma radiation (dose rate 6.691 kGy/h - Model II Excel 220 of the Energy Nuclear Department of UFPE-PE-Brasil). In each slide were counted approximately 1000 cells with intact nuclear and cellular distinction. All analysis was performed using an optical microscope, with a 1000x magnification and a drop of immersion oil on each slide. Statistical analysis of results between groups was
performed by the chi-square test (2), with one degree of freedom and five percent of significance through BioEstat software, version 5.0. The results showed that snails irradiated with 35, 40, 45 and 50 Gy showed a smaller number of haemocytes, whereas those exposed to 55 and 60 Gy had a greater quantity of these cells compared to control group. During the analysis of slides for scoring MN, different cellular changes on irradiated mollusk haemocytes were observed at all doses. These changes were nuclear anomaly, with many vacuoles. This MN are generated lither in response to radiation and can be used as are indicator of the presence of radiation in aquatic environments. In analysis of micronucleus frequency all doses, compared with the control group, showed significant differences. It can be concluded that the analysis of micronuclei is faster than of chromosomal aberrations unstable, which suggests its use in a preliminary assessment of suspected exposure to ionizing radiation.
Keywords: Bioindicators, mutagens and gamma radiation.
1 – INTRODUÇÃO
À medida que a humanidade vai avançando no desenvolvimento
tecnológico, na sua capacidade para intervir na natureza visando satisfazer
suas necessidades e desejos, surgem conflitos quanto ao uso do espaço, dos
recursos naturais causando o aumento da poluição e de agentes mutagênicos.
À partir dessa problemática é que surgiu a ecotoxicologia, com o uso de
bioindicadores, para contribuir sobremaneira na melhoria da qualidade de vida,
fornecendo ferramentas que podem minimizar os riscos para a saúde ambiental
e humana (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008).
Atrelado ao contexto, o Plano Nacional de Energia 2030 (também
chamado de PNE/2030) estabeleceu que o Brasil precisará expandir a oferta
de energia nuclear e a região Nordeste é indicada como prioridade na
construção das novas usinas, mais especificamente as margens do Rio São
Francisco. De acordo com o documento oficial datado de janeiro de 2011, a
cidade pernambucana de Itacuruba, no sertão do São Francisco reúne as
melhores condições porque: conta com solo estável, oferta de água em
abundância e localização nas proximidades das linhas de transmissão da
Chesf (Companhia Hidro Elétrica do São Francisco) a qual fornecerá a água
usada para resfriar os sistemas de geração da usina atômica.
(ELETRONUCLEAR, 2012).
Apesar dos benefícios de sua utilização e de toda a segurança envolvida
na construção de uma usina nuclear, os recentes acidentes no mundo, como o
de 23 de julho de 2008, na França, durante uma operação de manutenção
realizada em um dos reatores da usina nuclear de Tricastin (sul), substâncias
radioativas vazaram, contaminando muito levemente uma centena de
empregados. Em 11 de março de 2011, quando o Nordeste do Japão foi
atingido por um terremoto de nove graus na escala Richter, provocando ondas
gigantes (tsunamis) inviabilizando todo o sistema diesel de emergência
destinado à refrigeração de quatro reatores da Central Fukushima-Daiichi e os
levou ao status de grave acidente nuclear, com perda total dos reatores
envolvidos, devido ao derretimento dos seus núcleos e com liberação de
radioatividade para o meio ambiente após explosões de hidrogênio
(ELETRONUCLEAR, 2012), reforçam a necessidade de aprimoramentos no
estudo das prováveis consequências advindas em caso de um vazamento
radioativo.
Vários estudos têm avaliado organismos que podem ser utilizados como
bioindicadores das ações da radiação ionizante em diversos compartimentos
do ambiente. Portanto, a utilização de estuários fluviais, massa hídrica com
profundidade variante que sofre ação das marés, reforça a necessidade de
estudos sobre bioindicadores aquáticos para que estes possam ser
considerados como sensores específicos na captação energia proveniente de
fontes naturais ou artificiais (MELO, 2006).
Diariamente, os organismos vivos estão expostos à ação das radiações
provenientes de fontes naturais ou artificiais, onde existe uma carência de
sensores específicos na detecção da maioria dessas energias. As radiações
ionizantes são agentes mutagênicos de origem física que podem induzir, além
de mutações gênicas, aberrações cromossômicas e morte celular
(FERNANDES, 2005), o que torna de fundamental importância o estudo de
suas ações em organismos vivos.
Silva (2013) estudou compreender os possíveis danos biológicos que
surgem após exposições dos organismos à determinadas doses de radiação
ionizante. Fernandes (2005) verificou que o teste do micronúcleo mostrou-se
um ótimo meio de identificação dos efeitos de genotóxicos ao DNA pela
radiação gama.
De maneira em geral, os micronúcleos (MN) são estruturalmente
pequenos fragmentos do núcleo principal, representando o material genético
que foi perdido deste, como consequência do dano provocado por algum
agente mutagênico (VILLELA, 2006).
Paralelamente, em diversos trabalhos o molusco Biomphalaria glabrata é
utilizado como bioindicador ambiental dos efeitos causados por agentes
químicos e físicos (NAKANO et al., 2003; MELO, 2006). Este molusco se
destaca pelo seu curto ciclo de reprodução, sua fácil manutenção no
laboratório, alta resistência a mudanças ambientais, baixo custo de
manutenção (ARAÚJO-FILHO, 2010; SILVA, 2013) e por apresentar o
desenvolvimento embrionário completamente estudado (NAKANO et al., 2003),
além de sua ampla distribuição geográfica e interferência sobre a saúde
humana, como a esquistossomose.
Associando-se os fatores acima descritos, o presente trabalho objetiva
contribuir para a padronização do ensaio do micronúcleo na avaliação dos
danos genéticos causados em Biomphalaria glabrata, após a exposição a
radiação gama de 60Co. Os objetivos especificos foram:
• Avaliar a ação biológica das Radiações Ionizantes sobre organismo
aquático dulcícola Biomphalaria glabrata;
• Avaliar a frequência de hemócitos e micronúcleos em hemolinfa de
Biomphalaria glabrata expostos às doses de 35; 40; 45; 50; 55 e 60 Gy de
radiação gama 60Co;
• Utilizar o teste do Micronúcleo em Biomphalaria glabrata como um
bioindicador em situações de exposição acidental a radiação.
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 – Ecotoxicologia
Nas últimas décadas as comunidades científicas têm dado maior
importância aos impactos ambientais sobre a saúde humana e sustentabilidade
dos ecossistemas, com especial atenção aos ambientes aquáticos em virtude
da vital importância da água (BERTI et al., 2009).
A ecotoxicologia é a ciência que estuda os efeitos das substâncias
naturais ou sintéticas de origem física, química ou biológica sobre os
organismos vivos, particularmente sobre populações e comunidades, e sua
interação com o meio ambiente (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008).
O termo Ecotoxicologia foi proposto pela primeira vez em junho de 1969
pelo toxicologista René Truhaut. No Brasil, a primeira atividade em termos
metodológicos nessa área ocorreu em 1975, em um programa internacional de
padronização de testes de toxicidade aguda utilizando peixes tilápia. Este
experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a poluição em um efluente
de uma indústria química na região próxima do Rio Atibaia (SP), que recebia
rejeitos com elevadas concentrações de agentes químicos (ZAGATTO &
BERTOLETTI, 2008).
