UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE … · para a vida e me ensinaram o verdadeiro significado do amor e da ... fazei-o em nome do Senhor Jesus, dando por ele ... Efeito

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS CENTRAIS DA IANGAMBINA ISOLADA DE Ocotea duckei Vattimo:

ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO EM CÓRTEX MOTOR E CORPO ESTRIADO DE CAMUNDONGO

VERA TARGINO MOREIRA LIMA

Fortaleza 2005

ii



ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO EM CÓRTEX MOTOR E CORPO ESTRIADO DE CAMUNDONGO

Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia. Orientador: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa.

Fortaleza 2005

L711a Lima, Vera Targino Moreira Avaliação dos efeitos centrais da iangambina isolada de Ocotea duckei Vattimo: estudo comportamental e neuroquímico em córtex motor e corpo estriado de camundongo / Vera Targino Moreira Lima. – Fortaleza, 2005.

167 f: il.

Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Francisca Cléa Florenço de Sousa. Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará. Departamento de Fisiologia e Farmacologia. Faculdade de Medicina.

1. Farmacologia. 2. Lauraceae. 3. Ocotea. 4. Lignanas. 5. Yangambin.

6. Ansiolíticos. 7. Modelos animais. 8. Monoaminas biogênicas. 9. Receptores dopaminérgicos. 10. Receptores muscarínicos. 11. Receptores de serotonina. I. Sousa, Francisca Cléa Florenço de (orient.). II. Título.

CDD 615.1

iii



ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO EM CORTEX MOTOR E CORPO ESTRIADO DE CAMUNDONGO

Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.

Tese aprovada com louvor em 20 de julho de 2005

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________ Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa (Orientador)

Universidade Federal do Ceará-UFC

____________________________________________

Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Universidade Federal da Paraíba-UFPB

____________________________________________

Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida Universidade Federal do Piauí-UFPI

____________________________________________

Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho Universidade Federal do Ceará-UFC

____________________________________________

Prof. Dr. Carlos Maurício de Castro Costa Universidade Federal do Ceará-UFC

iv

Agradeço a Deus por ter permitido a minha

convivência com pessoas competentes e inteligentes

que muito contribuíram para a realização deste trabalho.

v

Dedicatória

À minha mãe, Regina, e ao meu pai, Abelardo (in memorium), que me deram meu primeiro impulso

para a vida e me ensinaram o verdadeiro significado do amor e da integridade.

Aos meus irmãos, Regina, Helosine, Alberto, Abelardo e Paulo, grandes amigos e incentivadores.

À Daniela, Denise e Débora, minhas filhas, por serem a razão e estímulo para prosseguir adiante e

representarem sempre amor, alegria, integridade, sinceridade, entusiasmo e inteligência em minha

vida..

vi

“Tudo quanto fizerdes, por palavra ou por obra, fazei-o em

nome do Senhor Jesus, dando por ele graças a Deus Pai”.

(Colossenses 3: 17)

vii

“O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato não os despreza. O Altíssimo

deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas, e dela se serve para acalmar as

dores e cura-las. O farmacêutico faz misturas agradáveis, compõe ungüentos úteis à saúde, e seu

trabalho não terminará, até que a paz divina se estenda sobre a face da terra”.

(Eclesiástico 38, 4. 6-8)

viii

AGRADECIMENTOS

Aos Secretários de Saúde do Estado do Ceará Dr. Anastácio de Queiroz Sousa (2001-2002) e

Dr. Jurandi Frutuoso Silva, pela compreensão ao autorizar meu afastamento do trabalho

para dedicar-me ao doutorado.

À Profa. Francisca Cléa Florenço de Sousa, pela preciosa orientação, confiança e apoio na

execução deste trabalho.

Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba, nas

pessoas do Prof. José Maria Barbosa Filho e doutoranda Celidarque da Silva Dias, que

gentilmente nos cedeu a substância isolada e que muito colaborou para a realização deste

estudo.

Aos Profs. Reinaldo Nóbrega de Almeida, Fernanda Regina de Castro Almeida, Manoel

Odorico de Moraes Filho e Carlos Maurício de Castro Costa, por terem gentilmente aceito o

convite para participar da banca examinadora.

À Profa. Glauce Socorro Barros Viana, pessoa a quem tenho admiração e respeito, por sua

cordial acolhida em seu laboratório, para que eu pudesse executar os experimentos e

concluir o meu doutorado.

Aos professores do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos e dedicação

permanente aos alunos e ao programa de pós-graduação.

Aos Profs. Manoel Odorico de Moraes Filho e Maria Elisabete Amaral de Moraes, a quem

tenho muita estima e respeito, pela amizade e apoio recebido.

À Dra. Fátima Maria Fernandes Veras, diretora do Centro de Ciências de Saúde da

Universidade de Fortaleza (UNIFOR), grande amiga e incentivadora.

À Profa. Geanne Matos, pelos comentários pertinentes que contribuíram para o

enriquecimento deste trabalho.

ix

À Norma Carvalho Linhares, bibliotecária da UFC, o agradecimento especial por sua

dedicação na correção da referência bibliográfica.

À Danielle Silveira Macêdo, por sua amizade e espírito cooperativo em muitos momentos que

necessitei da sua ajuda.

Aos amigos de pós-graduação: Lissiana, Izabel, Thiciane, Kalyne, Aline, Viviane, Patrícia,

Emanuelle, Carlos Renato, Iri Sandro, e Jefferson, pela amizade e apoio recebido.

Aos estudantes de iniciação científica: Edenilce, Andreisa, Emídio e Bruno, pela dedicação e

seriedade na execução dos experimentos.

À Vilani Bastos e Jaqueline, pela sua cooperação e apoio.

A todos que fazem parte do Laboratório de Neurofarmacologia, pelos préstimos e convívio

amigável, que tornaram mais agradável minha passagem por este laboratório.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de Ciências da

Saúde da Universidade Federal do Ceará e em especial aos funcionários da secretaria do

curso de pós-graduação, pelo apoio e cooperação.

À Febe, sempre solicita e atenciosa em todas às vezes em que estive no biotério.

Ao Dr. José de Anchieta Correia Maia, meu grande amigo e companheiro, pela dedicação,

incentivo, carinho e apoio sempre presentes.

Às minhas filhas, Daniela, Denise e Débora, por aceitar e compreender as ausências, durante

esta etapa da minha formação acadêmica.

x

SUMÁRIO

Lista de Tabelas xiii

Lista de Figuras xiv

Lista de Quadros xvi

Lista de Abreviaturas xvii

Resumo xx

Abstract xxi

1 INTRODUÇÃO 2 1.1 Generalidades 2

1.2 Família Lauraceae 10

1.3 Ocotea duckei Vattimo 11

1.4 Lignóides 14

1.5 Iangambina 15

1.5.1 Características da iangambina 15

1.5.2 Propriedades farmacológicas da iangambina 16

1.6 Sistema dopaminérgico 18

1.6.1 Receptores dopaminérgicos 20

1.6.2 Expressão dos receptores dopaminérgicos 21

1.6.3 Vias de transdução de sinal 22

1.6.3.1 Adenilato ciclase 23

1.6.3.2 Canais de cálcio e potássio 23

1.6.4 Funções da dopamina 24

1.7 Sistema colinérgico 26

1.7.1 Receptores colinérgicos 28

1.7.1.1 Receptores nicotínicos 28

1.7.1.2 Receptores muscarínicos 29

1.7.2 Regulação do receptor muscarínico da acetilcolina 32

1.8 Sistema serotonérgico 32

1.8.1 Localização dos receptores serotonérgicos 34

1.9 Sistema gabaérgico 36

1.10 Áreas cerebrais (córtex motor e corpo estriado) 38

1.11 Relevância e justificativa 39

2 OBJETIVOS 41

xi

3 MATERIAIS E MÉTODOS 43

3. 1 Material utilizado nos experimentos 43

3.2 Animais 43

3.3 Material botânico 44

3.4 Extração e isolamento 44

3.5 Preparo da droga 47

3.6 Tratamento dos grupos experimentais 47

3.7 Testes comportamentais 48

3.7.1 Teste de campo aberto 48

3.7.2 Teste do rota rod 48

3.7.3 Teste do nado forçado 49

- Procedimento experimental 49

3.7.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital 50


3.7.5 Teste da placa perfurada 50

3.7.6 Teste de labirinto em cruz elevado 51


3.7.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol 52

3.8 Dissecação das áreas cerebrais 52

3.9 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC 53

- Método 53


- Soluções reagentes 55

3.10 Determinação da densidade dos receptores dopaminérgicos 55

- Método 56



3.11 Determinação da densidade dos receptores muscarínicos 58

- Método 59



3.12 Determinação da densidade dos receptores serotonérgicos (5-HT2) 61

3.13 Dosagem de proteína 62

xii

- Método 62


3.14 Análise estatística 63

4 RESULTADOS 65

4.1 Testes comportamentais 65

4.1.1 Teste do campo aberto (vias intraperitoneal e oral) 65

4.1.2 Teste do rota rod (vias intraperitoneal e oral) 72

4.1.3 Teste do nado forçado (vias intraperitoneal e oral) 75

4.1.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital (vias intraperitoneal

e oral)

78

4.1.5 Teste da placa perfurada (vias intraperitoneal e oral) 81

4.1.6 Teste de labirinto em cruz elevado (vias intraperitoneal e oral) 84

4.1.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol (vias intraperitoneal

e oral)

90

4.2 Estudo neuroquímico 93

4.2.1 Dosagens de monoaminas 93

4.2.2 Ensaios de binding 102

4.2.2.1 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em

homogenatos de córtex motor e corpo estriado de

camundongo (experimentos in vitro).

102

4.2.2.2 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em

presença de mianserina em homogenatos de córtex motor e

corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).

104

4.2.2.3 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em

homogenatos de córtex motor e corpo estriado de

camundongo (experimentos in vitro).

106

4.2.2.4 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em

presença de dopamina em homogenatos de córtex motor e

corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).

108

5 DISCUSSÃO 111

6 CONCLUSÕES 131

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 134

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do

rota rod para camundongos

73

Tabela 2 - Efeito da administração oral da iangambina no teste do rota rod para

camundongos

74

Tabela 3 - Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do

labirinto em cruz elevado para camundongos

86

Tabela 4 - Efeito da administração oral da iangambina no teste de labirinto em

cruz elevado para camundongos

88

Tabela 5 - Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via

intraperitoneal, no modelo de convulsão induzida com

pentilenotetrazol em camundongos

91

Tabela 6 - Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via oral,

no modelo de convulsão induzida com pentilenotetrazol em

camundongos

92

Tabela 7 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em

homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo

(experimentos in vitro)

103

Tabela 8 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em

presença de mianserina em homogenatos de córtex motor e corpo

estriado de camundongo (experimentos in vitro)

105

Tabela 9 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em homogenatos

de córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in

vitro)

107

Tabela 10 - Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em

presença de dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo

estriado de camundongo (experimentos in vitro)

109

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Folhas e flores da Ocotea duckei Vattimo 12

Figura 2 - Ocotea duckei Vattimo 13

Figura 3 - Estrutura química da iangambina 15

Figura 4 - Vias dopaminérgicas no cérebro 20

Figura 5 - Vias da acetilcolina no cérebro 28

Figura 6 - Vias da 5-hidroxitriptamina (serotonérgicas) no cérebro 34

Figura 7 Receptor GABAA 37

Figura 8 - Isolamento da iangambina à partir das cascas do caule de Ocotea

duckei Vattimo.

46

Figura 9 - Efeito da iangambina intraperitoneal sobre a atividade locomotora

(campo aberto)

66

Figura 10 - Efeito da iangambina via oral sobre a atividade locomotora (campo

aberto)

67

Figura 11 - Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via

intraperitoneal)

68

Figura 12 - Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via

oral)

69

Figura 13 - Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via

intraperitoneal)

70

Figura 14 - Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via

oral)

71

Figura 15 - Efeito do tratamento agudo com iangambina por via intraperitoneal

no tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos

76

Figura 16 - Efeito do tratamento agudo com iangambina por via oral no tempo

de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos.

77

Figura 17 - Efeito da iangambina intraperitoneal no tempo de sono induzido por

pentobarbital em camundongos

79

Figura 18 - Efeito da iangambina via oral no tempo de sono induzido por

pentobarbital em camundongos

80

Figura 19 - Efeito do tratamento agudo com iangambina via intraperitoneal no

teste de placa perfurada para camundongos

82

xv

Figura 20 - Efeito do tratamento agudo com iangambina via oral no teste de

placa perfurada para camundongos

83

Figura 21 - Efeito da iangambina intraperitoneal no teste de labirinto em cruz

elevado

87

Figura 22 - Efeito da iangambina via oral no teste de labirinto em cruz elevado 89

Figura 23 - Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,

i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em córtex

motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento

96


i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em córtex

motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento

97

Figura 25 - Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de

DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em córtex motor de

camundongos determinado 24 horas depois da última administração

98


i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em corpo

estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento

99


i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em corpo

estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento

100

Figura 28 - Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de

DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em corpo estriado de

camundongos determinado 24 horas depois da última administração

101

xvi

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Fármacos protótipos de categorias terapêuticas, a partir de plantas 6

Quadro 2 - Receptores de dopamina 21

Quadro 3 - Subtipos muscarínicos de receptores da acetilcolina 31

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS [3H]-NMS - [3H]-N-metil-escopolamina

[3H]-SCH 23390 - [3H]-7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-3-metil-5-fenil-1H-3-benzazepina-7-ol 3H - Hidrogênio tritiado

5,7-DHT - 5,7-d-hidroxitriptamina

5-HIAA - Ácido-5-hidroxindolacético

5-HT - 5-hidroxitriptamina ou serotonina

AADC - L-aminoácido descarboxilase

Acetil-CoA - Acetil coenzima A

ADP - Adenosina difosfato

ALE - Atividade locomotora espontânea

AMPc - Adenosina monofosfato cíclico

ANOVA - Análise de variância

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATV - Área tegumentar ventral

BSA - Bovine seric albumin (Albumina sérica bovina)

CACA - Ácido cis-4-aminocrotônico

CE - Corpo estriado

CGP - Diretrizes para as Boas Práticas Clínicas

CHCl3 - Clorofórmio

CLAE/RMN - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotômetro

de ressonância magnética nuclear.

CLAE/UV/EM - Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotômetro

de ultravioleta e espectofotômetro de massas.

CM - Córtex motor

CNS - Conselho Nacional de Saúde

DA - Dopamina, dopaminérgico (s), dopaminérgica (s)

DOPAC - Ácido 3,4-diidroxifenilacético

DS - Duração do sono

DZP - Diazepam

EA - Extrato acético

EC - Extrato clorofórmico

EE - Extrato etanólico

xviii

EMEA - European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (Agência

Europeia para Avaliação de Produtos Medicinais)

EPM - Erro padrão da média

Flu - Flumazenil

FM - Fórmula molecular

GABA - Ácido gama amino butírico

GTP - Trifosfato de guanina

HCLO4 - Ácido perclórico

HPLC - High Performance Liquid Chromatograph (Cromatografia líquida de

alta performance)

HVA - Ácido homovanílico

i.p. - Intraperitoneal

i.v. - Intravenoso

Iag - Iangambina

IMP - Cloridrato de imipramina

L-DOPA - L-3,4-dihidroxifenilalanina

LTB4 - Leucotrieno B4

MDMA - 3,4-methlyenedioxymethampthetamine

MeOH - Metanol

MS - Ministério da Saúde

NA - Noradrenalina

NADP - Dinucleotídeo fosfato de nicotidamida adenina

NEBA - Número de entradas nos braços abertos

NMDA - N-metil-d-aspartato

NRM - Núcleo medial da rafe

NQ - Número de quedas da barra

NRD - Núcleo dorsal da rafe

PAF - Fator ativador de plaquetas

PEBA - Percentagem do número de entradas nos braços abertos

PF - Ponto de fusão

PGHS-2 Prostaglandina-endoperóxido sintetase-2

PKA - Proteína Kinase A

PM - Peso molecular

xix

Proteína G - Guanina nucleotídeo

Proteína Gi - Proteína G do tipo inibitória

PTBA - Percentagem do tempo de permanência nos braços abertos

PTZ Pentilenotetrazol

RDC - Resolução de Diretoria Colegiada

RMN - Ressonância magnética nuclear

RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro

rpm - Rotação por minuto

SCH-23390 - 7-cloro-2,3,4,5-tetrahidro-3-metil-5-fenil-1H-3-benzazepina-7-ol

SKF 97541 - Ácido 3-aminopropil-(metil)-fosfínico

SOS - Ácido octanosulfônico

SR 95531 - Gabazina

TACA - Ácido trans-4-aminocrotônico

TH - Tirosina-hidroxilase

TL - Tempo de latência do sono

TO - Tubérculo olfatório

TP - Tempo de permanência na barra

TPBA - Tempo de permanência nos braços abertos

TPMPA - Ácido [(1,2,5,6-tetrahidropiridina-4-y1)metilfosfínico]

UV - Ultra violeta

v.o. - Via oral

WHO - World Health Organization

xx

RESUMO

Avaliação dos efeitos centrais da iangambina isolada de Ocotea duckei Vattimo: Estudo comportamental e neuroquímico em córtex motor e corpo estriado de camundongo. VERA TARGINO MOREIRA LIMA. Orientador: Profa. Dra. Fca. Cléa Florenço de Sousa. Tese de Doutorado. Curso de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2005.

Os efeitos da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, por via intraperitoneal e oral), foram estudados em vários modelos animais de comportamento (campo aberto, rota rod, nado forçado, tempo de sono induzido por pentobarbital, placa perfurada, labirinto em cruz elevado, convulsão induzida por pentilenotetrazol). Binding in vitro com diferentes concentrações de iangambina (0,5-200 µl), foram realizados para avaliar sua interação com os receptores dopaminérgicos (D1- e D2-símile), receptores muscarínicos (M1+M2)-símile e receptores serotonérgicos (5-HT2)-símile, bem como, estudo em HPLC para determinar os efeitos da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg,i.p.) após 24 horas de sua administração aguda sobre os níveis de monoaminas e seus metabólitos em córtex motor e corpo estriado de camundongos. Os resultados mostraram que a iangambina induziu uma diminuição significativa na atividade locomotora e nas freqüências de rearing e grooming no teste de campo aberto, indicativo de possível efeito ansiolítico. Estes resultados podem estar relacionados com o sistema dopaminérgico, desde que houve interação da iangambina com os receptores D1- e D2-símile, em corpo estriado e D2-símile em córtex motor, acompanhado de uma redução de dopamina, indicando uma provável ação antagonista dopaminérgica. A iangambina não causou alteração na coordenação motora dos animais no teste de rota rod, sugerindo que a redução da atividade locomotora possa envolver ação central. Houve um aumento significativo na imobilidade dos camundongos no teste do nado forçado induzido pela iangambina. Este efeito, juntamente com a redução da dopamina, noradrenalina e serotonina induzida pela iangambina em corpo estriado, pode explicar seu efeito depressor neste modelo. Além disso, corroborando estes resultados, a iangambina potenciou o tempo de sono induzido pelo pentobarbital em camundongos, sugestivo de efeito depressor central. Iangambina nas doses empregadas neste trabalho, não protegeu os animais das convulsões induzidas por pentilenotetrazol, sugerindo que este efeito depende da dose usada. No teste da placa perfurada, a iangambina aumentou o número de head dips, em todas as doses estudadas, por via intraperitoneal ou oral, demonstrando atividade ansiolítica. O efeito ansiolítco da iangambina (75 mg/kg, i.p e 25, 50 e 75 mg/kg, v.o.) também foi confirmado no teste do labirinto em cruz elevado, onde apresentou aumento significativo na percentagem do número de entradas nos braços abertos e na percentagem do tempo de permanência nos braços abertos. Iangambina (50 e 75 mg/kg, v.o.) também aumentou o número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos, respectivamente. No entanto, iangambina 25 e 50 mg/kg, i.p., apresentou efeito ansiogênico evidenciado pela redução do tempo de permanência nos braços abertos o que provavelmente pode dever-se a ausência da formação de algum metabólito ativo gerado no metabolismo de primeira passagem. O efeito ansiolítico induzido pela iangambina 75 mg/kg, v.o., no modelo do labirinto, foi revertido com o flumazenil (2,5 mg/kg,i.p), indicando a possível participação dos receptores GABAérgicos no seu mecanismo de ação. O efeito ansiolítico da iangambina, observado no teste da placa perfurada e no labirinto em cruz elevado, foi acompanhado por uma redução de noradrenalina e serotonina em corpo estriado, no entanto, em córtex motor, iangambina (75 mg/kg, i.p.), induziu um aumento dos níveis de noradrenalina, assim como iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) induziu aumento de serotonina, demonstrando que o efeito ansiolitico associado a redução de noradrenalina e serotonina depende da área cerebral. A iangambina interagiu com receptores muscarínicos em córtex motor e corpo estriado. O bloqueio dos receptores dopaminérgicos induzido pela iangambina foi sinérgico à sua ação agonista sobre os receptores colinérgicos, desde que não alterou a redução da atividade locomotora dos animais no modelo de campo aberto. O presente trabalho mostra uma interação entre os sistemas dopaminérgico, colinérgico, serotonérgico e GABAérgico, revelando a importância da iangambina em doenças que alteram estes sistemas de neurotransmissão. A iangambina apresentou alterações comportamentais e neuroquímicas compatíveis com efeito ansiolítico-símile.

xxi

ABSTRACT

Evaluation of the central effects of yangambin isolated from Ocotea duckei Vattimo: Behavioral and neurochemical study in mice motor cortex and striatum. VERA TARGINO MOREIRA LIMA. Supervisor: Prof. Dr. Fca. Cléa Florenço de Sousa. Doctor’s Tese. Course of Post-graduation in Pharmacology. Department of Physyology and Pharmacology, UFC, 2005.

The effects of the acute administration of yangambin (25, 50 and 75 mg/kg intraperitoneal and oral), were studied in some animals behavioral models (open field, rotarod, forced swimming test, barbiturate-induced sleeping time, hole board, elevated plus maze, pentilenotetrazole-induced convulsion). Binding in vitro with differents concentrations of yangambin (0.5-200 µl), had been carried out to evaluate its interaction with the dopaminergic receptors (D1- and D2-like), muscarinic receptors (M1+M2)-like and serotonergic receptors (5-HT2)-like, as well as, HPLC studies to determine the effects of yangambin (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) after 24 h of its acute administration on the monoamines levels and its metabolites in mice motor cortex and striatum. The results showed that yangambin induced a significant reduction in the locomotor activity and the frequencies of rearing and grooming in the open field test, indicative of possible ansiolytic-like effect. These results can have related with the dopaminergic system, since that it had interaction of the yangambin with D1- e D2-símile receptors, in striatum and D2-símile in motor cortex, followed by a dopamine reduction, indicating a probable dopaminergic antagonistic action. The yangambin did not cause alteration in the motor coordination of the animals in the rotarod test, suggesting that the reduction of the locomotor activity can involve central action. It had a significant increase in the immobility of the mice in the forced swimming test induced by the yangambin. This effect, taken together with the reduction of the dopamine, noradrenaline and serotonin induced by yangambin in striatum, can explain its depressant effect in this model. Moreover, corroborating these results, the yangambin increased pentobarbital-induced sleeping time in treated mice, suggestive of central depressant effect. Yangambin in the doses used in this work, did not protect the animals from pentilenotetrazole-induced convulsions, suggesting that this effect depends on the used dose. In the hole board test, the yangambin increased the number of the head dips, in all the doses studied, intraperitoneal or oral, demonstrating ansiolytic activity. The ansiolytic effect of yangambin (75 mg/kg, i.p. and 25, 50 and 75 mg/kg, p.o.) was also confirmed in the elevated plus maze, where it presented significant increase in the percentage of the entries number in the open arms and the percentage of the time of permanence in the open arms. Yangambin 50 and 75 mg/kg, p.o., also increased the number of entries and the time of permanence in the open arms, respectively. However, yangambin 25 and 50 mg/kg, i.p., presented ansiogenic effect evidenced by the reduction of the time of permanence in the open arms which probably due to the absence of the formation of some active metabolite generated in the first-pass metabolism. The ansiolytic effect induced for yangambin 75 mg/kg, p.o., in the plus maze, was reverted with flumazenil (2.5 mg/kg, i.p.), indicating the possible participation of the GABAergic receptors in its mechanism of action. The ansiolytic effect of the yangambin, observed in the hole board and the plus maze test, was followed by a reduction of noradrenaline and serotonin in striatum, however, in the motor cortex, yangambin (75 mg/kg, i.p.), induced an increase of the noradrenaline levels, as well as yangambin (25, 50 and 75 mg/kg, i.p.) induced serotonin increase, demonstrating that the ansiolytic effect associated to the reduction of noradrenaline and serotonin depends on the cerebral area. The blockade of the dopaminergic receptors induced by yangambin was synergic to its agonist action on the cholinergic receptors, since that it did not modify the reduction of the locomotive activity of the animals in the open field test. The present work shows an interaction between the systems dopaminergic, cholinergic, serotonergic and GABAergic, that suggest the importance of yangambin in illnesses that modify these systems of neurotransmission. The yangambin presented compatible behavioural and neurochemical alterations with ansiolytic-like effect.

INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

1.1 Generalidades

As Plantas são fontes importantes de produtos naturais biologicamente ativos,

muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos.

Pesquisadores mostram-se impressionados com as diversidades, encontradas nos produtos

naturais em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas, (WALL;

WANI, 1996). Apesar do avanço nessa área de estudo, os dados disponíveis revelam que

apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal

(SOEJARTO, 1996).

Ao se considerar as perspectivas de obtenção de novos fármacos, dois aspectos

distinguem os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidadade molecular e a função

biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela derivada

dos processos de síntese, que, apesar dos avanços consideráveis, ainda é limitada (NISBET;

MOORE, 1997).

Quando se trabalha com plantas, a identificação da espécie e sua perpetuação são

os passos mais importantes para que qualquer investigação possa ser reproduzida. Estudos que

envolvem plantas medicinais, quer sejam nas áreas de etnobotânica, etnofarmacologia,

farmacologia, farmacognosia, fitoquímica, agronomia ou biotecnologia, para que mereçam

confiabilidade, devem partir da certeza de que as espécies envolvidas estejam corretamente

identificadas e depositadas no herbário de uma instituição. Para tanto, alguns procedimentos

devem ser seguidos, tais como coleta, herborização e registro.

Com a demanda pela utilização de plantas medicinais na cura ou prevenção de

doenças, o cultivo e/ou o extrativismo dessas plantas torna-se uma alternativa cada vez mais

importante na agricultura nacional (CORRÊA JÚNIOR et al., 1994).

Os fitoterápicos têm sido, no caso do Brasil e de muitos países, o suporte da

indústria farmacêutica genuinamente nacional de pequeno e médio porte (FARIAS et al.,

1994). Desta forma, a exploração de plantas de uso medicinal da flora nativa através da

3

extração direta nos ecossistemas tropicais (extrativismo) tem levado a reduções drásticas das

populações naturais dessas espécies, seja pelo processo predatório de exploração, seja pelo

desconhecimento dos mecanismos de perpetuação das mesmas. Assim, considerando-se o

valor das plantas medicinais não apenas como recurso terapêutico, mas também como fonte

de recursos econômicos, torna-se importante estabelecer linhas de ação voltadas para o

desenvolvimento de técnicas de manejo ou cultivo, tendo em vista a utilização dessas espécies

vegetais pelo homem aliada à manutenção do equilíbrio dos ecossistemas tropicais (REIS,

1996; SHELDON et al., 1997).

O cultivo de plantas medicinais envolve a possibilidade de domesticação da

espécie utilizada. O primeiro passo é a escolha das plantas que serão cultivadas, para que

sejam preparadas as condições necessárias para o bom desenvolvimento das mesmas. O

desconhecimento destas questões pode levar ao insucesso na obtenção dos príncipios ativos

de interesse pela não-adaptação da planta ao local de cultivo, ou mesmo à ausência de um

orgão, como a flor, que, em muitos casos, como o da camomila (Chamomolla recutita (L.)

Rausch.), é a parte da planta utilizada.

Em geral, as espécies apresentam épocas específicas em que contêm maior

quantidade de príncipio ativo no seu tecido, podendo esta variação ocorrer tanto no período de

um dia como em determinadas épocas do ano (MARTINS et al., 1995). Além disso deve-se

ter cuidado com o recipiente de coleta do material, bem como o modo correto de fazer esta

coleta. Cuidados com o material coletado, o local de secagem das plantas (Corrêa Júnior et al.,

1994), o período de armazenagem (Petrovick et al., 1997) são outros critérios que devem ser

observados.

Após a década de 60 houve um decréscimo no interesse e investimentos por parte

da indústria farmacêutica e institutos de pesquisa. Estes estariam relacionados com o lento

desenvolvimento e o alto custo para se obter os componentes ativos, devido aos processos

trabalhosos para a separação e purificação desses constituintes e a sua elucidação estrutural

(SARRET, 1979; KINGSTON, 1996).

