UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ … · transformou de diversas maneiras e me mostrou que sempre podemos ser melhores, atentos a necessidade do outro, e que bondade,

Maria Jaciara Ferreira Trindade

Estudo do potencial de produção da amilase de Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 utilizando amido bruto de mandioca

Divinópolis / MG

Agosto / 2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Maria Jaciara Ferreira Trindade

Estudo do potencial de produção da amilase de Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 utilizando amido bruto de mandioca

Orientador: Dr. Alexsandro Sobreira Galdino

Co-orientador: Dr. Ronaldo Alves Pinto Nagem

Divinópolis / MG

Agosto / 2016

Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ii

iii

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“Toma as tuas precauções, mas conserva a calma e não tenhas

medo nem vacile o teu coração,

O Senhor batalhará por vós.”

Isaías 7:4; Êxodo 14:14

v

A Deus, meu fiel companheiro. Aos meus Pais, Domingos e Maria da Conceição.

Aos meus irmãos, Sandra, Leonardo e Ronaldo e aos meus sobrinhos,

Miguel, Sophia, Maria Alice, Júlia e aos que aumentarão esta lista.

Vocês são a parte mais importante da minha vida.

vi

AGRADECIMENTOS

“Quem caminha sozinho pode até chegar mais rápido, mas aquele que vai acompanhado, com certeza chegará mais longe” (Érico Veríssimo).

A caminhada até aqui não foi fácil, principalmente pela distância, pela saudade,

pelas incertezas de um caminho desafiador. Na verdade, vejo a conclusão do

mestrado como o resultado mais visível do poder que há na Fé, no Amor e na

Amizade. Assim, rumo ao final desta história, dedico aqui algumas palavras àqueles

que direta ou indiretamente dela fazem parte.

Primeiramente, agradeço à Deus, meu companheiro fiel e protetor, por orientar

meus caminhos feitos de lutas e incertezas, mas também de esperanças e sonhos,

toda honra e toda glória.

Um agradecimento repleto de amor eu reservo aos meus Pais: Domingos

Trindade e Maria da Conceição, como é difícil traduzir em palavras tamanha gratidão...

Obrigada por acreditarem em mim, essa conquista é muito mais de vocês do que

minha. Amo vocês infinitamente!

À minha irmã Sandra, aos meus irmãos, Leonardo e Ronaldo, as minhas

cunhadas Tais e Mariana e ao meu cunhado Gil, obrigada por torcerem por mim, vocês

não fazem ideia do quanto são importantes em minha vida.

À Suelen, minha grande amiga, eu serei eternamente grata. A sua atitude me

transformou de diversas maneiras e me mostrou que sempre podemos ser melhores,

atentos a necessidade do outro, e que bondade, generosidade e solidariedade nos

edificam.

De forma muito especial agradeço a Aline Dias, por ser a amiga de todas as

horas, por me ajudar em tudo, por todas as orações e carinho. Minha amiga, você

estará sempre no meu coração, eu te amo muito!

À Laís Nogueira, por dividir todos os momentos comigo, esses dois anos tão

difíceis teriam sido insuportáveis sem a sua amizade, a sua companhia e

generosidade. Você é uma amiga muito especial, um cuidado de Deus comigo.

Agradeço a todos os amigos do Grupo de Oração Universitário (GOU), por

estarem sempre comigo e por serem meu apoio.

À Nathália Maria, Crhis e Jéssica Tauany, minhas grandes amigas, obrigada

por tudo, Amo vocês!

Ao Lusenir, pelas orações, pela torcida e pelo carinho.

vii

À todos do Grupo Labiom, pela amizade, por todo aprendizado, por tornarem a

rotina do laboratório mais alegre, muito obrigada! À Sára, Arthur e Wellington, pelos

sorrisos, companheirismo e por compartilhar alegrias e dificuldades. Vocês moram no

meu coração.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Alexsandro, pela grande oportunidade, pela

paciência com os resultados negativos e por me ensinar que eles são, na verdade,

uma oportunidade. Agradeço pela generosidade, por contribuir para minha formação

pessoal e acadêmica, meus sinceros agradecimentos. Serei sempre grata por tudo.

Ao co-orientador Prof. Dr. Ronaldo Nagem, pela disponibilidade em contribuir

com este trabalho.

À Profa. Dra. Letícia Fernandes de Oliveira, por aceitar o convite para a banca,

por sua disposição em ajudar e por todo o conhecimento passado desde a graduação.

Você contribuiu muito para a minha formação, muito obrigada.

À Profa. Dra. Raquel Cadete, o meu agradecimento por toda contribuição neste

trabalho e por gentilmente aceitar fazer parte da banca examinadora.

Ao Prof. Dr. Daniel Bonoto, agradeço pelos ensinamentos, por sempre atender

as minhas dúvidas, pela valiosa contribuição neste trabalho e por todo conhecimento

passado desde o primeiro período da graduação até a participação na avaliação deste

trabalho.

Ao Programa Multicêntrico em Bioquímica e Biologia Molecular, pela

oportunidade.

À Universidade Federal de São João del Rei e aos órgãos de fomento:

FAPEMIG, CAPES, CNPq, que possibilitaram a execução dos experimentos.

A todos que de alguma maneira colaboraram para a realização deste trabalho.

viii

RESUMO

As amilases apresentam grande importância biotecnológica e ampla aplicação

industrial. Portanto, existe uma demanda crescente por novas fontes desta enzima.

Os objetivos deste trabalho foram identificar a levedura amilolítica isolada, estudar o

potencial de produção da amilase e maximizar a produção por métodos estatísticos.

A levedura isolada de folhas da árvore Paineira (Ceiba speciosa) foi identificada por

meio do sequenciamento dos domínios D1/D2 da subunidade maior do gene do RNAr

como Cryptococcus laurentii. A levedura foi capaz de crescer e produzir amilase

quando cultivada em meio contendo amido bruto de mandioca como única fonte de

carbono, e a produção amilolítica máxima foi 3,85 (U/mL). Diante da demanda em

otimizar o processo de produção da amilase, adotou-se como estratégia a

Metodologia de Superfície de Resposta. Os fatores de maior influência sobre a

produção amilolítica foram as concentrações de amido bruto de mandioca, peptona e

extrato de levedura, e os parâmetros temperatura de incubação e pH inicial. As

condições de cultivo nas quais se obtém a maior produção da amilase foram

estimadas: amido bruto de mandioca 4,00%, peptona 1,50% e extrato de levedura

1,71% combinadas a pH inicial de 6.68 e temperatura de incubação de 22,00 °C.

Nestas condições, a atividade amilolítica máxima alcançou 12,90 U/mL,

representando um aumento de 167% na produção da amilase. A análise das proteínas

secretadas revelou a presença de uma única banda com atividade amilolítica, com

massa molecular de aproximadamente 67,0 kDa. Os resultados revelam o potencial

biotecnológico da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 e abre

perspectiva para estudos subsequentes que visem a otimização do processamento

enzimático do amido.

Palavras chaves: Cryptococcus laurentii, amilase, Metodologia de Superfície de

Resposta.

ix

ABSTRACT

Amylases show great biotechnological importance and broad industrial application.

Therefore, there is a growing demand for new sources of this enzyme. The objectives

of this study were to identify the isolated amylolytic yeast, to study the potential for

production of amylase and maximize the production by statistical methods. The yeast

isolated from leaves of the tree Paineira (Ceiba speciosa) was identified by sequencing

the domains D1 / D2 of the large subunit rRNA gene as Cryptococcus laurentii. The

yeast was able to grow and produce amylase when cultured in media containing raw

cassava starch as sole carbon source, and maximum amylolytic production was 3.85

(U / ml). Given the demand to optimize the amylase production process, we adopted a

strategy of Response Surface Methodology. It was found that the most influential

factors on the amylolytic production were the raw concentrations of cassava starch,

peptone and yeast extract, and the parameters incubation temperature parameters

and initial pH. The cultivation conditions under which we obtained the highest

production of amylase were estimated as: raw cassava starch 4.00%, peptone 1.50%,

yeast extract 1.71% combined with initial pH 6.68 and incubation temperature of 22°C.

Under these conditions, the maximum amylolytic activity was 12.90 U / mL,

representing an increase of 167% in the production of amylase. Analysis of secreted

proteins revealed the presence of a single band with amylolytic activity, with molecular

mass of approximately 67.0 kDa. The results show the biotechnological potential of

amylase from Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 and opens prospects for further

studies aimed at optimizing the enzymatic starch processing.

Key words: Cryptococcus laurentii, amylase, Response Surface Methodology.

x

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. xii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ............................................................................... xvi

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 14

1.1. Amido .................................................................................................................... 14

1.1.1. Amilose e amilopectina ........................................................................................ 15

1.1.2. Amido bruto de mandioca (fécula) ....................................................................... 17

1.2. Hidrólise do amido ................................................................................................. 18

1.2.1. Processamento enzimático do amido................................................................... 19

1.3. Amilases .................................................................................................................... 22

1.3.1. Aplicações industriais das amilases .................................................................... 22

1.3.1.1. Produção de Xaropes de glicose...................................................................... 23

1.3.1.2. Produção de Bioetanol ..................................................................................... 23

1.3.1.3. Industria Textil .................................................................................................. 24

1.3.1.4. Industria de detergentes .................................................................................. 25

1.3.1.5. Panificação ...................................................................................................... 25

1.4. Leveduras amilolíticas ............................................................................................... 26

1.4.1. O gênero Cryptococcus ...................................................................................... 28

1.5. Otimização de processos .......................................................................................... 31

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS ................................................................................. 32

2.1. Objetivo geral ........................................................................................................... 32

2.1.1. Objetivos específicos .......................................................................................... 33

2.2. Justificativa ............................................................................................................... 33

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL ................................................................................. 34

3.1. Material ..................................................................................................................... 34

3.1.2 Soluções e tampões ............................................................................................. 34

3.2. Procedimentos .......................................................................................................... 37

3.2.1. Microrganismo.................................................................................................... 39

xi

3.2.2. Isolamento, seleção e manutenção da levedura amilolítica ................................ 39

3.2.3. Identificação molecular da levedura amilolítica SBFL7 ........................................ 40

3.2.4. Determinação do crescimento celular ................................................................. 41

3.2.5. Atividade amilolítica dextrinizante ....................................................................... 42

3.2.6. Avaliação do potencial de produção de amilase pela levedura Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7 ............................................................................................... 42

3.2.7. Avaliação da assimilação de amido bruto de mandioca pela levedura

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 ........................................................................ 43

3.2.8. Análise das proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 ... 43

3.2.8.1. Colaração com Nitrato de Prata ....................................................................... 44

3.2.9. Detecção de atividade amilolítica em gel de poliacrilamida (Zimograma) ........... 44

3.2.10. Estudo dos fatores que influenciam a produção de amilase por Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7 ............................................................................................... 44

3.2.11. Determinação das condições que maximizam a produção da amilase de

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 ........................................................................ 46

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 48

4.1. Isolamento e seleção da levedura amilolítica a partir de folhas da árvore Paineira

(Ceiba speciosa) .............................................................................................................. 48

4.2. Identificação molecular da levedura amilolítica SBFL7 ............................................. 50

4.3. Avaliação do potencial de degradação do amido bruto de mandioca pela levedura

Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7 ............................................................................ 52

4.4. Estudo dos fatores que influenciam produção da amilase da levedura Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7 .................................................................................................. 54

4.5. Determinação das condições que maximizam a produção da amilase de

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 ............................................................................ 67

4.6. Análise das proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 .......... 78

5. CONCLUSÕES ................................................................................................................ 80

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 81

7. ANEXOS ........................................................................................................................ 105

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Polímeros do amido..............................................................................

Figura 2. Representação esquemática da estrutura e organização molecular

da amilopectina....................................................................................................

Figura 3. Representação esquemática da ação das enzimas amilolíticas.........

Figura 4. Fluxograma do processo de hidrólise enzimática do substrato

amiláceo...............................................................................................................

Figura 5. Estratégia experimental do projeto de pesquisa “Estudo do potencial

de produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 utilizando

amido de mandioca”.............................................................................................

Figura 6. Levedura amilolítica isolada a partir de folhas da árvore Paineira

(Ceiba speciosa)..................................................................................................

Figura 7. Perfil de crescimento celular e produção da amilase de Crytococcus

laurentii LABIOM SBFL7......................................................................................

Figura 8. Perfil de crescimento celular (DO600nm) e produção de amilase

(U/mL) pela levedura Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7 em condições

avaliadas no Delineamento Fatorial Fracionado (DFF)........................................

Figura 9. Gráfico de Pareto para seleção de fatores com maior efeito sobre a

resposta atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7..................................................................................................................

Figura 10. Gráficos de efeitos principais dos fatores estudados sobre a

atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7............

Figura 11. Perfil de crescimento celular (DO600nm) e produção de amilase

(U/mL) pela levedura Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 em cada uma das

condições avaliadas no Delineamento Box-Behnken...........................................

Figura 12. Gráfico de superfície de resposta e contorno dos efeitos combinados

de concentrações de amido bruto e peptona sobre a produção da amilase de

Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7................................................................


dos valores de temperatura (ºC) e concentrações de peptona sobre a produção

da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7.........................................


de concentrações de amido bruto e valores de pH inicial sobre a produção da

amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7..............................................

15

17

20

21

38

49

53

57

62

62

69

72

72

73

xiii


dos valores de pH inicial e concentrações de extrato de levedura (E.L.) sobre a

produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7.........................


dos valores de temperatura (ºC) e concentrações de extrato de levedura (E.L.)

sobre a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7.............

Figura 17. Condições de otimização para A.E. Máx. ajustada pelo modelo

gerado através do Delineamento Box-Behnken..................................................

Figura 18. Perfil de crescimento celular e produção de amilase pela levedura

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 para validação do modelo ajustado

através do Delineamento Box-Behnken...............................................................

Figura 19. Perfil eletroforético de proteínas secretadas por Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7 e Zimograma................................................................

73

74

76

77

79

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Diferentes leveduras selvagens produtoras de amilase......................

Tabela 2. Fatores e níveis estudados no Delineamento Fatorial Fracionado

(DFF) de resolução IV (213-8+4) para seleção de fatores importantes para a

produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.........................

Tabela 3. Fatores e níveis estudados no Delineamento Box-Behken para

otimização da produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7..

Tabela 4. Identificação da levedura amilolítica isolada das folhas da árvore

Paineira (Ceiba speciosa)....................................................................................

Tabela 5. Levantamento bibliográfico de parâmetros do meio de cultivo

utilizados para a produção de amilases microbianas............................................

Tabela 6. Combinações de níveis dos fatores estudados, segundo

Delineamento Fatorial Fracionado Resolução IV (213-8+4), com os respectivos

valores observados de atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii

LABIOM SBFL7....................................................................................................

Tabela 7. Estimativa do Coeficiente de Regressão (CR) e p-valor para a

atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7

segundo Delineamento Fatorial Fracionado (DFF)...............................................

Tabela 8. Análise de variância da regressão para a resposta atividade máxima

da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 no Delineamento Fatorial

Fracionado (DFF).................................................................................................

Tabela 9. Principais nutrientes presentes no amido de mandioca........................

Tabela 10. Coeficiente de Correlação de Pearson (r) entre os tempos de

cultivos e a atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7..................................................................................................................

Tabela 11. Combinações de níveis dos fatores, segundo Delineamento Box-

Behnken, com os respectivos valores observados de atividade máxima da

amilase de C. laurentii LABIOM SBFL7................................................................

Tabela 12. Estimativa do Coeficiente de Regressão (CR) e p-valor para a

atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7

segundo Delineamento Box-Behnken..................................................................

Tabela 13. Modelo ajustado com os coeficientes representando os valores reais

de cada fator avaliado para a produção da amilase de Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7...................................................................................................

27

46

47

51

55

58

60

61

64

66

67

70

71

xv

Tabela 14. Análise de variância do modelo simplificado para a resposta

atividade máxima da amilase de C. laurentii LABIOM-SBFL7 no Delineamento

Box-Behken.........................................................................................................

71

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

μg: microgramas

μL: microlitros

C. R.: coeficiente de regressão

DFF: Delineamento Fatorial Fracionado

E. L.: extrato de levedura

KDa: quilo Dalton

L: litro

min: minuto

m: mili

M: molar

mM: milimolar

MSR: Metodologia de Superfície de Reposta

OD: Densidade óptica

OD600nm: absorvância no comprimento de onda à 600 nanômetros

p: probabilidade real de erro associada à hipótese alternativa de teste estatístico

PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida

R2: coeficiente de determinação

rpm: rotações por minuto

SDS: Dodecil sulfato de Sódio

SSM: Synthetic starch medium

U: Unidade de atividade enzimática

V: Volts

v/v: volume por volume

YPD: Yeast Peptone Dextrose

YNB: Yeast Nitogen Base

14

1. INTRODUÇÃO

1.1. Amido

O amido (C6H10O5)n é um dos polímeros de armazenamento mais importantes

na natureza, sendo sintetizado e utilizado como molécula de reserva de glicose, de

ocorrência mais comum em plantas (TESTER et al., 2004). As principais fontes de

armazenamento de amido são as sementes de cereais, como o arroz, milho, trigo,

cevada e sorgo, as sementes de feijões e ervilhas, os caules do tipo tubérculos, como

batata, batata doce, inhame e as raízes de armazenamento, tendo como importante

exemplar a mandioca (ZEEMAN et al., 2010).

O processamento industrial do amido possibilita a formação de uma série de

derivados que são aplicados em diversos setores, tais como: revestimentos, fluídos

de perfuração de petróleo, adesivos, gelificantes, emulsionantes e agentes de

aumento de viscosidade. O amido pode ser aplicado na indústria têxtil com a finalidade

de gomar as linhas para facilitar a tecelagem e na indústria de papéis, visando

diferentes resistências e alta qualidade de impressão. Entretanto, a maior utilização

do amido está na indústria de alimentos e bebidas, onde é utilizado como espessante,

estabilizante e agente geleificante (FUNGARO, JUNIOR 2002). Apresenta importante

papel tecnológico em alimentos processados, podendo, entre outras funções, facilitar

o processamento, fornecer textura, atuar como espessante, ligante de água ou de

gordura (CEREDA, 2001). A partir do processamento do amido pode-se ainda obter

os xaropes de glicose, xaropes de maltose, as maltodextrinas e as ciclodextrinas,

utilizados em confeitarias, cervejarias e na indústria farmacêutica (GUPTA et al.,

2003).

De forma geral, o amido é composto por resíduos de glicose ligados entre si

por ligações O-glicosídicas. Esta ligação é estável em pH alcalino, mas é hidrolisada

em pH ácido. No final da cadeia polimérica está presente um grupo aldeído latente

que define a extremidade redutora do polímero. A molécula estrutural apresenta um

caráter ligeiramente aniônico, sendo, portanto considerado um polímero hidrofílico.

