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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
NADIA GRANDI BOMBONATO
INVESTIGAÇÃO DE BRUCELOSE EM PEQUENOS RUMINANTES
DOUTORADO
UBERLÂNDIA
2017
NADIA GRANDI BOMBONATO
INVESTIGAÇÃO DE BRUCELOSE EM PEQUENOS RUMINANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias, da Faculdade de
Medicina Veterinária, da Universidade Federal de
Uberlândia, como exigência parcial para obtenção
do título de Doutora em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Saúde Animal
Orientador: Profa. Dra. Anna Monteiro Correia Lima
UBERLÂNDIA
2017
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil.
B695i
2017
Bombonato, Nadia Grandi, 1957
Investigação de brucelose em pequenos ruminantes / Nadia Grandi
Bombonato. - 2017.
92 f. : il.
Orientadora: Anna Monteiro Correia Lima.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa
de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.
Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.te.2018.52
Inclui bibliografia.
1. Veterinária - Teses. 2. Caprino - Doenças - Teses. 3. Ovino -
Doenças - Teses. 4. Brucelose - Teses. I. Lima, Anna Monteiro Correia.
II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias. III. Título.
CDU: 619
Angela Aparecida Vicentini Tzi Tziboy – CRB-6/947
INVESTIGAÇÃO DE BRUCELOSE EM PEQUENOS RUMINANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias, da Faculdade de
Medicina Veterinária, da Universidade Federal de
Uberlândia, como exigência parcial para obtenção
do título de Doutora em Ciências Veterinárias.
Uberlândia, 04 de agosto de 2017.
__________________________________________________
Profa. Dra. Anna Monteiro Correia Lima (Orientadora) – FAMEV/UFU
__________________________________________________
Profa. Dra. Viviane de Souza – EMBRAPA/Sobral - CE
__________________________________________________
Prof. Dra. Karine Cristine de Almeida - UNIPAM
_________________________________________________
Prof. Dra. Camila Raineri – FAMEV/UFU
__________________________________________________
Prof. Dra. Fernanda Rosalinski Moraes – FAMEV/UFU
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus,
não sou o que era antes.”
Marthin Luther King
À minha família, pelo apoio,
incentivo e paciência.
AGRADECIMENTOS
À Deus por tudo que tenho e tudo que sou.
À Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia.
À minha orientadora Profa. Dra. Anna Monteiro Correia Lima, exemplo de ser
humano, de pesquisadora e professora, grande amiga e incentivadora, agradeço pelo carinho
e compreensão.
Aos membros da banca examinadora, pelas sugestões e enriquecimento do
trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias e seus professores.
Ao Centro Universitário de Patos de Minas – UNIPAM, pelo incetivo e apoio
durante todo o período da pós-graduação.
Aos colegas do Laboratório de Doenças Infecciosas da Universidade Federal de
Uberlândia, pelo apoio, carinho e amizade.
À minha amiga Mariana Assunção, pela ajuda nos momentos difíceis, pelo
incentivo em continuar minha pesquisa e pela amizade incondicional.
Ao amigo Luis Oliveira Lopes, pelo companheirismo e amizade.
A todos os colegas de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias da UFU.
A todos os proprietários das fazendas que me receberam e confiaram no trabalho
realizado.
Às minhas alunas e estagiárias Glaucia e Lorena, do Laboratório de Doenças
Infecciosas do Centro Universitários de Patos de Minas - UNIPAM, pelo constante auxílio
durante as coletas nas fazendas e processamento das amostras.
A todos da minha família que me incentivaram e torceram por mim, em especial à
minha mãe, pelo orgulho que tem ao falar de mim e de minha profissão.
A todos os outros colegas e amigos que direta e indiretamente contribuíram para
que este momento se concretizasse.
RESUMO
Bombonato, Nadia Grandi, 2017. Investigação de brucelose em pequenos ruminantes. Tese de
doutorado em Ciências Veterinárias. UFU. Uberlândia, MG. 92p.
Ao longo das últimas décadas a criação de ovinos e caprinos têm sofrido transformações
técnicas nos diversos elos de suas cadeias produtivas. É uma atividade explorada em todos os
continentes, sendo exercida em distintos ecossistemas com os mais diferentes tipos de clima,
solo, topografia e vegetação. Devido a importância que representam essas criações, cuidados
com a sanidade dos rebanhos devem ser tomados, não só pela perda e danos na produção
como também pelo controle de enfermidades que podem acometer o ser humano. Dentre essas
temos a brucelose, enfermidade infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero Brucella.
Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar a ocorrência da brucelose em duas
propriedades de caprinos leiteiros e três propriedades de ovinos de corte na região do Alto
Paranaíba, MG. Foram coletadas 48 amostras de sangue e leite de cabras em lactação para o
diagnóstico da B. abortus, pelo teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e Teste do
Anel em Leite (TAL). Foi também utilizada a PCR em tempo real para diagnóstico da B.
abortus e B. melitensis no leite desses animais. De 30 ovinos de três propriedades da região
foram coletadas amostras de sangue para diagnóstico da B. ovis, pelo teste de Imunodifusão
em Gel de Ágar (IDGA) e pela PCR em tempo real. Vinte amostras de sêmen ovino de duas
Centrais de Produção e Comercialização de Semen foram analisadas pela PCR em tempo real
para também verificar a presença de B. ovis. Para o teste do TAL no leite caprino, todas as 48
amostras foram negativas, já para o teste do AAT, uma fêmea caprina foi positiva, mostrando
que a B. abortus pode ocorrer também em caprinos. No diagnóstico pela PCR em tempo real
todas as amostras de leite mostraram resultado negativo para B. abortus e B. melitensis. Das
30 amostras de sangue ovino para o teste do IDGA, 3(10%) foram positivas e confirmadas
pela PCR em tempo real. Apesar da baixa ocorrência da B. abortus, e a não ocorrência da B.
melitensis nos caprinos investigados, deve sempre haver um monitoramento dos rebanhos
visto a importância zoonótica dos agentes. Quanto a B. ovis, devido aos problemas graves que
causa na reprodução dos ovinos, os exames devem ser feitos rotineiramente.
Palavras-chave: caprinos, ovinos, Brucella ovis, Brucella abortus, Brucella melitensis.
ABSTRACT
Bombonato, Nadia Grandi, 2017. Investigation of brucellosis in small ruminants. Doctoral
thesis in Veterinary Sciences. UFU. Uberlândia, MG. 92p.
Over the last decades, sheep and goat farming has undergone technical transformations in the
various links of its productive chains. It is an activity explored in all the continents, being
exerted in distinct ecosystems with the most different types of climate, soil, topography and
vegetation. Due to the importance of this animal’s productions, care for the health of herds
must be taken, not only for the loss and damages in the production, but also for the control of
diseases that can affect the human being. Among these we have brucellosis, an infectious
contagious disease, caused by bacteria of the genus Brucella. Thus, the objective of this
research was to investigate the occurrence of brucellosis in two properties of dairy goats and
three properties of sheep for meat production in the Alto Paranaíba, MG region. Forty-eight
blood samples and lactating goats' milk were collected for the diagnosis of B. abortus, by the
Acidified Buffered Antigen (ABT) and Milk Ring Test (MRT). Real-time PCR was also used for the diagnosis of B. abortus and B. melitensis in the milk of these animals. Blood samples were also collected from 30 sheep of three properties in the region, for diagnosis of B. ovis by the IDGA test and real-time PCR. Twenty samples of sheep semen from two Semen Production and Marketing Centers were analyzed by real-time PCR to also verify the presence of B. ovis. For the Ring Test in goat milk, all 48 samples were
negative, whereas for the ABT test, a caprine female was positive, showing that B. abortus
can also occur in goats. In the diagnosis by real-time PCR, all the milk samples showed
negative results for B. abortus and B. melitensis. From 30 sheep blood samples for the IDGA
Test, 3 (10%) were positive and confirmed by real-time PCR. Despite the low occurrence of
B. abortus, and the non-occurrence of B. melitensis in the goats investigated, there should
always be a monitoring of the herds, considering the zoonotic importance of the agents. As for B. ovis, due to the serious problems it causes in sheep breeding, examinations should be done routinely.
Key-words: Goats, sheep, Brucella ovis, Brucella abortus, Brucella melitensis.
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
abortus....................………………………………………………………………………..42
Tabela 2. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
melitensis..............................................................................................................................43
CAPÍTULO 3
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
ovis…………………………………………………………………………………………….……..55
CAPÍTULO 4
Tabela 1. Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
ovis…………………………………………………………………………………………….……..65
Tabela 2. Frequência de ovinos reagentes (valores relativos e absolutos) na pesquisa
de anticorpos anti-Brucella ovis pelo teste de IDGA e PCR em tempo real, na região
do Alto Paranaíba, MG.........................................................................................................68
SUMÁRIO
Capítulo 1 – Considerações Gerais.……………………………………………………….10
1. Introdução.....................................................................................................................11
2. Objetivo.……………………………………………………………………………...13
2.1 Objetivos gerais.……………………………………………………………………...13
2.2 Objetivos específicos.………………………………………………………………...13
3. Revisão de Literatura………………………………………………………………....14
3.1 A importância da produção de ovinos e caprinos .…………………………………...14
3.2 Brucelose….…………………………………………………………………………16
3.2.1 Brucella abortus ................................................................................................... 717
3.2.2 Brucella melitensis . ............................................................................................. 19
3.2.3 Brucella ovis.……………………………………………………………………………..21
3.3 Diagnóstico…………………………………………………………………………...23
Referências. ....................................................................................................................... 26
Capítulo 2 – Detecção de Brucella abortus e Brucella melitensis em leite caprino pela PCR
em tempo real .................................................................................................................... 37
Capítulo 3 – Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo real em sêmen ovino
comercial….………………………………………………………………………………50
Capítulo 4 – Investigação da ocorrência de infecção por Brucela ovis em rebanhos
ovinos……………………………………………………………………………………..59
Capítulo 5 – Considerações finais.......................................................................................73
AnexoI – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais.......................................74
Anexo II – Normas da Revista Ciência Rural para submissão do artigo: Investigação
da ocorrência de infecção por Brucella abortus e Brucella melitensis em rebanhos
caprinos .............................................................................................................................. 75
Anexo III – Normas da Revista Semina: Ciências Agrárias para submissão do artigo:
Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo real em sêmen ovino comercial.......... 80
Anexo IV – Normas da Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira para submissão
do artigo: Investigação da ocorrência de infecção por Brucela ovis em rebanhos
ovinos.…………………………………………………………………..………………. 83
10
Capítulo 1- Considerações Gerais
11
1. Introdução
O crescimento significativo da exploração de pequenos ruminantes está transformando
o cenário dos sistemas produtivos no mundo. Ao longo das últimas décadas a criação de
ovinos e caprinos têm sofrido transformações técnicas nos diversos elos de suas cadeias
produtivas. É uma atividade explorada em todos os continentes, sendo exercida em distintos
ecossistemas com os mais diferentes tipos de clima, solo, topografia e vegetação. Porém,
apenas em alguns países a atividade possui expressão econômica e assim como no Brasil é
desenvolvida de forma empírica com baixos níveis tecnológicos (CORREIA, 2016).
De acordo com dados do IBGE, o rebanho nacional de caprinos atingiu 9,78 milhões
de cabeças em 2016 apresentando uma variação positiva de em relação a 2015. O Nordeste
detém o maior efetivo de caprinos, sendo responsável por 92,7% do total da espécie no País.
O efetivo de ovinos foi de 18,45 milhões em 2016, com pouca variação em relação a 2015. A
Região Nordeste se destaca na criação de ovinos e concentrou 60,6% do rebanho nacional no
último ano. A Região Sul figura em seguida, representando 26,5% do efetivo da espécie,
acompanhada pelas Regiões Centro-Oeste (5,6%), Sudeste (3,8%) e Norte (3,6%) (IBGE,
2016).
Os produtos originados da ovinocaprinocultura, carne, leite e pele, têm crescente
procura e aceitação no mercado interno e externo, e para atender à demanda de mercado,
começam a ser observadas mudanças nos segmentos de produção e comercialização, com o
surgimento de criadores cada vez mais especializados na caprinocultura de corte ou leite e na
ovinocultura de corte. O abastecimento dos mercados urbanos de carne, leite e seus derivados
constitui o foco principal da atividade, onde a carne assume uma posição de destaque ao ser
comercializada em ambientes especializados a preços compensadores. Porém, verifica-se que
no mercado interno ainda não há a fiscalização adequada para que os produtos
comercializados sejam idôneos.
Devido a importância que representam essas criações, cuidados com a sanidade dos
rebanhos devem ser tomados, não só pela perda e danos na produção como também pelo
controle de enfermidades que podem acometer o ser humano.
Dentre as enfermidades que acometem pequenos ruminantes temos a brucelose com
caráter zoonótico e uma das mais difundidas no mundo. É causada pelo gênero Brucella onde
cada uma das espécies possui seus hospedeiros preferenciais entre os animais domésticos. A
Brucella abortus em bovinos, B. melitentis em caprinos e ovinos, B. ovis em ovinos e B. canis
em cães. A Brucella melitensis é considerada a mais patogênica para o ser humano e
12
considerada endêmica em várias regiões no mundo e em alguns países da América Latina,
porém ainda não encontrada no Brasil.
A infecção por bactérias do gênero Brucella spp. é uma das causas mais importantes de
problemas reprodutivos em animais domésticos, e as perdas econômicas geradas pela brucelose
vão além dos problemas reprodutivos, como barreiras internacionais ao comércio de produtos de
origem animal (carne, leite e derivados) e perdas para as indústrias devido a condenação dos
mesmos, além de gastos com programas de controle, erradicação e pesquisas (JARDIM et al.,
2006).
Considerando o número reduzido de rebanhos de pequenos ruminantes na região do
Alto Paranaíba em Minas Gerais, um levantamento sobre ocorrência das espécies de Brucella
que acometem esses hospedeiros é muito importante, não só para o conhecimento do estado
sanitário dos animais e controle da enfermidade, como também na minimização da doença
em humanos.
13
2. Objetivo
2.1 Objetivo Geral
Investigar a ocorrência da brucelose em caprinos e ovinos em propriedades na região
do Alto Paranaíba, MG.
2.2 Objetivos Específicos
• Identificar a ocorrência de anticorpos anti Brucella abortus em rebanhos
caprinos leiteiros utilizando o teste do Antigeno Acidificado Tamponado (AAT).
• Identificar a ocorrência de anticorpos anti Brucella abortus em amostras
individuais de leite caprino pelo Teste do Anel do Leite (TAL).
• Investigar a presença do DNA de Brucella abortus e Brucella melitensis em leite
caprino com o uso de marcadores moleculares padronizados para identificação dos agentes
por meio da PCR em Tempo Real.
• Investigar a presença do DNA de Brucella ovis em sêmen ovino comercial com
o uso de marcadores moleculares padronizados para identificação do agente por meio da PCR
em tempo real.
• Identificar a ocorrência de anticorpos anti Brucella ovis e de DNA por meio da
PCR em tempo real em ovinos.
14
3. Revisão de literatura
3.1. A importância da produção de ovinos e caprinos
Os caprinos foram os primeiros animais domesticados pelo homem, há cerca de dez
mil anos, a produzirem alimentos. Vêm acompanhando a história da humanidade com
registro em relatos históricos, porém apesar disso teve poucas vezes seu valor reconhecido.
Produzem leite, carne, couro e esterco, além de ter utilidade como animal de tração e ainda
hoje os caprinos tem um papel fundamental como fornecedores de alimentos em países ou
regiões em desenvolvimento (RIBEIRO, 1997).
A caprinocultura leiteira encontra-se bastante avançada em países como França,
Canadá, Espanha, Suíça, Inglaterra e Itália, e especialmente na França, Espanha, Suíça,
Inglaterra e Itália, que apresentam um consumo de 6,5 litros de leite por habitante ano,
porém 75% do total produzido destina-se a produção de queijos. Nos países como Canadá e
África do Sul concentra-se a produção de leite em pó. Esse fato proporciona aos governos a
adoção de políticas públicas que visem o desenvolvimento do mercado interno dos produtos
de origem caprina e ovina que apresenta um grande potencial (CARVALHO, 2014).
No Brasil, a produção de leite de cabra não ocorre somente na região Nordeste,
havendo outras bacias leiteiras já sedimentadas nas regiões Sudeste e Sul do país. O
desenvolvimento da caprinocultura leiteira no contexto brasileiro ocorre de acordo com o
sistema de produção utilizado (SILVA et al., 2012). Mais da metade do rebanho nacional
(52,61%) é composta por animais leiteiros, porém, sua produção é pouca expressiva, estando
em 21ª lugar (0,93%) na produção mundial. Apesar disso, dados sobre a produção leiteira
revelam que o Brasil se configura como maior produtor de leite de cabra da América do Sul,
com 150.000 t/ano (FAO, 2014).
Apesar da cidade de São Paulo se tratar de um grande e potencial centro
consumidor, o consumo tanto de derivados quanto de leite de cabra é restrito, devido
principalmente ao desconhecimento e à falta de costume da população. Porém, os
consumidores ressaltam que há potencial de elevação no consumo de ambos, desde que haja
maior disponibilidade, informação sobre o produto, além de um preço mais acessível para o
consumidor final (LIMA et al., 2015).
