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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR - LABOMAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
ROSA HELENA REBOUÇAS
COLONIZAÇÃO DE TECIDOS E LÍQUIDO CORPÓREO DO CAMARÃO
Litopenaeus vannamei POR Vibrio parahaemolyticus AUTÓCTONE DO AMBIENTE DE
CULTIVO
FORTALEZA
2017
ROSA HELENA REBOUÇAS
COLONIZAÇÃO DE TECIDOS E LÍQUIDO CORPÓREO DO CAMARÃO
Litopenaeus vannamei POR Vibrio parahaemolyticus AUTÓCTONE DO AMBIENTE DE
CULTIVO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Marinhas Tropicais da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial à obtenção do título de doutor. Área de
concentração: Utilização e manejo de
ecossistemas marinhos e estuarinos.
Orientador: Profa. Dra. Oscarina Viana de
Sousa.
Coorientador: Profa. Dra. Regine Helena Silva
dos Fernandes Vieira.
FORTALEZA
2017
___________________________________________________________________________
Página reservada para ficha catalográfica que deve ser confeccionada após apresentação e
alterações sugeridas pela banca examinadora.
Para solicitar a ficha catalográfica de seu trabalho, acesse o site: www.biblioteca.ufc.br, clique
no banner Catalogação na Publicação (Solicitação de ficha catalográfica)
___________________________________________________________________________
ROSA HELENA REBOUÇAS
COLONIZAÇÃO DE TECIDOS E LÍQUIDO CORPÓREO DO CAMARÃO
Litopenaeus vannamei POR Vibrio parahaemolyticus AUTÓCTONE DO AMBIENTE DE
CULTIVO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor. Área
de concentração: Utilização e manejo de ecossistemas marinhos e estuarinos.
Aprovada em: 23/06/2017.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profa. Dra. Oscarina Viana de Sousa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Prof. Dr. Vicente Vieira Faria
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Dra. Francisca Gleire de Rodrigues Menezes
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Prof. Dr. Pedro Carlos Cunha Martins
Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA)
_________________________________________
Profa. Dra. Renata Albuquerque Costa
Faculdades INTA - Sobral
Dedico esse trabalho à
“Mamãezinha querida”, minha maior
incentivadora.
AGRADECIMENTOS
A jornada percorrida para obtenção do título de Doutora em Ciências Marinhas Tropicais
não foi um caminho solitário. Foram muitas as pessoas que contribuíram, torceram, incentivaram e
inspiraram na realização desta conquista. Primeiramente agradeço a Deus pelo discernimento e pela
força a mim concedidos, sem Sua presença em minha vida não haveria vitória.
Minha gratidão especial a profissional que me inspirou a seguir o “caminho da
microbiologia”: Professora Regine Helena S. dos F. Vieira. Sua paixão e competência na arte de
ensinar me encantaram no primeiro dia de aula na disciplina Microbiologia do Pescado no curso de
Engenharia de Pesca. Obrigada por mais uma vez abrir as portas do seu laboratório e da sua
convivência. “Uma vez reginete, sempre reginete”.
Minha querida orientadora Professora Oscarina Viana de Sousa: quando crescer, eu quero
ser igual a você! Partilhar da sua companhia, amizade e sabedoria é uma grande felicidade. A você
todo meu respeito e admiração. Muito obrigada por tudo.
Muito obrigada a toda equipe da Central Analítica da UFC por me receber e acompanhar
nas análises com todo zelo e responsabilidade.
Minha gratidão às pessoas que fazem parte do Laboratório CEDECAM/CEAC: Gracinha,
Renata, Jamille, Fagner, Rubens, em especial ao Professor Rodrigo Maggioni.
Aos professores Alberto Nunes (LABOMAR-UFC), Luis Fernando Marins (FURG) e
Hassan Sabry pela doação dos animais, ração e demais materiais necessários para execução deste
trabalho.
À minha família de coração que me acolheu e colaborou durante a realização dos
experimentos desta tese... por ordem alfabética agradeço à: Francisco Silvanio, Giselle, Graciene
Fernandes, Hemilly Praxedes, Italo Magno, Jamille, Jéssica Lucinda, Jéssica Frota, Juliana e Diego,
Karla Catter, Mariana Lima, Mariana Franco, Rafael Sanro, Raul Vitor, Rebeca, Rubson Mateus,
Thiara Amaral. Em especial, as minhas irmãs de coração Fátima Cristiane, Francisca Gleire e Jade
Abreu, contar com a amizade de vocês é muito importante para mim. À Marina Tereza, partilhar da
sua experiência como pessoa e pesquisadora contribuíram para meu engrandecimento pessoal e
profissional. Gracias por las lecciones de español.
Durante os experimentos no CEAC tive a colaboração da administradora Ariana, dos
auxiliares de serviços gerais, Samara e Seu Zé. Obrigada pelo apoio e prontidão para ajudar.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram com esta tese meu MUITO
OBRIGADA!
RESUMO
A atividade de carcinicultura no nordeste do Brasil vem sendo ameaçada pelo
desencadeamento de doenças de origem viral e bacteriana. Mundialmente, desde 2009, vem
acontecendo nos cultivos de camarão surtos de uma doença emergente conhecida como
“doença da necrose hepatopancreática aguda” (AHPND, sigla em inglês) tendo o V.
parahaemolyticus como agente etiológico. Essa infecção tem chamado a atenção de criadores
devido às elevadas taxas de mortalidade registradas nas larviculturas de camarão. As rotas de
invasão desse patógeno nos tecidos de camarões Litopenaeus vannamei não são conhecidos.
Seu entendimento é parte fundamental na compreensão dos mecanismos patogênicos, além de
contribuir com a elaboração de estratégias de prevenção contra surgimento da doença. Assim,
o objetivo desta pequisa foi o de monitorar as interações da bactéria V. parahaemolyticus na
hemolinfa e tecidos de juvenis do camarão L. vannamei. Para isso foi utilizada uma estirpe
marcada de V. parahaemolyticus em bioensaios de invasão, por imersão, em 20 juvenis de
camarões L. vannamei. Foram realizadas análises microbiológicas e microscópicas das
amostras de fluido e tecidos. As amostragens foram realizadas nos tempos 0, 24, 48 e 72h
após a inoculação. Não foi detectada a presença de bactérias do gênero Vibrio na hemolinfa
pelas contagens com meio de cultura Agar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS) para os
animais oriundos dos tanques controle negativo e experimental. Foram detectadas contagens
de Vibrio spp. nas amostras de hepatopâncreas dos tanques controle negativo e experimental:
(0h: 2,2 logUFC/g e 24h: 0,6 logUFC/g); (0h: 0,3 logUFC/g e 48h: 1,1 logUFC/g) e para
amostras do intestino (24h: 1 logUFC/g); (0h: 0,7 logUFC/g e 24h: 0,6 logUFC/g). As
contagens de V. parahaemolyticus resultaram na detecção da bactéria nos tecidos do
hepatopâncreas (48h: 0,7 logUFC/g e 72h: 0,8 logUFC/g) e intestino médio (72h: 0,7
logUFC/g) para os animais do experimento desafio. Por meio das análises microscópicas,
observamos coerência entre as contagens em placas e a presença bacteriana nos tecidos. A
colonização tecidual pelo V. parahaemolyticus acontece de maneira diferenciada, com fixação
em um primeiro momento nos tecidos do intestino médio seguida de uma instalação tecidual
mais intensa no hepatopâncreas. A partir desse protocolo outras possibilidades e abordagens
se tornam viáveis usando o V. parahaemolyticus como indicador, viabilizando o
acompanhamento da colonização do organismo e análise paralela dos mecanismos
imunológicos de camarões e favorecendo o desenvolvimento de tecnologias para prevenção
ou tratamento de eventos de vibrioses nos cultivos de camarão.
Palavras-chave: Aquicultura. Patologia. Microscopia ótica.
ABSTRACT
Shrimp farming activity in Northeast Brazil has been threatened by viral and bacterial
diseases outbreaks. In a world scale, since 2009, shrimp farms have been emerging from an
emerging disease known as "acute hepatopancreatic necrosis disease" (AHPND), with V.
parahaemolyticus as the etiological agent. This infection has attracted the attention of farmers
because of the high mortality rates recorded in shrimp larvae. Invasion routes of this pathogen
in Litopenaeus vannamei shrimp tissues are not very clear. The comprehension of such routes
is fundamental to understand its pathogenic mechanisms, as much as for contributing to the
elaboration of strategies in order to prevent the further outbreaks. Thus, the objective of this
study was to monitor interactions of V. parahaemolyticus in the hemolymph and young tissues
of L. vannamei shrimp. In order to proceed with this, a strain of V. parahaemolyticus was
used, by immersion, in 20 young L. vannamei shrimps. Microbiological and microscopic
analyzes of fluid and tissue samples were performed. Samples were taken at 0, 24, 48 and 72
h after inoculation. Presence of bacteria of the Vibrio genus in the hemolymph was not
detected by the counts with Thiosulfate Citrate Bile Sucrose (TCBS) medium for the animals
from the negative and experimental control tanks. Counts of Vibrio spp. were detected in
hepatopancreas samples from negative and experimental control tanks: (0h: 2.2 logCFU / g
and 24h: 0.6 logCFU / g); (0h: 0.3 logCFU / g and 48h: 1.1 logCFU / g) and for intestine
samples (24h: 1 logCFU / g); (0h: 0.7 logCFU / g and 24h: 0.6 logCFU / g). Count of V.
parahaemolyticus resulted in the detection of the bacterium in hepatopancreas tissues (48h:
0.7 logCFU / g and 72h: 0.8 logCFU / g) and medium intestine (72h: 0.7 logCFU / g) for
challenge experiment. By microscopic analysis, we observed a consistency between plaque
counts and bacterial presence in tissues. Tissue colonization by V. parahaemolyticus occurs in
a differentiated way, with fixation at first in the tissues of the midgut followed by a more
intense tissue installation in the hepatopancreas. From this protocol, other possibilities and
approaches become viable using V. parahaemolyticus as an indicator, such as monitoring the
organism's colonization, and the parallel analysis of the immunological mechanisms of
shrimp, favoring the development of technologies in order to prevent or treat vibriosis events
in shrimp culture.
Keywords: Aquaculture. Pathology. Optical microscopy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Representação esquemática do sistema digestório de camarão
peneídeo............................................................................................... 25
Figura 02 Diagrama simples de um vetor de clonagem....................................... 28
Figura 03 Ilustração esquemática do plasmídio Psonda-ZsGreen1-Dr................. 33
Figura 04 Fluxograma do processo de competência celular para estirpes do
gênero Vibrio de acordo com Panda (1991)......................................... 35
Figura 05 Fluxograma do processo de transformação celular............................... 35
Figura 06 Fluxograma dos testes para expressão da fluorescência das colônias
transformadas...................................................................................... 37
Figura 07 Fluxograma do protocolo de lavagens celulares utilizando meio de
cultura com baixa indução de fluorescência........................................ 40
Figura 08 Fluxograma do teste desafio com V. parahaemolyticus (106T) e
camarões L. vannamei.......................................................................... 41
Figura 09 Imagens do processamento das amostras do camarão Litopenaeus
vannamei e disposição dos tecidos no interior das lamínulas em
câmara (Lab-Tek).............................................................................. 44
Figura 10 Perfil eletroforético da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) de
cinco cepas classificadas fenotipicamente como Vibrio
parahaemolyticus com os primers do gene tl utilizado para detectar a
espécie. Os padrões P1 e P2 são, respectivamente, gene tl e Vibrio
parahaemolyticus IOC 18950............................................................... 45
Figura 11 Verificação a integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr diluído em
diferentes concentrações....................................................................... 47
Figura 12 Eletroforese em gel de agarose do produto de PCR de DNA Total e
Plasmidial de V. parahaemolyticus (106; 106T), Vibrio sp. (195T) e
E. coli (V517; V517T).......................................................................... 49
Figura 13 Fluorescência celular apresentada por células de V.
parahaemolyticus (106; 106T) e E. coli (V517T) corados com
laranja de acridina (a) e sem adição de corantes
(b).......................................................................................................... 50
Figura 14 Contagens de colônias bacterianas em meio seletivo para gênero
Vibrio com e sem adição de antibiótico oriundas de amostras de
hepatopâncreas, intestino médio e hemolinfa de camarão L.
vannamei desafiados com V parahaemolyticus (106T)........................
53
Figura 15 Imagens dos esfregaços das amostras de hemolinfa extraídas de
camarão L. vannamei analisadas em microscópio confocal Zeiss
(modelo LSM 710 – Alemanha)........................................................... 56
Figura 16 Imagens das amostras de hepatopâncreas extraídas de camarão L.
vannamei analisadas em microscópio confocal (modelo LSM 710 –
Alemanha)........................................................................................... 57
Figura 17 Imagens das amostras de intestino médio extraídas de camarão L.
vannamei analisadas em microscópio confocal (modelo LSM 710 –
Alemanha)........................................................................................... 57
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Bactérias do gênero Vibrio relacionadas como agentes etiológicos em
eventos de doenças ocorridas em cultivos de camarão.......................... 23
Quadro 2 Investigações realizadas sobre as rotas de invasão de estirpes
bacterianas do gênero Vibrio em camarão cultivado............................. 26
Quadro 3 Características dos isolados identificados bioquimicamente como V.
parahaemolyticus................................................................................... 30
Quadro 4 Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer tl.......... 31
Quadro 5 Concentrações dos reagentes utilizados na reação de PCR................... 38
Quadro 6 Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer
ZsGreen.................................................................................................. 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Resultado do antibiograma para verificação da sensibilidade das estirpes à
canamicina. 46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg Micrograma
µL Microlitro
ABCC Associação Brasileira de Criadores de Camarão
AHPND Doença da Necrose Hepatopancreática Aguda (sigla em inglês)
ampr Resistência à Ampicilina
AVIB Associação de Biologistas de Víbrio
B Branco
BA Bahia
CE Ceará
CEAC Centro de Estudos em Aquicultura Costeira
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DSMZ Coleção Germânica de Microorganismos e Culturas Celulares
EMS Síndrome da Mortalidade Precoce (sigla em inglês)
FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura
FURG Universidade Federal do Rio Grande
G Gravidade ou Gramas
GFP Proteína Verde Brilhante (sigla em inglês)
H Hora
HP Hepatopâncreas
INT Intestino Médio
IOC Instituto Oswaldo Cruz
kDa Kilodalton
L Litro
LAMAP Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado
LB Luria Bertani
M Marcador Molecular
Min Minuto
mL Mililitro
mM Milimolar
OD Densidade Ótica (sigla em inglês)
ORI Origem de Replicação
PBS Solução Salina Fosfatada (sigla em inglês)
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (sigla em inglês)
PE Pernambuco
RJ Rio de Janeiro
RPM Rotação Por Minuto
RN Rio Grande do Norte
QS Quorum Sensing
Seg Segundo
Spp Espécie
TCBS Tiossulfato Citrato Bile Sacarose
TE Tampão de Eluição
TBE Tris-Borato-EDTA
tdh Hemolisina Termoestável Direta
tl Hemolisna Termolábil
trh Hemolisina Termoestável Relacionada a Hemolisina
TSA Ágar Triptona Soja (sigla em inglês)
UFC Unidade Formadora de Colônia
UV Ultravioleta
V Volts
YNB Yeast Nitrogen Base
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
® Marca Registrada
CaCL2 Cloreto de Cálcio
H2O Água
HCl Ácido Clorídrico
MgCl2 Cloreto de Magnésio
NaCl Cloreto de Sódio
ºC Grau Célsius
p/v Relação Peso Volume
U$ Dólar
λ Comprimento de Onda
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 14
1.1 OBJETIVOS............................................................................................ 16
1.1.1 Objetivo geral........................................................................................... 16
1.1.2 Objetivos específicos................................................................................ 16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................. 17
2.1 O gênero Vibrio......................................................................................... 17
2.1.1 Vibrio parahaemolyticus........................................................................... 18
2.1.2
Mecanismos de patogenicidade bacteriana e defesa imunológica em
camarão....................................................................................................
