UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · Victor pelo amor e pela força que nos momentos difíceis não me permitiam fraquejar. v AGRADECIMENTOS À Deus, pela oportunidade

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS

MARIA BETÂNIA TRINDADE CARVALHO

ALTERAÇÕES FUNCIONAIS EM ARTÉRIA MESENTÉRICA

DE RATOS COM PANCREATITE AGUDA

SÃO CRISTÓVÃO – SE

2014

i




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal de Sergipe como requisito à

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Fisiológicas.

Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo

SÃO CRISTÓVÃO – SE

2014

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

C331a

Carvalho, Maria Betânia Trindade

Alterações funcionais em artéria mesentérica de ratos com

pancreatite aguda / Maria Betânia Trindade Carvalho ; orientador

Enilton A. Camargo. – São Cristovão, 2014.

72 f. : il.

Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) –

Universidade Federal de Sergipe, 2014.

1. Pancreatite. 2. Artéria mesentérica. 3. Ducto biliopancreático - obstrução. I. Camargo, Enilton A., orient. II. Título.

CDU 616.37-002.1

iii




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da

Universidade Federal de Sergipe como requisito à

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Fisiológicas.

_______________________________________________________

1º Examinador: Prof Dr. Marcelo Nicolas Muscará (USP)

_______________________________________________________

2º Examinador: Prof. Dr. Valter Joviniano de Santana Filho (UFS)

________________________________________________________

3º Examinador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo (UFS)

SÃO CRISTOVÃO

2014

iv

DEDICATÓRIA

Dedico este Mestrado a Deus pelo dom da vida, aos

meus pais, Josefina e Gilmar, por não medirem

esforços para minha educação, e ao meu noivo

Victor pelo amor e pela força que nos momentos

difíceis não me permitiam fraquejar.

v

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela oportunidade de evoluir espiritualmente, e por ter permitido concluir esse

mestrado, guiando-me em todos os momentos.

Ao meu orientador, Prof. Enilton Camargo, pela confiança depositada em mim quando me

aceitou como sua aluna com toda a minha inexperiência em laboratório, pelos ensinamentos

compartilhados, pela competência e paciência na realização desse trabalho;

Aos meus pais, Josefina e Gilmar, por me mostrar a importância dos estudos, por todo

esforço que fizeram para que eu pudesse estudar e chegar até aqui;

Ao meu noivo Victor, por ter me apoiado na realização desse sonho, pelo amor e força que

foram essenciais para que eu superasse as dificuldades;

Às minhas irmãs Kelly, Karine e Nataly por serem exemplos diários na minha vida de que

coragem e determinação é o melhor caminho para alcançar nossos objetivos. Tenho muito

orgulho de vocês; e aos meus cunhados Léo, Pablo e Ângelo pela ajuda que hora ou outra

necessitei e pela torcida;

A todos os amigos do LAFAPI (Laboratório de Farmacologia do Processo Inflamatório)

pelos momentos de descontração e também pela torcida;

Agradeço, em especial, a Alan pela paciência com que me ensinou as técnicas utilizadas e

por ter participado de todos os experimentos do meu primeiro projeto com a mesma

dedicação com que fazia os seus;

Agradeço, em especial a Patrícia Cunha, que foi fundamental na realização desse trabalho,

nos experimentos e na elaboração da dissertação e sobretudo pela demonstração de amizade

ao compartilhar e me ajudar num momento de sufoco;

A Rangel que sempre que pôde participou nos experimentos e que sempre esteve disposto a

me ajudar;

Às aluna de iniciação científica, Janaíne e Dayane, pela ajuda prestada nessa etapa final do

mestrado principalmente no cuidado com os animais;

vi

Aos alunos do Laboratório de Biofísica do Coração, Rodrigo, Grace e Thássio pela

colaboração na realização deste trabalho;

Aos professores que gentilmente colaboraram com esse trabalho, Sandra Lauton Santos e

Márcio Roberto Viana Santos;

Aos membros da banca examinadora da qualificação, Renata Grespan e Sandra Lauton,

pelas apreciações e sugestões emitidas;

Aos professores constituintes da banca de defesa, Marcelo Muscará e Valter Joviniano pela

atenção dispensada na leitura desta dissertação e colaboração para finalização deste

trabalho;

Aos professores do PROCFIS (Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas) que

muito me ensinaram nas disciplinas realizadas, pelo exemplo e ajuda na construção do

conhecimento;

Ao professor Daniel Badauê pelo empenho com que conduz este programa e pela atenção em

saber sobre o desenvolvimento da minha pesquisa;

Á UFS pela oportunidade dada aos alunos em dá continuidade aos estudos após a

graduação.

Aos animais cujas vidas foram interrompidas em prol do desenvolvimento da ciência;

À Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe

(FAPITEC/SE), pelo apoio financeiro.

vii

“Aos outros, eu dou o direito de ser como são. A

mim, dou o dever de ser cada dia melhor.”

Chico Xavier

viii

RESUMO

Carvalho, M. B. T. Alterações Funcionais em Artéria Mesentérica de Ratos com

Pancreatite Aguda, Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Sergipe, São

Cristóvão, 2014. A pancreatite aguda é um processo inflamatório que se desenvolve a partir

de lesão dos ácinos pancreáticos e também pode envolver tecidos peripancreáticos e outros

órgãos. Alterações na função vascular são propostas como fatores que contribuem

sobremaneira para a morbidade dos pacientes com pancreatite, entretanto poucos estudos

foram direcionados para entender estas alterações e os mecanismos subjacentes. Com base

nessas premissas, o objetivo do presente estudo foi investigar as alterações vasculares

provocadas pela pancreatite aguda induzida por obstrução do ducto biliopancreático (ODBP)

sobre a reatividade de artéria mesentérica de ratos, com o intuito de gerar conhecimento

científico sobre os mecanismos envolvidos nesta condição e permitir abordagens futuras que

levem ao melhor tratamento desta doença em humanos. Para tanto, foram utilizados ratos

machos adultos Wistar (220-300 g) que foram divididos em grupos falso operado (Sham), no

qual somente houve a cirurgia, sem obstrução do ducto, ou ODBP, o qual foi submetido a

cirurgia e obstrução do ducto biliopancreático. Em seguida, os animais dos diferentes grupos

foram eutanasiados após 24 ou 48 h e a artéria mesentérica superior foi removida, bem como

soro foi separado para dosagem de amilase. Desta artéria foram obtidos anéis com endotélio

(1-2 mm) que foram utilizados para a realização dos experimentos de reatividade in vitro e

mensuração de óxido nítrico (NO) e ânion superóxido (O2•-). Para os experimentos de

reatividade, os anéis foram montados em sistema de banho de órgão isolado e foi testada sua

resposta relaxante ou contrátil, mediante estimulação com acetilcolina (ACh) ou fenilefrina

(Fen) respectivamente. Para avaliar a produção de NO e O2•-nos anéis dos animais dos

diferentes grupos, foram utilizadas sondas fluorescentes específicas para estes radicais livres.

Nos animais com ODBP foram encontradas concentrações séricas de amilase elevadas após

24 (p<0,05) ou 48 h (p<0,001), quando comparados ao grupo sham, confirmando a indução da

pancreatite. Os anéis dos animais com ODBP demonstraram uma diminuição da resposta

relaxante à acetilcolina ou contrátil à fenilefrina após 24 ou 48 h da indução da pancreatite,

quando comparados aos animais do grupo sham. Também foi observado aumento na

produção de NO (p<0,05) e de O2•- (p<0,05) nos anéis coletados após 48 h, mas não 24 h da

indução da pancreatite. Estes achados mostraram que a indução da pancreatite aguda por

ODBP prejudica tanto a resposta relaxante quanto a contrátil de anéis de artéria mesentérica,

por mecanismos que possivelmente são desencadeados pelo aumento na produção de NO e

O2•-, provavelmente associado com o processo inflamatório. Entretanto, experimentos

adicionais são necessários para identificar os mecanismos pelos quais a pancreatite aguda

causa estes efeitos.

Descritores: Pancreatite aguda; obstrução do ducto biliopancreático; artéria mesentérica,

estresse oxidativo.

ix

ABSTRACT

Carvalho, M. B. T. Functional Alterations in Mesentery Artery of Rats with Acute

Pancreatitis. Master's dissertation, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão,

2014. Acute pancreatitis is an inflammatory process that initiates with the damage of the

pancreatic acinar cells and can also involve other organs and peripancreatic tissues. Vascular

alterations are proposed as factors that contribute significantly to the morbidity of patients

with pancreatitis. However, few studies were directed to understand these alterations and the

underlying mechanisms. In this way, the objective of this study was to investigate vascular

changes caused by acute pancreatitis induced by common bile duct obstruction (CBDO) on

the vascular reactivity of rat mesenteric artery, in order to generate scientific knowledge about

the mechanisms involved in this condition and enable future approaches that lead to a better

treatment of this disease in humans. For this purpose, adult male Wistar rats were used (220-

300 g) and divided into two groups: (i) sham animals, which were submitted to surgery

procedure without obstruction of the duct and (ii) CBDO animals which were submitted to

surgery procedure and obstruction of the common bile duct. After 24 or 48 h of this surgery,

animals were anesthetized and the superior mesenteric artery was removed. Serum samples

were also obtained for amylase determination. Mesentery artery rings were obtained (1-2 mm)

and used for in vitro reactivity experiments and measurement of nitric oxide (NO) and

superoxide anion (O2•-). For the reactivity experiments, the rings were mounted in isolated

organ chambers and cumulative concentration-response curves to acetylcholine or

phenylephrine were obtained. For evaluating the production of NO and

O2

•-, rings were

incubated with specific fluorescent dyes. Levels of serum amylase were augmented in animals

with CBDO after 24 (p<0.05) or 48 h (p<0.001) of obstruction, when compared with sham

group, confirming the induction of pancreatitis. Mesenteric rings from CBDO animals

showed decreased relaxing response for acetylcholine or contractile response to

phenylephrine after 24 or 48 h of induction of pancreatitis, when compared with sham group.

Our data also showed an increase in NO (p<0,05) and O2•- (p<0,05) production in the rings

collected after 48 h of the surgical procedure, but not after 24 h. These findings showed that

acute pancreatitis induction by CBDO impaired relaxation and contractile response, possibly

by mechanisms that are triggered by increased NO and

O2

•- production, probably associated

with the inflammatory process. Additional studies are needed to identify the mechanisms

underlying these vascular effects of acute pancreatitis.

Keywords: Acute pancreatitis; Common Bile Duct Obstruction; Mesenteric Artery;

Oxidative Stress.

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição da solução de Tyrode para anéis de artéria mesentérica...................... 21

Tabela 2: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80 mM

(KCl 80).................................................................................................................................... 21

Tabela 3: A potência (pD2) e resposta máxima (Emax) de acetilcolina (ACh), e fenilefrina

(FEN) de artérias mesentéricas de ratos após pancreatite......................................................... 32

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura do Pâncreas. ................................................................................................. 3

Figura 2: Síntese de NO ........................................................................................................... 11

Figura 3: Representação esquemática dos mecanismos celulares que levam ao relaxamento

vascular pela via NO-GMPc ..................................................................................................... 12

Figura 4: Concentração sérica de amilase em ratos nos grupos sham e ODBP após 24 e 48 h

do procedimento cirúrgico. ....................................................................................................... 25

Figura 5: Curva concentração-resposta para a acetilcolina (ACh; 10-9

– 10-4

mol/L) em anéis

de artéria mesentérica superior isolada de rato coletadas 24 h após o procedimento cirúrugico,

com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µmol/L). .............................................. 27


– 10-4

mol/L) em anéis

de artéria mesentérica superior isolada de rato em anéis de artéria mesentérica superior isolada

de rato coletadas 48 h após o procedimento cirúrugico com endotélio funcional, pré-

contraídos com FEN (1 µmol/L). ............................................................................................. 29

Figura 7: Curva concentração-resposta para a fenilefrina (FEN; 10-9

– 10-4

mol/L) de anéis de

artéria mesentérica superior isolada de rato coletadas após 24 h do procedimento cirúrgico,

com endotélio funcional. Os valores foram expressos como média ± e.p.m. .......................... 30


– 10-4

mol/L) em anéis de

artéria mesentérica superior isolada de rato coletadas após 48 h do procedimento cirúrgico,

com endotélio funcional. Os valores foram expressos como média ± e.p.m. .......................... 31

