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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
FERNANDA NASCIMENTO RODRIGUES
ESTABELECIMENTO DE CULTIVO IN VITRO E ESTUDO PROTEÔMICO DE
CALOS CAULINARES E FOLIARES DE Artocarpus incisa L.
FORTALEZA – CE
2016
FERNANDA NASCIMENTO RODRIGUES
ESTABELECIMENTO DE CULTIVO IN VITRO E ESTUDO PROTEÔMICO DE
CALOS CAULINARES E FOLIARES DE Artocarpus incisa L.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira.
Coorientadora: Profa. Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho.
FORTALEZA
2016
FERNANDA NASCIMENTO RODRIGUES
ESTABELECIMENTO DE CULTIVO IN VITRO E ESTUDO PROTEÔMICO DE
CALOS CAULINARES E FOLIARES DE Artocarpus incisa L.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira.
Coorientadora: Profa. Dra. Cristina Paiva da Silveira Carvalho.
Aprovada em: 23/03/2016.
A Deus.
À minha família e aos meus amigos.
AGRADECIMENTOS
Acima de tudo, agradeço a Deus, por todas as bênçãos concedidas em
minha vida e por me permitir chegar até aqui.
Aos meus pais, Manoel e Rosenir, e à minha irmã Renata, por serem
minha base, meus maiores incentivadores, e os principais responsáveis por tudo o
que sou e que tenho hoje.
Ao meu namorado, Rodrigo, por estar ao meu lado ao longo desses
anos, por todo o apoio e compreensão nos momentos bons e ruins.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Renato Moreira, pelo acolhimento nessa
nova fase, por todos os ensinamentos e conselhos durante esse percurso, tanto na
área científica quanto na vida. Tenho grande admiração, e espero um dia poder
transmitir tudo o que me ensinaste com o mesmo amor e empolgação que
demonstra para os seus alunos.
À minha coorientadora, Profa. Dra. Cristina Paiva, pela dedicação
incondicional aos seus alunos, por ter abraçado junto comigo o desafio do
desenvolvimento desse projeto, pela amizade e apoio demonstrados dentro e fora
do laboratório, sou eternamente grata.
À Profa. Dra. Maria Izabel Gallão, pela ajuda na realização e no
entendimento dos experimentos histológicos, e por gentilmente ter aceitado
participar da banca.
Ao Dr. Eridan Orlando Pereira, pelo aceite em também compor a banca,
sou muito grata.
Aos amigos do Grupo de Pesquisa de Produtos Naturais Aplicados à
Saúde, muito obrigada por toda a ajuda, ensinamentos e paciência na execução dos
experimentos. Àqueles que sempre estiveram dispostos a me ajudar em todas as
etapas do processo, Antonio Neto, Cícero, Fernanda, Felipe, Hyldecia, Kueirislene,
Marina, Melissa, Nydy, Rogênio, Ronielly, Rosueti, Profa Cristina, vocês tornaram
esse caminho mais divertido, e nossa amizade seguirá para além das fronteiras do
laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Biotecnologia Vegetal, por toda a
colaboração e apoio nessa caminhada. Gostaria de agradecer, em especial, à Isabel
e à Rachel, por todo o ensinamento quando ingressei no laboratório, por dividirem
comigo as angústias, e pela amizade que sempre nos leva a encarar as situações
difíceis com descontração.
Aos membros do Laboratório de Biologia Celular Vegetal, em especial à
Aryelli, Eudson, Gleicy e João Mateus, por não hesitarem em me ajudar nos
experimentos histológicos, muito obrigada por tudo.
A todos os meus amigos, vocês contribuíram imensamente com esse
trabalho, mesmo nos momentos que não estavam relacionados a ele, pois vocês me
dão forças e me motivam a continuar seguindo os meus sonhos sempre. Agradeço
especialmente ao meu amigo Dalton, por me ajudar no cuidado do material vegetal,
e pela amizade demonstrada desde a graduação.
Às instituições, UFC e Unifor, pela estrutura para a realização desse
trabalho.
Às agências de fomento, CAPES, CNPq, FUNCAP e FINEP, pelo apoio
financeiro.
A todos aqueles que contribuíram, de alguma forma, para a realização
desse trabalho, muito obrigada!
“A persistência é o menor caminho do
êxito”. (Charles Chaplin)
RESUMO
A espécie Artocarpus incisa, pertencente à família Moraceae, é uma planta de porte
arbóreo com várias aplicações na medicina popular. Por ser uma espécie lenhosa,
várias dificuldades são relatadas para sua propagação, como a demora no seu
desenvolvimento e a baixa taxa de germinação. A cultura in vitro de tecidos vegetais,
em particular a cultura de calos, pode servir como uma ferramenta para contornar
essas dificuldades e facilitar a obtenção dos compostos de interesse. O presente
trabalho teve como intuito estabelecer as melhores condições de calogênese, bem
como realizar a análise histológica e o estudo proteômico de calos de A. incisa. Para
a indução dos calos, utilizou-se explantes advindos de folha e de caule, os quais
foram adicionados à formulação nutritiva Woody Plant Medium (WPM), e aplicados
em tratamentos contendo PVP, carvão ativado, e diferentes reguladores de
crescimento (2,4-D, BAP, ANA e CIN). Os resultados mostraram que o cultivo de
explantes foliares e caulinares em meio com carvão ativado 0,1%, suplementado
com 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP foi o melhor tratamento de indução de calos,
com um percentual de produção de 88%. A quantificação de proteínas através do
Protein UV do NanoVue detectou 15,97 µg de proteína/µL de extrato de caule; 20,07
µg de proteína/µL de extrato de folha; 0,75 µg de proteína/µL de extrato de calos
caulinares; e 16,85 µg de proteína/µL de extrato de calos foliares. Os tecidos
originais apresentaram maior concentração de proteínas do que os calos
produzidos, o que pode ser explicado pela diferenciação do tecido. A análise
histológica indicou que as células de calos se mostraram homogêneas e viáveis,
com parede celular fina, e com grande quantidade de polissacarídeos em grânulos.
O estudo proteômico, através de espectrometria de massas, levou à identificação de
peptídeos que apresentam relação com proteínas vegetais já relatadas. Detectou-se
proteínas relacionadas com a defesa (KM+, quitinase, catalase), metabolismo
(frutose-bifosfato aldolase, glutamato-carboxipeptidase) e sinalização celular
(calmodulina) nos calos, independente da origem destes. O trabalho foi pioneiro no
estudo proteômico de calos de A. incisa, e é um passo inicial na compreensão da
bioquímica e fisiologia da espécie em estudo.
Palavras-chave: Artocarpus incisa. Cultura de tecidos. Proteômica.
ABSTRACT
The species Artocarpus incisa, belonging to the Moraceae family, is a tree-sized
plant with multiple applications in folk medicine. As a woody species, several
difficulties are reported to its spread, such as the delay in its development and low
germination rate. In vitro culture of plant tissue, in particular callus culture, can serve
as a tool to overcome these difficulties and to facilitate obtaining the compounds of
interest. This work was meant to provide the best conditions of callus formation as
well as perform histological analysis and proteomic study of A. incisa calluses. For
induction of callus, explants were used arising from leaf and shoot, which have been
added to the nutritional formulation Woody Plant Medium (WPM), and applied in
treatments containing PVP, activated charcoal, and different growth regulators (2,4-
D, BAP, NAA and KIN). The results showed that the cultivation of shoot and leaf
explants in medium with 0.1% activated charcoal, supplemented with 4.5 uM of 2,4-D
and 4.4 uM BAP treatment was the best callus induction with an 88% percentage
production. Quantification of proteins by Protein UV from NanoVue detected 15.97 ug
protein / uL shoot extract; 20.07 ug protein / uL leaf extract; 0.75 ug protein / uL of
shoot callus extract; and 16.85 ug protein / uL of leaf callus extract. The original
tissues showed higher protein concentration than those in produced calluses, which
can be explained by the differentiation of tissue. Histological analysis indicated that
the cells of calluses were homogeneous and viable, with thin cell wall, and large
amount of polysaccharide granules. The proteomic study by mass spectrometry led
to the identification of peptides that have relation to previously reported plant
proteins. We were able to detect proteins related to the defense (KM+, chitinase,
catalase), metabolism (fructose-bisphosphate aldolase, glutamate carboxypeptidase)
and cell signaling (calmodulin) in calluses, regardless of the origin of these. The work
pioneered the proteomic study of A. incisa calluses, and is an initial step in
understanding the biochemistry and physiology of the species under study.
Keywords: Artocarpus incisa. Tissue Culture. Proteomics.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Crescimento dos calos foliares de A. incisa L. em tratamentos
contendo apenas um regulador de crescimento (2,4-D ou BAP), ou ambos no
meio nutritivo..........................................................................................................
Figura 2 - Quantidade de calos formados a partir de explantes foliares de A.
incisa L. após quatro semanas, submetidos a tratamentos contendo somente
um tipo de fitohormônio (2,4-D ou BAP), ou ambos no meio nutritivo...................
Figura 3 – Calos de A. incisa, cultivados em meio WPM + 4,5 µM de 2,4-D e
4,4 µM de BAP.......................................................................................................
Figura 4 - Cortes longitudinais de calos foliares e caulinares de A. incisa após
dois e quatro meses de subcultivo, respectivamente............................................
Figura 5 - SDS-PAGE de amostra de calo caulinar de A. incisa após seis
meses de subcultivo, e frutalina purificada (controle)............................................
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Lista de nutrientes, vitaminas e compostos orgânicos utilizados para
formulação do meio nutritivo Woody Plant Medium (WPM)..................................
Quadro 2 - Tratamentos utilizados para indução de calos a partir de explantes
foliares de A. incisa L.............................................................................................
Quadro 3 - Concentração de Proteínas Totais Solúveis determinada nos
extratos de folha, caule, calos foliares e calos caulinares de A. incisa, através
do NanoVue (GE Healthcare)................................................................................
Quadro 4 - Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-
QUAD-TOF a partir do extrato total de caule de A. incisa.....................................
Quadro 5 - Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-
QUAD-TOF a partir do extrato total de calos caulinares de A. incisa após seis
meses de subcultivo..............................................................................................
Quadro 6 - Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-
QUAD-TOF a partir do extrato total de folhas de A. incisa....................................
Quadro 7 - Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-
QUAD-TOF a partir do extrato total de calos foliares de A. incisa após seis
meses de subcultivo..............................................................................................
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
ANA Ácido 1-naftalenoacético
AT Azul de Toluidina
BAP 6-benzilaminopurina
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CIN Cinetina
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FINEP Financiadora de Estudos e Projetos
MS Murashige & Skoog
PAS Periodic Acid Schiff
PVP Polivinilpirrolidona
UFC Universidade Federal do Ceará
WPM Woody Plant Medium
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................
1.1. Artocarpus spp.................................................................................................
1.2. Cultura in vitro de tecidos vegetais..................................................................
1.2.1. Cultura in vitro de Artocarpus..........................................................................
1.3. Proteômica.......................................................................................................
1.4. Lectinas Vegetais............................................................................................
1.4.1. Lectinas de Artocarpus....................................................................................
2. JUSTIFICATIVA.....................................................................................................
3. OBJETIVOS...........................................................................................................
3.1. Objetivo Geral......................................................................................................
3.2. Objetivos Específicos..........................................................................................
4. MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................
4.1. Coleta do Material Vegetal, Desinfestação e Germinação das Sementes de
Artocarpus incisa L.....................................................................................................
4.2. Estabelecimento das condições de cultivo in vitro..........................................
4.3. Determinação de Proteínas Totais Solúveis....................................................
4.4. Análise histológica por microscopia de luz......................................................
4.4.1. Coloração com Azul de Toluidina (AT)............................................................
4.4.2. Coloração pela reação de PAS (Periodic Acid Schiff).....................................
4.5. Digestão tríptica das amostras para aplicação em Espectrometria de
Massas.......................................................................................................................
4.6. Espectrometria de Massas (LC/MS)................................................................
4.7. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS (SDS-PAGE)...
4.8. Atividade Hemaglutinante.................................................................................
4.9. Análise estatística............................................................................................
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................
5.1. Obtenção dos calos.........................................................................................
5.2. Subcultivo dos calos........................................................................................
5.3. Análise histológica dos calos caulinares e foliares..........................................
5.4. Determinação de Proteínas Totais Solúveis.....................................................
5.5. Análise Proteômica.........................................................................................
5.5.1. Caule................................................................................................................