19
2.1.3 Vibrioses na carcinicultura....................................................................... 21
2.1.4 Rotas de infecção de Vibrio spp. em camarão.......................................... 25
2.2 Transformação e manipulação bacteriana................................................. 27
2.2.1 Proteína verde fluorescente...................................................................... 28
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 30
3.1 Seleção das estirpes.................................................................................. 30
3.1.1 Identificação bioquímica e fatores de virulência...................................... 30
3.1.2 Caracterização genotípica dos isolados de V. parahaemolyticus............ 31
3.1.2.1 Extração do DNA...................................................................................... 31
3.1.2.2 Amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as
estirpes de V. parahaemolyticus................................................................
31
3.1.2.3 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene tl........................ 31
3.1.3 Perfil de sensibilidade à canamicina......................................................... 32
3.1.3.1 Antibiograma............................................................................................ 32
3.2 Vetor plasmidial........................................................................................ 32
3.2.1 Integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr.................................................... 33
3.3 Adaptação do protocolo de transformação do V. parahaemolyticus....... 34
3.3.1 Competência celular................................................................................. 34
3.3.2 Transformação celular.............................................................................. 35
3.3.3 Seleção dos transformados....................................................................... 36
3.3.4 Confirmação da transferência plasmidial por PCR................................. 38
3.3.4.1 Extração do DNA Plasmidial................................................................... 38
3.3.4.2 Extração do DNA Total............................................................................ 38
3.3.4.3 Amplificação por PCR para estirpes de V. parahaemolyticus
transformadas...........................................................................................
38
3.3.4.4 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene ZsGreen............. 39
3.3.5 Avaliação da fluorescência por microscopia ótica confocal................... 39
3.3.5.1 Redução da fluorescência induzida pelo meio de cultura e
autofluorescência......................................................................................
40
3.4 Teste desafio............................................................................................. 41
3.4.1 Teste desafio com Vibrio parahaemolyticus fluorescente........................ 41
3.4.1.2 Sinais patológicos externos dos animais.................................................. 42
3.4.2 Processamento das amostras..................................................................... 42
3.4.2.1 Coleta da hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas.......................... 42
3.4.3 Análises microbiológicas.......................................................................... 43
3.4.3.1 Contagens de Vibrio spp e Vibrio resistentes à canamicina...................... 43
3.4.4 Análise por microscopia ótica confocal.................................................. 43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 45
5.1 Escolha dos isolados................................................................................. 45
5.1.1 Sensibilidade à canamicina...................................................................... 46
5.2 Vetor plasmidial........................................................................................ 47
5.3 Adaptação do protocolo para transformação do V. parahaemolyticus.... 47
5.3.1 Processo de transformação e competência celular................................... 47
5.3.1.1 Seleção dos transformados....................................................................... 48
5.3.1.2 Confirmação da transferência plasmidial por PCR................................. 48
5.3.1.3 Avaliação da fluorescência celular por microscopia ótica confocal...... 49
5.4 Teste desafio com Vibrio parahaemolyticus fluorescente........................ 51
5.4.1 Sinais comportamentais............................................................................ 51
5.4.2 Análises microbiológicas.......................................................................... 52
5.5 Microscopia ótica confocal.................................................................... 55
6 CONCLUSÃO......................................................................................... 60
6.1 Considerações finais................................................................................. 60
7 REFERÊNCIAS...................................................................................... 61
14
1 INTRODUÇÃO
O camarão branco Litopenaeus vannamei é a espécie de maior importância
econômica, sendo a mais cultivada em todo o mundo (HUYNH et al., 2011). Nos anos de
2010 a 2015 o cultivo mundial dessa espécie produziu em média 3 milhões de toneladas,
arrecadando o equivalente a U$ 15 bilhões. Para o mesmo período, a média de produção de
camarão no Brasil foi de 69 mil toneladas, alcançando cifras de U$ 378 mil (FAO, 2017).
Apesar de seu potencial econômico a indústria aquicola vem sendo continuamente
ameaçada pelo surgimento de doenças resultando em produções ineficientes e consequente
redução nos lucros obtidos com essa atividade (MOSS et al., 2012; SOTO-RODRIGUEZ et
al., 2012).
Um aspecto no cultivo de camarões relacionado com a susceptibilidade a
doenças é o estresse animal provocado por perturbações das condições ecológicas nos
viveiros. Além do estresse ambiental, o desencadeamento das doenças na carcinicultura
pode ser estimulado pelas práticas de manejo que causam endogamia, diminuindo a
resistência aos patógenos (KAUTSKY et al., 2000; DOYLE, 2016).
A presença de patologias no camarão é um dos principais problemas enfrentado
pelos carcinicultores, implicando no aumento da taxa de mortalidade dos animais
cultivados e se refletindo diretamente na eficiência técnica do produtor (SILVA e
SAMPAIO, 2009). Entre essas patologias, a ocorrência de doenças infecciosas nos cultivos
de camarões marinhos teve um efeito devastador, causando colapso na produção de grandes
países produtores e desencadeando grandes perdas para a indústria. A partir de então, as
enfermidades passaram a ser vistas como um obstáculo econômico e uma ameaça a
viabilidade da atividade (NUNES e MARTINS, 2002).
Entre as enfermidades que acometem a carcinicultura, as de origens bacterianas
e virais são as que mais afetam o camarão de cultivo. Dentre as infecções de origem
bacteriana, destacam-se as vibrioses que são ocasionadas por micro-organismos
patogênicos e oportunistas encontrados na água e no sedimento, podendo também estar
presente na microbiota intestinal de camarões sadios (DOURADO, 2009). Recentemente,
algumas estirpes de Vibrio parahaemolyticus tem despertado atenção dos carcinicultores
devido estar relacionada como agente etiológico da Doença da Necrose Hepatopancreática
15
Aguda (AHPND) que surgiu emergencialmente na Ásia no ano de 2009 provocando
mortalidade em massa nos cultivos. (TRAN et al., 2013; DE LA PEÑA et al., 2015; LAI et
al., 2015). No Brasil esta enfermidade ainda não foi notificada. No entanto, a AHPND já foi
confirmada no México em 2013 e por se tratar de uma patologia mediada por plasmídio,
sua disseminação para outros países, incluindo o Brasil, pode ser uma questão de tempo
(NUNAN, 2014; DANGTIP et al., 2015; HAN et al., 2015).
Apesar da importância, pouco se sabe sobre a etiologia de algumas
enfermidades, incluindo as vibrioses o que significa incapacidade de resposta a eventos de
doenças (MENDES et al., 2009). Estudos sobre as rotas de infecção de bactérias do gênero
Vibrio são ainda limitados. A geração de conhecimento nessa área é fundamental para a
compreensão da etiologia e patogênese das doenças e dos fatores determinantes para o
desencadeamento no ambiente de cultivo, com consequente desenvolvimento de novas
estratégias de controle dessas infecções. Essas pesquisas sobre as vias de infecção devem
ser realizadas com a utilização de novas tecnologias e protocolos, incluindo bactérias
geneticamente marcadas, com o uso de proteína fluorescente, microscopia eletrônica de
transmissão e hibridização in situ (AGUIRRE-GUZMÁN et al. 2010; VINOJ,
VASEEHARAN e BRENNAM, 2014).
O objetivo da presente pesquisa foi descrever a rota de colonização do fluido
corpóreo e tecidos de camarões L. vannamei por V. parahaemolyticus. Considerando a
hipótese de que a colonização da hemolinfa e órgãos de camarões L. vannamei por
bactérias do gênero Vibrio ocorre de forma diferencial. Desta forma, reconhecendo que a
elucidação das rotas e sítios de invasão de patógenos bacterianos nos sistemas de camarão
são importantes para a gestão e sustentabilidade da atividade de carcinicultura e o
aprimoramento de estratégias de controle biológico (uso de probióticos e prebióticos).
16
1.1 OBJETIVOS
1. 1. 1 Objetivo geral
Descrever a colonização do Vibrio parahaemolyticus na hemolinfa e tecidos de juvenis do
camarão Litopenaeus vannamei.
1.1.2 Objetivos específicos
Adaptar protocolo de marcação genética para V. parahaemolyticus;
Realizar teste desafio usando estirpe de V. parahaemolyticus;
Quantificar víbrios totais na hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas de juvenis de
camarões cultivados após o teste desafio usando uma estirpe de V. parahaemolyticus;
Descrever a colonização na hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas de camarões por
V. parahaemolyticus.
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O gênero Vibrio
Pertencem ao gênero Vibrio bactérias Gram-negativas muitas vezes curvas,
facultativamente anaeróbias não formadoras de esporos e móveis por meio de um flagelo
polar. O crescimento da maioria é estimulado pela presença de cloreto de sódio
(DESMACHELIER, 1999). São habitantes naturais dos ecossistemas marinho e estuarino,
onde geralmente se localizam as fazendas de cultivo de camarão (GOPAL et al., 2005;
AUSTIN, 2010). Segundo definição feita por Baumann e Schubert (1984), a família
Vibrionaceae inclui os seguintes gêneros: Víbrio, Aeromonas, Photobacterium e
Plesiomonas. Esses micro-organismos foram classificados juntos não só por serem
encontrados principalmente na água, mas também por serem capazes de causar doença
gastrintestinal em humanos. Entretanto, as técnicas biomoleculares estabeleceram que esses
gêneros possuem apenas uma relação distante e pertencem a famílias distintas: Vibrio e
Aeromonas são classificadas na família Vibrionaceae e Aeromonadaceae, respectivamente,
e as Plesiomonas devido sua íntima relação com Proteus foram colocadas na família das
Enterobacteriaceae (MURRAY et al., 2004). Atualmente, o número de espécies aceitas para
o gênero Vibrio é de137 (incluindo subespécies) (DSMZ, 2017). No entanto, esse número
ainda está em expansão, devido ao desenvolvimento de métodos de identificação de grupos
ou espécie-específicos que proporcionam novas descobertas sobre a ecologia das bactérias
pertencentes à família Vibrionaceae (AVIB, 2013).
Poucas espécies de Vibrio são relacionadas como agente etiológico em doenças
humanas causadas pela ingestão de alimento marinho ou contato com água contaminada
com víbrio (HUEHN et al., 2014). Dentre as espécies de Vibrio patogênicas para humanos,
se destacam o V. cholerae, agente etiológico da cólera, que possui distribuição cosmopolita
sendo encontrada em rios e oceanos. A espécie V. cholerae se divide em sorogrupos
determinados pela presença ou ausência do antígeno O. O sorogrupo O1 toxigênico se
divide em biótipos Clássico e El Tor, além da existência do sorotipo O139 (ABBOUDE et
al., 1993; ALBERT et al., 1993; ABBOUD et al., 2007).
Estirpes bacterianas de V. parahaemolyticus são reconhecidas como importantes
18
causadores de gastroenterite relacionada ao consumo de mariscos contaminados
(MERCOGLIANO et al., 2014; YUXUE et al., 2015). Enquanto V. alginolyticus e V.
vulnificus podem estar associados a infecções de feridas ou septicemia primária de origem
marinha em pacientes imunodeprimidos. (MERCOGLIANO et al., 2014). Um
levantamento de dados realizado sobre os casos de doenças humanas provocadas por V.
alginolyticus nos EUA entre os anos de 1988 a 2012 demonstraram que das 1331 infecções
provocadas por este patógeno, 96% ocorreram em estados costeiros e sendo a maioria
(86%) relacionada a atividades na água (SLIFKA JACOBS, NEWTON e MAHON, 2007).
Em camarões marinhos, essas bactérias estão envolvidas em várias doenças
infecciosas que causam mortalidade e perdas econômicas nos cultivos (GOARANT e
MERIEN, 2006; SAKAI et al., 2007; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; ZHANG et al.,
2014). No ambiente aquático, em condições de estresse as espécies de Vibrio tornam-se
agentes patogênicos mortais para camarões (LIGHTNER, 2005). Ainda assim, em um
ambiente natural é difícil definir quais são os agentes estressores que estimulam a
expressão da patogenicidade em uma determinada comunidade microbiana. Uma vez que a
resposta à condição estressante vai variar de organismo para organismo (SUNG et al.,
2001). A resposta imune dos camarões pode ser afetada por condições ambientais
desfavoráveis que causam estresse, aumentando sua vulnerabilidade a bactérias autóctones
como o víbrio (KUMAR et al., 2014).
Para o entendimento dos processos infecciosos se faz necessária uma descrição
das bactérias patogênicas presentes nos viveiros de camarão (WALLING et al., 2010).
Várias espécies de Vibrio possuem importância como patógenos para a aquicultura
marinha, como V. harveyi, V. alginolyticus, Listonella (Vibrio) anguillarum e, mais
recentemente, o V. parahaemolyticus (HU et al., 2012).
2.1.1 Vibrio parahaemolyticus
A bactéria V. parahaemolyticus foi descoberta por Tsunesaburo Fujino após um
surto de gastroenterite provocado pela ingestão de “shirasu” (sardinhas novas não
submetidas à cocção) no ano de 1950 em Osaka, Japão (SHINODA, 2011). Os isolados
foram primeiramente nomeados como Pasteurella parahaemolytica e somente dez anos
19
depois, os autores Fujino et al. (1965 apud SHINODA, 2011) reexaminaram os isolados de
“shirasu” propondo o nome científico V. parahaemolyticus.