Figura 9: Produção basal de óxido nítrico em anéis de artéria mesentérica de ratos dos grupos

sham e ODBP após 24 h da indução da pancreatite. ................................................................ 35

Figura 10: Produção basal de óxido nítrico em anéis de artéria mesentérica de ratos dos

grupos sham e ODBP após 48 h da indução da pancreatite. .................................................... 36

Figura 11: Produção basal de ânion superóxido em anéis de artéria mesentérica de ratos dos


Figura 12: Produção basal de ânion superóxido em anéis de artéria mesentérica de ratos dos


xii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

[Ca2+

]i Concentração de Cálcio Intracelular

ACh Acetilcolina

AMPc Adenosina Monofosfato Cíclica

ANOVA Análise de Variância

Ca2+

/CaM Complexo Cálcio-calmodulina

Cav Canais para Cálcio operados por Voltagem

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa com Animal

cNOS Óxido Nítrico Sintase Constitutiva

COX Ciclooxigenase

DAG Diacilglicerol

e.p.m. Erro Padrão da Média

eNOS Óxido Nítrico Sintase Endotelial

FEN Fenilefrina

FHDE Fator Hiperpolarizante Derivado do Endotélio

FRDE Fator Relaxante Derivado do Endotélio

GCs Guanilato Ciclase Solúvel

GMPc Guanosina Monofosfato Cíclica

GTP Guanosina Trifosfato

IL Interleucina

iNOS Óxido Nítrico Sintase Induzível

IP3 Inositol 1,4,5-trifosfato

IP3R Receptor de Inositol 1,4,5-trifosfato

L-Arg L-arginina

MLC Cadeia Leve de Miosina

MLCF Fosfatase da Cadeia Leve de Miosina

MLCK Quinase da Cadeia Leve de Miosina

NO Óxido Nítrico

NOS Óxido Nítrico Sintase

ODBP Obstrução do Ducto Biliopancreático

PLC Fosfolipase C

PIP2 Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

xiii

PKC Proteína Quinase C

PKG Proteína Quinase G

RS Retículo Sarcoplasmático

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RyR Receptores de Rianodina

SRIS Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica

SARA Síndrome da Angústia Respiratória Aguda

TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa

UFS Universidade Federal de Sergipe

xiv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 3

2.1 Pancreatite Aguda ................................................................................................................. 3

2.2 Modelo de Pancreatite Aguda por Obstrução do Ducto Biliopancreático ............................ 7

2.3 Fisiologia do Endotélio ......................................................................................................... 9

2.4 Contração e Relaxamento da Musculatura Lisa Vascular .................................................. 13

2.5 Inflamação, Estresse Oxidativo e Disfunção Endotelial .................................................... 14

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 18

3.1 Geral ................................................................................................................................... 18

3.2 Específicos .......................................................................................................................... 18

4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 19

4.1 Animais ............................................................................................................................... 19

4.2 Procedimento Experimental de Indução da Pancreatite Aguda por ODBP........................ 19

4.3 Drogas ................................................................................................................................. 20

4.4 Soluções nutritivas .............................................................................................................. 20

4.5 Dosagem Bioquímica para Determinação da Amilase ....................................................... 21

4.6 Experimentos de Reatividade Vascular .......................................................................... 22

4.6.1 Preparação da artéria mesentérica superior isolada de rato ......................................... 22

4.6.2 Avalição da resposta vasocontrátil induzida pela FEN .................................................. 22

4.6.3 Avalição da resposta vascular relaxante induzida pela acetilcolina .............................. 23

4.7 Mensuração das Concentrações Intracelulares do NO ....................................................... 23

4.8 Mensuração de O2•- intracelular .......................................................................................... 24

4.9 Análise Estatística .............................................................................................................. 24

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 25

6 CONCLUSÕES.................................................................................................................... 42

7 PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 43

8 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 44

1

1 INTRODUÇÃO

A pancreatite é definida como a inflamação do pâncreas e é considerada a doença

pancreática mais comum em crianças e adultos; podendo ser aguda, representando um

processo inflamatório agudo do pâncreas; ou crônica, progredindo lentamente com constante

lesão inflamatória ao pâncreas (BUSIREDDY et al., 2014).

Apresentando uma morbidade e mortalidade significativa, a pancreatite aguda

consome enormes recursos da saúde (FORSMARK; BAILLIE, 2007), com uma incidência

anual relatada 13 a 45 casos por 100.000 pessoas (YADAV, 2013). A falência de órgãos é o

principal determinante da mortalidade na pancreatite aguda, sendo que pancreatite grave está

associada com uma mortalidade de 15% a 30%, enquanto que na pancreatite leve a

mortalidade é de até 1% (KARAKAYALI, 2014). Os cálculos biliares representam a maior

causa de pancreatite, seguido pelo consumo excessivo de álcool (BINKER; COSEN-

BINKER, 2014).

A pancreatite aguda (PA) é um processo que se desenvolve a partir de lesão aos ácinos

pancreáticos, resultante da exsudação de fluido contendo enzimas proteolíticas ativadas no

interstício do pâncreas com variado comprometimento da própria glândula, tecidos próximos,

e outros órgãos (PAL et al., 2012; BUSIREDDY et al., 2014; KARAKAYALI, 2014).

O processo inflamatório é iniciado com a migração de monócitos e neutrófilos para o

pâncreas que auxiliam na produção de diferentes citocinas e vários outros mediadores

inflamatórios (SHRIVASTAVA; BHATIA, 2010). As alterações morfológicas variam de

edema intersticial e evidência histológica mínima de necrose, como na pancreatite aguda

atenuada, a grandes áreas confluentes de necrose e hemorragia, características da pancreatite

grave. Com a exceção da pancreatite infecciosa, que resulta de lesão direta das células

acinares por microrganismos, todas as outras formas de pancreatite aguda, independentemente

da sua etiologia, ocorrem devido à autodigestão das enzimas pancreáticas (KLOPPEL;

MAILLET, 1993).

O sintoma mais comum que se apresenta na pancreatite aguda é dor abdominal,

classicamente descrita como ocorrendo na parte superior do abdômen e irradiando para as

costas. A dor é geralmente grave, persistente e associada principalmente a náuseas e vômitos

(TAICHMAN et al., 2010).

Em pacientes com pancreatite aguda grave a disfunção do endotélio é um dos

distúrbios fisiopatológicos críticos (CHEN et al., 2007). Citocinas inflamatórias estão

2

envolvidas diretamente com a disfunção vascular (SPRAGUE; KHALIL, 2009),

possivelmente pela alteração na atividade e expressão do canal para cálcio Cav1,2 (TIWARI

et al.; 2006), na regulação da função e expressão da Rho-quinase (HIROKI et al, 2004),

aumento da expressão de ciclo-oxigenase (MITCHELL; LARKIN; WILLIAMS, 1995) e/ou

no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ZHANG et al, 2008).

Apesar de serem moléculas sinalizadoras produzidas fisiologicamente, a produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS) é fundamental para a progressão de muitas doenças

inflamatórias. As ROS são produzidas por células que estão envolvidas na resposta de defesa

do hospedeiro, tais como leucócitos polimorfonucleares (PMN), que atuam tanto como

moléculas de sinalização, como mediadores de inflamação e podem promover a disfunção

endotelial (MITTAL et al, 2014). O estresse oxidativo interfere com a função endotelial de

várias formas, mas o mecanismo mais relevante é via redução de biodisponibilidade do NO,

que é o produto da taxa da produção de NO e a sua reação com ânion superóxido (O2•-) (CAI;

HARRISON, 2000).

Os modelos de pancreatite aguda experimental que se assemelham a situação humana

são ferramentas essenciais para estudar a patogênese da doença. O modelo de ligadura de

ducto biliopancreático é considerado por Yuan et al, (2011) uma analogia apropriada da

pancreatite biliar grave, por resultar em uma inflamação sistêmica com disfunção de múltiplos

órgãos.

Um estudo feito por Camargo et al. (2008) demonstrou que a pancreatite aguda

induzida por taurocolato de sódio ou fosfolipase A2, que causam respectivamente pancreatite

hemorrágica necrotizante e pancreatite edematosa, provoca efeitos deletérios na resposta

vascular relaxante dependente do endotélio (in vitro). Nenhum outro estudo foi direcionado

para o entendimento dos mecanismos envolvidos nas alterações vasculares causadas pela

pancreatite e os eventos fisiopatológicos desta patologia ainda não são compreendidos.

Diante disso, o presente estudo investigou os mecanismos envolvidos na resposta

vascular alterados pelo quadro de pancreatite aguda induzida por obstrução do ducto

biliopancreático (ODBP), um modelo de pancreatite grave que mimetiza a litíase biliar, sobre

as alterações in vitro da resposta relaxante dependente de NO e na resposta contrátil de artéria

mesentérica de ratos, focando na produção de NO e sua provável contribuição para os efeitos

vasculares da pancreatite.

3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Pancreatite Aguda

O pâncreas é um órgão complexo do sistema digestivo, que possui função glandular e

é composto por porções endócrina e exócrina. A porção exócrina compreende a maior parte

do pâncreas e contêm as células acinares, ductais e estreladas. As células acinares produzem

enzimas digestivas que facilitam o metabolismo dos carboidratos, proteínas e lipídios; as

células ductais, conduzem estas enzimas para o duodeno; e as células estreladas que

sintetizam e degradam as proteínas da matriz extracelular (CLEMENS et al., 2014). A porção

endócrina constitui apenas 1% a 2% do pâncreas adulto, e nele ocorre a produção de insulina

e glucagon pelas ilhotas de Langerhans, que regulam a homeostase da glicose (DESAI et al.,

2007; ZARET; GROMPE, 2008).

Figura 1: Estrutura do Pâncreas. Figura adaptada de Bardeesy e Depinho (2002).

A pancreatite aguda é definida como um processo inflamatório agudo do pâncreas, que

também pode envolver tecidos peripancreáticos e outros órgãos (BANKS, 1997). O quadro

agudo deste processo inflamatório apresenta um amplo espectro de gravidade, sendo que a

pancreatite pode ser subclínica, atenuada e sem disfunção de órgãos ou pode ser grave,

necrozante e hemorrágica (PHILLIP; STEINER; ALGÜL, 2014). Assim, a gravidade da

pancreatite aguda varia desde pancreatite edematosa até hemorrágica grave, sendo a primeira

um processo inflamatório em que não há nenhuma evidência de necrose do órgão por

4

tomografia computadorizada, mas na pancreatite grave, a inflamação induz a necrose deste

tecido (DRAGONETTI; LICHT; RUBIN, 1996).

A necrose pancreática pode levar ao desenvolvimento de pseudocistos no pâncreas ou

abcesso do tecido, que são complicações comuns associadas à patologia; e muitas vezes, este

tecido necrosado torna-se infectado, uma condição conhecida como necrose infectada

(BANKS; CONWELL; TOSKES, 2010).

A pancreatite aguda geralmente tem um início rápido manifestado por dor abdominal

superior, febre, vômitos, taquicardia, leucocitose e elevação das concentrações séricas de

enzimas pancreáticas (BARON e MORGAN, 1999).

A determinação da causa da pancreatite é um componente essencial da avaliação

diagnóstica, pois a causa afeta a terapia e a sua descoberta pode resultar na eliminação do

fator precipitante e prevenção de recorrência da doença (JOHNSON, 2005). A litíase biliar e

abuso de álcool são responsáveis por 70% a 75% dos casos de pancreatite aguda em humanos

(CRUZ-SANTAMARÍA; TAXONERA; GINER, 2012), 15% apresentam causa idiopática e

10% outras causas (CAPPELL, 2008) que incluem trauma, isquemia, obstrução mecânica,

infecções, doenças hereditárias e drogas (BINKER; COSEN-BINKER, 2014). O risco de

pancreatite relacionada com cálculos biliares aumenta com a idade e é mais prevalente em

mulheres, de acordo com a distribuição demográfica de cálculos biliares (YADAV;

LOWENFELS, 2013).

A pancreatite resultante de cálculos biliares refere-se a um episódio de pancreatite

aguda que se presume ter sido causada pela passagem de um ou mais cálculos biliares através

do ducto biliopancreático, ou pela impacção temporária na ampola de Vater. Muitos

investigadores demonstraram que as alterações na função e morfologia das células do ducto

podem resultar em uma variedade de agentes prejudiciais associada à pancreatite biliar,

entretanto o mecanismo pelo qual a obstrução do ducto pancreático leva a pancreatite aguda

não é totalmente claro (LIGHTNER; KIRKWOOD, 2001).