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5.5.2. Calos caulinares..............................................................................................
5.5.3. Folha................................................................................................................
5.5.4. Calos foliares...................................................................................................
5.6. SDS-PAGE e Atividade Hemaglutinante.........................................................
5.7. Considerações Finais.......................................................................................
6. CONCLUSÃO..................................................................................................
REFERÊNCIAS..........................................................................................................
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Artocarpus spp.
O gênero Artocarpus, que integra a família Moraceae, engloba um grupo de
plantas de porte arbóreo, possuindo 50 espécies. É um gênero nativo do sul e
sudeste da Ásia, Nova Guiné e sul do Pacífico. Os representantes principais são as
espécies Artocarpus integrifolia e Artocarpus incisa, popularmente conhecidas como
jaca e fruta-pão, respectivamente. Elas estão localizadas em regiões de clima
tropical úmido e são usualmente encontradas em locais com altitude abaixo de 1000
m. Os frutos possuem pico de produção nos meses de junho e dezembro. Todas as
partes da planta possuem látex de coloração branca. As sementes são grandes,
apresentando de 1 a 2 cm de espessura e são desprovidas de endosperma. A
germinação é do tipo hipógea, e as árvores podem alcançar até 20 metros de altura
e viver cerca de 80 anos (JAGTAP; BAPAT, 2010). No Brasil, as espécies que são
cultivadas se encontram na região amazônica e na costa tropical, do Pará ao Rio de
Janeiro (MADRUGA et al., 2014).
Muitos membros do gênero Artocarpus têm sido usados na medicina popular.
A principal espécie utilizada é a jaca, e cada uma de suas partes apresenta um uso
no tratamento de doenças. As raízes são utilizadas para o tratamento de diarreia e
febre; as folhas estimulam a produção de leite em mulheres e em animais, e também
são úteis no tratamento de sífilis e como vermífugos. O látex, adicionado ao vinagre,
promove a cura de abscessos, picada de cobra e inchaços glandulares, enquanto
que as folhas e a casca do caule são usadas para tratar anemia, asma, dermatite,
diarreia, tosse, atuando como expectorante (BALBACH; BOARIM, 1992). As frutas,
sementes e o tronco apresentam compostos químicos com propriedades
afrodisíacas (FERRAO, 1999).
A maior parte dos efeitos farmacológicos pode ser explicada pelos compostos
fenólicos, incluindo flavonoides, estilbenoides, arilbenzofuronas, presentes em todas
as partes da planta, e das lectinas presentes nas sementes (JAGTAP; BAPAT,
2010).
A espécie Artocarpus incisa L. é uma árvore de raízes profundas e caule
de casca cinzenta e lisa, com 80 a 90 cm de diâmetro, folhas grandes de 30 a 90 cm
de comprimento por 30 a 45 cm de largura, coriáceas, curvadas na base, recortadas
16
em 5 a 7 lobos, raramente inteiras, de cor verde escura. Suas flores são desprovidas
de pétalas e muito pequenas (RAGONE, 1997). Seus frutos são diferenciados em
duas variedades de fruta-pão. A variedade apyrena não possui sementes ou se as
possui são atrofiadas (variedade não seminífera) e é conhecida popularmente como
“fruta-pão de massa”. A variedade seminífera, conhecida como “fruta-pão de
caroço”, possui frutos que pesam até 2 kg, com epiderme formando protuberâncias
hexagonais, massa ou polpa em pequena quantidade, envolvendo em média 80
sementes (QUIJANO; ARANGO, 1979; MOREIRA et al., 1998).
Os primeiros estudos com a variedade seminífera de A. incisa L.
culminaram no isolamento de uma lectina (MOREIRA; OLIVEIRA, 1983), que foi
posteriormente denominada frutalina (MOREIRA et al., 1998).
1.2. Cultura in vitro de tecidos vegetais
A cultura in vitro de tecidos vegetais pode ser definida como uma cultura
asséptica de células, tecidos, órgãos, ou plantas inteiras sob condições nutricionais
e ambientais controladas (THORPE, 2007).
O primeiro trabalho relatado que empregou a técnica de cultura de tecidos
data do começo do século XX, quando Gottlieb Haberlandt, em 1902, desenvolveu
experimentos para manter as células do mesofilo em cultura, baseando-se no
postulado que estabelecia a “totipotencialidade das células vegetais”. A partir desse
momento, vários trabalhos têm sido relatados utilizando técnicas de cultura in vitro
de tecidos vegetais, ou micropropagação, sendo úteis em programas de
melhoramento vegetal, conservação da biodiversidade genética e na produção
biofarmacêutica, dentre outras aplicações (GARCÍA-GONZÁLES et al, 2010).
As técnicas de cultura de tecidos vegetais se baseiam em dois processos
de morfogênese, conhecidos como organogênese e embriogênese somática. A
organogênese é a formação de órgãos vegetais a partir de um tecido diferenciado, a
fim de formar uma planta inteira. Isso significa que apenas um órgão aéreo ou raiz é
emitido e a partir daí uma nova planta é regenerada. Além disso, a organogênese
pode ser direta, se o broto for obtido diretamente do tecido vegetal, denominado
explante, ou indireto, se o processo ocorrer com uma formação prévia de calos a
partir do explante inicial (VIJAYA; GIRI, 2003).
17
A embriogênese somática é a produção de embriões a partir de células
somáticas para obter uma planta inteira. Diferentemente da organogênese, esse
processo consiste na obtenção de estruturas aéreas e raízes a partir de um embrião
somático. O processo também pode ser direto ou indireto, se o material para a
indução dos embriões for o explante inicial ou calos previamente induzidos
(AMMIRATO, 1983).
A palavra calo é originária do latim callum, que significa rígido, e na
biologia vegetal se refere ao crescimento massivo de células e acumulação de
calose (um polissacarídeo) associada a uma injúria. Atualmente, essa palavra tem
sido usada de forma mais ampla, e massas de células desorganizadas são
coletivamente chamadas de calos (IKEUCHI et al, 2013). Para a indução de calos,
pedaços de cotilédones, hipocótilo, caule, folha ou embrião são usualmente
utilizados. Uma excelente fonte de explante para a indução de calos é o tecido de
plântulas de sementes assepticamente germinadas ou inflorescências maduras
(SMITH, 1992).
Muitas vezes existe a formação de calos que não possuem estruturas
diferenciadas. Estes calos podem apresentar estruturas compactas e/ou friáveis.
Calos friáveis são formados por divisão celular rápida, e compostos por células
indiferenciadas, altamente vacuoladas e frouxamente ligadas, enquanto que calos
compactos são formados por células com pequeno espaço intercelular, não
favorecendo a divisão celular rápida (IKEUCHI et al., 2013).
A indução de calos pode ocorrer usando explantes de qualquer parte da
planta, sob condições assépticas. Com o estímulo de substâncias endógenas de
crescimento adicionadas ao meio, o metabolismo celular é modificado de quiescente
para um metabolismo ativo. É comum o balanceamento de auxinas e citocininas no
processo de diferenciação e acúmulo de metabólitos em tecidos vegetais, e quando
usados conjuntamente, estimulam a divisão celular e controlam a morfogênese
(GASPAR et al., 1996; IKEUCHI et al., 2013).
Uma das dificuldades da cultura de tecidos é o ajuste de um protocolo
com um meio de cultivo que supra as necessidades da planta, tornando-a propícia à
multiplicação em larga escala. Cada espécie vegetal requer um meio de cultura
específico para ter um desenvolvimento considerado normal, por isso, torna-se
18
fundamental o estudo da composição em sais minerais, suplementos orgânicos e o
balanceamento e tipo de reguladores vegetais para a indução dos calos, ou a
diferenciação da parte aérea ou raiz das plantas (SANTOS el al, 2005).
O meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) formulado para o cultivo in
vitro de células de Nicotiana tabacum, apresentou-se eficiente para a maioria das
espécies vegetais herbáceas. No entanto, as espécies lenhosas frequentemente não
são responsivas à composição original. No cultivo dessas espécies, modificações
como a redução do teor de macronutrientes, apresentam melhor desempenho. Outra
possibilidade é a substituição do meio MS basal pelo meio WPM (Woody Plant
Medium) (MCCOWN; LLOYD, 1981), de composição mais diluída em compostos
nitrogenados e originalmente formulado para espécies lenhosas (MELO et al., 1999).
De acordo com Pasqual (2001) citado por Soares et al. (2009), o meio WPM possui
25% das concentrações de íons nitrato e amônia quando comparado ao meio MS,
no entanto, apresenta mais potássio e um elevado nível de íons sulfato.
Auxinas, ácido abscísico, citocininas, etileno e giberelinas são conhecidos
como sendo as cinco principais classes de fitohormônios naturais. Auxinas,
citocininas e a interação auxina-citocinina são consideradas como as mais
importantes para a regulação do crescimento e para o desenvolvimento organizado
na cultura de tecidos vegetais, sendo as duas classes de hormônios mais requeridas
(GASPAR et al, 1996). Uma razão intermediária entre as concentrações de auxina e
citocinina promove a indução de calos, enquanto uma alta relação entre
auxina/citocinina ou citocinina/auxina induz a regeneração de raiz ou parte aérea,
respectivamente (SKOOG; MILLER, 1957, apud IKEUCHI, 2013).
O grande objetivo da micropropagação é a produção de plantas
geneticamente idênticas, fisiologicamente uniformes, com desenvolvimento normal e
livre de patógenos, que podem ser aclimatadas por um período de tempo reduzido e
com baixo custo (RATHORE et al, 2004).
1.2.1. Cultura in vitro de Artocarpus
A micropropagação de plantas de porte arbóreo é possível, contudo, com
algumas exceções, os métodos in vitro não são ainda práticos e viáveis
comercialmente para a maioria das espécies arbóreas. A micropropagação de todos
19
os tipos de árvores perenes é fortemente afetada pela idade ontogenética (HACKET,
1985). A clonagem in vitro e in vivo de plantas adultas, ou maduras, é afetada
negativamente por características que acompanham a maturação, como a redução
da taxa de crescimento, redução ou perda total da capacidade de enraizamento, e a
ocorrência de um fenômeno indesejável chamado de plagiotropia, o qual consiste no
crescimento horizontal de algumas partes da planta (PIERIK, 1990).
A maturação é o principal problema que impede a utilização da cultura de
tecidos em larga escala entre espécies de plantas arbóreas. Além disso, a
micropropagação de plantas lenhosas que sofrem estresses abióticos no ambiente
natural se torna ainda mais difícil, devido à sazonalidade, e aos fatores ambientais
que influenciam no comportamento e desenvolvimento dos explantes na cultura in
vitro (RATHORE et al, 2004).
O primeiro estudo utilizando a técnica de cultura de tecidos para uma
espécie do gênero Artocarpus foi realizado por Rao et al. (1981), no qual utilizou-se
explantes de A. heterophyllus provenientes de caule, cotilédones e hipocótilos para
regeneração. Contudo, a metodologia utilizada não foi muito eficiente.
Subsequentemente, outros trabalhos conseguiram realizar a propagação in vitro
desta espécie de forma bem-sucedida, utilizando explantes advindos de brotos
(RAHMAN, 1988; RAHMAN; BLAKE 1988a, 1988b), explantes nodais (ROY et al.
1990) e gemas apicais da árvore adulta (AMIN; JAISWAL, 1993).
O uso de outras espécies do genêro Artocarpus para micropropagação é
pouco relatado, com um estudo com A. lakoocha (JOSHEE et al, 2002) e dois com
A. altilis (ROUSE-MILLER; DUNCAN, 2000; MURCH et al, 2008). Todos esses
trabalhos visaram à regeneração através de organogênese direta, com apenas um
relato do uso desse gênero para a produção de calos (MANEECHAI et al, 2012).
Apesar da importância de se ter um protocolo eficiente para
micropropagação das espécies desse gênero, em função dos diversos usos
terapêuticos decorrentes dos metabólitos produzidos por elas, ainda é um desafio se
obter uma metodologia que seja eficiente para o estabelecimento e sobrevivência de
explantes maduros de espécies de Artocarpus, assim como para outras espécies
lenhosas (ROUSE-MILLER; DUNCAN, 2000).
