UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA …cirurgiaonline.med.br/arquivos/14.pdf · Médico-Assistente da Divisão de Anestesiologia do Departamento de Cirurgia do Hospital das

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

UNIFESP – EPM

LUCAS PEDROSO FERNANDES FERREIRA LEAL

REPERCUSSÕES DA INTERPOSIÇÃO ILEAL ISOLADA

EM RATOS COM DISMETABOLISMO GLICÍDICO INDUZIDO POR DIETA

SÃO PAULO

2017

ii


REPERCUSSÕES DA INTERPOSIÇÃO ILEAL ISOLADA

EM RATOS COM DISMETABOLISMO GLICÍDICO INDUZIDO POR DIETA

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho Azevedo

Coorientadores: Profa. Dra. Valderez Bastos Valero Lapchik

Prof. Dr. Antonio Ricardo de Toledo Gagliardi

SÃO PAULO

2017

iii

Leal, Lucas Pedroso Fernandes Ferreira Repercussões da interposição isolada em ratos com

dismetabolismo glicídico induzido por dieta. / Lucas Pedroso Fernandes Ferreira Leal. – São Paulo, 2017

xxiv,120f. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo.

Programa de Pós-Graduação em Medicina Translacional. Repercussions of isolated ileal interposition in rats with diet-

induced disglycemia.

1.Cirurgia Bariátrica 2. Diabetes Mellitus tipo 2/cirurgia 3. Interposição Ileal 4. Peptídeo semelhante ao Glucagon 1 5. Dieta hiperlipídica 6. Experimentação animal 7. Ratos Wistar 8. Pâncreas/histopatologia

iv


ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA – UNIFESP – EPM

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TRANSLACIONAL

Chefe do Departamento de Medicina: Profa. Dra. Ana Luísa Godoy Fernandes

Coordenador do Programa de Pós-Graduação: Profa. Dra. Dulce Elena Casarini

v


ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA – UNIFESP – EPM

DEPARTAMENTO DE MEDICINA


Apoio financeiro recebido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

São Paulo - FAPESP – processo número 11 / 05944-1.

vi



COORDENADORA: Profa. Dra. Dulce Elena Casarini


“Repercussões da interposição ileal isolada

em ratos com dismetabolismo glicídico induzido por dieta”

Modelo experimental

BANCA EXAMINADORA

Presidente

1. Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo

Professor Livre Docente do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de

São Paulo – UNIFESP.

Membros Efetivos

2. Prof. Dr. Lilton Rodolfo Castellan Martinez

Professor Titular de Cardiologia do Curso de Medicina do Centro Universitário

São Camilo

3. Prof. Dr. Ismael Francisco Mota Siqueira Guarda

Médico-Assistente da Divisão de Anestesiologia do Departamento de Cirurgia do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo -

FMUSP

4. Prof. Dr. Otávio Cansanção de Azevedo

Médico-Preceptor do Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica do Hospital do

Servidor Público do Estado de São Paulo – HSPE-IAMSPE

5. Profa. Dra. Simone dos Anjos Caivano

Professora Associada do Departamento de Nutrição da Universidade

Metropolitana de Santos – UNIMES

Aprovação em 26 de junho de 2017 e homologação em 31 de julho de 2017.

vii

DEDICATÓRIA

A Deus, pelas graças e bênçãos recebidas e por sustentar as minhas forças.

Aos meus queridos pais, Antonio e Roselena, principais responsáveis pelas

construção e consolidação de meus valores morais, os quais superaram limitações

com sacrifícios em suas vidas e abdicaram de tudo em prol de minha educação e de

meus sonhos, que não poupam esforços para me ver prosperar e que, sempre,

manifestam-me seu amor incondicional, por suas dedicação e cumplicidade.

A meu avô Albertino, que faleceu pouco antes de me conhecer, mas que

certamente estaria bastante orgulhoso também nesta etapa de minha vida.

A meu avô Durval, grande amigo, exemplo de homem, que primeiro leu o

projeto desta pesquisa, e que, se estivesse dentre nós, compartilharia, à sua

maneira singular, mais um momento de felicidade, por ter exercido papel

fundamental em minhas formações.

Às minhas avós Nilde e Zulmira, que me proporcionaram muito carinho e

aprendizado, pela contribuição com o estímulo constante aos estudos.

À minha irmã Clarissa, estimada conselheira, que sempre se dispõe a me

auxiliar e me incentiva a alcançar meus objetivos, por sua importante e especial

participação em minha vida.

Ao meu cunhado André, irmão verdadeiro, por todos os ensinamentos, por todo

companheirismo e por toda ajuda ao longo desses anos.

À minha esposa Gisele, pela paciência, pelo apoio e por estar ao meu lado nos

momentos de dificuldades e de alegria.

Ao meu esperado e amado filho Joaquim, grande inspiração de minha vida, que

diariamente me motiva a ser alguém melhor e me ensina o que é o amor sincero,

por, na sua inocência, compreender meus afastamentos na execução desta

pesquisa, e por sempre me confortar com seus beijos e abraços.

viii

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho Azevedo, Professor Livre Docente

do Programa de Pós-Graduação em Medicina Translacional – Departamento de

Medicina – Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, brilhante mestre, grande

entusiasta da cirurgia baroendócrina, exemplo de pesquisador, que me acolheu

como aluno dando-me a oportunidade de trilhar os caminhos árduos da Pesquisa

Científica e de conhecer pessoas valorosas que me proporcionaram crescimento

intelectual e aprendizado de vida; por suas incansáveis buscas do rigor e do método

científico, em prol da qualidade; por seu profundo comprometimento e por sua

inspiradora dedicação à pesquisa; por seus ensinamentos e ideias, verdadeiros

alicerces, que viabilizaram o desenvolvimento deste trabalho, com muita

propriedade; pela competência, pela confiança, pela paciência, por todo empenho e

toda dedicação que me foram prestados na condução deste estudo; minha

admiração, eterna gratidão e meu reconhecimento.

ix

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP – Escola Paulista de

Medicina – EPM, renomada instituição, por ter permitido a realização de minha pós-

graduação, nos Programas de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação e de

Medicina Translacional, tendo-me proporcionado aprendizado, tempo e espaço para

a realização deste estudo, fundamentais para meu desenvolvimento como

pesquisador.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP,

pelo apoio financeiro que possibilitou o desenvolvimento da pesquisa.

À Profa.Dra. Valderez Bastos Valero Lapchik, coorientadora, pelo incentivo,

pela colaboração, pelos conhecimentos de bioterismo transmitidos, pelos subsídios

técnicos, pela parceria, pela oportunidade de ter utilizado o Laboratório de

Experimentação Animal do Instituto de Farmacologia e Biologia Molecular (InFar) da

UNIFESP, e principalmente pelas motivação, amizade e disponibilidade, que foram

imprescindíveis para a concretização deste projeto, em todas as suas fases.

À Profa.Dra. Gui Mi Ko, que também me recebeu no InFar, por seu total e

irrestrito apoio, tornando possível o desenvolvimento desta pesquisa ao dispor do

espaço físico, dos animais de experimentação, dos equipamentos e das pessoas

que me auxiliaram nas atividades práticas.

À Profa.Dra. Maria Teresa de Seixas Alves, pelos ensinamentos transmitidos

e por proporcionar a realização de todo o processo de imunohistoquímica no

Laboratório de Patologia da UNIFESP.

Ao Prof. Dr. Antonio Ricardo de Toledo Gagliardi, pelos ensinamentos

desde minha formação médica acadêmica, pelas críticas e pelos incentivos

transmitidos durante grande parte deste estudo, pela especial participação na minha

x

vida profissional, e também pela atenção sempre dispensada e pela amizade

solidificada.

À Profa.Dra. Dulce Elena Casarini, pela a oportunidade que me foi dada para

concluir o Programa de Pós-Graduação que coordena, pelas solicitude e

competência, pelo empenho e compreensão em viabilizar a conclusão desta

pesquisa e pelos ensinamentos, que contribuíram para o meu crescimento como

pesquisador e como ser humano.

À Profa.Dra. Anita Hilda Straus Takahashi, pela paciência despendida, pela

participação na elaboração deste trabalho e pela grande experiência profissional

transmitida.

Ao Prof.Dr. Magnus Régios Dias da Silva, pela atenção, pela colaboração e

pelos competentes conhecimentos transmitidos.

Aos Profs. Drs. Edna Frasson de Souza Montero, Ivan Hong Jun Koh,

José Luiz Martins, Djalma José Fagundes, Murched Omar Taha, Hélio Plapler e

Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, pelos ensinamentos transmitidos durante

minha participação no Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação

da UNIFESP, que permitiram ampliar meus horizontes e em muito contribuíram para

meu amadurecimento.

À Profa.Dra. Maria Auxiliadora Sampaio Oliveira Martins, que sempre

acreditou em meus potenciais, a quem devo minha iniciação em pesquisa em

Medicina, pelos ensinamentos técnicos recebidos durante minha formação médica

de graduação mas também sobre diversos aspectos de vida, pelo exemplo de

postura médica, competência profissional e invejável academicismo, e pelo estímulo

a realizar uma pós-graduação e executar uma pesquisa científica de relevância.

Aos colegas de pós-graduação Profa.Dra. Gilmara Silva Aguiar Yamaguchi

e Prof. Dr. Welligton Cardia, pelo convívio, pela cooperação, pela disposição em

xi

compartilhar suas experiências e terem dedicado parte de seu tempo ao meu

treinamento como pesquisador, contribuindo para a execução deste estudo.

Aos profissionais do Laboratório de Experimentação Animal do Instituto de

Farmacologia e Biologia Molecular – InFar - da UNIFESP - Universidade Federal de

São Paulo, em especial Jorge, Sandro e Alex, que colaboraram com o albergue e

com os cuidados dos animais e também me auxiliaram na execução das diversas

intervenções práticas.

Aos técnicos do Laboratório do Departamento de Patologia da UNIFESP -

Universidade Federal de São Paulo, especialmente Leonor Roman, Fernanda,

Kátia e Maria José, que participaram da realização do estudo imunohistoquímico

nesta pesquisa.

A todos os demais colegas de pós-graduação, por proporcionarem um

ambiente de excelência em pesquisa, emitindo sugestões, críticas e elogios, pelo

aprendizado conjunto, pela troca de conhecimentos e de experiências de vida, e em

especial a Bianca Marigliani, pelo auxílio na coleta de amostras e suporte em

alguns procedimentos, e a Fábio Kozu, por todo o seu apoio.

Aos mestres em estatística Dalton Santos Pinheiro e Angélica Barbosa

Neres Santana, pela competência, pela dedicação nas análises dos resultados

desta pesquisa e pela confecção das iconografias deste relatório.

A Stephan Garcia Andrade Silva e Ricardo de Moura Conrado, pela

parceria e pelo apoio nas etapas finais desta pesquisa.

A Clara Isabel, Bruno Vicenzo e Adriano Gronard Babolin, pelo suporte e

pelo afeto verdadeiro dispensados em nossa convivência notadamente familiar.

A todos não nomeados aqui que direta ou indiretamente contribuíram de

alguma forma para a concretização deste trabalho.

xii

EPÍGRAFE

“Veritas vos liberabit.”

Jo 8,32.

“Não há grandeza quando não há simplicidade.”

Leon Tolstói.

"Antes de julgar a minha vida ou o meu caráter, calce os meus sapatos

e percorra o caminho que eu percorri, viva as minhas tristezas, as minhas dúvidas

e as minhas alegrias. Percorra os anos que eu percorri, tropece onde eu tropecei e

levante-se assim como eu fiz.”

Clarice Lispector.

xiii

RESUMO

INTRODUÇÃO: O tratamento clínico do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é complexo.

Atualmente, busca-se procedimento cirúrgico que seja eficaz no tratamento do DM2

em indivíduos eutróficos e com sobrepeso. A interposição ileal isolada (III) pode vir a

constituir-se numa alternativa terapêutica para indivíduos selecionados. Não há

relatos da realização de III em modelo experimental de dismetabolismo glicídico

induzido por dieta, mimetizando a condição humana, sem influências genéticas nem

farmacológicas. A análise histológica do pâncreas desses animais também ainda

não foi realizada. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo é contribuir para o

tratamento do DM2, avaliando-se os efeitos ponderais, metabólicos e morfológicos

pancreáticos após a III em modelo experimental de dismetabolismo glicídico

induzido por dieta. MATERIAL E MÉTODOS: 72 ratos Wistar machos, com 12

semanas de vida, foram distribuídos em quatro grupos - Grupo Padrão (GP), Grupo

Interposição Ileal Isolada, Grupo Sham e Grupo Controle. O GP consumiu ração

padrão ao passo que os demais receberam dietas hiperenergéticas-hiperlipídicas

durante todo o procedimento. As intervenções cirúrgicas foram realizadas na 30ª

semana de vida, nos animais que desenvolveram obesidade, hiperglicemia,

intolerância à glicose e resistência insulínica induzidos por dieta. Análises

biométricas e bioquímicas foram realizadas, além de avaliação morfológica do

pâncreas. RESULTADOS: Na 18ª semana de pós-operatório, a III melhorou a

tolerância à glicose e a sensibilidade das células-alvo à insulina em ratos com

disglicemia induzida por dieta. A III não implicou em perda de peso, não promoveu

diminuição da ingesta de ração nem não afetou o depósito de gordura visceral. A III

não promoveu alterações histológicas estruturais no pâncreas. CONCLUSÃO: Em

ratos Wistar com disglicemia induzida por dieta, a III promove alterações benéficas

no metabolismo da glicose e não altera a morfologia do pâncreas endócrino.

PALAVRAS-CHAVE: cirurgia bariátrica; diabetes mellitus tipo 2 / cirurgia;

interposição ileal; transposição ileal; peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1);

incretinas; resistência à insulina; dieta hiperlipídica; experimentação animal; ratos

Wistar; íleo; pâncreas / histopatologia.

xiv

ABSTRACT

INTRODUCTION: The clinical management of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is

complex and permanent. In this moment, it is necessary a surgical procedure

considered effective for the treatment of this disease among individuals with body

mass index above morbid obesity. The isolated ileal transposition (III) could become

an alternative therapy in selected non-obese diabetic patients. There are no reports

of III performed in wistar rats in an experimental model of diet-induced disglycemia

without genetic or drug influences, nor its pancreas morphology evaluation.

OBJECTIVE: This study aims to contribute to the treatment of T2DM, evaluating the

physiological effects of III on glucose metabolism and investigating histological

changes of the pancreas in an experimental model of diet-induced disglycemia.

METHODS: Seventy two 12-week-old male Wistar rats were distributed into four

groups - ileal transposition, sham-operated, diabetic controls and non-diabetic

controls (NG). The NG group received usual rat feeding while the other groups

received hypercaloric-hyperlipidic diets. III was carried out in obese disglycemic rats

at the 30-week. All groups maintained their diets untill the 48-week. Glucose

tolerance, insulin resistance, food-intake, body weight, adiposity, serum substances

and pancreas morphology were evaluated. RESULTS: After a postoperative period

of 18 weeks, the III improved glucose tolerance and insulin sensitivity in diet-induced

disglycemic rats. III did not induced weight loss or food intake decrease, and did not

affected fat mass. It did not promoted morphological pancreatic alterations.

CONCLUSIONS: In rats with diet-induced disglycemia, III promotes beneficial

changes in glucose metabolism and does not modify the morphology of the

endocrine pancreas.

KEYWORDS: bariatric surgery; diabetes mellitus, type 2 / surgery; ileal interposition;

ileal transposition; glucagon-like peptide-1 (GLP-1); incretins; insulin resistance; diet,

high fat; animal experimentation; rats, Wistar; ileum; pancreas / pathology.

xv

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ............................................................................................................ vii

AGRADECIMENTO ESPECIAL ................................................................................. viii

AGRADECIMENTOS ................................................................................................... ix

EPÍGRAFE ................................................................................................................. xiiii

RESUMO .................................................................................................................... xiii

ABSTRACT ................................................................................................................. xv

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. xviii

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................xxii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ................................................xxiv

INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1

OBJETIVOS .................................................................................................................. 9

1. Objetivo geral ............................................................................................................ 9

2. Objetivos específicos ................................................................................................. 9

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 10

1. Comitê de Ética em Pesquisa e Financiamento ...................................................... 10

2. Amostra ................................................................................................................... 10

3. Procedimentos experimentais ................................................................................. 12

3.1 Dietas .................................................................................................................. 12

3.2 Consumo de ração, Curva de peso e Índice de Lee ........................................... 13

3.3 Testes laboratoriais e bioquímicos ...................................................................... 14

3.3.1 Glicemia periférica..................................................................................... 14

3.3.2 Dosagens séricas de glicemia, insulina, peptídeo C, glucagon, GLP-1 e

hemoglobina glicada .......................................................................................... 14

3.3.3 Teste de tolerância oral à glicose .............................................................. 15

3.3.4 Teste intraperitoneal de resistência insulínica ........................................... 15

3.3.5 Cálculo do HOMA-IR ................................................................................. 17

xvi

3.4 Caracterização do desenvolvimento de obesidade exógena e de alterações

secundárias do metabolismo glicídico ................................................................ 17

3.4.1 Avaliação biométrica entre as 12ª e 30ª semanas de vida ........................ 17

3.4.1.1 Peso corporal .................................................................................... 17

3.4.1.2 Índice de Lee ..................................................................................... 19

3.4.2 Consumo de ração entre as 12ª e 30ª semanas de vida .......................... 19

3.4.3 Análises bioquímicas entre as 12ª e 30ª semanas de vida ....................... 21

3.4.3.1 Glicemia periférica e Glicemia de jejum ............................................ 21

3.4.3.2 Hemoglobina glicada ......................................................................... 23

3.4.3.3 Insulina .............................................................................................. 24

3.4.3.4 Peptídeo C ........................................................................................ 25

3.4.3.5 Glucagon ........................................................................................... 25

3.4.3.6 GLP-1 ................................................................................................ 26

3.4.4. Testes metabólicos entre as 12ª e 30ª semanas de vida ......................... 27

3.4.4.1 Teste de tolerância oral à glicose - TTOG ......................................... 27

3.4.4.2 Teste intraperitoneal de resistência insulínica - IpITT ....................... 28

3.4.4.3 HOMA-IR ........................................................................................... 28

3.5 Anestesia, Antibioticoprofilaxia e Procedimentos operatórios ............................. 28

3.6 Cuidados pós-operatórios ................................................................................... 32

3.7 Eutanásia ............................................................................................................ 32

3.7.1 Adiposidade corporal ................................................................................. 32

3.7.2 Coleta de tecido pancreático ..................................................................... 32

4. Análise estatística .................................................................................................... 35

RESULTADOS ............................................................................................................ 37

1. Avaliação biométrica entre as 30ª e 48ª semanas de vida ...................................... 37

1.1 Peso corporal ..................................................................................................... 37

1.2 Índice de Lee ...................................................................................................... 38

1.3 Adiposidade ........................................................................................................ 39

2. Consumo de ração entre as 30ª e 48ª semanas de vida ......................................... 40

3. Análises bioquímicas entre as 30ª e 48ª semanas de vida ..................................... 41

3.1 Glicemia periférica .............................................................................................. 41

xvii

3.2 Insulina................................................................................................................ 42

3.3 Peptídeo C .......................................................................................................... 43

3.4 Glucagon ............................................................................................................. 44

3.5 GLP-1.................................................................................................................. 45

4. Testes metabólicos entre as 30ª e 48ª semanas de vida ........................................ 46

4.1. Teste de tolerância oral à glicose - TTOG ......................................................... 46

4.2. Teste intraperitoneal de resistência insulínica - IpITT ........................................ 48

4.3. HOMA-IR ........................................................................................................... 48

5. Estrutura do pâncreas na 48ª semana de vida ........................................................ 49

DISCUSSÃO ............................................................................................................... 50

CONCLUSÃO .............................................................................................................. 68

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 69

APÊNDICES ................................................................................................................ 86

Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP .................................... 86

Ata da Reunião da Comissão Julgadora da Defesa de Tese de Doutorado ............. 88

ANEXOS ..................................................................................................................... 89

Anexo 1- Formalina Tamponada ............................................................................... 89

Anexo 2 - Protocolo de silanização das lâminas ....................................................... 89

Anexo 3 - Protocolo de estudo imunohistoquímico ................................................... 90

Anexo 4 - Tabelas ..................................................................................................... 92

xviii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Evolução do ganho ponderal (g) entre as 12ª e 30ª semanas de vida.

Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta Experimental (DE/n=56).

Os valores são representados pela média ± desvio padrão. (*) diferença

significativa entre os grupos, p < 0,05.………........................…………….18

Figura 2 - Peso médio (g) na 30ª semana de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e

Grupo Dieta Experimental (DE/n=56). Os valores estão expressos em

mediana ± intervalo interquartil. (*) diferença significativa entre os grupos,

p < 0,05. …............................................................................................…18

Figura 3 - Consumo diário de ração (g) por quilograma de peso corporal entre as 12ª

e 30ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta

Experimental (DE/n=56). Os valores são representados pela média ± erro

padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.....................20

Figura 4 - Relação do consumo de ração e peso no período entre as 12ª e 30ª

semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta

Experimental (DE/n=56). Os valores são representados pela média ± erro

padrão. p < 0,05…...…………................................................………........21

Figura 5 - Evolução das glicemias periféricas semanais (mg/dL) entre as 12ª e 30ª

semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta

Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias. (*) diferença

significativa entre os grupos, p < 0,05 ….................................……..........22

Figura 6 - Níveis glicêmicos séricos médios (mg/dL) na 28ª semana de vida. Grupos

Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores

expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa entre os

grupos, p < 0,05….....................................................................................22

Figura 7 - Correlação entre a glicemia média (mg/dL) e a variação de peso corporal

(g) entre as 12ª e 30ª semanas de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16)

e Dieta Experimental (DE/n=56). O coeficiente de correlação é igual a

0,77. O coeficiente de determinação é igual a 0,59…….............………...23

Figura 8 - Níveis médios de hemoglobina glicada (ng/mL) na 28ª semana de vida.

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56).

xix

Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa

entre os grupos, p < 0,05.….................................................................….24

Figura 9 - Níveis séricos de insulina (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração

Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos

pelas médias e erro padrão. Não se encontrou significância estatística na

comparação entre os grupos, p > 0,05.…...…………..........................…..24

Figura 10 - Níveis séricos de peptídeo C (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos



grupos, p < 0,05.……………………......................................................….25

Figura 11 - Níveis séricos médios de glucagon (pg/mL) na 28ª semana de vida.

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56).

Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa

entre os grupos, p < 0,05.......................................................................…26

Figura 12 - Níveis séricos médios de GLP-1 (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos



grupos, p < 0,05………………………................................................…….26

Figura 13 - Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose na

28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta

Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias. (*) diferença

significativa entre os grupos, p < 0,0....………....................................…..27

Figura 14 - Esquemas demonstrativos sequenciais. (a) Regiões de secção intestinal

e isolamento do segmento de íleo distal a ser interposto. (b) Transposição

do segmento ileal isolado para porção inicial do jejuno ….......................30

Figura 15 – Imagem fotográfica das anastomoses intestinais efetuadas nos animais

submetidos a interposição ileal isolada (GT)…………………………….....31

Figura 16 - Fotomicrografia do pâncreas. Imunohistoquímica com marcação das

células beta. Imagem de um campo captada com aumento de 100 vezes

(QCapture Pro®). Realizadas medidas de áreas de ilhotas de Langerhans

no pâncreas em µm2 (Image J®)..............................................................34

xx

Figura 17 - Fotomicrografia do pâncreas. Imunohistoquímica com marcação das

células beta. Imagem de um campo captada com aumento de 400 vezes

(QCapture Pro®). Realizadas contagens de células beta e de células não

marcadas de cada ilhota de Langerhans (Image J®)...….........................35

Figura 18 - Evolução do ganho ponderal (g) entre as 30ª e 48ª semanas de vida.

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo

Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores são representados pelas

médias e erro padrão. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS

versus GC..................................................................................................37

Figura 19 – Índice de Lee (g/cm) n 48ª semana de vida. Grupo Ração Padrão

(GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham

(GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Os valores estão expressos em

mediana ± intervalo interquartil. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC,

GS versus GC...........................................................................................39

Figura 20 – Quantificação da adiposidade (%) na 48ª semana de vida, em relação ao

peso corporal. Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal

Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16).

Os valores estão expressos em mediana ± intervalo interquartil. p > 0,05 -

GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC..........................................40

Figura 21 – Consumo diário de ração (g) por peso (kg) de rato entre as 30ª a 48ª

semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal

Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores são

representados pelas médias e erro padrão. p > 0,05 - GT versus GS, GT

versus GC, GS versus GC….......................................................………...41

Figura 22 – Evolução das glicemias periféricas semanais (mg/dL) entre as 30ª e 48ª

semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal

(GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Valores expressos em

médias e erro padrão. p>0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus

GC.............................................................................................................42

Figura 23 - Níveis séricos de insulina (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana

de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição

Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle

xxi

(GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p > 0,05 - GT

versus GS, GT versus GC, GS versus GC.…...........................................43

Figura 24 – Níveis séricos de peptídeo C (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª

semana de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo

Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo

Controle (GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p >

0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC...............................44

Figura 25 – Níveis séricos de glucagon (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana

de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição

Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle

(GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p < 0,05 (*) - GT

versus GS, GT versus GC. p > 0,05 - GS versus GC...............................45

Figura 26 – Níveis séricos de GLP-1 (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de

pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal

Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16).

Valores expressos em médias e erro padrão. p<0,05 (*) - GT versus GS,

GT versus GC............................................................................................46

Figura 27 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose na

40ª semana de vida. Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15) e Grupo

Sham (GS/n=13). Valores expressos pelas médias. Não se encontrou

significância estatística na comparação entre os grupos, p > 0,05...........47

Figura 28 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose na

48ª semana de vida. Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15) e Grupo

Sham (GS/n=13). Valores expressos pelas médias. (*) diferença

significativa entre os grupos, p < 0,05.......................................................48

xxii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Achados corporais e metabólicos dos grupos GP e DE...........................11

Tabela 2 - Composição das dietas padrão e experimentais......................................13

Tabela 3 - Índice de Lee (g/cm) nas 12ª e 30ª semanas de vida…………………..…19

Tabela 4 - Taxa de conversão alimentar (kcal/g) entre as 12ª e 30ª semanas de vida

…………………………………………………………………………………...20

Tabela 5 - Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) na 28ª semana de vida..........27

Tabela 6 - Teste intraperitoneal de resistência insulínica (IpITT) pela constante de

decaimento da glicose (KITT) na 29ª semana de vida………....……….…28

Tabela 7 - HOMA-IR na 28ª semana de vida …..................................................…...28

Tabela 8 - Ganho de peso corporal (g) entre as 30ª e 48ª semanas de vida………..38

Tabela 9 - Adiposidade visceral (%) na 48ª semana de vida……………………........39

Tabela 10 - Níveis de insulina sérica (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de

pós-operatório)...............................................................................………42

Tabela 11 - Níveis séricos de peptídeo C (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª

semana de pós-operatório)……………...……………………………………43

Tabela 12 - Níveis séricos de glucagon (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana

de pós-operatório)…………………………...……………………...…………44

Tabela 13- Níveis séricos de GLP-1 (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de

pós-operatório)…………………………………………………………………45

Tabela 14 - Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) na 40ª semana de vida (10ª

semana de pós-operatório)………………………………………………..….46

Tabela 15 - Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) na 48ª semana de vida (18ª

semana de pós-operatório)……………………………………………...……47

Tabela 16 – Teste intraperitoneal de resistência insulínica (IpITT) nas 38ª e 46ª

semanas de vida (8ª e 16ª semanas de pós-operatório)..........................48

Tabela 17 - HOMA-IR na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-

operatório).................................................................................................49

Tabela 18 - Morfologia do pâncreas na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-

operatório).................................................................................................49

xxiii

Tabela 19 - Peso corpóreo médio (g) dos grupos GP e DE entre as 12ª e 30ª

semanas de vida.......................................................................................92

Tabela 20 - Taxa de consumo alimentar médio (g/kg/d) entre as 12ª e 30ª semanas

de vida.......................................................................................................93

Tabela 21 - Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose

(TTOG) na 28ª semana de vida................................................................93

Tabela 22 - Peso corpóreo médio (g) dos grupos entre as 30ª e 48ª semanas de

vida............................................................................................................94

Tabela 23 - Índice de Lee (g/cm) na 48ª semana de vida..........................................94

Tabela 24 – Taxa de consumo alimentar médio (g/kg/dia) entre as 31ª e 48ª

semanas de vida.......................................................................................95

Tabela 25 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose

(TTOG) nas 40ª e 48ª semanas de vida (10ª e 18ª semanas de pós-

operatório).................................................................................................95

xxiv

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ANOVA – Análise de variância

cm - Centímetros

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

DAB – 3,3’Diaminobenzidina

DH – Ração hipercalórica-hiperlipídica

dL - Decilitro

DM2 – Diabetes mellitus tipo 2

DE – Grupo Dieta Experimental

DP – Desvio padrão

EP – Erro padrão

EUA – Estados Unidos da América

FA – Fosfatase alcalina

FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

g – Grama

g/cm – Gramas por centímetro

g/kg – Gramas por quilograma

GLM – Modelo Linear Generalizado

GLP-1 – Glucagon-like peptide type 1

GC – Grupo controle dieta especial

GP – Grupo padrão

GS – Grupo sham

GT – Grupo interposição ileal isolada

HOMA-IR - Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance

HRP – Peroxidase

III – Interposição ileal isolada

IMC – Índice de massa corporal

IpITT – Teste intraperitoneal de tolerância insulínica

kcal/g – Quilocaloria por grama

kg – Quilograma

kg/m2 – Quilograma por metro quadrado

xxv

KITT – Constante de decaimento da glicose

L – Litro

mg – Miligrama

mg/dL – Miligramas por decilitro

mg/kg – Miligramas por quilograma

mL– Mililitro

mmol –Milimolar

n – Número

ng - Nanograma

PBS – Tampão Salina Fosfato

p – Nível descritivo, valor de significância

pg – Picograma

PO – Pós-operatório

RI – Resistência insulínica

SBA – Soro Albumina Bovina

SM – Síndrome metabólica

TTOG – Teste de tolerância oral à glicose

t1/2 – Meia-vida

UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo

U/kg – Unidade por quilograma

U/mL – Unidade por mililitro

α – Alfa (nível de significância)

β – Beta

ºC – Graus Celsius

µ – Micro

μm – Micrômetro

® – Marca registrada

% – Percentual

± - Mais ou menos

< - Menor que

= - Igual

> - Maior que

1

INTRODUÇÃO

A obesidade é um dos mais graves problemas da saúde pública da

atualidade e é considerada a mais relevante desordem nutricional nos países

desenvolvidos1,2,3. Nas últimas décadas, a população vem experimentando um

significativo incremento na prevalência da obesidade1,4,5. No ano de 2014,

observaram-se, na população adulta mundial, 39% de sobrepeso e 13% de

obesidade, que correspondem a quase 2 bilhões de indivíduos, mais do que o dobro

dos valores verificados em 19806. Estima-se que, no ano de 2030, 20% da

população adulta será obesa1. Ademais, constata-se que a obesidade também é

uma questão candente junto às crianças e aos adolescentes7-11,. Em 2014, cerca de

42 milhões de crianças abaixo dos 05 anos de idade encontravam-se acima do

peso; em países com economias emergentes, os índices verificados na infância são

30% maiores que os de países desenvolvidos6. No Brasil, os índices recentes de

sobrepeso e obesidade acima dos 20 anos de idade são da ordem de 52,5% - o que

corresponde a cerca de 82 milhões de pessoas -, notando-se um crescimento de

23% nos últimos 10 anos; a megalópole de São Paulo apresenta 47,9% de pessoas

com excesso de peso, tendo-se 15,5% de indivíduos obesos12,13.

A ocorrência de obesidade humana se deve a fatores genéticos14-18,

socioambientais19-22 e dieta com alto valor energético23-27. A superalimentação é

considerada sua etiologia mais frequente nos países industrializados e

urbanizados26,28-32, em função de dieta mais rica em gorduras, particularmente as de

origem animal, açúcares e alimentos refinados, com redução de carboidratos

complexos e fibras, também conhecida como “dieta ocidental”33-35. Outrossim, o

sedentarismo que a vida moderna impõe, aliado às facilidades tecnológicas do

cotidiano, condiciona os indivíduos predispostos geneticamente a acumular gordura

visceral20,33,34,36.

A obesidade, especialmente a de grau 3 (condição em que o índice de

massa corporal - IMC - é superior a 40 kg/m2), predispõe os indivíduos a

comorbidezes que afetam quase todos os sistemas orgânicos1-3,37-39, encurtando

suas qualidade2 e expectativa de vida1,2,40,41, o que gera um cenário adverso. A

redução de potenciais anos de atividade no obeso mórbido é de aproximadamente

2

12 anos, quando comparado a um indivíduo eutrófico. Isso ocorre de forma

diretamente proporcional ao aumento do IMC42. A crescente pandemia de obesidade

que cada vez mais tem afetado crianças e adolescentes pode tomar até 20 anos de

suas vidas9.

Quando a obesidade central está associada à resistência insulínica

(RI), hipertensão arterial sistêmica, dislipidemia e diabetes mellitus tipo 2 (DM2),

dentre outros distúrbios, caracteriza-se o quadro de Síndrome Metabólica (SM)43.

Sabe-se que a RI representa o principal fator de risco para o desenvolvimento de

doenças cardiovasculares nesses indivíduos44.

O tratamento conservador da obesidade mórbida (OM), com

adequação da alimentação, exercícios físicos, modificação de hábitos de vida e uso

de medicações, apenas muito raramente consegue determinar perda de peso em

níveis adequados e de forma duradoura3,45-48. Não obstante, pode haver resposta

significativa ao tratamento clínico no caso das obesidades grau 1 (IMC entre 30 e 35

kg/m2) e grau 2 (IMC entre 35 e 40 kg/m2).

Desde o advento da cirurgia minimamente invasiva tem havido um

incremento considerável nos procedimentos gastrointestinais que determinam perda

de peso significativa e duradoura, com taxas de complicações muito baixas49-53. Ao

contrário da abordagem conservadora45-48, a cirurgia bariátrica condiciona melhora

ou resolução das doenças associadas à OM em 70% a 100% dos pacientes52-58.

Estudos prospectivos e controlados demonstraram que o tratamento conservador da

OM ao longo de dez anos resulta em aumento do peso corporal da ordem de 1,6%,

comparado com 35% de perda de peso com a gastroplastia redutora com derivação

gastrojejunal50,59. Pode-se observar, ainda, que as taxas de mortalidade em

pacientes obesos são diminuídas de forma importante após operação bariátrica,

quando comparadas com as oriundas de grupos de pacientes tratados

clinicamente53-55,60-62.

O emagrecimento e o controle da SM são usualmente atribuídos a uma

combinação de fatores, como a diminuição acentuada do volume do reservatório

gástrico, aliada à má-absorção intestinal, e a modificações neuro-hormonais que

promovem saciedade precoce e melhora dos metabolismos de carboidratos e

lipídios37,56,63-75. Por sua vez, o controle das comorbidezes após a derivação

3

gastroduodenal em Y-de-Roux – principalmente aquelas decorrentes dos distúrbios

do metabolismo da glicose – é geralmente atribuído à própria diminuição da massa

corporal57,67,76-81. Não obstante, foi demonstrado efeito endócrino potencialmente

controlador da glicemia e promotor de saciedade precoce após operação de

gastroplastia redutora com bypass em Y-de-Roux, antes que advenha qualquer

perda de peso significativa82,83 e muitas vezes antes mesmo que o indivíduo receba

alta hospitalar72,78,83,84.

Observou-se que, após esta intervenção gastrojejunal, estavam

aumentadas no sangue periférico substâncias secretadas pelo intestino diretamente

na corrente sanguínea, em resposta à ingestão de nutrientes, com o resultante

aumento na produção de insulina e, com isso, da captação de glicose37,63,73,75,85-92 -

ditas incretinas -, tais como glucagon-like peptide-1 (GLP-1), produzido pelas células

L, ao qual se atribuem os efeitos antidiabéticos da cirurgia bariátrica56,63,66,73.

Alimentos que chegam rapidamente e mal digeridos às porções mais distais do

intestino delgado promovem aumento do GLP-137,73,75,85,87,88,93, o qual é provido das

capacidades bem definidas de induzir a diferenciação de células primitivas das

ilhotas de Langerhans em células β94,95, promover tanto a neogênese quanto a

proliferação das células 96,97, inibir a apoptose de células 96,97, potencializar a

biossíntese de insulina, por aumento da transcrição gênica89,90,96, amplificar a

secreção glicose-dependente de insulina90, facilitar a ação desse hormônio no

transporte da glicose para o interior das células63,85,86,96-98 e de agir no sistema

nervoso central (hipotálamo, pituitária, núcleo do trato solitário, núcleo

reticular)89,91,99-106, promovendo sensação de saciedade alimentar107-109, além de

diminuir as motilidades gástrica110 e intestinal89,90,96,111, reduzir a absorção de

gorduras pelo trato gastrointestinal112, aumentar a produção de somatostatina e

atenuar a produção de glucagon24,63,64,70-72,89-91,86,113-120. Destarte, a cirurgia bariátrica

constitui-se numa intervenção eminentemente metabólica.

A RI e o DM2 são condições devastadoras que estão correlacionadas

mais comumente à obesidade83,121-123. Admite-se que o grau de obesidade é o

principal fator preditor da ocorrência do DM2 em uma população29. A gordura

visceral está diretamente relacionada com o desenvolvimento de RI e,

eventualmente, de DM236. O DM2 perfaz cerca de 90% dos casos de diabetes;

4

desse total, 80% dos indivíduos estão acima do peso ou são obesos29,83,121,124.

