Radiobiologia e Fotobiologia Capitulo Vii

8/6/2019 Radiobiologia e Fotobiologia Capitulo Vii

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CAPTULO VII

MECANISMOS CELULARES DE REPARAO

A PRESERVAO DA INFORMAO GENTICA

O papel biolgico desempenhado pelas molculas de DNA exige que elas possuam duas propriedadesfundamentais: autorreplicao e preservao da informao gentica.

Para que o contedo informacional do DNA seja preservado e corretamente transmitido, de gerao emgerao, indispensvel que haja fidelidade na replicao semiconservativa e que existam mecanismos capazesde reparar modificaes estruturais produzidas no material gentico por agentes fsicos ou qumicos do meioambiente.

Erros na replicao semiconservativa podem ocorrer espontaneamente, mas, ao final da replicao, sobastante raros (1 em 109-1011 bases incorporadas) dada a existncia de mecanismos capazes de imped-los oucorrig-los. Durante a formao das novas cadeias polinucleotdicas, alm das diferenas de afinidade das basesnitrogenadas [formao preferencial de pares entre adenina e timina (A:T) ou entre citosina e guanina (C:G)](Figura VII-1), a atuao seletiva da DNA polimerase e sua capacidade exonucleoltica (editorial) que,

agindo no sentido 35, elimina nucleotdeos incorretamente inseridos, evita grande parte dos erros deemparelhamento. Em E. coli, a DNA polimerase III (Pol III), responsvel pela replicao semiconservativa uma enzima constituda de 10 protenas (subunidades) diferentes e cada clula contm de 10 a 20 molculas,que polimerizam de 500 a 1.000 nucleotdeos por segundo. Esta polimerase erra 1 em 104-105 basesincorporadas. A atividade de reviso editorial (exonuclease 3'5') encontra-se na subunidade epsilon (),codificada pelo gene dnaQ (mutD) (Figura VII-2) e aps sua ao (Figura VII-3) o nmero de bases erradaspassa para cerca de 1 em 107 bases incorporadas.

(a) Emparelhamento correto

(b) Emparelhamento incorreto1 em 104 bases

Figura VII-1 Emparelhamento correto e incorreto das bases nitrogenadas do DNA


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VII 2

Figura VII-2 - Estruturas da DNA polimerase durante a polimerizao e da editoraoP = Polimerizao; E = Editorao (exonucleoltica)

E = subunidade = Exo 3 5 ( mutD = dnaQ)

POLIMERIZAO EDITORAO

Adaptado de:

Fita molde

DNA neossintetizado

Figura VII-3 - Correo de erros de emparelhamento pela subunidade da DNA polimerase

Incorporao deG no lugar de A

A subunidade excisa Gatravs da atividade3 5 exonuclease

A sntese prosseguecom a incorporao

correta de A

Em clulas humanas a polimerizao mais lenta (em torno de 50 nucleotdeos por segundo) e o

complexo de replicao composto pelas DNA polimerases alfa (Pol), delta (Pol) e psilon (Pol),sendo que a atividade de reviso editorial encontra-se nas duas ltimas. Os erros das DNA polimeraseshumanas so semelhantes aos de E. coli e, considerando o tamanho do genoma humano (cerca de 3x109pares de nucleotdeos), um erro em 107 pode gerar milhares de erros de emparelhamento durante aduplicao do DNA.

Alm dos erros normais das polimerases outros ocorrem por incorporao de nucleotdeos lesados [8-oxo-GTP (GO) pode parear com adenina] ou por nucleotdeos normais em oposio a bases lesadas [timinapode parear com O6-metilguanina (O6MeG)]. Em sequncias repetitivas ocorre deslizamento das polimerases e

aparecimento de delees e inseres.Finalmente as clulas bacterianas assim como as eucariticas possuem polimerases especializadas nas

quais a fidelidade de replicao baixa e, portanto, cometem muitos erros. As representantes destaspolimerases emE. coli so as DNA polimerases II, IV e V e em eucariotos esto includas as polimerases da


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VII 3

famlia X [polimerases beta () e lambda ()] e as da famlia Y [polimerases eta (), iota () e kappa ()]. Estaspolimerases no tm a funo editorial e erram muito (1 em 104 para as da famlia X e 1 em 10 para as da Y).

Correo de erros de emparelhamento em longos fragmentos (Mismatch Repair MMR)

Aps a replicao, os erros que escaparam da edio das DNA polimerases necessitan ser corrigidospor meio de enzimas capazes de remover bases nitrogenadas incorretamente incorporadas cadeia ou dedegradar segmentos nos quais tenham ocorrido erros, ou ainda, eliminar bases alteradas ou lesadas; para tal, indispensvel a distino entre as hlices neossintetizadas e as preexistentes, o que depende dos diferentesgraus de metilao existentes entre elas.

Em E. coli, na hlice neossintetizada a adenina das milhares de sequncias 5GATC3 no estmetilada. Na hlice parental a adenina est metilada na posio N6 (N6MeA) pela DNA-adenina metilase (32kDa), produto do gene dam. Quando persistem erros de emparelhamento, aps a replicao, algumas enzimasentram em ao; as protenas MutS e MutL reconhecem os erros de emparelhamento e a protena MutH corta oDNA no sitio 5 de G de uma das sequncias 5GATC3 no metiladas adjacentes. Posteriormente a DNAhelicase II, produto do gene uvrD (mutU, recL, uvrE), em conjunto com protenas que se ligam hlice simples(SSB) abrem o fragmento e as exonucleases digerem o DNA. A PolIII sintetiza de novo, conforme mostrado naFigura VII-4.

Figura VII-4 Correo de erros de emparelhamento em grandes fragmentos (MMR)

E. coli

Embora a eficincia do reparo de alguns erros dependa da sequncia, em E. coli o nico erro para o

qual a correo muito difcil o par C:C, e o par mais facilmente corrigido o G:T. Alm dos erros de

emparelhamento o sistema tambm repara delees ou inseres de at quatro nucleotdeos, originadas pelodeslizamento da DNA polimerase, normalmente em sequncias repetitivas.A reparao iniciada pela ligao do homodmero de MutS (95 kDa) ao erro, seguida da ligao de

MutL (68 kDa), tambm na forma de homodmero, dependente da hidrlise de ATP. A ligao deste complexo,principalmente MutL, leva ativao de uma endonuclease GATC latente, associada protena MutH (25kDa), a qual incisa a ligao 5 da guanina na sequncia GATC no metilada.

O stio GATC pode dirigir a correo de um erro distante de at 1 kb, mas o sinal muito reduzidoquando a distncia ultrapassa 2 kb.

A combinao MutSLH parece sentir a presena do erro e da no-metilao, acreditando-se que paraisto se forme uma estrutura alfa (), que talvez seja a ativadora de MutH.

A reao estritamente exonucleoltica, iniciando-se no corte em GATC e prosseguindo atravs do erro

at cerca de 100 bases aps. A funo exonucleoltica bidirecional; no sentido 53 feita pelaexonuclease RecJ ou pela exonuclease VII (produto do genexseA) e no sentido 35 feita pela exonucleaseI (produto do gene sbcB), pela exonuclease VII ou pela exonuclease X.

Como essas exonucleases s agem em hlice simples necessrio que a helicase II (produto do geneuvrD), seja utilizada para desenrolar o DNA e permitir a entrada das exonucleases.


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VII 4

A ltima etapa o preenchimento da lacuna, especificamente pela PolIII, uma vez que outraspolimerases no so capazes de substitu-la, sugerindo uma ligao entre o sistema de reparao e o dereplicao do DNA. A DNA ligase termina o reparo, unindo o DNA neossintetizado ao preexistente.

Cepas bacterianas contendo mutaes no gene dam que produzam a enzima em quantidades maioresque o normal ou no a produzam so hipermutveis, uma vez que, neste caso, a diferenciao entre as hlicespela protena MutH dificultada.

A correo depende da modificao da adenina na sequncia GATC. O DNA sem modificao reparado, mas no especifica a hlice o que pode acarretar mutagnese ou quebras duplas pela ao de MutH. ODNA modificado nas duas hlices no reparado pelo MMR.

A inciso por MutH ocorre a 3 ou 5 do erro e a quebra simples serve de sinal para dirigir a excisoposterior. Assim, uma quebra previamente existente, no necessariamente no GATC, pode contribuir para oprocesso, independente de MutH e GATC, j que o complexo MutSL suficiente para ativar a exciso.

MutSL ativam a ao da DNA helicase II na quebra e h preferncia da exciso na direo do erro,coordenada tambm por MutSL. A poro da hlice incisada destacada pela helicase e hidrolisada pelasexonucleases.

O complexo da DNA polimerase III, que funciona como um carreador coloca o -clamp na hlice.O -clamp funciona como um fator de processividade da DNA polimerase III, mas tambm interage fisicamentecom MutS. O mesmo ocorre com o homlogo eucariotico do -clamp, o PCNA (Proliferating Cell Nuclear

Antigen) e o fator de replicao C (RFC- homlogo do comprexo ), que tm importantes papis na regulaoda exciso no MMR humano.

A inativao do MMR eleva a mutagnese espontnea entre 50 e 1000 vezes alm de permitir arecombinao ilegitima entre sequncias quase homlogas.

Os mutantes deficientes em Dam tambm so hipersensveis morte pelo agente alquilanteN-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). Entretanto, os mutantes duplos dam mutL e dam mutS no so maissensveis que a cepa selvagem, o que implica MutS e MutL no aumento de morte associada deficincia demetilao. Por outro lado, a mutagnese semelhante nas cepas selvagens e nos mutantes dam e dam mutL,mostrando a separao entre efeitos letais e mutagnicos. Estas observaes conduziram sugesto de que asleses O6MeG produzidas por MNNG podem provocar a resposta do reparo por erros de emparelhamento,devido formao dos pares O6MeG:T e O6MeG:C.

Como o sistema s repara erros na hlice filha, ele no repara a base metilada na hlice me (leso), jque, neste caso, seria um reparo abortivo que poderia resultar em letalidade, devido sntese intil do DNA.

Em clulas humanas, diversos genes codificam para protenas semelhantes MutS e MutL e asua no funcionalidade est relacionada ao aparecimento de alguns cnceres espordicos e apraticamente 100% dos cnceres de clon hereditrios HNPCC (Hereditary Non Polyposis ColorectalCancer) (Figuras VII-5 e VII-6).

Cncer de Clon

DEFICINCIA EM MMR

HNPCC SINDROME DE LYNCH

Figura VII-5 - Exemplo da cncer de clon


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VII 5

HNPCC

Figura VII-6 Exemplos de cncer de clon

Aparentemente, em clulas humanas a correo de erros de emparelhamento funciona demaneira semelhante ao descrito para E. coli. Em extratos de clulas humanas j foi verificado que acorreo realizada de maneira similar e, aparentemente, tambm ocorre a exciso bidirecional.

Os principais alvos do MMR humano so erros de emparelhamento, tais como: G:T, G:G, A:C eC:C, entretanto, as protenas do MMR tambm se ligam a leses, tais como: O 6MeG, ligada a C ou T,ligaes cruzadas GpG de cisplatina, fotoprodutos da radiao UVC, etc.

Em clulas humanas foram identificados genes que participam na correo dos erros deemparelhamento:MSH2 (MSH = MutS Homolog), MSH3 eMSH6que codificam protenas homlogas MutS bacteriana eMLH1(MLH = MutL Homolog),MLH3, ePMS2 (PMS=Post-Meiotic Segregation), queespecificam diferentes homlogos da MutL bacteriana

As protenas MSH2 e MSH6 [GTBP (G:T Binding Protein) ou p160] formam um heterodmeroque ativo na correo de erros de emparelhamento e foi designado MutS. MSH2 tambm formacomplexo com MSH3 gerando MutS. Dependendo do par, os heterodmeros reconhecem diferentessubstratos. MutS reconhece erros de emparelhamento de bases e pequenas delees/inseres enquantoMutS somente reconhece delees/inseres preferencialmente grandes e, para uma ligao eficiente deMutS ao erro h necessidade de fosforilao.