As primeiras espécies domesticadas pelo homem foram os ovinos e sua criação
possibilitava produção de alimento, principalmente carne e leite e ainda proteção pelo uso de
lã contra intempéries do ambiente. A ovinocultura está presente em praticamente todos os
15
continentes, isto devido principalmente ao seu poder de adaptação a diferentes climas,
relevos e vegetações. Esta criação está destinada à exploração econômica e também à
subsistência de famílias em zonas rurais. Na Europa a criação de ovinos ocorre de forma
intensiva com rebanhos produtores de carne e leite, destinados à fabricação de queijos
especiais, e na América do Sul as criações ocorrem em sistemas de confinamento e
pastagens naturais com rebanhos de raças mistas que produzem lã e carne de qualidade para
o mercado internacional (VIANA, 2008).
A criação de ovinos e caprinos no Brasil ainda tem um longo período a percorrer
para conquistar seu próprio mercado nas diversas regiões onde é praticada e se credenciar a
uma maior participação no mercado nacional e, até mesmo, no internacional. No entanto,
terá que satisfazer os pré-requisitos de aumento de produtividade e da melhoria da qualidade
de seus produtos. São objetivos difíceis, mas possíveis de atingir, desde que trabalhados
simultaneamente com a melhoria nos padrões de gerenciamento das unidades produtivas e
maior articulação entre os diversos componentes da cadeia produtiva (GUIMARÃES
FILHO; ATAÍDE JUNIOR, 2009).
Destacam-se como fatores limitantes para o desenvolvimento desse comércio a
irregularidade no fornecimento dos produtos de origem caprina e ovina, visto que a
exigência do mercado se dá principalmente no fornecimento fixo desses produtos durante
todo o ano sem períodos de sazonalidade. Tem-se ainda o abate clandestino desses animais
que agem competitivamente com frigoríficos industriais e também os elevados preços
comerciais praticados no mercado que reduz a competitividade de outros produtos
concorrentes (CARVALHO, 2014).
A oferta de carnes de ovinos e caprinos oriundos de frigoríficos certificados por
serviços de inspeção federal ou estadual é uma vantagem que conota para o crescimento da
demanda, haja vista que esses órgãos regulamentam e certificam o elevado padrão de
qualidade sanitária do produto com consequente aumento da confiabilidade do mercado em
consumir esse alimento (SEBRAE/RN, 2001).
No Brasil o número efetivo de ovinos teve um aumento de 3,4% em 2010
comparativamente a 2009 (IBGE, 2010). Dentro deste cenário a ovinocultura destaca-se no
cenário nacional por apresentar grande potencial de crescimento chegando a um rebanho com
mais de 18 milhões de cabeças (BRASIL, 2015).
Diferentemente dos maiores países criadores de ovinos e caprinos, o Brasil possui
condições edafoclimáticas altamente favoráveis nesse segmento, porém, essa atividade no
Nordeste ainda não se enquadrou como cadeia produtiva dentro do enfoque do agronegócio,
pois ainda é considerada pelos produtores como uma atividade secundária e pobre, enquanto
16
criadores dos outros países orgulham-se e lucram com os produtos e subprodutos advindos
dessa atividade (NETO, et al. 2007).
3.2. Brucelose
A brucelose é uma enfermidade infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero
Brucella. Em muitos países, apresenta-se na forma endêmica resultando em prejuízos
econômicos significativos aos sistemas de produção e sérias implicações em saúde animal e
pública, visto seu caráter zoonótico (BRASIL, 2006). Pode ser veiculada ao homem pela
ingestão de produtos de origem animal contaminados, principalmente leite e derivados que
não passaram por processamento térmico, e transmitida pelo contato direto ou indireto com
animais infectados, fetos abortados ou anexos fetais, além da própria manipulação de
carcaças e vísceras no abate sanitário. As principais manifestações clínicas são as febres
recorrentes, fraquezas, dores musculares, distúrbios nervosos e sudorese, podendo levar à
incapacidade parcial ou total ao trabalho (PAULIN; FERREIRA NETO, 2008).
De acordo com a Organização Internacional de Epizootias (OIE) a brucelose é
classificada como doença da lista B, onde estão incluídas as enfermidades que têm
importância socioeconômica e/ou para saúde pública e consequências significativas no
comércio internacional de animais e seus produtos (OIE, 2002).
O agente etiológico da brucelose é uma bactéria intracelular facultativa e Gram
negativa, cocobacilos curtos e pequenos que medem 0,6 a 1,5µm por 0,5 a 0,7µm de
dimensão, aeróbia, imóvel, não produz cápsula, flagelos ou esporos, pertencem ao gênero
Brucella da classe Proteobacteria (PROBERT et al., 2004). São microrganismos aeróbios,
porém uma atmosfera com tensão de 5 a 10% de CO2 favorece o isolamento de algumas
espécies. Apresentam temperatura de multiplicação na faixa de 20 a 40°C, sendo 37°C a
temperatura ideal, e um pH ótimo de 6.6 a 7.4 (OIE, 2009).
Cada espécie ou biovar de Brucella tem seu hospedeiro preferencial: Brucella
abortus (bovinos e bubalinos), B. melitensis (caprinos e ovinos), B. ovis (ovinos), B. canis
(cães), B. neotomae (ratos do deserto) (BANAI; CORBEL, 2010; BRASIL, 2006), as
quais são subdivididas em sete biovares para Brucella abortus (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 9) três para
B. melitensis (1, 2 e 3) e cinco para B. suis (1, 2, 3, 4 e 5), B. neotomae, B. ovis, B. canis, B.
ceti, B. pinnipedialis, B. microti e B. inopinata, onde os membros do gênero possuem
potencial zoonótico, embora a patogenicidade seja bastante variável para o ser humano
(MORENO et al., 2002; FOSTER et al., 2007; SCHOLZ et al., 2008; BANAI; CORBEL,
17
2010).
As bactérias do gênero Brucella podem ser divididas em dois grupos
antigenicamente distintos, denominadas lisas, que possuem em sua parede celular externa
lipopolissacarídeo liso (LPS) ou rugosas, que contêm em sua superfície externa o
lipopolissacarídeo rugoso (LPR) e antígenos proteicos (NIELSEN et al.,2004; CARDOSO et
al., 2006; POESTER et al., 2010).
As espécies B. melitensis, B. abortus, B. suis e B. neotomae normalmente
apresentam morfologia de colônia lisa e quando sofrem mutações para formas rugosas ou
mucóides, deixam de ser patogênicas. Já as espécies B. canis e B. ovis apresentam
morfologia de colônia predominantemente do tipo rugosa (ALTON et al., 1988; PAULIN;
FERREIRA NETO, 2003; MINHARRO, 2009; POESTER et al., 2010).
A capacidade de penetração do agente pela pele íntegra ou lesada e pelas
membranas mucosas, além da formação de aerossóis, predispõe os tratadores, veterinários,
laboratoristas, trabalhadores de matadouros, frigoríficos e entrepostos de leite ao risco de
infecção (LAGE et al., 2008).
A transmissão entre pessoas, apesar de possível, é considerada insignificante sob o
ponto de vista epidemiológico, apesar de relatos de casos de transmissão por meio de
transfusão de sangue, transplante de medula e relação sexual (GODFROID et al., 2005;
MINHARRO, 2009).
3.2.1 Brucella abortus
A Brucella abortus é o agente etiológico da brucelose em bovinos e responsável por
uma importante causa econômica de abortos em rebanhos (OSLEN; TATUM, 2010). O
agente também pode acometer outras espécies como búfalos, bisões e alces representando
um risco importante na manutenção do agente na população animal com especial
importância em áreas onde animais selvagens e rebanhos bovinos vivem juntos
(GODFROID, 2002). Equídeos, suínos, ovinos, caprinos e cães também podem ser
infectados pela B. abortus. Geralmente não é transmitida aos suínos, porém quando ocorre
se apresenta como infecção transitória, podendo servir de fonte de infecção para bovinos.
Em ovinos e caprinos a infecção ocorre ocasionalmente, sendo os ovinos mais resistentes
que caprinos. Nos ovinos pode causar epididimite e nos caprinos aborto (CARTER, 1991).
Infecções em animais selvagens podem dificultar a erradicação em rebanhos bovinos. Além
do mais, a B. abortus é um patógeno em humanos associado ao consumo de produtos lácteos
oriundos de rebanhos infectados (SELEEM, 2010).
18
Dentre outras brucelas a B. abortus é a de maior prevalência nos casos de brucelose
no Brasil, seguido pela B. suis em suínos. Já a Brucella melitensis e B. neotoma ainda não
foram isoladas no país (POESTER et al., 2002).
A infecção causada pela B. abortus ocorre pelo contato do agente com qualquer
mucosa do animal susceptível, principalmente a mucosa oral (THOEN et al., 1993). Depois
da penetração no organismo, há um curto período de bacteremia, e as bactérias vão se alojar
em vários órgãos, principalmente do sistema linfático (EAGLESOME; GARCIA, 1992;
THOEN et al., 1993).
A permanência e a disseminação da B. abortus no organismo se dá devido a
capacidade da mesma sobreviver dentro de macrófagos (GORVEL; MORENO, 2002). O
curso da doença depende do estágio fisiológico do animal. Os animais jovens, antes da
puberdade, parecem ser mais resistentes à infecção. Caso o animal não esteja gestante, a B.
abortus geralmente infecta linfonodos e glândula mamária (CRAWFORD et al., 1990).
Estando o animal gestante, as bactérias atingem o útero, local pelo qual possuem grande
tropismo, provocando assim o aborto (SAMARTINO; ENRIGHT, 1993).
Geralmente na primeira gestação após a infecção, ocorre o aborto, porém o mesmo
é muito menos frequente na segunda gestação após infecção e raro a partir da terceira
gestação (THOEN et al., 1993; CORBEL et al., 2006). De acordo com Thoen et al., (1993)
isso ocorre devido ao desenvolvimento de uma resposta imune, principalmente celular, pelos
animais, que diminui a área e a intensidade das lesões. Dessa forma a manifestação clínica
passa a ser a presença de natimortos ou o nascimento de bezerros fracos.
Após a infecção, a principal manifestação clínica é o aborto (terço final da
gestação), onde nos rebanhos com infecção crônica, quase sempre acontece nas fêmeas
primíparas e nos animais sadios recentemente introduzidos (BRASIL, 2006).
Nas fêmeas causa placentite necrótica, retenção de placenta, corrimentos vaginais,
endometrites, mastites (PACHECO, 2007). Os machos apresentam aumento de volume
testicular, uni ou bilateral além das ampolas e vesículas seminais. Pode haver atrofia do
órgão afetado devido à reação inflamatória do tipo necrosante, levando a quadros de
subfertilidade, infertilidade ou esterilidade (GORVEL; MORENO, 2002; PAULIN;
FERREIRA NETO, 2003; LAGE et al., 2008).
No aparelho locomotor, podem ser observadas infecções articulares, bursites,
espondilites em vértebras torácicas e lombares, podendo atingir medula óssea e tendões
(GUIDO; GRASSO, 2005). Não há nenhuma lesão patognomônica da brucelose no feto
abortado, mas, com frequência, observa-se broncopneumonia supurativa (PAULIN;
19
FERREIRA NETO, 2003; BRASIL, 2006). Os inchaços nas articulações dos joelhos e
jarretes, conhecidos como higromas, também apresentam evidência de brucelose
(RADOSTITIS et al., 2007; LAGES et al., 2008).
No começo da década de 1990, o Estado de Minas Gerais iniciou uma campanha de
vacinação obrigatória de bezerras com a vacina B19 em todo o estado. Além de Minas
Gerais, o único estado que possuía um programa de vacinação, apesar de haver diminuído os
índices de cobertura vacinal nos últimos anos, era o Estado do Rio Grande do Sul (PAULIN;
FERREIRA NETO, 2003).
Em 2016, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)
estabeleceu por meio da IN nº 19, 10/10/2016 o Regulamento Técnico do Programa
Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal - PNCEBT e a
Classificação das Unidades da Federação de acordo com o grau de risco para as doenças
brucelose e tuberculose, assim como a definição de procedimentos de defesa sanitária
animal a serem adotados de acordo com a classificação, na forma desta Instrução Normativa
(MAPA, 2016).
Alguns Estados, como o Mato Grosso, apresentaram aumento da prevalência
quando comparado aos dados do último diagnóstico de situação em nível nacional, realizado
em 1975. É relevante a diminuição significativa da prevalência da doença em alguns estados
como Minas Gerais, proporcionada pela campanha de vacinação das fêmeas bovinas e
bubalinas com vacina B19 iniciada em 1993 (PAULIN; FERREIRA NETO, 2003).
3.2.2 Brucella melitensis
O principal agente etiológico da brucelose em caprinos e ovinos é a Brucella
melitensis e também o principal agente responsável pela brucelose humana, conhecida como
febre de Malta. Aborto e infertilidade são os sinais clínicos predominantes em pequenos
ruminantes. Embora haja escassez de estudos específicos, ela é reconhecida como fonte de
perdas econômicas em ambas as espécies. A sua incidência é muito alta em países do sul e
leste da União Européia e em vários outros com baixa renda. Isto afeta países que possuem
mais do que 70% de propriedades pecuárias suscetíveis, tornando a brucelose de importância
internacional (FAO, 2006).
A infecção por B. melitensis em pequenos ruminantes tem sido tradicionalmente
negligenciada, pois a produção de ovinos e caprinos representa geralmente uma atividade de
baixa renda, praticada por pequenos produtores de áreas rurais menos relevantes no
20
desenvolvimento mundial. Devido a esses sistemas de produção serem usualmente nômades,
o controle e erradicação desta infecção são extremamente difíceis. A distribuição da doença
é praticamente mundial e vários países estão sofrendo uma reemergência desta doença em
caprinos e ovinos e consequentemente também em humanos (WHO, 2005). A brucelose em
caprinos e ovinos é considerada uma doença de menor importância no Brasil, pois a B.
melitensis ainda não foi diagnosticada no país (SELEEM et al., 2010; POESTER et al.,
2002).
Em caprinos a infecção por Brucella melitensis é similar à infecção causada por B.
abortus em bovinos (MEGID et al., 2016). Nos pequenos ruminantes, a infecção por B.
melitensis causa doença apenas em animais sexualmente maduros e animais jovens podem
ser infectados, porém não mostram nenhum sinal clínico, e a resposta sorológica é fraca e
transitória (ALTON, 1990). A B. melitensis (biovar 1, 2 ou 3), principal agente causador
brucelose em ovinos e caprinos, infecta caprinos causando uma infecção generalizada que
pode persistir por anos. Nas cabras prenhes a bactéria se multiplica no útero e glândula
mamária (RODOLAKIS, 2014).
O aborto no terço final da gestação é o sinal mais evidente, na infecção por
Brucella melitensis, mas pode haver um surto de abortos, seguido por um período de
resistência do rebanho, no qual eles não ocorrem. Em infecções experimentais ocorrem
sintomas caracterizados por febre, depressão, perda de peso e às vezes diarréia. Estes sinais
podem ocorrer também em surtos agudos e naturais e serem acompanhados por mastite,
claudicação, higroma e orquite, placentite e queda na produção de leite em cabras e ovelhas.
Muitas vezes, a infecção por B. melitensis acomete um grupo de animais, sem apresentar
sinais evidentes (BLOOD, 1991; OIE, 2004; MEGID et al., 2016).
Apesar da Brucella melitensis ser transmitida congenitamente via útero, cabritos e
cordeiros se infectam principamente pelo leite e colostro. A orquite e epididimite em ovinos
e caprinos podem ocorrer, mas não são comuns (MEGID et al., 2016).
Nos países do Sudeste da Europa e do Mediterrâneo a incidência da brucelose
causada pela B. melitensis em caprinos e ovinos é alta, e segundo a Organização Mundial da
Saúde (OMS), a brucelose é considerada uma das sete doenças negligenciadas e
subnotificadas (DONEV, 2010). A doença é reemergente em locais anteriormente
controlados, como Malta e Omã. Também ocorre no Oriente Médio, Ásia Central, ao redor
do Golfo Pérsico e alguns países da América Central (MEGID et al., 2016).
A incidência global da brucelose em humanos não é bem conhecida devido à
poucos dados registrados e grandes variações existentes entre as diferentes áreas
21
geográficas, mesmo dentro de um mesmo país. Assim, devido à deficiência nos Serviços de
Saúde de vários países onde a brucelose é endêmica, não há dados reais no estado global da
doença em humanos. A razão desta alta prevalência ocorre devido a fatores socioculturais,
agravada pela falta de medidas de controle a serem aplicadas em sistemas de produção de
pequenos ruminantes. O contato com animais e exposição ocupacional, assim como os
hábitos alimentares, e falta de medidas de higiene, representam os fatores de risco para a
infecção de humanos por B. melitensis (PAPPAS, 2006).
3.2.3 Brucella ovis
A brucelose ovina é uma doença infecto-contagiosa de distribuição mundial
causada pela Brucella ovis. É um micro-organismo não zoonótico, intracelular facultativo
que coloniza células do sistema macrocítico linfocitário, provocando doença crônica em
ovinos, conhecida como Epididimite Contagiosa dos Carneiros ou Epididimite Ovina.
