0

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

THIAGO FERREIRA DOS SANTOS

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM

CAFÉS COMERCIAIS BRASILEIROS POR PCR EM TEMPO REAL

RIO DE JANEIRO

2013

1

Thiago Ferreira dos Santos

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM

CAFÉS COMERCIAIS BRASILEIROS POR PCR EM TEMPO REAL

Orientadores: Prof.ª Dr.ª Adriana Farah.

Dr.ª Edna Maria Morais Oliveira.

Rio de Janeiro

2013

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de

Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Mestre em Ciência de Alimentos.

2

S237

Santos, Thiago Ferreira.

Desenvolvimento de método para detecção de adulterantes em cafés comerciais brasileiros por PCR em tempo real. / Thiago Ferreira dos Santos. – Rio de Janeiro : UFRJ, 2013.

78 f.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Química, 2013.

.

Orientadores: Adriana Farah de Miranda Pereira e Edna Maria Morais Oliveira.

1. Ciência dos Alimentos. 2. Café. 3. Reação em cadeia. 4. Polimerase. 5. Tempo real. 6. Adulterante. 7. Fraude. I. Pereira, Adriana Farah de Miranda. II. Oliveira, Edna Maria Morais. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Programa de Pós Graduação em Ciências dos

3

Thiago Ferreira dos Santos

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM

CAFÉS COMERCIAIS BRASILEIROS POR PCR EM TEMPO REAL

Aprovada por: 29/05/2013

__________________________________________

(Prof.ª. Drª Adriana Farah de Miranda Pereira, Instituto de Nutrição

Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ)

__________________________________________

(Prof. Dr. Joab Trajano Silva Instituto de Química.

Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ)

__________________________________________

(Dr. Otniel Freitas Silva. Embrapa Agroindústria de Alimentos - CTAA)

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de

Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro -

UFRJ, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Ciências de

Alimentos.

4

RESUMO

FERREIRA, Thiago Santos. Biblioteca e memória: Detecção de Adulterantes em Cafés

Comerciais Brasileiros por PCR em Tempo Real. Rio de Janeiro, 2013. Dissertação

(Mestrado em Ciências de Alimentos)- Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de

Janeiro. Rio de Janeiro, 2013.

O café é uma das principais bebidas comercializadas em todo o mundo. Durante o seu

processamento, este produto pode ser intencionalmente adulterado com materiais de baixo

custo, principalmente cereais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas em todo o mundo a fim

de determinar marcadores para a detecção de adulterantes em café torrado e moído e café

solúvel. No entanto, estes métodos podem apresentar baixa sensibilidade e especificidade.

Embora a tecnologia de DNA recombinante tenha demonstrado ser uma ferramenta

promissora para determinar a autenticidade de alimentos processados, não tem sido utilizada

para detectar adulterantes em café. O objetivo do presente trabalho de dissertação foi

desenvolver um método para detectar e estimar as concentrações de adulterantes comumente

adicionados a cafés comerciais brasileiros, por PCR em Tempo Real. O método desenvolvido

foi sensível e específico para quantificar até 8,1pg, 0,3pg e 2,6 pg de DNA de cevada, milho e

arroz, respectivamente. Vinte e uma amostras de diferentes qualidades adquiridas no mercado

brasileiro foram avaliadas para detecção de adulterantes. Dez amostras puras de café arábica e

conilon foram usadas como controle, não apresentando DNA de cereais. As oito amostras

comercialmente classificadas como gourmets ou superiores também não apresentaram cevada,

milho ou arroz na sua composição. No entanto, a cevada foi detectada em todas as doze

amostras avaliadas de café do tipo tradicional, sem selo de pureza e de menor custo. O milho

foi detectado apenas em uma amostra tradicional, além da cevada, enquanto o arroz não foi

detectado em nenhuma amostra comercial. Os teores variaram de 1,0 a 2,5% em café torrado

e moído e de 2,3 % a 5,2% em café solúvel. A técnica de PCR em Tempo Real demonstrou

ser adequada para a detecção de alimentos adulterantes em café torrado moído e café solúvel.

Palavras chave: Café, PCR em Tempo Real, adulterante, fraude.

5

ABSTRACT

FERREIRA, Thiago Santos. Biblioteca e memória: Detection of Adulterants in Brazilian

Commercial Coffees by Real-Time PCR based method. Rio de Janeiro, 2013. Master Degree

Dissertation (Food Science) - Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Rio de Janeiro, 2013.

It is well known that coffee is one of the main food products commercialized in the

world. During processing, coffee can be intentionally adulterated with cheaper materials,

including grains and cereals, such as barley, corn and rice. Many techniques have been

developed in order to establish suitable parameters and markers for detection of adulteration

of ground roast coffee and instant coffee. However, these methods may present low sensitivity

and specificity. Although the recombinant DNA technology has shown to be a promising tool

to determine the authenticity of processed foods, it has not been used to detect coffee

adulteration. The goal of the present dissertation was the development of a method to detect

and estimate the concentrations of contaminants commonly found in commercial Brazilian

coffees, using q-PCR technique. The method was sensitive and specific to quantify down to

8.1pg / 0.3pg / 2.6pg of barley, corn and rice DNA, respectively. Ten control samples were

evaluated and did not present barley, corn or rice. From the twenty one samples acquired in

the Brazilian market, eight, classified as gourmets or superior, did not present the respective

adulterants in their composition. The 12 low cost samples, however, were adulterated,

especially with barley, in percentages varying between 1% and 2.5 % in ground roast coffee

and between 2.3 % and 5.2 % in instant coffee. Corn was only detected in one traditional

sample, in addition to barley and rice was not detected in any of the commercial samples. The

Real-Time PCR method showed to be suitable for detection of low amounts of food

adulterants in roasted coffee.

Keywords: Adulterants, Coffee, Real Time PCR.

6

SUMÁRIO

RESUMO 3

ABSTRACT 4

GLOSSÁRIO 5

AGRADECIMENTOS 7

LISTA DE TABELAS 9

LISTA DE ILUSTRAÇÕES 10

LISTA DE SIGLAS 13

INTRODUÇÃO 16

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18

1. 1 O CAFÉ 18

1. 1. 1 Classificação Botânica 18

1. 1. 2 Beneficiamento do café 19

1. 1. 3 Torração do café 22

1. 1. 4 Principais defeitos do café 24

1. 1. 5 Dados de consumo 26

1. 1. 6 Composição química do café 27

1. 2 AUTENTICIDADE DO CAFÉ 28

1. 2. 1 Método para detecção de adulterantes em café 32

1. 2. 2 PCR em tempo real 35

1. 2. 3 Sistemas de detecção para PCR em tempo real 37

2 JUSTIFICATIVA 40

3 OBJESTIVOS 40

3. 1 OBJETIVO GERAL 40

3.2 Objetivos específicos 40

4 MATERIAIS E METODOS 41

4. 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA 41

7

4. 1. 1 Definição dos marcadores moleculares e dos sistemas de detecção para os

adulterantes 41

4. 2 AMOSTRAGEM E TORREFAÇÃO 41

4. 2. 1 Amostras controle 41

4. 2. 2 Amostras comerciais 42

4. 3 Adulterações de amostras de café em laboratório 42

4. 4 Extração de DNA 42

4. 4. 1 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras in natura 43

4. 4. 2 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras processadas 44

4. 4. 2. 1 Escolha do método de extração de DNA para as amostras torradas e moídas 44

4. 4. 2. 2 Análise da amplificabilidade 47

4. 5 SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE DOS PRIMERS 47

4. 5. 1 PCR convencional 47

4. 5. 2 Especificidade com PCR em Tempo Real 48

4. 6 SENSIBILIDADE E LINEARIDADE 48

4. 6. 1 Construção da curva padrão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação

(LQ) 48

4. 7 DETECÇÃO DOS ADULTERANTES 49

4. 8 FLUXO GRAMA EXPERIMENTAL 50

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 51

5.1 ESCOLHA DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO PARA AMOSTRAS PROCESSADAS 51

5. 1. 1 Determinação da concentração de DNA isolado das amostras in natura e

processadas 53

5. 2 Análises de bioinformática 55

5. 2. 1 Desenho dos primers e sua seletividade 55

5. 2. 2 Especificidade dos primers selecionados 57

8

5. 3 SENSIBILIDADE E LINEARIDADE 60

5. 3. 1 Construção da curva padrão 60

5. 4 ADULTERÇÃO INTENCIONAL EM LABORATÓRIO 63

5. 4. 1 Curva de estimativa de percentual de adulterantes 63

5. 5 DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM AMOSTRAS COMERCIAIS DE

CAFÉ 65

6 CONCLUSÃO 68

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 70

9

AGRADECIMENTOS

Eu gostaria de agradecer às pessoas na ordem com que apareceram na minha vida! Minha mãe

Jorgina dos Santos, caçula de uma analfabeta que formou filhos Oficiais da Aeronáutica e

Exército, professores e funcionários públicos. Exemplo de esforço, dedicação e amor altruísta

(te amo mãe). À minha família que, apesar de eu não ter tido a oportunidade de escolher, não

trocaria por nenhuma outra. À vidinha (Jéssica G. V. Ferreira dos Santos) minha esposa,

obrigado pela paciência, companheirismo e amor. Minha professora Janaína J. V. Cavalcante,

que com muita paixão me infectou com a Biologia molecular. À Raquel Guerra, que me fez o

convite para entrar em contato com a responsável do Laboratório de detecção de OGM da

EMBRAPA e por ser um amparo espiritual. À Dr. Edna Maria Morais Oliveira, minha mãe

científica, pessoa qualificada e capacitada. Eu te agradeço Edna por nunca ter me deixado sem

respostas, por ter a capacidade de enxergar o meu potencial quando, nem eu mesmo o

conhecia, pela ética profissional, pela postura impecável. Palavras realmente são pequenas

para descrever o que você representa para mim, a ciência brasileira avançaria muito se todos

os “Ph deuses” e “Ph divas” fossem como você. À Nildinha (Ivanilda Lima), a pessoa que

simplesmente me ensinou tudo do Lab. Nilda obrigado pela presença, companheirismo,

palhaçadas, favores, aventuras e etc... Não poderia deixar de lembrar da 1º estagiária Natália

Eudes que fez um “intensivão” comigo para o processo seletivo de mestrado. Natália você é

uma pessoa incrível. À Tatiane Corrêa, por sempre estar disposta a nos ajudar com sua

simplicidade e carinho (você é demais). Ao futuro Dr. Felipe Vitório “rs” você é o discípulo

que ultrapassou o mestre. A todos do Lab. de Detecção de OGM da EMBRAPA. Não deixaria

de fora os sofredores companheiros de mestrado: Adriana M. Miranda, Jeane Rosa, Viviane

M. Gomes, Karla Leal, Vanessa Rezende, Fabiana Ramos, Ivanilton Nery, Cynthia Annes

Rubião, Mariana Ramos dos Anjos e Andrea Matos. Foi muito bom rir, chorar e se desesperar

com vocês! À minha querida orientadora Adriana Farah, muito obrigado por ser o maçarico e

a lixa que derrete e dá polimento às minhas imperfeições, por me trazer a realidade do que é

ser um mestre e pela paixão com que você trabalha, é simplesmente deslumbrante. E por

último, e não menos importante, Deus: o motivo, a razão e a inspiração de tudo. Na verdade

Deus apareceu na minha vida bem antes de tudo e Ele é a razão do meu viver. Muito obrigado

Senhor, por mais este degrau alcançado.

10

"For God so loved the world, that he gave his only begotten Son, that whosoever believeth in

him should not perish, but have everlasting life."

(John 3:16)

“O profundidade das riquezas, tanto da sabedoria, como da ciência de Deus! Quão

insondáveis são os seus juízos, e quão inescrutáveis os seus caminhos!

Porque quem compreendeu a mente do Senhor? Ou quem foi seu conselheiro?

Ou quem lhe deu primeiro a ele, para que lhe seja recompensado?

Porque dele e por ele, e para ele, são todas as coisas; glória, pois, a ele eternamente.

Amém.”

(Romanos 11:33-36)

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Corte transversal de um grão de café adaptado de Murthy e Naidu (2012).

Figura 2: Processo de colheita do café adaptado de Murthy e Naidu (2012).

Figura 3: Processo de secagem natural dos grãos de café em terreiro.

Figura 4: Tanque de água para degomagem do café para obtenção de café despolpado.

Figura 5: Processo de torrefação industrial do café.

Figura 6: Comparação em porcentagem de bebidas consumidas regularmente. (ABIC, 2012).

Figura 7: Representação do processo de amplificação da PCR adaptado de HEID et al, 2011.

Figura 8: Esquematização de um gráfico de PCR em Tempo Real.

Figura 9: Esquema A: absorção e emissão do fluoróforos SYBR Green ligado

superficialmente a molécula de DNA. Esquema B: hibridização da sonda ao alvo e hidrólise

do fluoróforo repoter (VALASEK; REPA, 2005).

Figura 10: Gráfico da curva de dissociação demonstrando o DNA dupla-fita submetido ao

aumento de temperatura gerando a Tm.

Figura 11: Esquematização da função 5’ exonucleásica da Taq polimerase adaptado de Barros

et al 2008

Figura 12: Isolado de DNA genômico após extração com os métodos DNeasy/CTAB,

Dellaporta, DNeasy e CTAB (A, B, C e D respectivamente).

Figura 13: Isolado de DNA genômico submetido à reação Random Amplification of

Polymorphic DNA (PCR-RAPD) para análise de amplificabilidade. O gel está disposto da

seguinte ordem: Métodos de extração Dellaporta, CTAB, DNeasy e DNeasy/CTAB,

respectivamente.

Figura 14: PCR in silico e in vitro dos primers Café 1(A) e Cevada 3(B), utilizando DNA

genômico de café e cevada, respectivamente. P: padrão de bases.

12

Figura 15: PCR in silico e in vitro dos primers Zeína 2(C) e Arroz 1(D) utilizando DNA

genômico de milho e arroz, respectivamente.

Figura 16: Gráfico de curva de dissociação.Primer Café1 e primer Cevada3.

Figura 17: Primer zeina2 (EF): a letra E corresponde à amplificação específica do primer

Zeina2 em DNA genômico de milho, F corresponde à amplificação inespecífica do primer

Zeína2 em DNA genômico de café, cevada, soja arroz e trigo.