A protena MLH1 tambm forma heterodmeros com PMS2, PMS1 e MLH3 para formarMutL, MutL e MutL. Enquanto MutL contribui com MutS/ para o MMR, MutL pareceparticipar no reparo de inseres/delees e processos associados com a recombinao meitica. Afuno de MutL ainda no est esclarecida (Figura VII-7).

Em clulas humanas o reconhecimento dos erros depende de MutS e MutL e a especificidadeda correo similar de bactrias. Aparentemente PCNA, conduzido por RFC, liga-se a MutS eMutS e conduz o complexo para o erro. Quando o erro encontrado PCNA libera-se do complexo.Algumas evidncias indicam que MutS direcionada forquilha de replicao para se ligar a PCNAlocalizada no DNA replicado e ento transferida de PCNA para o DNA aps encontrar o erro. O sistemacorrige tanto troca de bases como pequenas delees e inseres de at quatro nucleotdeos. A reao dependente de ATP e acompanhada por sntese de reparo partindo da inciso e atravessando o erro(Figura VII-8).

Uma simples inciso em at 1 kb de distncia do erro pode dirigir o reparo, entretanto, aeficincia vai diminuindo com a distncia entre 100 e 1000 bases e independe do corte em 3ou em 5.

Assim como emE. coli, a exciso parece ser bidirecional e as lacunas geradas comeam na inciso

e vo at 90 a 170 nucleotdeos aps o erro. Como a exciso igual para erros de emparelhamento ouinsero de 2 nucleotdeos acredita-se que o mecanismo seja o mesmo.A sinalizao para distinguir a hlice filha no est clara em mamferos. Verificou-se que no

metilao em sequncias especficas como em E. coli. O sinal parece ser a permanncia de protenasassociadas hlice me durante a replicao ou a presena de quebras simples na hlice filha que


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VII 6

ocorrem durante a replicao ou ainda o PCNA que ao parar na forquilha funcionaria como um sinal dehlice.

Figura VII-7 MMR em humanos

ERRO

hMUTS ENCONTRA O ERRO

ENCONTRA A POLIMERASEE PRA A SNTESE

EXO I DEGRADA O DNA

POLIMERIZAO

Figura VII-8 Esquema da correo de erros de emparelhamento (MMR) em humanos A exonuclease I humana , possivelmente, a responsvel pela digesto (5 3) da fita contendo o

erro. No se conhece a exonuclease responsvel pela digesto da fita na direo 3 5, embora hajasugestes de que as funes editoriais das Pol e Pol seriam as responsveis por esta digesto. Almdisto, nenhuma helicase foi ainda detectada para este sistema em clulas humanas. Aparentemente aEXO1 a nica diretamente implicada no MMR, sendo tambm a nica que interage com MutS eMutL de eucariotos.

A quantidade de DNA degradado pelo complexo MutS-EXO1 controlada pela protena dereplicao A (RPA), que se liga e protege o DNA em hlica simples que gerado pela exonuclease. Istoacarreta a hidrlise de aproximadamente 250 nucleotdeos por vez, o que resulta em muitos ciclos dedegradao at que no haja mais erros presentes.

Recentemente foi detectado que MutL possui uma atividade exonuclease latente localizada nasubunidade PMS2 e que ativada por MutS, PCNA e RFC dependendo de ATP. Esta atividadeintroduz quebras simples na hlice descontnua, independente de onde se encontre a descontinuidade.


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VII 7

Portanto, MutL consegue gerar pontos para a hidrlise 5 3, mesmo que a descontinuidade esteja a3 do erro.

Aps a exciso nucleoltica do erro a sntese de reparao feita pela DNA polimerase juntocom PCNA. A etapa final a ligao pela DNA ligase I.

O tratamento de clulas com agentes alquilantes tais como MNNG conduz translocao deMSH2 e MSH6 para o ncleo, conduzindo ao aumento da atividade de ligao de MutS aos erros de

emparelhamento, entretanto, ainda no se mostrou inequivocamente a induo do MMR, tanto embactrias como em eucariotos.A primeira evidncia da existncia deste mecanismo em clulas humanas veio de estudos com

uma cultura celular hipermutvel, que era deficiente na correo dos erros. Esta cultura foi isolada invitro pela sua capacidade de sobreviver em presena de leses no DNA, pela exposio a agentesalquilantes, que normalmente matariam as clulas. A partir destes experimentos a seleo, in vitro, pararesistncia a MNNG ou metil nitroso uria (MNU) conduziu identificao de diversas linhagenscelulares de mamferos tolerantes a metilao.

Tanto em bactrias como em clulas humanas a resistncia adquirida contra o efeito letal deagentes metilantes, a qual no pode ser atribuda ao aumento do reparo das leses, definida comotolerncia a metilao.

A linhagem melhor caracterizada a MT1 (MT = Methylation Tolerance), derivada de clulas

humanas linfoblastides TK6, aps uma nica etapa de seleo para resistncia a MNNG. Estalinhagem, embora seja centenas de vezes mais resistente a MNNG que a parental, em alguns casos maissensvel mutagnese do MNNG. Portanto MT1 tolera adutos citotxicos.

Clulas MT1 tambm exibem um defeito de pontos de checagem (PC) do ciclo celular apstratamento com MNNG e so hipermutveis em ausncia de MNNG. A mutagnese espontnea elevada 60 vezes nas clulas MT1, sendo em sua maior parte do tipo transverses, transies A G einseres ou delees de um nucleotdeo.

Baseado nos fentipos de MT1 e de bactrias deficientes no reparo de erros de emparelhamentofoi sugerido que os defeitos de reparo podem conferir tolerncia a agentes alquilantes em clulas demamferos, assim como ocorre em bactrias.

Clulas MT1 so deficientes em atividade MutS e tm mutaes em ambos os alelos do gene que

codifica a subunidade MSH6. MT1 exibe um defeito de checagem no estgio G2 do ciclo celular.Observaes similares foram feitas em clulas de camundongos com o geneMSH2 nocauteado.

Correo de erros de emparelhamento em pequenos fragmentos (VSP = Very Short Patch)

Outras sequncias metiladas existem no DNA, tais como a (CC(A/T)GG), metilada pela DNA-citosinametilase (Dcm), na segunda citosina, na posio C5. Esta metilao emE. coli protege o DNA contra enzimasde restrio enquanto em clulas de mamferos ela suprime a transcrio, acarretando o bloqueio de algunsgenes. Em condies de baixa de 5-metil citosina (C5MeC) h um aumento da formao de tumores, sugerindoa localizao destas sequncias possivelmente em promotores de oncogenes.

A desaminao da C5MeC acarreta a formao do par T:G. O sistema VSP corrige eficientemente T noserros T:G que ocorrem naquelas sequncias. Os stios de reconhecimento de Dcm so pontos hipermutveis

devido desaminao espontnea da C5MeC do par G: C5MeC, um evento que conduz ao par T:G.O sistema VSP utiliza dois genes de reparao de erros de emparelhamento, mutS e mutL mas no os

genes mutH e uvrD. Adicionalmente, so necessrios os produtos dos genes vsr e polA. O gene vsr estlocalizado antes do dcm e fazendo parte da mesma unidade transcricional.

Em heteroduplexes nas quais as sequncias GATC esto metiladas, representando DNA replicado, osistema VSP entra em ao (Figura VII-9). quando o DNA est em replicao e a hlice filha no estmetilada, age o sistema MutSLH.

O produto do gene vsr uma protena de 18 kDa constituindo uma endonuclease de correo de erroshlice-especfica. Ela reconhece o par T:G no contexto CT(A/T)GG e NT(A/T)GG e faz incises do lado 5datimina produzindo terminais 5PO4 e 3OH. Aparentemente a PolI (que requerida para o VSP) remove atimina com sua atividade exonucleoltica 53 e faz a sntese de reparo de pequenos fragmentos (entre 10 e

20 nucleotdeos) como sua caracterstica.MutS e MutL provavelmente agem estimulando ou regulando a endonuclease Vsr, j que em clulascontendo plasmdeos multicpia com o gene vsr, MutS e MutL so dispensveis no reparo VSP. Alm disto, aprotena MutL interage fisica e funcionalmente in vitro com a Vsr, assim como com MutS.


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VII 8

ATP

DNA pol I (5 3 EXONUCLEASE)

5-METIL CITOSINADESAMINAO DA

DNACITOSINA METILASE

CTAGGGGTCC

CH3

GATCCTAG

CH3

CH3

5

53

3GATCCTAG

CH3

CH3

5

53

3GATCCTAG

CH3

CH3

TG

GATCCTAG

CH3

CH3

MutS

MutS

MutL

MutL

Vsr

GATCGGTCC CTAG

CH3

CH3 CH3

5

3

5

3

GATC

CTAG

CH3

CH3

GATC

CTAG

CH3

CCAGG

GGTCC

CH3

CH3 CH3

5

3

5

3

GATC

CTAG

CH3

CH3

GATC

CTAG

CH3

CCAGG

GGTCC

CH3

CH3 CH3

5

53

3GATC

CTAG

CH3

CH3

Figura VII-9 Esquema do mecanismo de correo de erros de emparelhamentoem pequenos fragmentos (Very Short Patch Repair) em E. coli

Uma vez terminado o reparo, a protena Dcm metila novamente a citosina. Neste caso, o reparo pode

ser considerado como uma reparao por exciso de nucleotdeos dirigida por MutS e MutL.

Em clulas humanas, a reparao de G:T para G:C foi demonstrada em extratos nucleares declulas HeLa (HeLa Henrietta Lacks Cncer cervical que a matou em 1951). A anlise dosintermedirios da reao indica que o reparo envolve a troca de um simples nucleotdeo e, a DNA Pol , a responsvel pelo fechamento da lacuna.

Atividades enzimticas capazes de incisar as ligaes fosfodister imediatamente a 5e 3datimina errada foram identificadas em extratos de clulas humanas.

Uma vez que a timina liberada como uma base livre, foi sugerido que uma Timina-DNAGlicosilase (TDG) gere um stio intermedirio absico, que serve de substrato para as incises. A enzima(55 kDa) foi isolada de clulas HeLa e uma timina-DNA glicosilase especfica para erros, que capaz deremover T do par G:T, sem atividade AP liase ou AP endonuclease associada. Em verdade a enzimareconhece o T pareado com G e no com A, uma verdadeira interao com a base oposta ao erro. O parG:T originado da desaminao de C5MeC nas sequncias CpG. Esta enzima tambm pode remover Udos pares G:U que podem surgir de desaminaes de citosina em regies ricas em G:C. Neste caso esteerro poderia ser corrigido pelo sistema de reparao de bases, o que tambm ocorre quando o uracilentra erradamente na molcula de DNA. Aps a retirada da timina a TDG permanece no localimpedindo a ao da AP endonuclease APE1. TDG ento sumolada, o complexo se desfaz e assim o sitioAP serve de substrato para a AP-Endonuclease I (APE1). Aps a ao de APE1 o processo ocorre como

um reparo por exciso de bases (ver adiante). No par G:T, tambm pode atuar a protena MBD4 (MethylBinding Domain), que compete com a TDG.TDG degradada por sumo, mas MBD4 permanece, porminativa (Figura VII-10).