O acetaldeído, um subproduto do metabolismo de etanol, induz perturbações no

microtúbulo e aumenta a permeabilidade da membrana celular das células acinares. A

obstrução biliar e presumivelmente a elevada pressão no ducto pancreático leva a um aumento

da permeabilidade da célula acinar, com a liberação e ativação de enzimas no interstício do

pâncreas (BENTREM; JOEHL, 2003).

A célula acinar pancreática apresenta uma estrutura altamente especializada

desenvolvida para a síntese, armazenagem de enzimas digestivas e seu pólo apical é

5

densamente ocupado por grânulos de zimogênio que secretam as enzimas por exocitose

(HUSAIN; THROWER, 2009). O processo de exocitose envolve a fusão das membranas que

contêm os grânulos de zimogênio com a membrana plasmática apical e ocorre após as células

acinares serem estimulados por hormônios, tais como a colecistocinina e acetilcolina

(RINDLER et al., 2007).

Admite-se amplamente que a pancreatite inicia-se nas células acinares (HALANGK;

LERCH, 2004). A ativação prematura de enzimas digestivas dentro das células acinares

pancreáticas é o que inicia a autodigestão do pâncreas (BATHIA et al., 2000; BHATIA;

MOOCHHALA, 2004; BHATIA et al., 2005), que progride através de diferentes fases

(CRUZ-SANTAMARÍA; TAXONERA; GINER, 2012). O tripsinogênio e outras proteases

pancreáticas são sintetizadas na célula acinar como moléculas precursoras inativas e

armazenadas em vesículas grandes dentro destas células conhecidas como grânulos de

zimogênio (PALADE, 1974; RINDERKNECHT, 1986; WILLIAMS, 2010;).

Fisiologicamente, a ativação da tripsina só ocorre após a secreção para o intestino

delgado e leva a ativação de outras pró-enzimas pancreáticas como quimotripsinogênio, pró-

elastase, e pró-fosfolipase A2 para cumprirem funções digestivas (RINDERKNECHT, 1986).

Entretanto, na pancreatite essa ativação ocorre prematuramente e as proteases ativadas lesam

o tecido, causando edema, lesão vascular, hemorragia e necrose (BHATIA et al., 2005).

Nesse contexto acredita-se que a fase inicial da lesão inflamatória pancreática se dá

quando ocorre a ativação prematura de tripsonogênio em tripsina dentro das células acinares

(BANKS, FREEMAN, 2006). Para tanto, uma variedade de mecanismos têm sido propostos,

incluindo perturbações da sinalização do cálcio nas células acinares, o estresse oxidativo, a

clivagem do tripsinogênio em tripsina pela catepsina B (uma hidrolase lisossômica) e a

diminuição da atividade do inibidor de tripsina intracelular (WEBER; ADLER, 2001;

WHITCOMB, 2003; SUTTON et al., 2003; HALANGK, LERCH, 2004; BHATIA et al.,

2005; BOOTH et al., 2011).

É sugerido que a ativação prematura de grandes quantidades de tripsinogênio poderia

sobrecarregar os mecanismos de proteção. Estes mecanismos incluem a presença de grandes

quantidades de inibidor de tripsina e a presença de proteases que podem degradar outras

proteases já ativas e levar a danos nos grânulos de zimogênio, com consequente liberação de

proteases ativas para o citosol. Além disso, a liberação de grandes quantidades de cálcio a

partir de grânulos de zimogênio para o citosol pode ativar proteases dependentes de cálcio,

6

tais como calpainas, que, por sua vez, pode contribuir para a lesão da célula (HALANGK;

LERCH, 2004).

Uma vez que as enzimas proteolíticas são ativadas e o tecido pancreático é danificado,

os pacientes mostram padrão de agravamento semelhante, caracterizado por uma intensa

resposta inflamatória (MAYER et al., 2000). A pancreatite aguda iniciada com dano nas

células acinares, leva a uma resposta inflamatória local, que caracteriza a segunda fase, mas

pode avançar posteriormente para uma resposta sistêmica devido à ação de citocinas pró-

inflamatórias, sintetizadas no pâncreas e que atingem a corrente sanguínea e contribuem para

as manifestações sistêmicas, características de fase final da doença (ESCOBAR et al., 2011;

BANKS, FREEMAN,2006).

Tanto local, quanto sistemicamente, a migração de leucócitos é uma das respostas

importantes. Mediadas por citocinas e vários outros autacóides, essa resposta corresponde à

ativação e quimiotaxia de células inflamatórias ativadas à microcirculação, a expressão de

moléculas de adesão, que permitem a adesão destas células ao endotélio, e migração de

células inflamatórias ativadas em aéreas de inflamação (BANKS, FREEMAN, 2006).

A liberação de mediadores inflamatórios abrange as citocinas pró-inflamatórias como

fator de necrose tumoral (TNF-), interleucinas (IL)-1, 6 e 8, as citocinas anti-inflamatórias

(IL-10 e outras) e outros mediadores como o óxido nítrico (NO), os metabólitos do ácido

araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos), várias enzimas proteolíticas e lipolíticas e

ROS, que superam a capacidade de sistemas antioxidantes endógenos (BATHIA et al., 2000;

LÓPEZ et al., 2008).

Independentemente de etiologia, uma vez iniciados os eventos inflamatórios nas

células acinares, o processo poderá avançar para a síndrome da resposta inflamatória

sistêmica (SRIS). As complicações pulmonares são as mais frequentes e potencialmente mais

graves, neste quadro vão desde a hipoxemia à síndrome da angústia respiratória aguda

(SARA); esta considerada a complicação pulmonar mais perigosa (BROWNE;

PITCHUMONI, 2006).

O diagnóstico de pancreatite aguda requer duas das seguintes características: (1) início

súbito de dor abdominal aguda irradiando para as costas, dor epigástrica, (2) concentrações de

amilase e /ou lipase no soro pelo menos três vezes maiores do que o limite superior ao normal

e (3) achados de imagem característicos de pancreatite aguda em tomografia

computadorizada, ressonância magnética, ou ultrassonografia abdominal (BUSIREDDY et

al., 2014).

7

A concentração de lipase no soro sobe no início da pancreatite e permanece elevada

durante vários dias (CAPPELL, 2008). O ultrassom e a colangiopancreatografia por

ressonância magnética são exames potencialmente valiosos na avaliação da pancreatite aguda

e são úteis também para detectar pedras no ducto biliar comum e avaliar o parênquima

pancreático (FAN, ANDRÉN-SANDBERG, 2010).

A compreensão de como a sinalização intracelular em células acinares conduz à

secreção de enzimas digestivas por exocitose tem sido uma área de pesquisa contínua. Tanto

para a compreensão da função acinar normal, como na pancreatite a abordagem envolve a

compreensão da sinalização do Ca2+

e outras moléculas e da maquinaria estrutural, que

compreende a formação de grânulos secretórios, o deslocamento destes para a membrana

apical e a sua fusão e liberação do conteúdo do grânulo (WILLIAMS, 2010).

Agressores pancreáticos tais como o álcool, cálculos biliares e o fumo causam lesões

pancreáticas repetidas e devem ser eliminados com o objetivo de diminuir a extensão da

doença e o desenvolvimento de dano permanente glandular (BANKS; CONWELL; TOSKES,

2010).

2.2 Modelo de Pancreatite Aguda por Obstrução do Ducto Biliopancreático

Os modelos de pancreatite aguda experimental que se assemelham a situação humana

são ferramentas essenciais para aumentar a compreensão dos mecanismos complexos desta

condição e na elaboração de estratégias terapêuticas. O modelo ideal deve abranger várias

características como, morfologia e fisiopatologia semelhantes às da situação humana e

possibilidade de variar a gravidade da doença de forma padronizada de acordo com os

objetivos experimentais (SU; CUTHBERTSON; CHRISTOPHI, 2006).

Nos últimos anos, múltiplas experiências com animais e estudos clínicos humanos

levaram a uma melhor compreensão dos eventos macro e microscópicos que levam a

inflamação pancreática no local do cálculo biliar impactado na sua passagem e a evidência

sugere que a obstrução do fluxo no ducto pancreático é o evento inicial (LIGHTNER;

KIRKWOOD, 2001).

O histórico estudo de Opie et al. (1901) propôs uma das primeiras hipóteses da

patogênese da pancreatite em humanos; a hipótese do canal comum, sugerindo que quando o

orifício ampular é obstruído por um cálculo biliar ou ocorre refluxo biliar para o ducto

8

pancreático, há a indução da pancreatite aguda. Desde então esforços tem sido somados para o

entendimento dos mecanismos envolvidos na gênese da pancreatite.

As alterações observadas nos pâncreas após ligadura ou obstrução do ducto

pancreático variam de acordo com os animais utilizados (HYUN; LEE, 2014). O modelo de

ligadura ou obstrução de ducto biliopancreático em ratos é útil para investigar as fases iniciais

da pancreatite por litíase em humanos que é a principal causa clínica da pancreatite aguda

(SAMUEL, 2005; MEYERHOLZ et al., 2008).

Algumas diferenças são encontradas entre a fisiopatologia da doença em ratos e

humanos. Uma delas está no fato de que em humanos os ductos biliares e pancreáticos são

separados e normalmente formam um curto canal comum na parede do duodeno, enquanto

que os do rato formar um longo canal comum, com o ducto biliar também servindo como um

ducto para o suco pancreático. Entretanto o pâncreas de ratos também compartilha muitas

semelhanças com o pâncreas humano. Estas semelhanças estão relacionadas com os

componentes celulares, incluindo as células acinares, ductais, estreladas e endócrinas os

drenos dos ducto pancreático para o duodeno e também mantém as duas funções exócrinas e

endócrinas (HYUN; LEE, 2014).

O modelo de ligadura de ducto biliopancreático foi desenvolvido numa tentativa de

reproduzir situação clínica em que ocorrem em humanos, semelhante a de cálculos biliares,

distúrbios da motilidade do esfíncter, edema e estenoses na papila, tumores da papila e

parasitas impactando o ducto biliopancreático terminal (SU; CUTHBERTSON;

CHRISTOPHI, 2006).

A obstrução do ducto pancreático pode levar ao aumento da pressão intraductal, que

resulta em danos para a integridade do sistema de ductos. Nesta situação em que enzimas

ativadas e mediadores inflamatórios podem infiltrar-se no parênquima pancreático através de

barreira alterada e induzir a pancreatite aguda (SIQIN et al., 2009). A ligadura do ducto

biliopancreatico comum no rato provoca uma síndrome clínica que se assemelha à falência

múltipla dos órgãos, observada no homem com características que incluem a necrose e

hemorragia pancreática, ocorre ainda infiltração de leucócitos e vários microtrombos no

pulmão, estômago e rins (VASILESCU; TASCA, 1991).

Um estudo realizado por Yuan et al, (2011) concluiu que a inflamação sistêmica com

disfunção de múltiplos órgãos na pancreatite aguda induzida por ligação do ducto pancreático

pode causar a morte, considerando este modelo experimental uma analogia apropriada da

pancreatite biliar grave, para investigar a patogênese da doença.

9

Assim, no modelo de indução de pancreatite por obstrução do ducto biliopancreático

(ODBP) é possível verificar muitos sintomas e sinais observados na pancreatite em humanos.

Estudo prévio do nosso grupo de pesquisa (SANTANA et al. 2012) demonstrou a presença de

hiperalgesia abdominal (que se aproxima a dor abdominal em humanos), além das alterações

inflamatórias pancreáticas e pulmonares. Entretanto, não há na literatura estudo mostrando

que neste modelo de pancreatite ocorrem alterações cardiovasculares, como as que são

observadas em humanos e que são importantes na evolução do quadro grave da doença.

2.3 Fisiologia do Endotélio

A parede dos vasos sanguíneos forma uma barreira seletiva para o transporte de

moléculas entre o sangue e tecidos e o revestimento endotelial apresenta uma grande área para

esta troca de materiais entre o sangue e os tecidos (BALDWIN; THURSTON, 2001). O

endotélio vascular não é apenas uma barreira anatômica entre a corrente sanguínea e as

células do músculo liso vascular, ele desempenha um papel central em vários sistemas de

regulação fisiológica de importância crucial.

