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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MARI DALVA STAFFEN
USO DA TÉCNICA MOLECULAR DNA BARCODE NA
IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTITUIÇÕES FRAUDULENTAS DE
PESCADOS COMERCIALIZADOS EM RESTAURANTES DE
CULINÁRIA JAPONESA DE FLORIANÓPOLIS/ SC
FLORIANÓPOLIS
2015
Mari Dalva Staffen
USO DA TÉCNICA MOLECULAR DNA BARCODE NA
IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTITUIÇÕES FRAUDULENTAS DE
PESCADOS COMERCIALIZADOS EM RESTAURANTES DE
CULINÁRIA JAPONESA DE FLORIANÓPOLIS/ SC
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado como requisito para
cumprimento da disciplina TCC II
(BIO7016) do currículo do Curso de
Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa
Catarina
Orientadora: Profª. Drª. Andrea Rita
Marrero
Coorientador: Prof. Dr. Renato
Hajenius Aché de Freitas
Florianópolis
2015
Mari Dalva Staffen
USO DA TÉCNICA MOLECULAR DNA BARCODE NA
IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTITUIÇÕES FRAUDULENTAS DE
PESCADOS COMERCIALIZADOS EM RESTAURANTES DE
CULINÁRIA JAPONESA DE FLORIANÓPOLIS/ SC
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para
o cumprimento da disciplina TCCII (BIO7016) e aprovado em sua
forma final pela Banca Examinadora.
Florianópolis, 26 de junho de 2015.
________________________
Profª Drª Maria Risoleta F. Marques
Coordenadora do Curso de Ciências Biológicas
AGRADECIMENTOS
É difícil transformar em palavras minha eterna gratidão e todo o meu
amor à minha família que sempre me apoiou, ajudou, deu carinho, colo,
atenção, dedicação e toda a base para a minha vida Meus agradecimentos
sinceros aos meus pais, irmãos, sobrinhos por acreditarem e apoiarem na luta
pela realização dos meus sonhos, e aos que não estão mais conosco, irmã,
cunhado e aos avós, a todos com muita saudade. São poucas as coisas na vida
que se consegue sozinho, e as que são conquistadas junto, trazem a satisfação da
realização. Agradeço do fundo do meu coração à minha irmã e melhor amiga,
Clisten, que resolveu enfrentar junto comigo os desafios da graduação, pelo
companheirismo, compreensão, carinho, esforço e toda paciência do mundo em
me incentivar, quando muitas vezes o que eu mais queria era desistir, e por
todos os trabalhos e provas em que viramos a madrugada estudando juntas, sou
eternamente grata.
A minha querida orientadora, Drª Andrea Rita Marrero, por ter me aceito
como membro da família LAPOGE e permitido que eu desenvolvesse uma área
nova no laboratório. Por ser minha orientadora e grande amiga, pela paciência,
pelos valiosos ensinamentos, pelas risadas e lágrimas compartilhadas e por ter
acreditado em mim.
Ao meu corientador Dr. Renato H.A. Freitas, por todo o conhecimento,
carinho, dedicação e pelas nossas animadas saídas para as coletas de amostras.
Ao LAPOGE, às estimadas professoras Drª Ilíada Rainha de Souza e Drª
Yara Costa Netto Muniz, por todo carinho, por estarem sempre dispostas em
ajudar, ensinar e por serem provedoras indispensáveis a todos os alunos do
laboratório. A Drª Sara Löfgren pela atenção e conhecimento. As amigas Leili,
Gabriela e Bibiana pela ajuda e companheirismo, pelas risadas e por todas as
muitas conversas.
Meu muito obrigado a todos os professores que contribuíram para a
minha vida acadêmica e futura profissão, em especial aos que serviram de
exemplo e inspiração.
Aos meus amigos que longe estão e aos novos que aqui conquistei Paula,
Jéssica, Heloisa, Mariana Becker, Aninha, Malva, Dani De Toni, Maurício
Graipel, Cátia Pinto, aos amigos da microbiologia e todos aqueles que
contribuíram cada um de forma única e especial na minha vida durante a
graduação.
Aos membros da banca examinadora, que gentilmente aceitaram
participar e contribuir com este trabalho, meu muito obrigada a Drª Daniela De
Toni, Dr. Geison de Souza Izídio e MSc. Leili Hausmann.
Ao Tiago Frigo pela oportunidade em participar da Operação DNA do
Pescado, através do IGEOF/ PMF.
À Universidade Federal de Santa Catarina e a todos os funcionários que
contribuíram durante todo o período da minha graduação.
Obrigada por tudo!
“... Se enxerguei mais longe foi porque me apoiei
nos ombros de gigantes...”
(Isaac Newton)
RESUMO
O acelerado processo de globalização dos costumes e hábitos
alimentares promove uma rápida difusão de restaurantes de culinária
japonesa, incentivando assim o consumo de peixes in natura. Os
pescados contribuem com ¼ da oferta mundial de proteína animal,
podendo ser peixes selvagens ou criados em cativeiros. Quando ocorre a
remoção das características morfológicas, através da limpeza do pescado
para o consumo, estes são suscetíveis a substituições, intencionais ou
acidentais. Durante o preparo de sushis e sashimis, peixes como salmão,
atum e aqueles utilizados genericamente como peixes brancos estão
sujeitos a fraudes que podem trazer risco para a segurança alimentar.
Este trabalho teve como objetivo a identificação molecular de pescados
comercializados em restaurantes de gastronomia japonesa de
Florianópolis/ SC, com o uso da ferramenta DNA Barcode através do
gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I – COI. Testes foram
realizados para a otimização dos protocolos das extrações de DNA
mitocondrial de tecido muscular de peixes, bem como a necessidade, ou
não, de alguns reagentes no processo para o sequenciamento. Os
melhores resultados foram obtidos com o uso do protocolo de extração
de DNA Salting Out, amplificação com o uso da Taq DNA Polimerase
Platinum e a purificação das amostras. Foram produzidas sequências do
gene COI, para 58 amostras de peixes cru coletadas às cegas, sem o
conhecimento dos proprietários dos restaurantes e outras 21 coletadas
em uma ação de fiscalização em parceria com o IGEOF Instituto de
Geração de Oportunidades de Florianópolis/SC e o PROCON (Órgão de
Proteção e Defesa do Consumidor). As sequências foram comparadas
com os bancos de dados BOLD Systems e GenBank e somente aqueles
que apresentaram similaridade de mais de 98% foram utilizadas. A
ferramenta DNA Barcode permitiu identificar geneticamente 12
espécies e 11 substituições. Estas ocorrências foram relatadas em
pesquisas de diversos países e, na maioria das vezes, caracterizaram
fraude comercial com o objetivo de aumento dos lucros por parte dos
comerciantes. Portanto, os resultados do presente trabalho ratificam a
alta sensibilidade, especificidade e confiabilidade do método DNA
Barcode, como também a extrema importância das parcerias realizadas
entre órgãos públicos e pesquisadores para garantir a transparência,
coibindo fraudes e protegendo os direitos do consumidor.
Palavras-chave: DNA Barcoding, Gastronomia Japonesa, Segurança
Alimentar, Fraudes, Fiscalização.