Vibrio parahaemolyticus é um habitante natural de ambientes estuarinos e
costeiros, moderadamente halofílico capaz de crescer em concentrações de NaCl de até 8%
(YANG et al., 2010). Sua virulência em humanos está fortemente ligada a genes que
codificam para hemolisina termoestável direta (tdh) e seu homólogo hemolisina relacionada
a hemolisina termoestável (trh) (WEST, KLEIN e LOVELL, 2013).
Além da patogenicidade em humanos, essa estirpe bacteriana tem sido descrita
como patógena para camarões peneídeos em várias partes do mundo (KUMAR et al., 2014;
ZHANG et al., 2014; YINGKAJORN et al., 2014; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015)
sendo um importante causador de mortalidade e perdas econômicas na atividade da
carcinicultura (LOMELÍ-ORTEGA e MARTÍNEZ-DÍAZ, 2014). Estudos realizados por
Kumar et al. (2014) confirmaram o papel do V. parahaemolyticus como patógeno
oportunista podendo causar mortalidade em larga escala em camarão branco do Pacífico L.
vannamei. Sua patogenicidade está relacionada à doença da necrose hepatopancreática
aguda (AHPND) também conhecida como a síndrome da mortalidade precoce (EMS) que
surgiu em 2009 na Ásia (NUNAN, et al., 2014; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Estirpes
de V. parahaemolyticus isoladas de cultivos de camarão acometidos pela AHPND não
apresentaram os genes tdh e trh. Indicando que os genes responsáveis pela virulência em
humanos não são os mesmos para camarões (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; CHOI et
al., 2016; LÓPEZ-LEÓN et al., 2016).
2.1.2 Mecanismos de patogenicidade bacteriana e defesa imunológica em camarão
O camarão branco L. vannamei é a espécie de camarão mais cultivada no
mundo, e como resultado da intensificação da carcinicultura, muitas fazendas apresentam
doenças virais e bacterianas (vibrioses) despertando a preocupação em relação a sanidade
dos animais e estimulando as pesquisas sobre o sistema imunológico dos invertebrados
(BURGENTS et al., 2005; CHIU-HSIA et al., 2007). Os mecanismos envolvidos na
patogênese e a reação de defesa resultado das vibrioses ainda não estão claramente
compreendidos. No entanto, em todos os filos animais, a fagocitose é considerada como
20
uma forma central e importante para eliminar micro-organismos ou outras partículas
pequenas (VAN DE BRAAK et al., 2002).
Em algumas espécies patogênicas pertencentes à família Vibrionaceae tem sido
demonstrado que os fatores de virulência são regulados através de uma rede complicada de
quorum sensing (QS) (LI, YEH e CHEN, 2010). O QS é um sistema de intercomunicação
bacteriana que controla a expressão de múltiplos genes em resposta à densidade
populacional (YE et al., 2008). Estão envolvidas nesse processo a produção, liberação e
subsequente detecção de moléculas sinalizadoras químicas chamadas de auto-indutoras
(HENKE e BASSLER, 2004). As bactérias usam o processo de comunicação QS para
controlar as transições entre comportamentos individuais e de grupo, existindo em víbrios,
dois fatores de transcrição mestre, AphA e LuxR, que coordenam a resposta QS (VAN
KESSEL et al., 2013). Fatores de virulência, desenvolvimento de biofilme e a motilidade
flagelar são mediados pelo AphA que é um pequeno regulador de transcrição PadR-familiar
DNA-obrigatório que desempenha várias funções em V. parahaemolyticus (WANG et al.,
2013).
Bactérias do gênero Vibrio produzem enzimas proteolíticas extra-celulares que
possuem papel na obtenção de nutrientes via digestão de vários substratos protéicos e
muitas podem desempenhar papel importante na virulência (ELGAML, HIGAKI e
MIYOSHI, 2013; LEE et al., 2002). O ciclo tradicional de infecção bacteriana compreende
as fases de entrada do patógeno, seguida pelo seu estabelecimento, multiplicação, uso de
mecanismos para evitar a defesa do hospedeiro, danos e saída (DONNENBERG, 2000).
Esses diferentes passos envolvem a expressão de fatores de virulência, tais como: produção
de fatores de adesão; produção de exopolissacarídeos e biofilmes; produção de enzima
lítica; sideróforos e aquisição de ferro e bacteriófagos (RUWANDEEPIKA et al., 2012).
Após infectar P. monodon com V. anguillarum, Van de Braak et al. (2002)
realizaram amostragens da hemolinfa do camarão em diferentes tempos (5min., 10 min.,
2h, 24h, 48h e 7 dias) verificando que as contagens desse patógeno decresceram com o
passar do tempo. Paralelo às contagens bacterianas, procederam a histologia dos tecidos,
onde foi detectada o encapsulamento da bactéria pelos hemócitos após o período de 24h e
aglutinação na hemolinfa após 10min. da exposição ao patógeno. A presença de
mecanismos e barreiras de defesa imunológica em camarão foi sugerida após desafio com
21
V. parahaemolyticus, quando houve ausência do patógeno na hemolinfa e músculo e as
contagens nas brânquias decresceram até o seu desaparecimento (AGUIRRE-GUZMÁN et
al., 2010). A microbiota natural do camarão pode também atuar como mecanismo de defesa
contra outros patógenos bacterianos. Shakila et al. (2006) pesquisaram a ação antagônica de
bactérias isoladas do intestino de Penaeus monodon, observando atividade antibacteriana
contra espécies dos gêneros Pseudomonas sp., Photobacterium sp., Bacillus sp. e frente a
culturas de Aeromonas hydrophila, A. sobria e do patógeno de camarões V. vulnificus.
Segundo afirmaram Aguirre-Guzmán et al. (2010), existia um número
significativamente maior de trabalhos científicos abordando a detecção e quantificação de
Vibrio sp. em camarão comparado ao número de estudos que abordava a patogenicidade
específica e as rotas de infecção desses patógenos no camarão. Assim, existe ainda carência
de informações que permitam dar subsídios a ações visando a redução de perdas na
atividade de cultivo de camarões. Vinoj, Vaseeharan e Brennan (2014) descreveram um
método para estudar a patogenicidade e colonização de V. parahaemolyticus marcado via
plasmídio com a proteína fluorescente verde (GFP) em hemolinfa, intestino, brânquias e
músculo do camarão Fenneropenaeus indicus, revelando uma eficiente colonização
bacteriana em massa através da região oral até o intestino e outros tecidos.
2.1.3 Vibrioses na carcinicultura
No Brasil a atividade da carcinicultura teve início na década de 1970
experimentando um desenvolvimento intenso e alcançando um patamar de indústria de
exportação na década de 1990 (QUEIROZ et al., 2013). A produção nacional de camarão
cultivado manteve-se constante ao longo dos anos até 2011, mas as exportações caíram
acentuadamente a partir de 2004 (ABREU et al., 2011). A indústria da carcinicultura vem
experimentando perdas econômicas significativas e estima-se que, no mundo todo,
aproximadamente 60% das perdas por doenças sejam causadas por patógenos virais e 20%
por patógenos bacterianos principalmente do gênero Vibrio (AGUIRRE-GUZMÁN et al.,
2004; FLEGEL, 2012).
A abundância natural dos víbrios em ecossistemas de cultivo de camarão,
somada às taxas de multiplicação e capacidade de se adaptar às mudanças ambientais
22
aumentam a preocupação com o surgimento das vibrioses (SAULNIER et al., 2000).
A salinidade é considerada um fator secundário na sobrevivência e crescimento
das estirpes de víbrio que se desenvolvem em ambientes com ampla variação de salinidade
(2 a 48) (EILER, JOHANSSON e BERTILSSON 2006; SOBRINHO et al., 2010). As
regiões costeiras e estuarinas apresentam variações na salidade (1-40), sendo os locais de
escolha preferencial para o cultivo de camarões marinhos. A migração desta atividade
agrícola para regiões interiores surgiu como uma alternativa para minimizar os custos da
produção e a pressão sobre as áreas costeiras. Além de aumentar as oportunidades de
emprego nas zonas rurais e auxiliar na diversificação da carcinicultura (McGRAW et al.,
2002; ARANEDA, PÉREZ e GASCA-LEYVA, 2008). Na região nordeste brasileira há
uma forte tendência para a interiorização da carcinicultura como alternativa
economicamente viável. No entanto, há a preocupação de que os agentes patogênicos para
camarões que são comuns para as zonas costeiras possam atravessar a barreira da salinidade
e atingir os cultivos de água doce (Informação verbal)1.
As bactérias do gênero Vibrio são reconhecidas como patógenos oportunistas
que causam mortalidades em larga escala em cultivos de camarão. As espécies que
preocupam mais os carcinicultores são: Vibrio alginolyticus, V. harveyi, V.
parahaemolyticus e V. nigripulchritudo (Quadro 1).
1 Prof. Dr. Pedro Carlos Cunha Martins (UFERSA) em ocasião da sua participação na banca da defesa de
tese de Rosa Helena Rebouças intitulada Colonização de tecidos e líquido corpóreo do camarão
Litopenaeus vannamei por Vibrio parahaemolyticus autóctone de ambiente de cultivo no dia 23 de junho
de 2017 no Instituto de Ciências do Mar – Labomar – UFC.
23
Quadro 1: Bactérias do gênero Vibrio relacionadas como agentes etiológicos em eventos de doenças ocorridas em cultivos de camarão.
Bactéria Hospedeiro Doença Local de infecção País Referência
V. harveyi P. monodon Vibriose Pós-larvas - KARUNASAGAR et al., 1994
Vibrio spp P. monodon Doença do pé vermelho Hepatopâncreas; órgão linfóide; hemolinfa Filipinas ALAPIDE-TENDÊNCIA e
DUREZA, 1997
Vibrio sp. luminescente P. monodon Vibriose luminescente Hepatopâncreas Filipinas LAVILLA-PITOGO, LEAÑO e
PANER, 1998
Vibrio spp. P. stylirostris Síndrome 93 Hemolinfa Nova Caledônia COSTA et al., 1998
V. vulnificus P. monodom - Hemolinfa, tecido conjuntivo - ALDAY-SANZ, ROQUE e
TURNBULL, 2002
V. alginolyticus L. vannamei Vibriose Músculo Taiwan LIU et al., 2004
V. campbelli L. vannamei - Órgão linfóide; coração; hemolinfa;
brânquias; hepatopâncreas - BURGENTS et al., 2005
V. penaeicida L. stylirostris Síndrome 93 Hemolinfa Nova Caledônia GOARANT e MERIEN, 2006
V. nigripulchritudo L. stylirostris Síndrome do verão Hemolinfa Nova Caledônia GOARANT et al., 2006
Vibrio spp. P. monodon
Necrose de cauda; doença
intestinal branca; LSS;
doença do pé vermelho
Hemolinfa Índia JAYASREE, JANAKIRAM e
MADHAVI, 2006
V. nigripulchritudo P. japonicus Síndrome do verão
Coração, cérebro, brânquias, estômago,
hepatopâncreas, órgão linfóide, glândula
antenal, músculo
Japão SAKAI et al., 2007
V. parahaemolyticus L. vannamei - Brânquias; hepatopâncreas - AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010
V. parahaemolyticus L. vannamei AHPND/EMS* Hemolinfa Índia KUMAR et al., 2014
V. parahaemolyticus L. vannamei Vibriose Camarão Tailândia YINGKAJORN et al., 2014
V. parahaemolyticus F. indicus - Brânquias, músculo, intestino; hemolinfa - VINOJ, VASEEHARAN e
BRENNAN, 2014
V. parahaemolyticus e
V. rotiferianus F. chinensis Vibriose Hemolinfa China ZHANG et al., 2014
V. parahaemolyticus L. vannamei AHPND/EMS* Hemolinfa México SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015
Fonte: Elaborada pela autora - * AHPND/EMS - Doença da necrose aguda hepatopâncreática/Síndrome da mortalidade precoce
24
As vibrioses que acometem os cultivos de L. vannamei se tornaram um grande
problema econômico global, fazendo com que o controle e prevenção de doenças em
camarões sejam o alvo principal de estudos recentes (BOWLER et al., 2015; LI et al., 2015;
CAO et al., 2015). A prevenção ou redução da mortalidade em massa na larvicultura de
camarão causada por vibrioses ainda é um problema chave para a indústria aquícola. Na
maioria dos casos, os antibióticos e antimicrobianos químicos são utilizados rotineiramente
para prevenir ou tratar a vibriose em camarões, embora tragam efeitos secundários negativos
(WEN et al., 2014; FLORES-MIRANDA et al., 2011; WONGTAVATCHAI, LÓPEZ-
DÓRIGA e FRANCIS, 2010). O uso inapropriado de agentes antimicrobianos pode contribuir
para a disseminação de genes de resistência no ambiente aquático e para o público
consumidor desse crustáceo (YANO et al., 2014). Segundo Adams e Boopathy (2013) a
resistência bacteriana aos antimicrobianos traz impactos na escolha de drogas que humanos e
animais podem usar, bem como seus resíduos em animais destinados ao consumo podem
trazer riscos à saúde dos seres vivos.
Em termos de impacto econômico, diversos países suspenderam ou proibiram a
importação de camarão vivo e ou outras formas de produtos de camarão oriundos de países
afetados pela AHPND provocada pelo V. parahaemolyticus (FAO, 2013). Essa enfermidade
foi notificada pela primeira vez em 2009 após causar perdas significantes na produção de
camarão no sudeste da Ásia. Inicialmente, não se sabia o que causava essa síndrome, porém
em 2013 o agente etiológico foi isolado e identificado como V. parahaemolyticus (TRAN et
al., 2013; DE LA PEÑA et al., 2015; ZORRIEHZAHRA e BANAEDERAKHSHAN, 2015).
Os sinais clínicos da AHPND incluem fraqueza, descoloração e redução do hepatopâncreas
que coincidem com as taxas de mortalidade (DE LA PEÑA et al., 2015). Esses sintomas
característicos da AHPND são causados por toxinas PirA e PirB que se assemelham a toxina
inseticida binária de espécies de Photorhabdus que são proteínas codificadas pelo plasmídio
pVA1 (DANGTIP et al., 2015; HAN et al., 2015; LEE et al., 2015; SIRIKHARIN, et al.,
2015). Os genes que codificam essas enzimas são flanqueados por uma sequência
codificadora de transposase que é um elemento genético móvel que pode induzir à
transferência horizontal. Desta forma, os genes PirA e PirB podem ser potencialmente
disseminados através dos processos de transposição, conjugação e captação plasmídica. Sendo
assim, é possível que estirpes não patogênicas se tornem patogênicas (HAN et al., 2015; LEE
et al., 2015).
