UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · A lesão de reperfusão é responsável por 50% do tamanho do infarto, sendo a principal responsável pelas alterações cardíacas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS

GRACE KELLY MELO DE ALMEIDA

EFEITO ANTIOXIDANTE DA DIOSMINA EM MIOCÁRDIO

DE RATO SUBMETIDO À LESÃO DE REPERFUSÃO

SÃO CRISTÓVÃO

2014

i


EFEITO ANTIOXIDANTE DA DIOSMINA EM

MIOCÁRDIO DE RATO SUBMETIDO À LESÃO DE

REPERFUSÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal de Sergipe como requisito à

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Fisiológicas.

Orientadora:

Dra. Sandra Lauton Santos

SÃO CRISTÓVÃO

2014

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

Almeida, Grace Kelly Melo de

A447e

Efeito antioxidante da diosmina em miocárdio de rato submetido à lesão de reperfusão / Grace Kelly Melo de Almeida; orientadora Sandra Lauton Santos – São

Cristóvão, 2014. 54 f.: il.

Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) - Universidade Federal de Sergipe,

2014.

O 1. Reperfusão cardíaca. 2. Extresse oxidativo. 3. Morte celular. 4. Diosmina. I.

Santos, Sandra Lauton, orient. II. Título.

CDU: 612.17

iii


EFEITO ANTIOXIDANTE DA DIOSMINA EM

MIOCÁRDIO DE RATO SUBMETIDO À LESÃO DE

REPERFUSÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal de Sergipe como requisito à

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Fisiológicas.

Orientadora: Dra. Sandra Lauton Santos

______________________________________________________

1º Examinador: Dra. Cristiane Banni Corrêia

______________________________________________________

2º Examinador: Dr. Enilton Aparecido Camargo

______________________________________________________

1º Examinador Suplente: Dra. Virgínia Mara Pereira

SÃO CRISTOVÃO

2014

iv

Dedicatória

Minha Mãe, detentora da minha admiração.

Ao meu Pai, ausência de corpo e presença de

espírito diária.

Meu namorado, pelo amor e companheirismo.

v

AGRADECIMENTOS

A Deus por iluminar os meus caminhos e me dar forças para seguir sempre em frente.

A toda minha família e amigos, que mesmo não sabendo ao certo o que eu fazia, me

apoiavam.

À Dra. Sandra Lauton Santos, por ter me ajudado a conquistar mais uma etapa da

minha vida. Com você aprendi o compromisso com ensino e pesquisa, e, além disso, que as

dificuldades que nos são impostas precisam ser vencidas e jamais desistir dos nossos

objetivos. Enfim, agradeço pela confiança em meu trabalho e pela amizade que criamos

durante esses dois anos.

Ao Laboratório de Biofísica do Coração e seus membros, Dr. Eduardo Antônio Conde

Garcia, Dra. Carla Maria de Lins Vasconcelos e a Dra. Evaleide Diniz de Oliveira pelo

conhecimento passado a cada dia.

Aos alunos de mestrado, Jucilene Freitas, Péligris Henrique, José Marden, Rodrigo

Miguel, e aos alunos de doutorado Raquel Moreira e Thássio Mesquita pelo apoio e pela

nossa grande amizade, uma das melhores coisas que ganhei durante o mestrado. O recente

mestre, Evaldo, grande amigo e que fez meus dias no laboratório se tornarem mais divertidos.

Agradeço também a Itamar Couto, foi mais que um amigo, uma das pessoas que mais me

ajudou para o desenvolvimento desse trabalho. A recente mestra, Maraiza Bezerra, por suas

palavras de conforto durante os momentos de estresse.

Aos animais que doaram suas vidas inconscientemente em prol da evolução da

ciência.

À UFS e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas - PROCFIS e seus

membros pela contribuição da minha formação acadêmica.

A CAPES - FAPITEC, pelo suporte durante o período de mestrado.

vi

RESUMO

Efeito Antioxidante da Diosmina em Miocárdio de Rato Submetido á lesão de

Reperfusão. Grace Kelly Melo de Almeida, Mestrado em Ciências Fisiológicas, UFS, São

Cristóvão, 2014. A lesão de reperfusão é responsável por 50% do tamanho do infarto, sendo

a principal responsável pelas alterações cardíacas ocasionadas pela sobrecarga de cálcio e

estresse oxidativo que ocorrem no processo de isquemia-reperfusão. A prevenção ou

limitação desta área torna-se um alvo para a proteção cardíaca. Neste contexto, a diosmina por

ser um flavonoide que apresenta ampla atividade biológica, principalmente cardioprotetora,

apresenta-se como uma substância a ser utilizada para a prevenção dessas lesões. O objetivo

deste estudo foi avaliar o efeito antioxidante da diosmina na lesão de reperfusão. Utilizou-se o

sistema de perfusão aórtico do tipo Langendorff pressão constante para a indução do modelo

de isquemia global cardíaca. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300 g) e os

procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da UFS

(04/2013). Os animais utilizados foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo 01 -

Sham: 20 minutos de estabilização, 100 minutos de perfusão com solução veículo (solução de

Krebs-Ringer acrescida de dimetilsulfóxido - DMSO 0,02 %); Grupo 02 - I-R + Veículo: 20

minutos de estabilização, 10 minutos de perfusão com solução veículo, seguido por 30

minutos de isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de reperfusão com a mesma solução;

Grupo 03 - I-R + Diosmina: 20 minutos de estabilização, perfusão por 10 minutos com

solução veículo, seguido por 30 minutos de isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de

reperfusão com solução de diosmina (0,1 µmol/L) e Grupo 04 - I-R + NAC: 20 minutos de

estabilização, perfusão por 10 minutos com solução veículo, seguido por 30 minutos de

isquemia e posteriormente, 60 minutos de reperfusão com o controle positivo NAC (N-

acetilcisteína - 24 µmol/L). Foi avaliado o efeito da diosmina sobre a contratilidade cardíaca,

através da mensuração da pressão intraventricular esquerda (PVE) e do índice de severidade

de arritmia (ASI). Além disso, foi analisada à área de lesão fazendo-se a marcação do infarto,

e mensuração da atividade das enzimas creatina quinase (CK) e lactato desidrogenase (LDH).

Também, foi analisado o efeito da diosmina na peroxidação lipídica (TBARS, hidroperóxidos

totais) e das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa

peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) nos corações estudados. E por fim, foi observada

a expressão da proteína caspase-3 pela técnica de western blot. Como resultados obtivemos o

reestabelecimento da PVE quando comparada ao grupo Sham, assim como verificamos

redução do ASI (p< 0,01) em relação aos corações que foram reperfundidos com o veículo.

Observamos, ainda, diminuição (p< 0,01) da área de infarto e da atividade das enzimas CK

total e LDH. A peroxidação lipídica e a concentração de hidroperóxidos mostraram-se

reduzidas (p< 0,01) em relação aos corações reperfundidos com o veículo. Além disso, a

atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR, também encontravam-se

reduzidas (p< 0,01) em relação aos corações reperfundidos com o veículo. Demonstramos

também redução (p< 0,01) da expressão da proteína caspase-3 quando comparado ao grupo

em que os corações foram reperfundidos com o veículo. Estes resultados em conjunto

evidenciam que a diosmina reduz as alterações decorrentes da isquemia-reperfusão cardíaca

por sua ação antioxidante.

Descritores: Reperfusão Cardíaca; Diosmina; Estresse Oxidativo; Morte Celular.

vii

ABSTRACT

Antioxidant Effect of Diosmin in Rat Myocardium Subjected to Reperfusion Injury.

Grace Kelly Melo de Almeida, MA in Physiological Sciences, UFS, São Cristóvão, 2014. The reperfusion injury is responsible for 50% of infarct size, being the main cause of cardiac

changes caused by calcium overload and oxidative stress occurring in the ischemia-

reperfusion process. Prevention or limitation of this area becomes a target for heart protection.

In this context, the diosmin to be a flavonoid that has wide biological activity, especially

cardioprotective, presents itself as a substance to be used for the prevention of these injuries.

The aim of this study was to evaluate the antioxidant effect of diosmin in reperfusion injury.

Was used aortic perfusion system of the type Langendorff constant pressure to induce cardiac

global ischemia model. Male Wistar rats (250-300 g) were used and the procedures were

approved by the Ethics Committee on Animal Research of the UFS (04/2013). The animals

were divided into 4 experimental groups: 01 - Sham: 20 minutes of stabilization, 100 minutes

of perfusion with vehicle solution (Krebs-Ringer solution plus dimethylsulfoxide - DMSO

0.02%); Group 02 - I-R + Vehicle: 20 minute of stabilization, 10 minute perfusion with

vehicle solution, followed by 30 minutes of ischemia and then reperfusion 60 minutes more

with the same solution, 10 minutes of perfusion with vehicle solution, followed by 30 minutes

of ischemia and then more 60 minutes of reperfusion with the same solution. Group 03 - I-R +

Diosmin: 20 minutes of stabilization, perfusion for 10 minutes with vehicle solution, followed

by 30 minutes of ischemia and subsequently a further 60 minutes of reperfusion with diosmin

solution (0.1 mol / L) and Group 04 - I-R + NAC: 20 minutes of stabilization, perfusion for 10

minutes with vehicle solution, followed by 30 min ischemia and after 60 minutes of

reperfusion with the positive control NAC (N-acetylcysteine - 24 mmol / L). Was evaluated

the effect of diosmin on cardiac contractility, by measuring the left intraventricular pressure

(PVE) and arrhythmia severity index (ASI). Furthermore, was analyzed the area of injury

making a mark on the infarct location, and measurement of the enzymes creatine kinase (CK)

and lactate dehydrogenase (LDH). Also, it was analyzed the effect of diosmin in lipid

peroxidation (TBARS, total hydroperoxides) and antioxidant enzymes superoxide dismutase

(SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) in the

hearts studied. Finally, we observed the expression of caspase-3 protein by western blot. As a

result we obtained the restoration of PVE when compared to the sham group, as well as

verified reduction of ASI (p< 0.01) compared to hearts were reperfused with the vehicle. We

also observed a decrease (p< 0.01) of the infarcted area and the overall activity of the

enzymes CK and LDH. Lipid peroxidation and the concentration of hydroperoxides shown to

be reduced (p< 0.01) compared to reperfused hearts with the vehicle. In addition, the activity

of antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx and GR also were reduced (p< 0.01) compared to

reperfused hearts with the vehicle. Also demonstrated reduction (p< 0.01) the expression of

caspase-3 protein compared to the group in which the hearts were reperfused with the vehicle.

These results together show that the diosmin reduces the changes arising from cardiac

ischemia-reperfusion for their antioxidant activity.

Keywords: Cardiac Reperfusion; Diosmin; Oxidative Stress; Cell Death.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Eventos ocorridos durante a isquemia cardíaca...........................................................5

Figura 2. Eventos ocorridos durante a reperfusão cardíaca........................................................6

Figura 3. Ilustração da contratura cardíaca por sobrecarga de cálcio.........................................7

Figura 4. Esquema representativo da reação de Fenton (A) e Haber Weiss (B).........................9

Figura 5. Esquema do sistema antioxidante enzimático.............................................................9

Figura 6. Ilustração molecular da estrutura base dos flavonoides............................................12

Figura 7. Ilustração da estrutura molecular da diosmina..........................................................14

Figura 8. Representação esquemática do protocolo de perfusão com diosmina em

concentrações crescentes...........................................................................................................17

Figura 9. Esquema representativo dos grupos experimentais...................................................18

Figura 10. Ilustração do sistema de perfusão do tipo Langendorff pressão constante..............19

Figura 11. Efeito da diosmina na pressão intraventricular esquerda (PVE) em corações

isolados de ratos........................................................................................................................25

Figura 12. Efeito da diosmina na pressão intraventricular esquerda (PVE) em corações

isolados de ratos submetidos à isquemia-reperfusão................................................................26

Figura 13. Efeito da diosmina nas arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos

submetidos à isquemia-reperfusão............................................................................................27

ix

Figura 14. Efeito da diosmina na limitação da área de infarto em corações isolados


Figura 15. Efeito da diosmina na atividade da creatina quinase total (CK) em corações


Figura 16. Efeito da diosmina na atividade da lactato desidrogenase (LDH) em corações


Figura 17. Efeito da diosmina no grau de peroxidação lipídica (TBARS) em corações isolados

de ratos submetidos à isquemia-reperfusão..............................................................................31

Figura 18. Efeito da diosmina na concentração de hidroperóxidos totais em corações isolados


Figura 19. Efeito da diosmina na atividade da superóxido dismutase (SOD) em corações


Figura 20. Efeito da diosmina na atividade da catalase (CAT) em corações isolados de ratos


Figura 21. Efeito da diosmina na atividade da glutationa peroxidase (GPx) em corações

isolados de ratos submetidos à isquemia-reperfusão...............................................................35

Figura 22. Efeito da diosmina na atividade da glutationa redutase (GR) em corações isolados


Figura 23. Efeito da diosmina na expressão proteica da caspase-3 em corações de ratos

submetidos à isquemia-reperfusão.........................................................................................38

x

LISTA DE SIGLAS

ANOVA Análise de Variância

ASI Índice de Severidade da Arritmia

ATP Adenosina Trifosfato

BHT Butil-hidroxitoluol

cAMP AMP Cíclico (Adenosina Monofosfato Cíclico)