ABSTRACT
The fast globalization process of customs and eating habits promotes a
quick spread of Japanese cuisine restaurants, thus encouraging fish
consumption in natura. Fish contribute with ¼ of the world's animal
protein, being either wild or raised in captivity. Removal of
morphological characteristics can occur during the cleaning process,
allowing intentional or accidental replacements. During the preparation
of sushi and sashimi, fish such as salmon, tuna and those usually called
white fish can be subjected to frauds, bringing risks to food safety. This
study aimed to identify fish sold in Japanese cuisine restaurants in
Florianópolis/SC molecularly, using a DNA Barcode tool through the
mitochondrial gene Cytochrome Oxidase subunit I - COI. Tests were
conducted to optimize extraction protocols of mitochondrial DNA in the
muscle tissues of fish, as well as to determine if the use of some
reagents were essential to the sequencing process. Best results were
obtained using Salting Out DNA extraction protocol, amplification
using Taq DNA Polymerase Platinum and sample purification. COI
gene sequences were produced for 58 samples of raw fish collected
without the knowledge of restaurants’ owners. Other 21 samples were
collected during enforcement actions in partnership with IGEOF –
Opportunities Generation Institute from Florianópolis/SC and PROCON
(Consumer Protection and Defense Agency). Generated sequences were
compared to sequences deposited in BOLD Systems and GenBank
databases. Only those showing similarity higher than 98% were used.
The DNA Barcode tool allowed genetic identification of 12 species and
11 replacements. These occurrences have been reported in researches
from different countries, most often characterizing commercial fraud
aiming to increase profits by merchants. Therefore, the results found in
this study confirm the high sensitivity, specificity and reliability of the
DNA barcode tool, as well as the extreme importance of partnerships
formed between public agencies and researchers to ensure transparency,
curbing fraud and protecting consumer rights.
Keywords: DNA Barcoding, Japanese Food, Food Security, Fraud,
Inspection.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação do genoma mitocondrial. A seta externa
indica a região do Citocromo Oxidase subunidade I – COI ................. 29
Figura 2 – Comparação dos resultados em gel de agarose, de extração
do DNA segundo os três protocolos testados ...................................... 39
Figura 3 – Comparação dos resultados das amplificações utilizando Taq
DNA Polimerase Platinum e Taq DNA Polimerase ............................ 40
Figura 4 – Semelhanças físicas entre filés de olhete (1) e/ou filés de
atum(2) ............................................................................................. 49
Figura 5 – Comparação de diferentes filés de salmão tratados com
pigmentos carotenóides ...................................................................... 50
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Distribuição das amostras de salmão coletadas em
restaurantes e os resultados após sequenciamento ............................... 44
Gráfico 2 - Distribuição das amostras de atum coletadas em restaurantes
e os resultados após sequenciamento .................................................. 45
Gráfico 3 - Distribuição das amostras de peixe branco coletadas em
restaurantes e os resultados após sequenciamento ............................... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Identificação comparativa considerando o nome declarado das
espécies comercializadas e a espécie identificada por Barcode no BOLD e no
BLAST. Todas as espécies obtiveram níveis de similaridade maior ou igual a
98%, indicando que a amostra testada pertence à espécie identificada
(Identidade 98%), com exceção das espécies cujo Nome popular está marcado
com asterisco (*), onde os valores foram inferiores ao mínimo desejado
(Identidade < 98%) e NI – não identificadas, nas quais não houve associação
entre a sequência e nenhum dos bancos de dados. ...................................... 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BEG Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética
BOLD Barcode of Life Database
CCB Centro de Ciências Biológicas
CN Controle Negativo
COI Citocromo Oxidase subunidade I
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês, desoxyribonucleic acid)
EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético (do inglês,
ethylenediaminetetraacetic acid)
F Forward
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FDA Food and Drug Administration
IgE Imunoglobulina E
IGEOF Instituto de Geração de Oportunidades de Florianópolis/SC
IUCN International Union for Conservation of Nature
LAPOGE Laboratório de Pólimorfismos Genéticos
M Molar
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MIP Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia
mL mililitros
mM Milimolar
MPA Ministério da Pesca e Aquicultura
pb Pares de base
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, polymerase chain
reaction)
pH Potencial Hidrogeniônico
pmol Picomol
PROCON Órgão de Proteção e Defesa do Consumidor
PVC Policloreto de Vinilo
R Reverse
rpm Rotações por minuto
s segundos
SC Santa Catarina
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SP São Paulo
TA Temperatura Ambiente
TBE Tris/ Borate/ EDTA
U Unidade
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
UNESP Universidade Estadual Paulista
UV Ultravioleta
V Volts
X vezes
µL Microlitro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................... 25
2.OBJETIVOS ............................................................................. 31
2.1OBJETIVOS GERAIS ........................................................ 31
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................. 31
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................... 33
3.1 COLETA ........................................................................... 33
3.2 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ............................ 33
3.3 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO POR SALTING OUT 34
3.4 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO POR SALTING OUT
COM BANHO-MARIA ...................................................... 35
3.5 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO POR HOTSHOT ...... 35
3.6 AMPLIFICAÇÃO DOS SEGMENTOS DE DNA ............... 35
3.7 CORRIDA ELETROFORÉTICA DOS SEGMENTOS
AMPLIFICADOS ............................................................... 36
3.8 PURIFICAÇÃO DA AMOSTRAS...................................... 36
3.9 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO ................................. 37
3.10 ANÁLISES DAS SEQUENCIAS OBTIDAS ................... 37
4. RESULTADOS ....................................................................... 39
4.1 OTIMIZAÇÃO DOS PROTOCOLOS ............................... 39
4.2 ESTIMATIVAS DE FRAUDES COMERCIAIS ................ 40
5. DISCUSSÃO ........................................................................... 47
5.1 OTIMIZAÇÃO DOS PROTOCOLOS ............................... 47
5.2 ESTIMATIVAS DE FRAUDES COMERCIAIS ................ 48
6. CONCLUSÃO ......................................................................... 53
REFERÊNCIAS .......................................................................... 55
25
1. INTRODUÇÃO
O mundo tem presenciado um acelerado processo de globalização
dos costumes e hábitos alimentares, aliado a uma mudança no perfil
alimentar da população. A descoberta na década de 1970, de que o
consumo de alimentos ricos em ácidos graxos poli-insaturados reduz o
risco de doenças cardíacas, associado à oferta de pescado e novas
formas de apresentação deste alimento, estão levando a alterações nos
hábitos alimentares e uma maior adesão à culinária oriental, elencando
peixes de águas frias, como a truta, salmão e o atum, considerados as
melhores fontes de ácidos graxos ômega-3 (BEHS, 2011).
A busca por uma dieta saudável contribui para o aumento do
consumo de peixes, recentemente introduzindo na sociedade ocidental, o
hábito de ingerir pescados crus, na forma de sushi (arroz temperado,
envolvendo peixe e vegetais, enrolado em alga) e sashimi (peixes
frescos fatiados em pequenos pedaços servidos com algum tipo de
molho), vem aumentando gradativamente também no Brasil
(VALLANDRO, 2010). Houve uma rápida difusão da culinária japonesa
pela presença de estabelecimentos especializados ou não nesse tipo de
culinária em regiões onde habitualmente não existiam (DOS SANTOS,
2006).
O consumo de peixes in natura leva a uma preocupação dos
órgãos ligados a saúde pública, por ser um produto altamente perecível
que necessita de condições higiênico-sanitário adequadas para seu
preparo e conservação (VIEIRA et al., 2007). Além disso, o preparo dos
pratos dificulta a verificação da autenticidade das espécies que estão
sendo ofertadas.
Associado a isso, o pescado representa uma importante parcela da
dieta diária de muitos países, contribuindo com ¼ da oferta mundial de
proteína de origem animal com importantes características nutricionais
(SANTOS, 2006). Alguns hábitos alimentares e fatores
socioeconômicos influenciam o consumo de pescado: segundo a FAO
(2006) o consumo mundial de peixe por pessoa, foi 16,7Kg e até 2030
este consumo deve aumentar para 20Kg por pessoa por ano.