Figura 18: Curvas padrão de café (◊), cevada (□), milho (Δ) e arroz (x), utilizado para

determinação de LD/LQ.

Figura 19: Adulteração em laboratório para construção de curva de estimativa em percentual

de cevada 10%-0,5% de cada adulterante.

Figura 20: Detecção de cevada em amostras comerciais brasileiras tradicionais utilizando pela

técnica de PCR em tempo real, utilizando-se o primer cevada3.

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificação filogenética do café.

Tabela 2: Quantificação de DNA genômico dos alimentos in natura, razão de pureza

260/280 nm.

Tabela 3: Quantificação de DNA genômico dos alimentos processados, razão de

pureza 260/230 nm.

Tabela 4: Marcadores moleculares de café, cevada, milho e arroz obtidos por

bioinformática.

Tabela 5: Média dos Cts das curvas padrão de café, cevada, milho e arroz, com os seus

respectivos desvios padrão.

Tabela 6: Eficiência, linearidade e sensibilidade dos primers

Tabela 7: Detecção e quantificação de cevada em cafés comerciais.

14

LISTA DE SIGLAS

ABIC - Associação Brasileira das Indústrias de Café

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

CIR - Commissioners of Inland Revenue

CIRAD - Coopération Internationale em Recherche Agronomique pour le Développement

CNNPA - Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos

CTAB - brometo de cetiltrimetilamónio

Ct - Cycle threshold

DESVPAD - Desvio padrão

DNA - Ácido desoxirribonucleico

DRIFTS - Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy

EUA - Estados Unidos da América

FAO - Food and Agriculture Organization

FDA - Food and Drug Administration

FSI/USDA - Food Safety and Inspection Service – United States Department of Agriculture

FUNCAFÉ - Fundo de Defesa da Economia do Café

HPLC - High-performance liquid chromatography

ISIC - Intitute for Scientif Information on Coffee

LANAGROS - Laboratórios Nacionais Agropecuários

MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OIC - International Coffee Organization

OGM - Organismo Geneticamente Modificado

15

OMS - Organização Mundial de Saúde

PCR - Polymerase Chain Reaction

PQC - Programa de Qualidade do Café

qPCR - Real-time polymerase chain reaction

RAPD - Random Amplification of Polymorphic

SCAA - Specialty Coffee Association of America

SUASA - Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária

16

INTRODUÇÃO

O café brasileiro já foi o maior gerador de riquezas e o produto mais importante da

história nacional. Embora tenha perdido espaço para outros produtos como o petróleo e a soja

hoje, este produto continua sendo um importante gerador de divisas (US$ 2 bilhões anuais, ou

26 milhões de sacas exportadas ao ano), contribuindo com mais de 2% do valor total das

exportações brasileiras, e respondendo por mais de um terço da produção mundial, que

movimenta, anualmente, cerca de 91 bilhões de dólares, ficando apenas 9% desse montante

com os países produtores (MOREIRA et al, 2001; NISHIJIMA et al, 2012).

Quando se fala em qualidade do café, devem ser considerados todos os processos para

a garantia da mesma ao longo da cadeia produtiva, ou seja, desde o plantio até o momento em

que o café é servido na xícara. Basicamente, podem ser citadas cinco etapas críticas na

produção: uniformidade do grau de maturação dos frutos na colheita, secagem,

armazenamento dos grãos crus, torrefação e armazenamento do café torrado e moído (TOCI;

FARAH, 2008). Além do fator da variação na qualidade do próprio café, visando preços

menores no mercado, este produto também tem sido alvo de misturas fraudulentas com uma

diversidade de materiais de menor custo, tais como cevada, milho, arroz, entre outros

(RUBAYIZA; MEURENS, 2005; NOGIUEIRA, 2009). Apesar de muitas vezes não causar

prejuízo ao valor nutricional, à adulteração, que geralmente é praticada por torrefadores, leva

à concorrência desleal, e à ilusão do consumidor, sendo crime previsto na lei. (LAGO, 2009).

Muitas técnicas têm sido desenvolvidas a fim de determinar parâmetros apropriados e

marcadores para diferentes tipos de adulteração em café torrado e moído. Os métodos

convencionais de identificação de adulterantes utilizando técnicas de reconhecimento de

padrões de cores e imagens características são subjetivos e, consequentemente, dependentes

da experiência do analista e sujeito a erro humano. Além dos métodos visuais, há os métodos

baseados na determinação de marcadores químicos tais como alguns carboidratos e compostos

voláteis, identificados por cromatografia líquida e gasosa (TOCI; FARAH, 2008, LAGO,

2009; OLIVEIRA et al, 2009; CRAIG et al, 2012).

Métodos baseados em técnicas estritamente físicas também foram propostos para a

detecção de adulterantes em café, tais como, espectroscopia fotoacústica proposta por Cesar et

al. (1984), espectroscopia por infravermelho, por Briandet et al. (1996) e espectrometria com

lente térmica, por Fontes et al.(2001). No entanto, métodos baseados em tais técnicas não

17

permitem a identificação dos adulterantes individuais e sua quantificação, sendo também

sujeitos a efeitos de matriz devido ao processamento. (NOGUEIRA, 2009).

A tecnologia do DNA recombinante tem sido utilizada para a determinação da

autenticidade de alimentos processados (GERMINI et al, 2004; ARLORIO et al, 2007;

PAFUNDO et al, 2009; LAUBE et al, 2010; CASTELLÁ; CABAÑES, 2011; COSTA et al,

2012). A reação em cadeia da DNA polimerase (PCR-Polymerase Chain Reaction) em tempo

real permite o controle da reação de amplificação ciclo para ciclo, em um sistema fechado,

sem interferência externa na evolução da reação. Um sinal fluorescente é detectado por

fluorescência em proporção ao aumento do teor do produto de amplificação. Esta

fluorescência é emitida por compostos que podem ser ligados a sondas ou intercalados na

parte externa, no sulco menor da dupla fita de DNA, como é o caso do SYBR Green

(BARROS et al, 2008).

Desta forma, a técnica de PCR em tempo real vem sendo amplamente utilizada para a

análise da presença de sequências específicas de DNA em diferentes matrizes alimentares

como detecção de patógenos e detecção e quantificação de organismos geneticamente

modificados (OGM). Além disso, já existem análises por esta técnica para a detecção de

glúten em alimentos destinados a portadores de doença celíaca (OLEXOVÁ et al, 2006;

PIKNOVÁ et al, 2008). No entanto, esta abordagem analítica ainda não foi utilizada para

detecção de adulterantes em café, tema que será abordado neste trabalho.

18

1 REVISÃO BIBLIGRÁFICA

1. 1 O CAFÉ

1.1.1. Classificação botânica

O café pertence à família Rubiaceae e ao gênero Coffea (Tabela 1). Existem

aproximadamente 100 espécies descritas do gênero Coffea, mas somente as espécies C.

arabica e a C. canephora, sendo a última conhecida como Robusta ou Conilon, possuem

importância econômica (ILLY, 2002).

Tabela 1: Classificação filogenética do café (MURTHY; NAIDU 2012).

Reino Plantae

Subreino Tracheobionta

Filo Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida

Subclasse Asteridae

Ordem Rubiales

Família Rubiaceae

Genêro Coffea

Denominado cafe em Francês, caffe em Italiano, Kaffee em Alemão, koffie Holandês e

coffee em Inglês. (SMITH, et al 1985), o café Arábica (Coffea arabica) é nativo da província

de Kaffa, na Etiópia, já o café Robusta (Coffea canephora) é nativo da África Central e a

transferência de mudas de café do continente Europeu para a América Central e do Sul

ocorreu por volta de 1700, chegando ao Brasil em 1727 (YANAGIMOTO et al, 2004;

SENBETA; MANFRED, 2006 DENICH; MURTHY; NAIDU, 2012). A palavra café

tem origem na palavra árabe “qahwa” que significa vinho. Por esta razão, quando o café foi

levado para a Europa, no século XIV, foi chamado de vinho da Arábia. Desde então, seu

cultivo influenciou diversas culturas no Brasil e no mundo, impulsionando-as

economicamente e tornando-se principal gerador de riquezas (NISHIJIMA et al, 2012).

O arbusto da espécie Arábica, oriunda de regiões montanhosas, é delicado, de pequena

a média produção, porte de até 5 a 6 m de altura e requer clima ameno, sendo considerada

19

uma espécie que produz um café de alta qualidade. A árvore do café Robusta, por sua vez, é

caracterizada por ser muito produtiva e resistente a doenças. A planta se desenvolve bem em

climas quentes e úmidos e pode atingir até 12 m de altura. No entanto, produz um café com

maior acidez e amargor, e de aroma pobre o que lhe atribui um conceito de café de baixa

qualidade. (SANGER et al, 2002).

1.1.2 Beneficiamento do café.

As sementes do fruto do cafeeiro (Figura 1), quando torradas e moídas, são infusas em

água quente e resultam em uma das bebidas mais consumidas no mundo, representando um

importante item no comércio internacional. No Brasil, o café constitui um importante produto

de exportação, sendo depois dos EUA, o maior consumidor desta bebida (MAY et al, 2011).

Figura 1: Corte transversal de um grão de café. Adaptado de Murthy e Naidu (2012).

Para se garantir a produção de uma bebida de boa qualidade e aceitação, deve-se escolher

uma boa variedade de grãos de café. A lavoura deve estar situada em uma área que apresente

condições climáticas favoráveis. Além disso, o preparo deve ser feito a contento, para que, ao

término de todo o processo, possa o produtor obter uma boa produtividade em um grão de

café de qualidade disponibilizada ao consumidor (MURTHY; NAIDU 2012).

Basicamente três tipos de colheitas são geralmente utilizados no Brasil: derriça (no

pano ou no chão), colheita mecânica e colheita a dedo (Figura 2). Como o gênero Coffea

possui uma florescência irregular durante seu desenvolvimento, gera frutos com diferentes

20

graus de maturação, fazendo com que durante a colheita, juntamente com os frutos cerejas

(maduros), sejam colhidos frutos verdes e extremamente maduros (TOCI & FARAH, 2008).

Figura 2: Processo de colheita do café. Adaptado de Murthy e Naidu (2012).

Antes da secagem, os frutos precisam ser beneficiados, o que consiste na sua

transformação, após a colheita, em grãos (secos) para a torrefação. Esse processo divide-se

em duas etapas:

1ª Etapa: Consiste na lavagem dos frutos do café com água, para separação das folhas, pedras

e outras impurezas. Os frutos também podem ser separados por densidade. Durante a

21

separação por densidade, os frutos secos e “passados” (do ponto de maturação) boiam,

enquanto os verdes e os maduros afundam.

2ª Etapa: Consiste na secagem e no despolpamento dos frutos. Este último pode ser realizado

de três modos, pelo Processo Natural, Processo Úmido e Processo de despolpamento Natural

ou Semi-úmido (BANDEIRA et al, 2009).

Na cafeicultura brasileira, cerca de 90% do café é preparado pelo Processo Natural

(TOLEDO; BARBOSA, 1998; DUARTE et al, 2009). Neste processamento, os frutos são

secos em terreiros, ao sol, resultando nos “cafés de terreiro”, ou em grandes secadores (Figura

3). Neste caso, a qualidade do produto depende das condições climáticas da zona de produção

(umidade, temperatura e chuvas), especialmente no período da colheita. Chuvas e alta

umidade no ar favorecem o desenvolvimento de microorganismos (TOCI & FARAH, 2008).

Figura 3: Processo de secagem natural dos grãos de café em terreiro.

(http://mariarruda50.blogspot.com.br/2011/06/contando-uma-historia.html).

O Processo Úmido requer necessariamente frutos maduros e pré-lavagem. Neste

processo o café é despolpado mecanicamente e fermentado em tanques para a retirada da

mucilagem (Figura 4). A fermentação pode ser enzimática ou por microorganismos (TOCI &

FARAH, 2008). Este processo apresenta um maior risco para a qualidade final da bebida,

pois o ponto final da fermentação deve ser bem controlado. De outro modo, ocorre a produção

22

de grãos excessivamente fermentados, conhecidos como defeito stinker (TOCI & FARAH,

2008).

Figura 4: Tanque de água para degomagem do café para obtenção de café despolpado.

(http://www.infobibos.com/Artigos/2010_2/CafeCereja/index.htm)

O Processo de despolpamento Natural, desenvolvido no Brasil, reúne o melhor dos

dois processos anteriores. Consiste na lavagem e despolpamento mecânico dos frutos e na

secagem dos grãos despolpados, porém ainda com a mucilagem (TOCI & FARAH, 2008).

1.1.3 Torração do café.

O café in natura, os grãos torrados e a bebida preparada são misturas complexas

formadas por várias substâncias de ocorrência natural ou derivadas do processamento, por

exemplo, sabe-se que o café é o único alimento que produz a vitamina niacina, decorrente da

torrefação (DAGLIA et al, 2002).

O processo de torrefação consiste em submeter o grão à elevação rápida de

temperatura para torrá-lo, fazendo com que a sua umidade interna chegue a cerca de 3%

(Figura 5). Esta operação consiste em três fases distintas. Na primeira fase, o grão chega até

100°C. Na segunda fase, toda a água livre é evaporada e a temperatura do café é elevada até a

temperatura de pirólise, de aproximadamente 180°C. Na terceira fase, o café sofre a pirólise,

23

ou torração propriamente dita. Na operação de torração, deve-se ter controle adequado do

peso e tamanho, e uniformidade dos grãos, temperatura interna da câmara, tempo de torração

e, quando se utiliza ar quente, controle da velocidade do ar. Este controle é necessário para

que se obtenha o grau de torração adequado, além de uma boa reprodutibilidade (FARAH,

2012).

Figura 5: Processo de torrefação industrial do café. (http://www.buhlergroup.com/europe/pt/solues-

industriais/alimentos/caf.htm).

Em torradores com leito fluidizado ou similares, à temperatura acima de 200 °C e uma

boa agitação dos grãos, dependendo da quantidade de grãos na câmara, o tempo de torração

pode ser de cerca de 5 a 10 minutos, variando conforme a intensidade de torração desejada.