20
Os principais problemas que se encontram com o cultivo in vitro de
espécies lenhosas são a contaminação, escurecimento, necrose do tecido, resposta
inconsistente dos explantes e baixa eficiência de propagação. Dessa forma, os
protocolos de micropropagação são geralmente específicos para as espécies, ou até
mesmo para cada cultivar específica (MURCH et al, 2008).
Contornados esses problemas, a micropropagação de plantas arbóreas
permite a produção, em grande quantidade, de espécies importantes do ponto de
vista econômico e ecológico, facilitando a sua conservação e distribuição pelo
mundo (MURCH et al, 2008).
1.3. Proteômica
A proteômica é uma poderosa ferramenta que envolve a identificação e
caracterização de proteínas (WANG et al, 2010). Além de realizar a identificação
sistemática das proteínas celulares, a proteômica também é útil para elucidar
detalhes moleculares que ocorrem durante processos complexos, como as etapas
envolvidas no desenvolvimento vegetal (YIN et al, 2007; YIN; LAN; ZHU, 2008).
Mudanças no perfil proteico decorrentes de alterações ambientais, do
desenvolvimento da planta, abundância de proteínas, modificações pós-traducionais
e interações entre proteínas podem ser investigadas (VALLEDOR; JORRÍN, 2011).
As técnicas de proteômica têm sido utilizadas para investigar os sistemas
de cultura de tecidos de muitas espécies, incluindo Citrus sinensis (PAN et al. 2009),
Cyclamen persicum (BIAN et al. 2010), Manihot esculenta (LI et al. 2010), Vanilla
planifolia (TAN et al, 2013) e Glycine max (MIERNYK; JETT; JOHNSTON, 2016).
A metodologia mais comum de análise proteômica é a combinação da
eletroforese bidimensional para separar e visualizar proteínas e a espectrometria de
massas para identificação proteica. As proteínas desempenham um papel duplo nos
processos genéticos, servindo tanto como um produto gênico, como carreador
funcional, e o RNAm é o intermediário desse processo. Todavia, devido aos
mecanismos de modificações pós-traducionais, à meia-vida de proteínas específicas
ou do RNAm, e à localização intracelular e associação molecular das proteínas
resultantes da expressão gênica, a relação entre o RNAm e os níveis de expressão
21
proteica ainda não está claro. Muitos estudos têm sido feitos para correlacionar os
níveis de expressão proteica e o RNAm das mesmas amostras (YIN et al, 2007).
Estudos proteômicos de calos vegetais têm sido realizados para elucidar
os eventos bioquímicos e moleculares decorrentes da interação auxina/citocinina na
desdiferenciação dos tecidos in vitro (YIN; LAN; ZHU, 2008), avaliar a resistência a
baixas temperaturas (LEI et al, 2013), e determinar a relação entre a maturação e a
competência da embriogênese somática no crescimento vegetal (HERINGER et al,
2015).
Portanto, a proteômica de calos tem se mostrado uma excelente
abordagem para estudos de bioquímica e fisiologia vegetal, e análises mais
aprofundadas são necessárias para se elucidar o papel das proteínas na iniciação e
diferenciação dos calos, bem como as suas funções no vegetal.
1.4. Lectinas vegetais
As lectinas são uma classe de proteínas que se ligam de maneira
reversível e com alta especificidade a mono e oligossacarídeos, diferindo das
enzimas por não apresentarem atividade catalítica, e de anticorpos por não
necessitarem de estimulação antigênica (SHARON; LIS, 1989; GABIUS et al., 2002).
Peumans e Van Damme (1995) apresentaram uma definição que
considerava que o único pré-requisito para uma proteína ser classificada como
lectina é que esta apresentasse, pelo menos, um domínio não catalítico capaz de
ligar-se reversível e especificamente a carboidratos. Além dessa definição, Peumans
e Van Damme propuseram uma classificação para as lectinas vegetais, levando-se
em consideração sua estrutura proteica. Elas foram divididas em merolectinas,
hololectinas e quimerolectinas.
As merolectinas são proteínas que apresentam exclusivamente um único
sítio ligante a carboidratos. As hololectinas são proteínas que também apresentam
apenas um domínio de ligação a carboidratos, porém contém dois ou mais sítios de
ligação (os quais podem ser iguais ou homólogos) para essas moléculas, estando
aptas a aglutinar células e/ou precipitar glicoconjugados. As quimerolectinas são
proteínas que possuem, além do domínio ligante a carboidratos, outro domínio com
22
atividade catalítica ou atividade biológica que age independentemente do domínio
ligante de açúcar (PEUMANS; VAN DAMME,1995).
Pouco tempo depois, Van Damme et al. (1998) propuseram uma
modificação nesta classificação, que foi ampliada com a inclusão de uma nova
classe, as superlectinas. As superlectinas são um grupo especial de
quimerolectinas, sendo proteínas de fusão, as quais são estruturalmente diferentes e
reconhecem carboidratos distintos.
Quatro anos depois, foi sugerido por Monteiro-Moreira (2002) mais uma
classe de lectinas, denominadas multilectinas, definidas como proteínas constituídas
exclusivamente de domínios ligantes a carboidratos, que são idênticos ou
homólogos, mas que reconhecem açúcares estruturalmente não relacionados. Ou
seja, são lectinas de especificidade múltipla.
Na natureza, as lectinas estão distribuídas em uma grande variedade de
organismos, como procariotos, algas, fungos, corais, plantas, invertebrados e
vertebrados (AKKOUH et al., 2015). Nas plantas, as lectinas são
predominantemente abundantes nas sementes (CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002).
Nas sementes de leguminosas, por exemplo, as lectinas chegam a constituir 10% do
total das proteínas (ETZLER, 1986).
A localização das lectinas nas células vegetais pode ser em corpos
proteicos (ou vacúolos de estocagem), que são pequenos vacúolos que sofreram
diferenciação para serem capazes de estocar proteínas durante a maturação da
semente e hidrolisá-las durante períodos de crescimento (CHRISPEELS, 1984).
Contudo, já foram identificadas lectinas que estão presentes no citoplasma, núcleo
(VAN DAMME et al, 2004) além de também ocorrerem no espaço intercelular
(ETZLER et al., 1986).
Apesar de diversas lectinas de plantas terem sido estudadas em grandes
detalhes, o papel fisiológico destas proteínas ainda é pouco conhecido (VAN
DAMME et al., 2004). Algumas evidências têm sustentado a ideia de que, quando as
plantas são estimuladas por fatores bióticos e abióticos específicos, elas respondem
por meio da expressão de lectinas nucleares ou citoplasmáticas. A localização e a
regulação da expressão destas lectinas indicam que as mesmas estão envolvidas
23
em interações proteína-carboidrato endógenas específicas (VAN DAMME et al.,
2004).
1.4.1. Lectinas de Artocarpus
Moreira e Ainouz (1977) isolaram a primeira lectina do gênero Artocarpus,
proveniente de sementes de A. integrifolia L. (jaqueira). Ela ficou posteriormente
conhecida como Jacalina, sendo a lectina mais estudada deste gênero e de toda a
família botânica.
Estudos subsequentes encontraram uma segunda lectina nas sementes
de A. integrifolia, a qual foi denominada inicialmente de Artocarpina, porém esse
termo já era utilizado para designar a lectina de A. lakoocha (CHOWDHURY;
AHMED; CHATTERJEE, 1991). Inicialmente, foi proposto que essa lectina era
específica a D-manose e D-glucose, mas não a D-galactose, e foi denominada KM+
(SANTOS-DE-OLIVEIRA et al, 1994). Contudo, investigações posteriores revelaram
que essa é uma lectina poliespecífica, que reage com vários tipos de
monossacarídeos (BARRE et al., 2004). Estudos relatam algumas atividades
biológicas relacionadas à KM+, como a ativação e migração de neutrófilos pela
ligação ao receptor CXCR2 (PEREIRA-DA-SILVA et al, 2006; TOLEDO et al, 2009),
e a degranulação de mastócitos pela ligação à imunoglobulina E (IgE) (MORENO et
al, 2003). Devido à sua atividade poliespecífica, a KM+ é considerada um
interessante agente imunomodulador (CECÍLIO et al, 2016).
A lectina encontrada em sementes de Artocarpus incisa L. (frutalina) foi
isolada e caracterizada por MOREIRA et al. (1998), por cromatografia de afinidade
em coluna de galactomanana de Adenanthera pavonina. A frutalina é uma
glicoproteína α-D-galactose ligante, que possui 2,1% de carboidratos em sua
estrutura e apresenta elevados teores de aminoácidos ácidos, hidroxilados e
hidrofóbicos, e baixo teor de aminoácidos sulfurados. Além da frutalina, foram
encontradas proteínas do tipo manose ligante (frutapina) e quitina ligante
(frutaquina) em A. incisa L., presentes em diferentes quantidades na semente.
Algumas das suas propriedades biológicas foram bem estabelecidas (MONTEIRO-
MOREIRA, 2002).
24
A estrutura primária da frutalina é composta pela cadeia alfa com 133
resíduos de aminoácidos e pela cadeia beta com 20 resíduos. A estrutura
secundária desta lectina é formada predominantemente por folhas beta
antiparalelas. A frutalina é uma proteína oligomérica, encontrando-se como
tetrâmero apenas em pH alcalino, com massa molecular aparente de 60 kDa
(MOREIRA et al., 1998; CAMPANA et al., 2002).
A frutalina apresenta duas bandas proteicas com massas moleculares
aparentes de 12 e 15 kDa quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida
sob condições desnaturantes (PAGE-SDS), na presença e ausência de β-
mercaptoetanol, evidenciando assim que esta lectina não apresenta pontes
dissulfeto (MOREIRA et al., 1998).
A partir do alinhamento das sequências de aminoácidos da frutalina com
outras lectinas isoladas de moráceas, observou-se que a frutalina apresenta em
torno de 40% de identidade com a KM+, lectina manose-ligante de Artocarpus
integrifolia, 76% com a lectina de Maclura pomifera e 98% com a Jacalina
(MONTEIRO-MOREIRA, 2002).
A determinação da estrutura tridimensional da frutalina, obtida através de
cristalografia de raio-X por Monteiro-Moreira (2015) mostra a grande similaridade
dessa lectina com a jacalina, lectina galactose ligante de Artocarpus integrifolia.
Esse fato corrobora com a hipótese de Monteiro-Moreira (2002) que, como a
estrutura primária das duas lectinas são bastante similares, esperava-se que a
estrutura tridimensional de ambas também estivesse bem próximas.
Devido à sua especificidade anomérica por α-D-galactose, diversas
atividades biológicas da frutalina foram descritas. Pesquisas mostraram o uso da
frutalina no estudo de lesões benignas e malignas de tireoide humana (MILHOME,
2003), na indução da migração de neutrófilos na cavidade pleural de ratos, na
indução da quimiotaxia e reorganização do citoesqueleto de actina em neutrófilos
humanos (BRANDO-LIMA et al, 2005), e na ativação mitogênica de linfócitos
humanos (BRANDO-LIMA et al, 2006). Além disso, estudos demonstraram efeito
citotóxico irreversível da frutalina em células HeLa advindas de câncer cervical
(OLIVEIRA et al, 2011), e efeito gastroprotetor (ABDON et al, 2014).
25
Com esses estudos, a frutalina mostrou ser uma ótima ferramenta para
investigações relacionadas ao câncer, apresentando potencial como biomarcador e
como um produto terapêutico, e possui a vantagem de advir de fonte vegetal.
26
2. JUSTIFICATIVA
O presente trabalho mostra o estabelecimento das condições de cultivo in
vitro para a formação de calos de Artocarpus incisa, oriundos de explantes foliares e
caulinares, e a análise histológica desses tecidos de calos.
O interesse em se estabelecer as condições de cultivo in vitro dessa
espécie partiu da concepção de que a cultura de tecidos, por sua própria natureza
clonal, pode fornecer material geneticamente homogêneo, essencial para a
obtenção de metabólitos de importância econômica. Além disso, a cultura de calos
pode assegurar a produção de substâncias ativas em um curto período de tempo e
sem a influência de fatores externos (POUREBAD et al, 2015).