A segurança alimentar está presente quando todas as pessoas, a
qualquer momento, têm acesso ao alimento, de forma física e
econômico, de maneira suficiente, nutritiva e sadia, atendendo as
necessidades e preferências alimentares, propiciando assim uma vida
saudável e ativa (KURIEN, 2005).
Segundo as várias definições de segurança alimentar, para que ela
ocorra, há a necessidade que existam três fatores: disponibilidade,
26
acesso e qualidade (DOS SANTOS, 2006). É a garantia a alimentos de
boa qualidade nutricional isento de componentes químicos e ou
tecnologias cujos efeitos sobre a saúde sejam desconhecidos,
respeitando os hábitos e a cultura alimentar que fazem parte do
patrimônio cultural das diferentes populações, associados às condições
ambientais e sociais, é necessário um sistema que garanta a produção,
distribuição e consumo dos alimentos no momento presente e para
gerações futuras, sem comprometer a capacidade da disponibilidade
alimentar (MALUF, 1974).
O Brasil é um dos grandes produtores de pescado, sendo de
grande relevância social e econômica para muitos municípios litorâneos,
produzindo em média 1.240.000 toneladas (MPA, 2010). Santa Catarina
é o maior produtor nacional de pescado marinho, representando o maior
polo pesqueiro do Brasil (produção e beneficiamento) (SECRETARIA
DE ESTADO DA AGRICULTURA E DA PESCA/ SC, 2014).
Entretanto, mesmo com este cenário positivo para a pesca, a produção
não está numericamente relacionada ao consumo. Pra citar um exemplo,
a produção de atuns em Itajaí é de aproximadamente 900 toneladas
anuais, mas o atum muitas vezes precisa ser adquirido do Rio Grande do
Norte para suprir o desabastecimento, pois de acordo com o Sindicato da
Indústria da Pesca de Itajaí (SINDIPI, 2012), 90% de tudo o que é
produzido em Santa Catarina é enviado para São Paulo.
Outro peixe muito utilizado em restaurantes de culinária japonesa
é o salmão, o qual o estado precisa importar principalmente do Chile,
para suprir a demanda do consumo. Sendo um peixe migratório nativo
das regiões temperadas e árticas do hemisfério norte, o salmão era
abundante e podia ser facilmente pescado, com a intervenção humana no
meio ambiente houve sensível queda nos estoques de salmão selvagem
do Atlântico na América do Norte, Europa e Báltico. Tem sido sobre
explorado desde o século 19 e em muitas regiões a espécie desapareceu
completamente (SLOW FOOD, 2006). Em virtude disso, a partir da
década de 80, foi iniciada a criação em cativeiro de salmão na costa da
Escócia, na Noruega e no Chile, o que possibilita, segundo Behs (2011),
que o salmão cultivado seja o tipo mais comumente encontrado nos
mercados pesqueiros.
Muitos crustáceos, moluscos e peixes como o salmão, apresentam
coloração característica devido aos pigmentos carotenoides obtidos
através da alimentação (SHAHIDI et al., 1998). Nos salmões a
coloração dos filés é um parâmetro padrão, a aparência avermelhada
contribui para a aceitação e serve como indicador de qualidade
(SIGURGISLADOTTIR et al., 1997).
27
No cultivo de salmões em cativeiro, a adição de pigmentos
carotenoides é a principal forma de manipular o mercado (BJERKENG,
2000), corantes como astaxantina e cantaxantina são adicionados a
alimentação ou durante o processamento dos produtos a base de salmão,
sem afetar seu sabor, determinando a aceitação e o preço do mercado.
Há muita controvérsia sobre o uso dos corantes como aditivos
alimentares: algumas evidências confirmam que a alergia alimentar,
mediada pela IgE (Imunoglobulina E), pode ocorrer após a exposição a
enzimas ou proteínas utilizadas no processamento de alimentos,
comprovando a ideia de que alguns corantes naturais podem apresentar
riscos à saúde, sendo potencial alergênico para asma e reação anafilática
(VOLP et al., 2009). Mas também existem estudos nos quais a
astaxantina, que possui atividade antioxidante, desempenha função na
modulação da peroxidação lipídica, com efeitos benéficos em doenças
crônicas como degeneração macular, câncer e doenças cardiovasculares
(SEABRA & PEDROSA, 2010).
A dificuldade em conseguir os principais pescados utilizados nos
cardápios dos restaurantes japoneses, favorecem as substituições
intencionais ou acidentais no comércio pesqueiro. “Um pedaço de sushi
de atum tem potencial para ser uma espécie em extinção, uma fraude ou
um perigo para a saúde” (LOWENSTEIN et al., 2009).
As semelhanças morfológicas entre as espécies ou a ambiguidade
no nome vernáculo, onde diferentes espécies recebem a mesma
denominação, pode ser a causa das substituições acidentais de pescados
(ARDURA et al., 2010; OCEANA, 2012). As substituições intencionais
são realizadas com o intuito de aumentar a lucratividade, quando
espécies de elevado valor comercial são substituídas por espécies de
baixo valor comercial (SMITH et al., 2008). Como nem sempre é
possível identificar a troca através de uma simples inspeção
morfológica, isso aumenta as chances de fraudes econômicas
(CARVALHO et al., 2008; SMITH et al., 2008).
A identificação correta dos produtos é também necessária por
razões ecológicas devido ao período reprodutivo (defeso), e espécies em
risco de extinção, econômicas e de qualidade do alimento, pois foram
registrados casos onde espécies são substituídas por outras que possuem
potencial risco à saúde humana e a segurança alimentar (JACQUET &
PAULY, 2008; FDA, 2010).
Ações visando coibir a prática de crimes ambientais, bem como
as relações de consumo e falsificação documental foram realizadas em
Itajaí por órgãos como a Polícia Federal, Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento – MAPA (POLÍCIA FEDERAL, 2014) e em
28
Florianópolis pelo IGEOF – Instituto de Geração de Oportunidades de
Florianópolis/SC com participação do PROCON (Órgão de Proteção e
Defesa do Consumidor) (CARVALHO et al., 2014).
A identificação de pescados processados e/ou filetados é
dificultada pela ausência dos caracteres morfológicos e a ocorrência de
substituições é relatada em diversos países como Estados Unidos e
Canadá (WONG & HANNER, 2008), Japão e Coréia (BAKER, 2008),
Itália (BARBUTO et al, 2010) entre outros.
Em 2003 Paul Hebert e colaboradores propuseram um método
promissor na identificação de espécies animais, o Barcode (código de
barras) genético, uma ferramenta sensível e robusta para a autenticação
das identificações. Esta técnica baseia-se num sistema global de
identificação de diferentes taxas, com uso de uma região de 650pb da
porção 5’ do gene mitocondrial COI - Citocromo Oxidase subunidade I
(Figura 1), que codifica parte de uma enzima terminal da cadeia
respiratória da mitocôndria, permitindo a discriminação de diferentes
espécies de maneira robusta, com alta sensibilidade, especificidade e
confiabilidade nos resultados (DE BRITO et al., 2015; WARD et al.,
2005; GALIMBERTI et al., 2013).
