UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX

Florianópolis, maio de 2011

Ms. Karina Bettega Felipe

Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT

1. Princípio

2. Amostra Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar

após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo.

3. Reagentes/soluções/suspensão celular

Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose

suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de

antibióticos penicilina 10.000u/mL e estreptomicina

10.000µg/mL (1%);

Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL

Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de

meio de cultura completo

Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL

4. Procedimento Preparar uma suspensão celular na concentração de

0,5X105 células/mL:

a) Retirar o meio de cultura da garrafa

b) Lavar a garrafa com PBS

c) Adicionar a tripsina

d) Esperar a tripsina reagir

e) Preparo do meio de inativação

f) Inativar a tripsina

g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon

h) Centrifugar as células

i) Retirar meio com tripsina

j) Ressuspender as células em meio simples

k) Contar as células

Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra

Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 104 X 10

l) Preparar suspensão 0,5 X105 células por mL

-200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL

- Contagem de células: 5 X 105 células/mL

-Número de células necessárias:

0,5 X105 células – 1000µl

X - 19200µl

X= 9,6 X105 células

5 X105 células – 1000µl

9,6X105 células- X

X= 1920µl

- Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X105 células?

- Suspensão utilizada para o teste:

- Precisaremos de 19.200µl 1920µl de soro

192µl de antibiótico

1920µl da suspensão celular

15168µl de meio

5 X105 células – 1000µl

0,5 X105 células - X

X= 100µl

100µl (0,5 X105 células) – 1000µl

X - 19200µl

X= 1920

Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço

Preparo da suspensão celular

24h

24, 48 ou 72 h

TRATAMENTO

Retirar o meio de cultura

Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL)

Solução mãe

(1000µg/mL)

100µg/mL

1800µL meio

200µL

50µg/mL

1000µL meio

25µg/mL

1000µL meio

12,5µg/mL

1000µL meio

6,25µg/mL

1000µL meio

3,125µg/mL

1000µL meio

1000µL 1000µL 1000µL

1000µL

1000µL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

100

100

50

50

50

25

25

25100

12,5

12,5

12,5

6,25

6,25

6,25

3,125

3,125

3,125

CTRL

CTRL

CTRL

24h

24, 48 ou 72 h

TRATAMENTO

Retirar o meio de cultura

O que vocês vão fazer!!!

Preparar solução

MTT

2h

5’

540 nm

Adicionar DMSO

Estabilização da cor

Lavar os poços 2X com PBS

Retirar o meio

5’

Preparo da solução de MTT (0,5mg/mL)

a) Preparo da solução estoque a 5mg/mL

- Pesar 5mg de MTT

- Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril.

b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL)

CV=CV

5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL

V= 1mL da solução estoque

+ 9 mL de meio completo

900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio

O que vocês vão fazer!!!

Preparar solução

MTT

2h

5’

540 nm

Adicionar DMSO

Estabilização da cor

Lavar os poços 2X com PBS

Retirar o meio

5’

Cálculos

Descontar o branco !

Fazer a média da absorbância

Considerar o controle como 100% de células viáveis e fazer regra de três para determinar a viabilidade celular das amostras