(BURGUESS, 1982; QUISPE et al., 2002).
Apesar de considerada de menor relevância quando comparada às outras bactérias
do mesmo gênero, devido ao fato de não ser zoonótica, a B. ovis tem sua importância
relacionada aos prejuízos econômicos que causa principalmente para produtores em que a
criação de ovinos é principal fonte de renda. Entre inúmeros agentes, é a principal causadora
da epididimite contagiosa ovina. Reduz os índices reprodutivos, aumenta anualmente o
número de carneiros não aptos à atividade reprodutiva, gera diminuição da vida reprodutiva
dos machos, abortamentos, mortalidade perinatal e a consequente diminuição nos
rendimentos de carne e lã (ROBLES, 2008).
A bactéria se multiplica nos órgãos afetados e é eliminada à medida que as células
infectadas são destruídas (MEGID et al., 2016). A eliminação de B. ovis ocorre
principalmente por meio do sêmen do animal infectado, de forma intermitente e por
períodos prolongados (WORTHINGTON et al., 1985; PAOLICCHI et al., 1991).
Ao final do segundo mês de infecção ocorre a bacteremia e o micro-organismo se
localiza no trato genital, baço, rins, fígado, pulmão e outros gânglios linfáticos e multiplica-
se nesses órgãos (GIL TURNES, 1998; MEGID et al., 2016).
A cauda do epidídimo é o local em que se observa maior alteração, geralmente
unilateral, inicialmente com edema palpável, seguido de hiperplasia e fibrose, que passa a
apresentar consistência firme à palpação. A inflamação do epidídimo causa degeneração
seminal no testículo adjacente e alteração na concentração, motilidade e morfolologia dos
22
espermatozóides, causando assim queda na fertilidade. O aumento da cauda desse órgão
caracteriza cronicidade da doença (FOSTER et al., 1989; BLASCO, 1990; WEST et al.,
1993; RIDLER; WEST, 2011; MEGID et al., 2016).
A infecção pode ocorrer em animais que ainda não tiveram contato sexual,
principalmente em períodos de estabulação prolongada, quando estes animais têm contato
com a urina de outros já infectados. Nessas condições, a bactéria penetra no organismo pela
mucosa nasal, oral, conjuntival e pela via percutânea, quando há feridas ou escoriações
(ALTON et al., 1988; BULGIN, 1990). Além disso a B. ovis não impede a concepção e
eventualmente verificam-se infertilidade, morte embrionária e abortamentos ou, ainda
nascimento de cordeiros fracos. As fêmeas que abortam têm infecção persistente e o agente
é isolado da placenta, descargas vaginais e leite. Cordeiros nascidos de fêmeas infectadas
raramente desenvolvem a infecção (MEGID et al., 2016).
Nas criações de ovinos em sistema extensivo, o contágio se dá em duas épocas.
Primeiramente na fase de pré-serviço quando os machos começam a ter um aumento da
libido e ter um comportamento homossexual de montar, cheirar e lamber outros machos e
posteriormente com contágio indireto durante o serviço, quando uma fêmea saudável atua de
forma passiva como agente intermediário entre dois machos infectados. Isto não quer dizer que a
fêmea adoeça, pois para que ela desenvolva a enfermidade ela deverá estar prenhe (ROBLES,
2008).
A espécie ovina se infecta de forma natural pela B. ovis, embora já tenha havido
confirmação da transmissão da bactéria de carneiros infectados para cervos criados no
mesmo pasto, e entre cervos infectados (RIDLER; WEST, 2011). Os caprinos podem ser
infectados de forma experimental, porém são menos suscetíveis quando comparados aos
ovinos, e a infecção nessa espécie é de caráter leve e de curta duração (BURGESS et al.,
1985).
Ao contrário do que ocorre na brucelose bovina, a manutenção da infecção por B.
ovis em um rebanho ocorre principalmente por meio do macho infectado, e este também é o
principal responsável pela transmissão da infecção entres os animais. Por esta razão, o
diagnóstico da brucelose ovina causada por B. ovis deve ser realizado fundamentalmente nos
machos da propriedade a ser investigada (ROBLES, 2008).
Para que haja o controle da brucelose ovina é necessário o estabelecimento de
medidas que tenham como alicerce a identificação e eliminação de animais infectados,
doentes ou portadores, e o bloqueio da introdução de novos animais infectados em um
23
rebanho. Desta forma, é fundamental a existência de métodos diagnósticos eficientes,
rápidos e viáveis em sua execução (COSTA, 2010).
3.3 Diagnóstico
O diagnóstico da brucelose pode ser feito pela identificação do agente por métodos
diretos, ou pela detecção de anticorpos contra B. abortus por métodos indiretos (BRASIL,
2006).
Os métodos indiretos ou sorológicos utilizados no diagnóstico da brucelose são
importantes recursos utilizados nas campanhas de controle e erradicação da doença em
bovinos e bubalinos (OLIVEIRA, 2003). Os mesmos identificam os anticorpos específicos
presentes no soro sanguíneo dos animais infectados, baseando-se em antígenos de superfície
bacteriana, compostos por lipopolissacarídeos (LPS) e proteínas de membrana externa
(ALTON et al., 1988; RAJASHEKARA et al., 2005; MINHARRO, 2009).
O diagnóstico sorológico é a base do combate à brucelose em rebanhos, permitindo
o monitoramento tanto de propriedades como de regiões inteiras, além de monitorar zonas
onde a doença já foi erradicada. Os testes devem ser utilizados respeitando-se as normas
técnicas estabelecidas pelos organismos internacionais, com antígenos padronizados e
específicos para cada prova (ALTON, 1988). Os principais testes para brucelose, são os que
buscam detectar anticorpos no soro e leite como também em muco vaginal e sêmen
(PAULIN, 2003; BRASIL 2006).
O Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose
Animal (PNCEBT) preconiza o Teste do Antígeno Acidificado Tamponado (TAAT) e o
Teste de Anel em Leite (TAL) como provas de triagem e como provas confirmatórias o
Teste do Mercaptoetanol (2-ME) e o Teste de Polarização Fluorescente (BRASIL, 2016).
Como os testes sorológicos não apresentam sensibilidade absoluta, há necessidade de
associação entre várias técnicas em busca de melhores resultados na detecção de animais
positivos, principalmente na fase inicial da infecção e em infecções crônicas. Essa estratégia
tem como base a escolha de um teste de triagem de fácil execução, pouco honeroso e com
boa sensibilidade, seguido de um teste confirmatório apenas nos soros positivos no teste
anterior, mais elaborados, e com melhor especificidade (COSTA, 2001; OLIVEIRA, 2003;
BRASIL, 2006).
Como teste de triagem temos o de soroaglutinação com Antígeno Acidificado
Tamponado (AAT), que é preparado com o antígeno acidificado na concentração de 8%,
tamponado em pH ácido (3,65) e corado com o Rosa de Bengala. É uma prova qualitativa
24
rápida, prática e de boa sensibilidade. Foi desenvolvido a partir da observação de que a IgG
é menos ativa em pH7, mudando de comportamento com a acidificação do meio. Como
podem ocorrer alguns poucos casos de reações falso-positivas em decorrência da utilização
da vacina B19 em bovinos, sugere-se a confirmação por meio de testes de maior
especificidade para se evitar o sacrifício de animais não infectados (OMS, 1986; WRIGHT;
NIELSEN, 1990; BRASIL, 2006).
O teste do anel em leite (TAL) foi idealizado para ser aplicado em misturas de leite
de vários animais, uma vez que a baixa concentração celular do antígeno (4%) o torna
bastante sensível. A prova revela anticorpos preferencialmente da classe IgA, presentes no
leite e aderidos às moléculas de gordura pela sua fração Fc. São empregados mais
comumente antígenos corados com hematoxilina, que dá a cor azul característica à reação
positiva. Se existirem anticorpos no leite, eles se combinarão com a B. abortus do antígeno,
formando uma malha de complexo antígeno-anticorpo que, por sua vez, será arrastada pelos
glóbulos de gordura, fazendo com que se forme um anel de cor azulada na camada de
gordura do leite caracterizando reação positiva (OMS, 1986; BRASIL, 2006).
Dentre os testes sorológicos confirmatórios temos o do Mercaptoetanol (2-ME), o
de Soroaglutinação em Tubos (SAT) e a Reação de Fixação de Complemento (RFC).
O teste do Mercaptoetanol é uma prova quantitativa seletiva que detecta somente apresença
de IgG no soro, que é a imunoglobulina indicativa de infecção crônica. Deve ser executada
sempre em paralelo com a prova lenta em tubos (SAT) (BRASIL, 2006). Tem sua
especificidade aumentada por inibição da atividade aglutinante da IgM mediante processo
químico que consiste no tratamento do soro com a droga 2-mercaptoetanol (TYMONEY et
al., 1988). A interpretação dos resultados é dada pela diferença entre os títulos dos soros sem
tratamento (prova lenta), frente ao soro tratado com 2-ME. Desta forma, resultados positivos
em ambas as provas indicam a presençade IgG, que são as aglutininas relacionadas com
infecção, devendo os animais ser considerados infectados (BRASIL, 2006).
Como teste confirmatório temos ainda o Teste de Soroaglutinação em Tubos (SAT)
chamada de prova lenta (leitura dos resultados é feita em 48 horas). É a prova sorológica
mais antiga e ainda hoje bastante empregada. É utilizada em associação como teste do 2-
Mercaptoetanol para confirmar resultados positivos em provas de rotina (BRASIL, 2006). É
executada num pH neutro, e demonstra uma boa sensibilidade analítica na detecção dos
isotipos bovinos com uma exceção importante, a IgG1 (WRIGHT E NIELSEN, 1990).
A Reação de Fixação de Complemento (RFC) é considerada a melhor prova para a
confirmação da brucelose pelo sorodiagnóstico, mostrando a melhor correlação com os
25
isolamentos em animais natural ou experimentalmente infectados (NIELSEN, 1995). É o
teste de referência recomendado pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o
trânsito internacional de animais. Na brucelose bovina, apesar da FC detectar tanto IgG1
como IgM, o isotipo IgG1 é muito mais efetivo como fixador do complemento (BRASIL,
2006). Trata-se de uma prova mais laboriosa e mais cara que as de aglutinação, sendo
recomendado seu uso como confirmatória para os soros positivos à triagem (CHAPPEL,
1989).
Os testes imunoenzimáticos que têm apresentado melhores resultados para
brucelose são os ELISA indiretos e competitivos (COLLING, 1998). O teste ELISA Indireto
(I ELISA) possui alta sensibilidade, entretanto, sua especificidade assemelha-se àquela do
AAT. Emprega-se como antígeno o lipopolissacarídeo de B. abortus imobilizado em placas
de 96 poços. Como conjugado, utiliza-se um anticorpo monoclonal anti-IgG1 bovina
conjugado com a peroxidase. Agentes quelantes (EDTA/EGTA) são utilizados para
minimizar reações não específicas (BRASIL, 2006). No teste ELISA Competitivo (C Elisa)
utiliza-se também como antígeno imobilizado na fase sólida o lipopolissacarídeo (LPS) de
B. abortus. No momento da prova, o soro a se testar é misturado com um anticorpo
monoclonal específico contra a cadeia “O” de B. abortus. Apresenta como vantagens altas
especificidade e sensibilidade e apesar de seu alto custo, é recomendado pela Organização
Mundial de Saúde Animal (OIE) como teste confirmatório para o diagnóstico de brucelose
(NIELSEN, 1995; BRASIL, 2006).
O Teste de Polarização de Fluorescência (FPA) se fundamenta na comparação de
velocidades dos movimentos aleatórios das moléculas em solução. O tamanho molecular é o
principal fator que influencia a velocidade de rotação de uma molécula, sendo inversamente
proporcional a ela (BRASIL, 2006). Se o anticorpo estiver presente no soro, irá ligar-se ao
antígeno, e a taxa rotacional desse antígeno conjugado será alterada, e esta mudança poderá
ser determinada pelo analisador de polarização fluorescente, baseado nas diferenças
rotacionais entre a LPS e o complexo antígeno-anticorpo. O FPA é uma prova de simples
execução, onde apenas o antígeno, com um indicador, é adicionado nas amostras diluídas
(SAMARTINO, 1999). Este teste foi validado para o sorodiagnóstico da brucelose em
bovinos, suínos, ovinos, caprinos, bisões e cervídeos, já que a reação cruzada com epítopos
comuns à Brucella abortus, B. melitensis e B. suis encontrados na cadeia O, permite o uso
de um só antígeno por serem estas espécies de brucelas lisas (NIELSEN, 2001).
Nos métodos diretos de diagnóstico temos o isolamento e a identificação do agente,
imunohistoquímica e métodos de detecção de ácidos nucleicos, principalmente a reação em
26
cadeia da polimerase (PCR). O isolamento e a identificação da B. abortus a partir de
material de aborto ou de secreções apresentam resultados muito bons quando a colheita
transporte do material é bem feita (BRASIL, 2006).
A aplicação da análise de DNA tem se intensificado bastante nos últimos anos, e o
desenvolvimento do método de reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction
- PCR) tem sido largamente empregado nas áreas biológicas, em especial na medicina
veterinária, pois muitas doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro
(OLIVEIRA, 2003).
Outro método molecular é PCR em tempo real (qPCR), baseada na PCR
tradicional, que, além de amplificar, simultaneamente, ela determina medidas quantitativas
ao longo dos ciclos da PCR, tornando-se uma ferramenta mais rápida, específica e sensível,
dando a capacidade de quantificar o DNA durante as reações (SCHMITTGEN, 2000).
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37
Capítulo 2 – Detecção de Brucella abortus e Brucella melitensis em leite caprino pela
PCR em tempo real
38
Detecção de Brucella abortus e Brucella melitensis em leite caprino pela PCR em
tempo real
Detection of Brucella abortus and Brucella melitensis in goat milk by real-time PCR
Resumo: A brucelose é uma zoonose de distribuição universal, que causa problemas
sanitários importantes e prejuízos econômicos. Cada espécie ou biovar de Brucella tem seu
hospedeiro preferencial: Brucella abortus (bovinos e bubalinos), B. melitensis (caprinos e
ovinos), B. ovis (ovinos), B. canis (cães), B. neotomae (ratos do deserto). Devido a escassez
de dados oficiais em relação a ocorrência da brucelose em caprinos, o objetivo deste trabalho
foi investigar a ocorrência de anticorpos contra amostras lisas de Brucella, assim como
utilizar a PCR em tempo real, para verificar a ocorrência de DNA de B. abortus e B.
melitensis em amostras de leite caprino. Foram analisadas 48 amostras de leite e sangue de
fêmeas caprinas na região do Alto Paranaíba em Minas Gerais. Das amostras de sangue
submetidas ao AAT, apenas um animal (2,1%) foi regente. Todas as amostras foram
negativas para o TAL e para a PCR em tempo real. Mesmo havendo baixa frequência de
animais regentes, o monitoramento dos rebanhos deve ser constante devido ao fator
zoonótico da enfermidade e aos prejuízos na produção animal.
Palavras-chave: Brucelose, caprinocultura, aborto, Brucella spp.
Abstract: Brucellosis is a zoonosis of universal distribution, which causes major health
problems and economic losses. Each species or biovar of Brucella has its preferred host:
Brucella abortus (bovines and buffaloes), B. melitensis (goats and sheep), B. ovis (sheep), B.
canis (dogs), B. neotomae. Due the lack of official data on the occurrence of brucellosis in
goats, the objective of this study was to investigate the occurrence of antibodies against
Brucella smooth samples, as well as to use real-time PCR to verify the occurrence of B.
abortus and B. melitensis in goat milk samples. It was analyzed 48 samples of milk and blood
39
of goat females in the Alto Paranaíba region of Minas Gerais. From the blood samples
submitted to AAT, only one animal (2,1%) was regents. All samples were negative for TAL
and for real-time PCR. Even though there is a low occurrence of reagents animals, the
monitoring of the herds should be constant due to the zoonotic factor of the disease and the
losses in animal production.
Key-words: Brucellosis, goat breeding, abortion, Brucella spp.
Introdução
A brucelose é uma enfermidade infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero
Brucella. É uma zoonose de distribuição universal, acarretando problemas sanitários
importantes e prejuízos econômicos (BRASIL, 2006).
Cada espécie ou biovar de Brucella tem seu hospedeiro preferencial: Brucella abortus
(bovinos e bubalinos), B. melitensis (caprinos e ovinos), B. ovis (ovinos), B. canis (cães), B.
neotomae (ratos do deserto) (BANAI; CORBEL, 2010; BRASIL, 2006).
Em caprinos a brucelose é caracterizada por abortos no terço final da gestação, queda
na fertilidade, ocorrência de natimortos e diminuição na produtividade leiteira (ALVES et al.,
1997).
O animal infectado é para o homem e para outros animais a principal fonte de
infecção que se dá por contato direto, de forma ocupacional ou ingestão de produtos
contaminados, principalmente por eliminação nas secreções vaginais e por meio do leite
(ELZER, 2002). As localizações de maior frequencia do agente no animal infectado são:
linfonodos, baço, fígado, aparelho reprodutor masculino e úbere (BRASIL, 2006).