Essa característica o torna capaz de absorver grande quantidade de água, o que

permite a esse composto atuar como controlador da perda de fluidos (NELSON; COX

2014).

15

Estruturalmente classificado como um homopolissacarídeo, os resíduos de

glicose do amido se organizam na forma de dois tipos de polímeros: amilose e

amilopectina (Figura 1).

Figura 1. Polímeros do amido. (a) Segmento curto de amilose, polímero linear de

resíduos de D-glicose em ligações α(1-4). Uma única cadeia pode conter alguns

milhares de resíduos de glicose. A amilopectina tem trechos de resíduos ligados de

maneira similar, situados entre pontos de ramificação. O glicogênio tem a mesma

estrutura básica, porém é mais ramificado do que a amilopectina. (b) Ponto de

ramificação α(1-6) na amilopectina. (c) Agrupamento de amilose e amilopectina como

o que supostamente ocorre nos grânulos de amido. Fitas de amilopectina (em preto)

formam estruturas em hélice dupla umas com as outras ou com fitas de amilose (em

azul). A amilopectina tem pontos de ramificação α(1-6) frequentes (em vermelho). Os

resíduos de glicose nas extremidades não redutoras das ramificações mais externas

são removidos enzimaticamente durante a mobilização do amido para produção de

energia. O glicogênio tem estrutura similar; porém, é mais ramificado e mais

compacto. (Retirado de NELSON; COX, 2014 p. 256).

1.1.1. Amilose e amilopectina

O teor e o arranjo espacial de amilose e amilopectina na estrutura interna do

amido refletem no grau de compactação do mesmo. Tais características também

influenciam na capacidade de gelatinização e retrogradação do amido. A gelatinização

ocorre entre as moléculas de amilose e as cadeias laterais curtas das moléculas de

amilopectina, por meio de ligações de hidrogênio em soluções aquosas. No momento

16

em que as moléculas de amilose e amilopectina começam a reassociar, a formação

de uma estrutura mais ordenada é favorecida, e tal processo é denominado de

retrogradação (VANDEPUTTE et al., 2003).

A amilose é um polímero linear helicoidal, insolúvel em água fria, composto em

média por 500-20.000 unidades de D-glicose, na qual 99% ligações entre as unidades

D-piranosídicas são do tipo α(1-4) e o restante de α(1-6). A média de conteúdo de

amilose nas fontes de amido encontradas na natureza é de aproximadamente 25%,

mas diferem em relação às fontes botânicas, variedades de uma mesma espécie e de

acordo com o grau de maturação da planta (ELIASSON, 2004).

Embora a estrutura estendida da amilose tenda a se enovelar em hélices

simples, pode ainda formar zonas de junções de dupla hélices esquerdas paralelas.

As ligações de hidrogênio entre as cadeias alinhadas são responsáveis pela formação

de um estado estrutural mais ordenado, formando áreas cristalinas que culminam na

retrogradação. Este processo de cristalização das moléculas de amido ocorre pela

forte tendência de formação de ligações de hidrogênio entre cadeias de amilose

adjacentes, enquanto as ligações são desfeitas com as moléculas de água. A

associação das moléculas do amido propicia o desenvolvimento de uma rede

tridimensional mantida coesa pelas áreas cristalinas. Tal processo é particularmente

causado pela amilose, uma vez que o estado altamente ramificado da amilopectina

reduz a sua suscetibilidade a retrogradação (CEREDA, 2001).

O restante da molécula de amido é composto pelo polímero ramificado

amilopectina, cuja estrutura molecular e proporção, afetam diretamente a

funcionalidade do amido. Estruturalmente, essa macromolécula consiste em

pequenas cadeias lineares com 10-60 unidades de glicose ligadas por α(1-4), e essas

cadeias são unidas entre si por ligações α(1-6) o que confere à estrutura uma

ramificação tipo arborescente (Figura 2) (BULÉON et al., 1998).

17

Figura 2. Representação esquemática da estrutura e organização molecular da

amilopectina. (1) Estrutura de um grânulo de amido contendo pilhas de lamelas

microcristalinas separadas por anéis de crescimento. (2) Visão ampliada das regiões

amorfas e cristalinas. (3) Estruturas de dupla hélice formadas por cadeias adjacentes

de amilopectina dando origem às lamelas cristalinas onde os pontos de ramificação

constituem as regiões amorfas. (4) Classificação das cadeias de amilopectina em tipos

A, B e C. (Adaptado de: TESTER et al., 2004; PEREIRA, 2008, apud YAMANI, 2010).

As cadeias de amilopectina exibem níveis hierárquicos de organização,

sugerindo uma classificação de cadeias A, B e C. Assim a amilopectina consiste de

uma cadeia principal C composta por ligações α-(1,4) e α-(1,6) que carrega o grupo

redutor da molécula, e numerosas cadeias ramificadas denominadas A e B. O tipo A

é composto por uma cadeia não-redutora de glicoses unidas por ligações α-(1,4) sem

ramificações. As cadeias do tipo B são estruturais, contendo uma ou várias cadeias

tipo A e podem conter cadeias tipo B unidas por meio de um grupo hidroxila primário.

O próximo nível estrutural compreende regiões cristalinas e amorfas alternadas,

formando camadas concêntricas resistentes a hidrólise ácida (ELIASSON, 2004).

Dentre os vários tipos de amidos encontrados na natureza muitas pesquisas tem

direcionado esforços utilizando amido bruto de mandioca.

1.1.2. Amido bruto de mandioca (fécula)

A mandioca (Manihot esculenta, Crantz) é uma raiz com alto teor de amido,

apresentando mais de trezentas variedades e é originária da América do Sul. Dentre

as culturas amiláceas, a mandioca destaca-se por diversas vantagens, tais como: fácil

propagação, variedades adequadas para serem colhidas em épocas diferentes do

ano, crescimento em solos de baixa fertilidade, alta produtividade, necessidade ínfima

18

de insumos e baixa demanda tecnológica. Além de possuir elevado teor de amido

nas raízes, possibilita que estas sejam armazenadas no próprio solo por um período

razoável, sem perdas significativas de qualidade e rendimento. De fato, a mandioca

possui grande potencial de aproveitamento: as folhas são fontes enriquecedoras de

alimentos, o caule pode ser utilizado como silagem, entretanto, o produto de maior

aproveitamento é o amido bruto ou fécula (TEIXEIRA, 2007).

A fécula, um importante substrato com a mesma estrutura química do amido é

um carboidrato facilmente extraído da raiz da mandioca, resultando em um produto

de cor branca, insípido e inodoro que despensa o uso de agentes de clareamento para

sua obtenção, uma vez que os tubérculos contêm baixa quantidade de proteínas (<

0,20 %), lipídios (< 0,15 %), cinzas (< 0,21 %) e fósforo (< 0,007 %) (MOORTHY,

2004). A distinção entre a fécula e o amido deve-se ao fato de que a fécula é fabricada

com as raízes, enquanto o amido é obtido de partes aéreas das plantas. Geralmente,

os termos amido bruto de mandioca e fécula são usados como sinônimos, sendo

também denominados tapioca, polvilho ou goma (ANVISA, 1978).

A FAO (Food And Agricultural Organization of United Nations), entidade da

Organização das Nações Unidas (ONU) para a alimentação, preconiza que a

produção de fécula seja avaliada como uma alternativa na geração de renda e a

considera uma excelente oportunidade para que os países produtores de mandioca –

em geral, nações em desenvolvimento – adicionem valor a esse produto de baixo

custo (FAOSTAT, 2016). Neste contexto, o Brasil destaca-se como importante

produtor mundial, onde os estados do Paraná, Mato Grosso do Sul e São Paulo se

destacam por serem responsáveis por cerca de 80% da produção brasileira de fécula

de mandioca (EMPRAPA, 2016).

Dentre as diversas vantagens que fundamentam o uso da fécula frente a outras

fontes de amido, destaca-se a facilidade de extração, custo reduzido e simplicidade

da produção, menor taxa de retrogradação em relação ao amido oriundo de outras

fontes, sendo esta uma importante característica que promove maior estabilidade dos

materiais ao longo do tempo (MALI et al., 2004), além da baixa temperatura de

gelatinização, clareza de sua pasta e alta estabilidade do gel (DITCHFIELD et al.,

2009).

1.2. Hidrólise do amido

Os amidos podem ser hidrolisados por via enzimática ou por via físico-química

(ácidos, calor e pressão). Embora a modificação química empregando ácidos fortes

19

ainda seja muito utilizada, esta vem perdendo espaço por apresentar desvantagens

consideráveis, tais como: corrosão dos equipamentos, destruição parcial dos

açucares, demanda por etapas subsequentes de neutralização e lavagens que

implicam na perda de açúcares presentes. Não obstante, o amido granular

remanescente poderá apresentar alterações na estrutura e propriedades tecnológicas

como viscosidade, solubilidade e formação de gel. Ainda assim, a baixa

fermentabilidade do hidrolisado configura um dos maiores problemas na hidrólise

ácida do amido, ocorrendo devido a degradação dos açúcares em furfurais e

hidroximetilfurfurais (FERREIRA et al., 2013; HASHEM, 2010).

Em contrapartida, modificações enzimáticas, apresentam muitas vantagens,

dentre as quais destaca-se a especificidade das enzimas, que proporciona a obtenção

de produtos com propriedades químicas e físicas bem definidas, seletividade, baixa

demanda energética e ausência de subprodutos indesejáveis. Adicionalmente, a

hidrólise enzimática permite que o processo seja conduzido em condições brandas de

temperatura, o que reduz os custos do processo (SEVERO et al., 2010). De fato, a

implementação da tecnologia enzimática não somente tem o potencial de aumentar a

viabilidade econômica do processo, mas sobretudo, melhorar a sustentabilidade,

reduzindo o impacto da produção sobre o ambiente e o consumo de produtos

químicos, água e energia e a subsequente geração de resíduos (WHITEHURST; VAN

OORT 2009).

1.2.1. Processamento enzimático do amido

Para biotransformar o amido em açúcares fermentescíveis são necessárias

diversas enzimas denominadas enzimas amilolíticas (Figura 3). Estas enzimas atuam

sinergicamente sobre o amido, degradando-o em oligossacarídeos e glicose e podem

ser classificadas em quatro grupos de acordo com o seu mecanismo de ação (IUBMB,

2016):

I. Endoamilases: Catalisam a hidrólise de ligações α-1,4 no interior do polímero de

forma randômica. A α-amilase (EC 3.2.1.1) pertence à esta classe, atuando ao acaso

ao longo das cadeias de amilose e amilopectina. Glicose, maltose, maltotriose,

maltotetraose, maltopentaose e maltohexaose são produtos originários da ação de α-

amilase.

20

II. Exoamilases: Atuam a partir das extremidades não redutoras das cadeias de

amilose e amilopectina catalisando sobre ligações α-1,4. A β-amilase (EC 3.2.1.2) é

uma típica representante das exoamilases. Os produtos de sua ação são maltose e β-

dextrina limite. Já β-glicosidase (EC 3.2.1.20) pode clivar as ligações α-1,6, contudo

essa reação ocorre de forma lenta e menos eficiente, quando comparada à hidrólise

das ligações α -1,4.

III. Desramificadoras: Catalisam exclusivamente a hidrólise das ligações α-1,6 nos

pontos de ramificação. Dentre as enzimas pertencentes a essa classe, está a

isoamilase (EC 3.2.1.68), atuando especificamente sobre as ligações α-1,6 de

amilopectina e dextrinas ramificadas, liberando oligossacarídeos lineares de cadeia

longa como produto final.

IV. Transferases: Catalisam a clivagem da ligação α-1,4 da molécula doadora e

transferem parte dessa molécula para um aceptor glicosídico, com a formação de uma

nova ligação glicosídica. As enzimas de ramificação (EC 2.4.1.18) formam uma nova

ligação α-1,6, enquanto a reação catalisada pela ciclodextrina glucanotransferase

(CGTase, EC 2.4.1.19) forma uma nova ligação α-1,4.

Figura 3: Representação esquemática da ação das enzimas amilolíticas. Os

círculos fechados indicam a extremidade redutora de uma cadeia oligossacarídica,

enquanto as setas representam a posição em que as enzimas podem hidrolisar. Fonte:

Bertoldo; Antranikian (2002).

21

O processamento enzimático do amido envolve duas importantes etapas: a

liquefação e a sacarificação. A liquefação normalmente ocorre com a adição de α-

amilases em pH 6,5 sob agitação, promovendo a conversão do amido em

oligossacarídeos menores e uma redução drástica da viscosidade. A modificação da

cristalinidade do amido constitui um passo limitante para a etapa de liquefação,

condição prévia para que possa haver hidrólise enzimática. Os produtos dessa etapa

são dextrinas e dextrinas α-limite, que ainda contém as ligações α(1-4) e α(1-6). Ao

término do processo de liquefação, são adicionadas as glicoamilases, que efetuam a

conversão dos oligossacarídeos em moléculas de glicose, processo denominado

sacarificação (KELSALL, LYONS 2003).

Em processos biotecnológicos, as etapas de pré-hidrolise, liquefação e

sacarificação (Figura 4) são de fundamental importância para que a matéria-prima

amilácea alcance o propósito industrial desejado. A hidrólise enzimática é realizada

em recipientes providos de agitadores ou em colunas contendo a enzima imobilizada,

o que permite uma alta relação entre o teor de enzima e o substrato, reduzindo o

consumo de enzimas e mantendo as condições ótimas de atuação do sistema

enzimático utilizado (SCIPIONI, 2011).

Figura 4 ‒ Fluxograma do processo de hidrólise enzimática do substrato amiláceo.

Fonte: SCIPIONI (2011).

Em face das vantagens do processamento enzimático do amido frente ao

processo físico-químico, faz-se necessário uma busca por microrganismos amilolíticos

capazes de sintetizar tais biocatalisadores de forma eficiente e economicamente

22

viável, e que sejam capazes de produzir amilases com características interessantes

do ponto de vista industrial, uma vez que estas enzimas tem conquistado aplicações

em diversos setores.

1.3. Amilases

As amilases integram a classe de hidrolases e são amplamente distribuídas na

natureza. A sua atividade catalítica resulta na clivagem das ligações glicosídicas do

amido, do glicogênio e de outros oligossacarídeos (GOMAA, 2013).

O advento da produção de enzimas amilolíticas com o propósito de atender

demandas industriais data o início do século passado. Em 1891, frente ao interesse

industrial da produção de glicose a partir de fontes amiláceas, Takamine propôs a

aplicação do fungo Aspergillus oryzae para a destilaria americana e, por conseguinte,

depositou a primeira patente para a produção de uma enzima microbiana nos EUA,

Reino Unido, França, Bélgica, Canadá e Alemanha. A produção da amilase fúngica,

denominada Takadiastase, destaca-se como método pioneiro para a produção

microbiológica de uma enzima em grande escala (TAKAMINE, 1914). A partir desse

fato, as técnicas e os processos utilizados para a produção de enzimas microbianas

foram aprimorados e microrganismos com alta capacidade de produção de

biocatalisadores foram isolados ou desenvolvidos (COSTA, 1996).

Desde então, as aplicações industriais e biotecnológicas para as amilases

expandiram substancialmente. Dentre as aplicações de maior relevância, destaca-se

a etapa de liquefação do amido no processo de produção de açúcar, álcool e cerveja.

No entanto, as amilases têm conquistado um amplo espectro de aplicações

industriais, sendo também utilizadas na produção de detergentes, na indústria têxtil,

panificadora e farmacêutica, no tratamento de esgotos e na alimentação animal

(KHEMAKHEM et al., 2013).

1.3.1. Aplicações industriais das amilases

As amilases constituem uma das mais importantes classes de enzimas com

grande potencial biotecnológico e aplicações em diferentes indústrias como de

alimentos, têxtil, química, farmacêutica e de detergentes (NANDY, 2016). Elas podem

ser obtidas a partir de diversas fontes, tais como plantas, animais e microrganismos,

no entanto as amilases microbianas possuem destaque em aplicações industriais

devido a sua maior estabilidade e menor tempo de produção. Um número expressivo

de amilases microbianas estão disponíveis comercialmente e têm substituído quase

23

completamente a hidrólise físico-química na indústria de processamento de amido

(GUPTA et al., 2003).

1.3.1.1. Produção de Xaropes de glicose

O maior mercado para a aplicação das amilases está na produção de

hidrolisados de amido (SOUZA, MAGALHÂES 2010). Denomina-se “hidrolisados de

amido” todos os produtos oriundos do fracionamento do amido, independentemente

do grau de fracionamento ou do catalisador utilizado. Esta denominação abrange

diferentes tipos de produtos, como xaropes de glicose, maltose, frutose, maltotetrose,

dextrinas e ciclodextrinas (BUCHHOLZ, SEIBEL 2008).

A expressão xarope de glicose compreende todas as soluções aquosas

purificadas e concentradas de polímeros de D-glicose, obtidas por hidrólise do amido

(SURMELY et al., 2003). De acordo com o direcionamento da aplicação, define-se a

composição de um hidrolisado, e em decorrência deste fator, cada tipo de xarope

demanda combinações específicas de enzimas amilolíticas (GOMES et al., 2007).

Diante da alta propriedade adoçante destes produtos, os xaropes de glicose e frutose

são amplamente empregados na indústria de refrigerantes. Além disso, nos setores

de balas, caramelos, padarias e confeitarias os xaropes de glicose são utilizados com

a finalidade de melhorar a estabilidade dos produtos frente ao congelamento e

descongelamento, sobre a cristalização e a retenção de umidade (FREITAS, 2012).

1.3.1.2. Produção de Bioetanol

A produção de biocombustíveis - provável alternativa para solução do problema

energético mundial, ocasionado pela oscilação dos preços, escassez do petróleo e

aumento de problemas ambientais relacionados aos combustíveis fósseis - configura

um dos principais setores de aplicação das amilases. Dessa forma, tais enzimas

passaram a ser empregadas na produção de bioetanol através da fermentação de

biomassa renovável. A ação catalítica conjunta das enzimas α-amilase e glicoamilase

promove a liquefação e sacarificação do amido (KHAW et al., 2007).

Biocombustíveis produzidos a partir de fontes amiláceas podem apresentar

vantagens energéticas, econômicas e ambientais. Nesse contexto, o amido têm sido

estudado como fonte de açucares fermentáveis devido a sua grande disponibilidade

e baixo custo (CHI et al., 2009). Diversas biomassas com elevado teor de amido são

reportadas como insumos para a produção industrial de etanol, são elas: batata

(Solanum tuberosum); trigo (Triticum spp.); centeio (Secale cereale); sorgo (Sorghum

24

bicolor); cevada (Hordeum vulgare) e mandioca (Manihot esculenta) (ROEHR, 2001).