25
2.1.4 Rota de infecção de Vibrio spp. em camarão
As vibrioses em camarões são classificadas como infecções secundárias e
oportunistas, ocorrendo em todos os estágios de vida do animal (larval, pós-larval, juvenil e
adulta). O processo de infecção causada pelo gênero Vibrio em camarão pode ser cuticular,
entérico (intestinal) e sistêmico (envolvendo vários órgãos). Quando localizada, apresenta
lesões melanizadas na carapaça e/ou abcessos pontuais no hepatopâncreas. Os locais
comumente afetados pelos víbrios incluem o órgão linfóide, hepatopâncreas, coração,
glândula antenal, tecido conectivo dermal, músculo esquelético e cordão nervoso (NUNES e
MARTINS, 2002) (Figura 1).
Figura 1: Representação esquemática do sistema digestório de camarão peneídeo.
Fonte: Fao (2001).
Em pós-larvas de camarão, o V. harveyi provoca destruição em massa do sistema
digestório, especialmente no hepatopâncreas e intestino anterior (SOONTHORNCHAI et al.,
2010). Opacidade do corpo, necrose e letargia foram sintomas observados em larvas e pós-
larvas de L. vannamei infectadas por V. harveyi, V. parahaemolyticus, e V. penaeicida
(AGUIRRE-GUZMÁN, VÁSQUEZ-JUAREZ e ASCENCIO, 2001).
Burgents et al. (2005) experimentaram um processo de infecção por V. campbelli
em pós-larvas de camarão L. vannamei observando invasão deste patógeno em brânquias,
hepatopâncreas, órgão linfóide, coração e hemolinfa. Pesquisadores no entanto alertam que
estudos sobre as rotas de infecção por bactérias do gênero Vibrio em camarões são
influenciados pelos protocolos, estirpes bacterianas empregadas e dose infectante
hepatopâncreas estômago
olho intestino médio
intestino posterior coração
segmento abdominal
ânus
pleópodos pereópodos
esôfago
antena
26
(SAULNIER et al., 2000; BURGENTS et al., 2005; AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010;
VINOJ, VASEEHARAN e BRENNAN, 2014) (Quadro 2).
Quadro 2: Investigações realizadas sobre as rotas de invasão de estirpes bacterianas do gênero Vibrio em
camarão cultivado.
Bactéria Crustáceo Protocolo de infecção Locais de infecção Referência
V. anguillarum P. monodon Injeção Hemolinfa, órgão linfóide VAN DE BRAAK
et al., 2002
V. campbelli L. vannamei Injeção
(104 UFC/mL)
Hemolinfa, órgão
linfóide, coração,
brânquias, hepatopâncreas
BURGENTS et
al., 2005
V. campbelli L. vannamei Injeção
(104 UFC/mL)
Coração, órgão linfóide,
hepatopâncreas, músculo,
brânquias
BURGE et al.,
2007
V. anguillarum F. chinensis Injeção
(107 UFC/mL) Órgão linfoide
YANG et al.,
2008
V. alginolyticus L. vannamei Injeção
(105 UFC/mL) Hemolinfa
LI, YEH e CHEN,
2008
V. parahaemolyticus L. vannamei Imersão
(106 UFC/mL)
Brânquias,
hepatopâncreas
AGUIRRE-
GUZMAN et al.,
2010
V. parahaemolyticus F. indicus Imersão
(103 a 108UFC/mL)
Músculo, brânquias,
intestino, hemolinfa
VINOJ,
VASEEHARAN
e BRENNAN
et al., 2014
V. furnissi P. monodon Injeção
(105UFC/mL) Hemolinfa
SUBRAMANIAN
et al., 2014
V. parahaemolyticus L. vannamei Imersão
(106 UFC/mL) Órgãos e tecidos
PEÑA-
NAVARRO e
VARELA-
MEJÍAS, 2015
V. harveyi Black Tiger
Shrimp
Imersão
(106 UFC/mL) Intestino
RUNGRASSAM
EE et al., 2016
Fonte: elaborada pela autora.
Foram testadas as possíveis rotas de infecção de V. parahaemolyticus em espécies
distintas de camarão, L. vannamei e Fenneropenaeus indicus, respectivamente. O protocolo
de infecção utilizado nestes testes foi o de imersão dos animais ao inóculo bacteriano. Sendo
observadas respostas diferentes no que se refere ao processo infeccioso e resposta
imunológica (AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010; VINOJ, VASEEHARAN e BRENNAN
2014).
No trabalho apresentado por Aguirre-Guzmán et al. (2010) foi detectada a
presença de V. parahaemolyticus após 30min. de infecção seguida de um decréscimo até o
desaparecimento, sugerindo que existe algum mecanismo que inibiu o processo infeccioso até
a eliminação da bactéria. O mesmo comportamento não foi notado por Vinoj, Vaseeharan e
Brennan (2014) em camarões F. indicus imersos em água contendo inóculo de V.
parahaemolyticus. Neste as contagens do patógeno e dos tecidos infectados mostraram-se
crescentes ao longo do experimento.
27
A resposta imunológica do camarão frente à patologia ocasionada por víbrios
pode também variar de acordo com o estágio de vida do animal. Em estudo realizado por
Soonthornchai et al. (2010) ao infectar por imersão pós-larvas e juvenis de Penaeus monodon
com V. harveyi, observaram a mortalidade das pós-larvas em dois dias de experimento em
contraste com a sobrevivência dos juvenis a altas doses da bactéria.
Estudos sobre as rotas de infecção podem se beneficiar pelo emprego de novas
tecnologias e protocolos, incluindo bactérias marcadas geneticamente com proteína verde
fluorescente, microscopia eletrônica de transmissão, hibridização in situ dentre outras
(AGUIRRE-GUZMÁN et al., 2010).
2.2 Transformação e manipulação bacteriana
Plasmídios são definidos como sendo moléculas de DNA extracromossômicas
encontradas em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (ACTIS, TOMALSKY e CROSA,
1999). Uma característica essencial dos plasmídios bacterianos é a sua capacidade de replicar
como elemento genético autônomo de uma forma controlada dentro do hospedeiro
(SUMMERTON, ATKINS e BESTWICK, 1983; DEL SOLAR et al., 1998). Sua estabilidade
pode ser alterada quando ocorrem rupturas nas ligações fosfodiéster, convertendo o DNA
super-enrolado nas formas circular aberta e linear (MIDDAUGH et al., 1998; LATULIPPE e
ZYDNEY, 2009). E dentre estas, a isoforma super-enrolada apresenta mais alta eficiência de
transfecção (LATULIPPE e ZYDNEY, 2009).
Esses genes podem se propagar por meio da transferência conjugativa que é um
processo importante, não só porque é um mecanismo crucial de propagação de alguns
plasmídios, mas também para espalhar genes que desempenham um papel na infecção e
resistência a antibióticos (WEGRZYN, 2005).
Os plasmídios possuem muitas propriedades úteis como vetores de clonagem
incluindo: (1) seu pequeno tamanho, o que facilita o isolamento e a manipulação do DNA; (2)
origem independente de replicação; (3) múltiplas cópias, de modo que estão presentes em
várias cópias na célula, propiciando tanto rendimento elevado de DNA, quanto expressão dos
genes clonáveis em altos níveis; (4) presença de marcadores selecionáveis, como genes de
resistência a antibióticos, que facilitam a detecção e seleção de clones plasmidiais
(MADIGAN et al., 2010). Podem ser veículo para introdução de novos genes em células,
existindo vetores plasmidiais comerciais disponíveis que podem ser usados para transportar
um gene desejado para um organismo hospedeiro (BAHERI, HILL e ROESLER, 2001).
28
A tecnologia do DNA recombinante permite que um fragmento de DNA de
interesse, conhecido como inserto, seja ligada a outra molécula de DNA chamada vetor e esta
molécula de DNA recombinante pode ser introduzida em uma célula hospedeira compatível
num processo chamado de transformação. Neste procedimento, a célula hospedeira que
recebeu o DNA recombinante recebe o nome de transformante ou célula transformada
(NASCIMENTO et al., 2003). A maioria dos vetores plasmidiais contém pouco mais do que
as sequências de nucleótideos essenciais necessárias para a sua utilização em clonagem de
DNA: uma origem de replicação (ORI), um gene de resistência à antibiótico, e uma região na
qual o fragmento de DNA exógeno pode ser inserido (Figura 2) (LODISH et al., 2000).
Figura 2: Diagrama simples de um vetor de clonagem.
Fonte: LODISH, et al., 2000.
Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser
introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de
transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar o
número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela
aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídio, ou seja, capacidade de crescer em meios
contendo antibiótico (NASCIMENTO et al., 2003).
2.2.1 Proteína verde fluorescente
A bioluminescência é um fenômeno natural no qual a luz visível é gerada por um
organismo em resposta a uma reação química (KENDALL e BADMINTON, 1998). A
proteína verde fluorescente (GFP) é uma proteína espontaneamente fluorescente formada por
Região na qual o DNA pode ser
inserido Vetor de
clonagem
plasmidial
29
238 aminoácidos (27kDa) derivados do cnidário do Pacífico, Aequoria victoria (PRASHER,
1995). A GFP na forma selvagem tem como característica a produção de uma luz verde
brilhante fluorescente quando estimulada com a luz ultravioleta (UV). Sua fluorescência é
muito estável, o que confere uma grande vantagem para sua observação (WARD, 2005;
CHALFIE et al., 1994).
Além da GFP, foram isoladas proteínas homólogas a partir de recifes de coral não
luminescentes que podem ser utilizadas como marcadores de organismos in vivo. O fluoróforo
obtido do recife de coral Zoanthus sp. (ZsGreen) é formado por 231 aminoácidos (26,1KDa)
emite fluorescência verde com espectros de excitação de 496nm e emissão em 506nm (MATZ
et al., 1999).
A proteína verde ZsGreen possui elevada sensibilidade (relação sinal/ruído),
permitindo uma fácil observação do brilho fluorescente por meio da microscopia de
fluorescência (NAKAMURA, ISHII e KONDO, 2013). Em comparação com a GFP oriunda
da A. victoria, a proteína ZsGreen apresenta melhor estabilidade e maior intensidade luminosa
(NAKAMURA, ISHII e KONDO, 2013; KAISHIMA et al., 2016).
As técnicas fluorescentes possuem diversas utilidades científicas, sendo
adequadas para estudar mecanismos patogênicos, tais como, Doença de Parkinson e processos
cancerígenos in vivo através do uso de células mamárias e de pequenos peixes como modelos
animais (VLASHI et al., 2009; MATSUI, GAVINIO e TAKAHASHI, 2012). Há ainda a
possibilidade de uso de células fúngicas, bacterianas e vírus como biossensores de patógenos.
(NAKAMURA, ISHII e KONDO, 2013; VLASHI et al., 2009; PANTELI et al., 2015). A
expressão da proteína verde fluorescente é altamente adequada para monitorar bactérias vivas
dentro de ambientes complexos e podem ser convenientemente analisadas dentro de amostras
fracionadas. Localização bacteriana, associação e processos de multiplicação podem ser
monitorados através da fluorescência. Desse modo o uso de marcadores fluorescentes facilita
a visualização não somente da localização de cada uma das bactérias em ambientes
complexos, mas também auxilia na análise da regulação gênica nesses ambientes (CHALFIE
e KAIN, 2005).
30
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção das estirpes
Foram selecionadas cinco cepas de V. parahaemolyticus pertencentes ao acervo
microbiológico do Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado
(LAMAP/LABOMAR-UFC). Essas estirpes foram isoladas de ambiente de carcinicultura no
Estado do Ceará, Brasil e fazem parte do projeto de pós-doutorado desenvolvido pela
pesquisadora Dra. Francisca Gleire Rodrigues de Menezes intitulado “Monitoramento de
resistência a substâncias antimicrobianas em áreas costeiras com concentração em cultivos de
camarão L. vannamei”.
Alguns critérios foram obedecidos para eleição dos isolados, tais como: origem do
isolado, identificação fenotípica e genotípica para V. parahaemolyticus, positividade para
detecção dos fatores de virulência (gelatinase, caseinase, fosfolipase, lípase e β-hemólise) e
sensibilidade à canamicina.
3.1.1 Identificação bioquímica e fatores de virulência
As cepas utilizadas foram identificadas previamente de acordo com Noguerola e
Blanch (2008) e apresentaram o seguinte perfil fenotípico com respostas positivas para as
provas: descarboxilação da lisina e ornitina, crescimento a 3, 6 e 8% de NaCl, crescimento a
20, 30, 35 e 40ºC, citrato, gelatinase, indol, NO2, oxidase, L-arabinose, arabinose, manitol,
ampicilina 10µg, O129/10µg; e respostas negativas para as provas: arginina, crescimento a
0% de NaCl, crescimento a 4 e 10ºC, arginina, hidrólise da esculina, gás, luminescência,
ONPG, Voges-Proskauer, decomposição da xantina, lactose, inositol, melibiose, ramnose,
salicina, sorbitol, sacarose e O129/150µg. Os fatores de virulência foram testados para os
isolados confirmados como pertencentes ao gênero Vibrio spp. de acordo com Austin et al.
(2005) e Liuxy, Lee e Chen (1996) (Quadro 3).
Quadro 3: Características dos isolados identificados bioquimicamente como V. parahaemolyticus.
Cepa Origem Provas de virulência
(+)
52 Água (CD) GEL; CAS; FOS; β
53 Água (CD) GEL; CAS; FOS; LIP
106 Hepatopâncreas GEL; CAS; FOS; LIP; β
194 Hemolinfa GEL; CAS; FOS; β
195 Hemolinfa GEL; CAS; FOS; β
CD = canal de drenagem de viveiro de camarão; GEL = Gelatinase; CAS = Caseinase; FOS = Fosfolipase; LIP =
Lipase; β = Beta-hemólise. Fonte: Acervo LAMAP.
31
As identificações bioquímicas foram ser confirmadas por meios moleculares com
a finalidade de evitar resultados falso-positivos (CROCI et al., 2007).
3.1.2 Caracterização genotípica dos isolados de V. parahaemolyticus
3.1.2.1 Extração do DNA
As estirpes bacterianas previamente identificadas por métodos bioquímicos como
sendo V. parahaemolyticus foram testadas com o gene tl (hemolisina termolábil), específico
para a espécie. A extração do DNA Total foi efetuada utilizando-se o kit de extração Wizard®
Genomic DNA Purification Kit (Ref.: A1125 - Promega). O DNA, produto da extração, foi
estocado em refrigerador com temperatura de aproximadamente 10ºC.