Esta intensidade geralmente é avaliada pela coloração dos grãos através da medição

colorimétrica ou pela determinação da perda de peso durante a torração. Esta perda de peso se

dá devido à evaporação da água e pirólise dos componentes orgânicos do café, que resulta na

formação de CO2 e compostos voláteis. (BASSO et al, 1999; WANG; LIM, 2012).

A torra mais comumente observada no comércio brasileiro é a escura ou extraforte.

Entretanto, uma torração drástica contribui para a perda de substâncias como ácidos

clorogênicos e derivados, que contribuem de forma importante para os efeitos fisiológicos

considerados benéficos a saúde. Ela pode vir a contribuir também para a produção de

compostos potencialmente prejudicais a saúde como o benzeno(a)pireno entre outros

24

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (FARAH et al, 2006). É importante ressaltar que este

tipo de torra também é escolhido pelas indústrias cafeeiras por dificultar a detecção de

matérias estranhas, pois quando estas são torradas juntamente com o café ocorre a absorção

do óleo e aderência das partículas mais finas de café torrado e moído às suas superfícies

tornando difícil o reconhecimento da adulteração sem o auxílio de métodos analíticos

adequados (TAVARES et al, 2012).

1.1.4 Principais defeitos do café

A não conformidade nos padrões de qualidade nesses processos gera defeitos no fruto,

sendo estes considerados defeitos extrínsecos e intrínsecos. Essas classificações advêm dos

órgãos Federais como o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e são

utilizadas pela Associação Brasileira das Indústrias de Café (ABIC). Os defeitos intrínsecos

são os grãos provenientes de estágios de maturação inadequadas e/ou de fermentação ou

oxidação ocorrida na planta, no chão ou após a colheita. Os principais defeitos estão listados a

seguir:

Defeito Verde: É originado de fruto imaturo e sabe-se que confere grande

adstringência à bebida e notas de folhas verdes desagradáveis (TOCI; FARAH, 2008).

Defeito ardido: pode ser gerado por problemas de irrigação durante o plantio, ou por

problemas na condução do processo de beneficiamento, que ocasionam fermentação

indesejável nos grãos maduros e verdes (TOCI; FARAH, 2008).

Defeito Preto: É o mais comumente originado por frutos passados do ponto de

maturação, que podem ocorrer por amadurecimento natural no cafeeiro, pela ação de chuvas

ou por quedas dos frutos no chão durante a colheita. O contato do fruto com o solo favorece a

ocorrência de fermentação microbiana indesejável. Grãos pretos podem ser originados por

deficiência de carboidratos no cafeeiro ou por fermentações microbianas no processo de

beneficiamento. Estes grãos produzem notas de fumo queimado (TOCI; FARAH, 2008).

Defeito Preto Verde: O grão preto-verde é originado do grão verde pela ação de altas

temperaturas, decorrente de processos inadequados de secagem ou possivelmente, por

fermentação do grão ardido (TOCI; FARAH, 2008).

25

Defeito Stinker: É aparentemente normal a olho nu. Porém, são provenientes de

processos inadequados de despolpamento via úmida e que comprometem seriamente a

qualidade da bebida, podendo ser identificados por fluorimetria. Alguns classificadores

consideram o grão stinker e o preto-verde os mesmos defeitos (BANDEIRA et al, 2009).

Defeito Mal-Granado & Concha: O grão elefante é um grão de grande tamanho.

Porém com má formação. O grão Mal-granado ou concha é parte de um grão elefante,

geralmente separados pelo processo de descascamento ou despolpamento (BANDEIRA et al,

2009).

Defeito Coco: Este tipo de grão é formado por um processo incorreto de

descascamento, permitindo que frutos secos inteiro passem pela peneira de separação

(BANDEIRA et al, 2009).

Defeito Chocho: O grão chocho é enrugado por problemas genéticos ou fisiológicos,

deficiência nutricional, ou estresse do cafeeiro (BANDEIRA et al, 2009).

Defeito Brocado: O grão brocado é aquele atacado na lavoura ou no beneficiamento

por Hypothenemus haempei, conhecido como broca do café (TOCI; FARAH, 2008).

Defeito Casca: Pedaços de casca oriundos do processo de descascamento que não

foram separados adequadamente (BANDEIRA et al, 2009).

A mistura de todos os defeitos é conhecida como PVA, devido aos principais defeitos

serem os grãos pretos, verdes e ardidos. Atualmente, a realidade do mercado interno é que

existem blends comercias com mais de 70% de PVA, embora a ABIC recomende a inclusão

de no máximo 20% destes (BANDEIRA et al, 2009. TOCI ; FARAH, 2008).

Já os defeitos considerados extrínsecos são classificados pela presença de outras

matérias como: arroz, trigo, soja, cevada e milho além de sujeira, folha e resíduos de madeira.

Até 2005, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) não contemplava análises

relativas à identificação de adulterantes em café. Já na União Europeia, exigia-se

determinação de glicose total, xilose total e frutose livre, a fim de detectar possíveis fraudes,

já que os teores desses açúcares são baixos no café e altos em certos grãos (BACHA, E. L.

2000).

26

1. 1. 5 Dados de consumo

Segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Café (ABIC, 2013), pesquisas

realizadas desde 2003 até 2010 pelo Fundo de Defesa da Economia do Café (FUNCAFÉ) e

pela ABIC, mostram que está havendo um aumento no consumo da bebida pela população

brasileira (Figura 6).

Figura 6: Comparação em porcentagem de bebidas consumidas regularmente (ABIC, 2012).

Visando preservar esta situação de mercado, o setor de café brasileiro tenta manter o

ritmo de “marketing” e modernização da indústria de bebidas, implementando estratégias

mercadológicas que estimulem o consumo de café e seus derivados. Neste contexto, a

inovação em tecnologia e produtos e a melhoria contínua constituem elementos decisivos para

alcançar e sustentar vantagens competitivas e, assim, favorecer o crescimento econômico, a

geração de riqueza, a qualidade de vida da sociedade e a satisfação dos consumidores

(ROCHA; FERREIRA, 2001).

O café também é utilizado em preparações do tipo expresso, “cappuccino”,

“frappucino”, na produção de balas, e dele ainda pode se extrair um óleo normalmente

utilizado como aditivo na indústria alimentícia e na indústria cosmética. Entre os fatores que

podem interferir na composição e qualidade do café estão fatores genéticos, tais como espécie

e variedade, maturação dos grãos, os processos de torrefação, armazenamento e a adição de

alimentos com baixo valor agregado, como a cevada, milho, soja, entre outros (MORGANO

27

et al., 2002; ASSAD et al, 2002; PROESTOS et al, 2005; ANDERSEN et al, 2006; ALVES et

al, 2009; REIS et al, 2012, FARAH, 2012).

O sabor e o aroma do café são atrativos que justificam e estimulam a grande aceitação

e consumo desta bebida. Pesquisas recentes apontam efeitos fisiológicos benéficos do

consumo de café atribuídos a diversos compostos nele presentes entre os quais se encontram a

cafeína e os compostos fenólicos, especialmente os ácidos clorogênicos, e isso também tem

contribuído para o aumento de consumo do café (FARAH; DONANGELO, 2006; DUARTE

et al, 2012).

1. 1. 6 Composição química do café

Geralmente, cafés crus apresentam na sua composição química, considerando as duas

espécies mais comuns, teores de 8,6 a 12,6 g/100g de proteínas, 12,3 a 14,0 g/100g de lipídios

e 3,5 a 4,5 g/100g de minerais. Como parte da composição mineral do café, destacam-se Ca,

K, Mg, Na, P, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Zn (MORGANO et al, 2002).

Além destes nutrientes, o café também contém fitoquímicos como os ácidos

clorogênicos e cafeína, já mencionados, e melanoidinas, entre outros compostos bioativos. A

composição mais comum dos grãos crus de café Arábica e Robusta corresponde,

respectivamente, em base seca, de 12-18 g/100g e 9-13 g/100g de lipídios, 3,0-4,2 g/100g e

4,0-4,5 g/100g de minerais, 5,5 a 8,0 g/100g e 7,0-10,0 g/100g de ácidos clorogênicos, 6-8

g/100g e 5-7 g/100g de oligossacarídeos, 50-55 g/100g e 37-47 g/100g de polissacarídeos,

0,9-1,2 g/100g e 1,6-2,4 g/100g de cafeína. A composição de alguns compostos não difere

entre as espécies consideradas, sendo de 2 g/100g de aminoácidos, 11-13 g/100g de proteína e

1,5- 2,0 g/100g de ácidos alifáticos (SALDAÑA et al, 1997).

1. 2 AUTENTICIDADE DO CAFÉ

Segundo o dicionário da língua portuguesa, a palavra adulterar significa: falsificar,

corromper. A atitude de adulterar caracteriza fraude e, portanto, considera-se adulteração a

mistura, intencional ou não, de materiais estranhos ao produto, normalmente de baixo custo,

que alteram a sua qualidade e causam danos ao consumidor, especialmente, os de ordem

econômica e moral (ASSAD et al, 2001).

28

A prática de misturar o café com outros alimentos data de pelo menos 1840 na

Inglaterra, onde eram encontrados até 50% de chicória no café (THE LANCET, 1853). No

entanto, em 1852, a mistura com chicória pelos comerciantes que inicialmente era permitida

desde que relatada no rótulo, tornou-se uma preocupação por parte do órgão de fiscalização,

denominado Commissioners of Inland Revenue (CIR). Apesar da permissão condicional da

mistura parecer justa, era costume da época os negociantes dobrarem a embalagem de modo a

ocultar a parte na qual se encontrava a informação da presença de chicória. Isso também não

garantiria o esclarecimento dos consumidores, tendo em vista que muitos deles não sabiam

ler. Havia também suspeita de corrupção por parte dos fiscais, já que o governo permitia a

mistura e o café já era em 1853 uma commodity responsável por 38, 597,000 lbs/ano.

A falta de fiscalização eficiente e a prática de adulterar, fez com que, em 1897,

houvesse diminuição no consumo do café na Europa, sendo o mesmo considerado de gosto

ruim. Mesmo sendo do conhecimento de todos na época que o café puro produzia uma

excelente bebida, parecia que ninguém era capaz de obtê-la, o que levou a suspeita de um

novo método de adulteração com adição da serragem. Este novo método consistia na lavagem

e secagem das bagas (os frutos do café) em máquinas centrífugas com serragem, fazendo com

que as fendas das bagas ficassem cheias de madeira em pó e mais claras. A coloração clara

era uma característica do café, considerado de ótima qualidade. Sendo assim, através deste

novo método de adulteração, o café de baixa qualidade podia ser vendido como de alta

qualidade, aumentando assim, seu valor de mercado. As autoridades da época acreditavam

que os cafés adulterados com serragem eram provenientes de cidades como Hamburg,

Bremen, Antwerp, e Rotterdam (THE LANCET, 1853).

Segundo Menezes e Bicudo (1958), indícios de adulteração no café brasileiro datam

desde 1950 e esta prática tornou-se mais comum nos anos 70 durante o período de

tabelamento de preços. O tabelamento de preços restringiu qualquer possibilidade de

segmentação de mercado. Com a alta inflação e preços tabelados, muitas empresas passaram a

sobreviver graças ao retorno do investimento no mercado financeiro. Em termos de estratégia

de mercado, as torrefadoras entraram em concorrência suicida e passaram a adulterar o café,

misturando-o com produtos mais baratos. Desde então, muitas técnicas físicas, químicas e

bioquímicas tem sido propostas para detecção de adulterantes em café. Nos dias atuais, já não

há, mas tabelamentos de preços no café para justificar a prática de adulterar. (NOGUIERA;

LAGO, 2009).

29

Como considerado anteriormente, sabe-se que o Brasil é o maior produtor de café do

mundo, e mesmo com os esforços da ABIC para manter um nível de qualidade aceitável no

comércio interno, certificando o café com o Selo de Pureza ABIC, na literatura é informado

que grande parte do café torrado e moído vendido no território brasileiro não é considerada de

boa qualidade (JHAM et al, 2007). Ao longo dos tempos, o café brasileiro tem sido adulterado

por parte da indústria cafeeira com milho, cevada, arroz, soja e trigo, entre outras substâncias

decorridas do seu processamento. Por serem considerados alimentos de menor valor agregado

e também apresentarem muita semelhança ao café quando torrado e moído, dificultam ainda

mais a detecção por parte dos órgãos fiscalizadores (MENEZES; BICUDO, 1958; LOPEZ, F.

C. 1974; KAZI, 1978; CEZAR, et al, 1984; , 1986 ASSAD, et al, 2001; JHAM et al, 2007;

NOGUEIRA; LAGO, 2009; REIS et al, 2012; FERREIRA et al, 2013).

Como toda e qualquer atividade produtiva que envolva fabricantes, comerciantes e

consumidores na produção, na comercialização e no consumo, o café é regulamentado por

uma legislação específica no Brasil e no mundo. Esta regulamentação objetiva garantir aos

produtores a correta valorização da qualidade de seu produto. Contudo, as normas

estabelecidas devem permitir aos consumidores finais a certeza de estar adquirindo um

produto de qualidade.

Inicialmente, observa-se algumas normas que melhor representam a evolução e o

“status quo” da legislação brasileira a respeito do café nos seguintes documentos:

1 – Resolução – CNNPA ( Comissão Nacional de Normas e Padrões para

Alimentos) nº 12, de 1978, que especifica um item para café torrado e moído no que se

refere aos padrões de identidade e qualidade para os alimentos (e bebidas), prevalecendo

sobre as normas técnicas especiais – o café torrado deve ser constituído por grãos torrados

procedentes de espécimes vegetais genuínos, sãos e limpos, ou o pó proveniente dos mesmos.

Nessa resolução, era tolerada a porcentagem de no máximo 1% de impurezas (cascas,

paus), no café torrado, em grão ou moído.

2 – Portaria nº 377, de 26 de abril de 1999, do Ministério de Saúde (M.S), que

tinha por objetivo fixar a identidade e a qualidade do café torrado em grão e o café torrado e

moído, sendo desta forma revogada a Resolução descrita acima (nª 12/78). Esta portaria

continha no que diz respeito à presença de cascas e paus no café torrado e moído, um limite

de 1% o que significa dizer que as amostras que fossem avaliadas segundo a identidade e

30

qualidade do café torrado e moído, deveriam respeitar este limite, caso contrário seriam

julgadas insatisfatórias.

