UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DEPARTAMENTO DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA –

PIBIC/CNPq e PIBIC/UFPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

PERÍODO: Ago/2014 a Jul/2015

( ) PARCIAL

(X) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Controle químico de qualidade na cadeia produtiva da

mandioca e do mel da região amazônica

Nome do Orientador: Kelly das Graças Fernandes Dantas

Titulação do Orientador: Doutora (Pós-Doutora)

Departamento: Química

Unidade: Instituto de Ciências Exatas e Naturais

Título do Plano de Trabalho: Determinação de Ca, Mg, Na, K, e P em pólen usando

radiação assistida por micro-ondas.

Nome do Bolsista: Monica Da Cruz Lopes

Tipo de Bolsa: (X) CNPq

( ) PIBIC/UFPA

1- INTRODUÇÃO

O pólen (do grego “pales”= “farinha” ou “pó”) é o conjunto de pequenos grãos

produzidos pelas flores das plantas mais evoluídas do sistema biológico vegetal, que são

os elementos reprodutores masculinos, onde se encontram os gametas que vão fecundar os

óvulos, para em seguida os transformar em frutos. As abelhas recolhem o pólen para

posteriormente usá-lo como alimento para todas as etapas de evolução da colméia

(SATTLER, 2013).

Há tempos o pólen faz parte da dieta humana. No Brasil sua exploração se

intensificou no final da década de 80 e atualmente, vem ganhando atenção por englobar

nutrientes como carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídeos, vitaminas e minerais, além

de carotenóides e flavonóides, com isso estimulando o interesse de sua utilização como

alimento alternativo. Devido apresentar diversas substâncias que são essenciais para a

alimentação humana pesquisadores vem desenvolvendo trabalhos para legitimar seus

benefícios (MARTINS, 2010).

O principal uso de pólen é como suplemento alimentar, sendo considerado uma

fonte proteica de elevado valor biológico e rico em vitaminas antioxidantes (A, C e E), é

ainda usado em outros setores, seja na farmacologia como ingrediente em produtos apifito-

aromáticos (encapsulados, tinturas, óleos essenciais), na cosmética (filtros solares, cremes,

máscaras, batons, sabonetes, xampus), em alimentos (barras de cereais, chocolates,

bolachas, saladas, pastas), bem como na própria atividade apícola como alimento para as

abelhas em período de estiagem (MARTINS, 2010).

O pólen apícola utilizado para consumo humano ou animal é uma mistura floral

onde encontram-se reunidas as bolotas de grãos de coloração variável, indicando as

diversas espécies botânicas coletadas pelas abelhas. Essa variação ocasiona diferenças no

valor nutritivo do pólen e uma composição química altamente complexa e provavelmente

até agora não totalmente esclarecida, tendo condições de fornecer praticamente todas as

substâncias indispensáveis ao bom funcionamento do organismo humano (ALVES, 1997)

Apesar de inúmeros benefícios do pólen, poucos estudos envolvendo sua

composição química são encontrados na literatura. Sendo assim, é relevante avaliar

procedimentos de digestão para a determinação de constituintes inorgânicos em amostras

de pólen de abelha produzido no Estado do Pará.

2- JUSTIFICATIVA

Sendo considerado como um suplemento natural, o pólen é um dos produtos de

abelhas bastante valorizado no mercado, pois contém altos teores de nutrientes. Sua

composição é formada por carboidratos (13-55%), proteínas (10-40%), lipídeos (1-20%),

água (3-8%), minerais (500-3000 mg/100g), resinas, vitaminas (20-100mg/100g) e outros

compostos (FUNARI et al., 2003).

A composição química do pólen pode variar de acordo com a espécie vegetal,

condições ambientais, idade e tipo nutricional da planta quando o pólen está

desenvolvendo, em diferentes regiões, e diferentes períodos do ano (FUNARI et al., 2003).