O principal agente etiológico da brucelose em caprinos e ovinos é a Brucella
melitensis, também responsável por causar a brucelose humana, conhecida como febre de
Malta (FAO, 2006). A brucelose em caprinos e ovinos é considerada uma doença de menor
importância no Brasil, pois a B. melitensis ainda não foi diagnosticada no país (POESTER et
40
al., 2002; SELEEM et al., 2010).
A infecção por Brucella melitensis em caprinos é similar à infecção causada por B.
abortus em bovinos (MEGID et al., 2016). Nos pequenos ruminantes, a infecção por B.
melitensis causa doença apenas em animais sexualmente maduros e animais jovens podem
ser infectados, porém, não mostram nenhum sinal clínico, e a resposta sorológica é fraca e
transitória (ALTON, 1990).
Para o diagnóstico sorológico da Brucela abortus o Programa Nacional de Controle e
Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT) preconiza o Teste do Antígeno
Acidificado Tamponado (TAAT) e o Teste de Anel em Leite (TAL) como provas de triagem
e como provas confirmatórias o Teste do Mercaptoetanol (2-ME) e a Reação de Fixação de
Complemento (RFC) (BRASIL, 2006).
A aplicação da análise de DNA tem se intensificado bastante nos últimos anos, e o
desenvolvimento do método de reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction
- PCR) tem sido largamente empregado nas áreas biológicas, em especial na medicina
veterinária, pois muitas doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro
(OLIVEIRA, 2003).
Outro método molecular é a PCR em tempo real (qPCR), baseada na PCR tradicional,
que, além de amplificar, simultaneamente, determina medidas quantitativas ao longo dos
ciclos da PCR, tornando-se uma ferramenta mais rápida, específica e sensível, dando a
capacidade de quantificar o DNA durante as reações (SCHMITTGEN, 2000).
Devido a escassez de dados oficiais em relação a ocorrência da brucelose em
caprinos, o objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de anticorpos contra amostras
lisas de Brucella, assim como utilizar a PCR em tempo real, para verificar a ocorrência de
DNA de B. abortus e B. melitensis em amostras de leite individuais na Região do Alto
Paranaíba, MG.
41
Material e métodos
Foram coletadas 48 amostras de leite individuais de sangue de todas as fêmeas em
lactação de duas propriedades produtoras de caprinos de leite na região do Alto Paranaíba,
MG. Uma propriedade localizada no município de São Gotardo possuia sistema de produção
intensivo, com os animais confinados em aprisco, com piso ripado suspenso. O manejo
sanitário e nutricional era acompanhado por Médico Veterinário e Zootecnista. Na outra
propriedade situada no municípo de Patos de Minas, o sistema de produção era semi-
extensivo, com aprisco ripado suspenso, apenas para alojar os animais no período noturno.
Não havia assistência médica veterinária e fornecimento de programa de nutrição adequada à
espécie. Os animais conviviam e pastejavam juntamente com ovinos e bovinos e não
recebiam as vacinas preconizadas para pequenos ruminantes.
Após a coleta, o material foi conduzido, em caixas isotérmicas, refrigerado, ao
Laboratório de Doenças Infeciosas do Centro Universitário de Patos de Minas, MG.
Para o diagnóstico sorológico da brucelose, foram realizados os exames do teste do
anel do leite (TAL) em amostras individuais, e do antígeno acidificado tamponado (AAT).
Para o teste do AAT, amostras de sangue venoso foram coletadas por venopunção
com auxílio de sistema coletor a vácuo, sem anti-coagulante para obtenção de soro, sendo
aliquotadas, identificadas e mantidas a –20°C até o momento das análises.
Amostras para o TAL foram colhidas após a anti-sepsia dos tetos e descarte dos três
primeiros jatos de leite de cada metade mamária. Dez mL de amostras individuais de leite de
cada teto foram colhidas, por ordenha manual, e acondicionadas em tubos falcon estéreis.
Os testes de TAL e AAT foram executados no Laboratório de Doenças Infecciosas do
Centro Universitário de Patos de Minas segundo protocolo preconizado pelo manual técnico
do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal
(PNCEBT) (BRASIL, 2006).
A PCR em tempo real para o diagnóstico da B. abortus e B. melitensis foi executada
42
para todas as amostras de leite coletadas e congeladas, pelo laboratório TECSA@ –
Tecnologia em Saúde Animal, em Belo Horizonte, MG.
Para o protocolo de extração de DNA foi utilizado o mini kit QIAamp DNA seguindo
as instruções do fabricante. No preparo da reação foi utilizado o Kit para SYBR qPCR: Fast
SYBR® Green Master Mix (2X –10 uL/reação) - Thermo Fisher Scientific (Applied
Biosystems).
A Concentração dos primers foi de 300 nM cada (0,6 uL cada, na concentração 10
uM). O volume template (DNA da amostra): 5 uL; volume H2O nuclease free: 3,8 uL;
volume total de reação: 20 uL.
O equipamento utilizado para o programa/ciclagem foi o Step One Real Time PCR
System.
Os controles positivos foram quantificados no Qubit 2.0 (Thermo) e considerados no
esquema de validação em 5 diluições 1:10 (todas resultantes em amplificação).
Os controles positivos para B. abortus e B. melitensis foram doadas pelo Laboratório
de Brucelose do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) em Pedro
Leopoldo, MG.
Para amplificação do fragmento de DNA (B. abortus) foram utilizados os primers,
BRUAB2 0168-F e BRUAB2 0168-R descritos por Hinic et al., (2008), que amplificam um
fragmento de 498 pb (Tab.1).
Tabela 1 - Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella abortus.
Primers Sequência Amplicon
BRUAB2 0168-F
BRUAB2 0168-R
5’ GCACACTCACCTTCCACAACAA 3’
5’ CCCCGTTCTGCACCAGACT 3’
498 pb
Para amplificação do fragmento de DNA (B. melitensis) foram utilizados os primers
43
BMEII0499-Re BMEII0499-F por Hinic et al., (2008), que amplificam um fragmento de
252pb (Tab.2).
Tabela 2 - Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella
melitensis.
Primers Sequência Amplicon
BMEII0499-R
BMEII0499-F
5’ CCAGCTTTTGGCCTTTTCC 3’
5’ TCGCATCGGCAGTTTCAA 3’
252pb
Para a análise de dados utilizou-se a estatística descritiva com o software Microsoft
Excell 2010 (Microsoft Co., EUA), onde obteve-se o cálculo de frequência.
Resultados e Discussão
Todas as 48 amostras testadas para o teste do anel do leite (TAL) não apresentaram
reatividade e, portanto, foram consideradas negativas. Em pesquisa desenvolvida por Messias
et al., (2011), amostras coletadas de 14 propriedades produtoras de leite de cabra no estado
da Paraíba, as quais em conjunto somavam um rebanho de 254 cabras em lactação, foram
negativas para o TAL. Porém sabe-se que a excreção de Brucella no leite é geralmente
intermitente e normalmente somente aparece de 6 a 12 dias após o aborto (FERREIRA;
FERREIRA,1990; LOUZÃ, 1993).
Para o teste de AAT, das 48 amostras analisadas, apenas uma (2,03 %) foi reagente.
Carneiro et al., (2005) relataram frequencia de 9,0% (36/400) de caprinos sororeagentes no
Estado da Bahia. Em Pernambuco, Pinheiro Junior et al., (2008), avaliaram 340 amostras de
soro de caprinos e apenas (0,6%) foram reagentes e 338 (99,4%) não reagentes ao AAT. O
mesmo foi registrado por Fraguas et al., (2004) no Rio de Janeiro, que ao analisarem 953
amostras de soros caprinos encontraram 0,2% de animais reagentes.
44
Varges et al., (2014) em pesquisa desenvolvida no Rio de Janeiro registraram sete
(5,6%) dos 124 caprinos testados, sororreativos ao AAT, sendo todos confirmados pelo 2-
ME. Das três vacas presentes na propriedade, uma apresentou sororreatividade aos dois
métodos diagnósticos empregados. Considerou-se que este animal, que fornecia leite para os
cabritos, teria sido a mais provável fonte de infecção para os cabritos do rebanho. O mesmo
não ocorreu nesta pesquisa, onde as quatro vacas que fornecem leite aos cabritos, testadas
para o TAL e ATT foram negativas. Deve-se, porém, salientar que duas vacas que também
forneciam leite aos cabritos foram descartadas antes da execução desta pesquisa.
Embora o principal agente da brucelose em caprinos seja a B. mellitensis, não há
relatos da mesma no Brasil (POESTER et al., 2002), mas existem relatos de infecções
esporádicas causadas por B. abortus em cabras (MEGID et al., 2007).
É importante ressaltar que por meio de testes sorológicos, não é possível distinguir
entre a presença de aglutininas anti-B. abortus e B. melitensis (VARGES et al., 2014). No
entanto, a partir dos aspectos epidemiológicos e a ausência de B. melitensis no Brasil, os
achados deste estudo sugerem fortemente tratar-se de infecção por B. abortus, concluindo-se,
portanto, que a brucelose por B. abortus ocorre em caprinos e que esta importante
enfermidade requer maior atenção dos veterinários e um programa de diagnóstico e controle
se faz necessário.
As 48 amostras de leite testadas na qPCR não apresentaram DNA de B. abortus e B.
mellitensis e, portanto, foram consideradas negativas. A amostra de soro reagente no AAT
não foi reagente à qPCR. Wareth et al., (2015) em pesquisa realizada com amostras de soro
de dez vacas, cinco búfalas, uma ovelha e nove cabras, coletadas logo após o aborto,
relataram que todas foram positivas para o gênero específico bcsp31 para os ensaios com
PCR em tempo real. O DNA de B. abortus, foi identificado em todas as amostras de soro
coletadas das vacas, búfalas, cabras e ovelha, sendo que a ovelha foi positiva para B. abortus
e B. melitensis.
45
A ocorrência de uma cabra reagente ao AAT gera preocupação, pois pode ser que a
mesma teve uma infecção subclínica e não apresentava bacteremia na época da coleta, e por
essa razão não foi detectada a presença de DNA de Brucella abortus e B. melitensis. Sabe-se
da limitação dos testes de diagnósticos, desta forma, investigações constantes devem ser
feitas.
Sabe-se que o aquecimento do leite a 80-85 ºC por 10 minutos elimina a bactéria e que
a mesma não sobrevive se o queijo é curado por um período maior que três meses (OLSEN;
TATUM, 2010; LUCE et al., 2012). Desta forma, a legislação européia requer que todos os
queijos feitos com leite cru, sejam submetidos a cura por um período não menor que 60 dias
(REGULATION (EC), 2004). Fato que não ocorre no Brasil, tornando o risco de
contaminação pelo leite e seus derivados maior.
Na propriedade onde ocorreu a positividade de uma cabra reagente para o AAT, a
ordenha era realizada manualmente e o leite comercializado in natura, ou congelado, o que
leva a preocupação da possibilidade de contaminação tanto do ordenhador quanto do
consumidor de leite. Ressaltando ainda que as crianças, por problemas de intolerância ao leite
bovino, e idosos, são os que mais consomem o leite caprino. Salienta-se que em cabras, a
excreção da Brucella é mais prolongada e abundante, desta forma há um risco aumentado de
infecção através do consumo de leite desta espécie (FERREIRA; FERREIRA,1990; LOUZÃ,
1993).
Conclusão
Foi constatada a presença de um caprino sorologicamente reagente para Brucella
abortus em uma propriedade de caprinos leiteiros na região do Alto Paranaíba, MG.
Entretanto não foram detectados DNA de B. abortus e B. melitensis nas amostras de leite.
A investigação da ocorrência de brucelose em caprinos deve ser constante, para que
medidas de controle adequadas sejam tomadas, além de estudos complementares para a
46
elucidação da epidemiologia da brucelose nesses animais e conscientização dos criadores,
por meio de programas de educação sanitária para prevenir e erradicar a doença de suas
propriedades.
O projeto desta pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética na Utilização de
Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia, sob ANÁLISE FINAL Nº
064/17 do protocolo de registro CEUA/UFU 016/17.
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50
Capítulo 3 - Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo real em sêmen ovino
comercial
51
Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo real em sêmen ovino comercial
Investigation of Brucella ovis by real-time PCR in commercial sheep semen
Nadia Grandi Bombonato¹; Mariana Assunção de Souza¹; Anna Monteiro Correia Lima¹
1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Medicina Veterinária,
Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Uberlândia, MG, Brasil. Centro Colaborador de
Defesa Agropecuária do Brasil Central. Correspondence: N. Bombonato
[[email protected]–Tel.: +55 (34) 99103-7731]. Laboratório de Doenças
Infectocontagiosas, Faculdade de Medicina Veterinária, RuaCeará, s/n,2D-33, Umuarama,
CEP 38400-902, Uberlândia, MG, Brasil.
Resumo: A brucelose ovina é uma doença infecto-contagiosa de distribuição mundial
causada pela Brucella ovis e apesar de ser um agente não zoonótico, provoca doença crônica
em ovinos, conhecida como Epididimite Contagiosa dos Carneiros ou Epididimite Ovina.
Provoca lesões genitais, caracterizadas por epididimite e sêmen com qualidade variável
gerando diminuição da vida reprodutiva dos machos, abortamentos e mortalidade perinatal.
O objetivo da pesquisa foi verificar por meio da PCR em tempo real, a presença da B. ovis
em semen comercial de ovinos com aptidão de corte das raças Santa Inês e Dorper. Todas as
20 amostras de sêmen analisadas pela PCR em tempo real nesta pesquisa não apresentaram
DNA de Brucella ovis e, portanto, foram negativas, confirmando que o manejo sanitário dos
carneiros doadores de sêmen das centrais de produção e distribuição em questão era
eficiente.
Palavras chave: Brucelose ovina, inseminação, doenças reprodutivas, Ovis aries.
52
Abstract: Sheep brucellosis is an infectious disease of worldwide distribution caused by
Brucella ovis and despite being a non-zoonotic agent, causes chronic disease in sheep,
known as Sheep Contagious Epididymitis or Ovine Epididymitis. Causes genital lesions,
characterized by epididymitis and semen with variable quality, resulting in decreased
reproductive life of males, abortions and perinatal mortality. The objective of this study was
to verify the presence of B. ovis in commercial semen of sheep with breeding ability of the
Santa Inês and Dorper breeds. All 20 semen samples analyzed by real-time PCR in this study
did not present Brucella ovis DNA and therefore were negative, confirming that the sanitary
management of semen donor sheep from the production and distribution centers in question
was efficient.
Key-words: Sheep brucellosis, insemination, reproductive diseases, Ovis aries.
Introdução
A Brucelose ovina é um agente não zoonótico, intracelular facultativo que coloniza
células do sistema macrocítico linfocitário, que provocando doença crônica em ovinos,
conhecida como Epididimite Contagiosa dos Carneiros ou Epididimite Ovina (BURGUESS,
1982; QUISPE et al., 2002). Apesar de ser considerada de menor relevância quando
comparada às outras bactérias do mesmo gênero, devido ao fato de não ser zoonótica, a B.
ovis tem sua importância relacionada aos prejuízos econômicos que causa principalmente
para produtores em que a criação de ovinos é principal fonte de renda (ROBLES, 2008).
É caracterizada por induzir lesões genitais, caracterizadas por epididimite e sêmen
com qualidade variável (MEGID; MATHIAS; ROBLES, 2010) reduzindo desta forma os
índices reprodutivos com o aumento anual do número de carneiros não aptos à atividade
53
reprodutiva, gerando diminuição da vida reprodutiva dos machos, abortamentos, mortalidade
perinatal e a consequente diminuição nos rendimentos de carne e lã (ROBLES, 2008).
A bactéria se multiplica nos órgãos afetados e é eliminada à medida que as células
infectadas são destruídas (MEGID et al., 2016). As alterações testiculares características da
epididimite em ovinos são geralmente unilaterais, evoluindo para atrofia testicular na fase
crônica e baixa fertilidade. A transmissão se dá pela ingestão e/ou contato sexual com
descargas genitais (ALVES et al., 2006) tendo o sêmen como a principal via de excreção da
B. ovis (PAOLICCHI et al., 1993).
A Instrução Normativa n. 87 da Secretaria de Defesa Agropecuária, de 10 de
dezembro de 2004, aprovou o Regulamento Técnico do Programa Nacional de Sanidade dos
Caprinos e Ovinos (PNSCO), com o controle e erradicação das doenças de caprinos e
ovinos, por meio de ações sanitárias e de vigilância epidemiológica. Dentre as estratégias de
atuação do PNSCO estão o cadastro de estabelecimentos, controle de trânsito de animais,
certificação de estabelecimentos, cadastramento de médicos veterinários do setor privado e
credenciamento de laboratórios para realização de exames diagnósticos das doenças de
controle oficial, entre elas a brucelose ovina causada pela B. ovis (PNSCO, 2005).
O diagnóstico da brucelose ovina é realizado geralmente por meio de provas
sorológicas sendo as mais utilizadas a Fixação de Complemento (FC), Imunodifusão em Gel
de Ágar (IDGA) e ensaio imunoenzimático (ELISA) (ROBLES, 1998).