CAT Catalase

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CK Creatina Quinase

CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido Desoxiribonucleico

E.P.M. Erro Padrão da Média

EDTA Ácido Etilenediaminotetraacético

ELISA Do Inglês “Enzyme-linked Immunosorbent Assay”

FOX Oxidação Ferrosa do Xilenol Orange

GPx Glutationa Peroxidase

GR Glutationa Redutase

GSH Glutationa Reduzida

GSSH Glutationa Oxidada

IAM Infarto Agudo do Miocárdio

LDH Lactato Desidrogenase

MDA Malonaldeído

MPTP Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial

MTT Sal de Tetrazolium

NAC N-acetilcisteína

NADP Nicotinamida Adenina Difosfato

NADPH Nicotinamida Adenina Difosfato Reduzida

xi

NADPH oxidase Nicotinamida Adenina Difosfato Oxidase

NCX Trocador Sódio-Cálcio

NHE Trocador Sódio-Hidrogênio

PBS Solução Tamponada de Fosfato

pH Potencial Hidrogeniônico

PMSF Fluoreto de Fenilmetilsulfonilo

PVE Pressão Intraventricular Esquerda

RNS Espécie Reativa de Nitrogênio

ROS Espécie Reativa de Oxigênio

RS Retículo Sarcoplasmático

RyR Receptor de Rianodina

SDS-PAGE Do Inglês “Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel

Electrophoresis”

SERCA Cálcio-ATPase do Retículo Sarcoplasmático

SOD Superóxido Dismutase

TBA Ácido Tiobarbitúrico

TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

TCA Ácido Tricloroacético

TTC Cloreto de Trifeniltetrazólio

u.a. Unidades Arbitrárias

UFS Universidade Federal de Sergipe

XO Xantina Oxidase

ΔE Variação de Absorbância

Δψ m Potencial Mitocondrial

xii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................1

2. REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................................3

2.1 Isquemia-Reperfusão Cardíaca.................................................................................3

2.2 Consequências da Lesão de Isquemia-Reperfusão Cardíaca....................................4

2.3 Radicais Livres e Estresse Oxidativo na Lesão de Reperfusão Cardíaca.................8

2.4 Flavonoides.............................................................................................................11

2.5 Diosmina.................................................................................................................14

3. OBJETIVOS.........................................................................................................................16

3.1 Geral........................................................................................................................16

3.2 Específicos..............................................................................................................16

4. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................17

4.1 Animais...................................................................................................................17

4.2 Grupos Experimentais.............................................................................................17

4.3 Modelo de Isquemia-Reperfusão Cardíaca ............................................................18

4.4 Avaliação da Pressão Intraventricular Esquerda (PVE) .........................................19

4.5 Avaliação do Indice de Severidade da Arritmia (ASI) ..........................................19

4.6 Análises da Lesão Tecidual.....................................................................................20

4.6.1 Marcação da Área de Infarte...................................................................20

4.6.2 Determinação da Atividade da Enzima Creatina Quinase Total

(CK)...................................................................................................................20

4.6.3 Determinação da Atividade da Enzima Lactato Desidrogenase

(LDH)................................................................................................................20

4.7Avaliações dos Parâmetros Antioxidantes...............................................................21

xiii

4.7.1Determinação do Grau de Peroxidação Lipídica (TBARS) .....................21

4.7.2 Mensuração de Hidroperóxidos Totais.....................................................21

4.7.3Determinação da Atividade da Enzima Superóxido Dismutase

(SOD)................................................................................................................22

4.7.4 Determinação da Atividade da Enzima Catalase (CAT) .........................22

4.7.5 Avaliação da Atividade da Enzima Glutationa Peroxidase (GPx)...........22

4.7.6 Avaliação da Atividade da Enzima Glutationa Redutase (GR)................23

4.8 Determinação da Expressão Proteica de Caspase-3 por Western Blot....................23

4.9 Determinação da Concentração Total de Proteínas................................................24

4.10 Análises Estatísticas..............................................................................................24

5. RESULTADOS ....................................................................................................................24

6. DISCUSSÃO........................................................................................................................38

7. CONCLUSÃO......................................................................................................................46

8. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO....................................................................................47

9. ANEXO.................................................................................................................................54

1

1. INTRODUÇÃO

O número de pessoas portadoras de patologias cardíacas, a exemplo da Doença

Arterial Coronariana e, consequentemente, o Infarto Agudo do Miocárdio (IAM), vem

crescendo nos últimos anos em todo o mundo. No Brasil, segundo o órgão brasileiro

DATASUS (2012) somente no mês de julho deste mesmo ano, 896 pessoas morreram em

hospitais vítimas do IAM, sendo a região nordeste a segunda maior contribuidora, 22.271.

Considerando que as doenças cardiovasculares constituem a principal causa de morbidade,

incapacidade e morte no mundo e no Brasil, o Ministério da Saúde através da Portaria nº

2.994/2011 aprovou a Linha de Cuidado do Infarto Agudo do Miocárdio e o Protocolo de

Síndromes Coronarianas Agudas (BRASIL, 2011).

Como meio de intervenção, a reperfusão é utilizada nas síndromes coronarianas

agudas. No entanto, a reperfusão tem o potencial de exacerbar a lesão tecidual, um processo

designado por "lesão de reperfusão”, sendo responsável por 50% do tamanho do infarto. A

lesão de reperfusão é representada por alterações tais como arritmias, disfunção mecânica ou

"atordoamento do miocárdio", lesão microvascular, respostas inflamatórias e apoptose

(ARTIGOU et al., 1993; BRASILEIRO, 1997; PERRELLI et al., 2011).

Os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da lesão da reperfusão são complexos. As

teorias mais aceitas são conhecidas como “O Paradoxo do Cálcio” e o “Paradoxo do

Oxigênio” ou “Hipótese Oxiradical”. A primeira teoria tenta explicar que as alterações

decorrentes da lesão de reperfusão ocorrem devido ao grande influxo de cálcio (Ca2+

) para o

interior da célula. Já a segunda, tenta explanar que essas modificações são resultado do

“estresse oxidativo” (BRASILEIRO, 1997; PERRELLI et al., 2011).

Um dos principais focos em pesquisa cardiovascular tem sido desenvolver abordagens

para minimizar os danos no músculo cardíaco que são gerados pós-isquemia, através de

mecanismos que reduzam o tamanho do infarto assim como, todas as manifestações da lesão,

com consequente melhora no prognóstico. Assim, recentemente voltaram-se as atenções para

a pesquisa de drogas cardioprotetoras, utilizadas isoladamente ou em associação, para reduzir

ou prevenir o dano sobre a célula cardíaca (PARANG; SINGH; ARORA, 2005; WOLFF &

BUDKER, 2005).

2

Drogas derivadas de produtos naturais podem apresentar-se como substâncias com

efeitos terapêuticos nas lesões de reperfusão. Um grupo de substâncias que vêm se destacando

são os flavonoides, uma classe de polifenois encontrados em frutas, vegetais, grãos, cascas,

raízes, caules, flores, chá e vinho. Essas substâncias possuem uma série de propriedades

farmacológicas, que os fazem atuarem sobre sistemas biológicos de forma benéfica para a

saúde humana (NIJVELDT et al., 2011).

Diversas funções são atribuídas aos flavonoides, entre elas pode-se citar a capacidade

antioxidante, esta constitui a atividade mais elucidada pelos estudos até agora desenvolvidos;

atividade anti-inflamatória; vasodilatodora; analgésica; anticancerígena; atuação

antiplaquetária; bem como ações antimicrobianas e antivirais (LIN et al., 1997; VOLP et al.,

2008).

Há evidências que indicam os efeitos benéficos dos flavonoides em corações

submetidos à isquemia-reperfusão in vitro, o que pode ser de uso em situações agudas de

isquemia-reperfusão tais como, cirurgias cardíacas e transplantes (BHANDARY et al., 2012;

LEBEAU; NEVIERE; COTELLE, 2001). Além disso, estudos experimentais evidenciaram

que a administração oral de flavonoides pode fornecer proteção contra a isquemia-reperfusão

no miocárdio, o que seria um benefício para pessoas com doenças crônicas como doença

isquêmica do coração (SUZUKI et al., 2007; TOUFEKTSIAN et al., 2008).

A diosmina (3',5,7-tri-hidroxi-4'-metoxiflavona-7-ramnoglucosídeo) é um flavonoide

encontrado em frutas cítricas que possui atividades biológicas, tais como atividade anti-

inflamatória, antioxidante, anti-hipertensiva, entre outras (SRINIVASAN & PARI, 2012;

SILAMBARASAN & RAJA, 2012; TAHIR et al., 2013).

Devido à diversidade de propriedades apresentadas pela diosmina, assim como há

necessidade do surgimento de drogas cardioprotetoras contra o surgimento das lesões de

reperfusão, decidimos avaliar no presente estudo a hipótese de que a diosmina possa

contribuir para a prevenção das lesões decorrentes da reperfusão cardíaca.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Isquemia-Reperfusão Cardíaca

O quadro clínico e diagnóstico do IAM foi descrito há cerca de cem anos quase

simultaneamente por dois autores russos, Obraztsov e Strazhesko, em 1910, numa revista

científica Alemã e, nos Estados Unidos, por Herrick num artigo publicado no JAMA em 1912

(MULLER, 1977).

Normalmente, a isquemia cardíaca ocorre quando o suprimento sanguíneo coronariano

para o miocárdio é interrompido devido à obstrução da vasculatura. Como o sangue através

das hemácias leva o oxigênio às células, a isquemia dá origem à hipóxia e contribui para a

fisiopatologia das lesões provocadas pelo IAM, insuficiência vascular periférica e choque

hipovolêmico (CENTURION et al., 2002).

A reperfusão compreende a restauração do fluxo sanguíneo com o consequente

restabelecimento das condições normóxicas após um período de hipóxia ou isquemia. Essa

restauração do fluxo sanguíneo produz aceleração das mudanças estruturais que se associam à

morte celular (RUIXING; WENWU; AL-GHAZALI, 2007). Existem diferentes hipóteses em

relação aos danos condicionados pela reperfusão, sendo as principais o aumento brusco na

oferta de O2 e na concentração intracelular de Ca2+

(FRÖHLICH et al., 2013; PIPER;

GARCÑA-DORADO; OVIZE, 1998b;).

Em 1972, Shen e Jennings demonstraram pela primeira vez que a lesão de reperfusão

do miocárdio resulta em sobrecarga de Ca2+

no citosol das células cardíacas. Além da

sobrecarga desse íon, a lesão de reperfusão é também ocasionada pelo estresse oxidativo

gerado, onde ambos levam a hipercontratura dos cardiomiócitos e abertura do poro de

transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP) (FRÖHLICH et al., 2013).

As observações a respeito das mudanças decorrentes da reperfusão foram direcionadas

ao campo da cirurgia cardíaca com circulação extracorpórea, onde foi observado que na

cirurgia de revascularização miocárdica há presença de disfunção contrátil do coração, que

ocorre após o restabelecimento da circulação coronariana (LERCH, 1993; MAXWELL &

LIP, 1997).

As alterações decorrentes da reperfusão são representadas de várias maneiras: (1)

Arritmias, com a reoxigenação miocárdica, onde frequentemente se tem a presença de

arritmias graves como taquicardia e fibrilação ventricular; (2) Atordoamento do miocárdio ou

4

lesão funcional, fenômeno caracterizado por uma disfunção do miócito que irá se recuperar

em alguns dias ou horas; (3) Lesão letal, consiste da morte celular como consequência da

reperfusão (BRASILEIRO, 1997).

2.2 Consequências da Lesão de Isquemia-Reperfusão Cardíaca

Durante a isquemia do miocárdio, o metabolismo mitocondrial é deprimido e a

produção de ATP é diminuída. A ausência de O2 e substratos oxidáveis provoca a diminuição

na atividade da cadeia respiratória, sendo este o mecanismo pelo qual a síntese de ATP é

reduzida. Dessa forma, para aumentar as fontes energéticas, a célula ativa o metabolismo

anaeróbio, porém, essa estratégia se mostra insuficiente para suprir as necessidades

energéticas da célula miocárdica, o que resulta em grande aumento na produção de piruvato e

lactato. Assim, a acidificação do meio intracelular durante a isquemia, combinada com a

depleção energética, determina a inibição de quase todos os mecanismos enzimáticos da

célula, produzindo uma importante alteração iônica (LOPASCHUK et al., 2000).

Em suma, essas alterações levam ao acúmulo de prótons no citoplasma da célula e a

posterior ativação do trocador sódio-hidrogênio (NHE) para tentar normalizar a acidez

celular. A ativação do trocador NHE, por sua vez, aumenta à concentração de sódio (Na+) no

citosol, resultando na inversão do trocador sódio-cálcio (NCX), com consequente sobrecarga

de Ca2+

citosólico (WALTERS; PORTER; BROOKES, 2014). Devido a redução de ATP,

essas alterações são agravadas ainda mais pela redução da atividade da cálcio-ATPase da

membrana celular e da cálcio-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA), que são

responsáveis pela remoção destes íons, contribuindo ainda mais com a sobrecarga de Ca2+

no

citosol (PIPER; KASSECKERT; ABDALLAH, 2006c). Além das alterações no transporte

iônico celular, ocorre ainda uma redução no influxo de Ca2+

para o interior das mitocôndrias

devido à redução do potencial mitocondrial (Δψm). Todavia, apesar de todas essas alterações,

o MPTP permanece no seu estado fisiológico, ou seja, no estado fechado (Figura 1)

(WALTERS; PORTER; BROOKES, 2014).