Ademais, resíduos ricos em amido como polpa de mandioca e águas residuais

provenientes de indústrias de alimentos, configuram um recurso importante para a

produção de biocombustíveis. No entanto, grande parte ainda é descartada

ocasionando graves problemas ambientais, tais como, liberação de gás metano na

atmosfera, altas concentrações de demanda química de oxigênio (DQO) e demanda

bioquímica de oxigênio (DBO), além da grande quantidade de cianeto, elemento

altamente tóxico (TANIMURA et al., 2014).

Em face da importância do aprimoramento da produção de etanol a partir de

amido, inúmeros estudos têm sido realizados a fim de desenvolver metodologias que

maximizem a produção e, simultaneamente, reduzam os custos operacionais. Nesse

sentido, leveduras têm sido modificadas geneticamente para co-expressão de

amilases e glicoamilases, viabilizando a sacarificação e fermentação simultânea

(AYDEMIR et al., 2014; FAVARO et al., 2015; GALDINO, 2008; INOKUMA et al.,

2015). Alternativamente, têm se estabelecido a busca por leveduras selvagens

capazes de produzir enzimas que possibilitem a produção de etanol de forma direta a

partir de fontes amiláceas (BÜTTNER et al., 1992; REDDY; BASAPPA, 1993;

TANIMURA et al., 2015).

1.3.1.3. Indústria Têxtil

As α-amilases possuem importante aplicação na indústria têxtil, visto que são

utilizadas na eliminação das gomas de amido ou de derivados de amido que são

aplicados para conferir resistência e proteger os fios durante o processo de tecelagem,

substituindo o uso de ácidos, bases ou oxidantes, que danificam em maior proporção

a celulose do tecido (SPIER, 2005).

Durante muito tempo a degomagem foi realizada utilizando peróxido de

hidrogênio (H2O2) e hidróxido de sódio (NaOH). No entanto, além de exigir que o

processo ocorra em elevadas temperaturas, a degomagem química apresenta várias

desvantagens, tais como a degradação da fibra tecidual, o alto consumo de energia,

e de forma ainda mais preocupante, uma grande quantidade de poluentes químicos

são eliminados nas águas residuais comprometendo o meio ambiente. Diante destes

fatores, diversos estudos têm sido direcionados para o desenvolvimento de

alternativas ecológicas e economicamente viáveis, sendo que grande parte utilizam a

α-amilase (HENDRIKSEN et al., 1999; FEITKENHAUER et al., 2003; SARETHY et al.,

2012; FU; LU, 2014; LI; YANG, 2015).

25

Dentre as vantagens da aplicação da α-amilase na indústria têxtil, destaca-se

a remoção seletiva da cobertura de amido mantendo as fibras dos tecidos intactas e

o fato de que os produtos da degomagem catalisada por esta enzima configuram

dextrinas facilmente removíveis por meio da lavagem, uma vez que apresentam alta

solubilidade em água (HENDRIKSEN et al., 1999).

1.3.1.4. Indústria de detergentes

A indústria de detergentes está em constante expansão e destina grandes

investimentos para a aplicação de enzimas como um dos principais ingredientes

empregados na constituição desses produtos. Dentre as principais enzimas, sabe-se

que as α-amilases têm sido utilizadas em detergentes em pó desde 1975 e devido a

sua grande eficiência, atualmente estão presentes em mais de 90% dos detergentes

líquidos (MITIDIERI et al., 2006; HMIDET et al., 2009; RANI, 2016).

A utilização de α-amilases em formulações de detergentes proporciona

eficiente remoção de manchas amiláceas das superfícies de tecidos, promovendo

também o aumento do grau de brancura, uma vez que o amido tende a se dispersar

e agir como um forte aglutinante de manchas em roupas. Soma-se a isso o fato de

que a sua aplicação permite a substituição de produtos cáusticos, ácidos e solventes

tóxicos, que agridem o meio ambiente e provocam o desgaste de materiais e de

instrumentos (ITO et al., 1998). Diante disso, estudos e investimentos têm sido

realizados visando o aperfeiçoamento da estabilidade da α-amilase frente à oxidação

promovendo maior estabilidade de armazenamento e maximizando o desempenho

destas enzimas em alvejantes e formulações de detergentes (NOVOZYMES, 2016;

ROY et al, 2012; BHANGE et al., 2016).

1.3.1.5. Panificação

A alfa-amilase potencializa a qualidade da farinha de trigo por meio da ação

conjunta com a beta-amilase, as quais promovem a dextrinização dos grânulos de

amido danificados e gelatinizados, alterando a absorção da água e a extensibilidade

da massa (IRIKI et al., 2003). Ademais, sua ação catalítica melhora o potencial

fermentativo pois disponibiliza substrato para a ação de outras enzimas para que

ocorra a liberação de monossacarídeos e dissacarídeos fermentescíveis para a

atuação das leveduras, proporcionando melhor coloração e volume, além de

aperfeiçoar características internas e externas do pão (HOPEK et al., 2006).

26

O mecanismo de endurecimento e perda da resiliência dos pães está

relacionado com o processo de recristalização e retrogradação da fração amilácea na

massa (AMIGO et al., 2016). Nesse sentido, a suplementação de farinhas para

panificação com α-amilases diminui o teor de amido no produto e como consequência

minimiza o processo de retrogradação. O incremento da amilase na preparação de

pães ainda retarda a perda de umidade do pão e reduz a taxa de envelhecimento.

Além das contribuições supracitadas, essas enzimas aumentam o teor de açúcares

na massa, proporcionando melhoria do sabor, coloração da crosta do pão e melhora

as características na etapa de assamento da massa (GIANNONE et al., 2016;

ROSELL et al., 2001).

Em estudos que visam a produção de amilases microbianas, maior relevância

tem sido destinada a condições de cultivo específicas, bem como a seleção de

linhagens para a produção de amilases em larga escala (GUPTA et al., 2003). A

otimização das condições de fermentação, envolvendo primordialmente parâmetros

físicos e químicos, é fundamental no desenvolvimento dos processos de produção de

tais enzimas, devido seu impacto na economia e na viabilidade do processo. Nesse

contexto, o efeito de diversos fatores incluindo pH, temperatura, fontes de carbono e

de nitrogênio sobre a produção de amilases têm sido investigados (SOUZA,

MAGALHÃES 2010). Todavia, a formulação de meios de cultivo de baixo custo para

a produção de amilases têm sido reportada em diversos trabalhos. Componentes

como resíduos de banana, laranja e soja, hidrolisado de arroz, casca de mandioca, e

outros resíduos contendo amido têm se destacado como suportes do crescimento

microbiano durante a produção enzimática (KRISHNA, CHANDRASEKARAN 1996;

DJEKRIF-DAKHMOUCHE et al., 2006; ABREU et al., 2011; SREEKANTH et al., 2013;

CELESTINO et al., 2014; CERDA et al., 2016)

1.4. Leveduras amilolíticas

O grande potencial biotecnológico e o rápido desenvolvimento científico

fomentaram o isolamento de um grande número de microrganismos, nesse contexto,

as leveduras representam uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço

biotecnológico e para o desenvolvimento econômico sustentável. Grande parte se

destaca por possuir genes que conferem características com aplicabilidade

tecnológica, como por exemplo, a capacidade de produzir enzimas que atuam na

hidrólise de biopolímeros, como o amido (REDDY et al., 2009).

27

Embora a produção de amilases tenha se estabelecido tradicionalmente a partir

de linhagens de fungos filamentosos, a capacidade amilolítica das leveduras abrange

diversos gêneros e estima-se que mais de 150 espécies possuam a habilidade de

hidrolisar o amido (SPENCER, SPENCER 1997).

Diferentes perfis de atividade de amilases produzidas por leveduras encontram-

se sumarizados na Tabela 1.

Tabela 1: Diferentes leveduras selvagens produtoras de amilase

Levedura Atividade de amilase

(U/mL) Referência

Aureobasidium pullulans 58.5 (LI et al., 2007)

Candida glabrata 25.39 (OLIVEIRA et al., 2015)

Candida parapsilosis 14.68 (OLIVEIRA et al., 2015)

Candida pelliculosa ND (KAWAMURA, SAWAI, 1968)

Candida tropicalis ND (SAWAI, 1958)

Candida japônica ND (EBERTOVA,1966)

Cryptococcus flavus 18.00 (TRINDADE, 2014)

Debaryomyces cantarellii 3.00 (DEMOT et al., 1984)

Debaryomyces castellii 5.00 (DEMOT et al., 1984)

Debaryomyces formicarius 3.70 (DEMOT et al., 1984)

Debaryomyces vanro'ii 5.40 (DEMOT et al., 1984)

Endomyces sp. 11.6 (HATTORI, TAKEUCHI 1962)

Endomycopsis burtonii 1.90 (DEMOT et al., 1984)

Endomycopsis capsularis 24.70 (DEMOT et al., 1984)

Endomycopsis fibuligera 7.10 (DEMOT et al., 1984)

Hansenula anomala 1.20 (DEMOT et al., 1984)

Hansenula capsulata 4.10 (DEMOT et al., 1984)

Hansenula holstii 1.40 (DEMOT et al., 1984)

Kluyveromyces marxianus 0,133 (STERGIOU et al., 2014)

Lipomyces kononenkoae 27.20 (SPENCER, VAN UDEN 1979)

Lipomyces tetrasporus 2.10 (DEMOT et al., 1984)

Pichia burtonii 4.70 (MOULIN, GALZY 1978)

Pichia media 3.50 (DEMOT et al., 1984)

Pichia nakazawae 23.30 (DEMOT et al., 1984)

Pichia polymorpha 8.20 (MOULIN et al., 1982)

28

Pichia pseudopolymorpha 3.20 (DEMOT et al., 1984)

Pichia sarbitophila 1.40 (DEMOT et al., 1984)

Pichia stipitis 9.40 (DEMOT et al., 1984)

Pichia vini 3.10 (DEMOT et al., 1984)

Rhodotorula mucilaginosa 25.00 (OLIVEIRA et al., 2015)

Saccharomyces cerevisiae 1.50 (OGDEN, TUBB 1985)

Saccharomyces malanga 11.80 (DEMOT et al., 1984)

Schwanniomyces alluvius 13.70 (LUSENA et al., 1985)

Schwanniomyces castellii 3.10 (CLEMENTI et al., 1980)

Schwanniomvcesocidentali 0.40 (MCCANN, BARNETT 1984)

Wickerhamia sp. 10.79 (HERNÁNDEZ et al.,2012)

* Atividade de amilase analisada por métodos distintos que utilizam diferentes tipos de amido como

substrato, em diferentes concentrações. ND = Não Determinado.

Fonte: Adaptado de Sandhu e colaboradores (1987).

Amilases produzidas por algumas leveduras tem se destacado por apresentar

propriedades bioquímicas atrativas para aplicação industrial. Um exemplo disso é a

levedura Cryptococcus flavus que é capaz de metabolizar o amido bruto de mandioca,

possuindo uma α-amilase termoestável e com grande afinidade pelo amido como

substrato (GALDINO, 2008; GALDINO et al., 2011; TRINDADE, 2014; WANDERLEY

et al., 2004).

1.4.1. O Gênero Cryptococcus

Desde a primeira metade do século XX, o gênero Cryptococcus tem sido

amplamente estudado devido ao fato de abranger duas espécies potencialmente

patogênicas: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Tais espécies são

causadoras da criptococose, uma importante infecção oportunista que afeta

principalmente pacientes imunossuprimidos causando a neurocriptococose (NATH et

al., 2016; ROLSTON, 2013).

No entanto, o gênero compreende aproximadamente 70 espécies que se

reproduzem assexuadamente por brotamento, sendo classificados quanto a

reprodução em basidiomicetos (KURTZMAN, FELL 2011). Quando observados

microscopicamente durante a forma assexuada haploide, esses basidiomicetos são

vistos como leveduras encapsuladas, ovaladas ou arredondadas, de cinco a dez

micrômetros, sem hifas ou pseudo-hifas, com brotamentos simples ou, raramente,

29

múltiplos (KWON-CHUNG, BENNETT 1992). As leveduras do gênero Cryptococcus

pertencem ao filo Hymenomycetos e possuem representantes nas classes:

Tremellales, Trichosporonales, Filobasidiales e Cystofilobasidiales (GUFFOGG et al.,

2004).

As espécies do gênero são amplamente distribuídas na natureza, podendo ser

isoladas a partir de fontes como água, solo, ar, folhas, frutos, flores e madeira em

processo de decomposição, bagaço da cana-de-açúcar, excretas de aves, mucosas

de animais e isolados clínicos (LARA et al., 2014; FELL, STATZELL-TALLMAN 1998).

São encontradas em diversos ambientes e climas, sobrevivendo em condições

desfavoráveis, como extremo frio da Antártica, em elevações como no Himalaia, e em

águas salinas (DE GARCIA et al., 2012; DUARTE et al., 2013; VIMERCATI et al.,

2016). Não obstante, possuem a capacidade de colonizar ambientes que apresentam

valores extremos de pH e altas concentrações de metais pesados (RUSSO et al.,

2010).

Em face da ubiquidade do gênero Cryptococcus, uma grande variedade de

enzimas tem sido descrita, muitas das quais relacionadas à sobrevivência e

adaptabilidade em tais habitats. Algumas destas enzimas se destacam por apresentar

importância econômica, tais como, inulinase produzida por Cryptococcus aureus,

poligalacturonase (PGase) secretada por Cryptococcus liquefaciens e lacase

produzida por Cryptococcus albidus (ABE et al., 2006; SHENG et al., 2008; SINGHAL

et al., 2009).

A levedura Cryptococcus sp S-2 tem sido descrita pela produção de diversas

enzimas de interesse biotecnológico: celulase, xilanase, α-amilase, PGase e lipase

(IEFUJI et al., 1994; KODAMA et al., 2009; THONGEKKAEW et al., 2008).

Do mesmo modo, a levedura Cryptococcus flavus se destaca pela produção de

enzimas com características desejáveis para aplicação industrial. Estudos

empregando a α-amilase encontrada nessa levedura revelam uma grande eficiência

na degradação do amido (GALDINO, 2008; GALDINO 2011; WANDERLEY et al.,

2004). A levedura também tem sido estudada como fonte das enzimas carboximetil

celulase e xilose redutase (CUI et al., 1992; MAYR et al., 2003).

Embora grande parte das enzimas supracitadas tenham sido expressas e

secretadas no meio de cultura, o alto custo de produção e o baixo rendimento -

características comuns entre leveduras selvagens - tem configurado verdadeiro

obstáculo para a aplicação industrial. Nesse sentido, estudos têm sido realizados

30

objetivando a otimização da produção enzimática utilizando substratos de baixo custo,

bem como a melhoria da produtividade através da expressão heteróloga (COUTINHO

et al., 2013; GALDINO et al., 2011; MASAKI et al., 2012; THONGEKKAEW et al., 2008;

TRINDADE, 2014).

1.4.2. A levedura Cryptococcus laurentii

O microrganismo em estudo foi isolado a partir de folhas da árvore

popularmente conhecida como Paineira (Ceiba speciosa) e resulta da busca por novas

fontes de enzimas de interesse industrial para que novas propriedades amilolíticas

fossem exploradas. Considerando que a disponibilidade de carbono como nutriente

nas folhas é o principal determinante na colonização epifítica (LINDOW, BRANDL

2003), e que o amido é sintetizado e armazenado nos amiloplastos a partir da

polimerização da glicose, levantou-se a questão da possível atividade de amilase

associada a espécie isolada. Dados da literatura corroboram o potencial de produção

de insumos biotecnológicos pela espécie em estudo (KURTZMAN et al., 2011).

A produção de invertases por Cryptococcus laurentii CCY 17-3-6 foi avaliada

por Dudíková e colaboradores (2007), e posteriormente a cepa C. laurentii MT-61,

isolada a partir de amostras de solo, revelou grande capacidade de produção da

mesma enzima, responsável pela hidrólise da sacarose na formação de açúcar

invertido, bastante utilizada em indústrias alimentícias e farmacêuticas (AYDOGAN et

al., 2014). Recentemente, Das e colaboradores (2016) relataram novas propriedades

da invertase produzida por C. laurentii S23, como termoestabilidade e ativação por

determinados íons metálicos.

A β-1,4-xilanase, principal enzima do complexo xilanolítico, é responsável pela

hidrólise aleatória das ligações β-1,4 da cadeia de hemicelulose, e possui aplicação

em rações animais e no branqueamento de papel. Impulsionados pela relevância

biotecnológica dessa enzima, Otero e colaboradores (2015) verificaram na levedura

C. laurentii a possibilidade de maximizar a produção xilanolítica. Lara e colaboradores

(2014) também destacam o potencial xilanolítico de C. laurentii isolada a partir do

bagaço da cana-de-açúcar.

C. laurentii possui capacidade de degradação da biomassa lignocelulósica,

convertendo-a em açucares fermentáveis por meio da ação da enzima β-glicosidase.

Tal habilidade se destaca como importante alternativa para o processo de produção

de etanol de forma sustentável (SOUZA et al., 2013).

31

Ainda na classe das hidrolases, C. laurentii tem sido descrita por produzir

β-galactosidase com propriedades interessantes do ponto de vista industrial, tais

como termoestabilidade, alta atividade específica e estabilidade em valores extremos

de pH (OHTSUKA et al., 1990). As enzimas L-α-amino-ϵ-caprolactamase, l-

lysinamidase e L-α-amino-S-caprolactam-hidrolase também são produzidas pela

levedura C. laurentii (ČESKIS et al., 1987; FUKUMURA, 1977; FUKUMURA et al.,

1978).

Van Staden e colaboradores (2007) avaliaram o potencial de produção de fitase

por C. laurentii, e verificaram alta atividade em condições ácidas, estabilidade térmica,

afinidade elevada para o substrato e não necessita de íons metálicos para a atividade,

cumprindo-se assim os principais critérios para uma fitase aplicável comercialmente.

Embora a habilidade desta levedura em utilizar o amido como fonte de carbono

já tenha sido descrita (KURTZMAN et al., 2011), até a elaboração do presente trabalho

não há na literatura científica, relatos sobre a amilase de C. laurentii. Desse modo,

este trabalho pretende contribuir com informações acerca da biotecnologia da

levedura em estudo, principalmente no que concerne ao processo de produção de

enzimas amilolíticas e sua otimização.

1.5. Otimização de processos

Altos níveis de produção de enzimas microbianas podem ser alcançados

através de manipulações genéticas ou da otimização da composição do meio de

cultivo. No entanto, microrganismos geneticamente modificados podem apresentar

certa instabilidade genética. Como a secreção de enzimas relacionadas ao

metabolismo é uma estratégia intrínseca à sobrevivência de microrganismos, a

manipulação de nutrientes e condições do meio de cultivo pode ser considerado um

método viável para se alcançar alta produtividade enzimática, melhorando

desempenho, e portanto, a viabilidade econômica do processo (DEY et al., 2001).

