UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO ... - sapili.org · Renato Manfredini Júnior Ao Professor, Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues, orientador desta dissertação, meu agradecimento

José Robson Venturim

ANÁLISE DA REATIVIDADE SORÓLOGICA E MOLECULAR

PARA HEPATITE C EM PACIENTES DE HEMODIÁLISE DA

REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA – ES

Vitória 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS

JOSÉ ROBSON VENTURIM

ANÁLISE DA REATIVIDADE SORÓLOGICA E MOLECULAR

PARA HEPATITE C EM PACIENTES DE HEMODIÁLISE DA

REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA – ES

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre em Ciências – Patologia Geral das Doenças Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues.

Vitória 2007

Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)

Venturim, José Robson, 1975- V469a Análise da reatividade sorológica e molecular para hepatite C em

pacientes de hemodiálise da região metropolitana de Vitória-ES / José Robson Venturim. – 2007.

86 f. : il. Orientador: Rodrigo Ribeiro Rodrigues. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Espírito Santo,

Centro de Ciências da Saúde. 1. Hepatite C. 2. Hemodiálise. 3. Sorologia. 4. Reação em cadeia de

polimerase. I. Rodrigues, Rodrigo Ribeiro. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde. III. Título.

CDU: 614

À minha esposa Alessandra e ao meu filho Arthur, pelo

simples motivo da existência. Por tudo o que representam

para mim, por todas as alegrias e por todos os sorrisos.

Dedico a vocês este meu trabalho, com todo amor.

AGRADECIMENTOS

“...e quem um dia irá dizer que existe razão nas coisas feitas pelo coração ... e quem irá dizer quem não existe razão !”

Renato Manfredini Júnior

Ao Professor, Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues, orientador desta dissertação, meu

agradecimento e gratidão, pelo compromisso, pelo entusiasmo contagiante, pelas

orientações, apoio, sugestões, esclarecimentos e a confiança em mim depositada.

Muito obrigado.

Ao Dr. Henrique Tommasi e ao Dr. Bruno O. Tommasi, por todo o apoio sob todos os

aspectos possíveis. Espero poder retribuir com minha seriedade e dedicação, por

tudo que me foi oferecido.

Ao Professor, Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, coordenador da Pós-Graduação,

por me ensinar o verdadeiro significado da palavra “professor”, minha mais profunda

admiração.

Ao Dr. Reynaldo Dietze, coordenador do Núcleo de Doenças Infecciosas, pelo apoio

e empenho na estruturação e manutenção deste centro de pesquisas, obrigado.

Ao Fabrício Martins e à Gabriela Nogueira do Instituto Tommasi de Pesquisa e

Desenvolvimento, agradecimentos muito especiais. Muito obrigado por todo apoio e

dedicação.

À Carla Baroni, um agradecimento muito especial, pela ajuda, apoio e dedicação.

Muito obrigado Carlinha. À Valéria pelas palavras e auxílio, sempre prestativo.

À equipe da Clinica Capixaba do Rim, especialmente Lucineide, Muriel e Ieda, pelo

apoio e prestatividade, muito obrigado.

Ao pessoal técnico do serviço de hemodiálise do Hospital Santa Rita de Cássia,

obrigado pela colaboração.

Ao Dr. Michel, do Instituto de Doenças Renais, responsável pelo serviço de

hemodiálise do Hospital da Associação dos Funcionários Públicos, obrigado.

À Kelly e Marcela da Fundação Sorológica Capixaba, obrigado pela ajuda. À Dra.

Regina e Fred do LACEN-ES, muito obrigado pelo apoio.

Ao meu amigo, Juan Mozart e ao pessoal da Roche diagnóstica, muito obrigado pelo

apoio.

Aos amigos Tatiana e Fabrício, pela amizade, pelo apoio, pelas conversas, pelo

incentivo mútuo, muito obrigado aos dois.

Aos meus amigos e colegas do mestrado: Cristina, Christiane, Ketene, João

Marcelo, Bianca, Renata e Marcela.

Aos colegas de trabalho do Laboratório Tommasi, em especial à Vanderléia,

Adryanna, Leonardo e Bianca pelo apoio e segurança em minhas ausências e

demais percalços.

Aos mestres da pós-graduação, por todo conhecimento e ensinamento, obrigado a

todos.

À Fátima, secretária da pós-graduação, pelo apoio e prestatividade.

Aos meus pais, em primeiro lugar pela minha vida e pela dedicação (e eu sei que

não foi pouca) para que eu pudesse chegar até aqui. Por todo o amor que sempre

por mim nutriram. Pela educação que me deram e respeito que me ensinaram a ter.

A vocês todo meu amor e toda minha gratidão, sempre. Nunca poderei agradecer a

contento. Obrigado de todo coração.

Ao meu irmão Cristiano, pelo amor fraternal, presença e lucidez, obrigado.

À minha esposa Alessandra, minha companheira. Obrigado por todo o amor, por

todo o carinho, pela ajuda nos momentos que caio, pela mão que ajuda a levantar e

seguir, pelo abraço nas conquistas.

Ao meu filho Arthur. Objetivo e sentido da minha vida, singela e intensa presença de

Deus em minha existência. Obrigado por iluminar o meu caminho.

"[...] acho que só há um caminho para a ciência — ou

para a filosofia: encontrar um problema, ver a sua beleza

e apaixonarmo-nos por ele; casarmo-nos com ele, até

que a morte nos separe — a não ser que obtenhamos

uma solução. Mas ainda que encontremos uma solução,

poderemos descobrir, para nossa satisfação, a existência

de toda uma família de encantadores, se bem que talvez

difíceis, problemas-filhos, para cujo bem-estar poderemos

trabalhar, com uma finalidade em vista, até ao fim dos

nossos dias".

Popper, K. R.

RESUMO

Este estudo teve por objetivo avaliar a reatividade de diferentes métodos

diagnósticos para hepatite C em amostras de pacientes em hemodiálise. Foi

focalizado, principalmente, na concordância entre os métodos sorológicos utilizados

para finalidade de triagem e métodos moleculares visando à confirmação da

infecção. O intuito fundamental foi avaliar se a amplitude da leitura dos testes

sorológicos atribui a estes, maior ou menor poder discriminatório frente aos métodos

moleculares. Foram analisadas amostras de sangue periférico de 50 pacientes de 5

serviços de hemodiálise, sendo 40 reativas em um método sorológico por

quimioluminescência e 10 negativas, inseridas como grupo controle. Outros dois

métodos sorológicos, ELISA colorimétrico e MEIA fluorimétrico, foram utilizados. Os

três métodos sorológicos foram comparados entre si e com os resultados de

métodos moleculares por PCR em tempo real e pelo método Amplicor®. As

amostras, que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os

métodos moleculares, foram submetidas à análise por “immunobloting”. O método

MEIA apresentou melhor correlação com os métodos moleculares do que ELISA e

CIA. Os resultados das análises demonstraram que valores mais elevados na

relação leitura da amostra / valor do “cut-off” (S/Co) dos testes sorológicos, possuem

melhor correlação com os métodos moleculares e com o “immunoblotting”. Para esta

avaliação este estudo seguiu os critérios do CDC, que classificam os resultados

como de alta reatividade ou baixa reatividade, de acordo com o valor de relação

S/Co que apresentam. A análise estatística pelo teste de Mann-Whitney, apresentou

diferença significativa (p < 0,05) nos valores de relação S/Co das amostras cujos

resultados sorológicos se confirmaram em PCR, daquelas cujos resultados não se

confirmaram. Foram encontrados resultados discrepantes, com resultados

sorológicos considerados altamente reativos nos três métodos, reatividade no

método de “immunoblotting” e resultados negativos em ambos os métodos

moleculares. Estes achados podem estar relacionados com um aspecto descrito em

diversos estudos que atribui à hemodiálise a capacidade da diminuição ou mesmo

eliminação da viremia para o VHC, entretanto, em cerca de 20 % dos casos na

história natural da infecção pelo VHC, pode ocorrer a resolução da infecção e desta

forma a detecção de anticorpos constitui o que se chama de “cicatriz sorológica”.

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the reactivity of different diagnostic methods for

hepatitis C in samples of hemodialysis patients. It focused mainly in agreement

between the serological methods used for purpose of screening and molecular

methods aiming to confirm the infection. The fundamental aim was to assess whether

the magnitude of the reading of serological tests attaches to them, more or less

discriminatory power front of molecular methods. We analyzed samples of peripheral

blood of 50 patients, 5 of hemodialysis services, and 40 in a reactive serologic

method by chemiluminescence and 10 negative, inserted as the control group. Two

other serological methods, colorimetric ELISA and MEIA fluorimetric were used. The

three serological methods were compared with each other and with the results of

molecular methods for real-time PCR method and the Amplicor®. The samples, which

showed disagreement between methods serological and molecular methods, were

subjected to analysis by "immunobloting." The method presented MEIA better

correlation with the molecular methods than ELISA and CIA. The results of the

analysis showed that higher values in the relationship reading of the sample / value

of the "cut-off" (S/Co) of serological tests, have better correlation with the molecular

methods and the "immunoblotting." For this evaluation this study followed the criteria

of the CDC, which classify the results as high reactivity or low reactivity, according to

the value of relationship S/Co presenting. Statistical analysis by the Mann-Whitney

test, showed a significant difference (p <0.05) in the values of respect S/Co of

serological samples whose results were confirmed in PCR, those whose results were

not confirmed. Discrepant results were found with serological results considered

highly reactive in the three methods, reactivity in the method of "immunoblotting” and

negative results in both molecular methods. These findings may be related to an

aspect described in various studies that attaches to the hemodialysis's capacity

reduction or even elimination of viremia for HCV, however, in about 20% of cases in

the natural history of HCV infection, the resolution may occur of the infection and

thus the detection of antibodies is what you call a "scar antibodies".

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. O Vírus da Hepatite C: Modelo estrutural e poliproteína sintetizada pela sua ORF .................................................................................... 19

Figura 2. Ciclo de vida do VHC. O vírus penetra na célula alvo pela interação

com receptores específicos e após o desnudamento, inicia seu processo de replicação ..................................................................... 20

Figura 3. Demonstração do comprometimento hepático que em geral se

observa no curso natural da hepatite C ................................................ 21

Figura 4. Padrões de resposta sorológica com a detecção de anticorpos

específicos na infecção pelo VHC, tanto em casos onde ocorre total recuperação (esquerda), quanto nos casos que evoluem para doença crônica (direita) ..................................................................... 23

Figura 5. O comprometimento do parênquima hepático, que perde o seu

modelo funcional (esquema superior esquerdo), devido ao processo que se instala e que termina por levar ao colapso hepático com extensa fibrose e cirrose macronodular (inferior direito) ............................................................................................... 26

Figura 6. Prevalência Mundial da Hepatite C em 2002, de acordo com a

Organização Mundial de Saúde ........................................................ 27

Figura 7. Prevalência da Hepatite C, em vários grupos populacionais nos Estados Unidos da América, segundo o CDC, em 2003 .................. 28

Figura 8. Proporção de testes de triagem sorológica por ELISA colorimétrico

para anticorpos anti-VHC, confirmados em “immunoblotting”, por faixa de valores expressos em relação amostra / “cut-off”, e grupos estudados .......................................................................................... 32

Figura 9. Proporção de testes de triagem sorológica por

quimioluminescência (VITROS®) para anticorpos anti-VHC, confirmados em “immunoblotting”, por faixa de valores expressos em relação amostra / “cut-off” e grupos estudados ............................. 32

Figura 10. Algoritmo apresentado pelo CDC para diagnóstico da Hepatite C ... 33

Figura 11. Gráfico esquemático representativo do funcionamento e

interpretação da PCR em tempo real ................................................ 46

Figura 12. Distribuição percentual dos resultados obtidos nos métodos de ELISA (A), CIA (B) e MEIA (C), para todas as 50 amostras do estudo, incluindo 10 amostras do grupo controle negativo ............... 57

Figura 13. Análise de concordância entre os métodos sorológicos. Os critérios utilizados para definição de baixa reatividade e alta reatividade foram definidos pelo CDC (USA). Os critérios de definição de amostras reativas, inconclusivas ou não-reativas são fornecidos pelos fabricantes dos reagentes e sistemas analíticos utilizados ..... 58

Figura 14. Análise comparativa dos resultados de cada amostra, expressos

em S/Co, nos três métodos sorológicos estudados, além do respectivo resultado dos dois métodos de biologia molecular utilizados ............................................................................................ 60

Figura 15. Correlação entre os resultados obtidos em ELISA colorimétrico

(MUREX®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 11; amostras reativas, n = 39 ; baixa reatividade, n = 4; alta reatividade, n = 35 ........................................ 61

Figura 16. Correlação entre os resultados obtidos em quimioluminescência

(Vitros ECi®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 10; amostras reativas, n = 40; baixa reatividade, n = 5; alta reatividade, n = 35 ........................................ 61

Figura 17. Correlação entre os resultados obtidos em MEIA (Axsym®) e PCR,

nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 12; amostras reativas, n = 38; baixa reatividade, n = 6; alta reatividade, n = 32 ............................................................................. 61

Figura 18. Representação estatística da associação entre os valores de

relação S/Co obtidos nos dois grupos de amostras reativas e o método de PCR. Para cada método os valores de “p” (probabilidade de significância) foram: ELISA x PCR: p = 0,0244; CIA x PCR: p = 0,0007; MEIA x PCR: p = 0,0001) ........................... 63

Figura 19. Representação estatística da Correlação Linear de Pearson em os

valores de CT no método de PCR em tempo real e os valores em S/Co de cada método sorológico estudado. Em nenhum dos métodos foi encontrada correlação estatisticamente significativa .... 65

Figura 20. Comparação entre os resultados dos métodos sorológicos e o

método de “immunoblotting”, considerando todas as amostras que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os métodos moleculares (A); amostras que apresentaram alta reatividade sorológica (B) e amostras que apresentaram baixa reatividade sorológica e amostras não reativas (C). Foram desconsiderados os resultados considerados “indeterminados” ou “inconclusivos” ................................................................................... 67

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores de relação S/Co, na sorologia para anticorpos anti-VHC, obtidos pelos estudos mencionados pelo CDC acima dos quais o VPP apresenta-se superior a 95 %................................................................................. 31

Tabela 2. Dados demográficos dos pacientes do estudo e grupo

controle................................................................................................ 39

Tabela 3. Características dos três ensaios de triagem sorológica para anticorpos anti-VHC utilizados ............................................................ 42

Tabela 4. Interpretação dos resultados da PCR qualitativa para VHC com

detecção de controle interno de amplificação – Amplicor® (Roche Diagnostics) ........................................................................................ 51

Tabela 5. Resultados individuais em cada um dos três métodos sorológicos

estudados (ELISA, MEIA e CIA), expressos em relação S/Co. As amostras 001 a 010 referem-se ao grupo controle; As amostras 013 a 059 referem-se ao grupo de estudo............................................................................. 55

Tabela 6. Estatística descritiva dos resultados obtidos nas análises sorológicas nos

três métodos estudados (ELISA, CIA e MEIA), separados por reatividade sorológica.............................................................................................. 56

Tabela 7. Resultados estatísticos descritivos obtidos para os grupos: (a) Constituído

de amostras cujos resultados sorológicos reativos não se confirmaram em PCR; (b) Constituído de amostras cujos resultados sorológicos reativos confirmaram-se em PCR. Resultados expressos em relação S/Co............................................................................................................... 62

Tabela 8. Estatística Descritiva – PCR em Tempo Real - TaqMan® Applied

Biosystems. Valores expressos em CT(“Cicle timing”, ponto em número de ciclos de amplificação onde a amostra apresenta fluorescência considerada positiva pelo sistema de detecção......................................... 64

Tabela 9. Comparação entre os resultados de “immunoblotting” e os demais

sorológicos e moleculares, para as amostras que apresentaram resultados discrepantes entre estes. Resultados dos métodos sorológicos expressos em relação S/Co..................................................................................... 66