5

Figura 1 – Eventos ocorridos durante à isquemia cardíaca, adaptado de Walters et al., 2014. NHE: trocador

sódio-hidrogênio; NCX: trocador sódio-cálcio; Ca2+

-ATPase: bomba de cálcio-ATPase; Poro MPTP: poro de

transição de permeabilidade mitocondrial; ROS: espécies reativas de oxigênio; Fos - Ox: cadeia de transporte de

elétrons; Δψ m: potencial de membrana mitocondrial; NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo hidreto; CL:

cardiolipina; Ca2+

: íons cálcio; ATP: adenosina trifosfato; ANT: adenina nucleotídeo translocase; RYR: receptor

de rianodina.

Com a reperfusão e a consequente reintrodução de O2 a atividade do NCX é

restaurada, levando à saída de Ca2+

para o meio extracelular em troca de Na+

para o meio

intracelular (WALTERS; PORTER; BROOKES, 2014). Além disso, ocorre a restauração da

produção ATP e a posterior ativação da SERCA e da Ca2+

-ATPase da membrana plasmática,

que promovem a redução na concentração de Ca2+

no citosol que foi acumulado durante o

período de isquemia (PIPER; KASSECKERT; ABDALLAH, 2006c) (Figura 2).

Todavia, com a volta da atividade das mitocôndrias e a consequente reativação da

cadeia de transporte de elétrons, ocorre uma grande produção de espécies reativas de oxigênio

(ROS) e de espécies reativas de nitrogênio (RNS) (WALTERS; PORTER; BROOKES,

2014). Essas espécies reativas, por sua vez, promovem um ataque à cardiolipina, fosfolipídio

localizado na membrana mitocondrial interna, alterando a fluidez da membrana, a

permeabilidade iônica, a estrutura e a função dos componentes da cadeia transportadora de

elétrons mitocondrial, resultando em redução da eficiência da fosforilação oxidativa

mitocondrial (PARADIES et al., 2009). Além disso, as ROS e RNS ocasionam a ativação dos

receptores de rianodina (RyR), localizados no retículo sarcoplasmático (RS), o que culmina

em uma grande liberação de Ca2+

e contribui ainda mais para a sobrecarga deste íon no citosol

(KÖHLER; SAG; MAIER, 2014; PIPER; KASSECKERT; ABDALLAH, 2006c).

6

Os efeitos combinados da sobrecarga de Ca2+

no citosol e produção de ROS e RNS na

matriz mitocondrial favorecem a abertura do MPTP (WALTERS; PORTER; BROOKES,

2014). Com a abertura do MPTP há alteração nas membranas mitocondriais levando a uma

liberação de citocromo c. Este, por sua vez, induz a cascata de caspases que promovem a

morte celular por apoptose (MONASSIER, 2008). Tanto a apoptose quanto a necrose estão

presentes em corações isquêmicos. Na maioria dos casos, a morte celular apoptótica é mais

prevalente em lesão de isquemia-reperfusão, especificamente é iniciada durante a fase inicial

da isquemia e concluída na reperfusão (IBANEZ et al., 2011). Assim, todos esses fatores

somados são responsáveis pelo surgimento das lesões durante o período de reperfusão.

Figura 2 – Eventos ocorridos durante à reperfusão cardíaca, adaptado de Walters et al., 2014. NHE: trocador

sódio-hidrogênio; NCX: trocador sódio-cálcio; Ca2+

-ATPase: bomba de cálcio-ATPase; Poro PT: poro

mitocondrial; ROS: espécies reativas de oxigênio; Fos-Ox : cadeia de transporte de elétrons; Δψ m: potencial de

membrana mitocondrial; NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo hidreto; CL: cardiolipina; Ca2+

: íons

cálcio; ATP: adenosina trifosfato; ANT: adenina nucleotídeo translocase; RYR: receptor de rianodina.

Cirurgiões cardíacos observaram que a reperfusão após uma isquemia prolongada,

ocasionalmente provoca o fenômeno denominado de "coração de pedra”, ou seja, um coração

duro e pálido resultante da contratura muscular e da perda concomitante do teor de proteína

celular, representado histologicamente por cardiomiócitos hipercontraídos e membranas

celulares rompidas (GANOTE, 1983).

A contratura cardíaca está relacionada à redução sustentada e enrijecimento do

miocárdio decorrente de várias causas. A patogênese de contratura induzida por reperfusão

7

pode ser de dois tipos: contratura por sobrecarga de Ca2+

e a contratura rigor (PIPER;

ABDALLAH; SCHÄFER, 2004a).

A contratura rigor se desenvolve na isquemia-reperfusão no momento em que há

baixas concentrações citosólicas de ATP, durante o período de isquemia, com consequente

alteração das ligações entre os miofilamentos que resulta em encurtamento muscular. Com a

reperfusão, a diminuição de energia é restaurada e a contratura rigor geralmente é reversível.

A contratura desenvolvida por este mecanismo na verdade não causa grandes danos

estruturais, mas leva a defeitos no citoesqueleto tornando os cardiomiócitos mais frágeis e,

portanto, susceptíveis à danos mecânicos (PIPER; MEUTER; SCHÄFER, 2003d).

A contratura por sobrecarga de Ca2+

surge em virtude das altas concentrações

citosólicas de Ca2+

, resultante do transporte iônico do NCX em modo inverso durante a

isquemia assim como, da saída destes íons do RS durante a reperfusão (PIPER;

KASSECKERT; ABDALLAH, 2006c; WALTERS; POTER; BROOKES, 2014). Essa

sobrecarga provoca uma ativação miofibrilar descontrolada, que também é alimentada pelo

reabastecimento de ATP (Figura 3). Estes mecanismos celulares contribuem para

hipercontratura dos cardiomiócitos, que é uma das causas de lesão celular letal que ocorre

durante a reperfusão (PIPER; ABDALLAH; SCHÄFER, 2004a).

Figura 3 – Ilustração da contratura cardíaca por sobrecarca de Ca2+

, adaptada de Piper et al. (2004a). NCE:

trocador sódio-cálcio; SR: retículo sarcoplasmático; ATP: adenosina trifosfato; Ca2+

: íons cálcio.

Foi evidenciado em experimento in situ que corações que sofreram contratura

apresentaram uma grande região necrótica e que as mesmas correlacionavam-se com o

8

aumento de enzimas antioxidantes durante os primeiros minutos de reperfusão (BARRABÉS

et al., 1996). Estas observações indicam que o processo de morte celular e desenvolvimento

de hipercontraturas pós-isquêmicas são fenômenos relacionados, e são fatores responsáveis

para o desenvolvimento de lesões de reperfusão.

2.3 Radicais Livres e Estresse Oxidativo na Lesão de Reperfusão Cardíaca

Radical livre é um grupo de átomos ou moléculas em um estado particular que contém

um ou mais elétrons não pareados no seu orbital. São caracterizados por apresentar uma

grande instabilidade e reatividade, pode interagir por meio de reações de óxido-redução com

qualquer molécula, tais como proteínas, fosfolipídios insaturados e ácidos

desoxirribonucleicos (DNA), causando danos às células e tecidos. Outra característica

importante dos radicais livres é a tendência em gerar reação de cadeia na produção de radicais

livres que, em última análise, amplifica seu efeito destrutivo (FERREIRA & MATSUBARA,

1997b; PHAM-HUY & PHAM-HUY, 2008).

Os radicais livres incluem hidroxila (OH•), ânion superóxido (O2

•-), o óxido nítrico

(NO•), dióxido de nitrogênio (NO2

•), peroxil (ROO

•) e peroxil lipídico (LOO

•). Além disso, o

peróxido de hidrogênio (H2O2), o ozônio (O3), o oxigênio singleto (1O2), o ácido hipocloroso

(HOCl), o ácido nitroso (HNO2), o peroxinitrito (ONOO-), o trióxido de diozônio (N2O3), o

peróxido lipídico (LOOH) não são radicais livres, no entanto, podem induzir reações

radicalares no organismo, sendo por isso também considerados como espécies reativas

(PHAM-HUY & PHAM-HUY, 2008).

As ROS e as RNS, em cardiomiócitos e outras células, são geradas por diversas fontes,

dentre as quais, as mais importantes são: as mitocôndrias, a nicotinamida adenina

dinucleotídeo fosfato-hidrogênio oxidase da família Nox (NADPH oxidase), xantina oxidase

(XO) e as óxido nítrico sintases (NOS) (DUNCAN et al., 2005; TZIOMALOS & HARE,

2009).

As espécies reativas também podem ser geradas sem o auxílio de enzimas como, por

exemplo, nas reações de Fenton e Haber Weiss (Figura 4). Na reação de Fenton, ocorre à

formação de duas OH•, um radical livre altamente reativo, pela reação de íons ferroso (Fe

2+)

ou cobre (Cu+) com o H2O2. Na reação de Haber Weiss ocorre à interação do H2O2 com o O2

•-

9

e também são formados dois radicais OH• (HALLIWELL & CROSS, 1994; TZIOMALOS &

HARE, 2009).

Figura 4 - A) Reação de Fenton - Formação de dois radicais hidroxila (OH•) pela reação de íos ferroso (Fe

2+) ou

cobre (Cu+) com o peróxido de hidrogênio (H2O2). B) Reação de Haber Weiss – Interação do peroxido de

hidrogênio (H2O2) com o ânion superóxido (O2•-) com a formação de dois radicais hidroxilas (OH

•).

Para proteger-se dessas espécies reativas, a célula possui um sistema antioxidante, que

compreendem as enzimas antioxidantes (1) superóxido dismutase (SOD), enzima que age

dismutando o O2•- em H2O2; (2) catalase (CAT), enzima que promove a dismutação do H2O2

em água (H2O) e O2, impedindo a formação do radical OH•; (3) glutationa peroxidase (GPx),

atua em conjunto com a CAT impedindo a formação do radical OH• (BRASILEIRO, 1997;

DUNCAN et al., 2005) (Figura 5).

Figura 5 - Esquema do sistema antioxidante enzimático, adaptado de Griendling e Fitzgerald (2003). Conversão

do oxigênio (O2) em ânion superóxido (O2•-) pelas enzimas NADPH oxidase. O O2

•- é dismutado pela superóxido

dismutase (SOD), formando peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser convertido em uma molécula de água

(H2O) e oxigênio (O2) pela catalase (Cat) e/ou glutationa peroxidase (GPx). O H2O2 pode formar radical

hidroxila (OH•) após reação reagir com o ferro (Fe

+2) na reação de Fenton. A glutationa redutase (GR), mantêm o

equilíbrio entre a glutationa reduzida (GSH) e a glutationa oxidada (GSSG). O óxido nítrico (NO) é formado por

ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), a partir do aminoácido L-arginina que produz NO e L-citrulina. O

O2•- também pode reagir com o NO para formar peroxinitrito (OONO

-)

Além dos antioxidantes enzimáticos, existem os antioxidantes não enzimáticos que são

divididos em endógenos e exógenos. Os antioxidantes endógenos são produzidos pelo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido

http://pt.wikipedia.org/wiki/L-arginina

http://pt.wikipedia.org/wiki/L-citrulina

10

metabolismo no corpo, tais como o ácido lipoide, glutationa, L-arginina, coenzima Q10, a

melatonina, ácido úrico, bilirrubina, proteínas de quelante de metal, transferrina, etc. Os

antioxidantes exógenos são os compostos que não podem ser produzidos no corpo e devem

ser fornecidos através de alimentos ou suplementos, tais como a vitamina E, vitamina C,

carotenoides, metais vestigiais (selênio, magnésio, zinco), flavonoides, ácido graxo ômega-3 e

ômega-6, etc. (DROGE, 2002).

A produção de ROS e de RNS desempenha um papel vital em muitos processos

biológicos, incluindo o crescimento celular, a sinalização celular, o relaxamento do músculo

liso, as respostas imunes, a síntese de moléculas biológicas, e modulação da pressão

sanguínea (DASURI; ZHANG; KELLER, 2013). Entretanto, quando produzido em excesso,

os radicais livres geram um fenômeno chamado de estresse oxidativo. Este é ocasionado

quando há o desequilíbrio entre os sistemas de defesa antioxidante com predomínio dos

oxidantes, culminando no surgimento de danos celulares (PHAM-HUY & PHAM-HUY,

2008).

A ação desses compostos nas membranas celulares estimula o processo de

peroxidação lipídica, onde os ácidos graxos das cadeias laterais dos lipídeos, especialmente

aqueles que contêm duas ou mais ligações duplas, são oxidados a hidroperóxidos. Estes

compostos, por sua vez, podem interagir com outros radicais ou íons metálicos gerando

aldeídos citotóxicos como o malonaldeído (MDA) (VALKO et al., 2007).

Os danos oxidativos induzidos nas células e tecidos decorrentes do estresse oxidativo,

têm sido implicados em vários processos patológicos tais como na isquemia-reperfusão

(obstrução arterial aguda, infarto do miocárdio, clampeamento vascular, cardioplegia na

circulação extracorpórea), pancreatites, insuficiência renal aguda, insuficiência hepática,

colites ulcerativas e outras doenças inflamatórias. Além disso, as espécies reativas também

estão implicadas na carcinogênese devido a danos ao DNA (VALKO et al., 2007; YOSHIDA,

1996).