Diante disso, existem duas maneiras pelas quais os parâmetros que afetam o

crescimento microbiano e a produção do produto de interesse podem ser otimizados:

o método clássico e o método estatístico. O método clássico consiste no estudo de

um fator por vez, ou seja, uma variável independente é estudada, enquanto todos os

outros fatores são mantidos constantes O método clássico não descreve os efeitos

completos dos parâmetros do processo, não garante a determinação das condições

32

ótimas e não detecta as possíveis interações entre dois ou mais fatores (BOX;

WILSON,1951).

Em contrapartida, a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) constitui um

conjunto de ensaios estabelecidos com critérios científicos e estatísticos, que busca

determinar a influência de diversas variáveis num dado sistema ou processo. O

princípio no qual se embasa, permite variar de uma só vez, todos os fatores

controláveis de maneira programada e racional. Um planejamento adequado permite,

além do aprimoramento de processos, a redução da variabilidade, a redução de

tempos de análise, e primordialmente, dos custos envolvidos (RODRIGUES, IEMMA,

2009).

A aplicação desta metodologia permite escolher uma série de experimentos

que produzam medidas confiáveis e adequadas do processo; ajustar um modelo

matemático que melhor se adapte aos dados coletados; e por último, estimar as

condições ótimas para que as variáveis produzam um máximo (ou mínimo) valor na

resposta. Dessa forma, o planejamento consciente dos experimentos que devem ser

realizados para estimar, e mesmo quantificar, a influência das variáveis sobre as

respostas desejadas, é indispensável para que resultados confiáveis sejam obtidos e

para que análises estatísticas consistentes possam ser realizadas (BARROS et al.,

2010).

A MSR tem sido amplamente empregada para se otimizar diversos processos

biotecnológicos, incluindo, parâmetros do meio de cultivo (CHEN et al., 2016;

IZMIRLIOGLU, DEMIRCI 2016; JIN et al., 2013), processos de produção de enzimas

(LAKSHMI, PRAKASHAM 2016; HANDA et al., 2016; RAOL et al., 2014) e de forma

específica, tem sido empregada com sucesso para a otimização da produção de

amilases microbianas (GHOSH et al., 2015; NAILI et al., 2016; STERGIOU et al., 2014;

TRINDADE, 2014). Nesse sentido, devido ao potencial amilolítico do gênero

Cryptococcus pretendeu-se nesse trabalho avaliar o potencial de produção da amilase

de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 de modo a contribuir com informações

biotecnológicas relevantes para esta espécie.

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS

2.1. Objetivo geral

Identificar a levedura amilolítica isolada e estudar o processo de

produção da amilase.

33

2.1.1. Objetivos específicos

Identificar a levedura isolada através de métodos moleculares;

Avaliar a influência de diferentes fatores para a produção de amilase

pela levedura isolada;

Otimizar as condições de cultivo da levedura visando a maximização da

produção da amilase.

Analisar o perfil de proteínas secretadas pela levedura e detectar a

atividade amilolítica em gel (zimograma).

2.2. Justificativa

A tecnologia enzimática vem sendo utilizada em diversos setores industriais e

a demanda por estes eficientes biocatalisadores tem crescido de forma significativa.

O mercado de enzimas de processamento de amido acompanha essa ascensão e o

custo das enzimas utilizadas no processo de liquefação representa 24% do custo total

do processo, impulsionando a busca por alternativas que reduzam tais custos e

aumente a viabilidade econômica do processo (WORLD ENZYMES, 2016).

Diante desta demanda, o isolamento de microrganismos provenientes de

recursos naturais, tais como plantas, resíduos, água e solo configura uma atividade

de extrema relevância para a obtenção de novas linhagens com características de

interesse industrial (SCHMIDELL et al., 2001).

Vale ressaltar que quando se busca a produção de um determinado metabólito

microbiano com potencialidade comercial, faz-se fundamental, além da seleção do

microrganismo produtor, a otimização dos parâmetros relacionados ao processo

visando alcançar rentabilidade e eficiência (SCHMIDELL et al., 2001). Dessa forma, a

utilização de substratos ricos em moléculas de alto valor biológico e de baixo custo

torna-se bastante interessante, uma vez que o meio de cultivo para o crescimento do

microrganismo responde por cerca de 30-40% do custo de produção das enzimas

(JOO, CHANG 2005).

Diversos estudos têm se destinado à otimização da produção de amilases, no

entanto, grande parte utiliza amido solúvel - substrato de alto custo - e se embasa no

método clássico de otimização, que além de não garantir a determinação das

condições ótimas, é bastante oneroso (BARROS et al., 2010).

Em contrapartida, este estudo se fundamenta no método estatístico de

otimização, utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta, que permite a

34

construção de modelos, a avaliação do efeito dos fatores envolvidos em um processo

e a determinação das condições ótimas para as respostas desejadas (BOX, WILSON

1951). Não obstante, utiliza como fonte de carbono o amido bruto de mandioca, um

substrato de fácil obtenção e baixo custo que consequentemente reduz os custos

relacionados a produção da amilase.

Além disso, o presente estudo contribui de forma significativa para a

biotecnologia do Gênero Cryptococcus, uma vez que trata-se do primeiro trabalho

destinado ao estudo do processo de produção da amilase da levedura Cryptococcus

laurentii utilizando métodos estatísticos, discutindo o conhecimento científico, as

limitações e contribuições desta estratégia.

3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1. Material

Meio Sabouraud

Glicose 2% (p/v)

Peptona 1% (p/v)

Extrato de levedura 0,5% (p/v)

Meio YPD

Extrato de Levedura 1,0% (p/v)

Peptona de caseína 2,0% (p/v)

Glicose 2,0% (p/v)

Para o meio sólido foi adicionado 2% de Ágar bacteriológico

Meio de indução de amilase SSM (Synthetic Starch medium)

Amido Solúvel 2% (p/v)

YNB (Yest Nitrogen Base) 0,67% (p/v)

3.1.2 Soluções e tampões

Dosagem da atividade amilolítica

Tampão Acetato de Sódio 0,5M pH 5.5

35

Acetato de Sódio 41 g

Água destilada 1 L

*calibrar o pH com Ácido acético glacial

Ácido acético 1M

Ácido acético glacial (PA) 2,9 mL

Água destilada 50 mL

Reagente FUWA

Iodo (I2) 1% (p/v) diluído em etanol 100%

Iodeto de potássio (KI) 10% (p/v)

Solução de uso I2/KI/H2O 1:1:3

Analise de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Acrilamida:Bis Acrilamida (39:1)

Acrilamida 39 g

Bis-acrilamida 1g


Tris-HCl 1,5M pH 8.8

TRIS 18,2 g


pH corrigido com solução de HCl

Tris-HCl 1M pH 6.6

TRIS 12,1 g


pH corrigido com solução de HC

SDS 10% (p/v)

Dodecil sulfato de sódio (SDS) 1 g


Perssulfato de amônio 10% (p/v)

36

Perssulfato de amônio 1 g


Tampão de amostra desnaturante (5X)

Tris-HCl 1M pH 6,8 60 mM

SDS 10% (p/v) 2%

β-Mercaptoetanol 14,4 mM

Glicerol 50% 25 %

Azul de Bromofenol 0,1%


Tampão de amostra não desnaturante (5X)

Tris-HCl 1M pH 6,8 312,5 mM

Glicerol 50 %

Azul de Bromofenol 0,05%


Tampão de corrida- Tris-glicina 5X (Estoque)

Tris 16,7 g

Glicina 104,5 g

Água destilada 1 L

Marcador de massa molecular para proteínas

Marcador molecular Pierce™ Unstained Protein MW Marker (Thermo scientific)

Padrões de massa molecular: beta-galactosidase (116 kDa), albumina bovina (66,2

kDa), ovalbumina (45 kDa), lactato desidrogenase (35 kDa), REase Bsp98I (25 kDa),

beta-lactoglobulina (18,4 kDa), lisozima (14,4 kDa).

Revelação de bandas proteicas por coloração com Nitrato de Prata

Solução de fixação

Metanol (99,8%) 500 mL

Ácido acético glacial 120 mL

Formaldeído (36,5 a 38%) 1 mL


37

Solução de lavagem

Etanol (99,8%) 500 mL


Solução de tratamento

Tiossulfato de sódio 20 mg


Solução de nitrato de prata

Nitrato de prata 0,2 g

Formaldeído (36,5% a 38%) 75 µL


Solução reveladora

Carbonato de sódio (estoque) 6%

A solução reveladora foi preparada misturando 98 mL da solução de carbonato de

sódio 6% com 2 mL da solução de tratamento e adicionado 0,05% de formaldeído a

37°C e tiossulfato de sódio 4 mg/mL.

Solução de parada

Metanol (P.A) 50 mL

Ácido acético glacial 120 mL


3.2. Procedimentos

O presente trabalho, cuja estratégia experimental se encontra na Figura 5, foi

desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia de Microrganismos (LABIOM), do

Campus Centro Oeste Dona Lindu da Universidade Federal de São João Del Rei

(UFSJ), no município de Divinópolis, Estado de Minas Gerais, Brasil. A identificação

da levedura isolada foi realizada em colaboração com o Laboratório de Ecologia e

Biotecnologia de Leveduras da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

38

Figura 5. Estratégia experimental do projeto de pesquisa “Estudo do potencial de

produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 utilizando amido de

mandioca”.

39

3.2.1. Microrganismo

Neste trabalho, foi utilizada a levedura isolada das folhas de Paineira, (Ceiba

speciosa) no campus Centro-Oeste da Universidade Federal de São João Del-Rei,

Divinópolis, Minas Gerais. A levedura isolada foi identificada como Cryptococcus

laurentii recebendo o código de LABIOM-SBFL7.

3.2.2. Isolamento, seleção e manutenção da levedura amilolítica

Amostras foliares da árvore paineira, Ceiba speciosa, foram coletadas no

campus Centro-Oeste Dona Lindu da UFSJ, localizado na cidade de Divinópolis,

estado de Minas Gerais. Dez folhas foram assepticamente coletadas em tubos falcon

estéreis, transportadas para o laboratório e processadas dentro de aproximadamente

três horas. As folhas foram lavadas com água destilada estéril previamente ao

processamento. Em seguida, foram cortados assepticamente fragmentos de 3 a 5mm

e estes foram depositados diretamente em contato com o meio de cultura Ágar

Sabouraud dextrose (glicose 2%, peptona 1%, extrato de levedura 0,5%, 2% de ágar)

em placas de Petri. Após 48 horas, os fragmentos de folhas foram assepticamente

retirados e as placas foram incubadas a 28ºC por aproximadamente 3 dias.

Posteriormente, colônias de leveduras foram selecionadas e purificadas pela técnica

de esgotamento em placas de Petri contendo Ágar Sabouraud dextrose. Foram

realizadas sucessivas repicagens, com estrias múltiplas em quadrantes, a fim de se

obter culturas puras. Foram selecionadas para isolamento colônias com

características morfológicas distintas e que se apresentassem fisicamente distantes

na placa.

Cada morfotipo isolado foi nomeado de acordo com o meio de cultura, e o

número da placa. Para verificar a capacidade amilolítica das leveduras, as linhagens

foram repicadas em placas de Petri contendo amido solúvel como única fonte de

carbono. O meio sólido SSM-Synthetic Starch Medium (Ágar 1,85, amido solúvel 2%,

YNB 1,68%) foi utilizado para esta finalidade. As placas foram incubadas a 28°C por

48 horas e após esse período foram tratadas com vapor de iodo para a revelação dos

halos de hidrólise.

As leveduras isoladas foram cultivadas em meio Ágar YPD (extrato de levedura

1%, peptona 2%, glicose 2%, ágar 2%) a 28°C. Este mesmo meio, com exceção do

ágar, acrescido de glicerol 25% (p/v) estéril foi utilizado para manutenção a -80°C. Os

diferentes morfotipos isolados foram depositados na Coleção de Microrganismos do

40

Laboratório de Biotecnologia de Microrganismos da UFSJ campus Centro-Oeste Dona

Lindu.

3.2.3. Identificação molecular da levedura amilolítica SBFL7

A levedura denominada SBFL7 foi identificada molecularmente por meio do

sequenciamento dos domínios D1/D2 da subunidade maior do gene do RNAr. Para a

extração do DNA total, a levedura foi cultivada em placas contendo ágar YM (glicose 10

g/L, peptona 5 g/L, extrato de levedura 3 g/L, extrato de malte 3 g/L, ágar 20 g/L) à 25ºC

por 24 horas. Após o crescimento, as colônias foram re-suspendidas em 100 μL de

tampão de lise (Tris-HCl 0,05M, EDTA 0,005M, NaCl 0,1M e SDS 1% p/v) e incubadas

em banho-maria a 65ºC por 30 minutos. Decorrida essa etapa, foram adicionados 200μL

de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) aos tubos e os mesmos foram homogeneizados

por inversão e centrifugados à 14.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi

retirado com auxílio de pipeta e transferido para outro tubo, ao qual foi adicionado v/v de

isopropanol. Os tubos foram deixados em repouso à temperatura ambiente durante 15

minutos para precipitação do DNA. Após essa etapa, os tubos foram centrifugados à

14.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado por inversão, e ao pellet

formado foram acrescentados 200μL de etanol 70%. Foi feita novamente uma

centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado por inversão

e os tubos incubados overnight à temperatura ambiente para total evaporação do etanol.

Após essa etapa, o DNA foi re-suspendido em 100 μL de tampão Tris-EDTA 0,1M (TE)

pH 8,0 e estocado a – 20ºC.

A amplificação dos domínios D1/D2 da subunidade maior do gene do RNAr foi

realizada por meio da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando-

se os iniciadores NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’), conforme Lachance e colaboradores (1999). A

PCR foi realizada em um volume final de 50 μL contendo 5 μL de tampão 10X

(Fermentas), 3 μL de MgCl2 25 mM (Fermentas) 2 μL de dNTP 10 mM, 1 μL dos

iniciadores NL1 e NL4 a 10 pmol/μL (MWG Biotech), 0,2 μL de Taq DNA Polimerase

5 U/μL (Fermentas) e 100 a 250 ng/μL de DNA; o volume final foi completado com

água ultrapura. As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o termociclador

Mastercycler (Eppendorf). O programa de ciclagem consistiu de uma desnaturação

inicial a 95 ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 15

segundos, anelamento à 54ºC por 25 segundos e extensão à 72ºC por 20 segundos,

41

com uma extensão final à 72ºC por 10 minutos. Os produtos de PCR foram analisados

por eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) em tampão TBE 0,5X. Os amplicons

foram corados pela adição de GelRed (Biotium) e os géis foram visualizados sob luz

ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat).

Para purificação dos amplicons gerados pela reação de PCR foram adicionados

aos tubos 11,25 μL de EDTA 125 mM e 135 μL de etanol absoluto. Os tubos foram

deixados em repouso à temperatura ambiente durante 15 minutos para a precipitação

do DNA. Posteriormente, os tubos foram centrifugados por 25 minutos a uma rotação

de 14.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e 120 μL de etanol 70% foram

adicionados para lavagem do sedimento. A mistura foi homogeneizada por inversão.

Posteriormente foi realizada uma nova centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos e

o sobrenadante foi descartado novamente. Os tubos foram incubados overnight à

temperatura ambiente para total evaporação do etanol. O DNA foi então re-

suspendido em 10 μL de água ultrapura. O produto obtido foi quantificado por

espectrometria, utilizando-se NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies). As

reações de sequenciamento foram realizadas por eletroforese capilar em aparelho ABI

3130, utilizando-se polímero POP7 e BigDye v3.1.

As sequências obtidas foram analisadas utilizando o programa BLASTn (Basic

Local Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI

desenvolvido pelo National Center for Biothecnology (ALTSCHUL et al., 1997). As

sequências foram comparadas às sequências já depositadas no GenBank, e as

sequências similares foram alinhadas utilizando-se o programa Molecular

Evolutionary Genetics Analysis-MEGA-6 (TAMURA et al., 2013). O poder

discriminatório das sequências da região D1/D2 da subunidade maior do gene do

rRNA é considerado suficiente para descrever novas espécies de leveduras, pois

isolados da mesma espécie apresentam de zero a no máximo de três bases diferentes

não-contíguas em uma sequência de cerca de 600 nucleotídeos (KURTZMAN et al.,

2011).

3.2.4. Determinação do crescimento celular

As culturas foram mantidas a 28°C em um shaker sob agitação constante de

200 rpm durante 120 h. Em intervalos de 24h, 2mL de cada cultura foram retirados e

utilizados para análise de crescimento. Tais amostras foram lidas em

espectrofotômetro em absorvância de 600 nm a fim de acompanhar o crescimento

42

celular da levedura. As amostras foram diluídas quando a densidade óptica

ultrapassou o valor de 0,8.

3.2.5. Atividade amilolítica dextrinizante

O ensaio para medida da atividade amilolítica dextrinizante fundamentou-se na

variação de intensidade da cor do complexo iodo-amido (FUWA, 1954). Para

determinar a atividade enzimática em solução, as amostras foram centrifugadas a

10.000 x g por 5min e em um tubo de ensaio foram adicionados: 60μL do

sobrenadante, 40μL de tampão acetato de sódio 0,5M pH 5,5 e 100μL de uma solução

de amido 0,5% (p/v). Essa mistura foi incubada a 40°C por 30min. A reação foi

interrompida com a adição de 200μL de ácido acético 1M e posteriormente corada

com 200μL de uma solução de iodo/iodeto (iodo 1% (p/v)) dissolvido em etanol. O

volume foi completado para 10mL com água destilada e após ser homogeneizado por

inversão, determinou-se as leituras a 660nm. Uma unidade (1U) de atividade de

amilase foi definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 0,1mg

de amido por minuto.

3.2.6. Avaliação do potencial de produção de amilase pela levedura

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7

O experimento de avaliação da produção de amilase pela levedura C. laurentii

iniciou-se com o pré-crescimento em meio YPD (extrato de levedura 1%, peptona 2%,

glicose 2%) líquido, a 28°C, a 200 rpm por 48 horas. Decorrido este tempo, procedeu-

se o pré-inóculo a fim de se antecipar a fase de adaptação da levedura ao meio de

cultivo. As culturas foram centrifugadas a 10.000 x g, lavadas com água destilada

estéril e parte das células obtidas foram transferidas para tubos cônicos de 50mL,

contendo 5mL de meio SSM (amido solúvel 2%, YNB 1,68%). As culturas foram

mantidas a 28°C, a 200 rpm durante 48 horas. Posteriormente, realizou-se o inóculo

das células em frascos Erlenmeyer de 250mL contendo 100mL de meio SSM (amido

solúvel 2%, YNB 1,68%). O cultivo foi realizado durante 120 horas. Em intervalos de

24 horas, 2mL de cada cultura foram retirados e utilizados para análise de crescimento

celular (600nm) e avaliação da atividade amilolítica, (660nm) monitorada por testes

empregando a metodologia de Fuwa (1954). Todos os testes foram realizados em

triplicata.