O endotélio vascular é versátil e multifuncional tendo muitas propriedades sintéticas e

metabólicas, que incluem a regulação de trombose e trombólise, adesão plaquetária,

modulação do tônus vascular e fluxo de sangue, regulação da resposta inflamatória e

imunológica por meio do controle de leucócitos, monócitos e interações de linfócitos na

parede vascular (SUMPIO; RILEY; DARDIK, 2002). Em condições fisiológicas, a função

endotelial é controlada principalmente por fatores hemodinâmicos, pressão arterial e fluxo

sanguíneo, que exercem efeitos na variação da taxa de fluxo sanguíneo, e nas alterações locais

causadas por estímulos químicos (PRATI et al., 2014).

As células endoteliais contribuem para regulação do tônus vascular através da

produção de substâncias vasodilatadoras e vasoconstritoras (PRATI, et al., 2014). Dentre as

substâncias vasodilatadoras liberadas pelo endotélio estão incluídas a prostaciclina

(MONCADA et al, 1976), o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (FHDE)

(FELETOU; VANHOUTTE, 1988), e o NO• (PALMER et al., 1987; IGNARRO, et al.,1987).

Os efeitos vasodilatadores são contrabalançados por mediadores vasoconstritores produzidos

pelo endotélio, como a endotelina-1 (ET-1) (YANAGISAWA et al., 1988) e ROS

(ENDEMANN; SCHIFFRIN, 2004; JUST; WHITTEN; ARENDSHORST, 2008).

10

Esses mediadores são liberados em resposta a uma gama de estímulos químicos, tais

como a trombina, bradicinina ou ADP, bem como alterações hemodinâmicas tais como

alterações no fluxo e na pressão arterial (SUMPIO, 1993).

Como o principal regulador da homeostase vascular, o endotélio mantém o equilíbrio

entre vasodilatação e vasoconstrição (FÉLÉTOU, 2011). No entanto a produção das

substâncias relaxantes é considerada mais importante, uma vez que sobrepõe aos efeitos dos

agentes vasoconstritores (CARVALHO et al., 2001). Perturbar esse equilíbrio estreitamente

regulado leva à disfunção endotelial (SENA, PEREIRA; SEIÇA, 2013).

Considerando-se os principais agentes vasoativos, o NO é um gás inorgânico,

moderadamente solúvel em água e de meia-vida muito curta (de 3 a 60 segundos)

(KIECHELE e MALINSKI, 1993). O NO é um fator vasoativo que não só regula a

vasodilatação através de efeitos sobre as células musculares lisas, mas também inibe a

agregação plaquetária e a adesão de leucócitos à parede do vaso (PRATI, et al., 2014).

Furchgott e Zawadzki (1980) demonstraram que o relaxamento das células musculares

lisas vasculares em resposta à acetilcolina é dependente da integridade do endotélio e envolve

a liberação de um fator relaxante derivado do endotélio (FRDE). Esse fator foi identificado

sete anos mais tarde, como um gás radical livre, o NO (PALMER et al, 1987; FURCHGOTT,

1988) .

O NO, um radical livre altamente reativo, é produzido a partir do aminoácido L-

arginina pela ação de uma família de isoenzimas, as óxido nítrico sintases (NOS)

(MONCADA; HIGGS, 1993; CALVER et al., 1993; KUO; SCHROEDER, 1995). Dois

grandes grupos podem ser identificados, as constitutivas (cNOS) e induzível (iNOS). A iNOS

não é um constituinte celular normal, mas pode ser expressa numa grande variedade de

células e gerar uma grande quantidade de NO de forma sustentada (MONCADA; HIGGS,

1993; BILLIAR, 1995). O NO produzido pela iNOS é independente da estimulação por

agonista e do aumento de íons cálcio (Ca2+

) no meio intracelular (GRIFFITH; STUEHR,

1995; GHOSH, SALERNO, 2003). O NO produzido por esta isoforma de enzima tem função

principalmente no sistema imune, induzido especialmente em macrófagos para aniquilar

patógenos (MARLETTA; SPIERING, 2003).

A óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) é uma isoforma de óxido nítrico sintase

constitutiva (cNOS) que está presente predominantemente como constituinte das células

endoteliais normais e é ativada por um aumento na concentração intracelular de Ca2+

induzida

11

por agonistas como a acetilconina, ATP, substância P, ou por estímulos físicos (MILLER;

VANHOUTTE, 1988; PALMER, 1988).

Em células endoteliais a eNOS liga-se a caveolina-1 na região das cavéolas, um

subconjunto de domínios lipídicos especializados que formam invaginações e assim

aumentam os microdomínios intracelulares onde organelas e proteínas de ancoragem se

agregam. A caveolina-1 inibe a atividade da eNOS e essa interação é regulada pela

concentração de Ca2+

/calmodulina (MICHEL et al., 1997). Após a ativação do agonista ocorre

aumento intracelular de cálcio que se liga a calmodulina e essa ligação Ca2+

/calmodulina

(Ca2+/

CaM) desloca a caveolina-1 e inverte sua interação inibitória com a eNOS (DESSY;

FERON; BALLIGAND, 2010).

A eNOS ativada catalisa a oxidação de cinco elétrons do nitrogênio guanidino da L-

arginina convertendo-a em NO e L-citrulina. Este processo requer oxigênio e um número de

cofatores, incluindo o Ca2+

, calmodulina, fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida-adenina

(NADPH), o mononucleotídeo flavina (FMN), dinucleotídeo de flavina-adenina (FAD) e

tetra-hidrobiopterina (GRIFFITH; STUEHR, 1995; MONCADA, 1997). No primeiro passo, a

L-arginina (L-Arg) é hidroxilada a N-hidroxi-L-Arg e, no segundo passo, N-hidroxi-L-Arg é

oxidada e forma a L-citrulina e o NO (LEONE et al., 1991). Em cada reação, o NADPH é

utilizado como a fonte de elétrons. A transferência de elétrons é essencial para a atividade

catalítica e é regulada pela ligação do complexo cálcio-calmodulina (ABU-SOUD et al.,

1994; WU et al., 1996).

Figura 2: Síntese de NO. A reação que ocorre em dois passos é catalisada pelas óxido nítrico

sintases. No primeiro passo, L-Arg é hidroxilada para formar N-hidroxi-L-Arg com a

utilização de uma molécula de oxigênio e dois elétrons do NADPH. Na segunda etapa, com

um elétron de NADPH e outra molécula de oxigênio, N-hidroxi-L-Arg é convertida em L-

citrulina e NO (ROUSSEAU et al., 2005).

12

O NO formado no tecido vascular difunde-se para as células do músculo liso vascular

liga-se ao ferro (Fe2 +

) do grupo prostético heme da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), o

que ativa esta enzima para produzir guanosina-3-5-monofosfato cíclico (GMPc) a partir da

guanosina-5-trifosfato (GTP) (DENNINGER; MARLETTA, 1999; CERQUEIRA;

YOSHIDA, 2002). O sinal é então transduzido para elementos da cascata de sinalização,

incluindo as proteínas quinases dependentes de GMPc, canais catiônicos dependentes de

GMPc e a fosfodiesterase regulada por GMPc (DENNINGER; MARLETTA, 1999).

Figura 3: Representação esquemática dos mecanismos celulares que levam ao

relaxamento vascular pela via NO-GMPc (CUNHA, 2013).

O GMPc é responsável pelo relaxamento do músculo liso e, consequentemente, pelo

aumento do diâmetro dos vasos sanguíneos e redução da pressão arterial (MONCADA e

HIGGS, 1993). O GMPc fornece o sinal que provoca o relaxamento vascular por meio da

sinalização da proteína-quinase dependente de GMPc (PKG). A ativação da guanilato ciclase

solúvel (GCs), no músculo liso vascular resulta em um aumento nas concentrações de GMPc

intracelular, que provoca a ativação da PKG. Tem sido relatado que a PKG aumenta o

sequestro de Ca2+

, inibe o influxo de Ca

2+, e diminui a sensibilidade de elementos contráteis

ao Ca2+

(GOLLASCH; NELSON, 1997).

13

2.4 Contração e Relaxamento da Musculatura Lisa Vascular

A concentração citoplasmática de cálcio ([Ca2+

]i) no músculo liso é um dos principais

determinantes para a contratilidade muscular lisa (HOROWITZ et al., 1996; LOHN et al.,

2000; WELLMAN; NELSON, 2003). O aumento de [Ca2+

]i no músculo liso durante a

contração ocorre como consequência do influxo de Ca2+

a partir do espaço extracelular ou da

liberação de Ca2+

das reservas intracelulares (HOROWITZ et al., 1996).

O influxo de Ca2+

extracelular ocorre através de canais para Ca2+

operados por

receptores e canais para Ca2+

voltagem dependentes (Cav). A liberação intracelular de Ca2+

do

retículo sarcoplasmático (RS) ocorre pela ativação de 1,4,5 trifosfato inositol (IP3) e dos

receptores de rianodina (RYR), que resulta em aumento intracelular de Ca2+

, que gera a

contração (NELSON, QUAYLE, 1995; IMTAZ et al., 2006;).

A ligação de agonistas como a noradrenalina, angiotensina II, ET-1, dentre outros, aos

receptores acoplados a proteína G heterotrimérica estimula a atividade da fosfolipase C

(PLC). A PLC é uma enzima ligada à membrana lipídica responsável por catalisar a formação

de dois potentes segundo mensageiros, o trifosfato inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG), a

partir do seu substrato o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2). A ligação de IP3 a receptores

no retículo sarcoplasmático (IP3R) resulta na liberação de Ca2+

para o citosol. O DAG,

juntamente com o Ca2+

ativa a proteína quinase C (PKC), que fosforila proteínas alvo

específicas (WEBB, 2003).

O aumento de Ca2+

intracelular é um dos principais determinantes para a fosforilação

da cadeia leve de miosina. A ligação de quatro íons Ca2+

a uma molécula de calmodulina

resulta na formação do complexo Ca2+/

CaM e que ativa a quinase da cadeia leve de miosina

(MLCK) responsável pela fosforilação da cadeia leve reguladora e leva a um aumento na

atividade da ATPase da miosina e ligação da miosina com o filamento de actina com

consequente contração (STULL et al., 1991).

No entanto, estudos realizados com métodos de permeabilização celular utilizando

receptores acoplado à proteína G confirmaram que quando esses músculos permeabilizados

são ativados por um agonista, enquanto o [Ca2+

]i é retido, eles respondem com aumento da

fosforilação cadeia leve de miosina (MLC) (KITAZAWA et al., 1989). Este fenômeno foi

chamado de sensibilização ao Ca2+

(SOMLYO, SOMLYO, 2003) e atualmente muita atenção

tem sido dada ao papel da proteína G monomérica, Rho, na sensibilização ao Ca2+

e na

contração do músculo liso. Nesta situação, a Rho ativada induz a fosforilação e inativação da

14

fosfatase da cadeia leve da miosina mediada pela Rho-quinase (SOMLYO; SOMLYO, 2000).

Estudos relatam que a inibição da fosfatase é capaz de induzir a contração da musculatura lisa

permeabilizada em condições em que a concentração de Ca2+

é mantida abaixo do limite de

contração (RUEGG; DISALVO; PAUL, 1982).

O relaxamento do músculo liso ocorre como resultado da ação direta de substâncias

que estimulam a inibição do mecanismo contrátil ou da remoção direta do estímulo contrátil.

O processo de relaxamento requer a diminuição da [Ca2+

]i e o aumento da atividade da

fosfatase da cadeia leve de miosina (MLCF) (MORGAN, 1990; SOMLYO et al., 1999).

O mecanismo eletromecânico do relaxamento muscular, que se dá por alterações no

potencial de membrana, abrange a hiperpolarização (SOMLYO; SOMLYO, 1968;

REMBOLD, 1996). Agentes que aumentam a concentração de AMP cíclico (AMPc) ou GMP

cíclico (GMPc) induzem o relaxamento por ativar canais para K+ que leva a hiperpolarização e

diminui o influxo de Ca2+

(NELSON et al., 1990; THOMBURY et al., 1991).

O aumento do sequestro e saída de Ca2+

ocorre pelo acréscimo da atividade da Ca2+

-

ATPase da membrana plasmática, pela Ca2+

-ATPase situada na membrana do retículo

sarcoplasmático, diminuição da [Ca2+

]i por estimulação do trocador Na+/Ca

2+, também

localizado na membrana plasmática (HOROWITZ et al, 1996; WEBB, 2003) e pela ação do

GMPc (NIE, MENG, 2006). A redução da [Ca2+

]i desfaz o complexo Ca2+/

CaM, inativando a

MLCK e ativa a fosfatase da miosina, que é a enzima responsável por desfosforilar a MLC,

levando ao relaxamento muscular (HARTSHORNE, 1987).