3 – Instrução normativa nº 16 de maio de 2010, do Ministério de Estado da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), que segundo esta legislação mais recente,

o café era considerado “fora do tipo” quando apresentasse umidade acima de 5 % e teor de

impurezas acima de 1%. O café só seria desclassificado se apresentasse percentual de

alimentos ou substancias estranhas ao café igual ou superior a 1,3%, sendo que os materiais

estranhos não poderiam estar em proporção acima de 0,1 %, quando considerados

isoladamente e nem exalar odores estranhos e impróprios para o consumo. Portanto não,

seriam apenas cascas e paus, mas sim de todos outros materiais que deveriam obedecer ao

limite.

. Exemplos: 0,5% Cascas e Paus + 0,4% Sedimentos + 0,1% Cevada = 1,0%

impurezas -> Café aprovado; 0,5% Cascas e Paus + 0,6% Sedimentos + 0,1% Cevada = 1,2%

impurezas -> Café fora do tipo; 0,5% Cascas e Paus + 0,7% Sedimentos + 0,1% Cevada =

1,3% impurezas -> café desclassificado; 0,2% Cascas e Paus + 0,3% Sedimentos + 0,2%

Cevada = 0,7% impurezas -> café desclassificado; (pois o percentual de matérias estranhas,

cevada, é superior a 0,1%).

Paralelamente a égide legislativa brasileira que estabelece limites de impurezas, o

mercado externo do café solicita através de varias organizações e cooperativas, dentre as

quais se pode citar a CIRAD - Coopération Internationale em Recherche Agronomique pour

le Développement, o ASIC – Association for Scientific information on Coffee, a OIC –

International Coffee Organization e a FAO – Food and Agriculture Organization, além do

FSI/USDA – Food Safety and Inspection Service – United StatesDepartment of Agriculture, a

revogação de limites de impurezas e adulterantes, visando o direito de escolha do consumidor

e sua integridade com relação a sujidade.

No mesmo escopo, o “Codex Alimentarius”, ligado FAO – Organização para a

Alimentação e a Agricultura – (Food and Agriculture Organization) e a OMS – Organização

Mundial de Saúde, órgão que estabelece os padrões genéricos e globais para alimentos,

conforme CODEX STAN 1-1985, que trata sobre a rotulagem de alimentos, disponibiliza as

informações completas ao consumidor internacional do conteúdo dos produtos adquiridos,

bem como averigua se há ou não limitação para matérias estranhas.

31

Além disso, pode-se relacionar o esforço internacional pela melhoria dos padrões na

qualidade dos grãos de café, que se traduzem no aprimoramento, pelos mecanismos de

ingerência da legislação mundial, a normalização interna existente em vários países

importantes e grandes consumidores da bebida de café, como é o caso do FDA – Food and

Drug Administration, através do seu Food Code, nos Estados Unidos da América, bem como

outras normas, em países como Canadá (HEALTH PROTECTION BRANCH – Guidelines

For General Cleanliness Of Food, 1999), Comunidade Europeia, Peru (PNTP 209.027, 2001),

dentre outros, que além de seguirem a legislação internacional específica do café, estabelecem

a obrigatoriedade da circulação exclusiva de um café puro livre de adulterantes e impurezas.

Somente em 2013 na Instrução normativa Nº 7, de 22 de Fevereiro do Ministério

de Estado da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) resolve revogar a Instrução

Normativa nº 16, de 24 de maio de 2010, publicada no Diário Oficial da União do dia 25 de

maio de 2010, seção 1. Isto significa que não será mais permitido nenhuma concentração de

adulterantes em café, assim como observado nas legislações de países no exterior.

Desse modo, a discrepância de realidade legislativa imposta aos cafés brasileiros que

frequentam o mercado interno e externo traduzir-se-á, com certeza, nos resultados obtidos

neste trabalho, a serem posteriormente, discutidos.

1. 2. 1 Método para detecção de adulterantes em café

Os laboratórios oficiais e credenciados realizam os exames técnicos e científicos

exigidos para conferir segurança e qualidade alimentar aos produtos do País. São as unidades

da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários, que pertence ao Sistema Unificado de

Atenção à Sanidade Agropecuária (SUASA), do Ministério da Agricultura. As unidades do

governo são coordenadas por seis Laboratórios Nacionais Agropecuários (LANAGROS), com

centrais no Pará, Rio Grande do Sul, em Pernambuco, Goiás, Minas Gerais e São Paulo. Essas

unidades realizam de 30% a 40% dos exames requisitados oficialmente, muitos deles com

exclusividade. A rede de laboratórios credenciados, privados ou vinculados a instituições de

ensino e fundações, completa o trabalho. O credenciamento desses estabelecimentos ocorre

por área de atuação mediante o cumprimento dos regulamentos editados pelo ministério. Da

propriedade rural até o ato de compra do consumidor, passando pelo transporte e as formas de

32

processamento, em praticamente todas as fases da cadeia produtiva agropecuária são

requisitados diferentes serviços laboratoriais (MAPA, 2013).

No Brasil, o primeiro método para detectar e quantificar a adulteração de café

investigou a adição de cascas de café no pó torrado e foi proposto por Menezes Jr. e Bicudo

(1958). O método foi baseado na análise microscópica visual de café em pó previamente

tratado com clorofórmio. As cascas de café foram separadas manualmente através do uso de

um microscópio estéreo e quantificados com um diagrama de área padrão. Uma evolução

desta técnica é a utilização de uma balança analítica, em vez de uma área de diagrama

(MENEZES; BICUDO, 1958).

O processo convencional atual no Brasil para detecção de fraudes em café torrado e

moído data de 1983, e caracteriza-se por ser um método subjetivo, extremamente dependente

de pessoal treinado. Para identificar o material fraudado é necessário realizar uma separação

manual com o auxílio de uma pinça e de uma lupa eletrônica entre os grânulos de café puro

dos grânulos de impurezas provenientes da fraude. Em seguida, os dois conjuntos de materiais

são pesados para se determinar a porcentagem da fraude presente na amostra analisada

(LOPEZ, F. C. 1983).

Desde os anos 60, métodos baseados em microscopia eletrônica têm sido utilizado

pelos órgãos de fiscalização para a detecção de adulterantes e outras sujidades. Estes métodos

convencionais para identificação de adulterantes utilizando técnicas de reconhecimento de

padrões de cores, fotografias características e processamento digital de imagens por

computador, são métodos subjetivos e, consequentemente, a confiabilidade da experiência do

analista é necessária, sendo assim, sujeito a erro humano.

Outra metodologia também utilizada para a detecção de adulterantes em café in natura

e torrado e moído é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) que, através do

tempo de retenção da substância química na coluna cromatográfica, permite separar

marcadores químicos dos adulterantes como, y-tocoferol, xilose, glicose, frutose e etc.

Entretanto esta metodologia está sujeita a efeito direto de matriz e possui baixa

especificidade, já que não poderia afirmar de qual alimento específico à substância detectada

pertence. (BLANC et al 1989; PRODOLLIET et al, 1995; GIRARD, et al 2006; RUIZ-

MATUTE et al, 2007).

33

Recentemente, métodos espectroscópicos baseados em leitura de transmitância ou

refletância têm sido propostos para análise de autenticidade em café torrado e moído.

Segundo Reis et al (2012) é possível a utilização do método Diffuse Reflectance Infrared

Fourier Transform Spectroscopy (DRIFTS) para a discriminação entre café, milho e casca

torrados. Entretanto, a discriminação entre os alimentos depende de extensos cálculos

estatísticos por apresentarem espectros similares. A quantificação dos alimentos adulterantes

também seria um fator limitante desta metodologia já que, não é especificada a substância que

caracteriza o espectro para cada adulterante (OLIVEIRA et al, 2004).

Ultimamente, tem se utilizado para alimentos, ferramentas da Biologia Molecular,

mais especificamente, a técnica baseada na reação em cadeia da DNA polimerase baseada nos

princípios da replicação do DNA fita dupla, o mecanismo responsável pela transmissão da

informação genética nas células. Trechos de DNA genômico podem ser amplificados in vitro,

sob condições específicas, nas quais são adicionados ao meio reacional DNA polimerase

termoestável, deoxinucleotídeos e oligonucleotídeos curtos - primers ou iniciadores,

(apresentando sequência de bases complementares ao DNA molde). Os ciclos dessa reação

produzem fragmentos de DNA da sequência-alvo, mesmo a partir de traços de DNA molde

(em 3 horas, obtém-se aproximadamente 1.000.000.000 cópias). O DNA pode ser isolado a

partir de inúmeras amostras, inclusive alimentos, utilizando técnicas de extração apropriadas

para cada material (MEYER, 1995).

Tipicamente, o programa de PCR consiste de uma etapa de desnaturação, anelamento

e extensão. Na desnaturação ocorre a separação do DNA dupla-fita através do aumento da

temperatura a mais ou menos 95°C. Posteriormente, a temperatura diminui a 55 - 65°C para

que ocorra o anelamento dos oligonucleotídeos ao DNA molde. Depois do anelamento dos

primers, a temperatura é elevada a 72°C, temperatura ótima de polimerização da Taq

polimerase. Nesta etapa, ocorre a adição dos nucleotídeos complementares ao DNA molde a

partir dos primers, e a complementação ocorre ao longo de ambas as cadeias do molde de

DNA da molécula, sendo assim, exatamente igual à fita molde (mãe), e já no primeiro ciclo o

DNA é duplicado. Com decorrer dos ciclos (40 ciclos) os primers delimitam uma região

especifica, sendo esta amplificada exponencialmente (Figura 7) (BARROS et al, 2008).

A técnica de PCR apresenta rapidez de execução, alto grau de seletividade e

sensibilidade, critérios estes que fazem com que este método seja o mais empregado na

maioria dos laboratórios analíticos interessados na detecção de organismos geneticamente

34

modificados, glúten, microrganismos patogênicos, além da análise de autenticidade de

diversos alimentos (ARLORIO et al, 2007; CANKAR et al, 2008; LAUBE et al, 2010;

CASTELLÁ; CABAÑES, 2011).

Figura 7: Representação do processo de amplificação da PCR, adaptado de HEID et al, 2011.

1. 2. 2 PCR em tempo real

Um aprimoramento desta técnica é a PCR em tempo real, também conhecida como

PCR quantitativa (qPCR). A PCR em tempo real permite o monitoramento da reação de

amplificação ciclo a ciclo, em sistema fechado, sem interferências externas no progresso da

reação. Isso porque um sinal fluorescente emitido é detectado em proporção ao aumento da

quantidade de DNA amplificado. Essa fluorescência é emitida por compostos fluoróforos, que

podem estar ligados a sondas tipo TaqMan ou intercalados na dupla fita do DNA amplificado

como o SYBR Green (MULLIS et al, 1990; HEID et al, 2011).

O aumento desse produto nos ciclos iniciais é pouco significativo, mas com o

progresso da reação, pode-se observar um aumento exponencial do sinal emitido (fase

35

exponencial ou linear). Nesse momento da reação, a eficiência é máxima, pois os reagentes

estão todos em concentrações adequadas que permitem o máximo de rendimento da reação.

Após essa fase, a curva de amplificação começa a perder a linearidade, pois os

reagentes já não estão totalmente disponíveis, diminuindo a eficiência e o rendimento da

reação (platô). A faixa linear da curva de amplificação, entre a linha de base (baseline) e a

mudança de curvatura, é usada para a determinação do parâmetro que permitirá a realização

dos cálculos para quantificação da sequencia de DNA alvo. É nessa faixa que é traçada a linha

limite (threshold), e determinado o ciclo da PCR que “cruza” tal linha limite chamado ciclo

de threshold Ct (Figura: 8 ) (HEID et al, 2011).

Figura 8: Esquematização de um gráfico de PCR em Tempo Real. Quatro fazes podem ser observadas: Baseline:

representa os ciclos inicias da reação em que não há produto de PCR suficiente para emitir fluorescência. Fase

exponencial: quando o produto da PCR aumenta exponencialmente. Fase linear: a fase linear é caracterizada por

um aumento linear no produto de PCR até que os regentes se tornem limitados. Platô: ocorre quando os

reagentes são consumidos não há mais aumento no produto de PCR. Treshold: linha limite que determina o

ciclo da PCR Ct. (Adaptado de Barros et al 2008).

A quantificação pode ser realizada por comparação direta dos valores de fluorescência

detectada no Ct (método ΔCt), ou por comparação do número de cópias utilizando-se uma

curva padrão (método da curva padrão) (HEID et al, 2011).

1. 2. 3 Sistemas de detecção por PCR em tempo real

36

A chave para a PCR em tempo real é a capacidade de controlar o progresso da

amplificação do DNA, em tempo real. E isto só é possível através de substâncias químicas e

instrumentação. Geralmente, os sistemas de detecção são corantes especiais ou sondas (Figura

9) (MARK A. VALASEK1; JOYCE J. REPA, 2005).

Figura 9: Esquema A: absorção e emissão do fluoróforos SYBR Green ligado superficialmente à molécula de

DNA. Esquema B: hibridização da sonda com o alvo e hidrólise do fluoróforo repoter (VALASEK; REPA,

2005).

O SYBR Green é um fluoróforo que se liga ao sulco menor da dupla-hélice de DNA

emitindo maior fluorescência do que quando está em solução (REISCHL et al, 2002).

Portanto, quanto maior a quantidade de DNA-duplafita presente na reação, maior a

quantidade de SYBR Green ligado ao DNA e também maior a emissão de fluorescência.

Assim, qualquer amplificação de DNA é traduzida em um sinal fluorescente. Por isso, este

sistema de detecção é considerado menos específico quando comparado a sistemas de

detecção tipo sonda. Para contornar esta limitação, é necessário a adição de uma etapa extra

na reação conhecida, como curva de dissociação ou Melting Curve (REISCHL et al, 2002).