43

3.2.7. Avaliação da assimilação de amido bruto de mandioca pela levedura


Para a avaliação da capacidade de utilização do amido bruto de mandioca

como única fonte de carbono, a levedura foi pré-cultivada em meio YPD (extrato de

levedura 1%, peptona 2%, glicose 2%) líquido, a 28°C, a 200 rpm por 48 horas. As

culturas foram centrifugadas a 10.000 x g, lavadas com água destilada estéril e parte

das células obtidas foram transferidas para tubos cônicos de 50mL, com 5mL de meio

composto por amido bruto de mandioca 2% e YNB 1,68%. Os tubos foram incubados

a 28°C, 200 rpm durante 48 horas. Em seguida, realizou-se o inóculo das células em

frascos Erlenmeyer de 250mL contendo 100mL de meio contendo amido bruto como

única fonte de carbono. O cultivo foi realizado durante 120 horas. Alíquotas foram

retiradas em intervalos de 24 horas e utilizados para verificação do crescimento celular

(600nm) e avaliação da atividade amilolítica (660nm) segundo Fuwa (1954), ambos

em triplicata.

3.2.8. Análise das proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7

Para análise do perfil de proteínas secretadas pela levedura Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7, alíquotas do sobrenadante de 120 h de cultivo foram

submetidas a eletroforese desnaturante de proteínas (SDS-PAGE). As alíquotas

foram filtradas com filtro de 0,22 µm e foram submetidas a diálise contra tampão

acetato de sódio 50mM em pH 5.5, por 48 h, a 4 °C. Afim de contornar os problemas

referentes a quantidade de interferentes e a baixa concentração de proteínas no

sobrenadante, foi utilizada a precipitação por acetona. Ao sobrenadante dialisado foi

adicionado um volume 3 vezes maior de acetona PA previamente gelada e as

amostras foram incubadas a -20 °C por 1 ou 24 h e em seguida foram centrifugadas

a 15.000 x g por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o pellet

formado foi mantido a temperatura ambiente para evaporação da acetona residual.

Após a precipitação, as amostras foram ressuspendidas em tampão de amostra (β-

mercaptoetanol 6%, 12% Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), 30% glicerol e 0,05 de

Coomassie Blue G-250). A mistura foi aquecida a 100º C por 5 minutos e submetida

à eletroforese em gel de poliacrilamida 12% (v/v). A corrida eletroforética foi realizada

à temperatura ambiente, em tampão Tris-HCl glicina pH 8,8, utilizando marcador

padrão de peso molecular. Empregou-se uma voltagem de aproximadamente 80 V

44

durante o gel de concentração e quando as amostras alcançaram o gel de separação,

aplicou-se uma voltagem de 100 V até o término da corrida eletroforética.

3.2.8.1. Colaração com Nitrato de Prata

Ao término da corrida eletroforética, as proteínas presentes no gel foram

visualizadas utilizando o método de coloração com Nitrato de Prata, conforme descrito

por Blum e colaboradores (1987). Brevemente, após a corrida, o gel foi incubado, sob

agitação constante, durante 1 h na solução fixadora. Em seguida, o gel foi incubado

na solução de lavagem durante 20 min. Após repetir o procedimento de lavagem por

três vezes, o gel foi incubado na solução de tratamento por 1 min, seguido de três

lavagens com água destilada por 20 segundos cada. Ao término das lavagens, o gel

foi incubado durante 20 min na solução de nitrato de prata. Novamente o gel foi lavado

com água destilada duas vezes de 2 min cada e revelado com a solução reveladora.

A revelação foi interrompida após o aparecimento das bandas, transferindo-se o gel

para a solução de parada.

3.2.9. Detecção de atividade amilolítica em gel de poliacrilamida

(Zimograma)

A eletroforese em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE) foi realizada em

condições não desnaturantes (ausência de β-mercaptoetanol). Após a corrida

eletroforética, o gel foi lavado com água destilada e, posteriormente, incubado em

tampão acetato de sódio 50mM em pH 5,5 por 1 hora e, em seguida, incubado a 4ºC,

por 12 horas, em uma solução contendo 0,5% de amido solúvel (SIGMA) em tampão

acetato de sódio 50 mM em pH 5.5 sob agitação pendular branda. Após este período,

o gel foi incubado a 37ºC, por 2 horas, em tampão acetato de sódio 50 mM em pH 5.5.

As bandas proteicas com atividade de amilase foram detectadas após coloração com

uma solução de iodo (I2 1mM em KI 0,5M) (LACKS; SPRINGHORN, 1980).

3.2.10. Estudo dos fatores que influenciam a produção de amilase por


O primeiro passo para a análise dos fatores importantes para a produção da

amilase consistiu no estudo por levantamento bibliográfico dos principais parâmetros

descritos na literatura por influenciar a produção de amilases microbianas. De posse

45

dessas informações, foram selecionadas as variáveis independentes, os níveis a

serem investigados e o delineamento estatístico adequado para este fim.

Para análise dos efeitos de diferentes parâmetros sobre a produção da amilase,

bem como as interações entre estes parâmetros, adotou-se a Metodologia de

Superfície de Resposta (MSR) descrita por Box e Wilson (1951). Um delineamento

fatorial fracionado (DFF) de resolução IV (1/256 fração) foi usado com quatro

repetições no ponto central (213-8+4) resultando em 36 unidades experimentais, com

cada fator sendo investigado em um nível máximo (+1), mínimo (-1) e médio (0). Este

planejamento constitui a primeira fase experimental de um processo de otimização e

tem como finalidade a triagem dos fatores controláveis mais importantes que atuam

sobre a produção da enzima de interesse e das interações entre tais fatores. As treze

variáveis independentes (fatores controlados) e os respectivos níveis em que foram

estudadas encontram-se sumarizadas na Tabela 2.

Um modelo de primeira ordem foi usado para descrever os efeitos dos fatores

sobre as respostas:

Resposta = β0 + ∑ βi Xi (Equação 1)

Em que: β0 representa a constante; βi refere-se ao coeficiente do termo linear e Xi

corresponde à variável independente.

46

Tabela 2. Fatores e níveis estudados no Delineamento Fatorial Fracionado (DFF) de

resolução IV (213-8+4) para seleção de fatores importantes para a produção da amilase

de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

Fatores Níveis

-1 0 1

pH inicial 5,00 6,00 7,00

Temperatura (°C) 25,50 28,00 30,50

Amido Bruto (%) 0,50 2,00 3,50

Frutose (%) 0,00 1,50 3,00

Xilose (%) 0,00 1,50 3,00

Lactose (%) 0,00 1,50 3,00

Galactose (%) 0,00 1,50 3,00

Glicose (%) 0,00 1,50 3,00

Triptona (%) 0,00 1,00 2,00

Peptona (%) 0,00 1,00 2,00

Sulfato de amônio (%) 0,00 1,00 2,00

E.L. (%) 0,00 1,00 2,00

Maltose (%) 0,00 0,75 1,50

E.L.: Extrato de levedura

3.2.11. Determinação das condições que maximizam a produção da

amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7

Para investigar as condições que maximizam a produção da amilase de C.

laurentii, realizou-se um Delineamento Box-Behnken com base nas conclusões

obtidas no primeiro planejamento experimental. Nesta etapa, foi realizado um

deslocamento dos valores para as variáveis que foram capazes de causar variação

na produção de amilase, de acordo com o direcionamento fornecido pelo DFF. O

objetivo do deslocamento consiste em alterar os níveis das variáveis em estudo de

modo a aumentar a resposta de interesse até atingir um ponto ótimo (ZHUANG et al.,

2006). As cinco variáveis independentes foram estudadas em níveis máximo (+1),

mínimo (-1) e médio (0) e foram ensaiadas 6 repetições no ponto central totalizando

46 unidades experimentais. Os níveis em que cada fator foi estudado estão descritos

na (Tabela 3).

47

Tabela 3. Fatores e níveis estudados no Delineamento Box-Behken para otimização

da produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

Fatores Níveis

-1 0 1

pH inicial 5,50 6,75 8,00 Temperatura (°C) 22,00 25,00 28,00 Amido Bruto (%) 2,50 3,25 4,00 Peptona (%) 1,50 2,25 3,00 E.L. (%) 1,50 2,25 3,00

E.L.: Extrato de levedura

Um modelo de segundo grau foi utilizado para estimar o efeito de cada variável

e interações (Equação 2).

Resposta = β0 + ∑ βi Xi + ∑ βij XiXj + ∑ βii Xi2 (Equação 2)

Em que: β0 representa a constante; βi e βii referem-se aos termos dos coeficientes

linear e quadrático, respectivamente; βij corresponde ao termo da interação e Xi

representa a variável independente.

Após a construção e a seleção dos modelos preditivos (primário e secundário)

que descreveram a produção de amilase por Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7,

procedeu-se a validação, etapa que visa verificar a validade da equação quadrática

obtida em termos de representatividade do modelo. Para tanto, ensaios

independentes foram conduzidos em condições estimadas pelo modelo matemático e

os índices estatísticos denominados fatores bias (FB) e exatidão (FA), foram

empregados para comparação entre os valores preditos e os experimentais (ROSS,

1996). As Equações 3 e 4 representam os respectivos índices.

𝐹B = 10(∑log(𝑃/0)

𝑛) (Equação 3)

𝐹A = 10(∑|log(𝑃/0)|

𝑛) (Equação 4)

Em que: P corresponde aos valores preditos; O corresponde aos valores observados

e n representa o número de dados experimentais.

O fator bias constitui um indicador do desvio médio relativo existente entre os

valores preditos pelo modelo matemático e os valores observados experimentalmente.

48

Portanto, informa se os valores preditos pelo modelo matemático estão sub ou

superestimados. Um valor de FB igual a 1 denota que os valores preditos e observados

estão em total acordo. O fator de exatidão, por sua vez, é uma medida de discrepância

entre valores experimentais e valores preditos, fornecendo a exatidão do modelo.

Valores aceitáveis de FA devem estar em torno de 1 (GIFFEL, ZWIETERING, 1999).

Os experimentos de validação foram realizados em triplicata e foram

conduzidos nas condições estimadas de cada fator (pH inicial: 6,68, temperatura: 22

°C, amido bruto 4%, peptona 1,5%, extrato de levedura 1,71%).

Para a análise estatística dos resultados, considerou-se um nível de

significância igual a 5%. A magnitude dos efeitos das variáveis e das possíveis

interações entre elas foi avaliada por meio do coeficiente de regressão e a

confiabilidade analisada pelo valor do coeficiente de determinação (R2). A partir dos

resultados experimentais analisou-se o ajuste das regressões por meio do teste F. A

correlação de Pearson foi calculada para os valores de atividade amilolítica obtidos

em cada intervalo de 24h e para a atividade enzimática máxima no DFF. As análises

estatísticas foram efetuadas no software Minitab® 16.1.0 (MINITAB INC. 2010) e a

construção dos gráficos de superfície de resposta foram realizadas no software

Statistica (STATSOFT INC., 2008), versão 8.0.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Isolamento e seleção da levedura amilolítica a partir de folhas da

árvore Paineira (Ceiba speciosa)

O isolamento da levedura foi realizado por meio do processamento de folhas

da árvore Ceiba speciosa, pertencente à família Malvaceae (Bombacaceae),

popularmente conhecida como paineira, barriguda, paineira-rosa, paina-de-seda,

árvore-de-paina, paineira-branca, dentre outros. A paineira é uma espécie arbórea,

decídua, heliófita, seletiva higrófita, encontrada principalmente nas florestas

semidecíduas nos Estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Mato Grosso do Sul,

Paraná, Santa Catariana e Rio Grande do Sul. Seu tronco é cilíndrico, reto, grosso,

podendo apresentar protuberâncias laterais - justificam o nome popular “barriguda” -

revestidas de fortes acúleos. As folhas são compostas, digitadas, com 4 a 7 folíolos.

Suas flores são branca-arroxeadas ou branca-avermelhadas. Seu fruto é grande,

contendo em média 120 sementes (LEMES, 2011; LORENZI, 1992).

49

Devido ao expressivo potencial paisagístico, a paineira é recomendada para

arborização urbana (MATOS; QUEIROZ, 2009), e por essa razão, constitui uma das

diferentes variedades arbóreas que compõem a área verde do campus Centro-Oeste

Dona Lindu da Universidade Federal de São João Del Rei, na cidade de Divinópolis,

Estado de Minas Gerais, e foi escolhida ao acaso para isolamento de leveduras para

fins biotecnológicos.

O isolamento resultou na obtenção de um morfotipo capaz de crescer em meio

contendo amido como única fonte de carbono, e apresentou resultado positivo para

produção de amilase em meio mínimo sólido contendo amido 0,5%, evidenciado pela

formação do halo de hidrólise após coloração com vapor de Iodo (Figura 6).

Figura 6. Levedura amilolítica isolada a partir de folhas da árvore Paineira (Ceiba

speciosa). A) Cultivo em meio ágar YPD, esgotamento por estrias múltiplas. B) Teste

de atividade amamilolítica em placa de Petri contendo amido 0,5% após revelação

com vapor de Iodo. A área não corada corresponde ao halo de hidrólise.

O crescimento de microrganismos em meio contendo amido como única fonte

de carbono constitui um indício de que estes produzam amilase e a secretam para o

meio extracelular, uma vez que a molécula de amido, devido à alta massa molecular,

não é capaz de penetrar com eficiência a célula microbiana (SALYERS et al., 1996).

Uma forma de verificar tal habilidade, constitui a análise de produção de enzimas

extracelulares em meio sólido, uma vez que esta apresenta vantagens como preparo

simples e interpretação objetiva. Contudo, não proporcionam uma estimativa segura

50

do potencial de produção da enzima de interesse, fornecendo informações para

critérios preliminares (LIN et al., 1991; NETO, CUNHA 1987).

Alguns microrganismos comprovadamente amilolíticos podem apresentar

halos de hidrólise que subestimam sua atividade devido ao fato das enzimas

permanecerem adsorvidas a parede celular e apresentarem reduzida difusão no meio

de cultura sólido (SALYERS et al., 1996). Diversos trabalhos descrevem o potencial

de leveduras em secretar amilases (CARRASCO et al., 2016; KREGIEL, 2016;

OLIVEIRA et al., 2015; WANDERLEY et al., 2004).

4.2. Identificação molecular da levedura amilolítica SBFL7

Historicamente, os microrganismos vêm sendo identificados e classificados por

critérios morfológicos e análises bioquímicas (taxonomia convencional), entretanto, os

métodos convencionais são laboriosos, consomem grande tempo de trabalho e

podem ocasionar erros de identificação, uma vez que diferenças sutis podem não ser

distinguidas. As informações procedentes de ácidos nucléicos apresentam alta

sensibilidade e especificidade e podem ser empregadas na classificação de linhagens

microbianas em diversos níveis taxonômicos hierárquicos, além de possibilitar a

distinção com segurança entre espécies extremamente correlatas (SUH et al., 2006).

Nesse sentido, o uso da região do rDNA para fins taxonômicos tem sido

bastante utilizado (FELL et al., 2000; KURTZMAN, ROBNETT 1998).

No presente estudo, procedeu-se a identificação da levedura amilolítica isolada

das folhas da Paineira (Ceiba speciosa) por métodos moleculares. Para este

propósito, as sequências obtidas por meio do sequenciamento dos domínios D1/D2

da subunidade maior do gene do RNAr foram avaliadas utilizando a ferramenta

BLASTn (Basic Local Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível

no portal NCBI desenvolvido pelo National Center for Biothecnology (ALTSCHUL et

al., 1997). Após a comparação das sequências obtidas com as sequencias já

depositadas no GenBank, as sequências similares foram alinhadas utilizando-se o

programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis-MEGA-6 (TAMURA et al., 2013).

Os números de acesso no NCBI foram considerados, bem como os autores das

sequências de depósito das linhagens tipo listados por Kurtzman e colaboradores

(2011). As sequências apresentaram identidade maior que 99% com a sequência da

levedura Cryptococcus laurentii previamente depositada no GenBank. A Tabela 4

51

apresenta a relação do morfotipo isolado com a espécie identificada e o número de

acesso no NCBI da linhagem tipo correspondente.

Tabela 4. Identificação da levedura amilolítica isolada das folhas da árvore Paineira

(Ceiba speciosa).

Espécie Código da linhagem

isolada N° acesso no NCBI da

linhagem tipo

Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 AF075469

De acordo com Kurtzman e colaboradores (2011), a espécie Cryptococcus

laurentii pertence a linhagem dos Tremellales, do clado Bulleromyces. Sobre as

características morfológicas, os autores relatam que as colônias são convexas,

ligeiramente amorfas, com coloração pálida creme-acinzentada, com aspecto

mucóide e suave, com margens ligeiramente irregulares. Em ágar YPD, após 14 dias

a 25 °C, a cultura é lisa a convexa, brilhante, pálida amarelada e ocasionalmente pode

apresentar coloração próxima ao salmão, mucóide, lisa, e com margem linear ou

pouco ondulada.

A levedura foi isolada pela primeira vez a partir de vinho de palma e descrita

como Torula laurentii (KUFFERATH, 1920). Este isolado foi então renomeado em

1950 como Cryptococcus laurentii CBS139 (SKINNER, 1950). Cryptococcus laurentii

também foi isolada a partir de plantas ornamentais, flores de eucaliptos e de pinheiros

(BERNARDO et al., 2001). Duarte e colaboradores (1994) recuperaram leveduras a

partir de árvores urbanas, e dentre as cepas isoladas, os autores destacam

Cryptococcus laurentii como a mais frequente, sendo as folhas os locais de maior

isolamento da levedura.

A superfície externa da folha (filoplano) constitui um importante substrato para

o desenvolvimento de leveduras. Os nutrientes fornecem aporte ao desenvolvimento

de diferentes espécies que são transportadas pelo vento ou depositados na superfície

das partes aéreas das plantas, possibilitando a sobrevivência, crescimento e

reprodução nos tecidos vegetais (LINDOW, BRANDL 2003). A colonização epifítica

varia conforme condições como: luz, umidade e temperatura, assim como a

disponibilidade de carbono, fontes de nitrogênio e moléculas inorgânicas configuram

52

fatores determinantes para a permanência dos microrganismos nestes habitats

(ARAÚJO et al., 1998).