A cultura de calos apresenta as seguintes vantagens: ela pode ser
conduzida em ambientes controlados, reduzindo a influência de fatores ambientais;
o tempo necessário para o amadurecimento dos tecidos de calos é mínimo; a
purificação de certos metabólitos a partir de calos é mais simples, uma vez que
esses não possuem quantidades elevadas de pigmentos; a produção de calos é
mais facilmente ajustada para suprimir a demanda de substâncias químicas do
mercado, inclusive compostos de valor medicinal (GARCÍA-GONZÁLES et al, 2010).
Além disso, os calos de diversas espécies vêm sendo utilizados para
estudos histológicos, com o objetivo de caracterizar o processo e as vias de
regeneração de plantas in vitro (ALVES; XAVIER; OTONI, 2004; DIBAX et al., 2010).
Entre as principais proteínas de importância farmacológica presentes em
sementes de Artocapus incisa L., pode-se listar as lectinas α-D-galactose-ligante
(frutalina), manose ligante (frutapina) e quitina ligante (frutaquina), presentes em
diferentes quantidades na semente (MONTEIRO-MOREIRA, 2002). Algumas destas
lectinas de A. incisa (com exceção da frutalina) estão presentes na semente em
concentrações extremamente baixas. A obtenção das mesmas em quantidades
apreciáveis, seja por cultura em forma de calos, seja em suspensões celulares, é
essencial para um estudo mais detalhado de seus efeitos.
Pesquisas já foram desenvolvidas avaliando a síntese de lectinas em
calos vegetais, onde foi demonstrada a presença de lectinas que também são
27
encontradas em sementes (GUPTA; SRIVASTAVA, 1998; SILVA et al, 2003; SILVA
et al 2005).
Além disso, realizou-se o primeiro estudo protêomico de calos de A.
incisa, comparando-se as proteínas detectadas nos calos com as dos explantes
originais. Os resultados poderão contribuir no entendimento da fisiologia dos calos e
na compreensão dos mecanismos moleculares que levam à formação de calos nas
diferentes partes da planta.
28
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Esse trabalho teve como objetivo estabelecer as condições de cultivo in
vitro para induzir a proliferação de calos em explantes caulinares e foliares de
Artocarpus incisa L., e analisar as proteínas expressas através da Espectrometria de
Massas.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Definir um protocolo eficiente de multiplicação in vitro de calos de A.
incisa L., oriundos de explantes de folha e caule;
Quantificar as proteínas totais nos calos e nos explantes de origem;
Realizar a análise histológica dos tecidos de calos caulinares e foliares
através de microscopia de luz;
Verificar as proteínas expressas pelos calos caulinares e foliares e pelos
explantes originais através de espectrometria de massas;
Comparar o perfil de expressão proteica dos calos com os tecidos de
origem.
29
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Coleta do Material Vegetal, Desinfestação e Germinação das
Sementes de Artocarpus incisa L.
Frutos e sementes de Artocarpus incisa L. foram coletados na região
serrana do município de Maranguape, Ceará, no período de novembro de 2014 e
fevereiro de 2015.
Os frutos de A. incisa coletados foram desinfestados de acordo com
Joshee et al (2002). Inicialmente foram lavados em água corrente por 1 hora, em
seguida mergulhados em detergente comercial diluído e enxaguados três vezes com
água destilada autoclavada. Na sequência, os frutos foram imersos em solução
alcoólica na concentração 70% e deixados secar ao ar livre para posterior remoção
das sementes.
As sementes de A. incisa foram lavadas em água corrente para retirada
dos resíduos do fruto. Em seguida, foram submersas em solução alcoólica na
concentração 70% por 1 minuto. Posteriormente, foram imersas em solução de
hipoclorito de sódio com 1% de cloro ativo por 15 minutos. Por fim, as sementes
foram lavadas três vezes em água destilada estéril. Todo o procedimento de
desinfestação das sementes foi realizado em câmara de fluxo laminar.
Após a etapa de desinfestação das sementes, foi feita a semeadura em
copos plásticos contendo areia e vermiculita autoclavadas, na proporção de 1:1. Os
recipientes com as sementes foram mantidos em câmara de germinação tipo B.O.D.
com fotoperíodo de 16 horas e temperatura 25 ± 2 ºC.
Após dois meses, as plantas foram transferidas para vasos, que também
continham areia e vermiculita, e foram mantidas na casa de vegetação do
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do
Ceará.
Para a desinfestação dos explantes, folhas de A. incisa foram lavadas em
detergente diluído por 5 minutos, e em seguida foram imersas por 20 minutos em
uma solução de hipoclorito de sódio (1% de cloro ativo), sendo então submetidas a
três lavagens em água destilada estéril. O mesmo procedimento foi adotado com os
30
explantes caulinares, sendo que o tempo de exposição à solução de hipoclorito de
sódio foi de 30 minutos.
4.2. Estabelecimento das condições de cultivo in vitro
As plantas de A. incisa mantidas em casa de vegetação foram usadas
como fonte de explantes para produção dos calos. Os fragmentos de folhas e de
caule foram cultivados em tubos de ensaio e/ou placas de Petri contendo o meio de
cultura WPM (Woody Plant Medium), uma formulação nutritiva mais adequada para
plantas lenhosas, acrescido de 2% de sacarose e 0,8% de ágar (Quadro 1). O pH foi
ajustado para 5,6 (MCCOWN; LLOYD, 1981).
Quadro 1 - Lista de nutrientes, vitaminas e compostos orgânicos utilizados para formulação do meio
nutritivo Woody Plant Medium (WPM).
COMPONENTES CONCENTRAÇÃO (mg/L)
MACRONUTRIENTES
NH4NO3 400
Ca(NO3)2 . 4H2O 556
K2SO4 990
MgSO4 . 7H2O 370
KH2SO4 170
CaCl2 . 2H2O 96
MICRONUTRIENTES
H3BO3 6,2
MnSO4 . H2O 22,3
ZnSO4 . 7H2O 8,6
Na2MoO4 . 2H2O 0,25
CuSO4 . 5H2O 0,25
FeSO4 . 7H2O 27,8
Na2 . EDTA 37,3
VITAMINAS E COMPOSTOS ORGÂNICOS
Tiamina HCl 1,6
Ácido nicotínico 0,5
Mio-inositol 100 Fonte: McCown; Lloyd, 1981
31
Para determinar as melhores condições de crescimento dos calos, testes
preliminares foram executados. Em todos os testes, utilizou-se a formulação nutritiva
WPM, da forma descrita anteriormente. Para o primeiro teste, os explantes foliares
foram inoculados em meio de cultura que foi suplementado com 36 µM da citocinina
sintética cinetina (CIN), de acordo com metodologia de Amin e Jaiswal (1993).
Para o segundo teste, utilizou-se explantes foliares distribuídos em dois
tratamentos. O primeiro foi suplementado com a auxina sintética ácido 1-
naftalenoacético (ANA) na concentração 3 µM, e com a citocinina cinetina na
concentração 4,6 µM, seguindo-se metodologia de Suri e Ramawat (1995). O
segundo tratamento foi suplementado com os mesmos reguladores de crescimento
anteriores, e foi acrescido de polivinilpirrolidona (PVP) na concentração 100 mM. O
PVP tem sido bastante empregado por sua ação antioxidante. Os compostos
fenólicos são adsorvidos pelo PVP por meio de ligações de hidrogênio, o que
previne a oxidação e polimerização (PASQUAL et al. 1997).
Para o terceiro teste, com o intuito de reduzir a oxidação dos explantes
foliares e caulinares, fez-se um pré-tratamento suplementando o meio nutritivo com
0,05% de carvão ativado, que tem a função de adsorver os compostos fenólicos
liberados pela planta (VAN WINKLE; JOHNSON; PULLMAN, 2003). Após quatro
semanas, os explantes oriundos do pré-tratamento foram transferidos para novos
tubos de ensaio contendo a formulação WPM, acrescida de 3 µM de ANA e 4,6 µM
de CIN.
Após os testes preliminares, realizou-se um experimento apenas com
explantes foliares, baseado na metodologia empregada por Maneechai et al (2012).
Inicialmente, fez-se um pré-tratamento suplementando o meio nutritivo com 0,1% de
carvão ativado.
Após quatro semanas, os explantes oriundos do pré-tratamento foram
separados em cinco tratamentos distintos. O primeiro continha a auxina sintética
ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) na concentração de 4,5 µM, o segundo
continha a citocinina sintética 6-benzilaminopurina (BAP) na concentração de 4,4
µM, o terceiro possuía 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP, o quarto apresentava 4,5
µM de 2,4-D e 8,8 µM de BAP, e o quinto não apresentava reguladores de
crescimento, atuando como grupo controle. O experimento foi conduzido em
delineamento inteiramente casualizado, havendo seis repetições para cada
32
tratamento, sendo considerada como unidade experimental uma placa de Petri com
cinco explantes.
Todos os meios de cultura passaram por prévia esterilização, utilizando
autoclavagem a 121 ºC por 15 minutos. O inóculo dos explantes foi realizado em
câmara de fluxo laminar. Os explantes foram cultivados na sala de cultura do
Laboratório de Biotecnologia Vegetal da UFC, com fotoperíodo de 16h e temperatura
25 ± 2 ºC. Após 4 semanas, fez-se uma avaliação quanto à ocorrência de formação
dos calos, calculando-se o percentual de indução de acordo com a seguinte fórmula:
%indução de calos =número de explantes que formaram calos
número total de explantes inoculados 𝑥 100
Após o estabelecimento das condições de cultivo in vitro, fez-se a
produção em grande quantidade dos calos oriundos dos explantes de folha e caule
de A. incisa, utilizando-se a melhor metodologia e seguindo todos os passos
mencionados anteriormente. Os subcultivos foram feitos a cada quatro semanas,
durante seis meses, até se obter uma grande quantidade de calos para análises
posteriores.
4.3. Determinação de Proteínas Totais Solúveis
Após a obtenção dos calos a partir de explantes foliares e caulinares de
A. incisa, estes foram macerados, separadamente, com o uso de almofariz e pistilo e
com adição de nitrogênio líquido. A farinha obtida foi dissolvida em solução salina
(NaCl 0,15 M) na proporção 1:3. Amostras de tecido de folha e caule também
passaram pelo mesmo procedimento. Todas as amostras foram centrifugadas a
3000 x g por cinco minutos. Em seguida, fez-se a determinação do teor de proteínas
totais solúveis com base no método “Protein UV”, no NanoVue Plus
Spectrophotometer (GE Healthcare). Esse método realiza a quantificação das
proteínas através da leitura de absorbância nos comprimentos de onda 280 nm e
260 nm, e fornece uma média dos valores obtidos. Essa técnica permite reduzir o
erro na leitura de absorbância a 280 nm que possa ser ocasionado pela presença de
ácidos nucleicos (GE Healthcare). Todas as análises foram realizadas em duplicata.
33
4.4. Análise histológica por microscopia de luz
A fim de se obter informações sobre as características histológicas dos
calos caulinares e foliares de A. incisa, foi realizada uma série de técnicas para o
estudo celular, que vão desde a fixação do material biológico até a montagem das
lâminas para serem visualizadas em microscópio de luz. Este procedimento foi
realizado no Laboratório de Biologia Celular Vegetal do Departamento de Biologia da
UFC. Utilizou-se amostras de calos foliares e caulinares cultivados por dois e quatro
meses, respectivamente, em sala de cultura do laboratório de Biotecnologia Vegetal.
As amostras foram colocadas em contato com aproximadamente 1 mL do
fixador Karnovsky (1965), sem glutaraldeído, em microtubos, e armazenadas a 4 ºC
por pelo menos 48 h. Em seguida, foram lavadas três vezes em tampão fosfato pH
7,2 por 10 minutos, e depois lavadas rapidamente por três vezes em água destilada.