Muitas das desvantagens apontadas para a busca de novos fármacos a partir de

produtos naturais estão sendo ultrapassadas através de avanços técnicos significativos,

principalmente a partir dos anos 80, tanto no desenvolvimento de métodos novos de

4

screening, como nas técnicas de isolamento e elucidação estrutural. Os novos métodos de

screening permitem em pouco tempo a avaliação de um número elevado de amostras quanto à

atividade sobre alvos específicos, enzima, receptor, determinada célula do organismo.

Modelos desse tipo, por exemplo inibição da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase,

enzima chave na biogênese do colesterol, permitem a avaliação de milhares de amostras em

alguns dias (HOOK et al., 1997).

A tendência na terapêutica, desde a metade do século XIX, tem sido a utilização

de substâncias isoladas em substituição aos extrativos vegetais que apresentam alguma

propriedade terapêutica comprovada e tenham seus constituintes ativos identificados. Tal

posicionamento leva em consideração vantagens como o asseguramento da constância de

composição, ausência de qualquer outra substância ativa, além daquela determinante da

atividade e maior facilidade para o controle de qualidade, em relação aos produtos de

composição complexa e não conhecida completamente.

Isso pode ser exemplificado através das vantagens da utilização de quinina em

comparação com extratos de quina, cujo teor em quinina é variável de acordo com a região e

época de coleta da droga vegetal, além da presença de cerca de 30 outros alcalóides

minoritários, entre os quais a quinidina, de ação cardíaca marcante sendo, portanto, o

asseguramento e a manutenção da constância de composição e da qualidade da preparação

mais difícil, em relação com uma forma farmacêutica contendo exclusivamente quinina.

Por esta razão, no período entre o isolamento da quinina (1820) e o final do século

passado, estabeleceram-se na Europa 20 empresas para a produção da quinina. De forma

semelhante, ao longo do tempo, a utilização de extrativos vegetais oriundos de espécies de

Digitalis spp., Papaver ssp., Colchicum autumnale L., Atropa belladonna L., Rauvolfia

serpentina (L.) Benth. Ex Kurz, Pilocarpus jaborandi L., Psychotria ipecacuanha (Brot.)

Strokes (= Cephaelis ipecacuanha (Brot) A. Rich), entre outras, foi substituída em maior ou

menor grau pelo emprego das substâncias isoladas dessas plantas, como: digoxina/digitoxina,

morfina/codeína, colchicina, atropina, reserpina, pilocarpina e emetina, respectivamente

(SCHENKEL et al., 2003).

Produtos naturais têm sido tradicionalmente empregados na identificação de

receptores e na investigação de funções fisiológicas e patofisiológicas e sítios de ação de

5

fármacos. Exemplos clássicos incluem nicotina, fisostigmina, muscarina, pilocarpina e

atropina no estudo de receptores nicotínicos e muscarínicos. Um exemplo mais recente inclui

os ésteres de forbol na compreensão do ciclo do fosfatidilinositol como mecanismo de

transdução celular (EVANS, 1993).

Inúmeras classes de diferentes produtos naturais têm sido empregadas como

matéria-prima para a síntese de diferentes substâncias bioativas. Derivados 4-hidróxi-

cumarínicos originaram o dicumarol, um anticoagulante descoberto pela indústria

farmacêutica Abbott e Lilly em 1945, que interfere na ação da vitamina K. Vários derivados

terpênicos têm sido empregados como matéria-prima em síntese, para a obtenção da

artemisinina, derivado sesquiterpênico com importantes propriedades antimaláricas (AVERY

et al., 1987; 1992).

A síntese do paclitaxel, derivado taxóide identificado em Taxus brevifolia Nutt.

(Wani et al., 1971) licenciado para o uso terapêutico contra o câncer, foi realizada por

Nicolaou e colaboradores a partir da acetilbacatina III (Nicolaou et al., 1994; Nicolaou;

Sorensen, 1996), representando um exemplo da importância dos produtos naturais na síntese

de fármacos (CORRÊA, 1995).

O emprego do safrol, principal componente químico do óleo de sassafrás, como

matéria-prima para síntese de compostos farmacologicamente úteis, forneceu novos análogos

de prostaglandinas, tromboxanos, agentes antiinflamatórios clássicos, nova classe de

substâncias candidatas a protótipo de inibidores seletivos de prostaglandina-endoperóxido

sintase-2 (PGHS-2) e de amidas naturais bioativas.

A importância histórica das substâncias ativas obtidas de plantas como protótipo

para o desenvolvimento de fármacos pode ser demonstrada no Quadro 1. A descoberta da

atividade dessas substâncias não representou apenas o surgimento de um grupo novo de

substâncias, mas originou a identificação de uma nova possibilidade de intervenção

terapêutica. Por exemplo, não se conheciam anestésicos locais, bloqueadores musculares,

anticolinérgicos, entre outras categorias terapêuticas, antes do isolamento e estudo da

atividade da cocaína, tubocurarina e atropina respectivamente. A terapêutica atual seria muito

deficiente, não tivesse ocorrido a descoberta dessas substâncias ativas (ROCHA; SILVA,

1973).

6

QUADRO 1 – Fármacos protótipos de categorias terapêuticas, a partir de plantas

Gênero

Fármaco

Data do isolamento

Categoria Terapêutica

Digitalis

digitoxina

1785-1875

Cardiotônico

Papaver morfina 1805 Hipnoanalgésico

Cinchona quinina 1820 Antimalárico

Atropa atropina 1833 Anticolinérgico

Physostigmina fisostigmina 1864 Anticolinesterásico

Pilocarpus pilocarpina 1875 Colinérgico

Ephedra efedrina 1887 Adrenérgico

Erythroxylon cocaína 1895 anestésico local

Chondrodendrum tubocurarina 1895 Bloqueador neuromuscular

Claviceps ergotamina 1922 Bloqueador adrenérgico

Melilotus dicumarol 1941 Anticoagulante

Rauvolfia reserpina 1952 Neuroléptico

Fonte: Schenkel et al., 2003

Entretanto, compostos conhecidos há muito tempo vêm sendo re-investigados

quanto a novas propriedades, como se exemplifica pela realização de ensaios clínicos com a

fisostigmina e galantamina em doença de Alzheimer (SHU, 1998).

Isto foi possível com a pesquisa fitoquímica que tem por objetivos conhecer os

constituintes químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença. A primeira etapa da

investigação é a coleta do material vegetal. Os processos de fracionamento de extratos

vegetais com vistas ao isolamento de substâncias ativas podem ser monitorados por ensaios

direcionados para a avaliação da atividade biológica (DEY; HARBORNE, 1991). Nos últimos

anos, também vem sendo utilizado o monitoramento das frações por cromatografia líquida de

alta eficiência acoplada a espectrofotômetro ultravioleta e espectrofotômetro de massas

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(CLAE/UV/EM) ou de ressonância magnética nuclear (CLAE/RMN). Essa combinação

possibilita direcionar as operações de fracionamento para o isolamento daqueles compostos

considerados de maior interesse em função dos dados espectrais obtidos (HOSTETTMANN

et al., 1997).

Entre os métodos físicos de análise empregados atualmente na determinação

estrutural, a espectrometria de massas, a espectrometria no ultravioleta (UV), no visível e no

infravermelho, bem como a ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio e carbono

13 constituem os mais amplamente empregados.

Geralmente, é graças ao conjunto de dados espectrais que o pesquisador consegue

elucidar completamente a estrutura de uma substância desconhecida. Essas informações

servem também como instrumentos importantes para a avaliação da qualidade de

fitoterápicos, tanto do ponto de vista qualitativo como quantitativo.

É importante salientar que a ação farmacológica é altamente dependente das

especificações dos produtos empregados. Como um dos exemplos mais claros pode ser

considerado os produtos oriundos do ópio (látex dessecado dos frutos imaturos de Papaver

somniferum L.). O pó de ópio tem usos bem diferentes dos apresentados para a tintura de ópio

(antiespasmódico para a musculatura lisa) e mais ainda dos alcalóides isolados, tais como a

morfina (analgésico de ação no sistema nervoso central) e a codeína (antitussígeno). Este

aspecto revela de modo o mais evidente possível que, raramente, a uma planta medicinal

podem ser imputadas indicações terapêuticas. O efeito farmacológico está ligado diretamernte

ao modo de emprego, onde a planta medicinal deve ser vista como matéria-prima do remédio

ou medicamento. Especialmente as condições de produção podem alterar a concentração das

substâncias ativas e, por conseqüência, a eficácia e a segurança terapêuticas (SCHENKEL et

al., 2003).

Muito freqüentemente, a atividade de extrativos vegetais não é reproduzida pelas

substâncias ativas isoladas, sendo a sua ação determinada por mais de um componente do

extrato, que pode eventualmente atuar sobre os mesmos processos bioquímicos, mas pode

também contribuir de outras maneiras, modificando a solubilidade, alterando fenômenos de

absorção ou influindo sobre a estabilidade. Deve-se salientar ainda a situação paradoxal das

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plantas medicinais brasileiras, consideradas como altamente promissoras, mas das quais tão

pouco se conhece (SCHENKEL et al., 2003).

As potencialidades de uso de plantas medicinais encontram-se longe de estarem

esgotadas. Novos conhecimentos e novas necessidades certamente encontrarão no reino

vegetal, soluções através da descoberta e desenvolvimento de novas moléculas com atividade

terapêutica, ou com aplicações na tecnologia farmacêutica ou no desenvolvimento de

fitoterápicos com maior eficiência de ação (SCHENKEL et al., 2003).

Individualmente, a descoberta de novos fármacos, ou fármacos acessíveis, pode

determinar a melhoria da qualidade de vida em doenças crônicas ou a própria sobrevivência

do paciente afetado. Socialmente, a descoberta de fontes naturais e locais de compostos

químicos usualmente importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de fabrificação

nacional, podem ter conseqüências econômicas significativas, além de possibilitar autonomia

de cada país no gerenciamento de suas políticas de saúde.

A idéia primordial na indicação do uso de fitoterápicos na medicina humana não é

substituir medicamentos registrados e já comercializados, mas sim aumentar a opção

terapêutica dos profissionais de saúde ofertando medicamentos equivalentes, também

registrados, talvez mais baratos, com espectro de ação mais adequados e, com indicações

terapêuticas complementares às medicações existentes, mas sempre em estrita obediência aos

preceitos éticos que regem o emprego de xenobióticos na espécie humana.

A planta medicinal utilizada em medicamentos é um xenobiótico, isto é, um

produto estranho ao organismo humano, nele introduzido com finalidades terapêuticas. Como

todo corpo estranho, os produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e assim

devem ser encarados até prova em contrário. De fato, não há por que, a priori, considerar

inócua uma planta medicinal, se do reino vegetal são obtidas substâncias extremamente

tóxicas como a estricnina, a digoxina, os curares e os heterosídeos cianogênicos (LAPA et al.,

2003).

Do ponto de vista toxicológico, deve-se considerar que uma planta medicinal ou

um fitoterápico não tem somente efeitos imediatos e facilmente correlacionados com a sua

ingestão, mas lembrar, principalmente, os efeitos que se instalam a longo prazo e de forma

9

assintomática, como os carcinogênicos, hepatotóxicos e nefrotóxicos, a exemplo do que

ocorreu recentemente no Brasil com os extratos de confrei (Symphytum officinalle L.)

(HIRONO et al., 1978; ABBOT, 1988; YEONG et al., 1991, 1993; BRASIL, 1992). De forma

semelhante e tão importante é o caso do ácido aristolóquico encontrado em espécies de

Aristolochia (como, por exemplo, o cipó-mil-homens), usadas em casos de gota, artrites,

reumatismo e doenças inflamatórias crônicas de pele. Estudos mostram que a exposição a

esses ácidos tem resultado em um grande número de pacientes com deficiências renais

chegando a alguns casos de morte (EMEA, 2000).

Portanto, o uso popular, e mesmo o tradicional, não são suficientes para validar

eticamente as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros. Nesse sentido, as

plantas medicinais não se diferenciam de qualquer xenobiótico sintético e sua preconização,

ou a autorização oficial do seu uso medicamentoso, devem ser fundamentadas em evidências

experimentais comprobatórias de que o risco a que se expõem aqueles que a utilizam é

suplantado pelos benefícios que possam advir (BRASIL, 1995).

A avaliação dessa segurança, ou seja, a avaliação da relação risco/benefício, é a

finalidade dos estudos farmacodinâmicos e toxicológicos pré-clínicos e clínicos de

medicamentos. Progressos nesse sentido ocorreram nos últimos 40 anos, após o acidente com

a talidomida (Lenz, 1988) e, portanto, foram posteriores à época em que muitos fitoterápicos

foram introduzidos no mercado.

Na sua essência, esses estudos visam garantir o cumprimento dos preceitos éticos

enunciados pela Organização Médica Mundial em 1964 – Declaração de Helsinki – revistos e

atualizados em Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong-Kong (1989) e traduzidos com muitas

particularidades e detalhes nas Diretrizes Éticas Internacionais Para Investigação Biomédica

Envolvendo Seres Humanos propostas pelo Conselho das Organizações Internacionais de

Ciências Médicas e Organização Mundial de Saúde, em 1982, e publicadas em World Health

Organization – WHO (1993). No mesmo sentido, com a intenção declarada de estabelecer

normas aplicáveis globalmente na pesquisa biomédica em seres humanos e facilitar a

movimentação internacional de produtos farmacêuticos, a Organização Mundial de Saúde

propôs o estudo das Diretrizes para as Boas Práticas Clínicas (CGP) em ensaios de produtos

farmacêuticos (WHO, 1992).

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Praticamente todos os países do mundo adotaram a Declaração de Helsinki. No

Brasil, os quatro conceitos bioéticos básicos (autonomia, não maleficência, beneficiência e

justiça) foram incorporados à Resolução 1/1988 do Conselho Nacional de Saúde (CNS),

Ministério da Saúde (MS), posteriormente substituída pela Resolução 196/1996 (Brasil,

1996), que normatiza as pesquisas nessa área visando o aprimoramento do conhecimento

científico e à produção de insumos para o atendimento médico-hospitalar.

Para a finalidade desta exposição, os fitoterápicos, remédios vegetais, remédios

herbários, ou simplesmente plantas medicinais, sob qualquer forma ou processamento, serão

considerados como novos medicamentos para o uso na espécie humana.

A portaria 6/1995 da Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde,

reformulada pela Portaria 1029/1988 e finalmente substituída pela Resolução RDC ANVISA

17/2000, regulamenta as condições para registro de medicamentos fitoterápicos (BRASIL,

1995; 1998; 2000).

A legislação brasileira mencionada acima (Resolução 196/1996 do Conselho

Nacional de Saúde – MS) regulamenta as etapas das pesquisas pré-clínicas e clínicas para

avaliação e registro de novos medicamentos (LAPA et al, 2003).

1.2 Família Lauraceae

A família Lauraceae possui 32 gêneros e em torno de 2000-2500 espécies. São

árvores e arbustos encontrados nas florestas tropicais e subtropicais com casca, folhas verdes

e frutos. O gênero inclui Persea (150spp.), Ocotea (300-400 spp.), Cinnamomum (250 spp.),

Aniba (40 spp.), Litsea (400 spp.), Neolitsea (80 spp.), Lindera (100 spp.), Laurus (2 spp.) e

Cryptocarya (200-250 spp.) (EVANS, 1996).

Muitas espécies são usadas como madeira para construção, perfume e

condimento. Metabólitos secundários foram considerados de interesse fitoquímico

(GOTTLIEB, 1972; GOTTLIEB; YOSHIDA, 1989).

11

A família Lauraceae tem sido a mais estudada, destacando-se, entre outros, o

gênero da Ocotea (WARD, 1999).

1.3 Ocotea duckei Vattimo

A Ocotea duckei Vattimo é um vegetal de porte arbóreo pertencente à família

Lauraceae, conhecida popularmente como “louro de cheiro”, “louro pimenta” ou “louro-

canela”. É uma planta encontrada no nordeste brasileiro nos estados da Paraíba, Pernambuco,

Ceará, Sergipe e Bahia (Barreto, 1990) (Figuras 1 e 2).

As espécies do gênero Ocotea ocorrem em geral em florestas úmidas tropicais e

subtropicais. Quimicamente apresentam uma grande variedade de substâncias, cujos

principais metabólitos são monoterpenos, alcalóides, lignanas e neolignanas (ROMOFF et al.,

1984).

No estudo químico com as cascas do caule desse vegetal foram obtidas seis

lignanas furofurânicas identificadas como epi-de-O-metiliangambina, epivattimfurano,

sesartemina, sesamina, endesmina e iangambina (ALMEIDA et al., 1995).

12

FIGURA 1 – Folhas e flores da Ocotea duckei Vattimo

13

FIGURA 2 – Ocotea duckei Vattimo

14

1.4 Lignóides

As micromoléculas que apresentam na sua estrutura química apenas o grupo

fenilpropânico (C6-C3)n são denominados de lignóides. Essas micromoléculas subdividem-se

em lignanas, neolignanas, alolignanas, norlignanas, oligolignóides e heterolignóides

(HAWORTH, 1942; GOTTLIEB, 1978). Dentre esses lignóides, as lignanas, depois da

celulose, são as substâncias orgânicas mais abundantes nos vegetais (SANTOS, 2003).

As lignanas, neolignanas e seus análogos são micromoléculas resultantes do

metabolismo secundário e responsáveis por inúmeras atividades biológicas (ABREU, 1994).

O termo lignana é originado do latim lignum que significa madeira, lenho. Essas

micromoléculas são dímeros formados a partir do acoplamento oxidativo de álcoois

cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos (HAWORTH, 1942). A literatura relata

mais de 500 lignóides, destes, 90% pertence ao grupo das lignanas e neolignanas

(GOTTLIEB; YOSHIDA, 1989).

Os precursores primários dos lignóides, arilpropanóides, desenvolvem-se a partir

da fenilalanina ou da tirosina através da via redutora (NADP) gerando a formação de ácidos

cinâmicos, aldeídos cinâmicos e álcoois cinamílicos, portanto, quatro monômeros estão

envolvidos na biogênese dos lignóides: ácido cinâmico, ácido cinamílico, propenilfenóis e

alilfenóis. Desta maneira, a formação das lignanas pode ser explicada pelo acoplamento

oxidativo entre unidades monoméricas radicalares. Assim, o acoplamento oxidativo entre os

radicais (cinamoila e cinamila) seguidos da adição de um ou dois íons hidretos, adição de íon

hidreto mais hidroxila inter ou intramolecular e ciclização e aromatização, conduzem a vários

tipos de lignanas, tais como, hordatina, podofilotoxina e iangambina (BARBOSA-FILHO,

2003).

15

1.5 Iangambina

A iangambina é uma lignana furofurânica isolada da Ocotea duckei, que foi

originalmente isolada aproximadamente há 30 anos atrás (Massanet et al., 1989), e tem

também sido purificada de plantas brasileiras (De-QUEIROZ et al., 1991). Esta lignana foi

previamente isolada da Virola elongata bark por MacRae e Towers (1985) e este trabalho

serviu como referencial na identificação do mesmo composto isolado da Ocotea duckei. A

Figura 3 mostra a estrutura química da iangambina.

1.5.1 Características da iangambina

• Sólido incolor

• FM – C24H30O6

• PM = 446

• PF = 118 °C – 120 °C

FIGURA 3 - Estrutura química da iangambina

OMe

MeO

MeO

O

O

OMe

OMe

OMeHH

16

1.5.2 Propriedades farmacológicas da iangambina

O uso tradicional desta planta não é registrado na literatura, no entanto recentes

estudos farmacológicos com o constituinte maior isolado, a iangambina, mostram vários

efeitos biológicos (ALMEIDA et al., 1995).

Evidências indicam que a liberação endógena do PAF, por células ativadas em

situações patológicas tais como choque anafilático e séptico, está provavelmente envolvida no

colapso cardiovascular e morte súbita freqüêntemente observados nestas doenças (LEVI et al.,

1984; TERASHITA et al., 1992). Estudos realizados por Castro-Farias-Neto et al. (1995a),

mostraram que doses baixas de PAF administradas sistematicamente em coelhos induziram

um prejuízo, porém reversível, da função cardiovascular e alterações hematológicas

caracterizadas pela redução dose-dependente na pressão arterial, tanto quanto, pela presença

de leucopenia e trombocitopenia. Eles observaram que a administração de iangambina

provocou desvio paralelo para direita na curva dose-resposta da hipotensão arterial induzida

pelo PAF, sem reduzir a resposta máxima, sugerindo a existência de antagonismo competitivo

com o PAF. Esses estudos também mostraram que a iangambina é um antagonista seletivo aos

efeitos hipotensores induzidos pelo PAF i.v. nas ações cardiovasculares, desde que, não

bloqueou os efeitos de outros mediadores vasoativos tais como, acetilcolina, histamina e

serotonina. Iangambina mostrou seletividade em bloquear a trombocitopenia induzida pelo

PAF, no entanto a leucopenia permaneceu inalterada.

O choque anafilático representa a maior manifestação crítica de reações de

hipersensibilidade imediata. Os sinais clínicos das reações alérgicas podem variar desde

pruridos e urticária, a colapso cardiovascular e morte (BOCHNER; LICHTENSTEIN, 1991).

Alguns mediadores químicos, tais como, histamina, prostaglandinas, leucotrienos,

tromboxano A2 e PAF parecem estar envolvidos na patofisiologia do choque anafilático

(BAKATHIR et al., 1991). Estudos em modelo de choque anafilático em ratos anestesiados

mostram que, a iangambina, é um antagonista do PAF de origem natural que protege da morte

os animais e alivia o colapso cardiovascular causado pelo choque anafilático. Esses achados

caracterizam o PAF como um mediador letal nas reações de hipersensibilidade (RIBEIRO et

al.; 1996).

17

Estudos forneceram evidências farmacológicas que existem tipos diferentes de

receptores do PAF sobre as plaquetas e leucócitos polimorfonucleares (HWANG, 1988;

HWANG, 1990). A iangambina inibe a agregação plaquetária induzida pelo PAF, no entanto

falhou em inibir a agregação induzida pelo colágeno, ADP ou trombina, mostrando que a

lignana é um antagonista específico dos efeitos do PAF nas plaquetas. Esta lignana não inibiu

a quimiotaxia dos neutrófilos induzida pelo PAF, sugerindo que pode ter diferenças entre os

receptores expressos nas plaquetas e nos neutrófilos (CASTRO-FARIAS-NETO et al.,1995b).

O conceito de que o PAF parece contribuir na fase precoce do dano tecidual em

algumas reações alérgicas (Doebber et al., 1986) levou Serra et al. (1997) a examinarem o

potencial da iangambina como uma droga anti-anafilática. Neste estudo observaram a

interferência da iangambina na reação de hipersensibilidade imediata em três modelos,

incluindo o da pleurite alérgica, choque anafilático e contrações espasmogênicas de

segmentos jejunais. Os resultados destes estudos mostraram que a iangambina é um potente

inibidor da infiltração de neutrófilos e eosinófilos, mas não do exsudato, induzido pelo PAF

ou do antígeno na cavidade pleural de ratos. Além disso, ela impede a hemoconcentração,

trombocitopenia e leucocitose induzida pelo PAF e atenua, de forma significativa, a

trombocitopenia e anafilaxia associada a indução alérgica. Esta lignana também exerceu um

efeito supressor no recrutamento leucocitário elicitado pelo LTB4. Estes achados forneceram

evidências que a iangambina exibe propriedade antagonista não somente sobre os receptores

do PAF mas também sobre outros receptores, podendo ser uma importante ferramenta na

conduta de algumas doenças alérgicas (SERRA et al., 1997).

Almeida et al. (1995) avaliaram a possível ação analgésica da iangambina usando

diferentes metodologias tais como os testes de contorções abdominais, retirada da cauda e de

Randall e Selitto (1957). No primeiro modelo a iangambina apresentou uma redução

significativa no número de contorções abdominais induzidas por ácido acético, um teste que

envolve estímulo químico. O segundo teste foi feito através de um estímulo térmico e

apresenta uma maior especificidade para determinar atividade analgésica de substâncias que

agem a nível do sistema nervoso central (ROMOFF et al, 1984). No entanto, a iangambina

não apresentou efeito significativo durante a realização do mesmo. No teste de Randall e

Selitto, a iangambina não elevou o tempo de reação à dor, o que indicaria uma provavel ação

antinociceptiva de natureza periférica. Assim sendo, os autores concluíram que não poderiam

sugerir um efeito analgésico desta substância, entretanto não descartariam a possibilidade da

18

mesma atuar de forma semelhante a agentes anti-histamínicos, estimulantes centrais e

flavonas, que embora possam inibir as contorções abdominais, não possuem ação analgésica

(ICASAHARA; HIKINO, 1987).

Estudo com a finalidade de avaliar o potencial mutagênico da iangambina também

foi feito através do Ames test. Resultados negativos foram obtidos com o tratamento das

linhagens TA97a, TA100 e TA102 de Salmonella typhimurium com a iangambina, indicando

que a iangambina não foi mutagênica para as linhagens testadas mesmo na presença de

ativação metabólica (MARQUES, et al. 2003).

Pachú et al. (1990) através do estudo da toxicidade aguda puderam verificar as

doses tóxicas da iangambina e proceder, a determinação da dose letal 50 % (DL50). Eles

observaram que o efeito letal da iangambina até 48 horas após o tratamento agudo por via

intraperitoneal em camundongos, não ocorreu até a dose de 1 g/kg.

Estudos farmacológicos sugeriram que a iangambina, possui atividade depressora

do sistema nervoso central, havendo possibilidade de atuar como anticonvulsivante e

hipnótico-sedativo (PACHÚ et al., 1990).

1.6 Sistema dopaminérgico

A dopamina pertence ao grupo de neurotransmissores chamado de catecolaminas.

As características estruturais dessas monoaminas são a presença de um único grupamento

amina, um núcleo de catecol (um anel benzeno com dois gupos de hidroxilas adjacentes) e

uma cadeia lateral de etilamina ou um de seus derivados (FELDMAN et al., 1997).

O precursor para a síntese da dopamina é o aminoácido tirosina. Duas reações

transformam a tirosina em dopamina: a primeira é catalisada pela enzima tirosina-hidroxilase

(TH) a qual converte tirosina em L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). A tirosina-

hidroxilase é considerada a enzima limitante desta via (FELDMAN et al., 1997). O segundo

passo é a descarboxilação da DOPA, catalisada pela enzima L-aminoácido descarboxilase

(AADC), a qual produz dopamina (FELDMAN et al., 1997).

19

A dopamina constitui em torno de 80% do conteúdo de catecolaminas no cérebro.

Projeções originadas de áreas cerebrais que sintetizam este neurotransmissor se estendem para

regiões do mesencéfalo formando quatro vias dopaminérgicas: (1) nigroestriatal; (2)

mesolímbica; (3) mesocortical e (4) tuberoinfundibular (Figura 4).

O sistema nigroestriatal compreende os neurônios dopaminérgicos que se

originam da substância negra pars compacta e terminam na região chamada de corpo estriado

dorsal. Esta região, inclui o núcleo caudado e putamen. A via nigroestriatal esta envolvida no

controle dos movimentos e a sua degeneração causa a doença de Parkinson, caracterizada por

tremor de repouso, rigidez e bradicinesia (GERFEN, 1992; LANG; LOZANO, 1998a).

A via mesocortical tem origem na área tegumentar ventral (ATV) e inerva

diferentes regiões do cortex frontal. Esta via parece estar envolvida em alguns aspectos do

aprendizado e memória (LE MOAL; SIMON, 1991; FELDMAN et al., 1997).

A via mesolímbica é originada do mesencéfalo na área tegumentar ventral e

inerva o estriado ventral (nucleus accumbens), o tubérculo olfatório (TO) e parte do sistema

límbico (FELDMAN et al., 1997). Esta via está implicada com o comportamento

motivacional (KOOB; BLOOM, 1988; KOOB, 1992).

A via tuberoinfundibular origina-se das células do núcleo periventricular e

arqueado do hipotálamo (FELDMAN et al., 1997). Projeção desta via atinge a eminência

mediana do hipotálamo onde libera dopamina no espaço perivascular do plexo capilar do

sistema porta hipotalâmico-hipofisário. Daí a dopamina é transportada para a pituitária

anterior onde atua sobre o lactótrofo para inibir a liberação da prolactina. Este hormônio

estimula a produção do leite na glândula mamária (Feldman et al., 1997; Doppler, 1994) e

estimula a proliferação de lactótrofo por um mecânismo autócrino na glândula pituitária

(SAIARDI et al., 1997).

20

Fonte: Rang et al., 2004

FIGURA 4 – Vias dopaminérgicas no cérebro.

1.6.1 Receptores dopaminérgicos

A dopamina exerce sua ação pela ligação a receptores de membrana específicos

(Gingrich; Caron, 1993), os quais pertencem a família de receptores ligados à proteína G

(guanina nucleotídeo) com 7 domínios transmembranas.