4.3. Avaliação do potencial de degradação do amido bruto de mandioca

pela levedura Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7

A partir dos resultados que demonstraram o potencial amilolítico da levedura

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7, foi avaliada a capacidade de utilização do

amido bruto de mandioca como única fonte de carbono. Com o objetivo de se verificar

a produção de amilase quanto a fonte de carbono utilizada, procedeu-se ao cultivo da

levedura em Meio SSM concomitante ao cultivo em meio contendo amido bruto de

mandioca 2% e YNB 0,67%. Os resultados estão apresentados graficamente na

Figura 7.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0h 24h 48h 72h 96h 120h

Ativid

ad

e E

nzim

ática

(U

/mL

)

(OD

60

0n

m)

Meio SSM (Starch Synthetic Medium)

Crescimento Atividade Enzimática (U/mL)

53

Figura 7. Perfil de crescimento celular e produção da amilase de Crytococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 em meio SSM (a) e meio contendo amido bruto de mandioca como

única fonte de carbono (b).

A atividade amilolítica máxima observada foi de 3,85 (U/mL), ao tempo de 120h

de cultivo em meio contendo amido bruto de mandioca como fonte de carbono, ao

passo que, utilizando o amido solúvel, o valor máximo observado foi 2,91 (U/mL), em

48h de cultivo. Este resultado fornece informações relevantes no que tange a fisiologia

da levedura frente ao metabolismo dos diferentes tipos de amido. Verifica-se, que no

cultivo contendo amido solúvel, o crescimento celular atinge o máximo em 24h

(OD600nm = 3,45), em seguida, pressupõe-se a desaceleração do crescimento,

evidenciada pelo decaimento nos valores de densidade ótica. Entretanto, quando o

amido bruto de mandioca é utilizado, o crescimento celular apresenta comportamento

divergente: valores de densidade ótica crescentes até o final do cultivo (OD600nm =

4,01), acompanhados pelo aumento gradual da produção de amilase: 3,85 U/mL.

Tais efeitos permitem supor que o amido solúvel (SIGMA, USA), por se tratar

de um substrato com alto grau de pureza e digestibilidade, configura uma fonte de

fácil acesso ao metabolismo microbiano, e portanto, forneça um aporte ao crescimento

celular observado nas primeiras horas de cultivo. Isso pode ser explicado pelo fato do

amido solúvel da SIGMA ser composto por uma grande quantidade de amilose, um

polímero linear e de mais fácil degradação. Em contrapartida, o amido bruto de

mandioca, substrato rudimentar e com baixas solubilidade e susceptibilidade a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0h 24h 48h 72h 96h 120h

Ativid

ad

e E

nzim

ática

(U

/mL

)

(OD

60

0n

m)

Amido bruto de mandioca

Crescimento Atividade Enzimática (U/mL)

54

degradação, sugere maior demanda ao metabolismo microbiano, o que pode justificar

a manutenção do crescimento celular, bem como a expressão e secreção da amilase,

ao longo das 120h de cultivo.

Adicionalmente, as diferenças observadas nos perfis de crescimento e

produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 podem ainda estar

relacionadas à própria estrutura do amido, que difere em função da origem do

polissacarídeo. A ação das enzimas amilolíticas sobre o grânulo de amido varia

conforme o tamanho, a cristalinidade do mesmo e a proporção de amilose (COSTA et

al., 2014). A proporção relativa de amilose e amilopectina difere consideravelmente

entre espécies vegetais distintas, o amido de batata, do qual provém o amido solúvel,

apresenta em média 30% de amilose e 70% de amilopectina (SCIPIONI, 2011),

enquanto que o amido de mandioca apresenta 16 e 84% respectivamente

(SWINKELS, 1985).

Sob a perspectiva biotecnológica, ainda que de forma preliminar, este resultado

é bastante promissor, visto que, utilizando substrato de baixo custo e fácil obtenção,

foi possível atingir maior produção da enzima de interesse, em detrimento do uso de

um substrato comercial - O amido solúvel (SIGMA, USA). Rattanachomsri e

colaboradores (2009), salientam que devido a sua natureza orgânica rica, baixo

conteúdo de cinzas, combinado ao baixo custo de cultivo e falta de competição com

outros usos industriais, os produtos oriundos da mandioca constituem substratos

ideais para a produção microbiana de produtos de valor agregado. Produtos como a

fécula, cascas e bagaço da mandioca já foram utilizados como substrato para a

produção de enzimas e outros insumos biotecnológicos (BAYITSE et al., 2015;

COUTINHO et al., 2013; LIN et al., 2011; MARQUES et al., 2013; MOSHI et al., 2016;

SHAKTIMAY et al., 2010).

4.4. Estudo dos fatores que influenciam produção da amilase da levedura


Um fator de fundamental relevância na montagem dos experimentos quando

se almeja a otimização de um processo, é o conhecimento das características e

peculiaridades envolvidas (RODRIGUES; IEMMA, 2009). Deve-se, portanto

considerar todo o conhecimento já estabelecido acerca do processo de modo a

construir um arcabouço teórico que permita interpretações bem fundamentadas e

decisões corretas no decorrer da execução experimental. Neste contexto, o primeiro

55

passo para o processo de otimização da produção da amilase de Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7 consistiu no estudo por levantamento bibliográfico das

condições de cultivo utilizadas para a produção de amilases microbianas (Tabela 5).

Tabela 5. Levantamento bibliográfico de parâmetros do meio de cultivo utilizados para

a produção de amilases microbianas.

Microrganismo Variáveis estudadas Referência

Aspergillus oryzae

MTCC 1847 Amido de batata, Nitrato de Sódio, pH, Temperatura. Ótimo:

Amido 2,01%, Nitrato de sódio 0,6%, pH 7,2, 25 ° C (TAMILARASAN et al.,

2014)

Bacillus megaterium Strain

B69

Teor de umidade, Tamanho do inóculo, Tempo, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4, CaCl2, NaNO3

(SAXENA et al., 2014)

Kluyveromyces marxianus IF0

pH, Temperatura. Ótimo: Amido 1%, pH 6.0, Temperatura: 30 °C (STERGIOU et al.,

2014)

Bacillus amyloliquefaciens

Temperatura, Tempo, pH, Tamanho do inóculo, KH2PO4, MgSO4,

NH4NO3, Amido, CaCl2, Maltose. Ótimo: período de incubação (42 horas) e CaCl2 (0,0275 M)

(GANGADHARAN et al., 2008)

Bacillus licheniformis

Amido, Frutose, Farinha de Soja, Peptona. Ótimo: frutose: 3%, peptona: 1%, farinha de soja: 2%

(KALISHWARALAL et al., 2010)

Bacillus laterosporus

Extrato de levedura, Amido, Peptona. NaCl. Ótimo: Extrato de levedura: 0,58%, Amido: 2,44%, Peptona: 2,34%, NaCl: 0,11%

(KUMAR et al., 2013)

Aspergillus oryzae CBS

819.72

Farelo de soja, Caseína ácida, Glicerol, (NH4)2SO4, CoCl2, NH3, CaCl2, ZnCl2, FeCl3, MnSO4, Tween 80. Ótimo: Ureia: 0,5%,

Caseína: 0,5%, Farelo de soja: 0,25%, Glicerol: 0,25%, (NH4)2SO4: 0.1%

(KAMMOUN et al., 2008)

Bacillus subtilis BI19

Farinha de arroz, Farinha de milho, Farinha de trigo, Amido, Farelo de arroz, Farelo de trigo, Peptona, Triptona, Extrato de

Levedura, Caseína, Ureia (DASH et al., 2015)

Bacillus amyloliquefaciens

pH inicial, Temperatura de incubação, Período de incubação, Volume do inóculo, Farinha de milho, Amido Solúvel, Farinha de arroz, Farinha de Trigo, Peptona, Triptona, Extrato de Levedura, Extrato de carne, Gelatina. Ótimo: Triptona e nitrato de amônio

(0,2%), Tempo: 48 h, pH: 9,0, Temperatura: 42 °C

(DEB et al., 2013)

Chrysosporium asperatum

Amido de batata, Sacarose, Glicose, Lactose, Frutose, Maltose, Xilose, Extrato de malte, Extrato de levedura, Peptona, Extrato

de carne, Ureia

(SANGHVI et al., 2011)

Aspergillus oryzae Teor de umidade, Relação C/N, Tamanho do inóculo. Ótimo: pH 6,0, teor de umidade: 76,25%, C/N: 0,62, tamanho do inóculo:

106,87

(SAHNOUN et al., 2015)

Aspergillus oryzae Amido, Extrato de levedura, K2HPO, MgSO4, Ureia. Ótimo: pH

7,5, Amido: 6.92 (g/L), Extrato de levedura: 4,5 (g/L), K2HPO: 1,5 (g/L)

(GIGRAS et al., 2002)

56

Candida utilis; Candida

guilliermondii Temperatura ótima: 30 °C, pH: 5.0

(OUÉDRAOGO et al.,

2012)

Candida albicans Maltose, Temperatura: 30 °C – 35 °C, pH: 6.0 (ARUNA et al., 2015)

Wickerhamia sp. Maltose, Glicose, Amido, Glicerol. Melhor fonte de carbono:

Maltose

(HERNÁNDEZ et al.,2012)

Saccharomycopsis capsularis

Glicerol, Amido, Glicose, Frutose, Arabinose, Lactose, Maltose, Manose, Ácido Glucônico, Peptona, Caseína, Triptona, Extrato

de levedura, K2HPO

(SONI et al., 1996)

Aureobasidium

pullulans Ótimo: 1% de amido, 1% de peptona, Temperatura: 28 °C,

agitação: 250 rpm (LI et al., 2007)

Saccharomycopsis

fibuligera Amido, Maltose, pH, Atividade máxima (SANDHU et al.,

1987)

Em virtude do potencial da levedura Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 em

metabolizar o amido bruto de mandioca e da importância de se otimizar as condições

de produção da amilase, um Delineamento Fatorial Fracionado (DFF) de Resolução

IV foi conduzido com a finalidade de selecionar os parâmetros mais importantes para

o cultivo da levedura, priorizando a produção da amilase. Foram estudadas 32

diferentes combinações de níveis entre os fatores, e foram ensaiadas quatro

repetições da combinação central cujo objetivo é avaliar o erro experimental do

planejamento. Considerou-se nesta etapa as exigências nutricionais e metabólicas,

principalmente no que diz respeito à expressão e secreção da enzima de interesse.

Conforme a matriz de planejamento (Tabela 6), foram realizados 36 ensaios

experimentais a fim de se determinar os efeitos dos diferentes fatores estudados sobre

a resposta. Em todos os ensaios foram avaliados o crescimento celular (OD600nm) e

atividade amilolítica, em intervalos de 24 horas. Os resultados foram representados

graficamente (Anexo A), e o conhecimento obtido através destes ensaios

fundamentaram as etapas subsequentes deste trabalho. Entretanto, para fins de

discussão, foram consideradas as unidade experimentais nas quais se obteve a maior

produção amilolítica (Figura 8).

57

Figura 8. Perfil de crescimento celular (DO600nm) e produção de amilase (U/mL) pela

levedura Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7 em condições avaliadas no

Delineamento Fatorial Fracionado (DFF). O crescimento celular e a produção de

amilase foram acompanhados em intervalos de 24 horas, durante 120 horas de

cultivo. Os gráficos são correspondentes as unidades experimentais descritas na

Tabela 6.

As unidades experimentais 14 e 22 evidenciaram a maior produção de amilase,

sendo observados 5,81 e 5,87 U/mL, respectivamente. Tais valores são superiores

aos encontrados por Mustafa e colaboradores (2016), que ao final do processo de

otimização da produção de amilase por Aspergillus flavus alcançaram

aproximadamente 1,05 U/mL. Essa comparação é de extrema relevância uma vez que

os fungos filamentosos são reconhecidos pelo seu potencial de secreção de enzimas.

Quando se avalia o perfil do crescimento da levedura nos ensaios de maior

atividade amilolítica (Figura 8), comportamentos ligeiramente distintos são

detectáveis, principalmente no que concerne a produção de biomassa. Nos ensaios

de nº 14 e 22 o crescimento atinge o seu valor máximo entre 72 (OD600nm = 9,52) e

48h (OD600nm = 2,03) de cultivo, respectivamente, e então percebe-se um decaimento

nos valores de densidade óptica. Quando se avalia a composição dos meio de cultivo

referentes a estes ensaios, verifica-se que a unidade experimental 14 foi

suplementada com as concentrações máximas das fontes de nitrogênio: peptona,

sulfato de amônio e extrato de levedura, enquanto o ensaio 22 foi suplementado

somente com peptona, também em sua concentração máxima. Nota-se que a

diferença entre os valores de crescimento celular não reflete em diferença significativa

nos valores de atividade de amilase. Tal observação permite supor que a produção

amilolítica não está diretamente relacionada a produção de biomassa, e que o

0

2

4

6

8

0

2

4

6

8

10

0horas

24horas

48horas

72horas

96horas

120horas A

tivi

dad

e En

zim

átic

a U

/mL

(OD

60

0n

m)

Unidade experimental 14

Crescimento Atividade Enzimática

0

2

4

6

8

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0horas

24horas

48horas

72horas

96horas

120horas

Ati

vid

ade

Enzi

mát

ica

(OD

60

0n

m)


Crescimento Atividade Enzimática

58

incremento de fontes de nitrogênio direciona o metabolismo da levedura para a

produção de biomassa, em detrimento da produção amilolítica.

Quanto ao perfil de produção de amilase, em ambos os ensaios os valores de

atividade aumentaram gradativamente até 120h de cultivo. Resultados semelhantes

foram verificados em Aspergillus flavus por Padmini e colaboradores (2012) e

corroborados por Ominyi (2013). No entanto, divergem dos resultados obtidos por

Wanderley e colaboradores (2004) e Galdino (2008), os quais verificaram que a

produção de amilase por Cryptococcus flavus, atinge o máximo nas primeiras 24h de

cultivo. Vale ressaltar que tais resultados foram observados quando se utilizou amido

solúvel como fonte de carbono. No entanto, quando Trindade (2014) avaliou a

produção da amilase de Cryptococcus flavus empregando amido bruto de mandioca,

o perfil de produção da enzima é semelhante aos resultados obtidos no presente

estudo, alcançando a atividade máxima ao final de 120h de cultivo. De fato, os

resultados obtidos pelos autores dos trabalhos mencionados acima reforçam a

hipótese já proposta no tópico 4.3 deste trabalho, de que o tipo de amido utilizado

influencia fortemente na produção da amilase em leveduras. O amido solúvel, por se

tratar de uma fonte de carbono de fácil acesso, é consumido rapidamente, e isto reflete

na produção da amilase apenas nas primeiras horas, enquanto que, o amido bruto de

mandioca, devido a maior complexidade estrutural e presença de impurezas que

podem até mesmo inibir o metabolismo microbiano, é consumido de forma gradual, e

seus produtos de hidrólise podem atuar na manutenção da cultura por tempo

prolongado.

Analisando a matriz de planejamento (Tabela 6) bem como os valores

estimados para os coeficientes de regressão (Tabela 7), verifica-se que os ensaios

que apresentaram maior atividade enzimática compartilham os mesmos valores de

pH, temperatura e concentrações de amido bruto e peptona, e que tais fatores são

altamente significativos em causar variação na resposta.

Todos os resultados obtidos em cada tempo de cultivo (24 a 120h) foram

analisados estatisticamente, no entanto, foram considerados para fins de discussão,

o maior valor de atividade amilolítica de cada ensaio individualmente, ou seja, tempo

no qual a atividade da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 atingiu

valores máximos. Dessa forma, a variável resposta considerada foi denominada

“atividade enzimática máxima (A.E. máx.)”.

59

A matriz do planejamento experimental com a combinação dos fatores e a

resposta obtida experimentalmente em cada uma dessas combinações encontram-se

sumarizadas na Tabela 6.

Os Coeficientes de Regressão obtidos a partir dos resultados experimentais, o

seu respectivo p-valor e coeficiente de determinação são apresentados na Tabelas 7.

58

Tabela 6. Combinações de níveis dos fatores estudados, segundo Delineamento Fatorial Fracionado Resolução IV (213-8+4), com os

respectivos valores observados de atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7.

Ensaio

Fatores Resposta

pH Temperatura

(°C)

Amido Bruto (%)

Frutose (%)

Xilose (%)

Lactose (%)

Galactose (%)

Glicose (%)

Triptona (%)

Peptona (%)

Sulfato de

amônio (%)

E.L. Maltose

(%)

A.E. Máx.

(U/mL) Tempo

1 5,0 25,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,69 120h 2 7,0 25,5 0,5 0,0 0,0 3,0 0,0 3,0 0,0 2,0 2,0 2,0 1,5 2,94 96h 3 5,0 30,5 0,5 0,0 0,0 0,0 3,0 3,0 0,0 2,0 2,0 0,0 0,0 1,66 72h 4 7,0 30,5 0,5 0,0 0,0 3,0 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 1,5 3,26 120h 5 5,0 25,5 3,5 0,0 0,0 3,0 3,0 3,0 2,0 2,0 0,0 2,0 0,0 5,42 120h 6 7,0 25,5 3,5 0,0 0,0 0,0 3,0 0,0 2,0 0,0 2,0 0,0 1,5 5,21 96h 7 5,0 30,5 3,5 0,0 0,0 3,0 0,0 0,0 2,0 0,0 2,0 2,0 0,0 3,84 120h 8 7,0 30,5 3,5 0,0 0,0 0,0 0,0 3,0 2,0 2,0 0,0 0,0 1,5 4,63 96h 9 5,0 25,5 0,5 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 2,0 0,0 2,0 1,5 3,83 96h

10 7,0 25,5 0,5 3,0 0,0 3,0 0,0 3,0 2,0 0,0 2,0 0,0 0,0 2,31 96h 11 5,0 30,5 0,5 3,0 0,0 0,0 3,0 3,0 2,0 0,0 2,0 2,0 1,5 2,06 96h 12 7,0 30,5 0,5 3,0 0,0 3,0 3,0 0,0 2,0 2,0 0,0 0,0 0,0 3,22 96h 13 5,0 25,5 3,5 3,0 0,0 3,0 3,0 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,5 4,29 120h 14 7,0 25,5 3,5 3,0 0,0 0,0 3,0 0,0 0,0 2,0 2,0 2,0 0,0 5,81 96h 15 5,0 30,5 3,5 3,0 0,0 3,0 0,0 0,0 0,0 2,0 2,0 0,0 1,5 3,14 120h 16 7,0 30,5 3,5 3,0 0,0 0,0 0,0 3,0 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 4,51 120h 17 5,0 25,5 0,5 0,0 3,0 3,0 3,0 0,0 2,0 2,0 2,0 0,0 1,5 1,61 96h 18 7,0 25,5 0,5 0,0 3,0 0,0 3,0 3,0 2,0 0,0 0,0 2,0 0,0 3,03 72h 19 5,0 30,5 0,5 0,0 3,0 3,0 0,0 3,0 2,0 0,0 0,0 0,0 1,5 0,43 24h 20 7,0 30,5 0,5 0,0 3,0 0,0 0,0 0,0 2,0 2,0 2,0 2,0 0,0 3,43 96h 21 5,0 25,5 3,5 0,0 3,0 0,0 0,0 3,0 0,0 0,0 2,0 2,0 1,5 3,23 96h 22 7,0 25,5 3,5 0,0 3,0 3,0 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,0 0,0 5,87 120h 23 5,0 30,5 3,5 0,0 3,0 0,0 3,0 0,0 0,0 2,0 0,0 2,0 1,5 4,06 120h

59

24 7,0 30,5 3,5 0,0 3,0 3,0 3,0 3,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,0 1,05 96h 25 5,0 25,5 0,5 3,0 3,0 3,0 3,0 0,0 0,0 0,0 2,0 2,0 0,0 2,14 96h 26 7,0 25,5 0,5 3,0 3,0 0,0 3,0 3,0 0,0 2,0 0,0 0,0 1,5 4,38 120h 27 5,0 30,5 0,5 3,0 3,0 3,0 0,0 3,0 0,0 2,0 0,0 2,0 0,0 2,31 96h 28 7,0 30,5 0,5 3,0 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 1,5 1,75 96h 29 5,0 25,5 3,5 3,0 3,0 0,0 0,0 3,0 2,0 2,0 2,0 0,0 0,0 4,21 72h 30 7,0 25,5 3,5 3,0 3,0 3,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,0 2,0 1,5 5,11 96h 31 5,0 30,5 3,5 3,0 3,0 0,0 3,0 0,0 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,77 96h 32 7,0 30,5 3,5 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,5 4,72 96h 33 6,0 28,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,75 5,39 96h 34 6,0 28,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,75 4,48 120h 35 6,0 28,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,75 4,96 96h 36 6,0 28,0 2,0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,75 4,51 120h

E.L.: Extrato de levedura, A.E. Máx.: Atividade Enzimática Máxima

60

Tabela 7. Estimativa do Coeficiente de Regressão (CR) e p-valor para a atividade

máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 segundo Delineamento

Fatorial Fracionado (DFF).