O pólen estimula o interesse dos pesquisadores devido apresentar substâncias

bioativas e a possibilidade de seu uso na medicina. Este produto possui propriedades

antibacterianas e quantidades significativas de compostos fenólicos (flavonóides, ácidos

fenólicos e diterpenosfenólicos) que possuem ação antioxidante entre outras atividades

(MARTINS, 2010).

Visto que a região Amazônica possui imensa diversidade de espécies de plantas, a

mesma oferece uma grande variedade em tipos de pólen se comparada a outras regiões do

Brasil (SOUZA et al., 2004).

A espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS) é uma das técnicas

analíticas fundamentais na determinação de constituintes minerais em amostras de pólen

de abelha, este fato pode estar relacionado devido a sua simplicidade e reprodução de

resultados precisos, com custos acessíveis (SZCZESNA, 2007).

Com isso, torna-se relevante o desenvolvimento de procedimentos analíticos para

a determinação de constituintes inorgânicos em amostras de pólen de abelha usando ácido

nítrico diluído e radiação assistida por micro-ondas.

3-OBJETIVOS

3.1 - Objetivo geral

Desenvolvimento de um procedimento analítico de preparo de amostras usando ácido

nítrico diluído para determinação de Ca, Mg, Na e K por FAAS e a determinação de P por

espectrofotometria UV-VIS em amostras de pólen.

3.2- Objetivos específicos

- Desenvolvimento de procedimentos de preparo de amostras usando ácido nítrico diluído e

concentrado;

- Determinação de Ca, Mg, Na e K em amostras de pólen por FAAS;

-Determinação de P em amostras de pólen por espectrofotometria UV-VIS;

-Validação dos procedimentos analíticos utilizando estudos de adição e recuperação.

4-MATERIAIS E MÉTODOS

4.1- Instrumentos e acessórios

Um liofilizador (Modelo L101, Liotop, São Carlos, SP, Brasil) foi utilizado para

secagem das amostras, onde a umidade foi removida por um período de 72 horas (Figura

01).

FIGURA 01–Liofilizador L101.

Após a secagem, as amostras foram moídas usando um moinho criogênico (Modelo

Spex, 6770 Freezer/Mill, Estados Unidos) fazendo assim sua homogeneização e, obtendo,

portanto uma melhor representatividade a partir de pequenas massas de pólen (Figura 02).

FIGURA 02 –Moinho criogênico Spex.

O programa para pulverização das amostras de pólen seguiu 2 ciclos de moagem

com duração de 2 minutos a cada ciclo como está demonstrado na Tabela 01.

TABELA 01- Programa de moagem das amostras de pólen em moinho.

Etapas Tempo (min)

Pré-congelamento

Moagem

Congelamento

10

2

2

Em seguida, as amostras moídas foram digeridas em forno de radiação micro-ondas

com cavidade (Figura 03) modelo Start E (Milestone, Sorisole, Itália) usando frascos

fechados de teflon(TFM). O programa de aquecimento do forno de micro-ondas está

ilustrado na Tabela 02.

FIGURA 03- Forno de micro-ondas com cavidade Start E.

TABELA 02 – Programa de aquecimento do forno de micro-ondas para digestão de

amostras de pólen.

*Etapa de ventilação

Para a determinação de Ca, Mg, Na e K foi utilizado um espectrômetro de absorção

atômica com chama (Figura 04) modelo iCE 3300 (ThermoScientific, Reino Unido,

Etapas Tempo

(min)

Temperatura

(ºc)

Potência

(w)

1

2

3

10

15

50

180

180

0

800

800

0

Cambridge). As condições instrumentais obtidas nas análises são apresentadas na Tabela

03.

FIGURA 04 –Espectrômetro de absorção atômica com chama.

TABELA 03 – Condições instrumentais do FAAS para determinação dos teores totais de

Ca, Mg, Na e K em amostras de pólen de abelha.

Parâmetros Comprimento de onda

(nm)

Corrente da lâmpada

(mA)

Resolução espectral

(nm)

Ca

Mg

Na

K

422,7

385,2

330,3

766,5

5

4

5

10

0,5

0,5

0,2

0,5

Um espectrofotômetro UV-VIS (Figura 05) modelo GENESYS 10S UV-Vis

spectrofhotometer (Thermoscientific, Estados Unidos) foi utilizado para a determinação do

teor de fósforo em amostras de pólen de abelha.