Na isquemia-reperfusão cardíaca diversas alterações metabólicas são produzidas e

condicionam o aumento na produção de radicais livres. Essas alterações compreendem: (1) a

redução dos componentes da cadeia respiratória como o citocromo 1; (2) o aumento de cAMP

e de seus metabólitos (adenosina, inosina e hipoxantina) que promove a ativação da XO; (3)

acumulação de NADH, NADPH, flavoproteínas e lactato, que reagem com o O2 induzindo a

11

formação de radicais livres; (4) alterações do metabolismo dos lipídeos, em especial, a

ativação de fosfolipases pela acumulação de Ca2+

citosólico, as quais induzem a liberação de

ácido araquidônico que estimula à formação de radicais livres pela cicloxigenase (MAUPOIL

et al., 1993).

Investigações realizadas em modelo experimental de isquemia - reperfusão cardíaca

têm demonstrado que o dano celular gerado nessa patogênese é acompanhado por alteração na

atividade das enzimas SOD, CAT, GPx, bem como, na peroxidação lipídica (GE et al., 2014;

QIAO; MA; LIU, 2011) . Estes indicativos confirmam que a ROS e RNS desempenham um

papel importante na lesão de reperfusão cardíaca.

Atualmente, vários trabalhos vêm investigando o efeito de compostos com atividade

antioxidante no modelo de isquemia - reperfusão cardíaca, com a finalidade de reduzir os

danos que são gerados (HE et al., 2012; JIN, 2012; ZHANG et al., 2013). Tem-se observado

que tais substâncias, tem a capacidade de reduzir o dano celular que é ocasionado, podendo

estas ser de importante uso terapêutico.

2.4 Flavonoides

Alguns compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário de plantas,

derivados dos aminoácidos aromáticos fenilalanina e também da tirosina. Essas substâncias

possuem anéis aromáticos com um ou mais grupos de hidroxila, incluindo seus derivados.

Existe uma grande variedade de compostos fenólicos, incluindo os fenóis simples, derivados

do ácido benzoico, ligninas, flavonoides, entre outros (SHAHIDI & NACZK, 2003).

Os flavonoides foram descobertos em 1530 pelo Szent-György, conquistando, assim, o

prêmio Nobel. Este pesquisador extraiu a citrina da casca do limão, substância essa,

apresentando capacidade de regulação da permeabilidade dos capilares sanguíneos. Desta

forma, essa classe de produtos naturais foi denominada como vitamina P (de permeabilidade)

e também por vitamina C2, visto que alguns flavonoides apresentavam propriedades

semelhantes às da vitamina C. Porém, devido a não confirmação destas substâncias como

pertencentes à classe das vitaminas, essa classificação foi abandonada em 1950 (MARTÍNEZ-

FLÓREZ et al., 2002).

O termo flavonoides deriva do latim “flavus” que significa amarelo, e define uma

classe de pigmentos responsáveis pela tonalidade das flores e folhas nas cores amarelo,

12

laranja e vermelho (NANDAVE; OJHA; ARYA, 2005). Estão presentes em várias partes das

plantas, desde a raiz até as flores e frutos, sendo encontrados nos vacúolos das células (YAO,

2004).

Os flavonoides ocorrem na forma livre (aglicona) ou ligada a açucares (glicosídeos).

São componentes de baixo peso molecular com estrutura base C6-C3-C6 (dois anéis fenil – A

e B – ligados através de um anel pirano – C) (Figura 6). Dependendo da substituição e do

grau de oxidação no anel C3, os flavonoides podem ser classificados em 10 classes de

compostos: antocianinas, leucoantocianidinas, flavonóis, flavonas, glicoflavonas, biflavonilas,

chalconas, aronas, flavononas e isoflavonas (YAO, 2004).

Figura 6- Ilustração molecular da estrutura plana base dos flavonoides (YOKOZAWA et al., 1997).

Esses compostos são consumidos em grandes proporções dentro de uma dieta humana

regular, e são encontrados em vegetais, legumes, frutas, chás de ervas, mel, entre outros

produtos de consumo cotidiano. Também são encontrados em várias plantas medicinais, e

vêm sendo utilizados pela medicina popular em todo o mundo, principalmente em

substituição a remédios no combate e prevenção de doenças tais como no câncer, doenças

cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, processos inflamatórios, entre outros (LOPES

et al., 2000; YOKOZAWA et al., 1997).

Em relação aos interesses farmacêuticos, os flavonoides ocupam lugar de destaque

devido suas diversas interferências nos sistemas biológicos, tais como inibindo os sistemas

NADPH oxidase de neutrófilos, fosfolipase A2, mieloperoxidase, entre outras (AKHLAGHI

& BANDY, 2009).

A propriedade mais bem descrita desse grupo de substâncias é a capacidade de atuar

como antioxidante. As flavonas e catequinas parecem ser os mais poderosos dessa classe, para

a proteção do organismo contra as ROS. Essa proteção é conferida devido à capacidade desses

13

compostos em inativar os radicais livres, devido à presença do grupo hidroxila em sua

composição que sequestram tais espécies reativas. Além disso, alguns dos efeitos

antioxidantes dos flavonoides estão relacionados à sua capacidade em quelar íons metálicos,

tais como ferro e cobre, que são cofatores críticos da reação de Fenton na geração de radicais

livres (NIJVELDT et al., 2001).

Pesquisas sobre os flavonoides receberam impulso adicional com a descoberta do

“Paradoxo Francês”, que faz um link entre um maior consumo de vinho tinto com a redução

da incidência de doenças cardíacas. Neste estudo, indivíduos que apresentavam elevada

concentração de colesterol sanguíneo, semelhantes aos dos americanos e ingleses, e que

consumiam vinho tinto diariamente, a incidência de mortalidade por doenças coronárias

isquêmicas eram tão baixas quanto a dos japoneses e chineses. Esse efeito foi atribuído aos

componentes do vinho tinto, que diminuíam a oxidação do colesterol LDL, agregação

plaquetária e a formação de trombose na população francesa (RENAUD & LORGERIL,

1992; VOLP et al., 2008).

Recentemente, investigações epidemiológicas sugerem um papel protetor dos

flavonoides na dieta contra a doença arterial coronariana. Em um estudo, por exemplo, foi

analisada a relação entre o consumo de chá e café com a incidência de infarto do miocárdio

(SESSO et al., 1999). Os indivíduos que ingeriam mais de uma xícara de chá por dia

apresentaram menor risco de desenvolver a doença, enquanto o consumo de café não foi

significantemente associado com a redução do risco cardiovascular.

Trabalhos em modelo de isquemia-reperfusão cardíaca experimental, também tem

demonstrado os benefícios dos flavonoides na atenuação das lesões de reperfusão que são

geradas. Sun et al. (2012) estudando os efeitos da luteolina em corações de ratos diabéticos

submetidos à isquemia-reperfusão observaram que esse polifenol foi capaz de reduzir o

tamanho do infarto e melhorar a hemodinâmica do coração.

Em outro ensaio, foi investigado o efeito do pré-tratamento com quercetina em

corações submetidos à isquemia cardíaca in vivo, e pode-se evidenciar uma diminuição dos

indicadores de estresse oxidativo e inflamatórios relacionados com a lesão de isquemia do

miocárdio (LIU et al., 2014).

14

Devido aos extensos efeitos benéficos dos flavonoides frente a diversas patologias,

especificamente no sistema cardiovascular em modelos experimentais de isquemia -

reperfusão cardíaca, em que há excesso de radicais livres e sobrecarga de Ca2+

, substâncias

que atuem nestas desordens são de grande relevância, pois podem ser potencialmente

utilizadas terapeuticamente na prevenção das lesões de reperfusão cardíaca.

2.5 Diosmina

A diosmina (3',5,7-tri-hidroxi-4'-metoxiflavona-7-ramnoglucosídeo) (Figura 7) é um

flavonoide encontrado em frutas cítricas. Foi isolada pela primeira vez em 1925, a partir da

Scrophularia nodosa. Em 1969, foi utilizada pela primeira vez como agente terapêutico

(COVA, 1992).

Figura 7 – Ilustração da estrutura molecular da diosmina (SILAMBARASAN & RAJA ,2012).

Investigações farmacocinéticas têm demonstrado que a diosmina é rapidamente

transformada pela flora intestinal em sua forma aglicona, diosmetin. Diosmetin é absorvida e

rapidamente distribuída por todo o corpo, com tempo de meia-vida de 26-43 horas. Diosmetin

é degradada em ácidos fenólicos ou em derivados de glicina conjugado, que são eliminados

através da urina (LYSENG-WILLIAMSON & PERRY, 2003).

A diosmina é utilizada, por ser um agente protetor vascular, para o tratamento de

insuficiência venosa crônica, linfodema e varizes (JANTET, 2002; PECKING et al., 1997).

Como um flavonoide, a diosmina também exibe propriedades anti-inflamatórias, antioxidante,

entre outras (KILICOGLU et al., 2012; TONG et al., 2012) .

Silambarasan e Raja (2012) avaliaram o efeito anti - hipertensivo da diosmina e

constataram que esse flavonoide foi capaz de reduzir a pressão arterial sistólica e diastólica, e

o grau de peroxidação lipídica no plasma e tecidos (fígado, rim, coração e aorta).

15

Em outro estudo, foram avaliados os efeitos anti-hiperlipidêmicos em miocárdio de

ratos infartados induzidos com isoproterenol. O pré-tratamento com diosmina minimizou as

alterações eletrocardiográficas e diminuiu o grau de peroxidação lipídica (QUEENTHY &

JOHN, 2013).

Um recente trabalho demonstrou o efeito benéfico no perfil oxidativo do coração de

animais tratados com diosmina e submetidos à isquemia e reperfusão tecidual

(SENTHAMIZHSELVAN et al., 2014), prevenindo, desta forma, os danos cardíacos. Esses

resultados aqui citados evidenciam que a diosmina possui potencial para tratar patologias em

que há alterações cardíacas e estresse oxidativo. Alterações estas, que ocorrem no infarto

agudo do miocárdio, objeto do presente estudo.

Apesar de Senthamizhselvan et al. (2014) demonstrarem o papel preventivo da

diosmina no coração submetido à isquemia e reperfusão, não é conhecido se essa substância é

capaz de melhorar as lesões que são geradas no coração após a isquemia. Sabe-se que os

primeiros minutos de reperfusão são cruciais para o desenvolvimento das lesões, assim,

propusemos verificar a hipótese de que a diosmina possa contribuir para a prevenção do

surgimento das lesões de reperfusão em coração de ratos pós-isquêmicos.

16

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar os efeitos da diosmina na prevenção das lesões de reperfusão cardíaca em

ratos Wistar.

3.2 Específicos

Verificar o efeito antioxidante da diosmina em tecido cardíaco pós-isquêmico.

Avaliar o possível efeito antiarrítmico da diosmina em coração pós-isquêmico.

Analisar se a diosmina atenua a morte celular em coração pós-isquêmico.

17

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar, pesando entre 250 e 300 g, provenientes do Biotério

Central da Universidade Federal de Sergipe (UFS) e do Biotério do Laboratório de Biofísica

do Coração da UFS. Os animais tiveram livre acesso à alimentação e água, foram submetidos

a ciclos claro/escuro de 12/12 horas, em temperatura controlada (23 ± 3ºC). Durante a

execução dos experimentos foram obedecidas as normas de manipulação dos animais

propostas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) com o

número de protocolo 04/2013 (ANEXO 1).

4.2 Grupos Experimentais

Para determinar a dose da diosmina a ser utilizada no modelo experimental de

isquemia-reperfusão cardíaca, foi analisado o efeito contrátil desse flavonoide. Para isso,

foram utilizados corações isolados de ratos (n = 4). Esses, após a canulação e estabilização no

sistema de perfusão do tipo Langendorff pressão constante, foram perfundidos com solução

de Krebs-Ringer em concentrações crescentes de diosmina (0,1 µmol/L – 10 µmol/L) por um

período de 15 minutos (Figura 8).

Figura 8 - Representação esquemática do protocolo de perfusão com diosmina em concentrações

crescentes.

Para os experimentos de isquemia-reperfusão, os animais utilizados foram divididos

em 4 grupos experimentais (Figura 9):

18

Grupo 01 - Sham: Após um período de estabilização (20 minutos), os corações foram

perfundidos por mais 100 minutos com solução veículo (solução de Krebs-Ringer acrescida

de dimetilsulfóxido - DMSO 0,02%).

Grupo 02 - I-R + Veículo: Após um período de estabilização os corações foram

perfundidos por 10 minutos com solução veículo, seguido por um período de 30 minutos de

isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de reperfusão com a mesma solução.

Grupo 03 - I-R + Diosmina: Após um período de estabilização, os corações foram

perfundidos por 10 minutos com solução veículo, seguido por um período de 30 minutos de

isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de reperfusão com solução de diosmina (Krebs-

Ringer + diosmina 0,1 µmol/L diluída em DMSO 0,02%).

Grupo 04 - I-R + NAC: Após um período de estabilização, os corações foram

perfundidos por um período de 10 minutos com solução veículo, seguido por um período de

30 minutos de isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de reperfusão com o controle

positivo NAC (N- acetilcisteína 24 µmol/L em solução de Krebs- Ringer).

Figura 9 – Esquema representativo das etapas realizadas nos grupos experimentais.