Após a fixação, o material foi submetido a uma desidratação em série etanólica
crescente (50, 60, 70, 80, 90 e 100%) por 1 h em cada concentração, sendo 30 min
a vácuo e, logo após, colocado em contato com a solução de pré-infiltração e
deixado a vácuo por 1 h, para depois ser armazenado a 4 ºC por 24 h. Após esse
período, as amostras foram transferidas para a solução de infiltração contendo
resina líquida, na qual permaneceu por mais 24 h a 4 ºC. Para inclusão na resina, as
amostras foram depositadas de forma a se obter cortes transversais e longitudinais
em suportes de plástico contendo a solução de infiltração e a resina endurecedora
(Historesin Embbeding Kit - Jung) na proporção 15:1. Os suportes foram deixados
em repouso por 24 h e os blocos de resina contendo o material de A. incisa foram
submetidos a cortes de 6 µm em micrótomo CUT 5062 Slee Mainz. Os cortes foram
distendidos em banho-maria a 40 °C e transferidos para lâminas, para então
passarem pelo processo de coloração diferencial (o detalhamento de cada método
de coloração citoquímica está exposto nas seções seguintes). Para a montagem das
lâminas, duas a três gotas de verniz foram dispostas sobre os cortes e cobertos com
lamínula. Após a secagem, as lâminas foram visualizadas em microscópio de luz
OLYMPUS BX 41 acoplado a uma câmera digital (UC30) e a um computador
contendo o software “CELLB”, por onde se fez o registro fotográfico.
34
4.4.1. Coloração com Azul de Toluidina (AT)
Para detecção de radicais aniônicos (CARVALHO; RECCO-PIMENTEL,
2013), as lâminas foram colocadas em contato com o corante Azul de Toluidina
0,025% pH 6,8 por 15 minutos, em seguida lavadas rapidamente com água
destilada, deixadas em repouso para secar e depois montadas.
4.4.2. Coloração pela reação de PAS (Periodic Acid Schiff)
Este teste visa detectar polissacarídeos neutros (CARVALHO; RECCO-
PIMENTEL, 2013). O material contido nas lâminas foi oxidado em ácido periódico
0,5% por 9 minutos, em seguida lavado em água destilada e secado levemente.
Logo após, o material foi colocado em contato com o reagente de Schiff por 12
minutos no escuro e lavado três vezes por 3 minutos em água sulfurosa (HCl 8,3%,
metabissulfito 10%, em água destilada). Após este procedimento, as lâminas foram
deixadas em repouso para secar e em seguida montadas.
4.5. Digestão tríptica das amostras para aplicação em
Espectrometria de Massas
Os extratos de caule, folha, calos caulinares e calos foliares de A. incisa
foram inicialmente centrifugados a 3000 x g por cinco minutos. O sobrenadante foi
transferido para novos tubos de microcentrífuga e armazenado. Em seguida, 50 µL
de cada amostra, na concentração de 1 µg/µL, foram transferidos para tubos de
microcentrífuga. Adicionou-se 10 µL de bicarbonato de amônio 50 mM.
Posteriormente, as amostras foram aquecidas a 80 ºC por 15 minutos. Em seguida,
os tubos foram centrifugados a 3000 x g por cinco minutos. Adicionou-se 2,5 µL de
ditiotreitol (DTT) 100 mM, e as amostras foram agitadas em vortex. Em seguida, os
tubos foram aquecidos a 60 ºC por 30 minutos. Após o aquecimento, as amostras
foram deixadas resfriando a temperatura ambiente, e foram centrifugadas a 3000 x g
por cinco minutos. Posteriormente, adicionou-se 2,5 µL de iodoacetamida (IAA) 300
mM e agitou-se em vortex. As amostras foram mantidas na ausência de luz, em
temperatura ambiente, por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se 10 µL da solução
de tripsina (Promega) em bicarbonato de amônio 50 mM, e agitou-se em vortex. As
amostras foram deixadas em estufa a 37 ºC, durante 24 horas, para que a digestão
35
tríptica ocorresse. Os sobrenadantes obtidos foram transferidos para frascos
apropriados (Total Recovery vials, Waters).
4.6. Espectrometria de Massas (LC/MS)
Os peptídeos obtidos após a aplicação dos extratos digeridos de folha,
caule, calos foliares e calos caulinares de A. incisa foram analisados em
espectrômetro de massas SYNAPT HDMS (Waters, Manchester, Reino Unido). A
análise foi realizada por ESI-Q-TOF acoplado a um sistema de cromatografia nano
ACQUITY UPLC, utilizando separação por fase reversa em uma coluna do tipo BEH
C18 com dimesões de 100 mm x 75 μm e tamanho da partícula de 1,7 μm, com um
gradiente de 0 a 85% de acetonitrila, contendo ácido fórmico 0,1%, a um fluxo de
400 nL/ minuto. A coluna foi alimentada com 50 ng de amostra, contendo os
peptídeos. Para todas as medições, o espectrômetro de massas foi operado no
modo 'V', com uma potência de resolução de, pelo menos, 10.000 m/z. Todas as
análises foram realizadas utilizando ionização por electrospray no modo ESI (+)
através da fonte NanoLockSpray. Os espectros de massas obtidos foram
processados usando o software ProteinLynx Global Server v. 2.4 (Waters) e os
arquivos PKL gerados foram consultados no bando de dados NCBI (National Center
for Biotechnology Information) usando a pesquisa do software MASCOT v.2.5.1
(Matrix Science – www.matrixscience.com).
4.7. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na Presença de SDS
(SDS-PAGE)
Amostras de calos caulinares de A. incisa e de frutalina purificada foram
utilizadas para a execução da eletroforese. A metodologia utilizada foi adaptada de
Laemmli (1970), para o uso de gel 15%. Para a preparação do gel de separação
com concentração 15%, utilizou-se 1,135 mL de água ultrapura, 3 mL de acrilamida
29%/ bisacrilamida 1%, 1,265 mL de Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, 50 µL de SDS 10%, 125
µL de PSA 1% e 6 µL de TEMED. Após a sua preparação, o gel foi adicionado entre
as placas do aparato. Depois de polimerizado, adicionou-se o gel de aplicação com
concentração 3%, o qual foi preparado utilizando-se 1,538 mL de água ultrapura,
375 µL de acrilamida 29%/ bisacrilamida 1%, 282 µL de Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8, 23
µL de SDS 10%, 125 µL de PSA 1% e 6 µL de TEMED. Em alíquotas de 20 µg de
proteínas das amostras de calos caulinares de A. incisa e de frutalina, adicionou-se
36
15 µL de tampão de amostra (Tris-HCl 0,25 M, Glicerol 10%, SDS 2,5% e azul de
bromofenol 0,001%). As amostras foram fervidas por cinco minutos. Após a
polimerização completa do gel, a cuba de eletroforese foi preenchida com tampão de
corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS 0,1%), e as amostras foram aplicadas
nos poços. A corrida durou aproximadamente quatro horas, com configuração de
200 V e 30 mA. Com o término da corrida, o gel foi mantido em agitação, por 30 min,
em solução corante de proteínas (0,25 g de Coomassie Brilliant Blue R250 em 45
mL de metanol: 45 mL de água: 10 mL ácido acético). Em seguida, o corante foi
retirado e o gel passou por sucessivas lavagens com água destilada e aquecimento
em micro-ondas por 1 minuto por vez, até que fosse possível visualizar as bandas
de forma nítida.
4.8. Atividade Hemaglutinante
Para os ensaios de atividade hemaglutinante foram empregadas amostras
de sangue de coelho coletadas no setor do Núcleo de Biologia Experimental –
NUBEX (Unifor). O sangue foi coletado através da veia marginal da orelha. Em
seguida, as amostras de sangue foram transferidas para um tubo contendo
anticoagulante heparina, na concentração de 1μL/mL de sangue coletado, e lavado
com NaCl 0,15 M por cinco vezes (3.000 x g, 4 ºC, 5 min.). O sobrenadante foi
descartado e o precipitado foi utilizado para preparação de uma suspensão de
hemácias 2%.
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados por diluições
seriadas em placas segundo o método de Moreira e Perrone (1977). Utilizou-se duas
placas, a primeira para o ensaio com calos de origem caulinar, e a segunda para
calos de origem foliar. Em cada poço foram adicionados 100 μL de solução de NaCl
0,15 M, e 100 μL do extrato de calos apenas no primeiro poço. Após a diluição
seriada, adicionou-se o mesmo volume de suspensão de hemácias 2%. O controle
negativo consistia de volumes iguais de NaCl 0,15 M e solução de hemácias 2%.
Após 30 minutos de incubação a 37 ºC e repouso por mais 30 minutos à temperatura
ambiente, a atividade hemaglutinante foi observada visualmente.
37
4.9. Análise estatística
Os dados obtidos com o experimento de indução de calos caulinares e
foliares de A. incisa foram examinados utilizando-se a análise de variância (ANOVA).
O teste de múltiplas comparações de Tukey foi utilizado para identificar as médias
que diferiram no teste de ANOVA. Valores de p<0,05 foram considerados
estatisticamente diferentes. O programa utilizado foi o GraphPadPrism 6.
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Obtenção dos calos
Para o primeiro teste preliminar realizado, no qual utilizou-se explantes
foliares de A. incisa inoculados em tubos contendo a formulação WPM,
suplementada com 36 µM de CIN, seguiu-se a metodologia relatada por Amin e
Jaiswal (1993). Nesse artigo, que teve por objeto de estudo a espécie A.
heterophyllus, foi relatado que o aumento da concentração de citocininas favorecia a
produção de calos, com maior produção na concentração de 36 µM de cinetina. No
presente trabalho utilizou-se 15 tubos de ensaio para a avaliação, e não houve
formação de calos em nenhum deles, além da ocorrência de oxidação dos
explantes.
A oxidação dos explantes no cultivo in vitro é um problema conhecido de
várias plantas lenhosas, sendo relatado em espécies como Cocos nucifera
(coqueiro) (SIQUEIRA; INOUE, 1991), Hancornia speciosa (mangabeira) (LÉDO et
al, 2007) e Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia) (SARTOR et al, 2013). Isso ocorre
como resultado da alta concentração de compostos fenólicos nas espécies
lenhosas, que acabam oxidando e degradando o material vegetal (KERBAUY,
2004). Para amenizar esse processo, pode-se fazer uso de substâncias adsorventes
ou antioxidantes, como PVP, carvão ativado, ácido ascórbico e ácido cítrico
(SIQUEIRA; INOUE, 1991).
No segundo teste, utilizou-se explantes foliares e 15 tubos de ensaio
contendo a formulação WPM suplementada com 3 µM de ANA e 4,6 µM de CIN, e
outros 15 tubos de ensaio contendo a mesma formulação anterior, e acrescido de
100 mM de PVP. O estudo baseou-se na metodologia de Suri e Ramawat (1995),
que obtiveram crescimento de calos com essa formulação para uma espécie
laticífera. O PVP foi adicionado para atuar como um agente adsorvente de
compostos fenólicos. Os resultados mostraram, todavia, que o PVP não só não
conseguiu reduzir a oxidação, como interferiu no crescimento dos calos, pois apenas
20% dos explantes que estavam na formulação que continha o PVP apresentaram
calogênese após quatro semanas. Em contrapartida, 73% dos explantes que se
encontravam em meio nutritivo sem PVP apresentaram formação de calos, apesar
dos explantes se mostrarem oxidados.
39
Os calos formados foram subcultivados em novos tubos com meios
nutritivos contendo a mesma formulação WPM suplementada com 3 µM de ANA e
4,6 µM de CIN, porém após quatro semanas todo o material estava oxidado e
contaminado.
O uso do PVP como agente adsorvente mostrou-se eficaz em trabalhos
com Rubus sp. (amoreira-preta) (AUGUSTO; BIASI, 2002) e Musa spp. (bananeira)
(OLIVEIRA et al, 2011). Contudo, em estudo com coqueiro, o uso de 400 mM de
PVP não conseguiu reduzir o grau de oxidação (SIQUEIRA; INOUE, 1991). O
resultado obtido por Sartor et al (2013), para o jacarandá-da-bahia, também mostrou
que a concentração de 400 mM de PVP não foi capaz de impedir a oxidação, e os
explantes ainda mostraram grau de oxidação maior do que aqueles sem nenhum
tratamento. Logo, os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os dois
citados anteriormente, especialmente pelo fato das espécies estudadas serem
lenhosas, as quais apresentam grande liberação de compostos fenólicos da cultura
in vitro.
No terceiro teste, realizou-se um pré-tratamento contendo a formulação
WPM acrescida de 0,05% de carvão ativado, como uma forma de reduzir a oxidação
dos explantes. Foram empregados 50 explantes foliares e 50 caulinares.
Após quatro semanas, 20% dos explantes foliares e 86% dos explantes
caulinares contaminaram. O material restante apresentou um reduzido grau de
oxidação na região central do explante. Os explantes foliares e caulinares que se
mostraram viáveis foram subcultivados em formulação WPM contendo 3 µM de ANA
e 4,6 µM de CIN.