De acordo com Knie e Lopes (2004), na ecotoxicologia, os testes
aplicados têm por propósito averiguar se as substâncias químicas, isoladas ou
como misturas complexas são nocivas aos sistemas vivos, e como e onde se
manifestam seus efeitos. Estes testes utilizados nas avaliações de risco
possibilitam a detecção de substâncias potencialmente tóxicas bem antes que
efeitos adversos reais possam ocorrer. Como vertente, o conceito de que o
perfil genético de uma população pode ser modificado pela exposição a
agentes ambientais mutagênicos, configurou um novo ramo na ciência
denominada “genética ecotoxicológica” ou “ecogenotoxicologia” (BERTI et al.,
2009).
2.2 – Bioindicadores
Nas últimas décadas, o crescimento mundial demográfico paralelamente
ao avanço tecnológico e a expansão industrial, proporcionaram um aumento da
quantidade de dejetos e de poluentes no meio ambiente. Uma saída na
questão ambiental é o uso de bioindicadores, utilizado há décadas, onde
geralmente existiam misturas de agentes com uma ou mais matrizes
ambientais, como água, sedimentos e organismos que dificultava muito o
trabalho para identificação dos mesmos. (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2008).
Os biomarcadores podem ser usados de forma preditiva, permitindo que sejam
tomadas ações de biorremediação antes que ocorram danos ambientais
irreversíveis com conseqüências ecológicas severas (FREIRE et al., 2008).
O indicador biológico deve, portanto, prover uma análise dos efeitos de
modificantes ambientais, envolvendo a medida de respostas biológicas em uma
escala temporal que evidencie alterações sutis, além de trazer informações
quanto ao seu mecanismo de ação. A observação desses efeitos pode indicar
sinais iniciais de alerta. Nesse aspecto é adequado desenvolver escalas de
respostas biológicas em relação ao tempo, que sejam sensíveis a severidade
da exposição (relação dose–resposta) e que espelhem a suscetibilidade de
dano; principalmente aquele que se reflete no desenvolvimento dos jovens da
população após a exposição aos agentes (CASTRO, 2004). A tabela 1 mostra
alguns organismos e o parâmetro avaliado nos testes toxicológicos.
Tabela 1 – Testes de toxicidade para avaliação de amostras líquidas.
Zagatto & Bertoletti, 2008.
O monitoramento e a avaliação dos riscos de ambientes impactados não
podem ser baseados exclusivamente em análises químicas de amostras
ambientais, pois estas análises não são apropriadas para a indicação e
predição dos efeitos deletérios causados por contaminantes da biota (FREIRE
et al., 2008).
Os bioindicadores aquáticos são importantes, pois absorvem poluentes,
por meio do alimento ou do próprio ambiente por contato direto,
bioconcentrando nos tecidos esses resíduos, tornando-se um organismo-
sentinela capaz de detectar danos ao ambiente (ZAGATTO & BERTOLETTI,
2008). Dentre esses bioindicadores, B. glabrata se destaca por apresentar o
desenvolvimento embrionário completamente estudado (NAKANO et al., 2003).
Apesar desses requisitos, poucos relatos são encontrados na literatura sobre
testes com bioindicadores para detecção da mutagenicidade induzida pela
radiação gama.
De acordo com RABELLO-GAY et al. (1991), os agentes que causam
contaminação podem ser físicos ou químicos. Os de natureza química são
aquelas substâncias, simples ou compostas ou produtos que possam penetrar
no organismo, por meio da pele ou por ingestão. Como exemplo, pode-se citar
drogas e elementos químicos, como mercúrio e chumbo. Dentre os agentes
físicos, por sua vez, destaca-se a radiação, esta forma de energia pode
interagir direta ou indiretamente com os seres vivos.
2.3 – Radioatividade
Radiação é um tipo de energia, emitida por uma fonte que se propaga na
forma de partículas ou ondas eletromagnéticas. De acordo com sua energia e
forma de interação, a radiação pode ser classificada em ionizante, energia
suficiente para arrancar elétrons do átomo, produzindo pares de elétrons, e não
ionizante que pode causar excitação dos átomos, quebrando moléculas e
ligações químicas. (SEGRETO & SEGRETO, 2000; CNEN, 2005; BITELLI,
2006; OKUNO & YOSHIMURA, 2010).
Radiações não ionizantes possuem baixa energia, menor que 10 eV,
com comprimento de onda (λ) maior que 200 nm e estão em nosso entorno. O
calor e ondas de rádio (ondas de radiofreqüência) são formas comuns de
radiações não ionizantes, além dos raios ultravioleta, infravermelho, o laser, luz
visível e as microondas. (OKUNO & YOSHIMURA, 2010)
Com altos níveis de energia, comprimento de onda de alguns picômetros
até comprimentos menores como 10−15/10−18 metros, as radiações ionizantes
naturais são originadas, de maneira em geral, do núcleo de átomos radioativos,
podem alterar o estado físico de outros átomos e causar a perda de elétrons,
tornando-os eletricamente carregados. Este processo chama-se "ionização".
Um átomo pode se tornar ionizado quando a radiação interage com um de seus
elétrons, arrancado-o do mesmo (OKUNO & YOSHIMURA, 2010).
Nuclideos que apresentam número atômico (Z) e número de nêutrons
diferentes são classificados como instáveis, estes tendem buscar a estabilidade
por meio da emissão de radiação particulada: alfa, beta, prótons, nêutrons; e
ondas eletromagnéticas: radiação gama (CARDOSO,1999; CNEN, 2005;
BITELLI, 2006; OKUNO & YOSHIMURA, 2010). Outra forma de radiação
ionizante eletromagnética são os Raios X, descoberto por Röntgen em 1895.
Esta energia possui características semelhantes a radiação gama,
diferenciando-se apenas por ser de origem não nuclear, ou seja, originam-se
de fenômenos da eletrosfera. Os Raios X são produzidos artificialmente,
apresentam comprimento de onda muito curto, cerca de um milhão de vezes
menor do que um milímetro, sendo atualmente utilizado no radiodiagnóstico por
imagem (WERLANG, 2009).
As radiações ionizantes podem interagir diretamente com componentes
celulares como DNA, proteínas e lipídios, provocando alterações estruturais e
por esta razão é chamado de efeito direto. Já o efeito indireto ocorre quando
existe uma interação da radiação com meio, produzindo radicais livres e estes
por sua vez atingem as moléculas alvos. Os radicais livres originários da
radiólise da água são: primários: •OH, •H e e-, e secundário: H2O2. Estes
radicais são eletronicamente instáveis e podem exercer duas funções sobre as
biomoléculas: receptores de elétrons, funcionando como agentes oxidantes, e
doadores de elétrons, funcionando como agentes redutores (BITELLI, 2006).
Segundo Okuno & Yoshimura (2010), os efeitos biológicos da radiação
são comumente classificados em relação a dependência da dose, tempo de
aparecimento e tipos de efeitos.