LISTA DE SIGLAS

ABNT: Associação Brasileira de Normas Técnicas

Abs: Absorbância

ALT: Alanina amino-transferase

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CIA: Imunoensaio quimioluminescente (“Chemiluminescent Immune assay”)

CD: Tipo de receptor celular observado em leucocitos (“Cluster of differentiation”)

CDC: Centro de prevenção e controle de doenças infecciosas - USA (“Center of

Disease Control and Prevention”)

CNES: Cadastro Nacional de estabelecimentos de saúde

CNPJ: Cadastro Nacional de Pessoa Jurídica

CT: Número de ciclos de amplificação necessários para a detecção (“Cicle timing”)

C1q: Componente do complemento

C1qR: Receptor de C1q

DNA: Ácido Desoxirribunucléico (“Desoxirribonucleic acid”)

ELISA: Imunoensaio enzimático ligado à enzima (“enzyme linked immuno sorbent

assay”)

HBsAg: Antígeno de superfície do vírus da hepatite B (“Hepatitis B surface antigen”)

HBV: Vírus da hepatite B (“Hepatitis B virus”)

HRP: Peroxidase de rábano

IC: Intervalo de confiança

IFN: Interferon

Ig: Imunoglobulina

IL: Interleucina

IPC: Controle positivo interno de amplificação (“Internal Positive Control”)

Log: Unidade de medição em escala logarítimica

MEIA: Imunoensaio enzimático fluorescente microparticulado (“Microparticle Enzyme

Immunoassay”)

min: Minuto

mL: Mililitro

mM: Milimol � L: Microlitro

� M: Micromol

NAT: Teste de ácido nucléico (“Nucleic Acid Test”)

NHP: Plasma-controle humano normal

NK: “Natural killer”

nm: Nanômetros

ORF: Região de leitura aberta (“Open Reading Frame”)

p: Probabilidade de significância estatística

PCR: Reação da polimerase em cadeia (“Polymerase Chain Reaction”)

r: Coeficiente de correlação estatística

RDC: Resolução de Diretoria Colegiada

RNA: Ácido ribonucléico (“Ribonucleic acid”)

seg: Segundo

SUS: Sistema Único de Saúde

Th1: T helper

TMB: Tetrametilbenzidina

VHC: Vírus da Hepatite C (HCV, “Hepatitis C Virus”)

WB: Tampão de lavagem (“Wash Buffer”)

SUMÁRIO 1 Introdução …………………………………………………………………….. 18

1.1 A hepatite C e seu agente etiológico ……………………………………...... 18

1.2 História natural da hepatite C …………….................................................. 20

1.3 Aspectos Imunológicos da Infecção pelo VHC e do Diagnóstico

Sorológico …………………….....................................................................

22

1.4 Patogênese da hepatite C ......................................................................... 25

1.5 Epidemiologia da hepatite e sua relação com a hemodiálise ................... 26

2 Objetivos .................................................................................................. 36

3 Materiais e métodos ................................................................................ 38

3.1 Caracterização do estudo ......................................................................... 38

3.2 Caracterização dos indivíduos de estudo ................................................. 38

3.3 Considerações éticas ................................................................................ 39

3.4 Análises estatísticas .................................................................................. 40

3.5 Imunoensaios ............................................................................................ 40

3.6 Métodos de Biologia Molecular ................................................................. 42

3.6.1 PCR em tempo real ................................................................................... 43

3.6.2 PCR Qualitativa – Amplicor® v2.0 ............................................................. 47

3.7 Immunoblotting .......................................................................................... 52

3.8 Formatação e normas técnicas ................................................................. 52

4 Resultados ............................................................................................... 54

4.1 Análises Sorológicas ................................................................................. 54

4.2 Análise dos Métodos de Biologia Molecular ............................................. 59

4.3 Análise estatística da correlação entre os métodos estudados ................ 62

4.4 Immunoblotting .......................................................................................... 65

5 Discussão ................................................................................................ 69

6 Conclusões .............................................................................................. 74

7 Referências .............................................................................................. 77

8 Anexo ....................................................................................................... 85

Introdução

Introdução

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 A Hepatite C e seu agente etiológico

O vírus causador da hepatite C (VHC) foi identificado e descrito em 1989 por Choo e

col.. Sua estrutura de 50nm e nucleocapsídeo envelopado, é de um vírus RNA de

fita simples que apresenta polaridade positiva (aproximadamente 10.000

nucleotídeos), formando uma longa fase de leitura aberta ou ORF (do inglês “open

reading frame”) a qual codifica uma poliproteína de aproximadamente 3010

aminoácidos (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005). Esta poliproteína contém tanto

proteínas estruturais (Core, E1 e E2) quanto não-estruturais (NS1, NS2, NS3, NS4 e

NS5) responsáveis pela replicação do vírus (STRAUSS, 2001). O VHC é classificado

como membro da família Flaviviridae e gênero Hepacivirus, sendo considerado a

mais freqüente causa de hepatites virais crônicas (PAROLIN et al., 2005). O VHC

apresenta alta taxa de mutação (1 em 1000 bases por ano) (REHERMANN;

NASCIMBENI, 2005), o que pode provocar a um aumento na diversidade viral. A

análise filogenética do vírus levou à definição de 6 genótipos (denotados pelos

números de 1 a 6), com cerca de 20 a 35 % de diferenças na seqüência de

nucleotídeos e mais de 50 subtipos (denotados pelas letras a, b, c,... adicionadas

subsequentemente ao número do genótipo) (STRAUSS, 2001).

Variações encontradas dentro de um mesmo genótipo e subtipo, provavelmente

relacionadas à replicação imperfeita do vírus, levam ao aparecimento de

”quasispecies”. Uma associação entre o aparecimento de “quasispecies” e pressão

imunológica, exercida pelo hospedeiro, tem sido observada. A ocorrência de

“quasispecies” é frequentemente menor nos estágios iniciais da doença quando

comparadas à encontrada na doença avançada crônica (REHERMANN;

NASCIMBENI, 2005).

Considerando-se que o VHC é um patógeno humano, a inexistência de modelos

experimentais, seja através da utilização de animais de experimentação (com

exceção do chimpanzé, modelo este que apresenta custos elevados e aspectos

Introdução

19

éticos cada vez mais controversos) ou através de cultivo celular que possam ser

adaptados, torna muito difícil o estudo da hepatite C (STRAUSS, 2001).

Figura 1 – O Vírus da Hepatite C: Modelo estrutural e poliproteína sintetizada pela sua ORF. Fonte: www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/03006938h.htm (adaptado)

O VHC não se integra ao genoma do hospedeiro e exibe uma meia-vida de cerca de

3 horas, com uma cinética viral da ordem de 1012 vírions por dia. O VHC promove

elevada viremia após uma semana de infecção (REHERMANN; NASCIMBENI,

2005), a qual diminui entre 8 a 12 semanas pós-infecção. Os sintomas relacionados

à icterícia são atribuídos à lesão tecidual hepática promovida pela ação da resposta

imunitária mediada por células T, sendo observados raramente nos casos de

hepatite C, diferentemente do que ocorre na hepatite B. A maioria dos pacientes

desenvolve hepatite crônica e os títulos de RNA viral se estabilizam cerca de 2 – 3

logs abaixo do observado na fase aguda da doença (REHERMANN; NASCIMBENI,

2005). Após a entrada na célula, o nucleocapsídeo do VHC penetra no citoplasma e

o RNA viral assume as funções de RNA mensageiro diretamente, efetuando a

tradução de sua longa poliproteína. A replicação do vírus ocorre no citoplasma, junto

Introdução

20

à membrana perinuclear no chamado complexo de replicação associado à

membrana (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005); Este complexo atua

conjuntamente com o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi, na montagem

final das partículas virais que serão liberadas, conforme demonstrado na figura 2.

Figura 2: Ciclo de vida do VHC. O vírus penetra na célula alvo pela interação com receptores específicos e após o desnudamento, inicia seu processo de replicação. Fonte: http://www.tibotec.com/content/backgrounders/www.tibotec.com/hcv_lifecycle.html (adaptado).

1.2 História Natural da Hepatite C

A hepatite C apresenta um período de incubação bastante variável, tendo em média

de 6 a 12 semanas, podendo até ser superior a 12 meses após a infecção pelo

vírus. Durante esta fase o único marcador confiável é a detecção do RNA viral, uma

vez que a produção de anticorpos específicos não ocorre imediatamente devido à

“janela imunológica”, que pode durar de 4 até 20 semanas, o que dificulta o

diagnóstico sorológico (STRAUSS, 2001). Uma vez detectados, os anticorpos

continuarão a ser encontrados mesmo após a cronificação da doença, o que

geralmente ocorre em mais de 80 % dos casos. Destes, 5 a 30 % evoluem para

Introdução

21

cirrose hepática, após 10 a 20 anos e posteriormente ao hepatocarcinoma (HWANG,

2001), sendo este um dos aspectos mais alarmantes da infecção pelo VHC. De

acordo com estudos retrospectivos, os intervalos entre a infecção pelo VHC e a

detecção de seqüelas variam de 10 a 14 anos para hepatite C crônica, 21 a 25 anos

para cirrose hepática e 28 a 29 anos para hepatocarcinoma (HWANG, 2001).

Figura 3: Demonstração do comprometimento hepático que em geral se observa no curso natural da hepatite C. Fonte:http://hopkins-gi.nts.jhu.edu/pages/latin/templates/ index.cfm?pg=disease1& organ=2&disease=18&lang_id=1(adaptado)

Um aspecto importante na história natural da hepatite C encontra-se associado aos

pacientes em hemodiálise, sendo este grupo um dos mais estudados a partir de

1990. Furusyo e col. (2000) demonstraram que os níveis plasmáticos de RNA viral

do VHC, decresciam em pacientes portadores de hepatite C crônica, submetidos à

hemodiálise. Porém, neste grupo de pacientes estudado não havia indícios de um

“clearence” (depuração) da viremia. Alguns anos antes, Okuda e col. (1996) e

Hayashi e col. (1997), haviam demonstrado, no Japão, que partículas virais podiam

ser adsorvidas pelas membranas de diálise e destruídas pela pressão hidráulica do

sistema. Estes dados foram confirmados por outros estudos subseqüentes, como

Fabrizi e col. (2003) e Ishida e col. (2004), sendo que estes últimos, embora

demonstrem que membranas de polissulfonas exerçam um efeito mais significativo

na diminuição da viremia, salientam que somente um estudo longitudinal poderia

demonstrar, de forma conclusiva, o impacto desta observação na dinâmica da

infecção pelo VHC nestes pacientes.

Introdução

22

Recentemente, um estudo caso-controle publicado por Okuda e Yokosuda (2004),

demonstrou que este impacto pode ser extremamente significativo. Neste estudo,

com seguimento variando entre 4-23 anos, todos os 25 pacientes-casos, positivos

para anticorpos contra o VHC e em processo de hemodiálise, acompanhados por

mais de 15 anos, permaneceram assintomáticos. Além disso, em 15 destes 25 (60

%) a detecção de RNA viral não era mais possível, após determinado período de

tempo. Entretanto, um quarto dos pacientes-controles não dialisados, diagnosticados

como portadores de infecção pelo VHC no mesmo mês dos pacientes-casos com os

quais foram pareados, progrediram para um quadro de cirrose hepática. Desta

maneira, estes autores demonstraram que pacientes com hepatite C crônica

submetidos à hemodiálise apresentam um decréscimo nos níveis de RNA-VHC no

sangue, bem como após um longo período pode ocorrer até mesmo o “clearence”

(depuração) da viremia. Estes dados sugerem que a hemodiálise pode alterar o

curso da infecção pelo VHC nestes pacientes.

1.3 Aspectos Imunológicos da Infecção pelo VHC e do Diagnóstico

Sorológico

Ao contrário da hepatite B, anticorpos neutralizantes não oferecem imunidade

protetora ao VHC e até o presente momento, não existe vacina eficaz disponível

(STRAUSS, 2001). A resposta imune celular adaptativa somente se manifesta após

aproximadamente um mês e a resposta humoral após cerca de dois meses, o que

levou ao aparecimento de várias hipóteses relacionadas à capacidade do VHC em

subverter o aparecimento de uma resposta imune adaptativa (REHERMANN;

NASCIMBENI, 2005). Anticorpos específicos para o VHC são detectáveis,

geralmente, após aproximadamente 12 semanas e eles não indicam a possibilidade

de soroconversão (como ocorre na hepatite B). O diagnóstico da infecção pode ser

feito pela detecção de anticorpos em indivíduos onde estes sabidamente não eram

detectáveis. Para esta finalidade são utilizados os testes de triagem sorológica.

Estes testes devem ser seguidos da realização de ensaios de maior especificidade,

como testes de “immunoblotting” ou testes de ácido nucléico (como a PCR). No

entanto, embora a resposta imune exibida obedeça ao padrão típico, com a resposta

Introdução

23

imune inata se manifestando inicialmente e coordenando a resposta adaptativa, esta

parece não ser eficiente e inicia-se com um atraso significativo.

Figura 4: Padrões de resposta sorológica com a detecção de anticorpos específicos na infecção pelo VHC, tanto em casos onde ocorre total recuperação (esquerda), quanto nos casos que evoluem para doença crônica (direita). Fonte: www.thailabonline.com/ hepatitisc.htm (adaptado)

O VHC induz uma mudança na expressão intra-hepática de genes relacionados à

resposta de interferon (IFN) do tipo I. Mesmo com esta indução da produção de IFN

pela resposta inata, o VHC consegue se estabelecer e dar origem a uma infecção

crônica. Pacientes que se recuperam espontaneamente da hepatite C, tipicamente

conseguem montar uma resposta celular do tipo T CD4+ e CD8+ vigorosas.

Entretanto, pacientes com doença crônica exibem uma resposta do tipo T-

dependente tardia, transitória ou mesmo inexistente (REHERMANN; NASCIMBENI,

2005). Estas observações sugerem a existência de uma associação significativa

entre a resposta imune celular e o curso da infecção pelo VHC. Alguns estudos

indicam que o aparecimento de resposta celular do tipo Th1 e a indução da

expressão de IFN-γ no fígado de chimpanzés infectados, coincidiam com o

decréscimo dos níveis de RNA viral. Utilizando-se ensaios funcionais, células T VHC

- específicas foram detectadas tanto em amostras de sangue de pacientes e

chimpanzés infectados, no período de 5 a 9 semanas após a infecção, quanto em

amostras de biópsias hepáticas em chimpanzés entre 6 a 12 semanas após a

infecção (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005).

Introdução

24

Uma das hipóteses mais mencionadas para a incapacidade do sistema imunológico

em eliminar o VHC, se concentraria no desequilíbrio entre as respostas Th1 e Th2,

uma vez que a resposta do tipo Th1 estaria relacionada com uma maior capacidade

de ação anti-viral (STRAUSS, 2001). Entretanto, os mecanismos de escape viral do

VHC dependem, provavelmente, de outros fatores virais e/ou do hospedeiro.. A

formação de “quasispecies” contribui para uma rápida diversificação da população

viral. O aparente atraso na ação da resposta adaptativa, seja celular ou humoral,

facilitaria ainda mais este processo, de forma que mutantes eficientes nos processos

de escape possam se desenvolver (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005).