3.1.2.2 Amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as estirpes de V.
parahaemolyticus
No processo de amplificação foi utilizada como controle positivo, uma estirpe de
referência: V. parahaemolyticus cedida pelo Instituto Oswaldo Cruz-RJ (IOC 18950). Para
confirmar geneticamente as espécies de V. parahaemolyticus foi utilizado o gene tl com
sequência dos iniciadores Forward: 5‟-AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG-3‟ e
Reverse: 5‟-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3‟. As ciclagens foram efetuadas em
Termociclador (Amplitherm) nas condições indicadas no Quadro 4:
Quadro 4: Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer tl.
Etapas Temperatura/Tempo
Desnaturação inicial 94ºC/3 minutos
Desnaturação (30 ciclos) 94ºC/1 minuto
Anelamento 58ºC/1 minuto
Extensão 72ºC/1 minuto
Extensão final 72ºC/5 minutos
Fonte: BEJ et al., 1999.
3.1.2.3 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene tl
Os produtos da PCR foram aplicados em gel de agarose 1% preparado com
tampão Tris-Borato-EDTA 1X (TBE 1X) e a corrida eletroforética realizada em 120 volts (V)
32
em tampão TBE. A cada cavidade do gel foram aplicados 5µL da amostra acrescida de 1µL de
Gel Red (Invitrogen) e 2µL de Blue Juice (Invitrogen). O padrão molecular 1Kb plus DNA
Ladder foi usado como referência dos geis para identificação das bandas. Os geis foram
analisados em equipamento de fotodocumentação (Kodak EDAS290).
3.1.3 Perfil de sensibilidade à canamicina
3.1.3.1 Antibiograma
A sonda plasmidial ZsGreen1-Dr possui característica de resistência a canamicina
(CAN) como marca seletiva. O antibiograma foi realizado pela técnica da difusão em ágar
(NCCLS, 2003).
Ao ágar Mueller Hinton 1% NaCl (MH1%) foi acrescido o antibiótico CAN na
concentração de 30µg/mL. O controle positivo foi realizado com inoculação em ágar MH1%
sem adição do antibiótico. A partir da cepa de V. parahaemolyticus crescida em Triptona Soja
Ágar 1% NaCl (TSA1%) foi ajustado o inóculo bacteriano de acordo com a Escala de
McFarland 0,5 (2x108UFC/mL). Alíquotas de 200µL foram transferidas para duas placas de
Petri. Em seguida, foram vertidos 15mL de ágar MH1% + CAN e ágar MH1%,
respectivamente. Os inóculos foram homogeneizados com movimentos circulares. As placas
foram mantidas em repouso sobre a bancada até a solidificação do meio. Após solidificação as
placas foram incubadas invertidas em estufa bacteriológica a 28ºC/24h. A ausência de
crescimento bacteriano nas placas de Petri contendo Ágar MH1% + CAN indica a
sensibilidade ao antimicrobiano testado.
3.2 Vetor plasmidial
O plasmídio ZsGreen1-Dr foi obtido junto ao Laboratório de Biologia Molecular
do Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal do Rio Grande –
FURG. Possui origem de replicação SV40 e um cassete que confere resistência a
neomicina/canamicina (Figura 3).
33
Figura 3: Ilustração esquemática do plasmídio Psonda-ZsGreen1-Dr.
Fonte: Laboratório de Biologia Molecular - FURG
3.2.1 Integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr
A integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr foi verificada pela corrida em gel de
agarose. O plasmídio foi diluído em solução TE nas proporções de 1:1 e 1:2. Os produtos
foram aplicados em gel de agarose 3% preparado com tampão TBE 1X e a corrida
eletroforética realizada em 120 V em tampão TBE. A cada cavidade do gel foram aplicados
5µL da amostra acrescida de 1µL de Gel Red (Invitrogen) e 2µL de Blue Juice (Invitrogen). O
padrão molecular 1Kb plus (DNA Ladder) foi usado como referência do gel para identificação
das bandas. O gel foi analisado em equipamento de fotodocumentação (Kodak EDAS290).
pSonda – ZsGreen1-Dr (2 sequências)
4.311pb
HSV/TK/polyA/sinais
Resistência
CAN
34
3.3 Adaptação do protocolo de transformação do V. parahaemolyticus
Com base nas confirmações fenotípica para gênero, genotípica para espécie e
respostas aos testes de virulência foram selecionadas as estirpes de Vibrio sp. (195) e V.
parahaemolyticus (106) utilizadas nos testes de otimização do processo de transformação
celular. Como controle positivo foi utilizado uma cepa de E. coli competente (V517).
O processo de transformação celular compreendeu duas etapas distintas: a
competência celular e a transformação celular.
3.3.1 Competência celular
Para estabelecer a competência bacteriana foi utilizado o método químico com
Cloreto de Cálcio descrito por Panda, Dasgupta e Das (1991).
A estirpe de V. parahaemolyticus foi crescida em 1mL de caldo Luria Bertani 1%
de NaCl (LB1%) sob agitação de 150 RPM a 37ºC overnight. Em seguida foram adicionados
50mL de caldo LB1% que foram incubados sob agitação (150 RPM/37ºC) para o crescimento
da cultura até a fase exponencial. Leituras de absorbância foram realizadas em
espectrofotômetro (Thermo) em intervalos de 30 minutos a partir do instante T=0 até que o
crescimento celular atingisse o valor de 3,4 x 108 UFC/mL (OD550 = 0,3). A partir do
crescimento em caldo LB1%, foram distribuídos 20mL em dois tubos tipo falcon estéreis para
centrifugação (10.000 x g/3min.). O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em
15mL de 10mM Tris HCl pH 7,6/10mM MgCl2 e incubado em temperatura ambiente por
20min. Essa etapa foi realizada com o intuito de estimular a secreção de Dnase das células,
que impede a transformação celular.
Logo após nova centrifugação (10.000 x g/3min.), o sobrenadante foi descartado e
o pellet ressuspenso em 10mL de solução de 10mM Tris HCl/25mM CaCl2 seguida da
incubação por 15min em temperatura ambiente. Procedeu-se nova centrifugação (10.000 x
g/3min.) e descarte do sobrenadante para prosseguir com lavagens sucessivas do pellet com
10mL de solução de 10mM Tris HCl/25mM CaCl2 e 10mL de 10mM Tris HCl/50mM CaCl2 a
0ºC. Por fim, o pellet foi ressuspenso em 1mL de 10mM Tris HCl/50mM CaCl2. Alíquotas de
200µL foram distribuídas em criotubos que foram adicionados de glicerol na proporção de 1:1
para conservação das amostras em temperatura de congelamento.
A Figura 4 apresenta a representação esquemática do processo de competência
celular.
35
Figura 4: Fluxograma do processo de competência celular para estirpes do gênero Vibrio de acordo com Panda
(1991).
Fonte: Elaborada pela autora.
3.3.2 Transformação celular
Em 200µL da suspensão com células competentes foram adicionados 10µL do
plasmídio ZsGreen1-Dr, sendo incubado em um banho de gelo a 0ºC por 30min. Em seguida
as células foram submetidas a choque térmico em banho-maria a 37ºC/2min. O processo que
compreende o banho de gelo e o choque térmico foi repetido. Logo após o choque térmico,
0,8mL de caldo LB1% foram adicionados à mistura anterior e posteriormente incubados a
37ºC/1h. A Figura 5 apresenta o fluxograma do processo de transformação celular.
Figura 5: Fluxograma do processo de transformação bacteriana.
Fonte: Elaborada pela autora.
36
3.3.3 Seleção das células transformadas
O sucesso da transformação celular é caracterizado pela expressão do gene pela
célula manipulada. O vetor utilizado neste experimento (ZsGreen1-Dr) carreia a resistência a
canamicina como marca seletiva. Sua fluorescência verde é expressa quando exposta a um
espectro de luz de excitação e emissão máxima de 496nm e 506nm, respectivamente (MATZ
et al., 1999).
Foram testados diferentes protocolos para seleção/detecção das colônias
transformadas: aplicação de comprimento de onda luminosa no espectro do ultravioleta
(365nm) e detecção de expressão de resistência a antibiótico. Foram realizados testes (Figura
6) para identificar as células transformadas utilizando-se meio de cultura não seletivo sólido
(Ágar LB1%) acrescido do antibiótico (canamicina) que corresponde a marca seletiva do
plasmídio e um aminoácido (L-arabinose) indutor de fluorescência.
Teste 1:
O plasmídio ZsGreen1-Dr é marcado com o gene de resistência à canamicina. A
partir do criotubo com V. parahaemolyticus transformado foram plaqueados 100µL na
superfície de placas de Petri contendo Ágar LB1% acrescido de canamicina na concentração
de 30µg/mL, e Ágar LB1% sem adição de antimicrobiano. As placas foram incubadas em
estufa bacteriológica a 37ºC/48h. Após o período de incubação foi observado o crescimento
de colônias nas placas de ágar LB1% com e sem adição de canamicina. As placas foram
expostas à luz ultravioleta (UV – λ=365nm) por 5seg. para verificação da presença ou
ausência de fluorescência das colônias. As colônias a serem selecionadas devem apresentar
resistência à canamicina e fluorescência após exposição à luz UV.
Teste 2:
A expressão da proteína fluorescente do plasmídio ZsGreen1-Dr foi induzida com
a adição de 0,2% p/v de L-arabinose. As cepas transformadas foram crescidas em caldo LB
suplementado com 0,2% de L-arabinose, 10µg de canamicina e 1% de NaCl sob agitação a
37ºC por um período de 48h. Após 10h, 24h e 48h de incubação procedeu-se o plaqueamento
em superfície com auxílio de swab estéril em placas de Petri contendo Ágar Marine
suplementado com 0,2% (p/v) e 2% (p/v) de L-arabinose, respectivamente. As placas foram
37
incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC/24h. Posteriormente ao período de incubação as
placas foram expostas a luz UV (λ=365nm) por 5seg. para visualização da fluorescência.
Teste 3:
Como controle do procedimento de transformação foi utilizada uma cepa de
Escherichia coli competente (V517). A partir dos criotubos com V. parahaemolyticus e E. coli
V517 transformadas foram adicionados 0,8mL de caldo LB1% e LB sem adição de NaCl
acrescido de 0,2% de L-arabinose, respectivamente. Os criotubos foram incubados em banho-
maria a 37ºC/1h. Em seguida foram plaqueados 100µL na superfície de placas de Petri
contendo Ágar LB1% e LB sem adição de NaCl, respectivamente, ambos acrescidos de
canamicina nas concentrações de 0µg, 3µg e 30µg. As placas foram incubadas em estufa
bacteriológica a 37ºC/48h. Após o término do período de incubação foram observados os
crescimentos de colônias na superfície do ágar e as placas foram expostas à luz UV
(λ=365nm) por 5seg. para observação da fluorescência.
Figura 6: Fluxograma dos testes para expressão da fluorescência das colônias transformadas.
Fonte: Elaborada pela autora.
38
3.3.4 Confirmação da transferência plasmidial por PCR
3.3.4.1 Extração do DNA Plasmidial
A presença do plasmídio ZsGreen1-Dr na estirpe de V. parahaemolyticus (106
e106T) e na estirpe de E. coli (V517) foi verificada através da extração plasmidial realizada
com o kit de extração Pure Yield Plasmid Miniprep System (Ref.: A1222 - Promega). Em
seguida, os produtos da extração foram analisados pela corrida eletroforética em gel de
agarose (3%). O produto da extração foi estocado em refrigerador com temperatura de
aproximadamente 10ºC.
3.3.4.2 Extração do DNA Total
A eficiência para detectar o gene plasmidial ZsGreen no produto de extração do
DNA Total das cepas bacterianas transformadas com o vetor plasmidial ZsGreen1-Dr foi
testada. A extração do DNA Total dos isolados foi efetuada utilizando-se o kit de extração
Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Ref.: A1125 - Promega). Em seguida, os produtos
da extração foram analisados pela corrida eletroforética em gel de agarose (3%). O DNA,
produto da extração, foi estocado em refrigerador com temperatura entre 2 a 8ºC.
3.3.4.3 Amplificação por PCR para as estirpes de V. parahaemolyticus transformadas
A PCR do DNA Plasmidial e Total foi realizada com a enzima Taq DNA
polimerase. As concentrações e volumes dos reagentes utilizados na amplificação estão
expostos no Quadro 5.
Quadro 5: Concentrações dos reagentes utilizados na amplificação do DNA.
Reagentes Concentração inicial
(mol)
H2O ultra-pura 10,4
Tampão 5X 1,0
MgCl2 0,2
dNTP 0,1
ZsGreen F 0,1
ZsGreen R 0,1
Taq Polimerase 0,1
DNA molde 0,5
Fonte: Elaborada pela autora.
39
Os primers utilizados para identificação da proteína verde fluorescente foram:
ZsGreen Forward 5‟-ACCGGTCGGTACCGGCTCAGTC-3‟ e ZsGreen Reverse: ZsGreen 5‟-
AGTCGCGGTACCTCAGGGCAATG-3‟ (HEDDLE e MAZALEYRAT, 2007).
As ciclagens foram efetuadas em Termociclador (Amplitherm) nas condições
indicadas no Quadro 6:
Quadro 6: Etapas da amplificação do DNA bacteriano utilizando primer ZsGreen.
Etapa Temperatura/Tempo
Desnaturação inicial 94ºC/5minutos
Desnaturação (30 ciclos) 94ºC/1minuto
Anelamento 56ºC/1minuto
Extensão 72ºC/1,5minutos
Extensão final 72ºC/7minutos
Fonte: SUSIC, BOHANEC e MUROVEC, 2014.
3.3.4.4 Corrida eletroforética dos produtos da PCR com gene ZsGreen
Os produtos de PCR foram aplicados em gel de agarose 1% preparado com
tampão TBE 1X e a corrida eletroforética realizada em 120 V em tampão TBE. A cada
cavidade do gel foram aplicados 5µL da amostra acrescida de 1µL de Gel Red (Invitrogen) e
2µL de Blue Juice (Invitrogen). O padrão molecular 1Kb plus (DNA Ladder) foi usado como
referência dos géis para identificação das bandas. Os géis foram analisados em equipamento
de fotodocumentação (Kodak EDAS290).