Após quatro semanas de cultivo, apenas cinco explantes caulinares
apresentaram formação de calos, e todo o restante do material encontrava-se
bastante oxidado.
Nesse ponto, percebe-se que os reguladores de crescimento utilizados
foram capazes de induzir a formação de calos, porém o protocolo ainda não foi
eficiente. A discordância nos resultados ao se comparar com Suri e Ramawat (1995)
pode ser decorrente da grande diferença das espécies em estudo, pois o artigo faz
uso de Calotropis procera, uma planta herbácea, e que não apresentou problemas
40
quanto à oxidação, apesar de ser uma espécie laticífera. O carvão ativado
apresentou pouca eficiência, provavelmente em função da baixa concentração
utilizada, não sendo capaz de adsorver todos os compostos fenólicos presentes no
meio. Pasqual (1990) relata o uso do carvão ativado com sucesso para o
crescimento de embriões de diferentes culturas em uma faixa de 0,2% a 3%. Chapla
et al (2009) descrevem que o crescimento in vitro de Miltonia flavescens Lindl. foi
favorecido com a adição de carvão ativado em concentrações entre 0,1% e 0,2%.
Portanto, um novo teste foi realizado com o uso do carvão ativado em concentração
maior, para confirmar seu efeito no controle da oxidação dos explantes.
A realização dos testes preliminares teve como intuito avaliar as
respostas dos explantes de folha quando submetidos a diferentes tratamentos com
substâncias adsorventes e fitohormônios. Percebeu-se que o uso do carvão ativado
não interferiu na formação de calos, e os hormônios utilizados ainda não forneciam
uma metodologia eficiente. Fez-se uso apenas de explantes foliares nos testes
preliminares devido ao fácil acesso de obtenção desse material. Portanto, após a
realização desses testes, definiu-se um experimento que utilizou carvão ativado
como pré-tratamento, e dois reguladores de crescimento que se mostraram
eficientes para a indução de calos de uma espécie do gênero Artocarpus, de acordo
com Maneechai et al (2012).
Nesse experimento, utilizou-se 40 placas de Petri, com cinco explantes
por placa, contendo a formulação WPM acrescida de 0,1% de carvão ativado. Após
quatro semanas, os explantes foliares mostraram redução no grau de oxidação,
ocorrendo apenas nas bordas, comprovando a eficácia dessa metodologia.
O trabalho desenvolvido com mangabeira (LÉDO et al, 2007) relatou
melhoria no crescimento de plântulas in vitro com a adição de 0,2% de carvão
ativado. Van Winkle et al (2003) também descrevem o benefício da utilização de
carvão ativado no meio de cultivo de conífera. Contudo, como o carvão ativado
também pode adsorver compostos do meio nutritivo, como micronutrientes e
reguladores de crescimento (VAN WINKLE; JOHNSON; PULMANN, 2003), não é
interessante adicioná-lo à formulação para crescimento dos calos, ou pode-se
aumentar a concentração desses compostos, caso seja necessário inclui-lo na
formulação de crescimento.
41
Após quatro semanas com o pré-tratamento, 25% das placas
contaminaram, e o restante do material foi distribuído em cinco tratamentos distintos,
com um tratamento para cada seis placas, os quais estão relatados no Quadro 2:
Quadro 2: Tratamentos utilizados para indução de calos a partir de explantes foliares de A. incisa L.
Tratamento Formulação com
fitohormônios
Quantidade de
explantes
foliares/placa
Quantidade total
de explantes
foliares
A WPM + 4,5 µM de
2,4-D
5 30
B WPM + 4,4 µM de
BAP
5 30
C WPM + 4,5 µM de
2,4-D e 4,4 µM de
BAP
5 30
D WPM + 4,5 µM de
2,4-D e 8,8 µM de
BAP
5 30
E WPM 5 30
A escolha dos reguladores seguiu o protocolo de Maneechai et al (2012).
Após quatro semanas, analisou-se a formação de calos (Figura 1).
Figura 1 – Crescimento dos calos foliares de A. incisa L. em tratamentos contendo apenas um
regulador de crescimento (2,4-D ou BAP), ou ambos no meio nutritivo.
A B C
42
Fonte: Elaborado pela autora.
Legenda: A – WPM + 4,5 µM de 2,4-D; B – WPM + 4,4 µM de BAP; C – WPM + 4,5 µM de 2,4-D + 4,4 µM de BAP; D – WPM + 4,5 µM de 2,4-D + 8,8 µM de BAP; E – WPM (controle). Cada tratamento foi realizado em sextuplicata. Os resultados foram obtidos após quatro semanas de cultivo. As setas indicam os calos formados.
Os tratamentos A e B, que continham apenas um tipo de regulador de
crescimento, não apresentaram formação de calos, bem como o grupo controle (E).
Os tratamentos que continham os dois reguladores de crescimento apresentaram
bom desenvolvimento dos calos, com formação em 73% dos explantes do grupo C e
70% dos explantes do grupo D. A análise estatística mostrou que não houve
diferença significativa nos valores de crescimento de calos entre os grupos C e D
(Figura 2). Osman et al (2016) realizaram experimentos utilizando diferentes
concentrações de 2,4-D e CIN para a formação de calos a partir de endosperma da
espécie lenhosa Barringtonia racemosa L. Eles obtiveram o melhor percentual de
indução de calos (56,7%) utilizando 4,5 µM de 2,4-D e 7 µM de CIN. Isso mostra o
efeito sinergístico dos dois hormônios para o crescimento de calos. Atribui-se ao 2,4-
D a capacidade de estimular a divisão celular e suprimir a organogênese, sendo
capaz de induzir calos mesmo na ausência de citocininas (STABA, 1980). Contudo,
a adição de citocinina é fundamental para se obter calos com características
morfológicas desejáveis, como friabilidade e maior tamanho. A combinação
hormonal entre 2,4-D, benziladenina (BA) e ácido naftalenacético (ANA) mostrou-se
eficaz na indução de calos a partir de folhas de Berberis aristata DC., com uma
produção de 97,5% (BRIJWAL; PANDEY; TAMTA, 2015). Maneechai et al. (2012)
foram os primeiros a relatar a produção de calos de uma espécie de Artocarpus, e
conseguiram obtê-los com o uso de fitohormônios nas concentrações de 4,5 µM de
2,4-D e 4,4 µM de BAP. O presente trabalho corrobora com esses dados, mostrando
a necessidade de se utilizar um balanço correto entre auxinas e citocininas para
promover o desenvolvimento de calos em espécies lenhosas. Como não houve
D E
43
diferença significativa, neste trabalho, em relação ao aumento da concentração de
BAP, escolheu-se utilizar as menores concentrações (4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de
BAP) para realizar a produção dos calos foliares e caulinares em grande quantidade.
Figura 2: Quantidade de calos formados a partir de explantes foliares de A. incisa L. após quatro semanas, submetidos a tratamentos contendo somente um tipo de fitohormônio (2,4-D ou BAP), ou ambos no meio nutritivo.
Fonte: Elaborado pela autora.
*Os dados foram avaliados por análise de variância (ANOVA), aplicando o teste de Tukey, com 0,05% de probabilidade para confirmar a significância do resultado. Letras minúsculas iguais não diferem significativamente.
5.2. Subcultivo dos calos
Inicialmente, inoculou-se explantes foliares em 25 tubos de ensaio
contendo formulação WPM, acrescida de 0,1% de carvão ativado, e explantes
caulinares em outros 25 tubos, contendo a mesma formulação. Após quatro
semanas, os explantes foram transferidos para novos tubos contendo formulação
WPM, acrescida de 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP. Decorridas quatro semanas,
observou-se um percentual de formação de calos de 88%, tanto para os explantes
foliares quanto para os caulinares, mostrando a eficiência do protocolo.
A cada quatro semanas, os calos foram subcultivados em novos meios
nutritivos com mesma formulação, durante seis meses, até que não houvesse a
presença do tecido original. Os calos de origem caulinar foram maiores (2-3 cm) do
44
que aqueles de origem foliar (1-2 cm) (Figura 6). Os calos caulinares também se
mostraram mais friáveis do que os foliares. Ambos apresentaram coloração
esbranquiçada.
Lee e Lee (2013) relataram que a formulação nutritiva e reguladores de
crescimento que utilizaram para produzir calos de Viscum album (visco coreano),
oriundos de explantes de caule e folha, só foram capazes de formar calos nos
explantes caulinares, e com uma taxa de 4,89%.
Warcol et al (2015) descrevem que a melhor formulação para a obtenção
de calos de Cordyline australis, a partir de gemas axilares, produziu calos a uma
taxa de 70,5%. Portanto, o protocolo utilizado nesse trabalho pode ser considerado
excelente para a espécie em estudo.
Figura 3 – Calos de A. incisa, cultivados em meio WPM + 4,5 µM de 2,4-D e 4,4 µM de BAP.
Fonte: Elaborado pela autora. Legenda: A – calo caulinar após quatro meses de subcultivo; B – calo foliar após dois meses de subcultivo. Barras = 5 mm.
5.3. Análise histológica dos calos caulinares e foliares
Os cortes histológicos dos calos caulinares e foliares de A. incisa,
analisados por microscopia de luz, são mostrados na Figura 4. O corante Azul de
Toluidina (AT) se liga a radicais aniônicos presentes, por exemplo, na pectina e
lignina encontradas na parede celular vegetal. Também pode interagir com os ácidos
nucleicos presentes no núcleo celular (SILVA et al, 1997). Tanto os calos caulinares
quanto os foliares apresentam pectina e lignina na sua composição, o que é
característico de célula vegetal, e que foi evidenciado pela coloração AT a pH 6,8.
Observou-se que ocorreu reação metacromática entre o corante e o material, e em
algumas regiões da parede celular a coloração se mostra mais azulada, enquanto
em outras ela se encontra em tom arroxeado. Essa diferença ocorre devido à
45
disponibilidade de pectina na organização do material para reagir com o corante.
Resultados semelhantes foram obtidos por Feitosa et al (2013), após a coloração de
amostras de calos de Jatropha curcas L., e por Barbosa et al (2005) ao estudar
calos de genótipos de Coffea.
O teste do PAS é capaz de detectar polissacarídeos neutros, os quais se
encontram em maior quantidade na parede celular e nos grânulos de amido
(CORTELAZZO, 1992). Ambos os calos avaliados apresentaram regiões com
grande concentração de polissacarídeos neutros, os quais provavelmente são
depósitos de amido, o que pode ser decorrente do intenso metabolismo desse
tecido. A parede celular também mostrou forte coloração após a realização do teste
do PAS, por conta da presença de celulose e hemicelulose, os quais são os
principais carboidratos que a constituem (GALLÃO et al, 2007).
Figura 4: Cortes longitudinais de calos foliares e caulinares de A. incisa após dois e quatro meses de subcultivo, respectivamente.
Fonte: Elaborado pela autora. Legenda: (A) Corte de calo caulinar corado com Azul de Toluidina pH 6,8, mostrando reação metacromática nas paredes e núcleos celulares. (B) Corte de calo foliar corado com Azul de Toluidina pH 6,8. (C) Corte de calo caulinar corado pelo teste do PAS. (D) Corte de calo foliar corado pelo teste do PAS. As regiões arroxeadas em (A) e (B), indicadas pelas setas pretas, representam os núcleos celulares. Os grânulos em (C) e (D), indicados pelas setas vermelhas, revelam a presença de
polissacarídeos neutros (amido).
46
A análise microscópica revelou que os calos caulinares e foliares não
apresentam distinção aparente. As duas colorações, no entanto, foram úteis para
demonstrar que os calos estudados se encontravam morfológica e histologicamente
com características de calos friáveis, apresentando parede celular fina, células
homogêneas, sem sinais de ruptura, com espaços vacuolares e com presença de
grânulos de polissacarídeos neutros. Essas características são relatadas por Gallão
et al (2010), Saeed e Shahzad (2015) e Ma et al (2015). Logo, pode-se afirmar que
os calos produzidos se encontram viáveis para a realização dos estudos posteriores.