Cinco distintos receptores dopaminérgicos foram isolados, caracterizados e

subdivididos em duas sub-famílias, D1- e D2-símile, com base em suas propriedades

bioquímicas e farmacológicas (Quadro 2).

A sub-família D1-símile compreende os receptores D1- e D5-, enquanto o D2-

símile inclui os receptores D2-, D3- e D4-. O C-terminal de ambas sub-famílias contém locais

de fosforilação e esterificação, os quais parecem estar envolvidos na dessenssibilização do

receptor (BATES et al., 1991; NG et al, 1994). Ligantes dopaminérgicos facilmente

distinguem os receptores das sub-famílias D1- e D2-símile. Entretanto, a maioria deles não

diferencia claramente entre os membros da mesma sub-família. Por exemplo, o antagonista do

receptor D1, SCH-23390, ou o agonista SKF-38393 tem afinidade semelhante para ambos

receptores D1- e D5. A seletividade farmacológica destes compostos tem ainda de ser

determinada em animais vivos. Para esta finalidade o uso de animais knock-out de um

21

receptor em particular será de grande ajuda na definição da seletividade de um composto

particular para um receptor específico.

QUADRO 2 – Receptores de dopamina

Distribuição

Papel Funcional

Tipo D1 Tipo D2

D1 D5 D2 D3 D4

Córtex

Reatividade, Humor

+++

−

++

−

+

Sistema límbico Emoção, Comportamento Estereotipado

+++ + ++ +

Estriado Controle motor

+++ + ++ + +

Hipotálamo ventral e adeno-hipófise

Secreção de prolactina − − ++ + −

Transdução de sinais

↑AMPc ↑AMPc ↓AMPc e/ou ↑IP3

↓AMPc e/ou ↑IP3

↓AMPc e/ou ↑IP3

IP3 – trifosfato de inositol Fonte: Rang et al., 2004

1.6.2 Expressão dos receptores dopaminérgicos

Os gens dos receptores dopaminérgicos D1- e D2 possuem uma maior distribuição

e apresentam maiores níveis de expressão. O receptor D1 é principalmente expresso no

caudado-putamen, núcleo accumbens, tubérculo olfatório, córtex cerebral (JACKSON;

WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Os receptores D1 também foram detectados na ilha de

Calleja e no núcleo sub-talâmico (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Na

substância negra pars reticulata não foi detectado nenhum RNAm para o receptor D1, embora

tenha sido mostrado a ligação de ligantes específicos para este receptor nesta região. Isto

sugere que o receptor D1 é sintetizado no neurônio estriatal que envia suas projeções para a

substância negra através da via nigroestriatal (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON,

1994).

22

O gen do receptor D5 tem um padrão de expressão mais restrito quando

comparado com o receptor D1. A expressão deste receptor foi detectada no hipocampo, núcleo

mamilar lateral e no núcleo parafascicular do tálamo (JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994).

O receptor D2 é expresso predominantemente nos tecidos cerebrais, tais como o

caudado putamen, tubérculo olfatório e núcleus accumbens. Este receptor é também expresso

na substância negra pars compacta e na área tegumentar ventral. Estas são as regiões

anatômicas que originam as fibras dopaminérgicas, indicando que os receptores D2 têm uma

localização pré-sináptica. Em contraste, os receptores D1-símile são receptores

exclusivamente pós-sinápticos (CIVELLI et al., 1991). Além do cérebro os receptores D2

estão também localizados na retina, fígado, sistema vascular e glândula pituitária (NG et al,

1994, JACKSON;WESTLIND-DANIELSSON, 1994; PICETTI et al., 1997).

A distribuição neuroanatômica do RNAm do receptor D3 no cérebro de ratos é

restrita a poucas regiões cerebrais tais como a ilha de Calleja, um pouco do núcleo septal,

hipotálamo e regiões distintas do tálamo e cerebelo (JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994). Além disso, o receptor D3 está também localizado na substância negra

pars compacta indicando localização pré-sináptica.

O receptor D4 parece estar altamente expresso no córtex frontal, amígdala, bulbo

olfatório, hipocampo, hipotálamo e mesencefálo (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON,

1994).

1.6.3 Vias de transdução de sinal

As vias de transdução de sinal ativadas pelos receptores dopaminérgicos são

numerosas. Entretanto os efeitos mais descritos mediados pela dopamina são a ativação ou

inibição da via do AMPc e a modulação da atividade de canais.

A estimulação de efetores celulares originados de receptores dopaminérgicos é

mediada via interação com membros de proteínas regulatórias heterotriméricas ligadas ao

GTP (proteína G) (HEPLER; GILMAN, 1992). A região da terceira alça intracelular dos

23

diferentes receptores dopaminérgicos tem um papel central na interação com a proteína G

(STRADER et al., 1989).

1.6.3.1 Adenilato ciclase

Receptores do sub-tipo D1-símile são reguladores dos níveis de AMPc

(MONSMA-JR et al., 1990; SUNAHARA et al.,1991; JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994). A estimulação destes receptores resulta na ativação da proteína kinase

A (PKA). A PKA fosforila proteínas citoplasmáticas e nucleares e regula o metabolismo

celular, incluindo a função de canais iônicos e também dessenssibiliza a proteína G ligada aos

receptores, levando a uma resposta celular para liberar o neurotransmissor (CHOI et al., 1993;

HOFMANN et al., 1994).

A inibição da atividade da adenilato ciclase, entretanto, parece ser uma

propriedade geral dos receptores D2-símile. O receptor D2 foi primeiro caracterizado como um

inibidor dos níveis de AMPc intracelular na glândula pituitária, e nas células estriatais. O

receptor D2 desencadeia a inibição da adenilato ciclase por acoplamento de vias sinalizadas

bloqueadas pela toxina pertussis (GINGRICH; CARON, 1993; JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994). Similarmente ao receptor D2, o receptor D3 é descrito como um

inibidor dos níveis de AMPc endógeno em vários tipos celulares (JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994; ROBINSON; CARON, 1997; MISSALE et al., 1998). Entretanto, o

receptor D3 parece inibir a adenilato ciclase com menos eficiência que o receptor D2

(MISSALE et al., 1998). A literatura também relata que o receptor D4 pode inibir o acúmulo

de AMPc na retina e em uma variedade de tipos celulares (MISSALE et al., 1998).

1.6.3.2 Canais de cálcio e potássio

A estimulação do receptor D1 aumenta a corrente dos canais de Ca2+ do tipo L e

leva a redução da corrente nos canais de Ca2+ do tipo N e P em neurônios neoestriatais de

ratos, via uma ação direta ou indireta da PKA (MISSALE et al., 1998). De modo oposto, em

células glomerulares da adrenal em ratos, o receptor D1 inibe a corrente dos canais de Ca2+ do

tipo T (DROLET et al., 1997). Os receptores D1 podem também mobilizar os estoques de

24

Ca2+ intracelulares pela ativação da via do AMPc sem ativar a hidrólise do fosfoinositídeo

(MISSALE et al., 1998).

Os receptores D2 podem diretamente modular vários efetores diferentes pela

ligação da subunidade α da proteína Gi (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).

Além disso, via proteína Gi, o receptor D2 reduz a corrente de canais de Ca2+ do tipo N em

interneurônios colinérgicos neoestriatais em ratos (Yan et al., 1997) e medeia a inibição da

atividade de Ca2+ nos melanótrofos (TARASKEVICH; DOUGLAS, 1990).

A modulação do receptor D2 na concentração do Ca2+ intracelular pode ter um

papel importante na biossíntese da dopamina, visto que os receptores D2 têm localização tanto

pré como pós-sináptica. De fato a tirosina-hidroxilase, a enzima que limita a taxa de produção

da dopamina, é ativada pela Ca2+/calmodulina dependente de proteína-quinase (Braun;

Schulman, 1995) e a Ca2+/calmodulina dependente de proteína-quinase é subsenqüêntemente

ativada por Ca2+ ligado a calmodulina (CHOI et al., 1993).

Existem trabalhos conflitantes reportando que os receptores D1-símile são capazes

de aumentar ou diminuir o efluxo de potássio. De fato foi demonstrado que os agonistas D1-

símile aumentam a corrente de potássio em células de retina de galinha via um mecanismo

independente de AMPc, mas inibem este efluxo em neurônios estriatais de ratos (MISSALE

et al., 1998). Correntes de potássio em vários tecidos neurais, tais como o estriado, neurônios

dopaminérgicos mesencefálicos, lactótrofos e melanótrofos são regulados pela ativação dos

receptores D2 (SUNAHARA et al., 1991; JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).

1.6.4 Funções da dopamina

A importância da dopamina no controle dos movimentos é demonstrada em

condições patológicas tais como a doença de Parkinson. De fato esta doença é caracterizada

pela redução da dopamina circulante devido à degeneração de neurônios dopaminérgicos

(LANG; LOZANO, 1998a, 1998b). A disponibilidade de agonistas e antagonistas permitiu

estudos, os quais indicam o papel dos receptores dopaminérgicos nas funções motoras tais

como locomoção, rearing, catalepsia, sniffing e grooming em camundongos e ratos.

Geralmente, agonistas aumentam a função dopaminérgica, aumentando a atividade motora,

25

enquanto os antagonistas possuem efeito oposto. A administração sistêmica do agonista do

receptor D1, SKF-38393, em ratos aumenta o grooming e o sniffing, mas não aumenta

significantemente a locomoção ou outros comportamentos estereotiopados (JACKSON;

WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Entretanto, a infusão direta deste agonista dentro do

núcleo accumbens também afeta a locomoção, rearing e a estereotipia de maneira dose-

dependente (MEYER et al., 1993a). De forma oposta, a injeção de antagonistas dos receptores

D1, tais como SCH-23390 ou SKF-83566 reduzem os mesmos comportamentos, de maneira

dose e tempo-dependente (MEYER et al., 1993b).

As administrações de baixas doses de agonistas dos receptores D2 causam uma

redução das funções motoras, provavelmente pela estimulação dos receptores pré-sinápticos.

Isto leva a uma redução do disparo das células dopaminérgicas e liberação de dopamina

(JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994). A injeção de antagonistas dos receptores

D2, tanto quanto antagonistas dos receptores D1, diminuem a atividade motora. Quando altas

doses destes compostos são administradas, o animal torna-se cataléptico, mantendo uma

posição anormal por um período de tempo (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994;

FELDMAN et al., 1997). Um achado interessante consiste no efeito sinérgico entre os

receptores D1 e D2, desde que estereotipia induzida pela administração de agonistas dos

receptores D1 e D2 juntos são mais intensas que aquelas produzidas por um dos agonistas

sozinho (JACKSON;WESTLIND-DANIELSSON, 1994; FELDMAN et al., 1997).

A geração de camundongos modificados geneticamente para os diferentes

componentes das vias dopaminérgicas constitui uma poderosa ferramenta para estudar o papel

dessas proteínas in vivo. Análise comportamental de animais mutantes para quatro receptores

dopaminérgicos (D1-D4) mostrou que cada um apresenta um fenótipo locomotor.

Inesperadamente, em contraposição aos prognósticos feitos a partir de análises

farmacológicas, a locomoção em animais knock-out de receptores D1 não é afetada (Drago et

al., 1994), nem tão pouco a sua linha de base aumenta, quando comparado aos animais

normais (XU et al., 1994). Estes resultados confirmam dados anteriores sugerindo uma

interação mais complexa entre os diferentes tipos de receptores dopaminérgicos na regulação

dos movimentos voluntários, especialmente com respeito à interação dos receptores D1 e D2.

26

O estudo do comportamento locomotor de camundongo Knock-out para o receptor

D2 claramente revelou um impedimento motor no camundongo mutante (BAIK et al., 1995).

O impedimento é caracterizado pelos movimentos reduzidos e não-coordenados e também na

supressão de rearings.

Mutantes de receptores D3 e D4 também mostraram fenótipo locomotor anormal.

Mutantes do receptor D3 apresentaram um fenótipo hiperlocomotor o qual está de acordo com

os resultados obtidos pelos estudos farmacológicos usando agonistas (Feldman et al., 1997) e

antagonistas (Accili et al., 1996) de receptores D3. Surpreendentemente, a locomoção em

mutantes dos receptores D4 foi também afetada, e em particular é reduzida, apesar do que tem

sido predito da expressão anatômica deste receptor (SVENSSON et al., 1994; RUBINSTEIN

et al., 1997).

1.7 Sistema colinérgico

A acetilcolina representa a classe de neurotransmissores do sistema nervoso

parassimpático, ambos em nível de transmissão ganglionar e nas junções neuroefetoras

(BARNES, 1987; ANDERSON; GRUNDSTROM, 1987; UNDEM; MYERS,1997).

Como neurotransmissor a acetilcolina é sintetizada nas terminações nervosas pela

enzima colina acetiltransferase, usando Acetil-CoA e colina como substratos. A aceticolina é

então acumulada em vesículas sinápticas. Eventualmente, o influxo de cálcio induz

despolarização gerando a liberação exocitótica do neurotransmissor dentro do espaço

extracelular. Aí, a acetilcolina pode interagir com os receptores localizados sobre as células

alvo (pós-sinápticos ou receptores pós-juncionais) tanto quanto sobre os seus próprios

terminais nervosos colinérgicos (pré-sinápticos ou auto-receptores pré-juncionais). A ação da

aceticolina é finalizada pela aceticolinesterase, a qual está altamente expressa nas adjacências

dos nervos colinérgicos, ambos pré- e pós-juncionais (CANNING; FISCHER, 1997).

Recentes estudos, em particular o de Wessler et al. (2001), demonstraram

claramente que a colina acetiltransferase e o seu produto acetilcolina, estão presentes em uma

grande extensão de células não-neuronais, incluindo células epiteliais e endoteliais, células do

músculo liso, tanto quanto, várias células do sistema imune, tais como linfócitos, macrofágos,

27

eosinófilos e neutrófilos (KLAPPROTH et al., 1997; WESSLER et al., 1999). Comparada à

situação nos nervos, onde a acetilcolina é estocada em vesículas, está faltando um mecanismo

de estoque particular para a acetilcolina, nas células não-neuronais. Todavia, existe uma boa

evidência de que a acetilcolina pode também ser liberada de células não-neuronais. Por

exemplo, a liberação de acetilcolina foi demonstrada em diferentes preparações de células

epiteliais (WESSLER et al., 1999). Entretanto o mecanismo de liberação de células não-

neuronais é completamente diferente do observado nas terminações nervosas. Usando

placenta humana como modelo para estudo in vitro da liberação de acetilcolina não neuronal,

evidências mostram que a acetilcolina é expelida de células não-neuronais via transporte ativo

mediado por membros da família transportadora de cátion orgânico (WESSLER et al., 2001).

Embora existam especulações substanciais a respeito do papel funcional da aceticolina não-

neuronal (Wessler et al., 1998; Wessler et al., 1999), dados limitados foram elaborados para

apoiar a função específica desta acetilcolina. Uma contribuição no controle da adesão celular

epitelial, interações célula-célula, e na proliferação, parece ser a mais documentada, tendo

portanto, um papel na regulação da integridade da camada epitelial.

Os neurônios colinérgicos possuem um papel central no controle da atividade

estriatal via receptores muscarínicos (BERNARD et al., 1993). Infelizmente poucos estudos

existem que elaborem tal regulação muscarínica, especialmente visando interações entre

acetilcolina e aminoácidos. De qualquer modo, o conhecimento dos subtipos de receptores

muscarínicos sobre os terminais nervosos estriatais liberando os principais transmissores

inibitórios e excitatórios do cérebro deveriam ser explorados do ponto de vista terapêutico em

algumas desordens do movimento e na doença de Alzheimer (SUGITA et al., 1991). Um

estudo usando fatias de estriado e superfusão local no estriado de ratos anestesiados indicou

que os receptores colinérgicos controlam a atividade de liberação do glutamato corticoestriatal

via um mecanismo de feed-back negativo (GODUKHIN et al., 1984). Realmente, foi

demonstrado que o glutamato parece ativar os interneurônios colinérgicos (Kawaguchi et al.,

1995), levando a liberação da acetilcolina (Giovannini et al., 1994), a qual diminui a liberação

do glutamato via receptores muscarínicos pré-sinápticos e receptores nicotinícos sensíveis nos

interneurônios estriatais (Godukhin et al., 1984) (Figura 5). A liberação espontânea de

GABA endógeno foi elevada quando oxotremorina, um agonista muscarínico não-seletivo, foi

administrada em estriado de rato, aparentemente por intermédio de uma facilitação

muscarínica (van der HEYDER et al., 1980). Registros intracelulares realizados em neurônios

estriatais in vitro demonstraram que a muscarina e aceticolina inibiram a liberação do GABA

28

e do aminoácido excitatório (SUGITA et al., 1991). Dois estudos de microdiálise, em ratos

movimentando-se livremente, levaram a conclusão de que a ativação de receptores

muscarínicos M1 eleva e que a dos receptores M2 inibe a liberação da dopamina no estriado

desses animais (XU et al., 1989; DE KLIPPEL et al., 1993).


FIGURA 5 – Vias da acetilcolina no cérebro

1.7.1 Receptores colinérgicos

A acetilcolina pode atuar através de duas classes diferentes de receptores, os

receptores nicotínicos e muscarínicos.

1.7.1.1 Receptores nicotínicos

Os receptores nicotínicos estão ligados a canais iônicos e sua ativação usualmente

causa um influxo de íons de carga positiva resultando na despolarização da membrana, a qual

pode ser detectada, por exemplo, como “potencial excitatório pós-sináptico” em neurônios

pós-ganglionares. Receptores nicotínicos são formados por cinco sub-unidades homólogas ou

29

idênticas organizadas formando um íon de canal central (CONTI-TRONCONI et al., 1994;

LINDSTRON, 2000). Existem múltiplas isoformas de receptores nicotínicos. Receptores

nicotínicos musculares, localizados na placa terminal das junções neuromuscular são

formados de duas subunidades α, uma β, uma γ e uma δ, embora os receptores nicotínicos

neuronais parecem ser compostos de somente dois tipos diferentes de subunidades (α e β) ou

de cinco subunidades α. Pelo menos dez diferentes subunidades α e quatro β foram

identificadas até o momento e os neurônios expressaram α2-10 e β2-4 (CONTI-TRONCONI et

al., 1994; SGARD et al., 2002). Dependendo da composição da subunidade, os receptores

nicotínicos mostram diferentes cinéticas de ativação e inativação e variadas propriedades

farmacológicas.

1.7.1.2 Receptores muscarínicos

Os receptores muscarínicos da acetilcolina medeiam a maioria das ações do

neurotransmissor acetilcolina no sistema nervoso central e no sistema nervoso periférico

assim como em orgãos de terminações nervosas parassimpáticas. Em mamíferos, cinco

distintos subtipos de receptores muscarínicos (M1-M5) foram identificados, com cada subtipo

de receptor sendo produto de um gen diferente (Quadro 3). Os receptores muscarínicos

pertencem à superfamília de receptores de sete segmentos transmembranas, os quais ativam

vias de transdução de sinais através de sua interação com o nucleotídeo guanina ligados a uma

proteína heterotrimérica regulatória (proteína G). Os subtipos de receptores M1, M3 e M5 são

eficientemente ligados à toxina pertussis através de subtipos de proteína Gαq/11 e Gα13,

levando por exemplo, a ativação da fosfolipase C e fosfolipase D, enquanto os receptores M2

e M4 ligam-se preferencialmente a toxina pertussis ativando proteínas Gi e Go, levando a

inibição da adenilato ciclase (CAULFIELD, 1993; RÜMENAPP et al., 2001).

Os diferentes subtipos de receptores muscarínicos mostram único mas não

exclusivo, modelo de expressão no sistema nervoso central e orgãos periféricos, tais como o

coração, glândulas exócrinas e tecidos musculares lisos (LEVEY et al., 1991, CAULFIELD,

1993). Estudos em camundongos geneticamente modificados faltando um dos subtipos de

receptores muscarínicos tem identificado importantes, mas desconhecidas, funções de vários

subtipos de receptores no sistema nervoso central e sistema nervoso periférico. Por exemplo,

30

os receptores muscarínicos M1 no sistema nervoso central são os principais mediadores da

ativação da MAP-quinase induzida pela acetilcolina, um processo essencial para a memória

(HAMILTON et al., 1997; HAMILTON; NATHANSON, 2001). A deficiência do receptor

M1 também leva a uma significante elevação da transmissão dopaminérgica no estriado e um

enorme aumento da atividade locomotora (GERBER et al., 2001; MIYAKAWA, 2001). Além

disso, a deficiência de receptores M1 em camundongos apresenta um aumento da resposta

para os efeitos estimulatórios da anfetamina (GERBER et al., 2001).

Os receptores muscarínicos do subtipo M2 contribuem para a mediação da

antinocicepção central, e os camundongos knockout para este receptor mostram interrupção

do tremor induzido pelo agonista e atenuação da hipotermia induzida pelo agonista

(GOMEZA et al., 1999a). Além do mais, os receptores muscarínicos M2, são essenciais para a

bradicardia dependente deste receptor e contribuem, embora somente em pequena extensão,

para a contração induzida na base do estômago, bexiga urinária e traquéia (STENGEL et al.,

2000).

Os receptores muscarínicos do subtipo M3 têm um papel chave na secreção

salivar, contração da pupila e contração do músculo detrusor da bexiga em camundongos

(MATSUI et al., 2000). De forma importante os receptores M3 estão envolvidos na regulação

da ingestão da comida e apetite: camundongos deficientes para este tipo de receptor

apresentam uma significante redução na ingesta de alimentos, redução do peso corporal e dos

depósitos de gordura periférica (YAMADA et al., 2001b).

Como os receptores muscarínicos M1, os receptores M4, no cérebro, estão

envolvidos na modulação da resposta dopaminérgica central: camundongos com deficiência

de receptores M4 mostram um aumento na atividade locomotora basal e uma grande elevação

na resposta locomotora após ativação de receptores dopaminégicos D1 (GOMEZA et al.,

1999b). Os receptores M4, entretanto, parecem possuir um papel insignificante na regulação

do tônus da musculatura lisa periférica (STENGEL et al., 2000).

Finalmente, os receptores muscarínicos da acetilcolina do subtipo M5 facilitam a

liberação da dopamina induzida pelos receptores muscarínicos no estriado e modulam em

ambos processos de recompensa e retirada da morfina (BASILE et al., 2002). Além disso, os

31

receptores M5 são requisitados na dilatação colinérgica de artérias e arteriolas sangüíneas

cerebrais (YAMADA et al., 2001a).

Um aspecto geral dos receptores muscarínicos e de outros receptores ligados à

proteína G é que eles são altamente regulados. Progressos impressionantes têm sido feitos no

entendimento do mecanismo molecular que regula os sinais dos receptores muscarínicos.

Como os receptores muscarínicos são largamente considerados como modelo para outros

receptores ligados a proteína G, especialmente aqueles ligados às proteínas Gαi e Gαq/11, este

conhecimento aplica-se a um grande número de outros receptores ligados à proteína G.

QUADRO 3 - Subtipos muscarínicos de receptores da acetilcolina

Receptor Principais localizações

Resposta celular Resposta funcional

M1 SNC: córtex, hipocampo Glândulas: gástrica, salivares, etc.

↑ IP3, DAG Despolarização

Excitação (peps lento)

↑ condutância do K+

Excitação do SNC (?memória) Secreção gástrica

M2 Coração: átrios Músculo liso: TGI SNC: ampla distribuição

↓AMPc ↓ Condutância do Ca++

↑ Condutância do K+

Inibição cardíaca Inibição neural Efeitos muscarínicos centrais (tremor e hipotermia)

M3 Glândulas exócrinas: gástricas, salivares, etc. Músculo liso: trato GI, olho Vasos sangüíneos: endotélio

↑ IP3

↑ [Ca++]i Secreção gástrica, salivar Contração do músculo liso GI Acomodação ocular Vasodilatação

M4 ? Pulmão SNC: corpo estriado

Igual ao M2 Aumento da locomoção

M5 SNC: expressão muito localizada na substância negra Glândulas salivares Íris/ músculo ciliar

Igual ao M3 Desconhecida


IP3- trifosfato de inositol; DAG – diacilglicerol; GI- gastrintestinal

32

1.7.2 Regulação do receptor muscarínico da acetilcolina

Embora a acetilcolina seja rapidamente hidrolisada depois de liberada, a

dessenssibilização dos receptores muscarínicos ocorre abaixo das condições fisiológicas assim

como os nervos vagais são tonicamente ativos no animal intacto. Além do mais, a

administração in vivo de antagonistas dos receptores muscarínicos bloqueando a liberação da

acetilcolina ou induzindo o estado de inatividade do receptor muscarínico pode evocar up-

regulation deste receptor (WALL et al., 1992; WITT-ENDERBY et al., 1995). Assim como

ocorre com um grande número de receptores ligados a proteína G, a dessenssibilização

induzida por agonistas dos receptores muscarínicos usualmente envolve fosforilação do

receptor (KWATRA; HOSEY, 1986; HAGA; HAGA, 1990). Esta modificação do receptor

ocorre sobre os resíduos de serina ou treonina na terceira alça citoplasmática e no C-terminal

dos receptores muscarínicos da aceticolina.

1.8 Sistema serotonérgico

Desde a sua descoberta há mais de 50 anos atrás, a serotonina tem provado ser um

dos maiores neuromediadores centrais, tanto do ponto de vista filogenético como

ontogenético. Seu papel como neurotransmissor foi demonstrado em uma grande variedade de

invertebrados e vertebrados, enquanto as funções morfogenéticas da serotonina surgem muito

cedo durante o desenvolvimento cerebral (LAUDER; KREBS, 1978). Além disso, a

serotonina não é restrita ao sistema nervoso central. Os neurônios serotonérgicos têm um

papel importante na inervação entérica, e a serotonina pode ser estocada e liberada dos assim

chamados paraneurônios e plaquetas sangüíneas. A profusa distribuição dos terminais

contendo serotonina contrasta com a limitada e discreta localização de suas células corporais

correspondentes, localizadas principalmente nos núcleos da rafe. Esta ampla distribuição da

inervação serotonérgica explica a variedade de funções nas quais a serotonina está envolvida,

incluindo o ciclo sono-vigília, controle do humor, controle sexual e alimentar,

termoregulação, controle da dor etc. Além do mais, disfunções serotonérgicas foram

reportadas em numerosos processos neuropatológicos tais como desordens do sono, ansiedade

e depressão, agressividade, bulimia e anorexia, tanto quanto nas condições

33

neurodegenerativas incluindo as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington (VERGÉ;

CALAS, 2000).

Os neurônios contendo serotonina originam-se no mesencefálo no núcleo da rafe e

inervam a substância negra e a área tegmentar ventral. Estudos neuroanatômicos mostram

uma alta densidade de fibras serotonérgicas imunoreativas na substância negra pars compacta,

pars reticulata e área tegmentar ventral (HERVÉ et al., 1987; MOUKHLES et al., 1997).

Interessantemente, o tegmento ventral mesencefálico incluindo a substância negra contém

altas concentrações de serotonina, e ambas, substância negra pars compacta e reticulata,

recebem uma densa contribuição serotonérgica, a qual é maior na substância negra reticulata

(9x106 varicosidade/mm3) que na pars compacta (6x106 varicosidade/mm3) (MOUKHLES et

al., 1997). Áreas terminais de substância negra pars compacta e área tegmentar ventral, tais

como o estriado ou o núcleo accumbens, recebem uma contribuição de neurônios

serotonérgicos originados no núcleo da rafe (Azmitia; Segal, 1978) (Figura 6). Vários

subtipos de receptores serotonérgicos estão presentes nos gânglios basais. Uma alta densidade

de receptores 5-HT1B foram encontrados na substância negra, área tegmentar ventral, globus

pallidus e núcleo entopenducular (PAZOS; PALACIOS, 1985; BARNES; SHARP, 1999). Em

contraste, locais de ligação dos receptore 5-HT1A e RNAm codificando o receptor 5-HT1A são

detectados nos gânglios basais (BARNES; SHARP, 1999). Por outro lado, de alto a moderado

níveis de receptores 5-HT2A e 5-HT2C e o RNAm correspondente estão presentes em várias

áreas do prosencéfalo incluindo o gânglio basal e o sistema límbico.

O entendimento da função da neurotransmissão dentro de áreas do sistema

nervoso onde ela tem sido localizada também requer a identificação do seu alvo e os

mecanismos de transduções associados aos receptores. A história dos receptores

serotonérgicos começou com o trabalho de Gaddum e Picarelli (1957) que definiu dois

subtipos de receptores 5-HT, chamados D e M baseado no bloqueio destes receptores pela

dibenzilina ou morfina, respectivamente. O desenvolvimento de ensaios de binding usando

radioligante e a progressiva disponibilidade de ligantes seletivos, tornou possível a

caracterização de vários subtipos de receptores, enquanto a sua distribuição cerebral é

estudada usando autoradiografia quantitativa. Mais recentemente, um grande número de gens

codificando subtipos de receptores 5-HT foram identificados (HOYER; MARTIN, 1997). A

disponibilidade do número crescente de anticorpos específicos (Vergé; Harmon, 1997)

possibilitou o estudo da localização dos receptores 5-HT em níveis celular e subcelular.