2.5 Inflamação, Estresse Oxidativo e Disfunção Endotelial

Várias condições patológicas, incluindo alterações nas propriedades anticoagulante e

anti-inflamatórias do endotélio, modulação de crescimento vascular deficiente e desregulação

do remodelamento vascular tem sido utilizadas para se referir ao termo disfunção endotelial

(GIMBRONE, 1995). Entretanto, vários estudos tem utilizado esse termo para se referir a

uma diminuição do vasorrelaxamento dependente do endotélio causado por uma perda da

bioatividade na parede do vaso (SCHACHINGER; BRITTEN; ZEIHER, 2000).

Uma via comum mediando o estresse oxidativo, disfunção vascular e indução de

fatores inflamatórios foi mostrada como uma evidência crescente (LIAO et al., 1994). Estudos

levantaram a questão de que a disfunção endotelial tem como uma causa importante a

inflamação (VALLANCE; COLLIER; BHAGAT, 1997).

15

A inflamação pode produzir disfunção endotelial pela capacidade de prejudicar a

vasodilatação mediada pelo fluxo aumentando a vasoconstrição, através da redução dos

vasodilatadores derivados do endotélio (VERMA et al., 2002) ou reduzindo a sua

biodisponibilidade (VITA et al, 2004).

As citocinas têm um importante papel na lesão endotelial induzida por inflamação; e

alterações na função do endotélio podem estar subjacentes a associação entre doença

cardiovascular e inflamação (ESTEVE et al., 2007). A exposição de células endoteliais às

citocinas pró-inflamatórias induz à atividade pró-coagulante (VANE; ANGGARD;

BOTTING, 1990), conduz à expressão de moléculas de adesão na superfície celular

(ALEXANDER, 1995) e prejudica o relaxamento vascular dependente do endotélio

(BHAGAT; COLLIER; VALLANCE, 1996).

As citocinas induzem a expressão de várias enzimas, tais como a iNOS e a ciclo-

oxigenase-2 (COX-2), que, por sua vez, produzem mediadores com ações vasculares que

contribuem para a resposta inflamatória (VILA; SALAICES, 2005). As citocinas podem

induzir vasoconstrição por aumentar a síntese de ET-1 que reduz a expressão de eNOS ou por

redução da biodisponibilidade de NO (VILA; SALAICES, 2005). A diminuição da produção

de NO promove a adesão dos leucócitos, trombose, vasoconstrição e proliferação celular

(VITA; KEANEY, 2002).

A biodisponibilidade deficiente de NO é um evento primordial na disfunção

endotelial. Esta é caracterizada por uma redução do vasorrelaxamento mediado pelo

endotélio, desregulação hemodinâmica, capacidade fibrinolítica prejudicada, volume

aumentado, excesso de produção de fatores de crescimento, aumento da expressão de

moléculas de adesão e genes inflamatórios, aumentada permeabilidade da camada de células,

e aumento do estresse oxidativo (TADDEI, et al., 2003; LAUGHLIN; NEWCOMER;

BENDER, 2008; CADE, 2008; ADDABBO; MONTAGNANI; GOLIGORSKY, 2009;

HIROSE et al., 2010).

O estresse oxidativo descreve a condição em que uma produção excessiva de ROS ou

espécies reativas de nitrogênio (RNS) excede os mecanismos de defesa antioxidantes

endógenos, tendo um efeito negativo sobre a função celular, devido à lesão das membranas

lipídicas, enzimas e ácidos nucleicos (CAI; HARRISON, 2000).

Todas as camadas da parede vascular têm sistemas enzimáticos capazes de produzir

ROS, como O2•-, radical hidroxila, NO, radicais lipídicos, peróxido de hidrogênio (H2O2),

ácido hipocloroso e peroxinitrito (CAI; HARRISON, 2000). Na vasculatura, as fontes mais

16

importantes de geração de ROS são a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial

(CHANCE; SIES, 1979; TURRENS, 2003; JEZEK; HLAVATA, 2005), as NADPH oxidases

(GRIENDLING et al., 1997; RAY; SHAH, 2005; SOCCIO et al., 2005) e a xantina oxidase

(SUZUKI et al., 1995; CAI; HARRISON, 2000). A eNOS desacoplada e as enzimas,

lipoxigenase e ciclo-oxigenase, citocromo P450, peroxidases e outra hemoproteínas são fontes

de ROS (CAI; HARRISON, 2000).

O NO é uma espécie radicalar que reage rapidamente com uma gama de moléculas

que contêm orbitais com elétrons não pareados que são tipicamente outros radicais livres ou

metais de transição (BECKMAN; KOPPENOL, 1996).

O NO reage com o O2

•- a uma taxa significativamente mais rápida do que a reação do

O2•-

com a enzima superóxido dismutase, formando o peroxinitrito (SARAN; MICHEL;

BORS, 1990; BECKMAN; KOPPENOL, 1996). A reação do O2•-

com NO diminui a

biodisponibilidade NO

e seu efeito vasodilatador e o peroxinitrito provoca impactos

substanciais no sistema vascular (COOKE; DAVIDGE, 2003; WOLIN et al., 2010).

Doenças inflamatórias podem provocar lesões sobre o endotélio vascular que estão

fortemente ligadas ao excesso de produção de NO por leucócitos e/ou à redução na atividade

do sistema antioxidante que resulta em uma formação maciça de ROS (UM et al., 2003;

MENDELSON et al. 2005; FORTUÑO et al., 2005). A pancreatite aguda resulta em um

estresse oxidativo que amplifica o processo inflamatório pelo recrutamento e a liberação de

mediadores de células inflamatórias e causa danos nos tecidos, levando a uma resposta

inflamatória sistêmica (ROBLES; VAZIRI; ICHII, 2014).

As células endoteliais, assim como todas as outras células, possuem complexos

sistemas antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, que atuam sinergicamente para

defender o organismo de danos causados pelos radicais livres (LEE et al., 2011). A

deficiência de antioxidantes é outro mecanismo que ocasiona estresse oxidativo em células

endoteliais.

Os sítios de inflamação e infecção são fonte de citocinas, quimiocinas, e ROS. Os

leucócitos ativados aderem à superfície das células endoteliais também são uma importante

fonte de ROS . Citocinas no local inflamatório podem contribuir significativamente para a

produção de ROS, particularmente pelos leucócitos polimorfonucleares. Durante este período,

o endotélio pode ser exposto a concentrações elevadas de múltiplas ROS por um período de

tempo prolongado (LUM; ROEBUCK, 2001).

17

O estresse oxidativo está intimamente relacionado com a progressão de muitas

doenças e estas condições levam a anormalidades vasculares generalizadas que

provavelmente resultam em disfunção endotelial (COOKE; DAVIDGE, 2002). Não é

totalmente compreendido o mecanismo através do qual o estresse oxidativo medeia a função

endotelial e a reatividade vascular, entretanto a formação de peroxinitrito numa manifestação

de estresse oxidativo pode estar envolvida na progressão de uma grande variedade de doenças

(BECKMAN; KOPPENOL, 1996), principalmente na presença de quadro inflamatório,

situação na qual a expressão de iNOS pode produzir grandes quantidades de NO (CHAUHAN

et al., 2003).

18

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Investigar as alterações funcionais in vitro em artéria mesentérica de ratos com

pancreatite aguda e mecanismos moleculares envolvidos.

3.2 Específicos

Avaliar a resposta vasorrelaxante da artéria mesentérica superior em animais com

pancreatite aguda;

Investigar a resposta contrátil da artéria mesentérica superior em animais com

pancreatite aguda;

Comparar as respostas vasculares encontradas nos animais com pancreatite nos

períodos de 24 e 48 horas pós-indução por ODBP;

Mensurar a produção de NO e O2•- na artéria mesentérica superior de animais com

pancreatite aguda.

19

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados 40 ratos machos adultos de 6 a 8 semanas, da espécie Wistar (220-

270 g), provenientes da FIOCRUZ/Salvador-BA ou do centro Multidisciplinar para

Investigação Biológica (CEMIB-UNICAMP). Eles foram alojados no Laboratório de

Farmacologia Cardiovascular (LAFAC), em caixas apropriadas e mantidos a 21-22°C com

livre acesso a água e comida em um ciclo claro-escuro de 12 h. Os animais não foram

privados do acesso à ração e água antes do experimento. Os protocolos experimentais foram

realizados de acordo com os princípios éticos de experimentação animal e foram submetidos

ao Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS. Todos os procedimentos descritos neste

trabalho foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da

Universidade Federal de Sergipe (CEPA/UFS) sob o número de protocolo 13/14.

Ao final dos experimentos, os animais foram eutanasiados por exsanguinação sob

anestesia. Suas carcaças foram acondicionadas em sacos plásticos e guardadas em freezer

reservado para este fim até o descarte definitivo conforme a rotina do Departamento de

Fisiologia, pelo serviço de coleta seletiva de lixo biológico da UFS.

4.2 Procedimento Experimental de Indução da Pancreatite Aguda por ODBP

Para a indução da pancreatite os animais foram anestesiados com quetamina (80

mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por via intraperitoneal, submetidos à laparotomia e

posteriormente à ODBP, conforme descrito anteriormente (SAMUEL et al., 1994) e

modificado por estudo de nosso grupo de pesquisa (SANTANA et al., 2012).

Este procedimento consiste em uma laparotomia mediana através da qual o pâncreas

foi exteriorizado pela porção duodenal, permitindo a realização da ligadura do ducto

biliopancreático na região próxima ao duodeno. Para realização de tal procedimento duas

linhas foram inseridas contornando o ducto biliopancreático que foi suturado em duas

posições com uma distância de, pelo menos, 0,5 cm entre elas. Entre estas posições, foi

realizado um pequeno corte, com o objetivo de garantir a obstrução do fluxo no ducto

biliopancreático. Simultaneamente grupos de animais foram submetidos à anestesia,

20

laparotomia e exteriorização do pâncreas, sem a ODBP, como controle experimental (sham ou

“falso operado”).

Os animais foram eutanasiados 24 (grupos sham 24 h e ODBP 24 h) ou 48 horas

(grupos sham 48 h e ODBP 48 h) após o procedimento cirúrgico, por exsanguinação sob

anestesia. Não foram encontrados sinais de hemorragia na cavidade peritoneal no momento da

laparotomia para retirada da artéria mesentérica superior.

4.3 Drogas

Durante a realização dos experimentos foram utilizadas as seguintes drogas: cloridrato

de L (-) fenilefrina (FEN) e acetilcolina (ACh), todas obtidas da Sigma. Todas as soluções

foram mantidas a 0ºC e quando necessário, foram diluídas em água destilada para

concentrações desejadas.

4.4 Soluções nutritivas

Para a preparação da solução nutritiva (Tyrode) foram utilizadas as seguintes

substâncias: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de Ca2+

di-hidratado

(CaCl2.2H2O), cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O), bicarbonato de sódio

(NaHCO3), fosfato de sódio mono-hidratado (NaH2PO4), todos da Vetec, e glicose (C6H12O6),

da Qeel.

Na solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80 mM, a

concentração de Na+ foi equimolarmente substituída. As tabelas a seguir mostram as

composições das mesmas.

21

Tabela 1: Composição da solução de Tyrode para anéis de artéria mesentérica.

Substância Concentração (mmol/L)

NaCl 158,3

KCl 4,0

CaCl2 2,0

MgCl2 1,05

NaHCO3 10,0

NaH2PO4 0,42

Glicose 5,6

Tabela 2: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80

mM (KCl 80).

Substância Concentração (mmol/L)

NaCl 82,3

KCl 80,0

CaCl2 2,0

MgCl2 1,05

NaHCO3 10,0

NaH2PO4 0,42

Glicose 5,6

4.5 Dosagem Bioquímica para Determinação da Amilase

A determinação da amilase para cada grupo experimental foi realizada por método

colorimétrico utilizando-se kit comercial (kit cinético para determinação de amilase;

Labtest®).

22

4.6 Experimentos de Reatividade Vascular

4.6.1 Preparação da artéria mesentérica superior isolada de rato

Os ratos foram previamente anestesiados e então eutanasiados por dessangramento.