Diversos outros mecanismos foram propostos e apresentados como correlacionados

a esta capacidade do VHC. Um deles está relacionado a uma seqüência específica

na proteína do core do VHC que exibe capacidade de se ligar ao domínio globular

do receptor de C1q (componente do complemento expresso na superfície de

macrófagos e células T). Esta ligação leva a uma hiporegulação na produção de IL-

12 pelos macrófagos e conseqüentemente, uma hipoproliferação e diminuição de

produção de IL-2 e IFN-γ pelas células T (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005). A

ligação do core com o ligante de C1q, C1qR, ocorre de forma mais acentuada nas

células CD8+ do que as células CD4+, devido a uma maior expressão deste

receptor entre as células T citotóxicas. Esse fenômeno leva a uma supressão, mais

acentuada, da proliferação da população de células T CD8+, comprometendo a

resposta celular citotóxica, fato provavelmente responsável pela escassez de

sintomas na hepatite C aguda, uma vez que estes sintomas são geralmente

associados à lesão tecidual provocada pela citotoxicidade da resposta imune (YAO

et al, 2004). Como a proteína do core do VHC é a primeira proteína produzida após

a infecção viral, este mecanismo poderia ajudar a esclarecer a razão pelo atraso na

resposta adaptativa celular e humoral ao VHC (EISEN-VANDERVELDE et al, 2004).

O receptor responsável pela ligação do VHC à célula ainda não é conhecido. Porém,

recentemente, dados obtidos em estudos “in vitro” demonstraram que, em altas

concentrações, a proteína recombinante E2 do VHC, liga-se cruzadamente com a

proteína CD81, presente na superfície de células NK (“Natural Killer”), inibindo sua

citotoxicidade e a produção de citocinas (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005).

Introdução

25

1.4 Patogênese da hepatite C

O VHC é, provavelmente, o vírus de maior diversidade antigênica dentre os vírus

que infectam humanos. Entretanto, muitas evidências clínicas sugerem que fatores

do hospedeiro são importantes na persistência viral ou na "cura" da infecção

(THOMAS; SEEFF, 2005).

A magnitude dos dados clínicos disponíveis na avaliação do paciente portador de

hepatite C crônica é, em geral, contrária aos efeitos celular do VHC. Alterações

histológicas mínimas, ou mesmo ausentes, ausência de sinais e sintomas ou mesmo

alterações laboratoriais dignas de nota, além é claro de uma longa evolução da

doença e a carga viral elevada, são características da infecção pelo VHC

(STRAUSS, 2001). Várias evidências têm sugerido que as lesões hepáticas estão

diretamente relacionadas a mecanismos imunológicos. Esperadamente, isto inclui a

modulação da resposta adaptativa para os pólos Th1, com maior ação anti-viral ou

Th2, onde predomina a produção de anticorpos, os quais se mostram ineficazes na

infecção pelo VHC, em detrimento de uma melhor ação celular de ação anti-viral

mais eficiente (STRAUSS, 2001).

A lesão hepática, propriamente dita, ocorre devido a ação de células citotóxicas

sobre a célula infectada. Considerando-se que o processo ocorre de forma crônica,

com intensidade e velocidade variáveis e a resposta inflamatória é incompleta, ou

seja, ineficiente na eliminação do VHC, a resposta imune acaba por ser o principal

responsável pela fibrose hepática, fator preponderante de progressão da doença

(STRAUSS, 2001). Diversos estudos sugerem que a persistência viral ocorre devido

a ineficácia da resposta imune inata a qual pode levar a um retardamento da ação

da resposta imune adaptativa (THOMAS; SEEFF, 2005). Obviamente, outros fatores

podem estar associados à progressão da doença como idade, uso de álcool e

medicamentos hepatotóxicos, infecção concomitante por outros vírus,

imunodeficiências, presença de outras doenças e o genótipo do VHC envolvido na

infecção (STRAUSS, 2001). Apesar de não possuírem uma significância estatística,

dados epidemiológicos sugerem que pacientes infectados pelo VHC do genótipo 1b,

Introdução

26

apresentam um prognóstico pior e uma evolução mais rápida para as formas mais

graves da doença (STRAUSS, 2001).

Figura 5: O comprometimento do parênquima hepático, que perde o seu modelo funcional (esquema superior esquerdo), devido ao processo que se instala e que termina por levar ao colapso hepático com extensa fibrose e cirrose macronodular (inferior direito). Fontes:http://hopkins-gi.nts.jhu.edu/pages/latin/templates/index.cfm?pg=disease1& organ=2&disease=18&lang_id=1 e http://library.med.utah.edu/WebPath/LIVEHTML

1.5 Epidemiologia da Hepatite C e sua relação com hemodiálise

A definição de hepatite crônica, normalmente empregada, implica na persistência da

detecção do RNA viral por um período superior a 6 meses. Na infecção pelo VHC foi

demonstrado que esta persistência é da ordem de 75 a 85 % (THOMAS; SEEFF,

2005). Em 2005 aproximadamente 170 milhões de pessoas em todo o mundo eram

portadores de infecção crônica pelo VHC, sendo esta a causa mais freqüente de

indicação para transplantes de fígado nos Estados Unidos da América e na Europa

(KEEFFE, 2005).

Introdução

27

Figura 6: Prevalência Mundial da Hepatite C em 2002, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Fonte: www.molecular-virology.uni-hd.de/rsr/area_hcv.htm

A hepatite C é uma doença infecciosa de transmissão predominantemente

parenteral (STRAUSS, 2001), apesar da possibilidade de transmissão pelas vias

materno-fetal (vertical), mesmo que com menor eficiência em relação à transmissão

do vírus da hepatite B e sexual (TENGAN et al, 2001). A hepatite C representa um

sério problema de saúde pública, principalmente em instituições onde o uso de

sangue, hemoderivados ou terapias que podem propiciar o contato dos pacientes

com o vírus, como serviços de hemodiálise.

Foi demonstrado, que o VHC é o agente causador da grande maioria das hepatites

virais pós-transfusionais (STRAUSS, 2001). Desta forma, todas as pessoas que

receberam transfusão de sangue ou hemoderivados, antes do início da triagem

sorológica para o VHC, iniciada na década de 1990, devem ser consideradas como

portadoras do vírus em potencial (STRAUSS, 2001). “A maioria das hepatites, que

ocorre entre pacientes em tratamento por hemodiálise [...] é causada pelo vírus da

hepatite do tipo C” (SALOM, apud LAZZARINI et al, 2000).

Os testes para diagnóstico de hepatite C disponíveis, atualmente, incluem testes de

triagem sorológica para anticorpos contra o VHC realizados por imunoensaios

enzimáticos (EIE). Estes testes sorológicos diferenciam-se quanto às diferentes

regiões virais utilizadas como antígeno da fase sólida. Desta forma, existem

Introdução

28

disponíveis os chamados testes de primeira, segunda ou terceira geração que

basicamente incluem um maior número de antígenos diferentes representando as

regiões estrutural e não-estrutural do vírus. Outros testes para diagnóstico da

infecção pelo VHC são os testes sorológicos mais específicos como

“immunobloting”, além de técnicas de biologia molecular como a pesquisa do RNA-

VHC por testes de ácidos nucléicos (NAT) como PCR ("Polimerase Chain Reaction"

ou Reação da polimerase em cadeia).

Dados recentes demonstram que a prevalência do VHC encontra-se elevada entre

pacientes dos serviços de hemodiálise. O MMWR (“Morbidity and Mortality Weekly

Report” – Relatório Semanal de Morbidade e Mortalidade) Vol. 52, 167 RR-3 do

CDC (USA) de 07 de fevereiro de 2003 classifica a população de pacientes de

hemodiálise como uma população de média prevalência indicando uma taxa de

prevalência de 9,5 %, com base em grandes estudos multicêntricos realizados.

Figura 7: Prevalência da Hepatite C, em vários grupos populacionais nos Estados Unidos da América, segundo o CDC, em 2003. Fonte: CDC (adaptado) No Brasil existem poucos dados oficiais sobre a prevalência do VHC em pacientes

de hemodiálise. Foi observada uma prevalência de 23,8 % em Salvador-BA

(SANTANA et al, 2001) e 52,0 % em Fortaleza-CE (MEDEIROS et al, 2004), sendo

que no primeiro estudo foi utilizado método de “immunoblotting” como confirmatório

além da triagem sorológica, enquanto no segundo estudo os dados representam

apenas os resultados da triagem sorológica. Naghettini e col. (1997), em Goiânia-

GO, demonstraram a existência de uma variabilidade na determinação da

Introdução

29

prevalência associada à metodologia utilizada. Estes autores, quando utilizaram

apenas a detecção do anti-VHC por um ELISA de 2ª geração obtiveram prevalência

de 35,3 % na população estudada (n=173), porém, ao utilizar um teste confirmatório

tipo “line immunoassay” (INNO-LIA® VHC Ab, Innogenetics) encontraram uma

prevalência de 25 % para a mesma população. Mesmo assim, apesar da

variabilidade gerada pelos diferentes métodos, os resultados encontrados

apontavam para uma prevalência mais elevada nos serviços de hemodiálise

brasileiros para o VHC.

Estudos mais recentes apontam para uma redução desta prevalência, devido à

adoção de medidas relacionadas ao monitoramento e diminuição do risco de

transmissão do vírus. Albuquerque e col. (2005), em Recife-PE, avaliando um grupo

de 250 pacientes de hemodiálise encontraram prevalência de 8,4 % quando

utilizando um teste de ELISA e 7,6 % quando da pesquisa do RNA do VHC. De

forma semelhante, Carneiro e col. (2005), em Goiânia-GO, demonstraram

diminuição significativa na incidência de casos de VHC, diminuindo de 71 % no

período de 1993 – 2002, para 34,2 % no período de 1996 – 2002 e para 11,7 %

considerando o período de 1999 – 2002.

Os procedimentos visando à diminuição da contaminação nestes serviços incluem,

além das medidas preventivas obrigatórias de biossegurança, o uso de máquinas de

diálise independentes para pacientes contaminados pelo VHC e pacientes cujos

exames sorológicos não apresentam reatividade para o VHC. Estes exames são

realizados periodicamente com o intuito de monitorar a possibilidade de

contaminação dos pacientes usuários dos serviços e assim estabelecer o

fluxograma de hemodiálise dos mesmos. A RDC nº 154, de 15 de junho de 2004 da

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que estabelece o regulamento

técnico para o funcionamento de serviços de diálise, descreve em detalhes os

procedimentos e estruturas, necessários à segurança destes procedimentos.

Tanto o algoritmo para diagnóstico do VHC recomendado pelo CDC (figura 10),

quanto o recomendado pelo Ministério da Saúde no Brasil (Brasil, 2002), incluem a

presença de testes confirmatórios para os casos de positividade sorológica. O

Introdução

30

Ministério da Saúde estabelece a necessidade da realização da pesquisa de RNA-

VHC em todos os pacientes cujos testes sorológicos de pesquisa de anticorpos anti-

VHC revelaram-se reagentes. Apesar desta determinação, a realização dos testes

de biologia molecular dificilmente é realizada rotineiramente pelos programas de

hemodiálise para pesquisa do RNA-VHC, devido às dificuldades existentes para o

custeio destes procedimentos. Esta realidade compromete o monitoramento correto

da infecção pelo VHC nestes pacientes, uma vez que boa parcela dos serviços de

hemodiálise no Brasil é realizada por instituições privadas ou filantrópicas,

conveniadas ao Sistema Único de Saúde (SUS). Desta forma, na maioria das vezes,

os testes sorológicos para pesquisa de anticorpos anti-VHC constituem-se no único

critério de classificação de reatividade ou não reatividade. Estes resultados definem

qual o tratamento a ser dado aos pacientes no momento da hemodiálise, embora os

centros de referência em diagnóstico e tratamento da hepatite C, já tenham

incorporado os métodos de biologia molecular no diagnóstico.

A proporção de testes de triagem sorológica reativos, confirmados nos testes

suplementares, aumenta à medida que aumenta a prevalência do VHC na

população estudada. Além disto, nos testes sorológicos em que o resultado final é

expresso na forma de relação entre leitura da amostra / valor do “cut-off” (S/Co), o

valor preditivo positivo (VPP) dos testes de triagem sorológica elevam-se

consideravelmente quando se utilizam valores mais elevados desta relação como

limites de corte para a reatividade (CDC, 2003). Entretanto, foi demonstrado que as

amostras reativas que apresentam baixa relação S/Co demonstram um

comportamento oposto ao observado pelas amostras que apresentam alta relação

S/Co. Enquanto que a proporção de testes de triagem sorológica com alta relação

S/Co que são confirmados em testes mais específicos, aumenta conforme aumenta

a prevalência da população estudada, os resultados com baixa relação S/Co

diminuem sua confirmação de positividade conforme aumenta a prevalência do VHC

na população estudada (CDC, 2003).

Em 2003, o CDC elaborou um relatório estabelecendo uma série de recomendações

acerca dos testes de detecção de anticorpos anti-VHC, que enfocam principalmente

dois aspectos:

Introdução

31

a. Recomendação da realização de testes mais específicos para confirmação,

sejam eles sorológicos (“immunoblotting” como o RIBA®) ou testes de biologia

molecular (PCR), particularmente em populações que apresentam uma baixa

prevalência da doença, com a finalidade de identificar e excluir casos falso-

positivos de triagem sorológica.

b. Recomendação do uso de um algoritmo que utiliza a relação S/Co,

estabelecendo que testes reativos na triagem sorológica, cujos resultados

apresentem valores de relação S/Co iguais ou superiores aos que foram

estabelecidos (tabela 1) como de VPP igual ou superior a 95 %, sejam

reportados com positivos sem a necessidade de realização de testes

suplementares. Esta recomendação é salientada particularmente em

populações de maior prevalência da hepatite C (entre elas pacientes de

serviços de hemodiálise).

Tabela 1: Valores de relação S/Co, na sorologia para anticorpos anti-VHC, obtidos pelos estudos mencionados pelo CDC acima dos quais o VPP apresenta-se superior a 95 %.

Teste de Triagem Sorológica Valor da relação S/Co a partir da qual o teste apresenta VPP acima de 95%

ELISA colorimétrico (Foram avaliados dois kit’s: Ortho

HCV Version 3.0 e Abbott HCV EIA 2.0)

3.8

Quimioluminescência (CIA) Ortho Vitros ECi Anti-HCV

8.0

Imunoensaio Fluorescente Microparticulado (MEIA) Abbott

Axsym HCV

10.0

Fonte: http://www.cdc.gov/Ncidod/diseases/hepatitis/c/sc_ratios.htm (adaptado).

As figuras 8 e 9 demonstram os resultados encontrados, pelo CDC, para os métodos

sorológicos de ELISA colorimétrico e quimioluminescência, respectivamente, em

diversas populações estudadas.

Introdução

32

Introdução

33

Na prática laboratorial não são incomuns valores de relação S/Co para o teste de

anticorpos anti-VHC considerados de baixa reatividade em pacientes

hemodialisados. Resultados como estes não apresentam uma confiabilidade

adequada para permitir que qualquer decisão seja tomada, o que torna necessária à

realização de testes suplementares confirmatórios.

Figura 10: Algoritmo apresentado pelo CDC para diagnóstico da Hepatite C. Fonte: http://www.cdc.gov/Ncidod/diseases/hepatitis/resource/posters.htm (modificado). Muitos estudos, realizados com a finalidade de avaliar a especificidade dos testes

sorológicos de terceira geração, utilizaram-se de amostras de doadores de sangue.

Porém, diferentemente dos doadores de sangue, pacientes em situações diversas

como portadores de alguma infecção, doenças hepáticas, doenças auto-imunes,

mulheres grávidas e pacientes com limitações fisiológicas, como pacientes de

hemodiálise, estão sujeitos à possibilidade de ocorrência de reações inespecíficas,

interferindo com os testes sorológicos (ZACHARY et al, 2005). Tendo em vista que a

maioria dos testes sorológicos foi desenvolvida, nitidamente, privilegiando a

Introdução

34

sensibilidade na detecção da infecção pelo VHC em detrimento da melhor

especificidade, muitos estudos ao longo dos anos enfocaram a ocorrência de

resultados falso-positivos (BAR-SHANY et al, 1996; COLIN et al, 2001; POLYWKA et

al, 2001; OETHINGER et al, 2005; ZACHARY et al, 2005).