Trata-se de preocupantes afecções metabólicas, dentre as doenças crônicas mais

comuns, caracterizadas pela alta concentração de glicose sanguínea, resultante de

deficiência da secreção ou da ação da insulina, e que se encontram também em

crescente epidemia global25,83,125-130. Atualmente, afetam mais de 415 milhões de

pessoas em todo o mundo, com expectativa de duplicação nas primeiras décadas

desse milênio122,124,130. Em 2010, o número de indivíduos acometidos de SM,

incluindo DM2, era de cerca de 285 milhões e a estimativa é que este número atinja

439 milhões até o ano de 2030131-136. Tem-se que, caso a projeção esteja correta,

um a cada 10 adultos será diabético, no ano de 2040124. Todavia, a RI e o DM2 não

acometem somente a população obesa, havendo incidência cada vez maior de DM2

entre indivíduos com IMC na faixa da eutrofia e do sobrepeso125,130,137-139.

As complicações do DM2 geralmente resultam em baixa qualidade de

vida, invalidez e morte prematura83,124,126,130,140. Apesar dos esforços que têm sido

envidados no sentido do controle da glicemia em pacientes diabéticos, até o

momento nenhuma das terapêuticas tradicionais teve impacto significativo na

progressão da doença54,55,64,87,114,128,140-145. As dietas que impõem grande restrição

energética e os programas clínicos multidisciplinares para perda ponderal raramente

têm demonstrado benefícios consideráveis em médio e em longo

prazos54,59,121,140,146. Vale dizer que a manutenção do controle glicêmico nos

pacientes obesos diabéticos por medidas conservadoras, apesar de diversas opções

farmacológicas, sopesando-se suas limitações, efeitos colaterais, contraindicações e

barreiras socioeconômicas e culturais, é um verdadeiro desafio na prática clínica

diária121,140,141,144-160, tendo-se apenas uma pequena parcela da população com DM2

alcançando as metas terapêuticas140,141,145,157. Em contrapartida, é bem sabido que

as intervenções cirúrgicas bariátricas podem controlar o DM2, mesmo em longo

prazo24,51-55,59,64,68,83,113,114,123,128,129,140,161.

A cirurgia bariátrica e metabólica apresenta-se como uma alternativa

válida não só para o tratamento da obesidade e de suas comorbidezes, mas

também para o DM254,163,164, RI e suas consequências54,55,72,113,165. Admite-se que o

impacto sobre DM2 se deve ao efeito direto da intervenção cirúrgica e

secundariamente à melhora das anormalidades relacionadas à

5

obesidade24,57,64,65,67,71,75,129,166,167. Cada vez mais se valorizam os fatores

enterohormonais e metabólicos dos procedimentos bariátricos63,66,72,83,113,165. Os

mecanismos envolvidos, em especial com a melhora dos parâmetros clínicos do

DM2, são decorrentes das ações de hormônios gastrointestinais, como aumento da

absorção de glicose, diminuição do stress nas ilhotas pancreáticas e melhora da

sensibilidade insulínica66,68,89-91,114,168,169,170. Induzir as células L ileais a clivar o

proglucagon e liberar o GLP-1 parece ser o meio mais eficaz de se obter a resposta

incretínica nos pacientes diabéticos submetidos à cirurgia bariátrica. O tratamento

cirúrgico de pacientes portadores de DM2, obesos ou não, deve ser visto atualmente

como uma alternativa válida para a abordagem dessa enfermidade.

É imperativa a obtenção de novas opções terapêuticas antidiabéticas

que ofereçam maiores eficácia, durabilidade, conveniência, segurança e

tolerabilidade, a fim de se atingirem mais precocemente os objetivos de um controle

glicêmico adequado e de se evitar ou retardar a necessidade de medidas

adicionais149,162 para indivíduos com sobrepeso e obesidade grau 176,171. Tornam-se

necessárias opções mais agressivas, baseadas na etiopatogenia do DM2154,

focadas na preservação da função das células β e na interrupção da progressão

desta doença152, sendo certo que terapias convencionais não levam à cura desta

afecção64,67,172. Tem sido preconizada a construção de outras configurações

cirúrgicas do tubo digestório26,29,173-176 – sem restrição alimentar, sem a exclusão de

qualquer segmento, sem caráter disabsortivo – visando provocar resposta

metabólica adequada frente ao desafio de tratar mediante cirurgia o DM2.

Várias são as intervenções operatórias que podem alcançar esses

efeitos, todas elas baseadas na “hipótese do intestino posterior”, conhecida como

teoria “hindgut”166,177, em que um processo fisiológico promove melhora do

metabolismo da glicose24,64,67,70-72,77,93,113,178,114. Nessa seara, insere-se a

interposição ileal – técnica que consiste em se realizar um rearranjo do trato

digestivo, transpondo um segmento de íleo terminal a um nível mais proximal, no

trajeto do jejuno, de forma isoperistáltica. A estimulação precoce das células L por

alimentos parcialmente digeridos corrige os efeitos deletérios da “síndrome do

intestino distal vazio”179-181 e reforça o mecanismo do “freio ileal”24,64,70-72,77,113,114,117-

120.

6

É mister registrar que a avaliação de procedimento operatório, no

âmbito da cirurgia bariátrica e metabólica, envolvendo apenas a interposição ileal de

forma isolada não foi ainda realizada em humanos. Recentemente foram publicados

resultados clínicos promissores de procedimentos que associam a gastrectomia

vertical à interposição ileal182-204. Essa primeira modalidade operatória pode induzir

saciedade precoce associada a benefícios no metabolismo glicídico e causar perda

ponderal, em curto e em médio prazos205-209. Em pacientes diabéticos não-obesos, a

técnica combinada demonstrou eficácia no controle do DM2184-204. É interessante

observar que em tais intervenções cirúrgicas antidiabéticas propostas182-204, um dos

tempos operatórios constantes em todas as suas versões é a gastrectomia vertical.

Como têm sido realizadas de forma combinada a outras operações, não se conhece

o papel de cada procedimento isoladamente. Note-se que a gastrectomia vertical é

um procedimento misto205-217, isto é, restritivo (pela acentuada redução da

capacidade reservatória gástrica) e metabólico (tanto pela diminuição dos níveis

circulantes do hormônio orexígeno grelina, produzido pelo fundo e grande curvatura

gástricos, quanto pelo incremento do hormônio incretínico GLP-1, em função do

aumento da velocidade de esvaziamento do trato digestório proximal, com a

subsequente chegada mais precoce de nutrientes ainda não digeridos no íleo

distal58,208,216,217). Nesse cenário, é questionável a finalidade da realização dessa

etapa operatória – a gastrectomia vertical – em pacientes que não necessitam de

perda ponderal.

Tem-se que a obesidade e o DM2 estão relacionados a diversas

condições clinicometabólicas que devem ser consideradas quando se busca um

modelo experimental para pesquisas. Muitos envolvendo roedores29,70,218-222, cujas

características biológicas são semelhantes às dos humanos – no que diz respeito ao

genoma, ao metabolismo glicídico e à nutrição em geral222 –, têm sido utilizados.

O modelo animal de obtenção da obesidade e SM por meio de

alterações provocadas na dieta – obesidade induzida por dieta – é o que melhor

mimetiza a condição da obesidade humana26,29-32. Ademais, os modelos

experimentais de RI são muito úteis na avaliação de aspectos fisiopatogênicos,

fisiopatológicos e terapêuticos da síndrome metabólica29, nomeadamente do DM2. É

de se considerar, portanto, que o dismetabolismo glicídico induzido por dieta

7

experimental é o modelo ideal e necessário para se analisar padrões bioquímicos,

metabólicos e histológicos que ocorrem nas intervenções cirúrgicas bariátricas,

especialmente no que concerne ao metabolismo glicídico.

A interposição ileal isolada (III) já se mostrou eficaz na correção do

dismetabolismo em diversas pesquisas envolvendo animais de

experimentação67,77,93,96,109,166,178,223-247. É sabido que o íleo terminal representa

importante papel no eixo enteroendócrino77,90,102,172,178, por abrigar uma maior

densidade de células L produtoras de GLP-1, sustentando-se a hipótese do intestino

posterior como mecanismo principal do controle do DM-265,67,77,93,117,247,248. Admite-

se que apenas a transposição de um segmento do íleo distal para uma porção mais

proximal do tubo digestório pode influir beneficamente no metabolismo glicídico, sem

que haja segmentos gastrintestinais removidos ou excluídos do trânsito

alimentar24,64,67,69-72,77,93,102,108,113,114,117-120,128,176-178,223,225,227,248-251. Também se

observou, em ratos euglicêmicos e de peso normal, que a III melhorou a tolerância à

glicose, sem ocorrência de hipoglicemia nem de redução ponderal67,166,252,253.

Vale salientar que não há relatos de que a avaliação histológica do

pâncreas de animais com dismetabolismo glicídico induzido por dieta, submetidos a

essa cirurgia, tivesse sido realizada. Nosso grupo demonstrou que, em ratos

normais (não-obesos e não-diabéticos), a III não induz a alterações na estrutura do

pâncreas, não sendo observados aumento de ilhotas de Langerhans nem aumento

da celularidade total ou de células β253. Estudos revelaram os efeitos tróficos

benéficos desta técnica operatória nas estruturas do intestino e do pâncreas, em

modelos experimentais de diabetes genético e com diabetes fármaco-induzido, e

inclusive em populações com pequenas alterações de peso77,93,96,100,166,223-

225,228,242,254-259. Desta feita, analisar os efeitos promovidos pela III na situação ora

proposta na presente pesquisa parece ser uma etapa importante nesse

conhecimento.

A III pode vir a constituir-se, teoricamente, numa alternativa terapêutica

efetiva, de natureza cirúrgica, para pacientes com RI ou DM2 com pouca elevação

de seu peso corporal (isto é, com obesidade leve - grau 1 ou apenas sobrepeso),

sem implicações em seu estado nutricional e que fosse efetiva no controle, ou até

remissão, da doença. A melhora precoce e sustentada do DM2 em pacientes

8

submetidos a cirurgias bariátricas consolidadas despertam a necessidade de

investigação das repercussões da III no metabolismo glicídico e na abordagem

dessa enfermidade.

A configuração da intervenção cirúrgica estudada nesta pesquisa faz

supor que não se produz nenhum distúrbio da absorção dos nutrientes, é

tecnicamente mais simples, menos dispendiosa, não requer nenhuma remoção de

segmento de tubo disgestório, nem condiciona desvio de trânsito alimentar de

nenhuma ordem, destarte evitando a incidência de desnutrição. Importam os

benefícios que a intervenção cirúrgica estudada possa vir a proporcionar, com

segurança e sem implicações sobre o seu estado nutricional, para uma imensa

população de indivíduos portadores de DM2 de difícil controle clínico, e não obesos

mórbidos, promovendo melhora substancial e até mesmo a remissão da disglicemia.

Entretanto, para que a interposição ileal isolada venha a se consolidar

como opção terapêutica do diabetes, faz-se necessária sua validação em modelos

animais que melhor traduzam a realidade da população, muito embora se conheçam

os perfis dos enterohormônios após a cirurgia bariátrica com efeito incretínico em

humanos e em outros modelos animais. Há que se avaliar os efeitos que lhe podem

ser atribuídos exclusivamente e verificar se tais repercussões sobre o metabolismo

glicídico permanecem em longo prazo, visto que os resultados clínicos obtidos

podem ser secundários, principalmente, aos procedimentos associados realizados.

Essa intervenção não foi até o momento realizada de forma isolada em

modelo experimental com dismetabolismo glicídico comprovadamente induzido por

dieta, mimetizando a condição humana247. As pesquisas relatadas na literatura

envolvem diferentes linhagens de ratos, incluindo animais

normais166,225,226,243,244,246,255,258, ou modificados genética67,77,96,100,178,227,229-239,257 e

quimicamente166,242,259, ou que utilizam de dietas hipercalóricas por curto período de

tempo, não se tendo demonstrado categoricamente alterações pré-operatórias do

metabolismo de carboidratos93,109,228,240,241,245, notando-se viéses metodológicos que

impedem que as conclusões possam ser extrapoladas para a clínica com prudência,

haja vista que a situação de hipoinsulinemia genética e a resultante de destruição

pancreática não se superpõem à condição de RI como de fato ocorre na população

em geral, inclusive em indivíduos não obesos.

9

OBJETIVOS

1. Objetivo geral

Contribuir para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2, mediante

avaliação dos efeitos da interposição ileal isolada em modelo experimental de

dismetabolismo glicídico induzido por dieta em ratos.

2. Objetivos específicos

Investigar as modificações ponderais e da ingestão alimentar

decorrentes da interposição ileal isolada;

Averiguar as alterações do metabolismo da glicose secundárias à

interposição ileal isolada; e

Examinar a morfologia e a celularidade do pâncreas endócrino após a

interposição ileal isolada.

10

MATERIAL E MÉTODOS

1. Comitê de Ética em Pesquisa e Financiamento

O projeto da pesquisa (180733/11) foi encaminhado ao Comitê de

Ética em Pesquisa Experimental da Universidade Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), tendo sido avaliado e aprovado sob o

número 0529/11. O presente estudo obteve financiamento da Fundação de Amparo

à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, mediante o processo 11/05944-1.

Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as orientações do

manual “Cuidados e Manejos de Animais de Laboratório”260.

2. Amostra

Modelo experimental.

Utilizaram-se 72 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), Wistar -

2BAW heterogêneos, com 12 semanas de vida, fornecidos pelo Laboratório de

Experimentação Animal do Instituto de Farmacologia e Biologia Molecular (InFar) da

UNIFESP, onde foram mantidos durante todo o experimento. Os animais

permaneceram alojados em gaiolas com quatro integrantes cada, identificados e

mantidos por 36 semanas, com temperatura ambiente controlada de 23 2C,

umidade relativa de 55 15%, e com dispositivo automático (Timer – Kienzle)

proporcionando ciclo de alternância de luminosidade entre claro e escuro de 12 em

12 horas (06:00 / 18:00 horas). Através de sorteio, os animais foram inicialmente

distribuídos em 2 grupos:

- Grupo Ração Padrão (GP), com 16 animais, que receberam somente

ração padrão durante todo o experimento, não submetidos a nenhuma intervenção

cirúrgica.

- Grupo Dieta Experimental (DE), contendo 56 animais, os quais

passaram a consumir formulações hiperenergéticas-hiperlipídicas, quando foram

então distribuídos, na 30ª semana de vida, aleatoriamente, em:

11

-- Grupo Interposição Ileal Isolada (GT) – submetidos à

transposição ileal, com 20 animais;

-- Grupo Sham (GS) – submetidos à operação simulada, com 20

animais; e

-- Grupo Controle (GC) – não submetidos a nenhuma

intervenção cirúrgica, com 16 animais.

As características corporais e do perfil glicêmico dos animais dos

grupos GP e DE encontram-se elencadas na Tabela 1.

Tabela 1 – Achados corporais e metabólicos dos grupos GP e DE

GP DE p-valor

Peso Corporal 429,50 (48,27) 512,02* (44,95) <0,01

Índice de Lee 296,3 (6,61) 306,7* (9,15) <0,01

Eficiência Alimentar 110,6 (11,3) 45,3* (2,5) 0,003

Glicemia 114,75 (10,82) 129,66* (14,74) <0,01

Hemoglobina Glicada 9,23 (6,88) 18,77* (7,15) 0,003

Insulina 1.465,81 (805,34) 1.795,71 (846,75) 0,724

Peptídeo C 2.331,44 (479,51) 2.007,08* (187,92) 0,015

Glucagon 77,55 (55,90) 13,04* (6,66) 0,001

GLP-1 113,08 (31,32) 60,22* (20,71) 0,047

Área do gráfico – TTOG 21.367,97 (299,33) 24.683,46* (358,66) 0,035

KITT – IpITT 1,521 (0,08) 1,071* (0,19) 0,042

HOMA-IR 6,36 (1,92 - 16,73) 9,23* (1,51 - 29,27) 0,036

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores representam a média e desvio padrão ou a mediana e o intervalo mínimo-máximo. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

Quadro - Distribuição dos animais nos grupos da pesquisa.

Amostra

n = 72

Grupo

Ração Padrão

(GP)

n = 16

Grupo

Interposição Ileal

Isolada (GT)

n = 20

Grupo

Sham

(GS)

n = 20

Grupo

Controle

(GC)

n = 16

12

3. Procedimentos experimentais

3.1. Dietas

Os animais do grupo DE foram mantidos com as formulações de dietas

hiperenergéticas, ricas em lípides, peletizadas, ministradas ad libitum, em de

revezamento ordenado semanal, por 18 semanas. Os animais do grupo GP, por sua

vez, receberam dieta padrão. A oferta de água foi de livre acesso em ambos os

grupos.

A dieta experimental foi constituída de quatro tipos de rações (DH)

propostas por Nascimento et cols261, de acordo com as especificações da Nutrient

Requirements of the Laboratory Rat, recomendadas pela National Academy of

Sciences, as quais foram produzidas industrialmente pela empresa Rhoster®,

Araçoiaba da Serra-SP. Trata-se de formulações compostas por ração padrão para

ratos com suplementação protéica, vitamínica e mineral. Os ingredientes adicionais

hiperenergéticos utilizados no preparo das dietas experimentais, em gramas por

quilo, são, respectivamente:

- DH1 - ração padrão, 355; amendoins torrados, 176; caseína, 123;

óleo de milho, 82; chocolate, 88; biscoito de milho, 176; e vitaminas e minerais.


óleo de milho, 61; batata frita, 153; e vitaminas e minerais.

- DH3 - ração padrão, 371; amendoins torrados, 185; caseína, 99; óleo

de milho, 68; macarrão, 185; queijo ralado, 92; e vitaminas e minerais.


óleo de milho, 80; leite condensado, 161; bolacha wafer, 116; e vitaminas e minerais.

A composição de macronutrientes das rações padrão e experimentais

hipercalóricas-hiperlipídicas, produzidas e analisadas em laboratório pela empresa

Rhoster®, Araçoiaba da Serra-SP, está apresentada na Tabela 2.

13

Tabela 2 - Composição das dietas padrão e experimentais.

Rações

Componentes Padrão DH 1 DH 2 DH 3 DH 4

Proteína (%) 26 27 28 28 26

Carboidrato (%) 54 43 36 33 43

Gordura (%) 3 20 23 24 20

Outros (%) † 17 10 13 15 11

Calorias (Kcal/g) 3,5 4,6 4,6 4,6 4,6

DH - dieta hipercalórica-hiperlipídica. † - vitaminas, minerais, umidade, cinzas.

Aos animais dos grupos GT, GS e GC, distribuídos a partir do grupo

DE, na 30ª semana de vida, ofereceram-se, até o final do experimento, por mais 18

semanas, os mesmos quatro tipos diferentes de rações em ciclos alternados. Não

houve modificação na ministração das dietas.

3.2. Consumo de ração, curva de peso e índice de Lee

O consumo de ração foi observado três vezes por semana, em dias

predeterminados, anotando-se em cada gaiola a diferença entre os pesos da ração

ofertada e da ração consumida. Fez-se o cálculo aritmético para quantificação do

consumo diário de cada ração, em gramas.

A taxa de consumo alimentar foi calculada como sendo a relação entre

a quantidade de ração ingerida, em gramas, por quilo de massa corporal dos

animais, por dia. A taxa de conversão alimentar foi utilizada para analisar a

capacidade de os animais converterem a ração consumida em massa corporal.

Calculou-se a relação entre o total de energia ingerido, em quilocalorias, e o ganho

de peso semanal, em gramas, multiplicado por 100.

A pesagem de cada animal foi realizada uma vez por semana, em dias

preestabelecidos, na quarta hora do período claro, com balança Filizola BP-6; o

registro foi feito em gramas.