Em seguida, através de uma incisão no abdome do animal, foi retirada a artéria mesentérica

superior. Anéis do primeiro segmento da artéria (1 - 2 mm) foram obtidos livres de tecido

conjuntivo e adiposo, e foram mantidos em cubas para órgão isolado contendo 10 mL de

solução nutritiva de Tyrode, pH a 7,4, a 37ºC e gaseificada com uma mistura carbogênica

(95% de O2 e 5% de CO2). Para o registro das contrações isométricas, os anéis foram

suspensos por linhas de algodão fixadas a transdutores de força (Letica Scientific Instruments,

TRI 210, Barcelona, Espanha). Estes transdutores estavam conectados a um sistema de

aquisição de dados de quatro canais constituído por um amplificador de sinais (AECAD 0804,

AVS, São Paulo-SP, Brasil) e uma interface conversora analógica-digital (DATAQ

Instruments, DI 148U, Akron – OH, USA) com software de aquisição (DATAQ Instruments,

Windaq Lite, Akron – OH, USA).

Cada anel foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de, no

mínimo, 60 min. Durante este tempo, a solução nutritiva foi trocada a cada 15 min para

prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA e ALTURA, 1970).

No final de cada experimento, a presença do endotélio funcional foi verificada pela

habilidade da ACh (1 mol/L), um agonista muscarínico, em relaxar os anéis pré-contraídos

com FEN (1 mol/L), um agonista α1-adrenérgico. Foram considerados com endotélio

funcional, os anéis que apresentaram relaxamentos superiores a 75% sobre a pré-contração

com FEN. Já os anéis com relaxamentos inferiores a 10%, foram considerados sem endotélio

funcional (FURCHGOTT e ZAWADZKI, 1980).

4.6.2 Avalição da resposta vasocontrátil induzida pela FEN

Após período de estabilização e teste funcional do endotélio vascular curvas

concentração-resposta também foram obtidas para FEN (10-9

– 10-4

M), um agonista α1-

adrenérgico.

23

4.6.3 Avalição da resposta vascular relaxante induzida pela acetilcolina

Após o período de estabilização, os anéis foram pré-contraídos com KCl 80 mM e em

seguida foram lavados a cada 15 min com solução nutritiva de Tyrode, durante um período de

60 min. Foram obtidas curvas concentração-resposta para o agente vasodilatador: ACh (10-9

-

10-4

M). As respostas vasorelaxantes foram calculadas a partir da contração induzida por FEN

(1 µM) que foi considerada como 100%.

4.7 Mensuração das Concentrações Intracelulares do NO

Para detecção das concentrações intracelulares de NO, os anéis de artéria mesentérica

dos grupos experimentais foram obtidos como previamente descrito e carregados com 10 µM

da sonda fluorescente sensível ao NO•, 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofluoresceína

diacetato (DAF-FM), InvitrogenTM

/Molecular Probes®

, por 30 minutos à 37°C. As amostras

foram incubadas com as sondas fluorescentes em solução de Tyrode e então lavadas no

mesmo tampão para remover o excesso das mesmas.

Para a execução deste experimento na mesentérica, os anéis da artéria mesentérica

previamente carregados com a sonda foram incluídos em meio crioprotetor, Tissue-Tek

O.C.T. (SAKURA Finetechnical®

, Japan) e mantidos à -80ºC. Posteriormente foram

realizados cortes em criostato (Leica CM 1850 criostato, Leica Instruments, Alemanha) com

espessura de 20 µm. Os cortes dos anéis foram transferidos para lâminas histológicas, e para

aquisição de imagens fluorescentes, foi utilizado microscópio de fluorescência (IX2-ICB,

Olympus®

, EUA) acoplado a câmera digital (XM-10, Olympus ®, EUA) com excitação e

emissão em comprimentos de onda semelhante ao utilizado para detecção em células

vasculares.

O software ImageJ 1.38 (NIH) foi utilizado para o processamento das imagens

capturadas. As imagens de microscopia de fluorescência foram analisadas de acordo com a

intensidade de fluorescência por área e os resultados obtidos foram expressos em unidades

arbitrárias (u.a.). A análise dos resultados foi realizada no Prism 5.0.

24

4.8 Mensuração de O2•- intracelular

Para detecção de O2•- intracelular, os anéis de artéria mesentérica foram processados

como acima descrito, porém, carregados com 10 µM da sonda fluorescente sensível ao O2•-,

di-hidroetídeo (DHE), Calbiochem®

, por 30 min à 37ºC. As imagens foram capturadas e as

análises processadas como descrito anteriormente.

4.9 Análise Estatística

Os valores foram expressos como média erro padrão da média (e.p.m). Quando

necessário foram utilizados o test t de Student (não-pareado) e a análise de variância

(ANOVA) de uma ou duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni para avaliar a

significância das diferenças entre as médias. Em todos estes procedimentos foi utilizado o

programa estatístico GraphPadPrism (versão 5.0).

As imagens de microscopia de fluorescência foram analisadas de acordo com a

intensidade de fluorescência por área, sendo expressas em média e.p.m. das u.a. e foi

adotado o test t de Student.

Para efeito estatístico, foram considerados significativos os valores que apresentavam

P0,05.

25

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A pancreatite aguda é uma condição inflamatória do pâncreas caracterizada

clinicamente por dor abdominal e concentrações elevadas de enzimas pancreáticas no sangue,

associada a edema, necrose das células acinares, hemorragia e inflamação grave do pâncreas

(ZHAO, LIAO, NISSEN, 2013). Entretanto, também é comum serem encontradas alterações

cardiovasculares nos pacientes (YEGNESWARAN, KOSTIS, PITCHUMONI, 2011).

O estabelecimento de modelos de pancreatite experimental para investigar as

alterações cardiovasculares é de importância para permitir compreender como tais

manifestações são desencadeadas e os mecanismos subjacentes. No presente estudo foi

utilizada a pancreatite induzida por ODBP, considerada como pancreatite grave e associada a

intensa resposta inflamatória sistêmica (YUAN et al, 2011). Para estabelecer a presença de

pancreatite aguda nos animais utilizados neste estudo, foi realizada a dosagem de amilase

sérica utilizando amostras de soro coletadas após 24 h ou 48 h do procedimento cirúrgico. A

hiperamilasemia é utilizada para auxiliar no diagnóstico da pancreatite, assim como a

elevação de lipase (PEZZILI et al., 1993; OTSUKI et al., 2013).

Observou-se que a pancreatite aguda induzida por ODBP foi acompanhada de

aumento na concentração sérica de amilase tanto 24 h (p<0,05) quanto 48 h amilase (p<

0,001) após a obstrução do ducto biliopancreático, em relação ao grupo sham (Figura 3).

24 48

0

1000

2000

3000

4000*** SHAM

ODBP

*

Tempo (h)

Am

ilase (

U/L

)

Figura 4: Concentração sérica de amilase em ratos nos grupos sham e ODBP após 24 e

48 h do procedimento cirúrgico. Os valores representam a média ± e.p.m. Os dados foram

analisados por ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni, n = 6. * p < 0,05;

*** p< 0,001 vs sham.

26

A elevação da atividade de amilase no soro foi observada em ratos com pancreatite

aguda induzida por ODBP (HIRATA et al, 2002; BARRET et al., 2008). No presente estudo a

hiperamilasemia encontrada após 24 h da ODBP corrobora estudos realizados anteriormente

(SEVILLANO et al, 2003; SANTANA et al., 2012). Observou-se que após 48 h da obstrução

houve um maior aumento na concentração sérica de amilase no grupo ODBP, quando

comparado ao grupo sham, pois o fator tempo foi fator de variação significativa (p<0,05;

ANOVA de duas vias). Segundo Fan e Andrén-Sandberg, (2010), em humanos a

hiperamilasemia decorrente da pancreatite permanece elevada por 3 a 5 dias, mostrando a

possível correlação do modelo utilizado no presente estudo com esta condição clínica. De

acordo com estudo prévio recente do nosso grupo de pesquisa, além da hiperamilasemia, na

pancreatite induzida por ODBP também são encontradas elevações da concentração de lipase,

da atividade de mieloperoxidase pancreática e pulmonar, do edema pancreático e da

peroxidação lipídica no pâncreas, bem como está presente a hiperalgesia abdominal, após 24 h

da ODBP (SANTANA et al., 2012).

A pancreatite aguda causada por ODBP induz um processo inflamatório agudo do

pâncreas que progride para a síndrome da resposta inflamatória sistêmica generalizada com o

desenvolvimento de síndrome da disfunção múltipla de órgãos (WEBER; ADLER, 2001;

BHATIA, 2002; BROWNE; PITCHUMONI, 2006).

Não há na literatura estudos que tenham investigado possíveis alterações vasculares

em animais com pancreatite por ODBP. Relacionado à avaliação destas alterações na

pancreatite, o estudo de Camargo et al. (2008) foi o primeiro a examinar a reatividade de

anéis de artéria mesentérica e pulmonar após indução de pancreatite aguda por injeção no

ducto biliopancreático de um sal biliar (taurocolato de sódio) ou de fosfolipase A2 (PLA2)

secretórias.

Como as alterações na função vascular são propostas como fatores que contribuem

sobremaneira para a morbidade dos pacientes com pancreatite (YEGNESWARAN, KOSTIS,

PITCHUMONI, 2011), o presente estudo propôs uma investigação destes efeitos no modelo

de pancreatite induzida por ODBP em ratos, que mimetiza a pancreatite causada por litíase

biliar em humanos, com o intuito de gerar conhecimento científico sobre os mecanismos

envolvidos nesta condição e permitir abordagens futuras que levem ao melhor tratamento

desta doença em humanos.

A Figura 5 mostra a resposta vasorrelaxante obtida com a incubação de ACh aos anéis

de artéria mesentérica superior de rato, coletados após 24 h do procedimento cirúrgico, com

27

endotélio funcional, pré-contraídos com fenilefrina (1 mol/L). A ANOVA de duas vias

mostrou interação significativa entre os fatores concentração de ACh e resposta relaxante

(p=0,0008), indicando que as curvas para os grupos Sham e ODBP apresentam diferenças

entre si. Como pode ser observado nesta Figura, nas artérias dos animais que tiveram o ducto

biliar obstruído houve uma diminuição significativa na potência (pD2= 6,50 ± 0,05; n=4) e na

resposta máxima de relaxamento (Emax= 96,0 ± 1,0; n=4) em comparação com a potência

(pD2= 7,20 ± 0,05; n=4) e a com a resposta máxima (Emax= 99,7 ± 0,8; n=4; Tabela 3) do

grupo sham.

3456789

0

25

50

75

100

SHAM 24 h, pD2=7,20 ± 0,05

ODBP 24 h, pD2=6,50 ± 0,05***

*

- log [ACh] (mol/L)

% d

e r

ela

xam

en

to


– 10-4

mol/L) em

anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato após 24 h do procedimento

cirúrugico, com endotélio funcional e pré-contraídos com fenilefrina (1 µmol/L). Os

valores foram expressos como média ± e.p.m. Os dados de pD2 ou Emax foram analisados por

teste t de Student; (sham, n = 4; ODBP, n = 4). *p<0,05 ou *** p < 0,001 vs sham.

Esse resultado corrobora o estudo de Camargo et al. (2008) no qual foi observado que

em anéis de artéria mesentérica, a potência para a acetilcolina foi significativamente

diminuída em animais que foram submetidos a pancreatite por administração de tauracolato

de sódio ou fosfolipase A2 no ducto biliopancreático em comparação com o grupo que

recebeu solução salina. Entretanto, nesse mesmo estudo não foram encontradas alterações nas

respostas máximas para o agonista muscarínico, diferente do que foi encontrado no presente

estudo e mostradas na figura acima.

28

Possivelmente, as alterações na resposta máxima verificadas no presente estudo

devem-se ao fato que a pancreatite aguda induzida por ODBP é um modelo associado a

elevada gravidade da doença, que mimetiza a pancreatite biliar grave, que causa uma

inflamação sistêmica com disfunção múltipla de órgãos e pode levar a morte (YUAN et al.,

2011). De acordo com o estudo de Hingorani et al. (2000) mesmo um processo inflamatório

atenuado, como o causado pela vacina de Salmonella typhi pode alterar a regulação endotelial

de tônus vascular na circulação arterial em humanos. Além destes fatos, o estudo de Camargo

et al. (2008) utilizou o tempo de 4 h de indução ao passo que no presente estudo foram

utilizadas inicialmente 24 h de indução.