A proposta deste estudo tem por objetivo avaliar a relação S/Co (leitura da amostra /

valor do “cut-off”) dos testes sorológicos e sua correlação com os resultados obtidos

em métodos de pesquisa do RNA viral do VHC (PCR) e métodos sorológicos

suplementares (“immunoblotting”), nos casos discrepantes. A ocorrência de

resultados falso-positivos e a proporção desta ocorrência em diferentes faixas de

resultados obtidos na relação S/Co, para os três métodos de triagem sorológica

estudados. Neste estudo foram utilizados dois métodos diferentes de detecção do

RNA viral, de forma que também analisamos o grau de concordância entre os

mesmos, além da sua correlação com os testes sorológicos. As amostras

discordantes entre sorologia e métodos moleculares, foram avaliadas pelo método

de “immunoblotting”.

O presente estudo também busca avaliar se as recomendações quanto ao critério de

alta reatividade e baixa reatividade, elaboradas pelo CDC em 2003, aplicam-se aos

resultados das amostras de pacientes dos serviços de hemodiálise estudados. REN

e colaboradores (2005) demonstraram a aplicabilidade do algoritmo, proposto pelo

CDC, ao analisarem vários testes de triagem sorológica em amostra de bancos de

sangue chineses. Também demonstraram existir relevância no uso da relação S/Co,

em virtude da correlação entre a elevação desta e o aumento da confirmação da

infecção.

Objetivos

Objetivos

36

2 OBJETIVOS

Avaliar a relevância estatística da relação S/Co (leitura da amostra / valor do “cut-

off”), obtida em diferentes métodos sorológicos e sua correlação com métodos

moleculares como a PCR e, nos casos discrepantes, com métodos sorológicos

suplementares como o “immunoblotting”;

Avaliar a concordância entre os métodos sorológicos para detecção de anticorpos

para o VHC;

Avaliar a aplicabilidade dos critérios estabelecidos pelo CDC em 2003, quanto à

classificação dos resultados em baixa ou alta reatividade sorológica, em pacientes

dos serviços de hemodiálise estudados.

Materiais e Métodos


38

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Caracterização do estudo

O estudo em questão caracteriza-se por ser um estudo do tipo descritivo transversal

do tipo análise comparativa. As metodologias diagnósticas avaliadas neste estudo

foram comparadas sob o ponto de vista paramétrico e não-paramétrico. O estudo

busca ainda atribuir relevância aos valores encontrados, também do ponto de vista

estatístico.

3.2 Caracterização dos indivíduos de estudo

A população alvo deste estudo é formada por pacientes dos serviços de hemodiálise

atendidos pelo laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas Ltda, na região

metropolitana de Vitória - ES, a saber: Serviço de hemodiálise do Hospital da

Associação dos Funcionários Públicos – Vitória - ES; Serviço de hemodiálise do

Hospital Santa Rita de Cássia – Vitória-ES, Clínica Capixaba do Rim – Unidades em

Vitória - ES, Serra - ES e Cariacica - ES.

No universo de pacientes atendidos, foi encontrado um número total de 43

indivíduos, com testes sorológicos reagentes (Vitros ECi® “Anti-HCV assay”), o que

perfaz aproximadamente 10,16 % do universo de pacientes atendidos (423

pacientes), sendo este, portanto o “n” pretendido para este estudo. No entanto,

alguns indivíduos tiveram que ser excluídos do grupo de estudo, por motivo de óbito

(1 indivíduo) e por mudança ou abandono do tratamento (2 indivíduos). Desta forma

foram considerados como grupo de estudo, 40 indivíduos. Sendo considerado como

critério de inclusão a reatividade sorológica para VHC e estar paciente sob

tratamento por hemodiálise.

Um grupo controle foi constituído de 10 indivíduos (correspondente a 25 % do total

de amostras reativas), sorologicamente não reativos para o VHC e escolhidos de

forma aleatória (por sorteio) entre o universo de pacientes. Todos as amostras,

incluindo o grupo controle, foram testadas sorologicamente para anticorpos anti-HIV


39

1 e 2 e também para o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg),

visando avaliar a possibilidade da presença de co-infecção por estes vírus, em todas

as amostras analisadas os resultados foram não reagentes, indicando a provável

inexistência de co-infecção nas amostras estudadas, para este vírus.

As amostras de soro e plasma obtidas foram aliquotadas e congeladas a - 20° C, as

alíquotas foram destinadas às análises sorológicas e de biologia molecular. As

análises sorológicas antecederam as análises de biologia molecular em cerca de 3

meses. Do total de amostras analisadas no grupo de estudo, 11 amostras

apresentaram resultado negativo para a pesquisa do RNA do VHC, além das 10

amostras do grupo controle. Considerando-se que todas as amostras apresentaram

ao menos um resultado sorológico reagente para anticorpos anti-VHC, todas estas

11 amostras foram coletadas novamente visando à confirmação do resultado da

PCR, tendo em vista a baixa estabilidade do RNA “in vitro”.

Os dados demográficos, dos pacientes dos grupos de estudo e controle, são

apresentados na tabela 2.

Tabela 2: Dados demográficos dos pacientes do estudo e grupo controle.

Sexo

N Feminino Masculino

Idade

(em anos)

Grupo de Estudo 40 16 24 31 - 73

Grupo Controle 10 5 5 16 - 59

3.3 Considerações éticas

O projeto deste estudo foi submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa

(CEP) do Centro de ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Espírito

Santo (UFES). Obteve aprovação com parecer nº CEP-074/06, aprovado na

Reunião Ordinária de 28/09/2006. Todos os indivíduos foram esclarecidos quanto ao

estudo e, aqueles que concordaram em participar, assinaram o Termo de


40

Consentimento. Todas as amostras foram identificadas numericamente, de forma a

garantir o total anonimato a todos os indivíduos participantes do estudo.

3.4 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa BioEstat 4.0 para

Windows (Manuel Ayres - Instituto Marimauá – Belém-PA). Os dados foram

analisados quanto à estatística descritiva dos resultados de cada método sorológico

e quanto à correlação com os métodos moleculares. Para avaliar a correlação entre

os resultados dos métodos sorológicos, expressos de forma numérica em S/Co e os

resultados dos métodos moleculares, os mesmos foram separados em dois grupos:

Grupo (a) constituído por amostras sorologicamente reativas cujos resultados não

foram confirmados nos métodos de biologia molecular; Grupo (b) constituído por

amostras cujos resultados sorológicos reativos foram confirmados pelos métodos de

PCR. Foi utilizado para esta finalidade o teste de Mann-Whitney, teste não-

paramétrico utilizado para a comparação de dois grupos independentes sob a

influência de uma variável (SOARES; SIQUEIRA, 2002).

Os valores de número de ciclos de amplificação necessários à detecção (CT),

obtidos para cada amostra positiva em PCR pelo método de PCR em tempo real,

foram pareados com os valores de relação S/Co da respectiva amostra em cada um

dos três métodos sorológicos. O pareamento foi analisado pelo teste de Correlação

Linear de Pearson.

3.5 Imunoensaios

Foram utilizados imunoensaios enzimáticos nos testes sorológicos da amostras:

• “VITROS ECi® Anti-HCV assay” (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey,

USA – Importado e comercializado no Brasil por Johnson e Johnson Produtos

Profissionais Ltda. CNPJ: 54.516.661/0002-84 – Registro ANVISA: 1032590629):

Imunoensaio enzimático por quimioluminescência de terceira geração que utiliza

os antígenos recombinantes do Core Viral e das regiões NS3, NS4 e NS5 do


41

VHC. Equipamento utilizado: VITROS ECiQ®, sistema automatizado de

imunoensaio quimioluminescente. Realizados no Laboratório Henrique Tommasi

Netto Análises Clínicas Ltda., CNPJ: 28.133.312/0001-92, em Vitória - ES.

• “Abbott Murex® Anti-HCV (versão 4.0)” (Fabricado por Murex Biotech S.A. (PTY)

Ltd., África do Sul – Distribuído por: Abbott Laboratórios do Brasil Ltda. – CNPJ:

56.998.701/0001-16 – Registro no Ministério da Saúde: 10055310825):

Imunoensaio enzimático colorimétrico para detecção de anticorpos contra o vírus

da hepatite C em soro ou plasma humano. Equipamento utilizado: TECAN

Gênesis RPM 2000®, sistema automatizado para processamento de ELISA.

Realizados no laboratório da Fundação de Estudos Sorológicos Capixaba

(FESCA) – CNPJ: 39.617.113/0001-76, em Vitória - ES.

• “Abbott Axsym® Anti-HCV” (Fabricado por Abbott Laboratories – Diagnostic

Division – Illinois – USA – Distribuído por: Abbott Laboratórios do Brasil Ltda. –

CNPJ: 56.998.701/0001-16 – Registro no Ministério da Saúde/ANVISA:

Imunoensaio enzimático microparticulado (MEIA) com revelação por

fluorescência para detecção de anticorpos contra o vírus da hepatite C em soro

ou plasma humano. Equipamento utilizado: Abbott Axsym® – Sistema

automatizado de análises imunológicas. Realizados no laboratório central de

referência (LACEN-ES) do Instituto Estadual de Saúde Pública (IESP) do estado

do Espírito Santo, em Vitória - ES.

Foram utilizados na avaliação de co-infecção dos pacientes do estudo pelo vírus da

hepatite B e pelo vírus HIV, os seguintes imunoensaios:

• Anticorpos anti-HIV: Ensaio imunoenzimático quimioluminescente - Vitros ECiQ

(Ortho Clinical Diagnostics) - Realizado no laboratório Henrique Tommasi Netto

Análises Clínicas Ltda.

• HBsAg: Ensaio imunoenzimático quimioluminescente - Liaison® (Diasorin) -

Realizado no laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas Ltda.


42

Tabela 3: Características dos três ensaios de triagem sorológica para anticorpos anti-VHC utilizados.

Antígenos

Axsym® anti-HCV 3.0 (Abbott Diagnostics)

Vitros ECi® anti-HCV (Ortho Clinical Diagnostics)

Murex anti-HCV 4.0 – (Murex Biotech)

Core

Proteína recombinante HCr43 (E. coli)

Proteína recombinante c22-3 (levedura)

Proteína recombinante HCr43 (E. coli)

NS3

Proteína recombinante c200 (levedura); Proteína

recombinante c100-3 (levedura)

Proteína recombinante c200 (levedura)


NS4

Proteína recombinante c200 (levedura); Proteína

recombinante d 00-3 (levedura)



NS5

Proteína recombinante NS5 (levedura)



Princípio Imunoensaio enzimático indireto

Imunoensaio enzimático indireto

Imunoensaio enzimático indireto

Sólida Fase Micropartículas (MEIA) Cubetas de reação individuais (“Wells”)

Microplacas de reação

Volume de Reação(µL)

83 20 20

Tempo de reação(min)

30 56 120

Zona cinza (S/Co)

0,80 – 0,99 0,90 – 0,99 0,90 – 0,99

Fonte: http://www.cdc.gov/Ncidod/diseases/hepatitis/c/sc_ratios.htm (adaptado) e instruções de uso fornecidas pelos fabricantes.

3.6 Métodos de Biologia Molecular

Os testes de biologia molecular utilizadas baseiam-se na identificação do RNA viral

do VHC em amostras de soro (PCR em tempo real) e plasma (PCR qualitativa -

Amplicor®). Os métodos de biologia molecular qualitativos são considerados

métodos mais sensíveis e específicos na detecção de infecção por vírus. Uma vez

que seu objetivo é detectar o próprio RNA viral, os mesmos são considerados

métodos de diagnóstico direto, enquanto os métodos sorológicos são considerados

métodos de diagnóstico indireto da presença viral.


43

3.6.1 PCR em Tempo Real

Pesquisa do RNA viral através da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)

Qualitativa para VHC por método de tempo real (Real-Time PCR), padronizado pelo

Instituto Tommasi de Pesquisa e Desenvolvimento (ITPD), CNPJ: 05.814.244/0001-

21, Vila Velha-ES.

Materiais Utilizados:

• QIAamp MinElute® “Virus Spin Kit” - Cat. N. 57704 - Lote: 127131849 - Val:

11/06/2008 – QIAGEN - Importado por: Uniscience do Brasil

• TaqMan® - “Universal PCR Master Mix” - Applied Biosystems – P/N: 4304437 -

Lote: J00968 - Val.: 31/01/2008

• TaqMan® “RNase P Detection Reagentes (FAM)” - Lote: 0505054

• “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” - Applied Biosystems - Lote:

0703014 - Val: 31/03/2008

• TaqMan® “Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC® Dye)” – PN:

4308323 - Applied Biosystems - Lote: 0703101

• MGB TaqMan® “Probe” – P/N: 4316034 – Lote: 185388386-9 - Applied

Biosystems

• “Primers” HCV - Região 5` UTR (“5`untranslated region”, sorotipo 1a, 1 a 341 pb,

região mais conservada do genoma, com identidade de nucleotídeos de 99,6 %)

- Applied Biosystems – Patenteados.

Procedimentos:

• Isolamento e purificação de ácido nucléico viral:

Material necessário:

• QIAamp MinElute® ”Vírus Spin Kit” – QIAGEN

• Centrífuga Eppendorf® (14000 rpm).

• Bloco térmico (56° C), pré-aquecido.

• Etanol (96 – 100 %).

• Tubos de microcentrífuga com tampa (tipo Eppendorf®).


44

Etapas prévias e volumes necessários:

Volume de amostra: 200 � L de soro ou plasma.

Preparação do carreador de RNA: Adicionar 310 � L de tampão AVE ao frasco

contendo 310 � g de carreador de RNA liofilizado, obtendo uma solução a 1 � g/ � L.

Adição da solução carreador RNA/Tampão AVE ao Tampão AL: Calcular o volume

necessário de cada tampão utilizando as seguintes fórmulas:

n x 0,22 mL = y mL y mL x 28 � L/mL = z � L

Onde:

n = número de amostras a serem processadas simultaneamente.

y = cálculo do volume ncessário de tampão AL

z = volume da solução carreador RNA/Tampão AVE a ser adicionado ao tampão AL.

Procedimento:

Pipetar 25 � L de protease em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.

Adicionar 200 � L de amostra neste mesmo tubo.

Adicionar 200 � L de tampão AL contendo 28 � g/mL de carreador de RNA. Fechar o

tubo e homogeinizar em vórtex por 15 segundos.

Incubar em bloco térmico a 56° C por 15 minutos.

Centrifugar rapidamente para remover gotículas formadas por condensação no

interior do tubo.

Adicionar 250 � L de etanol (96 – 100 %), fechar o tubo e homogeinizar em “vórtex”

por 15 segundos. Incubar o homogeinizado por 5 minutos à temperatura ambiente

(15 – 25° C).

Centrifugar rapidamente para remover gotículas formadas por condensação no

interior do tubo.

Aplicar, cuidadosamente, o homogeinizado obtido na etapa anterior em uma coluna

“QIAamp MinElute”® sem encostar a ponteira na membrana da coluna. Fechar a

tampa da coluna e centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Retirar a coluna e transferí-


45

la para um tubo de coleção de 2 mL novo, fornecido no kit e descartar o tubo

contendo o filtrado.

Cuidadosamente, abrir a tampa da coluna e adicionar 500 � L de tampão AW2 sem

encostar a ponteira na membrana da coluna. Fechar a tampa e centrifugar a 8000

rpm por 1 minuto. Retirar a coluna e transferi-la para um tubo de coleção de 2 mL

novo, fornecido no kit e descartar o tubo contendo filtrado.

Abrir a tampa da coluna cuidadosamente e adicionar 500 � L de etanol (96 – 100%),

sem encostar a ponteira na membrana da coluna. Fechar a tampa da coluna e

centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Retirar a coluna e transferi-la para um tubo de

coleção de 2 mL novo, fornecido no kit e descartar o tubo contendo o filtrado.