Segundo a dependência da dose os efeitos podem ser estocásticos e
não estocásticos. Os efeitos estocásticos são absolutamente aleatórios,
probabilísticos podendo surgir com pequenas doses de radiação. O câncer
radioinduzido e as mutações genéticas são exemplos de efeitos estocásticos.
Os efeitos não estocásticos, por sua vez, necessitam de um limiar de dose para
produzi-lo, podem ser representados como efeitos precoces. O eritema é um
exemplo deste efeito (BITELLI, 2006).
De acordo com o tempo de aparecimento os efeitos podem ser
classificados em imediatos ou tardios. Os efeitos imediatos caracterizam-se por
surgirem em minutos ou horas depois da exposição (até 60 dias), já os tardios
podem surgir após 60 dias ou anos depois da exposição, sendo representados
por eritema cutâneo e náuseas (imediato) e câncer radioinduzidos,
radiodermite crônica, mutações genéticas (tardio). Do ponto de vista biológico
os efeitos podem ser somáticos quando afetam o próprio indivíduo irradiado
(eritema) ou efeito hereditário atingindo os descendentes, através das células
germinativas do individuo exposto (mutações genéticas) (BITELLI, 2006).
Para Tauhata et al. (2003), entre os danos celulares, os mais
importantes são os relacionados à molécula do DNA. As lesões podem ser
caracterizadas por quebras simples e duplas da molécula, ligações cruzadas
(entre DNA-DNA, entre DNA-proteínas), alterações nos açucares ou em bases
(substituições ou deleções). Podendo levar à morte reprodutiva da célula ou a
alterações no material genético das células sobreviventes, com consequências
a longo prazo.
Estudos com modelos para avaliar os danos provocados pelo agente
físico, radiação, nos sistemas biológicos, utilizaram bactérias (MORAES et. al.,
1998), culturas de células (COSTA et al., 2002), peixes (CHATY et al., 2004),
conchas de moluscos (FRANTSEVICH et al., 1995), ghost de hemácias
(AMANCIO, 2006) e cultura de linfócitos (FERNANDES, 2005).
A radiação ionizante em caracóis tem sido usada para vários fins
(AZEVEDO et al., 2004). Estudos utilizaram os moluscos B. glabrata para
analisar os efeitos biológicos das radiações. Liard et al. (1968), irradiando
grupos de B. glabrata com uma fonte 60Co, observaram que a capacidade
reprodutora era mantida nas doses de 40 Gy, enquanto nas de 80 Gy havia um
retardo no desenvolvimento embrionário. As doses de 320 e 640 Gy
demonstraram ser letais. Silva (2013) analisou os efeitos biológicos da radiação
gama de 60Co sobre a fecundidade, fertilidade dos moluscos B. glabrata na
ausência de radiação (controle) e doses de 25, 30 e 35 Gy concluindo que
doses de radiação gama na faixa de 25-30 Gy foram letais para a totalidade
dos embriões de B. glabrata.
Os modelos animais ideais para o estudo dos efeitos biológicos das
radiações ionizantes devem possuir como característica um curto ciclo vida,
fácil manutenção em laboratório, resposta rápida e precisa, e boa
reprodutibilidade. O molusco Biomphalaria glabrata (B. glabrata) por reunir
todas estas características vem se tornado alvo de estudo para uma futura
utilização como bioindicador de agentes químicos e físicos no meio ambiente
(MÜNZINGER, 1987; MOTTA et al., 1997; CANTINHA, 2010).
2.4 – Biomphalaria glabrata
Espécie pertence à família Planorbidae, que se distingue dos outros moluscos
de água doce por possuir sangue vermelho. A taxonomia encontra-se descrita
na Figura 1 (NEVES, 2002; REY, 2010; CANTINHA, 2010).
Figura 1 – Classificação taxonômica do molusco B. glabrata. Fonte: (Rey, 2010).
Os moluscos da espécie Biomphalaria glabrata são animais de hábito
aquáticos (dulcícolas) e distribuídos ao longo de mais de treze estados
brasileiros, nas diferentes regiões (BARBOSA, 1995). Segundo Rey (2010),
possui tempo de vida médio de aproximadamente um ano. O tamanho da
concha pode atingir 3 a 4 cm de diâmetro em ambiente natural e 1 a 2,5 cm em
criadouros, se apresentam discóide, enroladas em espiral plana, sem opérculo,
na qual forma-se de cada lado, uma depressão que lembra o umbigo (Figura
2).
Figura 2 – Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melânico. Fonte: LBR - UFPE
Estes caramujos são considerados cosmopolitas e habitam os mais
variados corpos de água doce, tais como lagos, poços, pequenos córregos e
brejos, vivendo de preferência em águas rasas com pouca velocidade. Têm
grande poder de adaptação a variações extremas das condições ambientais,
inclusive sobrevivendo a períodos de seca não prolongada. (COURA, 2005).
Segundo Leal (1976), os Biomphalarias são capazes de estivar por até seis
meses, pois os moluscos jovens resistem melhor à estação da seca,
repovoando o habitat em cinqüenta dias.
Alguns traços, dentre outros que tornam comum um habitat favorável à
colonização desses planorbídeos são a riqueza de microflora e matéria
orgânica, pouca turbidez, boa insolação, pH entre 6.0 e 9.0, baixo teor de NaCl
e temperatura média entre 20 e 25º C (JUBERG et al., 1987; COURA, 2005;
BARNES, 2007; LIMA, 2009).
O sistema circulatório é do tipo vascular-lacunar constituído pelas lacunas
deixadas pelas vísceras e por vasos, com aurícula e ventrículo únicos
formando o coração. A hemoglobina encontra-se dissolvida no plasma
(hemolinfa), onde circulam os amebócitos ou hemócitos (NEVES, 2002; REY,
2010), células ligadas a mecanismos de defesa destes animais (SERRANO et
al., 2002).
O plasma é rico em água, cloreto de sódio, bicarbonatos e hemoglobina
dissolvida, contendo ferro que permite a utilização do oxigênio dissolvido à
baixa tensão (VERRENGIA GUERRERO et al., 1997; NEVES, 2002; REY,
2010). Os hemócitos são as principais células efetoras do sistema de defesa do
caramujo, fagocitando, encapsulando e destruindo agentes infecciosos. Como
o sistema circulatório é aberto, essas células podem se mover livremente para
dentro e fora dos tecidos (SILVA, 2013) (Figura 4). Devido a tais
características, os hemócitos podem representar uma nova ferramenta no
estudo da monitoração ambiental.
Figura 4 – Hemócito de B. glabrata (setas). Microscopia óptica de fluorescência,
aumento de 1000x. Foto cedida por Luanna Ribeiro da Silva.
Os testes de genotoxicidade, como estudo das aberrações
cromossômicas e o teste do micronúcleo vêm se mostrando como boa
alternativa para análise da ação dos agentes físicos e químicos sobre moluscos
dulcícolas, como o Biomphalaria glabrata (MAJONE et. al, 1990; BOLOGNESI
et. al , 1999). Dados preliminares obtidos no laboratório de Radiobiologia do
Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE (DBF-UFPE) indicam que
o teste do micronúcleo é eficiente para o agente físico, radiação.