As falhas diagnósticas dos testes diagnósticos convencionais levaram pesquisadores a
desenvolver métodos moleculares de PCR baseados na amplificação de fragmentos de DNA
de B. ovis em amostras de sêmen de animais infectados (MANTEROLA et al., 2003;
SAUDERS et al., 2007). PCR em Tempo Real também conhecido como PCR quantitativo
também é outra ferramenta que permite a quantificação do DNA alvo. Devido a um menor
tempo de extensão por não precisar de eletroforese, a PCR em tempo real é ainda menos
demorada (HINIC et al., 2008).
54
Devido aos sérios problemas reprodutivos que a Brucella ovis causa em rebanhos
ovinos, o objetivo da pesquisa foi investigar por meio da PCR em tempo real, a presença
desta bacteria em semen comercial dos ovinos com aptidão de corte das raças Santa Inês e
Dorper mais requisitados pelos criadores no sudeste do Brasil.
Material e métodos
A pesquisa foi conduzida utilizando-se 20 amostras de semen ovino commercial das
raças ovinas de corte, Santa Inês e Dorper, oriundas de duas centrais distribuidoras de sêmen
ovino na região sudeste do Brasil.
As amostras de sêmen congeladas foram enviadas ao laboratório TECSA@ em Belo
Horizonte e foram submetidas ao diagnóstico por PCR em Tempo Real para Brucella ovis.
Para o protocolo de extração de DNA foi utilizado o mini kit QIAamp DNA seguindo
as instruções do fabricante. No preparo da reação foi utilizado o Kit para SYBR qPCR: Fast
SYBR® Green Master Mix (2X –10 uL/reação) - Thermo Fisher Scientific (Applied
Biosystems).
A Concentração dos primers foi de 300 nM cada (0,6 uL cada, na concentração 10
uM). O volume template (DNA da amostra): 5 uL; volume H20 nuclease free: 3,8 uL;
volume total de reação: 20 uL.
O equipamento utilizado para o programa/ciclagem foi o Step One Real Time PCR
System.
O controle positivo para B. ovis foi doado pelo Laboratório de Brucelose do
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) em Pedro Leopoldo, MG. O
mesmo foi quantificado no Qubit 2.0 (Thermo) e considerado no esquema de validação em 5
diluições 1:10 (todas resultantes em amplificação).
55
Para a amplificação fragmento de DNA (B. ovis) para a técnica da PCR gênero-
específica, os primers utilizados foram BOV A0504-R e BOV A0504-F designados para a
sequência de nucleotídeos da Brucella ovis (Tab.2) (HINIC et al., 2008).
Tabela 2 - Sequência dos primers utilizados na PCR para identificação de Brucella ovis.
Primers Sequência Amplicon
BOV A0504-R
BOV A0504-F
5’ CCCTGATTTCAAGCCATTCC 3’
5’CGCTATCGATGGCGTAGTTG 3’
499 pb
Resultados e Discussão
Segundo Schmittgen e Zakrajsek (2000) a PCR em tempo real (qPCR) é baseada na
PCR tradicional, porém, além de amplificar, simultaneamente, ela determina medidas
quantitativas ao longo dos ciclos da PCR, tornando-se assim uma ferramenta mais rápida,
específica e sensível, dando a capacidade de quantificar o DNA durante as reações. Desta
forma vários autores avaliaram o PCR em tempo real para detecção de Brucella spp.,
(HINIC, 2008). Porém Moustaca et al., (2015) relataram pela primeira vez a PCR em tempo
real específica para B. ovis, enfatizando que o diagnóstico espécie-específico para esta
bactéria em carneiros é extremamente importante para diferenciá-la de outras espécies de
alto potencial zoonótico que podem também infectar ovinos.
Todas as 20 amostras de sêmen analisadas pela PCR em tempo real nesta pesquisa
foram negativas para Brucella ovis. Isso pode confirmar que o manejo sanitário e
monitoramento constante dos carneiros doadores de sêmen das centrais de produção e
distribuição, e preconizado pelos órgãos oficiais foi eficiente.
Moustaca et al., (2015) em pesquisa desenvolvida com ovinos concluiram que ensaios
com PCR em tempo real para detectar Brucella ovis em sêmen tiveram alta sensibilidade e
56
especificidade e que esses ensaios têm potencial para ser usado como ferramentas adicionais
para um diagnóstico mais rápido de epididimite infecciosa ovina associada com B. ovis ou
Histophilus somni utilizando-se amostras de sêmen e urina.
De acordo com o Programa Nacional de Sanidade de Caprinos e Ovinos (PNSCO), a
brucelose causada pela B. ovis é uma das enfermidades de notificação oficial, sendo os
animais positivos direcionados ao abate sanitário. Segundo a Instrução Normativa nº 1, de
22 de janeiro de 2014, que determina os requisitos sanitários mínimos para a produção e
comercialização de sêmen, os ovinos para ingressarem no Centro de Coleta e
Comercialização de Semen (CCPS) deverão estar acompanhados de documento de trânsito
animal e apresentar testes negativos de AAT ou 2-Mercaptoetanol (2-ME) ou teste de
Fixação de Complemento, realizados dentro dos últimos 60 dias para brucelose. Além disso,
esses exames devem ser repetidos constantemente durante a permanência dos animais na
CCPS e antibióticos são adicionados durante o processamento do sêmen (BRASIL, 2004).
Conclusão
As amostras analisadas de sêmen congelado das Centrais de Produção e
Comercialização de Sêmen foram negativas para a PCR em tempo real, de acordo com o
preconizado pela legislação.
O projeto desta pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética na Utilização de
Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia, sob ANÁLISE FINAL Nº 064/17
do protocolo de registro CEUA/UFU 016/17.
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59
Capítulo 4 - Investigação da ocorrência de infecção por Brucella ovis em rebanhos
ovinos
60
Investigação da ocorrência de infecção por Brucella ovis em rebanhos ovinos
Investigation of the occurrence of Brucella ovis infection in sheep flocks
Nadia Grandi Bombonato¹, Mariana Assunção de Souza¹ e Anna Monteiro Correia
Lima¹
1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Medicina
Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia (UFU), Uberlândia, MG, Brasil.
Centro Colaborador de Defesa Agropecuária do Brasil Central. Correspondence: N.
Bombonato [[email protected]– Tel.: +55 (34) 99103-7731]. Laboratório de
Doenças Infecto Contagiosas, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Ceará,
s/n,2D-33, Umuarama, CEP 38400-902, Uberlândia, MG, Brasil.
Resumo: A brucelose ovina é uma doença bacteriana infecciosa crônica causada
por Brucella ovis e caracterizada por distúrbios reprodutivos, tais como diferentes
graus de epididimite e orquite, placentite, aborto e elevada mortalidade de
cordeiros. Apesar de considerada de menor relevância quando comparada às outras
bactérias do mesmo gênero, devido ao fato de não ser zoonótica, a B. ovis tem sua
importância relacionada aos prejuízos econômicos na criação de ovinos. O objetivo
deste trabalho foi verificar a ocorrência da B. ovis em rebanhos ovinos, na região do
Alto Paranaíba, MG, por meio do teste sorológico de Imunodifusão em Gel de Ágar
(IDGA) e da PCR em tempo real. Das 30 amostras de soro ovino submetidas ao
teste de IDGA para detecção de anticorpos contra B. ovis, 3 (10%) de uma mesma
propriedade apresentaram reação positiva ao teste e confirmadas pela PCR em
tempo real. Os resultados relatados por vários autores mostram que no Brasil a
61
brucelose em ovinos causada pela B. ovis encontra-se bastante disseminada. Desta
forma conclui-se que o monitoramento das propriedades deve ser constante e que os
animais a serem introduzidos no rebanho devem ser testados para B. ovis.
Termos para indexação: Epididimite, brucelose ovina, Ovis aries.
Abstract: Sheep brucellosis is a chronic infectious bacterial disease caused by Brucella
ovis and characterized by reproductive disorders such as different degrees of
epididymitis and orchitis, placentite, abortion and high mortality of lambs. Although
considered of minor relevance when compared to other bacterias of the same genus,
due to the fact that it is not zoonotic, B. ovis has its importance related to economic
losses in sheep farming. The objective of this work was to verify the occurrence of B.
ovis in sheep flocks in the region of Alto Paranaíba, MG, through the serological test of
Immunodiffusion in Agar Gel (IDGA) and real time PCR. From 30 samples of sheep
serum submitted to the IDGA test to detect antibodies against B. ovis, 3 (10%) of the
same property showed a positive reaction to the test and confirmed by real-time PCR.
The results reported by several authors show that in Brazil the brucellosis in sheep
caused by B. ovis is disseminated. In this way, it is concluded that the monitoring of the
properties must be constant and that the animals to be introduced in the herd should be
tested for B. ovis.
Index terms: Epididymite, ovine brucellosis, Ovis aries.
Introdução
A brucelose ovina é reconhecida como a mais importante causa de epididimite
ovina, sendo uma das principais causadoras de infertilidade nesta espécie (RIDLER;
WEST, 2011). É uma doença bacteriana infecciosa crônica causada por Brucella
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ovis e caracterizada por distúrbios reprodutivos, tais como diferentes graus de
epididimite e orquite, placentite, aborto e elevada mortalidade de cordeiros (NIILO
et al., 1983; BAIGÚN et., 2000).
A B. ovis tem sua importância relacionada aos prejuízos econômicos que
causa principalmente para produtores em que a criação de ovinos é principal fonte
de renda. Entre inúmeros agentes, é a principal causadora da epididimite contagiosa
ovina. Reduz os índices reprodutivos, aumenta anualmente o número de carneiros
não aptos à atividade reprodutiva, gera diminuição da vida reprodutiva dos machos,
abortamentos, mortalidade perinatal e a consequente diminuição nos rendimentos de
carne e lã (ROBLES, 2008).
Os sinais clínicos iniciais causados pela brucelose ovina passam geralmente
despercebidos, os animais apresentam um período de febre acompanhada de apatia,
dispneia e inflamação do escroto (ROBLES, 2008).
Carneiros infetados com B. ovis frequentemente apresentam sêmen de baixa
qualidade, grande quantidade de células inflamatórias, particularmente neutrófilos
(ROBLES et al., 1998). A inflamação do epidídimo causa degeneração seminal no
testículo adjacente e alteração na concentração, motilidade e morfolologia dos
espermatozóides, causando assim queda na fertilidade. O aumento da cauda desse
órgão caracteriza cronicidade da doença (FOSTER et al., 1989; BLASCO, 1990;
WEST et al., 1993; RIDLER; WEST, 2011; MEGID et al., 2016).
A B. ovis não impede a concepção e eventualmente verificam-se infertilidade,
morte embrionária e abortamentos ou, ainda nascimento de cordeiros fracos e pouco
viáveis. As fêmeas que abortam têm infecção persistente e o agente é isolado da
placenta, descargas vaginais e leite. Cordeiros nascidos de fêmeas infectadas
raramente desenvolvem a infecção (MEGID et al., 2016).
O diagnóstico de epididimite em carneiros por B. ovis pode ser obtido por meio da
63
palpação do epidídimo, avaliação do sêmen, teste de aglutinação e hemoaglutinação,
imunodifusão em gel de ágar (IDGA), reação de fixação do complemento (RFC),
ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), teste com anticorpos fluorescentes, teste
alérgico e isolamento no sêmen (AFZAL; KIMBERLING, 1980).
Mesmo havendo a possibilidade de uso vários testes de diagnósticos, ressalta-
se a necessidade do diagnóstico diferencial entre a epididimite dos carneiros
causada por B. ovis e outras causadas por Actinobacillus seminis e Haemophilus
somnus (CARVALHO JUNIOR et al., 2010).
Além dos métodos sorológicos como o IDGA e FC, outro método molecular
utilizado no diagnóstico de doenças infecciosoas é a PCR em tempo real (qPCR),
baseada na PCR tradicional, que, além de amplificar, simultaneamente, determina
medidas quantitativas ao longo dos ciclos da PCR, tornando-se uma ferramenta
mais rápida, específica e sensível, dando a capacidade de quantificar o DNA
durante as reações (SCHMITTGEN, 2000).
O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrência da infecção por B. ovis em
rebanhos ovinos, por meio do teste sorológico de Imunodifusão em Gel de Ágar
(IDGA) e da PCR em tempo real.
Material e métodos
Foram examinadas 30 amostras de soro de ovinos em idade reprodutiva de 1 a
4 anos, das raças Santa Inês e mestiços Dorper, provenientes de três propriedades
pertencentes a dois municípios da região do Alto Paranaíba, MG. Os municípios
contemplados foram escolhidos em função do conhecimento prévio de proprietários
que concordaram com a realização da investigação. De cada propriedade foram
coletadas 10 amostras de sangue, sendo que cada propriedade possuia apenas um
macho reprodutor.
64
O sistema de produção das três propriedades era do tipo semi-extensivo, com
aprisco para abrigo dos animais durante a noite, produzem ovinos de corte e
possuem assistência veterinária.
Por ocasião das colheitas, foi realizada uma avaliação clínica nos animais para
a detecção de alterações sugestivas de infecção por B. ovis. A colheita de sangue foi
realizada por meio de punção veno-jugular, e foi obtido um volume total de 10mL
por animal. Após a retração do coágulo, o soro sanguíneo foi centrifugado a 3000
rpm durante 10 minutos e armazenado a -20ºC até a realização das provas
sorológicas. As amostras de soro foram colocadas em tubos estéreis e identificados
com o número do animal e o nome da propriedade e, em seguida, acondicionados
em caixas isotérmicas com gelo, e enviados ao Laboratório TECSA@de Belo
Horizonte.
Para a pesquisa de anticorpos contra B. ovis, foi utilizada a técnica de
Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA) empregando-se kits comerciais produzidos pelo
Instituto de Tecnologia do Paraná (TECPAR). A técnica foi executada de acordo com
as instruções do fabricante, utilizando-se antígeno de lipopolissacarídeos e proteínas de
B. ovis.
Para o protocolo de extração de DNA foi utilizado o mini kit QIAamp DNA
seguindo as instruções do fabricante. No preparo da reação foi utilizado o Kit para
SYBR qPCR: Fast SYBR® Green Master Mix (2X –10 uL/reação) - Thermo Fisher
Scientific (Applied Biosystems).
A concentração dos primers foi de 300 nM cada (0,6 uL cada, na
concentração 10 uM). O volume template (DNA da amostra) foi: 5 uL; volume H2O
nuclease free: 3,8 uL; volume total de reação: 20 uL.
O equipamento utilizado para o programa/ciclagem foi o Step One Real Time
PCR System.
65
O controle positivo foi quantificado no Qubit 2.0 (Thermo) e considerado no
esquema de validação em 5 diluições 1:10 (todas resultantes em amplificação).
O controle positivo para B. ovis foi doado pelo Laboratório de Brucelose do
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) em Pedro Leopoldo,
MG.
Na amplificação do fragmento de DNA (B. ovis) para a técnica da PCR gênero-
específica, os primers utilizados foram BOV A0504-R e BOV A0504-F designados para a
sequência de nucleotídeos da Brucella ovis (Tab.1) (HINIC et al., 2008).
Tabela 1 - Sequência dos primers utilizados na qPCR para identificação de Brucella
ovis.
Primers Sequência Amplicon
BOV A0504-R
BOV A0504-F
5' CCCTGATTTCAAGCCATTCC 3’
5’CGCTATCGATGGCGTAGTTG 3’
500 pb
Para a análise dos dados foi realizado o cálculo de frequência utilizando o
software Microsoft Excel 2010. Para comparação de frequências foi utilizado o teste
exato de Fisher, com nível de significância fixado em p<0,05 (bicaudal) para o
intervalo de confiança de 95%, pelo software Graph Pad Prism, versão 7.03
(GraphPad Software, Inc., San Diego, California, EUA).
Resultados e discussão
Das 30 amostras de soro ovino submetidas ao teste de IDGA para detecção de
anticorpos contra B. ovis, 3 (10%) apresentaram reação positiva ao teste. Silva et al.,
(2003) e Azevedo et al., (2004) no Rio Grande do Norte encontraram 34% em 290
66
amostras e 11,3% em 115 amostras respectivamente. Em pesquisa realizada em São
Paulo, Nozaki et al., (2004) detectaram 12,0% em 1033 amostras. Já Clementino et
al., (2007) na Paraíba verificaram um percentual menor de animais positivos, 5,57%
em 498 amostras.
Mendonça et al., (2017) no estado de Sergipe, analisaram 932 soros ovinos
pelo teste de IDGA, onde 41 (4,40 %) foram positivos, e entre os municípios
analisados 73,68% (14/19) possuíam animais sororreagentes e 46,30% (25/54) das
propriedades apresentaram pelo menos um animal positivo para B. ovis no IDGA.
Verificou-se alta positividade de rebanhos com baixa soropositividade de animais e
esse resultado, do ponto de vista epidemiológico, sugere que a infecção seja
endêmica, pois regiões onde a enfermidade é recente há altas prevalências, de 20%
a 60%, enquanto regiões endêmicas tendem a apresentar prevalências menores.
Salaberry et al., (2011), analizaram 334 amostras de soro sanguíneo de ovinos
provenientes de 12 propriedades localizadas no município de Uberlândia, MG, por
meio do teste de FC para o diagnóstico da B. ovis, e não observaram animais
reagentes. O mesmo aconteceu com Marinho e Mathias (1996) e Schäfer et al.,
(1997), que não detectaram ovinos reagentes nos estados de São Paulo e Santa
Catarina, respectivamente.