FIGURA 05 –Espectrofotômetro UV- Visível.

4.2- Reagentes, soluções e amostras

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. As soluções analíticas foram

preparadas com água ultrapura (resistividade 18,2Ω) (Millipore, Sinergy, Estados Unidos).

Para a digestão das amostras as soluções foram preparadas utilizando ácido nítrico

a 65% m v-1 (Quimex, São Paulo, Brasil), purificado em um sistema de sub-destilação

(Berghof, modelo BSA 929-IR, Alemanha). Como reagente oxidante auxiliar foi utilizado

peróxido de hidrogênio 30% m m-1 (Impex, São Paulo, Brasil).

As soluções estoque contendo 1000 mg L-1 de Ca, Mg, K, Na e P (Sigma, São Paulo,

Brasil) foram preparadas a partir do padrão espectroscópico para absorção atômica.

As amostras de pólen foram fornecidas pela Embrapa Amazônia Oriental, sendo

coletadas em apiários localizados em alguns municípios do Estado do Pará.

Depois da coleta, as amostras (Tabela 04) foram entregues no Laboratório do Grupo de

Espectrometria Analítica Aplicada no prédio de Química Pesquisa- UFPA- Belém (PA).

TABELA 04- Origem das amostras e espécies de abelhas produtoras de pólen.

Amostras Origem Nome cientifico

PCAST 2 Castanhal Apis mellifera

PIGAÇU 1 Igarapé – Açu Apis mellifera

PCAST 1 Castanhal Melipona flavolineata

PCAST3 Castanhal Melipona fasciculata

PTRA Tracuateua Melipona flavolineata

PBET2 Belterra Scaptotrigona angustula

PIGAÇU 2 Igarapé – Açu Melipona fasciculata

4.3-Descontaminação dos materiais

Os materiais plásticos de polietileno, vidrarias e as ponteiras das micropipetas

foram lavados com água e sabão neutro, e posteriormente com água destilada – deionizada

antes do uso. Em seguida, foram imersos em um banho de solução de HCl 10%(v/v) por

24 h. Posteriormente, os mesmos foram lavados com água destilada e secos em capela de

fluxo laminar.

4.4 – Preparo das amostras

Os procedimentos de digestão utilizando diferentes volumes de ácido nítrico foram

aplicados à amostra PTRA devido ela obter coloração diferenciada entre as outras.

Para possibilitar a utilização de uma única amostra em todos os procedimentos, uma

grande quantidade da amostra PTRA foi liofilizada e moída em um moinho criogênico.

Uma massa de 0,250g da amostra em triplicata (n=3) foi pesada e transferida para os

frascos de digestão. Posteriormente, a amostra foi submetida ao programa de aquecimento do

forno de micro-ondas com cavidade como descrito na Tabela 02 empregando-se diferentes

volumes de reagentes para cada procedimento como descrito na Tabela 05.

Tabela 05-Procedimentos e volume de reagentes.

Procedimentos

HNO3 14 mol L-1

(v v-1)

H2O2 30%

(m m-1)

H2O

Procedimento 1

Procedimento 2

Procedimento 3

1,5 mL

3 mL

6 mL

3 mL

3 mL

3 mL

4,5 mL

3 mL

-

Os brancos analíticos foram constituídos da mesma mistura e volumes dos reagentes

aplicados à amostra e consequentemente do mesmo programa de aquecimento. Os digeridos

foram transferidos para frascos volumétricos e ajustados com água ultra pura para 14 mL.

5-RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1- Determinação dos constituintes inorgânicos

A princípio, uma amostra de pólen PTRA foi submetida ao programa de

aquecimento em forno de micro-ondas com cavidade apresentado na Tabela 02,

empregando-se três procedimentos diferentes de digestão. O peróxido de hidrogênio 30%

(m m-1) foi utilizado como agente oxidante auxiliar em todas as digestões. A Tabela 06

indica as concentrações encontradas para Ca, Mg, Na e K por FAAS. Os resultados

obtidos mostraram que todos os valores ficaram próximos entre si.

