Universidade Federal de Santa Catarina
Cinética EnzimáticaCinética Enzimática
Estágio de DocênciaJuliana Ribeiro Mariotto
ObjetivosObjetivos
Medir velocidade das transformações;
Estudar a influência das condições de trabalho;
Correlacionar: velocidades fatores;
Otimização do processo;
Critérios para o controle;
Projetar o reator mais adequado.
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação;
Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S P;
Velocidade inicial (V0): [S] >> [E] tempo muito curto [S] = constante.
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
[E] = cte
[S] = V0 linear
[S] = V0
V0 = Vmáx
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Alguns casos a V0 não pode ser medida
• Não existe técnica experimental;• Equação química não representa a
transformação;
Velocidade da reação:• Velocidade média de consumo ou produção;• Variação de uma propriedade no sistema.
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório;
Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)• E combina-se reversivelmente com S ES
k1
E + S ES k-1
• ES se rompe E e P k2
ES E + P
Influência do SubstratoInfluência do Substrato
Qualquer instante da reação: E e ES;
[S] = velocidade da reação [S];
Vmáx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima “saturada”;
[S]: estado pré-estacionário ES;• Estado estacionário [ES] = cte;• V0 estado estacionário.
Equação Michaelis-MentenEquação Michaelis-Menten
Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas;
Expressa pela Equação de Michaelis e Menten;
Hipótese: limitante quebra de ES E + P.
Equação Michaelis-MentenEquação Michaelis-Menten
Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato;
Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a [S] inicial relacionadas através de Km.
SK
SVV
m
máx
0
Equação Michaelis-MentenEquação Michaelis-Menten
Relação numérica: V0
é metade de Vmáx;
km = “afinidade” pelo substrato;
KKmm afinidade afinidade
máxVV 2
10
Vmáx é proporcional à [E].
Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx
Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica;
Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos;
Significado e magnitude de Vmáx e Km varia;
Km: depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.
Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx
K2 << K-1 afinidade da enzima;
K2 >> K-1;
K2 e K-1 são comparáveis a Km função complexa;
Vmáx: número de passos da reação e identidade dos passos limitantes.
1
12
k
kkKm
Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx
Enzima na saturação: EP e Vmáx = k3.[Et];
Kcat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas;
Kcat e Km = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.
E + S ES EP E + PK1 K2 K3
K-1 K-2
Reação de 1ª OrdemReação de 1ª Ordem
[S] << Km
k = constante de velocidade de 1ª ordem (min-1)
m
máx
K
SVV 0 SkV 0
[S] V0
Fração constante de S P dtS
Sdk
1
Reação de 1ª OrdemReação de 1ª Ordem
Determinar S utilizado ou P formado durante qualquer intervalo de tempo Equação integrada de 1ª ordem.
0
0log3,2 ttkS
S
Reação de 1ª OrdemReação de 1ª Ordem
t1/2 = tempo de “meia vida” tempo necessário para converter em P metade do S presente.
kt
693,02
1
Reação de Ordem ZeroReação de Ordem Zero
[S] >> Km
SSV
V máx0
máxVV 0
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Lineweaver-Burk máxmáx
m
VSV
K
V
111
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Método de Hanes S
VV
K
V
S
máxmáx
m 1
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Método de Eadie-Scatchard SV
KVV mmáx
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Forma integrada
t
SS
KK
V
S
S
t mm
máx 00 1
log3,2
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Exemplo:
[S] (g/L) Vo (g/L.h)
0,25 0,78
0,51 1,25
1,03 1,66
2,52 2,19
4,33 2,35
7,25 2,57
0,0
1,0
2,0
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
Vo
(g/L
.h)
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Exemplo: Lineweaver-Burk
y = 0,228x + 0,3668
R2 = 0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[S] (L/g)
1/V
o (
L.h
/g)
L
gK
V
K
hL
gV
V
SV
VSV
K
V
mmáx
m
máxmáx
máxmáx
m
622,0228,0
73,23668,01
Portanto,
3668,01
228,01
111
0
0
Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos
Exemplo: Método de Hanes
y = 0,3595x + 0,2419
R2 = 0,9993
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
[S]/
Vo
(h
)
L
gK
V
K
hL
gV
V
SV
S
SVV
K
V
S
mmáx
m
máxmáx
máxmáx
m
672,02419,0
78,23595,01
Portanto,
3595,02419,0
1
0
0
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
Forma estrutural = substrato competição;
Porcentual de inibição concentrações e afinidade pela enzima.