Centrifugar a coluna contida no tubo de coleção de 2 mL novo a 14000 rpm por 3

minutos, para secar a membrana completamente.

Retirar a coluna e transferí-la para um tubo de coleção de 2 mL novo, previamente

aquecido em bloco térmico a 56° C. Mantê-la no bloco térmico com a tampa aberta,

por 3 minutos, visando secar por completo a membrana.

Transferir a coluna para um tubo de microcentrífuga novo de 1,5 mL (não fornecidos

no kit) e descarte o tubo prévio. Cuidadosamente, abrir a tampa da coluna e aplicar

de 20 a 150 � L (60 � L no caso deste estudo) de tampão AVE ou água destilada livre

de RNase no centro da membrana. Fechar a tampa, incubar à temperatura ambiente

por 1 minuto e centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto. Utilizar o filtrado para processo

de formação de cDNA e amplificação.

• Formação de DNA complementar (cDNA):

Materiais necessários:

“High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit”.

Termociclador Perkin Elmer – Modelo: GeneAmp PCR System 2400.

Tubos de reação para PCR.

Procedimento:

Em cada tubo adicionar 50 � L do filtrado proveniente da extração anterior, 10 � L de

10X “Reverser transcription buffer”, 4 � L de 25X dNTPs, 10 � L “random primers”, 5

� L MultiScribe reverse transcriptase 50 U/ � L e 21 � L de água RNAse-free.

Programa: “Hold” (10 min / 25° C), “Hold” (120 min / 37° C)


46

• Amplificação – Reação da Polimerase em Cadeia, em Tempo Real:

Equipamento: ABI 7300 Real-Time PCR System

Sistema de detecção: TaqMan®

Controle interno de amplificação: VIC®-IPC (“Internal Positive Control”).

Características: Sondas fluorescentes; elaboração de curva de fluorescência e

obtenção de valor CT para cada amostra individualmente. O valor de CT refere-se ao

ponto, em número de ciclos e suas frações, onde a fluorescência do amplificado

ultrapassa o valor estipulado como “threshold” e é inversamente proporcional à

quantidade de material genético, a ser amplificado, presente na amostra. O

“threshold” é um valor calculado pelo software do sistema, baseado na referência

passiva do fluoróforo utilizado, na linha de base de fluorescência inicial e na

magnitude (� Rn) do sinal gerado pelo fluoróforo em cada “corrida” específica de

PCR.

Figura 11: Gráfico esquemático representativo do funcionamento e interpretação da PCR em tempo real. Fonte: Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System Absolute Quantification Getting Started Guide Protocolo:

H2O destilada “DNAse-free”: 1,75 � L

TaqMan Universal Mix (2x): 25 � L

Primer F (10.000 nM): 3 � L

Primer R (10.000 nM): 3 � L

TaqMan Probe (10 � M) 1,25 � L


47

Exo IPC Mix (10X): 5 � L

Exo IPC DNA (50X): 1 � L

cDNA (1 – 100 ng): 10 � L.

Volume Total de reação: 50 � L.

Programa:

“Hold” (AmpErase® UNG - Ativação): 2 min / 50° C

“Hold” (AmpliTaq Gold® DNA Polimerase): 10 min / 95° C

40 ciclos: Desnaturação (15 seg / 95° C); Anelamento (1 min / 60° C)

3.6.2 PCR Qualitativa – Amplicor® v2.0 Pesquisa do RNA do VHC por reação de polimerase em cadeia, através do método

Amplicor® v2.0 (Roche Diagnostics) não-automatizado. Realizado no laboratório de

Imunologia e Biologia Molecular do Núcleo de Doenças Infecciosas (NDI) da

Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).

Reagentes necessários:

• Amplicor® “HCV Specimen Preparation Kit”, v2.0 (HCV PREP) - P/N: 21111086

123 – 96 testes.

• Amplicor® “HCV Controls Kit”, v2.0 (HCV CTL) – P/N: 21111175 123 – 8 sets.

• Amplicor® “HCV Amplification Kit”, v2.0 (HCV AMP) – P/N: 21111094 123 – 96

testes.

• Amplicor® “HCV Detection Kit”, v2.0 (HCV MWP DK) – P/N: 21111108 123 – 96

testes.

• Amplicor® “Internal Control Detection Kit” (IC MWP DK) – P/N: 20763306 – 96

testes.

Procedimentos:

Isolamento e purificação de ácido nucléico viral:

Material necessário:

• Amplicor® HCV Specimen Preparation Kit, v2.0 (HCV PREP), composto de:


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HCV LYS, v2.0 (Reagente de lise).

HCV DIL, v2.0 (Diluente de amostras).

HCV IC, v2.0 (Controle Interno contendo RNA recombinante do VHC com

seqüências de ligação do iniciador do VHC).

• Isopropanol de grau reagente.

• Etanol 70 % preparado a fresco em grau reagente.

• Centrífuga a 16000 g.

• Bloco térmico a 60o C.

• Vórtex.

• Pipetas com ponteiras com barreira (filtro) isentas de RNase.

• Tubos de polipropileno com tampas rosqueáveis de 1,5 mL (Sarstedt)

• Luvas descartáveis sem talco.

Procedimento:

Preparo do reagente de lise de trabalho: Adicionar o conteúdo de um frasco de HCV

IC ao frasco de HCV LYS. Estabilidade de 8 horas à temperatura ambiente. O frasco

de HCV LYS quando mantido na temperatura de armazenamento (2 a 8o C), forma

um precipitado. Antes de utilizar deve-se aquecer por até 30 minutos em banho-

maria na temperatura de 37º C e agitar para a dissolução do precipitado.

Adicionar em tubo de tampa rosqueável (Sarstedt):

• 400 � L do reagente de lise de trabalho

• 200 � L de plasma (para as amostras) ou 200 � L de plasma-controle (NHP,

disponível no kit Amplicor® Controls Kit) para os controles (positivo e negativo)

• 20 � L de controle (positivo ou negativo) para os controles.

Procedimento:

Incubação a 600 C por 10 minutos, após adicionar 600 µL isopropanol. Novamente

incubar à temperatura ambiente por 2 minutos.

Centrifugação: 15 minutos a 16000g, desprezar o sobrenadante. Adicionar 1000 µL

de etanol a 70%, agitar em vórtex por 5 segundos. Centrifugação: 5 minutos a

16000g, adicionar HCV DIL: 200 µL. Com auxílio de uma ponteira, soltar o "pellet"

formado, agitar em “vórtex” por 10 segundos.

Estabilidade: 3 horas à temperatura ambiente / 1 mês a -700 C.


49

• Amplificação e Identificação: Materiais necessários:

• Amplicor® “HCV Amplification Kit”, contendo:

HCV MMX, v2.0 ( Mistura principal ou “master mix”).

HCV Mn2+, v2.0.

• Amplicor® “HCV Detection Kit”, contendo:

HCV MWP, v2.0 (Microplacas revestida e sonda para o VHC).

[1] DN (solução de desnaturação - NaOH)

[2] HCV HYB (Tampão de hibridização).

[3] AV-HRP (Conjugado de avidina-peroxidase).

[4A] SUB A (Substrato A – H2O2).

[4B] SUB B (Substrato B - TMB).

[5] STOP (Reagente de parada da reação – ácido sulfúrico).

10X WB (Solução de lavagem concentrada 10 x).

• Amplicor® “Internal Control Detection Kit”.

• Pipetas com ponteiras com barreira (filtro) e isentas de RNase.

• Tubos de reação MicroAmp® (Tubos de PCR).

Equipamentos:

• Termociclador Perkin Elmer, modelo: GeneAmp PCR System 2400

• Lavador de microplacas – Bio-Rad, modelo PW40

• Leitora óptica de microplacas – Bio-Rad, modelo: A1

Procedimentos:

• Preparação da mistura principal de trabalho (“Master mix”):

Posicionar a quantidade de tubos de reação para amostras e controles na

bandeja que vai ao termociclador. Preparar o “master mix” adicionando 100 µL de

HCV Mn2+ no frasco de HCV MMX e agitar 10 a 15 vezes por inversão

(estabilidade 4 horas 2 - 8º C). Distribuir 50 � L de “master mix” em cada tubo de

reação. Guardar em saco plástico a 2 - 8º C e até o momento de usar.

Adicionar 50 � L de amostra ou controle processados, em cada tubo de reação

devidamente identificado, contendo 50 � L do “master mix”. Tampar os tubos de

reação e encaminhar ao termociclador.


50

• Programa:

“Hold”: 50º C / 5 min

“Hold”: 62º C / 30 min

“Cycle”: 90º C / 10 seg, 58º C / 25 seg (37 vezes)

“Hold”: 91º C (não exceder 3 horas)

Tempo de reação de aproximadamente 1 hora e 45 minutos. As amostras

deverão ser removidas dentro das 3 horas do “Hold” final e poderão ser retiradas

a qualquer momento desse período final.

Ao término da amplificação adicionar imediatamente 100 � L da solução de

desnaturação ([1] DN) em cada tubo (não deixar abaixar a temperatura da amostra

amplificada). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente (podem ficar até 2

horas em temperatura ambiente para serem detectadas, caso não ocorra a detecção

nesse período manter 2 - 8° C por até 1 semana).

Deixar os kits de detecção de HCV e Controle Interno à temperatura ambiente.

Pipetar 100 � L do tampão de hibridização ([2] HCV HYB) em cada poço das placas

(HCV e Controle Interno). (Obs: Se o “amplicon” desnaturado foi armazenado na

geladeira, incubar 3-4 minutos 37°C para diminuir a viscosidade).

Pipetar 25 � L da amostra desnaturada, usando ponteiras com barreira nas tiras

correspondentes.

Incubar 60 min a 37ºC (± 2°C).

Preparar o tampão de lavagem (10X WB) (diluir 1:10 em água destilada) 40 mL para

cada tira de 8 poços.

Lavar a placa 5 vezes utilizando o lavador de microplacas.

Adicionar 100 � L de conjugado avidina-peroxidase conjugate( [3] AV-HRP).

Incubar 15 minutos a 37ºC ± 2°C.

Preparar a solução de trabalho do substrato (4 partes de solução [4A] SUB A para 1

parte da solução [4B] SUB B) e deixar ao abrigo da luz.

Lavar a placa 5 vezes bater bem a placa para tirar o tampão residual.

Adicionar 100 µL da solução de trabalho do substrato.

Incubar 10 minutos em temperatura ambiente e ao abrigo da luz.

Adicionar 100 µL do reagente de parada de reação ([5] STOP).


51

Ler a placa em 450 nm no máximo 30 minutos após a adição do reagente de parada

da reação.

Interpretação dos Resultados:

Após certificar-se que os valores dos controles positivos e negativos validaram a

corrida, proceder a interpretação dos resultados considerando além dos resultados

das amostras, também o resultado obtido pelo controle interno de amplificação,

conforme os critérios estabelecidos na tabela 4.

Tabela 4: Interpretação dos resultados da PCR qualitativa para VHC com detecção de controle interno de amplificação – Amplicor® (Roche Diagnostics).

Resultado da amostra VHC

(Abs. a 450 nm)

Resultado do Controle Interno de

amplificação (Abs. a 450 nm)

Interpretação

< 0,3

� 0,3

VHC RNA não detectado. A amostra é presuntivamente negativa para o VHC.

< 0,3

< 0,3

Inibição na Amostra. O VHC RNA se presente

não pode ser detectado. Processar outra alíquota da amostra original ou coletar nova

amostra.

�

1,0

Qualquer valor

Para uma corrida válida, amostras com HCV

são interpretadas como positivas independente do resultado do controle interno.

�

0,3 e < 1,0

Qualquer valor

Equívoca. Resultados são inconclusivos para o VHC RNA. Repetir todo processo em duplicata usando nova alíquota da amostra do paciente. Amostras onde as duas repetições forem

� 0.3,

serão consideradas positivas para HCV RNA. Quando uma ou as duas repetições forem < 0,3, serão consideradas presuntivas negativas para HCV RNA desde que os resultados do Controle

Interno sejam �0.3 para ambas replicatas.

Fonte: Amplicor® Hepatitis C virus Test, version 2.0 – Instructions for use – Doc. Ver. 4.0 - 06/2006 (adaptado).


52

3.7 Immunoblotting As amostras que apresentaram resultados discordantes entre os métodos

sorológicos e os métodos moleculares, foram submetidas à análise pelo método de

“immunoblotting”. Esta análise foi realizada no laboratório Balagué Center S.A.

(Barcelona, Espanha), por intermédio do laboratório Lab-Rede (CNES: 3282406) de

Belo Horizonte - MG ao qual o laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas

Ltda é afiliado. Fabricante: Innogenetics, lote: 172185, validade: 31/07/2008.

O método utiliza peptídeos sintéticos de terceira geração, de forma a identificar

anticorpos presentes na amostra contra os peptídeos das regiões E2, NS3, NS4,

NS5 e duas regiões do core viral (C1 e C2). Como critério de interpretação,

considera-se como resultado positivo o aparecimento de pelo menos duas bandas

de fraca reatividade ou mais. Como resultado negativo, considera-se a ausência de

bandas ou o aparecimento de apenas uma banda de fraca reatividade, exceto se

esta banda corresponder à região NS3. O resultado é considerado indeterminado

quando do surgimento de uma banda de reatividade normal ou intensa, ou ainda a

presença de uma única banda de reatividade fraca sendo esta correspondente a

NS3.

3.8 Formatação e Normas Técnicas

Esta dissertação está redigida segundo as normas técnicas da ABNT, exceto as

referências bibliográficas que serão citadas como referenciadas no “Pubmed”

(www.pubmed.com), excluindo o dia e mês da publicação, quando presentes.

Resultados

Resultados

54

4 RESULTADOS

4.1 Análises Sorológicas

Os resultados obtidos para os três diferentes métodos sorológicos são apresentados

na tabela 5. Os resultados foram expressos em valor numérico correspondente a

razão entre a leitura da amostra e o valor do “cut-off” ou linha de corte (S/Co, do

inglês “Sample/cut-off”), visando a comparação entre os métodos. Os três métodos

sorológicos apresentaram resultados concordantes para a maioria das amostras

testadas, salvo em casos específicos (amostras 044 e 056), onde observou-se

comportamento duvidoso ou inconclusivo.

A interpretação dos resultados foi realizada de acordo com o estabelecido pelos

fabricantes. Um resultado igual a 1,0 representa uma leitura da amostra idêntica ao

valor da linha de corte (“cut-off”). Este parâmetro é utilizado para estabelecer a

reatividade do teste. Portanto, resultados ligeiramente abaixo de 1,0 são

considerados inconclusivos (“zona cinza”; 0,90 a 0,99 para os testes Vitros Eci® e

ELISA Murex® e 0,80 a 0,99 para o teste Axsym®). Resultados inferiores aos da

região de resultados inconclusivos (“zona cinza”) são considerados não reativos.

Com relação à possibilidade de coinfecção pelos vírus HIV ou HBV, os testes

sorológicos realizados para pesquisa de anticorpos anti-HIV (I e II) e para pesquisa

de HBsAg foram não reagentes para todas as amostras.

Resultados

55

Tabela 5: Resultados individuais em cada um dos três métodos sorológicos estudados (ELISA, MEIA e CIA), expressos em relação S/Co. As amostras 001 a 010 referem-se ao grupo controle; As amostras 013 a 059 referem-se ao grupo de estudo.

