Universidade Federal de Santa Catarina Cinética Enzimática Estágio de Docência Juliana Ribeiro Mariotto

Universidade Federal de Santa Catarina

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

Estágio de DocênciaJuliana Ribeiro Mariotto

ObjetivosObjetivos

Medir velocidade das transformações;

Estudar a influência das condições de trabalho;

Correlacionar: velocidades fatores;

Otimização do processo;

Critérios para o controle;

Projetar o reator mais adequado.

Influência do SubstratoInfluência do Substrato

Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação;

Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S P;

Velocidade inicial (V0): [S] >> [E] tempo muito curto [S] = constante.


[E] = cte

[S] = V0 linear

[S] = V0

V0 = Vmáx


Alguns casos a V0 não pode ser medida

• Não existe técnica experimental;• Equação química não representa a

transformação;

Velocidade da reação:• Velocidade média de consumo ou produção;• Variação de uma propriedade no sistema.


Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório;

Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)• E combina-se reversivelmente com S ES

k1

E + S ES k-1

• ES se rompe E e P k2

ES E + P


Qualquer instante da reação: E e ES;

[S] = velocidade da reação [S];

Vmáx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima “saturada”;

[S]: estado pré-estacionário ES;• Estado estacionário [ES] = cte;• V0 estado estacionário.

Equação Michaelis-MentenEquação Michaelis-Menten

Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas;

Expressa pela Equação de Michaelis e Menten;

Hipótese: limitante quebra de ES E + P.


Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato;

Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a [S] inicial relacionadas através de Km.

SK

SVV

m

máx

0


Relação numérica: V0

é metade de Vmáx;

km = “afinidade” pelo substrato;

KKmm afinidade afinidade

máxVV 2

10

Vmáx é proporcional à [E].

Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx

Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica;

Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos;

Significado e magnitude de Vmáx e Km varia;

Km: depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.


K2 << K-1 afinidade da enzima;

K2 >> K-1;

K2 e K-1 são comparáveis a Km função complexa;

Vmáx: número de passos da reação e identidade dos passos limitantes.

1

12

k

kkKm


Enzima na saturação: EP e Vmáx = k3.[Et];

Kcat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas;

Kcat e Km = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.

E + S ES EP E + PK1 K2 K3

K-1 K-2

Reação de 1ª OrdemReação de 1ª Ordem

[S] << Km

k = constante de velocidade de 1ª ordem (min-1)

m

máx

K

SVV 0 SkV 0

[S] V0

Fração constante de S P dtS

Sdk

1


Determinar S utilizado ou P formado durante qualquer intervalo de tempo Equação integrada de 1ª ordem.

0

0log3,2 ttkS

S


t1/2 = tempo de “meia vida” tempo necessário para converter em P metade do S presente.

kt

693,02

1

Reação de Ordem ZeroReação de Ordem Zero

[S] >> Km

SSV

V máx0

máxVV 0

Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos

Lineweaver-Burk máxmáx

m

VSV

K

V

111


Método de Hanes S

VV

K

V

S

máxmáx

m 1


Método de Eadie-Scatchard SV

KVV mmáx


Forma integrada

t

SS

KK

V

S

S

t mm

máx 00 1

log3,2


Exemplo:

[S] (g/L) Vo (g/L.h)

0,25 0,78

0,51 1,25

1,03 1,66

2,52 2,19

4,33 2,35

7,25 2,57

0,0

1,0

2,0

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

Vo

(g/L

.h)


Exemplo: Lineweaver-Burk

y = 0,228x + 0,3668

R2 = 0,9991

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 1 2 3 4 5

1/[S] (L/g)

1/V

o (

L.h

/g)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

VSV

K

V

mmáx

m

máxmáx

máxmáx

m

622,0228,0

73,23668,01

Portanto,

3668,01

228,01

111

0

0


Exemplo: Método de Hanes

y = 0,3595x + 0,2419

R2 = 0,9993

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

[S]/

Vo

(h

)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

S

SVV

K

V

S

mmáx

m

máxmáx

máxmáx

m

672,02419,0

78,23595,01

Portanto,

3595,02419,0

1

0

0

Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos

Forma estrutural = substrato competição;

Porcentual de inibição concentrações e afinidade pela enzima.


[S] Vmáx =

Km Experimento • 1º [E], [S] = cte• 2º [E], [I] = cte

1/V0 x 1/[S]


Equação de Michaelis e Menten

Lineweaver-Burk

SKIK

SVV

Im

máx

1

SV

KIK

VV máx

Im

máx

11

11


ISKK

K

V

V

mI

m

I

10

Relação entre as velocidades com e sem inibidor

[S] = influência do [I] desprezível.

Inibidores Não-CompetitivosInibidores Não-Competitivos

Ocupa outro sítio ES, EI e EIS;

[S] = não leva todas as E produtiva;

Vmáx e Km normal.

Inibidores Não-CompetitivosInibidores Não-Competitivos

Equação da velocidade:

Lineweaver-Burk

IIm

máx

K

IS

K

IK

SVV

11

ImáxImáx

m

K

I

VSK

I

V

K

V1

111

1

Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos

Bloqueio de ES;

2 sítios ativos I se fixa no complexo ES;

ESI = não forma P;

Vmáx e Km


Equação da velocidade:

Lineweaver-Burk:

SK

IK

S

KIV

V

I

m

I

máx

1

1

Imáxmáx

m

K

I

VSV

K

V1

111


Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis

Combinam-se com um grupo funcional destruição;

União covalente inibidor e enzima.

Vmáx e Km =


Equação de Michaelis e Menten:

SK

SEIkVV

mmáxI

][3


Lineweaver-Burk: SEIKV

K

EIKVV máx

m

máxI

111

33

Influência do pHInfluência do pH

Valor de pH ótimo = atividade máxima;

Velocidade da reação: pH afasta do ótimo;

Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis;

Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H+.

bHNHCHCHCHCHNHCHCHCHCH

aHCOOCHCOOHCH

2222232222

22


HA A + H+

pH HA A

Aminoácidos:

pH -COO- captam prótons = -COOH; pH -NH3

+ são dissociados = NH2;

Ligação eletrostática = -COO- -- NH3+.

Influência do pHInfluência do pH pH ótimo depende do número e tipo de

grupos ionizáveis estrutura primária;

Variações do pH afeta substrato com grupos ionizáveis;

Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros.


pH 5 e 8 = não afeta a atividade;

Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada;

5 > pH > 8 = inativação irreversível.

Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura

T velocidade de reação = energia cinética;

T muito elevadas = desnaturação da enzima• Rompidas as pontes de hidrogênio

alterações estruturas = nova conformação;• T desnaturação pouco acima da T ótima.


Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor;

Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes;

Substratos protegem a enzima da desnaturação.


K é função da T Lei de Arrhenius

RTekk

0


Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa

Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura

• Velocidade quando a T 10ºC.

10

log3,2 1012 QTTREa

RTekk

'0

'

Regulação da AtividadeRegulação da Atividade

Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente;

Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência;

• Atividade catalítica ou sinais;

Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores.

Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas

Ligação não-covalente e reversível modulador;

Inibição por retroalimentação• Enzima reguladora inibida pelo P final da

via reequilibra as necessidades celulares;

Moduladores: inibidores ou estimuladores.


Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas;

Sítio alostérico específico para o modulador;

Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas.


curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.

Modificação CovalenteModificação Covalente

Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura;

Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibem vias ativas.

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