Correo de erros por MutY (metil independente)

O erro G:A ocorre muito frequentemente durante a polimerizao, entretanto, na ausncia de MutSLHo nmero de mutantes com este erro no muito elevado, devido existncia de outros sistemas; assim, aprotena MutY retira A do par G:A e tambm participa da reparao da leso oxidativa 8-oxoguanina (8-oxoG= GO), em conjunto com as protenas MutT e MutM como ser visto adiante.

Este sistema libera pequenos fragmentos e independente de MutSLH, hidrlise de ATP ou metilao.Os erros G:A so corrigidos para G:C. O reparo requer a funo do gene mutY(micA) e da PolI, a qual libera e,em seguida, incorpora entre 10 e 20 nucleotdeos.

A protena MutY funciona como uma DNA glicosilase com uma atividade 3AP liase associada,removendo especificamente A dos pares errados G:A e C:A com uma eficincia 20 vezes maior para o par G:A.


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MMR EMPEQUENOSFRAGMENTOS(HUMANOS)

Figura VII-10 Mecanismo de correo de erros de emparelhamento em pequenos fragmentos

Em clulas humanas, recentemente foi purificada uma enzima, que cliva especificamente errosA:G e A:C. A MYH interage com PCNA e dirigida forquilha com o erro na hlice neossintetizada,evitando que o G ou C seja retirado e cause a mutagnese. Ela faz simultaneamente incises na primeiraligao fosfodister 3 e 5 do erro no lado com A e no no lado com G, uma ao muito similar daprotena MutY deE. coli.

Erros de emparelhamento e recombinao gentica

Normalmente, a frequncia de recombinao gentica entre E. coli vs S. typhimurium (recombinaohomeloga) da ordem de 10-6 para um dado carter (ex.,xyl ou met), comparada com a recombinao entreE.coli vsE. coli (recombinao homloga), que de 10-1.

Em mutantes mutSLHa frequncia aumenta cerca de 1.000 vezes quando a divergncia de nucleotdeos de cerca de 20% (E. coli vs S. typhimurium), sendo os mutantes mutS e mutL os mais eficazes em deixar arecombinao ocorrer.

A induo do sistema SOS estimula a recombinao homeloga atravs da superproduo da protenaRecA. J que a protena RecA capaz de deixar mais de 30% de erros de emparelhamento na recombinao, oefeito cumulativo de deficincia de correo de erros de emparelhamento e induo do sistema SOS leva a taxade recombinao homeloga a aproximar-se da homloga.

Trocas entre sequncias divergentes em somente 3% so dramaticamente inibidas por MutS, um efeitoque pode ser significativamente aumentado por MutL. Como estas protenas no interferem na recombinao

homloga o maior efeito bloquear a migrao dos cruzamentos das hlices de DNA durante as trocashomelogas, no deixando a recombinao ocorrer, formando uma verdadeira barreira entre as espcies.

Barreiras genticas entre bactrias

Embora a transferncia de material durante a conjugao seja altamente eficiente, a frequncia derecombinao entre E. coli vs S. typhimurium muito baixa, aproximadamente 105 vezes menor que entre asmesmas espcies.

Durante a conjugao Hfr x F- (Figura VII-11) o DNA entra na clula receptora como uma hlicesimples com a fita lder 5. Na clula F- a fita complementar sintetizada, gerando a dupla hlice.

As pontas da dupla hlice so substrato para a enzima RecBCD, que com sua ao helicase eexonuclease digere a dupla hlice at encontrar uma sequncia chi () (5GCTGGTGG3). A sequncia altera a enzima baixando a afinidade de RecD com o heterodmero RecBC.

Com a perda de RecD o complexo RecBC fica deficiente em exonuclease, mas proficiente em helicase,produzindo hlices simples de DNA. A protena RecA forma um polmero na hlice simples e catalisa a


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VII 10

procura por sequncias idnticas no DNA em hlice dupla. A troca de hlices mediada por RecA requer ummnimo de identidade para processamento.

Ponte deprotoplasma

Figura VII-11 Conjugao bacteriana

Durante a conjugao interespcies o nmero de segmentos com o mnimo de identidade limitadopelo grau de divergncia entre os DNAs dos conjugantes, diminuindo a velocidade da recombinao mediadapor RecA. Consequentemente, o complexo entre RecA e DNA em hlice simples permanece mais tempo nocruzamento interespcies que no cruzamento intraespcies, resultando na ativao da funo coprotesica deRecA e desrepresso do regulon SOS. Como resultado aumenta a quantidade das protenas RecA e RuvAB oque estimula a recombinao entre as espcies. Assim, o SOS age como um regulador positivo indutvel darecombinao interespcies.

Entretanto, a induo do sistema SOS no afeta a atividade de correo de erros de emparelhamento emgrandes fragmentos (MMR), que um poderoso inibidor da recombinao entre sequncias divergentes e, aligao das protenas MutS e MutL bloqueia a troca de hlices promovida por RecA, reduzindo a frequncia derecombinao interespcies (Figura VII-12).

DNA doador

DNA idntico

10-1 recombinantes

DNA divergente

Induo do SOS

10-6 recombinantes 10-3 recombinantes

Alta expresso de recA e ruvAB

MutSL+ MutSL

= (5GCTGGTGG3)

RuvABC

Figura VII-12 Esquema do modelo proposto para a manuteno da barreira gentica entrebactrias (papel das protenas MutS e MutL)


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VII 11

Reparao de delees e inseres

As repeties de dinucleotdeos e trinucleotdeos que ocorrem frequentemente no DNA de eucariotos emais raramente em procariotos, representam um problema potencial durante a replicao, provocandodeslizamento entre as hlices e conduzindo a delees e inseres. A frequncia de delees e inseres numfragmento de dinucleotdeos repetitivos (AC)20 aumentada cerca de 10 vezes em cepas deE. coli mutL e mutS,o que no ocorre em mutantes recA. Este fato correlaciona-se com a deteco de instabilidade em repeties dedinucleotdeos em clulas humanas deficientes no reparo de erros de emparelhamento.

Por outro lado, repeties de trinucleotdeos (CTG)180 so mais estveis nos mutantes mutH, mutL oumutS, sugerindo a participao do sistema MMR na promoo das delees e inseres. Entretanto, aestabilidade das repeties de trinucleotideos (CGG)80 no afetada pela reparao de erros deemparelhamento em E. coli. Em clulas humanas ainda no foi reportada instabilidade de repeties detrinucleotdeos em clulas mutantes, deficientes na reparao de erros de emparelhamento.

A instabilidade de micro-satlites um biomarcador para a perda de MMR em clulas tumorais j queo MMR o maior guardio contra a instabilidade de micro-satlites. Estes micro-satlites so replicadosinacuradamente, levando a frequentes deslizamentos da DNA polimerase e ineficienmte correo.

A perda do MMR diminui apoptose, aumenta a sobrevivncia celular e resulta em resistncia aquimioterapia, portanto, a falha de MMR contribui para o crescimento seletivo destas clulas durante a

carcinognese, explicando parcialmente o aumento da suscetibilidade a cnceres tecido especficos associados adefeitos em genes MMR.

A atuao conjugada dos processos acima descritos faz com que a probabilidade de ocorrncia e (ou)persistncia de um erro de emparelhamento seja bastante reduzida, da ordem de grandeza de l0 -10, ou seja, deum nucleotdeo indevidamente inserido para cada 1010 nucleotdeos. Na polimerizao normal os erros so daordem de 10-4; aps a reviso editorial passam para 10-7 e aps a ao das protenas Mut so da ordem de 10-10. Uma base nitrogenada incorporada erroneamente acarreta alterao do contedo informacional,transmissvel s geraes subsequentes, constituindo a mutagnese direta.

REPARAO DE LESES (ASPECTOS GERAIS)

Agentes qumicos tambm podem provocar erros de emparelhamento, causando modificaesestruturais nas bases nitrogenadas e alterando sua capacidade de formao correta de pares. Isto ocorre, porexemplo, aps tratamento com certos agentes alquilantes, como MNNG, capaz de inserir, por exemplo,grupamentos metil no O6 da guanina, de forma que esta passa a se emparelhar com a timina, e no mais com acitosina.

Diversos agentes fsicos ou qumicos do meio ambiente promovem modificaes estruturais namolcula de DNA, englobadas sob a designao genrica de leses, cuja persistncia representa um obstculo manuteno dos processos bioqumicos intracelulares. Assim, fcil entender a importncia dos mecanismosenzimticos que atuam restaurando a integridade do genoma ou criando vias que permitam clula tolerar asleses, isto , manter suas funes mesmo sem a eliminao dos danos provocados no DNA.

A no funcionalidade dos mecanismos de reparao conduz inativao celular aps o tratamento com

o agente fsico ou qumico ou, eventualmente, modificao do patrimnio gentico, isto , ao surgimento demutaes. Mas nem sempre os mecanismos de reparao atuam corretamente, em alguns casos eles podempromover o desaparecimento da leso, com alterao do contedo informacional, o que caracteriza amutagnese indireta. Estas diferentes possibilidades encontram-se esquematicamente representadas na FiguraVII-13.

Os mecanismos de reparao do DNA so, em geral, dependentes dos produtos de diversos genes e secaracterizam por possurem vrias etapas, possibilitando vias alternativas, muitas vezes coexistentes ecompetitivas.

REVERSO DIRETA DAS LESES

Alguns tipos de leses podem ser revertidos diretamente, mediante a ao de uma nica enzima, quedesfaz a leso produzida, restaurando a integridade da molcula de DNA. Como exemplos de mecanismosdeste tipo de reparao podem ser citados: a ligao direta de quebras simples, a fotorreativao enzimtica e aremoo de grupamentos alquil. Outro mecanismo enzimtico a remoo de dois fosfatos da leso 8-oxo dGTP, formando 8-oxo-dGMP, que no incorporada ao DNA (ver adiante).


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VII 12

DNA

Tratamentos com agentes fsicos ou qumicos

DNA LESADO

Reparao CORRETA Reparao AUSENTE ou MAL-SUCEDIDA Reparao INCORRETA

DNA RESTAURADO

(Preservao da informaobiolgica)

PERDA DE ATIVIDADEBIOLGICA

DNA MUTADO (Evoluo)

Figura VII-13 - Atuao dos mecanismos de reparao na eliminao das leses,na preservao do contedo informacional e na mutagnese

Alm destes mecanismos enzimticos, algumas leses, como os dmeros de pirimidinas podem ser

revertidos diretamente pela radiao ultravioleta, como o caso da fotorreverso.

Reparo de quebras simples pela ligao direta

Na maior parte das vezes a reparao das quebras produzidas no DNA pelas radiaes X, e outrosagentes requer o sistema recombinacional. Alm disto, os grupamentos deixados normalmente requeremprocessamento para limpeza das pontas antes da polimerizao. Em E. coli, e possivelmente em outrosorganismos, algumas das quebras simples produzidas podem ser reparadas diretamente pela ao da DNAligase. A enzima de E. coli requer NAD e Mg2+ como cofatores e, como todas as DNA ligases, requer pontaslivres no stio da quebra e a presena de 3OH e 5PO 4. Assim, uma quebra simples com estas caractersticas,produzida por agentes lesivos, est sujeita ao reparo pela ligao direta (Figura VII-14).

P

O

O O

OOH

5

3 5

3

+ DNA ligase

+ NAD (E. coli) ou

+ ATP (T4)

P

O

O

OO5

3 5

3

+ AMP + NMN ou PP i

Figura VII-14 - Esquema do modelo proposto para ligao direta dequebras simples no DNA de E. coli


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VII 13

Fotorreativao

Entre os fotoprodutos formados pelas radiaes UV germicidas (UV-C), os dmeros de pirimidinas(CPD = Ciclobutane Pyrimidine Dimer) so os mais frequentes, sendo os maiores responsveis pela inativaocelular.