34


FIGURA 6 - Vias da 5-hidroxitriptamina (serotonérgicas) no cérebro.

1.8.1 Localização dos receptores serotonérgicos

Estudos de autoradiografia usando radioligantes seletivos demonstraram que os

locais de ligação de cada subtipo de receptor mostram uma particular distribuição regional no

cérebro e os estudos imunocitoquímicos geralmente confirmam estes dados.

Desta forma os receptores 5-HT1A estão principalmente localizados nas estruturas

límbicas: o hipocampo, córtex, septum, amígdala e núcleus da rafe e a projeção dorsal da

coluna espinhal (MARCINKIEWICZ et al., 1984; PAZOS; PALACIOS, 1985; KIA et al.,

1996).

Os receptores 5-HT1B estão localizados predominantemente nas áreas

extrapiramidais tais como a substância negra, globus pallidus e com menor densidade no

estriado (PAZOS; PALACIOS, 1985; PAZOS et al., 1985b; VERGÉ et al., 1986; SARI et al.,

1997).

35

Os receptores 5-HT1D, os quais estão intimamente relacionados com os receptores

5-HT1B, são menos abundantes e localizam-se nas mesmas áreas. De qualquer modo, o

RNAm do receptor 5-HT1D foi encontrado em alta densidade com respeito aos receptores 5-

HT1B no nucleos trigêmeo de cobaio e humano (Rebeck et al., 1994; Bouchelet et al.,1996),

sugerindo o envolvimento preferencial deste subtipo de receptor no efeito inibitório do

sumatriptano na inflamação neurogênica.

Os receptores 5-HT1E e 5-HT1F são menos abundantes e os mais pobremente

caracterizados. O primeiro subtipo foi encontrado nas áreas corticais, estriado e amígdala de

cérebros de roedores e primatas (BRUINVELS et al., 1994). No cérebro de cobaio, o RNAm e

locais de ligação para os receptores 5-HT1F foram detectados no córtex, núcleo mamilar,

núcleo talâmico e núcleo oculomotor (MENGOD et al., 1996).

Locais de ligação para os receptores 5-HT2A, formalmente denominados de 5-HT2,

são particularmente abundantes no claustrum, tubérculo olfatório e córtex frontal (PAZOS et

al., 1985a). Estudos imunocitoquímicos recentes (Hamada et al., 1998; Wu et al., 1998;

Cornea-Hébert et al., 1999) confirmaram esta localização.

Os receptores 5-HT2C (formalmente chamados de 5-HT1C) são altamente

expressos no plexo coróide (Pazos; Palacios, 1985), e estão também presentes em muitas

estruturas cerebrais, tais com o núcleo olfatório anterior, córtex piriforme, nucleus

accumbens, estriado ventral, núcleo talâmico e amigdalóide, substância negra (MENGOD et

al., 1990).

Os locais de ligação do receptor 5-HT3 estão principalmente localizados em um

número limitado de estruturas medulares: o núcleo do trato solitário, o núcleo dorsal do nervo

vago e o núcleo do trato espinhal do nervo trigêmeo, e a projeção dorsal da coluna espinhal

(KILPATRICK et al., 1988; LAPORTE et al., 1992). Locais de baixa densidade foram

encontrados no hipocampo, amígdala e cortex entorinal (LAPORTE et al., 1992).

Investigações iniciais imunocitoquímicas indicaram uma enorme distribuição do receptor 5-

HT3, notavelmente no córtex e núcleo olfatório anterior (MORALES et al., 1996, 1998).

Os locais de ligação e o RNAm do receptor 5-HT4 foram encontrados em várias

áreas cerebrais: o sistema olfatório, estriado, córtex, septum, hipocampo, amígdala,

36

hipotálamo dorsal, substância negra e núcleo interpeduncular (WAEBER et al., 1994;

VILARÓ et al., 1996).

Os receptores 5-HT5 são pobremente caracterizados. Tem sido sugerido que este

subtipo de receptor está localizado principalmente nos astrócitos (CARSON et al., 1996).

Estudos recentes com camundongos knock-out para os receptores 5-HT5A, usando

autoradiografia e 125I-LSD na presença de clozapina e espiperona indicaram uma restrita

localização de locais de ligação dos receptores 5-HT5A no bulbo olfatório e neocortex, embora

os locais de ligação do receptor 5-HT5B fossem encontrados no dorsomedial do tálamo

(WAEBER et al., 1998).

Os receptores 5-HT6, os quais não puderam ser estudados usando ligantes

seletivos, foram localizados no tubérculo olfatório, córtex, estriado, núcleo accumbens e

hipocampo, usando hibridização localizada (Ruat et al., 1993) e imunocitoquímica (GÉRARD

et al., 1997).

Na ausência de um radioligante seletivo, os locais de ligação dos receptores 5-HT7

foram estudados usando diferentes radioligantes com coquetéis de drogas apropriadas.

Estruturas fortemente marcadas incluíram o cortex, hipocampo e o núcleo talâmico,

hipotalâmico e amigdalóide (WAEBER; MOSKOWITZ, 1995; GUSTAFSON et al., 1996).

1.9 Sistema gabaérgico

O ácido γ-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório no

sistema nervoso central de vertebrados. O GABA ativa três diferentes classes de receptores

tais como: GABAA, GABAB e GABAC.

Os receptores GABAA, estão ligados a canais iônicos de Cl- (BORMANN, 1988;

SILVILOTTI; NISTRI, 1991). Estes receptores são ativados pelo GABA, muscimol e

isoguvacina, e são inibidos pela bicuculina, gabazina (SR 95531) e (+)-β-hidrastina

(WERMUTH et al., 1986). Os receptores GABAB são ativados pelo GABA, (-)-baclofen,

ácido (±)-4-amino-3-(5-cloro-2-tienil)butanóico e ácido 3-aminopropil-(metil)fosfínico (SKF

97541), e são inibidos pelo faclofen, saclofen e 2-hidroxisaclofen (SEABROOK et al., 1990).

37

Estes receptores são conhecidos por estarem ligados a canais de Ca2+ ou K+, via proteína G,

tanto quanto por ativarem sistemas de segundos mensageiros dentro da célula (BORMANN,

1988; BOWERY, 1993). Os receptores GABAC são derivados de várias isoformas da

subunidade-ρ, e estão diretamente associados a canais de íon cloro. Estes receptores são

ativados por GABA e certas conformações restritas análogas ao GABA tais como ácido cis-4-

aminocrotônico (CACA) e ácido trans-4-aminocrotônico (TACA), e são inibidos pelo ácido

imidazol-4-acético e ácido [(1,2,5,6-tetrahidropiridina-4-yl)metilfosfínico] (TPMPA)

(Ragozzino et al., 1996) mas são insensíveis a bicuculina, barbituratos, benzodiazepínicos e

baclofen (FEIGENSPAN et al., 1993; QIAN; DOWLING, 1993, WISDEN et al., 1996).

Recentemente tem sido proposto que os receptores GABAC poderiam ser classificados como

um set especializado de receptores GABAA (BARNARD et al., 1998). Os receptores GABAA

(Figura 7) são os de maior importância por possuirem um papel central na regulação da

excitabilidade cerebral, e muitas drogas importantes tais como os benzodiazepínicos,

barbitúricos, neuroesteróides, etanol e alguns anticonvulsivantes e anestésicos gerais

interagem com estes receptores tanto quanto elicitam seus efeitos farmacológicos.

Fonte: <http://www.pr.mq.edu.au/macnews/sept01/apaf.htm>

FIGURA 7 - Receptor GABAA

38

1.10 Áreas cerebrais (córtex motor e corpo estriado)

O lobo frontal, constituído pelo córtex prefrontal, córtex premotor e córtex motor

primário, é responsável pelo planejamento da ação e controle do movimento (KANDEL,

2000). As áreas motoras do córtex cerebral são subdivididas em área motora primária e várias

áreas premotoras. Cada área contém populações de neurônios que se projetam do córtex para

o tronco cerebral e coluna vertebral. O córtex motor também recebe impulsos do gânglio basal

e do cerebelo. A área motora do córtex cerebral é responsável pelo movimento voluntário

(KRAKAUER; GHEZ, 2000). O gânglio basal possui grande papel nos movimentos

voluntários normais. Esta região também está envolvida na produção das desordens do

movimento. Estudos postmortem de pacientes com doença de Parkinson e de Huntington

revelaram alterações nesta área cerebral. Essas doenças têm três tipos de distúrbios motores:

tremor e outros movimentos involuntários, alterações na postura e tônus muscular e

finalmente, pobreza e lentidão dos movimentos sem paralisia. Desta forma distúrbios nos

gânglios da base podem resultar tanto na redução do movimento, como a que ocorre na

doença de Parkinson, movimento excessivo, aquele observado na doença de Huntington.

Além destas desordens do movimento, danos nos núcleos da base estão associados com

distúrbios neuropsiquiátricos cognitivos comportamentais, refletindo o importante papel

destes núcleos em diversas funções do lobo frontal (DeLONG, 2000). Os circuitos que

envolvem o comportamento não-motor dos núcleos da base, originam-se de regiões prefrontal

e límbica do córtex e engaja em áreas específicas do estriado, pallidum e substância negra

(DeLONG, 2000). Diferente de outros componentes motores, o gânglio basal, não conecta

diretamente com a coluna vertebral. Estes núcleos recebem impulso primário do córtex

cerebral e envia seus impulsos para o cérebro, via tálamo, córtex prefrontal anterior, córtex

premotor e motor. As funções motoras do gânglio basal são mediadas, em grande parte, por

áreas motoras do córtex frontal. Os quatro principais núcleos dos gânglios da base são o corpo

estriado, globus pallidus, substância negra e núcleo subtalâmico. O corpo estriado consiste de

três importantes subdivisões: o núcleo caudado, o putamen e o estriado ventral, o qual inclui o

nucleus accumbens, uma região envolvida com a emoção e memória (DeLONG, 2000).

39

1.11 Relevância e justificativa

O uso de produtos naturais como matéria-prima para síntese de substâncias

bioativas, especialmente fármacos, tem sido amplamente relatado ao longo do tempo. É de

interesse da medicina o estudo de substâncias isoladas de plantas, por apresentarem grande

potencial no mercado. A iangambina, uma substância pura, extraída da casca do caule da

Ocotea duckei Vattimo, apresentou em estudos preliminares possível efeito depressor em

nível de sistema nervoso central. Visto que, estes efeitos foram pouco estudados, resolvemos

verificar suas ações comportamentais em vários modelos relacionados com a atividade no

sistema, bem como seus efeitos neuroquímicos em duas áreas cerebrais, córtex motor e corpo

estriado. O córtex motor é responsável pelo movimento voluntário e, esta área motora do

córtex cerebral, recebe impulsos do gânglio basal. O gânglio basal, constituído pelo corpo

estriado, globus pallidus, substância negra e núcleo subtalâmico, também possui um

importante papel no movimento voluntário. Desordens nesta região, têm importância na

clínica neurológica, além de fornecer importantes informações sobre o controle motor e servir

como modelo para estudar as relações dos neurotransmissores nas desordens do humor,

cognição e comportamento não-motor. Assim, existe uma correlação entre estas duas áreas

cerebrais, o que justifica a importância de seu estudo. Ambas áreas cerebrais recebem

inervações dopaminérgicas, serotonérgicas, noradrenérgicas, gabaérgicas, que são

moduladoras da intrínseca neurotransmissão a qual medeia a função cortical, além disso, são

regiões envolvidas com o controle motor, que é um evento bastante alterado em pessoas que

apresentam psicopatologias, valendo a pena mencionar, que a emoção e a memória também

estão relacionadas com o corpo estriado. Com base nestas considerações o presente trabalho

objetivou estudar os efeitos da iangambina em vários modelos animais de comportamento

com a finalidade de verificar seus efeitos na atividade motora, depressão, ansiedade, além de

possível atividade miorelaxante e anticonvulsivante. Os sistemas muscarínico,

catecolaminérgico e serotonérgico foram focalizados porque, o mau funcionamento destes

sistemas está relacionado com distúrbios motores e doenças afetivas.

OBJETIVOS

41

2 OBJETIVOS

Gerais:

- Avaliar os efeitos da iangambina em nível do sistema nervoso central, através do

estudo das alterações comportamentais e neuroquímicas produzidas em córtex

motor e corpo estriado de camundongos.

Específicos:

- Estudar as alterações comportamentais nos seguintes modelos:

• Campo aberto (ALE)

• Rota rod

• Nado forçado

• Tempo de sono induzido por pentobarbital

• Placa perfurada

• Labirinto em cruz elevado

• Convulsão induzida por pentilenotetrazol

- Estudar as alterações neuroquímicas produzidas em córtex motor e corpo

estriado de camundongos através de:

• Determinação dos níveis de monoaminas NA, DA e 5-HT e seus

metabólitos DOPAC, HVA e 5-HIAA

• Investigação da possível interação da iangambina com os sistemas

dopaminérgico, colinérgico e serotonérgico através dos seguintes

ensaios de binding in vitro:

Receptores dopaminérgicos D1-símile

Receptores dopaminérgicos D2-símile

Receptores muscarínicos (M1+M2)-símile

Receptores serotonérgicos (5-HT2)-símile

METODOLOGIA

43

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3. 1 Material utilizado nos experimentos

Materiais utilizados nos experimentos

Marca/Modelo

- Agitador de tubos

Modelo 251, FANEN, SP, Brasil

- Balança analítica Modelo H5, Mettler, Suíça - Banho Maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil - Centrífuga refrigerada Eppendorf - Contador de cintilação líquida Modelo LS 6500, Beckman, Fullerton, Ca, USA - Cubetas de plástico para leitura em espectrofotômetro

Sarstedt, Alemanha Oriental

- Espectrofotômetro Modelo Beckman DU 640B, Fullerton, CA, USA - Estufa para secagem Modelo 315 SE FANEM, SP, Brasil - Filtros de fibra de vidro GF/B Whatman, Maidstone England- - Freezer -70 ºC Modelo ULT 2586-3D14, Revco Scientific, Inc.

Asheville, N.C.,USA - Frascos de vidro (vials) para contagem de cintilação

Beckman, Fullerton, Ca, USA

- Guilhotina Harvard, USA - Homogeneizadores manuais Bellico, USA - Medidor de pH Modelo B374, Micronal, SP, Brasil - Micropipetas H.E., Pedersen, Dinamarca - Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc.

NY, USA - Bomba para HPLC LC-10AD Shimadzu Corp, Japan - Programa de computação para integração de picos

Shimadzu Corp., Japan

- Degaseificador DGU-2A Shimadzu Corp., Japan - Detector de fluorescência RF-535 Shimadzu Corp., Japan - Equipamento de Millipore para filtração a vácuo Millipore Apparatus, Bedford, MA, USA - Campo aberto Caixa de acrílico - Labirinto em cruz elevado Acrílico - Rota Rod Ugo Basile, Italy - Placa Perfurada Ugo Basile, Italy - Cuba

Acrílico

3.2 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos com peso variando entre 25–30 g

provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará.

44

Durante todos os experimentos os animais foram mantidos em gaiolas com no

máximo 30 animais, em condições ambientais semelhantes, com ciclos de alternância

claro/escuro de 12 horas, recebendo ração tipo Purina e água ad libitum. Os protocolos

experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal desta universidade.

3.3 Material botânico

A planta Ocotea duckei Vattimo coletada no município de Santa Rita-Paraíba foi

identificada pela botânica Maria de Fátima Agra do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica

da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e a exsicata está depositada e catalogada no

Herbário Prof. Lauro Pires Xavier do Departamento de Biologia /CCEN /UFPB sob o número

de registro JPB 4309.

A coleta do material (caule) e o isolamento da iangambina foram realizados pelo

grupo de pesquisa do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da

Paraíba. A extração e isolamento foram feitas pela doutoranda Celidarque da Silva Dias

conforme descrito abaixo sob a orientação e supervisão do Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho

que gentilmente nos cedeu a substância isolada e que muito colaborou para a realização deste

estudo.

3.4 Extração e isolamento

As cascas do caule de Ocotea duckei foram secas (40 – 45°C), pulverizadas e

extraídas com etanol 95 %, em percolador por 72 horas. O extrato etanólico foi destilado em

rotavapor sob pressão reduzida a 60 °C, originando um resíduo que foi submetido a um

screening farmacológico e fitoquímico. Este resíduo foi então tratado com solução de ácido

acético a 5 % sob agitação vigorosa e filtrado em celite, fornecendo um material insolúvel

(descartado), e um extrato acético que foi extraído três vezes com clorofórmio (CHCl3). O

extrato CHCl3 foi concentrado em rotavapor a 50 °C e o resíduo obtido foi tratado com

metanol, que resultou na formação de um precipitado onde foi isolado a iangambina. O

45

sobrenadante foi então submetido à cromatografia em coluna e camada delgada de sílica gel

que levou ao isolamento de outras substâncias incluindo iangambina (Figura 8).

46

CHCl3 (3 vezes)

CASCA SECA E PULVERIZADA

EXTRATO ETANÓLICO (EE)

Percolação com etanol 95 % (3 vezes) Concentração

Ácido acético 5 % (3 vezes) Filtração com celite

INSOLÚVEL EXTRATO ACÉTICO (EA)

RESÍDUO DO EC EA DESENGORDURADO

MeOH

IANGAMBINA

Figura 8 – Isolamento da iangambina à partir das cascas do caule de Ocotea duckei Vattimo.

47

3.5 Preparo da droga

A iangambina (Iag) (LTF/UFPB) foi emulsificada com Tween 80 a 5 % (SIGMA-

USA) e dissolvida em água bidestilada, obtendo-se a concentração final de 2,5; 5,0 e 7,5

mg/mL para ser administrada nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg. Diazepam (DZP) 1 mg/kg

(União Química Brasil) e Cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg (Geigy)

foram usadas como droga padrão. Flumazenil (Ro 15-1788) (Flu) 2,5 mg/kg (Sigma-USA),

Pentobarbital sódico 40 mg/kg (Sigma-USA), Pentilenotetrazol (PTZ) 100 mg/kg (Sigma-

USA). O flumazenil foi emulsionado em Tween 80 a 2 % em água bidestilada.

3.6 Tratamento dos grupos experimentais

As doses de 25, 50 e 75 mg/kg de iangambina foram escolhidas para a realização

deste trabalho a partir de dados obtidos por Pachú et al. (1990) que observaram que o efeito

letal da iangambina até 48 horas após o tratamento não ocorreu até a dose de 1 mg/kg,

portanto foi possível estabelecer essas doses com maior segurança. Os animais foram tratados

com iangambina de forma aguda, por via intraperitoneal (i.p.) ou via oral (v.o.). Vinte e

quatro horas após a administração por via i.p., os animais foram sacrificados, seus cérebros

removidos e o estriado e o córtex motor dissecados sobre gelo, para a dosagem de

monoaminas utilizando HPLC. Para os experimentos de binding in vitro a dissecação das duas

áreas cerebrais foi feita em animais não tratados. No caso dos testes comportamentais, os

animais foram submetidos a cada teste 30 minutos ou 1 hora após a administração

intraperitoneal ou oral da droga, respectivamente. Os animais do grupo controle foram

tratados com solução de Tween 80 a 5 %, usado como veículo. Grupos com diazepam (DZP)

1 mg/kg i.p. ou Cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p., foram feitos,

onde ambas as substâncias, foram usadas como droga de referência ansiolítica e

antidepressiva, respectivamente. O DZP foi usado também no modelo do rota rod, no teste do

tempo do sono induzido por pentobarbital e no teste da convulsão induzida por

pentilenotetrazol, como droga padrão, para avaliar as atividades miorelaxante, sedativa e

anticonvulsivante, respectivamente. Com a finalidade de investigar, o mecanismo de ação da

iangambina, foi feito outro grupo, onde se administrou flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg, i.p., um

48

antagonista do receptor benzodiazepínico, e 15 min depois foi administrado iangambina (Iag)

75 mg/kg, v.o. (FLU + Iag 75).

3.7 Testes comportamentais

Foram usados sete testes comportamentais: campo aberto (open field), rota rod,

nado forçado, tempo de sono induzido por pentobarbital, placa perfurada (hole board),

labirinto em cruz elevado (plus maze) e o teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol.

3.7.1 Teste de campo aberto

Um campo aberto feito em acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x

15 cm) dividido em nove quadrados de áreas iguais, foi usado para avaliar a atividade

exploratória do animal (ARCHER, 1973). Após 30 ou 60 minutos da administração da droga

por via intraperitoneal ou oral respectivamente, cada animal foi colocado no centro do campo

e o número de cruzamentos (com as quatro patas), números de rearing e grooming foram

registrados durante 5 minutos

3.7.2 Teste do rota rod

Para o teste de rota rod, após 30 ou 60 minutos da administração da droga por via

intraperitoneal ou oral respectivamente, o animal foi colocado com as quatro patas sobre uma

barra de 2,5 cm de diâmetro, elevado a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm. Para cada

animal foram registrados o número de quedas (sendo o limite máximo de 3 quedas para cada

animal) e o tempo de permanência na barra, em um período de até 1 minuto (DUNHAM;

MIYA, 1957).

49

3.7.3 Teste do nado forçado

Este modelo, idealizado por Porsolt et al., 1977a, se baseia no fato de que o

roedor, ao ser colocado em uma cuba de acrílico com água, apresenta um comportamento

desesperado, caracterizado como desespero comportamental. Neste modelo, os roedores são

forçados a nadar por 5 minutos em um ambiente sem saída. De princípio o animal apresenta

comportamento de fuga e luta, nadando e buscando uma saída deste ambiente. Quando

percebe que seu esforço está sendo em vão, o animal, então, apresenta um comportamento de

conformismo, tentando se adaptar a esta nova situação aversiva. Neste momento, o animal

apresenta uma postura típica de imobilidade, realizando apenas movimentos mínimos

necessários para não se afogar. O uso de drogas que causam depressão, como a reserpina,

aumenta o comportamento de conformismo, e portanto, o tempo em que o animal apresenta-se

imóvel no teste. Já as drogas que apresentam efeitos antidepressivos, exacerbam o

comportamento de fuga e luta, e desta forma, diminuem o tempo em que o animal apresenta-

se imóvel. Também foi constatado que o tempo de imobilização do animal durante o teste está

diretamente correlacionado com a eficácia clínica de drogas antidepressivas. Isto é, quanto

menor o tempo de imobilidade apresentado pelo animal, maior será a eficácia clínica da droga

teste (PORSOLT et al., 1977a, 1977b, 1978; BUCKETT et al., 1982; NISHIMURA et al.,

1988; BORSINI; MELI, 1988; SANCHEZ; MEIER, 1997).

- Procedimento experimental

O teste do nado forçado (Porsolt et al., 1978), incluiu duas exposições dos

animais, em uma cuba de acrílico com água, separadas por um espaço de um dia. Assim, os

animais foram submetidos a uma primeira exposição (pré-teste), para induzir a depressão, 24

horas antes da realização do teste final (segunda exposição). Durante o pré-teste, cada animal

não tratado, foi colocado, durante 15 minutos, em uma cuba de acrílico transparente de 40 cm

de altura por 18 cm de diâmetro, contendo 15 cm de água fresca a 25 °C. No teste final, 30

minutos ou 1 hora após o tratamento com a iangambina, via intraperitoneal ou oral

respectivamente, os animais foram novamente colocados na cuba e deixados por 5 minutos.

Durante este período foi observado o tempo em que o animal apresentou-se imóvel. O

camundongo foi considerado imóvel quando permaneceu flutuando, fazendo apenas pequenos

50

movimentos para manter a cabeça fora d’agua. Neste modelo um grupo de animais recebeu

Cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p., como droga padrão.

3.7.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital

Este teste se baseia no fato de que, em geral, as drogas depressoras do sistema

nervoso central atuam sinergicamente aumentando o tempo de sono induzido por barbitúricos,

embora algumas drogas desprovidas de ação central, como por exemplo, adrenalina e

histamina, também apresentem resultados positivos (RILEY; SPINKS, 1958).


Trinta minutos ou uma hora após a administração de iangambina (25 ou 50

mg/kg) intraperitoneal e oral, respectivamente, veículo (i.p. ou v.o.) ou Diazepam 1 mg/kg,

i.p., todos os grupos receberam pentobarbital sódico 40 mg/kg, intraperitoneal. O tempo desde

a injeção do pentobarbital até o animal perder o reflexo postural é registrado como latência de

sono e o tempo de latência entre a perda e a recuperação voluntária do reflexo postural é

registrado como tempo de sono (WAMBEBE, 1985; ROLLAND et al., 1991). Um tempo

máximo de 240 min foi imposto nesta medida, isto é, animais os quais o tempo de sono estava

acima de 240 min foram contados como 240 min. A latência de sono foi também registrada.

3.7.5 Teste da placa perfurada

O teste da placa perfurada, usado para avaliar o comportamento exploratório em

camundongos, foi realizado como descrito previamente por Dorr et al., 1971. O aparato usado

foi um Ugo Basile de 60 x 30 cm com 16 buracos espaçados uniformemente com sensores de

infra-vermelho. Camundongos machos adultos foram divididos em cinco grupos. Foi feito o

grupo controle (Tween 80 a 5 %), três grupos receberam doses de iangambina 25, 50 e 75

mg/kg, respectivamente, por via i.p. ou oral e em outro grupo foi administrado Diazepam 1

mg/kg, i.p., que foi usado como droga padrão. O número de vezes que o animal colocou a

cabeça no buraco da placa perfurada, head dips, foi contado para cada animal durante um

51

período de 5 minutos. O procedimento experimental foi executado em uma sala silenciosa,

com luz de baixa intensidade.

3.7.6 Teste de labirinto em cruz elevado

Através do uso de modelos animais indutores de ansiedade, foram obtidos muitos

achados em relação à ansiedade. O mais utilizado e aceito pela comunidade científica é o

labirinto em cruz elevado (TREIT, 1985; RODGERS, 1997; ZANGROSSI JR., 1997).

O labirinto em cruz elevado para camundongos (Lister, 1987), consistiu de dois

braços abertos (30 x 5 cm) e dois braços fechados (30 x 5 x 25 cm), conectados entre si por

uma plataforma central (5 x 5 cm), formando uma cruz grega, elevada a 45 cm do chão. As

paredes foram confeccionadas em acrílico transparente e o piso em acrílico preto. Neste

modelo, os roedores evitam os braços abertos do labirinto, restringindo a maioria de suas

atividades aos braços fechados. Uma atividade relativamente baixa nos braços abertos é

indicativa de ansiedade. Em contrapartida, roedores submetidos ao tratamento com

ansiolíticos cruzam mais vezes pelos braços abertos e permanecem mais tempo nestes braços

quando comparados aos animais controle (ZANGROSSI JR. 1997).


Trinta minutos ou uma hora após o tratamento com a iangambina, através da via

intraperitoneal ou oral respectivamente, cada animal foi colocado na plataforma central com o

focinho direcionado para um dos braços fechados. Durante 5 minutos foram observados os

seguintes parâmetros: número de entradas nos braços abertos e fechados e o tempo de

permanência do animal em cada um desses braços. A percentagem do tempo de permanência

em cada braço foi calculada utilizando-se a razão do tempo em cada um dos braços e o tempo

total de permanência em ambos os braços. A percentagem do número de entradas foi

calculada usando a razão entre o número de entradas em cada um dos braços e o número total

de entradas nos braços abertos e fechados. Além dos grupos tratados com a iangambina, foi

feito um grupo no qual foi administrado diazepam 1 mg/kg, i.p., como droga padrão. Os

animais controle foram tratados com solução de Tween 80 a 5 %, usado como veículo.

52

Subseqüentemente, com a finalidade de investigar o mecanismo de ação da

iangambina, foram feitos dois grupos, ou seja, em um grupo, camundongos foram tratados

com flumazenil (Ro 15-1788) 2,5 mg/kg, i.p., um antagonista do receptor benzodiazepínico, e

15 min depois foi administrada salina por via oral. No outro grupo foi administrado

flumazenil e 15 min depois foi associado a iangambina 75 mg/kg, v.o.. Os dois grupos

experimentais foram conduzidos ao labirinto, e os animais colocados um a um no centro da

plataforma deste modelo, 1 hora depois da administração da salina e iangambina 75,

respectivamente. O grupo (Flu + Iag 75 v.o.) foi comparado com o grupo Iag 75 mg/kg, v.o..

Todo o teste foi realizado em uma sala fechada, com temperatura e umidade

controlada (23 ± 1 0C), iluminação de pouca intensidade (lâmpada vermelha de 15 W) e

ruídos atenuados.

3.7.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol

Este experimento foi realizado seguindo a metodologia descrita por Swinyard et

al., 1952, e teve a finalidade de avaliar a possível ação anticonvulsivante da droga em teste.