Estudo de Yuan et al. (2011) mostrou que 75% da mortalidade em ratos com

pancreatite aguda induzida por ligadura do ducto ocorre em 2 a 4 dias após a obstrução. A alta

taxa de mortalidade observada na pancreatite aguda neste modelo experimental foi associada

com o progressivo aumento sistêmico de citocinas, instabilidade cardiovascular, lesão

pulmonar aguda, lesão hepática e disfunção renal, sugerindo que a sistêmica inflamação com

falência múltipla de órgãos é a causa imediata da morte (YUAN et al., 2011).

Como a resposta inflamatória sistêmica deve aumentar com o tempo, é plausível

existir uma correlação das alterações vasculares com o tempo de indução da pancreatite.

Diante disso, buscamos avaliar a resposta relaxante dependente da concentração de ACh, em

anéis de artéria mesentérica coletados 48 h após o procedimento cirúrgico.

A Figura 6 mostra a resposta vasorelaxante à ACh de anéis de artéria mesentérica

superior de rato, coletadas após 48 h do procedimento cirúrgico, com endotélio funcional, pré-

contraídos com FEN. A ANOVA de duas vias também mostrou interação significativa entre

os fatores concentração de ACh e resposta relaxante (p<0,0001), indicando que as curvas para

os grupos Sham e ODBP apresentam diferenças entre si. Como pode ser observado, nas

artérias dos animais que tiveram o ducto biliar obstruído houve uma diminuição significativa

na potência (pD2= 6,4 ± 0,02; n=8) e na resposta máxima de relaxamento (Emax= 81,5 ± 0,98;

n=8) em comparação em comparação com a potência (pD2= 7,2 ± 0,02; n=4) e a com a

resposta máxima (Emax= 97,7 ± 0,80; n=4; Tabela 3) do grupo sham.

29

3456789

0

25

50

75

100

SHAM 48 h, pD2=7,20 ± 0,02

OBDP 48 h, pD2=6,40 ± 0,02***

***

- log [ACh] (mol/L)

% d

e r

ela

xam

en

to


– 10-4

mol/L) em

anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato em anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato após 48 h do procedimento cirúrugico, com endotélio funcional

e pré-contraídos com fenilefrina (1 µmol/L). Os valores foram expressos como média ±

e.p.m. Os dados de pD2 ou Emax foram analisados por test t de Student; (sham, n = 4; ODBP, n

= 8). *** p < 0,001 vs sham.

Vallance et al. (1997) propuseram que a infecção aguda ou inflamação pode resultar

em uma diminuição reversível no relaxamento vascular dependente do endotélio. Os

resultados do presente estudo mostram que a indução da pancreatite por ODBP promoveu

uma diminuição do vasorrelaxamento dependente do endotélio no período de 24 h após a

indução e o efeito prejudicial sobre o relaxamento do vaso aumenta após 48 h da indução,

mostrando que o aumento do tempo de exposição dos animais a ODBP agrava a diminuição

da resposta relaxante à acetilcolina. É possível que estes efeitos sejam atribuídos a ação de

citocinas pró-inflamatórias, principalmente o TNF-. O estudo de Wimalasundera et al.

(2003) demonstrou que a incubação desta citocina com anéis de artéria mesentérica por 30

minutos reduz o relaxamento dependente de NO induzido por ACh.

Uma vez que nossos resultados indicam que a resposta relaxante da artéria mesentérica

a ACh se encontra comprometida pela indução da pancreatite, para melhor avaliar a

30

funcionalidade desta artéria foi investigada a resposta contrátil a FEN, um agonista de

receptor adrenérgico, em anéis de artéria mesentérica de ratos com ODBP.

A Figura 7 mostra as curvas de concentração-resposta a FEN em anéis de artéria

mesentérica superior de rato, coletadas após 24 h do procedimento cirúrgico. A ANOVA de

duas vias indicou interação significativa entre os fatores concentração de FEN e resposta

contrátil (p<0,0001), indicando que as curvas para os grupos Sham e ODBP apresentam

diferenças entre si. Nos animais que tiveram o ducto biliar obstruído houve uma diminuição

significativa na tensão desenvolvida durante a contração (Emax= 1,01 ± 0,01 g; n=4) em

comparação com o grupo sham (Emax= 1,09 ± 0,01 g; n=4).

456789

0.0

0.5

1.0

SHAM 24 h, pD2=6,00 ± 0,01

ODBP 24 h, pD2=5,20 ± 0,01***

- log [FEN] (mol/L)

Ten

são

(g

)

**


– 10-4

mol/L) de


cirúrgico, com endotélio funcional. Os valores foram expressos como média ± e.p.m. Os

dados de pD2 e Emax foram analisados por teste t de Student; (sham, n = 4; ODBP, n = 4).

**p < 0,01 ou *** p < 0,001 vs sham.

Nossos resultados demonstraram que na artéria mesentérica de ratos com ODBP, por

um período de 24 h, houve redução na potência e na resposta máxima contrátil a FEN quando

comparada ao grupo sham. Esses dados se assemelham aos do estudo de Camargo et al.

(2008) que mostraram que a pancreatite induzida por tauracolato de sódio causou uma

31

redução da potência da FEN em anéis de artéria mesentérica e de artéria pulmonar, mas sem

alterações na resposta máxima, após 4 h da indução.

Esses dados corroboram também o estudo de Aires et al. (2013) que mostrou que em

anéis aórticos de animais intoxicados com paraquat, um herbicida de contato que causa alta

taxa de mortalidade por envenenamento, a vasoconstrição induzida por FEN foi fortemente

prejudicada.

A Figura 8 mostra o efeito vasoconstritor induzido pela fenilefrina em anéis de artéria

mesentérica superior de rato, coletadas após 48 h do procedimento cirúrgico. A ANOVA de

duas vias demonstrou interação significativa entre os fatores concentração de FEN e resposta

contrátil (p<0,0001), indicando que as curvas para os grupos Sham e ODBP apresentam

diferenças entre si. Como pode ser observado, persistiu a diminuição da tensão desenvolvida

durante a contração nos animais que tiveram o ducto biliar obstruído (Emax= 0,84 ± 0,01; n=8)

em comparação com o grupo sham (Emax= 0,99 ± 0,004; n=5).

456789

0.0

0.5

1.0

SHAM 48 h, pD2=6,50 ± 0,02

ODBP 48 h, pD2=5,60 ± 0,01***

- log [FEN] (mol/L)

Ten

são

(g

)

***


– 10-4

mol/L) em


cirúrgico, com endotélio funcional. Os valores foram expressos como média ± e.p.m. Os

dados de pD2 e Emax foram analisados por teste t de Student; (sham, n = 5; ODBP, n = 8). ***

p < 0,001 vs sham.

O efeito prejudicial sobre a tensão de contração também aumentou após 48 h da

indução, mostrando que o aumento do tempo de exposição dos animais a ODBP também

agrava a diminuição da resposta contrátil a FEN. Sugerimos que a diminuição da

32

sensibilidade da resposta contrátil à FEN ocorra devido às complicações desta condição

patológica na fase inicial da pancreatite aguda. No entanto, outros estudos são necessários

para identificar a via de sinalização na qual o processo inflamatório que ocorre na pancreatite

aguda leva a essa resposta alterada a FEN.

A diminuição à resposta relaxante da ACh e à resposta contrátil da FEN também foi

observada em estudo com modelo de sepse de Wiel et al., (2006), em que foram utilizados

coelhos infectados com 0,5 mg/kg da endotoxina LPS (Sorotipo Escherichia coli)

administrada por via intravenosa. Neste estudo, o LPS reduziu a resposta máxima à ACh,

assim como modificou a sensibilidade à FEN.

A tabela 3 apresenta os valores da potência e resposta máxima das curvas de

concentração-resposta a ACh e FEN de artérias mesentéricas de ratos após a pancreatite,

mostradas nas Figuras 4-7.

Tabela 3: A potência (pD2) e resposta máxima (Emax) de acetilcolina (ACh), e

fenilefrina (FEN) de artérias mesentéricas de ratos após pancreatite.

A potência (pD2) e resposta máxima (Emax) de acetilcolina (ACh) e fenilefrina (FEN) obtidas a partir

das curvas de concentração-resposta de anéis de artéria mesentérica dos grupos sham e ODBP. A

potência é representada como o log da concentração molar para produzir 50% da resposta máxima. Os

valores foram expressos como média ± e.p.m. para um n de 4-8 animais; *p<0,05; ** p < 0,01; *** p

< 0,001 vs o respectivo sham; ###p<0,001 vs o respectivo sham ou ODBP 24 h (ANOVA de duas vias

seguido por pós-teste de Bonferroni).

Foram encontradas reduções significativas na potência e na resposta máxima para a

ACh e FEN dos anéis de artérias mesentéricas de animais com ODBP, tanto coletados 24 h

quanto 48 h após a indução, quando comparados com o grupo sham. Não foram encontradas

diferenças significativas entre o grupo sham de 24 h e sham de 48 h em relação a potência e a

resposta máxima para Ach, no entanto, foram observados aumento de potência e redução de

resposta máxima para o efeito da FEN em animais do grupo sham 48 h em comparação ao

pD2 Emax

Grupos

Sham 24 h

ODBP 24 h

Sham 48 h

ODBP 48 h

ACh

7,20±0,05

6,50±0,05***

7,20±0,02

6,40±0,02***

FEN

6,00±0,01

5,20±0,01***

6,50±0,02###

5,60±0,01***###

ACh (%)

99,7±0,8

96,0±1,0*

97,7±0,8

81,5±0,9***###

FEN(g)

1,09±0,01

1,01±0,01**

0,99±0,004###

0,84±0,01***###

33

grupo sham 24 h. A redução da resposta máxima sugere que a realização do processo

cirúrgico com laparotomia e exposição do pâncreas gera um quadro inflamatório que apesar

de não ser intenso, interfere na resposta contrátil. Por sua vez, o aumento da potência no

tempo de 48 h para o grupo sham permanece de difícil interpretação. A comparação entre o

grupo ODBP de 24 h e ODBP de 48 h mostrou diferença significativa para a resposta máxima

da ACh e para a potência e resposta máxima da FEN.

Os dados obtidos mostram uma diminuição significativa na resposta do relaxamento

dependente do endotélio em artéria mesentérica de ratos com ODBP. O relaxamento vascular

ocorre principalmente pela ação do NO produzido pela eNOS (FÖRSTERMANN; MÜNZEL,

2006). O NO pode ser formado a partir da ativação de receptores muscarínicos do tipo M3

presentes no endotélio (FLEMING et al.,1991). Após a ativação do agonista ocorre o aumento

intracelular de cálcio que se liga a calmodulina e essa ligação cálcio/calmodulina ativa a

eNOS que catalisa a síntese de NO a partir da L - arginina (GRIFFITH; STUEHR, 1995;

MONCADA, 1997; DESSY; FERON; BALLIGAND, 2010). O NO formado no tecido

vascular difunde-se para as células do músculo liso vascular (DENNINGER; MARLETTA,

1999; CERQUEIRA e YOSHIDA, 2002;), e vai atuar na regulação do tônus vascular através

da sua ação dilatadora que depende da ativação da guanilil ciclase solúvel e

consequentemente do aumento intracelular de GMPc (VANE, 1990).

O NO pode ser sintetizado na maioria dos tecidos e células e, além de ser uma

molécula vasodilatadora derivada do endotélio, o NO, também possui outros efeitos

biológicos. As suas funções mais importantes no sistema cardiovascular são a regulação da

pressão arterial, inibição da agregação de trombócitos, da adesão dos leucócitos e da

proliferação de células do músculo liso, além da oxidação de LDL (SOYDINÇ et al., 2007). A

formação de NO se opõe às ações dos potentes fatores contráteis derivado do endotélio como

a angiotensina II e a ET-1 (MONCADA; HIGGS, 1993; VERMA; ANDERSON, 2001). O

controle do tônus vascular das artérias é um fator determinante na proteção vascular e na

preservação da reatividade do vaso (SENA; PEREIRA; SEIÇA, 2013).

Algumas condições, tais como aterosclerose, diabetes mellitus e doenças inflamatórias

provocam danos nos tecidos e disfunção endotelial que estão fortemente ligadas ao excesso de

produção de NO derivado de leucócitos e /ou a redução na atividade do sistema antioxidante

que conduz a uma formação maciça de ROS (UM et al., 2003; MENDELSON et al., 2005;

FORTUÑO et al., 2005). Considerando os achados do presente estudo, é possível que a

pancreatite aguda induzida por ODBP também cause disfunção endotelial, o que justificaria a

34

redução do relaxamento dependente de endotélio. Resposta semelhante é observada em

modelo de sepse causada por ligação e perfuração cecal (WANG; BA; CHAUDRY, 1995),

indicando que a presença de quadro inflamatório generalizado compromete o relaxamento

dependente de endotélio.