A fotorreativao consiste na eliminao de CPDs formados no DNA pelo UV-C, mediante exposiodas clulas s radiaes UV de comprimentos de onda superiores a 300 nm ou luz visvel. O processo,esquematicamente representado na Figura VII-15, mediado pela enzima de fotorreativao ou fotoliase, quetem a propriedade de combinar-se, mesmo em ausncia de luz, com DNA contendo dmeros de pirimidinas.Quando o complexo enzima-substrato iluminado, ele se dissocia, sendo liberados o DNA reparado e a enzima,esta podendo atuar em outros stios nos quais ainda existam dmeros. Existem entre 10 e 20 molculas porclula bacteriana e a fotoliase (49 kDa) age rompendo a ligao ciclobutano entre a duas pirimidinas, numavelocidade de 5 dmeros /molcula/min e, em E. coli codificada pelo gene phr. Para estas clulas oscomprimentos de onda mais eficientes para promover a fotorreativao situam-se entre 340 e 390 nm.

FiguraVII-15 - Esquema representativo da fotorreativao enzimtica

DNAnativo

DNAcom

dmero

Fotoliaseliga-se aodmero

Absorode luz

(> 300 nm)

Reparaoe liberaoda enzima

Recentemente foi detectado que a fotoliase de plantas tambm capaz de desfazer a ligao do

fotoproduto 6-4 (6-4PP = 6-4 Pirimidina Pirimidona).A fotoliase contm dois cromforos FADH2 ou FADH

- (1,5-dihidroflavina adenina dinucleotdeo) efolato MTHF [5,10-metenoetiltetrahidrofolil (poliglutamato)] ou deazaflavina (8-HDH). O folato absorve amaioria dos ftons e chamado de antena da fotoliase. O folato, ao receber um fton, passa ao estadotripleto e desativa-se transferindo a energia para o FADH-. O FADH- excitado (singleto) transfere um eltron

para o dmero. Atravs de um rearranjo eletrnico h quebra do anel ciclobutano, gerando pirimidina epirimidina nion o qual transfere o eltron para o FADHo, regenerando o FADH2 (Figura VII-16A)A fotorreativao permite no somente o aumento da viabilidade celular aps exposio ao UV-C,

germicida, mas tambm a reduo da mutagnese fotoinduzida.O processo, em E. coli parece ser altamente especfico para dmeros de pirimidinas, mas, a fotoliase

talvez desempenhe outros papis na clula, entre os quais o favorecimento de outros mecanismos de reparao.A ligao da fotoliase aos dmeros torna estas leses mais acessveis ao complexo UvrABC, aumentando aeficincia da reparao por exciso de nucleotdeos (ver adiante).

Foi mostrado que a FADH2 purificada da fotoliase deE. coli catalisa a monomerizao de dmeros deuracil em poli-U in vitro, mas com uma eficincia 1.000 vezes menor que a de dmeros de uracil do DNA.

A fotorreativao j foi descrita em diversos sistemas biolgicos: micoplasmas, bactrias, leveduras,moscas, sapos, diversas plantas e mamferos no placentrios, mas no em mamferos superiores.

Em S. cerevisiae o gene PHR1 localiza-se no cromossomo 15 e codifica uma protena de 66,2 kDa. Estegene complementa mutantes phrde E. coli deficientes em fotorreativao e vice versa. Diferentemente de E.coli, em clulas da levedura existem muitas molculas de fotoliase (entre 250 a 300 em condiesconstitutivas).


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VII 14

Curiosamente o gene PHR1 tem a sua transcrio aumentada quando as clulas so submetidas radiao UV-C ou a diversos agentes qumicos que interagem com o DNA embora a fotoliase no estejaenvolvida na reparao de leses qumicas.

A fotorreativao muito importante em plantas, que esto constantemente expostas ao sol. Em estudoscomA. thaliana foi verificado que a fotorreativao altamente eficiente para reparar dmeros e leses 6-4PP eque mutantes uvr2-1 necrosam quando expostos a baixas doses de UV-C. O mesmo fenmeno de sensibilidadefoi verificado no arroz Norin I (economicamente o mais importante no Japo) cujas sementes so deficientesem fotorreativao de dmeros.

A fotoliase que repara leses 6-4PP foi inicialmente detectada em D. melanogaster. Posteriormente foitambm detectada em plantas (A. thaliana) e alguns vertebrados (X. laevis eD. rerio). O mecanismo propostopara a ao destas fotoliases o mesmo utilizado pelas que reparam os dmeros e, alm disto, ambas utilizamFAD para a transferncia dos eltrons para a leso. A ligao do 6-4PP fotoliase induz o rearranjo e um aneloxetano formado com o auxilio de dois resduos His na fotoliase. Uma vez sendo formado o radical na leso aligao entre as pirimidinas quebrada e um eltron transferido de volta para o cofator cataltico (FiguraVII-16B).

Figura VII-16 Fotorreativao do dmero (A) e do fotoproduto 6-4 (B)

dmero TT

fotoproduto 6-4 TT intermedirio oxetane

Alguns estudos sugeriram a existncia de protenas filogeneticamente correlacionadas fotoliase

em clulas de mamferos e outros mostraram perda de dmeros, dependentemente de luz, em clulas emcultura e em pele humana intacta, entretanto, estes estudos no foram confirmados.

Muitos estudos falharam na tentativa de mostrar fotorreativao em organismos mais avanadosque os no-placentrios (marsupiais); portanto, acredita-se que ela no exista em seres humanos.

Em clulas humanas foram detectadas protenas similares s fotoliases, os criptocromos,porm no relacionadas ao reparo de leses, mas sim regulao do ritmo circadiano. Estas protenaspertencem famlia dos receptores de luz azul que em plantas seriam responsveis pela florao emresposta luz (CRY2).

J foram clonados os genes hCRY1 ehCRY2 em humanos emCRY1 emCRY2 em camundongos.CRY1 e CRY2 so expressos em diversos tecidos tais como: fgado, testculos, crebro (nunca expostos luz) e retina. O gene mCRY2 altamente expresso na retina e mCRY1 no ncleo supraquiasmtico, queagem como fotorreceptores do ritmo circadiano em mamferos.

Aparentemente os genes CRY1 e CRY2 tm papis antagnicos, uma vez que o perodo circadiano diminudo em camundongos cry1-/- e aumentado em camundongos cry2-/-. Estes genes revelam umamodificao evolucionria muito interessante, uma vez que uma enzima de reparao de DNA parece terse transformado em uma protena com funes completamente diferentes.

Quando uma dose de radiao UV-C suficiente para causar eritema aplicada em seres humanosa aplicao tpica de fotoliase deA. nidulans incorporada a lipossomas acarreta significativa reduo donmero de dmeros de pirimidinas nas clulas da pele e tambm evita a imunossupresso induzida porUV-B. Foi tambm demonstrado que a expresso do gene da fotoliase de marsupiais em camundongos


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VII 15

repara eficientemente os dmeros e reduz os efeitos da irradiao na pele (eritema, hiperplasia,apoptose). A expresso de fotoliases de dmeros em clulas XP-A humanas reduz substancialmente amutagnese e aumenta a sobrevivncia ao UV-C.

Os dmeros so os maiores alvos para eventos mutagnicos e formao de mutaes nas vias dogene p53 na formao de clulas epidmicas pr-neoplsicas. Portanto, a eliminao preferencial dedmeros doskeratincitos basais reduz drasticamente a induo de cncer de pele pelo UV.

Fotorreverso

A reverso de dmeros de pirimidinas pode tambm ser obtida por outros processos, independentes dafotoliase. Ela ocorre, por exemplo, mediante exposio das clulas, previamente irradiadas com UV germicida,a comprimentos de onda situados entre 200 e 300 nm (235nm favorece a fotomonomerizao e 280 nm favorecea dimerizao), uma vez que a unio de duas pirimidinas uma reao reversvel e que cada comprimento deonda, ainda que com diferentes eficincias, pode promover tanto a dimerizao como a monomerizao; adesdimerizao devida unicamente exposio ao UV-C constitui a fotorreverso direta.

Protenas ricas em triptofano, como a codificada pelo gene 32 do fago T4, e mesmo oligopeptdeosricos neste aminocido, podem, quando expostos a comprimentos de onda de 334 nm, adquirir a capacidade depromover a monomerizao de timinas dimerizadas, o que parece ser consequncia da transferncia de eltrons

do anel do triptofano para os dmeros; este fenmeno constitui a fotorreverso sensibilizada.

Reverso direta de alquilaes

Transferncia de grupamentos alquil

Quando clulas so tratadas com agentes alquilantes tais como MNU ou MNNG, seu DNA alquiladonas mais diversas posies. Em alguns casos, estas leses podem ser reparadas diretamente, pela remoo dosgrupamentos alquil.

As metilaes que ocorrem no oxignio exocclico das bases so diretamente removidas, sendo O6MeGa mais abundante (6 a 8% das metilaes totais) e O4MeT a de menor importncia (< 0,4%). A metilao da

ligao fosfotrister da ordem de 17%. (Na Figura VII-17 esto representados os diferentes stios demetilao com as respectivas ocorrncias).

Pareamento C:G no DNA Pareamento T:A no DNA

Fosfato na cadeia fosfodiester

Figura VII-17 - Principais stios de alquilao no DNA

EmE. coli existem duas enzimas que reparam o DNA por transferncia direta do grupamento alquil; as

protenas Ada e Ogt (O6-Metilguanina - DNA Metiltransferases) codificadas pelos genes ada e ogtrespectivamente.

A protena Ada (39 kDa) remove grupamentos metil das posies O6 da guanina, O4 da timina e daligao fosfotrister enquanto a Ogt s consegue remov-los das posies O6 da guanina e O4 da timina. A


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VII 16

remoo dos grupamentos alquil das bases acarreta a inativao das protenas (enzima suicida), entretanto, nocaso da remoo do metil da ligao fosfotrister, a protena Ada sofre uma mudana conformacional,tornando-se um ativador de seu prprio gene, conduzindo sntese de milhares de molculas de Ada.

A protena Ogt (19 kDa) constitutiva, no tendo sido detectada nenhuma ativao por qualquertratamento.

Foi mostrado que os mutantes ada e ogt so propensos a acumular mutaes espontaneamente,mostrando a existncia de alquilaes espontneas provenientes provavelmente do cloreto de metila, que abundante na atmosfera, com uma estimativa anual de emisso de 5 x106 toneladas, a maior parte de fontesnaturais e de fontes endgenas como a S-adenosil metionina e outros doadores intracelulares.

Apesar da semelhana quanto sua atuao, recentemente foi verificado que aparentemente Adaprefere O6MeG e Ogt prefere O4MeT.

Uma vez que as enzimas so capazes de remover diversos grupamentos alquil, h proposta dedenomin-las O6-alquilguanina-DNA alquiltransferases I e II (O6-AgtI e O6AgtII)

A protena Ada, produto do gene ada remove grupamentos alquil inseridos nas posies O6 da guanina,O4 da timina com sua parte C terminal de 19 kDa (C-Ada19) e da ligao fosfotrister, com sua parte Ngerminal de 20 kDa (N-Ada20) transferindo-os para uma cistena constituinte da protena, o que justifica a suainativao durante o processo (Figura VII-18). Uma vez que a metilao da guanina na posio O6 conduz,durante a replicao semiconservativa do DNA, a erros de emparelhamento, torna-se fcil entender os efeitos

mutagnicos deste tipo de leso e a importncia da reparao adaptativa na reduo da mutagnese. Em clulasdeE. coli no adaptadas existem entre 20 e 60 molculas desta enzima, cuja concentrao pode ser multiplicadapor 100 ou 200 em consequncia do tratamento indutor.