No DNA Barcode as sequências do gene funcionam como um
código genômico com quatro nucleotídeos (adenina, timina, citosina e
guanina). A análise da combinação de quinze posições dos quatro
nucleotídeos, criaria um bilhão de códigos únicos. Atualmente são
conhecidas cerca de 15 milhões de espécies, permitindo assim, que cada
táxon seja identificado por apresentar uma sequência única de DNA
(NETO, 2013). Devido a imensa diversidade, a abordagem genômica
representa uma estratégia capaz de identificar as espécies, utilizando um
fragmento de DNA, ampliando e estimulando os estudos de maneira
acurada.
Técnicas baseadas na identificação do DNA são difundidas e
ganham destaque devido à necessidade de pequenas quantidades
amostrais e por permitirem a identificação do produto em condições
diversas como produtos congelados, salgados, processados por
cozimento ou aquecimento.
A vantagem do DNA Barcode é que um grande número de
exemplares pode ser estudado de modo eficiente, pois o genoma
mitocondrial possui características como herança materna, baixo
polimorfismo ancestral, universalmente presente entre os animais, alto
número de cópias por células, além de apresentar taxa de mutação
diferenciada entre as espécies (AZEREDO, 2005).
29
Figura 1: Representação do genoma mitocondrial. A seta externa indica a região
do Citocromo Oxidade subunidade I – COI.
Fonte: Adaptado de chimerasthebooks.blogspot.com
Para o depósito das sequências estudadas e publicadas foi criado
um banco gênico do DNA Barcode, denominado BOLD (Barcode of
Life Database) (RATNASINGHAM & HEBERT, 2007) que permite
associar outros tipos de dados às amostras, como dados taxonômicos,
ponto e data de coleta, entre outras informações. Além disso, as
sequências gênicas são atreladas a um espécime (ou fotos do mesmo,
eventualmente) depositado em coleção científica. Desde a proposta da
utilização do COI por Hebert et al. (2003) como uma ferramenta para a
identificação das espécies animais, este vem sendo utilizado na
identificação de pescado inteiro ou processado, detectando substituições
de espécies intencionais ou acidentais em diferentes etapas da cadeia
produtiva (BARBUTO et al., 2010; CARVALHO et al., 2011;
CARVALHO, et al., 2014). Desta forma surge a necessidade de avaliar a autenticidade dos
pescados, pois após o processamento torna-se difícil a identificação das
espécies por parâmetros morfológicos, uma vez que os produtos
fraudados possuem a aparência de um produto legítimo, genuíno, sem
30
sê-lo, ludibriando o consumidor final. A utilização da ferramenta DNA
Barcode na identificação de peixes comercializados em restaurantes de
culinária japonesa em Florianópolis/SC, para verificar se há
substituições de espécies e consequentemente fraude comercial na venda
destes produtos, além de contribuir para a segurança alimentar, garante
que o direito do consumidor não seja violado ou prejudicado.
31
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Identificar peixes utilizados no preparo de pratos da culinária
japonesa através de DNA Barcode visando a identificação real ou
fraudulenta de espécies de pescados comercializados em restaurantes de
gastronomia japonesa de Florianópolis/ SC.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Padronizar os protocolos de extração de DNA, bem como a
estocagem de amostras para identificar quais os mais adequados
para amostras coletadas em restaurantes;
Estabelecer protocolos operacionais de amplificação gênica
(Reação em Cadeia da Polimerase – PCR) e sequenciamento do
DNA amplificado;
Identificar as espécies de peixes coletadas nos restaurantes de
culinária japonesa;
Diferenciar as espécies presentes nos pontos de coleta com base em
um sistema de “código de barras” Barcode, comparando-os com os
bancos de dados BOLD Systems e GeneBank;
Em caso de substituições, identificar que espécies foram utilizadas.
32
33
3. MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho está vinculado a um projeto maior intitulado “Gato
por Lebre: Identificação Molecular (Barcode) de pescados
comercializados em Santa Catarina”, que vem sendo realizado e
executado na Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) desde
2014.
Todas as amostras de peixes coletadas em restaurantes de
culinária japonesa utilizadas no presente trabalho foram armazenadas no
Laboratório de Polimorfismos Genéticos (LAPOGE), do Departamento
de Biologia Celular, Embriologia e Genética, Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina (BEG-CCB-
UFSC), para identificação e realização de estudos futuros. O projeto
conta ainda com a colaboração do Laboratório de Biologia de Teleósteos
e Elasmobrânquios (LABITEL), do Departamento de Ecologia e
Zoologia da UFSC (ECZ-CCB-UFSC).
3.1 COLETA
As coletas de amostras de peixes em restaurantes de culinária
japonesa foram realizadas em uma primeira campanha entre os meses de
outubro de 2014 a maio de 2015, totalizando 71 amostras coletadas às
cegas (sem o conhecimento dos proprietários dos estabelecimentos) e
em uma segunda campanha realizada no dia 13 de maio de 2015 em
parceria com o PROCON (Departamento de Defesa do Consumidor) e o
Instituto de Geração de oportunidades de Florianópolis (IGEOF),
aumentando 21 amostras coletadas com o conhecimento dos
proprietários dos restaurantes, sendo que os dados gerados resultaram
em um laudo público, e fraudes incidiram em autos de infração emitidos
pelo PROCON Municipal de Florianópolis/ SC.
Dos diferentes peixes crus servidos nos restaurantes (N=92),
foram coletados pequenos fragmentos, sendo os mesmos armazenados
em tubos tipo Eppendorf® 1,5mL contendo álcool 96% (Merck®) e/ou
congelados em freezer armazenados no LAPOGE/UFSC. Das 21
amostras da segunda campanha uma das triplicatas de cada amostra está
sob os cuidados e tutela do IGEOF, caso algum dos estabelecimentos
solicite uma contraprova.
3.2 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras coletadas a partir do tecido muscular dos peixes,
foram fracionadas em pedaços menores de 1cm3 (semelhantes ao
34
tamanho de um grão de arroz), possibilitando assim várias extrações
referentes a uma mesma amostra. Posteriormente, algumas triplicatas
foram armazenadas a -20ºC e outras em tubos com álcool 96%
(Merck®) em temperatura ambiente.
3.3 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO POR SALTING OUT
A extração do DNA genômico seguiu o protocolo da técnica de
Salting Out, descrita por John et al. (1991) e modificada por Lahiri &
Nurnberger (1991). Foram feitas pequenas adaptações no volume de
cada reagente e soluções para as extrações de tecido muscular de peixes.
Também foram feitos testes com a adição de banho-maria para
otimização do protocolo Salting Out e outro protocolo testado foi
HotSHOT descrito por Truett et al., 2000 modificado por Meeker et al.,
2007.
De cada amostra armazenada em álcool foi retirado um pequeno
fragmento que foi seco em papel toalha para evitar a interferência do
álcool nas reações. Posteriormente, foram acrescentados 600µL de
Solução de Lise II (Tris-HCl 0,01M, Amresco®; KCl 0,05M, Vetec®);
MgCl2 0,0025M, (Nuclear®); Nonidet – 1%, (Amresco®); TWEEN 20
– 1%( Amresco®), 20µL de SDS 10% (Amresco®) e 150µL de
Perclorato de Sódio 5M (Vetec®). As amostras foram maceradas com o
auxílio de um pistilo de PVC, tesoura e/ou pinça, obtendo uma mistura
homogênea de minúsculos fragmentos do tecido junto com as soluções.