5.4. Determinação de Proteínas Totais Solúveis
Os extratos totais de folha, caule, calos foliares e calos caulinares de A.
incisa foram analisados no equipamento NanoVue para quantificar as proteínas
totais de cada amostra. A opção “Protein UV” realiza a leitura em dois espectros de
absorbâncias, 260 nm e 280 nm, e fornece uma média dos resultados na
concentração de µg/µL (GE Healthcare Application Note, 2008). As análises foram
realizadas em duplicata. Os valores que se obteve estão descritos no quadro 3:
Quadro 3: Concentração de Proteínas Totais Solúveis determinada nos extratos de folha, caule, calos foliares e calos caulinares de A. incisa, através do NanoVue (GE Healthcare).
Material Vegetal Concentração de Proteínas Totais
Solúveis (µg/µL)
Extrato de folha 20,07
Extrato de calos foliares 16,85
Extrato de caule 15,97
Extrato de calos caulinares 0,75
*Cada análise foi realizada em duplicata.
Bala et al (2010) relatam que a quantidade de proteínas totais dos calos
de Pisum sativum (ervilha), oriundos de explante de semente, foi de 4,42 µg/µL,
enquanto o tecido original possuía 9,49 µg/µL. Já Gupta e Srivastava (1998)
descrevem que, para Zizyphus mauritiana, os calos obtidos de folhas cotiledonares
apresentavam 9,58 µg/µL de proteínas totais, enquanto a semente apresentava
19,16 µg/µL. Silva et al (2003) relatam uma baixa concentração no conteúdo de
proteínas totais dos calos de Abrus pulchellus, com valor de 0,44 µg/µL. Logo, a
quantidade de proteínas totais de um tecido vegetal e dos calos oriundos varia muito
47
de espécie para espécie. Contudo, o tecido original costuma apresentar valores
maiores de proteína, que pode ser decorrente da diferenciação do tecido. Neste
trabalho, a quantidade de proteínas detectadas nos calos foliares foi bastante
superior ao encontrado em calos caulinares. Essa discrepância pode ser devida a
própria diferença entre os tecidos de calos. Esse fato condiz com o que é descrito
por Santos et al (2008), que acompanharam os teores de proteínas totais de calos
formados a partir de segmentos foliares e nodais de Coffea canephora 'Apoatã'
durante 84 dias. Durante todo o experimento, os calos foliares mostraram maior
quantidade de proteínas em relação aos nodais. Portanto, diferenças significativas
na quantidade de proteínas detectadas entre calos oriundos de diferentes explantes
podem ocorrer numa mesma espécie.
5.5. Análise Proteômica
A partir da análise das amostras de caule, folha, calos foliares e calos
caulinares de A. incisa, e identificação por espectrometria de massas, pôde-se
observar que a lista de picos obtidas representa fragmentos iônicos das amostras
digeridas, e, ao ser associada ao banco de dados de proteínas do NCBI, mostrou
identidade com peptídeos de algumas proteínas vegetais já relatadas.
A análise qualitativa dos peptídeos das amostras de calos em outras
plantas é sustentada pelo padrão proteico diferenciado que este tecido apresenta
em relação ao explante original (YIN; LAN; ZHU, 2008). Apesar da baixa
similaridade entre os peptídeos das amostras estudadas em relação às proteínas
relatadas no banco de dados, pode-se sugerir que há a presença de proteínas
vegetais diversas nos calos produzidos in vitro, e que estas proteínas podem estar
totalmente ou parcialmente processadas.
5.5.1. Caule
Nos peptídeos identificados na amostra de caule de A. incisa L. (Quadro
4), foi observada a presença de uma proteína relacionada à defesa vegetal, a
quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G. De acordo com Sun et
al (2013), o gene que codifica para essa proteína (GsSRK), em Glycine soja,
apresentou maiores níveis de expressão quando exposta a estresses salino, de
seca, e indução com ácido abscísico (ABA). Além disso, eles demostraram que a
48
superexpressão desse gene em Arabidopsis thaliana promoveu a germinação da
semente, o enraizamento primário e o crescimento foliar durante os estágios iniciais
do estresse salino. Portanto, essa proteína, em A. incisa L., deve apresentar o
mesmo papel de tolerância ao estresse salino e de seca.
Duas proteínas relacionadas ao crescimento também foram detectadas
nos extratos de caule. Uma delas é a helicase DEAD/DEAH box. Diferentes
proteínas DEAD-box podem ser encontradas nos eucariotos, e elas apresentam
funções importantes no metabolismo do RNA, incluindo transcrição, splicing,
biogênese ribossomal, tradução, dentre outras (LINDER, 2006).
A segunda proteína é a queuine tRNA-ribosiltransferase, também
conhecida como tRNA-guanina transglicosilase, é uma enzima que atua na
incorporação da base queuine no tRNA. Queuine é uma base hipermodificada que
ocorre na posição instável dos anticódons dos tRNAs de aspartato, asparagina,
histidina e tirosina. Alguns estudos sugerem que a queuine apresenta importantes
efeitos na fisiologia de eucariotos, independente do papel do tRNA. Alguns destes
efeitos estão relacionados com a distribuição da isoenzima lactato desidrogenase,
padrões de fosforilação proteica e na modulação da proliferação celular (REUYL,
2003; TODOROV; GARCIA, 2006).
49
Quadro 4: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de caule de A. incisa.
Massa Molecular Calculada
pI Calculado
Score ID Sequência de Peptídeos
Descrição e Origem das Proteínas Identificadas
1 870 6.18 62 gi|460366084 KDGVLSPR Proteína quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G (Solanum lycopersicum)
2 1954 5.67 56 gi|255085454 NKWHIIVEGVDIPPPIK
DEAD/DEAH box helicase (Micromonas sp. RCC299)
3 1955 5.44 56 gi|303282327 DKWHIIVEGVDIPPPIK
DEAD/DEAH box helicase (Micromonas pusilla CCMP1545)
4 1228 5.76 45 gi|743802237 NFDDKYTPTK Queuine tRNA-ribosiltransferase-like isoforma X1 (Populus euphratica)
5 1074 5.87 18 gi|168003513 ADSQISSPDR Proteína deduzida (Physcomitrella patens)
6 1097 9.14 18 gi|242046094 ALKALSPDQR Proteína hipotética SORBIDRAFT_02g037480 (Sorghum bicolor)
*Estas proteínas foram caracterizadas pela massa molecular e pI calculados, sequências dos peptídeos incomuns, o número de entrada no NCBI, e a
origem.
50
5.5.2. Calos caulinares
Dentre as proteínas relacionadas aos peptídeos detectados nos calos
caulinares de A. incisa (Quadro 5), a catalase foi identificada. Essa proteína
apresenta um papel importante no mecanismo de defesa vegetal, pois atua na
redução do dano oxidativo causado por estresses bióticos e abióticos (CHELIKANI;
FITA; LOEWEN, 2004).
A quitinase também está relacionada com o mecanismo de defesa
vegetal, pois é capaz de hidrolisar as ligações glicosídicas da quitina. Esse
carboidrato faz parte da composição estrutural de vários patógenos de plantas, em
especial os fungos (VAN LOON; REP; PIETERSE, 2006).
Outra proteína identificada que está relacionada com a defesa vegetal é a
glucan endo-1,3-β–glucosidase, também conhecida como β-1,3-glucanase. Essa
enzima está envolvida na hidrólise de β-D-glucanas, e esse carboidrato é
encontrado na parede celular fúngica (BARBOSA et al, 2004). Portanto, essa enzima
atua de forma a evitar a infecção por fungos.
A frutose-bifostato aldolase é uma enzima encontrada na glicólise,
enquanto a glutamato carboxipeptidase e a aspartato-semialdeído desidrogenase
estão relacionadas ao metabolismo das proteínas. Tan et al (2013) relatam que
enzimas do metabolismo energético são encontradas em abundância em tecidos de
calos em função da intensa atividade metabólica, devido ao seu rápido crescimento
e divisão celular.
51
Quadro 5: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de calos caulinares de A. incisa após seis
meses de subcultivo.
Massa Molecular Calculada
pI Calculado
Score ID Sequência de Peptídeos Descrição e Origem das Proteínas Identificadas
1 2250 7.40 123 gi|115679 GFFEVTHDVSHLTCADFLREGNFDLVGNNMPVFFIR
Catalase isoenzima 1 (Zea mays)
2 2250 6.87 109 gi|5759096 GFFEVTHDVSHLTCADFLREGNFDIVGNNFPVFFIRDEEVDYFPSR
Catalase CAT 1 (Manihot esculenta)
3 1345 6.49 104 gi|2213867 GILAADESTGTIGKVAPEVIAEYTVR
Frutose-bifosfato aldolase (Mesembryanthemum crystallinum)
4 1331 6.56 85 gi|719974028
GILAADESTGTIGKVAPEVVAEYTVRANSEATLGSYK
Frutose-bifosfato aldolase isoenzima citoplasmática-like (Nelumbo nucifera)
5 1128 5.85 84 gi|733408561
SADLIDALGVR Glutamato carboxipeptidase (Microbacterium mangrovi)
6 2226 5.33 82 gi|63253782
EAIGSFSVIYDLNGEPFSGPK Lectina KM+ (Artocarpus integer)
7 1459 6.77 80 gi|1168410 LSSINVENVESNR Frutose-bifosfato aldolase isoenzima citoplasmática 2 (Pisum sativum)
8 1567 4.26 76 gi|62825470
NTDSEEEIKEAFR Calmodulina parcial (Obelia dichotoma)
9 1469 6.12 74 gi|763760850
SVELLQGDGGPGTIK Proteína hipotética B456_005G063600 (Gossypium raimondii)
10 1168 4.97 72 gi|497334562
QDLPALALDGR Aspartato-semialdeído desidrogenase (Actinomyces sp. ICM47)
11 1209 6.23 69 gi|114408 VVDALGVPIDGR Subunidade alfa da ATP sintase mitocondrial (Oenothera biennis)
12 2002 8.05 66 gi|227774 LPGYGVITNIINGGLECGR Quitinase básica (Arabidopsis thaliana)
13 1983 6.75 61 gi|16215 EGNFDLVGNNFPVFFIR Catalase (Arabidopsis thaliana)
14 1306 5.20 59 gi|729375836
AGMEMALIDAAAK L-Ala-D/L- amino ácido epimerase isoforma X1 (Tarenaya hassleriana)
15 1155 5.13 57 gi|288557884
IIEGDGGPGTIK Proteína relacionada à patogênese 10.6 (Vitis vinifera)
52
16 1440 5.51 57 gi|674903250
REIMVDGEEHAR BnaA01g19050D (Brassica napus)
17 1259 8.99 52 gi|640925577
TNMYLSLQFK Proteína dedos de zinco C6 (Colletotrichum sublineola)
18 1328 9.27 49 gi|703076038
DISLDYALFRTYNNNLVQHVKHWGLFLPNK
Glucan endo-1,3-beta-glucosidase, isoforma básica (Morus notabilis)
19 1025 7.07 47 gi|930750741
MGMGGLPMGK Proteína quinase alfa 3-like isoforma X2 (Haplochromis burtoni)
20 2139 4.55 45 gi|913330960
LRAEETQPEVAQEDSNPAR Proteína não-caracterizada LOC106140052 (Amyelois transitella)
*Estas proteínas foram caracterizadas pela massa molecular e pI calculados, sequências dos peptídeos incomuns, o número de entrada no NCBI, e a
origem.
53
É válido ressaltar a presença de peptídeos relacionados à lectina KM+
(ROSA et al, 1999), uma lectina manose-ligante das sementes de Artocarpus
integrifolia. A presença de uma lectina manose-ligante indica uma possível
associação a um mecanismo de defesa, pois é relatado que o efeito inseticida de
lectinas pode ser primariamente determinado pela ligação a estruturas glicosiladas
no intestino dos insetos, causando inibição da absorção de nutrientes e/ou
destruição das células intestinais (VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004). Essa
característica é válida no tecido estudado, já que o calo, na sua ocorrência natural,
acontece em situações de injúria. Yin et al (2008) detectaram uma lectina ligante a
manose em calos de arroz, e sugerem que esta proteína apresenta também um
papel chave na diferenciação dos calos.