Os resultados mostram que no Brasil a brucelose em ovinos causada pela B.
ovis encontra-se bastante disseminada. Em relação ao sexo dos animais, Marinho &
Mathias (1996), no estado de São Paulo, observaram que, dos 183 ovinos testados
pela prova de IDGA para pesquisa de anticorpos anti-Brucella ovis, 20,8% (38/183)
eram machos e 79,2% (145/183) eram fêmeas. Dos 38 machos, apenas um (2,63%)
foi positivo e, das 145 fêmeas, cinco (3,44%) foram positivas. Na presente pesquisa
a maioria dos animais testados nas três propriedades eram fêmeas, visto que em
cada propriedade havia apenas um macho reprodutor. Entretanto a relação entre a
67
positividade e o sexo não apresentou diferença estatística significante (p = 1,00),
corroborando com os achados de Azevedo et al., (2004), que ao analisarem 115
soros de ovinos do Rio Grande do Norte, não observaram significância estatística
entre a positividade e o sexo, o que indica que machos e fêmeas estão igualmente
expostos ao risco de infecção.
O exame clínico realizado nos machos das 3 propriedades não revelou
alterações nos epidídimos, sugestivos de infecção por B. ovis. Azevedo et al. (2004)
evidenciaram 20,8% de positividade nos carneiros testados, porém os mesmos não
apresentaram lesões testiculares macroscópicas. Por outro lado, Ramos et al., (1966)
no Rio Grande do Sul diagnosticaram 7,3% em 3317 carneiros que apresentavam
epididimite clínica. O mesmo ocorreu com Magalhães Neto & Gil-Turnes (1996),
também no Rio Grande do Sul, onde de 160 carneiros positivos para o teste de
IDGA, num total de 1638 machos, encontraram 9,8% que apresentavam
manifestações clínicas.
Nenhum dos reprodutores nesta pesquisa foi positivo aos testes. Na
propriedade onde ocorreu a positividade à B. ovis, a contaminação das fêmeas do
rebanho pode ter ocorrido pelo contato com carneiros que foram descartados e não
foram avaliados.
Testes moleculares baseados em PCR podem ser considerados uma alternativa
para os entraves apresentados pelo isolamento bacteriano, uma vez que têm
demonstrado ser mais rápidos e mais sensíveis que os métodos tradicionais de
diagnóstico (BRICKER, 2002).
Utilizando a PCR convencional, Costa et al., (2012) testaram amostras de
urina e soro de noventa carneiros oriundos de 31 propriedades das quais quatro
foram positivas, sendo que dezoito (20%) amostras de urina foram positivas pela
PCR, enquanto o método de IDGA identificou 16 (17,8%) carneiros soropositivos.
68
Além do PCR denominado convencional, diversos autores vêm
desenvolvendo o diagnóstico da infecção por Brucella através da técnica de PCR
em tempo real. Este método diagnóstico possui as vantagens de execução mais
rápida e fácil, limitar a possibilidade de contaminação do DNA utilizado e permitir
a quantificação dos produtos de DNA avaliados (BOUNAADJA, et al., 2009).
Muitos autores têm realizado ensaios utilizando a PCR em tempo real para
detecção de Brucella spp. (HINIC, 2008). Porém Mustaca et al., (2015) fez o
primeiro relato de B. ovis-específico utilizando a PCR em tempo real. O diagnóstico
especie-específico de B. ovis em carneiros é extrememente importante para
diferenciação de outras espécies de Brucella com alto potencial zoonótico (i.e. B.
melitensis) que podem também infectar carneiros. Desta forma, o diagnóstico
diferencial entre B. ovis e B. melitensis em ovinos tem uma importancia
significativa em saúde pública.
Das 30 amostras analisadas para a PCR em tempo real neste estudo, 3(10%)
foram positivas para B. ovis, sendo as mesmas positivas também para o IDGA, não
demonstrando diferenças significativas (p = 1,00) de positividade em relação ao
teste utilizado (Tabela 2).
Tabela 2. Frequência de ovinos reagentes (valores relativos e absolutos) na pesquisa
de anticorpos anti-Brucella ovis pelo teste de IDGA e PCR em tempo real, na
região do Alto Paranaíba, MG.
Resultados IDGA (%) qPCR (%)
Positivos 3 10 3 10
Negativos 27 90 27 90
Total 30 100 30 100
69
A propriedade onde ocorreram os resultados positivos para brucelose, possui
um histórico de casos de neosporose e toxoplasmose, tornando-se, portanto,
necessário o monitoramento e diferenciação desses agentes, para controle da
sanidade reprodutiva do rebanho.
Conclusões
1. Foi constatada a presença de ovinos positivos para Brucella ovis em uma das
propriedades avaliadas na região do Alto Paranaíba, MG.
2. São necessários estudos complementares para a elucidação da epidemiologia
da B. ovis e implantação de medidas de controle adequadas.
3. Deve-se conscientizar os criadores, através de programas de educação
sanitária na prevenção e erradicação da enfermidade de suas propriedades.
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73
Capítulo 5 – Considerações finais
Apesar da importância que a ovinocultura e caprinocultura vem assumindo nas
últimas décadas no Brasil, as questões sanitárias dessa criações são muitas vezes
negligenciadas.
Várias enfermidades ocorrentes em caprinos e ovinos, são citadas no PNSCO
Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e Ovinos e algumas são de notificação
oficial, porém apenas a brucelose causada pela Brucella ovis, causadora da epididimite
ovina é contemplada pelo programa.
Esperava-se maior prevalência de brucelose em caprinos e ovinos na região do
Alto Paranaíba, visto que não há um controle efetivo da sanidade nos rebanhos, porém
levantamentos epidemiológicos são extremamente importantes para a prevenção e
controle desta enfermidade, devido a questão zoonótica, onde a Brucella abortus e
Brucela melitensis podem ser transmitidas pelo leite, pelo contato direto ou indireto com
animais infectados e manipulação de carcaças e vísceras no abate sanitário.
Salienta-se que diferentemente dos bovinos, caprinos e ovinos não são vacinados
contra a brucelose em nosso país. Isso é preocupante visto que esses animais convivem de
forma frequente com bovinos que podem estar contaminados.
Apesar de não ser caracterizada como zoonose a brucelose ovina causada pela B.
ovis causa problemas reprodutivos sérios nos rebanhos, comprometendo a produção e
causando prejuízos econômicos.
Mesmo que a brucelose ovina e caprina causada por Brucella melitensis, não
tenha sido diagnosticada no Brasil, é importante que haja registros e documentações do
status sanitário desse animais em relação à brucelose, tanto pelo risco de contaminação em
humanos quanto pela comercialização de animais.
74
Anexo I – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais
75
Anexo II – Normas da Revista Ciência Rural para submissão do artigo: Detecção de
Brucella abortus e Brucella melitensis em leite caprino pela PCR em tempo real.
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Objetivo e política editorial
1. CIÊNCIA RURAL - Revista Científica do Centro de Ciências Rurais da
Universidade Federal de Santa Maria publica artigos científicos, revisões
bibliográficas e notas referentes à área de Ciências Agrárias que deverão ser
destinados com exclusividade.
Preparação de originais
2. Os artigos científicos, revisões e notas devem ser encaminhados
via eletrônica editados em idioma Português ou Inglês, todas as linhas deverão
ser numeradas e paginados no lado inferior direito. O trabalho deverá ser
digitado em tamanho A4 210 x 297mm, com no máximo, 25 linhas em espaço
duplo, com margens superior, inferior, esquerda e direita em 2,5cm, fonte
Times New Roman, tamanho 12. O máximo de páginas será 15 para artigos
científicos, 20 para revisão bibliográfica e 8 para nota, incluindo tabelas,
gráficos e ilustrações. Cada figura e ilustração deverá ser enviado em arquivos
separados e constituirá uma página. Tabelas, gráficos e figuras não poderão
estar com apresentação paisagem.
3. O artigo científico deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e
Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução com
Revisão de Literatura; Material e Métodos; Resultados e Discussão; Conclusão
e Referências; Agradecimento(s) e Apresentação; Fontes de Aquisição;
Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança devem aparecer antes das
referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais
obrigatoriamente devem apresentar parecer de aprovação de um comitê
de ética institucional já na submissão. (Modelo .doc, .pdf).
4. A revisão bibliográfica deverá conter os seguintes tópicos: Título
(Português e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words;
Introdução; Desenvolvimento; Conclusão; e Referências. Agradecimento(s) e
Apresentação; Fontes de Aquisição e Informe Verbal; Comitê de Ética e
Biossegurança devem aparecer antes das referências. Pesquisa envolvendo
seres humanos e animais obrigatoriamente devem apresentar parecer de
aprovação de um comitê de ética institucional já na
submissão. (Modelo .doc, pdf).
5. A nota deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e Inglês);
Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Texto (sem subdivisão, porém
com introdução; metodologia; resultados e discussão e conclusão; podendo
conter tabelas ou figuras); Referências. Agradecimento(s) e Apresentação;
Fontes de Aquisição e Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança
devem aparecer antes das referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e
76
animais obrigatoriamente devem apresentar parecer de aprovação de um
comitê de ética institucional já na submissão. (Modelo.doc, pdf).
6. Não serão fornecidas separatas. Os artigos estão disponíveis no formato pdf
no endereço eletrônico da revista (www.scielo.br/cr).
7. Descrever o título em português e inglês (caso o artigo seja em português) -
inglês português (caso o artigo seja em inglês). Somente a primeira letra do
título do artigo deve ser maiúscula exceto no caso de nomes próprios. Evitar
abreviaturas e nomes científicos no título. O nome científico só deve ser
empregado quando estritamente necessário. Esses devem aparecer nas
palavras-chave e resumo e demais seções quando necessários.
8. As citações dos autores, no texto, deverão ser feitas com letras maiúsculas
seguidas do ano de publicação, conforme exemplos: Esses resultados estão de
acordo com os reportados por MILLER & KIPLINGER (1966) e LEE et al.
(1996), como uma má formação congênita (MOULTON, 1978).
9. As Referências deverão ser efetuadas no estilo ABNT (NBR 6023/2000)
conforme normas próprias da revista.
9.1. Citação de livro:
JENNINGS, P.B. The practice of large animal surgery. Philadelphia:
Saunders, 1985. 2v.
TOKARNIA, C.H. et al. (Mais de dois autores) Plantas tóxicas da Amazônia
a bovinos e outros herbívoros. Manaus: INPA, 1979. 95p.
9.2. Capítulo de livro com autoria:
GORBAMAN, A. A comparative pathology of thyroid. In: HAZARD, J.B.;
SMITH, D.E. The thyroid. Baltimore: Williams & Wilkins, 1964. Cap.2, p.32-
48.
9.3. Capítulo de livro sem autoria:
COCHRAN, W.C. The estimation of sample size. In: ______. Sampling
techniques. 3.ed. New York: John Willey, 1977. Cap.4, p.72-90.
TURNER, A.S.; McILWRAITH, C.W. Fluidoterapia. In: ______. Técnicas
cirúrgicas em animais de grande porte. São Paulo: Roca, 1985. p.29-40.
9.4. Artigo completo:
Sempre que possível o autor deverá acrescentar a url para o artigo referenciado
e o número de identificação DOI (Digital Object Identifiers) conforme
exemplos abaixo:
MEWIS, I.; ULRICHS, CH. Action of amorphous diatomaceous earth against
different stages of the stored product pests Tribolium confusum (Coleoptera:
Tenebrionidae), Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae), Sitophilus
granarius (Coleoptera: Curculionidae) and Plodia interpunctella (Lepidoptera:
Pyralidae). Journal of Stored Product Research, Amsterdam (Cidade
opcional), v.37, p.153-164, 2001. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/S0022-474X(00)00016-3>. Acesso em: 20 nov.
2008. doi: 10.1016/S0022-474X(00)00016-3.
77
PINTO JUNIOR, A.R. et al (Mais de 2 autores). Resposta de Sitophilus
oryzae (L.), Cryptolestes ferrugineus (Stephens) e Oryzaephilus
surinamensis (L.) a diferentes concentrações de terra de diatomácea em trigo
armazenado a granel. Ciência Rural, Santa Maria (Cidade opcional), v. 38, n.
8, p.2103-2108, nov. 2008. Disponível
em:<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-
84782008000800002&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 25 nov. 2008. doi:
10.1590/S0103-84782008000800002.
9.5. Resumos:
RIZZARDI, M.A.; MILGIORANÇA, M.E. Avaliação de cultivares do ensaio
nacional de girassol, Passo Fundo, RS, 1991/92. In: JORNADA DE
PESQUISA DA UFSM, 1., 1992, Santa Maria, RS. Anais... Santa Maria: Pró-
reitoria de Pós-graduação e Pesquisa, 1992. V.1. 420p. p.236.
9.6. Tese, dissertação:
COSTA, J.M.B. Estudo comparativo de algumas caracterísitcas digestivas
entre bovinos (Charolês) e bubalinos (Jafarabad). 1986. 132f.
Monografia/Dissertação/Tese (Especialização/ Mestrado/Doutorado em
Zootecnia) - Curso de Pós-graduação em Zootecnia, Universidade Federal de
Santa Maria.
9.7. Boletim:
ROGIK, F.A. Indústria da lactose. São Paulo: Departamento de Produção
Animal, 1942. 20p. (Boletim Técnico, 20).
9.8. Informação verbal:
Identificada no próprio texto logo após a informação, através da expressão
entre parênteses. Exemplo: ... são achados descritos por Vieira (1991 - Informe
verbal). Ao final do texto, antes das Referências Bibliográficas, citar o
endereço completo do autor (incluir E-mail), e/ou local, evento, data e tipo de
apresentação na qual foi emitida a informação.
9.9. Documentos eletrônicos:
MATERA, J.M. Afecções cirúrgicas da coluna vertebral: análise sobre as
possibilidades do tratamento cirúrgico. São Paulo: Departamento de
Cirurgia, FMVZ-USP, 1997. 1 CD.
GRIFON, D.M. Artroscopic diagnosis of elbow displasia. In: WORLD
SMALL ANIMAL VETERINARY CONGRESS, 31., 2006, Prague, Czech
Republic. Proceedings…. Prague: WSAVA, 2006. p.630-636. Capturado em
12 fev. 2007. Online. Disponível
em: http://www.ivis.org/proceedings/wsava/2006/lecture22/Griffon1.pdf?LA=1
UFRGS. Transgênicos. Zero Hora Digital, Porto Alegre, 23 mar. 2000.
Especiais. Capturado em 23 mar. 2000. Online. Disponível na
Internet: http://www.zh.com.br/especial/ index.htm.
ONGPHIPHADHANAKUL, B. Prevention of postmenopausal bone loss by
low and conventional doses of calcitriol or conjugated equine
estrogen. Maturitas, (Ireland), v.34, n.2, p.179-184, Feb 15, 2000. Obtido via
78
base de dados MEDLINE. 1994-2000. 23 mar. 2000. Online. Disponível na
Internet http://www. Medscape.com/server-java/MedlineSearchForm.
MARCHIONATTI, A.; PIPPI, N.L. Análise comparativa entre duas técnicas de
recuperação de úlcera de córnea não infectada em nível de estroma médio. In:
SEMINARIO LATINOAMERICANO DE CIRURGIA VETERINÁRIA, 3.,
1997, Corrientes, Argentina. Anais... Corrientes: Facultad de Ciencias
Veterinarias - UNNE, 1997. Disquete. 1 disquete de 31/2. Para uso em PC
10. Desenhos, gráficos e fotografias serão denominadas figuras e terão o
número de ordem em algarismos arábicos. A revista não usa a denominação
quadro. As figuras devem ser disponibilizadas individualmente por página.
Os desenhos figuras e gráficos (com largura de no máximo 16cm) devem ser
feitos em editor gráfico sempre em qualidade máxima com pelo menos 300
dpi em extensão .tiff. As tabelas devem conter a palavra tabela, seguida do
número de ordem em algarismo arábico e não devem exceder uma lauda.
11. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos serão de inteira
responsabilidade do (s) autor (es).
12. Será obrigatório o cadastro de todos autores nos metadados de submissão.
O artigo não tramitará enquanto o referido item não for atendido.
Excepcionalmente, mediante consulta prévia para a Comissão Editorial outro
expediente poderão ser utilizados.
13. Lista de verificação (Checklist pdf ou doc)
14. A taxa de tramitação é de R$ 80,00 e a de publicação é de R$ 100,00 por
página impressa. A taxa de publicação somente deverá ser paga após a
revisão final das provas do manuscrito pelos autores. Professores do Centro
de Ciências Rurais e os Programas de Pós-graduação do Centro têm os seus
artigos previamente pagos pelo CCR, estando isentos da taxa de publicação.
Trabalhos submetidos por esses autores, no entanto, devem pagar a taxa de
tramitação. No caso de impressão colorida, todos os trabalhos publicados
deverão pagar um adicional de R$ 600,00 por página colorida impressa,
independentemente do número de figuras na respectiva página.