Trinta minutos ou uma hora após o tratamento com iangambina 25, 50, 75 mg/kg ou controle

(Tween 80 a 5 %), através das vias i.p. e v.o. respectivamente, ou Diazepam 1 mg/kg, i.p., foi

feita a administração em todos os animais com pentilenotetrazol 100 mg/kg, i.p..Em seguida

os camundongos foram colocados em gaiolas individuais e observados por até 20 minutos. O

tempo de manifestação da primeira convulsão do tipo clônica ou tônico-clônica (latência de

convulsão) e a latência de morte foram os parâmetros observados.

3.8 Dissecação das áreas cerebrais

Os animais foram mortos por estiramento cervical, os encéfalos retirados

rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com gelo.

Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi retirada

das leptomeninges com o auxílio de uma pinça reta de microdissecação, a qual, progredindo

delicada e tangencialmente aos ventrículos laterais, divulsionou o córtex em toda a sua

53

extensão fronto-occipital. O córtex já divulsionado foi rebatido para os lados, expondo parte

do corpo estriado. O corpo estriado (caudado, putamen e núcleo acumbens) foi isolado das

estruturas circunjacentes por divulsionamento com uma tesoura de microdissecação, sendo a

sua retirada orientada pelo diâmetro da porção tuberosa visível desses núcleos, após o

rebatimento lateral do córtex.

Após a retirada do corpo estriado (CE) o rebatimento do córtex feito inicialmente

foi desfeito, ou seja, procurando-se reconstituir o contorno dos hemisférios cerebrais, o córtex

foi recolocado em sua posição inicial e, com o auxílio de uma tesoura de microdissecação, foi

removida em sua porção superior e mediana, uma extensão em torno de 3-5 mm, tendo como

limite posterior um plano imaginário que dividia o cérebro em partes iguais, anterior e

posterior. A porção cortical assim retirada corresponde a área motora do córtex fronto-parietal

(ZILLES; WREE, 1985).

Terminada a dissecação, cada área (corpo estriado e córtex motor) foi colocada

em papel alumínio devidamente identificada, pesada e conservada a -70 °C para uso posterior.

Quando necessária a estocagem por um certo período de tempo (no máximo 6 meses a -70 °C)

os tecidos foram considerados como tendo a mesma viabilidade para experimentação que os

ensaiados imediatamente ou 24 h após a dissecação (BURKE; GREENBAUN, 1987;

FIELDER et al., 1987).

3.9 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC

- Método

Para a determinação dos níveis de monoaminas foi utilizado o equipamento de

HPLC (High Performance Liquid Chromatograph). Na cromatografia líquida clássica, um

adsorvente (alumina ou sílica) é empacotado em uma coluna e é eluído por um líquido ideal

(fase móvel). Uma mistura para ser separada é introduzida na coluna e é carregada através da

mesma por um líquido eluente. Se um composto da mistura (soluto) é adsorvido fracamente

pela superfície da fase sólida estacionária, ele atravessará a coluna mais rapidamente que um

outro soluto que seja mais rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível

54

se existem diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a

condutância do eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos solutos. Para

ser capaz de detectar, no primeiro caso os solutos devem ser iônicos e no segundo caso, os

solutos devem ter a característica de serem relativamente fáceis de se oxidarem ou reduzirem.

Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou

oxidação de solutos são chamados detectores amperométricos ou coulométricos. Neste estudo

foi utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor de soluto, em

torno de 1 %. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem a aplicação de um potencial para

um eletrodo (geralmente de carbono vítreo), oxidação da substância que está sendo estudada

próximo à superfície do eletrodo seguindo a amplificação e medida da corrente produzida. As

catecolaminas são oxidadas nos grupos de anel hidroxil para produzir um derivado

ortoquinona com a liberação de dois elétrons.


Os animais foram decapitados 24 h após a administração intraperitoneal de

iangambina 25, 50 e 75 mg/kg e imediatamente tiveram seus cérebros dissecados sob gelo. O

CE e CM foram utilizados para preparar homogenatos a 10 %. Os tecidos cerebrais foram

sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30 s e centrifugados por 15 minutos em

centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. Uma alíquota de 20 µL do sobrenadante foi, então,

injetada no equipamento de HPLC, para a análise química.

Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS(M) com comprimento de

25 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 µm, da Shimadzu, Japão, foi utilizada. A

fase móvel utilizada era composta por tampão ácido cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido

octanosulfônico sódico, 0,69 M (SOS), como reagente formador do par iônico, acetonitrila 4

% v/v e tetrahidrofurano 1,7 % v/v. Noradrenalina (NA), dopamina (DA), ácido

diidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA), serotonina (5-HT) e ácido 5-

hidroxiindolacético (5-HIAA) foram eletronicamente detectados usando um detector

amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japan) pela oxidação em um eletrodo de

carbono vítreo fixado em 0,85 V relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.

(HALLMAN; JONSSON, 1984).

55

- Soluções reagentes

- Fase móvel

Foram pesados 15,75 g de ácido cítrico (grupo química, R.J., Brasil) e completado

para um volume de 400 mL com água puríssima (Milli-Q). Esta solução foi ajustada para pH

3,0 com hidróxido de sódio 12,5 M (Reagen, R.J, Brasil). A esta solução foi adicionado o

SOS 75 mg (Sigma, MO, USA) e completado o volume para 471,5 mL com água Milli-Q. Em

seguida, foi procedida a filtração e degaseificação, e posteriormente adição de 20 mL de

acetonitrila (Carlo Erba Reagenti, MI, Itália) e 8,5 mL de tetrahidrofurano (Sigma, MO, USA)

para um volume final de 500 mL.

- Ácido perclórico 0,1 M

Adicionou-se 1,8 mL de ácido perclórico (Sigma, MO, USA) em um balão

volumétrico e completo o volume para 300 mL.

3.10 Determinação da densidade dos receptores dopaminérgicos

A determinação dos receptores dopaminérgicos foi feita através de ensaios de

binding in vitro executados em homogenatos cerebrais de camundongos não tratados,

variando os seguintes parâmetros:

- Receptores D1-símile

Foi utilizado o ligante específico [3H]-SCH 23390 (87,0 Ci/mmol - New England

Nuclear, USA), de acordo com método previamente descrito (MELTZER et al., 1989).

56

- Receptores D2-símile

Foi utilizado o ligante específico [3H]-espiroperidol (114,0 Ci/mmol - New

England Nuclear, USA), segundo uma adaptação do método previamente descrito por Meltzer

et al. (1989) e Kessler et al. (1991).

- Método

O [3H]-SCH 23390 é um antagonista dopaminérgico que possui alta afinidade

pelos receptores D1-símile. O ligante [3H]-espiroperidol é um antagonista dopaminérgico que

possui alta afinidade pelos receptores D2-símile, possuindo também afinidade pelos receptores

serotonérgicos do tipo 5-HT2 (TERAI et al., 1989; KESSLER et al., 1991). Para bloquear os

receptores serotonérgicos foi utilizado um antagonista específico, a mianserina.

A dopamina, um agonista dopaminérgico, foi adicionada, na forma não marcada,

nos brancos dos ensaios para receptor D1 para determinar a radioatividade de background ou

ligações não-específicas, em uma concentração elevada para interagir com os mesmos sítios

de ligação do receptor, impedindo assim, a ligação do [3H]-SCH23390, que fica livre. O

mesmo foi feito com relação ao receptor D2. Esses ligantes livres são retirados do filtro

através de lavagens sucessivas, e a radioatividade é, então, contada por cintilação líquida.


Logo após a dissecação das áreas cerebrais em gelo, como mencionado

anteriormente, foram feitos homogenatos a 10 % em tampão tris-HCl 50 mM, pH 7,4.

Os homogenatos contendo 50-100 µg de proteína foram incubados com

iangambina em diferentes concentrações (0-200 µM) durante 30 minutos em tampão tris-HCl

modificado (50 mM, pH 7,4). No caso dos receptores D1-símile o tampão continha 7,58 nM

de [3H]-SCH 23390. No caso dos receptores D2-símile o tampão continha 10 µM de

mianserina (incubada por 30 minutos à temperatura ambiente) para bloquear os receptores

serotonérgicos e 3,77 nM de [3H]-espiroperidol. Em ambos os ensaios, os respectivos ligantes

57

foram incubados na presença e na ausência de dopamina 100 µM (durante 10 minutos), sendo

o volume final do ensaio de 0,2 mL.

Após incubação a 37 °C durante 60 minutos, a reação foi terminada por filtração a

vácuo através de filtros Whatman GF/B. Os discos de papel de filtro foram lavados três vezes

com 4 mL de solução salina 0,9 % gelada, secos a 60 °C por no mínimo 2 h e colocados em

frascos de vidro (vials) com 3 mL de um coquetel de cintilação líquida contendo tolueno.

A radioatividade foi medida em um contador de cintilação líquida Beckman LS-

6500 com a eficiência de 61 %. O binding específico foi calculado como binding total menos

o binding não-específico feito na presença de dopamina 100 µM para os receptores D1 e D2, e

os resultados foram expressos como fentomoles por miligrama de proteína. A concentração de

proteína foi determinada segundo o método de Lowry (1951), utilizando-se albumina sérica

bovina (BSA) como padrão.


- [3H]-espiroperidol (114 Ci/mmol, Amersham Life Science, USA)

5 µL de [3H]-espiroperidol foram diluídos em tampão tris-HCl, pH 7,4, de forma a

obter uma concentração final de 43,28 nM.

- [3H]- SCH 23390 (87 Ci/mmol, Amersham Life Science)

5 µL de [3H]-SCH 23390 foram diluídos em tampão tris HCl, pH 7,4 de forma a

obter uma concentração final de 11,5 nM

- Tampão Tris-HCl

6 g de Tris-HCl (trizma base, Sigma, Brasil) foram diluídos em 1000 mL de água

bidestilada, obtendo-se uma concentração de 50 mM. O pH foi ajustado com

solução HCL 0,1 N (MERCK, Rio de Janeiro, Brasil) para pH 7,4.

58

- Tris HCl modificado

NaCl 120 mM; KCl 1 mM; CaCl2 2 mM; MgCl2 1 mM, NaEDTA 1 mM e

ascorbato sódico 1 mM foram dissolvidos em tampão tris-HCl 50 mM pH 7,4.

- Mianserina

Comprimidos de mianserina (Tolvon 30 mg, Organon, SP, Brasil) foram

macerados e diluídos em tampão tris-HCl obtendo-se uma concentração final de 10

µM.

- Dopamina (cloridrato de dopamina)

10 mg de dopamina (Sigma) foram diluídas em 2 mL de tampão tris-HCl não

modificado tendo uma concentração final de 5 mg/mL. A esta solução foi

acrescentado ácido ascórbico 0,1 %.

- Coquetel de cintilação

0,5 g de p-bis-2-(5-feniloxazolil) benzeno, POPOP (Sigma, St. Louis, MO, USA) e

4,0 g de 2,5-difeniloxasol, PPO (Sigma, St. Louis, MO, USA) foram dissolvidos

em 1000 mL de tolueno (Beckman, Fullerton, CA, USA).

3.11 Determinação da densidade dos receptores muscarínicos

A densidade dos receptores muscarínicos foi determinada através de ensaios de

binding in vitro executados em homogenatos cerebrais de camundongos não tratados. Para a

determinação de receptores muscarínicos (M1+M2)-símile foi utilizado o ligante não

específico [3H]-N-metilescopolamina ([3H]-NMS, 85 Ci/mmol - New England), de acordo

com o método previamente descrito (DOMBROWSKI et al., 1983).

59

- Método

O antagonista muscarínico marcado, [3H]-NMS, liga-se a sítios específicos dentre

os quatro primeiros segmentos transmembrana dos receptores muscarínicos (Wheatley et al.,

1988) que existem nos tecidos homogeneizados. Desse modo, o ligante tritiado marca os

receptores presentes no tecido estudado.

A atropina é um outro antagonista clássico utilizado nos brancos dos

experimentos para determinar a radioatividade de background ou ligações não-específicas. A

atropina acrescentada em concentração muito maior do que a [3H]-NMS interage,

seletivamente, com os mesmos sítios de ligação do receptor, deslocando e deixando livre toda

a droga marcada, que é logo depois filtrada. A radioatividade contida no filtro é, então,

determinada por cintilação líquida.


Terminada a dissecação das áreas cerebrais em gelo, como mencionado

anteriormente, foram feitos homogenatos a 10 % em tampão fosfato de sódio, 150 mM, pH

7,4.

Rapidamente, os homogenatos contendo 50 -100 µg de proteína foram incubados

com iangambina em diferentes concentrações (0- 200 µM) durante 30 minutos em tampão

fosfato de sódio contendo 2,38 nM de [3H]-NMS, na presença ou na ausência de sulfato de

atropina 12,5 µM em um volume final de 0,2 mL.

Após incubação a 37 °C por 30 minutos, a reação foi terminada por filtração a

vácuo através de filtros Whatman GF/B. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL de

solução salina 0,9 % gelada, secos a 60 °C por no mínimo 2 h e colocados em frascos de vidro

(vials) com 3 mL de um coquetel de cintilação líquida contendo tolueno.


6500 com uma eficiência de 61 %. A ligação específica foi calculada como a ligação total

menos a ligação não-específica feita na presença de atropina 12,5 µM os resultados foram

60

expressos como fentomoles por miligrama de proteína. A concentração de proteína foi

determinada segundo o método de Lowry et al., 1951 utilizando-se albumina sérica bovina

(BSA) como padrão.


- Solução estoque de [3H]-N-metil-escopolamina ([3H]-NMS)

Cloridrato de [3H]-NMS (85 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA, USA),

dissolvido em tampão fosfato de sódio 150 mM, pH 7,4 para obter uma

concentração de 23,52 nM.

- Solução estoque de atropina

Sulfato de atropina (Sigma, St. Louis, MO, USA) foi dissolvido em água

bidestilada, para obter uma concentração de 0,5 mM.

- Tampão fosfato de sódio

NaH2PO4 (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil) foi dissolvido em água bidestilada, para

obter uma solução 150 mM e o pH foi ajustado para 7,4 com solução de HCl 1 N

(Merck, Rio de Janeiro, Brasil).

- Coquetel de cintilação

0,5 g de p-bis-2-(5-feniloxazolil) benzeno, POPOP (Sigma, St. Louis, MO, USA) e

4,0 g de 2,5-difeniloxasol, PPO (Sigma, St. Louis, MO, USA) foram dissolvidos

em 1000 mL de tolueno (Beckman, Fullerton, CA, USA)

61

3.12 Determinação da densidade dos receptores serotonérgicos (5-HT2)

Tecidos cerebrais de 3 áreas formando um pool foram utilizados para os

experimentos. O tecido foi homogeneizado em 2 mL de tampão Tris-HCl 0,05 M pH 7,4. O

homogenato foi centrifugado por 15 min a 20,000 X g, 4 °C. O sobrenadante foi descartado e

o decantado foi lavado por 3 vezes com o mesmo volume de tampão Tris-HCl 0,05 M. O

decantado final foi ressuspenso em 0,3 mL do mesmo tampão para determinação subseqüente

da ligação do [3H]-espiroperidol. Como descrito acima na determinação dos receptores D2-

símile, o referido ligante tem afinidade por receptores D2 e 5-HT2 e foi utilizado para

determinação destes últimos de acordo com o método descrito por Peroutka and Snyder, 1980,

com algumas modificações. O ensaio consistiu das membranas (0,3–0,5 mg de proteína)

incubadas com iangambina (0-100 µM) durante meia hora com tampão Tris- HCl (pH 7,4)

consistindo de ácido ascórbico 0,1 %, NaCl 120 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, na presença de

[3H]-espiroperidol 4,72 nM e dopamina 100 µM para bloquear receptores D2-símile. A

ligação inespecífica foi definida pela adição de ciproheptadina 100 µM. O tempo de

incubação foi 30 min a 37 °C, e o volume final foi 0,2 mL.

Após incubação a reação foi terminada por filtração a vácuo através de filtros

Whatman GF/B. Os filtros foram lavados três vezes com 4 mL de solução salina 0,9 %

gelada, secos a 60 °C por no mínimo 2 h e colocados em frascos de vidro (vials) com 3 mL de

um coquetel de cintilação líquida contendo tolueno.


6500 com uma eficiência de 61 %. A ligação específica foi calculada como a ligação total

menos a ligação não-específica feita na presença de ciproheptadina 100 µM os resultados

foram expressos como fentomoles por miligrama de proteína. A concentração de proteína foi

determinada segundo o método de Lowry et al. (1951) utilizando-se albumina sérica bovina

(BSA) como padrão.

62

3.13 Dosagem de proteína

- Método

A quantidade de proteína em homogenatos de cérebro foi determinada a 25 °C

utilizando albumina sérica bovina como padrão, de acordo com o método previamente

descrito (Lowry et al., 1951), que utiliza duas reações de formação de cor para analisar a

concentração proteica fotometricamente. Inicialmente é feita uma reação biureto de baixa

eficiência na qual os íons de cobre alcalino produzem uma cor azulada na presença de

ligações peptídicas. Esta cor biureto é característica de todas as proteínas e fornece uma cor

básica de fundo para a próxima etapa de ensaio. Depois o método emprega uma mistura

complexa de sais inorgânicos, o reagente Folin-Ciocalteau que produz uma cor verde azulada

intensa na presença de tirosina ou triptofano livres ou ligados a proteínas. Como as

quantidades desses dois aminoácidos são geralmente constantes nas proteínas solúveis, com

poucas exceções, a cor das reações (verde-azulada) é indicativa da presença de proteína e a

intensidade da cor proporcional à concentração. Esta coloração foi medida em 750 nm,

através de espectrofotômetro Beckman DU 640B.


- Reagente A: Na2CO3 (Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) a 2 % em NaOH

(Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) 0,1 N;

- Reagente B: CuSO4.5H2O a 0,5 % em NaKC4H4O6.4H2O (Grupo Química, Rio de

Janeiro, RJ, Brasil) a 1 %;

- Reagente C: Solução de cobre alcalino (24 mL do reagente A com 1 mL do

reagente B, misturados no momento de usar);

- Reagente de Folin - Ciocalteau - Fenol (Labordin, Piraquara, PR, Brasil), 1:1 em

água bidestilada;

63

- Solução de albumina sérica bovina (Sigma, St Louis, MO, USA) 1 mg/mL em

água bidestilada.

3.14 Análise estatística

A análise estatística dos dados foi feita através de um computador Pentium III

utilizando o programa GraphPad Instat tm., GraphPad software V 3.0., Copyright (c). Para

comparações múltiplas foi utilizado Análise de Variância (ANOVA), teste de Student

Newman Keuls ou teste de Dunnett, como teste post hoc. Para os testes não-paramétricos

(número de quedas no rota rod) foi usado teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunns.

As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em p< 0,05.

RESULTADOS

65

4 RESULTADOS

4.1 Testes comportamentais

4.1.1 Teste do campo aberto (vias intraperitoneal e oral)

A atividade locomotora espontânea (ALE), rearing e grooming foram realizados

como descrito no material e métodos. Os resultados são expressos como média ± EPM do

número de travessias, rearings e groomings durante 5 minutos. Como apresentado nas

Figuras 9 e 10 após o tratamento intraperitoneal e oral com iangambina ocorreu redução na

ALE (controle = 67,2 ± 2,7; Iag 25 = 40,0 ± 5,1; Iag 50 = 30,9 ± 2,9; Iag 75 = 47,8 ± 3,2) e

(controle = 67,9 ± 4,4; Iag 25 = 54,5 ± 2,9; Iag 50 = 45,9 ±1,2; Iag 75 = 42,9 ± 3,5)

respectivamente. O diazepam 1 mg/kg i.p., usado como droga padrão, também reduziu a ALE

em relação aos respectivos grupos controles (controle i.p. = 67,2 ± 2,7; controle v.o. = 67,9 ±

4,4; DZP 1 mg/kg i.p. = 40,6 ± 5,0).

A mesma diminuição foi vista com relação ao comportamento de rearing nas duas

vias usadas (controle = 16,4 ± 1,9; Iag 25 = 5,0 ± 1,2; Iag 50 = 7,0 ± 2,1; Iag 75 = 5,0 ± 0,9) e

(controle = 11,8 ± 1,1; Iag 25 = 7,2 ± 0,7; Iag 50 = 4,5 ± 0,6; Iag = 7,9 ± 1,2) respectivamente.

O diazepam também reduziu este parâmetro comportamental em relação aos grupos controles

(controle i.p. = 16,4 ± 1,9; controle v.o. = 11,8 ± 1,1; DZP 1 mg/kg, i.p. = 2,6 ± 0,9) (Figuras

11 e 12).

Conforme as Figuras 13 e 14, o comportamento de grooming foi também

reduzido em ambas as vias (controle = 4,5 ± 0,5; Iag 25 = 3,0 ± 0,4; Iag 50 = 2,2 ± 0,3; Iag 75

= 2,3 ± 0,3) e (controle = 5,5 ± 0,7; Iag 25 = 3,2 ± 0,3; Iag 50 = 3,5 ± 0,5; Iag 75 = 1,2 ± 0,3)

respectivamente. Foi observada uma redução do mesmo comportamento após o tratamento

com diazepam em relação aos grupos controles (controle i.p. = 4,5 ± 0,5; controle v.o. = 5,5 ±

0,7; DZP 1 mg/kg, i.p. = 2,7 ± 0,6).

66

FIGURA 9 - Efeito da iangambina intraperitoneal sobre a atividade locomotora (campo aberto). A atividade locomotora no campo aberto foi medida como o número de travessias de um quadrante para o outro de animais controles e tratados com iangambina (Iag) em doses de 25, 50 e 75 mg/kg i.p.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 6 – 15 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).

Controle Iag 25 Iag 50 Iag 75 Diazepam0

25

50

75ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg

***

***

*****

Tra

vess

ias

/ 5 m

in

67

FIGURA 10 - Efeito da iangambina via oral sobre a atividade locomotora (campo aberto). A atividade locomotora no campo aberto foi medida como o número de travessias de um quadrante para o outro de animais controles e tratados com iangambina (Iag) em doses de 25, 50 e 75 mg/kg v.o.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 14 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; *p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).


25

50


*

*** *** ***

Tra

vess

ias

/ 5 m

in

68

FIGURA 11 – Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via intraperitoneal). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via intraperitoneal. Os controles receberam Tween 80 a 5 %. Os valores representam média ± EPM (n = 6 – 15 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).

controle iag 25 iag 50 iag 75 diazepam0

5

10

15


Núm

ero

dere

arin

gs /

5 m

in

***

***

***

***

69

FIGURA 12 – Efeito da iangambina no número de rearings no campo aberto (via oral). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via oral. Os controles receberam Tween 80 a 5%. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 14 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01; ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).


5

10


****

******

Núm

ero

de r

eari

ngs

/ 5

min

70

FIGURA 13 – Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via intraperitoneal). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via intraperitoneal. Os controles receberam Tween 80 a 5 %. Os valores representam média ± EPM (n = 6 – 15 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (*p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).


1

2

3

4


*

* *

*

Núm

ero

degr

oom

ings

/5

min

71

FIGURA 14 – Efeito da iangambina no número de groomings no campo aberto (via oral). Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via oral. Os controles receberam Tween 80 a 5 %. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 14 camundongos por grupo). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).

Controle Iag 25 mgIag 50 mgIag 75 mgDiazepam0.0

2.5

5.0

7.5ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1 mg/kg** **

*

***

Núm

ero

degr

oom

ings

/5

min

72

4.1.2 Teste do rota rod (vias intraperitoneal e oral)

Os animais tratados por via intraperitoneal com iangambina nas doses de 25, 50 e

75 mg/kg, não apresentaram alterações significativas (p > 0,05) no número de quedas da barra

(NQ: Iag 25 = 1,30 ± 0,33; Iag 50 = 1,60 ± 0,37; Iag 75 = 1,22 ± 0,40) ou no tempo de

permanência na barra em segundos (TP: Iag 25 = 54,10 ± 3,42 s; Iag 50 = 52,40 ± 2,97 s; Iag

75 = 52,78 ± 2,77 s) em relação ao grupo controle (NQ: 1,83 ± 0,27 e TP: 56,33 ± 0,87 s)

(Tabela 1).

Nenhuma alteração nestes parâmetros foi observada com os animais tratados com

iangambina nas mesmas doses por via oral (NQ: Iag 25 = 1,47 ± 0,25; Iag 50 = 1,85 ± 0,23;

Iag 75 = 1,00 ± 0,19) e (TP: Iag 25 = 51,26 ± 2,47 s; Iag 50 = 46,95 ± 2,83 s; Iag 75 = 56,27 ±

0,70 s) em relação ao grupo controle (NQ: 1,35 ± 0,26 e TP: 48,65 ± 3,22 s) (Tabela 2).

De maneira semelhante, o diazepam 1 mg/kg, i.p., não alterou nenhum dos

parâmetros observados quando comparado ao grupo controle (NQ: 1,6 ± 0,27 e TP: 55,70 ±

0,87 s).

73

TABELA 1 - Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do rota rod

para camundongos.

Grupos

Número de Quedas Tempo de Permanência (s)

Controle

1,83 ± 0,27 56,33 ± 0,87

Iag 25

1,30 ± 0,33 54,10 ± 3,42

Iag 50

1,60 ± 0,37 52,40 ± 2,97

Iag 75

1,22 ± 0,40 52,78 ± 2,77

DZP 1

1,60 ± 0,27

55,70 ± 0,87

Os animais foram tratados por via intraperitoneal com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM do número de quedas da barra ou do tempo de permanência na barra (s). (n = 9 – 12 camundongos por grupo). Foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido por Dunns como teste post hoc (para o parâmetro do número de quedas). Para o tempo de permanência foi utilizado ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc. Os dados foram considerados significativos a partir de p < 0,05.

74

TABELA 2 – Efeito da administração oral da iangambina no teste do rota rod para

camundongos.

Grupos

Número de Quedas Tempo de Permanência (s)

Controle

1,35 ± 0,26 48,65 ± 3,22

Iag 25

1,47 ± 0,25 51,26 ± 2,47

Iag 50

1,85 ± 0,23 46,95 ± 2,83

Iag 75

1,00 ± 0,19 56,27 ± 0,70

DZP 1

1,60 ± 0,27

55,70 ± 0,87

Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM do número de quedas da barra ou do tempo de permanência na barra (s). (n = 10 – 20 camundongos por grupo). Foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido por Dunns como teste post hoc (para o parâmetro do número de quedas). Para o tempo de permanência foi utilizado ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc. Os dados foram considerados significativos a partir de p < 0,05.

75

4.1.3 Teste do nado forçado (vias intraperitoneal e oral)

No teste do nado forçado como mostrado nas Figuras 15 e 16 ocorreram

aumentos significativos no tempo de imobilidade dos animais nas duas vias estudadas em

relação aos respectivos grupos controle após a administração da iangambina intraperitoneal e

oral (via intraperitoneal: controle = 118,10 ± 10,96; Iag 25 = 166,40 ± 2,10; Iag 50 = 187,60 ±

12,40; Iag 75 = 186,67 ± 14,62) e (via oral: controle = 116,70 ± 11,50; Iag 25 = 156,90 ±

10,00; Iag 50 = 163,13 ± 12,80; Iag 75 = 165,08 ± 2,70).

O cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p. (Figuras 15 e

16) reduziu o tempo de imobilidade dos animais em relação aos grupos controle (controle i.p.

= 118,10 ± 10,96; controle v.o. = 116,70 ± 11,50; Clor. de imipramina 10 mg/kg, i.p. = 18,10

± 2,7).

76

FIGURA 15 – Efeito do tratamento agudo com iangambina por via intraperitoneal no tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos. Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via intraperitoneal e 1/2 hora após o último tratamento foram colocados na cuba de acrílico e o teste foi conduzido de acordo com o exposto no material e métodos. O cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 10 camundongos por grupo) do tempo de imobilidade (s). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; **p < 0,01 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).

ControleIag 25 mIag 50 mIag 75 mClor.Imp0

100

200

300ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/ kgIag 75 mg/kgClor.de Imipramina 10mg/kg

*****

***

***

Tem

po d

e im

obil

idad

e (s

)

77

FIGURA 16 – Efeito do tratamento agudo com iangambina por via oral no tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos. Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg por via oral e 1 hora após o último tratamento foram colocados na cuba de acrílico e o teste foi conduzido de acordo com o exposto no material e métodos. O cloridrato de imipramina (Clor. de imipramina) 10 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 15 camundongos por grupo) do tempo de imobilidade (s). Estatisticamente significativo quando comparado ao controle (***p < 0,001; *p < 0,05 ANOVA e Student Newman Keuls como teste post hoc).