TABELA 06- Teores de Ca, Mg, Na e K determinados por FAAS em digeridos de

amostras de pólen usando diferentes procedimentos de decomposição (n=3).

Elementos Procedimento 1 Procedimento 2 Procedimento 3

Ca

Mg

Na

K

2768,84±269,20

804,47±1,49

<LOD

7928,51±246,05

2748,19±32,85

821,32±1,49

<LOD

7042,76±822,43

3057,22±301,08

829,75±66,18

<LOD

7261,82±27,62

As recuperações obtidas no teste de adição e recuperação para Ca, Mg, Na e K por FAAS

estão apresentadas na Tabela 07.

TABELA 07- Valores da adição e recuperação usando diferentes procedimentos de

decomposição.

Elementos Procedimento 1 Procedimento 2 Procedimento 3

Ca

Mg

Na

K

94,60%

*

119,8%

98,17%

126,72%

102,00%

*

97,40%

109,59%

105,2%

*

*

* Valores que não ficaram na faixa de 80% - 120%.

Visto o êxito alcançado em todos os procedimentos apresentadas nas Tabelas

acima, o procedimento 2 foi adotado às outras amostras de pólen devido os melhores

brancos analíticos obtidos nas análises (garantindo ótimos limites de detecção e

quantificação), a diminuição do uso de reagentes concentrados e geração de menos

resíduos ao ambiente, menor custo nas análises, além de garantir maior segurança ao

analista.

Os resultados obtidos para a determinação de Ca, Mg, e K por FAAS nas demais

amostras de pólen estão apresentados na Tabela 08.

TABELA 08 – Teores médios (mg kg-1) e respectivos desvios padrão (n=3) obtidos para

Ca, Mg e K em digeridos de amostras de pólen de abelha.

Amostras Ca Mg K

PCAST 2

PIGAÇU 1

PCAST 1

PCAST 3

PTRA

PBET2

PIGAÇU2

1849,50±37,60

6506,67±101,96

2102,17±92,70

697,36±105,21

2748,19±32,85

1800,10±122,99

3937,06±901,04

1476,41±99,35

1540,06±8,15

728,89±12,43

1308,45±87,62

821,32±1,49

1272,84±88,79

724,80±11,30

20263,89±2190,87

9427,46±646,14

9129,17±200,72

4240,63±348,48

7042,76±822,43

6964,98±697,38

10602,01±5477,80

O cálcio é classificado como um macronutriente, sendo de extrema importância

na alimentação humana e essencial nos processos de coagulação sanguínea e na

transmissão de tecidos nervosos. Sua carência causa raquitismo e osteoporose é

recomendada a ingestão de 1000-1300 mg/dia . As amostras coletadas no município de

Igarapé- Açu (PIGAÇU1) e (PIGAÇU2) apresentaram os maiores teores, 6506,67 e

3937,06 mg/kg, respectivamente.

Em relação aos trabalhos encontrados na literatura, DA SILVA et al. (2014)

encontraram teores para cálcio de 1864,1 a 3424,9 mg/kg. As amostras que mais se

aproximaram foram, PCAST 2 com teor de 1849,50 mg/kg e a PIGAÇU 2 com valor de

3937,06 mg/kg . A amostra PCAST 3 apresentou resultado inferior ao de DA SILVA et

al. (2014).

A amostra PIGAÇU 1 se mostrou bem acima da literatura. A análise foi validada

pelo teste de adição e recuperação, com uma recuperação que variou de 99,38% a

111,13%.