RESULTADOS

Amostras Vitros

Eci (CIA)

Murex (ELISA)

Axsym (MEIA)

Amostras

Vitros Eci

(CIA)

Murex (ELISA)

Axsym (MEIA)

001 0,05 (NR) 0,15 (NR) 0,41(NR) 031 22,0 (R) 5,13 (R) 95,05 (R)

002 0,26 (NR) 0,35 (NR) 0,52 (NR) 032 25,1 (R) 4,94 (R) 119,14 (R)

003 0,07 (NR) 0,57 (NR) 0,33 (NR) 033 26,5 (R) 5,25 (R) 111,23 (R)

004 0,18 (NR) 0,29 (NR) 0,37 (NR) 034 5,28 (R) 2,85 (R) 2,30 (R)

005 0,03 (NR) 0,31 (NR) 0,54 (NR) 035 24,7 (R) 5,30 (R) 104,13 (R)

006 0,03 (NR) 0,30 (NR) 0,36 (NR) 036 1,82 (R) 1,16 (R) 1,33 (R)

007 0,02 (NR) 0,29 (NR) 0,42 (NR) 037 24,3 (R) 5,40 (R) 95,44 (R)

008 0,03 (NR) 0,37 (NR) 0,47 (NR) 038 26,30 (R) 5,40 (R) 92,27 (R)

009 0,05 (NR) 0,18 (NR) 0,29 (NR) 039 26,2 (R) 5,35 (R) 142,26 (R)

010 0,20 (NR) 0,31 (NR) 0,52 (NR) 040 23,5 (R) 4,94 (R) 141,1 (R)

013 26,1 (R) 4,88 (R) 53,1 (R) 041 21,3 (R) 4,77 (R) 117,82 (R)

014 20,6 (R) 5,13 (R) 100,16 (R) 042 24,7 (R) 5,12 (R) 74,25 (R)

016 24,2 (R) 6,21 (R) 135,57 (R) 044 1,37 (R) 1,28 (R) 0,84 (I)

017 24,9 (R) 5,40 (R) 57,09 (R) 047 26,2 (R) 5,03 (R) 136,64 (R)

018 12,0 (R) 4,70 (R) 5,98 (R) 048 24,9 (R) 5,12 (R) 129,07 (R)

019 23,8 (R) 5,03 (R) 103,95 (R) 049 9,39 (R) 3,9 (R) 11,04 (R)

020 24,0 (R) 5,0 (R) 104,72 (R) 050 26,8 (R) 5,33 (R) 143,29 (R)

021 22,9 (R) 5,4 (R) 140,76 (R) 051 23,4 (R) 5,40 (R) 121,43 (R)

023 26,4 (R) 5,3 (R) 124,39 (R) 052 24,9 (R) 5,08 (R) 93,78 (R)

024 25,9 (R) 5,3 (R) 98,77 (R) 053 28,0 (R) 5,46 (R) 125,56 (R)

025 18,8 (R) 4,94 (R) 3,00 (R) 054 7,63 (R) 1,50 (R) 2,92 (R)

026 26,8 (R) 5,12 (R) 53,73 (R) 055 17,1 (R) 5,30 (R) 3,98 (R)

028 20,9 (R) 5,08 (R) 118,80 (R) 056 2,63 (R) 0,41 (NR) 0,85 (I)

029 22,7 (R) 5,2 (R) 101,83 (R) 057 29,3 (R) 5,21 (R) 125,74 (R)

030 23,0 (R) 5,3 (R) 149,44 (R) 059 29,1 (R) 4,85 (R) 133,06 (R)

O critério de interpretação como (R) Reagente, (I) Inconclusivo ou (NR) Não-Reagente, segue as recomendações dos fabricantes dos reagentes utilizados e seus respectivos sistemas analíticos.

Resultados

56

Os resultados obtidos foram analisados através de estatística descritiva (Tabela 6).

As médias dos resultados das amostras reativas foram 4,8 para o método ELISA,

21,27 para o método quimioluminescente e 91,08 para o método MEIA. Estes valores

demonstram um padrão de diferença na amplitude da leitura de cada método para as

amostras reativas. Amostras reativas apresentaram, em média, uma leitura cerca de

5 vezes superior no método quimioluminescente do que em ELISA e cerca de 4,5

vezes superior no método MEIA do que na quimioluminescência.

No entanto, amostras com baixa reatividade apresentaram valores muito próximos

nos três métodos, como demonstrado no parâmetro “valor mínimo” da tabela 6.

Tabela 6: Estatística descritiva dos resultados obtidos nas análises sorológicas nos três métodos estudados (ELISA, CIA e MEIA), separados por reatividade sorológica.

Método

Parâmetro

Amostras não-reativas e/ou inconclusivas

Amostras Reativas

n 11 39 Média 0,32 4,80

Mediana 0,31 5,12 Mínimo 0,15 1,16 Máximo 0,57 6,21

Desvio Padrão 0,11 1,12 IC (90%) 0,26 a 0,38 4,50 a 5,10 IC (95%) 0,25 a 0,40 4,44 a 5,16

ELISA colorimétrico (MUREX®)

IC (99%) 0,21 a 0,43 4,32 a 5,28

n 10 40 Média 0,09 21,27



Quimioluminescência (Vitros ECi® – Ortho Clinical Diagnostics)

IC (99%) 0,01 a 0,18 18,02 a 24,53

n 12 38 Média 0,493 91,08



MEIA (Axsym® – Abbott)

IC (99%) 0,33 a 0,66 70,42 a 111,74

Os resultados expressos em valores da relação S/Co.

Resultados

57

Como podemos observar na figura 12, a distribuição qualitativa dos resultados em

cada um dos métodos sorológicos estudados, analisados segundo o critério

estabelecido pelo CDC, demonstra que diferenças significativas somente foram

observadas para resultados obtidos pelo o método MEIA. A análise dos resultados

obtidos pelo MEIA, apresentou tanto uma freqüência ligeiramente maior de amostras

com baixa reatividade e ainda amostras com resultados inconclusivos, fatos não

observados para os outros dois métodos sorológicos estudados.

0%

22%

70%

8%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Am os tras (n = 50)

Fre

quên

cia

(%)

Alta reatividade - ELISA ( � 3,8)

Baixa reatividade - ELISA ( � 1,0 a 3,79)

Inconclusivas - ELISA ( � 0,90 a 0,99)

Não reativas - ELISA (< 0,90)

A

0%

20%

72%

8%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Am os tras (n = 50)

Fre

quên

cia

(%)

Alta reatividade - CIA ( � 8,0)

Baixa reatividade - CIA ( � 1,0 a 7,9)

Inconclusivas - CIA ( � 0,90 a 0,99)

Não reativas - CIA (< 0,90)

B

64%

4%

20%12%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Am os tras (n = 50)

Freq

uênc

ia (%

)

Alta reatividade - MEIA ( � 10,0)

Baixa reatividade - MEIA ( � 1,0 a 9,9)

Inconclusivas - MEIA ( � 0,80 a 0,99)

Não reativas - MEIA (< 0,80)

C

Figura 12: Distribuição percentual dos resultados obtidos nos métodos de ELISA (A), CIA (B) e MEIA (C), para todas as 50 amostras do estudo, incluindo 10 amostras do grupo controle negativo.

Resultados

58

A concordância dos resultados obtidos pelos três diferentes métodos sorológicos é

apresentada na figura 13. Os resultados demonstraram uma forte tendência de

correlação entre os métodos de ELISA e CIA, com o método de MEIA demonstrando

ligeira discordância com os outros métodos. Quando comparados método a método,

os percentuais de resultados concordantes salientam esta observação, conforme

demonstrado na figura 13.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Todos os métodos ELISA x CIA ELISA x MEIA CIA x MEIA

Co

nco

rdân

cia

(%)

Amostras Não-reativas ou Inconclusivas Amostras ReativasBaixa Reatividade Alta Reatividade

ANÁLISE DE CONCORDÂNCIA ENTRE OS MÉTODOS SOROLÓGICOS ESTUDADOS

Todos os métodos ELISA x CIA ELISA x MEIA CIA x MEIA Amostras Não-

reativas ou Inconclusivas

83,30%

90,91%

91,67%

83,30%

Amostras Reativas

95,00% 97,50% 97,44% 95,00%

Baixa Reatividade

66,67% 100,00% 66,67% 66,67%

Alta Reatividade

88,89% 97,22% 91,43% 88,89%

Figura 13: Análise de concordância entre os métodos sorológicos. Os critérios utilizados para definição de baixa reatividade e alta reatividade foram definidos pelo CDC (USA). Os critérios de definição de amostras reativas, inconclusivas ou não-reativas são fornecidos pelos fabricantes dos reagentes e sistemas analíticos utilizados.

Resultados

59

4.2 Análise dos Métodos de Biologia Molecular

As amostras analisadas pelos métodos de biologia molecular foram alíquotas das

mesmas amostras utilizadas na análise pelos métodos sorológicos. Todas as

amostras com resultados negativos em qualquer um dos métodos de PCR, foram

recoletadas e reprocessadas.

O padrão observado nos resultados sorológicos, bem como os resultados das

análises de biologia molecular, é apresentado na figura 14. Podemos visualizar a

existência de resultados paradoxais (amostras 018, 025, 034, 036, 054, 055) onde a

leitura do método MEIA é consideravelmente menor do que o padrão demonstrado

para amostras reativas. Nestas amostras a leitura do método MEIA é equivalente ou

inferior aos métodos de CIA e ELISA (Murex®).

Os resultados dos métodos moleculares utilizados são apresentados de forma

qualitativa. Em algumas amostras sorologicamente reativas (017, 018, 024, 025,

034, 036, 037, 044, 049, 054 e 056), os resultados dos métodos moleculares não

foram concordantes com as análises sorológicas. Destas amostras não

concordantes, seis amostras (017, 018, 024, 025, 037 e 049) apresentaram pelo

menos um dos resultados sorológicos (apresentados na tabela 5) acima do limite

que o caracteriza com resultado de alta reatividade pelos critérios do CDC.

Resultados

60

Figura 14: Análise comparativa dos resultados de cada amostra, expressos em S/Co, nos três métodos sorológicos estudados, além do respectivo resultado dos dois métodos de biologia molecular utilizados.

Os dois métodos moleculares utilizados apresentaram uma concordância de 100%

nas amostras estudadas. Dentre as 50 amostras analisadas, 29 foram consideradas

positivas e 21 negativas para a presença de RNA do VHC em ambos os métodos de

biologia molecular.

Os resultados dos métodos sorológicos estudados apresentaram diferenças de

comportamento com relação à concordância com os métodos moleculares, mas

somente no que se refere às amostras consideradas reagentes. Esta discrepância

foi mais acentuada ao considerarmos todas as amostras reativas (S/Co � 1,0) e

menos acentuada, porém ainda relevante, quando consideradas apenas amostras

de alta reatividade sorológica. Os percentuais de concordância entre os métodos

sorológicos e os de biologia molecular obtidos, são apresentados nas figuras 15, 16

e 17.

Resultados

61

100%

74,40%

0%

82,90%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Faixas de valores em relação S/Co

Co

rrel

ação

(%

)

Não-reativas (< 1,0) Reativas (Todas, � 1,0)

Baixa reatividade (� 1,0 a 3,79) Alta retividade ( � 3,8)

Figura 15: Correlação entre os resultados obtidos em ELISA colorimétrico (MUREX®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 11; amostras reativas, n = 39; baixa reatividade, n = 4; alta reatividade, n = 35 .

0%

100%

72,50%82,90%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Faixas de v alores em relação S/Co

Co

rrel

ação

(%

)

Não-reativas (< 1,0) Reativas (Todas, � 1,0)

Baixa reatividade ( � 1,0 a 7,9) Alta reatividade (� 8,0)

Figura 16: Correlação entre os resultados obtidos em quimioluminescência (Vitros ECi®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 10; amostras reativas, n = 40; baixa reatividade, n = 5; alta reatividade, n = 35.

100%

76,30%

16,70%

87,50%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Faixa de v alores em relação S/Co

Co

rrel

ação

(%)

Não-reativas (< 1,0) Reativas (Todas, 1,0)

Baixa reatividade ( 1,0 a 9,9) Alta reatividade ( 10,0)

Figura 17: Correlação entre os resultados obtidos em MEIA (Axsym®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 12; amostras reativas, n = 38; baixa reatividade, n = 6; alta reatividade, n = 32.

Resultados

62

4.3 Análise estatística da correlação entre os métodos estudados

Para avaliar a relevância estatística da expressão dos resultados sorológicos em

valores de relação S/Co, as amostras sorologicamente reativas em cada método

foram separadas em dois grupos: Grupo (a) constituído por amostras

sorologicamente reativas cujos resultados não foram confirmados nos métodos de

biologia molecular; e Grupo (b) constituído por amostras, cujos resultados

sorológicos foram confirmados pelos métodos de PCR.

Os valores de relação S/Co de cada grupo, para cada método, foram submetidos à

análise estatística pelo teste de Mann-Whitney. A tabela 7 apresenta os resultados

estatísticos obtidos para os dois grupos em cada um dos métodos sorológicos.

Tabela 7: Resultados estatísticos descritivos obtidos para os grupos: (a) Constituído de amostras cujos resultados sorológicos reativos não se confirmaram em PCR; (b) Constituído de amostras cujos resultados sorológicos reativos confirmaram-se em PCR. Resultados expressos em relação S/Co.

Método

Parâmetro

Grupo (a)

Grupo (b) n 10 29

Média 3,64 5,19 Mediana 4,30 5,13 Mínimo 1,16 4,77 Máximo 5,40 6,21


ELISA colorimétrico (MUREX®)

IC (99%) 2,13 a 4,76 5,03 a 5,33

n 11 29 Média 12,18 24,54



Quimioluminescência (Vitros ECi® – Ortho Clinical Diagnostics)

IC (99%) 5,95 a 17,42 22,97 a 25,67

n 9 29 Média 30,87 110,22



MEIA (Axsym® – Abbott)

IC (99%) 2,82 a 62,66 92,75 a 122,04

Resultados

63

A análise da associação entre os resultados dos dois métodos baseados em PCR e

cada um dos três métodos sorológicos foi estatisticamente significante como pode

ser observado na figura 18.

Figura 18: Representação estatística da associação entre os valores de relação S/Co obtidos nos dois grupos de amostras reativas e o método de PCR. Para cada método os valores de “p” (probabilidade de significância) foram: ELISA x PCR: p = 0,0244; CIA x PCR: p = 0,0007; MEIA x PCR: p = 0,0001).

Os valores de CT obtidos pelo método de PCR em tempo real foram analisados

quanto à estatística descritiva. Os resultados são apresentados na tabela 8.

Resultados

64

Tabela 8: Estatística Descritiva – PCR em Tempo Real - TaqMan® Applied Biosystems. Valores expressos em CT(“Cicle timing”, ponto em número de ciclos de amplificação onde a amostra apresenta fluorescência considerada positiva pelo sistema de detecção.

Parâmetro Amostras Positivas para RNA-VHC (n=29) Média 29,98

Mediana 29,20 Mínimo 24,12 Máximo 39,43

Desvio Padrão 4,45 Intervalo de confiança (90%) 28,57 a 31,38 Intervalo de confiança (95%) 28,28 a 31,67 Intervalo de confiança (99%) 27,69 a 32,26

Os valores de CT, obtidos para cada amostra positiva em PCR em tempo real, foram

pareados com os valores de relação S/Co da respectiva amostra em cada um dos

três métodos sorológicos. O pareamento foi analisado pelo teste de Correlação

Linear de Pearson, utilizando o programa BioEstat 4.0. Coeficientes de correlação (r)

de 0 a 0,25 (ou – 0,25) indicam pouca ou nenhuma correlação, de 0,25 a 0,50 (ou –

0,25 a – 0,50) pequeno grau de correlação, de 0,50 a 0,75 (ou – 0,50 a -0,75)

moderado a bom grau de correlação e de 0,75 a 1 (ou – 0,75 a – 1) muito bom a

excelente grau de correlação (DAWSOM; TRAPP, 2004). Os resultados obtidos são

demonstrados na figura 19.

Resultados

65

Figura 19: Representação estatística da Correlação Linear de Pearson em os valores de CT no método de PCR em tempo real e os valores em S/Co de cada método sorológico estudado. Em nenhum dos métodos foi encontrada correlação estatisticamente significativa.