14

Calculou-se o índice de Lee262 para avaliação biométrica individual,

nas 12ª, 30ª e 48ª semanas de vida. O valor foi obtido mediante o cálculo da relação

entre o peso, em gramas, e o comprimento naso-anal, em centímetros, de acordo

com a seguinte fórmula:

3P(g)

CNA(cm)x 1000

3P(g)

CNA(cm)x 1000

3.3. Testes laboratoriais e bioquímicos

3.3.1. Glicemia periférica

A verificação da glicose periférica de todos os animais deu-se

semanalmente, em dias pré-determinados. A glicemia foi determinada após seis

horas de jejum, utilizando-se glicosímetro e fitas para glicemia da marca Breeze2®;

os resultados foram expressos em mg/dL.

3.3.2. Dosagens séricas de insulina, peptídeo C, glucagon, GLP-1

e hemoglobina glicada

As coletas sanguíneas para os testes laboratoriais ocorreram em três

ocasiões:

- 12ª semana de vida (início do experimento);

- 28ª semana de vida (após 16 semanas de consumo de ração padrão

ou dieta experimental, conforme o caso, e duas semanas antes da época das

intervenções cirúrgicas nos grupos GS e GT); e

- 48ª semana de vida (correspondente à 18ª semana de pós-operatório

para os animais dos grupos GS e GT).

15

Aos animais de todos os grupos foi oferecida somente água nas 12

horas que antecederam os procedimentos de coleta de sangue. Obteve-se 0,5 mL

de sangue através de punção da veia da cauda de cada um dos animais, após

pesagem e sob anestesia prévia, em tubos heparinizados, contendo DPPIV,

seguindo-se o protocolo recomendado. As dosagens de insulina, peptídeo C,

glucagon, GLP-1 e hemoglobina glicada foram realizadas pelo laboratório da

Genese®, na cidade de São Paulo (SP-Brasil), utilizando o método de

Milliplex®MAP (Luminex Corporation’s Multiple Analyte Profiling®, Merck Millipore

Corporation, Darmstadt, Alemanha); os resultados foram expressos em pg/mL.

3.3.3. Teste de tolerância oral à glicose

Os animais de todos os grupos foram submetidos ao teste de

tolerância oral à glicose (TTOG)77,93,100,178,228,240,242. Amostras de glicemia periférica

foram obtidas imediatamente antes (tempo 0), 15, 30, 60, 90, 120 e 180 minutos

após a administração de 1g de glicose por quilo de peso, por gavagem, mediante

punções na cauda, com glicosímetro e fitas da marca Breeze2®. A intolerância foi

determinada de acordo com a área do gráfico da curva glicêmica (0 a 180 minutos).

O teste foi realizado nos seguintes momentos:


ou dieta experimental, conforme o caso, e duas semanas antes da época das

intervenções cirúrgicas nos grupos GS e GT);


para os animais dos grupos GS e GT); e



3.3.4. Teste intraperitoneal de resistência insulínica

Realizou-se o teste intraperitoneal de resistência insulínica

(IpITT)77,93,178,253 nas seguintes ocasiões:

16


ou dieta experimental, conforme o caso, e uma semana antes da época das

intervenções cirúrgicas nos grupos GS e GT);


para os animais dos grupos GS e GT); e



Após seis horas de jejum, todos os animais foram pesados. Na

sequência, realizou-se a coleta de sangue periférico pela cauda para obtenção da

glicemia basal (tempo 0). Em seguida, administrou-se injeção de insulina regular da

marca Humulin®, na dosagem de 1 unidade por quilo de peso corporal, via

intraperitonial. As amostras foram obtidas após 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos, para

aferição da glicemia capilar, mediante punções na cauda, com glicosímetro e fitas da

marca Breeze2®. Mensurou-se a sensibilidade à insulina utilizando-se a velocidade

constante do decaimento da glicose (KITT) como índice do metabolismo da glicose

mediado pela insulina. Foi utilizada a fórmula KITT = 0,693 x 100 / t½ para efeito de

comparação entre os grupos de estudo. O t½ foi calculado a partir da curva da

análise dos mínimos quadrados da concentração da glicose durante a fase de

decaimento linear; representa a meia-vida do decaimento da glicose e foi

determinado a partir do coeficiente angular da reta obtida pela regressão linear do

logaritmo natural da glicose versus o tempo. O KITT corresponde à queda da glicose

expressa em porcentagem por minuto e foi obtido pela seguinte fórmula:

X0=0, x1=5, x2=10, x3=15, x4=20, x5=25, x6=30

Y0=ln(m0/m0), y1=ln(m1/m0), y2=ln(m2/m0), y3=ln(m3/m0), . . . ,y6=ln(m6/m0)

17

3.3.5. Cálculo do HOMA-IR

A RI foi calculada nas 12ª, 28ª e 48ª semanas de vida pelo teste

indireto HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment) – modelo matemático utilizado

para quantificar a RI e a função das células β do pâncreas, que prediz a

sensibilidade à insulina – através da fórmula:

HOMA-IR: Insulina em jejum (µU/mL) x Glicemia em jejum (mmol/mL) / 22,5.

3.4. Caracterização do desenvolvimento de obesidade exógena e

de alterações secundárias do metabolismo glicídico

Verificaram-se os efeitos no peso, na ingestão alimentar e no perfil

glicêmico após a ministração de rações hiperenergéticas-hiperlipídicas para o grupo

DE. Observou-se distinção entre os grupos GP e DE após o período de consumo de

formulações dietéticas diferentes. Comprovou-se que o ciclo de dietas experimentais

é eficiente em promover aumento do peso corporal e incremento da adiposidade, em

ratos Wistar, que passam a apresentar hiperglicemia, intolerância a glicose e

resistência periférica à insulina.

3.4.1. Avaliação biométrica entre as 12ª e 30ª semanas de vida

3.4.1.1. Peso corporal

No início da pesquisa, os animais dos grupos GP e DE apresentaram

pesos semelhantes (p=0,245). A variação do peso ao longo do tempo foi crescente

em ambos os grupos. Ao se comparar a evolução do ganho de massa corporal dos

animais nas 18 semanas subsequentes, observou-se a distinção entre os grupos,

com maior incremento no grupo DE (Figura 1). A partir da 15ª semana de vida, os

animais do grupo DE apresentaram pesos significantemente maiores em relação aos

animais do grupo GP, e essa relação se manteve até a 30ª semana de vida

(p<0,05). Na 30ª semana de vida, verificou-se uma diferença média positiva de

http://pt.wikipedia.org/wiki/Resist%C3%AAncia_%C3%A0_insulina

http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_beta

http://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%A2ncreas

18

82,5g entre os grupos, com ganho ponderal 19,2% maior no grupo DE em

comparação ao grupo GP (p<0,01) (Figura 2).

Figura 1 – Evolução do ganho ponderal (g) entre as 12ª e 30ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta Experimental (DE/n=56). Os valores são representados pela média ± desvio padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

Figura 2 – Peso médio (g) na 30ª semana de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta Experimental (DE/n=56). Os valores estão expressos em mediana ± intervalo interquartil. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

* * *

* * * * * * * * *

* * * *

* * *

* * * * * * * * *

* * * *

*

19

3.4.1.2. Índice de Lee

Não houve diferença entre os grupos no início do estudo (p>0,05). Os

animais do grupo DE apresentaram índice de Lee superior ao dos animais do grupo

GP, na 30ª semana de vida (p<0,01). Ao se comparar o índice de Lee na 30ª

semana de vida, observou-se diferença entre os grupos (Tabela 3).

Tabela 3 – Índice de Lee (g/cm) nas 12ª e 30ª semanas de vida.

GP DE

Média DP Média DP p-valor

Lee 12ª semana 302,2 6,03 296,6 8,76 0,060

Lee 30ª semana 296,3 6,61 306,7* 9,15 < 0,01

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores representam a média e desvio padrão (DP). (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

3.4.2. Consumo de ração entre as 12ª e 30ª semanas de vida

Observou-se variação da ingestão alimentar ao longo do tempo em

ambos os grupos (Figura 3). A análise comparativa das taxas de consumo alimentar

a cada semana mostrou que, em gramas, houve menor consumo de dieta

experimental em relação à ração padrão (Figura 3). Verificou-se que nas ocasiões

do oferecimento da dieta experimental DH2 para os animais do grupo DE, o

consumo semanal foi menor do que o consumo das demais formulações (semana

17, semana 21, semana 25, semana 29) (Figura 3). Houve diferença estatística entre

as médias semanais e no período entre as 12ª e 30ª semanas de vida (p<0,01).

20

Figura 3 – Consumo diário de ração (g) por quilograma de peso corporal entre as 12ª e 30ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta Experimental (DE/n=56). Os valores são representados pela média ± erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

No grupo GP, observou-se a necessidade de ingestão de 110,6kcal

para o aumento de cada grama de peso corporal, ao longo das 18 semanas, ao

passo que, no grupo DE, a taxa de conversão alimentar foi significativamente menor,

com valor de 45,3kcal/g (p=0,003) (Tabela 4); houve menor consumo, em gramas,

de ração especial para que se tivesse o incremento de peso corporal. Observou-se,

na análise da eficiência alimentar pela relação entre o consumo de ração e o peso

corporal que a ingestão foi maior no grupo GP e que o grupo DE apresentou maior

ganho ponderal entre as 12ª e 30ª semanas de vida (Figura 4).

Tabela 4 - Taxa de conversão alimentar (kcal/g) entre as 12ª e 30ª semanas de vida

GP DE p-valor

Eficiência alimentar 110,6 ± 11,3 45,3 ± 2,5* 0,003

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores representam a média ± erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

* * *

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* * *

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21

Figura 4 – Relação do consumo de ração e peso no período entre as 12ª e 30ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta Experimental (DE/n=56). Os valores são representados pela média ± erro padrão. p < 0,05.

3.4.3. Análises bioquímicas entre as 12ª e 30ª semanas de vida

3.4.3.1. Glicemia periférica e glicemia de jejum

No início do estudo, a comparação das glicemias periférica e de jejum

entre os animais de ambos os grupos não mostrou diferença estatística (p>0,05)

(Figura 5). A partir da primeira semana da administração da dieta experimental,

houve aumento sustentado dos níveis glicêmicos periféricos dos animais do grupo

DE, em relação aos do grupo GP (Figura 5). A média do nível de glicose sérica, na

28ª semana de vida, dos animais do GP foi de 105 mg/dL, ao passo que a dos

animais do grupo DE foi de 116 mg/dL (Figura 6). A avaliação comparativa das

médias dos níveis sanguíneos de glicose, tanto intersticial quanto sérica, entre os

dois grupos demonstrou diferença estatística (p<0,01).

22

Figura 5 – Evolução das glicemias periféricas semanais (mg/dL) entre as 12ª e 30ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16) e Grupo Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

Figura 6 – Níveis glicêmicos séricos médios (mg/dL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

Observou-se uma correlação linear positiva forte entre a glicemia

média e a variação de peso corporal no período entre as 12ª e 30ª semanas de vida

(Figura 7). O coeficiente de correlação (r) foi significante e o valor obtido foi 0,77; o

coeficiente de determinação (r2) foi igual a 0,59.

*

*

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* *

23

Figura 7 – Correlação entre a glicemia média (mg/dL) e a variação de peso corporal (g) entre as 12ª e 30ª semanas de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). O coeficiente de correlação é igual a 0,77. O coeficiente de determinação é igual a 0,59.

3.4.3.2. Hemoglobina glicada

Verificou-se elevação significante dos níveis de hemoglobina glicada

no grupo DE, na análise comparativa realizada na 28ª semana de vida (p=0,003)

(Figura 8).

24

Figura 8 – Níveis médios de hemoglobina glicada (ng/mL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

3.4.3.3. Insulina

Não houve diferença estatística na comparação da insulinemia de cada

grupo na 28ª semana de vida (p=0,724) (Figura 9).

Figura 9 – Níveis séricos de insulina (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias e erro padrão. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos, p > 0,05.

*

25

3.4.3.4. Peptídeo C

Verificou-se diferença estatística na comparação dos níveis séricos de

peptídeo C na 28ª semana de vida, menor no grupo DE. (p=0,015) (Figura 10).

Figura 10 – Níveis séricos de peptídeo C (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

3.4.3.5. Glucagon

Não houve diferença entre os grupos GP e DE na 12ª semana de vida

(p>0,05). Constatou-se hipoglucagonemia no grupo DE, ao se compararem os níveis

séricos de glucagon na 28ª semana de vida (p=0,001) (Figura 11).

*

26

Figura 11 – Níveis séricos médios de glucagon (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

3.4.3.6. GLP-1

Observou-se aumento da secreção de GLP-1 no grupo GP, na 28ª

semana de vida, e não no grupo DE (p=0,047) (Figura 12).

Figura 12 – Níveis séricos médios de GLP-1 (pg/mL) na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias e erro padrão. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

*

*

27

3.4.4. Testes metabólicos entre as 12ª e 30ª semanas de vida

3.4.4.1. Teste de tolerância oral à glicose - TTOG

Verificou-se que os animais do grupo DE desenvolveram intolerância a

glicose na 28ª semana de vida. Encontrou-se significância estatística nos momentos

de todas as aferições, quando comparados os níveis de glicemia periférica do grupo

DE com os do grupo GP (p<0,05) (Tabela 5). A área do gráfico da curva da glicose

foi maior no grupo DE (p=0,03) (Figura 13).

Tabela 5 – Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) na 28ª semana de vida.

Instantes de medição GP DE


0 minuto 114,75 14,460 129,20* 10,817 < 0,01

15 minutos 119,56 20,505 131,96* 10,639 0,016

30 minutos 112,19 20,666 133,45* 11,560 < 0,01

60 minutos 129,69 21,459 137,60* 11,026 0,035

90 minutos 122,44 20,083 141,82* 8,914 < 0,01

120 minutos 124,56 20,544 143,73* 9,953 < 0,01

180 minutos 100,69 17,876 129,40* 8,538 < 0,01

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores representam a média e desvio padrão (DP), em mg/dL. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

Figura 13 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose na 28ª semana de vida. Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressos pelas médias. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

*

28

3.4.4.2. Teste intraperitoneal de resistência insulínica - IpITT

O teste intraperitoneal de resistência insulínica (IpITT) realizado na 29ª

semana de vida revelou que os animais do grupo DE apresentaram menor queda da

glicemia periférica, em porcentagem por minuto, com KITT significativamente inferior

ao do grupo GP (p=0,042) (Tabela 6).

Tabela 6 – Teste intraperitoneal de resistência insulínica (IpITT) pela constante de decaimento da glicose (KITT) na 29ª semana de vida.

GP DE


KITT (%/minuto) 1,521 0,08 1,071* 0,19 0,042


3.4.4.3. HOMA-IR

O HOMA-IR aferido na 28ª semana de vida foi significativamente maior

no grupo DE (p=0,036) (Tabela 7).

Tabela 7 – HOMA-IR na 28ª semana de vida.

GP DE

Mediana Mínimo Máximo Mediana Mínimo Máximo p-valor

28ª semana 6,36 1,92 16,73 9,23* 1,51 29,27 0,036

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores expressam a mediana e o intervalo mínimo-máximo. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

3.5. Anestesia, antibioticoprofilaxia e procedimentos operatórios

Nos dias determinados, com 30 semanas de vida, dois ratos com

dismetabolismo glicídico comprovado nos testes procedidos foram separados e

aleatoriamente distribuídos, um no GT e outro no GS. Em ambos os grupos, foi

realizada anestesia geral dissociativa para a realização das intervenções cirúrgicas,

utilizando Zoletil 50® (composto de tiletamina e zolazepan) na dose de 20 mg/kg de

peso e Fentanil® na dose de 0,025 mg/kg de peso, coletados na mesma seringa e

injetados simultaneamente, via intramuscular263.

29

Cada animal foi mantido em ventilação espontânea durante os

procedimentos, e o plano anestésico foi controlado mediante avaliação periódica, a

cada 30 minutos, dos reflexos auricular e interdigital, que permaneceram abolidos.

Uma vez constatado o reaparecimento desses reflexos, fez-se complementação

anestésica com um terço da dose inicial. A antibioticoprofilaxia foi realizada com

cefoxitina, na dose de 50 mg/kg de peso, via intramuscular, logo depois de

anestesiados para a cirurgia264,265.

Os animais anestesiados tiveram os pelos da região abdominal

parcialmente cortados com tesoura rente à pele e foram posicionados em decúbito

dorsal horizontal na mesa cirúrgica, sobre placa aquecida, com as patas e a cauda

devidamente imobilizadas com esparadrapo. Adotaram-se todos os princípios de

assepsia de Halsted260. A anti-sepsia da região abdominal foi feita com iodopovidine

em veículo alcoólico. Colocou-se campo cirúrgico esterilizado fenestrado na região

abdominal do animal, e foi realizada incisão longitudinal mediana da parede, de 5 cm

de extensão, com bisturi descartável de lâmina de número quinze. Utilizou-se

instrumental microcirúrgico estéril para execução dos procedimentos operatórios.

No animal componente do GT, procedeu-se a intervenção conforme a

técnica operatória proposta por Koopmans223. O ceco foi identificado e exposto,

juntamente com o íleo terminal. A seguir, o intestino delgado foi seccionado

perpendicularmente na região distando 5 cm da transição íleo-cecal. O íleo foi

novamente seccionado perpendicularmente na região distante 15 cm da transição

íleo-cecal, separando-se, dessa forma, um segmento ileal de 10 cm, o qual foi

envolto em gaze umedecida com solução de cloreto de sódio a 0,9%, aquecida. Em

seguida, foi realizada a anastomose dos segmentos do íleo remanescente, de forma

a se restabelecer a continuidade do tubo digestório. Posteriormente, foi seccionado

o jejuno distante 5 cm da transição duodeno-jejunal. O segmento do íleo distal

anteriormente separado foi interposto aos segmentos do jejuno seccionado, em

posição isoperistáltica, por entero-enteroanastomose. (Figura 14 e Figura 15).

30

Figura 14 – Esquemas demonstrativos sequenciais253

. (a) Regiões de secção intestinal e isolamento do segmento de íleo distal a ser interposto. (b) Transposição do segmento ileal isolado para porção inicial do jejuno.

No animal componente do GS, procedeu-se a operação simulada. O

ceco foi identificado e exposto, juntamente com o íleo terminal. A seguir, o intestino

delgado foi seccionado perpendicularmente na região distando 5 cm da transição

íleo-cecal e realizada a anastomose dos segmentos intestinais. Depois, nas regiões

distantes 5 e 15 cm da transição duodeno-jejunal, a fim de simular a terceira

anastomose, a qual é realizada no caso do grupo GT, também se procedeu à

secção seguida de síntese das alças intestinais. A continuidade do tubo digestório,

sem interposição de nenhum segmento intestinal, foi mantida.