2.5 – Teste do Micronúcleo
Micronúcleos (MN) são pequenas estruturas resultantes de fragmentos
cromossômicos acêntricos ou cromossomos que se atrasam em relação aos
demais na migração para os pólos da célula na anáfase e não devem
apresentar nenhuma conexão estrutural com o núcleo principal (RABELLO-
GAY et al., 1991). Para Heddle et al. (1991) são pequenos corpos contendo
DNA e localizados no citoplasma que aparecem na telófase e são originados
de quebras isocromatídicas, cromatídicas, ou de disfunções do fuso mitótico.
Possuem características como formato arredondado, cor e textura semelhante
a do núcleo principal e tamanho igual ou menor a 1/3 do núcleo principal.
(Figura 4)
Figura 4 – Micronúcleo em célula de B. glabrata. Microscopia óptica aumento 1000x.
Fonte: DBR - UFPE
O Teste de Micronúcleo foi descrito primeiramente por Schimidt W. em
1975 (FLORES & YAMAGUCHI, 2008) . Trata-se de um ensaio tecnicamente
simples, confiável e sensível, que propicia a detecção de agentes clastogênicos
(que quebram cromossomos) e aneugênicos (que induzem aneuploidia ou
segregação cromossômica anormal). O primeiro teste prático foi desenvolvido
para detecção de danos na estrutura do cromossomo induzidos por agentes
químicos (SCHMIDT, 1975). Rabello-Gay et al. (1991) apud Heddle e Carrono
(1977) mediram o conteúdo de DNA de micronúcleos induzidos por
radiação gama na medula de camundongos. Atualmente se verifica que tais
resultados estão de acordo com o esperado, na hipótese de que os
micronúcleos surgem de fragmentos acêntricos produzidos por quebra ao
acaso do genoma do animal.
A utilização do ensaio do micronúcleo para detectar e quantificar a ação
genotóxica de carcinogênicos e mutagênicos foi bem estabelecida em vários
sistemas, tanto in vitro, com in vivo (RABELLO-GAY et al., 1991 apud Heddle,
1973). Tem sido amplamente utilizado há vários anos com um grande número
de substâncias testadas em diferentes organismos como: peixes (BELPAEME
et al., 1996), anfíbios (JAYLET et. al., 1986; VAN HUMMELEN et. al., 1986) ,
moluscos marinhos (GODOY et al., 2008; CARRILHO et al., 2008; MERSCH et.
al., 1996) e moluscos aquáticos das espécies Dreissena polymorpha e
Planorbarius corneus expostos ao agente Pentaclorofenol (PAVLICA et. al.,
2000).
O aspecto mais importante do Teste do Micronúcleo é que permite
identificar eventual aumento na frequência de mutação em células expostas a
agentes genotóxicos (FLORES & YAMAGUCHI, 2008).
Pelas iniciativas adotadas no Laboratório de Biofísica e Radiobiologia –
UFPE, o Teste do Micronúcleo em hemócitos de B. glabrata pode vir a ser um
excelente ensaio para o desenvolvimento de um novo bioindicador para
agentes físicos e químicos em ambientes aquáticos.
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Origem, criação e manutenção dos moluscos
Para realização dos experimentos foram utilizados moluscos adultos
jovens da espécie Biomphalaria glabrata melânicos (pigmentados), naturais de
São Lourenço da Mata – PE e mantidos no moluscário do laboratório de
Radiobiologia do Departamento de Biofísica e Radiobiologia da UFPE. As
cubas plásticas utilizadas como recipientes de acondicionamento dos
moluscos, medem 25 x 55 x 17 cm, comportando aproximadamente 20 litros
água filtrada e declorada (filtro Bella Fonte ®), pH em torno de 7,0 e
temperatura de 25ºC ± 2ºC (Figura 5). A troca da água foi realizada duas vezes
por semana e a alimentação oconteceu diariamente com alface orgânica fresca
(Lactura sativa).
Figura 5 - Criadouro dos moluscos Biomphalaria glabrata.
3.2- Seleção dos Moluscos
Moluscos Biomphalaria glabrata pigmentados foram separados,
colocados em recipientes individuais de 180 mL (Figura 6A) e observados por
cinco dias consecutivos. Nestes intervalos foram selecionados os caramujos
que apresentaram, juntas, as seguintes características:
I. Idade mínima de dois meses
II. Diâmetro da concha entre 10 e 14 mm; (Figura 6B).
III. Adultos jovens, sexualmente maduros, constatado pela produção das
desovas;
Figura 6 – A= Recipientes individuais. B= Paquímetro utilizado para medir o diâmetro
da concha.
3.3- Irradiação dos Animais
Os moluscos selecionados foram divididos em sete grupos, cada grupo
foi formado com dez exemplares e foram expostos: à ausência de dose
(controle) e as doses de 35; 40; 45; 50; 55 e 60 Gy de radiação gama de 60Co
(Fonte modelo II 220 Excel – MDS Nordion – Figura 7) pertencente ao
Departamento de Energia Nuclear da UFPE.
Figura 7- Fonte Gammacell® 220 Excel-MDS Nordion.
.
Para proceder às irradiações os moluscos foram acondicionados em
tubos de ensaio plástico rosqueados de 50 ml (FALCON) (Figura 8), separados
por finas camadas de gazes úmidas, para evitar a dissecação, e em seguida
colocados na fonte Gammacell®. Após a irradiação, os moluscos foram
acondicionados, separados por grupos, em recipientes contendo 280 ml de
água filtrada e alimentados com alface fresca. Somente após 48 horas os
moluscos foram submetidos ao teste do micronúcleo.
Figura 8 – Tubos Falcon onde os B. glabrata foram irradiados.
3.4 – Ensaio do Micronúcleo
Para a realização deste ensaio foi utilizado a hemolinfa dos moluscos
irradiados e não irradiados.
3.4.1 – Coleta da Hemolinfa
A hemolinfa do molusco B. glabrata foi coletada por meio da
sensibilização da parte dorsal do animal (Figura 9).
1) O molusco, previamente selecionado, foi colocado sobre uma
superfície limpa e coberta com uma camada de papel absorvente;
2) O animal foi posicionado de forma que o orifício de saída do
manto ficasse bem visível ao manuseador;
3) Com o auxílio de uma micropipeta de 50 µL, foi realizado leves
toques no manto do animal, promovendo a contração do corpo, e
consequente liberação hemolinfa. Quando ocorria retração grande
do animal para dentro da concha, parte da mesma era retirada
com o auxílio de uma pinça, facilitando o acesso ao manto do
animal;
4) Foi coletado aproximadamente 100 µL da hemolinfa e colocada
diretamente numa lâmina;
5) Para sua proteção contra predadores, o molusco pode liberar um
material viscoso que pode causar o entupimento da ponteira na
pipeta. Nesses casos, o material era retirado do animal por uma
haste flexível plástica com algodões nas duas extremidades e o
procedimento de coleta da hemolinfa era repetido.