Os resultados obtidos pelo teste de correlação linear de Pearson, demonstraram não

existir correlação estatística significativa entre os valores apresentados.

Resultados

66

4.4 Immunoblotting

As amostras que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os

métodos moleculares, no total 11 amostras, foram submetidas à análise pelo método

de “immunoblotting”. Os resultados apresentaram boa correlação com os métodos

sorológicos, para as amostras de alta reatividade e pouca correlação com as

amostras de baixa reatividade. Houve discordância entre o método de

“immunoblotting” e os métodos moleculares em várias amostras. A tabela 9

apresenta os resultados obtidos.

Tabela 9: Comparação entre os resultados de “immunoblotting” e os demais sorológicos e moleculares, para as amostras que apresentaram resultados discrepantes entre estes. Resultados dos métodos sorológicos expressos em relação S/Co.

Amostras

CIA

ELISA

MEIA

PCR

Real-Time

PCR

Amplicor®

Immunoblotting

017

24,9 (R)

5,40 (R)

57,09 (R)

Negativo

Negativo Positivo

(Bandas: C1, C2, NS3, NS4 e NS5)

018

12,0 (R)

4,70 (R)

5,98 (R)

Negativo

Negativo

Positivo (Bandas: C1, C2, E2,

NS3)

024

25,9 (R)

5,3 (R)

98,77 (R)

Negativo

Negativo Positivo

(Bandas: C1, C2, E2, NS3, NS4 e NS5)

025

18,8 (R)

4,94 (R)

3,00 (R)

Negativo

Negativo

Positivo (Bandas: C1, C2 e NS5)

034

5,28 (R)

2,85 (R)

2,30 (R)

Negativo

Negativo

Positivo (Bandas: C1, C2 e NS3)

036

1,82 (R)

1,16 (R)

1,33 (R)

Negativo

Negativo

Positivo (Bandas: E2 e NS3)

037

24,3 (R)

5,40 (R)

95,44 (R)

Negativo

Negativo

Positivo (Bandas: C1, C2, E2, NS3

e NS4)

044

1,37 (R)

1,28 (R)

0,84 (I)

Negativo

Negativo

Negativo (Bandas: Muito fraca C1 e

C2)

049

9,39 (R)

3,9 (R)

11,04 (R)

Negativo

Negativo

Indeterminado (Bandas: NS3)

054

7,63 (R)

1,50 (R)

2,92 (R)

Negativo

Negativo

Indeterminado (Bandas: NS3)

056

2,63 (R)

0,41 (NR)

0,85 (I)

Negativo

Negativo

Negativo

Critérios de interpretação: (R) reagente, (NR) não reagente e (I) inconclusivo (conforme os fabricantes dos ensaios sorológicos).

Resultados

67

77.8%

88.9%100.0%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Todas as amostras (n = 11)

Con

cord

ânci

a (%

)

CIA ELISA MEIA

A

100.0% 100.0% 100.0%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Amostras com alta reatividadesorológica (n = 6)

Con

cord

ânc

ia (%

)

CIA ELISA MEIA

B

50.0%

75.0%

100.0%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Amostras com baixa reatividadesorológica e não reativas (n = 5)

Co

nco

rdân

cia

(%)

CIA ELISA MEIA

C

Figura 20: Comparação entre os resultados dos métodos sorológicos e o método de “immunoblotting”, considerando todas as amostras que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os métodos moleculares (A); amostras que apresentaram alta reatividade sorológica (B) e amostras que apresentaram baixa reatividade sorológica e amostras não reativas (C). Foram desconsiderados os resultados considerados “indeterminados” ou “inconclusivos”.

A figura 20 apresenta a concordância entre os resultados dos métodos sorológicos e

o método de “immunoblotting” para estas amostras. Os métodos moleculares e o

método de “immunoblotting” somente concordaram em 20% destas amostras,

desconsiderando-se as amostras que obtiveram resultados “indeterminados”.

Discussão

Discussão

69

5 DISCUSSÃO

Considerando-se que o delineamento deste estudo não buscou estabelecer

parâmetros epidemiológicos para a população estudada, como por exemplo, a

prevalência da infecção pelo VHC, o grupo controle de 25 % do número de amostras

reagentes foi selecionado, de forma aleatória, dentre a população inicial deste

estudo, porém com sorologia não reativa para o VHC. O objetivo da inclusão deste

grupo foi observar o comportamento dos demais métodos sorológicos avaliados

além do método de triagem inicial (Quimioluminescência – Vitros ECi®) e comparar

estes métodos entre si e com metodologias de caráter confirmatório. Sob este

prisma e à luz de outros estudos anteriormente publicados, a expectativa era de que

quanto maiores fossem os valores obtidos nas leituras dos testes reativos, menores

seriam as chances de tratar-se de um resultado falso-positivo.

Os dados apresentados pelo CDC em 2003 foram corroborados em nossas análises.

Para resultados considerados pelo CDC como de baixa reatividade, todos os testes

sorológicos apresentaram pouca ou nenhuma concordância com os métodos

moleculares. Tomando por base a detecção do RNA-VHC por PCR na amostra

como confirmação da infecção, apenas uma amostra no método de MEIA (amostra

055) teve seu resultado sorológico, considerado de baixa reatividade, confirmado.

Nos outros dois métodos sorológicos estudados, nenhuma amostra de baixa

reatividade teve seu resultado confirmado pelos métodos de biologia molecular. Esta

tendência tem sido também demonstrada por outros autores (OETHINGER et al,

2005; MOREIRA et al, 2005; REN et al, 2005). Tendo em vista, que os métodos

sorológicos para detecção de anticorpos contra o VHC surgiram no início da década

de 1990 com a intenção de triagem de doadores de sangue, não é surpresa que os

mesmos privilegiem a sensibilidade. Este aspecto pode levar uma elevação no

número de resultados falso-positivos, no que se refere à presença do vírus e não de

anticorpos residuais, como ficou constatado pela análise em “immunoblotting”, onde

apenas 4 amostras (044, 049, 054 e 056) apresentaram resultados caracterizados

como falso-positivos.

Discussão

70

Amostras com resultados considerados altamente reativos, pelo critério apresentado

pelo CDC em 2003, apresentaram elevada concordância com os métodos

moleculares. Este valor ficou abaixo dos 95% mencionados pelo CDC, entretanto, os

critérios adotados pelo CDC referem-se à detecção de anticorpos anti-VHC e não,

obrigatoriamente, da presença do vírus. Desta forma, os valores obtidos pelos

métodos MEIA (87,5%), CIA e ELISA (82,9% para ambos), ao serem avaliadas no

método de “immunoblotting” apresentaram boa correlação com este, sendo que

amostras com sorologia altamente reativa apresentaram elevada concordância. No

entanto, apenas as amostras discordantes entre sorologia e PCR foram avaliadas no

“immunoblotting”, o que não permite estabelecer com precisão a magnitude desta

correlação. A utilização do método de “immunoblotting” no estudo se justifica,

exatamente, na avaliação da reatividade sorológica de cada método na ausência de

evidenciação molecular do RNA viral. As amostras reativas sorologicamente no

método de “immunoblotting” demonstram especificidade da reatividade dos

anticorpos presentes na amostras, descartando-se assim a possibilidade de

reatividade cruzada com anticorpos produzidos contra outros patógenos.

Para as amostras sorologicamente não reativas, todos os testes apresentaram

excelente concordância entre si e com os métodos moleculares, embora o número

reduzido de amostras não reagentes, inseridas como controle, não nos permita

estabelecer uma inferência mais aprofundada neste sentido. De toda forma, merece

menção o fato de que nenhum teste apresentou resultado falso-negativo para as 50

amostras estudadas.

A análise dos resultados sorológicos aponta para uma melhor correlação do método

MEIA com os métodos moleculares, em detrimento dos outros dois métodos

sorológicos estudados. Particularmente, a análise dos resultados das amostras

discordantes entre os métodos sorológicos e moleculares, revelou que, embora

tenha sido observada relevância estatística no uso da relação S/Co, classificando-os

em alta reatividade e baixa reatividade, resultados com alta reatividade também

apresentaram discordância com métodos moleculares. Este achado pode estar

relacionado com a questão de que a detecção de anticorpos anti-VHC, pode

permanecer elevada mesmo após o “clareamento” da infecção, que pode ocorrer em

Discussão

71

cerca de 20 % dos casos. Esta situação é normalmente definida como “cicatriz

sorológica”. Os testes moleculares estudados apresentaram resultados equivalentes,

tanto o método de PCR em tempo real com detector TaqMan®, quanto a PCR

qualitativa Amplicor®, demonstraram concordância entre si e com a maioria absoluta

dos resultados sorológicos. Entretanto, um pequeno grupo de amostras, com

resultados sorológicos fortemente reativos, apresentou-se negativo para RNA-VHC.

Consideramos relevante, a evidenciação de que os processos de diálise possam

estar relacionados com a diminuição da circulação sangüínea de partículas virais,

conforme descrito anteriormente (FURUSYO et al, 2000; FABRIZI et al, 2003;

OKUDA et al, 2005). Esta constatação demonstra que a não evidenciação de

material genético viral em amostra de sangue periférico, não pode ser utilizada como

critério absoluto para a total exclusão da presença do vírus no organismo. Nos casos

de pacientes de hemodiálise, resta saber se o vírus realmente não está mais

presente, apesar do resultado sorológico ainda fortemente reativo ou se o mesmo

apenas não se encontra circulante no sangue periférico. A constatação de que a

maioria dos resultados sorológicos de alta reatividade (no caso do método MEIA, a

totalidade dos resultados), ter se confirmado no método de “immunoblotting”, reforça

os aspectos mencionados por outros autores. Esta questão pode ser melhor

investigada por meio de biópsia hepática e pesquisa do material genético do VHC

nesta amostra, procedimento invasivo e de difícil realização.

Os resultados de ambos os métodos moleculares foram totalmente concordantes.

No entanto, algumas ressalvas merecem menção, como o fato da possibilidade de

não detecção pela inativação do RNA da amostra, uma vez que o mesmo é muito

mais lábil do que o DNA. Para evitar que esta possibilidade influenciasse no

resultado final, todas as amostras do grupo de estudo com resultado negativos em

qualquer um dos dois métodos, foram recoletadas e reprocessadas, sendo

resguardadas todas as precauções quanto à preservação das amostras. Este

procedimento revelou-se importante em diversos casos onde a primeira análise

apresentou resultado negativo e uma nova análise, com nova amostra, apresentou

reatividade. Nestes casos, foi coletada uma terceira amostra, visando à confirmação

do resultado.

Discussão

72

Oethinger e col. (2005) reportaram que nenhuma amostra reativa no sistema

analítico Vitros ECi® (Ortho), com relação S/Co < 5,0, foi confirmada por PCR (n=83)

ou “immunoblotting” (n=163), em uma população de militares considerada de

prevalência média (8 a 10 %) pelo CDC. Os autores sugerem, inclusive, que testes

sorológicos deste sistema com relação S/Co < 5,0 não sejam seguidos de testes

complementares e sejam reportados como não reagentes, visando a economia de

recursos, uma vez que nesta faixa de resultado o VPP do testes é inferior a 1%. Esta

opinião não é compartilhada neste nosso estudo, tendo em vista que a pesquisa de

anticorpos anti-VHC ainda é o marcador mais utilizado e por vezes o único, para

triagem da infecção pelo VHC em nosso país, mesmo que nossos resultados

estejam em acordo com a proposta apresentada.

A conversão sorológica de não-reagente para reagente ainda é, atualmente, a forma

de identificar a infecção aguda pelo VHC. Valores baixos de relação S/Co, podem

expressar momentos iniciais da infecção, período onde a viremia é notadamente

mais elevada e conseqüentemente, a infectividade. Em serviços de hemodiálise,

assim como em bancos de sangue, a triagem deve permitir a detecção de infecção

pelo VHC o mais precocemente possível. Entretanto, nestes casos, fatalmente os

testes utilizados apresentaram um maior percentual de resultados falso-positivos.

Neste contexto, os testes suplementares de confirmação são fundamentais para o

estabelecimento do diagnóstico.

Conclusões

Conclusões

74

6 CONCLUSÕES

1. Em relação à relevância estatística da utilização do valor da relação S/Co, os

resultados demonstraram ser estatisticamente significante o uso deste valor.

Desta forma, a estratificação da reatividade sorológica, em baixa reatividade e

alta reatividade, demonstra ser uma abordagem relevante. Este aspecto

reforça a recomendação de valorizar este índice como critério auxiliar na

interpretação dos resultados. Portanto, concluímos serem aplicáveis as

recomendações do CDC no que se refere à detecção de anticorpos anti-VHC.

Mesmo amostras com resultados sorológicos de alta reatividade,

apresentaram resultados moleculares negativos, para a pesquisa de RNA do

VHC, portanto, ao serem reportadas como reativas devem ser seguidas de

recomendação para execução de métodos confirmatórios para infecção,

como recomenda o CDC (CDC, 2003).

2. A não ocorrência de resultados falso-negativos nas amostras avaliadas,

mesmo considerando ser o universo de amostras não-reativas reduzido,

salienta uma característica importante dos métodos sorológicos atuais para

diagnóstico de hepatite C, a elevada sensibilidade. Entretanto, quanto às

amostras com resultados reativos, os métodos sorológicos apresentaram

concordância inferior ao esperado, tendo o método MEIA apresentado menor

concordância com os demais métodos sorológicos (CIA e ELISA), porém

apresentado maior correlação com os métodos moleculares e com o método

de “immunoblotting”, entre as amostras discordantes.

3. A demonstração de amostras com resultados sorológicos de alta reatividade

nos três métodos sorológicos estudados e reatividade concomitante no

método de “immunoblotting”, porém com PCR negativa para RNA do VHC, vai

de encontro aos resultados apresentados por diversos autores (FURUSYO et

al, 2000; FABRIZI et al, 2003; OKUDA et al, 2005), quanto à diminuição da

viremia em pacientes em tratamento de hemodiálise. A confirmação desta

hipótese somente poderia ser efetuada com a pesquisa do RNA do VHC

Conclusões

75

em tecido hepático, o que poderia descartar a possibilidade de cura da

infecção e conseqüentemente, tratar-se os anticorpos detectados de uma

“cicatriz sorológica” ou memória imunológica. Não foi evidenciada correlação

significativa entre os valores de CT, obtidos pelo método de PCR em tempo

real e os valores de relação S/Co, obtidos pelos métodos sorológicos. Este

aspecto indica não haver relação direta entre a viremia e a quantidade de

anticorpos circulantes contra o vírus, uma vez que o valor de CT é um

indicador, inversamente proporcional, da viremia.

4. Finalmente, em suma, podemos concluir que a estratégia de estratificação

dos resultados sorológicos, em alta e baixa reatividade, constitui-se de uma

abordagem consistente, inclusive do ponto de vista estatístico. A valorização

dos resultados, desta forma estratificados, permite uma abordagem mais

racional dos mesmos. Testes sorológicos realizados por diferentes métodos,

não devem ser utilizados em um mesmo diagnóstico, pois diferenças

significativas foram encontradas entre os métodos estudados. Os testes

suplementares como “immunobloting” e testes moleculares, continuam, em

nossa interpretação, fundamentais para a conclusão diagnóstica,

especialmente em resultados de baixa reatividade sorológica.

Referências

Referências

77

7 REFERÊNCIAS

Albuquerque AC, Coêlho MR, Lopes EP, Lemos MF, Moreira RC. Prevalence and

risk factors of hepatitis C virus infection in hemodialysis patients from one center in

Recife, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(5):467-70.

Amplicor® Hepatitis C Vírus Test, version 2.0 – Instructions for use – Doc. Ver. 4.0 –

USA, 06/2006.

Applied Biosystems 7300/7500/7500 - Fast Real-Time PCR System Absolute

Quantification Getting Started Guide. 2005.