ControleIag 25 mIag 50 mIag 75 mCl. IMP 10

100

200ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgClor.de Imipramina10 mg/kg

* * *

***Tem

po d

e im

obil

idad

e (s

)

78

4.1.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital (vias intraperitoneal e oral)

No teste do tempo de sono induzido por pentobarbital foram observados dois

parâmetros: o tempo de latência (s), que corresponde ao tempo que o animal leva para

adormecer, e a duração do sono (min). Conforme a Figura 17 A e B, após a administração

intraperitoneal da iangambina (Iag) 25 e 50 mg/kg, foi visto uma redução significativa no

tempo de latência do sono (TL) apenas com a maior dose em relação ao grupo controle (TL:

controle = 276,92 ± 14,63; Iag 25 = 247,42 ± 15,51; Iag 50 = 177,00 ± 18,17), e apresentou

aumento significativo na duração do sono (DS) nas duas doses empregadas em relação ao

controle (DS: controle = 37,62 ± 1,64; Iag 25 = 53,45 ± 4,48; Iag 50 = 64,06 ± 6,81).

Nenhuma alteração no tempo de latência foi vista após administração oral da

iangambina nas mesmas doses usadas (TL: controle = 353,50 ± 27,19; Iag 25 = 317,88 ±

25,79; Iag 50 = 311,13 ± 15,70), contudo, foi observado aumento significativo na duração do

sono em ambas as doses (DS: controle = 26,81 ± 2,19; Iag 25 = 49,56 ± 2,61; Iag 50 = 43,48

± 3,62) Figura 18 A e B.

Como esperado, o diazepam 1 mg/kg, i.p., reduziu o tempo de latência do sono e

aumentou a duração do sono respectivamente (TL: 187,6 ± 9,25 e DS: 74,18 ± 6,82) em

relação aos grupos controle (TL: controle i.p. = 276,92 ± 14,63 e DS:controle i.p. = 37,62 ±

1,64) e (TL: controle v.o. = 353,50 ± 27,19 e DS: = 26,81 ± 2,19) conforme as Figuras 17 e

18 A e B.

79

A

B

FIGURA 17 – Efeito da iangambina intraperitoneal no tempo de sono induzido por pentobarbital em camundongos. Os animais foram tratados por via intraperitoneal com iangambina (Iag) 25 e 50 mg/kg, 30 minutos antes da administração do pentobarbital 40 mg/kg, i.p.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 10 – 12 camundongos por grupo) do tempo de latência em segundos (A) e a duração do sono em minutos (B). Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

Controle Iag 25 mg/kIag 50 mg/kDiazepam 10

100

200

300

ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgDiazepam 1 mg/kg

*** ***

Tem

po d

e la

tênc

ia (

s)


25

50

75

100

*

*****

Dur

ação

do

sono

(m

in)

80

A

B

FIGURA 18 – Efeito da iangambina via oral no tempo de sono induzido por pentobarbital em camundongos. Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25 e 50 mg/kg, 1 hora antes da administração do pentobarbital 40 mg/kg, i.p. O diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM (n = 10 – 12 camundongos por grupo) do tempo de latência em segundos (A) e a duração do sono em minutos (B). Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.


100

200

300

400

ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgDiazepam 1 mg/kg ip

***

Tem

po d

e la

tênc

ia (

s)

Controle Iag 25 mg/Iag 50 mg/Diazepam0

25

50

75

100

***

***

**

Dur

ação

do

sono

(m

in)

81

4.1.5 Teste da placa perfurada (vias intraperitoneal e oral)

Neste modelo experimental, após a administração aguda de iangambina nas doses

de 25; 50 e 75 mg/kg, foi observado um significante aumento do número de vezes que o

animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), tanto por via

intraperitoneal como por via oral, quando comparado aos respectivos grupos controle (via

intraperitoneal: controle = 26,5 ± 1,42; Iag 25 = 34,9 ± 1,57; Iag 50 = 34,3 ± 2,84; Iag 75 =

34,3 ± 2,30) e (via oral: controle = 26,4 ± 1,44; Iag 25 = 43,1 ± 4,68; Iag 50 = 38,5 ± 1,39; Iag

75 = 37,6 ± 3,89) conforme evidenciado nas Figuras 19 e 20 respectivamente.

O efeito do diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p., administrado 30 min antes do teste da

placa perfurada é mostrado nas Figuras 19 e 20. Comparado com os grupos controle (i.p. e

v.o.), os animais tratados com diazepam manifestaram um aumento significativo do número

de vezes que o animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), (controle

i.p. = 26,5 ± 1,42; controle v.o. = 26,4 ± 1,44; DZP 1 mg/kg, i.p. = 45,4 ± 1,27).

82

FIGURA 19 – Efeito do tratamento agudo com iangambina via intraperitoneal no teste de placa perfurada para camundongos. Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg e diazepam 1 mg/kg, que foi usado como droga padrão. Os tratamentos com as drogas foram realizados por via intraperitoneal e 1/2 hora após a administração cada animal foi colocado no aparato. Os valores representam média ± EPM (n = 9 – 14 camundongos por grupo) do número de vezes que o animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips) durante 5 minutos de observação. ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

Controle Iag 25 mgIag 50 mgIag 75 mgDiazepam0

10

20

30

40


Núm

ero

deH

ead

Dip

s

* ***

***

83

FIGURA 20 - Efeito do tratamento agudo com iangambina via oral no teste de placa perfurada para camundongos. Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, v.o. e diazepam 1 mg/kg, i.p. que foi usado como droga padrão. Após 1 hora e 1/2 hora da administração oral e intraperitoneal, respectivamente, cada animal foi colocado no aparato. Os valores representam média ± EPM (n = 8 – 10 camundongos por grupo) do número de vezes que o animal colocou a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips) durante 5 minutos de observação. ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

ControleIag 25 mIag 50 mIag 75 mDiazepa0

10

20

30

40

50ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kgDiazepam 1mg/kg ip

*** ***

** **

Núm

ero

deH

ead

Dip

s

84

4.1.6 Teste de labirinto em cruz elevado (vias intraperitoneal e oral)

Neste modelo, a administração intraperitoneal da iangambina nas doses de 25 e 50

mg/kg, reduziu de maneira significativa apenas o tempo de permanência nos braços abertos

(TPBA) (Iag 25: TPBA = 68,5 ± 10,0 s) e (Iag 50: TPBA = 73,6 ± 12,1 s), com relação ao

grupo controle (TPBA = 115,1 ± 10,1 s). A iangambina nas mesmas doses, não alterou o

número de entradas nos braços abertos (NEBA), a percentagem do número de entradas nos

braços abertos (PEBA) e a percentagem do tempo de permanência nos braços abertos

(PTBA), (Iag 25: NEBA = 5,3 ± 0,4; PEBA = 42,6 ± 1,7 %; PTBA = 33,6 ± 5,5 %) e (Iag 50:

NEBA = 5,8 ± 0,6; PEBA = 44,8 ± 2,5 %; PTBA = 32,3 ± 5,3 %), quando comparado ao

controle (NEBA = 6,6 ± 0,4; PEBA = 42,6 ± 1,7 %; PTBA = 39,6 ± 2,3 %), no entanto na

dose de 75 mg/kg foi observado um aumento significativo nos seguintes parâmetros, PEBA,

TPBA e PTBA (Iag 75: PEBA = 59,7 ± 3,3 %; TPBA = 160,8 ± 17,7 s; PTBA = 67,7 ± 7,0

%), quando comparado ao controle (PEBA = 42,6 ± 1,7 %; TPBA = 115,1 ± 10,1 s; PTBA =

39,6 ± 2,3 %. A iangambina na dose de 75 mg/kg, não alterou o número de entradas nos

braços abertos (NEBA = 5,5 ± 0,7) em relação ao grupo controle (NEBA = 6,6 ± 0,4) (Tabela

3 e Figura 21 A e B).

A administração oral da iangambina nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg produziu

aumento significativo em dois parâmetros, PEBA e PTBA (Iag 25: PEBA = 47,4 ± 1,2 %;

PTBA = 49,5 ± 1,8 %), (Iag 50: PEBA = 48,8 ± 1,6 %; PTBA = 47,2 ± 2,4 %) e (Iag 75:

PEBA = 58,4 ± 3,6 %; PTBA = 67,7 ± 7,0 %), quando comparado ao controle (PEBA = 40,3±

2,0 %; PTBA = 39,7 ± 2,6 %). Foi observado um aumento significativo nas doses de 50 e 75

do NEBA (Iag 50: 8,1 ± 0,5) e do TPBA (Iag 75: 170,2 ± 16,2 s), respectivamente em relação

ao grupo controle (NEBA = 6,2 ± 0,6; TPBA = 115,3 ± 5,7 s). A iangambina nas doses de 25

e 75, não alterou o NEBA (Iag 25 = 7,8 ± 0,5; Iag 75 = 5,3 ± 0,6) comparado ao grupo

controle (NEBA = 6,2 ± 0,6) e nas doses de 25 e 50 não foi observada nenhuma alteração do

TPBA (Iag 25 = 125,9 ± 5,7 s; Iag 50 = 124,6 ± 6,4 s) comparado ao controle (TPBA = 115,3

± 5,7 s) Tabela 4 e Figura 22 A e B).

85

O diazepam (1 mg/kg, i.p.), utilizado como droga padrão, aumentou

significativamente todos os parâmetros observados (NEBA = 16,1 ± 1,2; PEBA = 67,7 ± 4,4

%; TPBA = 204,0 ± 13,1 s; PTBA = 72,3 ± 4,2 %) com relação ao controle intraperitoneal

(NEBA = 6,6 ± 0,4; PEBA = 42,6 ± 1,7 %; TPBA = 115,1 ± 10,1 s; PTBA = 39,6 ± 2,3 %) e

o controle oral (NEBA = 6,2 ± 0,6; PEBA = 40,3± 2,0 %; TPBA = 115,3 ± 5,7 s; PTBA =

39,7 ± 2,6 %) (Tabelas 3 e 4; Figuras 21 e 22 - A e B)

Com objetivo de investigar se o efeito ansiolítico da iangambina poderia ser

mediado pelo receptor benzodiazepínico, flumazenil 2,5 mg/kg,i.p., um antagonista específico

para o reconhecimento deste receptor, foi co-administrado com iangambina 75 mg/kg, v.o. em

camundongos. Conforme a Tabela 4 e Figura 22 - A e B, podemos observar que o tempo de

permanência nos braços abertos (TPBA) e a percentagem do tempo de permanência nos

braços abertos (PTBA) foram revertidos de maneira significativa no grupo tratado com Iag 75

na presença do flumazenil, com relação aos animais tratados com Iag 75 mg/kg, v.o.,

demonstrando que provavelmente a iangambina exerceu seu efeito ansiolítico via receptor

benzodiazepínico, TPBA (Flu + Iag 75 = 111,4 ± 15,7 s) e PTBA (Flu + Iag 75 = 43,7 ± 6,1

%), versus TPBA (Iag 75 = 170,2 ± 16,2 s) e PTBA (Iag 75 = 67,9 ± 5,4 %). O flumazenil

sozinho não alterou os parâmetros observados (NEBA = 5,7 ± 0,5; PEBA = 44,7 ± 3,0 %;

TPBA = 106,3 ± 7,9 s; PTBA = 46,3 ± 3,8 %) com relação ao grupo controle (NEBA = 6,2 ±

0,6; PEBA = 40,3± 2,0 %; TPBA = 115,3 ± 5,7 s; PTBA = 39,7 ± 2,6 %).

86

TABELA 3 – Efeito da administração intraperitoneal da iangambina no teste do

labirinto em cruz elevado para camundongos

Grupos

NEBA

PEBA

TPBA

PTBA

Controle

6,6 ± 0,4 42,6 ± 1,7 115,1 ± 10,1 39,6 ± 2,3

Iag 25 mg/kg

5,3 ± 0,4 42,6 ± 1,7 68,5 ± 10,0*** 33,6 ± 5,5

Iag 50 mg/kg

5,8 ± 0,6 44,8 ± 2,5 73,6 ± 12,1* 32,3 ± 5,3

Iag 75 mg/kg 5,5 ± 0,7 59,7 ± 3,3** 160,8 ± 17,7* 67,7 ± 7,0**

DZP 1 mg/kg

16,1 ± 1,2** 67,7 ± 4,4** 204,0 ± 13,1** 72,3 ± 4,2**

Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25; 50 e 75 mg/kg, i.p.. O diazepam (DZP) 1 mg/kg, i.p. foi administrado como droga padrão e 1/2 hora após a administração das drogas os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) em segundos e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA). Os valores representam média ± EPM (n = 08 – 20 camundongos por grupo). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; grupos tratados comparados ao controle (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).

87

A

B

FIGURA 21 – Efeito da iangambina intraperitoneal no teste de labirinto em cruz

elevado. Os animais foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, i.p. O diazepam

(DZP) 1 mg/kg, i.p. foi administrado como droga padrão e 1/2 hora após a administração das

drogas os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz

elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços

abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de

permanência nos braços abertos (TPBA) e percentagem do tempo de permanência nos braços

abertos (PTBA) o que está expresso como percentagem em relação ao controle. NEBA e

TPBA (A) e PEBA e PTBA (B). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; grupos tratados

comparados ao controle (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).

0

100

200

300

Contro

le

Iag 25

Iag 50

Iag 75

DZP 1

% d

e A

ltera

ção

NEBA

TPBA*** *

*

**

**

0

50

100

150

200

Contro

le

Iag 25

Iag 50

Iag 75

DZP 1

% d

e A

ltera

ção

PEBA

PTBA

****

****

88

TABELA 4 - Efeito da administração oral da iangambina no teste de labirinto em cruz

elevado para camundongos.

Grupos

NEBA

PEBA

TPBA

PTBA

Controle 6,2 ± 0,6 40,3 ± 2,0 115,3 ± 5,7 39,7 ± 2,6

DZP 1 16,1 ± 1,2** 67,7 ± 4,4**

204,0 ± 13,1** 72,3 ± 4,2**

Iag 25 7,8 ± 0,5 47,4 ± 1,2** 125,9 ± 5,7 49,5 ± 1,8**

Iag 50 8,1 ± 0,5* 48,8 ± 1,6** 124,6 ± 6,4 47,2 ± 2,4*

Iag 75 5,3 ± 0,6 58,4 ± 3,6** 170,2 ± 16,2** 67,9 ± 5,4**

Flu 2,5 5,7 ± 0,5 44,7 ± 3,0 106,3 ± 7,9 46,3 ± 3,8

Flu 2,5 + Iag 75 5,8 ± 0,7 54,2 ± 3,3 111,4 ± 15,7a 43,7 ± 6,1a

Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, flumazenil (Flu) 2,5 mg, i.p., seguido por salina (Flu + salina v.o.) ou de Iag 75 (Flu + Iag 75), 15 min após o tratamento com flumazenil. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Após 1 hora e 1/2 hora da administração oral da iangambina e DZP i.p., respectivamente, e 1 hora, após a administração da salina e Iag 75 nos grupos Flu + salina e Flu + Iag 75, os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) em segundos e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA). Os valores representam média ± EPM (n = 10 – 17 camundongos por grupo). *p < 0,05; **p < 0,01; grupos tratados comparados ao controle e ap < 0,05 vs Iag 75 mg/kg (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).

89

A

B

FIGURA 22 – Efeito da iangambina via oral no teste de labirinto em cruz elevado. Os animais foram tratados por via oral com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, flumazenil (Flu) 2,5 mg, i.p., seguido por salina (Flu + salina v.o.) ou de Iag 75 (Flu + Iag 75), 15 min após o tratamento com flumazenil. O diazepam (DZP) 1 mg/kg i.p., foi utilizado como droga padrão. Após 1 hora e 1/2 hora da administração oral da iangambina e DZP i.p., respectivamente, e 1 hora, após a administração da salina e Iag 75 nos grupos Flu + salina e Flu + Iag 75, os camundongos foram colocados na plataforma central de um labirinto em cruz elevado, onde foram avaliados os parâmetros acima referidos: número de entradas nos braços abertos (NEBA), percentagem do número de entrada nos braços abertos (PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) e percentagem do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) o que está expresso como percentagem em relação ao controle. NEBA e TPBA (A) e PEBA e PTBA (B). *p < 0,05; **p < 0,01; grupos tratados comparados ao controle e ap< 0,05 vs Iag 75 mg/kg (ANOVA e Dunnett como teste post hoc).

a

0

50

100

150

200

250

300

Controle

DZP 1Ia

g 25

Iag 5

0

Iag 7

5

Flu 2,5

Flu 2,5

+ Iag 75

% d

e A

ltera

ção NEBA

TPBA

***

**

**

a

0

50

100

150

200

Controle

DZP 1Iag

25

Iag 50

Iag 75

Flu

Flu + Iag 7

5

% d

e A

lter

ação

PEBA

PTBA

** ** ** ***

**** **

90

4.1.7 Teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol (vias intraperitoneal e oral)

Os animais tratados por via intraperitoneal e por via oral com iangambina nas

doses de 25, 50 e 75, não apresentaram alterações em suas latências de convulsão quando

comparados ao controle (via intraperitoneal: Iag 25 = 85,3 ± 5,9 s; Iag 50 = 82,4 ± 8,2 s; Iag

75 = 64,6 ± 1,8 s; controle = 68,2 ± 3,8 s) e (via oral: Iag 25 = 89,2 ± 4,0 s; Iag 50 = 81,7 ±

6,8 s, Iag 75 = 72,3 ± 3,9 s; controle = 73,9 ± 3,9 s) (Tabela 5 e 6).

A latência de morte aumentou de forma significativa apenas na dose de

iangambina 75 mg/kg, i.p (320,8 ± 16,8 s; controle = 268,3 ± 26,9 s). Nas outras doses usadas,

tanto por via intraperitoneal como por via oral, não houve modificação neste parâmetro em

relação ao controle (via intraperitoneal: Iag 25 = 284,2 ± 29,7 s; Iag 50 = 264,6 ± 26,7 s;

controle = 268,3 ± 26,9 s) e (via oral: Iag 25 = 216,0 ± 28,0 s; Iag 50 = 201,2 ± 28,6 s; Iag 75

= 227,8 ± 27,2 s; controle = 221,3 ± 23,3 s) (Tabela 5 e 6).

A percentagem de animais tratados por via intraperitoneal e oral com iangambina

que apresentaram convulsão, assim como de animais que morreram foi de 100 % para todos

os grupos.

O diazepam 1 mg/kg, i.p., usado como droga padrão, aumentou de forma

significativa a latência de convulsão (controle i.p. = 68,2 ± 3,8 s; controle v.o. = 73,9 ± 3,9 s;

DZP 1 = 190,1 ± 17,2 s). Todos os animais tratados com diazepam sobreviveram durante o

tempo do teste (Tabela 5 e 6).

91

TABELA 5 – Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via

intraperitoneal, no modelo de convulsão induzida com pentilenotetrazol em

camundongos

Grupos

Latência de convulsão (s)

Latência de morte (s)

Controle

68,2 ± 3,8 (17) 268,3 ± 26,9 (17)

Iag 25 mg/kg

85,3 ± 5,9 (14) 284,2 ± 29,7 (14)

Iag 50 mg/kg

82,4 ± 8,2 (16) 264,6 ± 26,7 (16)

Iag 75 mg/kg

64,6 ± 1,8 (13) 320,8 ± 16,8 (13)*

DZP 1 mg/kg i.p.

190,1 ± 17,2 (18)*** -

Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., 30 minutos antes da administração de pentilenotetrazol 100 mg/kg, i.p.. O diazepam (DZP) 1,0 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM da latência de convulsão e morte dos animais em segundos. Em parênteses o número de animais por grupo. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. *p < 0,05; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

92

TABELA 6 – Avaliação da atividade anticonvulsivante da iangambina, por via oral., no

modelo de convulsão induzida com pentilenotetrazol em camundongos

Grupos

Latência de convulsão (s) Latência de morte (s)

Controle

73,9 ± 3,9 (20) 221,3 ± 23,3 (20)

Iag 25 mg/kg

89,2 ± 4,0 (13) 216,0 ± 28,0 (13)

Iag 50 mg/kg

81,7 ± 6,8 (10) 201,2 ± 28,6 (10)

Iag 75 mg/kg

72,3 ± 3,9 (13) 227,8 ± 27,2 (13)

DZP 1 mg/kg i.p.

190,1 ± 17,2 (18)*** -

Camundongos machos foram tratados com iangambina (Iag) 25, 50 e 75 mg/kg, via oral., 1 hora antes da administração de pentilenotetrazol 100 mg/kg, i.p. O diazepam (DZP) 1,0 mg/kg, i.p. foi utilizado como droga padrão. Os valores representam média ± EPM da latência de convulsão e morte dos animais em segundos. Em parênteses o número de animais por grupo. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc foi usado. ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

93

4.2 Estudo neuroquímico

4.2.1 Dosagens de monoaminas

Os níveis das monoaminas e seus metabólitos em córtex motor de camundongos

após 24 horas da administração aguda de iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) estão

apresentados nas Figuras 23 e 24.

Nos grupos tratados com iangambina nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg houve uma

redução em torno de 73, 84 e 63 %, respectivamente, nos conteúdos de dopamina, (Iag 25 =

48,5 ± 5,2; Iag 50 = 27,9 ± 5,5; Iag 75 = 65,4 ± 7,1) e em cerca de de 50, 47 e 70 % nos

conteúdos de HVA (Iag 25 = 56,6 ± 7,5; Iag 50 = 60,1 ± 7,8; Iag 75 = 33,2 ± 4,4) quando

comparado aos seus respectivos controles (DA = 176,9 ± 18,7 e HVA = 113,6 ± 13,7).

Nenhuma diferença significativa foi vista com estas doses com relação aos níveis de DOPAC

(Controle = 35,2 ± 4,1; Iag 25 = 29,5 ± 3,7; Iag 50 = 24,1 ± 3,4; Iag 75 = 25,4 ± 3,3).

O tratamento com iangambina na dose de 75 mg/kg, aumentou cerca de 70% os

conteúdos de noradrenalina, (Iag 75 = 557,9 ± 42,6) quando comparado ao controle (327,3 ±

47,3), entretanto nas doses de 25 e 50 mg/kg não foi observada nenhuma diferença

significativa (Controle = 327,3 ± 47,3; Iag 25 = 257,3 ± 32,6; Iag 50 = 265,1 ± 37,3).

A Figura 24 mostra um aumento de 288, 90 e 64 % nos níveis de serotonina em

camundongos tratados com iangambina 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente (Iag 25 =

521,1 ± 22,5; Iag 50 = 256,5 ± 12,7; Iag 75 = 220 ± 42,6), quando comparado ao controle

(134,4 ± 16,8), acompanhado de uma redução de 24, 46 e 35 %, nos níveis de 5-HIAA para as

doses de 25, 50 e 75 mg/kg, respectivamente (Iag 25 = 211,0 ± 28,7; Iag 50 = 148,7 ± 8,68;

Iag 75 = 179,4 ± 14,3) com relação ao controle (278,0 ± 28,2).

A Figura 25 apresenta o efeito da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, ip),

administrada de forma aguda, 24 horas após o tratamento sobre as taxas de DOPAC/DA,

HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em córtex motor.

94

Houve um aumento significativo de 244, 372 e 100 % nas taxas de DOPAC/DA

com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,62 ± 0,07; Iag 50 = 0,85

± 0,15; Iag 75 = 0,36 ± 0,05), quando comparado ao controle (0,18 ± 0,02). Foi observado,

apenas com as doses de 25 e 50 mg/kg, i.p., um aumento significativo de 121 e 326 % nas

taxas de HVA/DA, respectivamente (Iag 25 = 1,35 ± 0,25; Iag 50 = 2,60 ± 0,34) quando

comparado ao controle (0,61 ± 0,08), embora, nenhuma diferença significativa tenha sido

vista com a maior dose (controle = 0,61 ± 0,08; Iag 75 = 0,54 ± 0,11). Houve uma redução

significante de 79, 72, 54 %, nas taxas de 5-HIAA/5-HT, para as doses de 25, 50 e 75 mg/kg,

i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,41 ± 0,06; Iag 50 = 0,55 ± 0,03; Iag 75 = 0,91 ± 0,17)

quando comparado ao controle (1,98 ± 0,14).

As Figuras 26 e 27 mostram os níveis das monoaminas e seus metabólitos em

corpo estriado de camundongos, após 24 horas da administração aguda de iangambina 25, 50

e 75 mg/kg, i.p..

Nenhuma diferença significativa foi vista nos níveis de dopamina após o

tratamento com iangambina nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg, (Controle = 2041,0 ± 184,9; Iag

25 = 2030,0 ± 244,1; Iag 50 = 2409,0 ± 289,8; Iag 75 = 2060,0 ± 250,2), no entanto,

apresentou aumento significativo nos conteúdos de DOPAC de 145, 107 e 266 % para as

doses de 25, 50 e 75 mg/kg, respectivamete (Iag 25 = 1180,0 ± 87,2; Iag 50 = 996,5 ± 73,9;

Iag 75 = 1764,0 ± 188,2) quando comparado ao controle (481,2 ± 41,5) e aumentou os níveis

de HVA em torno de 44 %, apenas com a dose de 75 mg/kg (Iag 75 = 1268,0 ± 49,8) quando

comparado ao controle (882,1 ± 79,3). Não houve diferença significativa entre os grupos 25 e

50 mg/kg com relação aos níveis de HVA (Controle = 882,1 ± 79,3; Iag 25 = 1080,0 ± 105,7;

Iag 50 = 767,8 ± 26,8).

Os conteúdos de noradrenalina foram reduzidos em torno de 68, 76 e 74 % para as

doses de iangambina 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente (Iag 25 = 410,9 ± 29,8; Iag 50 =

305,2 ± 25,3; Iag 75 = 328,2 ± 32,8) quando comparado ao controle (1286,0 ± 80,2).

Nenhuma alteração significativa foi evidenciada entre quaisquer dos grupos com

relação aos níveis de serotonina (Controle = 684,6 ± 62,5; Iag 25 = 719,5 ± 36,3; Iag 50 =

95

667,5 ± 76,6; Iag 75 = 724,1 ± 73,4), no entanto houve aumento significativo nos conteúdos

de 5-HIAA em torno de 229, 278 e 111 %, para as doses de 25, 50 e 75 mg/kg,

respectivamente (Iag 25 = 537,6 ± 55,3; Iag 50 = 618,1 ± 61,5; Iag 75 = 344,3 ± 42,7),

quando comparado ao controle (163,1 ± 16,2).

A Figura 28 apresenta o efeito da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, ip),

administrada de forma aguda, 24 horas após o tratamento sobre as taxas de DOPAC/DA,

HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em corpo estriado.

Houve um aumento significativo de 134, 73 e 203 % nas taxas de DOPAC/DA

com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,61 ± 0,05; Iag 50 = 0,45

± 0,08; Iag 75 = 0,79 ± 0,09), quando comparado ao controle (0,26 ± 0,02). Foi observada,

apenas com a maior dose, um aumento significativo de 59 % nas taxas de HVA/DA, (Iag 75 =

0,70 ± 0,12), quando comparado ao controle (0,44 ± 0,03), entretanto, nenhuma alteração

significativa foi vista com as doses de 25 e 50 mg/kg,i.p.,(controle = 0,44 ± 0,03; Iag 25 =

0,54 ± 0,07; Iag 50 = 0,36 ± 0,04). Houve aumento significante de 225, 320, 70 %, nas taxas

de 5-HIAA/5-HT, para as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, i.p., respectivamente, (Iag 25 = 0,78 ±

0,09; Iag 50 = 1,01 ± 0,15; Iag 75 = 0,41 ± 0,05) quando comparado ao controle (0,24 ± 0,02).

96

FIGURA 23 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em córtex motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 5 – 10). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.

con25 D50 D75 Despcon25 D50 D75 Despcon25 H50 H75 H0

100

200ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg

DA DOPAC HVA

******

*** ** ***

***

ng/g

de

teci

do

97

FIGURA 24 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em córtex motor de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 4 – 8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Noradrenalina (NA), serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.

con25 50 N75 Nespcon5-H5-H5-Hespcon5-H5-H5-H0

250

500

750ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75mg/kg

NA 5-HT 5-HIAA

ng/g

de

teci

do

*****

* * **** **

98

FIGURA 25 – Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em córtex motor de camundongos determinado 24 horas depois da última administração. As medidas foram realizadas em 4-7 áreas de cada grupo. N = 5-7 para DOPAC/DA; N = 5-6 para HVA/DA e N = 4-6 para 5-HIAA/5-HT. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC); ácido homovanílico (HVA); serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

DODODODOESHVAHVAHVAHVAES5HI5HI5HI5HIESP0

1

2


DOPAC/DA HVA/DA 5HIAA/5HT

*****

*

*

**

Tax

a de

Met

abol

izaç

ão

******

***

99

FIGURA 26 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de DA, DOPAC e HVA (ng/mg de tecido) em corpo estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 5 – 9). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.

con25 D50 D75 Despcon25 D50 D75 Despcon25 H50 H75 H0

1000

2000

3000

ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg

DA DOPAC HVA

***

***

**

ng/g

de

teci

do

100

FIGURA 27 – Efeito da administração aguda da iangambina (25, 50 e 75 mg/kg, i.p.) nos níveis de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/mg de tecido) em corpo estriado de camundongos determinado 24 horas depois do tratamento. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 5 – 12). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; ***p < 0,001 quando comparado ao controle. Noradrenalina (NA), serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.

con25 50 N75 Nespacon5-H5-H5-Hespacont5-H5-H5-H0

500

1000


NA 5-HT 5-HIAA

*********

******

*ng/g

de

teci

do

101

FIGURA 28 – Efeito do tratamento agudo da iangambina sobre as taxas de DOPAC/DA, HVA/DA e 5-HIAA/5-HT em corpo estriado de camundongos determinado 24 horas depois da última administração. As medidas foram realizadas em 5-11 áreas de cada grupo. N = 6-7 para DOPAC/DA; N = 5-8 para HVA/DA e N = 5-11 para 5-HIAA/5-HT. Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC); ácido homovanílico (HVA); serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

DODODODOESPHVAHVAHVAHVAESP5HI5HI5HI5HIESP0.0

0.5

1.0

1.5ControleIag 25 mg/kgIag 50 mg/kgIag 75 mg/kg

***

*** * **

***

*

DOPAC/DA HVA/DA 5HIAA/5HT

Tax

a de

Met

abol

izaç

ão

102

4.2.2 Ensaios de binding

4.2.2.1 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em homogenatos de

córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).