Figura VII-18 Mecanismo de ao da protena Ada

metil fosfotrister

O6 metilguanina

Quando a transferncia feita da O6-metil guanina ou da O4-metil timina o metil capturado pelacistena 321 do stio ativo C terminal (Pro-Cys-His-Arg-Val/Ile) e a enzima inativada, entretanto quando ometil retirado do fosfotrister ele capturado pela cistena 38 (do N terminal) a enzima transforma-se em umativador do seu prprio gene, conduzindo sntese de milhares de molculas da protena Ada.

Quando da metilao de cys 38, que irreversvel, Ada transforma-se na ativadora da transcrio dosgenes da resposta adaptativa, ada-alkB, alkA e aidB (Figura VII-19), uma vez que, neste caso, a mudanaconformacional de Ada aumenta a capacidade de ligao aos promotores destes genes, facilitando a ligao daRNA polimerase.

A transformao da protena Ada conduz desrepresso de outro gene, o alkA, que codifica a sntese da3-metil adenina DNA glicosilase II (AlkA) que remove bases metiladas em diferentes posies (N3 e N7 daguanina, O2 da citosina, N3 e N7 da adenina e O2 da timina, entre outras).

Na Figura VII-20 est representado esquematicamente o processo da resposta adaptativa para agentesalquilantes.


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VII 17

Metilfosfotriester Fosfato

Ativao datranscrio

GuaninaO6-metilguanina

Figura VII-19 - Inativao e ativao da protena Ada em bactrias

Figura VII-20 Mecanismo da resposta adaptativa para agentes alquilantes

No induzido

Baixo nvel de reparo

Sinal indutor

Ativao datranscrio

Induo

Aumento dareparao

Em clulas no adaptadas a protena AlkA atua juntamente com a Tag, mas a quantidade desta no sealtera durante a adaptao; em clulas adaptadas, a quantidade de AlkA multiplicada por 20, e esta enzimapassa a ter um papel importante na eliminao de bases alteradas.

A protena Ada tambm regula outros genes tais como o alkB e o aidB.O papel da protena AlkB o reparo de N1MeA e N3MeC em DNA em hlice simples. Por outro lado, o

papel da protena AidB ainda no est bem estabelecido. Aparentemente ela inativa agentes alquilantes antesque eles causem as leses, no participando do reparo das leses.

Aps a metilao do N-terminal Ada reconhece as regies promotoras do regulon ada e recruta a RNApolimerase para iniciar a ativao dos genes de resistncia a metilao. Assim, Ada um quimiosensor demetilao emE. coli.

A atividade O6-AGT em leveduras expressa em um nvel de 150 molculas por clula na fase

exponencial de crescimento e indetectvel na fase estacionria. Em S. cerevisiae o gene clonadoMGT1 capazde complementar o duplo mutante ada ogtde E. coli. Mutantes deletados em MGT1 so sensveis morte emutagnese por tratamento com agentes alquilantes. Adicionalmente mutantes mgt1 tm a mutagneseespontnea aumentada, sugerindo a existncia de alquilao endgena em S. cerevisiae. O geneMGT1 mapeia


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VII 19

Aps exposio a agentes alquilantes as clulas humanas podem adquirir resistncia morte eleses cromossmicas, mas no mutagnese. Este fentipo denominado tolerncia metilao eenvolve uma deficincia no reparo de erros de emparelhamento.

Durante a replicao do DNA contendo O6-MeG h alta probabilidade da incorporao de timinana frente da base alquilada. Tanto C como T em frente a O6-MeG so reconhecidas como bases erradas esero excisadas pelo sistema MMR, que s age na hlice filha. Portanto, o reparo de O6-MeG ftil eperigoso, pois se o MMR continua a exciso as bases colocadas em frente base alquilada podem gerarquebras no DNA, aumentando a morte celular.

A O6-MGMT, logicamente, tem um papel importante na preveno do cncer. Em um grandenmero de cnceres, a mutao oncognica resultou de uma transio G:C para A:T, a qual pode terresultado de uma alquilao de G. Em verdade, a superexpresso de O6-MGMT protege camundongostransgnicos de cnceres induzidos por agentes alquilantes. Em um caso, a expresso de O 6-MGMThumana em camundongos transgnicos protegeu-os contra o linfoma de timo, induzido por MNU. Emoutro caso, a expresso do gene ada deE. coli em camundongos transgnicos protegeu os animais contracncer de fgado induzido por dimetil ou dietilnitrosamina.

A ocorrncia de tumores cerebrais em ratos jovens tratados com etil nitrosuria correlacionadacom a persistncia da O6 alquil guanina no crebro. Similarmente, o tratamento crnico com MNUespecificamente resulta em tumores neurais em animais experimentais e acompanhado por progressiva

acumulao de O6

MeG no crebro sem a concomitante acumulao em outros tecidos.Os efeitos citotxicos das leses alquilantes podem ser usados no tratamento de cncer.Clinicamente so usadas nitrosourias e agentes cloroetilantes tais como carmustina (BCNU), entretantoo aumento da produo de O6-MGMT uma das causas da resistncia a estas terapias. Portanto, ainibio de O6-MGMT pode aumentar a eficincia dos tratamentos.

O meio mais simples para inibir a enzima alquilar a sua cistena ativa. Por algum tempo aO6MeG como base livre foi o nico substrato usado, entretanto, a O6BuG se mostrou mais efetiva que aforma metilada. A pr-incubao de linhagens celulares de cncer com esta pequena molcula aumenta asensibilidade ao tratamento com agentes tipo CNU. Ensaios clnicos de fase I de O6BuG e BCNUestabeleceram a dose mxima tolervel. O estudo tambm mostrou que O6BuG rapidamente convertidaa 8-oxo-O6BuG, que tambm um bom inativador de O6-MGMT in vivo.

Estudo de fase II com doses de 120 mg/m2 de O6BuG no produziram regresso de tumor empacientes com glioma maligno resistente a nitrosouria, embora alguns pacientes exibissem estabilidadeda doena por 18 semanas com o tratamento. Portanto, mais estudos so necessrios.

Ainda no foi detectada doena humana associada com a mutao no gene O6-MGMT. O fentipoMer- parece ser o efeito e no a causa da transformao maligna.

Em clulas humanas o gene da O6MGMT foi o primeiro que mostrou ser indutvel por estressesgenotxicos e por glicocorticides, conduzindo resposta adaptativa das clulas aos efeitos citotxicos emutagnicos de agentes alquilantes simples.

A expresso de O6MGMT regulada pela metilao do gene e do promotor. A metilao dopromotor provoca a inibio e a metilao do gene resulta no aumento da expresso da protena. Ametilao tambm est envolvida na resistncia adquirida por clulas de melanoma contra drogasanticncer contendo cloroetila.

Em clulas eucariticas ainda no se detectou a reparao das metilaes nas ligaesfosfotrister.

Transferncia de grupamentos alquil por AlkB

As metilaes podem ocorrer em 14 stios diferentes no DNA (ver Figura VII-17), 12 dos quais soreparados por Ada, AlkA e AlkB. As metilaes mais abundantes so N7MeG (70%) e N3MeA (10%).

Alguns agentes alquilantes, tais como: CH3Cl, CH3I e CH3Br, geram metilaes em RNA e DNA emhlice simples (N1MeA e N3MeC), uma vez que estes stios esto protegidos na dupla hlice.

AlkB uma dioxigenase -cetoglutarato-Fe(II) dependente, que utiliza um intermedirio ferro-oxo para

hidroxilar N

1

MeA e N

3

MeC no DNA. Estes intermedirios hidroxilados so instveis e se decompem,gerando formaldedo e regenerando a base ntegra. No caso de N1etilAdenina liberado acetaldedo, numaverdadeira demetilao oxidativa (Figura VII-22).

In vitro, AlkB repara DNA em hlice simples assim como DNA em hlice dupla (preparado poranelamento aps a metilao).


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VII 20

Alm disto, AlkB tambm capaz de retirar o N1metil de dATP, impedindo a incorporao doprecursor metilado durante a sntese de DNA.

Figura VII-22 Mecanismo de ao da protena AlkB

O primeiro gene humano descrito como homlogo aoalkB deE. coli foi o ABH1. Entretanto, osresultados obtidos no foram confirmados, embora este gene possua 18,5% de identidade com alkB epossivelmente tenha uma funo relacionada.

Posteriormente ABH2 e ABH3 (tambm conhecido como DEPC-1), foram descritos e mostraramcomplementar a mutaoalkB deE. coli.

ABH2 est localizado no cromossomo 12 e composto de 4 exons e AHB3 est no cromossomo 11,sendo composto de 10 exons.

As protenas AHB2 e AHB3 so do grupo da superfamlia das dioxigenases cetoglutarato Fe(II)-dependentes, contendo a sequncia contexto de ligao do Fe(II).

As duas protenas retiram metil de N1MeA e N2MeC e ABH2 mais ativa em N1MeA e ABH3 emN3MeC no DNA.

Em contraste com AlkB as protenas humanas tm muito pouca afinidade por N1-etilA.As protenas AlkB e ABH3 preferem DNA em hlice simples e RNA, enquanto ABH2 prefere

DNA em hlice simples e dupla, por isto AlkB e ABH3 reparam eficientemente RNA, entretanto, apreferncia das duas protenas humanas por DNA o dobro daquela observada para RNA.

Como as metilaes N1MeA e N3MeA so geradas em DNA em hlice simples, foi sugerido queAlkB e os homlogos devam funcionar nas forquilhas de replicao e nos stios de transcrio. Em

verdade, os mutantes alkB deE. coli so muito mais sensveis a agentes alquilantes em fase exponencialdo que na estacionria de crescimento e ABH2, mas no ABH3, colocaliza com PCNA nos foci dereplicao. Alm disto,alkB tambm est associado com a replicao em organismos como C. crescentus,aumentado sua expresso durante a fase S, junto com outros genes requeridos para a sntese de DNA.

Ainda no se demonstrou a induo dos genes humanos pelos tratamentos com agentes metilantesde hlices simples DNA.

REPARAO POR EXCISO

Aspectos gerais

O isolamento de mutantes deE. coli B denominados Bs-1 e Bs-2, bastante sensveis s radiaes UV-C,levou, h mais de quatro dcadas, proposio da existncia de um mecanismo de reparao independente dailuminao e que, nestes mutantes, seria deficiente. Por esta razo, este mecanismo foi inicialmente


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VII 21

denominado de reparao no escuro (dark repair), sendo hoje conhecido como reparao por exciso oureparao por exciso-ressntese.

Este tipo de reparao, provavelmente o mais importante mecanismo de eliminao de leses foto,radio ou quimioinduzidas, admite vrias vias alternativas, que podem ser agrupados em:

a) remoo da base nitrogenada lesada, seguida da insero de uma base idntica, no lesada por umainsertase. Em clulas humanas foi detectada atividade insertase, mas, o gene no foi detectado e o mecanismo obscuro.

b) remoo da base nitrogenada lesada, gerando um stio apurnico ou apirimidnico, capaz de serreconhecido por uma endonuclease, que produz uma quebra na cadeia polinucleotdica, seguindo-se aeliminao do fragmento, ressntese e ligao;

c) exciso de um fragmento relativamente curto da cadeia contendo a leso, seguida de ressntese eligao.

d) exciso de um longo fragmento de cadeia, formado por mais de 1.500 nucleotdeos, seguida deressntese e ligao.

REPARAO POR EXCISO DE BASES (BER)

O material gentico constantemente exposto a agentes fsicos e qumicos que induzem grande

variedade de modificaes no DNA. Para evitar que esses agentes causem mutaes ou morte celular osorganismos desenvolveram diversos mecanismos para prevenir e reparar as leses.