Monteiro-Moreira (2002) relata a presença de uma lectina manose-ligante
nas sementes de A. incisa, a qual foi denominada frutapina, e que é expressa em
pequenas quantidades. Contudo, a sequência dessa proteína e sua estrutura
tridimensional ainda não foram elucidadas. Todavia, sabendo-se que a jacalina,
proteína galactose ligante de A. integrifolia, apresenta grande similaridade estrutural
com a frutalina, proteína galactose-ligante de A. incisa (MONTEIRO-MOREIRA et al,
2015), pode-se sugerir que a KM+ detectada nas amostras de calos seja, na
verdade, a frutapina, e que ambas também apresentam grande similaridade
estrutural.
Outra proteína relevante é a calmodulina, que está envolvida no processo
de sinalização celular mediada por íons cálcio. A calmodulina está envolvida em
diversos processos celulares, dentre eles pode-se citar a imunidade inata (MA et al.,
2008), respostas induzidas por hormônios (LUAN et al., 2002), patogênese e
cicatrização (YAMANAKA et al., 2001), e resposta hipersensitiva (BLUME et al.,
2000). Considerando-se que, para a formação de calos na cultura in vitro, é
necessário que haja a estimulação com o uso de fitohormônios, como auxinas e
citocininas, pode-se sugerir que a calmodulina tenha um papel envolvido na
sinalização desses hormônios ao tecido vegetal, induzindo a desdiferenciação e
favorecendo o crescimento dos calos.
Proteínas dedos de zinco estão entre as proteínas mais abundantes do
genoma de eucariotos. Apresentam diversas funções, como reconhecimento de
54
DNA, empacotamento de RNA, ativação transcricional, regulação da apoptose,
enovelamento e montagem de proteínas, e ligação a lipídeos (LAITY; LEE;
WRIGHT, 2001). Considerando-se essas funções, essa proteína pode estar
envolvida no crescimento e manutenção dos calos, pois desempenha papéis
essenciais na regulação do metabolismo.
5.5.3. Folha
Dentre as proteínas relacionadas aos peptídeos identificados na amostra
de folha de A. incisa (Quadro 6), a proteína glutamato carboxipeptidase é conhecida
por atuar no metabolismo das proteínas, e também foi detectada nos calos
caulinares.
A proteína taumatina-like está incluída no grupo das proteínas
relacionadas à patogênese (PR-proteínas) e, nas plantas, ela atua na defesa do
hospedeiro, especialmente contra fungos patogênicos. Seu mecanismo antifúngico
está relacionado a uma variedade de atividades enzimáticas, dentre ela está incluída
a glucanase, que atua na parede celular de fungos (LIU; STURROCK;
EKRAMODDOULLAH, 2010).
A zeamatina também está incluída no grupo das proteínas taumatina-like,
apresentando, portanto, atividade antifúngica (BATALIA et al, 1996).
A proteína S-isoprenilcisteína metiltransferase está envolvida na
modificação pós-traducional de proteínas que apresentam a terminação CaaX (C é
uma cisteína, A é um aminoácido alifático, e X é um dos demais aminoácidos). Essa
modificação ocorre, por exemplo, em proteínas da família Ras, as quais estão
relacionadas com o crescimento celular, diferenciação e sobrevivência (HRYCYNA
et al, 1991).
De modo geral, nos peptídeos detectados na amostra de folha de A.
incisa, poucas proteínas foram identificadas. O baixo número de proteínas
identificadas pode ser associado à dificuldade de extração e identificação proteica
no tecido, da mesma forma como ocorreu no caule.
55
Quadro 6: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de folhas de A. incisa.
Massa Molecular Calculada
pI Calculado
Score ID Sequência de Peptídeos
Descrição e Origem das Proteínas Identificadas
1 1128 5.85 90 gi|733408561 SADLIDALGVR Glutamato carboxipeptidase (Microbacterium mangrovi)
2 1479 4.90 75 gi|17978815 CPQAYSYAYDDK
Proteína taumatina-like (Daucus carota)
3 1287 5.06 69 gi|255538966 FSCLTGDCGSGK
Precursor zeamatina (Ricinus communis)
4 1260 9.28 53 gi|750321973 APMSKIDSCPR Proteína S-isoprenilcisteína metiltransferase (Sphingobium lactosutens)
*Estas proteínas foram caracterizadas pela massa molecular e pI calculados, sequências dos peptídeos incomuns, o número de entrada no NCBI, e a
origem.
56
5.5.4. Calos foliares
Nos peptídeos identificados na amostra de calos de folha de A. incisa
(Quadro 7), foi observada a presença de proteínas como a KM+, frutose-bifosfato
aldolase e calmodulina, as quais também foram encontradas nos tecidos de calos
caulinares. A presença desses peptídeos reforça seus papéis descritos
anteriormente nos tecidos de calos, independentemente de sua origem.
A proteína quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G foi
detectada também nos extratos de caule, e ela provavelmente deve manter a sua
função de tolerância a estresses abióticos nos tecidos de calos.
A proteína homóloga de resistência à infecção tardia R1A-3 confere
resistência a patógenos que transportam o gene de avirulência Avr-1. Proteínas
dessa classe protegem a planta contra patógenos que contêm uma proteína de
avirulência específica, através da interação indireta com esta proteína. Isso
desencadeia um sistema de defesa, incluindo a resposta de hipersensibilidade, a
qual restringe o crescimento do organismo infectante (KUANG et al, 2005).
Proteínas osmotina-like fazem parte da família das PR-proteínas. Seu
mecanismo de ação relacionado à defesa vegetal ainda não está completamente
elucidado, contudo estudos mostraram que elas conferem resistência a estresses
abióticos, especialmente tolerância à seca e à salinidade (WEBER et al, 2014).
57
Quadro 7: Lista de proteínas identificadas por espectrometria de massas ESI-QUAD-TOF a partir do extrato total de calos foliares de A. incisa após seis
meses de subcultivo.
Massa Molecular Calculada
pI Calculado
Score ID Sequência de Peptídeos
Descrição e Origem das Proteínas Identificadas
1 2226 5.33 122 gi|63253782 EAIGSFSVIYDLNGEPFSGPK
Lectina KM+ (Artocarpus integer)
2 1345 6.49 65 gi|2213867 GILAADESTGTIGKVAPEVIAEYTVR
Frutose-bifosfato aldolase (Mesembryanthemum crystallinum)
3 1128 9.19 58 gi|145347856 SLDALDAIGVR Proteína deduzida (Ostreococcus lucimarinus CCE9901)
4 870 6.18 56 gi|460366084 KDGVLSPR Proteína quinase serina/treonina com receptor S-like e lectina tipo G (Solanum lycopersicum)
5 1128 6.33 55 gi|971573908 SADILADRLR Proteína homóloga de resistência à infecção tardia (Solanum tuberosum)
6 1625 8.52 51 gi|848856255 MDIATTFFPSNNPR
Proteína não-caracterizada LOC105975214 (Erythranthe guttata)
7 1808 4.18 49 gi|16223 VFDKDQNGFISAAELR
Calmodulina (Arabidopsis thaliana)
8 1791 7.55 48 gi|34538350 NECPYTVWAAASPGGGR
Proteína osmotina-like II (Gossypium hirsutum)
*Estas proteínas foram caracterizadas pela massa molecular e pI calculados, sequências dos peptídeos incomuns, o número de entrada no NCBI, e a
origem.
58
5.6. SDS-PAGE e Atividade Hemaglutinante
A abordagem proteômica permitiu a detecção de diversas proteínas,
contudo, pode-se ressaltar a possível presença da lectina frutapina, similiar à KM+,
como foi relatado para os tecidos de calos, e a qual não foi detectada nos tecidos
originais. Com o intuito de aprofundar os estudos na identificação dessa lectina,
realizou-se ensaios preliminares de eletroforese e atividade hemaglutinante. A
eletroferese da amostra de calo de origem caulinar permitiu a visualização de uma
banda proteica que se encontra em posição intermediária entre as bandas
características da frutalina, estando mais próxima da banda de 15 kDa (Figura 5).
Barre et al. (2004), ao caracterizar a lectina KM+, demonstraram que a eletroforese
dessa proteína também apresenta uma única banda, e que esta também se
encontra em posição intermediária às bandas da jacalina, que estão nas posições de
15 e 18 kDa. Além disso, a atividade hemaglutinante demonstrou que as amostras
de calos caulinares e calos foliares apresentaram aglutinação até a diluição 1/16. Os
resultados obtidos pela análise proteômica, eletroforese e atividade hemaglutinante
fornecem indícios de que há a presença de uma lectina similar à KM+ nos calos, e a
qual já foi detectada nas sementes de A. incisa por Monteiro-Moreira (2002), sendo
denominada frutapina.
Figura 5: SDS-PAGE de amostra de calo caulinar de A. incisa após seis meses de subcultivo, e frutalina purificada (controle). Comparação com a eletroforese realizada por Barre et al. (2004) com a lectina KM+ purificada de A. integrifolia, utilizando jacalina como controle.
Fonte: Elaborado pela autora. Fonte: Barre et al., 2004.
Legenda: O retângulo preto indica a banda proteica da possível lectina (frutapina) encontrada no tecido de calo.
59
5.7. Considerações finais
De modo geral, a detecção de proteínas nas amostras dos tecidos
originais foi maior do que nos tecidos de calos. Esse fato pode ter sido ocasionado
pela diferença do material ou pela metodologia de extração utilizada, a qual foi
maceração em nitrogênio líquido e centrifugação. A maceração pode ser um método
ineficaz de extração proteica, e por isso a digestão tríptica não foi capaz de fornecer
peptídeos que fossem similares aos depositados no banco de dados. A extração foi
a mesma utilizada nos tecidos de calos, mas para o tecido original pode-se sugerir a
integração do método de maceração e centrifugação com outras metodologias que
tornem a extração mais eficiente. Contudo a análise proteômica mostrou-se
relevante na caracterização dos calos e dos tecidos, pois mostrou a eficiência da
extração em cada tecido, identificou peptídeos relacionados a proteínas únicas de
cada tipo de amostra, e principalmente, identificou proteínas comuns entre eles. A
abordagem também possibilitou visualizar possíveis papéis fisiológicos das
proteínas dos calos, as quais apresentaram papéis principalmente relacionados à
defesa. Esse fato pode ter relação com a função dos calos na natureza, o qual é
produzido em situações de injúria.
O estudo proteômico, aliado à análise eletroforética e à atividade
hemaglutinante, mostraram fortes indício da presença da lectina frutapina nos
tecidos de calos, reforçando a importância da presença de uma lectina manose-
ligante no desenvolvimento desse tecido.
O estudo desenvolvido pode ser complementado com outras
perspectivas, como a visualização deste painel proteico por eletroforese
bidimensional, além de sugerir a otimização de métodos de extração, investigação
de outros tecidos, investigação de DNA e RNA de moléculas de interesse no tecido,
ensaios de atividade biológica, dentre outros.
60
6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho mostram a eficiência na metodologia
de produção de calos caulinares e foliares de A. incisa, apesar das dificuldades
apresentadas para espécies lenhosas, pois conseguiu-se um percentual de
produção de 88%. A quantificação de proteínas totais mostrou que os explantes de
caule e folha apresentam maior quantidade de proteínas quando comparados com
os calos, e esse fato pode estar relacionado com o grau de diferenciação do tecido.
A análise histológica não revelou diferenças entre os calos caulinares e foliares,
contudo, foi útil para mostrar que as células apresentavam características de calos
friáveis e em pleno crescimento. A abordagem proteômica permitiu identificar
peptídeos que apresentam similaridade com proteínas vegetais descritas, e
identificou maior número de proteínas nos calos do que nos tecidos originais. Pode-
se destacar a presença de uma lectina semelhante à KM+ em ambas as amostras
de calos, o que pode ser um indício da presença de frutapina nos calos. Essa
suspeita foi reforçada com os ensaios preliminares de eletroforese e atividade
hemaglutinante, o que leva a crer que essa lectina apresenta um importante papel
fisiológico no desenvolvimento desse tecido. Além disso, a proteômica permitiu a
detecção de diversas proteínas relacionadas à defesa vegetal, e esse fato pode ter
relação com o papel dos calos na natureza, pois são tecidos encontrados em
situações de injúria. Portanto, o presente trabalho serviu como um passo inicial para
o entendimento da bioquímica e fisiologia dos calos de A. incisa L., e fornece uma
base para estudos mais aprofundados desse tecido e das proteínas que o
constituem.
61
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