O magnésio é um importante mineral promove o bom funcionamento dos

músculos e do coração, auxiliando também no metabolismo de gorduras e no processo

digestivo. Sua deficiência causa câimbras, nervosismo, fraqueza muscular entre outras

alterações no organismo, recomenda-se a ingestão de 240-420 mg/dia. Magnésio

apresentou concentrações relativamente próximas entre a maioria das amostras, obtendo

concentração máxima de 1540,06 mg/kg na amostra de PIGAÇU 1 e uma concentração

mínima de 724,80 mg/kg na amostra de PIGAÇU 2. As amostras de PCAST1 e PIGAÇU

2 foram as que mais se aproximaram da concentração de LORESTANI et al (2010),que

encontrou concentração igual a 738,05 mg/kg as demais obtiveram valores acima da

literatura citada. A análise foi validada pelo teste de adição e recuperação, com uma

recuperação que variou de 85,32% a 105,27%.

O potássio tem como principais funções a participação na síntese de proteínas e

metabolismo de carboidratos, possui participação na transmissão nervosa e contração

muscular, principalmente na musculatura cardíaca. A carência desse macronutriente leva

a fraqueza, problemas cardíacos e fadiga muscular. É recomendada a ingestão de 2000

mg/dia deste mineral. DA SILVA et al (2014) obtiveram valores de concentração de

potássio igual á 5918,5 mg/kg. A amostra que mais se aproximou de seu resultado foi a

PCAST 3 com teor de 4240,63 mg/kg. As demais amostras apresentaram concentrações

superiores ao da literatura estudada.

Segundo MARTINS (2010), a composição mineral do pólen de abelha varia

conforme a origem floral, a composição do solo e a origem geográfica. Assim, os elevados

teores de potássio encontrados nas amostras de Igarapé-Açu (PIGAÇU 1 ) e (PIGAÇU 2)

pode está relacionado devido o município de Igarapé-Açu está localizado na região de

maior produção agropecuária do Estado do Pará (HAYDEN e DE FRANÇA, 2013). A

análise foi validada pelo teste de adição e recuperação, com recuperação em torno de

101,36% a 116,84%.

5.2 – Figuras de mérito

As figuras de mérito obtidas experimentalmente nas análises por FAAS podem

ser observadas na Tabela 09.

TABELA 09 – Figuras de mérito obtidas na determinação de Ca, Mg e K por FAAS em

amostras digeridas de pólen de abelha.

Parâmetros

Equação da reta

(Y)

Coeficiente de correlação

(R2)

LOD

(mg kg-1)

LOQ

(mg kg-1)

Ca Y= 0,257x – 0,079 0,999 4,7 15,5

Mg Y = 0,621x – 0,083 0,995 0,3 1,1

K Y = 0,257x – 0,079 0,995 0,82 2,72

6 – CONCLUSÃO

O presente estudo foi de suma importância para o desenvolvimento de novos

procedimentos de preparo de amostra e para conhecimento da composição química do

pólen de abelha produzido no Estado do Pará. Os procedimentos propostos utilizando

volumes reduzidos de ácido nítrico foram eficientes para a digestão das amostras de pólen

em um sistema de micro-ondas com cavidade. Com o avanço da química verde, a

utilização de baixos volumes de ácidos no preparo de amostras é uma alternativa viável,

visto que a redução de reagentes concentrados melhora os brancos analíticos nas análises,

minimiza a geração de resíduos no meio ambiente e aumenta a segurança nas análises.A

amostra PIGAÇU 1 apresentou maiores teores de Ca e Mg, a amostra PCAST 2

apresentou maior teor de K e a PIGAÇU 2 o menor valor para Mg. Sendo assim o presente

estudo se mostrou satisfatório com redução no volume de soluções tóxicas.

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8- DIFICULDADES

A reforma ocorrida no laboratório atrapalhou um pouco a obtenção dos resultados.

As análises de Na e P serão realizadas e apresentadas no seminário PIBIC.

9- PARECER DO ORIENTADOR

A aluna foi assídua e responsável durante o desenvolvimento do plano de

trabalho.

DATA :10 / 08 /2015

Kelly G. Fernandes Dantas

ASSINATURA DA ORIENTADORA

Monica da Cruz Lopes

ASSINATURA DA ALUNA