Após o término da reação de PCR o produto amplificado é submetido a um aumento

gradual de temperatura, fazendo com que as moléculas de DNA se desnaturem

gradativamente. Como a ligação de hidrogênio entre a guanina e a citosina é mais forte do que

a ligação entre a adenina e timina, as regiões do produto (amplicon) ricas em guanina e

citosina resistem mais tempo ligadas com o aumento da energia térmica. Como parte da

molécula ainda está ligada, um sinal fluorescente ainda é emitido, e este sinal luminoso mais

37

fraco é detectado pelo equipamento de qPCR. Então, a diminuição da fluorescência é plotada

(como slope negativo) versus à temperatura, o que resulta em um pico acentuado de fusão

(melting temperature, Tm) para cada produto de PCR (Figura 10).

Figuara 10: Gráfico da curva de dissociação demonstrando o DNA dupla-fita submetido ao aumento de

temperatura, gerando a Tm.

Através da curva de dissociação, é possível descriminar com alta sensibilidade todos

os produtos amplificados durante a reação, ou seja, qualquer amplificação inespecífica.

Através da curva de dissociação, é possível verificar também a qualidade dos primers, a

concentração do DNA molde e a temperatura de anelamento ideais para a condução da reação.

(VALASEK; REPA, 2005).

As sondas do tipo TaqMan possuem maior especificidade, pois o seu sinal

fluorescente só é emitido quando ela está pareada na parte central da região alvo delimitada

pelos primers (Figura 11). As sondas são marcadas quimicamente nas extremidades 5’-3’em

uma extremidade a sonda é marcada com um composto com efeito quencher e em outra com

efeito repórter (VALASEK; REPA, 2005). Quando esses compostos estão próximos, ligados

na sonda, o quencher através da transferência de energia por ressonância, reduz grandemente

a emissão fluorescente do repórter. Se a sequência alvo está presente, a sonda se hibridiza na

região central delimitada pelos primers (Figura 11).

°C

ΔR

N

38

Figura 11: Esquematização da função 5’ exonucleásica da Taq polimerase. (Adaptado de Yuan et al

2000).

Ao reconhecer os primers, a DNA polimerase inicia a extensão da molécula,

acrescentando os nucleotídeos trifosfatados, mas ao perceber a presença da sonda a sua frente

à enzima ativa a sua função 5’ exonucleásica e cliva a sonda separando os corantes quencher

e repórter possibilitando assim o repoter emitir a sua fluorescência (LIFE TECHNOLOGIES,

2013).

A cada ciclo da reação, as moléculas de corante reporter adicionais são clivadas a

partir de suas respectivas sondas, o que resulta em um aumento na intensidade de

fluorescência proporcional à quantidade de amplicon produzido (LIFE TECHNOLOGIES,

2013).

39

2 JUSTIFICATIVA

Diante do atual cenário de adulterações frequentes no mercado nacional e,

considerando a importância do café para a economia brasileira, a falta de sensibilidade e

especificidade dos métodos atualmente empregados para detecção de fraudes, e a necessidade

de desenvolvimento de métodos seguros e eficazes, capazes de identificar e quantificar a

presença de adulterantes em café torrado e moído e café solúvel, justifica-se o

desenvolvimento de um método baseado em qPCR para este fim.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral: O objetivo geral do presente trabalho foi desenvolver um método capaz de

detectar e estimar os teores dos adulterantes mais comumente observados no café torrado e

moído brasileiro, utilizando a técnica qPCR.

3.2 Objetivos específicos:

- Definir marcadores moleculares através de genes endógenos e desenhar as

ferramentas para detecção/quantificação das sequências de DNA específicas do café e dos

adulterantes (cevada, milho, arroz);

- Determinar parâmetros de desempenho dos sistemas de detecção e quantificação

definidos (linearidade, seletividade, especificidade, limite de detecção- LD e limite de

quantificação- LQ);

- Testar os sistemas de detecção e quantificação de adulterantes em diferentes

amostras de café do mercado brasileiro.

40

4 MATERIAIS E METODOS

4. 1 FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA

4. 1. 1 Definição dos marcadores moleculares e dos sistemas de detecção para os adulterantes

As sequências de DNA correspondentes aos genes endógenos para café, cevada, milho

e arroz, foram pesquisadas no banco de dados de genomas Genbank do National Center for

Biotechnology Information (NCBI), com os número de acesso EF044213.1, NC_008590.1,

M60837.1 e NC_008394.4, respectivamente. As sequências escolhidas foram submetidas à

análise de similaridade com outros genes do banco de genomas, no software online Basic

Local Alignment Search Tool (BLAST) do próprio NCBI, que permite identificar regiões

similares entre sequências homólogas de diferentes espécies e calcular a sua significância

estatística (ZHANG et al, 2000; MORGULIS et al, 2008). Para cada marcador (gene)

escolhido, foram desenhados os sistemas de detecção. Os oligonucleotídeos iniciadores

(primers) foram desenhados utilizando-se o software online Genefisher, com um tamanho de

fragmento amplificado de ±100 pb. Os respectivos marcadores (primers) foram analisados in

silico, no software online BIOINFX- Free Ferramentas Online, com seus genes alvos

previamente selecionados. Os oligonucleotídeos iniciadores foram sintetizados por MWG

Operon Eurofins (Ebersberg, Alemanha) (GIEGERICH et al, 1996; http://bioinfx.net/#info)

4. 2 AMOSTRAGEM E TORREFAÇÃO

4. 2. 1 Amostras controle

Quatro amostras de café torrado e moído de uma marca comercial com grau de torra

escuro foram adquiridas para testar os métodos de extração CTAB, Dellaporta, DNeasy e o

método híbrido CTAB/DNeasy.

Dez amostras cruas de café (4 da espécie C. arabica, cultivares Mundo Novo, Catuai

Amarelo, Catuai Vermelho e Bourbon; e 6 da espécie C. canephora cv. Conillon) foram

utilizadas como controle de pureza, sendo obtidas diretamente de produtores dos Estados de

São Paulo, Minas Gerais e Espírito Santo. Amostras in natura de cevada (Hordeum vulgare),

milho não geneticamente modificado (Zea mayz) e arroz agulhinha (Oryza sativa) foram

utilizadas como alvo específico. Amostras de soja (Glicine max) e trigo (Triticum aestivum)

41

foram utilizadas como alvos não específicos. Todas foram adquiridas no mercado livre de

Santa Cruz, Rio de Janeiro.

Duas amostras de café entre as dez utilizadas no estudo (C. arabica), e uma de cada

um dos alimentos adulterantes (cevada, milho, arroz, soja e trigo), foram torradas,. As

sementes de café foram torradas em um torrador de leito fluidizado (I-Roast, EUA), a 230 ºC

para se obter o grau de torra escuro (# 35 Agtrom- SCAA); As amostras de cevada, milho e

arroz foram torradas em micro-ondas para obter a mesma cor que o café. Todas as amostras

foram moídas em moinho (IKA A11 basic) e peneiradas em peneira com malha de 500 µm.

4. 2. 2 Amostras comerciais

Vinte e uma amostras de café comercial (torrado e moído e solúvel) foram adquiridas em

diferentes mercados do Brasil. Das 21 amostras, 9 foram classificadas como gourmet ou

superior e 12 tradicionais, sendo 3 do tipo solúvel, comercializadas a preços mais baixos.

4. 3 Adulterações de amostras de café em laboratório

Para calcular o teor de adulterantes nas amostras comerciais de café, foram construídas

curvas padrão, através da adulteração de um blend de 80% de Coffea arabica e 20% de Coffea

canephora, com acréscimo de 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% de cevada e de milho, separadamente.

As amostras foram pesadas em balança analítica (Bioprecisa FA -2104N, Brasil).

Para a quantificação, ou seja, determinação do percentual de cada adulterante, a

seguinte equação da reta foi utilizada:

y = ax + b

onde:

x = log [% de adulterante adicionado intencionalmente];

y = média Ct em amostras de café intencionalmente adulterados

42

4. 4 Extração de DNA

4. 4. 1 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras in natura

Para o isolamento e purificação do DNA das amostras de café, cevada, milho, arroz e

trigo, as mesmas foram acondicionadas em tubo Eppendorf de 1,5 mL (estéril) e pesadas, em

duplicata, em balança analítica (Bioprecisa FA-2104N, Brasil) até alcançarem 100mg. Em

seguida, foram adicionados 1.000 µL do tampão CTAB (1.4 M NaCl, 20g/L CTAB, 0.1 M

Tris-HCl, 20mM Na2EDTA, pH 8.0); e 20 µL de proteinase K (20 mg/mL) (Life

Technologies; São Paulo, Brasil), sendo homogeneizados a posteriori e incubados em banho

aquecido a 65 ºC por 1:30 h, com agitação para homogeneização a cada 30 min. Após esta

etapa, foram adicionados 20 µL de RNAse (10mg/mL) (Life Technologies; São Paulo, Brasil)

e incubados em temperatura ambiente por 15 min, seguidos de centrifugação por 10 min a

17,950 x g (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha). Um volume de 500 µL do

sobrenadante foi transferido para um novo tubo e adicionado 500 µL de clorofórmio absoluto,

homogeneizado e centrifugado por 10 min a 17,950 x g. Quinhentos microlitros da fase

aquosa foram transferidos para um novo tubo de 1,5 mL e foram adicionados 2 volumes do

tampão de precipitação CTAB (5g/L CTAB; 0,04M NaCl) sendo incubado por 1:30 h em

temperatura ambiente. Logo em seguida, a solução foi centrifugada a 17,950 x g por 10 min e

o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi dissolvido com 350 µL de NaCl 1,2M. Foi

adicionado 350 µL de clorofórmio, agitado em vórtex (Vixar KMC -1300V, Brasil) e

centrifugado por mais 10 min a 17,950 x g. O filme superior foi transferido para um novo

tubo e adicionado igual volume de isopropanol e incubado a -20ºC por 24h. O precipitado foi

centrifugado por 10 min 17,950 x g, lavado com etanol 70% e posto para secagem em fluxo

laminar. Logo após a secagem, as amostras foram resuspensas em água deionizada tipo Milli-

Q. Todas as reações foram realizadas em duplicatas.

Após a extração, os isolados de DNA foram preparados para visualização em cuba de

eletroforese 150 A/ 150V por 100 min em gel de agarose 2% TAE 1× corado com brometo de

etídio 0,5µg/mg (LifeTechnologies; California, Estados Unidos), visualizados em

transiluminador UV (Vilber Lourmat ECX-20 – M, Alemanha) e quantificados em

espectrofotômetro a 260 nm/ 280 nm (Shimadzu UV-1800, Japão).

43

4. 4. 2 Extração e quantificação de DNA a partir de amostras processadas

4. 4. 2. 1 Escolha do método de extração de DNA para as amostras torradas e moídas

Para a avaliação dos protocolos para extração de DNA das amostras torradas e moídas,

foram testados 4 métodos, os métodos CTAB, Dellaporta, DNeasy modificado e o método

hibrído CTAB/DNeasy, desenvolvido no presente trabalho. Os testes foram realizados

usando o café torrado e moído como matriz. O método CTAB foi conduzido como descrito

anteriormente. O método Dellaporta está descrito a seguir.

As amostras de café torrado e moído foram adicionadas ao tubo Eppendorf de 1,5 ml e

pesadas (50 mg) em balança analítica (Bioprecisa FA-2104N, Brasil). Em seguida, foram

adicionados 1.000 µL do tampão de extração extraction buffer EB (Tris 100 mM, EDTA 50

mM, NaCl 500 mM, β-mercaptoetanol 10mM, pH 8,0), e 300 µL de dodecil sulfato de sódio-

SDS 20%. A mistura foi homogeneizada e agitada em vórtex (Vixar KMC -1300V, Brasil).

Após a homogeneização, a mistura foi incubada em banho aquecido a 65 ºC, por 10min. Em

seguida, foram adicionados 300 µL de acetato de sódio 3M, seguido de homogeneização em

vórtex e incubação a 0 ºC por 20 min. Subsequentemente, a mistura foi centrifugada por 20

min a 17,950 x g (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha), sendo 500 µL do

sobrenadante transferidos para um novo tubo de 1,5 mL, no qual adicionou-se 500 µL de

isopropanol, seguido de incubação a -20 ºC por 1 h e centrifugação por 15 min a 17,950 x g.

O sobrenadante foi descartado. O tubo foi vertido para baixo em papel toalha para a secagem

do precipitado. O precipitado foi dissolvido em 700 µL tampão TE (Tris 50 mM, EDTA 10

mM, pH 8,0) e centrifugado por mais 10 min a 17,950 x g rpm. O sobrenadante foi transferido

para tubo novo de 1,5 mL no qual foram adicionados 75 µL de acetato de sódio 3M e 500 µL

de isopropanol. Em seguida, a mistura foi incubada por 5 min à temperatura ambiente e

centrifugado por 5 min a 17,950 x g, sendo o sobrenadante descartado. Um mL de Etanol 70%

foi adicionado ao tubo e centrifugado por 5 min a 17,950 x g . A posteriori, o DNA

precipitado foi seco em fluxo laminar, e resuspenso com 50 µL de água deionizada tipo Milli-

Q. Todas as reações foram realizadas em duplicatas.

Após extração, os isolados de DNA foram preparados para visualização em cuba de

eletroforese 150 A/ 150 V por 100 min em gel de agarose 2%, como já descrito.