Todas as anastomoses intestinais realizadas foram termino-terminais,

com seis pontos totais e separados, utilizando-se fios de polipropileno número 7-0,

pré-montados em agulha cilíndrica. Após a revisão final, terminado o ato cirúrgico,

os animais foram hidratados com 1,0 mL de solução cristalóide (soro fisiológico a

0,9%) para cada 300g de peso, na temperatura de 36ºC, via intraperitoneal. A

síntese da parede abdominal foi realizada com sutura contínua em monobloco do

peritônio parietal, da camada muscular e da aponeurose, utilizando-se fio de

31

poliglactina 4-0, pré-montado em agulha cilíndrica. Na pele foi feita sutura contínua

com pontos invertidos, utilizando-se fio de poliglactina 4-0, pré-montado em agulha

cilíndrica. Procedeu-se, ao término do procedimento operatório, à hidratação

complementar com 15 mL de solução cristalóide (soro fisiológico a 0,9%), na

temperatura de 36ºC, via subcutânea, no dorso, conforme técnica padrão.

Figura 15 – Imagem fotográfica das anastomoses intestinais efetuadas nos animais submetidos a interposição ileal isolada (GT).

32

3.6. Cuidados pós-operatórios

Antes da recuperação anestésica total, os animais receberam

analgesia com 0,5 mL da solução de 3 g de dipirona diluídos em 1 mL de água, por

gavagem. Os animais foram mantidos aquecidos e em observação até a

recuperação completa da anestesia, quando foram colocados em gaiolas individuais

e encaminhados para a sala de albergue, no mesmo Laboratório, sob as mesmas

condições ambientais pré-operatórias. Durante as primeiras 72 horas seguintes de

pós-operatório, foram mantidos com 1 g de dipirona diluído em 100 mL de água. Foi

reintroduzida água ad libitum assim que houve recuperação anestésica. O acesso à

dieta em farelos foi permitido após 12 horas do término da cirurgia.

3.7. Eutanásia

Os animais foram avaliados e acompanhados até a 48ª semana de

vida, correspondente à 18ª semana do pós-operatório. Nesse momento, foram

realizados os mesmos procedimentos de jejum e anestesia e, em seguida, efetuou-

se a eutanásia pela técnica de decapitação, conforme orientações da Sociedade

Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório e do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal – SBCAL-COBEA260.

3.7.1. Adiposidade corporal

Foram coletados e pesados em balança de precisão, por ocasião da

eutanásia, os depósitos de gordura peri-epididimal e retroperitoneal de todos os

animais de cada grupo. O índice de adiposidade foi calculado através de proporção,

considerando-se o peso corporal de cada animal.

3.7.2. Coleta de tecido pancreático

O pâncreas dos animais de todos os grupos foi removido junto à

grande curvatura gástrica e à região esplênica, em monobloco, para estudo

imunohistoquímico. Os tecidos coletados para análise morfológica comparativa com

microscopia ótica foi devidamente disposto em cassete e fixado em formaldeído

33

tamponado a 10%, em um volume aproximado de 20 vezes o tamanho do espécime,

por período de tempo compreendido entre 12 e 24 horas após a coleta e, em

seguida, processado para inclusão em parafina. Os cortes histológicos foram obtidos

em micrótomo Minot regulado para a espessura de 5 m e colocados em lâminas

previamente tratadas com organosilano a 5%, utilizando-se o maior eixo da peça.

As lâminas com os cortes histológicos seguiram o protocolo de

imunohistoquímica do laboratório do Departamento de Patologia da UNIFESP. O

estudo das células beta foi realizado mediante marcação com anticorpo antiinsulina

do tipo policlonal de coelho código H-86:SC-9168, da empresa Santa Cruz

Biotechnology, EUA.

A captura das imagens foi realizada com sistema computadorizado,

constituído por microscópio de luz (Olympus - Modelo BX4OF-3), adaptado a uma

câmera de alta resolução (Olympus – Modelo QColor 3) e monitor de vídeo colorido

(LG Flatron®). Foram realizadas fotomicrografias utilizando-se o programa QCapture

Pro® (desenvolvido pela Q Imaging Corporate Headquarters, Surrey, Canada), em

equipamentos disponíveis no Departamento de Patologia da UNIFESP. Utilizou-se o

programa de processamento e análise de imagens Image J®, desenvolvido no

Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland,

EUA, e obtido gratuitamente na Internet.

A partir dos dois maiores diâmetros da amostra na lâmina, foram

digitalizadas todas as imagens microscópicas consecutivas, no aumento de 400

vezes. Os parâmetros histológicos analisados em todas as fotomicrografias

captadas foram:

A. Número absoluto de ilhotas pancreáticas, definido através da

somatória de todas as imagens visualizadas nos dois diâmetros;

B. Área das ilhotas pancreáticas, definida através da somatória

de todas as áreas de ilhotas presentes nas imagens digitalizadas nos dois diâmetros

e expressa em µm2;

34

C. Número absoluto de células beta, obtido através da somatória

de todas as células que imunoexpressam insulina, nas ilhotas pancreáticas

analisadas em todas as imagens digitalizadas;

D. Número absoluto de células não marcadas, obtido através da

somatória de todas as células que não imunoexpressam insulina, nas ilhotas

pancreáticas analisadas em todas as imagens digitalizadas; e

E. Densidade de células beta e densidade de células totais,

obtidas através da relação entre os parâmetros descritos: C/B e (C+D)/B.

Figura 16 – Fotomicrografia do pâncreas. Imunohistoquímica com marcação das células beta. Imagem de um campo captada com aumento de 100 vezes (QCapture Pro®). Realizadas medidas de áreas de ilhotas de Langerhans no pâncreas em µm2 (Image J®).

35

Figura 17 – Fotomicrografia do pâncreas. Imunohistoquímica com marcação das células beta. Imagem de um campo captada com aumento de 400 vezes (QCapture Pro®). Realizadas contagens de células beta e de células não marcadas de cada ilhota de Langerhans (Image J®).

4. Análise estatística

Inicialmente, realizou-se uma análise exploratória dos dados. Para a

avaliação de variáveis de natureza quantitativa, foram calculados os valores

descritivos (média, mediana, valor mínimo, valor máximo, intervalo interquartílico,

desvio-padrão e erro padrão). As análises descritivas foram feitas no Microsoft Excel

2010 com auxílio do software SPSS (Statistical Product and Service Solutions -

SPSS Inc., Chicago, Ilinois, EUA). Para a análise de variáveis de natureza

qualitativa, foram avaliadas as frequências (absoluta e relativa) e o período em que

foram coletadas as informações. Foram confeccionados gráficos do tipo boxplot e de

36

perfis de média para análise dos valores quantitativos nos diferentes grupos, em

diferentes tempos, além de gráfico de dispersão para detectar o grau de associação

entre as variáveis.

Nas análises inferenciais, para verificação de diferença entre grupos,

foi realizado o tesde de normalidade Shapiro-Wilk. Nos dados com comportamento

paramétrico foram aplicados o teste t–student entre dois grupos e o teste ANOVA

(análise de variância) entre três grupos ou mais. Nos dados com comportamento

não-paramétrico foram realizados o teste de Mann Whitney e o teste Kruskal-Wallis

entre dois grupos e entre três ou mais grupos respectivamente. A subsequente

identificação das diferenças entre os grupos se deu pelo teste post-hoc de Duncan.

Utilizou-se para testar os contrastes entre as médias o teste F, pela metodologia do

GLM (General Linear Model).

Utilizou-se o coeficiente de correlação de Pearson (r) como métrica

para compreender o relacionamento entre a variação do peso corporal e a glicemia

média, cujo critério de significância estabelecido foi de 70%. Na análise de

regressão, utilizou-se como indicador o coeficiente de determinação (r2) para

verificação da predição do dado obtido.

A avaliação dos níveis de significância foi feita pelo software SPSS

(Statistical Product and Service Solutions - SPSS Inc., Chicago, Ilinois, EUA). Em

todas as conclusões obtidas foi adotado o nível de significância de 0,05 (α = 5%), e

níveis descritivos (p-valor) inferiores a esse valor foram considerados significantes

(p<0,05).

37

RESULTADOS

1. Avaliação biométrica entre as 30ª e 48ª semanas de vida

1.1. Peso corporal

Observou-se variação de peso ao longo do tempo em todos os grupos.

No período pós-operatório, verificou-se que houve redução do peso corporal médio

no grupo GT, com recuperação a partir da 2ª semana (semana 32), ao passo que a

diminuição do peso médio dos animais do grupo GS deu-se somente na 1ª semana

de pós-operatório (semana 31), com elevação progressiva nas semanas seguintes

(Figura 18). Ao se comparar as médias dos pesos na 48ª semana de vida, não foi

observada diferença entre os grupos GT e GS (Tabela 8). Não se observou perda de

peso no grupo GT. Os animais do grupo GC mantiveram o aumento de peso gradual

até o final do estudo. Manteve-se estável a evolução ponderal dos animais do grupo

GP (Figura 18).

Figura 18 - Evolução do ganho ponderal (g) entre as 30ª e 48ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores são representados pelas médias e erro padrão. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

38

Notou-se que o incremento de peso foi significativamente inferior no

grupo GT entre as 30ª e 48ª semanas de vida, comparado aos dos grupos GS e GC.

(p=0,024) (Tabela 8).

Tabela 8 - Ganho de peso corporal (g) entre as 30ª e 48ª semana de vida.

GP GT GS GC

Média

DP Média

DP Média

DP Média

DP p-valor

Peso 30ª semana

429,50a

44,96

524,62b

57,73 509,00b

39,29 500,47b

41,87 <0,001

Peso 48ª semana

423,19a

70,96 542,21b

101,99 551,07b

103,68 568,72b

58,26 0,002

Ganho de Peso

6,31a

5,10 17,59*a

16,80 42,07b

22,00 68,25b

10,70 0,024

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação ao peso corporal, p > 0,05. Ganho de peso de GT < ganho de peso de GS. (*) – p < 0,05, GT versus GS e GT versus GC.

1.2. Índice de Lee

O índice de Lee, na 48ª semana de vida, foi maior nos animais dos

grupos que receberam dieta experimental, em relação ao GP (p=0,02) (Figura 19).

Não houve diferença significante entre os grupos GC, GS e GT.

39

Figura 19 - Índice de Lee (g/cm) n 48ª semana de vida. Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Os valores estão expressos em mediana ± intervalo interquartil. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

1.3. Adiposidade

Foi notória a diferença de adiposidade na 48ª semana de vida, maior

nos animais dos grupos que receberam dieta experimental, em relação ao GP

(p<0,01) (Figura 20). Não houve diferença estatística na avaliação da adiposidade

entre os grupos GC, GS e GT (Tabela 9). Não houve redução significante da

adiposidade no grupo GT.

Tabela 9 - Adiposidade visceral (%) na 48ª semana de vida.

Tecido Adiposo GP GT GS GC

Média DP Média DP Média DP Média DP p-valor

Peso (g) 12,85a

4,91 36,71b

14,66 43,34b

16,64 42,77b

9,74 < 0,01

% Peso corporal 2,97a

0,90 6,53b

2,02 7,83b

2,20 7,52b

1,37 < 0,01

Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação à adiposidade, p > 0,05.

40

Figura 20 – Quantificação da adiposidade (%) na 48ª semana de vida, em relação ao peso corporal. Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Os valores estão expressos em mediana ± intervalo interquartil. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

2. Consumo de ração entre as 30ª e 48ª semanas de vida

Observou-se variação da ingestão alimentar ao longo do tempo em

todos os grupos, com menor consumo de dieta experimental em relação à ração

padrão e menor aceitação da formulação do tipo DH2 (semana 33, semana 37,

semana 41, semana 45). Verificou-se redução transitória do consumo alimentar nas

primeiras duas semanas de pós-operatório no grupo GT (semana 30, semana 31),

com recuperação a partir daí (Figura 21). Notou-se, no grupo GS, redução do

consumo apenas na primeira semana de pós-operatório (semana 30) (Figura 21). A

análise comparativa das taxas de ingestão alimentar revelou que não houve

41

diferença estatística entre os grupos GT, GS e GC. Não houve redução do consumo

de ração no grupo GT.

Figura 21 – Consumo diário de ração (g) por peso (kg) de rato entre as 30ª a 48ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores são representados pelas médias e erro padrão. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

3. Análises bioquímicas entre as 30ª e 48ª semanas de vida

3.1. Glicemia periférica

Observou-se que os níveis semanais de glicemia intersticial dos grupos

GC, GS e GT mantiveram-se mais elevados do que aqueles apresentados pelo

grupo GP (Figura 22).

43

42

Figura 22 – Evolução das glicemias periféricas semanais (mg/dL) entre as 30ª e 48ª semanas de vida. Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Valores expressos em médias e erro padrão. p>0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

3.2. Insulina

Não se observou diferença nos níveis séricos de insulina dos grupos

GT, GS e GC na análise da 48ª semana de vida (Tabela 10 e Figura 23).

Tabela 10 - Níveis de insulina sérica (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).

Grupo n Média DP p-valor

GP 16 694,10a 479,28

GT 15 1.380,13b 634,48

GS 13 1.397,31b

555,89

GC 16 1.648,78b 723,90 0,016

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação aos níveis séricos de insulina, p > 0,05.

43

Figura 23 - Níveis séricos de insulina (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

3.3. Peptídeo C

Ao se compararem os níveis de peptídeo C dos grupos submetidos aos

ciclos de dieta experimental, observaram-se valores mais elevados no grupo GT em

relação aos demais (Tabela 11 e Figura 24). Não se encontrou diferença estatística

na comparação dos níveis séricos de peptídeo C entre o grupo GT e os grupos GS e

GC na análise da 48ª semana de vida (Tabela 11).

Tabela 11 - Níveis séricos de peptídeo C (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).


GP 16 836,25a

278,17

GT 15 1.566,4b 732,16

GS 13 1.147,31a,b

444,41

GC 16 1.515,11b 568,03 0,004

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação aos níveis séricos de peptídeo C, p > 0,05.

44

Figura 24 - Níveis séricos de peptídeo C (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p > 0,05 - GT versus GS, GT versus GC, GS versus GC.

3.4. Glucagon

Na 48ª semana de vida, notaram-se maiores níveis de glucagon no

grupo GT, quando comparado com os grupos GS e GC, atingindo valores

semelhantes do grupo GP (Tabela 12 e Figura 25).

Tabela 12 - Níveis séricos de glucagon (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).

Grupo N Média DP p-valor

GP 16 62,34a 13,49

GT 15 60,12*a 7,10

GS 13 52,43b 7,13

GC 16 42,99b 16,15 0,046

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Glucagonemia de GT > glucagonemia de GS. (*) – p<0,05, GT versus GS e GT versus GC.

45

Figura 25 - Níveis séricos de glucagon (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p < 0,05 (*) - GT versus GS, GT versus GC. p > 0,05 - GS versus GC.

3.5. GLP-1

Constatou-se diferença das concentrações séricas de GLP-1 dos

animais do grupo GT, mais elevada em relação aos grupos GP, GS e GC, na 48ª

semana de vida (Tabela 13 e Figura 26). Observou-se que, na 48ª semana de vida,

não houve diferença entre os grupos GS e GC (Tabela 13).

Tabela 13 - Níveis séricos de GLP-1 (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).


GP 16 82,43a

24,12

GT 15 133,21*b

21,27

GS 13 57,33c

18,07

GC 16 42,18c

23,13 0,002

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b,c) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Níveis séricos de GLP-1 de GT > níveis sérios de GLP-1 de GS e de GC. (*) – p<0,05, GT versus GS e GT versus GC.

*

46

Figura 26 - Níveis séricos de GLP-1 (pg/mL) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório). Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores expressos em médias e erro padrão. p<0,05 (*) - GT versus GS, GT versus GC.

4. Testes metabólicos entre as 30ª e 48ª semanas de vida

4.1. Teste de tolerância oral à glicose - TTOG

Não se verificou melhora da tolerância à glicose na 40ª semana de

vida. Não se encontrou diferença na comparação entre as áreas dos gráficos das

curvas glicêmicas dos grupos GT, GS e GC (Tabela 14 e Figura 27).

Tabela 14 – Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) na 40ª semana de vida (10ª semana de pós-operatório).

Instantes de medição

GP GT GS GC


0 minuto 112,06

8,82 124,53 12,46 122,46 17,10 121 16,92 0,088

15 minutos 119,44a

22,37 152,87b

21,34 157,15b 17,58 155,58

b 31,20 0,001

30 minutos 120,56a

16,26 154,07b

20,68 146,08b 11,27 149,74

b 34,93 0,026

60 minutos 124,94a

18,43 147,87a

20,31 146,54a,b

19,86 150,63b 32,38 0,011

90 minutos 122,25a

13,39 147,87b

20,98 151,85b 18,20 153,05

b 32,81 0,018

120 minutos 128,94a

14,02 138,93a,b

18,05 148,62a,b

23,62 150,58b 26,74 0,020

180 minutos 101,13a

12,33 129b

19,03 137b

23,87

125,05b

13,48 0,001

Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa, p < 0,05.

*

47

Figura 27 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose na 40ª semana de vida. Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15) e Grupo Sham (GS/n=13). Valores expressos pelas médias. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos, p > 0,05.

Na 48ª semana de vida, a área do gráfico da curva glicêmica do grupo

GT foi menor que as dos grupos GS e GC (Tabela 15 e Figura 28). Evidenciou-se

melhora da tolerância à glicose na 48ª semana de vida no grupo GT.

Tabela 15 – Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).

Instantes de medição

GP GT GS GC


0 minuto 112,44a 8,82 117,8

a,b 9,84 125,69

b 14,34 122,72

a,b 12,80 0,017

15 minutos 122,88a 22,37 148,6

b 25,60 164

b 23,99 158,17

b 26,59 0,027

30 minutos 116,56a 16,26 146

b 25,43 158,92

b 23,00 160,56

b 32,28 0,010

60 minutos 130,94a 18,43 146,27

a,b 22,19 163,38

b 17,22 159,89

b 34,14 0,006

90 minutos 131,13a 13,39 149,8

a,b 25,73 165,15

b 17,54 164,89

b 27,65 0,001

120 minutos 125,38a 14,02 148,2

b 27,31 156,85

b 16,68 149,78

b 26,02 0,028

180 minutos 106,56a

12,33 124,93b

13,22 133,77b 20,34 130,67

b 15,79 0,009

Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa, p < 0,05.

48

Figura 28 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose na 48ª semana de vida. Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15) e Grupo Sham (GS/n=13). Valores expressos pelas médias. (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

4.2. Teste intraperitoneal de resistência insulínica - IpITT

Ao se avaliar a resistência à insulina pela constante de decaimento da

glicose (KITT) nas 38ª e 46ª semanas de vida, em porcentagem por minuto, verificou-

se maior queda no grupo GT, em comparação aos grupos GS e GC, com diferença

estatística (Tabela 16).

Tabela 16 – Teste intraperitoneal de resistência insulínica (IpITT) nas 38ª e 46ª semanas de vida (8ª e 16ª semanas de pós-operatório).

GP GT GS GC


38a semana 1,86

a 0,29 1,76*

a 0,14 1,32

b 0,136 1,26

b 0,31 0,044

46a semana 2,82

a 0,21 3,58*

a 0,57 2,50

b 0,09 2,22

b 0,23 0,036

Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores representam a média e desvio padrão (DP) da KITT - constante de decaimento da glicose, em %/minuto. Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. KITT de GT > KITT de GS. (*) – p < 0,05, GT versus GS e GT versus GC.

4.3. HOMA-IR

Não se verificou diferença estatística no HOMA-IR calculado na 48ª

semana de vida na comparação entre os grupos GT, GS e GC (Tabela 17).