4.3 Modelo de Isquemia-Reperfusão Cardíaca

Os animais foram decapitados após 10-15 minutos da injeção intraperitoneal de 400UI

de heparina. O tórax foi aberto e o coração cuidadosamente removido e perfundido no sistema

de perfusão do tipo Langendorff de pressão constante (Figura 10). O fluido de perfusão

utilizado foi à solução de Krebs-Ringer contendo (em mmol/L): 118,4 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 de

KH2PO4, 1,2 MgSO4. 7H2O, 2,5 CaCl2. 2H2O, 11,7 glicose e 26,5 NaHCO3. Esta solução foi

mantida a 37°C, com pressão de 65 mmHg, pH 7,4 e oxigenação (5% de O2 e 95% de CO2)

constantes. Foi aguardado um período de estabilização de 20 minutos com solução Krebs-

19

Ringer, seguido de um período de perfusão de 10 minutos com solução veículo. Foi realizada

isquemia global por 30 minutos pela interrupção da disponibilização da solução nutritiva e da

oxigenação. Após este período, o fluxo foi restabelecido e mantido por um período de 60

minutos (BELL; MOCONU; YELLON, 2011).

Figura 10 - Ilustração do sistema de perfusão do tipo Langendorff pressão, adaptada de Skrzypiec-Spring et al.

(2007). VL: ventrículo esquerdo; O2: oxigênio; CO2: gás carbônico.

4.4 Avaliação da Pressão Intraventricular Esquerda

A avaliação da pressão intraventricular esquerda (PVE) foi determinada em coração

isolado de rato, por meio de um balonete insuflado com água até uma pressão de 15 cmHg. O

balonete foi introduzido no ventrículo esquerdo do coração através da abertura oriunda da

remoção do átrio esquerdo. Este sistema estava acoplado a um transdutor de pressão (HP

1290A), cujos sinais foram amplificados (HP 7754A), digitalizados (DATAQ DI 710,

WINDAQ PRO Acquision) e gravados em computador. Todo o sistema hidráulico usado para

determinar a pressão intraventricular foi preenchido com água destilada e calibrado com uma

coluna de mercúrio

4.5 Avaliação do Índice de Severidade da Arritmia

As arritmias cardíacas foram avaliadas como a presença de taquicardia e/ou fibrilação

ventricular nos primeiros 30 minutos de reperfusão. Para obter uma medida quantitativa, as

arritmias foram classificadas arbitrariamente por sua duração. A ocorrência de arritmias

20

cardíacas de até 3 minutos foi classificada com o fator 2; 3 - 6 minutos foi classificada com

fator 4; 6 - 10 minutos foi classificada com fator 6; 10-15 minutos foi classificada com o fator

8; 15 - 20 minutos foi classificada com o fator 10; 20 - 25 minutos foi classificada com o fator

11; e de 25 - 30 minutos classificada com o fator 12. Entretanto, se maior ou igual há 30

minutos foi considerada uma arritmia irreversível (FERREIRA; SANTOS; ALMEIDA,

2001a).

4.6 Análises da Lesão Tecidual

4.6.1 Marcação da Área de Infarte

Para avaliação macroscópica do tamanho do infarto, os corações foram tratados com

cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). Para isso, os corações foram seccionados (± 2 mm) em

criostato e os cortes obtidos foram incubados em solução de TTC 1% (diluído em solução de

Krebs-Ringer) durante 10 minutos. Após esse período, os cortes foram mergulhados em

solução de formalina tamponada por 30 minutos, para a remoção do excesso da coloração. Em

seguida, os tecidos foram digitalizados em um scanner (EPSON TX 105) e as imagens obtidas

foram analisadas com o software ImageJ 1.38x (NIH) (BELL; MOCANU; YELLON, 2011) .

4.6.2 Determinação da Atividade da Enzima Creatina Quinase Total

A atividade da creatina quinase total (CK) foi determinada no perfusato, obtido nos

períodos da estabilização do coração e reperfusão, utilizando-se o kit comercial (VIDA

biotecnologia). Foi utilizado o método cinético, de acordo com as instruções do fabricante.

4.6.3 Avaliação da Atividade da Enzima Lactato Desidrogenase

A determinação da atividade da lactato desidrogenase (LDH) foi realizada em

perfusato, obtido nos períodos da estabilização do coração e reperfusão. Foi utilizado o

método cinético, de acordo com as instruções do fabricante (Labteste).

21

4.7 Avaliações dos Parâmetros Antioxidantes

4.7.1 Determinação do Grau de Peroxidação Lipídica

As mensurações dos produtos de peroxidação lipídica foram feitas de acordo com

Bose et al.(1989). Resumidamente, as amostras foram pesadas e homogeneizadas em 10 vezes

o volume de solução de tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,4), contendo butil-hidroxitoluol

(BHT; 12,6 mmol/L). Em seguida, 200 µL do homogenato foram incubados a 90ºC por 45

minutos com solução contendo ácido tiobarbitúrico (TBA 0,37%), em meio ácido (15% de

ácido tricloroacético- TCA e 0,25 N de ácido clorídrico). As amostras, em seguida, foram

centrifugadas por 5 minutos a 14.000 rpm. Ao sobrenadante, acrescentou-se n-butanol e

solução saturada de NaCl. A mistura foi agitada em vórtex por 30 segundos e novamente

centrifugada a 14.000 rpm (Heal Force, Neofuge 15R) por 2 minutos. Alíquotas do

sobrenadante foram pipetadas em placas de 96 poços para a leitura de absorbância em leitor

de microplaca (Biotek, ELx800 Absorbance Microplate Reader) a 535 nm, corrigindo pelos

valores de absorbância a 572 nm. A quantidade de MDA produzida foi expressa em

nanomoles por gramas de tecido, e foi interpretada como marcador de peroxidação lipídica

formado pela reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS).

4.7.2 Mensuração de Hidroperóxidos Totais

A quantificação dos hidroperóxidos totais foi realizada de acordo com Jiang et al.

(1992). O método se baseia basicamente na oxidação de íons ferroso (Fe2+

) a íons férricos

(Fe3+

) em condições ácidas, pelos hidroperóxidos lipídicos. O indicador utilizado é o xilenol

orange que reage com os íons Fe 3+

produzindo um cromóforo azul-arroxeado, o qual pode ser

medido espectrofotometricamente a 560 nm. O ensaio foi realizado em reagente de FOX, o

qual é composto por xilenol orange (0,25 mmol/L), sulfato ferroso amoniacal (Fe

(NH4)2(SO4)2.6H2O, 0,25 mmol/L), hidroxitolueno butilado (BHT, 4,4 mmol/L), metanol

(CH4O) e ácido sulfúrico (H2SO4, 97%). Em um microtubo foi adicionado reagente de FOX

ao homogenato. Após 30 minutos, a amostra foi centrifugada e o sobrenadante colocado em

microplaca. A quantificação dos hidroperóxidos foi expressa em mol/L, foi utilizado o

coeficiente de extinção molar 4,3 x 10-4

M-1

cm-1.

22

4.7.3 Determinação da Atividade da Enzima Superóxido Dismutase

A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi mensurada através da formação de

O2•-

pela auto-oxidação do pirogalol e a inibição da redução do sal de tetrazolium (MTT)

segundo Madesh e Balasubramanian (1998). Resumidamente, o tecido foi homogeneizado em

tampão fosfato (PBS 50 mmol/L, pH 7,4), centrifugado a 12000 rpm (Heal Force, Neofuge

15R) por 30 minutos. A reação foi realizada pipetando em placa de Elisa: o sobrenadante

obtido, PBS, MTT (1,25 mmol/L) e pirogalol (100 µmol/L). A microplaca foi agitada por 5

minutos e logo após acrescentou-se DMSO. A leitura foi realizada em leitor de microplaca

(Biotek, ELx800 Absorbance Microplate Reader) a 570 nm. A atividade da SOD foi expressa

em unidade de SOD por miligrama de proteína.

4.7.4 Determinação da Atividade da Enzima Catalase

O ensaio da atividade da catalase (CAT) foi realizado conforme o método descrito por

Nelson e Kiesow (1972) e adaptado por Gioda et al. (2010). Resumidamente, as amostras

foram homogeneizadas em PBS e em seguida os homogenatos foram centrifugados (Heal

Force, Neofuge 15R) a 12000 rpm por 30 minutos a 4 °C. Em cubeta de quartzo foi pipetado

tampão fosfato (50 mmol/L, pH 7,0) e o homogeneizado. A reação foi iniciada com a adição

de H2O2 (0,3 mol/L). As medidas foram realizadas em espectrofotômetro (Hitachi, Japão), em

intervalos de 15 segundos, a 25°C, no comprimento de onde de 240 nm. A atividade da

enzima foi expressa pela diferença da variação das absorbâncias (ΔE) /minuto/miligrama de

proteínas.

4.7.5 Avaliação da Atividade da Enzima Glutationa Peroxidase

A atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) foi determinada de acordo com o

método descrito por Paglia e Valentine (1967). Em suma, as amostras foram pesadas e

homogeneizadas em tampão fosfato de sódio (50 mmol/L), acrescido de KCl (140 mmol/L),

pH 7,4 (1:10, p/v). Em seguida, os homogenatos foram centrifugados (Heal Force, Neofuge

15R) a 12000 rpm por 30 minutos a 4°C e o sobrenadante separado para o ensaio. Na

microplaca foi colocado tampão fosfato (100 mmol/L, pH 7,0), NADPH (8,4 µmol/L), GR

(10 U/mg de proteína/mL), azida sódica (NaN3, 1,125 mol/L), GSH (0,15 mmol/L), H2O2 (2,2

mmol/L) e a amostra. O monitoramento foi feito a 340 nm, 25ºC, por 8 minutos. A atividade

23

da Gpx foi avaliada pela oxidação do NADPH. Os resultados foram expressos em

nanomol/NADPH/minuto/miligrama de proteínas.

4.7.6 Avaliação da Atividade da Enzima Glutationa Redutase

A atividade da enzima glutationa redutase (GR) foi determinada de acordo com o

método de Mannervik e Carlberg (1985), no qual a atividade da redutase é proporcional ao

consumo de NADPH monitorado a 340 nm. Em síntese, a amostra foi homogeneizada em

tampão fosfato (0,2 mol/L, pH 7,5) contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, 6,3

mmol/L), acrescido de Leupeptina (5 mg/mL) e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, 100

mmol/L). O homogenato foi centrifugado por 30 minutos a 12.000 rpm (Heal Force, Neofuge

15R), a 4ºC. Para o ensaio, ao homogenato foram adicionados solução de albumina (0,5

mg/mL de tampão) e GSSH (10 mmol/L). A reação foi iniciada com a adição de NADPH (1,2

mg/mL). O monitoramento foi feito a 340 nm, 37ºC, por 8 minutos. O resultado foi expresso

em miliunidade de GR/minuto/ miligrama de proteínas.

4.8 Determinação da Expressão Proteica da Caspase - 3 por Western Blot

As amostras foram diluídas em tampão da amostra (Tris HCl/SDS pH = 6,8, 3%

Glycerol, 1% SDS, 0,6% β-mercaptoetanol e 0,1% Azul de Bromofenol) e aquecidas à 98°C

por 5 minutos. Para separação, foram aplicados 60 µg de proteínas em gel de SDS-PAGE (do

inglês “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”) a 7,5% ou 10%.

Após serem separadas no gel de poliacrilamida, as proteínas foi transferida para uma

membrana de nitrocelulose (Millipore®, USA) com poros de 0,44 μm. A qualidade da

transferência foi monitorada através da coloração da membrana com solução de Ponceau

0,3%. A membrana foi então lavada em solução salina tamponada com Tris-Base acrescido

com 0,05% de Tween 20% (TBS-T) e colocada por 1 a 2 horas em solução de bloqueio (4%

de albumina em TBS-T). Após o bloqueio, a membrana foi incubada em temperatura de 6-

8ºC, com o anticorpo primário específico diluído em 1% de albumina em TBS-T, overnight.

Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: anti-caspase-3 (1:5000; policlonal

feito em coelho; Santa Cruz Biotechnology Inc) e anti-GAPDH (1:10000; policlonal feito em

camundongo; Sigma). Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBS-T durante 5

minutos e incubada por 2 horas com anticorpos secundários específicos conjugados à

peroxidase (1:2000 - Sigma). Após o período de incubação, a membrana foi novamente

24

lavada por mais três vezes em TBS-T durante 5 minutos. As bandas proteicas foram

detectadas por uma reação de quimioluminescência (Luminata strong™ - Western HRP

substrate, Merck-Millipore, Darmstad, Germany) e a intensidade das mesmas foi avaliada por

análise densitométrica através do software ImageJ 1.38x (NIH).

Para estes experimentos foram utilizados o sistema Mini Protean III Tetracell e Mini

Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BIORAD®).

4.9 Determinação da Concentração Total de Proteínas

A concentração total de proteínas foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951).

Resumidamente, às amostras foi adicionado NaOH 0,5 mol/L, e após 15 minutos

acrescentado 2% Na2CO3, 1% CuSO4 e 2% KNaC4H4O6.4H2O (100:1:1). Ao final foi

adicionado o reagente de Folin e após 30 minutos foi realizada a leitura a 630 nm em

espectrofotômetro de placa (ELx800, BIOTEK Instruments®). Uma curva padrão de

albumina bovina (Sigma-Aldrich®) foi construída para comparação.

4.10 Análises Estatísticas

Para tratamento estatístico, os resultados obtidos foram analisados em software Prism

5.1 (GraphPad). Os dados experimentais foram expressos com média ± erro padrão da média

(E.P.M.). Para a comparação múltipla dos dados paramétricos foi utilizado análise de

variância (ANOVA) de uma via e o grau de significância entre os grupos foi determinado pelo

pós-teste de Bonferroni. Para efeito estatístico, foram considerados significativos os valores

que apresentaram p < 0,01.