O método híbrido CTAB/DNeasy foi avaliado por apresentar mais etapas de

purificação sendo mais rápido do que os métodos de extração tradicionais, que utilizam

44

incubação overnight. Para tanto, foram pesados 150 mg de amostra na balança analítica e

acondicionados em tubo de 2 mL estéril Eppendorf. Adicionou-se 300 µL de água deionizada

tipo Milli-Q, 20 µL de proteinase K (20 mg/ml) (Life Technologies; São Paulo, Brasil) e

1.000 µL de tampão CTAB modificado (1.4 M NaCl, 20g/L CTAB, 0.1 M Tris-HCl, 20mM

Na2EDTA, 1% β-mercaptoethanol, 4% Polivinilpirrolidona (v/v), pH 8,0) sendo

homogeneizado e incubado em banho aquecido a 65 ºC por 1 h com intervalos para

homogeneização a cada 20 min. Em seguida, adicionou-se 20 µL de RNAse (10 mg/ml)

(LifeTechnologies; California, Estados Unidos) e incubou-se a mistura por 5 min à

temperatura ambiente e por 5 min a 65 ºC, seguido de centrifugação por 10 min a 17,950 x g

(Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha). Foram transferidos 800 µL do

sobrenadante para um novo tubo e mais 800 µL de clorofórmio absoluto foram adicionados,

seguido de agitação em vortex (Vixar KMC-1300V, Brasil) e centrifugação por mais 10 min a

17,950 x g. Setecentos microlitros da fase aquosa foram transferidos para um novo tubo e

mais 700 µL de clorofórmio absoluto foram adicionados, seguido de agitação em vortex e

centrifugação por mais 10 min a 17,950 x g. Quinhentos microlitros do sobrenadante foram

transferidos para um novo tubo e 2 volumes do tampão de precipitação CTAB (5 g/L CTAB,

0,04 M NaCl) foram adicionados. O tubo foi incubado em temperatura ambiente por 1 h. Ao

término da incubação, a mistura foi centrifugada por 5 min a 20,817 x g. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado, dissolvido com 400 µL de NaCl 1.2 M. Foi também adicionado

1.5x o volume do tampão AP3 binding com etanol e a mistura foi homogeneizada por meio de

pipetagem. Logo após a homogeneização, foram adicionados 650 µL do lisado na coluna

adsorvente DNeasy Mini spin e a mistura foi centrifugada por 1 min a 6,800 x g. A última

etapa foi repetida novamente até o fim de todo o lisado no tubo. Foi colocado a coluna

DNeasy Mini spin dentro de em novo tubo de 2 mL para o processo de lavagem com o tampão

AW wash DNeasy. Quinhentos microlitros do tampão AW foram adicionados na coluna, que

foi centrifugada por 1 min a 6,800 x g. Mais 500 µL do tampão AW foram adicionados na

coluna e centrifugados por mais 2 min a 20,817 x g. Após a lavagem, o tampão de eluição AE

DNeasy foi aquecido, sendo 200 µL deste tampão adicionados à coluna de sílica modificada

DNeasy para a eluição do DNA. O eluato foi submetido a mais uma etapa de purificação com

colunas clean DNA Eurofins, (Ebersberg, Alemanha).

Para conduzir o método DNeasy modificado, foram pesados 100 mg da amostra em

balança analítica (Bioprecisa FA-2104N, Brasil) e acondicionados em tubo Eppendorf de 2

mL. Foram adicionados 360 µL da solução de lise AP1 acrescidos de 40 µL de proteinase K

45

(20 mg/mL) (DNeasy Mini Plant, Alemanha) e homogeneizado. Em seguida, a amostra foi

incubada em banho aquecido a 65 ºC por 3 h. Após o aquecimento, foram adicionados 4 µL

de RNase (10 mg/ml) (DNeasy Mini Plant, Alemanha). O tubo foi agitado em vortex e

incubado a temperatura ambiente por 5 min. Cento e trinta microlitros da solução de

precipitação AP2 foram adicionados, a mistura foi homogeneizada manualmente e incubada

no gelo por 5 min. Posteriormente, foi centrifugada a 17,950 x g por 5 min. Quatrocentos

microlitros do sobrenadante foram aplicados na coluna Mini Spin lilac e centrifugados a

19,356 x g (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Alemanha) por 3 min. O filtrado foi

transferido para um novo tubo de 2 mL. Foi adicionado ao filtrado 1.5 x volume do tampão

AP3 binding com etanol DNeasy homogeneizado por pipetagem. Logo em seguida, o

precipitado foi adicionado na coluna DNeasy Mini spin. White e centrifugado a 6,800 x g por

1 min para a adsorção do precipitado na coluna. 500 µL do tampão AW foram aplicados na

coluna e a mistura foi centrifugado a 6,800 x g por 1 min. Mais 500 µL do tampão AW foram

adicionados para a lavagem final do DNA, sendo a mistura centrifugada a 19,356 x g por 2

min para que a coluna seque. O tampão AE para eluição do DNA retido na coluna foi

aquecido previamente a 65 ºC, adicionado na coluna e incubado por 5 min à temperatura

ambiente. Esta etapa foi repetida duas vezes. O eluato foi quantificado e analisado nas

mesmas condições supracitadas nos demais métodos. Todas as reações foram realizadas em

duplicatas.

4. 4. 2. 2 Análise da amplificabilidade

Para a avaliação da amplificabilidade dos DNAs genômicos das amostras processadas, a

análise de PCR-RAPD (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biossystems, Estados Unidos)

foi conduzida, com um volume final de 50 µL nas seguintes condições: 30 ng/µL de DNA,

Tampão PCR 1× (20mM Tris-HCl pH 8.4; 50mM KCl), 3.5mM MgCl2, 0,4 μM de

desoxinucletídeos trifosfatados dNTPs (LifeTechnologies; California, Estados Unidos), 0,15

U/μL DNA polimerase (LifeTechnologies; California, Estados Unidos) e primers OPW 15

Operon Eurofins contendo 20 μM. O termociclador foi calibrado nas seguintes condições: 40

ciclos com desnaturação inicial (95 ºC por 5 min), mais 50 s a 95 ºC, temperatura de

anelamento de 55 ºC por 50 s e temperatura de polimerização de 72 ºC por 50 s e adicionado

ao término mais 70 ºC por 5 min. Os produtos de PCR foram preparados para visualização em

cuba de eletroforese 150 A/ 150 V por 100 min em gel de agarose 2% TAE 1× corado com

46

Brometo de Etidium 0,5 µg/mg (LifeTechnologies; California, Estados Unidos) e visualizados

em transiluminador UV (Vilber Lourmat ECX-20–M, DEU). Todas as reações foram

realizadas em duplicatas.

4. 5 SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE DOS PRIMERS

4. 5. 1 PCR convencional

Para a avaliação da seletividade dos primers, foram conduzidas análises por PCR

convencional com seus respectivos alvos, utilizando-se uma concentração inicial de DNA

molde de 40 ng/µL: Tampão PCR 1× (20 mM Tris-HCl pH 8,4; 50 mM KCl), 3,5 mM

MgCl2, 0,4 μM de desoxinucletídeos trifosfatados dNTPs (Invitrogen LifeTechnologies;

California, Estados Unidos), 0,15 U/μL de DNA polimerase (Invitrogen LifeTechnologies;

California, Estados Unidos) e 20 μM de primers. O termociclador (GeneAmp PCR System

9700, Applied Biossystems, California, Estados Unidos) foi calibrado nas seguintes

condições: 40 ciclos com desnaturação inicial (95 ºC por 5 min), seguido da seguinte

sequência: 50 seg a 95 ºC, tempo e temperatura de anelamento para cada primer, 50 seg a

temperatura de polimerização de 72 ºC, 5 min a 70 ºC. Os produtos de PCR foram

separados e visualizados como já descrito anteriormente, por eletroforese em gel de agarose,

seguido de foto-documentação. Todas as reações foram realizadas em duplicatas.

4. 5. 2 Especificidade com PCR em Tempo Real

Para a análise de especificidade, os primers foram submetidos à reação qPCR ABI

PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, California, Estados Unidos. A

mistura continha 1 x Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) e iniciadores

com concentração de 240 nM e 50 ng/µL de DNA molde em um volume final de 25 µl. As

condições térmicas foram as seguintes: 10 min a 95 ºC, 45 ciclos de 15 seg a 95 ºC e 1 min à

temperatura de anelamento de cada par de iniciadores. Ao término da reação, foi adicionada a

curva de dissociação com temperatura inicial de 60 ºC. Como o objetivo foi a análise da

especificidade, foi realizada a reação de cada primer com o seu DNA genômico alvo e,

separadamente, com o DNA genômico das demais espécies avaliadas no presente trabalho.

Todas as reações foram realizadas em duplicatas.

47

4. 6 SENSIBILIDADE E LINEARIDADE

4. 6. 1 Construção da curva padrão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação

(LQ)

Para a construção da curva padrão, foram feitas diluições com doze pontos

correspondentes a doze concentrações de DNA isolado em água Milli-Q, variando de

0,0002% a 100% (m/v) de DNA genômico de cevada e, 0,01% a 100% para café Para milho e

arroz, as curvas foram feitas utilizando-se 9 concentrações de DNA genômico.. As reações

foram conduzidas em qPCR ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied

Biosystems, California, EUA. A mistura continha 1 x Power SYBR Green Master Mix

(Applied Biosystems, California, Estados Unidos) e os iniciadores 240 nM, e 10 ng/µL de

DNA molde em um volume final de 25 µL. A condição térmica foi: 10 min a 95 º C, 45 ciclos

de 15 seg a 95 ºC e 1 min à temperatura de anelamento de cada par de iniciadores. Ao término

da reação, foi adicionada a curva de dissociação com temperatura inicial de 60 ºC. Todas as

análises foram feitas em decaplicatas.

Os valores dos Ct’s médios foram utilizados para formar a inclinação e o coeficiente

de correlação da reta (Tabela 1).

A eficiência foi calculada através da equação:

Eficiência = ((10^(-1/slope))-1) * 100

Slope = y da equação de correlação da reta.

Baseado na curva padrão de cada adulterante, foram utilizados os últimos pontos das

curvas para a definição dos limites de detecção (LD), a concentração do último ponto foi

multiplicada por três para determinar o limite de quantificação (LQ). Estes parâmetros foram

estabelecidos segundo Barros et al., 2008; Joint Research Centre; 2006; Cankar et al., 2006.

4. 7 DETECÇÃO DOS ADULTERANTES

A partir dos isolados de DNA das amostras comercias e adulteradas em laboratório foram

conduzidas reação qPCR ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems,

California, Estados Unidos. A mistura continha 1 x Power SYBR Green Master Mix (Applied

Biosystems) e iniciadores com concentração de 240 nM e 50 ng/µL de DNA molde em um

48

volume final de 25 µl. As condições térmicas foram as seguintes: 10 min a 95 ºC, 45 ciclos de

15 seg a 95 ºC e 1 min à temperatura de anelamento de cada par de iniciadores. Ao término da

reação, foi adicionada a curva de dissociação com temperatura inicial de 60 ºC. Os pimers de

cada adulterante está listado na tabela 4. As reações a partir das amostras que foram

adulteradas em laboratório foram realizadas com cinco réplicas já, as amostras comerciais em

triplicatas.

49

4. 8 FLUXOGRAMA EXPERIMENTAL

Escolha do método de

extração de DNA para

amostras processadas

Extração de DNA e

quantificação das

amostras

Escolha dos genes

marcadores, desenhos

dos primers e preparação

das amostras

Seletividade e

especificidade dos

primers

Construção de curvas padrão para

a determinação da eficiência,

limite de detecção, quantificação

e linearidade do método

Detecção de

adulterantes em

amostras adulteradas

em laboratório

50

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ESCOLHA DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO PARA AMOSTRAS PROCESSADAS

A escolha de um método de extração de DNA é de extrema importância para analises

em Biologia Molecular, pois cada amostra apresenta uma matriz química própria e um isolado

de DNA impuro, o que pode comprometer a reação inibindo a enzima Taq Polimerase,

podendo assim, apresentar um resultado falso negativo (KAWATA et al 2003; REN et al,

2006; PINTO et al, 2007; ELSANHOTY et al, 2011). Para este propósito, foram analisados os

métodos de extração CTAB, DNeasy, Dellaporta e o método híbrido CTAB & DNeasy

modificado, desenvolvido no presente trabalho.

A alta degradação do DNA genômico e a interação de substâncias intrínsecas do café

no isolado de DNA ocasionaram interferência na fluorescência do intercalante de DNA

(brometo de etídio), não sendo possível uma visualização satisfatória em gel de agarose, e não

permitindo descriminar qualitativamente quais dentre os métodos existentes seriam melhores

para a extração de DNA de café torrado moído (Figura 12). Entretanto, os resultados do

presente estudo são compatíveis com relatos da literatura (MARTELLOSSI et al, 2005;

SPANIOLAS et al, 2008).

Figura 12: Isolado de DNA genômico após extração com os métodos DNeasy/CTAB, Dellaporta, DNeasy e

CTAB (A, B, C e D respectivamente).

51

A concentração de DNA nos isolados de café processado com ponto de torra escura foi

determinada através da média de absorbâncias das amostras de 0,323 ± 0,006 a 260 nm e

0,667 ± 0,079 a 230 nm, resultando na concentração de 35,9 ± 0,643 ng/µL, com a razão entre

as absorbâncias de 0,7 (Figura 12). Segundo Murray e Thompson (1980), a razão ideal para

pureza entre 260/230 nm é 2. No entanto, 0,7 foi suficiente para o sucesso da reação.

Na Figura 13 é possível observar que apesar do grau de degradação do DNA genômico

e a baixa pureza, o isolado é amplificável e o método que apresentou melhor qualidade de

isolamento foi o método híbrido DNeasy/CTAB, por apresentar amplificação (raia 4) e mais

etapas de purificação, como precipitação do complexo formado entre o CTAB e o DNA;

centrifugação com clorofórmio, que desnatura proteínas, tornando insolúveis à fase aquosa,

onde o DNA é solúvel; adsorção em sílica modificada DNeasy e purificação com etanol 70 %

(MURRAY; THOMPSON, 1980). Além da associação das etapas de purificação dos

métodos CTAB e o DNeasy, a adição de β-mercaptoetanol, um forte redutor, permitiu evitar a

oxidação dos polifenóis durante o processo de extração em altas temperaturas (KAWATA et

al, 2003). Além disso, a adição do Polivinil Perrolidona (PVP) permitiu a otimização da

precipitação do DNA, separando-o de forma mais eficiente dos demais constituintes da matriz

celular (KIM et al, 1997; KAWATA et al, 2003).

Para avaliar a capacidade de amplificação das amostras de DNA obtida pelos

diferentes métodos de extração, PCR-RAPD foram conduzidas, usando o primer decamérico

OPW15. Em seguida, foi conduzida a eletroforese horizontal em gel de agarose (Figura 13).

52

Figura 13: Isolado de DNA genômico submetido à reação Random Amplification of Polymorphic DNA (PCR-

RAPD) para análise de amplificabilidade. O gel está disposto na seguinte ordem: Métodos de extração

Dellaporta, CTAB, DNeasy e DNeasy/CTAB, respectivamente. A raia 5 corresponde ao padrão de bases.