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
[S] Vmáx =
Km Experimento • 1º [E], [S] = cte• 2º [E], [I] = cte
1/V0 x 1/[S]
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
Equação de Michaelis e Menten
Lineweaver-Burk
SKIK
SVV
Im
máx
1
SV
KIK
VV máx
Im
máx
11
11
Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos
ISKK
K
V
V
mI
m
I
10
Relação entre as velocidades com e sem inibidor
[S] = influência do [I] desprezível.
Inibidores Não-CompetitivosInibidores Não-Competitivos
Ocupa outro sítio ES, EI e EIS;
[S] = não leva todas as E produtiva;
Vmáx e Km normal.
Inibidores Não-CompetitivosInibidores Não-Competitivos
Equação da velocidade:
Lineweaver-Burk
IIm
máx
K
IS
K
IK
SVV
11
ImáxImáx
m
K
I
VSK
I
V
K
V1
111
1
Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos
Bloqueio de ES;
2 sítios ativos I se fixa no complexo ES;
ESI = não forma P;
Vmáx e Km
Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos
Equação da velocidade:
Lineweaver-Burk:
SK
IK
S
KIV
V
I
m
I
máx
1
1
Imáxmáx
m
K
I
VSV
K
V1
111
Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos
Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis
Combinam-se com um grupo funcional destruição;
União covalente inibidor e enzima.
Vmáx e Km =
Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis
Equação de Michaelis e Menten:
SK
SEIkVV
mmáxI
][3
Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis
Lineweaver-Burk: SEIKV
K
EIKVV máx
m
máxI
111
33
Influência do pHInfluência do pH
Valor de pH ótimo = atividade máxima;
Velocidade da reação: pH afasta do ótimo;
Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis;
Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H+.
bHNHCHCHCHCHNHCHCHCHCH
aHCOOCHCOOHCH
2222232222
22
Influência do pHInfluência do pH
HA A + H+
pH HA A
Aminoácidos:
pH -COO- captam prótons = -COOH; pH -NH3
+ são dissociados = NH2;
Ligação eletrostática = -COO- -- NH3+.
Influência do pHInfluência do pH pH ótimo depende do número e tipo de
grupos ionizáveis estrutura primária;
Variações do pH afeta substrato com grupos ionizáveis;
Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros.
Influência do pHInfluência do pH
pH 5 e 8 = não afeta a atividade;
Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada;
5 > pH > 8 = inativação irreversível.
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
T velocidade de reação = energia cinética;
T muito elevadas = desnaturação da enzima• Rompidas as pontes de hidrogênio
alterações estruturas = nova conformação;• T desnaturação pouco acima da T ótima.
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor;
Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes;
Substratos protegem a enzima da desnaturação.
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
K é função da T Lei de Arrhenius
RTekk
0
Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura
Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa
Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura
• Velocidade quando a T 10ºC.
10
log3,2 1012 QTTREa
RTekk
'0
'
Regulação da AtividadeRegulação da Atividade
Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente;
Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência;
• Atividade catalítica ou sinais;
Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores.
Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas
Ligação não-covalente e reversível modulador;
Inibição por retroalimentação• Enzima reguladora inibida pelo P final da
via reequilibra as necessidades celulares;
Moduladores: inibidores ou estimuladores.
Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas
Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas;
Sítio alostérico específico para o modulador;
Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas.
Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas
curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.
Modificação CovalenteModificação Covalente
Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura;
Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibem vias ativas.