*

49

Tabela 17 – HOMA-IR na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).

GP GT GS GC p-valor

2,77a (2,21-9,13)

6,88

b (1,78-7,72)

7,37

b (1,81-5,71) 7,76

b (1,97-8,91)

0,009

Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores representam a mediana e o intervalo mínimo-máximo. Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação ao HOMA-IR, p > 0,05.

5. Estrutura do Pâncreas na 48ª semana de vida

Comparando-se o número e a área das ilhotas de Langerhans nos

tecidos pancreáticos examinados, bem como os números de células beta e de

células não-marcadas e as densidades, não foi observada diferença significativa

entre os grupos (Tabela 18).

Tabela 18: Morfologia do pâncreas na 48ª semana de vida (18ª semana de pós-operatório).

GP GT GS GC


Número de Ilhotas 29,25 8,87 38,93 17,13 39,69 24,68 33,22 15,23 0,28

Área das Ilhotas 252,16 88,45 348,83 112,45 258,75 126,36 273,92 100,88 0,76

Células Beta 2262,5 844,34 3053,36 1633,17 3856,18 2094,87 3215,09 1987,71 0,38

Células Não-Beta 1301,75 659,40 2193,09 1551,86 2064,27 1933,30 1577,91 1620,05 0,49

Densidade Beta 10,40 2,87 13,34 8,12 17,25 13,03 16,47 8,60 0,25

Densidade Células 16,11 4,46 19,43 12,97 29,51 22,91 24,32 13,04 0,37

Grupo Ração Padrão (GP/n=16), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT/n=15), Grupo Sham (GS/n=13), Grupo Controle (GC/n=16). Valores representam a média e desvio padrão (DP). Área expressa em µm

2. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos, p > 0,05.

50

DISCUSSÃO

Os tratamentos disponíveis para se fazer frente ao DM2 são em

grande parte inadequados em relação à sua eficácia, no que concerne à capacidade

de enfrentar fatores importantes de sua patogênese172, quais sejam o déficit de

insulina e a resistência insulínica. Dentre os novéis procedimentos cirúrgicos que

têm sido desenvolvidos para tratar o DM2 em indivíduos com sobrepeso e

obesidade em grau leve, merece destaque a III. Os principais efeitos no controle da

glicemia, num aspecto funcional, após essa intervenção operatória, parecem estar

relacionados à chegada mais precoce de nutrientes ainda não digeridos no íleo

terminal, sem afetar o trânsito gastrointestinal24,64,67,70-

72,77,93,108,113,114,117,177,178,223,225,227,229,248-251, com consequente modificação do eixo

êntero-insular100,102 e com repercussão em seus tecidos-alvo, não incorrendo em

perda de peso177,185. Acredita-se que a III pode otimizar o metabolismo da glicose,

conduzindo a uma melhora do DM265,67,93,102,176, podendo vir a representar uma nova

medida terapêutica para essa afecção, em indivíduos selecionados.

Admite-se que o desenvolvimento de modelos experimentais para

estudo de diversas doenças humanas é essencial para o progresso das ciências

biológicas. Em laboratórios, roedores são utilizados com frequência, por serem

animais de pequeno porte facilmente manipuláveis, com características biológicas,

ciclos vital e reprodutivo bem conhecidos222, o que permite numerosas análises,

inclusive post-mortem, com relevância no âmbito da medicina translacional.

Enquanto as atenções estão voltadas para as alterações provocadas por variadas

modalidades terapêuticas, tanto para a obesidade quanto para o DM2 – sejam

medicamentosas ou cirúrgicas –, percebe-se a ausência de um modelo experimental

animal ideal para ser utilizado em pesquisas correlatas, o qual considere as

modificações metabólicas envolvidas na prática, traduzindo efetivamente a realidade

humana.

No presente, há alguns modelos animais utilizados para o estudo de

obesidade, síndrome metabólica e RI, os quais podem ser classificados em29:

a) genéticos: animais com mutação gênica, animais transgênicos ou

aqueles em que se produziu knock-out de um ou mais genes;

51

b) químicos: aqueles nos quais o diabetes mellitus é induzido através

da ministração de drogas que promovem lesão pancreática ou hipotalâmica;

c) cirúrgicos: aqueles nos quais a hiperglicemia é subsequente ao

procedimento de pancreatectomia parcial;

d) exógenos: aqueles nos quais a resistência à insulina é induzida

através de mudanças nos padrões dietéticos, oferecendo-se um maior aporte

energético, por uma sobrecarga de carboidratos ou de gordura, isoladamente ou em

associação.

Dentre esses, os que se utilizam de dietas padronizadas hipercalóricas

para desenvolver a obesidade são os que melhor simulam o aparecimento do DM2

como de fato ocorre em grande parte da população em geral26,29-32. Em animais de

experimentação, obtém-se incremento de peso variável e maior adiposidade com

mudanças metabólicas e endócrinas variadas, do mesmo modo como ocorre em

seres humanos266-271, especialmente no que concerne às resistência insulínica,

hiperglicemia e hiperinsulinemia33,34,272-276. Ademais, a manutenção dessas dietas

por um período estendido faz que os animais, além da obesidade, desenvolvam

comorbidezes em longo prazo272-281.

O método mais eficaz para se induzir obesidade em modelos

experimentais exógenos é aumentando-se a quantidade relativa de gorduras na

dieta oferecida272,282,283. A gordura é palatável e caloricamente densa, o que facilita a

hiperfagia e o consumo crônico em altas quantidades, visto que induz menos

saciedade comparada a carboidratos e proteínas266,284,285. Além disso, a

metabolização da gordura se volta mais para o armazenamento do que para a

oxidação267. A maioria dos roedores torna-se obesa com dietas hiperlipídicas,

apresentando respostas variáveis em relação à tolerância à glicose e à RI, dentre

outros parâmetros228,261,272,286,287. Obtém-se também animais obesos mediante

consumo de dietas ricas em carboidratos273,288, “dietas de cafeteria”274,289 e de dietas

ricas em frutose29.

Verifica-se na literatura biomédica grande diversidade de composições

dietéticas290. A “dieta padrão” para ratos apresenta de 7 a 10% de gorduras, sendo

que alguns autores utilizam formulações hipercalóricas com proporções de 14 a

60%283. A dieta com um teor médio de 22% de gorduras aproxima-se do observado

52

na “dieta ocidentalizada”, “junk food” ou “dieta de cafeteria” dos humanos31-35,291.

Nesse modelo, acrescentam-se à ração padrão produtos altamente energéticos

consumidos habitualmente pela população em geral, como bacon, castanhas,

amendoim torrado, chocolate, leite condensado, refrigerantes, bolacha de maisena,

bolo de chocolate, dentre outros26,29-32. As “dietas de cafeteria” podem se apresentar

de diversas formas e são – diga-se – saborosas. Entretanto, apresentam algumas

limitações: há dificuldade em se determinar o consumo específico de cada um dos

seus componentes dietéticos e podem ser servidas em estado deteriorado261, vez

que são oferecidas in natura.

No presente estudo, fez-se necessária a utilização de um modelo

controlado de dieta experimental hipercalórica-hiperlipídica261. Esse modelo de

obesidade induzida por dieta, com consequentes alterações na homeostase

glicêmica, permite uma avaliação de modo mais apropriado e aceitável. Há algumas

vantagens sobre a “dieta de cafeteria”, tais como o fato de ser pelletizada (menos

perecível e com maior integridade), de se ter o conhecimento de seus componentes

alimentares e do consumo energético, e principalmente de se sopesar aspectos

fisiopatológicos fundamentais. Evidentemente que, para a devida análise das

repercussões da III, nomeadamente em relação ao DM2, há que se utilizar modelos

animais que melhor traduzam o que ocorre com humanos37,70,71,220,291. Isso se fez

nesta pesquisa, de modo inédito na Literatura, envolvendo animais sem modificação

genética, nem lesão neurológica ou pancreática induzidas quimicamente, com

dismetabolismo glicídico comprovado por testes e análises laboratoriais antes de se

efetuar a intervenção cirúrgica. As experiências relatadas envolvem animais

hipoinsulinêmicos67,77,96,166,178,227,229-239,242, alguns com peso normal e não

diabéticos166,225,226,243,244,246, não reproduzindo com fidelidade as características da

maioria da população diabética, ao passo que outras procedem a III após consumo

de dietas hipercalóricas mas sem se ter previamente avaliado se havia de fato

RI93,109,228,240,241,245. Ante a preocupação atual da medicina em buscar novas terapias

para o DM2, parece oportuno se estabelecerem parâmetros eficazes e eficientes de

mimetização fenotípica dessa doença em animais de experimentação, a fim de que

as inovações terapêuticas – clínicas ou cirúrgicas – possam ser testadas e,

posteriormente aplicadas, com segurança.

53

Ensaios clínicos com interposição ileal, em associação à gastrectomia

vertical, realizados em humanos diabéticos com IMC abaixo de 35 Kg/m2,

demonstraram modestas diminuição de peso e de ingestão alimentar, com

satisfatório controle de comorbidezes, incluindo o DM2, e com poucas complicações

precoces182,184-189,192-197,216. A despeito de ser controvertida a realização da

gastrectomia vertical em indivíduos diabéticos não-obesos, por implicar em perda de

peso substancial, questiona-se se os benefícios metabólicos de grande valia obtidos

se devem mais provavelmente à interposição ileal, e não à abordagem gástrica

acoplada. Ressalte-se que não há nenhuma pesquisa clínica conduzida, no âmbito

da cirurgia bariátrica e metabólica, envolvendo a prática da interposição ileal de

forma isolada (III).

As complicações decorrentes da interposição ileal em seres humanos

não podem ser diretamente avaliadas, haja vista que esta intervenção nunca foi

realizada isoladamente in anima nobile. Pode-se, neste sentido, escrutinar os relatos

cirúrgicos perioperatórios ocorridos exclusivamente no decurso de sua realização no

contexto de procedimento combinado, na qual associou-se à gastrectomia vertical a

interposição ileal, assim como identificar, no período pós-operatório, sinais e

sintomas que possam ser atribuídos em especial à interposição ileal de per se. Em

algumas séries cirúrgicas, nenhuma complicação ocorreu189,191,192,197. Noutras, os

efeitos adversos foram de pequena monta, tais como diarreia transitória196 e íleo

paralítico prolongado189, anorexia, náuseas e dor abdominal no pós-operatório

precoce201. Considerando-se globalmente a casuística dos autores que associam a

interposição ileal à gastrectomia vertical184-193,196,197,201, apenas um óbito foi

relatado193, tendo sido devido à deiscência da sutura intestinal que se seguiu à

remoção de divertículo de Meckel. A maioria das complicações cirúrgicas citadas

pelos autores184-189,193,196,197 são próprias de procedimentos abdominais

videolaparoscópicos em geral, não tendo havido relato de hipoglicemia, volvo nem

isquemia intestinais. Destarte, não é legítimo supor que os indivíduos diabéticos

não-obesos que venham a ser submetidos a III tenham a sua qualidade de vida

comprometida pela ocorrência de efeitos adversos graves e maiores complicações;

pelo contrário, talvez a III possa ser benéfica para essa população177.

54

Dentro deste contexto, a fim de verificar se as modificações

bioquímicas no que concerne à tolerância à glicose e à RI, bem como as possíveis

alterações histológicas no pâncreas, podem ser exclusivamente decorrentes do

papel do íleo terminal transposto, procedeu-se, pela primeira vez na Medicina, à III

em modelo experimental sem a interferência de fatores genéticos, fármaco-induzidos

nem operatórios combinados, em ratos Wistar com dismetabolismo glicídico

comprovado.

O número diferente de animais em cada um dos dois grupos na

primeira etapa da pesquisa (GP=16 e DE=56) deveu-se ao planejamento de

subsequente distribuição randomizada dos animais que receberam dieta especial.

Na segunda etapa, foram alocados em outros três grupos (GT=20, GS=20 e

GC=16), considerando-se ainda a possibilidade de perdas, seja no período

perioperatório, seja após a realização de procedimentos intervencionistas.

O ciclo de dietas hipercalóricas-hiperlipídicas utilizado neste estudo foi

eficiente em promover o desenvolvimento de obesidade e alterações no

metabolismo da glicose em ratos Wistar. Houve incremento tanto no peso corporal

quanto na adiposidade visceral, que se associaram a hiperglicemia, intolerância a

glicose e resistência periférica à insulina.

Admite-se que o consumo das formulações experimentais promoveu o

desenvolvimento de obesidade no grupo DE, pelo incremento do peso corporal total

da ordem de 19,2% em relação ao do grupo GP, ao final das primeiras 18 semanas

de estudo. Não há critérios bem estabelecidos e uniformes para a determinação de

obesidade em ratos; sugeriu-se um valor mínimo de peso de 15% acima do controle

e até mesmo, além do aspecto ponderal, quando alterações metabólicas - como a RI

- são verificadas269-272,283,287,292. Os resultados, no que concerne ao ganho de peso

corporal, encontram-se em consonância com alguns estudos que utilizaram “dieta de

cafeteria”274,289 ou dietas hipercalóricas272,261,282,293. O tempo necessário para o

desenvolvimento de obesidade foi similar ao de outros modelos análogos32,261,282,289.

Tem-se que o aumento do peso dos animais foi consequente à

mudança da composição corporal, no que tange à maior adiposidade. Sabe-se que

animais submetidos à dieta hiperlipídica apresentam aumento do ganho de peso e

maciço acúmulo de gordura272,294, que influencia diretamente na RI176,278. Ainda, um

55

sinalizador importante para a presença de RI é o padrão central de distribuição da

gordura corporal acarretada pela dieta31,32. O índice de Lee maior no grupo DE, na

30ª semana de vida, além de mensurar a obesidade, sinaliza, indiretamente, as

alterações no metabolismo glicídico, identificando o fenótipo “diabetogênico” desse

grupo, como em estudos clínicos295; trata-se de parâmetro nutritivo correlacionado

com a massa gorda em ratos, como equivalente ao IMC, e considerado acurado e

sensível para evidenciar a presença de gordura visceral, merecendo destaque262.

No que diz respeito ao consumo alimentar, no presente estudo,

verificou-se que houve menor ingestão de dieta experimental em relação à dieta

padrão. Um dos objetivos do ciclo de formulações foi aumentar os níveis de ingestão

pela modificação do paladar, estimulando a alimentação. Contudo, os resultados se

deram diferentemente de estudos prévios, uma vez que se postulou que dietas

hiperlipídicas promovem menos saciedade e consequentemente resultam em

maiores níveis de consumo273,296,297. Constatou-se que, nas ocasiões do

oferecimento do tipo DH2 para os animais do grupo DE, o consumo semanal foi

inferior em relação ao consumo das demais formulações, ao que se atribui ser

decorrente dos efeitos de seus próprios ingredientes e maior oleosidade. Pôde-se

demonstrar que a obesidade induzida pela dieta experimental foi derivada da maior

eficiência alimentar, com necessidade de um menor consumo de ração especial

para que houvesse o incremento de um grama de peso corporal, em relação à dieta

padrão. Notou-se a maior capacidade de conversão da ração especial consumida

em massa corporal, haja vista a taxa de conversão alimentar significativamente

menor no grupo DE, que apresentou maior ganho ponderal, com maior acúmulo de

gordura corporal, face a menor quantidade de energia ingerida.

O ciclo alternado dos 04 tipos de dieta experimental foi decisivo para a

instituição de um estado disglicêmico, em 18 semanas, pelo aumento progressivo da

massa adiposa associada à disfunção metabólica e resistência à insulina. Pode-se

afirmar, pela correlação revelada, que 59% da variação da massa corporal foi

explicada pelas maiores concentrações médias de glicose observadas no grupo DE,

que apresentou níveis de hemoglobina glicada mais elevados. Sabe-se que a

qualidade da dieta tem importante influência no desenvolvimento da RI, podendo-se

até desenvolver o DM2 em ratos Wistar37,261.

56

Demonstrou-se, mediante as análises bioquímicas realizadas na

primeira fase da presente pesquisa, entre as 12ª e 30ª semanas de vida, que o

grupo DE apresentou uma menor captação de glicose pelos tecidos, ao se verificar

os maiores níveis de glicose durante todas as medições realizadas no decorrer do

TTOG, e nomeadamente aos 120 minutos, em comparação ao grupo GP, o que foi

condizente com a análise das áreas dos gráficos das curvas glicêmicas. Apesar de

não se ter verificado diferença entre os níveis de insulina sérica dos grupos GP e

DE, designadamente hiperinsulinemia no grupo DE, como era de se esperar272,261,

observaram-se valor maior no teste HOMA-IR e valor menor no IpITT do grupo DE,

além de maiores níveis de peptídeo C no grupo GP. Tem-se, ante a habilidade

marcadamente reduzida de a insulina endógena induzir a captação de glicose nos

tecidos periféricos, que houve comprometimento significante da sensibilidade dos

tecidos-alvo à insulina, o que traduz uma fase de desordem metabólica cursando

com hiperglicemia e elevados níveis de glicemia pós-prandial, sem a ocorrência de

hiperinsulinemia compensatória. Outrossim, estes resultados sugerem que também

houve comprometimento da secreção de insulina por declínio progressivo da

funcionalidade das células beta, o qual pode ser atribuído tanto à própria

glicotoxicidade quanto à lipotoxicidade induzida por ácidos graxos livres e por alguns

isozimas da proteína-quinase C32,38,172,229,298-300.

Cabe registrar que a dose de insulina utilizada no IpITT nos grupos GP

e DE (i.e., 0,5UI/kg)272 foi superior à empregada em outros estudos93,178, em que

também houve diferenciação entre as doses usadas no grupo controle (0,25UI/kg) e

nos grupos de ratos diabéticos(0,5UI/kg)178.

É de se salientar que, no grupo DE, ainda que com níveis de insulina

semelhantes aos do grupo GP, houve desenvolvimento exagerado de adiposidade,

com maior lipogênese, que pode ser possível por alterações de sinalização da

insulina no hipotálamo, no tecido músculo-esquelético e no fígado, predispondo a

resistência insulínica31,172,301. O excesso de tecido adiposo libera uma grande

quantidade de ácidos graxos livres, os quais afetam diretamente a sinalização da

insulina, diminuem a captação muscular da glicose, aumentam exageradamente a

síntese de triglicérides e induzem gliconeogênese no fígado302,303, influenciando

ainda mais no desenvolvimento de RI176.

57

A menor secreção de glucagon no grupo DE, ao término da primeira

fase desta pesquisa, deu-se diante da hiperglicemia sustentada que se verificou

durante este período, a qual reduz a secreção de glucagon, seja por efeito direto

sobre as células alfa, seja por mediação via liberação de insulina, que é

reconhecidamente um potente inibidor da secreção do glucagon38,304-307. Como os

grupos GP e DE apresentaram níveis semelhantes de insulina sérica, a regulação da

secreção do glucagon é explicada pelos efeitos da despolarização das células alfa

pela ação da glicose sobre os canais de potássio ATP-dependentes, tendo-se o

fechamento de tais canais, com a elevação do potencial de membrana, diminuindo o

influxo de cálcio e, consequentemente, reduzindo a secreção do hormônio38,304-307.