Figura 9– Coleta da hemolinfa
3.4.2 – Preparação das lâminas para Análise do Micronúcleo
Após a coleta da hemolinfa, foi colocado 100 µL da mesma, em cada
lâmina, e quantidade igual de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 10 mM
em solução de Ringer. Após esse procedimento, a lâmina foi colocada por 30
minutos em uma câmara úmida. Passado o tempo de espera, as células foram
fixadas com 200 µL gluteraldeído a 1% em solução de Ringer por 5 minutos,
em seguida enxaguadas com Ringer e coradas com Giemsa (Azur-eosina-azul
de metileno- Merck). Todo processo do ensaio do micronúcleo foi realizado
segundo a metodologia de Pavlica (2000) com algumas adaptações.
3.4.3 – Coloração convencional (Giemsa)
Para corar as lâminas de forma convencional, foi utilizado uma solução
estoque de Giemsa 5% , diluída em tampão fosfato, pH 6.8. As lâminas foram
submersas nesta solução por 7 minutos e em seguida lavadas com água
destilada com posterior secagem em temperatura ambiente.
3.4.4 – Contagem dos micronúcleos
Para cada grupo experimental foi realizado a contagem de 4 lâminas. Em
cada lâmina foram contadas aproximadamente 1000 células intactas com
distinção nuclear e celular segundo os critérios de PAVLICA et al. (2000). Os
micronúcleos foram identificados segundo critérios abaixo:
I. Diâmetro menor que 1/3 do tamanho do núcleo;
II. Cor e textura semelhante ao núcleo;
III. Não está em contato direto com o núcleo;
Toda análise foi feita em microscópio óptico com aumento de 1000x, com
uma gota de óleo de imersão em cada lâmina. A captação da imagem foi
realizada na câmara CCD e registrada no microcomputador.
3.4.5 – Análises estatísticas
3.4.5.1 – Teste Qui Quadrado
A análise estatística dos resultados obtidos entre os grupos foi realizada
pelo Teste do 2, com 1 (um) grau de liberdade e 5% (cinco por cento) de
significância por meio do programa BioEstat, versão 5.0.
3.4.5.2 – Coeficiente correlação de Pearson
O teste estatístico de coeficiente correlação de Pearson indica a força e
a direção do relacionamento linear entre duas variáveis aleatórias. Ele é obtido
dividindo a covariância de duas variáveis pelo produto de seus desvios padrão
(MORETTIN & BUSSAB, 2010), como mostra a equação, abaixo:
O valor de r está sempre entre -1 e +1, com r = 0 correspondendo à
não-associação. Os valores de r positivos correspondem a uma correlação
positiva entre as sequências de dados, e os valores negativos correspondem a
uma correlação negativa. Quanto maior o valor de r (positivo ou negativo), mais
forte a associação. No extremo, se r = 1 ou r = -1, todos os pontos no gráfico
de dispersão caem exatamente numa linha reta (crescente e decrescente,
respectivamente). No outro extremo, se r = 0 não existe nenhuma
associação linear (MORETTIN & BUSSAB, 2010). A Tabela 2 descreve como
interpretar os valores do coeficiente de correlação de Pearson.
Tabela 2 - Interpretação dos coeficientes de Pearson
Fonte: MORETTIN & BUSSAB (2010)
Valor de r Interpretação
0,00 a 0,19 Correlação muito fraca
0,20 a 0,39 Correlação fraca
0,40 a 0,69 Correlação moderada
0,70 a 0,89 Correlação forte
0,90 a 1,00 Correlação muito forte
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
A seguir são apresentados os resultados obtidos nas análises da ação
da radiação gama em hemócitos de hemolinfa de Biomphalaria glabrata
expostos a altas doses de radiação gama de 60Co.
4.1- Efeitos da radiação gama de 60Co sobre hemócitos de B.
glabrata
Na tabela 3 são apresentados os números totais de hemócitos obtidos
em hemolinfa de B. glabrata expostos a radiação gama nas doses de 35, 40,
45, 50, 55,60 Gy e o controle não irradiado.
Tabela 3 – Número total de Hemócitos originários dos moluscos irradiados e não irradiados.
Pelos dados da tabela, observa-se que a radiação produziu uma
diminuição no número de hemócitos, fato este comprovado pelo teste do
Qui-quadrado (p < 0,05), o qual mostrou que existe diferença estatística
significativa entre hemócitos do grupo controle e as doses de 35, 40 e 45 Gy.
Porém, não ocorreu diferença significativa entre o controle e as doses de 50
e 55 Gy, o que indica uma estabilização da reação dos efeitos da radiação
na hemolinfa de B. glabrata, produção de mais hemócitos para buscar
homeostase.
Dose (Gy) Nº de Células
Controle 4190
35 2852
40 3815
45 3653
50 4092
55 4321
60 4491
Pode-se observar a existência de um comportamento de defesa
diferenciado entre as doses analisadas. Cantinha et al. (2010) e Silva (2013)
encontraram semelhantes, quando analisaram embriões e adultos jovens do
Biomphalaria glabrata, respectivamente.
Na Tabela 3 também pode-se observar que a radiação provocou um
aumento mais acentuado no número de hemócitos para as doses de 55 e 60
Gy. No entanto, esta ação só foi estatisticamente comprovada (p < 0,05)
para a dose de 60 Gy. Estes resultados indicam que a dose de 60 Gy é uma
dose crítica para o molusco, pois, apesar de produzir um maior número de
células de defesa (hemócitos) as mesmas não devem conseguir
desempenhar as atividades adequadamente, devido as alterações
morfológicas sofridas após a irradiação, fato comprovado pela análise em
microscópio.
Estes resultados sugerem a existência de um comportamento de
defesa diferente entre os grupos de moluscos irradiados com doses altas de
radiação gama de 60Co, o que já é explicado pelo fenômeno denominado
hormesis, o qual se refere à ação benéfica da radiação sobre organismos
vivos quando expostos a baixas doses de radiação ou outro agente tóxico.
Sendo os hemócitos as células de defesa do B. glabrata, pode-se perceber
que inicialmente a radiação agiu de forma a diminuir o número destas
células, no entanto, na medida em que a dose de radiação aumentou,
cresceu o número de hemócitos (LUCKEY,1982).
CANTINHA et al.(2010) analisou efeitos de altas doses de radiação
sobre a fecundidade B. glabrata e observou que o número de embriões
produzidos por moluscos irradiados com as doses de 40 e 60 Gy foi maior
que o do grupo controle. Porém estes embriões apresentaram uma maior
inviabilidade.
A Figura 9 apresenta um gráfico onde são mostrados os valores
médios de hemócitos com os respectivos desvios padrões, para cada dose
de radiação. Foi realizada uma análise de correlação utilizando o Coeficiente
de Pearson, a qual retornou um valor de coeficiente de 0,18 indicando não
haver correlação entre a dose de radiação e a quantidade de hemócitos
encontrados. Portanto, a quantidade de hemócitos não é dose-dependente.
Figura 10 – Gráfico da variação do número de células de B. glabrata irradiados.