5. RESULTADOS

5.1 Efeito da Diosmina na Pressão Intraventricular Esquerda

Inicialmente avaliamos os efeitos da diosmina sobre a PVE (Figura 11). Para isso,

foram testadas as concentrações de 0,1 µmol/L, 1 µmol/L e 10 µmol/L dessa substância em

miocárdio de ratos.

A diosmina, nas concentrações de 1 µmol/L e 10 µmol/L, desencadeou elevação da

PVE (3,2 ± 0,3 cmHg, n = 4; 2,4 ± 0,2 cmHg, n = 4) ( p< 0,01) em relação ao período de

25

estabilização (1,20 ± 0,09 cmHg, n = 4). Em contrapartida, a concentração de 0,1 µmol/L

(Figura 14B) não apresentou tal resposta (1,3 ± 0,1 cmHg, n = 4).

Para avaliar o papel antioxidante da diosmina nos corações pós-isquêmicos, objetivo

principal do presente trabalho, buscamos analisar o efeito de uma concentração desta droga

que não interferisse na PVE. Então, a concentração de 0,1 µmol/L, por não ter promovido esta

alteração, foi escolhida para darmos continuidade ao presente estudo.

Figura 11 - Efeito da diosmina na pressão intraventricular esquerda (PVE) em corações isolados de ratos.

PVE desenvolvida nos corações nos períodos de estabilização (n= 4) e perfusão com diosmina nas concentrações

de 0,1, 1 e 10 µmol/L (n= 4). Os valores foram representados como média ± E.P.M. e expressos em centímetros

de mercúrio (cmHg) *** p< 0,01 ou *p< 0,01 vs Estabilização; ### p< 0,01 ou #p< 0,01 vs Diosmina 0,1

µmol/L (ANOVA de uma via seguida do pós-teste de Bonferroni).

Assim, posteriormente avaliamos o efeito da diosmina na concentração de 0,1 µmol/L

na PVE em miocárdios que sofreram isquemia-reperfusão (Figura 12). Foi observado que

houve uma redução (p< 0,01) da PVE dos corações do grupo I-R + Veículo (0,19 ± 0,04

cmHg, n= 4) em relação aos corações do grupo Sham ( 0,97 ± 0,18 cmHg, n= 4).

Nos corações reperfundidos com a diosmina, houve um aumento desta medida (1,06 ±

0,03 cmHg, n= 3, p< 0,01) em relação aos corações do grupo I-R + Veículo (0,19 ± 0,04

cmHg, n= 4), sendo que este aumento se aproximou aos valores basais de PVE dos corações

do grupo Sham (0,97 ± 0,18 cmHg, n= 4). Assim como ocorreu com o grupo I-R + Diosmina,

quando os corações foram reperfundido com o controle positivo houve um aumento da PVE

(1,00 ± 0,03 cmHg, n= 4, p< 0,01) em relação aos corações que foram reperfundidos com o

veículo (0,19 ± 0,04 cmHg, n= 4). Porém, não houve diferença significativa entre os corações

do grupo I-R + Diosmina e o grupo I-R + NAC.

26

Figura 12 - Efeito da diosmina na pressão intraventricular esquerda (PVE) em corações isolados de ratos

submetidos á isquemia-reperfusão. PVE desenvolvida nos corações dos grupos Sham (n= 4), I-R + Veículo

(n= 4), I-R + Diosmina (n= 3), I-R + NAC (n= 3). Os valores foram representados como média ± E.P. M e

expressos em centímetros de mercúrio (cmHg). ***p< 0,01 vs Sham; ### p< 0,01 ou #p< 0,01 vs I-R + Veículo

(ANOVA de uma via seguida do pós-teste de Bonferroni).

5.2 Efeito da Diosmina nas Arritmias de Reperfusão

A fim de analisarmos também as alterações contráteis existentes durante á reperfusão,

mensuramos á presença de arritmias, através do ASI, durante os primeiros 30 minutos de

reperfusão. Foi evidenciado que o grupo I-R + Veículo apresentou um índice de 9,6 ± 0,9

(n= 6). O grupo I-R + Diosmina teve a medida do ASI reduzida (3,3 ± 0,9, n= 6, p< 0,01) em

relação ao grupo I-R + Veículo. Assim como o grupo I-R + Diosmina, o grupo I-R + NAC

também apresentou baixos índices de ASI (3,7 ± 0,6, n= 7, p< 0,01) quando comparado com o

grupo I-R + Veículo. Porém, não houve diferença estatística entre os grupos I-R + Diosmina e

I-R + NAC (Figura 13).

27

Figura 13 - Efeito da diosmina nas arritmias em corações isolados de ratos induzidas pela isquemia-

reperfusão. As arritmias de reperfusão foram quantificadas durante os primeiros 30’ de reperfusão, através do

índice de severidade de arritmia (ASI) nos grupos I-R + Veículo (n= 6), I-R + Diosmina (n= 6) e I-R + NAC

(n= 7). Os valores foram representados como média ± E.P. M e expressos em unidade arbitrária (u.a). ###p<

0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

5.3 Efeito da Diosmina na Limitação da Área de Infarto

Na figura 14A podemos observar a área de lesão do infarto nos corações dos grupos

estudados. Estas regiões lesadas foram quantificadas e apresentadas na figura 14B. Nos

resultados obtidos podemos verificar que o grupo Sham não apresentou área isquêmica

(0,0 ± 0,0, n= 4).

Entretanto, no grupo I-R + Veículo os corações apresentaram uma área isquêmica

(21,5 ± 3,6, n= 4, p< 0,01). Porém, ao reperfundir os corações isquêmicos com diosmina ou

NAC a área lesionada foi reduzida (6,9 ± 0,8 % e 6,3 ± 1,1% respectivamente, n= 4; n= 5,

p< 0,01). A redução da área isquêmica observada no grupo I-R + Diosmina não foi diferente

do grupo I-R + NAC.

28

A

B

Figura 14 - Efeito da diosmina na limitação da área de infarto em corações isolados submetidos à

isquemia-reperfusão. Painel A: Imagem representativa da área de infarto nos grupos experimentais estudados.

Sham (n= 4), I-R + Veículo (n= 4), I-R + Diosmina (n= 4) e I-R + NAC (n= 5). Painel B: Percentual da área de

infarto dos grupos estudados representado como média ± E.P.M. ***p< 0,01 vs Sham; ###p< 0,01 vs I-R +

Veículo (ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

29

5.4 Efeito da Diosmina na Atividade da Enzima Creatina Quinase Total

Avaliamos, no perfusato, a atividade da enzima CK Total. Esta enzima consiste em

uma macromolécula intracelular encontrada no miocárdio, que extravasa das células

miocárdicas devido à lesão da membrana sarcolemal (LOZOVOY; PRIESNITZ; SILVA,

2008).

Nos corações não submetidos à isquemia-reperfusão, a atividade desta enzima foi de

55,9 ± 6,4 U/L (n= 12). Já os corações submetidos à isquemia e reperfundidos com o veículo,

tiveram a atividade da CK elevada (141,5 ± 10,1 U/L, n= 9, p< 0,01) em relação aos corações

não isquêmicos.

Em contrapartida, nos corações do grupo I-R + Diosmina observamos que a atividade

desta enzima estava reduzida (77,9 ± 5,2 U/L, n= 9, p< 0,01) quando comparada aos corações

do grupo I-R + Veículo. Os corações reperfundidos com NAC também tiveram a atividade da

CK total (56,1 ± 6,6 U/L, n= 8, p< 0,01) reduzida em relação aos reperfundidos com veículo.

Contudo, essa redução não foi significativa em relação aos corações reperfundidos com

diosmina (Figura 15).

Figura 15 - Efeito da diosmina na atividade da creatina quinase (CK) em corações isolados de ratos

submetidos á isquemia-reperfusão. A atividade da CK foi observada nos grupos Sham (n= 12), I-R + Veículo

(n= 9), I-R + Diosmina (n= 9) e I-R + NAC (n= 8). Os valores foram representados como média ± E.P.M e

expressos em unidade por litro (U/L). ***p< 0,01 vs Sham; ###p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via

seguida do pós-teste de Bonferroni).

30

5.5 Efeito da Diosmina na Atividade da Enzima Lactato Desidrogenase

Também avaliamos a atividade da enzima LDH no perfusato. Assim como a CK, esta

enzima consiste em um dos marcadores que definem a possibilidade de IAM.

A atividade da LDH mostrou-se elevada (p< 0,01) nos corações reperfundidos com

veículo (29,7 ± 2,0 U/L, n= 11) em comparação ao grupo Sham (10,5 ± 1,2 U/L, n= 10)

evidenciando, desta forma, que os corações sofreram lesão tecidual. No grupo I-R + Diosmina

a atividade da LDH reduziu (14,4 ± 2,6 U/L, n= 7, p< 0,01) em relação ao grupo I-R +

Veículo (29,7 ± 2,0 U/L, n= 11). Além disso, nos corações reperfundidos com NAC a

atividade desta enzima, também, se mostrou reduzida (10,9 ± 3,2 U/L, n= 7, p< 0,01).

Contudo, a redução da atividade da LDH no grupo controle positivo não foi diferente do

grupo diosmina (Figura 16).

Figura 16 - Efeito da diosmina na atividade da lactato desidrogenase (LDH) em corações isolados de ratos

submetidos á isquemia-reperfusão. A atividade da LDH foi analisada nos grupos Sham (n= 10), I-R + Veículo


expressos em unidade por litro (U/L). ***p< 0,01 vs Sham; ###p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via

seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

5.6 Efeito da Diosmina no Grau de Peroxidação Lipídica

Na perspectiva de analisarmos o efeito da diosmina sobre o dano causado nas

membranas celulares pela alta concentração de ROS e RNS, investigamos a formação do

produto indireto da peroxidação lipídica, o MDA, nos grupos experimentais estudados. Foi

observado que no grupo I-R + Veículo houve aumento (9,1 ± 0,8 nmol de MDA/mg de tecido,

31

n= 13, p< 0,01) da medida de TBARS quando comparado ao grupo Sham (3,0 ± 0,5 nmol de

MDA/mg de tecido, n= 10). No grupo I-R + Diosmina verificamos uma redução na

concentração de MDA (5,4 ± 0,5 nmol de MDA/mg de tecido, n= 11, p< 0,01) em relação ao

grupo I-R + Veículo.

O grupo I-R + NAC apresentou baixo grau de peroxidação lipídica (2,8 ± 0,5 nmol de

MDA/mg de tecido, n= 7, p< 0,01) quando comparado ao grupo I-R + Veículo. Todavia, não

houve diferença significativa na concentração de TBARS entre os grupos I-R + Diosmina e

I-R + NAC (Figura 17).

Figura 17 - Efeito da diosmina no grau de peroxidação lipídica em corações isolados de ratos submetidos à

isquemia-reperfusão. Foram mensuradas as concentrações de malondealdeído (MDA) nos grupos Sham

(n= 10), I-R + Veículo (n= 13), I-R + Diosmina (n= 11) e I-R + NAC (n= 7). Os valores foram representados

como média ± E.P.M. e expressos em nanomoles de MDA por grama de tecido (nmol de MDA/ g de tecido). ***

p< 0,01 vs Sham; ##p< 0,01 ou ###p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de

Bonferroni).

5.7 Efeito da Diosmina na Concentração de Hidroperóxidos Totais

Ainda avaliando os danos ocasionados nas membranas celulares durante a isquemia-

reperfusão cardíaca, mensuramos os hidroperóxidos totais nos quatro grupos estudados. A

medida de hidroperóxidos totais no grupo Sham foi de 4,90 x 10-6

±0, 93 x 10-6

mol/L (n= 13,

p< 0,05). O grupo I-R + Veículo apresentou um aumento nesta medida (9,5 x10-6

± 2,5 x 10-7

mol/L, n = 7, p< 0,01) em relação ao grupo Sham. O grupo I-R + Diosmina apresentou

quantidades reduzidas de hidroperóxidos (3,40 x 10-6

± 0, 69 x 10-6

mol/L, n= 11, p< 0,01) em

relação ao grupo I-R + Veículo. Quanto ao grupo I-R + NAC ocorreu, também, redução

destes compostos (1,90 x 10-6

± 0,38 x10-6

mol/ L, n= 8, p< 0,01) em relação ao grupo I-R +

32

Veículo. Em contrapartida, não houve diferença estatística entre os grupos I-R + NAC e I-R +

Diosmina (Figura 18).

Figura 18 - Efeito da diosmina na concentração de hidroperóxidos em corações isolados de ratos

submetidos à isquemia-reperfusão. Os hidroperóxidos totais foram mensurados nos grupos Sham (n= 13),

I-R+ Veículo (n= 7), I-R + Diosmina (n= 11) e I-R + NAC (n= 8). Os valores foram representados como média ±

E.P. M e expressos em moles por litro (mol/L). **

p< 0,01 vs Sham; ###p < 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de

uma via seguida do pós-teste de Bonferroni).

5.8 Efeito da Diosmina na Atividade da Enzima Superóxido Dismutase

Com o intuito de avaliarmos a atividade das enzimas antioxidantes no modelo de

isquemia-reperfusão cardíaca foi observada a atividade da SOD nos corações estudados.

Ocorreu aumento da atividade desta enzima no grupo I-R+ Veículo (2,0 ± 0,2 U/mg de

proteína, n= 6, p< 0,01) em relação ao grupo Sham (0,3 ± 0,1 U/ mg de proteína, n= 9).