Fator A.E máx. (R2 = 97,11)

CR p-valor

Constante 3,40 0,00*

pH inicial 0,47 0,00*

Temperatura -0,41 0,00*

Amido Bruto 0,90 0,00*

Frutose 0,19 0,10

Xilose -0,21 0,08

Lactose -0,17 0,14

Galactose 0,07 0,48

Glicose -0,20 0,09

Triptona 0,14 0,20

Peptona 0,42 0,00*

Sulfato de amônio -0,33 0,01*

E.L. 0,32 0,03*

Maltose 0,01 0,91

pH inicial*Temperatura -0,09 0,40

pH inicial*Amido Bruto -0,11 0,31

pH inicial*Frutose -0,04 0,68

pH inicial*Xilose 0,05 0,64

pH inicial*Lactose -0,09 0,40

pH inicial*Galactose -0,06 0,52

pH inicial*Glicose -0,17 0,13

pH inicial*Triptona -0,01 0,87

pH inicial*Peptona 0,12 0,27

pH inicial*Sulfato de amônio -0,09 0,41

pH inicial*E.L. -0,05 0,62

pH inicial*Maltose 0,16 0,16

Temperatura*Frutose 0,00 0,99

Temperatura*E.L 0,20 0,09

Temperatura*Maltose 0,00 0,96

Ct Pt 1,43 0,00

(*) variáveis estatisticamente significativas, ao nível de 5% de significância

A partir dos resultados obtidos experimentalmente, avaliou-se o ajuste da

regressão por meio do teste F para análise de variância (ANOVA) (Tabela 8). Verifica-

se que 97,11% dos dados experimentais podem ser explicados, a um nível de

61

confiança de 95%. Sendo assim, o modelo obtido para a atividade enzimática máxima

permite estudar a influência dos fatores sobre a resposta, e possui alto poder de

predição, como revelado pelo valor do coeficiente de determinação (R2).

Tabela 8. Análise de variância da regressão para a resposta atividade máxima da

amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 no Delineamento Fatorial

Fracionado (DFF).

Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Grau de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F p-Valor

Regressão 68,32 29 2,35 6,96 0,01

Erro 2,03 6 0,33 - -

Total 70,35 35 - - -

F (tabelado)= 2,04

As interpretações dos efeitos dos fatores sobre as respostas são apresentadas

nas Figuras 9 e 10, por meio de Diagrama de Pareto, que permite priorizar os efeitos

mais importantes, e de gráficos de efeitos principais, que possibilitam a visualização

do comportamento de cada fator e permite estabelecer a direção do deslocamento

dos níveis de cada variável para a próxima etapa do estudo. Estabeleceu-se que todas

as variáveis com p-valor <0,05 são consideradas significativas.

62

Figura 9. Gráfico de Pareto para seleção de fatores com maior efeito sobre a resposta

atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

Figura 10. Gráficos de efeitos principais dos fatores estudados sobre a atividade

máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

63

Verifica-se, da análise dos coeficientes de regressão e p-valores estimados

(Tabela 7), bem como da avaliação dos efeitos dos fatores (Figuras 9 e 10) que a

produção de amilase por Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 foi influenciada de

forma significativa pela variação dos fatores amido bruto de mandioca, peptona, pH

inicial, temperatura, sulfato de amônio e extrato de levedura.

Valores positivos dos coeficientes de regressão (Tabela 7) sugerem um

aumento na atividade da amilase quando a variável segue em direção ao seu nível

máximo. Em contrapartida, valores negativos indicam que uma maior resposta é

obtida no nível mínimo da variável. As variáveis amido bruto, peptona e extrato de

levedura apresentaram efeitos significativos e positivos sobre a produção da amilase.

Da mesma forma, o pH inicial influenciou significativa e positivamente a resposta. O

aumento dos níveis dessas variáveis resulta em um aumento significativo dos valores

de atividade amilolítica. De forma contrária, a temperatura de cultivo influenciou

negativamente, ou seja, a diminuição da temperatura em que o cultivo se estabeleceu,

resultará em aumento significativo da produção da amilase.

Verifica-se, da comparação dos efeitos estimados sobre a resposta (Figura 9),

que o amido bruto de mandioca foi o fator mais importante em causar variação nos

valores da atividade da amilase. Segundo Russell (2003), os requisitos específicos

para o metabolismo de leveduras incluem: (i) água; (ii) uma fonte de carbono –

carboidratos fermentescíveis como fonte de energia; (iii) oxigênio; (iv) fonte de

nitrogênio; (v) fatores de crescimento, como vitaminas, e (vi) íons inorgânicos –

essenciais para o metabolismo celular. Na Tabela 9 estão sumarizados os

componentes do amido bruto de mandioca, através da qual nota-se que se trata de

um substrato rico em nutrientes que não somente induz a expressão da amilase, mas

também fornece suporte nutricional ao crescimento celular. Além dos componentes

apresentados, ainda fazem parte da composição química do amido de mandioca

alguns minerais, tais como: Nitrogênio, Ferro e Manganês, nas concentrações de 0,35;

44,0 e 17,0 (mg/kg de massa seca), respectivamente (SILVA, 2005).

64

Tabela 9. Principais nutrientes presentes no amido de mandioca

Composição do Amido de Mandioca

Componente Quantidade (%)

Amido 63,6

Proteína 2,31

Fósforo 0,03

Cálcio 0,09

Potássio 0,28

Extrato Etéreo 0,65

Fibra 8,33

Glicose 0,24

Fonte: SILVA, (2005).

Neste estudo foi avaliada a influência de diversas fontes de carbono sobre a

produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7: amido, frutose,

xilose, lactose, galactose, glicose e maltose. Entretanto, apenas o amido bruto de

mandioca influenciou significativamente a resposta. De fato, alguns estudos relatam a

indução de amilases utilizando outras fontes de carbono, nos quais a maltose exerceu

importante influência sobre a produção da amilase da levedura Wickerhamia sp.,

enquanto glicose reprimiu fortemente a expressão da enzima (HERNÁNDEZ-

MONTAÑEZ et al., 2012). O efeito indutor da maltose também foi verificado sobre a

produção amilolítica de Candida albicans (ARUNA et al., 2015).

Quanto à glicose, existe controvérsia sobre o seu papel para a produção de

amilase, e este varia, de forma muito específica, em função das concentrações

utilizadas e do microrganismo amilolítico. Efeito fortemente repressor tem sido descrito

para amilases bacterianas (HENKIN et al., 1991; MAHALAKSHMI, JAYALAKSHMI

2016), amilases fúngicas (FRANCIS et al., 2002; GOTO et al., 1998) e também para

a produção de amilases por leveduras (HORN et al., 1988; STEWART, RUSSELL

1987). No entanto, a glicose induziu a expressão da amilase de Aspergillus nidulans

e Aspergillus oryzae (LACHMUND et al., 1993). Gancedo (1992), propõe que a

utilização de glicose e outras fontes de carbono rapidamente metabolizáveis,

dependendo da concentração utilizada, podem reprimir a expressão de genes que

65

codificam enzimas relacionadas ao metabolismo de outras fontes de carbono. De fato,

tais resultados demonstram a grande complexidade do controle metabólico e

transcricional microbiano, e a relevância da realização de estudos abrangentes sobre

fontes nutricionais quando se busca o conhecimento acerca da fisiologia de

determinado microrganismo visando a produção de metabólitos.

Dentre as fontes de nitrogênio investigadas, apresentaram resultado

estatisticamente significativo peptona e extrato de levedura, influenciando de forma

positiva a produção da amilase, e sulfato de amônio de forma negativa. As fontes de

nitrogênio exercem efeitos importantes sobre a produção de enzimas microbianas,

uma vez que atuam como precursores para a biossíntese de ácidos nucléicos,

aminoácidos, proteínas e outros componentes celulares. Neste sentido, as fontes de

nitrogênio orgânico têm sido descritas por diversos pesquisadores como sendo mais

efetivas para a produção de amilase (PEDERSEN, NIELSEN 2000; JIN et al., 2001;

KUNAMNENI et al., 2005; GOYAL et al., 2005). Quanto as fontes inorgânicas, a

utilização de sais de amônia, como o sulfato de amônia, tem sido atribuída à

acidificação do meio de cultivo, ocasionando a redução do crescimento do

microrganismo e resultando em baixos níveis de produção da amilase. Tal efeito se

justifica pela capacidade da amônia em aceitar um próton, reduzindo o pH do meio do

cultivo a níveis que comprometem a viabilidade da cultura (CARLSEN et al., 1996).

Os demais fatores com influência estatisticamente significativa sobre a

produção de amilase foram o pH inicial e a temperatura do cultivo. A análise dos

efeitos principais (Figura 10) permite verificar que valores maiores de atividade

amilolítica são observados quando os valores de pH tendem ao nível máximo, e

quando a temperatura de incubação tendem ao nível mínimo. A influência do pH e da

temperatura na produção da amilase podem estar diretamente relacionadas ao

crescimento celular, e portanto, influenciam significativamente a produção da amilase.

STERGIOU e colaboradores (2014) salientam que a otimização das condições

fisiológicas de crescimento celular é essencial para maximizar o padrão de síntese da

amilase.

A análise dos efeitos principais dos fatores estudados, bem como os valores

observados para a resposta produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7 no DFF permitiram estipular as faixas de níveis a serem investigadas para os

fatores: concentração de amido bruto, peptona e extrato de levedura, e valores de pH

e temperatura na etapa seguinte do estudo. Adicionalmente, direcionou o

66

planejamento experimental de segunda fase de otimização por meio de um

Delineamento do tipo Box-Behnken.

Atentou-se ainda para o fato de que seria desejável que a tomada de decisão

com relação à escolha dos fatores a serem selecionados para o próximo passo da

otimização, fosse válida e aplicável a todos os tempos de cultivo (de 24 a 120h), uma

vez que, a atividade da amilase atingiu valores máximos em tempos distintos para

cada ensaio, e não se poderia estimar o tempo em que atividade máxima seria

alcançada durante a etapa subsequente a esta, uma vez que o tempo de cultivo não

foi estabelecido como fator de estudo. A maneira encontrada para atender a essa

demanda consistiu na avaliação do Coeficiente de Correlação de Pearson (r), que

permite mensurar o grau de relação linear entre variáveis distintas. Quanto mais

próximo estiver de 1 ou -1, mais forte é a associação linear entre as variáveis testadas

(STANTON, 2001). Sendo assim, testou-se a hipótese de que existe correlação linear

entre os valores de atividade amilolítica obtidos em cada tempo de cultivo e a resposta

atividade enzimática máxima. Os valores obtidos são apresentados na Tabela 10.

Tabela 10. Coeficiente de Correlação de Pearson (r) entre os tempos de cultivos e a

atividade máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7

Correlação de Pearson (r)

Variáveis correlacionadas A.E. Máx. 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

24 horas r 0,86

p-valor 0,00

48 horas r 0,86 0,96

p-valor 0,00 0,00

72 horas r 0,92 0,90 0,90

p-valor 0,00 0,00 0,00

96 horas r 0,94 0,90 0,90 0,98

p-valor 0,00 0,00 0,00 0,00

120 horas r 0,94 0,75 0,75 0,86 0,86

p-valor 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Os Coeficientes de Correlação de Pearson (r) apresentaram significância

estatística (p-valor=0,00) e valores ≥0,75, o que estabelece que existe uma correlação

linear positiva e estatisticamente significativa entre os valores de atividade amilolítica

67

obtidos em cada tempo de cultivo e a resposta atividade enzimática máxima,

corroborando a legitimidade da hipótese testada.

Deve-se considerar de suma importância uma adequada formulação do meio

de cultivo quando se busca a otimização da produção de um determinado metabólito

microbiano, tanto do ponto de vista fisiológico quanto econômico (BEZBARUAH, et al.,

1994). Conforme observado neste trabalho, a utilização do Delineamento Fatorial

Fracionado permitiu reduzir o número de fatores estudados de 13 para 5, o que implica

redução significativa de custos. Delineamentos fatoriais fracionados, de fato têm

constituído alternativa adequada na etapa de triagem dos fatores em estudos de

otimização (GÜNDOĞDU et al., 2016; GRUDZIEŃ et al., 2013; PRADO et al., 2016).

4.5. Determinação das condições que maximizam a produção da

amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7

O delineamento Box-Behnken foi proposto com o objetivo de se delinear a

região ótima de produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 e

construir modelos preditivos válidos para estimar a variável resposta. Foram

estudadas 40 diferentes combinações de níveis entre os fatores e foram realizadas 6

repetições do ponto central com a finalidade de se avaliar o erro experimental do

planejamento, totalizando 46 unidades experimentais. A Tabela 11 representa a matriz

do planejamento experimental com as combinações dos fatores avaliados e a variável

resposta obtidas experimentalmente.

Tabela 11. Combinações de níveis dos fatores, segundo Delineamento Box-Behnken,

com os respectivos valores observados de atividade máxima da amilase de C. laurentii

LABIOM-SBFL7.

Ensaio

Fatores Resposta

pH inicial Temperatura

(°C) Amido Bruto

(%) Peptona

(%) E.L. (%)

A.E. Máx.

(U/mL) Tempo (h)

1 5,50 22,0 3,25 2,25 2,25 8,59 120

2 8,00 22,0 3,25 2,25 2,25 8,46 120

3 5,50 28,0 3,25 2,25 2,25 6,94 120

4 8,00 28,0 3,25 2,25 2,25 5,98 120

5 6,75 25,0 2,50 1,50 2,25 7,02 120

6 6,75 25,0 4,00 1,50 2,25 9,26 120

7 6,75 25,0 2,50 3,00 2,25 8,52 120

8 6,75 25,0 4,00 3,00 2,25 8,22 120

9 6,75 22,0 3,25 2,25 1,50 9,38 120

10 6,75 28,0 3,25 2,25 1,50 5,75 96

68

11 6,75 22,0 3,25 2,25 3,00 8,18 120

12 6,75 28,0 3,25 2,25 3,00 7,12 120

13 5,50 25,0 2,50 2,25 2,25 7,93 120

14 8,00 25,0 2,50 2,25 2,25 7,48 120

15 5,50 25,0 4,00 2,25 2,25 8,93 120

16 8,00 25,0 4,00 2,25 2,25 7,23 120

17 6,75 25,0 3,25 1,50 1,50 8,65 120

18 6,75 25,0 3,25 3,00 1,50 8,58 120

19 6,75 25,0 3,25 1,50 3,00 7,64 120

20 6,75 25,0 3,25 3,00 3,00 8,62 120

21 6,75 22,0 2,50 2,25 2,25 8,49 120

22 6,75 28,0 2,50 2,25 2,25 6,23 96

23 6,75 22,0 4,00 2,25 2,25 8,59 120

24 6,75 28,0 4,00 2,25 2,25 7,21 120

25 5,50 25,0 3,25 1,50 2,25 8,71 120

26 8,00 25,0 3,25 1,50 2,25 8,52 120

27 5,50 25,0 3,25 3,00 2,25 8,49 120

28 8,00 25,0 3,25 3,00 2,25 8,15 120

29 6,75 25,0 2,50 2,25 1,50 7,29 120

30 6,75 25,0 4,00 2,25 1,50 8,33 120

31 6,75 25,0 2,50 2,25 3,00 7,01 96

32 6,75 25,0 4,00 2,25 3,00 8,16 120

33 5,50 25,0 3,25 2,25 1,50 6,91 96

34 8,00 25,0 3,25 2,25 1,50 8,21 120

35 5,50 25,0 3,25 2,25 3,00 8,37 120

36 8,00 25,0 3,25 2,25 3,00 6,67 120

37 6,75 22,0 3,25 1,50 2,25 10,4 120

38 6,75 28,0 3,25 1,50 2,25 5,51 120

39 6,75 22,0 3,25 3,00 2,25 8,36 120

40 6,75 28,0 3,25 3,00 2,25 8,12 120

41 6,75 25,0 3,25 2,25 2,25 8,56 96

42 6,75 25,0 3,25 2,25 2,25 8,61 96

43 6,75 25,0 3,25 2,25 2,25 8,67 96

44 6,75 25,0 3,25 2,25 2,25 8,65 96

45 6,75 25,0 3,25 2,25 2,25 8,61 96

46 6,75 25,0 3,25 2,25 2,25 8,64 96

Os experimentos foram conduzidos durante 120h, e foram avaliados o

crescimento celular (OD600nm) e a atividade amilolítica (U/mL) em intervalos de 24h.

Todos os resultados foram avaliados e estão representados individualmente no Anexo

B. Para fins de discussão, foram consideradas as unidade experimentais nas quais se

obteve a maior produção amilolítica (Figura 11).

69

Figura 11. Perfil de crescimento celular (DO600nm) e produção de amilase (U/mL) pela

levedura Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 em cada uma das condições

avaliadas no Delineamento Box-Behnken. O crescimento celular e a produção de



Tabela 11.