Sabe-se que a exposição de indivíduos a irradiação de corpo inteiro
pode apresentar diferentes efeitos biológicos. Em humanos, o sistema
hematopoiético é um dos mais radiossensíveis, juntamente com as células de
defesa, os linfócitos. Na dosimetria biológica, os linfócitos são os mais
utilizados para verificar os efeitos biológicos sofridos por indivíduos expostos
acidentalmente ou ocupacionalmente a radiação ionizante (FERNANDES,
2005; BRAGA, 2006). Pelos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se
observar nos moluscos um comportamento semelhante, pois as células de
defesa, os hemócitos, apresentam mudanças morfológicas e presença de
micronúcleo quando expostos à radiação ionizante, sugerindo assim a sua
utilização na aferição da dosimetria biológica ambiental.
Trabalhos realizados por MELO (2001) e SILVA (2013) avaliaram a
utilização dos moluscos como biomarcadores de exposição a radiação
ionizante em ambientes aquáticos, porém os resultados abordavam apenas
aspectos morfológicos como alterações na fecundidade, fertilidade e
mortalidade dos moluscos, não sendo possível a identificação de algumas
alterações biológicas por estes testes. Os resultados encontrados, no entanto,
indicaram ser necessário a utilização de uma ferramenta para análise dos
efeitos biológicos sofridos pela molécula do DNA após a exposição à radiação.
Neste contexto, o teste do micronúcleo mostrou-se ideal por ser mais sensível
e eficaz na detecção das alterações não perceptíveis morfologicamente.
No presente trabalho, durante a análise das lâminas para contagem dos
MN, foram observadas diferentes alterações celulares nos hemócitos dos
moluscos irradiados, em todas as doses, sendo a dose de 60 Gy a que
apresentou maior número de células morfologicamente alteradas. Dentre as
modificações, algumas em forma de vacúolos sugerindo apoptose celular
(Figura 10-A) e presença de pontes nucleoplasmáticas (Figura 10-B), dados
semelhantes foram observados por Silva (2013).
Figura 11-A – Vacúolos em hemócito de Biomphalaria glabrata com
deformidade após receber dose de 60 Gy. B- Ponte nucleoplasmática. Aumento de
1000x.
Outras alterações celulares foram exclusivamente observadas durante a
análise microscópica dos hemócitos, originárias dos moluscos expostos a dose
de 60 Gy. Para esta dose, observou-se que os hemócitos apresentaram
fragilidade celular além de prolongamentos filamentosos da membrana celular
(Figura 11), não encontrou-se na literatura relatos desta forma de ocorrência.
Figura 12 - Hemócitos morfologicamente alterados. Aumento de 1000x.
4.2 – Análise da Frequência de Micronúcleo
Na Tabela 4, são apresentados os números de micronúcleo encontrados
em hemolinfa de B. glabrata para cada dose de radiação utilizada. Observa-se
um aumento expressivo da frequência de micronúcleo dos animais expostos
em todas as doses de radiação gama estudas em relação ao controle.
Tabela 4- Frequência de MN de hemócitos de B. glabrata expostos a radiação gama de 60Co.
Comparando a frequência de micronúcleo detectada nos grupos
experimentais pode-se observar a existência de uma relação dose-
dependente, comprovada pelo teste estatístico de Correlação de Pearson, o
qual mostrou haver uma forte correlação ( = 0,85), significativa ao nível de
5%. Também foi constatado diferenças estatisticamente significante entre as
doses de exposição e o grupo controle, por meio do teste do χ2.
A detecção de micronúcleo é uma técnica utilizada para verificar
danos citogenéticos provocados por agentes clastogênicos e aneugênicos
principalmente em vertebrados (CÓLUS, 2002). Trabalhos têm sido
realizados com moluscos marinhos (Mytilus galloprovincialis) com o objetivo
de analisar a contaminação ambiental nestes habitats. Nesse trabalho ficou
demonstrado que o ensaio do micronúcleo foi capaz de detectar alterações
no DNA dos moluscos expostos a diferentes agentes químicos, assim como
VUKMIROVIC (1994) em seus trabalhos. Santos et al. (2010) empregou o
teste de micronúcleo comprovando que doses elevadas extratos de
quercetina causam danos ao DNA in vivo. Vieira et al. (2010) evidenciou que
o mesmo teste foi utilizado com sucesso no seu estudo para detectar efeitos
citotóxicos. Já Amaral (2005) mostrou que os resultados utilizando MN são
Dose (Gy) Frequência Mn Nº de Mn
0 0,0004773269 2
35 0,0031556802 9
40 0,0026212319 10
45 0,0060224473 22
50 0,0043988269 18
55 0,0043971303 19
60 0,0046677039 21
mais sensíveis e mais rápidos do que a verificação de aberrações
cromossômicas, como anéis e dicêntricos, por exemplo.
5. CONCLUSÃO
Os dados obtidos com a irradiação dos moluscos Biomphalaria glabrata
adultos com doses de 35, 40, 45, 50, 55 e 60 Gy de radiação gama de 60Co,
permitiu concluir que:
Moluscos adultos de B. glabrata se mostraram sensíveis aos efeitos
da radiação gama de 60Co;
Uma redução do número de hemócitos foi observada nos animais
submetidos às doses de 35, 40 e 45 Gy. Enquanto cresceu a
quantidade dessas estruturas nas doses de 55 e 60 Gy;
A análise das lâminas para contagem dos micronúcleos mostrou
diferentes alterações nucleares e citoplasmáticas nos hemócitos dos
moluscos irradiados, em todas as doses;
A dose de 60 Gy foi a que apresentou maior número de células
morfologicamente alteradas, com fragilidade celular além de
prolongamentos filamentosos da membrana celular, vacuolização e
presença de pontes nucleoplasmáticas;
Comparando, estatisticamente, a frequência de micronúcleo
detectada nos grupos experimentais pode-se observar a existência
de uma relação dose-dependente.
Com os resultados obtidos, sugere-se que o teste do micronúcleo
funciona como bioindicador de danos causados pela radiação ou presença de
radiação, contudo não pode ser utilizado como teste biodosimétrico pela baixa
especificidade demonstrada.
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMANCIO, F. F. ; CASTELLUCI, E. E. ; MELO, A. M. M. A. ; NAKANO, E. ;
BRAGANCA, C. A. ; KAWANO, T. . Dominant Lethal Effects of 2,4 D in
Biomphalaria glabrata. Mutation Research. Genetic Toxicology and
Environmental Mutagenesis, 2006.
AMARAL, A. Brazilian Archives of Biology and Technology. Physical and
Biological Dosimetry for Risk Perception in Radioprotection. V.48, Special:
pp. 229-234, 2005.
ARAÚJO-FILHO, E. F. Teste do Micronúcleo em Biomphalaria Glabrata para
detecção da Mutagenicidade Induzida pela Radiação Gama de 60Co.
Monografia – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Biomedicina:
Recife, 2010.
AZEVEDO, C. M.; BORGES, C. C.; ANDRADE, Z. A. Comportamento das
lesões histopatológicas induzidas pelo Schistosoma mansoni em Biomphalaria
glabrata após radiação ionizante. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical 37(3):218-221, mai-jun, 2004.
BARBOSA, FS., org. Tópicos em malacologia médica [online]. Rio de Janeiro:
FIOCRUZ, 314 p. ISBN 85-85676-13-2. Available from SciELO Books
<http://books.scielo.org>.1995.