A Tabela 7 mostra o efeito da iangambina em homogenatos de córtex motor e

corpo estriado, diretamente sobre o binding de [3H]-SCH 23390 (experimento in vitro). Em

córtex motor, a iangambina não produziu efeito em nenhuma das doses usadas, no entanto, em

corpo estriado, ocorreu uma inibição em torno de 40 % do binding de [3H]-SCH 23390

quando incubado com iangambina em todas as doses estudadas (Iag 5 µM = 181,2 ± 22,9; Iag

10 µM = 183,6 ± 27,4; Iag 50 µM = 143,7 ± 8,4; Iag 100 µM = 166,2 ± 9,8 fmoles/mg de

proteína) quando comparado ao controle (280,1 ± 17,6 fmoles/mg de proteína).

103

TABELA 7 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-SCH 23390 em homogenatos

de córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).

Iangambina

(µM)

Córtex Motor

D1-símile

Corpo Estriado

D1-símile

0 118,1 ± 5,9 (6) 280,1 ± 17,6 (4)

5 - 181,2 ± 22,9 (4)**

10 - 183,6 ± 27,4 (4)**

50 114,9 ± 10,3 (6) 143,7 ± 8,4 (4)***

100 125,9 ± 15,7 (6) 166,2 ± 9,8 (4)**

200 143,8 ± 9,5 (6) -

Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 200), na presença de [3H]-SCH 23390, para os receptores D1-símile. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos como média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

104

4.2.2.2 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença de

mianserina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo

(experimentos in vitro).

O efeito da iangambina diretamente sobre o binding de [3H]-espiroperidol em

presença de mianserina apresentou inibição no binding D2 nas duas áreas cerebrais estudadas

apenas com as duas maiores doses. Em córtex motor a inibição foi maior que em corpo

estriado, em torno de 45,5 % e 29 %, respectivamente, do binding de [3H]-espiroperidol

quando incubado com iangambina (córtex motor: Iag 100 µM = 165,3 ± 17,3; Iag 200 µM =

114,4 ± 11,7; controle = 256,3 ± 22,7 fmoles/mg de proteína) e (corpo estriado: Iag 100 µM =

165,1 ± 17,7; Iag 200 µM = 154,7 ± 6,4; controle = 224,8 ± 11,8 fmoles/mg de proteína), não

ocorrendo nenhum efeito nas outras doses usadas em ambas áreas cerebrais (Tabela 8).

105

TABELA 8 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença

de mianserina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo


Iangambina

(µM)

Córtex Motor

D2-símile

Corpo Estriado

D2-símile

0 256,3 ± 22,7 (5) 224,8 ± 11,8 (6)

5 266,6 ± 31,4 (4) 188,7 ± 9,9 (4)

10 288,4 ± 27,9 (5) 198,6 ± 20,4 (4)

50 256,5 ± 23,1 (5) 187,2 ± 18,1 (4)

100 165,3 ± 17,3 (6)** 165,1 ± 17,7 (5)*

200 114,4 ± 11,7 (5)*** 154,7 ± 6,4 (6)**

Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 200), sobre o binding de [3H]-espiroperidol na presença de mianserina, para os receptores D2-símile. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos como média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

106

4.2.2.3 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em homogenatos de córtex

motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).

Em córtex motor, a iangambina produziu efeito no binding muscarínico, onde

apresentou uma inibição de 63 % do binding de [3H]-NMS apenas na presença de 200 µM

(107,8 ± 19,9 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle (291,6 ± 25,1 fmoles/mg

de proteína), não ocorrendo nenhum efeito nas outras doses usadas. Com relação a outra área

cerebral estudada, o corpo estriado, ocorreu uma inibição em torno de 42 % do binding de

[3H]-NMS quando incubado com iangambina (Iag 10 µM = 179,4 ± 21,3; Iag 50 µM = 158,6

± 5,6; Iag 100 µM = 173,6 ± 21,3 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle

(292,1 ± 20,9 fmoles/mg de proteína) (Tabela 9).

107

TABELA 9 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-NMS em homogenatos de

córtex motor e corpo estriado de camundongo (experimentos in vitro).

Iangambina

(µM)

Córtex Motor

(M1+M2)-símile

Corpo Estriado

(M1+M2)-símile

0 291,6 ± 25,1 (5) 292,1 ± 20,9 (10)

5 - 296,5 ± 27,2 (4)

10 - 179,4 ± 21,3 (4)**

50 324,4 ± 21,0 (5) 158,6 ± 5,6 (4)**

100 256,5 ± 19,5 (5) 173,6 ± 21,3 (4)**

200 107,8 ± 19,9 (7)*** -

Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 200), na presença de [3H]-NMS, para os receptores muscarínicos. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos com média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. **p < 0,01; ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

108

4.2.2.4 Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença de

dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo


A Tabela 10 mostra o efeito da iangambina diretamente sobre o binding de [3H]-

espiroperidol em presença de dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de

camundongo. Em córtex motor ocorreu inibição de 47,5 %, 63,5 % e 77,8 %,

respectivamente, do binding de [3H]-espiroperidol em presença de dopamina quando incubado

com iangambina (Iag 10 µM = 35,28 ± 1,51; Iag 50 µM = 24,49 ± 0,69; Iag 100 µM = 14,89

± 0,73 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle (67,18 ± 1,00 fmoles/mg de

proteína). Em corpo estriado houve inibição de 48 % apenas na presença de iangambina 100

µM (45,42 ± 4,82 fmoles/mg de proteína) quando comparado ao controle (87,55 ± 1,51

fmoles/mg de proteína), não ocorrendo efeito nas outras doses usadas.

109

TABELA 10 – Efeito da iangambina sobre o binding de [3H]-espiroperidol em presença

de dopamina em homogenatos de córtex motor e corpo estriado de camundongo


Iangambina

(µM)

Córtex Motor

5-HT2-símile

Corpo Estriado

5-HT2-símile

0 67,18 ± 1,00 (4) 87,55 ± 1,51 (5)

10 35,28 ± 1,51 (4) *** 71,44 ± 6,46 (4)

50 24,49 ± 0,69 (4) *** 89,09 ± 5,43 (4)

100 14,89 ± 0,73 (4) *** 45,42 ± 4,82 (5)***

Os homogenatos de animais não tratados foram incubados por 30 min com iangambina (0 – 100), sobre o binding de [3H]-espiroperidol na presença de dopamina, para os receptores 5-HT2-símile. Os resultados (fmoles/mg de proteína) são expressos com média ± EPM do número de experimentos mostrados em parênteses. Para análise estatística, ANOVA e teste de Student Newman Keuls com teste post hoc foi usado. ***p < 0,001 quando comparado ao controle.

DISCUSSÃO

111

5 DISCUSSÃO

Ocotea duckei Vattimo, popularmente conhecida como “louro de cheiro”, “louro

pimenta” e “louro canela” é encontrada no Nordeste do Brasil (BARRETO, 1990). Da casca

do caule desta planta foram isoladas algumas lignanas furofurânicas, entre elas a iangambina

(CASTRO-FARIAS-NETO et al., 1995a; MORAIS et al., 1996; MORAIS et al., 1998;

MORAIS et al., 1999; BARBOSA-FILHO et al.,1999). Alguns trabalhos (Herbert et al., 1997;

Serra et al., 1997; Araújo et al., 2001) mostraram que a iangambina possui propriedades

farmacológicas. Castro-Farias-Neto et al., (1995 a,b) mostraram que a iangambina é um

antagonista seletivo do receptor do fator ativador de plaquetas (PAF) e Serra et al. (1997)

mostraram um efeito anti-alérgico da lignana furofurânica. Almeida et al. (1995) e Pachú et

al. (1993) observaram um aumento no tempo de sono induzido por pentobarbital e efeito

anticonvulsivante em animais pré-tratados com iangambina sugerindo atividade sobre o

sistema nervoso central.

O interesse do Laboratório de Neurofarmacologia em estudar compostos

biologicamente ativos, aliados a dados anteriores de possíveis efeitos centrais da iangambina,

levou-nos a investigar esta substância. Neste trabalho, os efeitos da iangambina foram

estudados em vários modelos de comportamento animal, tais como o campo aberto, rota rod,

nado forçado, tempo de sono induzido por pentobarbital, placa perfurada, labirinto em cruz

elevado, bloqueio da convulsão induzida por pentilenotetrazol. Estes testes são modelos

clássicos para screening de atividades sobre o sistema nervoso central em animais e fornece

informações tais como desempenho psicomotor, locomoção, atividades ansiolítica,

miorelaxante, depressora e anticonvulsivante. O flumazenil, um antagonista

benzodiazepínico, foi usado para investigar o possível envolvimento da iangambina no

sistema gabaérgico. Foram exploradas também possíveis alterações neuroquímicas causadas

pela iangambina, usando ensaios de binding in vitro com o fim de verificar interferência com

os sistemas dopaminérgico, colinérgico e serotonérgico bem como dosagem de monoaminas

em córtex motor e corpo estriado de camundongos para ver alterações no sistema

monaminérgico.

Estudos neurofarmacológicos, neuroquímicos e neuroanatômicos demonstraram

anteriormente interações dinâmicas entre vários neurotransmissores no sistema nervoso

112

central. Existem indicações (Arnt et al., 1987) de que os receptores D1 e D2 interagem em

sinergismo ou antagonismo. Assim, agonistas dos receptores não são efetivos separadamente,

mas atuam sinérgicamente estimulando a locomoção e induzindo estereotipia. A locomoção

depende da ativação dos receptores D1 (Starr et al., 1989), enquanto o comportamento

estereotipado depende do receptor D2 (USHIJIMA et al., 1995). Sousa et al. (1999)

demonstraram em trabalhos anteriores que o mazindol, agonista dopaminérgico, aumentou a

atividade locomotora em animais sugerindo que o efeito estimulante do mazindol pode ser

mediado pela ativação dos receptores D2, desde que, na presença de antagonista D2, tais como

pimozide e sulpiride, o efeito do mazindol foi atenuado significativamente indicando que a

ativação deste receptor é necessária para ocorrer esta resposta comportamental. Além disso,

sabe-se que o tratamento com o haloperidol, antagonista dopaminérgico, diminui a atividade

locomotora em ratos (Vasconcelos et al., 2003) enquanto a anfetamina induz comportamento

de hiperatividade (VANOVER, 1998).

O corpo estriado, junto com o pallidum, substância negra e núcleos subtalâmico

fazem parte do gânglio basal. Observações clínicas sugerem que o gânglio basal está

envolvido no controle das desordens do movimento, podendo resultar tanto na redução do

movimento, como observado na doença de Parkinson, ou movimento excessivo, como

acontece na doença de Huntington. Como foi mencionado antes, o gânglio basal faz parte do

sistema motor extra-piramidal que está envolvido com o movimento voluntário. As ações

motoras do gânglio basal são, em grande parte, conectadas ao córtex prémotor e motor via

sistema piramidal (DeLONG, 2000). No presente trabalho uma redução na atividade

locomotora no teste do campo aberto foi detectada com todas as doses de iangambina

estudadas. Foi observada também redução no comportamento de rearing e grooming.

Nossos dados dos experimentos de binding in vitro mostraram que a iangambina

interagiu com os receptores D2 em córtex motor e D1 e D2 em corpo estriado, mostrando a

participação destes receptores na locomoção. Além disso, tem sido relatado que a redução da

atividade locomotora é causada pela diminuição da dopamina, de forma que a locomoção

depende do aumento ou redução desta monoamina (HSICH et al., 1994). Nossos resultados

corroboraram com estes estudos, desde que, foi observado que os níveis de dopamina foram

reduzidos no córtex motor, e apesar de não terem sido alterados em corpo estriado,

apresentaram aumento na taxa DOPAC/DA e HVA/DA, indicando a redução do fluxo desta

monoamina nesta região (HJORTH; MAGNUSSON, 1988). Desta feita, estas observações

113

associadas, com a redução da atividade locomotora induzida pela iangambina sugere que a

substância possa atuar por mecanismos dopaminérgicos, desde que houve uma interação da

droga com estes receptores nas duas áreas cerebrais, córtex motor e corpo estriado, áreas

conhecidas por seu envolvimento no comportamento motor.

O teste de campo aberto também é amplamente usado como medida de

emocionalidade em roedores (Broadhurst, 1958; Broadhurst, 1978; Albonetti; Farabollini,

1984), além de ser utilizado para estudar os efeitos de ansiolíticos e outras classes de drogas

sobre o comportamento em um novo ambiente. Desta forma, a locomoção, rearing e

grooming em roedores, observados no campo aberto, são os parâmetros comportamentais

mais usados para descrever influências dos eventos da vida ou da administração de drogas

(MONTGOMERY, 1955; ARAKAWA; IKEDA, 1991; REX et al., 1996). Angrini et al.,

(1998) mostraram que o clordiazepóxido, um ansiolítico de referência, o propranolol, um β-

bloqueador com atividade antagonista serotonérgica (Costain; Green, 1978), usado

freqüentemente no tratamento clínico da ansiedade humana (Wheatley, 1981) e a buspirona,

um agonista parcial 5-HT1A (Simeon et al., 1994), amplamente prescrita no tratamento da

ansiedade humana, apresentaram efeitos comportamentais semelhantes no campo aberto.

Todas essas drogas reduziram o comportamento locomotor.

Em um outro estudo com ratos, usando um tipo diferente de campo aberto (Hine,

1995) foi observado que houve maior movimento em ratos de raças que geralmente

mostraram maior emocionalidade, e isto é consistente com o trabalho anterior que mostrou

uma redução na locomoção com o clordiazepóxido e as outras drogas com ação ansiolítica.

Nossos resultados mostraram que a iangambina reduziu a atividade locomotora nas três doses

usadas, tanto por via intraperitoneal como oral, sugerindo uma ação ansiolítica. O diazepam

na dose usada também reduziu a locomoção dos animais. Dados na literatura demonstraram

que a redução na atividade locomotora espontânea dá uma indicação do nível de

excitabilidade do sistema nervoso central (Mansur et al., 1971) e esta redução pode estar

relacionada a sedação resultante da depressão do sistema nervoso central (OZTURK et al.,

1996; PEREZ et al., 1998).

A atividade de rearing também esta relacionada com a hiperatividade

dopaminérgica. Estudos apontam que o aumento da atividade dopaminérgica elícita um maior

comportamento de rearing (SWANSON et al., 1997). Nossos estudos mostraram que a

114

iangambina interagiu com receptores D2 em córtex motor e em D1 e D2 em corpo estriado e

apresentou redução nos níveis de dopamina e aumento da taxa metabólica deste

neurotransmissor em córtex motor e corpo estriado, respectivamente. A redução do

comportamento de rearing induzido pela iangambina vem corroborar com estas observações.

Em alguns estudos o rearing tem sido focalizado como um aspecto de comportamento

exploratório (Johansson; Ahlenius, 1989; Hine, 1995), mas outros sugerem que agentes

ansiolíticos diminuem o número de rearing (HUGHES, 1972; STOUT, 1994).

No presente trabalho, como mencionado anteriormente, a iangambina reduziu o

número de rearing em todas as doses usadas em ambas vias administradas. A dose de

diazepam usada neste estudo também reduziu o número de rearing. Estes achados são

consistentes com estudos anteriores que mostraram que ratos de raça mais emocional

apresentaram maior número de rearing em campo aberto que uma raça menos emocional

(Hine, 1995), e com outros achados anteriores que apresentaram uma redução no número de

rearing em campo aberto produzido por ansiolíticos (GRAY, 1982). A atividade de rearing

em roedores é também descrita como um comportamento estereotipado complexo

(DANDIYA et al., 1969). Assim sendo, a redução de rearing, induzida pela iangambina, pode

também ser devido a redução da excitabilidade do sistema nervoso central por esta substância,

desde que, o sistema nervoso central é conhecido facilitar o rearing (GUPTA et al., 1971).

Desta forma, a redução do rearing observada em camundongos tratados com iangambina

associado a redução da atividade locomotora no campo aberto sugere a atividade depressora

da iangambina, considerando que, o rearing está relacionado com os níveis de excitabilidade

do sistema nervoso central (CUNHA; MASUR, 1978).

De acordo com MacFarland e Reeder, 1974 quase todos os animais gastam uma

significante parte do tempo no comportamento de grooming. Embora vários transmissores

possam modular a expressão deste comportamento (Moody et al, 1988; Traber, et al., 1988

apud Serafim; Felício, 2001), a dopamina está particularmente envolvida (COOLS; SPRUIJT;

ELLENBROEK, 1988 apud SERAFIM; FELÍCIO, 2001; DRAGO, 1999). Nossos resultados

apresentaram redução de grooming em campo aberto, assim como uma interação com

receptores dopaminérgicos nas duas áreas cerebrais estudadas, acompanhada de uma redução

da dopamina em córtex motor e elevação da sua taxa metabólica em corpo estriado. O

aumento de grooming é observado em roedores apreensivos (Archer, 1973), e em um grande

número de estudos, pesquisadores observaram que drogas ansiolíticas reduzem o grooming

115

em campo aberto (BARROS et al., 1994; DUNN et al., 1981; MOODY et al., 1993). Então,

corroborando com trabalhos anteriores que observaram redução de grooming com drogas

ansiolíticas, podemos a partir da redução do grooming induzida pela iangambina em campo

aberto, sugerir possível efeito ansiolítico desta substância o qual pode ter sido produzido pela

combinação de efeitos originados em outros receptores no sistema nervoso central, incluindo

o receptor D1/D2 (LEUNG et al., 2003). Vale salientar que a redução da atividade locomotora,

rearing e grooming também foi observada nos animais tratados com o diazepam, que foi

usado como droga ansiolítica de referência.

O teste de rota rod é amplamente usado para medir o desempenho da coordenação

motora nos animais (SEDELIS et al., 2001). Desta forma, pode-se dizer que é um modelo

simples que serve para detectar déficits neurológicos em ratos e camundongos (DUNHAM;

MIYA, 1957). A iangambina não causou alteração na coordenação motora no teste de rota

rod no protocolo estudado, sugerindo que a redução da ação locomotora observada, pode não

ter sido exercida através do bloqueio neuromuscular periférico, mas preferivelmente os efeitos

devem envolver neurônios que controlam atividade depressora central (ADZU et al., 2002).

O teste do nado forçado estabelecido por Porsolt et al. (1977a) é um modelo

animal amplamente usado para avaliar efeitos antidepressivos, e a atividade antidepressiva

neste teste, pode ser avaliada tanto em ratos como em camundongos (PORSOLT et al, 1977a;

PORSOLT et al., 1979; BORSINI, 1995). É bem estabelecido que a depressão está

relacionada a redução de noradrenalina e serotonina e que inibidores seletivos da recaptação

de noradrenalina e ou serotonina melhoram a depressão (BLIER; MONTIGNY, 1994). Foi

sugerido que a dopamina também participa na depressão e está implicada na regulação do

humor (BROWN et al., 1993). Estes achados são evidenciados em modelos animais de

depressão, que mostraram níveis de dopamina extracelular reduzidos (ROSSETTI et al.,

1993).

Recentemente foi considerado que a dopamina pode estar relacionada com os

efeitos antidepressivos (JOCA et al., 2000). De acordo com estudos anteriores, o teste do nado

forçado provocou um aumento significativo na concentração de dopamina durante este teste

(RENARD et al., 2003). A tendência por uma correlação inversa entre os níveis de dopamina

e os efeitos antidepressivos foi encontrada particularmente com a paroxetina, que apresentou

alta magnitude de efeitos antidepressivos e produziu uma baixa concentração de dopamina,

116

enquanto, a tranilcipromina mostrou menores efeitos antidepressivos, e altas concentrações de

dopamina (RENARD et al., 2004). De qualquer modo esta correlação é limitada, desde que,

outros elementos, além da concentração da dopamina deveriam ser considerados, em

particular, a atividade antidepressiva que caracteriza cada uma dessas drogas.

Foi evidenciado em nossos resultados que a iangambina aumentou o tempo de

imobilidade nas três doses usadas, tanto por via intraperitoneal como oral, e as concentrações

de dopamina foram reduzidas em córtex motor e corpo estriado. Esses resultados corroboram

dados obtidos no estudo de Renard et al. em 2004, que mostraram que drogas ansiolíticas, tais

como a buspirona e o diazepam não apresentaram atividade antidepressiva no teste do nado

forçado, embora as concentrações de dopamina induzidas por ambas as drogas fossem

consistentes com as concentrações reduzidas deste neurotransmissor obtidas com fármacos

que apresentaram efeito antidepressivo neste modelo experimental. De outra forma, a

atividade antidepressiva da bupropiona, um inibidor seletivo da recaptação da dopamina, não

deve estar ligada com a concentração da dopamina no teste do nado forçado (RENARD et al.

2004). Assim, estudos envolvendo a participação dos receptores dopaminérgicos no

mecanismo de ação deste fármaco, foram mostrados por Yamada et al. (2004). Neste estudo

foi observado que o SCH 23390, um antagonista do receptor D1, e o sulpiride, um antagonista

do receptor D2, antagonizaram os efeitos anti-imobilidade da bupropiona, sugerindo que a

participação dos receptores D1 e D2 podem potencialmente melhorar a depressão.

Dados na literatura mostram um aumento nos níveis de DOPAC (ácido 3,4-

diidroxifenilacético) em córtex préfrontal (Claustre et al., 1986) e no núcleo caudado

acompanhado de um aumento do 5-HIAA (ácido 5-hidroxindolacético) (Ikeda; Nagatsu,

1985) decorrente do estresse induzido pelo nado forçado. Em nossos resultados foi observado

que a iangambina também aumentou esses dois metabólitos (DOPAC e 5-HIAA) em corpo

estriado, região que contém o núcleo caudado, mostrando provavelmente, um efeito depressor

da droga a nível de sistema nervoso central, desde que, o teste do nado forçado induziu

depressão em animais expostos a este modelo. Além disso, conforme nossos resultados a

iangambina, interagiu com os receptores dopaminérgicos D1, em corpo estriado, e D2 em

córtex motor e corpo estriado, provavelmente produzindo um efeito antagonista em ambos

receptores, aumentando a imobilidade dos animais, como evidenciado previamente com

drogas como o SCH 23390 e o sulpiride, que reverteram o efeito antidepressivo da

bupropiona.

117

Porsolt et al., (1979) sugeriram que a imobilidade de ratos no teste do nado

forçado, reflete atividade do sistema central de catecolaminas. Eles observaram que a

imobilidade foi reduzida por drogas que elevam a atividade dopaminérgica e α-adrenérgica e

aumentada por agentes que as reduzem. Observaram também que, a imobilidade não foi

afetada por drogas β-adrenérgicas e foi relativamente insensível a drogas que atuam

seletivamente sobre a serotonina.

Em nossos resultados observamos que, em córtex motor e corpo estriado, houve

uma redução de dopamina induzida pela iangambina, o que é consistente com a redução da

atividade locomotora evidenciada no campo aberto e seu efeito depressor visto em ambos

modelos (campo aberto e teste do nado forçado). No entanto, em córtex motor, houve

aumento da concentração de noradrenalina e serotonina, e a iangambina não reduziu o tempo

de imobilidade no teste do nado forçado. Assim sendo, o aumento da noradrenalina e

serotonina influenciando o efeito antidepressivo depende da área cerebral estudada. Na outra

área estudada, ou seja, o corpo estriado, houve diminuição no fluxo de serotonina,

evidenciado pelo aumento da sua taxa metabólica, acompanhado da redução de noradrenalina.

Sabendo que, o corpo estriado consiste em três importantes subdivisões: o núcleo caudado, o

putamen e o estriado ventral, o qual inclui o nucleus accumbens, uma região envolvida com a

emoção e memória (DeLong, 2000), a redução da noradrenalina e serotonina induzida pela

iangambina nesta região, pode também indicar seu efeito depressor no nado forçado. Nossos

resultados também mostraram que a imipramina, uma droga antidepressiva clássica, e usada

neste modelo como droga de referência, como esperado, diminuiu o tempo de imobilidade, no

teste do nado forçado indicando um efeito antidepressivo.

O efeito depressor da iangambina sobre o sistema nervoso central foi também

avaliado pelo teste do tempo de sono induzido por pentobarbital. A redução da latência para o

sono bem como o prolongamento no tempo de sono são classicamente relacionados a drogas

que deprimem o sistema nervoso central (WILLIANSON et al., 1996). Os resultados

mostraram que a iangambina reduziu a latência do sono, com a maior dose usada por via

intraperitoneal, e foi observado, tanto por via intraperitoneal como oral, aumento na duração

do sono com todas as doses empregadas. Entretanto vale salientar que este teste não é

específico, visto que compostos que interferem com a biotransformação do pentobarbital pelo

citocromo P450 podem mostrar o mesmo efeito de drogas que deprimem o sistema nervoso

central (GOLOUBKOVA et al., 1998). Ou seja, o prolongamento da hipnose pelo

118

pentobarbital pode ser devida as propriedades sedativas e/ou hipnóticas (Fujimori, 1965)

atribuídas a inibição do metabolismo do pentobarbital (Kaul; Kulkarni, 1978) ou mecanismos

centrais envolvidos na regulação do sono (N’GOUEMO et al., 1994).

No entanto, no presente trabalho, foi avaliada também a atividade locomotora dos

animais no campo aberto, e a iangambina reduziu de forma significativa a atividade

locomotora. A literatura enfatiza que a redução deste comportamento é indicativo de sedação

(Ozturk et al., 1996), como resultado da redução da excitabilidade do sistema nervoso central

(Mansur et al., 1971) e drogas que suprimem esta atividade, podem estar ligadas a atividade

depressora central. Assim sendo, os efeitos da iangambina na potenciação do sono induzido

pelo pentobarbital e a redução da atividade locomotora sugerem muito bem efeito depressor

central (PEREZ et al., 1998). Além do mais a coordenação motora dos animais não foi afetada

pela iangambina, avaliada no teste de rota rod, sugerindo que a mesma não exerceu bloqueio

neuromuscular periférico, mas preferencialmente elicitou uma ação central (Perez et al.,

1998), indicando que esta substância pura pode provavelmente atuar como uma droga

neurosedativa (CAPASSO et al., 1996).

A ansiedade, diferente de outras condições psiquiátricas, tais como, esquizofrenia

e depressão, é uma emoção normal e também uma desordem psiquiátrica. Muitas vezes é

difícil separar a condição normal da patológica, no entanto, quando os sintomas são

freqüentes e mal adaptados, interferindo com o funcionamento normal do indivíduo, a

ansiedade é considerada patológica e requer terapia farmacológica (BHATTACHARYA;

SATTYAN, 1997). O aparecimento dos benzodiazepínicos, contribuiu para uma melhor

compreensão das bases da ansiedade. Essas drogas foram introduzidas na clínica médica há

mais de quatro décadas e são os agentes ansiolíticos de escolha devido a sua efetividade e

relativa segurança. Entretanto, essas drogas podem induzir tolerância e dependência física

(WALKER, 1990). Isto tem direcionado a pesquisa para novos e melhores agentes

ansiolíticos. Drogas que reduzem a atividade serotonérgica central, tais como, o agonista

parcial do receptor 5-HT1A, buspirona, e o antagonista 5-HT3, ondansetron, tem desviado a

atenção dos benzodiazepínicos.

Desde que as plantas possuem múltiplas ações farmacológicas por conterem

numerosos constituintes de natureza química diversa, tem sido uma importante fonte da

medicina. Desta maneira, na pesquisa de novos ansiolíticos efetivos e seguros, os

119

farmacologistas investigam na natureza, e esforços são realizados na busca de fármacos para

ansiedade originados do reino vegetal (PETKOV; STANEVA, 1963). O teste da placa

perfurada (Hole board), foi estudado para explorar o potencial ansiolítico da iangambina.