Os ensaios experimentais realizados com a finalidade de se determinar as

concentrações dos fatores pH inicial, temperatura de cultivo e concentrações de amido

bruto, peptona e extrato de levedura que potencializam a produção da amilase

revelaram maiores valores de atividade amilolítica nos ensaios de número 9 e 37,

sendo observados 9,38 e 10,44 U/mL, respectivamente. Tais valores são semelhantes

a produção amilolítica da levedura Wickerhamia sp. que atingiu o valor de 10,79 U/mL

(HERNÁNDEZ-MONTAÑEZ et al., 2012) e são superiores aos encontrados por Kim e

colaboradores (2016), os quais ao término do processo de otimização da amilase de

Arthrobacter sp relataram 2,50 U/mL.

Da análise dos gráficos correspondentes aos ensaios 9 e 37, verifica-se que a

produção da amilase prolonga-se durante as 120h de cultivo. O crescimento

exponencial da levedura foi observado até 48h nos ensaios citados, a partir deste

último tempo, a cultura entrou na fase estacionária.

Na Tabela 12 estão dispostos os coeficientes estimados do modelo completo

em unidades codificadas, ou seja, com os coeficientes representando a magnitude da

influência de cada fator na resposta avaliada, para o estudo e a visualização

quantitativa desta influência.

0

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

0horas

24horas

48horas

72horas

96horas

120horas A

tivi

dad

e En

zim

átic

a U

/mL

(OD

60

0n

m)


Crescimento Celular Atividade Enzimática

0

2

4

6

8

10

12

0

2

4

6

8

0horas

24horas

48horas

72horas

96horas

120horas

Ati

vid

ade

Enzi

mát

ica

U/m

L

(OD

60

0n

m)


Crescimento Celular Atividade Enzimática

70

Tabela 12. Estimativa do Coeficiente de Regressão (CR) e p-valor para a atividade

máxima da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7 segundo Delineamento

Box-Behnken.

Fator A.E. máx. (R2 = 95,41)

CR p-valor

Constante 8,62 0,00*

pH inicial(L) -0,26 0,00*

Temperatura (L) -1,10 0,00*

Amido bruto (L) 0,37 0,00*

Peptona (L) 0,08 0,26

E.L. (L) -0,08 0,25

pH inicial(Q) -0,43 0,00*

Temperatura (Q) -0,62 0,00*

Amido bruto (Q) -0,40 0,00*

Peptona (Q) 0,16 0,09

E.L. (Q) -0,49 0,00*

pH inicial * Temperatura -0,20 0,15

pH inicial * amido bruto -0,31 0,03*

pH inicial * Peptona -0,03 0,79

pH inicial * E.L. -0,75 0,00*

Temperatura * amido bruto 0,22 0,13

Temperatura * peptona 1,17 0,00*

Temperatura * E.L. 0,64 0,00*

Amido bruto * peptona -0,63 0,00*

Amido bruto * E.L. 0,02 0,84

Peptona * E.L. 0,26 0,07

E.L.: extrato de levedura. (*) estatisticamente significativo ao nível de confiança de 95%.

71

O modelo preditivo de segunda ordem foi ajustado com a finalidade de

descrever a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 em

função dos valores dos níveis dos fatores selecionados. A Tabela 13 mostra o modelo

ajustado com coeficientes não codificados. De acordo com Rodrigues e Iemma (2009),

é sempre favorável que o modelo ajustado seja simples e possua o menor número

possível de parâmetros. Sendo assim, além dos fatores lineares e quadráticos,

apenas as interações estatisticamente significativas a um nível de confiança de 95%

foram selecionadas.

Tabela 13. Modelo ajustado com os coeficientes representando os valores reais de

cada fator avaliado para a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7.

Resposta Modelo preditivo R2 (%)

A.E. máx.

y = - 31,2* + 6,44X1* + 1,26X2* + 10,01X3*- 10,59X4 + 2,11X5 - 0,27X1

2* - 0,06X22* - 0,72X3

2* + 0,29X42

- 0,87X52* - 0,33X1X3* - 0,80X1X5* + 0,52X2X4*

+ 0,28X2X5* - 1,12X3X4*

93,93

X1: pH inicial; X2: temperatura; X3: amido bruto; X4: peptona; X5: extrato de levedura. (*) Indica os termos significativos da equação (p-valor < 0,05).

O modelo de regressão foi avaliado com o objetivo de estimar a sua capacidade

preditiva, antes de ser utilizado para a determinação dos valores das variáveis que

maximizam a resposta. Esta avaliação foi realizada pela aplicação da análise de

variância (ANOVA) apresentada na Tabela 14. A falta de ajuste não foi observada,

indicando que o modelo foi válido para este estudo. Esta afirmativa foi reforçada pelo

satisfatório coeficiente de determinação obtido (R2 =93,93) quando os valores

experimentais e preditos foram comparados.

Tabela 14. Análise de variância do modelo ajustado para a resposta atividade máxima

da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7 no Delineamento Box-Behken.

Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Grau de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F p-Valor

Regressão 41,50 15 2,76 30,97 0,00

Erro 2,68 30 0,08 - -

Total 44,18 45 - - -

F (tabelado)= 2,01 R2 = 93,93

72

As Figuras 12 a 16 mostram os gráficos de superfície gerados a partir da

equação ajustada para a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7.

Figura 12. Gráfico de superfície de resposta e contorno dos efeitos combinados de concentrações de amido bruto e peptona sobre a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

Figura 13. Gráfico de superfície de resposta e contorno dos efeitos combinados dos valores de temperatura (ºC) e concentrações de peptona sobre a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

73

Figura 14. Gráfico de superfície de resposta e contorno dos efeitos combinados de concentrações de amido bruto e valores de pH inicial sobre a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

Figura 15. Gráfico de superfície de resposta e contorno dos efeitos combinados dos valores de pH inicial e concentrações de extrato de levedura (E.L.) sobre a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

74

Figura 16. Gráfico de superfície de resposta e contorno dos efeitos combinados dos valores de temperatura (ºC) e concentrações de extrato de levedura (E.L.) sobre a produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

Observa-se da equação ajustada (Tabela 13) e dos gráficos de superfície

gerados em função desta, a existência de interações duplas entre os fatores. Para as

interações, valores positivos indicam que a resposta aumentará se as duas variáveis

forem em direção ao mesmo nível, inferior ou superior. E valores negativos indicam

um aumento na resposta se as variáveis forem em direções contrárias, ou seja, uma

variável em direção ao nível superior e a outra em direção ao nível inferior

(MARTENDAL et al., 2007). Interações duplas tornam a indicação de níveis para os

fatores um tanto complexa, uma vez que a escolha do nível para um fator deve estar

relacionada ao nível escolhido para outro. Por outro lado, a existência de interações

pode constituir vantagem, pois quando diversas combinações de fatores podem ser

utilizadas para se obter a mesma resposta, níveis mais econômicos de fatores que

elevam o custo do processo podem ser selecionados. Este comportamento pode ser

visualizado quando se avalia a Figura 12. Verifica-se, que a quantidade de peptona

no meio de cultivo pode ser drasticamente diminuída quando combinada a

concentrações mais elevadas de amido bruto de mandioca, contribuindo para a

formulação de meios mais econômicos.

75

Verifica-se, das interações estatisticamente significativas para a produção da

amilase, que o efeito da interação entre temperatura e peptona foi o mais proeminente

(Tabela 12). O sinal positivo indica sinergismo entre as duas variáveis, e da análise

da Figura 13 pode-se visualizar tal comportamento. Verifica-se que a produção de

amilase é favorecida quando a temperatura e as concentrações de peptona tendem

ao nível mínimo em que foram estudas, ou seja, a redução combinada dos níveis das

duas variáveis contribuem para o aumento da resposta.

Os parâmetros físico-químicos influenciaram significativamente a produção da

amilase, tanto os termos lineares, quanto os termos quadráticos. Nota-se que a

biossíntese da amilase foi favorecida nos níveis de temperatura mais baixos e valores

intermediários (ponto central) de pH inicial. Duarte (2016) obteve resultados bastante

semelhantes no que concerne a temperatura de incubação da levedura Cryptococcus

laurentii, a melhor produção de biomassa foi verificada a 20°C, e Duarte (2015)

também relata que a produção da lipase por Cryptococcus laurentii foi favorecida em

temperaturas baixas e moderadas (≥ 20°C).

As faixas de valores de pH inicial nas quais a produção da amilase é

maximizada (Figuras 14 e 15) encontram-se próximas a neutralidade. De fato, tais

faixas são descritas por estarem relacionadas com as condições ótimas de

crescimento celular para grande parte das leveduras (DEAK, 2006; REGULY, 1998;).

Estes valores coincidem com as condições de pH otimizadas para a produção da

amilase de Kluyveromyces marxianus e outras linhagens de leveduras amilolíticas

(BASTOS et al., 2015; STERGIOU et al., 2014).

A relevância de se determinar o pH que favoreça a produção da amilase

transcende a relação com o crescimento celular. Além de alterar a permeabilidade da

membrana celular, Wallis e colaboradores relatam que o pH do meio de cultivo pode

regular a produção de glicoamilase a nível transcricional, bem como, pode alterar

modificações pós-traducionais, como a glicosilação. O padrão de modificação pós-

traducional de proteínas por glicosilação é um importante processo que afeta sua

conformação, estabilidade, secreção e atividade biológica e responde a variação do

pH do meio de cultivo (WALLIS et al., 2001). Galdino e colaboradores 2011 descrevem

que a amilase nativa produzida pela levedura Cryptococcus flavus é glicosilada, e a

análise dos possíveis sítios de glicosilação revela que estes se encontram em regiões

conservadas (GALDINO et al., 2008) da estrutura da enzima, o que permite supor que

exista uma grande probabilidade da amilase produzida por Cryptococcus laurentii

76

LABIOM-SBFL7 apresentar padrão de glicosilação que seja importante para a sua

secreção.

A interação entre as concentrações de amido bruto e os valores de pH inicial

revelou-se estatisticamente significativa, e o sinal negativo do coeficiente do termo

demonstra que a interação ocorre de forma antagônica. Da Figura 14 pode-se notar

que o efeito da concentração de amido bruto sobre a resposta varia em função do

valor do pH inicial do meio de cultivo. De acordo com Neto e colaboradores (2010),

quando o termo linear do coeficiente de um fator apresenta-se positivo e o quadrático

apresenta-se negativo, há um forte indício de que a região ótima para este parâmetro

foi alcançada. No presente trabalho, este padrão foi verificado para as concentrações

de amido bruto de mandioca, indicando proximidade com a região ótima.

O valor máximo ajustado para a atividade da amilase de Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 e as condições que a proporcionaram encontram-se representadas

na Figura 17. Os valores indicados para as concentrações de amido bruto de

mandioca, peptona e extrato de levedura, bem como as condições de pH inicial e

temperatura foram utilizados para o experimento de validação.

Figura 17. Condições de otimização para A.E. Máx. ajustada pelo modelo gerado através do Delineamento Box-Behnken.

Para a obtenção do valor de atividade amilolítica máxima predita pelo modelo,

faz-se necessário a utilização de amido bruto de mandioca 4,00%, peptona 1,50% e

extrato de levedura 1,71%. Além da composição dos nutrientes do meio de cultivo, as

condições físico-químicas ideais são pH inicial de 6.68 e temperatura de incubação

de 22,00 °C. Nestas condições está prevista a obtenção de 11,22 U/mL de produção

amilolítica. Os resultados obtidos experimentalmente são apresentados na Figura 18.

77

Figura 18. Perfil de crescimento celular e produção de amilase pela levedura

Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 para validação do modelo ajustado através do

Delineamento Box-Behnken.

Do perfil de produção de amilase no experimento de validação, verifica-se que

a maior produção ocorreu no tempo de 120h reproduzindo o comportamento já

verificado nos ensaios anteriores. O valor de atividade amilolítica máxima foi 12,90

(U/ml). A partir dos resultados obtidos experimentalmente para a validação do modelo

preditivo, foram calculados os fatores bias (FB) e exatidão (FA), sendo 0,90 e 0,97,

respectivamente. Estes resultados reforçam a capacidade preditiva e a exatidão do

modelo.

Diante da qualidade de ajuste do modelo demonstrada pelo alto valor do

coeficiente de determinação, pela considerável significância dos termos do modelo de

segunda ordem obtido através do Delineamento Box-Behnken, e pelo resultados dos

índices (FB) e (FA), admite-se que o mesmo seja empregado para estimar valores de

atividade da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 em função das

concentrações de amido bruto de mandioca, peptona e extrato de levedura, e dos

parâmetros pH inicial e temperatura de incubação nas condições experimentais

avaliadas. De fato, os métodos estatísticos de otimização têm se estabelecido como

uma valiosa ferramenta para a determinação de condições de cultivo que resultem em

excelentes desempenhos catalíticos de amilases microbianas, no entanto, até onde

se tem conhecimento, este é o primeiro trabalho que se destina ao estudo da produção

0

2

4

6

8

10

12

14

0

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5

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0 24 48 72 96 120

Ati

vid

ade

amin

olít

ica

(OD

60

0n

m)

Validação

Crescimento Atividade aminolítica

78

de amilase pela levedura Cryptococcus laurentii empregando a Metodologia de

Superfície de Resposta.

Sahnoun e colaboradores (2015) relataram que a aplicação do Delineamento

Composto Central (DCC) culminou com um aumento de 33 vezes no valor de

produção da amilase por Aspergillus Oryzae. Recentemente, Samadlouie e

colaboradores (2016) obtiveram sucesso na estratégia de otimização da produção da

amilase de Bacillus amyloliquefaciens, resultando em ganho de 90% na atividade

enzimática máxima.

4.6. Análise das proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7

Para a análise das proteínas secretadas pela levedura Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7, as etapas de preparação das amostras configuraram uma etapa

crítica. A concentração de amostras por liofilização, ácido tricloroacético (TCA) ou

sulfato de amônio são métodos bastante empregados para concentração de

proteínas, no entanto, neste trabalho não se obteve êxito na aplicação de tais

metodologias, devido ao fato de precipitarem interferentes do amido bruto de

mandioca presente no sobrenadante, mesmo após repetidas centrifugações.

O método de concentração no qual se obteve melhores resultados consistiu na

precipitação por acetona a -20 °C. No entanto, diversas estratégias que antecedem a

precipitação também foram estudadas com a finalidade de se obter sucesso na

análise do perfil de proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL-7.

O processo de diálise foi realizado exaustivamente por até 48h (linha 2) e frações

dessa amostra foram filtradas em filtro 0,22µm (linha 3).

A análise das proteínas secretadas pela levedura Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 permitiu verificar a variação no perfil de secreção em função do meio

de cultivo utilizado (Figura 19). Da avaliação da Linha 1, observa-se que o cultivo em

meio YPD (extrato de levedura 1%, peptona 2%, glicose 2%) resultou na secreção de

poucas proteínas, no entanto, nota-se a presença de uma banda de grande

intensidade com massa molecular de aproximadamente 40 kDa. Supõe-se que esta

proteína possa estar relacionada ao metabolismo de glicose, uma vez que nas linhas

correspondentes ao experimento de validação, no qual o amido bruto de mandioca é

a única fonte de carbono, a sua presença não foi verificada.

79

Figura 19. Perfil eletroforético de proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii

LABIOM-SBFL7 e Zimograma. Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida

(SDS-PAGE) do sobrenadante de 120h de cultivo em 1) YPD (extrato de levedura

1%, peptona 2%, dextrose 2%); e 2, 3, 4 e 5) Sobrenadante do experimento de

validação. As amostras diferem quanto a forma de concentração. M. Marcador de

massa molecular. Linha 1. Sobrenadante dialisado e precipitado por acetona. Linha

2. Sobrenadante dialisado, filtrado (0,22 µm) e precipitado por acetona. Linha 3.

Sobrenadante dialisado e precipitado por acetona. Linha 4. Sobrenadante

precipitado por acetona. Linha 5. Zimograma, atividade amilolítica em gel em

condições não desnaturantes.

De fato, a obtenção de análises em gel SDS-PAGE quando se trata do perfil de

proteínas secretadas por microrganismos selvagens apresenta algumas limitações

como baixos níveis de secreção e presença de interferentes do meio de cultivo. Em

virtude disso, em alguns casos não se consegue obter resultados com qualidade

considerável (HERNÁNDEZ-MONTAÑEZ et al., 2012; NURACHMAN et al., 2010;

VIJAYAN et al., 2015; ZAFERANLOO et al., 2014). Entretanto, o perfil de proteínas

secretadas fornece informações importantes sobre o microrganismo em estudo, e de

forma mais específica, fornece uma estimativa da produção da proteína de interesse.

Nesse sentido, todas as alternativas que visam contornar as limitações intrínsecas à

esta etapa experimental foram válidas para a obtenção deste resultado.

Da comparação entre a análise eletroforética (SDS-PAGE) e o zimograma,

pode-se supor que a massa molecular da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-

SBFL7 seja aproximadamente 67 kDa. Este resultado está de acordo com o

80

observado para a α-amilase produzida pela levedura Cryptoccus flavus (GALDINO,

2008).

5. CONCLUSÕES

O isolamento de microrganismos a partir das folhas da Paineira (Ceiba

speciosa) permitiu a seleção da linhagem identificada como Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7, que revelou potencial para a degradação do amido

bruto de mandioca.

Através do Delineamento Fatorial Fracionado verificou-se que os

macronutrientes amido bruto de mandioca, peptona, extrato de levedura, e

sulfato de amônio, bem como os parâmetros pH inicial e temperatura de

incubação, dentro das condições experimentais avaliadas, são importantes em

causar variação na produção da amilase produzida pela levedura Cryptococcus

laurentii LABIOM-SBFL7.

Através da Metodologia de Superfície de Resposta foi possível determinar

níveis dos parâmetros estudados, que quando validados levaram ao aumento

de 167% na produção da amilase de Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7.

A análise das proteínas secretadas por Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7

revelou a variação da secreção em função do meio de cultivo e permitiu verificar

a presença de uma única banda com atividade amilolítica com massa molecular

de aproximadamente 67,0 kDa.

81

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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105

7. ANEXOS

106

107

108

109

ANEXO A - Perfil de crescimento celular (DO600nm) e produção de amilase (U/mL) pela

levedura Cryptococcus laurentii LABIOM SBFL7 em cada uma das condições

avaliadas no Delineamento Fatorial Fracionado (DFF). O crescimento celular e a

produção de amilase foram acompanhados em intervalos de 24 horas, durante 120

horas de cultivo. Os gráficos são correspondentes as unidades experimentais

descritas na Tabela 6.

110

111

112

113

114

115

ANEXO B - Perfil de crescimento celular (DO600nm) e produção de amilase (U/mL) pela

levedura Cryptococcus laurentii LABIOM-SBFL7 em cada uma das condições

avaliadas no Delineamento Box-Behnken. O crescimento celular e a produção de



Tabela 11.

116

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ … · transformou de diversas maneiras e me mostrou que sempre podemos ser melhores, atentos a necessidade do outro, e que bondade,