Quando reperfundidos com diosmina a atividade desta enzima foi reduzida (0,2 ± 0,1 U/ mg

de proteína, n= 8, p< 0,01). Além disso, o grupo reperfundido com NAC também apresentou

uma diminuição da atividade da SOD (0,10 ± 0,03 U/ mg de proteína, n= 9, p< 0,01) em

relação ao grupo I-R + Veículo . Mas, não houve diferença entre os corações reperfundidos

com a diosmina e os reperfundidos com o NAC (Figura 19).

33

Figura 19 - Efeito da diosmina na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em corações isolados

de ratos submetidos à isquemia-reperfusão. A atividade da SOD foi mensurada nos grupos Sham (n= 9), I-R

+ Veículo (n= 6), I-R + Diosmina (n= 8) e I-R + NAC (n= 9). Os valores foram representados média ± E.P. M e

expressos em unidade de SOD por miligrama de proteína (U/mg de proteína). ***p< 0,01 vs Sham; ###p< 0,01

vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

5.9 Efeito da Diosmina na Atividade da Enzima Catalase

Analisamos, também, atividade da CAT nos grupos experimentais estudados e

observamos um aumento (p< 0,01) na atividade desta enzima no grupo I-R + Veículo (0,20 ±

0,01 ΔE/min/mg de proteína, n= 8) em relação ao grupo Sham (0,020 ± 0,005 ΔE/min/mg de

proteína, n= 10). Entretanto, o grupo I-R+ Diosmina e o grupo I-R + NAC apresentaram a

atividade da CAT reduzida (0,020 ± 0,004 ΔE/min/mg de proteína, n= 9 e 0,04 ± 0,01

ΔE/min/mg de proteína, n= 7, p< 0,01, respectivamente) em relação ao grupo I-R + Veículo.

O grupo I-R + Diosmina não apresentou diferença significativa em relação ao grupo I-R +

NAC (Figura 20).

34

Figura 20 - Efeito da diosmina na atividade da catalase (CAT) em corações isolados de ratos submetidos à

isquemia-reperfusão. A atividade da CAT foi mensurada nos grupos Sham (n= 10), I-R + Veículo (n= 8), I-R +

Diosmina (n= 9) e I-R + NAC (n= 7). Os valores foram representados como média ± E.P. M e expressos pela

diferença de absorbância por minuto, por miligrama de proteína (ΔE/min/mg de proteína). ***p< 0,01 vs Sham;

###p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

5.10 Efeito da Diosmina na Atividade da Enzima Glutationa Peroxidase

A enzima antioxidante GPx foi avaliada e pudemos verificar um aumento (p< 0,01) da

atividade desta enzima no grupo I-R + Veículo (0,20 ± 0,02 nmol de NADPH/min/mg de

proteína, n= 5) quando comparada com a do grupo Sham (0,05 ± 0,01 nmol de

NADPH/min/mg de proteína, n= 5). Porém, ao avaliarmos a atividade enzimática da GPx no

grupo I-R + Diosmina foi evidenciada uma redução (0,020 ± 0,009 nmol de NADPH/ min/mg

de proteína, n= 6, p< 0,01) quando comparada com a atividade desta enzima no grupo I-R +

Veículo. No grupo controle positivo foi observado, também, que a atividade da GPx estava

reduzida (0,030 ± 0,008 nmol de NADPH/min/mg de proteína, n= 7, p< 0,01) em relação ao

grupo I-R + Veículo. Entretanto, a atividade da GPx no grupo NAC não apresentou diferença

em relação a do grupo diosmina (Figura 21).

35

Figura 21 - Efeito da diosmina na atividade da glutationa peroxidase (GPx) em corações isolados de ratos

submetidos à isquemia-reperfusão. A atividade da GPx foi avaliada nos corações dos grupos Sham (n= 5), I-R

+ Veículo (n= 5), I-R + Diosmina (n= 6) e I-R + NAC (n= 7). Os valores foram representados média ± E.P. M e

expressos em nanomoles de NADPH por minuto, por miligrama de proteína (nmol NADPH/min/mg proteína).

***p< 0,01 vs Sham; ###p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida do pós-teste de Bonferroni).

5.11 Efeito da Diosmina na Atividade da Enzima Glutationa Redutase

No grupo Sham, a atividade da GR foi de 0,030 ± 0,007 nmol de NADPH/min/mg de

proteína (n= 9). Os corações reperfundidos com o veículo apresentaram a atividade elevada

desta enzima (0,20 ± 0,02 nmol de NADPH/min/mg de proteína, n= 9, p< 0,01) em relação ao

grupo Sham. Porém, nos corações reperfundios com a diosmina a atividade desta enzima

reduziu (0,040 ± 0,007 nmol de NADPH/min/mg de proteína, n= 9, p< 0,01) em relação ao

grupo I-R + Veículo. A atividade da GR mensurada nos corações reperfundidos com o NAC,

também se mostrou reduzida (0,010 ± 0,005 nmol de NADPH/min/mg de proteína, n= 7,

p< 0,01). Todavia, esta enzima manteve sua atividade semelhante nos corações reperfundidos

tanto com a diosmina quanto com o NAC (Figura 22).

36

Figura 22 - Efeito da diosmina na atividade da glutationa redutase (GR) em corações isolados de ratos

submetidos à isquemia-reperfusão. A atividade da GR foi mensurada nos grupos Sham (n= 9), I-R +Veículo


expressos em miliunidade de GR por minuto ,por miligramas de proteína ( mU/min/mg proteína). ***p< 0,01 vs

Sham; ###p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Bonferroni).

5.12 Efeito da Diosmina na Expressão Proteica de Caspase-3

Na figura 23A podemos observar a expressão proteica de caspase-3 nos corações dos

grupos experimentais avaliados. Observamos um aumento na expressão proteica de caspase-3

nos corações reperfundidos com veículo (3,5 ± 0,6, n= 4). Porém, essa expressão foi reduzida

(p< 0,01) nos corações reperfundidos com diosmina (1,7 ± 0,2, n= 4). O mesmo foi observado

nos corações reperfundidos com NAC (1,1 ± 0,1, n= 5). Todavia, a redução da expressão de

caspase-3 não se mostrou diferente entre os grupos I-R + Diosmina e I-R + NAC (Figura

23B).

37

A

B

Figura 23 - Efeito da diosmina na expressão da caspase-3 em corações isolados de ratos submetidos à

isquemia-reperfusão. Painel A: Imagem representativa da expressão de caspase-3 nos grupos experimentais

estudados. I-R + Veículo (n= 4), I-R + Diosmina (n= 4) e I-R + NAC (n= 5). Painel B: Expressão de caspase-3

nos grupos experimentais. Os valores foram representados em unidade arbitrária (u.a) e representam a média ±

E.P.M. #p< 0,01 ou ##p< 0,01 vs I-R + Veículo (ANOVA de uma via seguida do pós-teste de Bonferroni).

38

6 DISCUSSÃO

A doença cardíaca isquêmica secundária ou IAM é um dos problemas de saúde mais

prevalentes no mundo, e uma das principais causas de morbidade e mortalidade. A

reoxigenação miocárdica desencadeia as lesões de reperfusão que são responsáveis pelo

surgimento de alterações tanto contráteis quanto oxidantes, as quais são representadas por

arritmias ventriculares e até mesmo por morte celular (BRASILEIRO, 1997; ZWEIER;

TALUKDER, 2006).

Essa lesão, inicia-se durante a isquemia por insuficiência do metabolismo anaeróbico

em manter o aporte energético do cardiomiócito que ativa a glicólise, resultando na redução

do pH e consequente elevação de Na+ e Ca

2+ intracelular. Com a reperfusão, ocorrem

distúrbios no transporte iônico acarretando sobrecarga de Ca2+

no citoplasma e há formação

exacerbada de ROS e RNS pelas mitocôndrias, levando a mudanças estruturais e funcionais

dos constituintes celulares e ativação de vias sinalizadoras de morte celular (AKAHLAGHI;

BANDY, 2009).

A elevação da concentração de ROS e RNS associada ao acúmulo de Ca2+

no

citoplasma causa lesões de isquemia-reperfusão (WALTERS; POTER; BROOKES, 2014).

Essa lesão é estabelecida nos primeiros minutos da restauração do fluxo sanguíneo, tornando

esse tempo importante para modulação de ações que previnam o seu surgimento (PIPER;

ABDALLAH; SCHÄFER, 2004a).

Em humanos foi demonstrado que durante a isquemia e reperfusão do miocárdio, para

a defesa há uma depleção de antioxidantes endógenos não enzimáticos tais como, ácido

ascórbico e vitamina E contra o estresse oxidativo. Este estudo indica a suplementação com

antioxidantes como terapia alternativa ao tratamento convencional da isquemia cardíaca

(AKAHLAGHI & BANDY, 2009).

Muitos antioxidantes encontrados em produtos naturais podem intervir e ajudar na

prevenção de lesões de reperfusão (SUZUKI et al., 2007; TOUFEKTSIAN, 2008), além

disso, apresentam baixo custo e diversas vantagens em relação aos compostos sintéticos.

Abordagens da eficácia de agentes farmacológicos para atenuar as consequências da

lesão de isquemia-reperfusão mostram limitações experimentais ou não conseguem traduzir-

39

se em tratamentos clínicos úteis (FERDINANDY; SCHULZ; BAXTER, 2007). Desta forma,

necessita-se de alternativas que possam ser utilizadas para essa finalidade.

No presente trabalho, utilizamos um modelo de isquemia-reperfusão global, no qual

foi estudado o efeito da diosmina, flavonoide com característica antioxidante, na prevenção da

lesão de reperfusão.

Evidenciamos que os corações do grupo I-R + Veículo, tiveram uma redução

acentuada da função contrátil cardíaca (Figura 12). Já é conhecido que a depressão da

contratilidade cardíaca é uma consequência precoce da isquemia miocárdica, e pode resultar

em insuficiência cardíaca aguda. Além disso, a taxa e/ou tempo de recuperação da função

cardíaca pós-isquêmica é amplamente utilizada como índice de lesão de isquemia e reperfusão

experimental (FERDIANDY; SCHULZ; BAXTER, 2007).

Todavia, nos corações isquêmicos, a reperfusão com diosmina (Figura 12) ofereceu

uma proteção cardíaca por uma melhor recuperação pós-isquêmica do ventrículo esquerdo.

Resultado semelhante ao nosso foi observado por Senthamizhselvan et al. (2014), que

utilizaram como pré-tratamento a diosmina nas concentrações de 50 e 100 mg/Kg,

identificando que esta substância promoveu recuperação da força contrátil ventricular,

aumentando-a em relação ao controle. Assim como a diosmina, em outro estudo, evidenciou-

se o papel protetor da diogenina contra a lesão de isquemia-reperfusão. Foi avaliado o efeito

desta substância (1nM) na função contrátil cardíaca, e pode-se observar que a mesma

melhorou durante a reperfusão via recuperação da PVE (BADALZADEH, R.; YOUSEFI, B.;

MAJIDINIA, M.; EBRAHIMI, H, 2014).

Durante a isquemia-reperfusão, arritmias ventriculares graves como taquicardia

ventricular e fibrilação ventricular, podem se desenvolver contribuindo para a morte súbita

cardíaca após a oclusão coronária (JANSE & WIT, 1989).

Em nosso estudo, observamos no grupo I-R + Veículo que ocorreu um aumento do

ASI (Figura 13). Esta evidência pode ser explicada pela redução da concentração de ATP

celular durante o período de isquemia, onde muitas ATPases reduzem sua atividade

resultando numa elevada sobrecarga de Ca2+

durante a diástole, que culmina em pós-

despolarizações ocasionando arritmias ventriculares (DEL MONTE et al., 2004). Além disso,

durante a isquemia ocorre elevação da concentração de prótons no espaço intracelular,

ocasionando o influxo de Na+ pelo trocador Na

+/H

+. Tal elevação da concentração intracelular

40

deste íon, por sua vez, aumenta a concentração citosólica de Ca2+

por meio da inversão do

trocador Na+/Ca

2+, contribuindo também para o surgimento de arritmias (BERS, 2002).

Quando os corações pós-isquêmicos foram reperfundidos com diosmina, essa

substância apresentou um efeito antiarritmogênico (Figura 13), o qual foi representado pela

redução do ASI. Corroborando com nosso resultado, Liao et al. (2010) investigaram o efeito

da luteolina na arritmia ventricular em corações submetidos a isquemia e reperfusão. Nesse

estudo, o pré-tratamento com a luteolina (1 a 10 μg/kg - via intravenosa) reduziu a incidência

e a duração da taquicardia ventricular, bem como a fibrilação ventricular durante a isquemia

do miocárdio e reduziu arritmias ventriculares.

Em nosso estudo, realizamos a marcação do infarto dos corações dos grupos em

estudo com TTC (Figura 14). Este corante tem por finalidade marcar o tecido viável onde há

desidrogenases ativas que convertem o composto solúvel em precipitado insolúvel, formazan

vermelho. Como as desidrogenases estão localizadas principalmente nas mitocôndrias, a

intensidade de coloração está correlacionada com o número de mitocôndrias funcionais e

pode facilmente diferenciar o tecido viável do tecido não viável, este representado pela

coloração esbranquiçada (FERRERA et al., 2009). Observamos que os corações pós-

isquêmicos reperfundidos com o veículo apresentaram a área de infarto maior, verificada por

um aumento acentuado da área esbranquiçada. Todavia, os corações que foram reperfundidos

com a diosmina tiveram a área lesionada reduzida, evidenciado que esta substância tem a

capacidade de prevenir o surgimento das lesões de reperfusão.