Uma grande variedade de leses reparada por um sistema em mltiplas etapas, denominado reparaopor exciso de bases, composto das seguintes etapas:a) liberao da base lesada ou mal emparelhada por uma DNA glicosilase especfica,b) inciso da cadeia acar fosfato no sitio absico resultante, por uma liase ou por uma endonuclease,c) remoo do terminal criado,d) sntese de reparo ee) ligao do DNA neossintetizado ao preexistente.

O sistema de exciso de bases o principal sistema para a reparao de bases modificadas, stios comperda de bases, quebras simples e pequenas lacunas no DNA.

DNA glicosilases

Bases nitrogenadas lesadas pelo tratamento com agentes fsicos ou qumicos podem ser removidas pelaatuao de N-glicosilases, capazes de romper a ligao entre a base e a desoxirribose.

Muitas DNA glicosilases reconhecem somente uma forma particular da leso da base e a maioria dasDNA glicosilases altamente especfica para bases com uma leso especfica.

Elas so protenas pequenas, com menos de 30 kDa e o aparecimento de bases livres aps tratamentodo DNA com agentes genotxicos a maior demonstrao da atividade das DNA glicosilases. Istonormalmente feito por anlise cromatogrfica seja da mistura inteira da incubao do DNA marcadoradioativamente seja da frao contendo oligo ou mononucleotdeos solveis em cido ou lcool.

As DNA glicosilases podem ser monofuncionais, removendo a base e deixando um stio AP ou

bifuncionais devido a terem associada uma atividade liase que cliva o DNA no lado 3 do sitio absico.

Uracil-DNA glicosilases (UDGs)

Famlia 1 - Uracil-DNA glicosilase (Ung)

uma enzima codificada em E. coli pelo gene ung, constituindo-se de um polipetdeo de 26 kDa queremove molculas de uracil incorporadas ao DNA pela DNA polimerase, que incorpora erradamente umamolcula de uracil para cada 1.000 a 10.000 timinas.

O uracil tambm pode ser formado no DNA em consequncia da desaminao da citosina, fenmenoeste que ocorre com elevada frequncia pela ao de agentes fsicos ou qumicos. Portanto, Ung tem um papel

relevante em evitar a mutagnese espontnea C:G T:A.Algumas formas de vida usam o uracil no DNA (bacterifagos PBS1 e PBS2 de Bacillus subtilis).Estas cepas, entretanto, possuem Ung e, em verdade, logo aps a infeco o gene ugi do fago (inibidor da Ung) expresso, permitindo a replicao do vrus.


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VII 22

A Ung utiliza DNA em hlice dupla ou simples contendo deoxiuridina. A enzima retira o uracil eengloba-o no seu stio ativo, o que limita as leses reparveis. Entretanto, alm do uracil, foi mostrado queela tambm capaz de reconhecer 5-fluoruracil e 5-hidroxiuracil. A enzima capaz de remover 800 resduos deuracil por minuto e cada clula tem cerca de 300 molculas (Figura VII-23).

Figura VII-23 Mecanismo de ao da Uracil-DNA glicosilase (Ung)

Em clulas de mamferos existem duas formas do mesmo gene, designadas UNG2 no ncleo e

UNG1 na mitocndria. A protena UNG nuclear co-localiza com fatores de replicao: protena dereplicao A (RPA) e antgeno nuclear de proliferao celular (PCNA) nos stios da replicao. Aprincipal funo de UNG em clulas de mamferos remover U quando ele incorporado em frente a Adurante a replicao, tendo tambm um pequeno papel na remoo de U em frente a G por desaminaoda citosina fora da replicao. Estas protenas existem em bactrias, leveduras, mamferos, plantas e emalguns virus, mas no em insetos.

Interessantemente, alguns vrus, incluindo HSV1, HSV2 e varicela zoster, codificam sua prpriauracil-DNA glicosilase, indicando a importncia desta enzima para sua manuteno. No existe doenahumana conhecida associada com defeito em UNG.

Famlia 2 UDGs (Timina-DNA glicosilases - TDG)

As TDG de eucariotos foram inicialmente descritas pela capacidade de retirar timina dos pares G:T.Elas tambm so capazes de retirar uracil mas somente dos pares G:U. As bactrias possuem homlogosestruturais designados Mug (mismatch-specific uracil-DNA glycosylase). As TDG e Mug existem em

mamferos, insetos e outros eucariotos (S. pombe).Estas glicosilases possuem um mecanismo de reconhecimento das leses diferente da famlia 1, o quepermite a elas excisar uracil e timina em frente guanina. Alm disto, elas tambm podem remover a basealquilada 3,N4-etenocitosina oposta a G e 1,N2-etenoguanina oposta a C, sendo talvez a reparao de adutos deeteno o papel mais importante para estas enzimas.

Famlia 3 5-Hidroximetiluracil-DNA glicosilase (somente em eucariotos)

O 5-hidroximetiluracil formado pela oxidao do grupamento metil da timina ou peladesaminao da 5-hidroximetilcitosina. Ele detectado em urina de ratos e de humanos e usado comomedida da formao de leses oxidativas no DNA nestes organismos. Esta leso removida por umaglicosilase especfica presente em todos os vertebrados, mas no em procariotos, provavelmente porqueos procariotos no tm muitos resduos 5-metilcitosina. A enzima age igualmente em DNA em hlicesimples como em dupla, em contraste com a uracil-DNA glicosilase, que prefere DNA em hlice simples eoutras glicosilases que preferem DNA em hlice dupla. A enzima purificada foi designa SMUG (single-


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stranded specific monofunctional uracil-DNA glycosylase). Posteriormente foi verificado que ela prefereDNA dupla hlice (700 vezes mais que hlice simples).

Alem do 5-hidroximetiluracil SMUG pode remover 5-formiluracil e 5-hidroxiuracil do DNA

Famlia 4 UDGs de Archaea e algumas bactrias

Bactrias termofilicas vivem em altas temperaturas, uma condio na qual as desaminaes so muitofrequentes, gerando pares G:U e G:T, pela desaminao de citosina e 5-metilcitosina respectivamente. Estesorganismos possuem uma famlia de DNA glicosilases denominada TmUDG. Estas enzimas detectadas emdiversos membros de Archaea hipertermofilicos, possuem centros ferro-enxofre estruturais e parecem agir demaneira homloga protena UNG de mamferos na forquilha de replicao.

Protenas MBD4 de mamferos

Estas protenas contm um domnio (MDB = methyl-binding domain) que se liga a DNA rico emsequncias 5-Me-CpG. A protena MDB4 tem uma atividade que remove T e U mal emparelhados com Gcom alta especificidade para as sequncias CpG metiladas. Alm da ao glicosilase MDB4 tambm temao liase. Ela compete com a TDG na remoo de timinas do par G:T.

Alm de sua atuao nas ilhas CpG a protena tambm remove timina de erros com O6

-metilguanina.

Deficincia em DNA glicosilases

A deficincia de ung aumenta os nveis de mutagnese, principalmente GC AT em E. coli. Emleveduras a deficincia de UNG no aumenta muito a mutagnese e em mamferos a deficincia em UNG causapr-disposio para malignidade nas clulas e alteraes do sistema imune.

Camundongos Ung-/- so frteis e no mostram defeitos no desenvolvimento. Entretanto as clulas soparcialmente deficientes na remoo de U incorporado erroneamente. No primeiro ano de vida os camundongos

so normais, mas, aps 18 meses, eles morrem mais que o controle e comeam a aparecer muitos linfomas declulas . Isto representa o primeiro exemplo de aumento de malignidade espontnea em camundongos comoresultado da deficincia de uma DNA glicosilase.

Camundongos nocaute para MBD4 apresentam trs vezes mais mutaes C G nos stios CpG.Quando cruzados com camundongos com um dos alelos mutados em Apc (adenomatoous polyposis coli) oresultante manifesta formao acelerada de tumores no trato gastrointestinal e mutaes CpG TpG no gene

Apc. Embora a inativao de MBD4 por si no aumente a susceptibilidade para cncer em camundongos halterao do espectro de mutaes em genes supressores, modulando, portanto, a pr-disposio paracancerizao

3 metil adenina DNA glicosilases (bactrias) / N-metilpurina-DNA glicosilase (humanos)

Quando do tratamento das clulas com agentes alquilantes, diversas posies nas bases so alquiladas eno so reconhecidas pelas protenas Ada e Ogt. Entre as bases alquiladas, a 3-metil-adenina a leso maiscrtica uma vez que interfere com a replicao, conduzindo letalidade.

EmE. coli, duas protenas so responsveis pela eliminao destas bases, as enzimas TagA e AlkA (3-metil-adenina DNA glicosilase I e II), codificadas pelos genes tagA e alkA, respectivamente. A protena TagA(21 kDa) capaz de reparar diversas bases alm da 3-meA. Ela tambm catalisa a exciso de 3-metilguanina e3-etiladenina.

A protena AlkA (31 kDa), alm de remover 3-meA capaz de catalisar a eliminao de pelo menosmais 20 produtos de metilao, tais como: 3-metilguanina, 7-metilpurinas, 7 e 3-etilpurinas, O 2-metilpirimidinas, 5-hidroximetiluracil, N1-carboxietiladenina, N7-carboxietilguanina, etc.

Em clulas deE. coli no adaptadas AlkA responsvel pela retirada de 5 a 10% da 3-meA, entretanto

em clulas adaptadas ela responsvel por 50 a 70% da atividade total.Em S. cerevisiae o gene MAG1 codifica a metil adenina DNA glicosilase Mag1 que semelhana deAlkA remove 3-metilpurinas, 7-metilpurinas, etenoadenina e O2-metilpirimidinas


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Em clulas humanas s foi detectada uma N-metil purina-DNA glicosilase (MPG), que umaprotena de 33 kDa. A enzima de mamferos funcionalmente homloga AlkA deE. coli com relao especificidade de substrato, entretanto ela no tem homologia de sequncia com Tag nem com AlkA,portanto, o nome N-metil purina-DNA glicosilase preferido para a enzima humana. Entretanto, onome no define completamente o espectro de substratos. A enzima remove tambm a leso 8-oxoG(GO), hipoxantina e 1,N6-eteno adenina da mesma maneira que 3-MeA. Os mutantes de E. coli soextremamente sensveis aos efeitos mutagnicos e letais dos agentes alquilantes, entretanto, emmamferos no foi detectada nenhuma doena associada com a deficincia de MPG.

DNA glicosilases com atividade AP liase associada

Em reaes in vitro foi detectada uma associao de eliminao das bases com concomitante quebradas ligaes fosfodister. Foi mostrado que as incises ocorrem por -eliminao no lado 3 do stio AP e foimostrado tambm que esta -eliminao em stios AP pode ser facilitada por algumas protenas bsicas, no sesabendo, entretanto, se elas so verdadeiras enzimas, uma vez que, a quebra por endonucleases envolve umamolcula de gua, ou seja, so endonucleases hidrolticas.

Isto gerou controvrsias acerca das verdadeiras AP endonucleases e sua distino entre protenas queprovocam quebras esprias no DNA.

Qumica e estrutura dos stios AP

Os stios AP existem no DNA como uma mistura de equilbrio contendo cadeia aberta , -aldedoinsaturado, e -hemiacetal e cadeia aberta , -hidrato insaturado. Os aldedos abertos constituem somente1% dos stios AP, mas so os mais reativos. Os stios AP podem reagir quimicamente levando quebra dacadeia na ausncia de protenas.