Posteriormente foram agitadas em um agitador de tubos (Vortex®); em
cada tubo foi acrescentado 260µL de NaCl 6M (Nuclear®) e a seguir, as
amostras foram centrifugadas a 12.000rpm por 5min. a temperatura
ambiente. Novos microtubos de 1,5mL foram identificados e, para estes,
foram transferidos os sobrenadantes resultantes da centrifugação. Ao
sobrenadante foram adicionados 600µL de Álcool Isopropílico Absoluto
(Merck®) e as amostras foram novamente centrifugadas a 12.000rpm
por 15min. a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e ao
precipitado foi acrescentado 600µL de Etanol 70% (Merck®). As
amostras foram centrifugadas a 12.000rpm por 5 min., o sobrenadante
foi descartado e o precipitado foi mantido a temperatura ambiente por
12h para secagem. Após a secagem dos precipitados, foi adicionado a
cada tubo 100µL de água ultrapura Mili-Q® para eluir o DNA e,
posteriormente, as amostras foram armazenadas a -20°C.
Algumas amostras foram quantificadas por espectrofotometria no
aparelho Nano Drop Thermo Scientific® e em seguida foram feitas
alíquotas para solução estoque e solução de uso.
35
3.4 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO POR SALTING OUT COM
BANHO-MARIA
Para este protocolo foram utilizados os mesmos reagentes e
soluções do protocolo Salting Out descritos no item 3.3, adicionando o
uso do banho-maria a 95ºC durante 30min. após a maceração do tecido.
Na sequência são adicionados os demais reagentes e procedimentos
seguindo o protocolo Salting Out.
3.5 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO POR HOTSHOT
O tecido muscular dos peixes foi colocado em microtubos (tipo
Eppendorf®) de 1,5mL contendo 500µL de NaOH 50mM (Nuclear®).
O tecido foi macerado brevemente e levado ao banho-maria a 95ºC
durante 30min. Após este procedimento, os tubos foram refrigerados a
4ºC por 15min., até a amostra estar completamente fria. Na sequência
foi adicionado Tris-HCl 1M (Amresco®) para neutralizar a solução
básica. As amostras foram centrifugadas a 12.000rpm por 15min. Novos
microtubos de 1,5mL foram identificados e nestes foram transferidos os
sobrenadantes resultantes da centrifugação prontos para o uso na PCR.
De 1 a 5µL desta solução foram usados para PCR com volume final de
25µL. As amostras foram armazenadas a -20ºC sem comprometer a sua
eficiência.
3.6 AMPLIFICAÇÃO DOS SEGMENTOS DE DNA
A genotipagem das amostras foi realizada pela amplificação de
sequências-alvo específicas do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I -
COI pela técnica PCR (do inglês Polymerase Chain Reaction),
utilizando oligonucleotídeos iniciadores (primers) que flanqueiam as
regiões gênicas de interesse. Os primers utilizados foram L5698 – Asn F
5' AGG CCT CGA TCC TAC AAA GKT TTA GTT AAC 3' (MIYA &
NISHIDA, 2000) e H7271–COI R 5' GTG GTG GGC TCA TAC AAT
AAA 3’(MELO et al., 2011).
Para a reação de amplificação foram adicionadas as
concentrações mencionadas abaixo em tubos de 0,2mL (tipo
Eppendorf®) e adicionados 1µL de DNA genômico da amostra desejada
totalizando o volume final de 25µL. As amostras foram colocadas em
um termociclador (Termal Cycler, Veriti 96 Well, Applied Biosystems®)
e submetidas a uma desnaturação inicial a 94°C por 3 minutos e, em
seguida, a 35 ciclos de: 94°C por 30s, 56°C por 1 minuto e 72°C por 2
minutos; e um passo de extensão final a 72°C por 5 minutos
(CHIACHIO, 2009).
Material utilizado:
36
1. Água ultrapura Mili-Q®;
2. dNTPs 0,2mM de cada (100mM, Invitrogen®);
3. MgCl2 1,5mM (50mM, Invitrogen®);
4. Tampão de PCR 1X (10X, 0,2M Tris-HCl pH 8,5; 0,5M KCl;
Invitrogen®);
5. Primer Forward (10pmol HLAGR, IDT®);
6. Primer Reverse (10pmol HLAGF, IDT®);
7. Taq DNA Polymerase Platinum 0,5U/µL (5U/ µL; Invitrogen®) e
Taq DNA Polymerase 0,5U/µL (5U/ µL; Invitrogen®).
3.7 CORRIDA ELETROFORÉTICA DOS SEGMENTOS
AMPLIFICADOS
Os produtos da amplificação foram analisados por eletroforese
em gel de agarose em concentração de 1% (95V, 50 minutos). Para o
preparo dos géis foram adicionados 40mL de TBE 0,5X (50mL de TBE
10X; 950mL de água); 0,4g de agarose. Para a corrida eletroforética se
utilizou tampão TBE 0,5X em presença do corante fluorescente
GelRed™. Após a eletroforese o gel foi submetido à luz UV para
visualização da região gênica amplificada, tendo posteriormente suas
imagens capturadas pelo fotodocumentador DNR-Bio-Imaging Systems
MiniBIS PRO® através do software GelCapture©, que foram então
analisadas.
Em toda PCR foi utilizado um controle negativo (CN) com água
ultrapura ao invés de DNA genômico para assegurar a ausência de
contaminação por DNA exógeno durante a reação.
3.8 PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS AMPLIFICADAS
Após análise da amplificação, o produto de PCR foi purificado
com o auxílio da enzima ExoSAP-IT® (Exonuclease I: Recombinant; SAP: Pandalus borealis – USB Corporation). Em microtubos de 0,2µL
adicionou-se 0,5µL de Exo; 0,5µL de SAP; 9µL de produto da PCR
inicial amplificado. As amostras foram colocadas no termociclador
(Termal Cycler, Veriti 96 Well, Applied Biosystems®) e submetidas ao
seguinte programa: 37ºC por 60 minutos; 80ºC por 15min. O produto de
purificação foi analisado em gel de agarose em concentração de 1%
(95V, 30 minutos), utilizando 2µL do produto purificado; em presença
do corante fluorescente GelRed™. Para a corrida eletroforética foi
utilizado tampão TBE 0,5X, sendo que as mesmas concentrações foram
utilizadas para o preparo do gel. Após a eletroforese o gel foi submetido
à luz UV para visualização da região amplificada e purificada, tendo
posteriormente suas imagens capturadas pelo fotodocumentador DNR-
37
Bio-Imaging Systems MiniBIS PRO® através do software GelCapture©,
que foram então analisadas.
3.9 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
Para a reação de PCR foi utilizado 1,0µL de BigDye® Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems®); 1,5µL
de tampão BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction
(Applied Biosystems®); 1,0µL do Primer H7271-COI R e
eventualmente o Primer L5698-Asn F 5pmol/µL; 6,5µL de produto da
PCR inicial purificado aplicado em microplaca para PCR de 96 wells
Axygen®, selado com filme de vedação para microplacas Axygen® e
levada ao termociclador (Termal Cycler, Veriti 96 Well, Applied
Biosystems®) sob o seguinte programa: 96ºC por 2 minutos; 35 ciclos a
96ºC por 30s, 50ºC por 15s, 60ºC por 4 minutos e etapa final a 12ºC.
Para precipitação do DNA foi adicionado 2,5µL de EDTA
125mM Vetec®; 25µL de etanol absoluto Merck® nas amostras. Após a
reação de PCR para sequenciamento, a microplaca foi selada e
homogeneizada por inversão 4X. Levada para a centrífuga de
microplacas modelo 5804R Eppendorf® centrifugada por 45 minutos a
4.000rpm. A seguir o sobrenadante foi descartado, adicionado 150µL de
etanol 70% Merck®, novamente centrifugada por 15 minutos a
4.000rpm, descartado o sobrenadante e centrifugada a placa invertida
sobre papel toalha, e agitadas no spin a 300rpm. Após estes
procedimentos a microplaca foi mantida em temperatura ambiente para
secar (overnight) e/ou em estufa, em local escuro, em seguida foi
encaminhado para o sequenciamento.