BARNES, R. S. K.; CALOW, P.; OLIVE, J. W.. Gastrópodes. In: Os
invertebrados: uma nova síntese. São Paulo: Atheneu, 7ª edição. 2007.
BELPAEME, K.; DELBEKE, K.; ZHU, L.; KIRCHVOLDERS, M. Cytoge-netic
studies of brown trout _Salmo trutta fario. using the micronucleus test and the
alkaline comet assay. Mutagenesis 11 _5. 485–492,1996.
BERTI, A. P.; GRASSI, L. E. A.; SILVA, E. M.; SILVEIRA, M. J. A importância
da genética ecotoxicológica . SaBios: Rev. Saúde e Biol., vol. 4, n.1, p. 52-55,
jan./jun. 2009.
BITELLI, T. Física e dosimetria das radiações. 2ª ed. São Paulo: Atheneu,
442 p., 2006.
BOLOGNESI, C.; LANDINI, E; ROGGIERI, P.; FABBRI, R.; VIARENGO, A.
Genotoxicity biomarkers in the assement of heavy metal effects in mussels:
experimental studies; Environmental and Molecular Mutagenesis, 33:287-
292,1999.
BRAGA, L. R. P. Aplicação de citogenética na avaliação da radioproteção de
traumatologistas do Recife. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal
de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e
Nucleares (Proten), 2006.
CANTINHA, R.S. ; BORRELY, S.I. ; NAKANO, E. ; AMARAL, A. ; SILVA, L.R.S.
; MELO, A.M.M.A. . Effects of high dose rate gamma radiation on survival and
reproduction of Biomphalaria glabrata. International Journal of Low
Radiation, v. 7, p. 245, 2010.
CARDOSO, E. M. Radioatividade. Apostila educativa. Comissão Nacional de
Energia Nuclear, 2009. Disponível em: <
http://www.cnen.gov.br/ensino/apostilas/radio.pdf >. Acesso em 23 agost. 2013.
CARRILHO. J; LEITÃO. A; VICENTE. C; MALHEIRO. I. Cytogenetics of
Anodonta cygnea (Mollusca: Bivalvia) as possible indicator of environmental
adversity; Estuarine, Coastal and Shelf Science 80, 303–306, 2008.
CASTRO, V. L. S. S.. Aspectos da Exposição Ambiental aos Agroquímicos no
Desenvolvimento Animal. Cadernos de Ciência & Tecnologia, v. 21, n. 3, p.
469-497. Brasília, 2004.
CHATY, S.; RODIUS, F.; VASSEUR, P. A comparative study of the expression
of CYP1A and CYP4 genes in aquatic invertebrate (fresh mussel, Unio tumidus)
and vertebrate (Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology,
London, v. 69, n° 1, p. 81-94. July 2004.
CÓLUS, I. M. S., MARTINEZ, C. B. R.; Biomarcadores em peixes
neotropicais para o monitoramento da poluição aquática na bacia do rio
Tibagi. In: MEDRI, M. E. et al.Editores. Londrina, PR : M. E. Medri, p. 551-577,
2002.
COMISSÃO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR (CNEN). Diretrizes básicas
de proteção radiológica (CNEN-NN-3.01). Rio de Janeiro: CNEN, 2005. 26 p.
Disponível em: <www.cnen.gov.br/seguranca/normas/pdf/Nrm301.pdf>. Acesso
em 03 Jun. 2013.
COSTA, R. F. B.; FAGUNDES, D. J. Modelos Experimentais de Hiperplasia
Intimal: Efeitos Da Radiação Ionizante. Acta Cir. Bras. vol.17, nº.3. São
Paulo: May 2002.
COURA, J R. Dinâmica das Doenças Parasitárias. Rio de janeiro: Gunabara
Koogan,2V. 2005..
ELETROBRAS ELETRONUCLEAR (ELETRONUCLEAR). Disponível em:
www.eletronuclear.gov.br/, acessado em 22 de jul. 2013.
FERNANDES, T, S.; Emprego das aberrações cromossômicas instáveis e
micronúcleos no biomonitoramento individual: estudo comparativo.
Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco, Programa
de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares (Proten), 2005.
FLORES, M.; YAMAGUCHI, M. U. Teste do Micronúcleo: Uma triagem para
avaliação genotóxica. Revista Saúde e Pesquisa, v. 1, n. 3, p. 337-340,
set./dez. 2008.
FRANTSEVICH, L.I.; PAN`KOV, I.V.; ERMAKOV, A. A.; KORNYUSHIN, A. V. ;
ZAKHARCHUK, T. N. Molluscs indicator of environmental pollution by
radionuclides. Russ j ecol, 26 (1): 47-52, 1995.
FREIRE, M. M.; SANTOS, V. G.; GINUINO, I. S. F.; ARIAS, A. R. L.
Biomarcadores na avaliação da saúde ambiental dos ecossistemas aquáticos
Oecol. Bras., 12 (3): 347-354, 2008.
GODOY, J..M.; OLIVEIRA, M. S., ALMEIDA, C. E. B. , CARVALHO, Z. L. ,
SILVA, E. R. , FERNANDES F. C, PITANGA F. L. , DANELON O. M.; 210Po
concentration in Perna perna mussels: looking for radiation effects; Journal of
Environmental Radioactivity; 99 631-640, 2008.
HEDDLE, J.A., CIMINO, M.C., HAYASHI, M., ROMAGNA, F., SHELBY, M.D.,
TUCKER, J.D., VANPARYS, PH., MACGREGOR, P.T; Micronuclei as an index
of cytogenetic damage: past, present, and future. Environmental and
Molecular Mutagenesis, 277–291, 1991.
JAYLET, A.; DEPARIS, P.; FERRIER, V.; GRINFELD, S.; SIBOULET, R.; A
new micronucleus test using peripheral blood erythrocytes of the newt
Pleurodeles waltl to detect mutagen in freshwater pollution. Mutat. Res. Vol.
164 245–257,1986.
JURBERG, P.; SCHALL, V. T.; BARBOSA, J. V.; GATTI, M. J.; SOARES, M.
S.; Behavior of Biomphalaria glabrata the intermediate host snail of
Schistosoma mansoni, at different depeths in water in laboratory conditions.
Men. Ins. Osvaldo Cruz, 82 (2): 197- 208, 1987.
KNIE, J. L. W.; LOPES, E. W. B. Testes Toxicológicos: Métodos, técnicas e
aplicações. Florianópolis: FATMA/GTZ, 289 p., 2004.
LEAL, M. A. M. Marcação Radioisotópica do caramujo vetor da
esquistossomose e sua utilização em estudos da dinâmica de populações.
Tese de Mestrado. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Instituto de
Biofísica, 1976.
LIARD, F.; CHIRIBOCA, J.; PELLEGRINO, J.; COLÓN, J. & SILVA, R. M..
Effects of radiaton on the reproductive potencial do Biomphalaria glabrata. Rev
Bras Pesqui Biol, 1(3-4): 157-67, 1968.
LIMA, S. A. Avaliação da toxicidade do extrato de folhas Anacardium
occidentale sobre embriões de Biomphalaria glabrata e larvas de Branchipus
stagnalis. Monografia – Universidade Federal de Pernambuco. CCB.
Biomedicina: Recife, 2009.