-eliminao Ocorre de duas maneiras: um prton transferido do grupo CH 2 da desoxirribose para o grupo carbonil do carbono 1 ou uma base de Schiff formada entre uma amina e o grupo C 1 carbonil dacadeia aberta do aldedo. Ambas as reaes so seguidas de -eliminao que deixa 3 ,-aldedo insaturado,

4-hidroxi-2-pentenal e 5PO4, sendo este o mais relevante mecanismo de clivagem nos stios AP.

-eliminao Em certas condies o aldedo insaturado 3 pode sofrer uma reao adicional de deltaeliminao, resultado da liberao de 4-hidroxi-pent-2,4-dienal deixando uma lacuna de um nucleotdeo eterminais 3PO4 e 5PO4.

Rearranjo Em condies alcalinas o aldedo 3, insaturado pode rearranjar-se formando um 32-oxociclopent-1-enil terminal.

Todas as DNA glicosilases que podem hidrolisar as ligaes fosfodister no stio da perda da base ofazem por -eliminao. Portanto, foi sugerido que estas e outras protenas que facilitam a -eliminao nos

stios AP devem ser designadas como AP liases e no AP endonucleases.Na Figura VII-24 esto representadas as reaes descritas acima.

MutY-DNA-glicosilase (no contexto da leso GO) Sistema GO

A MutY-DNA glicosilase uma glicosilase de 36 kDa que catalisa a remoo de adenina,independentemente do estado de metilao do DNA. codificada pelo gene mutY. Clulas deficientes emMutY so hipermutveis, gerando transverses G:C T:A.

O gene foi clonado e gera um polipeptdeo de 39,1 kDa cuja sequncia apresenta homologia com aendonuclease III, produto do gene nth deE. coli.

A protena MutY purificada capaz de remover adenina do DNA contendo A:G ou A:C e temassociada uma atividade 3AP liase.

A protena evita a mutagnese potencial das leses GO (G:C T:A) que escapam do reparo daFpg/MutM, j que esta no reconhece eficientemente GO em frente a A.

Deve ser notado, entretanto, que os mutantes mutY somente conduzem ao aumento de mutaesespontneas G:C T:A presumivelmente porque as MutSLH eliminam C:A e possivelmente G:A, tornando o


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papel de MutY redundante. A MutY a nica glicosilase que funciona na correo de erros de emparelhamentode bases normais.

OH

O

3

5\

OH

OOH

O

3

5\

\

5\

3

~OH

3\

5\

\

3\

5

OH

O

OH

~OH

5\

/

3

\

3\

5

3\

5\

DNA glicosilase ou Perdaespntanea de base

, Eliminao* Eliminao*Hidrlise

AP-endonuclease (classe II)

Figura VII-24 - Mecanismos de inciso de stios AP no DNA

Sistema GO

A leso GO pode parear tanto com C como com A, de modo que o sistema GO est envolvido com aatenuao dos efeitos mutagnicos desses erros de emparelhamento.

A observao de que tanto mutantes fpg/mutMcomo mutYtm aumento da frequncia de transversesG:C T:A levou concluso que eles devem participar de um reparo comum. Em verdade, havia sidomostrado que a protena MutY capaz de catalisar a remoo de A do par A:GO, um substrato que podeaparecer na replicao se existirem leses GO no DNA. Alm disto, a protena MutY permanece ligada aoDNA aps a retirada da A do par A:GO, possivelmente protegendo o stio GO contra o ataque da Fpg, evitandoquebras duplas.

A superexpresso do gene fpg/mutM corrige completamente o fentipo mutante mutY. E o duplomutante mutY mutM tem uma taxa de mutagnese espontnea que 20 vezes maior que a soma das taxas dosdois mutantes isoladamente. Coletivamente estas observaes levaram ao modelo de reparao das leses GO(Figura VII-25).


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VII 26

ReplicaoReplicao

Dano oxidativo

Replicao

Reparo

Reparo

e

Figura VII-25 - Esquema do modelo proposto para eliminao de 8-oxoG do DNA de E.coli: A) 8-oxoG; B) atividade das enzimas MutY e MutM (Fpg) C) atividade fosfatase de

MutT

Se as leses GO forem removidas pela MutM antes da replicao, o reparo efetuado pelo sistema deexciso de bases normal. Se a leso GO no eliminada antes da replicao e a replicao for acurada, entrarcitosina e a Fpg ter outra oportunidade de eliminar a leso. Entretanto a replicao pode levar formao dopar A:GO. A exciso de A pela MutY pode iniciar o processo de exciso da hlice no lesada, o que podeconduzir formao do par C:GO, que , outra vez, sujeito ao da MutM.

Aps a remoo da A pela MutY, o ataque a GO pela Fpg bloqueado pela ligao de MutY ao DNA.Resta saber como o sistema de exciso de bases consegue contornar este obstculo e colocar a base certa.

Um terceiro elemento no sistema GO o gene mutT, cujo produto no uma DNA glicosilase.A inativao de mutT causa um aumento de at 10.000 vezes na mutagnese espontnea gerando

transverses A:T C:G. A protena codificada por mutT pequena (15 kDa), tem uma fraca atividade GTPasetrifosfatase, mas cerca de 1.000 vezes mais ativa sobre a 8-oxo-dGTP (8-oxo-7,8-dihidro-2-dGTP), originadada oxidao de dGTP. Sua ao gera 8-oxo-GMP que no incorporada ao DNA.

A inativao de mutT leva formao de A:GO durante a replicao e, neste caso, a protena MutYconduz mutagnese A:T G:C. Em verdade foi verificado que o duplo mutante mutTmutY menos mutvelespontaneamente que o simples mutante mutT.

Evidentemente a deficincia em protenas MutY, MutT e MutM acarreta alta taxa de mutagneseespontnea, devida simplesmente respirao celular.

O genoma de D. radiodurans codifica mltiplos homlogos de MutT, entretanto o eucarioto S.cerevisiae, no codifica nem MutT nem MutY.

Em seres humanos genes semelhantes a mutY, mutT e fpg/mutM j foram detectados e a nofuncionalidade do genefpg/mutMhumano detectada na maioria dos cnceres de pulmo.

Em clulas humanas o sistema GO atua de maneira semelhante ao descrito paraE. coli, evitandoque GO (que pareia igualmente com A e C) conduza s transverses mutagnicas GCTA e ATCG.Alm disto, o sistema GO em humanos envolve outros sistemas de reparao tais como BER, MMR eNER, como pode ser visto na Figura VII-26.

A protena MTH1 (MTH = MutT Homolog) capaz de degradar 8-oxo-dGTP assim como 8-oxo-dATP e 2 hidroxi-dATP, gerando monofosfatos, que no so incorporados ao DNA. A localizao deMTH1 ubqua, sendo encontrada no ncleo, citosol e mitocndrias, existindo 3 ou 4 variantes (MTHa-d) nas clulas.

Em camundongos Mth-/-

, aumenta muito a quantidade de tumores espontneos, embora astransverses ATCG no sejam observadas nesses camundongos. Entretanto as transverses GCTAaparecem em maior nmero, assim como inseres/delees de 1 base em microssatlites demononucleotdeos.


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VII 28

Camundongos deficientes em Ogg1 e Myh tm predisposio para tumores de pulmo, ovrio etambm para linfomas, o que no ocorre em simples mutantes. Isto sugeriria a substituio de umaprotena pela outra para eliminar 8-oxoG. Foi detectado tambm que isto dependeria do produto do geneCSB atravs de um mecanismo ainda desconhecido.

Dmero de pirimidina-DNA-glicosilase (DP-DNA-glicosilase)

Certos organismos possuem DNA glicosilases com atividades AP liases associadas que reconhecemdmeros de pirimidinas no DNA. A UV-endonuclease deMicrococcus luteus e a UV-endonuclease do fago T4,codificada pelo gene denV, encontrada em bactrias infectadas so exemplos deste tipo de enzimas.

Estas enzimas reconhecem os dmeros e cortam a ligao glicosdica na posio 5' do dmero.Posteriormente, cortam a ligao fosfodister, deixando uma terminao 3'PO4. Esta terminao removidapelas AP endonucleases e a DNA polimerase I e DNA ligase completam a reparao.

A T4-DP-DNA-glicosilase (18 kDa) absolutamente especfica para dmeros de pirimidina. Em suaao AP liase ela deixa sempre terminais 5 (Figura VII-27). A fotorreativao libera timina o que comprova aao DNA glicosilase. A deM. luteus tambm tem 18 kDa e age da mesma maneira.

DP-DNA glicosilase

3 AP liase

Monomerizao do dmero(fotoliase)

Figura VII-27 - Esquema proposto para o mecanismo de eliminao de dmerospela DP-DNA glicosilase do bacterifago T4.

Recentemente um homlogo funcional dessas enzimas foi detectado em Neisseria mucosa, na qual

Nmu-PdgI e II e cortam o DNA contendo diversas leses produzidas por UV assim como alguns tipos de lesesoxidativas, de uma maneira idntica, isto DNA glicosilase com AP liase associada.

interessante salientar que estas endonucleases podem substituir deficincias de exciso em E. coli

assim como em clulas de mamferos, entretanto o DNA do gene denVno hibridiza com o DNA total do M.luteus.

DNA endonuclease III (Timina Glicol DNA glicosilase ou TG-DNA glicosilase)

Esta enzima, designada endonuclease III, foi purificada e mostrou ser uma DNA glicosilase/AP liase(-eliminao) que ataca leses de pirimidinas, mas no os dmeros ou adutos 6-4. Ela recebeu numerosasdesignaes: timina glicol-DNA glicosilase, uria-DNA glicosilase, endonuclease de raios X, endonuclease deraios gama, redoxiendonuclease e simplesmente endonuclease.

Ela capaz de reconhecer resduos de pirimidina tais como: timina glicol, 5,6-dihidrotimina, uria,cido beta-ureidoisobutirico, 5-hidroxi-6-hidrotimina, uracil glicol, 5,6-dihidrouracil e 5-hidroxi-6-hidrouracil,5-hidroxi-2-deoxicitidina e 5-hidroxi-2-deoxiuridina entre outros, como substrato. Recentemente foi reportadoque a endonuclease III tambm ataca resduos de guanina no DNA lesado por agentes oxidantes.

A enzima codificada pelo gene nth (endonuclease three) e tem 23,4 kDa. Ela tem um ncleo Fe-Sque se liga ao DNA, conhecido como dedo de zinco primitivo, e parece ser um novo domnio queaparentemente tambm existe na protena MutY.


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Embora a maioria das bases reparadas pela endonuclease III in vitro seja formada como resultado daradiao ou oxidao, os mutantes nth no so mais sensveis que as cepas selvagens ao perxido de hidrognioou radiao ionizante. Entretanto, a deficincia neste gene emE. coli leva a um grande nmero de mutaesespontneas, mostrando a existncia de leses mutagnicas no reparadas produzidas por agentes endgenos.

Endonuclease VIII

A endonuclease VIII foi purificada em mutantes deficientes em endonuclease III e mostrou umaatividade TG-DNA glicosilase assim como atividade AP liase. O gene (nei) foi isolado e codifica uma protenasimilar endonuclease III, exceto que ela tem atividade , liase em vez de somente . Todos os substratospara endonuclease III so tambm para endonuclease VIII, embora ela contribua com menos de 10% daatividade de reparao e no claro por que aE. coli teria esta enzima redundante.

Culturas de E. coli deficientes em nei e nth so hipersensveis a perxido de hidrognio e radiaesionizantes. Estes duplos mutantes tambm apresentam mutagnese espontnea 20 vezes maior que a cepaselvagem, principalmente transies C T. Isto sugere que a funo biolgica destas enzimas seria o reparodos produtos de desaminao das citosinas oxidadas, que pareiam como timinas.