Neste teste é medido o comportamento exploratório em roedores (FILE; WARDILL, 1975). O

número de vezes que o animal coloca a cabeça no buraco da placa perfurada (head dips), tem

sido registrado como um parâmetro para avaliar as condições de ansiedade em animais. Neste

modelo, doses não-sedativas de benzodiazepínicos e outras drogas ansiolíticas, aumentaram o

número de head dips em camundongos, enquanto seus antagonistas o reduziram (CRAWLEY,

1985).

Estudos realizados por Takeda et al. (1998) demonstraram que, ansiolíticos

benzodiazepínicos, tais como, o diazepam e o clordiazepóxido, apresentaram efeitos

consistentes no comportamento de head dips no teste da placa perfurada, ou seja, ambos

aumentaram o número de head dips em doses que estes compostos não produziam sedação.

Esta observação é consistente com resultados anteriores, que mostraram aumento na

freqüência de head dips seguida de injeções de doses não sedativas de diazepam. No entanto

este efeito foi revertido com doses maiores de diazepam, o qual induziu sedação (SUZUKI et

al., 1990). Estudos realizados com compostos ansiogênicos, tais como, FG7142 e β-CCM,

ambos derivados β-carbolina, mostraram que estas drogas reduziram o número de head dips

(TAKEDA et al., 1998). Estes efeitos sugerem que a redução no comportamento de head dip

pode refletir estado ansiogênico do animal, e que ambos os estados ansiolíticos e ansiogênicos

podem ser estimados usando o teste da placa perfurada (TAKEDA et al., 1998). Com base

nestes estudos e, em informações que a expressão de um estado ansiolítico em animais pode

ser refletida por um aumento no comportamento de head dip, nossos resultados forneceram

evidências que a iangambina apresentou efeito ansiolítico, desde que, nas doses de 25, 50 e 75

mg/kg, tanto por via intraperitonal como oral, mostrou aumento deste comportamento.

Nos últimos anos o labirinto em cruz elevado (LCE) tem sido amplamente usado

como um procedimento rápido e simples para detectar ambos efeitos ansiolítico e ansiogênico

de drogas em ratos e camundongos (PELLOW et al., 1985). Quando confinados nos braços

abertos, ratos mostram manifestações comportamentais e fisiológicas de medo, tais como

freezing, defecação, e aumento de corticosteróides no plasma (PELLOW et al., 1985; TREIT

et al.,1993). Drogas ansiolíticas aumentam o número e o tempo de permanência nos braços

abertos, enquanto agentes ansiogênicos fazem o oposto (HANDLEY; MITHANIM, 1984;

120

PELLOW et al., 1985; PELLOW; FILE, 1986; TRULLAS; SKOLNICK, 1991). Este modelo

experimental é muito sensível para determinar a influência do receptor

GABAA/Benzodiazepínico no processo de ansiedade, visto que, outras drogas como a

buspirona, que envolve receptores serotonérgicos, tem resultados muito variáveis em relação a

esse teste. Portanto, o labirinto em cruz elevado é uma excelente ferramenta para detectar

compostos que tenham relação com o complexo receptor GABAA/Benzodiazepínico

(RODGERS et al., 1997).

No presente estudo, o LCE foi usado para confirmar o efeito ansiolítico da

iangambina, evidenciado no teste da placa perfurada, em adição aos seus efeitos sedativos e

depressores demonstrados nos testes do tempo de sono induzido por pentobarbital e nado

forçado, respectivamente. Como esperado, o diazepam, usado como droga ansiolítica de

referência, produziu significante aumento em todos os parâmetros analisados, ou seja, número

de entradas nos braços abertos (NEBA), percentual do número de entradas nos braços abertos

(PEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) e percentual do tempo de

permanência nos braços abertos (PTBA). Estes aumentos foram acompanhados por alterações

significativas na atividade locomotora.

Estes resultados foram consistentes com vários estudos anteriores, os quais

mostraram que o diazepam e outros benzodiazepínicos produziram efeitos ansiolíticos em

uma variedade de procedimentos para screening de atividade ansiolítica, incluindo modelos

de conflito (Vogel, 1971), labirinto (Pellow; File, 1986), outros modelos não-punitivos (File,

1980; Winslow; Insel, 1991) e modelos de discriminação de drogas (ANDREWS;

STEPHENS, 1990). Usando o teste de labirinto em cruz elevado, a iangambina por via

intraperitoneal nas doses de 25 e 50 mg/kg , reduziu significativamente apenas um parâmetro

observado, o tempo de permanência nos braços abertos, indicativo de efeito ansiogênico,

embora na dose de 75 mg/kg, pela mesma via, tenha aumentado o percentual do número de

entradas nos braços abertos, o tempo de permanência nos braços abertos e o percentual do

tempo de permanência nos braços abertos, indicando efeito ansiolítico. No mesmo modelo, a

administração oral da iangambina, apresentou efeito ansiolítico, desde que, com as três doses

estudadas, apresentou aumento no percentual de entrada e no percentual do tempo de

permanência nos braços abertos e com as doses de 50 e 75 mg/kg foi observado também

aumento no número de entradas e no tempo de permanência nos braços abertos,

respectivamente. A redução aversiva aos braços abertos é resultado de efeito ansiolítico

121

expresso por um aumento no número de entradas e no tempo de permanência nos braços

abertos do labirinto em cruz elevado.

Desta forma, nossos resultados mostraram que a iangambina apresentou efeito

ansiogênico com as duas menores doses (25 e 50) por via intraperitoneal, embora, com a dose

de 75 mg/kg, i.p., e com estas mesmas doses administradas por via oral, as alterações

comportamentais induzidas pela iangambina no LCE foram consistentes com efeito

ansiolítico, semelhante ao produzido pelo diazepam. Assim sendo, a iangambina apresentou

efeitos diferentes no LCE dependendo da via de administração. A injeção pela via

intraperitoneal induziu efeito ansiogênico, pelo menos com as duas menores doses. Por outro

lado, quando foi administrada por via oral e com a maior dose i.p., foi observado efeito

ansiolítico. Estas observações poderiam ser explicadas por parâmetros farmacocinéticos,

desde que, em seguida à administração não parenteral da droga, uma significativa porção da

dose pode ter sofrido metabolismo de primeira passagem gerando um metabólito ativo que

sinérgicamente pode ter atuado com a droga original potenciando seus efeitos (De-PARIS et

al., 2000). O efeito ansiolítico da iangambina foi também acompanhado, por uma redução na

atividade locomotora com as três doses usadas no campo aberto.

Sabe-se que muitas drogas tais como os benzodiazepínicos e o fenobarbital

possuem efeitos ansiolíticos e sedativos (TREIT, 1985). Neste estudo, como mencionado

anteriormente, a iangambina administrada por via intraperitoneal e oral, prolongou a duração

do sono no teste da indução do sono por pentobarbital. A redução da latência para a perda dos

reflexos foi vista apenas com a maior dose oral de iangambina. Semelhantes resultados foram

obtidos com o diazepam, no que se refere a duração do sono, mas, no caso do diazepam, o

tempo requerido para perder os reflexos foi muito menor que a iangambina, indicando que o

efeito sedativo do diazepam é bem maior (RABBANI et al., 2003). O efeito depressor da

iangambina foi também evidenciado no teste do nado forçado, onde a substância aumentou o

tempo de imobilidade dos animais, como já descrito anteriormente.

Um dos principais achados no presente estudo foi a caracterização do efeito

ansiolítico da iangambina, no teste do labirinto em cruz elevado, em adição ao seu efeito

sedativo apresentado no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital. Todos estes

efeitos, freqüentemente, são mediados por receptores GABAA (LEUNG et al., 2000). Modelos

comportamentais em roedores têm sido realizados com antagonista do receptor

122

benzodiazepínico, flumazenil, para explorar o mecanismo de ação das drogas. Agentes

ansiolíticos, aumentam e agentes ansiogênicos reduzem a entrada e o tempo gasto nos braços

abertos do labirinto em cruz elevado (PELLOW et al., 1985). De fato, trabalhos anteriores

mostram que o flumazenil preveniu os efeitos ansiolíticos dos benzodiazepínicos no LCE

(Luscombe et al., 1991) e inibiu o efeito ansiolítico do diazepam no LCE (KURIBARA;

MARUYAMA, 1996; KURIBARA et al., 1998). Com a finalidade de esclarecer o mecanismo

de ação do efeito ansiolítico produzido pela iangambina, usamos o flumazenil. Nossos

resultados mostraram que o tratamento com flumazenil associado a iangambina 75 mg/kg,

v.o., em camundongos, foi capaz de reverter dois parâmetros comportamentais observados no

labirinto em cruz elevado, o tempo de permanência e percentagem do tempo de permanência

nos braços abertos, indicando reversão da atividade ansiolítica da iangambina, e sugerindo

que locais de ligação no receptor benzodiazepínico GABAA podem estar envolvidos no

desenvolvimento do efeito ansiolítico desta substância. Observamos também que o flumazenil

sozinho não alterou nenhum dos parâmetros observados no LCE (NEBA, PEBA, TPBA e

PTBA) em relação ao grupo controle.

Um outro teste usado para avaliar efeitos sedativos sobre o sistema nervoso

central incluiu o teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (ELISABETSKY et al.,

1999). As convulsões são freqüentemente propostas como resultado do desequilíbrio das

atividades excitatória ou inibitória neuronais, seguidas do aumento da excitação

glutamatérgica ou redução da inibição gabaérgica (ELISABETSKY et al., 1999). Convulsões

experimentais podem ser induzidas pela ativação e suprimidas pela inibição dos receptores de

glutamato (OBRENOVITCH et al., 1996). Antagonistas glutamatérgicos, agindo sobre

receptores NMDA ou não-NMDA, mostraram possuir propriedades anticonvulsivantes em

vários modelos animais (MELDRUM, 1992). No entanto, as convulsões induzidas por

pentilenotetrazol estão também relacionadas com a inibição da transmissão GABAérgica

(GIORGI et al., 1991). O aumento do potencial promovido pelo neurotransmissor GABA,

pode ser obtido de diversas maneiras, envolvendo tanto uma ação direta no complexo receptor

GABAérgico (Benzodiazepínicos, barbituratos e possivelmente topiramato) ou ação na

recaptação ou metabolismo do GABA (tiagabina e vigabatrina) (PORTER; MELDRUM,

1998).

O pentilenotetrazol (PTZ) é o agente protótipo das substâncias químicas

sistêmicas convulsivantes (PAPY et al., 1971). É um derivado tetrazólico (Stone, 1970), com

123

ação convulsivante em camundongos, ratos, gatos e primatas e quando administrado por via

parenteral, produz inicialmente abalos mioclônicos, que se mantêm sustentados, evoluindo

para convulsões generalizadas do tipo tônico-clônica. A nível sináptico, o PTZ parece

interagir com o complexo GABA receptor-benzodiazepínico-canal de cloro (Olsen, 1981),

provavelmente de algum modo diminuindo a potência de inibição e causando convulsões.

Sabe-se que os benzodiazepínicos produzem seus efeitos sedativos, hipnóticos, ansiolíticos e

anticonvulsivantes pela sua interação com receptores GABAA (GOODCHILD 1993;

SHADER; GREEBLAT, 1993).

Foi demostrado neste trabalho que o diazepam, usado como droga de referência,

aumentou de forma significativa a latência de convulsão induzida por PTZ e os animais

sobreviveram durante o tempo do teste. No entanto, apesar de nossos resultados terem

mostrado que o efeito ansiolítico da iangambina no teste de labirinto foi revertido pelo

flumazenil, um antagonista do receptor benzodiazepínico, a mesma não protegeu das

convulsões induzidas por pentilenotetrazol. No entanto, sabemos que, quando a dose do

benzodiazepínico é aumentada, os efeitos ansiolíticos são produzidos primeiro, seguido pelos

efeitos anticonvulsivantes e posteriormente ocorre redução do tônus muscular, seguido por

sedação e hipnose (RAO et al., 1999).

O diazepam na dose usada neste trabalho, apresentou efeito ansiolítico e

aumentou a latência de convulsão induzida pelo PTZ, sem apresentar efeito miorelaxante,

como evidenciado no teste do rota rod. Desta forma as doses administradas da iangambina

neste trabalho, não foram suficientes para proteger os animais contra as convulsões. No

entanto, Pachú et al. (1993) mostraram que a iangambina na dose de 125 mg/kg, i.p. reduziu

de forma significativa as convulsões induzidas por pentilenotetrazol em camundongos,

sugerindo um possível efeito anticonvulsivante, o qual pode ser indicativo de um efeito mais

específico devido sua ação sobre o sistema GABAérgico (COOPER et al, 1996). Desta forma,

é possível que o efeito anticonvulsivante da iangambina, dependa também da dose usada.

Os neurônios noradrenérgicos ascendentes originados do locus ceruleus inervam

estruturas cerebrais tais como o córtex, hipocampo e tálamo (FILLENZ, 1990). De acordo

com Handley e Mithani, (1984) drogas que interferem com a neurotransmissão

noradrenérgica tais como α2-agonistas seletivamente aumentam a exploração dos braços

124

abertos e então foram considerados como ansiolíticos, enquanto α2-antagonistas, tais como a

ioimbina, seletivamente reduzem a exploração dos braços abertos e foram considerados como

ansiogênicas. Similarmente, a cafeína e anfetamina, dois estimulantes comportamentais que

têm também mostrado possuir atividade ansiogênica no homem e em outros modelos animais,

possuem atividade ansiogênica no labirinto (PELLOW et al., 1985).

O efeito ansiolítico da iangambina, foi acompanhado por uma redução dos níveis

de noradrenalina no corpo estriado, região cerebral que inclui o nucleus accumbens, local que

envolve as emoções (DeLONG, 2000). O aumento induzido pela iangambina na exploração

dos braços abertos, corroborou com esses estudos, que sugerem, que drogas que reduzem este

neurotransmissor, aumentam a exploração dos braços abertos no labirinto. No entanto, em

córtex motor a iangambina induziu aumento deste neurotransmissor apenas com a dose de 75

mg/kg, demonstrando que estas observações dependem da área cerebral estudada.

Além da noradrenalina, outros neurotransmissores estão envolvidos na ansiedade,

por exemplo GABA e serotonina. As inervações serotonérgicas originadas do núcleo dorsal

da rafe (NRD) e núcleo medial da rafe (NRM) localizam-se no tronco cerebral (MOLLIVER,

1987). Regiões tais com o estriado e córtex frontal recebem preferencialmente inervações

serotonérgicas do NRD (McQUADE; SHARP, 1997). Pesquisadores têm demonstrado que

manipulações na neurotransmissão serotonérgica produzem efeitos inconsistentes sobre a

ansiedade.

Assim sendo, vários modelos de ansiedade aguda em ratos estão associados com

aumento dos níveis de serotonina no hipocampo (MARSDEN et al., 1993 apud VOIGT et al.,

1999). Isto foi observado em experimentos de microdiálise nos quais ratos foram expostos em

diferentes testes de ansiedade como por exemplo o teste de Vogel (Matsuo et al., 1996),

labirinto (Wright et al., 1992) e interação social (CADOGAN et al., 1994).

Enquanto alguns estudos demonstraram uma associação da ansiedade a um

aumento de serotonina no hipocampo, outros mostraram que não existe uma simples relação

entre as ações ansiolíticas e os efeitos de ansiolíticos sobre o aumento de serotonina

(MARSDEN et al., 1993). Por exemplo, Rex et al. (1993) encontraram aumento dos níveis de

serotonina em córtex frontal de cobaio exposto ao labirinto. Eles observaram que este efeito

foi atenuado pelo diazepam, um ansiolítico benzodiazepínico. Demonstraram também que o

125

antagonista do receptor benzodiazepínico, flumazenil, reverteu ambos efeitos

comportamentais e neuroquímicos do diazepam. Surpreendentemente, o flumazenil sozinho,

como o diazepam, reduziu o aumento extracelular da serotonina, mas não afetou o

comportamento.

Nossos resultados apresentaram que, o efeito ansiolítico da iangambina

evidenciado nos testes de labirinto em cruz elevado e placa perfurada, foi acompanhado por

uma redução da serotonina em corpo estriado, no entanto, em córtex motor, houve um

aumento de 5-HT e redução do seu metabólito, indicando provavelmente síntese deste

neurotransmissor nesta região. Estes resultados mostraram que o efeito ansiolitico associado a

redução de serotonina depende da área cerebral estudada. Além disso, nossos resultados

também mostraram que apesar da iangambina ter reduzido o fluxo de serotonina com as três

doses usadas e mostrado efeito ansiolítico no LCE, apresentou perfil ansiogênico no mesmo

modelo com as doses de 25 e 50 mg/kg i.p..

Estes resultados vêm corroborar com as observações feitas por Marsden et al.,

(1993) que mostraram que não existe uma simples relação entre as ações ansiolíticas e os

efeitos de ansiolíticos de drogas sobre o aumento de serotonina. Além disso, teorias

tradicionais têm defendido que a ansiedade é ocasionada preferencialmente por um aumento

mais do que por uma redução da função serotonérgica ou que a depletação de serotonina

produz desinibição comportamental mais que alguma ação específica sobre a ansiedade

(SOUBRIE, 1986; TYE et al.,1977). Tais teorias são desconfortáveis com observações que

mostram ótimos tratamentos das desordens da ansiedade humana que envolve intervenções

que aumentam a serotonina sináptica, justificando a interferência, de que, em algum caminho

a redução da função serotonérgica está implicada nas desordens da ansiedade. Além disso,

existem algumas evidências obtidas de modelos animais mostrando que manipulações que

reduzem a serotonina cerebral podem aumentar o comportamento de ansiedade (GURTMAN

et al., 2002).

Recentemente, Hall et al., (1999) mostraram que duas semanas após a

administração de doses baixas da neurotoxina serotonérgica 5,7-d-hidroxitriptamina (5,7-

DHT) em ratos, ocorreu um significante aumento no comportamento da ansiedade no labirinto

seguida da redução nos níveis de serotonina cerebral. Ricaurte et al., (2000) mostraram que a

administração de doses altas de 3,4-methlyenedioxymethampthetamine (MDMA) em animais

de laboratório causou destruição dos terminais serotonérgicos, redução da concentração de

126

serotonina no cérebro e redução na densidade de locais transportadores de serotonina.

Resultados de análise bioquímica revelaram que dez semanas depois da administração do

MDMA os ratos tiveram significativamente menos serotonina que os controles na amígdala,

hipocampo e caudado-putamem. Estes pesquisadores examinaram o comportamento da

ansiedade, nos animais, na 4a, 6a e 9a semana seguida ao MDMA e encontraram aumento da

ansiedade nos testes de emergência, interação social e labirinto respectivamente (GURTMAN

et al., 2002). Adicionalmente, os usuários de MDMA, particularmente os usuários de grande

quantidade, têm sido associados com elevada ansiedade (GAMMA et al., 2000; McGUIRE,

2000 apud GURTMAN et al., 2002; PARROTT et al., 2000; SCHIFANO et al., 1998;

VERKES et al., 2001; WAREING et al., 2000).

Portanto, não são incoerentes nossos resultados obtidos com as duas menores

doses de iangambina por via intraperitoneal, que apresentou perfil ansiogênico no modelo de

labirinto em cruz elevado acompanhado do aumento da taxa de 5-HIAA/5-HT em corpo

estriado. O que pode também ter acontecido, é que por esta via e nesta concentração de

iangambina, não houvesse ainda o metabólito ativo suficiente para agir sinergicamente com a

substância original, e que, apesar de ter sido evidenciado redução no fluxo de serotonina em

corpo estriado, não foi acompanhado de efeito ansiolítico no modelo de labirinto, embora

tenha ocorrido este efeito, no teste de placa perfurada. Essa divergência nestes modelos

provavelmente deve-se a sensibilidade específica de cada um ao comportamento animal.

Estudos da interação do sistema neurotransmissor dopaminérgico com o

gabaérgico tem sido de muito interesse recentemente (LEUNG et al., 2003). Drogas atuando

sobre o receptor GABAA exercem alteração na concentração extracelular da dopamina no

nucleus accumbens (MOTZO et al., 1997). Por exemplo, imidazenil e diazepam manifestaram

marcada redução na concentração extracelular da dopamina (Finlay et al., 1992), enquanto um

aumento da liberação deste neurotransmissor foi elicitada em nucleus accumbens pelo

antagonista benzodiazepínico, flumazenil. Além disso, trabalhos anteriores indicaram

interação entre os receptores dopaminérgicos D1 e os mecanismos do ácido γ-aminobutírico

na substância negra (Trevitt et al., 2002) e que, drogas que apresentam efeito sedativo-

tranquilizante geralmente possuem ação antagonista sobre os receptores D1/D2 no cérebro

(JIN et al., 1986).

127

Nossos resultados mostraram que a iangambina reduziu a concentração da

dopamina no córtex motor e apesar de ter apresentado estabilização nos níveis deste mesmo

neurotransmissor em corpo estriado, aumentou DOPAC e HVA, acompanhado de um

aumento nas taxas de DOPAC/DA e HVA/DA, o que é consistente com a maior utilização da

dopamina, indicando portanto, uma maior taxa metabólica deste neurotransmissor

(ROBINSON; WISHAW, 1988; HATIP-AL-KHATIB et al., 2001). Foi observado também,

que a iangambina agiu sobre os receptores dopaminérgicos D1/D2 no cérebro de camundongos

e que pode atuar sobre o receptor GABAA no local dos benzodiazepínicos, desde que seu

efeito ansiolítico foi revertido pelo flumazenil. Então, o efeito ansiolítico-hipnótico da

iangambina pode ser gerado por uma combinação de efeitos originados de vários receptores

no sistema nervoso central incluindo os receptores D1/D2 e GABAA.

Estudos comportamentais e neuroquímicos têm esclarecido interações entre os

sistemas dopaminérgico e colinérgico em áreas cerebrais associadas com o movimento

(STEELE et al., 1996). Tem sido demonstrado (Gongorra-Afaro et al., 1996), por exemplo,

que neurônios colinérgicos pedunculares os quais inervam a substância negra pars compacta,

modulam o comportamento motor pelo aumento da atividade dopaminérgica nigroestriatal. A

atividade locomotora é um comportamento claramente dependente da transmissão

dopaminérgica nas áreas nigroestriatal e mesolímbica de cérebros de mamíferos (FRUSSA-

FILHO et al., 1992). Estes modelos podem ser usados para estudar interações de

neurotransmissores incluindo dopamina/acetilcolina.

A regulação dopaminérgica de neurônios colinérgicos pós-sinápticos possui um

importante papel na mediação do comportamento motor (DECSI, 1988; WICKENS, 1990).

Drogas anticolinérgicas induzem ativação motora e têm efeitos sinérgicos com estimulantes

psicomotores sobre o estímulo motor (SOUSA et al., 2001). Em contraste, agonistas

colinérgicos antagonizam o efeito comportamental ativado por agonistas dopaminérgicos.

Estes resultados sugerem uma relação oposta dopaminérgica-colinérgica com respeito a

regulação das estruturas cerebrais que controlam a função motora. Então, neurônios

dopaminérgicos nigroestriatais ou agonistas dopaminérgicos (Jackson et al, 1993) exercem

ação inibitória sobre os neurônios colinérgicos estriatais que podem ser bloqueadas por

antagonistas do receptor D2 (JACKSON; ZIGMOND, 1990; DE BOER; ABERCROMBIE,

1996).

128

Com base nestes conceitos, nossos resultados mostraram que a iangambina ativou

receptores D1 e D2 em corpo estriado e D2 em córtex motor. Apresentou também, redução nos

níveis de dopamina em córtex motor e apesar de não ter alterado os níveis desta monoamina

em corpo estriado, mostrou uma redução do fluxo da mesma, desde que, houve um aumento

significativo da sua taxa metabólica nesta região. Assim, a redução do fluxo da dopamina em

corpo estriado, acompanhado da diminuição da atividade locomotora observada no teste de

campo aberto, indicam que provavelmente a iangambina apresentou atividade antagonista

dopaminérgica. Observamos também que a mesma interagiu com receptores muscarínicos em

córtex motor e corpo estriado. Então, podemos sugerir que o bloqueio sobre os receptores

dopaminérgicos induzido por esta substância é sinérgico à sua ação agonista sobre os

receptores colinérgicos, haja visto que a redução da atividade locomotora dos animais foi

mantida no modelo de campo aberto.

Nossos resultados corroboram com um estudo realizado por Sousa et al. (2001)

que mostraram que o pimozide, antagonista dopaminérgco D2 e o carbacol, agonista

muscarínico, diminuíram a atividade locomotora, e a atropina, antagonista muscarínico,

reverteu este comportamento indicando que estes dois sistemas neurotransmissores atuam em

direção oposta. Além disso, estudos mostraram que drogas anticolinérgicas, incluindo a

atropina, aumentam a atividade locomotora (SYPOS et al., 1999). Foi evidenciado também

(Brudzynski et al., 1991) que injeções intracerebrais de carbacol no mesencéfalo basal

reduzem a atividade locomotora, e este efeito foi revertido pelo pré-tratamento com a

atropina. Também foi mostrado (Wang et al., 1993) que a ativação de receptores D2 com o

agonista D2, quinpirole, ou de receptores muscarínicos com carbacol induziu inibição da

liberação da [3H]-ACh no estriado.

Baseada nas observações obtidas no nosso trabalho e levando em consideração

que um dos grandes desafios da indústria farmacêutica é a busca do desenvolvimento de

novos fármacos ansiolíticos que venham produzir pouca ou nenhuma sedação, sugerimos que

a iangambina apresentou perfil de droga ansiolítica. Este efeito foi evidenciado nos modelos

do campo aberto, placa perfurada e labirinto em cruz elevado, apresentando como vantagem

em relação ao diazepam, menos sedação conforme observado no modelo do tempo do sono

induzido por pentobarbital. Desta maneira, é importante continuar a investigar esta substância,

pois acreditamos que a mesma possui um grande potencial ansiolítico e provavelmente este

efeito deve envolver a participação dos receptores GABAA, D1 e D2.

129

Além disso, nossos resultados neuroquímicos mostraram que a iangambina

reduziu os níveis de noradrenalina em corpo estriado, consistentes com estudos que apontam

que drogas que reduzem este neurotransmissor, aumentam a exploração dos braços abertos no

LCE, indicando perfil ansiolítico. No entanto, em córtex motor a iangambina induziu aumento

deste neurotransmissor, demonstrando que estas observações depende da área cerebral

estudada.

A serotonina também é um outro neurotransmissor envolvido na ansiedade.

Observamos que a redução de serotonina em corpo estriado induzida pela iangambina foi

acompanhada de efeito ansiolítico nos testes do LCE e placa perfurada. No entanto, em córtex

motor, houve aumento de serotonina. Estes resultados mostraram que o efeito ansiolítico

associado a redução de serotonina depende da área cerebral estudada.

Observamos também que a iangambina alterou alguns parâmetros

comportamentais envolvidos com o sistema dopaminérgico, tais como atividade locomotora,

rearing e grooming. Estudos mostram que drogas antagonistas dopaminérgicas, em geral,

reduzem a atividade locomotora dos animais, e este efeito foi observado no modelo do campo

aberto, e além disto, aumentou a imobilidade dos animais no modelo do nado forçado, uma

característica de drogas que produzem bloqueio dos receptores dopaminérgicos, sugerindo

que a iangambina apresentou ação antagonista nestes receptores podendo portanto também ser

investigada quanto a uma possível atividade neuroléptica.

CONCLUSÕES

131

6 CONCLUSÕES

O estudo dos efeitos da administração da iangambina em vários modelos

comportamentais e sobre as alterações neuroquímicas permitiu as seguintes conclusões:

• A iangambina reduziu a atividade locomotora dos animais, indicando uma

provável atividade antagonista dopaminérgica;

• A coordenação motora dos animais não foi alterada no teste do rota rod;

• Nos modelos do nado forçado e no teste do tempo de sono induzido por

pentobarbital, apresentou efeito depressor central;

• Indicou efeito ansiolítico nos modelos de campo aberto, placa perfurada e

labirinto em cruz elevado;

• O efeito ansiolítico da iangambina sugere envolver a participação dos

receptores GABAA, D1 e D2;

• O efeito ansiolítico da iangambina associado a redução de noradrenalina e

serotonina depende da área cerebral estudada;

• A iangambina apresentou efeito ansiogênico nas doses de 25 e 50 mg/kg, i.p.

no modelo do labirinto em cruz elevado, que pode ser explicado por

parâmetros farmacocinéticos;

132

• A iangambina não protegeu os animais contra as convulsões induzidas por

pentilenotetrazol, este efeito parece depender da dose usada;

• Houve interação entre os sistemas dopaminérgico, colinérgico, serotonérgico e

GABAérgico, sugerindo a importância da iangambina em doenças que alteram

estes sistemas de neurotransmissão;

• As alterações comportamentais e neuroquímicas induzida pela iangambina

foram consistentes com um efeito ansiolítico-like desta substância;

• A iangambina apresentou grande potencial ansiolítico com a vantagem de

produzir menos sedação que o diazepam, conforme evidenciado no modelo do

tempo de sono induzido por pentobarbital.

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