3.3.5 Avaliação da fluorescência por microscopia ótica confocal
A partir das culturas de V. parahaemolyticus (106 e 106T) e E. coli (V517 e
V517T) crescidas em ágar TSA 1% NaCl e sem adição de NaCl (24h/37ºC) com o auxílio de
uma alça bacteriológica foram preparados esfregaços bacterianos para observação em
microscopia confocal. As lâminas foram preparadas em duplicata, sem e com adição de
corante laranja de acridina.
Para a coloração com laranja de acridina utilizou-se a técnica descrita pelo
fabricante (BD, 2004): os esfregaços das amostras foram preparados em lâminas de vidro e
secas ao ar. Em seguida os esfregaços foram fixados com metanol durante 2 minutos. O
excesso do metanol foi escorrido e as lâminas colocadas para secar ao ar. As lâminas foram,
então, mergulhadas em solução aquosa de laranja de acridina 4% durante 2 minutos e lavadas
40
com água destilada e secar ao ar. Uma gota de óleo mineral 1:1 foi colocada sobre os
esfregaços corados com laranja de acridina e sem adição de corantes e sobre cada lâmina foi
colocada uma lamínula e as bordas foram seladas com esmalte incolor. As lâminas foram
observadas em microscópio confocal modelo LSM 710 (Zeiss, Alemanha) com comprimento
de onda de excitação 400nm e emissão 500nm.
3.3.5.1 Redução da fluorescência induzida pelo meio de cultura e autofluorescência.
Para este procedimento foi utilizado o meio de cultura Yest Nitrogen Base (YNB)
que possui característica de baixa indução de fluorescência celular de acordo com Bhatta,
Goldys e Learmonth (2006). Foram utilizadas neste protocolo uma cepa padrão de E coli
(ATCC 25922) e duas estirpes de V. parahaemolyticus (106 e 106T). As cepas crescidas em
ágar TSA foram repicadas para caldo LB para crescimento em overnight sob agitação 150 x
g/37ºC. A partir deste crescimento, alíquotas foram transferidas para o meio YNB até
obtenção da densidade ótica 0,1. A leitura da densidade ótica das culturas foi verificada em
espectrofotômetro (Thermo) a um comprimento de onda de 600nm. Uma alíquota de 1mL foi
transferida para um tubo de microcentrífuga e procedeu-se a centrifugação nas condições de
2.400 x g/8min. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 1mL de água
destilada estéril. A centrifugação e lavagens com água destilada foram repetidas por três vezes
e o pellet ressuspenso em 1mL de água destilada estéril. Em seguida foram preparados
esfregaços em lâminas de vidro. Uma gota da suspensão celular foi colocada no centro da
lâmina de vidro. Após a secagem em bico de Bunsen, uma gota de glicerol (1:1) foi
depositada sobre o esfregaço que foi coberta com uma lamínula. As lâminas foram observadas
em microscópio confocal, modelo LSM 710 (Zeiss, Alemanha) com comprimento de onda de
excitação 400nm e emissão 500nm. A fotossensibilização foi testada pela excitação com laser
a 488nm, com bleaching a cada 5seg. (Figura 7).
Figura 7: Fluxograma do protocolo de lavagens celulares utilizando meio de cultura com baixa indução de
fluorescência.
Elaborada pela autora
Esfregaço em lâmina de vidro coberto com
lamínula
Microscópio Confocal
Condições do bleaching: Laser 488nm a cada 5seg.
Caldo LB
overnight
150RPM/37ºC
Caldo YNB OD = 0,1 a 600nm
Lavagens com água destilada
2.400RPM/8min
3 vezes
41
3.4 Teste desafio
3.4.1 Teste desafio com Vibrio parahaemolyticus fluorescente
Os procedimentos de infecção e patogenicidade foram conduzidos em área restrita
na unidade de bioensaio do Centro de Estudos em Aquicultura Costeira –
CEAC/LABOMAR/UFC. Camarões juvenis (n=20), L. vannamei, (9,7g±0,5) obtidos do
Laboratório de Nutrição de Organismos Aquáticos - CEAC/LABOMAR/UFC, foram
aclimatados por 15 dias em tanque circular (500L) com aeração e água do mar filtrada. Os
animais foram alimentados com ração comercial duas vezes ao dia (manhã e tarde) durante
todo o período do bioensaio. Nos períodos da manhã e tarde, foram ofertadas 5 e 10g de ração
(35% proteína bruta), respectivamente, sendo lançadas diretamente nos tanques.
Em um aquário de vidro contendo 38L de água do mar filtrada e com aeração,
foram adicionados 2L de inóculo do V. parahaemolyticus 106T de forma que a concentração
bacteriana final fosse 107 UFC/mL. Em seguida 50 animais foram depositados no aquário
permanecendo pelo período de 2h. Após a exposição, os camarões foram lavados com água do
mar filtrada e colocados em tanque circular com 500L de água do mar filtrada. Foi utilizado
um controle negativo com 50 camarões juvenis que permaneceram por 2h imersos em 40L de
água do mar sem exposição ao inóculo bacteriano. Logo após a infecção por imersão (T = 0h),
cinco (05) animais dos tanques experimental e controle negativo foram coletados e
transportados para o Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado –
LAMAP/LABOMAR/UFC, para processamento e execução das análises laboratoriais. As
coletas se repetiram nos tempos 24, 48 e 72h (Figura 8).
Figura 8: Fluxograma do teste desafio com V. parahaemolyticus 106T e camarões L vannamei.
Fonte: Elaborada pela autora.
5 animais
T= 0, 24, 48 e 72h 5 animais
T= 0, 24, 48 e 72h
V. ph 106T
107
UFC/mL
Tratamento
Período de imersão: 2h
Controle negativo
Período de imersão: 2h
Lavagem com água do mar
42
Ao final do experimento, a água do mar utilizada nos aquários e tanques foram
descontaminadas com hipoclorito de sódio 10ppm por um período de 24h. e os camarões não
utilizados foram abatidos por imersão em banho de gelo e destruídos por incineração.
3.4.1.2 Sinais patológicos externos dos animais
Durante os períodos de aclimatação (15 dias) e de experimento (4 dias), os
animais foram acompanhados para observação de sinais patológicos externos de acordo com
Manilal et al. (2010): necrose e/ou pontos pretos na carapaça, necrose nas patas, anorexia,
letargia e mortalidade. As observações dos sinais patológicos externos foram realizadas pelo
método focal nos dez minutos anteriores e dez minutos posteriores ao arraçoamento no
período da manhã (8h) (ALTMANN, 1974).
3.4.2 Processamento das amostras
Cada amostra foi composta por 05 camarões retirados do tanque experimental e
05 do tanque controle negativo. Os animais foram inicialmente insensibilizados em água
gelada e em seguida sacrificados individualmente por imersão em banho de gelo.
3.4.2.1 Coleta da hemolinfa, intestino médio e hepatopâncreas
A carapaça do camarão foi desinfetada com álcool 70% e foi aspirada 0,1mL da
hemolinfa de cada animal com uma seringa para insulina (BD ultra-fine 30U) por meio de
uma punção ventral direta entre o último esternito cefalotorácico e o primeiro abdominal
(LIGHTNER, 1996). Como anticoagulante utilizou-se uma solução de citrato de sódio 10%
(p/v) na proporção de 1:1 (BARRETO et al., 2012). Em seguida, os animais foram dissecados
para retirada do intestino e hepatopâncreas.
O conteúdo intestinal teve sua saída forçada pela utilização de uma espátula
esterelizada. Foram seccionados e descartados fragmentos (± 0,5cm) da parte anterior
(próxima ao hapatopâncreas) e posterior (próxima ao ânus). O fragmento correspondente ao
intestino médio foi dividido em duas partes iguais para as análises. O hepatopâncreas foi
dividido em duas partes por meio de corte longitudinal. Um fragmento de cada tecido foi
destinado à análise microbiológica e a outra metade foi utilizada para análise microscópica.
43
3.4.3 Análises Microbiológicas
Para as análises microbiológicas, as amostras foram reunidas em “pools” para
animais dos tanques experimental e controle, respectivamente. A hemolinfa foi
homogeneizada e os tecidos foram macerados e diluídos em 9mL de salina 1% NaCl, que
corresponde à diluição 10-1
, a partir desta foram preparadas diluições seriadas até 10-5
(TZUC
et al., 2014).
3.4.3.1 Contagens de Vibrio spp. e Vibrio resistentes à canamicina
A quantificação da população de Vibrio sp. e Vibrio parahaemolyticus 106T foi
realizada por meio da técnica “Spread Plate” (DOWNES; ITO, 2001). De cada diluição foi
tomada uma alíquota de 0,2mL que foi inoculada em duas placas contendo meio ágar
Tiossulfato Citrato Bile Sacarose (TCBS) e TCBS com adição de 30µg de canamicina/mL. O
inóculo foi espalhado com o auxílio de uma alça de Drigalski e as placas foram incubadas a
30°C/18 horas. Ao final do período de incubação foram realizadas as contagens das placas
que apresentaram número de colônias entre 25 e 250 colônias e os resultados foram expressos
em UFC/g.
Os resultados das contagens bacterianas foram analisados pelo Teste de hipótese de
Mann-Whitney para verificar se há ou não diferença significativa para as contagens entre os
tecidos analisados
3.4.4 Análise por microscopia ótica confocal
A hemolinfa e os tecidos do intestino médio e hepatopâncreas foram observados a
fresco em microscópio confocal. Após o preparo, as amostras foram imediatamente
conduzidas à Central Analítica da Universidade Federal do Ceará – Campus do Pici. As
amostras foram analisadas em microscópio óptico confocal, modelo LSM 710 (Zeiss,
Alemanha) com comprimento de onda de excitação 400 e emissão 500nm.
Uma gota da hemolinfa foi colocada no centro de uma lâmina de vidro e coberta
com uma lamínula que foi selada com esmalte incolor.
O intestino médio dos animais coletados em cada amostra foi lavado com solução
salina fosfatada (PBS) para retirada de sujidades. Em seguida, os mesmos foram dispostos no
interior de lamínulas em câmara (Lab-Tek).
44
Para os hepatopâncreas, foram realizados cortes finos. Os fragmentos foram
lavados com solução PBS e dispostos no interior de lamínulas em câmara (Lab-Tek) (Figura
9).
Figura 9: Imagens do processamento das amostras do camarão Litopenaeus vannamei e disposição dos tecidos
no interior das lamínulas em câmara (Lab-Tek).
1: punção da hemolinfa; 2: hepatopâncreas; 3 retirada do intestino médio; 4: fragmentos dos hepatopâncreas
dispostos em lamínula em câmara (Lab-Tek); 5: fragmentos dos intestinos médio dispostos em lamínula em
câmara (Lab-Tek).
1
3 2
5 4
45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Escolha dos isolados
Entre cinco isolados com características de V. parahaemolyticus apenas dois (02)
foram confirmados genotipicamente baseado na presença do gene tl. Durante a caracterização
fenotípica, alguns isolados presuntivos de V. parahaemolyticus podem demonstrar reações
atípicas na série de testes bioquímicos (DILEEP et al., 2003; CROCI et al., 2007; TERZI,
BÜYÜKTANIR, YURDUSEV 2009).
A Figura 10 apresenta o resultado da corrida eletroforética dos isolados
identificados bioquimicamente e analisados geneticamente com os primers tl para
confirmação da espécie como V. parahaemolyticus.
Figura 10: Perfil eletroforético da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) de cinco cepas classificadas
fenotipicamente como V. parahaemolyticus com os primers do gene tl utilizado para detectar a espécie. Os
padrões P1 e P2 são, respectivamente, gene tl e V. parahaemolyticus IOC 18950.
M* - Marcador; B** - controle negativo (branco)
A hemolisina termolábil (tlh) é uma exotoxina que ataca e provoca a lise
incompleta na membrana dos eritrócitos com liberação da hemoglobina, possui ação de
fosfolipase A2/lisofosfolipase. Algumas hemolisinas como tdh e trh possuem papéis na
virulência bem esclarecidos, enquanto a ação virulenta da tlh ainda não está bem definida
(SHINODA et al., 1991; ZHANG eAUSTIN, 2005).
O gene tl vem sendo utilizado com eficiência para confirmar geneticamente os
isolados identificados bioquimicamente como sendo V. parahaemolyticus ratificando sua
M* 52 53 106 194 195 P1 P2 B**
12.000
2.000 1.650
1.000 850 650 500 400 300 200 100
5.000
46
especificidade para identificação deste patógeno (CHAKRABORTY, SURENDRAN e
JOSEPH, 2008; TERZI, BÜYÜKTANIR, YURDUSEV, 2009).
5.1.1 Sensibilidade à canamicina
Os resultados da confirmação molecular da espécie e a sensibilidade dos isolados
de V. parahaemolyticus ao antibiótico correspondente à marca seletiva do vetor plasmidial
ZsGreenl-Dr estão mostrados na Tabela 1.
Tabela 1: Resultado do antibiograma para verificação da sensibilidade das estirpes à canamicina.
Bactéria Identificação molecular
(gene tl)
Antibiograma
30µg/mL CAN
52 Vibrio sp. S
53 V. parahaemolyticus S 106 V. parahaemolyticus S 194 Vibrio sp. S 195 Vibrio sp. S
CAN = canamicina; S = sensível
Os cinco isolados pertencentes ao gênero Vibrio testados apresentaram
sensibilidade à canamicina na concentração de 30µg/mL. Esse antimicrobiano está
classificado no grupo dos aminoglicosídeos agindo sobre a síntese de proteína e destruindo a
membrana citoplasmática de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Sua utilização é
comum na clínica veterinária como agente antimicrobiano e também como promotor de
crescimento (HUGHES e HERITAGE, ALI e ULLAH, 2017). Na clínica humana seu uso é
recomendado pela Organização Mundial da Saúde no tratamento da tuberculose (ARBEX et
al., 2015).
A escolha da estirpe bacteriana a ser transformada foi baseada no critério de
sensibilidade ao antibiótico que corresponde à marca seletiva do vetor plasmidial. Após a
introdução do DNA plasmidial, a transformante passou a expressar o perfil de resistência
antimicrobiana contida no vetor.
O perfil de resistência ao antibiótico que confere a marca seletiva do vetor
plasmidial tem sido a técnica utilizada para verificar o sucesso da transformação bacteriana
(CHU e LU, 2008; POLLACKI-BERTI, WOLLENBERG e RUBY 2010; MANJUSHA e
SARITA, 2011).
47
Diluição 1:1
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
5.2 Vetor plasmidial
As diferentes isoformas do DNA plasmidial podem ser separadas por diferentes
métodos, incluindo a eletroforese em gel de agarose (LATULIPPE e ZYDNEY, 2011). A
Figura 11 indica a corrida eletroforética em gel de agarose (3%) do plasmídio ZsGreen1-Dr
diluído em diferentes concentrações para verificação da sua integridade.