Segundo Martellossi et al (2005) a adição de carvão ativado melhora

significantemente a pureza do isolado de DNA. No entanto, embora tenha sido empregado no

presente trabalho, a qualidade do isolado de DNA a partir de café torrado e moído ainda pode

melhorar consideravelmente.

Após estas análises, o método escolhido para extração do café, cevada e arroz torrado

e moído foi o método híbrido CTAB/DNeasy modificado. As amostras in natura foram

extraídas utilizando-se método CTAB modificado supracitado.

5. 1. 1 Determinação da concentração de DNA isolado das amostras in natura e processadas

As concentrações das soluções de DNA das amostras in natura e processadas (torradas

e moídas) estão apresentadas nas Tabelas 2 e 3. A razão entre as absorbâncias (Abs260/Abs280)

que caracteriza um isolado de DNA como suficientemente puro, livre de contaminantes

proteicos e pronto para aplicação em PCR convencional e em tempo real é 1,8. (MURRAY;

THOMPSON, 1980; WAGNER et al, 1987; ZIRMMERMANN et al, 1998).

53

Tabela 2: Quantificação de DNA genômico dos alimentos in natura, razão de pureza 260/280 nm.

A razão entre as absorbâncias (Abs260/Abs230) traduz o quanto o isolado de DNA das

amostras estava contaminado com compostos fenólicos ou outras substâncias de baixo peso

molecular, como dissacarídeos, peptídeos e compostos aromáticos. Na Tabela 3, podemos

observar os resultados de absorbância e razão de pureza 260/230 nm do DNA genômico dos

alimentos in natura café e cereais. Os compostos fenólicos apresentam comportamento físico-

químico similar ao DNA, dificultando a sua separação. Considerando que o valor da razão

correspondente ao padrão de pureza é 2 quando se refere a compostos fenólicos (MURRAY;

THOMPSON, 1980; WAGNER et al, 1987; ZIRMMERMANN et al, 1998), a razão

observada no presente trabalho foi relativamente baixa. Sabe-se que o café é naturalmente

rico em compostos fenólicos, dificultando o isolamento de um DNA purificado (KIM et al,

1997; DUARTE et al, 2009). No entanto, mesmo sendo os compostos fenólicos um dos

principais inibidores de PCR, nossos resultados indicam que os valores da razão 260/230 nm

obtidos no presente trabalho foi suficiente para que a reação ocorresse.

Tabela 3: Quantificação de DNA genômico dos alimentos processados, razão de pureza 260/230 nm

Estudos realizados por Farah et al (2005, 2006) demonstram que altas temperaturas

diminuem significativamente os teores de compostos fenólicos e este comportamento pode

explicar também o sucesso da reação de PCR já que durante a reação ocorre um aumento

repetitivo da temperatura a ± 95 ºC durante a ciclagem, possibilitando a diminuição de

interferência destas substâncias na reação.

Amostras 260 nm 280 nm Razão

260/280 nm

[DNA]

ng/µL

Cafés 0,097±0,025 0,049±0,013 1,9 127,5±35,5

Cereais 0,087±0,035 0,051±0,013 1,7 103,4±28,3

Amostras 260 nm 230 nm Razão

260/230 nm

[DNA]

ng/µL

Cafés 0,043±0,016 0,068±0,030 0,6 33,7±17,3

Cereais 0,054±0,029 0,062±0,017 0,8 42,3±21,7

54

5. 2 Análises de bioinformática

5. 2. 1 Desenho dos primers e sua seletividade

Os genes marcadores para café, cevada, milho e arroz, pesquisados no NCBI estão

listados nas Tabelas 4 e 5. Com o objetivo de constatar a especificidade de cada gene

escolhido, os mesmos foram analisados estatisticamente com relação à sua similaridade com

outras espécies no banco de genomas do programa BLAST. As regiões dos marcadores que

apresentaram similaridades com outras espécies foram desprezadas, sendo as regiões

específicas escolhidas como DNA molde para o desenho dos primers. Os genes de cevada

(citocromo F), milho (zeina) e arroz (proteína hipotética do cromossomo 8) não apresentaram,

no programa de análises de similaridade genômica BLAST, qualquer similaridade com

organismos das espécies de café utilizadas comercialmente (Coffea arabica e Coffea

canephora). O programa BLAST tem sido extensamente utilizado para análises de genes

escolhidos utilizados como molde para desenho de marcadores específicos, principalmente em

autenticidade e segurança de alimentos, permitindo assim o desenvolvimento desta eficiente

ferramenta (PAFUNDO, et al 2009; CASTELLÁ, CABAÑES F.J, 2011; FUCHS, 2012;

COSTA et al, 2012).

55

Tabela 4: Marcadores moleculares de café, cevada, milho e arroz, obtidos por bioinformática.

Organismo Gene alvo Descrição Nome Primer (5’ – 3’)

Café Clp Subunidade da protease caseinolítica, ATP-

dependente, enzima proteolítica do cloroplasto.

Café1-F TTC CGA AGT CCT GGA GAG

Café1-R CGG AGG ATA TCT CAA TCG

Café2-F GGA ATT GGG ATC CAA AGG

Café2-R GAC GCT ACA ATT GCT GAG

Café3-F AGA ACA AGA TCC GCT CTG

Café3-R TGG GAT CTT CAC GGA CAG

Cevada PetA Proteína do citocromo F presente no cloroplasto. Cevada1-F TGC ACT CAA CCT TCA TCG

Cevada1-R CTG GTG CTG CAA TTG TAG

Cevada2-F TGG GGA TGG TGA GAA GAG

Cevada2-R AAC CGC ACT CAA AGG TAG

Cevada3-F CCG GAC CAG AAC TTC TTG

Cevada3-R CCT GAA GCA CGA TTT CTG

Milho Zeína Proteína zeína do milho Zeína1-F TGG CCA GCT AGC TAC AAC

AAA CCG

Zeína1-R GCG GGG TTA GCC GAA AAC

Zeína2-F CAG GCT CCA ACA AGC AAT

CG

Zeína2-R GCA ACT GTT GTG CCC TGA TG

Zeína3-F CAG GCT CCA ACA AGC AAT

CG

Zeína3-R CAA CTG TTG TGC CCT GAT GG

Arroz Proteína

Hipotética

Faz parte dos 113 genes do cromossomo 1 não

codificador de RNA (npRNA).

Arroz1-F GTG GAA ATC AGC TCA CTG

Arroz1-R AAG GCC TAA CTC TGA AGG

Arroz2-F CTA TCT CGT CTC TGC ATG

Arroz2-R CAG CAG TGT AGG GTA GAG

Arroz3-F CAG ACA AGG GAG TGA AGG

Arroz3-R TCG TCG ACG TAC TCG TAG

F-Foward primer. R- Reverse primer.

56

5. 2. 2 Especificidade dos primers selecionados

Para a definição de tais pares de primers, foi necessário seguir algumas etapas,

observando as regiões do gene que não apresentavam regiões homólogas com organismos de

outras espécies na análise de similaridade do BLAST. Sendo assim, foram desenhados 3 pares

de primers para a escolha do melhor. Como ilustram as Figuras 7 e 8, os primers selecionados

foram os Café1, Cevada3, Zeína2 e Arroz1. O desenho dos pares de primers precisa garantir a

capacidade de produzir um produto de PCR (amplicon) seletivo e específico. Dependendo do

primer escolhido ou das condições não otimizadas da reação, é comum um primer apresentar

múltiplos produtos, já que, frequentemente, os organismos vegetais apresentam regiões

similares dentro do seu genoma. Para analisar a seletividade dos primers e verificar se

produziriam somente um amplicon, os mesmos foram reagidos previamente em silico

(MARK A. VALASEK; JOYCE J. REPA, 2005).

Nas Figuras 14 e 15 podemos observar que tanto in silico através do programa

BIOINFX como em PCR convencional in vitro, os primers apresentaram somente uma banda

estreita (amplicon) específica dentro do seu próprio genoma.

Figura 14: PCR in silico e in vitro dos primers Café 1(A) e Cevada 3(B), utilizando DNA genômico de café e

cevada, respectivamente. P: padrão de bases. Os primers apresentaram banda estreita (amplicomI) no gel de

agarose esperado de acordo com o padrão de base de aproximadamente 110 pares de base-pb

A

B

P

P

A

B

57

Figura 15: PCR in silico e in vitro dos primers Zeína 2(C) e Arroz 1(D) utilizando DNA genômico de milho e

arroz, respectivamente. P: padrão de bases. Os primers apresentaram banda sharp (amplicomI) no gel de agarose

esperado de acordo com o padrão de base de aproximadamente 110 pares de base-pb.

Segundo Klein D. (2002) múltiplas amplificações poderiam interferir diretamente na

fluorescência detectada pelo equipamento de qPCR gerando um o Ct superestimado, logo

uma quantificação errônea. Nossos resultados indicam que os primers selecionados no

presente trabalho são altamente seletivos para o seus respectivos alvos. Para a análise da

especificidade, os primers selecionados Café1, Cevada3, Zeina2 e Arroz1 foram reagidos com

seus respectivos alvos e com o DNA genômico de outras espécies (Figura 16 e 17). Observou-

se que os primers obtiveram um grau de especificidade satisfatório.

Nas Figuras 16 e 17 pode-se observar também que a curva de dissociação (melting

curve) para os primers Café1, Cevada3, Zeina2 e Arroz1 apresentaram amplificação

específica somente com seus respectivos alvos (adulterantes). Mesmo com ocorrência de

alguma amplificação quando o DNA dos adulterantes não alvos estava presente, estes foram

considerados não específicos por apresentar uma temperatura de dissociação diferente daquela

apresentada quando a PCR foi conduzida com o DNA do respectivo adulterante (alvo).

P

P

C

D

58

Para a definição da temperatura de dissociação de cada marcador, foi utilizada a

média das temperaturas da curva padrão de DNA. Os primers apresentaram uma temperatura

de dissociação de 74,8±0,4; 77,7±0,5; 83±1,2; 81,4±0,7 para café, cevada, milho e arroz

respectivamente. A diferença de temperatura de dissociação ocorre por causa do aquecimento

desigual da placa aquecedora no equipamento (ARLORIO et al, 2007; PAFUNDO et al,

2009; COUILLEROT et al, 2010).

Figura 16: Gráfico de curva de dissociação. Primer Café1 (AB): a letra A corresponde à amplificação específica

do primer Café1 em DNA genômico de café. B corresponde à não ocorrência de amplificação inespecífica.

Primer Cevada3 (CD): a letra A corresponde à amplificação específica do primer Cevada3 em DNA genômico

de cevada. B corresponde à amplificação inespecífica do primer cevada3 em DNA genômico de arroz, trigo,

soja, milho e café.

Amplificações inespecíficas podem ocorrer tanto por causa das condições reacionais

(diluição dos primers, concentração de sal, concentra de DNA inicial e temperatura de

anelamento dos primers), quanto pela presença de sequências de DNA genômico conservadas

entre os vegetais. Estas amplificações não diminuem a especificidade dos marcadores

(primers) por que só ocorrem na ausência da sequência alvo (PAFUNDO et al, 2009).

Temperatura °C

Δ R

N

Temperatura °C

59

Figura 17: Primer zeina2 (EF): a letra E corresponde à amplificação específica do primer Zeina2 em DNA

genômico de milho, F corresponde à amplificação inespecífica do primer Zeína2 em DNA genômico de café,

cevada, soja arroz e trigo. Primer arroz1 (GH): a letra H corresponde à amplificação específica do primer Arroz1

em DNA genômico de arroz, G corresponde à amplificação inespecífica do primer em DNA genômico de café,

cevada, milho, trigo e soja.

5. 3 SENSIBILIDADE E LINEARIDADE

5. 3. 1 Construção da curva padrão

A sensibilidade dos sistemas de detecção qPCR (primers) foi avaliada, utilizando-se

diluições seriadas de DNA genômico (íntegro) de café e cevada: 0,0002% a 100% de 50 ng

(m/v), milho e arroz: 0,01% a 100% de 50 ng (m/ v) que foram reagidos em 10 réplicas,

gerando uma média de Ct para cada ponto (Tabela 5). Os valores de LQ variaram entre 0,3 a

8,1 pg/µL (Tabela 6).

Δ R

N

Temperatura °C Temperatura °C

60

Tabela 5: Média dos Cts das curvas padrão de café, cevada, milho e arroz, com os seus respectivos

desvios padrão.

Ct: Ciclo de treshold. DESVAP: Desvio padrão.

Observando as Figuras 18 e 19 pode-se constatar que cada par de primers obteve uma

alta correlação entre o percentual de adulterante (concentração do alvo) e o valor de Ct

(Tabela 5). Os valores de R2 foram de 0,99 até a segunda casa decimal e todos apresentaram

valor acima de 5 na terceira casa decimal. Um estudos realizado por Laube et al (2010) que

desenvolveu primers e sondas para detecção de espécies de plantas em mel também obteve

um R2 igual 0,99.

Pafundo et al (2009), que desenvolveram um sistema de detecção de traços de

amêndoas em alimentos processados para pessoa alérgicas, obtiveram um valor de R2 em

torno de 0,95. Já Arlorio et al (2007) obtiveram um valor de R2 = 0,999 no seu sistema de

detecção para avelã também em alimentos processados. No desenvolvimento de detecção de

microrganismos tipo Aspergillus niger, Castellá, F. e J. Cabañes (2011) também encontraram

valores de R2 próximos a 1, demonstrando o quanto a técnica de DNA recombinante é linear

independentemente da matriz estudada.

Café Cevada Milho Arroz

Media

Ct

DESVPAD Media

Ct

DESVPAD Media

Ct

DESVPAD Media

Ct

DESVPAD

14,5 0,59 15,46 0,17 21,23 0,08 22,96 0,11

15,6 0,34 16,36 0,06 22,13 0,01 23,71 0,05

17,3 0,46 18,91 0,18 23,94 0,03 25,77 0,11

18,6 0,16 19,58 0,05 25,01 0,04 26,60 0,18

20,7 0,32 21,55 0,04 27,60 0,04 - -

22,1 0,56 23,19 0,09 29,12 0,07 29,55 0,22

24,8 0,34 25,59 0,42 30,70 0,21 31,81 0,06

25,4 0,31 26,38 0,06 32,07 0,30 33,56 0,17

28,5 0,16 28,38 0,12 33,64 0,06 35,44 0,42

30,3 0,35 30,59 0,31 - - - -

32,9 0,69 32,59 0,75 - - - -

34,7 0,47 35,02 0,85 - - - -

61

Figura 18: Curvas padrão de café (◊), cevada (□), milho (Δ) e arroz (x), utilizado para determinação de LD/LQ.