As sequências das amostras amplificadas foram obtidas através
da técnica de sequenciamento por capilaridade no sequenciador Modelo
ABI 3130 Applied Biosystems® no Laboratório de Biologia e Genética
de Peixes, Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da
UNESP, campus de Botucatu/ SP, sob os cuidados do Prof. Dr. Claudio
de Oliveira e através da técnica de sequenciamento por capilaridade no
sequenciador Modelo 3500 Series Genetic Analyzer da Applied
Biosystems® no Laboratório de Protozoologia do Departamento de
Microbiologia, Imunologia e Parasitologia da UFSC, campus Trindade,
Florianópolis/ SC, sob cuidados do Prof. Dr. Edmundo Carlos Grisard.
3.10 ANÁLISES DAS SEQUÊNCIAS OBTIDAS
Os cromatogramas resultantes do sequenciamento foram
analisados manualmente e as sequências de DNA revisadas no software
Chromas Lite 2.1.1 Technelysium®. Verificada a qualidade dos picos de
38
sequenciamento manualmente, os arquivos em formato FASTA das
sequências obtidas foram comparados nos bancos gênicos on-line BOLD
Systems (www.boldsystems.org) e Blast® GenBank
(blast.ncbi.nlm.nih.gov) (ALTSCHUL et al., 1997). No Blast® foi
utilizado o programa Nucleotide Blast que pesquisa um banco de dados
de nucleotídeos usando uma consulta de nucleotídeos. No BOLD foi
utilizado o método de pesquisa “Species Level Barcode Records” que
considera as sequências com mais de 98% de similaridade com a
pesquisada e comprimento mínimo da sequência de 500pb.
Os dados gerados foram organizados em uma tabela comparativa,
considerando as informações obtidas nas coletas e no sequenciamento.
Foram consideradas válidas aquelas com índice de similaridade igual ou
superior a 98% em um ou ambos os bancos gênicos.
39
4. RESULTADOS
4.1 OTIMIZAÇÃO DOS PROTOCOLOS
Os três protocolos testados para extração de DNA de peixes
(Salting Out é identificado na figura 2 como Lise II, Salting Out com
banho-maria e HotSHOT) foram comparados para verificar a eficiência
de obtenção de DNA, custo/ benefício e qualidade de extração. A figura
2 mostra a comparação da corrida eletroforética dos segmentos
ampliados utilizando as mesmas condições de PCR para todos.
Figura 2: Comparação dos resultados em gel de agarose, da extração do DNA
segundo os três protocolos testados.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
Dos testes realizados para a extração do DNA mitocondrial das
amostras de peixes, foram utilizados três protocolos, Salting Out, Salting
Out com banho-maria e HotSHOT, dos quais o primeiro é o protocolo
padrão utilizado na extração de DNA no Laboratório de Polimorfismos
40
Genéticos – LAPOGE/UFSC, o segundo foi uma adaptação proposta a
partir da união do método Salting Out com o HotSHOT, adaptando
somente o processo de banho-maria, que foi acrescido no passo do
rompimento celular e liberação do seu conteúdo, e o terceiro HotSHOT,
foi baseado no método para o isolamento de DNA genômico para PCR a
partir de tecido do peixe-zebra ou paulistinha (Danio rerio), no qual o
choque térmico propicia o extravasamento do conteúdo celular. Para
uma boa extração de DNA apenas uma banda íntegra deve aparecer nos
resultados do gel de agarose após a eletroforese, pois rastros podem
indicar degradação de DNA ou excesso de proteínas (PARPINELLI &
RIBEIRO, 2009).
Foram testadas as Taq DNA Polimerase e a Taq DNA Polimerase
Platinum, sendo que esta última apresentou resultados satisfatórios
enquanto que a Taq DNA Polimerase não se mostrou eficiente na
amplificação da região de interesse das amostras testadas (Figura 3).
Figura 3: Comparação dos resultados das amplificações utilizando Taq DNA
Polimerase Platinum e Taq DNA Polimerase.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
4.2 ESTIMATIVAS DE FRAUDES COMERCIAIS
Do total de 92 amostras coletadas em restaurantes, 75 amostras
apresentaram bons resultados na amplificação e purificação, sendo
encaminhadas para o sequenciamento, assim como 4 amostras foram
repetidas sem purificação, totalizando 79 amostras sequenciadas (Tabela
1).
41
Tabela 1: Identificação comparativa considerando o nome declarado das espécies comercializadas e a espécie identificada por
Barcode no BOLD e no BLAST. Todas as espécies obtiveram níveis de similaridade maior ou igual a 98%, indicando que a
amostra testada pertence à espécie identificada (Identidade 98%), com exceção das espécies cujo Nome popular está marcado
com asterisco (*), onde os valores foram inferiores ao mínimo desejado (Identidade < 98%) e NI – não identificadas, nas quais
não houve associação entre a sequência e nenhum dos bancos de dados.
ID Nome popular Espécie atribuída1 Espécie BOLD2 Espécie BLAST2 Nome popular3
RES001 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES002 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES003 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES004 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus sp. Atum RES005 Atum Thunnus sp. Seriola lalandi Seriola lalandi Olhete RES006 Atum Thunnus sp. No match Seriola lalandi Olhete * RES007 Atum Thunnus sp. Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Escolar-preto RES008 Atum Thunnus sp. Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Escolar-preto RES009 Atum Thunnus sp. Seriola zonata Seriola lalandi Olhete RES010 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES011 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus tonggol Atum RES012 Atum Thunnus sp. Salmo salar Salmo salar Salmão RES013 Atum Thunnus sp. Thunnus alalunga Thunnus alalunga/ T. orientalis Atum RES014 Atum Thunnus sp. Salmo salar Salmo salar Salmão RES015 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES016 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES017 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES018 Atum Thunnus sp. Thunnus obesus Thunnus obesus Atum RES019 Dourado Coryphaena hippurus Coryphaena hippurus No significant similarity found. Dourado RES020 Espada Trichiurus lepturus Xiphias gladius NI Espadarte RES021 Linguado Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Linguado RES022 Linguado Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Paralichthys orbignyanus Linguado RES023 Olhete Seriola sp. No match Lepidocybium flavobrunneum Escolar-preto* RES024 Olhete Seriola sp. Seriola lalandi Seriola lalandi Olhete
42
RES025 Olhete Seriola sp. Seriola zonata Seriola zonata Olhete RES026 Peixe Branco - Salmo salar Salmo salar Salmão RES027 Peixe Branco - Seriola zonata Seriola lalandi Olhete RES028 Peixe Branco - Salmo salar Salmo salar Salmão RES029 Peixe Branco - No match Thunnus sp Atum* RES030 Peixe Branco - Seriola zonata Seriola lalandi Olhete RES031 Peixe Branco - No match Salmo salar Salmão* RES032 Peixe Branco - Salmo salar Salmo salar Salmão RES033 Peixe Branco - Oreochromis sp. Oreochromis niloticus Tilápia do Nilo RES034 Peixe Branco - Coryphaena hippurus NI Dourado RES035 Peixe Branco - Coryphaena hippurus NI Dourado RES036 Prego Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Lepidocybium flavobrunneum Peixe prego RES037 Prego Echinorhinus brucus Ruvettus pretiosus NI Anchova negra RES038 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES039 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES040 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES041 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES042 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES043 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES044 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES045 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES046 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES047 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES048 Salmão Salmo salar Seriola zonata Seriola zonata Olhete RES049 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES050 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES051 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES052 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES053 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES054 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES055 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES056 Salmão Salmo salar No match Salmo salar Salmão*
43
RES057 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES058 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES059 Salmão Salmo salar no match Oncorhynchus kisutch Salmão-prateado* RES060 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES061 Salmão Salmo salar No match Salmo salar Salmão* RES062 Salmão Salmo salar No match No match NI RES063 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES064 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES065 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES066 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES067 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES068 Salmão Salmo salar Thunnus alalunga Thunnus alalunga Atum RES069 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES070 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES071 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo trutta Salmão RES072 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES073 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES074 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES075 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES076 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES077 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES078 Salmão Salmo salar Salmo salar Salmo salar Salmão RES079 Tilápia Oreochromis niloticus Oreochromis sp. Oreochromis sp. Tilápia vermelha Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
1. Nome popular e científico, respectivamente da amostra conforme obtido no momento da coleta; A ausência de nome científico indica que pode
tratar-se de uma variedade de espécies.