Figura 11: Verificação a integridade do plasmídio ZsGreen1-Dr diluído em diferentes concentrações.
Foi verificada a presença de três bandas em alturas diferentes em todas as
diluições do plasmídio. Os padrões de bandas apresentados indicam a presença do DNA
plasmidial nas formas: super-enrolada, circular aberta e linear. O DNA plasmidial é
naturalmente encontrado na isoforma super-enrolada, podendo ser quebrada por uma
variedade de processos químicos ou mecânicos resultando nas isoformas linear e circular
aberta (LATULIPPE e ZYDNEY, 2009).
A qualidade da solução estoque plasmidial pode ser verificada pela eletroforese
em gel de agarose. O contraste na intensidade do brilho das bandas apresentadas pode indicar
a presença em maior ou menor quantidade da isoforma plasmidial. A isoforma super-enrolada
é a de menor peso molecular, sendo a que migra mais no gel, seguida das formas linear e
circular aberta (LATULIPPE e ZYDNEY, 2010).
Circular aberto
Super enrolado
Linear
12.000
2.000 1.650
1.000
850
650
500
400
300
5.000
Diluição 1:2
M* 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 B**
M* - Marcador; B** - Controle negativo (branco)
48
5.3 Adaptação do protocolo para transformação do V. parahaemolyticus
5.3.1 Processo de transformação e competência celular
5.3.1.1 Seleção dos transformados
A seleção dos transformados se deu pela capacidade de resistência ao antibiótico
que corresponde à marca seletiva do plasmídio ZsGreen1-Dr.
Após a inoculação em ágar não seletivo acrescido de canamicina (30µg/mL) das
estirpes de Vibrio sp. (195T), V. parahaemolyticus (106T) e E. coli competente (V517T) as
colônias foram expostas à luz UV (λ=365nm), não sendo observada a expressão da
fluorescência nas colônias crescidas. Uma característica inerente aos diferentes tipos de
fluoróforos, é que a expressão da fluorescência se dá pela exposição a um determinado
espectro de luz de excitação. A proteína originada do coral Zoanthus sp. (ZsGreen) necessita
ser exposta a um comprimento de luz com excitação máxima de 493nm com emissão máxima
da fluorescência verde a 505nm (MATZ et al., 1999; NAKAMURA, ISHII, KONDO, 2013).
Experimentos com o propósito de transfecção do vetor pGFPuv para estirpes de
Aeromonas hydrophila foram realizados por Chu e Lu (2008). As células transformadas foram
confirmadas pelo crescimento das colônias em ágar contendo antibiótico e pela emissão da
fluorescência após exposição à luz UV (λ= 300nm). Colônias de V. parahaemolyticus
transformadas com GFP e resistência a canamicina, apresentaram fluorescência verde ao
serem observadas por microscopia ótica confocal (VINOJ, VASEEHARAN, BRENNAN,
2014). A seleção das supostas células transformadas pode ser realizada pela resistência ao
antibiótico que corresponde à marca seletiva do vetor plasmidial (POLLACKI-BERTI,
WOLLENBERG e RUBY 2010). Assim sendo, as colônias resistentes à canamicina foram
selecionadas e o sucesso da transfecção vetorial foi testado pela técnica da PCR com primer
específico para o gene ZsGreen.
5.3.1.2 Confirmação da transferência plasmidial por PCR
A extração do DNA Total e Plasmidial das estirpes Vibrio sp. (195T) e V.
parahaemolyticus (106T) permitiu a detectar a presença do vetor plasmial que carreia gene
para fluorescência (pZsGreen1-Dr). Na Figura 12 está representada a corrida eletroforética do
DNA Total e Plasmidial dos isolados de Vibrio sp (195T), V. parahaemolyticus (106 e 106T) e
49
E. coli (V517 e V517T) não transformados e transformados com o plasmídio ZsGreen1-Dr. O
par de primers para ZsGreen foi usado para amplificar a região onde se localiza o marcador de
fluorescência.
Figura 12: Eletroforese em gel de agarose do produto de PCR de DNA Total e Plasmidial de Vibrio sp. (195T),
V. parahaemolyticus (106; 106T) e E. coli (V517; V517T).
M* - marcador; B** - controle negativo (branco).
A presença do gene ZsGreen foi confirmada pela PCR de DNA total e plasmidial.
Observou-se no gel de agarose 3% a presença de bandas nas diferentes isoformas do
plasmídio. Em Soares et al. (2004) a presença de clones foi avaliada pela PCR das colônias e
PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para confirmação da presença do gene
introduzido.
5.3.1.3 Avaliação da fluorescência celular por microscopia ótica confocal
Esfregaços bacterianos foram observados em microscópio óptico confocal modelo
LSM 710 (Zeiss, Alemanha) com comprimento de onda de emissão 400nm e excitação
500nm. Esperava-se que a expressão da fluorescência ocorresse apenas nas células
submetidas à transfecção do vetor plasmidial. Porém, células bacterianas do controle
negativo, não submetidas ao processo de transformação, apresentaram autofluorescência. Em
bactérias vivas, a autofluorescência pode ser provocada por uma variedade de biomoléculas
intracelulares e metabólitos que têm espectros de comprimento de onda de excitação e
emissão específicos (AMMOR, 2007; BAO et al., 2008). A autofluorescência verde intrínseca
da cultura de E. coli tem sido negligenciada há muito tempo e corrigida empiricamente em
experiências com proteína verde brilhante (GFP) (MIHALCESCU et al., 2015).
M* B** 106T 106 V517T V517 195T M* 106T V517T 195T B**
100
12.000
1.650 1.000
5.000
2.000
50
Na Figura 13 foi observada a fluorescência dos esfregaços bacterianos corados e
sem adição do corante laranja de acridina.
Figura 13: Fluorescência celular apresentada por células de V. parahaemolyticus (106; 106T)e E. coli (ECT)
corados com laranja de acridina (a) e sem adição de corantes (b).
Fonte: Elaborada pela autora.
A autofluorescência pode afetar a sensibilidade dos ensaios de fluorescência
microscópica ou de citometria de fluxo interferindo ou mesmo impedindo a detecção de
fluorescência específica de baixo nível (YANG et al., 2012). Para evitar/reduzir o fenômeno
da autofluorescência celular deve ser utilizado um meio de cultura minimamente definido,
reduzindo compostos autofluorescentes, a fim de maximizar o sinal repórter (YOUNG et al.,
2012). Knight e Billinton (2001) afirmam que a autofluorescência celular e/ou a
autofluorescência dos meios tendem a diminuir mais rapidamente do que a fluorescência da
GFP com a incidência prolongada da luz. Com base nestas afirmações, a autofluorescência
celular foi diferenciada da fluorescência do vetor plasmidial. A célula de E. coli
(ATCC25922), manteve a fluorescência inalterada. No entanto, para a célula transformada
106T, o sinal de fluorescência decaiu em 50% após 45 segundos do fotobranqueamento.
O presente experimento diferiu da afirmação de Knight e Billinton (2001) quando
o sinal do repórter ZsGreen1-Dr decaiu após a incidência prolongada da luz. No entanto, foi
51
comprovado que as proteínas fluorescentes derivadas da família Aequoria victoria apresentam
baixa fotoestabilidade (BARBIERI e DAMRON, 2016).
A autofluorescência apresentada pela E. coli (ATCC25922) pode ser explicada
pela presença das flavinas que são coenzimas essenciais ao metabolismo bacteriano e que
podem ser excitadas a 450-490nm emitindo fluorescência verde nos comprimentos de onda de
500 a 560nm (YANG et al., 2012; MIHALCESCU et al., 2015). Dentre os víbrios um fator
que diferencia as espécies são os regulons de saída, as estirpes V. harveyi e V. fisheri são
reconhecidas pela capacidade de emitir bioluminescência através de um complexo mecanismo
genético regulados pelos genes luxAB com pico de emissão a 490nm. Nas espécies
patogênicas Vibrio cholerae e V. parahaemolyticus foram encontrados mecanismos capazes de
estimular a luminescência tais como o V. harveyi (BASSLER, GRRENBERG e STEVENS,
1997; GODE-POTRATZ e McCARTER, 2011; YOSHIZAWA et al., 2012).
Os filtros de luz utilizados no microscópio óptico confocal para este experimento
foram determinados pela característica do fluoróforo que apresenta excitação e emissão
máximas de 400nm e 500nm, respectivamente, estando dentro da faixa que estimula a
autofluorescência da estirpe de E. coli (ATCC25922) e que barra a emissão da luminescência
do gênero Vibrio. Desta forma, por meio deste ensaio, a fluorescência emitida pela sonda foi
diferenciada da autofluorescência intrínseca pelo reconhecimento do fotobranqueamento das
células bacterianas testadas.
5.4 Teste desafio com V. parahaemolyticus fluorescente
5.4.1 Sinais patológicos externos
Durante os 15 dias de aclimatação não foram notadas mudanças comportamentais
e corporais externas nos animais, tais como, natação errática, letargia, anorexia, opacidade e
atrofia do hepatopâncreas, melanização, pontos brancos ou erupções na carapaça. No decorrer
do teste desafio, os sinais externos de patologia nos camarões permaneceram inalterados no
tanque controle negativo. Todavia, para o tanque experimental, foram notados sinais de
letargia nos camarões desafiados com a estirpe de V. parahaemolyticus (106T) a partir das 24h
de inoculação. O apetite permaneceu inalterado durante os períodos de aclimatação e controle,
não havendo sobras de ração nos tanques controle negativo e experimental. Não foi registrada
mortalidade dos camarões no decorrer do experimento, incluindo os períodos de aclimatação e
teste desafio.
52
A idade dos animais influencia na resposta imunológica frente a estirpes
bacterianas com potencial patogênico. Pós-larvas de camarão P. monnodom foram sensíveis à
exposição com V. harveyi na densidade de 107UFC/mL, apresentando mortalidade após dois
dias de infecção. Em contraste os animais juvenis que sobreviveram mesmo após exposição a
doses consideradas altas (107UFC/mL) do mesmo patógeno (SOONTHORNCHAI et al.,
2010). Pós-larvas de L. vannamei (0,5 – 2g), após serem inoculadas por imersão com uma
estirpe de V. parahaemolyticus isolada de camarões doentes com AHPND (108UFC/mL)
apresentaram sinais da doença após 18h e mortalidade em massa no 4º dia após a infecção
(TRAN et al., 2013). Em contrapartida, experimentos realizados com juvenis de camarões
(19,6±2,5g e 8,32±0,57g, respectivamente) demonstram a resistência à estirpes de bactérias
do gênero Vibrio potencialmente patogênicas (BURGE et al., 2007; PEÑA-NAVARRO e
VARELA-MEJÍAS, 2015).
Em um experimento realizado por Soto-Rodriguez et al. (2012) juvenis de
camarão L. vannamei (5 e 15g, respectivamente) apresentaram sensibilidade distinta ao
patógeno V. parahaemolyticus na dose de 103UFC/g. Os animais mais jovens exibiram taxas
de mortalidade a partir de 7h (50±37,8%) de exposição, atingindo a 100% após 48h. Os
animais com peso maior se mostraram mais resistentes, manifestando morbidade inicial após
10h (2,5 ±4,3%) da inoculação, atingindo 92,5±8,3% da população com 96h de exposição ao
patógeno.
A dose infectante também é um fator crucial que influencia diretamente na taxa de
mortalidade. Juvenis de L. vannamei com peso variando entre 1-4g foram submetidos à
infecção por imersão com V. parahaemolyticus isolado de um surto de AHPND, com doses
variando de 101 a 10
6UFC/mL. O grupo de animais submetidos a dosagens mais altas (10
6 e
105) do patógeno apresentaram 100% de mortalidade até a 21ªh e 104ªh após a infecção,
respectivamente (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Fato semelhante foi constatado quando
juvenis de L. vannamei (2-4g) foram expostos ao víbrio causador da AHPND em diferentes
concentrações (105 a 10
8UFC/g). Os animais submetidos a dosagens mais altas do patógeno
apresentaram mortalidade em poucas horas após a exposição (CHOI et al.; 2016).
Demonstrando que a taxa de mortalidade está relacionada com a idade dos animais e a
dosagem do inóculo bacteriano.
5.4.2 Análises microbiológicas
As contagens de Vibrio spp. e Vibrio resistente a canamicina (V. parahaemolyticus
53
- 106T) foram acompanhadas durante os quatro tempos de amostragens. A partir do instante
t=0h seguido dos tempos 24, 48 e 72h após a inoculação. Nos gráficos estão apresentados os
valores logaritizados do número de UFC de Vibrio spp. e Vibrio resistente a canamicina. A
contagem de vibrios totais foi feita em meio de cultura TCBS normal enquanto que na
contagem de Vibrio resistente a canamicina foi usado o meio TCBS com adição de
canamicina. (Figura 14).
Figura 14: Contagens de colônias bacterianas em meio seletivo para gênero Vibrio oriundas de amostras de
hepatopâncreas e intestino médio de camarão L. vannamei desafiados com V parahaemolyticus (106T).
Vibrio spp – contagens em meio TCBS sem adição de canamicina (30µg/mL); Vibrio spp. RCAN – contagens em meio TCBS
com adição de canamicina (30µg/mL).
Fonte: Elaborada pela autora.
Não foram detectados vibrios nas amostras de hemolinfa de qualquer animal
(controle e experimental) analisados durante o perido do experimento.
Analisando os animais do tanque controle negativo, foi detectado crescimento
microbiano nos tecidos do hepatopâncreas (2,2 logUFC/g e 0,6 logUFC/g) e intestino (1
logUFC/g) sobre o meio TCBS, sem canamicina, no primeiro (T=0h) e segundo (T=24h) dias
54
de amostragens. Ao mesmo tempo não foi verificado crescimento bacteriano a partir das
amostras de hemolinfa e tecidos sobre o meio seletivo acrescido de canamicina ao longo do
experimento. A ausência de crescimento bacteriano nas placas de TCBS com adição de
canamicina confirma que os animais não entraram em contato com a estirpe 106T. Sendo,
portanto, o resultado esperado para essas contagens.
Para os animais amostrados do tanque experimental, o número de bactérias do
gênero Vibrio spp. nos tecidos do hepatopâncreas, nos instantes T=0 e 48h de análises foram
0,35 logUFC/g e 1,1 logUFC/g. A quantificação de Vibrio spp. no intestino médio no tempo
T= 24h foi de 0,61 logUFC/g. As contagens de Vibrio resistente a canamicina apresentaram-se
nos tempos T=48 e 72h no meio TCBS com canamicina na hemolinfa (0,7 logUFC/g e 0,8
logUFC/g). As amostras de intestino médio apresentaram crescimento bacteriano no instante
T=72h (0,7 logUFC/g).