A endonuclease III humana (NTHL1) tem atividade similar a Nth de E. coli e remove uria eoutras pirimidinas oxidadas. Em camundongos existem pelo menos duas atividades enzimticas comatividade semelhante, o que parece refletir a situao de Nei e Nth emE. coli.

Os produtos gnicos em mamferos com similaridade com Nei e Fpg so designados NEIL1,NEIL2 e NEIL3. Seus substratos preferidos so pirimidinas oxidadas e resduos FaPy, sendo poucoeficientes sobre 8-oxoG. Camundongos com supresso de NEIL1 tornam-se hipersensveis a radiao .

Fpg glicosilase/ Fpg/MutM-DNA-glicosilase /8-hidroxiguanina-DNA glicosilase

A 7-metil-guanina a mais abundante leso produzida por agentes metilantes. Este aduto no letal,mas a metilao pode levar abertura do anel imidazol conduzindo formao de 2,6-diamino-4-hidroxi-5-

(metil) formamidopirimidina (FaPy), que inibe a replicao, podendo ser letal.Em E. coli, a glicosilase Fpg/MutM (formamidopirimidina-DNA- glicosilase ou Fpg glicosilase),codificada pelo gene fpg/mutM elimina esta base lesada, sendo tambm capaz de eliminar a 4,6-diamino-5-formamidopirimidina gerada pela irradiao com raios X ou e por tratamentos com agentes oxidantes como operxido de hidrognio. Estudos subsequentes mostraram que a Fpg e outra enzima (8-hidroxiguaninaendonuclease ou 8-oxoG-DNA glicosilase), que reconhece 8-hidroxiguanina (ou GO) no DNA eram idnticas.

O genefpg/mutMfoi clonado e a protena gerada (31 kDa) s age no DNA em hlice dupla.Os mutantes fpg/mutM, embora no sejam sensveis s radiaes ionizantes ou agentes alquilantes,

demonstram uma taxa um pouco elevada de mutagnese espontnea (transverso G:C T:A).A glicosilase Fpg difere das demais, j que tem uma AP liase classe I associada, que faz ,-eliminao

e uma atividade desoxirribofosfodiesterase (dRPase). Assim, a Fpg mesmo tendo muitas aes no consegueliberar a base, clivar a cadeia e processar os terminais para a sntese de reparao, j que deixa um terminal3PO4, que necessita uma 3diesterase para sua remoo. A ao de Fpg forma uma base de Schiffintermediria, um mecanismo idntico ao descrito para a endonuclease III. O significado biolgico para asatividades AP liase e dRPase associadas FaPy ainda no conhecido.

Alm das leses citadas, recentemente foi mostrado que a Fpg tambm capaz de reconhecer 5-hidroxicitosina, 5-hidroxiuracil e anis imidazol abertos contendo aminofluoreno ou aflatoxina.

Uma das mais abundantes leses induzidas no DNA pelas radiaes ionizantes e estressesoxidativos a 7,8-dihidro-o-oxoguanina (GO). A 8-oxoG-DNA glicosilase foi primeiro identificada emE.

coli como uma atividade que liberava formamido pirimidinas (geradas como produtos secundrios depurinas alquiladas) do DNA. A enzima foi denominada Fpg e o gene fpg/mutMfoi clonado. Mais tardefoi detectado que ela a enzima responsvel pela eliminao de GO no DNA de E. coli e de clulas de

mamferos.Esta leso, a GO, uma fonte importante de mutaes espontneas e a expresso do genefpg/mutMdeE. coli em clulas de mamferos protege-as contra a mutagnese induzida pelos raios X. Istopode explicar porque tanto em procariotos como em eucariotos existem quatro mecanismos para aeliminao de GO: a) Uma 8-oxoGTPase (MTH) (MutT Homolog), que hidrolisa 8-oxodGTP do pool


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de nucleotdeos, gerando 8-oxodGMP, impedindo sua incorporao no DNA; b) A 8-oxoG DNAglicosilase que remove a base oxidada do DNA; c) A metil purina-DNA glicosilase (MPG), que removeGO por ao glicosdica e d) Uma DNA glicosilase, MutY em E. coli e MYH em humanos que remove oresduo adenina do par GO:A.

A leso GO pareia com A em alta frequncia e embora o par GO:C seja um bom substrato paraa DNA glicosilase, o par GO:A no . Alm disto, a DNA glicosilase MYH ajuda a reparao da lesoGO indiretamente, iniciando uma reao de reparo que converte GO:A em GO:C.

A Fpg/MutM deE. coli um monmero de 30 kDa e tem um dedo de zinco, responsvel pelasua afinidade pelo DNA. A enzima libera a base por uma ao glicosdica e ento o stio AP clivado por e -eliminao. A enzima humana tambm libera a base e a desoxirribose em uma reao em duasetapas.

Quando o cDNA do gene MTH expresso em mutantes mutT de E. coli verifica-se aumentosignificativo de atividade 8-oxo-dGTPase, e grande diminuio da mutagnese espontnea, caractersticadestas cepas. A protena codificada tem 156 aminocidos e homologia com a protena MutT de E. coli.

O gene MYH contm 15 introns e 7,1 kb. Os 16 exons codificam uma protena (MYH) de 535aminocidos (65 kDa), com 41% de identidade com a protena MutY deE. coli. O gene humano mapeiano cromossomo 1, entre p32.1 e p34.3.

Em clulas humanas a protena homloga de Fpg foi denominada OGG1, entretanto ela tem

muito pouca homologia com a protena bacteriana. O gene OGG1 foi localizado no cromossomo 3 entrep25 e p26, em uma regio comumente deletada em cnceres de pulmo. Ele pode, possivelmente,funcionar como um gene humano supressor de tumores e a perda parcial ou total das protenas humanasOGG1 pode predispor as clulas para a transformao oncognica, como visto anteriormente.

AP ENDONUCLEASES

Os stios AP podem aparecer espontaneamente pela hidrlise da ligao glicosdica e, em diversosestudos foi sugerido que mais de 25.000 stios AP sejam gerados por dia por clula humana em condiesfisiolgicas normais.

Um mecanismo alternativo para a inciso do DNA durante o reparo por exciso de bases pode ser ahidrlise das ligaes glicosdicas seguida da hidrlise da ligao fosfodister catalisada por uma 5 APendonuclease deixando terminais 3OH e 5PO4, portanto, as AP liases in vivo devem ter um papel secundriona inciso do DNA nos stios AP.

As AP endonucleases clivam as ligaes fosfodister adjacentes aos stios AP. As enzimas da classe Iclivam a ligao 3, e as de classe II clivam a ligao 5 do acar absico. Todas as enzimas de classe Iconhecidas so glicosilases com AP liases associadas. As de classe II no tm AP glicosilases associadas e soas verdadeiras AP endonucleases.

AP endonucleases emE. coli

Exonuclease III

A exonuclease III foi caracterizada como uma 3 5 exonuclease (necessita de terminal 3OH e duplahlice) com uma atividade fosfatase associada.

Alm destas aes ela tambm degrada copolmeros mistos de ribo e deoxiribonucleotdeos, o quecorresponde a uma atividade RNaseH. A exonuclease III tem tambm uma atividade fosfodiesterase queremove resduos 3-fosfoglicolato do DNA. Esta atividade pode tambm remover os resduos aldedo 3 , insaturados gerados aps a -eliminao nos stios AP. Isto pode ser mostrado, pois a exonuclease III podeativar o DNA incisado pela AP liase da endonuclease III para servir de primer-template para a PolI deE. coli.

Alm disto, a enzima tambm tem uma atividade 5 AP endonuclease, que antes de ser caracterizada foidenominada de endonuclease II e tambm endonuclease VI.

A exonuclease III, produto do gene xthA, uma protena de 28 kDa e a atividade endonuclease tem

necessidade absoluta de Mg2+

e inibida em presena de EDTA. A enzima catalisa a hidrlise, em hlice dupla,de stios AP no lado 5 da perda da base deixando terminais 3OH e 5dRPO4.A presena de diversas funes catalticas associadas a uma pequena protena sugere que um nico sitio

ativo catalise todas as reaes enzimticas da exonuclease III, atravs de trs importantes domnios em suaestrutura. Um o stio ativo que catalisa a clivagem das ligaes fosfodister em uma das hlices do DNA. O


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segundo reconhece a estrutura de dupla hlice e o terceiro reconheceria o espao deixado pela base retirada,facilitando a funo AP endonuclease.

O papel biolgico da atividade AP endonuclease da exonuclease III ainda no claro, mas os mutantesxthA so sensveis ao perxido de hidrognio e s radiaes UV longas que produzem leses oxidativas noDNA.

A natureza das leses responsveis por tal fentipo no conhecida, mas, os radicais livres produzidospelo perxido de hidrognio podem gerar quebras simples com terminais 3PO4 e a exonuclease III responsvel por mais de 99% da atividade 3-fosfatase em E. coli. Alm disto, a exonuclease III tambm atacaDNA contendo produtos de fragmentao de timina como resduos de uria, sugerindo que esta enzima tem umpapel no reparo de leses oxidativas.

Mutaes no gene katF (rpoS), tambm resultam em sensibilidade aumentada radiao UV longo eperxido de hidrognio. Este gene codifica o fator sigma () e a sua deficincia elimina a expresso daexonuclease III, sugerindo de o genexthA seja regulado por katF.

Endonuclease IV

A endonuclease IV foi identificada como uma AP endonuclease resistente a EDTA. Entretanto, emausncia do substrato (DNA), a endonuclease IV pode ser inativada por pr-incubao com agentes quelantes

de metais, tais como: EDTA ou 1,10-fenantrolina, sugerindo que a enzima contm um componente metlicoessencial.

Parecida com a atividade da exonuclease III, a endonuclease IV ataca as ligaes fosfodister no lado5 da perda da base, deixando grupos 3OH. Adicionalmente ela tambm pode remover fosfoglicoaldedo, 3-fosfato, desoxirribose-5-fosfato e resduos 4-hidroxi-2-pentenal do terminal 3 do DNA dupla fita. Ela tambmtem uma ao contra resduos de uria. Em verdade, a nica diferena que a exonuclease III tem uma ao 3-exonuclease que no est presente na endonuclease IV.

O gene que codifica a endonuclease IV o nfo (endonuclease four), e a protena tem 31,6 kDa.Os mutantes deficientes em endonuclease IV so sensveis a MMS, mitomicina C e aos agentes

oxidantes tert-butil hidroperxido e bleomicina. Em mutantes duplos nfoxthA a sensibilidade a estes agentes es radiaes ionizantes aumentada. Os mutantes nfo so mais sensveis ao tert-butil hidroperxido e

bleomicina que os mutantesxthA sugerindo que a endonuclease IV pode reconhecer algumas leses que no soreconhecidas pela exonuclease III. Em verdade, recentemente, foi detectado que a bleomicina gera uma lesoespecfica no DNA que requer a endonuclease IV para um reparo eficiente.

Agentes qumicos como paraquat e menadiona, que so reduzidos enzimaticamente in vivo viatransferncia de um eltron e ento autooxidados gerando radicais superxido, induzem aumento de 10 a 20vezes no nvel de endonuclease IV. A endonuclease IV tambm induzida quando as clulas deficientes emsuperxido dismutase so cultivadas em presena de oxignio puro, e esta induo independente do geneoxyR que controla o regulon de estresse oxidativo induzido por perxido.

A endonuclease IV est presente nas clulas em nveis dez vezes menores que a exonuclease III,entretanto chega a nveis equivalentes exonuclease III aps tratamento das clulas com agentes que geramsuperxido ou pelo oxido ntrico, que ativam o regulon SoxRS (Ver adiante).

Na Figura VII-2

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Radiobiologia e Fotobiologia Capitulo Vii