2. Nome científico da espécie cujas sequências depositadas nos bancos de dados retornaram a maior similaridade com a sequência obtida na
análise.
3. Nome popular atribuído à espécie identificada na análise, de acordo com o banco de dados FISHBASE (www.fishbase.org) e identificação
taxonômica de especialista.
44
Em todos os casos durante a comparação das sequências obtidas
com as sequências dos bancos de dados BOLD e GenBank foi adotado o
critério do BOLD para identificação das amostras em nível específico, o
qual considera no máximo 2% de divergência genética.
A identificação por DNA Barcode indicou que, entre as amostras
sequenciadas de salmão, grupo com maior amostragem (n=41), foram
identificadas as espécies Salmo salar – salmão (n=35), Seriola zonata –
olhete (n=1) e Thunnus alalunga – atum (n=1) e 4 não apresentaram
resultados quando comparadas aos bancos de dados (Gráfico 1).
Gráfico 1: Distribuição das amostras de salmão coletadas em restaurantes e os
resultados após sequenciamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
As amostras de Thunnus sp. – Atum (n=18), apenas 11 foram
identificadas sem substituições sendo que as demais não eram
correspondentes com a espécie comercializada, sendo substituídas por:
Seriola. lalandi (n=2), Lepidocybium flavobrunneum – peixe-prego
(n=2) e S. salar (n=2), totalizando 6 substituições. Uma amostra não
apresentou resultados quando comparado aos bancos de dados (Gráfico
2).
41 Amostras de Salmão
Salmões nãofraudados
Fraudes
No match
45
Gráfico 2: Distribuição das amostras de atum coletadas em restaurantes e os
resultados após sequenciamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
Para o grupo genericamente identificado como Peixe Branco
(n=20) foram detectadas 3 substituições, todas por S. salar (Gráfico 3).
Gráfico 3: Distribuição das amostras de peixe branco coletadas em restaurantes
e os resultados após sequenciamento.
Fonte: Elaborado pela autora, 2015.
18 Amostras de Atum
Atuns nãofraudados
Fraudes
No match
20 Amostras de Peixes Branco
Peixes Branconão fraudados
Fraudes
No match
46
47
5. DISCUSSÃO
5.1 OTIMIZAÇÃO DOS PROTOCOLOS
Para a realização da maioria das metodologias de biologia
molecular, o primeiro passo é a extração dos ácidos nucleicos (DNA e
RNA), obtidos a partir de vários tipos de tecidos e células. A definição
do melhor protocolo de extração de DNA dependerá de diversos fatores
como, o tipo de tecido, o grau de integridade e pureza do DNA para a
PCR, sequenciamento, clonagem ou outra utilização do mesmo
(GOUVEIA & REGITANO, 2007).
Comparando os três métodos (Salting Out, HotShot e Salting Out
com banho maria), verificou-se que os protocolos utilizados possuem
validade para a extração de DNA mitocondrial de peixes, demostrando
assim a eficiência dos mesmos. Apenas o protocolo Salting Out com
banho-maria apresentou alguns rastros devido a maior concentração
proteica, porém levando em consideração o número de amostras que
apresentaram resultados positivos e avaliando o tempo gasto para a
execução dos protocolos. No presente trabalho foi adotado o protocolo
Salting Out, que apresentou os melhores resultados nos testes, e foi
usado para as extrações das amostras subsequentes. Outros trabalhos
testaram os protocolos de Fenol-Clorofórmio, Cloreto de Sódio e
Acetato de Amômia (GARCIA et al., 2010). Parpinelli e Ribeiro (2009)
analisaram três protocolos de extração de DNA (Fenol-Clorofórmio,
NaCl e Brometo de Cetiltrimetilamônio – CTAB) e verificaram que os
melhores resultados para o método de extração através do protocolo
Fenol-Clorofórmio. Halfen et al. (2012) também realizou testes para a
obtenção do DNA genômico utilizando os protocolos descritos por
Bardakci & Skibinski (1994), cuja as otimizações tornaram a técnica
menos laboriosa e mais econômica, bem como os protocolos descritos
por Miller et al. (1988) e Wasko et al. (2003), cuja a combinação entre
as três técnicas preserva a integridade do DNA diminuindo o uso de
substâncias agressivas.
Para a Reação da Polimerase em Cadeia – PCR foram testadas a
Taq DNA Polimerase e a Taq DNA Polimerase Platinum, enzimas
termoestáveis, utilizadas na amplificação de fragmentos de DNA,
suportando elevadas temperaturas. É importante assegurar a atividade da
polimerase durante as condições operacionais, a taxa de extensão
depende fortemente dos meios de reação e do DNA-molde. Outra
característica necessária é que a DNA Polimerase não se dissocie do
DNA quando translocada para outra posição: DNA polimerases
eficientes possuem alta fidelidade, inserindo o nucleotídeo correto à fita
48
em extensão (LUDWIG, 2010; PAVLOV et al., 2004). Para este
trabalho os resultados revelaram maior fidelidade na incorporação dos
nucleotídeos com o uso da Taq DNA Polimerase Platinum, composta
por anticorpos específicos que inibem a atividade da polimerase em
temperatura ambiente. Esta polimerase só é ativada durante o início da
PCR a 94ºC (lifetechnologies.com), possibilitando a amplificação da
região gênica de interesse com bons resultados quando comparado com
a Taq DNA Polimerase. Com relação à necessidade ou não de
purificação do DNA isolado (remoção de proteínas, polissacarídeos e
outros contaminantes da amostra), os resultados evidenciaram que este
procedimento é essencial para a manutenção da qualidade, para que as
impurezas não interfiram, garantindo assim a qualidade das sequências
produzidas. Segundo Figueiredo et al., (2003) a purificação representa
2% do valor total de uma placa sequenciada, sendo assim um passo
indispensável para produzir sequencias com qualidade, além de
promover a preservação dos capilares do sequenciador automático do
DNA.
5.2 ESTIMATIVAS DE FRAUDES COMERCIAIS
Adotando o critério do BOLD, de que indivíduos da mesma
espécie apresentam no máximo 2% de divergência em suas sequências
(RATNASINGHAM & HEBERT, 2007), comparando o resultado do
banco de dados obtido com aqueles do BOLD e GenBank, 7 amostras
apresentaram inconsistências.