O estresse oxidativo e a inflamação estão intimamente ligados com a evolução de

doenças cardiovasculares (PASHKOW, 2011). As ROS são consideradas importantes

mediadores na pancreatite aguda (SEVILLANO et al, 2003) e o estresse oxidativo é um

importante mediador da disfunção na vasodilatação dependente do endotélio no contexto da

doença cardiovascular (PASHKOW, 2011). O aumento na produção de ROS, em condições

patológicas, leva à disfunção endotelial, relaxamento vascular prejudicado, aumento do

crescimento das células do músculo liso vascular e hipertrofia, bem como o aumento da

deposição de proteínas da matriz extracelular (COHEN; TONG, 2010). As ROS produzem

efeitos deletérios, principalmente, devido à sua habilidade de produzir mudanças em

organelas intracelulares e induzir o aumento de [Ca+2

]i (DHALLA; TEMSAH;

NETTICADAN, 2000).

Partindo desse pressuposto, buscamos investigar a produção de NO e O2•-

para avaliar

a participação das ROS e RNS no comprometimento do relaxamento vascular em artéria

mesentérica de ratos com ODBP. Foram realizados experimentos para avaliação da produção

destas espécies utilizando sondas fluorescentes sensíveis à ROS e RNS em anéis de artéria

mesentérica dos animais em estudo.

Na Figura 9 estão apresentados os resultados das medidas da produção intracelular de

NO, nos anéis de artéria mesentérica coletados 24 h após o procedimento cirúrgico. Nestes

anéis não foram detectadas alterações significativas na produção de NO, no grupo ODBP

(0,77 ± 0,20 u.a.), quando comparado às dos animais do grupo sham (0,72 ± 0,01 u.a.).

35

Sham 24 h ODBP 24 h

0.0

0.5

1.0

1.5

DA

F F

luo

rescên

cia

(u.a

.)

c


grupos sham e obstrução do ducto biliopancreático (ODBP) após 24 h da indução da

pancreatite. Nos painéis superiores estão apresentadas as imagens representativas das

medidas realizadas no grupo sham (A) ou ODBP (B) e no painel C está representada a

quantificação da fluorescência (média ± e.p.m.) em unidades arbitrárias (u.a.). Barra de escala

em A e B: 20 µm.

Na figura 10 estão apresentados os resultados das medidas da produção intracelular de

NO, nos anéis de artéria mesentérica coletados 48 h após procedimento cirúrgico. Foi

detectado maior intensidade de fluorescência (p < 0,001) no grupo ODBP (1,7 ± 0,1 u.a.)

quando comparado aos animais do grupo sham (1,0 ± 0,1 u.a.).

A B

36

Sham 48 h ODBP 48 h

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 *C

DA

F F

luo

rescên

cia

(u.a

.)


grupos sham e obstrução do ducto biliopancreático (ODBP) após 48 h da indução da




em A e B: 20 µm.

Nossos resultados mostraram um aumento na produção de NO e uma diminuição na

resposta contrátil a fenilefrina. Esses dados corroboram o estudo de Aires et al. (2013) que

demonstrou um aumento na produção de NO• em anéis aorta com endotélio intacto retirados

de ratos intoxicados com paraquat, quando comparado ao grupo controle, associado a uma

deficiência na resposta contrátil a fenilefrina, que foi associada a inflamação pulmonar e

aumento da produção de TNF- e da expressão de iNOS.

No presente estudo o aumento na produção de NO foi acompanhado de redução da

resposta contrátil a fenilefrina, mas não houve aumento no vasorelaxamento, ao contrário, foi

A B

37

encontrada a diminuição da resposta relaxante dependente do endotélio em artéria mesentérica

de ratos com ODBP. A partir destes resultados, pode-se sugerir que o aumento na produção de

NO ocorra por um aumento na expressão da iNOS na parede vascular, induzida por citocinas

inflamatórias, que em conjunto com a geração de superóxido, provocam danos endoteliais

(BECKMANN; KOPPENOL, 1996).

Sugere-se então, que a disponibilidade de NO esteja, na verdade, reduzida; por esta ser

modulada por RNS, sendo diminuída, por exemplo, pela rápida reação do O2•-

com NO para

produzir peroxinitrito (COHEN; TONG, 2010; PASHKOW, 2011;). Um equilíbrio entre as

concentrações locais de superóxido e NO liberado desempenha um papel crítico na

manutenção normal da função endotelial (GOTO et al, 2003).

A partir dessas evidências realizamos experimentos para verificar a produção

intracelular de O2•-. Nas Figuras 11 e 12 estão apresentados os resultados da produção

intracelular de O2•-, nos anéis de artéria mesentérica coletados 24 h e 48 h respectivamente,

após procedimento cirúrgico. Na Figura 11 observa-se que não foram detectadas alterações

significativas na produção de O2•-, no grupo ODBP 24 h (0,81 ± 0,14 u.a.) quando comparado

às dos animais do grupo sham 24 h (1,00 ± 0,16 u.a.). Contudo, na Figura 12 está

demonstrado o aumento da produção deste ânion nas artérias dos animais do grupo ODBP

48h (1,45 ± 0,14 u.a., p<0,05) quando comparado às dos animais do grupo sham 48 h (1,06 ±

0,10 u.a.) respectivamente.

38

Sham 24 h ODBP 24 h

0.0

0.5

1.0

1.5

DH

E F

luo

rescên

cia

(u.a

.)

Figura 11: Produção basal de ânion superóxido em anéis de artéria mesentérica de ratos

dos grupos sham e obstrução do ducto biliopancreático (ODBP) após 24 h da indução da




em A e B: 20 µm.

A B

39

Sham 48 h ODBP 48 h

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0C

*

DH

E F

luo

rescên

cia

(u.a

.)

Figura 12: Produção basal de ânion superóxido em anéis de artéria mesentérica de ratos

dos grupos sham e obstrução do ducto biliopancreático (ODBP) após 48 h da indução da




em A e B: 20 µm.

Produzido por redução do oxigênio (COHEN; TONG, 2010) e mediador chave em

muitas das ações deletérias das ROS, o O2•- inicia a formação de muitas espécies reativas de

oxigênio (COOKE; DAVIDGE, 2003) e tem sido implicado na mediação da disfunção

vascular (FRIDOVICH, 1986). Os resultados apresentados mostraram alterações na produção

de O2•- apenas após 48 h da ODBP, tempo em que as alterações vasculares são mais intensas.

A B

A B

40

Este ânion pode reagir rapidamente como o NO, formando peroxinitrito, o que ocorre a uma

taxa significativamente mais rápida do que a reação do O2•-, com a enzima superóxido

dismutase (SARAN; MICHEL; BORS, 1990; BECKMAN; KOPPENOL, 1996).

Estudo realizado por Cooke e Davidge (2003) mostrou uma redução na resposta do

relaxamento dependente do endotélio em artérias mesentéricas em ratos nocautes para SOD

(SOD-/-

) e um aumento na formação de peroxinitrito.

O peroxinitrito é uma espécie reativa de nitrogênio (RNS) que possui alta reatividade

com proteínas, DNA e lipídios (COHEN; TONG, 2010), sendo capaz de inativar uma grande

variedade de enzimas, causando lesão celular (SZABÓ et al., 1997) e provocar impactos

substanciais no sistema vascular (COOKE; DAVIDGE, 2003). É conhecido que o

peroxinitrito leva a disfunção e ao desacoplamento de eNOS (FÖRSTERMANN; MÜNZEL,

2006). O desacoplamento da eNOS contribui para o aumento da produção de O2•- e da

disfunção endotelial (KELLEY; SIMONEAU, 1994; GUZIK et al., 2002).

Ainda não são totalmente compreendidos os mecanismos pelos quais a inflamação

pode prejudicar relaxamento dependente do endotélio (HINGORANI et al., 2000). Uma

alternativa é que a presença de citocinas e outros fatores inflamatórios induz alterações

fenotípicas importantes do endotélio, incluindo uma redução na produção de NO e/ou na sua

atividade biológica (VERMA et al., 2002; WIDLANSKY et al., 2003; WIMALASUNDERA

et al., 2003).

A disfunção endotelial pode ocorrer também devido à diminuição da expressão de

eNOS (FÖRSTERMANN; MÜNZEL, 2006); no entanto, vários estudos têm mostrado que

fatores de risco cardiovascular estão associados com um grande aumento da expressão de

eNOS (LI et al., 2002). Em doenças vasculares o aumento da expressão da eNOS é

provavelmente uma consequência do excesso de produção de H2O2 que é produto da

dismutação de O2•-, pode aumentar a expressão de eNOS através de mecanismo transcricional

e pós-transcricional (DRUMMOND et al., 2000).

Em resumo, os resultados obtidos neste estudo mostram que na pancreatite induzida

por ODBP está presente um quadro de disfunção vascular caracterizado pela redução da

capacidade contrátil e relaxamento (dependente de NO) da artéria mesentérica, mesmo na

presença de maior quantidade de NO e O2•- após 48 h da indução da pancreatite. A principal

hipótese para explicar estes achados é que durante a pancreatite ocorreu aumento da expressão

vascular e extravascular de iNOS e esta enzima é responsável pela maior produção de NO,

pois produz grandes quantidades deste radical. Além disso, a reação do NO com o O2•-

; que

41

também foi encontrado em maior quantidade e que tem sido associado por estudos como

causador de lesão no endotélio; formando peroxinitrito leva a alterações na resposta relaxante

e contrátil no endotélio vascular. Esta hipótese é embasada por estudo que demonstrou que o

aumento da iNOS está associado a disfunção endotelial na sepse causada por 15 h de

exposição ao LPS, que é acompanhada por redução tanto do relaxamento induzido por

acetilcolina quanto da contração induzida por FEN. Considerando que a pancreatite causada

por ODBP causa um quadro inflamatório sistêmico semelhante à sepse é plausível que

eventos parecidos estejam ocorrendo. Contudo, estudos adicionais são necessários para

comprovar esta proposta.

42

6 CONCLUSÕES

No presente estudo foi observado que a pancreatite aguda induzida por ODBP diminui

a resposta relaxante à ACh e diminuiu a sensibilidade a resposta contrátil à FEN em anéis de

artéria mesentérica isolados após 24 e 48 h da indução. Nossos dados mostraram também um

aumento na produção de NO e O2• -

nos anéis de artéria mesentérica coletados 48 h após a

indução.

Estes achados sugerem que o aumento na produção de NO ocorra devido a um

aumento na expressão de iNOS que ocorre no processo inflamatório e que a alta reatividade

do NO leve a um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio que causa danos ao

endotélio. Entretanto, são necessários experimentos adicionais para identificar o mecanismo

pelo qual a pancreatite aguda altera a dinâmica vascular.

43

7 PERSPECTIVAS

Diante dos resultados apresentados, as perspectivas para desdobramentos futuros

imediatos do presente estudo são:

i. Avaliar a resposta relaxante de anéis de artéria mesentérica de animais do

grupo sham ou ODBP utilizando doadores de NO, como o nitroprussiato de

sódio;

ii. Avaliar a resposta relaxante de anéis de artéria mesentérica de animais do

grupo sham ou ODBP sem endotélio ou na presença de inibidores da síntese de

NO;

iii. Comparar a resposta contrátil de anéis de artéria mesentérica de animais do

grupo sham ou ODBP ao KCl 80 mmol/L;

iv. Mensurar a expressão das isoformas de NOS e de nitrotirosina, que é um

biomarcador de peroxinitrito, para identificar o papel destas no aumento da

produção de NO;

v. Identificar a relação das ROS na diminuição do vasorelaxamento dependente

do endotélio em artérias mesentéricas de ratos com pancreatite induzida por

ODBP.

Outra perspectiva futura inclui o estudo de vias de sinalização pelas quais a pancreatite

aguda danificaria o endotélio vascular, causando diminuição do relaxamento dependente do

endotélio e ao mesmo tempo diminuindo a sensibilidade a resposta contrátil à FEN. Além

disso, é de nosso interesse o estudo da função cardíaca dos animais submetidos à ODBP, para

complementar e gerar um estudo cardiovascular mais completo.

44

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · Victor pelo amor e pela força que nos momentos difíceis não me permitiam fraquejar. v AGRADECIMENTOS À Deus, pela oportunidade