É sabido que o efeito incretínico, de um modo geral, está severamente

reduzido na população portadora de DM2, em comparação com indivíduos

normais77, o que também se pôde constatar nesta pesquisa, ante as menores

concentrações de GLP-1 no grupo DE, após 16 semanas de consumo das dietas

experimentais. No início do estudo, verificou-se semelhança entre os grupos GP e

DE.

Especula-se que, com a continuidade de ministração das formulações

dietéticas por um período maior, seria possível desenvolver DM2 nesses animais,

associado com aumento de outras comorbidezes37,261,272-281. A dieta experimental foi

mantida na alimentação de todos os animais, inclusive no período pós-operatório.

Não houve modificação do conteúdo das rações com o fito de se excluírem da

interpretação dos resultados da III os efeitos da alteração da dieta, optando-se pela

manutenção das mesmas condições pré-operatórias no sentido de avaliar as reais

alterações orgânicas induzidas pela intervenção cirúrgica em análise. Caso

houvesse modificação da dieta oferecida, em termos nutricionais, no pós-operatório,

como se fosse, paralelamente, uma mudança de estilo de vida em humanos, outros

resultados sobre o metabolismo dos carboidratos poderiam ser encontrados.

Insta aduzir que estudos experimentais envolvendo animais adultos

das linhagens Long-Evans93,228,240 e Sprague-Dawley241, em que foram utilizadas

dietas hipercalóricas com teor de gordura de 28%, 38% e 41%, por um período de

06 a 08 semanas antes de serem submetidos a III, não demonstraram a ocorrência

de obesidade nem aumento da adiposidade corporal, nem mesmo avaliaram

58

múltiplas alterações no metabolismo de carboidratos para se retratar o DM2;

somente um, no pré-operatório, analisou apenas a ocorrência de intolerância oral a

glicose228. Ademais, noutro se procedeu à cirurgia dispondo-se de um segmento de

íleo transposto de 20 cm241, o que distingue tal procedimento da presente pesquisa e

das demais em que se considerou a técnica de isolamento de 10 cm de intestino

descrita por Koopmans223-225, e macula maiores comparações pós-operatórias. É de

se destacar que, na presente pesquisa, avaliaram-se diversos parâmetros, tanto no

período pré-operatório quanto no pós-operatório, numa condição de disglicemia

induzida comprovada antes de se realizar a III, a fim de se tentar desvendar os

mecanismos de melhora do metabolismo glicêmico.

Na segunda fase deste estudo, isto é, após os procedimentos

operatórios, a III não promoveu redução de peso corporal nos ratos obesos.

Entretanto, a evolução ponderal foi distinta entre os grupos GT e GS. Como era de

se esperar, no período pós-operatório precoce, houve diminuição de peso nas

primeiras duas semanas subsequentes à cirurgia em ambos os grupos, com

recuperação e aumento ponderal progressivo após esse período. Atribuem-se a

essa redução de peso o trauma cirúrgico e a diminuição do consumo alimentar, que

se deram de maneiras similares, mas não idênticas. Apesar de, ao término da

pesquisa, não ter sido constatada diferença entre as médias de peso de ambos os

grupos, verificou-se que o incremento de peso foi significativamente inferior no grupo

GT, com menor variação em percentual entre as 30ª e 48ª semanas de vida,

comparada às dos grupos GS e GC. A III atenuou o ganho de peso usualmente

associado ao consumo de dietas hiperlipídicas, como já demonstrado109, o que pode

decorrer de aumento do gasto ou de redução do acúmulo de energia247.

Ao se comparar o ganho de peso entre os grupos interposição e sham,

com animais de outras linhagens submetidos a regimes de dietas hipercalóricas

distintos, com maiores teores de gordura e por menores períodos de tempo,

verificaram-se resultados semelhantes. Observou-se redução ponderal até o 11º dia

de pós-operatório, sendo que, após este período, houve incremento de peso

gradual, porém com ganho menor no grupo interposição ileal até a 6ª semana de

pós-operatório93. Há relatos de redução ponderal de forma similar até a 2ª semana

de pós-operatório, não se encontrando diferença na análise comparativa dos grupos

59

ao término dos estudos nas 6ª e 10ª semanas de pós-operatório228,240. Note-se que a

transposição de um segmento mais longo de íleo teve impacto significante na

redução do ganho de peso por três semanas no grupo submetido a III, até a 8ª

semana de pós-operatório241. Os resultados obtidos na presente pesquisa, na 18ª

semana de pós-operatório, estão em conformidade com tais averiguações.

O índice de Lee, aferido ocasião da eutanásia, foi parâmetro sensível

para evidenciar a presença de gordura visceral, mas não específico para o tipo de

tratamento. Os depósitos de gordura, quantificados objetivamente na ocasião da

eutanásia, revelaram a ocorrência de maior adiposidade nos animais submetidos

aos ciclos de dieta experimental. Esses achados se assemelham aos de estudos

prévios que demonstram um maior acúmulo de gordura quanto mais energia é

proveniente de lípides da dieta do que de carboidratos ou proteínas267,272,287. Não se

encontrou diferença significante na análise comparativa do grupo GT com os demais

grupos submetidos ao mesmo regime de dietas. É de se ressaltar, ainda, que a

avaliação das evidentes gorduras periepididimal e retroperitoneal não demonstrou

menor percentual em relação ao peso corporal no caso do grupo GT, comparado

aos grupos GS e GC. Diferentemente do averiguado em modelos experimentais

análogos93,228,240, a III não promoveu mudança na composição corporal, não

afetando a deposição de gordura, nem reduzindo a adiposidade nos animais do

grupo GT, nesta pesquisa.

Quanto à ingestão alimentar, verificou-se redução transitória inicial nas

primeiras duas semanas de pós-operatório no grupo GT, que gradualmente passou

a se aproximar dos valores observados no grupo GS. A resposta bifásica após a III,

como já relatada em outros estudos228,241, pode ser devida ao aumento na liberação

de hormônios anorexígenos pelo íleo terminal89-91,96,242, numa fase precoce. Diversos

trabalhos realizados com ratos submetidos a interposição ileal demonstraram o

aumento de tais hormônios93,166,226,228,241,242, que reduzem de princípio o consumo de

alimentos, o que acredita-se ser compensado posteriormente por outros fatores247.

Verificou-se, ao se avaliar as taxas de consumo alimentar entre as 30ª

e 48ª semanas de vida, que não houve diferença entre os grupos GT, GS e GC.

Também não houve diferença entre os grupos interposição ileal e sham quanto ao

consumo alimentar no pós-operatório em modelos semelhantes228,240, apesar de

60

relato da ocorrência de diminuição significativa do consumo de ração cumulativo

após a III, tanto com 10 cm de extensão de íleo transposto93, quanto com 20 cm241.

Vale salientar que, no presente estudo, verificou-se, após a III, menor ganho

ponderal no grupo GT, em que pese ter consumido volume de ração semelhante aos

demais, possivelmente devido a adaptações metabólicas93,108,185-188,226,228,241. Assim,

essa diferença entre os grupos não pode ser atribuída ao consumo das dietas

depois da III, o qual não foi distinto.

As análises bioquímicas realizadas no período pós-operatório

demonstraram, na 48ª semana de vida, uma melhora do metabolismo glicídico do

grupo GT em relação ao do grupo GS. As medições realizadas no decorrer dos

TTOG traduzem otimização do processo de captação de glicose nos tecidos

periféricos. Aos 120 minutos, na 40ª semana de vida, bem como aos 60 minutos, na

48ª semana, observaram-se níveis semelhantes nos grupos GT e GP. Admite-se

que a melhora na tolerância à glicose deu-se de modo mais lento em relação ao

descrito na literatura médica, uma vez que houve redução significativa da área do

gráfico da curva glicêmica do TTOG apenas na 48ª semana de vida, que

corresponde à 18ª semana de pós-operatório. Já se demonstrou esse efeito a partir

da 6ª e da 10ª228,240 semana, mas não antes da 3ª semana de pós-operatório93. Não

obstante, quando expostos a doses de glicose por via oral, os animais do GT

demonstraram otimização de sua regulação.

Não houve diferença nos níveis séricos médios de insulina entre os

grupos GT, GS e GC, na 48ª semanas de vida, não se tendo também observado

diferença na comparação entre os grupos no que tange ao HOMA-IR. Entretanto,

houve diferença nos testes de IpITT realizados no pós-operatório. Constatou-se, no

grupo GT, queda da glicose de forma mais intensa, a qual pode ser explicada pelo

maior estímulo à captação de glicose pelos tecidos insulino-sensíveis, que traduz

redução da resistência à insulina nesses animais.

A insulina de jejum, apesar de avaliar as sensibilidades hepática e

tecidual à insulina no organismo como um todo, apresenta correlações fracas com a

ação insulínica in vivo. A insulinemia não reflete a atividade da insulina em tecidos

independentes da insulina e pode haver reação cruzada com pró-insulina,

distorcendo os valores obtidos309. As diferenças percebidas nos outros métodos de

61

avaliação da resistência insulínica podem decorrer de o IpITT avaliar a sensibilidade

à insulina de forma direta in vivo, refletindo a captação de glicose pelos tecidos

induzida pela insulina, bem como a inibição da liberação de glicose pelo fígado309,

ao passo que o HOMA-IR é modelo matemático que se propõe a predizer, em

condições estáticas, a sensibilidade à insulina para o corpo-total, assumindo que a

resistência insulínica seria a mesma no fígado e nos tecidos periféricos, com

parâmetros exclusivos obtidos no jejum, quando estão captando glicose

principalmente os tecidos independentes da ação da insulina309,310.

Já se revelou a ocorrência de concentrações plasmáticas de insulina

semelhantes após a III, em comparação ao grupo sham, apesar da maior

sensibilidade à insulina verificada no grupo interposição, e em contraste à

manutenção da intolerância à glicose93, assim como, paradoxalmente, há relato da

diminuição dos níveis de insulina plasmática após a III241. Na presente pesquisa,

pode-se atribuir que, no grupo GT, houve melhora da eficiência da insulina nos

tecidos periféricos. Tem-se que, após a III, o grupo GT apresentou níveis mais

baixos de glicemia e maior indução da captação de glicose, com níveis de insulina

não elevados e com aumento no IpTT. Estes fatos indicam que houve aumento da

sensibilidade no grupo GT, e não nos demais grupos, possivelmente como efeito

mais tardio resultante do procedimento operatório, como corroborado em outros

estudos77,93,102,178, o qual pode estar associado à alteração na sinalização da

insulina.

O achado de níveis séricos elevados de peptídeo C no grupo GT,

quando comparados aos dos grupos GC e GS, sugere um possível aumento na

secreção precoce de insulina no grupo GT. O comportamento aleatório da amostra,

ante a grande variância verificada, implicou na ausência de diferença estatística na

análise entre os grupos, em que pesem os maiores valores registrados no grupo GT.

A proinsulina, quando liberada pelo pâncreas na circulação em resposta ao aumento

sérico de glicose, é clivada em insulina e peptídeo-C (peptídeo de conexão), em

quantidades equimolares90,91. Ademais, o peptídeo C possui meia-vida maior que a

da insulina e não sofre metabolização hepática, ao passo que, antes de atingir a

circulação sistêmica, a insulina se liga a seus receptores ou é degradada por

insulinases específicas no fígado, reduzindo-se em cerca de 50% o total secretado

62

na primeira passagem38,304-307. Postulou-se que, apesar de as concentrações de

insulina plasmática não serem diferentes entre os grupos interposição ileal e sham,

parece que o pico da secreção se insulina se dá mais precocemente após a III,

conforme a secreção de GLP-1 verificada imediatamente após o estímulo glicídico93.

Nesse sentido, um possível aumento da secreção de insulina, constatado pelo

aumento de peptídeo C, pode traduzir uma melhora metabólica, com recuperação

funcional das células beta. Mas não há como se afirmar categoricamente que isso se

deu na presente pesquisa. Outras pesquisas voltadas especificamente para melhor

avaliar o comportamento do peptídeo C após a III seriam interessantes, envolvendo

uma amostra maior e modelo experimental semelhante.

Não se constatou queda dos níveis de glugagon, que seria em

princípio esperada em decorrência do possível aumento da secreção de insulina,

secundariamente à interposição ileal, como relatado na literatura89,90,96,100,102,176; ao

invés, encontraram-se níveis séricos mais elevados de glucagon no grupo GT.

Pesquisa envolvendo animais Sprague-Dawley não-obesos e não-diabéticos

também demonstrou claramente a hiperglucagonemia após a III244. Sabe-se que as

maiores captação e utilização da glicose promovem o aumento da secreção de

glucagon, assim como a diminuição do efeito tônico inibitório que a insulina lhe

exerce38,304-307, o que pode justificar este achado247, na 48ª semana de vida

Consistente com relatos anteriores, observamos aumento na secreção

de GLP-1 em resposta à exposição intraluminal intestinal de glicose após a

III77,93,166,178,228,229,240-245. É possível que níveis mais modestos de GLP-1 tenham sido

verificados em decorrência de efeito secundário à elevação do glucagon, que

suprime a secreção de GLP-1172.

Há estudos que demostram efeitos tróficos da III na estrutura

pancreática em modelos experimentais diabéticos distintos77,96,100,259, bem como a

ausência de repercussões arquiteturais em animais não-diabéticos e não-obesos253.

Observou-se que a III reduziu a apoptose de células beta pancreáticas após III77,100,

aumentou a massa259, preservou a arquitetura96 e induziu remodelamento das

ilhotas de Langerhans77, bem como promoveu maior expressão de receptores de

GLP-1100 e de proteínas257, tudo podendo ser atribuído a mecanismos de melhora da

funcionalidade das células beta. Contudo, tais resultados possuem limitações que

63

devem ser consideradas na prática clínica. Tornou-se imprescindível que se

utilizasse modelo mais realístico, com o objetivo de se reproduzirem adequadamente

as modificações observadas em roedores para a população humana254. É de se

destacar que, nesta pesquisa, mostrou-se, pela primeira vez, a avaliação

morfológica do pâncreas após a III em animais com dismetabolismo glicídico

induzido por dieta.

No presente estudo, todos os parâmetros morfológicos analisados

foram indistinguíveis entre os grupos. Destaque-se que o fato de não se ter

encontrado diferença significante entre os grupos traduz um resultado positivo da III,

haja vista que os aspectos do grupo GT seguem tanto o padrão da normalidade

observado no grupo GP quanto o padrão funcionalmente acometido de GC. A

manutenção da arquitetura das ilhotas do grupo GC, sem redução do número e da

área de ilhotas, nem perda global de células beta, diferentemente de relatos

anteriores77,279, reforça a ocorrência de perda progressiva da funcionalidade das

células beta devido ao consumo prolongado de dieta hiperlipídica, suficiente para

provocar alterações significativas no metabolismo glicídico. Acredita-se que a III

tenha promovido recuperação funcional das células beta, sopesando-se os demais

resultados bioquímicos, ante a indicação de restauração de uma resposta secretória

insulínica precoce à glicose. O aumento da secreção de GLP-1 pode explicar a

restauração da função das células beta90,91,100,102,247,256,257, conforme indicado no

grupo GT, face às ausências de hiperplasia de células beta, de hipertrofia de ilhotas

de Langerhans e de outras expressões morfológicas. Ademais, as consequências

metabólicas observadas no grupo GT, as quais alteraram alguns aspectos da

evolução característica do DM2, podem decorrer de modificações moleculares na

sinalização da insulina já descritas238,256,257,311,312 as quais antecipam, não

expressam, ou mesmo não refletem, mudanças histológicas. É possível que a III, por

si só, não promova alterações estruturais no pâncreas endócrino, como já

relatado253, mas preserve sua arquitetura e a interação celular. Outros estudos que

estendam o tempo de observação pós-operatório são necessários para se detectar e

analisar os possíveis efeitos morfológicos no pâncreas que podem estar associados

à III.

64

Na presente pesquisa, a melhora efetiva da tolerância à glicose

constatadas no grupo GT, ainda que mais tardiamente, ante a menor insulinemia

dentre os grupos, com recuperação funcional das células beta, o aumento dos níveis

de peptídeo C e a hiperglucagonemia, indicam que tenha havido melhora da

sinalização da insulina, com conseqüente incremento da captação da glicose, e de

modo independente de insulina. Já se postulou que a interposição ileal pode

melhorar a captação da glicose em tecidos periféricos sem mudança significativa na

resistência insulínica nem na produção deste hormônio77,178,241.

Não se pode dizer que houve redução dos níveis de glicose nos

animais do GT por aumento expressivo da secreção de insulina, mesmo

considerando-se as ações secretagoga e reguladora de células beta do GLP-

190,91,172, visto que se verificou apenas aumento da secreção em nível pancreático,

ante os resultados encontrados, mas sim pelo aumento da utilização periférica da

glicose que esta incretina promove, ainda que se tenha postulado que o GLP-1 não

influencia diretamente na sensibilidade à insulina313. A melhora da tolerância à

glicose promovida pela III implica em menores níveis de glicemia, assim como em

menores quantidades de insulina, necessárias para manutenção dos níveis

glicêmicos e maior processamento da glicose, como relatado. A otimização do

metabolismo glicêmico após a III deve-se aos efeitos da estimulação do intestino

posterior, com mudanças hormonais e adaptações metabólicas, conforme relatos

anteriores178,232,240,247,252,253,257.

Tem-se que a III resulta não só em aumento das concentrações

plasmáticas de GLP-1, mas também da expressão de seus receptores em tecidos

periféricos100,240,241, tais como músculo, gordura e fígado. Assim, o GLP-1 pode

induzir, além da redução da gliconeogênese hepática, aumento na captação de

glicose insulino-dependente no músculo e gordura256,314-318, melhorando a tolerância

a glicose após a III. Estudos também têm correlacionado receptores de GLP-1 no

cérebro à homeostase da glicose319, sendo que a sinalização de receptores de GLP-

1 cerebrais também parece estar envolvida no controle do fluxo de glicose periférica

no músculo esquelético e no fígado, na sensibilidade à insulina e na secreção de

insulina98. Acredita-se que tenha havido aumento da resposta das células-alvo em

tecidos periféricos à insulina após a III, por alteração em diversos pontos da via de

65

transmissão do sinal hormonal, devido a supra-regulação da sensibilidade à insulina

ou mesmo melhora da sinalização da insulina, desde a ligação ao seu receptor até a

ativação do transporte de glicose, ao que se atribui a otimização do metabolismo

glicídico, apesar de os mecanismos subjacentes permanecerem desconhecidos241. A

complexa interação entre as diversas sinalizações neural e alimentar, num circuito

metabólico complexo, ainda precisa ser mais investigada102,240,241,256.

Apesar de algumas ligeiras discrepâncias entre estudos distintos da

presente pesquisa, envolvendo animais não-obesos não-diabéticos, não-obesos

diabéticos e obesos diabéticos, há relatos de melhora da sensibilidade à insulina

após a III247. Verificamos que, de fato, houve influência positiva sobre os efeitos da

insulina na captação, na metabolização e no armazenamento da glicose no grupo

GT, com relevância terapêutica. Entrementes, as repercussões funcionais

verificadas, induzidas pela III, podem também ser devidas a ações extrapancreáticas

do GLP-1, à produção e à secreção de outros enterohormônios não avaliados nesta

pesquisa, a modificações histológicas que ocorrem na mucosa intestinal, nas células

L e noutras, e mesmo a mecanismos não-mediados pelo GLP-1, além das

mudanças na microbiota intestinal e na metabolização de ácidos biliares, que podem

interferir no metabolismo da glicose, nas ações da insulina e de diversos hormônios,

como já relatado77,90,91,98,100,172,178,238,240,247,312,319. A contribuição do íleo interposto

parece ser considerável no que tange aos benefícios metabólicos observados, tendo

em conta a hipótese do intestino posterior, o que pode vir a revolucionar o

tratamento do DM2.