Dos animais amostrados do tanque experimental, a partir do instante T=0 foi
possível realizar as contagens de Vibrio spp. nos tecidos do hepatopâncreas e intestino médio.
Em contrapartida, a enumeração bacteriana de Vibrio resistente a canamicina dos camarões do
tanque experimental foi detectada partir do instante T=48h.
Para ambos os gráficos, Vibrio spp e Vibrio resistente a canamicina, chama
atenção o 3º dia (T=48h) de amostragens, em que as contagens oriundas das amostras do
hepatopâncreas se mostram superiores no gráfico Vibrio spp. Isso se deve ao fato de que o
ágar sem adição do antibiótico se torna menos seletivo, permitindo o desenvolvimento de
colônias oriundas de células não transformadas (Vibrio spp.) como de células transformadas
(106T).
Os valores encontrados para as contagens de Vibrio spp e Vibrio resistentes a
canamicina apresentaram distribuição não normal. Portanto, foram analisados como dados
não paramétricos pelo Teste de hipótese de Mann-Whitney. Não havendo diferença
significativa para as contagens entre os tecidos analisados.
A colonização bacteriana em organismos aquáticos, incluindo os camarões, é um
fato natural. Estirpes do gênero Vibrio têm sido isoladas a partir de amostras da hemolinfa de
animais aparentemente sadios (ALBUQUERQUE-COSTA, LIMA-ARAÚJO e
FERNANDES-VIEIRA, 2013). No entanto, há uma divergência sobre a presença de bactérias
na hemolinfa de animais que não apresentam sinais patológicos (ALBUQUERQUE-COSTA,
LIMA-ARAÚJO e FERNANDES-VIEIRA, 2013, KUMAR et al., 2014).
A existência de fatores de proteção imunológica do animal pode explicar as
alterações nas contagens bacterianas. Dentre as ferramentas de defesa imune do camarão, os
55
hemócitos possuem papel importante no combate às bactérias patogênicas, sendo responsáveis
pela agregação e redução da carga bacteriana na hemolinfa e órgãos do camarão (VAN DE
BRAAK et al., 2002; SOONTHORNCHAI et al., 2010). Outra teoria aceita é a de que no
momento em que ocorre ausência da bactéria no fluído e tecido dos camarões, provavelmente,
o micro-organismo não foi capaz de vencer suas barreiras imunológicas. A cutícula e o trato
digestivo, na maioria dos casos, mecanismos de proteção contra o ataque de patógenos
altamente virulentos (MARTIN, RUBIN e SWANSON, 2004; AGUIRRE-GUZMAN et al.,
2010; SOONTHORNCHAI et al., 2010).
Estirpes de V. parahaemolyticus vêm sendo isoladas de camarões acometidos pela
AHPND com o intuito de compreender e/ou elucidar os processos infecciosos provocados por
esta bactéria (JOSHI et al., 2014; SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; CHOI et al., 2016). Em
camarões, o órgão mais afetado pela vibriose AHPND é o hepatopâncreas, e à medida que a
patologia progride causa atrofia da glândula a tal ponto que provoca a morte do animal
(SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Camarões L. vannamei moribundos afetados pela doença
AHPND apresentaram baixa ou nenhuma densidade de Vibrio sp. na hemolinfa
(0,075logUFC/mL), alta densidade no hepatopâncreas (2,89 logUFC/g) e no estômago (3,6
logUFC/g) (SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015). Em contrapartida, juvenis de camarão F.
indicus (10±1,5g) expostos por imersão ao V. parahaemolyticus marcado com GFP
apresentaram maior índice da bactéria na hemolinfa (4,6 logUFC/mL), seguido do intestino
(2,5 logUFC/g) e hepatopâncreas (1,9 logUFC/g) (VINOJ, VASEEHRARAN e BRENNAN,
2014).
O que vem sendo constatado é que, aparentemente, certa densidade bacteriana
deve ser alcançada para que a toxina patogênica que causa a doença seja expressa (SOTO-
RODRIGUEZ et al., 2015; CHOI et al., 2016). Além disso, o potencial de virulência pode
variar entre estirpes da mesma espécie (JOSHI et al., 2014; VINOJ, VASEEHRARAN e
BRENNAN, 2014).
5.7 Microscopia ótica confocal
O uso de proteínas fluorescentes é um meio de visualização e detecção direta do
micro-organismo, permitindo diferenciar as células marcadas das que ocorrem naturalmente
nos ambientes (VINOJ, VASEEHARAN e BREENAN, 2014). Desta forma, a invasão
bacteriana aos fluídos e tecidos dos camarões analisados acompanhada por meio da
microscopia ótica confocal, permitiu visualizar as células marcadas com fluoróforo verde
56
(ZsGreen1-Dr).
A hemolinfa e os tecidos dos animais do tanque controle negativo não
apresentaram sinais de fluorescência. Durante as análises dos fragmentos do fluido e tecidos,
na microscopia confocal, foi observado um background verde próprio do tecido do camarão.
Esse fato permite confirmar a presença da célula marcada dentro do tecido, sem que haja a
necessidade de utilizar corantes teciduais. Esse background verde ocorre naturalmente em
amostras teciduais de camarão e peixes (XU, SHOEMAKER e KLESIUS, 2012; SHANTI e
VASEEHARAN, 2014).
Nas imagens extraídas a partir das amostras de hemolinfa de camarão L. vannamei
(Figura 15), tanto no controle negativo quanto no tratamento, não foram observadas células
fluorescentes, ratificando as contagens de víbrios realizadas neste estudo que não confirmou a
presença bacteriana nas amostras do fluído dos camarões em todos os dias de amostragens.
No entanto, percebemos estruturas esféricas com baixa intensidade de brilho em contraste
com o background verde da hemolinfa. Essas estruturas podem ser devido à ativação dos
hemócitos que fazem parte do sistema de defesa do organismo (SOONTHORNCHAI et al.,
2010).
Figura 15 Imagens dos esfregaços das amostras de hemolinfa extraídas de camarão L. vannamei analisadas em
microscópio confocal Zeiss (modelo LSM 710 – Alemanha).
A1: controle T = (0h); A2: controle T = (24h); A3: controle T = (48h); B1: tratamento T = (0h); B2: tratamento T = (24h); B3:
tratamento T = (24h); HCT: hemócito?; ( ) indica a localização do hemócito.
Fonte: Elaborada pela autora.
HCT?
HCT?
HCT?
HCT?
57
Analisando as imagens dos fragmentos de hepatopâncreas (Figura 16), sinais de
fluorescência foram observados com maior intensidade a partir do terceiro dia de coleta
(T=48h). As células bacterianas foram observadas agrupadas e raramente notamos células
isoladas neste órgão. Observou-se uma coerência entre os resultados obtidos a partir das
imagens da microscopia confocal e das contagens bacterianas do hepatopâncreas, detectando
contagens bacterianas o Vibrio 106T a partir das 48h de amostragem.
Figura 16 Imagens das amostras de hepatopâncreas extraídas de camarão L. vannamei analisadas em
microscópio confocal (modelo LSM 710 – Alemanha).
C1: controle T = (0h); C2: controle T = (24h); C3: controle T = (48h); D1: tratamento T = (0h); D2: tratamento T = (24h); D3:
tratamento T = (48h); Vph106T: V. parahaemolyticus 106T.
Fonte: Elaborada pela autora.
Para o intestino médio, células fluorescentes foram visíveis a partir do instante T
= 0h dia após a imersão, aumentando a densidade no terceiro dia de amostragens (Figura 17).
Vph106T
58
Figura 17 Imagens das amostras de intestino médio extraídas de camarão L. vannamei analisadas em
microscópio confocal (modelo LSM 710 – Alemanha).
E1: controle T = (0h); E2: controle T = (24h); E3: controle T = (48h); F1: tratamento T = (0h); F2: tratamento T = (24h); F3:
tratamento T = (48h); Vph106T: V. parahaemolyticus 106T.
Fonte: Elaborada pela autora.
As contagens de Vibrio spp. nos tecidos dos intestinos foram presentes nos tempos
T=0 e 24h de coletas. Em contraste com as contagens de víbrios (106T), sendo a bactéria
marcada detectada somente no 3º dia (48h) de amostragem. As bactérias do gênero Vibrio
quando expostas a condições ambientais adversas são capazes de entrar numa fase viável, mas
não cultivável (VNC) (BAFFONE et al., 2003), o que pode explicar a ausência da bactéria V.
parahaemolyticus 106T nos três primeiros dias de amostragens. Além disso, a análise dos
mecanismos de defesa imunológica dos camarões é um fator que não pode ser neglicenciado
quando o assunto é localização da infecção tecidual desses animais. Há a hipótese de que a
presença da bactéria patogênica nos tecidos pode desencadear a expressão de genes, tais como
os peptídeos antimicrobianos (AMP, sigla em inglês) e proteínas específicas de um complexo
e ainda incompreendido sistema imune. Já foi demonstrado que os genes estimuladores de
interferons (STING, sigla em inglês) atuam na ativação de uma resposta imunológica de
forma distinta nos diferentes tecidos, com ativação mais intensa no tecido intestinal do que no
hepatopâncreas (GU et al., 2017; LI et al., 2017). Somada a essas informações, temos a
especificidade do potencial virulento das estirpes. Observações sobre a colonização de V.
Vph106T
Vph106T Vph106T
59
harveyi e V. parahaemolyticus em tecidos de camarão P. monodom indicaram que a presença
da bactéria no estômago do camarão provocou danos teciduais, enquanto sua permanência no
intestino anterior, médio e posterior não trouxe prejuízos aos tecidos (SOONTHORNCHAI et
al., 2015). O presente estudo sugere que por via de imersão, o V. parahaemolyticus (106T)
colonizou primeiro o intestino médio, seguido do hepatopâncreas, confirmando que o
hepatopâncreas é um importante órgão de acumulação bacteriana (BURGENTS et al., 2005;
SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015).
O uso da GFP para marcação e localização bacteriana em tecidos de organismos
aquáticos tem sido explorado nos últimos anos (LING et al., 2000; RENGPIPAT,
WONGTAGPRASERT e PALAGA, 2009; SHANTHI e VASEERAHAN 2014 ). Contudo,
pouco se tem divulgado sobre o uso da proteína oriunda dos corais do gênero Zoantus
(ZsGreen) para marcação dos diversos gêneros bacterianos com teste desafio em animais
aquáticos para determinar sua localização. A Zsgreen foi utilizada com sucesso para marcação
de bactérias do gênero Edwardsiella permitindo sua localização nos tecidos de peixes (XU,
SHOEMAKER e KLESIUS, 2012). Do mesmo modo, proteína fluorescente Zsgreen se
mostrou eficiente para marcação e localização de Vibrio parahaemolyticus na hemolinfa,
hepatopâncreas e intestino de camarões L. vannamei. Pesquisas com as bactérias V.
parahaemolyticus e V. rotiferianus tem despertado atenção devido ao seu potencial para
desencadear eventos de mortalidade em massa em cultivos de camarão (KUMAR et al., 2014;
SOTO-RODRIGUEZ et al., 2015; ZHANG et al., 2014).
As estirpes de V. parahaemolyticus relacionadas com o desencadeamento dos
eventos de mortalidade em massa de pós-larvas de camarão acometidas pela AHPND têm
apresentado o plasmídio PVA1 (DANGTIP et al., 2015; HAN et al., 2015; LEE et al., 2015;
SIRIKHARIN, et al., 2015). A troca de material genético entre estirpes bacterianas da mesma
espécie e mesmo entre espécies distintas é ocasionada pela transferência plasmidial que
ocorre naturalmente no ambiente (BENNET, 2008). A identificação de plasmídios que
codificam para virulência em crustáceos é um alerta para a possibilidade de que novas estirpes
bacterianas não relacionadas a eventos patogênicos e/ou disseminação de estirpes portadoras
do potencial virulento se espalhem por regiões ainda não acometidas por estas doenças.
Estirpes de V. campbelli isoladas de cultivos de camarão na China (2013) e na
América Latina (2016) foram identificadas como agentes etiológicos da AHPND. Essas cepas
patogênicas continham o plasmídio que codifica paras as toxinas PirAB, confirmando esses
genes como sendo responsáveis pelo desencadeamento da doença e indicando a transferência
horizontal dos genes entre as espécies bacterianas (DONG et al., 2017; HAN, 2017).
60
A elucidação das vias de invasão e acompanhamento da instalação bacteriana nos
tecidos podem ser ferramentas imprescindíveis para o desenvolvimento de tecnologias e
técnicas de manejo preventivo dos processos patológicos.
61
6 CONCLUSÃO
O protocolo para transformação celular pelo método químico foi modificado e
adaptado para transfecção plasmidial em uma estirpe selvagem de Vibrio parahaemolyticus,
permitindo a diferenciação das cepas marcadas com o fluoróforo verde. Esse procedimento
permitiu o acompanhamento desse patógeno nos tecidos e hemolinfa dos camarões após
exposição a dose infectante por imersão.
A colonização tecidual pelo V. parahaemolyticus acontece de maneira
diferenciada, com fixação em um primeiro momento nos tecidos do intestino médio seguida
de uma instalação tecidual mais intensa no hepatopâncreas. Durante o acompanhamento das
bactérias nos camarões, por cultivo e microscopia, não foi detectada presença de espécies de
Vibrio cultiváveis e do V. parahaemolyticus (106T) nas amostras de hemolinfa o que está
relacionado a presença de hemócitos que atuam no sistema de defesa desses crustáceos.
6.1 Considerações finais
A facilidade de detecção e interpretação dos resultados mostram a importância
dessa estirpe marcada com fluoróforo como uma ferramenta no estudo e entendimento do
papel do V. parahaemolyticus como patógeno em camarões marinhos. A partir desse
protocolo, outras possibilidades e abordagens se tornam viáveis usando o V. parahaemolyticus
transformado como indicador. Um bom exemplo é a possibilidade de acompanhamento da
colonização do organismo e análise paralela dos mecanismos imunológicos do camarão
favorecendo o desenvolvimento de tecnologias para prevenção ou tratamento de eventos de
vibrioses nos cultivos de camarão.
Atenção deve ser dada a eventos de autofluorescência em outros gêneros
bacterianos presentes na microbiota de camarões e que podem resultar em leituras errôneas
dos resultados.
62
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