As pescarias oceânicas de grandes peixes pelágicos apresentam
elevada importância econômica e social, os peixes capturados alcançam
altos preços no mercado internacional, sendo muito explorados. Várias
espécies (Thunnus albacares, T. atlanticus, T. obesus e T. orientalis) são
vendidas pelo nome popular de atum enão se caracteriza como fraude
(NETO, 2013). Entretanto, como citado neste trabalho, de todo o atum
produzido em Santa Catarina, 90% é enviado para São Paulo (SINDIPI,
2012), o que provoca baixa disponibilidade de atuns no mercado
catarinense. Este fato possibilita substituições quando os peixes não são
vendidos inteiros ou muitas vezes são previamente manipulados com a
utilização de corantes. As espécies comercializadas como atum que
neste trabalho foram detectadas substituições são: S. salar, L.
flavobrunneum e Seriola sp..
Autores relataram casos de substituições de atum por peixe-
prego, porém como este nome popular é utilizado para pelo menos duas
espécies (L. flavobrunneum e Ruvettus pretiosus) em alguns países é
proibida a comercialização de ambos devido à constatação de problemas
49
relacionados à segurança alimentar (FOOD SAFETY, 2011;
FELDMAN et al., 2004). O peixe olhete apresenta um filé de coloração
semelhante ao atum (Figura 4), porém seu preço de mercado é bem mais
acessível o que justifica as fraudes na intenção de um ganho financeiro
ilícito. Por outro lado, a substituição por salmão ocorre devido à adição
de corantes junto à ração dos peixes criados em cativeiro (BJERKENG,
2000), a qual pode enganar o consumidor final.
Figura 4: Semelhanças físicas entre filés de olhete (1) e/ou filés de atum (2).
Fontes: sushialacarte.com.br e gourmetsan.com.br
O salmão é um peixe de alto valor comercial, o que facilita as
substituições fraudulentas no comércio de pescados, principalmente
devido à falta de rigor na fiscalização (NETO, 2013). No presente
estudo foi verificada uma substituição por peixe de menor valor
comercial, no caso o olhete. Intrigantemente verificou-se também
substituição por um peixe de valor comercial maior ou semelhante, no
caso o atum. Estas substituições podem ocorrer quando peixes filetados
recebem a adição de corantes, ou com o uso de rações enriquecidas com
corantes, mascarando assim sua verdadeira identificação (BEHS, 2011).
Peixes de águas frias, como o atum e o salmão, são as melhores
fontes de ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 (BEHS, 2011), quando
estes são substituídos por outras espécies, o consumidor é enganado e o
seu direito ao acesso à alimentos de qualidade é negado.
Nos restaurantes de culinária japonesa, muitos peixes são
chamados genericamente de “peixe branco”, podendo ser peixe-prego,
olhete, robalo, tilápia, dourado, espada, linguado, entre outros. Com a
remoção de caracteres morfológicos de peixes processados, isso
inviabiliza a correta identificação dos mesmos. Outro problema é o uso
do mesmo nome popular para muitas espécies, como por exemplo, L.
flavobrunneum e R. pretiosus que em muitas regiões são conhecidos
como peixe-prego, o que causa preocupação, pois a utilização do mesmo
nome popular dificulta a correta identificação das espécies (ARDURA
et al., 2010; CAWTHORN et al., 2012), podendo ocasionar danos à
saúde humana.
1 2
50
Também há espécies que, devido a sua morfologia semelhante,
são identificados no momento da captura de maneira errônea como por
exemplo o peixe-espada – Trichiurus lepturus e o espadarte – Xiphias gladius que, ocasionalmente, é chamado de peixe-espada, porém ambos
são considerados como peixes-de-bico e são pescados da mesma
maneira que os atuns (OLAVO et al., 2005; ENCICLOPÉDIA
ESCOLAR BRITANNICA, 2015).
Carvalho et al., 2014 mostraram que em Florianópolis ocorreram
substituições na comercialização de peixes considerados nobres por
outros de menor valor. Outros trabalhos no Brasil e exterior também
demostraram este tipo de substituição (CARVALHO et al., 2011;
WONG & HANNER, 2008; FILONZI et al., 2010). O que chamou a
atenção no presente trabalho foi a identificação de peixes brancos
identificados como salmão: uma vez que esta espécie é criada em
cativeiro muitas vezes os corantes não são adicionados a dieta alimentar
dos mesmos ou quando é, a absorção é diferenciada entre os indivíduos
(ARGENTA, 2007) (Figura 5). Isso resulta na carne branca de alguns
salmões os quais são vendidos como peixe branco, facilitando assim
substituições fraudulentas, porém não fazendo sentido financeiro aos
comerciantes.
Figura 5: Comparação de diferentes filés de salmão tratados com pigmentos
carotenóides.
Fonte: ARGENTA (2007).
A imprecisão na identificação das espécies ou o uso exclusivo das
características morfológicas, pode significar limitações na identificação,
principalmente quando há apenas um fragmento de uma espécie
(RIBEIRO et al., 2012). Vários autores, norte americanos, canadenses,
italianos, entre outros, relataram substituições quando analisaram várias
espécies de peixes (BAKER, 2008; WONG & HANNER, 2008;
LOWENSTEIN et al., 2009; LOWENSTEIN et al., 2010; FILONZI et
al., 2010; CAWTHORN et al., 2012). No Brasil o caso mais conhecido é
o que descreve substituições em Surubins (Pseudoplatystoma sp.),
descrito por Carvalho et al. (2011). Em Florianópolis foram detectadas
substituições em bacalhau, congrio rosa comercializados em
51
supermercados e linguados servidos em restaurantes (CARVALHO et
al., 2014).
A técnica do DNA Barcode é suficiente para a identificação de
espécies de peixes (HEBERT et al., 2003, 2004; SMITH et al., 2008) e
os resultados do presente estudo reforçam a eficiência da técnica,
demonstrando assim a necessidade de mecanismos regulatórios que
auxiliem a reduzir práticas ilícitas de substituições de espécies. Os
consumidores precisam de informações claras e precisas na hora de
fazer as escolhas alimentares, a identificação dos peixes deve ser
autêntica e não enganosa (LOBO et al., 2014), permitindo que os
consumidores não sejam lesados por essa prática e façam escolhas
conscientes.
52
53
6. CONCLUSÃO
As técnicas usadas nos protocolos de extração de DNA foram
otimizadas, sendo o método de extração de DNA Salting Out, juntamente com o uso da Taq DNA Polimerase Platinum e a purificação
das amostras as técnicas que apresentaram os melhores resultados.
O presente trabalho corrobora a eficiência do DNA Barcode na
identificação de peixes. As comparações das sequências das amostras
coletadas em restaurantes de culinária japonesa com os bancos de dados
BOLD Systems e GenBank demonstram alta sensibilidade,
especificidade e confiabilidade nos resultados.
O peixe com maior evidência de substituições fraudulentas em
restaurantes de culinária japonesa de Florianópolis foi o atum.
Devido à presença de substituições e a popularização dos
restaurantes de culinária japonesa, são necessários mecanismos
regulatórios e o desenvolvimento de estratégias para autenticar a
identificação das espécies comercializadas, sendo o DNA Barcode uma
opção confiável baseada em resultados científicos.
É de extrema importância efetivar parcerias realizadas entre
órgãos de fiscalização e instituições de ensino para coibir as práticas
ilícitas, reduzindo a taxa de fraude, garantindo assim a transparência no
comércio de produtos de peixe, para que o consumidor não seja lesado.
54
55
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