Sun et al. (2012) tiveram como um dos objetivos no seu estudo, investigar os efeitos

biológicos da luteolina sobre o tamanho do infarto do miocárdio em ratos diabéticos

submetidos a isquemia-reperfusão. Foi observado que o pré-tratamento com a luteolina foi

capaz de reduzir a área de infarto de maneira significativa em relação ao controle. Liao et al.

(2010) também observaram o efeito protetor do pré-tratamento com luteolina em corações de

ratos submetidos a isquemia-reperfusão, e evidenciaram que esta substância foi capaz de

reduzir a área de infarto dos mesmos, quando comparada ao grupo controle.

Em nossos experimentos, ao analisamos a atividade das enzimas CK e LDH nos

corações do grupo isquêmico, observamos que havia uma elevação da atividade destas

enzimas (Figuras 15 e 16). Na isquemia, com a cessação da glicólise aeróbica e

consequentemente estabelecimento da glicólise anaeróbica, ocorre uma produção ineficiente

41

de fosfatos de alta energia e ao acúmulo de ácido láctico, o que culmina na diminuição do pH

celular e alterações metabólicas importantes. Sem energia para a manutenção da sua atividade

metabólica normal e integridade da membrana celular, a célula morre liberando suas

macromoléculas na circulação, tais como CK e LDH (LOZOVOY; PRIESNITZ; SILVA,

2008).

Os corações que foram reperfundidos com a diosmina tiveram a atividade da CK e

LDH reduzidas, sugerindo que este flavonoide possui uma propriedade protetora contra os

danos celulares ocasionados pela isquemia-reperfusão. Resultados semelhantes aos nossos

foram identificados no estudo de Senthamizhselvan et al. (2014), os quais observaram que os

corações pré-tratados com diosmina apresentaram uma redução da atividade das enzimas CK

e LDH no perfusato coronário. Badalzadeh et al. (2014), avaliaram o efeito diogenina em

corações submetidos à isquemia global, e verificaram que este flavonoide reduziu a

concentração de LDH no perfusato coronário. Liu et al. (2014) avaliaram o efeito protetor da

quercetina no dano celular miocárdico pós-isquêmico, e observaram que este flavonoide

reduziu as concentrações séricas de CK e LDH.

Com a volta da circulação de sangue nos corações submetidos à isquemia ocorre o

estresse oxidativo devido à formação exacerbada de radicais livres, sendo considerado como

um dos principais fatores que contribuem para a lesão de reperfusão. Moléculas reativas de

oxigênio e nitrogênio estão envolvidas em alguns efeitos deletérios à célula, tais como a

peroxidação lipídica das membranas celulares. Este fenômeno é considerado como o principal

mecanismo de lesão em uma variedade de doenças, principalmente na isquemia-reperfusão

(CECONI et al., 1992). Em consonância, os nossos resultados revelaram que os corações

submetidos à isquemia e reperfusão, na situação controle, exibiram concentrações aumentadas

de MDA e hidroperóxidos totais, indicando claramente a elevação do estresse oxidativo

(Figuras 17 e 18).

Ao investigamos a ação da diosmina no grau da peroxidação lipídica, constatamos que

esta substância atua reduzindo a formação de MDA (Figura 17). Este resultado está em

concordância com os efeitos da diosmina observados na produção de hidroperóxidos totais

(Figura 18), os quais são produtos primários da peroxidação lipídica (LIMA & ABDALLA,

2001). Assim, a diosmina apresenta um efeito protetor contra a lesão tecidual pós-isquêmica.

42

Corroborando nosso estudo, Senthamizhselvan et al. (2014) analisaram o efeito do

pré-tratamento com diosmina em relação ao grau de hidroperóxidos totais e de MDA no

coração de ratos submetidos a isquemia-reperfusão, identificando que a substância apresenta

um potencial de proteção contra a peroxidação lipídica. Liu et al. (2014) investigaram o efeito

protetor da quercetina sobre lesões de isquemia-reperfusão, in vivo, em corações de ratos. Os

autores demonstraram que este flavonoide reduziu o grau de MDA em relação ao grupo

controle, sugerindo uma característica em comum dos flavonoides, a forte capacidade

protetora contra a peroxidação lipídica.

Esse efeito da diosmina sobre a peroxidação lipídica é bem caracterizado na literatura

para diversas condições experimentais, a destacar: neuropatia diabética experimental em ratos

(JAIN et al., 2014), hepatocarcinogenese em modelo murino (THAIR et al., 2013a), lesão

pancreática induzida por isquemia-reperfusão hepática de rato (KILICOGLU et al., 2012) e

isquemia-reperfusão de retina de ratos (TONG et al., 2012). Os mecanismos propostos para

estes efeitos incluem seu caráter antioxidante.

A produção de ROS e RNS durante a isquemia é geralmente baixa e seu significado

patológico é incerto. Tem sido proposto que estas espécies geradas durante a isquemia podem

desempenhar um papel importante na sinalização, e que elas podem provocar um pré-

condicionamento. Entretanto, a geração de radicais livres é produzida em larga escala durante

os primeiros minutos de reperfusão pós-isquêmica, contribuindo para a patogênese de

diversas doenças, especialmente quando os mecanismos de defesa normais estão prejudicados

(PENNA et al., 2009).

Em nosso modelo de isquemia e reperfusão, na ausência de diosmina, houve uma

elevação da atividade das enzimas antioxidantes SOD, Cat, Gpx e GR (Figuras 19 a 22),

provavelmente devido ao aumento da geração de ROS e RNS. Esses dados quando

comparados a literatura se mostram distintos. Os estudos desenvolvidos por Liu et al. (2014) e

Senthamizhselvan et al. (2014) apontaram que os danos ocasionados pelas espécies reativas

são responsáveis pela redução da atividade dessas enzimas antioxidantes. A divergência entre

nossos dados possivelmente é em decorrência das distinções entre os parâmetros

metodológicos adotados por esses autores, que evidenciaram o efeito das substâncias luteolina

e diosmina, respectivamente, em pré-tratamentos de ratos.

A geração de ROS e RNS determina mudanças dependentes do tempo na

disponibilidade de antioxidantes no miocárdio após isquemia-reperfusão. Esse desbalanço

43

pode ser ocasionado pelos diferentes modelos experimentais empregados por distintos grupos

de pesquisadores. A maioria dos estudos parece encontrar esgotamento ou elevação de

antioxidantes enzimáticos e isso é atribuído a diferentes espécies animais, grau de fluxo

sanguíneo colateral, tempo de isquemia, horário da administração de drogas e via de

administração de substâncias (MARCZIN et al., 2003).

Em relação ao tempo, 30 a 35 minutos de isquemia são o ideal para ocasionar a lesão

tecidual. Para a progressão das lesões, a duração da reperfusão deve refletir o curso de tempo

da fisiopatologia da lesão miocárdica, a qual parece variar de espécie para espécie. Para o

coração de rato, muitos grupos relatam que 30 minutos de reperfusão é suficiente. Além disso,

há evidências que não existe nenhuma diferença no tamanho do infarto nos tempos de 60 a

120 minutos de reperfusão (BELL; MOCONU; YELLON, 2011; FERRERA et al., 2009).

Assim, utilizamos em nosso modelo experimental, o tempo de 30 minutos para isquemia e 60

minutos para a reperfusão.

A SOD é uma enzima responsável pela remoção do O2•-, primeiro radical livre

produzido durante o estresse oxidativo. Após a formação do H2O2, dois mecanismos de

defesas endógenos são ativados, a CAT e a GPx, sendo esta última, um dos agentes mais

importantes dos sistemas de defesas antioxidantes (DHALLA et al., 2000). Na presença de

baixas quantidades de H2O2, os peróxidos orgânicos são eliminados preferencialmente por

esta última. Já em condições onde há altas concentrações de H2O2 predomina a ação da Cat

(CHUNG-MAN et al., 2001).

Após a exposição da glutationa reduzida (GSH) ao agente oxidante, ocorre sua

oxidação à glutationa oxidada (GSSH) via enzima GPx, que a utiliza como substrato para

catalisar a reação para remoção dos peróxidos, gerando uma molécula de água. A recuperação

da GSH é então feita pela enzima GR, uma flavoproteína dependente de NADPH, sendo esta,

uma etapa essencial para manter íntegro o sistema de proteção celular (DHALLA et al.,

2000).

Evidenciamos, que nos corações isquêmicos que foram reperfundidos com diosmina

as enzimas SOD, Cat, GPx e GR tiveram suas atividades reduzidas. Acreditamos que isso

tenha ocorrido devido à capacidade sequestradora de radicais livres da diosmina. Essa

proteção é característica dos flavonoides, devido à presença de grupo hidroxila em sua

estrutura que inativa os radicais livres (NIJVELDT et al., 2001). Senthamizhselvan et al.

44

(2014) observaram o efeito quelante da diosmina. Este flavonoide foi capaz de eliminar o O2•-

e OH•, de maneira dependente, nas concentrações de 20, 40, 60, 80 e 100 µmol/L. Assim, os

radicais livres tais como O2•- e OH

•, produzidos durante a isquemia-reperfusão, foram

eliminados pela diosmina. Queenthy e John (2013) também observaram a capacidade

sequestradora dos radicais livres por essa substância. A eliminação de O2•- e OH

• foi realizada

de maneira dependente e uma pequena quantidade desta substância também pode produzir

impacto positivo.

Na isquemia-reperfusão cardíaca o aumento acentuado da produção de ROS e RNS,

associado à sobrecarga de Ca2+

são as causas mais importantes para a abertura do MPTP. Esse

poro é um canal não específico, formado no local do contato entre as membranas interna e

externa mitocondriais. A sua composição molecular exata permanece controversa e este

parece possuir um regulador importante, a ciclofilina D. Como resultado da abertura do

MPTP, há rupturas da membrana externa que facilitam a liberação do citocromo c, o que

culmina em morte celular (MOZAFFARI et al., 2013; WALTERS; POTTER; BROOKES,

2014).

Observamos em nosso estudo, que os corações do grupo isquêmico apresentaram um

aumento na expressão da proteína caspase-3 (Figura 23). A apoptose de cardiomiócitos é um

dos principais contribuintes para o desenvolvimento de infarto do miocárdio, e está

relacionada à insuficiência cardíaca (BIALIK et al., 1997; GOTTLIEB et al., 1994). Na

cardiomiopatia humana, a apoptose de células do músculo cardíaco é associada com a

liberação de citocromo c e ativação de caspase-3. Esta ativação ocorre durante a fase final da

via de sinalização pró-apoptótica e representa um potencial alvo de intervenção para a

supressão da apoptose em cardiomiócitos (NARULA et al., 1999).

Nossos dados evidenciam que nos corações reperfundidos com diosmina a expressão

da caspase-3 apresentou-se reduzida (Figura 23). A isquemia-reperfusão induz apoptose no

miocárdio, enquanto que a inibição da atividade de caspase atenua a apoptose em

cardiomiócitos e, consequentemente, a lesão decorrente da isquemia-reperfusão

(BORUTAITE et al., 2003; GUSTAFSSON et al., 2002 ). Assim, acreditamos que a diosmina

é capaz de impedir o desencadeamento de morte celular nos cardiomiócitos pós-isquêmicos.

45

A maioria dos estudos sugerem que a família Bcl-2 é reguladora chave da apoptose

fisiológica e patológica. A família é composta por dois promotores de morte celular, tais

como Bax, Bad e inibidores da morte celular, que incluem a proteína Bcl-2, Bcl-X, etc

(CHAE et al. 2004; JIAN WEN et al. 2003). Entretanto, interessantemente no estudo de

Senthamizhselvan et al. (2014), ao investigarem o papel protetor da diosmina em corações

isquêmicos no processo de morte celular não foi observada um aumento da expressão da

proteína Bcl-2, o que não corrobora com a literatura.

Dong et al. (2011) investigaram o papel da vitexin em coração de ratos isolados

submetidos á isquemia global na atenuação da apoptose. Estes autores observaram que a

perfusão com essa substância antes da isquemia, promoveu uma redução da expressão da

proteína Bax e aumento da expressão da proteína Bcl-2, evidenciando o papel anti-apoptótico

desse flavonoide nas lesões de isquemia-reperfusão.

Em conjunto, os resultados apresentados no presente estudo sugerem que a diosmina

reduziu as lesões decorrentes da reperfusão e este fato possivelmente está atrelado às suas

ações antioxidantes, e que a mesma não apresenta divergências de efeitos em relação a outras

substâncias pertencentes à mesma classe (QI et al., 2011; LIU et al., 2014).

É importante destacar que mais estudos sobre os mecanismos de ação protetor deste

flavonoide necessitam ser desenvolvidos para que o mesmo venha ser utilizado em

tratamentos clínicos para atenuar as consequências da lesão de reperfusão.

46

7 CONCLUSÃO

Esse estudo indica que a diosmina apresenta efeito protetor quanto ao surgimento das

lesões de reperfusão, sugerindo que a mesma representa uma alternativa terapêutica em

potencial a ser utilizada no tratamento ou como coadjuvante pós-infarto agudo do miocárdio

em humanos. Vale ressaltar que investigações adicionais precisam ser realizadas para

comprovar seu potencial clínico.

47

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ANEXOI

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · A lesão de reperfusão é responsável por 50% do tamanho do infarto, sendo a principal responsável pelas alterações cardíacas