Os pagamentos poderão ser efetuados por:
a) Transferência/depósito no Banco do Brasil, Agência 1484-2, Conta Corrente
36.189-5 em nome da FATEC (CNPJ: 89.252.431/0001-59) - Projeto 96945. A
submissão do artigo obrigatoriamente deve estar acompanhada da taxa de
tramitação, podendo ser enviada via fax (55 3220 8695/3220 8698) ou ainda
enviado por email ([email protected]) para que se possa fazer a
verificação e prosseguir com a tramitação do artigo (Em ambos os casos o
nome e endereço completo são obrigatórios para a emissão da fatura).
b) Solicitação de fatura (.doc ou .pdf). Nessa modalidade o formulário
disponível deverá ser encaminhado devidamente preenchido via e-mail ou fax
(55 3220 8695/3220 8698) para que possamos encaminhar a solitação a
Fundação que administra os nossos recursos e esta encaminhará a fatura ao
79
endereço especificado no formulário.
c) O pagamento da taxa de tramitação também pode ser feito por meio online
através de cartão de crédito (VISA) através deste link
15. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
16. Os artigos não aprovados serão arquivados havendo, no entanto, o
encaminhamento de uma justificativa pelo indeferimento.
17. Em caso de dúvida, consultar artigos de fascículos já publicados antes de
dirigir-se à Comissão Editorial.
Critérios de avaliação
Todos os trabalhos submetidos são inicialmente examinados pela equipe CR,
comitê editorial e de área e então enviados a dois avaliadores ad hoc no
mínimo. As revisões são submetidas normalmente para três consultores ad hoc.
80
Anexo III – Normas da Revista Semina: Ciências Agrárias para submissão do artigo:
Investigação de Brucella ovis por PCR em tempo realem semen ovino commercial.
Normas editoriais para publicação na Semina: ciências agrárias
A revista Semina: Ciências Agrárias, com periodicidade trimestral, é uma publicação de
divulgação científica do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Estadual de
Londrina. Tem como objetivo publicar artigos, comunicações, relatos de casos e revisões
relacionados às Ciências Agronômicas, Ciência e Tecnologia de Alimentos, Medicina
Veterinária, Zootecnia e áreas afins.
Categorias dos Trabalhos
a) Artigos científicos: no máximo 25 páginas incluindo figuras, tabelas e referências
bibliográficas;
b) Comunicações científicas: no máximo 12 páginas, com referências bibliográficas
limitadas a 16 citações e no máximo duas tabelas ou duas figuras ou uma tabela e uma
figura;
b) Relatos de casos: No máximo 10 páginas, com referências bibliográficas limitadas a 12
citações e no máximo duas tabelas ou duas figuras ou uma tabela e uma figura;
c) Artigos de revisão: no máximo 35 páginas incluindo figuras, tabelas e referências
bibliográficas.
Apresentação dos Trabalhos
Os originais completos dos artigos, comunicações, relatos de casos e revisões podem ser
escritos em português, inglês ou espanhol e devem ser enviados em três cópias impressas
em papel A4, com espaçamento duplo, elaborado no editor de texto Word for Windows,
fonte Times New Roman, tamanho 12 normal, com margens esquerda e direita de 2,5 cm e
superior e inferior de 2 cm, respeitando-se o número de páginas, devidamente numeradas,
de acordo com a categoria do trabalho. Figuras (desenhos, gráficos e fotografias) e tabelas
serão numeradas em algarismos arábicos e devem estar separadas no final do trabalho. As
figuras e tabelas deverão ser apresentadas nas larguras de 8 ou 16 cm com altura máxima
de 22 cm, lembrando que se houver a necessidade de dimensões maiores, no processo de
editoração haverá redução para as referidas dimensões. As legendas das figuras deverão ser
colocadas em folha separada obedecendo à ordem numérica de citação no texto.
Fotografias devem ser identificadas no verso e desenhos e gráfico na parte frontal inferior
pelos seus respectivos números do texto e nome do primeiro autor. Quando necessário
deve ser indicado qual é a parte superior da figura para o seu correto posicionamento no
texto.
Preparação dos manuscritos
Artigo científico:
Deve relatar resultados de pesquisa original das áreas afins, com a seguinte organização
dos tópicos: Título; Título em inglês; Resumo com Palavras-chave (no máximo seis
palavras); Abstract com Key-words (no máximo seis palavras); Introdução; Material e
Métodos; Resultados e Discussão com as conclusões no final ou Resultados, Discussão e
Conclusões separadamente; Agradecimentos; Fornecedores, quando houver e Referências
Bibliográficas. Os tópicos devem ser escritos em letras maiúsculas e minúsculas e
destacados em negrito, sem numeração. Quando houver a necessidade de subitens dentro
dos tópicos, os mesmos devem receber números arábicos. O trabalho submetido não pode
ter sido publicado em outra revista com o mesmo conteúdo, exceto na forma de resumo de
congresso, nota prévia ou formato reduzido.
Na primeira página do manuscrito devem constar as seguintes informações:
81
1. Título do trabalho: O título, acompanhado de sua tradução para o inglês, deve ser breve
e suficientemente específico e descritivo, contendo palavras que permitam ao leitor ter
uma idéia do conteúdo do artigo.
2. Nomes dos autores: Deverão ser escritos por extenso, separados por ponto e vírgula,
logo abaixo do título do trabalho. A instituição, os órgãos de fomento e a identificação dos
autores deverão ser feitos por inserção numérica de notas de rodapé ao final do título e dos
nomes. O autor para correspondência com endereço completo, telefone, fax e E-mail
deverá ser destacado com um asterisco sobrescrito junto ao seu número de identificação.
A partir da segunda página do manuscrito a apresentação do trabalho deve obedecer à
seguinte ordem:
1. Título do trabalho, acompanhado de sua tradução para o inglês.
2. Resumo e Palavras-chave: Deve ser incluído um resumo informativo com um mínimo
de 150 e um máximo de 300 palavras, na mesma língua que o artigo foi escrito,
acompanhado de sua tradução para o inglês (Abstract e Key words).
3. Introdução: Deverá ser concisa e conter revisão estritamente necessária à introdução do
tema e suporte para a metodologia e discussão.
4. Material e Métodos: Poderá ser apresentado de forma descritiva contínua ou com
subitens, de forma a permitir ao leitor a compreensão e reprodução da metodologia citada
com auxílio ou não de citações bibliográficas.
5. Resultados e discussão com conclusões ou Resultados, Discussão e Conclusões: De
acordo com o formato escolhido, estas partes devem ser apresentadas de forma clara, com
auxílio de tabelas, gráficos e figuras, de modo a não deixar dúvidas ao leitor, quanto à
autenticidade dos resultados, pontos de vistas discutidos e conclusões sugeridas.
6. Agradecimentos: As pessoas, instituições e empresas que contribuíram na realização do
trabalho deverão ser mencionadas no final do texto, antes do item Referências
Bibliográficas.
Observações:
Quando for o caso, antes das referências, deve ser informado que o artigo foi aprovado
pela comissão de bioética e foi realizado de acordo com as normas técnicas de
biosegurança e ética.
Notas: Notas referentes ao corpo do artigo devem ser indicadas com um símbolo
sobrescrito, imediatamente depois da frase a que diz respeito, como notas de rodapé no
final da página.
Figuras: Quando indispensáveis figuras poderão ser aceitas e deverão ser assinaladas no
texto pelo seu número de ordem em algarismos arábicos. Se as ilustrações enviadas já
foram publicadas, mencionar a fonte e a permissão para reprodução.
Tabelas: As tabelas deverão ser acompanhadas de cabeçalho que permita compreender o
significado dos dados reunidos, sem necessidade de referência ao texto.
Grandezas, unidades e símbolos: Deverá obedecer às normas nacionais correspondentes
(ABNT).
7. Citações dos autores no texto: Deverá seguir o sistema de chamada alfabética escrita
com letras maiúsculas seguidas do ano de publicação de acordo com os seguintes
exemplos:
Os resultados de DUBEY (2001) confirmam que o.....
De acordo com SANTOS et al. (1999), o efeito do nitrogênio….
Beloti et al. (1999b) avaliaram a qualidade microbiológica….
......e inibir o teste de formação de sincício (BRUCK et al., 1992).
......comprometendo a qualidade de seus derivados (AFONSO; VIANNI, 1995).
8. Referências Bibliográficas: As referências bibliográficas, redigidas segundo a norma
NBR 6023, ago. 2000, da ABNT, deverão ser listadas na ordem alfabética no final do
artigo. Todos os autores participantes dos trabalhos deverão ser relacionados,
82
independentemente do número de participantes (única exceção à norma – item 8.1.1.2). A
exatidão e adequação das referências a trabalhos que tenham sido consultados e
mencionados no texto do artigo, bem como opiniões, conceitos e afirmações são da inteira
responsabilidade dos autores.
As outras categorias de trabalhos (Comunicação científica, Relato de caso e Revisão)
deverão seguir as mesmas normas acima citadas, porem, com as seguintes orientações
adicionais para cada caso:
Comunicação científica
Uma forma concisa, mas com descrição completa de uma pesquisa pontual ou em
andamento (nota prévia), com documentação bibliográfica e metodologia completas, como
um artigo científico regular. Deverá conter os seguintes tópicos: Título (português e
inglês); Resumo com Palavras-chave; Abstract com Key-words; Corpo do trabalho sem
divisão de tópicos, porém seguindo a seqüência – introdução, metodologia, resultados
(podem ser incluídas tabelas e figuras), discussão, conclusão e referências bibliográficas.
Relato de caso
Descrição sucinta de casos clínicos e patológicos, achados inéditos, descrição de novas
espécies e estudos de ocorrência ou incidência de pragas, microrganismos ou parasitas de
interesse agronômico, zootécnico ou veterinário. Deverá conter os seguintes tópicos:
Título (português e inglês); Resumo com Palavras-chave; Abstract com Key-words;
Introdução com revisão da literatura; Relato do (s) caso (s), incluindo resultados,
discussão e conclusão; Referências Bibliográficas.
Artigo de revisão bibliográfica
Deve envolver temas relevantes dentro do escopo da revista. O número de artigos de
revisão por fascículo é limitado e os colaboradores poderão ser convidados a apresentar
artigos de interesse da revista. No caso de envio espontâneo do autor (es), é necessária a
inclusão de resultados próprios ou do grupo envolvido no artigo, com referências
bibliográficas, demonstrando experiência e conhecimento sobre o tema.
O artigo de revisão deverá conter os seguintes tópicos: Título (português e inglês); Resumo
com Palavras-chave; Abstract com Key-words; Desenvolvimento do tema proposto (com
subdivisões em tópicos ou não); Conclusão; Agradecimentos (se for o caso) e Referências
Bibliográficas.
Outras informações importantes
1. O autor principal deverá enviar, junto com o original, autorização para publicação do
trabalho na Semina Ciências Agrárias, comprometendo-se a não publicá-lo em outro
periódico.
2. A publicação dos trabalhos depende de pareceres favoráveis da assessoria científica “Ad
hoc” e da aprovação do Comitê Editorial da Semina Ciências Agrárias, UEL.
3. Não serão fornecidas separatas aos autores, uma vez que os fascículos estarão
disponíveis no endereço eletrônico da revista (http://www.uel.br/proppg/semina).
4. Os trabalhos não aprovados para publicação serão devolvidos ao autor.
5. Transferência de direitos autorais: Os autores concordam com a transferência dos
direitos de publicação do referido artigo para a revista. A reprodução de artigos somente é
permitida com a citação da fonte e é proibido o uso comercial das informações.
6. As questões e problemas não previstos na presente norma serão dirimidos pelo Comitê
Editorial da área para a qual foi submetido o artigo para publicação.
Universidade Estadual de Londrina
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva
Comitê Editorial da Semina: Ciências Agrárias
Campus Universitário - Caixa Postal 6001 86051-990, Londrina, Paraná, Brasil.
83
Anexo V – Normas da Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira para submissãodo artigo:
Diagnóstico da Brucelaovis em rebanhos ovinos pela PCR em tempo real
Diretrizes para Autores
Escopo e política editorial
A revista Pesquisa Agropecuária Brasileira (PAB) é uma publicação mensal da Embrapa,
que edita e publica trabalhos técnico-científicos originais, em inglês, resultantes de
pesquisas de interesse agropecuário. A principal orma de contribuição é o Artigo, mas a
PAB também publica Notas Científicas e Revisões a convite do Editor.
As submissões de artigos científicos, notas científicas e revisões (a convite do editor)
devem ser encaminhadas via eletrônica e, preferencialmente, em inglês. No entanto,
aqueles encaminhados em português ou espanhol terão que ser obrigatoriamente
traduzidos para o inglês antes de serem publicados. As despesas de tradução serão de
responsabilidade dos autores.
Análise dos artigos
A Comissão Editorial faz a análise dos trabalhos antes de submetê-los à assessoria
científica. Nessa análise, consideram-se aspectos como escopo, apresentação do artigo
segundo as normas da revista, formulação do objetivo de forma clara, clareza da redação,
fundamentação teórica, atualização da revisão da literatura, coerência e precisão da
metodologia, resultados com contribuição significativa, discussão dos fatos observados em
relação aos descritos na literatura, qualidade das tabelas e figuras, originalidade e
consistência das conclusões. Após a aplicação desses critérios, se o número de trabalhos
aprovados ultrapassa a capacidade mensal de publicação, é aplicado o critério da relevância
relativa, pelo qual são aprovados os trabalhos cuja contribuição para o avanço do
conhecimento científico é considerada mais significativa. Esse critério é aplicado somente
aos trabalhos que atendem aos requisitos de qualidade para publicação na revista, mas que,
em razão do elevado número, não podem ser todos aprovados para publicação. Os
trabalhos rejeitados são devolvidos aos autores e os demais são submetidos à análise de
assessores científicos, especialistas da área técnica do artigo.
Forma e preparação de manuscritos
Os trabalhos enviados à PAB devem ser inéditos (não terem dados – tabelas e figuras –
publicadas parcial ou integralmente em nenhum outro veículo de divulgação técnico-
científica, como boletins institucionais, anais de eventos, comunicados técnicos, notas
científicas etc.) e não podem ter sido encaminhados simultaneamente a outro periódico
científico ou técnico. Dados publicados na forma de resumos, com mais de 250 palavras,
não devem ser incluídos no trabalho.
- São considerados, para publicação, os seguintes tipos de trabalho: Artigos Científicos,
Notas Científicas e Artigos de Revisão, este último a convite do Editor.
- Os trabalhos publicados na PAB são agrupados em áreas técnicas, cujas principais são:
Entomologia, Fisiologia Vegetal, Fitopatologia, Fitotecnia, Fruticultura, Genética,
Microbiologia, Nutrição Mineral, Solos e Zootecnia.
- O texto deve ser digitado no editor de texto Microsoft Word, em espaço duplo, fonte
Times New Roman, corpo 12, folha formato A4, com margens de 2,5 cm e com páginas e
84
linhas numeradas.
Informações necessárias na submissão on-line de trabalhos
No passo 1 da submissão (Início), em “comentários ao editor”, informar a relevância e o
aspecto inédito do trabalho.
No passo 2 da submissão (Transferência do manuscrito), carregar o trabalho completo em
arquivo Microsoft Word.
No passo 3 da submissão (Inclusão de metadados), em “resumo da biografia” de cada
autor, informar o link do sistema de currículos lattes (ex.:
http://lattes.cnpq.br/0577680271652459). Clicar em “incluir autor” para inserir todos os
coautores do trabalho, na ordem de autoria.
Ainda no passo 3, copiar e colar o título, resumo e termos para indexação (key words) do
trabalho nos respectivos campos do sistema.
No passo 4 da submissão (Transferência de documentos suplementares), carregar, no
sistema on-line da revista PAB, um arquivo Word com todas as cartas (mensagens) de
concordância dos coautores coladas conforme as explicações abaixo:
- Colar um e-mail no arquivo word de cada coautor de concordância com o seguinte
conteúdo:
“Eu, ..., concordo com o conteúdo do trabalho intitulado “.....” e com a submissão para a
publicação na revista PAB.
Como fazer:
Peça ao coautor que lhe envie um e-mail de concordância, encaminhe-o para o seu próprio
e-mail (assim gerará os dados da mensagem original: assunto, data, de e para), marque
todo o email e copie e depois cole no arquivo word. Assim, teremos todas as cartas de
concordâncias dos co-autores num mesmo arquivo.
Organização do Artigo Científico
A ordenação do artigo deve ser feita da seguinte forma:
- Artigos em português - Título, autoria, endereços institucionais e eletrônicos, Resumo,
Termos para indexação, título em inglês, Abstract, Index terms, Introdução, Material e
Métodos, Resultados e Discussão, Conclusões, Agradecimentos, Referências, tabelas e
figuras.
- Artigos em inglês - Título, autoria, endereços institucionais e eletrônicos, Abstract, Index
terms, título em português, Resumo, Termos para indexação, Introduction, Materials and
Methods, Results and Discussion, Conclusions, Acknowledgements, References, tables,
figures.
- Artigos em espanhol - Título, autoria, endereços institucionais e eletrônicos, Resumen,
Términos para indexación; título em inglês, Abstract, Index terms, Introducción,
Materiales y Métodos, Resultados y Discusión, Conclusiones, Agradecimientos,
Referencias, cuadros e figuras.
85
- O título, o resumo e os termos para indexação devem ser vertidos fielmente para o
inglês, no caso de artigos redigidos em português e espanhol, e para o português, no caso
de artigos redigidos em inglês.