Axsym® System Anti-HCV 3.0 – Instructions for use – List. N° 5C36 – 34.3443/R5 –

USA. Abbott Laboratories, 2004.

Bar-Shany S, Green MS, Shinar E. False positive tests for anti-hepatitis C antibodies

and the problem of notifying blood donors. Int J Epidemiol. 1996;25:674-8

Brasil. Ministério da Saúde. Hepatites Virais: O Brasil está atento / Ministério da

Saúde, Secretaria de Políticas de Saúde, Programa Nacional de Hepatites Virais –

(Série A. Normas e Manuais Técnicos) – Brasília: Ministério da Saúde, 2002. 24p.

Busek S, Oliveira G. Molecular epidemiology of the hepatitis C virus in Brazil. Genet

Mol Res. 2003;2(1):117-23.

Campiotto S, Pinho JR, Carrilho FJ, Da Silva LC, Souto FJ, Spinelli V, Pereira LM,

Coelho HS, Silva AO, Fonseca JC, Rosa H, Lacet CM, Bernardini AP.. Geographic

distribution of hepatitis C virus genotypes in Brazil. Braz J Med Biol Res. 2005;38(1):

41-49.

Referências

78

Carneiro MA, Teles SA, Dias MA, Ferreira RC, Naghettine AV, Silva SA, Lampe E,

Yoshida CF, Martins RM. Decline of hepatitis C infection in hemodialysis patients in

Central Brazil: A ten years of surveillance. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(4):345-

9.

Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidelines for laboratory testing

and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003;52(Nº RR-3): 16p.

Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Recommendations for

Preventing Transmission of Infections Among Chronic Hemodialysis Patients.

MMWR 2001;50(Nº RR05):43p.

Chevaliez S, Pawlotsky JM. Use of virologic assays in the diagnosis and

management of hepatitis C virus infection. Clin Liver Dis. 2005;9(3):371-82.

Colin C, Lanoir D, Touzet S, Meyaud-Kraemer L, Bailly F, Trepo C; HEPATITIS

Group. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C antibodies detection

assays: an analysis of the literature. J Viral Hepat. 2001;8:87-95.

Dawson B, Trapp RG. Basic & clinical biostatistics. 4.ed. New York: LANGE, 2004.

438p. p.48-51.

Eisen-Vandervelde AL, Waggoner SN, Yao ZQ, Cale EM, Hahn CS, Hahn YS.

Hepatitis C virus core selectively suppresses interleukin-12 synthesis in human

macrophages by interfering with AP-1 activation. J Biol Chem. 2004;279(42):43479-

86.

Fabrizi F, Bunnapradist S, Lunghi G, Martin P. Kinetics of hepatitis C virus load

during hemodialysis: novel perspectives. J Nephrol. 2003;16(4):467-75.

Fabrizi F, Lunghi G, Ganeshan SV, Martin P, Messa P. Hepatitis C virus infection and

the dialysis patient. Semin Dial. 2007;20(5):416-22.

Referências

79

Ferreira AW, Ávila SLM. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas

e Auto-Imunes. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 443 p.

Furusyo N, Hayashi J, Kanamoto-Tanaka Y, Ariyama I, Etoh Y, Shigematsu M,

Kashiwagi S. Liver damage in hemodialysis patients with hepatitis C virus viremia: a

prospective 10-year study. Dig Dis Sci. 2000;45(11):2221-8.

Gonçalves PL, Cunha CB, Busek SC, Oliveira GC, Ribeiro-Rodrigues R, Pereira FE.

Detection of hepatitis C virus RNA in saliva samples from patients with seric anti-

HCV antibodies. Braz J Infect Dis. 2005;9(1):28-34.

Hayashi H, Okuda K, Yokosuka O, Kobayashi S, Yokozeki K, Ohtake Y, Irie Y.

Adsorption of hepatitis C virus particles onto the dialyzer membrane. Artif Organs.

1997;21(10):1056-9.

Hussein MM, Mooij JM, Hegazy MS, Bamaga MS. The impact of polymerase chain

reaction assays for the detection of hepatitis C virus infection in a hemodialysis unit.

Saudi J Kidney Dis Transpl. 2007;18(1):107-13.

Hwang SJ. Hepatitis C virus infection: an overview. J Microbiol Immunol Infect.

2001;34(4):227-34.

Ishida H, Tanabe K, Tokumoto T, Shimizu T, Shimmura H, Yoshioka T, Toma H.

Hepatitis C virus decreases in patients with maintenance hemofiltration therapy. Artif

Organs. 2004;28(3):316-8.

Jadoul M, Poignet JL, Geddes C, Locatelli F, Medin C, Krajewska M, Barril G,

Scheuermann E, Sonkodi S, Goubau P; HCV Collaborative Group. The changing

epidemiology of hepatitis C virus (HCV) infection in haemodialysis: European

multicentre study. Nephrol Dial Transplant. 2004;19(4):904-9.

Referências

80

Janeway, CA; Travers, P; Walport, M; Shlomchik, M. Imunobiologia: o sistema

imune na saúde e na doença. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. 767 p., p. 639 –

660.

Kalantar-Zadeh K, Miller LG, Daar ES. Diagnostic discordance for hepatitis C virus

infection in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis. 2005;46(2):290-300.

Keeffe EB. Hepatitis C virus. Clin Liver Dis. 2005;9:xi-xiii (preface).

Large MK, Kittlesen DJ, Hahn YS. Suppression of host immune response by the core

protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. J

Immunol. 1999;162(2):931-8.

Lazzarini FAS, Andrade D, Rossi LA, Ferraz, AEP. Incidência de soroconversão para

o vírus da hepatite C após a implementação de programa de prevenção e controle

em unidade de hemodiálise. Rev. Latino-Am. Enfermagem. 2000;8(5):7-12.

Medeiros MTG, Lima JMC, Lima JWO. Prevalência e fatores associados à hepatite C

em pacientes de hemodiálise. Rev. Saúde Pública. 2004;38(2):187-193.

Moreira RC, Lemos MF, Longui CA, Granato C. Hepatitis C and hemodialysis: a

review. Braz J Infect Dis. 2005;9(4):269-75.

Murex anti-HCV (versão 4.0) – Instruções de uso – REF: VK47/48 versão 4.0 –

7F51-01/7F51-02 – Pub n° C03VK47SP – UK, 2002.

Naghettini AV, Daher RR, Martin RMB. Soroprevalência do vírus da hepatite C na

população em diálise de Goiânia, GO. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1997;30(2):113-

117.

Oethinger M, Mayo DR, Falcone J, Barua PK, Griffith BP. Efficiency of the ortho

VITROS assay for detection of hepatitis C virus-specific antibodies increased by

elimination of supplemental testing of samples with very low sample-to-cutoff ratios. J

Referências

81

Clin Microbiol. 2005; 43(5): 2477-80.

Okuda K, Hayashi H, Yokozeki K, Irie Y. Destruction of hepatitis C virus particles by

haemodialysis. Lancet. 1996;347(9005):909-10.

Okuda K, Yokosuka O. Natural history of chronic hepatitis C in patients on

hemodialysis: Case control study with 4-23 years of follow-up. World J Gastroenterol.

2004;10(15):2209-2212

Parolin C, Corso AD, Alberghina L, Porro D, Branduardi P. Heterologous production

of five Hepatitis C virus-derived antigens in three Saccharomyces cerevisiae host

strains. J Biotechnol. 2005;120(1):46-58.

Pires-Alves M, Novais CM. PCR em tempo real – Uma inovação tecnológica da

reação em cadeia da polimerase. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.

2004;33:10-13.

Polywka S, Schröter M, Feucht HH, Zöllner B, Laufs R. Relevance of reactivity in

commercially available hepatitis C virus antibody assays.. J Clin Microbiol.

2001;39(4):1665-8.

QIAamp® MinElute® Virus Spin Kit– Handbook – 2.ed. – 04/2005.

Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus

infection. Nat Rev Immunol. 2005;5(3):215-29.

Ren FR, Lv QS, Zhuang H, Li JJ, Gong XY, Gao GJ, Liu CL, Wang JX, Yao FZ,

Zheng YR, Zhu FM, Tiemuer MH, Bai XH, Shan H. Significance of the signal-to-cutoff

ratios of anti-hepatitis C virus enzyme immunoassays in screening of Chinese blood

donors. Transfusion. 2005;45(11):1816-22.

Referências

82

Santana GO, Cotrim HP, Mota E. Anticorpo contra o vírus C da hepatite em

pacientes sob programa de hemodiálise em Salvador, BA, Brasil. Arq. Gastroenterol.

2001;38(1):24-31.

Shamshirsaz AA, Kamgar M, Bekheirnia MR, Ayazi F, Hashemi SR, Bouzari N,

Habibzadeh MR, Pourzahedgilani N, Broumand V, Shamshirsaz AH, Moradi M,

Borghei M, Haghighi NN, Broumand B. The role of hemodialysis machines dedication

in reducing Hepatitis C transmission in the dialysis setting in Iran: a multicenter

prospective interventional study. BMC Nephrol. 2004;5(1):13.

Soares JF, Siqueira AL. Introdução à estatística médica. 2.ed. Belo Horizonte:

COOPMED, 2002. 300 p., p.174-219.

Souza KP, Luz JA, Teles SA, Carneiro MA, Oliveira LA, Gomes AS, Dias MA, Gomes

SA, Yoshida CF, Martins RM. Hepatitis B and C in the hemodialysis unit of Tocantins,

Brazil: serological and molecular profiles. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2003;98(5):599-

603.

Strauss E. Hepatite C. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2001;34(1):69-82.

Tengan, FM, Eluf-Neto, J, Cavalheiro NP, Barone AA. Sexual transmission of

hepatitis C virus. Rev. Inst. Med. Trop. 2001;43(3):133-137.

Thomas DL, Seeff LB. Natural history of hepatitis C. Clin Liver Dis. 2005;9(3):383-98.

Yao ZQ, Eisen-Vandervelde A, Waggoner SN, Cale EM, Hahn YS. Direct binding of

hepatitis C virus core to gC1qR on CD4+ and CD8+ T cells leads to impaired

activation of Lck and Akt. J Virol. 2004;78(12):6409-19.

Yao ZQ, Nguyen DT, Hiotellis AI, Hahn YS. Hepatitis C virus core protein inhibits

human T lymphocyte responses by a complement-dependent regulatory pathway. J

Immunol. 2001;167(9):5264-72.

Referências

83

Vitros Immunodiagnostic Products Anti-HCV Reagent Pack – Instructions for use,

version 2.0 – Pub n° J03805, USA. Ortho Clinical Diagnostics, 2003

Zachary P, Ullmann M, Djeddi S, Meyer N, Wendling MJ, Schvoerer E, Stoll-Keller F,

Gut JP. Evaluation of three commercially available hepatitis C virus antibody

detection assays under the conditions of a clinical virology laboratory. J Clin Virol.

2005;34(3):207-10.

Anexo

Anexo

85

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Título do Projeto:

PROPOSTA DE PROCEDIMENTO CONFIRMATÓRIO NA TRIAGEM

SOROLÓGICA PARA HEPATITE C EM PACIENTES DE HEMODIÁLISE NA

REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA-ES

DIREITOS DO SUJEITO DA PESQUISA (SEUS DIREITOS): Este termo de consentimento tem a função de informar você sobre o projeto de pesquisa que você está sendo convidado(a), neste momento, a participar. Esta pesquisa pretende estudar a possibilidade de ser desenvolvido um teste confirmatório nos exames de sangue sorológicos para a hepatite C, exames estes que você normalmente já realiza periodicamente como parte do seu tratamento. Após você ser devidamente informado(a) dos objetivos deste estudo, suas perguntas terem sido devidamente esclarecidas e se você concordar em participar do estudo, será solicitado a você que assine este termo de consentimento. Você receberá também uma cópia deste termo de consentimento para que possa guardá-la. Neste momento você está sendo informado(a) de que o estudo que você está sendo convidado a participar não implica em nenhum procedimento ou necessidade de coleta de sangue ou outros materiais além das coletas de sangue que já são normalmente realizadas para realização de seus exames periódicos. A sua participação neste estudo é voluntária e, além disso, você poderá solicitar que quer deixar o estudo em qualquer momento, mesmo após ter concordado em participar do mesmo. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO

O estudo que você está sendo convidado(a) a participar, visa observar possibilidades de melhorar o diagnóstico sorológico da hepatite C. A hepatite C é uma doença contagiosa e todos os pacientes que realizam hemodiálise, juntamente com pacientes que recebem transfusão de sangue entre outros, são considerados grupos de maior risco em contrair esta doença. Periodicamente você realiza exames para avaliar se existe a presença de anticorpos em seu sangue contra o vírus da hepatite C. Um diagnóstico rápido e seguro da presença do vírus, em um paciente que realiza hemodiálise, diminui a possibilidade de se passar o vírus da hepatite C para outro paciente. Por isso, um estudo como esse que avalia a possibilidade de melhorar o diagnóstico da hepatite C por meio de exames de laboratório é importante. RISCO EM PARTICIPAR DO ESTUDO Você não estará exposto a nenhum risco por participar deste estudo. As amostras de sangue que serão utilizadas neste estudo serão as amostras de sangue normalmente coletadas, em seus exames periódicos. CONFIDENCIALIDADE Suas informações pessoais, seu nome e os resultados de seus exames são absolutamente CONFIDENCIAIS, isto é, não serão divulgados para ninguém e

Anexo

86

apenas o pesquisador responsável pelo projeto, terá acesso aos seus dados. No estudo, sua amostra de sangue será identificada com um número de participação, desta forma seu nome não será utilizado de forma alguma em nenhum relatório ou publicação sobre este estudo. BENEFÍCIOS POR PARTICIPAR DESTE ESTUDO Ao participar deste estudo, dirigido especificamente apenas a pacientes de serviços de hemodiálise, você estará sendo indiretamente beneficiado por quaisquer resultados positivos que possam ser obtidos com esta pesquisa. Bem como estar beneficiando demais pacientes na mesma condição. CUSTOS Nenhum custo existe por participar deste estudo. Você não receberá nenhuma remuneração por participar deste estudo, mesmo por que isto é proibido no Brasil. PERGUNTAS Se, depois de concordar em participar do estudo, você ainda tiver alguma pergunta você poderá fazê-la através do telefone diretamente ao pesquisador responsável pelo estudo, o Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues, pelos telefones (27) 3335-7210 ou (27) 3337-7206. Se você tiver alguma dúvida ou pergunta sobre os seus direitos como voluntário deste estudo, você poderá contactar o Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, Presidente do Comitê de Ética em Pesquisa do Centro Biomédico da UFES no telefone (27) 3335-7243. CONSENTIMENTO A SUA PARTICIPAÇÃO NESTE ESTUDO É VOLUNTÁRIA. Você tem o direito de recusar ou de se retirar do estudo a qualquer momento sem riscos para o seu tratamento. TERMO DE CONSENTIMENTO: Eu recebi uma cópia deste Termo de Consentimento e sei que uma cópia ficará guardada no meu arquivo do estudo. Eu fui informado e entendi que minha participação no estudo é VOLUNTÁRIA e que posso deixar o estudo a qualquer momento que quiser. Eu entendo que ao assinar ou colocar minha impressão digital no espaço abaixo, estou concordando em participar deste estudo nos termos estabelecidos neste documento. ___________________________ __________________________ ________ Assinatura ou impressão digital do voluntário Nome do Voluntário Data e Hora Eu expliquei os objetivos deste estudo ao voluntário. Tenho plena convicção que ela/ela entendeu os objetivos, riscos e benefícios em potencial da sua participação no estudo. _________________________ RODRIGO RIBEIRO RODRIGUES ______________ Assinatura do Pesquisador Nome do Pesquisador Data e Hora

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO ... - sapili.org · Renato Manfredini Júnior Ao Professor, Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues, orientador desta dissertação, meu agradecimento