Vale consignar que pesquisas com modelos experimentais diversos

demonstraram que, após a interposição ileal, ocorrem reduções do consumo

alimentar e do peso corporal, as quais podem estar associadas tanto à melhora do

DM2 quanto aos efeitos do GLP-193,104-106,223,241. Contudo, já se sugeriu que

mecanismos independentes de peso podem contribuir para a melhora da resistência

insulínica247. As otimizações do metabolismo glicídico observadas nesta pesquisa

ocorreram apesar do consumo alimentar semelhante aos GS e GC e

independentemente de perda de peso no grupo GT. Não houve mudança

significativa na composição corporal, no que tange à adiposidade do grupo GT, que

pudesse ter tido alguma influência sobre a homeostase glicêmica. Os resultados

66

sugerem que pode haver alguns mecanismos insulino-independentes e não-

relacionados à perda de peso que possuem algum papel na otimização da

sensibilidade à insulina, conforme postulado247, mas ainda há incertezas se as

modificações do metabolismo glicídico são completamente independentes de perda

ponderal.

Existe a possibilidade de as diferenças de linhagens terem contribuído

para a variação entre os efeitos promovidos pela III, visto que trabalhos anteriores

utilizaram-se de animais Sprague-Dawley241 e Long-Evans93,228,240, ainda que com

ratos de mesma idade, mas com peso, tempo de exposição e qualidade de dieta

distintos, sendo certo que a experiência que utilizou a linhagem Wistar forneceu

dieta hipercalórica tão somente no período pós-operatório109. Talvez a exposição

crônica dos animais às dietas experimentais, no presente estudo, por um período de

tempo superior ao empregado em tais experimentos (18 semanas), antes da

realização da III, tenha afetado mais efetivamente o metabolismo de carboidratos,

repercutindo de alguma maneira sobre os resultados, em que pesem as

semelhanças observadas. Acredita-se, ainda, que a manutenção da ministração da

dieta hipercalórica no período pós-operatório tenha contribuído para que a

implementação do metabolismo glicídico tenha se dado mais tardiamente. Não

obstante, apesar de haver diferenças nos efeitos da III de acordo com o modelo

experimental e protocolo cirúrgico utilizados247,283, é notória a influência do íleo

interposto no metabolismo de carboidratos.

Apresentaram-se evidências experimentais que corroboram os efeitos

da interposição ileal isolada na resolução do DM2. Utilizou-se um modelo

experimental controlado, reprodutível e mais preciso, com dismetabolismo glicídico

induzido por dieta, que poderá vir a ser uma ferramenta útil para investigar

sistematicamente os mecanismos pelos quais a III melhora o metabolismo de

carboidratos, uma vez que permite uma avaliação mais exata de seu papel, ao

compartilhar características com o DM2 que se instala na população. Trata-se de

procedimento eficaz na indução de uma melhoria na tolerância à glicose, mediante

maior captação de glicose pelos tecidos, com melhora da sensibilidade à insulina,

sem restrição nem disabsorção, e sem afetar o peso corporal e a ingestão alimentar.

Em nível de investigação pré-clínico, confirmou-se o papel terapêutico potencial da

67

interposição ileal isolada, que poderá vir a ser admitida como uma alternativa

cirúrgica de grande relevância para o tratamento do DM2 em indivíduos

selecionados, não-obesos, que apresentem resposta insuficiente a medidas

dietéticas e farmacológicas. Diante dos resultados de todos os estudos existentes,

incluindo os de nosso grupo, acreditamos que seja o momento de se promover

pesquisa clínica envolvendo indivíduos diabéticos com sobrepeso e sem resposta

satisfatória a medidas conservadoras.

Os resultados apresentados fornecem contribuição sobre os efeitos

metabólicos por detrás da III, proporcionando novas oportunidades para se

compreender a relação entre o trato gastrintestinal e o DM2, ante a confirmação de

seus efeitos quando novas séries de animais sem modificações genéticas nem

fármaco-induzidas forem avaliadas. É preciso se identificar os circuitos e fatores

envolvidos nas mudanças fenotípicas observadas, mormente as bases moleculares

desse procedimento, agregando conhecimento. A compreensão dos processos

fisiológicos fundamentais tem enormes benefícios que permitem ajudar um

segmento da população de indivíduos diabéticos. Estudos adicionais semelhantes

são necessários para validar estas perspectivas, com vistas também a se

descobrirem alvos terapêuticos que podem vir a reproduzir os benefícios

metabólicos observados até de uma forma menos invasiva, assumindo importância

no futuro do tratamento do DM2, antes de a III ser introduzida na prática clínica.

68

CONCLUSÃO

A interposição ileal isolada não promove redução ponderal, diminuição

do consumo alimentar nem minoração da gordura visceral.

A interposição ileal isolada induz melhora da tolerância à glicose e da

sensibilidade das células-alvo à insulina.

A interposição ileal isolada não implica em alterações morfológicas na

estrutura do pâncreas endócrino.

69

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86

APÊNDICES

Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São

Paulo – CEP/UNIFESP.

87

88

Ata da Reunião da Comissão Julgadora da Defesa de Tese de Doutorado.

89

ANEXOS

Anexo 1- Formalina tamponada

A formalina tamponada apresenta um percentual de formaldeído

variável entre 3,7 e 4% com pH estável em 7,4. A fórmula para preparo de 1 litro de

formol tamponado é:

1. Diluir 6,5g de fosfato de sódio dibásico anidro em 450 mL de

água filtrada;

2. Diluir 4g de fosfato de sódio monobásico monohidratado em

450 mL de água filtrada;

3. Juntar as duas soluções:

4. Acrescentar 100 mL de formol comercial a 37% ou 40%.

Anexo 2 – Protocolo de silanização das lâminas

Lâmina Silanizada: (3–Aminopropyl) triethoxy-silane, minimum 98%

(Sigma A3648). O protocolo de silanização das lâminas envolve as seguintes

etapas:

As lâminas são colocadas em carrinhos de metal (usa-se luvas).

Em cubas de vidro com capacidade para, aproximadamente, 500ml

são colocados os seguintes reagentes:

1. Álcool absoluto: submersão do carrinho com as lâminas por

três minutos;

2. Álcool absoluto: submersão do carrinho com as lâminas por

três minutos;

3. Silano 4% em acetona: submersão do carrinho com as

lâminas por três minutos;

4. Álcool absoluto: seis a dez banhos de imersão; e

5. Álcool absoluto: seis a dez banhos de imersão;

90

Ao passar o carrinho de uma cuba para outra, esgotar bem o excesso

do reagente, para não “contaminar” o reagente seguinte. Retira-se o excesso de

acetona em papel toalha e secam-se as lâminas em estufa, 80ºC, por trinta minutos.

As lâminas são guardadas em caixas, ficando protegidas de poeira.

Anexo 3 – Protocolo de estudo imunohistoquímico

O protocolo de estudo imunohistoquímico inclui as seguintes etapas:

a) desparafinação: as lâminas foram deixadas em estufa a 60ºC

por 12 horas, para melhor adesão do tecido e, em seguida, desparafinadas com 3

banhos em xilol por 5 minutos cada, em temperatura ambiente;

b) hidratação: as lâminas foram submersas duas vezes em

etanol absoluto por 5 minutos e lavadas com água corrente, por 2 minutos, para a

hidratação dos cortes;

c) recuperação antigênica: as lâminas foram colocadas em

solução de citrato de sódio 10 mM, pH 6,0, por 30 minutos em panela de vapor

(95ºC), deixando-se depois esfriar à temperatura ambiente por 20 minutos e lavadas

em PBS (Tampão Salina Fosfato) 0,05 M, pH de 7,4, quatro vezes por 3 minutos

cada;

d) bloqueio da peroxidase endógena: as lâminas foram

incubadas com peróxido de hidrogênio 3%, quatro vezes por 5 minutos cada e, em

seguida, lavadas com água corrente e tampão PBS, pH de 7,4, três vezes por 3

minutos cada;

e) bloqueio de sítios inespecíficos: as lâminas foram incubadas

em PBS, pH de 7,4 + SAB (Soro Albumina Bovina) 1% por 30 minutos em

temperatura ambiente;

f) ligação com o primeiro anticorpo primário: os cortes

histológicos de cada lâmina foram incubados com anticorpo primário, diluídos em

PBS + SAB 1%, em titulação pré-estabelecida pelo fornecedor, e deixadas em

câmara úmida a 4ºC de 16 a 18 horas e, na seqüência, foram lavadas em PBS, pH

de 7,4, por 3 vezes;

91

g) ligação do anticorpo secundário: os cortes foram incubados

com o anticorpo secundário, conjugado com biotina do Kit Dako EnVision por 30

minutos, à temperatura ambiente em câmara úmida. Após a incubação, lâminas

foram lavadas em PBS, pH de 7,4, por 3 vezes e novamente incubadas com a

solução de amplificação (estreptavidina conjugada com peroxidase) do Kit Dako, por

30 minutos, e, em seguida, lavadas com tampão PBS, pH de 7,4, por três vezes;

h) revelação: os cortes foram cobertos com solução de

cromógeno 3,3’diaminobenzidina DA lí uido , por 15 minutos, e, em seguida,

lavados com água destilada;

i) revelação: os cortes foram cobertos com solução de

cromógeno Permanent Red, por 20 minutos;

j) contracoloração: os cortes foram lavados em água corrente,

por 5 minutos, e, em seguida, contracorados com hematoxilina de Harris, por 20

segundos;

l) desidratação e montagem: as lâminas foram lavadas em água

corrente, por 10 minutos, submersas em etanol absoluto 4 vezes e, a seguir, em xilol

por 3 vezes e levadas para montagem com lamínula, e em meio de montagem

Enttellan ® (Merck) e identificadas.

Adotou-se como padrão de positividade o aparecimento de coloração

marrom acastanhada característica.

92

Anexo 4 – Tabelas

Tabela 19 - Peso corpóreo médio (g) dos grupos GP e DE entre as 12ª e 30ª semanas de vida.

GP DE

Semana Média DP Média DP p-valor

12 310,56 24,18 300,77 23,99 0,245

13 349,19 32,95 330,93 32,99 0,063

14 362,00 27,97 352,93 25,33 0,227

15 362,63 25,74 380,21* 24,28 0,018

16 372,31 38,91 410,93* 25,45 < 0,01

17 368,31 36,29 419,86* 29,05 < 0,01

18 386,50 31,44 423,64* 27,97 < 0,01

19 389,56 30,27 437,48* 29,59 < 0,01

20 391,38 32,01 463,11* 30,51 < 0,01

21 397,81 33,57 470,82* 32,44 < 0,01

22 403,25 35,12 470,77* 30,29 < 0,01

23 406,38 35,52 482,68* 35,61 < 0,01

24 408,19 38,04 495,20* 38,50 < 0,01

25 404,88 38,79 502,98* 39,12 < 0,01

26 414,31 45,44 493,16* 41,70 < 0,01

27 425,56 42,75 515,77* 43,83 < 0,01

28 415,13 46,16 524,15* 41,64 < 0,01

29 422,63 48,23 527,91* 40,93 < 0,01

30 429,50 48,27 512,02* 44,95 < 0,01


93

Tabela 20 – Taxa de consumo alimentar médio (g/kg/d) entre as 12ª e 30ª semanas de vida.

GP DE

Semana de Vida Média DP Média DP p-valor

12 7 72,16 5,95 57,78* 17,15 < 0,01

13 69,89 6,17 53,55* 10,13 < 0,01

14 73,95 7,66 51,23* 11,15 < 0,01

15 65,73 4,27 45,65* 9,02 < 0,01

16 62,07 4,02 37,52* 9,14 < 0,01

17 61,96 8,74 34,09* 7,68 < 0,01

18 51,31 10,69 40,14* 10,67 < 0,01

19 59,34 4,21 39,73* 9,80 < 0,01

20 61,77 4,42 35,55* 10,47 < 0,01

21 61,21 4,65 23,92* 5,93 < 0,01

22 60,63 4,44 38,43* 10,98 < 0,01

23 63,02 6,49 34,98* 10,46 < 0,01

24 56,35 5,19 34,05* 9,08 < 0,01

25 59,50 5,41 19,83* 4,25 < 0,01

26 58,11 6,96 38,76* 10,19 < 0,01

27 49,68 5,08 32,30* 9,15 < 0,01

28 55,55 5,53 32,04* 9,19 < 0,01

29 57,67 5,33 19,20* 5,98 < 0,01

30 46,47 4,88 27,68* 14,06 < 0,01


Tabela 21 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose (TTOG) na 28ª semana de vida.

GP DE

Média EP Média EP p-valor

28ª semana 21367,97 299,33 24683,46* 358,66 0,035

Grupos Ração Padrão (GP/n=16) e Dieta Experimental (DE/n=56). Valores representam a média e erro padrão (EP). (*) diferença significativa entre os grupos, p < 0,05.

94

Tabela 22 - Peso corpóreo médio (g) dos grupos entre as 30ª e 48ª semanas de vida.

Semana GP GT GS GC


30 429,50a

44,96

524,62b

57,73 509,00b

39,29 500,47b

41,87 < 0,01

31 435,75a

45,97 502,94b

47,71

482,00b

41,92 527,68b

45,62 0,036

32 434,25a

50,35 496,88b

58,08 482,93a,b

70,35 537,42b,c

46,07 0,037

33 429,57a

60,54 503,93b

61,86 491,71b

71,30 541,47b

47,45 0,031

34 438,56a

53,17 499,67b

61,29 500,64b

62,01 529,00b

45,27 0,016

35 440,06a

53,02 527,40b

72,53 526,43b

68,32 552,15b

50,97 0,002

36 442,06a

54,95 513,13b

89,29 517,21b

72,58 560,00b

53,24 0,020

37 437,56a

53,78 523,47b

67,79 542,07b

76,86 555,26b

56,49 0,002

38 425,87a

55,13 505,53b

76,14 533,21b

70,98 541,63b

49,21 0,004

39 436,94a

56,17 527,53b

92,29 549,93b

75,79 558,31b

50,42 0,003

40 442,88a

58,10 528,21b

100,47 563,57b

78,17 572,57b

54,23 0,012

41 428,50a

57,65 504,07b

96,47 561,64b

79,23 557,00b

47,22 0,024

42 442,75a

62,90 494,43a,b

97,14 526,36b

75,99 548,31b

49,06 0,012

43 446,06a

63,27 515,86b

90,27 563,21b

85,48 567,31b

48,52 0,048

44 442,19a

66,81 521,57b

93,21 567,14b

92,48 571,10b

49,58 0,028

45 438,38a

68,42 521,86b

103,68 531,71b

89,73 556,00b

59,32 0,031

46 451,13a

63,14 537,43a,b

104,29 512,93a,b

143,00 549,77b

47,06 0,016

47 443,75a

69,89 538,07b

101,39 546,86b

98,61 565,33b

55,57 0,013

48 423,19a

70,96 542,21b

101,99 551,07b

103,68 568,72b

58,26 0,002

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação ao peso corporal, p > 0,05.

Tabela 23 – Índice de Lee (g/cm) na 48ª semana de vida

GP GT GS GC


Lee 48ª semana

285,73a 12,36 299,46

b 12,25 299,55

b 14,21 303,47

b 11,41 0,02

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação ao índice de Lee, p > 0,05.

95

Tabela 24 – Taxa de consumo alimentar médio (g/kg/dia) entre as 31ª e 48ª semanas de vida.

Semana GP GT GS GC

Media DP Média DP Média DP Média DP p-valor

31 59,71a

6,68 22,89b

12,34 35,79b

3,70 31,25b

2,60 < 0,01

32 44,66a 5,40 27,53

b 10,16 35,39

b 6,30 28,01

b 3,68 < 0,01

33 52,61a

7,87 20,97b

2,45 24,37b 7,39 16,60

b 2,41 < 0,01

34 49,28a

6,44 30,61b

5,48 37,35b 8,35 32,23

b 3,39 < 0,01

35 42,85a

5,25 34,86b

7,74 40,81b 18,03 29,86

b 2,76 < 0,01

36 56,73a

7,52 25,15b

6,73 34,20b 11,23 24,74

b 3,78 < 0,01

37 33,40a

4,80 16,51b

4,11 18,44b 7,05 13,15

b 3,89 < 0,01

38 43,86a

5,09 31,72b

6,59 32,20b 11,87 27,38

b 3,90 < 0,01

39 47,52a

5,83 31,18b

8,69 35,90b 14,63 27,16

b 6,32 < 0,01

40 65,69a

9,70 30,12b

11,07 30,93b 23,04 25,39

b 5,14 < 0,01

41 53,24a

6,62 13,53b

6,81 14,48b 12,76 11,34

b 3,02 < 0,01

42 49,27a

6,52 32,35b

9,20 35,01b 8,10 29,62

b 2,59 < 0,01

43 49,77a

7,18 30,89b

6,08 27,81b 10,94 25,35

b 3,19 < 0,01

44 51,15a

6,87 45,02b

24,11 26,68b 7,48 30,47

b 6,56 < 0,01

45 39,40a

7,33 23,27b

10,61 14,56b 10,30 12,38

b 6,13 < 0,01

46 50,72a

7,42 30,42b

5,16 41,54b 45,88 29,78

b 4,03 < 0,01

47 66,19a

12,41 32,70b

10,25 35,25b 23,40 27,27

b 3,75 < 0,01

48 60,02a

11,32 34,21b

6,79 42,34b 20,66 23,12

b 6,68 < 0,01

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e desvio padrão (DP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação ao consumo alimentar, p > 0,05. Tabela 25 – Áreas das curvas glicêmicas dos testes de tolerância oral a glicose (TTOG) nas 40ª e 48ª semanas de vida.

GP GT GS GC

Média EP Média EP Média EP Média EP p-valor

40ª semana 21.596,25a

324,70 25.687,50a,b

659,58 26.311,73a,b

632,66 26.248,42b

947,74 0,034

48ª semana 22.009,69a

308,51 25.696,50*a

868,33 27.905,77b

517,35 27.308,75b 869,76 0,023

Grupo Ração Padrão (GP), Grupo Interposição Ileal Isolada (GT), Grupo Sham (GS), Grupo Controle (GC). Os valores representam a média e erro padrão (EP). Comparação entre os grupos (a,b) – letras iguais representam não ter diferença significativa e letras diferentes representam ter diferença significativa. Não se encontrou significância estatística na comparação entre os grupos GT e GS em relação à área da curva glicêmica na 40ª semana de vida, p > 0,05. Na 48ª semana de vida, área da curva glicêmica de GT < área da curva glicêmica de GS. (*) – p < 0,05, GT versus GS e GT versus GC.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA …cirurgiaonline.med.br/arquivos/14.pdf · Médico-Assistente da Divisão de Anestesiologia do Departamento de Cirurgia do Hospital das