- O artigo científico deve ter, no máximo, 20 páginas, incluindo-se as ilustrações (tabelas e
figuras), que devem ser limitadas a seis, sempre que possível.
Título
- Deve representar o conteúdo e o objetivo do trabalho e ter no máximo 15 palavras,
incluindo-se os artigos, as preposições e as conjunções.
- Deve ser grafado em letras minúsculas, exceto a letra inicial, e em negrito.
- Deve ser iniciado com palavras chaves e não com palavras como “efeito” ou
“influência”.
- Não deve conter nome científico, exceto de espécies pouco conhecidas; neste caso,
apresentar somente o nome binário.
- Não deve conter subtítulo, abreviações, fórmulas e símbolos.
- As palavras do título devem facilitar a recuperação do artigo por índices desenvolvidos
por bases de dados que catalogam a literatura.
Nomes dos autores
- Grafar os nomes dos autores com letra inicial maiúscula, por extenso, separados por
vírgula; os dois últimos são separados pela conjunção “e”, “y” ou “and”, no caso de artigo
em português, espanhol ou em inglês, respectivamente.
- O último sobrenome de cada autor deve ser seguido de um número em algarismo
arábico, em forma de expoente, entre parênteses, correspondente à chamada de endereço
do autor.
Endereço dos autores
- São apresentados abaixo dos nomes dos autores, o nome e o endereço postal completos
da instituição e o endereço eletrônico dos autores, indicados pelo número em algarismo
arábico, entre parênteses, em forma de expoente.
- Devem ser agrupados pelo endereço da instituição.
- Os endereços eletrônicos de autores da mesma instituição devem ser separados por
vírgula.
Resumo
- O termo Resumo deve ser grafado em letras minúsculas, exceto a letra inicial, na
margem esquerda, e separado do texto por travessão.
- Deve conter, no máximo, 200 palavras, incluindo números, preposições, conjunções e
artigos.
86
- Deve ser elaborado em frases curtas e conter o objetivo, o material e os métodos, os
resultados e a conclusão.
- Não deve conter citações bibliográficas nem abreviaturas.
- O final do texto deve conter a principal conclusão, com o verbo no presente do
indicativo.
Termos para indexação
- A expressão Termos para indexação, seguida de dois-pontos, deve ser grafada em letras
minúsculas, exceto a letra inicial.
- Os termos devem ser separados por vírgula e iniciados com letra minúscula.
- Devem ser no mínimo três e no máximo seis, considerando-se que um termo pode
possuir duas ou mais palavras.
- Não devem conter palavras que componham o título.
- Devem conter o nome científico (só o nome binário) da espécie estudada.
- Devem, preferencialmente, ser termos contidos no AGROVOC: Multilingual
Agricultural Thesaurus ou no Índice de Assuntos da base SciELO .
Introdução
- A palavra Introdução deve ser centralizada e grafada com letras minúsculas, exceto a
letra inicial, e em negrito.
- Deve apresentar a justificativa para a realização do trabalho, situar a importância do
problema científico a ser solucionado e estabelecer sua relação com outros trabalhos
publicados sobre o assunto.
- O último parágrafo deve expressar o objetivo de forma coerente com o descrito no início
do Resumo.
Material e Métodos
- A expressão Material e Métodos deve ser centralizada e grafada em negrito; os termos
Material e Métodos devem ser grafados com letras minúsculas, exceto as letras iniciais.
- Deve ser organizado, de preferência, em ordem cronológica.
- Deve apresentar a descrição do local, a data e o delineamento do experimento, e indicar
os tratamentos, o número de repetições e o tamanho da unidade experimental.
- Deve conter a descrição detalhada dos tratamentos e variáveis.
- Deve-se evitar o uso de abreviações ou as siglas.
- Os materiais e os métodos devem ser descritos de modo que outro pesquisador possa
repetir o experimento.
87
- Devem ser evitados detalhes supérfluos e extensas descrições de técnicas de uso
corrente.
- Deve conter informação sobre os métodos estatísticos e as transformações de dados.
- Deve-se evitar o uso de subtítulos; quando indispensáveis, grafá-los em negrito, com
letras minúsculas, exceto a letra inicial, na margem esquerda da página.
Resultados e Discussão
- A expressão Resultados e Discussão deve ser centralizada e grafada em negrito, com
letras minúsculas, exceto a letra inicial.
- Todos os dados apresentados em tabelas ou figuras devem ser discutidos.
- As tabelas e figuras são citadas seqüencialmente.
- Os dados das tabelas e figuras não devem ser repetidos no texto, mas discutidos em
relação aos apresentados por outros autores.
- Evitar o uso de nomes de variáveis e tratamentos abreviados.
- Dados não apresentados não podem ser discutidos.
- Não deve conter afirmações que não possam ser sustentadas pelos dados obtidos no
próprio trabalho ou por outros trabalhos citados.
- As chamadas às tabelas ou às figuras devem ser feitas no final da primeira oração do
texto em questão; se as demais sentenças do parágrafo referirem-se à mesma tabela ou
figura, não é necessária nova chamada.
- Não apresentar os mesmos dados em tabelas e em figuras.
- As novas descobertas devem ser confrontadas com o conhecimento anteriormente
obtido.
Conclusões
- O termo Conclusões deve ser centralizado e grafado em negrito, com letras minúsculas,
exceto a letra inicial.
- Devem ser apresentadas em frases curtas, sem comentários adicionais, com o verbo no
presente do indicativo.
- Devem ser elaboradas com base no objetivo do trabalho.
- Não podem consistir no resumo dos resultados.
- Devem apresentar as novas descobertas da pesquisa.
- Devem ser numeradas e no máximo cinco.
Agradecimentos
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- A palavra Agradecimentos deve ser centralizada e grafada em negrito, com letras
minúsculas, exceto a letra inicial.
- Devem ser breves e diretos, iniciando-se com “Ao, Aos, À ou Às” (pessoas ou
instituições).
- Devem conter o motivo do agradecimento.
Referências
- A palavra Referências deve ser centralizada e grafada em negrito, com letras minúsculas,
exceto a letra inicial.
- Devem ser de fontes atuais e de periódicos: pelo menos 70% das referências devem ser
dos últimos 10 anos e 70% de artigos de periódicos.
- Devem ser normalizadas de acordo com a NBR 6023 da ABNT, com as adaptações
descritas a seguir.
- Devem ser apresentadas em ordem alfabética dos nomes dos autores, separados por
ponto-e-vírgula, sem numeração.
- Devem apresentar os nomes de todos os autores da obra.
- Devem conter os títulos das obras ou dos periódicos grafados em negrito.
- Devem conter somente a obra consultada, no caso de citação de citação.
- Todas as referências devem registrar uma data de publicação, mesmo que aproximada.
- Devem ser trinta, no máximo.
Exemplos:
- Artigos de Anais de Eventos (aceitos apenas trabalhos completos)
AHRENS, S. A fauna silvestre e o manejo sustentável de ecossistemas florestais. In:
SIMPÓSIO LATINO-AMERICANO SOBRE MANEJO FLORESTAL, 3., 2004, Santa
Maria. Anais.Santa Maria: UFSM, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal,
2004. p.153-162.
- Artigos de periódicos
SANTOS, M.A. dos; NICOLÁS, M.F.; HUNGRIA, M. Identificação de QTL associados à
simbiose entre Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii e soja. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v.41, p.67-75, 2006.
- Capítulos de livros
AZEVEDO, D.M.P. de; NÓBREGA, L.B. da; LIMA, E.F.; BATISTA, F.A.S.;
BELTRÃO, N.E. de M. Manejo cultural. In: AZEVEDO, D.M.P.; LIMA, E.F. (Ed.). O
agronegócio da mamona no Brasil. Campina Grande: Embrapa Algodão; Brasília:
Embrapa Informação Tecnológica, 2001. p.121-160.
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Fórmulas, expressões e equações matemáticas
- Devem ser iniciadas à margem esquerda da página e apresentar tamanho padronizado da
fonte Times New Roman.
- Não devem apresentar letras em itálico ou negrito, à exceção de símbolos escritos
convencionalmente em itálico.
Tabelas
- As tabelas devem ser numeradas seqüencialmente, com algarismo arábico, e
apresentadas em folhas separadas, no final do texto, após as referências.
- Devem ser auto-explicativas.
- Seus elementos essenciais são: título, cabeçalho, corpo (colunas e linhas) e coluna
indicadora dos tratamentos ou das variáveis.
- Os elementos complementares são: notas-de-rodapé e fontes bibliográficas.
- O título, com ponto no final, deve ser precedido da palavra Tabela, em negrito; deve ser
claro, conciso e completo; deve incluir o nome (vulgar ou científico) da espécie e das
variáveis dependentes.
- No cabeçalho, os nomes das variáveis que representam o conteúdo de cada coluna
devem ser grafados por extenso; se isso não for possível, explicar o significado das
abreviaturas no título ou nas notas-de-rodapé.
- Todas as unidades de medida devem ser apresentadas segundo o Sistema Internacional
de Unidades.
- Nas colunas de dados, os valores numéricos devem ser alinhados pelo último algarismo.
- Nenhuma célula (cruzamento de linha com coluna) deve ficar vazia no corpo da tabela;
dados não apresentados devem ser representados por hífen, com uma nota-de-rodapé
explicativa.
- Na comparação de médias de tratamentos são utilizadas, no corpo da tabela, na coluna
ou na linha, à direita do dado, letras minúsculas ou maiúsculas, com a indicação em nota-
de-rodapé do teste utilizado e a probabilidade.
- Devem ser usados fios horizontais para separar o cabeçalho do título, e do corpo; usá-los
ainda na base da tabela, para separar o conteúdo dos elementos complementares. Fios
horizontais adicionais podem ser usados dentro do cabeçalho e do corpo; não usar fios
verticais.
- As tabelas devem ser editadas em arquivo Word, usando os recursos do menu Tabela;
não fazer espaçamento utilizando a barra de espaço do teclado, mas o recurso recuo do
menu Formatar Parágrafo.
- Notas de rodapé das tabelas
- Notas de fonte: indicam a origem dos dados que constam da tabela; as fontes devem
constar nas referências.
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- Notas de chamada: são informações de caráter específico sobre partes da tabela, para
conceituar dados. São indicadas em algarismo arábico, na forma de expoente, entre
parênteses, à direita da palavra ou do número, no título, no cabeçalho, no corpo ou na
coluna indicadora. São apresentadas de forma contínua, sem mudança de linha, separadas
por ponto.
- Para indicação de significância estatística, são utilizadas, no corpo da tabela, na forma de
expoente, à direita do dado, as chamadas ns (não-significativo); * e ** (significativo a 5 e
1% de probabilidade, respectivamente).
Figuras
- São consideradas figuras: gráficos, desenhos, mapas e fotografias usados para ilustrar o
texto.
- Só devem acompanhar o texto quando forem absolutamente necessárias à documentação
dos fatos descritos.
- O título da figura, sem negrito, deve ser precedido da palavra Figura, do número em
algarismo arábico, e do ponto, em negrito.
- Devem ser auto-explicativas.
- A legenda (chave das convenções adotadas) deve ser incluída no corpo da figura, no
título, ou entre a figura e o título.
- Nos gráficos, as designações das variáveis dos eixos X e Y devem ter iniciais
maiúsculas, e devem ser seguidas das unidades entre parênteses.
- Figuras não-originais devem conter, após o título, a fonte de onde foram extraídas; as
fontes devem ser referenciadas.
- O crédito para o autor de fotografias é obrigatório, como também é obrigatório o crédito
para o autor de desenhos e gráficos que tenham exigido ação criativa em sua elaboração. -
As unidades, a fonte (Times New Roman) e o corpo das letras em todas as figuras devem
ser padronizados.
- Os pontos das curvas devem ser representados por marcadores contrastantes, como:
círculo, quadrado, triângulo ou losango (cheios ou vazios).
- Os números que representam as grandezas e respectivas marcas devem ficar fora do
quadrante.
- As curvas devem ser identificadas na própria figura, evitando o excesso de informações
que comprometa o entendimento do gráfico.
- Devem ser elaboradas de forma a apresentar qualidade necessária à boa reprodução
gráfica e medir 8,5 ou 17,5 cm de largura.
- Devem ser gravadas nos programas Word, Excel ou Corel Draw, para possibilitar a
edição em possíveis correções.
- Usar fios com, no mínimo, 3/4 ponto de espessura.
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- No caso de gráfico de barras e colunas, usar escala de cinza (exemplo: 0, 25, 50, 75 e
100%, para cinco variáveis).
- Não usar negrito nas figuras.
- As figuras na forma de fotografias devem ter resolução de, no mínimo, 300 dpi e ser
gravadas em arquivos extensão TIF, separados do arquivo do texto.
- Evitar usar cores nas figuras; as fotografias, porém, podem ser coloridas.
Notas Científicas
- Notas científicas são breves comunicações, cuja publicação imediata é justificada, por se
tratar de fato inédito de importância, mas com volume insuficiente para constituir um
artigo científico completo.
Apresentação de Notas Científicas
- A ordenação da Nota Científica deve ser feita da seguinte forma: título, autoria (com as
chamadas para endereço dos autores), Resumo, Termos para indexação, título em inglês,
Abstract, Index terms, texto propriamente dito (incluindo introdução, material e métodos,
resultados e discussão, e conclusão, sem divisão), Referências, tabelas e figuras.
- As normas de apresentação da Nota Científica são as mesmas do Artigo Científico,
exceto nos seguintes casos:
- Resumo com 100 palavras, no máximo.
- Deve ter apenas oito páginas, incluindo-se tabelas e figuras.
- Deve apresentar, no máximo, 15 referências e duas ilustrações (tabelas e figuras).
Outras informações
- Não há cobrança de taxa de publicação.
- Os manuscritos aprovados para publicação são revisados por no mínimo dois
especialistas.
- O editor e a assessoria científica reservam-se o direito de solicitar modificações nos
artigos e de decidir sobre a sua publicação.
- São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos
trabalhos.
- Os trabalhos aceitos não podem ser reproduzidos, mesmo parcialmente, sem o
consentimento expresso do editor da PAB.
Contatos com a secretaria da revista podem ser feitos por telefone: (61)3448-4231, via e-
mail: [email protected] ou pelos correios:
Embrapa Informação Tecnológica Pesquisa Agropecuária Brasileira – PAB
Caixa Postal 040315 CEP 70770 901 Brasília, DF
92
Condições para submissão
Como parte do processo de submissão, os autores são obrigados a verificar a
conformidade da submissão em relação a todos os itens listados a seguir. As submissões
que não estiverem de acordo com as normas serão devolvidas aos autores.
1. O manuscrito deve ser inédito e não pode ter sido submetido, simultaneamente, a
outro periódico, e seus dados (tabelas e figuras) não podem ter sido publicados
parcial ou totalmente em outros meio de publicação técnicos ou científicos
(boletins institucionais, anais de eventos, comunicados técnicos, notas científicas,
etc.).
2. O texto deve ser submetido no formato do Microsoft Word, em espaço duplo,
escrito na fonte Times New Roman 12, tamanho de papel A4, com páginas e linhas
numeradas; e o arquivo não deve ultrapassar o tamanho de 20 MB.
3. O artigo deve ter, no máximo, 20 páginas e tem que estar organizado na seguinte
ordem: Título; nome completo dos autores, seguido de endereço institucional e
eletrônico; Resumo; Termos para indexação; Title, Abstract; Index terms;
Introdução; Material e Métodos; Resultados e Discussão; Conclusões;
Agradecimentos; Referências; tabelas e figuras.
4. Os padrões de texto e de referências bibliográficas devem ser apresentados de
acordo com as orientações, para a apresentação de manuscritos, estabelecidas nas
Diretrizes aos autores, as quais se encontram na página web da revista PAB.
5. Mensagens de concordância dos coautores com o conteúdo do manuscrito e sua
submissão à revista devem ser compiladas pelo autor correspondente em um
arquivo do Microsoft Word e carregadas no sistema como um documento
suplementar, no quarto passo do processo de submissão.
6. Diante do grande número de trabalhos recebidos para publicação (média de 110
por mês), solicitamos sua concordância com os seguintes procedimentos adotados
pela revista PAB:
Os trabalhos são analisados pela Comissão Editorial, antes de serem submetidos à
assessoria científica. Nessa análise, consideram-se os seguintes aspectos, entre
outros: escopo, apresentação do artigo segundo as normas da revista; formulação
do objetivo de forma clara; clareza da redação; fundamentação teórica; atualização
da revisão da literatura; coerência e precisão da metodologia; discussão dos fatos
observados em relação aos descritos na literatura; resultados com contribuição
significativa; qualidade das tabelas e figuras; e, finalmente, originalidade e
consistência das conclusões.
Após a aplicação desses critérios, caso o número de trabalhos aprovados ultrapasse
a capacidade de publicação mensal, é aplicado o critério da relevância relativa.
Segundo esse critério, os trabalhos com contribuição mais significativa para o
avanço do conhecimento científico são aprovados. Esse critério é aplicado apenas
aos trabalhos que atendam aos requisitos de qualidade, mas que, por excederem a
capacidade de publicação mensal da revista, não podem ser todos aprovados. Por
esse mesmo motivo, informamos que não aceitamos pedido de reconsideração.