LUCKEY, T.D. Hormesis with ionizing radiation. Journal Name: Nucl. Sci. Eng.;
(United States); Journal Volume: 3. 1982..
MAJONE, F.; BRUNETTI, R.; FIMAGALLI, O.; GABRIELE, M.; LEVIS, H. G.
Induction of micronuclei by mitomycin C and colchicine in the marine mussel
Mytilus galloprovinciali; Mutat. Res. 244: 14, 1990.
MELO, A. M. M. A. ; ESTEVAM, E. C. ; AMANCIO, F. F. ; KAWANO, T. ;
NAKANO, E. ; PEREIRA, C. A. B. . DOMINANT LETHAL EFFECTS OF 2,4D IN
Biomphalaria glabrata. Mutation Research, 2006.
MERSCH, J.; BEAUVAIS, M.-N.; NAGEL, P. Induction of micronuclei in
haemocytes and gill cells of zebra mussels, Dreissena polymorpha, exposed to
clastogens. Mutat. Res. Vol. 371 _47–55, 1996.
MORAES, I. R.; GELLI, D. S.; JAKABI, M.; MASTRO, N. L. D. Study about the
sensibility in vitro of different strains of Vibrio cholerae 01 exposed to 60 Co
gamma radiation. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. vol.35 n.6 São Paulo, 1998.
MORETTIN, P. A., BUSSAB, W.O. Estatística Básica 6. Ed. Ed. Saraiva, 2010.
MOTTA, M. A. & MELO, A. M. M. A. Fecundity changes induced by low-doses
of gamma radiation on Biomphalaria straminea (Dunker, 1948). Mem Inst
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 92, n° 4 , p. 559-561. Jul./Aug. 1997.
MÜNZINGER, A.. Biomphalaria glabrata, a sultable organism for a biotest.
Environ Tecnol Lettr, 8: 141-148, 1987;
NAKANO, E.; WATANABE, L. C.; OHLWEILER, F. P.; PEREIRA, C. A. B.;
KAWANO, T. Establishment of the dominant lethal test in the freshwater
mollusk Biomphalaria glabrata (SAY, 1818). Mutation Research, London, v.
536, n° 1-2, p. 145 154. Apr. 2003.
NEVES, D. P. et al. Parasitologia Humana. 10 ed. São Paulo : Editora Atheneu,
2002.
NUNES, E. S. ; SOUZA, M.A.A. ; VAZ, A. F.M. ; COELHO, L.C.B.B. ; AGUIAR,
J.S. ; T. G. SILVA ; GUARNIERI, M.C. ; MELO, A. M. M. A. ; OLIVIA, M. L. V. ;
CORREIA, M.T.S. . Inactivation and fragmentation of lectin from Bothrops
leucurus snake venom by gamma irradiation. Radiation Physics and
Chemistry (1993), v. 81, p. 484-487, 2012.
OKUNO, E.; YOSHIMURA, E. M. Física das radiações. São Paulo : Oficina de
Textos, 2010.
PAVLICA, M., KLOBUCAR, G. I. V. M, VETMA, N., ERBEN, R., PAPES, D.,
Detection of micronuclei in haemocytes of zebra mussel and great ramshorn
snail exposed to pentachlorophenol. Mutation Research, 465 (2000) 145 –
150.
RABELLO-GAY, M. N.; RODRIGUES, M. A. L. R.; MONTELEONE-NETO, R..
Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese: Métodos e critérios de avaliação.
Sociedade Brasileira de Genética/ Revista Brasileira de Genética. Ribeirão
Preto, 246 p., 1991.
REY, Luis. Bases da parasitologia médica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2010.
SANTOS, F. V.; CALVO, T. R.; CÓLUS, I M. S.; VILEGAS, W.; VARANDA, E.
A. Mutagenicity of two species of the genus Alchornea measured by Salmonella
microsome assay and micronucleus test. Brazilian Journal of
Pharmacognosy. 20(3): 382-389, Jun./Jul. 2010.
SEGRETO, H. R. C.; SEGRETO, R. A.; Revisäo e atualizaçäo em
radiobiologia: aspectos celulares, moleculares e clínicos / Radiobiology review
and update: cellular, molecular and clinical aspects. Folha médica v. 119, n. 4:
p. 9-27, out.-dez. 2000.
SERRANO, D. R.; ZANOTTI-MAGALHÃES, E. M.; MAGALHÃES, L. A.;
CARVALHO, J. F.. The influence of hydrocortisone on cellular defence
mechanisms of Biomphalaria glabrata. Men. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de
Janeiro, vol.97, n.6, p.881-885, 2002.
SILVA, L. R. S. ; BORGES, E. ; AMARAL, A. ; AMANCIO, F. F. ; MELO, A. M.
M. A. . Avaliação da radiossensibilidade de hemócitos de Biomphalaria glabrata
expostos à radiação gama. Scientia Plena, v. 9, p. 1-6, 2013.
SCHMIDT, W., The micronucleus test. Mutation Research. Vol. 3 _9–15, 1975.
TAUHATA, L.; SALATI, I. P. A.; PRINZIO, R. D.; PRINZIO, A. R. D.. Radiações
nucleares: usos e cuidados. Rio de Janeiro: CNEN, 2003.
VAN HUMMELEN, P.; ZOLL, C.; PAULUSSEN, J.; KIRSCH-VOLDERS, M.;
JAYLET, A.; The micronucleus test in Xenopus: a new and simple in vivo
technique for detection of mutagens in fresh water, Mutagenesis. Vol.4 _12–
16,1989.
VERRENGIA GUERRERO, N. R.; MOZZARELLI, M. N.; GIANCARLO, H.;
NAHABEDIAN, D.; WIDER, E.. Biomphalaria glabrata: Relevance of albino
organisms as useful tool for environmental lead monitoring. Bulletin of
Environmental Contamination and toxicology. New York, v. 59, n° 5, p. 822-
827. Nov. 1997.
VIEIRA, P. M. A; SANTOS, S. C. B.; CHEN-CHEN, L. A. Assessment of
mutagenicity and cytotoxicity of Solanum paniculatum L. extracts using in vivo
micronucleus test in mice. Braz. J. Biol., vol. 70, no. 3, p. 601-606. 2010.
VILLELA, I. V.; Avaliação do potencial genotóxico de amostras ambientais da
região hidrográfica da bacia do lago Guaíba. Tese de Doutorado,
Universidade federal do Rio Grande do Sul, Centro Biotecnologia do Estado do
Rio Grande do Sul. 2006.
VUKMIROVIC, M.; BIHARI, N.; ZAHN, R. K.; MULLER, W. E. G.; BATEL, R.
DNA damage in marine mussel Mytilus galloprovincialis as a biomarker of
environmental contamination. Marine Ecology Progress Series 109. P. 165 -
171, 1994.
WERLANG, H.Z.; BERGOLI, P.M.; MADALOSSO, B. H. Manual do residente
de radiologia.2ª. edição. Rio de Janeiro. Ed. Guanabara Koogan., p.321, 2009.
ZAGATTO, P. A.; BERTOLETTI, E.. Ecotoxicologia Aquática: Princípios e
Aplicações. Editora Rima. São Paulo, 2008.