Diluição de DNA genômico de café e cevada 0,0002% à 100% e milho e arroz 0,01% a 100% de 50 ng (m/v). Ct

= média de 10 réplicas. Café1: Slope -3,6159; valor de R2: 0,9959. Cevada3: -3,4458; valor R2: 0,9972. Zeina2:

Slope -3,2274; valor de R2: 0,9946. Arroz1: Slope -3,1509; valor de R2: 0,9958.

Quando esses valores são comparados com aqueles estabelecidos em protocolos de

validação de análises de detecção/quantificação de sequências específicas de DNA, fica

evidente que o uso dessa ferramenta molecular tem potencial de aplicação para o controle de

qualidade na indústria do café.

Para calcular a eficiência de amplificação de cada um dos sistemas de detecção e

quantificação definidos, diluições seriadas de DNA foram testadas e os resultados da reação

foram tabelados para o cálculo da equação de regressão do R2. A curva padrão foi construída

e o valor da inclinação da reta, que indica a sensibilidade do teste, permitiu o cálculo da

eficiência da reação. A curva padrão demonstra o log da quantidade de amostra inicial contra

o número de ciclos Ct da qPCR, e é gerada pelo software ABI PRISM 7000 system. Uma

correlação linear, com um fator de inclinação da curva entre -3,1 e -3,6, que equivale a um

cálculo de eficiência de reação de 88 a 117 %. Segundo Vaerman et al (2004) e Laube et al

(2010) esses são valores aceitáveis para a maioria das aplicações que requerem quantificação

y = -3,66x + 21,281 R² = 0,9954

y = -3,4458x + 22,111 R² = 0,9972

y = -3,2274x + 27,557 R² = 0,9946

y = -3,1503x + 28,988 R² = 0,9959

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3

Mé

dia

Ct

log quantidade inicial de DNA [ng]

62

exata. Na Tabela 6, é possível observar que todos os primers obtiveram um valor de eficiência

entre 88 % à 107 % (TÖWE et al, 2010).

Tabela 6: Eficiência, linearidade e sensibilidade dos primers.

Marcadores Eficiência (%) Slope R2 LD

pg/µL

LQ

pg/µL

Café1 88 -3,6159 0,9959 0,7 2,4

Cevada3 95 -3,4458 0,9972 5,0 8,1

Zeina2 104 -3,2274 0,9946 0,1 0,3

Arroz1 107 -3,1509 0,9958 0,9 2,6

LD- limite de detecção; LQ- limite de quantificação.

5. 4 ADULTERÇÃO INTENCIONAL EM LABORATÓRIO

5. 4. 1 Curva de estimativa de percentual de adulterantes

Não foi feita a curva de estimativa para arroz, pois não foi detectada a presença de

arroz em nenhuma das amostras no presente trabalho, no entanto, em etapa futura a curva será

realizada. A Figura 19 apresenta a detecção dos alimentos adulterados intencionalmente, em

laboratório, com coeficientes de correlação (R2) com cerca de 0,98 e 0,95 para cevada e

milho, respectivamente.

63

Figura 19: Adulteração em laboratório para construção de curva de estimativa em percentual de cevada, milho e

arroz 10%-0,5% de cada adulterante. Valores de Ct = média de 8 replicatas. A- slope: -3,9501. R2 = 0,9809. B-

slope: -2,9343. R2 = 0,9503 C- slope: -2,9271. R2 = 0,998.

Vários fatores poderiam explicar porque estes valores de R2 são mais baixos quando

comparados com os valores das curvas padrão, como: degradação do DNA quando submetido

a processamento, tais como o tratamento térmico prolongado, por ação de nucleases (hidrólise

enzimática, ocorre quando a membranas celulares são rompidas) e DNAses da própria planta

que lisam o DNA, e depurinação em pH baixo (perda de bases púricas), fatores estes que

ocorrem em matrizes alimentares como o café torrado e moído, podendo assim interferir na

reação de PCR e, consequentemente, no valor de R2 (DOVERI; LEE, 2007).

Apesar dos valores do R2 serem satisfatórios, os mesmos ainda poderão ser

melhorados através do aperfeiçoamento do processo de homogeneização da mistura (blend)

C

64

de 80% de café Arábica e 20 % de Robusta com a concentração de cada adulterante. Mesmo

assim, os valores de R2 obtidos no presente trabalho estão de acordo com os de Fuchs et al

(2012), que obtiveram um R2 de 0,98 com misturas de aipo em salsicha. Fuchs et al (2012)

também utilizaram o método de estimativa para quantificar a presença de Aipo (Apium

graveolens) em alimentos processados, como tempero, já que 2,5 % da população adulta e 6 a

8 % das crianças no mundo são alérgicas a esta apiácea. Os autores realizaram uma correlação

direta entre o Ct da amostra contaminada intencionalmente com o Ct observado na amostra

comercial, ou seja, se o Ct da amostra for correspondente ao Ct de alguma concentração logo

o autor considera aquela concentração na amostra. Entretanto, também é possível utilizar a

equação do gráfico (Figura 20) para calcular a porcentagem do adulterante como foi utilizada

no presente trabalho (FERREIRA et al, 2012).

5. 5 DETECÇÃO DE ADULTERANTES EM AMOSTRAS COMERCIAIS DE CAFÉ

Para testar a aplicabilidade do método em amostras comerciais, foram realizadas

analises em cafés de diferentes qualidades reconhecidas no mercado, incluindo amostras com

selo de pureza e sem selo de pureza da ABIC. Foram também analisadas 10 amostras de café

controle torradas no próprio laboratório. Conforme esperado, os alimentos adulterantes

investigados no presente trabalho não foram detectados nas amostras de café controle. O

mesmo ocorreu nas amostras de café torrado e moído tipo gourmet ou superior, de acordo

com o selo PQC (Programa de Qualidade do Café) da ABIC (Tabela 7). Embora haja relatos

na literatura da presença de arroz em café comercial (ASSAD et al, 2000), não foi detectada a

presença deste cereal nas amostras de café torrado e moído e de café solúvel avaliadas. No

entanto, sabe-se que pode haver ciclos de adulteração, utilizando diferentes alimentos no

mercado, que variam quando os métodos de detecção destes se aperfeiçoam.

Apenas na amostra de café torrado e moído tradicional G (Tabela 7) foi possível

detectar traços de milho. No entanto, foi detectada a presença de cevada nas 12 amostras

comerciais tradicionais de baixo custo e sem o selo de qualidade avaliadas, sendo que

somente na amostra A não foi possível sua quantificação (Figura 20). Vale ressaltar que esta é

uma amostragem pequena do mercado e não representativa das diferentes categorias de café,

sendo utilizada somente com o objetivo de testar a aplicabilidade do método, e não de avaliar

a qualidade das amostras comercializadas no mercado brasileiro.

65

Figura 20: Detecção de cevada em amostras comerciais brasileiras tradicionais por PCR em tempo real,

utilizando-se o primer cevada3.

O teor de cevada em 42% das amostras tradicionais apresentou-se dentro do limite de

matérias estranhas de 1,3% permitido na legislação vigente até recentemente, na portaria

nº381 de 2009 (MAPA, 2010), sendo que 58% das amostras apresentaram teores acima

daqueles permitidos na legislação brasileira e não poderiam estar sendo comercializados.

Somente em 2013 a Instrução normativa Nº 7, de 22 de Fevereiro do Ministério de Estado da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) revogou a Instrução Normativa nº 16, de 24

de maio de 2010, publicada no Diário Oficial da União do dia 25 de maio de 2010, seção 1,

sendo agora não mais permitido, qualquer adulteração ou presença de matérias estranhas em

cafés comerciais brasileiros, igualando a legislação nacional aos padrões do mercado externo.

No entanto, é importante ressaltar que não há uma regulamentação específica para cafés tipo

solúvel, que no presente trabalho apresentaram maior concentração de adulterantes. Portanto,

estima-se que no futuro este tipo de café seja um alvo específico de adulterações até que a

Legislação seja adaptada a essa situação.

A maior concentração de adulterante encontrada em amostras de café solúvel deve-se

ao fato deste café ser produzido a partir da extração aquosa dos compostos hidrossolúveis

seguida de concentração da bebida, o que acaba por ocasionar concentração de DNA que por

sua vez também é hidrossolúvel (Tabela 7).

66

Tabela 7: Detecção e quantificação de cevada em cafés comerciais.

*- Café solúvel; - Não detectado ou abaixo do limite de quantificação; Ct- Cycle threshold; Cv: Coeficiente de

variação.

Os resultados obtidos no presente trabalho estão de acordo com os descritos na

literatura, utilizando-se outras metodologias. Jham et al, (2007) detectou através de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) um modesto aumento nos perfis de

tocoferóis em amostras comerciais indicando a presença de milho em cafés comerciais. Blanc

et al (1989) detectou alta concentração de carboidratos em amostras comercias de café

solúvel. Além de adulterantes, foi detectado também através de microscopia eletrônica

Amostras Média Ct Cv [%] Detecção Quantificação [%]

Am

ost

ras

Tra

dic

ionai

s

A 33,6±0,7 2,083 + -

B 33,0±0,7 2,121 + 1,2

C 32,8±0,3 0,915 + 1,3

D 33,3±0,1 0,300 + 1,0

E 32,4±0,3 0,926 + 1,7

F 31,9±1,3 4,075 + 2,2

G 31,7±0,3 0,946 + 2,5

H 32,3±1,2 3,715 + 1,8

I 32,6±0,1 0,307 + 1,5

J* 31,8±0,8 2,516 + 2,3

L* 30,6±0,3 0,980 + 4,8

M* 30,4±0,2 0,658 + 5,2

Am

ost

ras

tipo G

oum

ert

ou s

uper

ior N - - - -

O - - - -

P - - - -

Q - - - -

R - - - -

S - - - -

T - - - -

U

V

-

-

-

-

-

-

-

-

67

pedaços de vidro e bactéria da espécie Bacillus cereus em cafés comercializados no Rio de

Janeiro (SOUZA et al, 2005). Esses resultados demonstram a realidade e a necessidade de

fiscalização brasileira da produção e comercialização do café torrado e moído.

Embora métodos analíticos como HPLC sejam sensíveis e precisos, eles não são

específicos, não permitindo uma identificação exata do adulterante e possuindo uma faixa de

sensibilidade menor, com,limite de quantificação de 2,5 % para monossacarídeos, por

exemplo (PAULI et al 2011).

Segundo Oliveira et al (2009), é possível descriminar café puro e cevada pelos seus

perfis cromatográficos de compostos voláteis. Entretanto, os resultados são confusos quando

se mistura o adulterante ao café puro, apresentando efeito de matriz, e dificultando a

detecção de cevada nas amostras comercias.

6 CONCLUSÃO

Foi possível, através de análises de bioinformática e banco de genomas, encontrar

genes endógenos para o café, cevada, milho e arroz, e desenhar primers específicos e

seletivos para cada um dos genes alvos, tanto em análises in silico quanto in vitro. Os

parâmetros de desempenho dos sistemas de detecção e quantificação dos primers forneceram

resultados extremamente satisfatórios, com linearidade satisfatória e sensibilidade de detecção

e quantificação de DNA a nível de pg/µL.

Através das ferramentas de detecção supracitadas, foi possível detectar adulterações

realizadas no laboratório com 0,5% a 10% de cereais e construir curvas de estimativa para a

quantificação de adulterantes de amostras comerciais.

Aplicando-se o método desenvolvido no presente trabalho, foi possível detectar milho

e quantificar cevada nas amostras comercias, estando estas livres adição de arroz. A

ocorrência de adulteração nas amostras tradicionais demonstra a necessidade de informar os

órgãos de fiscalização quanto à necessidade de maior vigilância e intervenção junto às

indústrias brasileiras.

Por fim, os resultados obtidos no presente trabalho de dissertação demonstram que a

metodologia de q-PCR pode ser aplicada com a finalidade de detecção de adulterantes

específicos no café. No entanto, para que esta metodologia venha a ser utilizada por órgãos de

68

fiscalização do governo, uma validação criteriosa do método deverá ser realizada e o processo

de homogeneização deverá ser aperfeiçoado.

69

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADRIANA FARAH, A., DONANGELO, C. M. Phenolic compounds in coffee. Braz. J.

Plant Physiol., 18(1):23-36, 2006.

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE CAFÉ. Indicadores da indústria.

Disponível em http://www.abic.com.br/publique/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=61#1910

Acesso em 31 jan. 2013.

AMATALDEM, L. C., LEIT, F., MENEZES, H. C. Identificação de voláteis de café através

de cromatografia gasosa de alta resolução/espectrometria de massas empregando um

amostrador outomático de “headspace”. Ciência e Tecnoligia de Alimentos. v.21, p. 123-

128, 2001.

ARLORIO, M., CERETI, E., COÏSSON, D. J., TRAVAGLIA, F., MARTELLI, A. Detection

of hazelnut (Corylus spp.) in processed foods using real-time PCR. Food Control. v. 18, p.

140-148, 2007.

ASSAD, D. E., SANO, E. E., CUNHA, R. A. S., CORREA, S. B. T., RODRIGUES, R. H.

Identificação de impurezas e misturas em pó de café por meio de comportamento espectral e

análise de imagens digitais. Pesq. agropec. bras. v. 37, n. 2, p. 211-216, fev. 2002.

ANDERSEN, L. F., JACOBS, JR., CARLSEN, D. R., BLOMHOFF, M. H. R. Consumption

pf coffee is associated with reduced risk of death atributed to inflammatory and

cardiovascular diseases in the lowa women’s heath study. The American Journal pf Clinical

Nutrition. v. 83, p. 1039-1049, 2006.

ALVES, R. C. CASAL, S. ALVES, M. R., OLIVEIRA, M. B. Discrimination between

arabica and robusta coffee species on the basis of their tocopherol profiles. Food Chemistry.

v. 114, p. 295-299, 2009.

BLANC, M. B., DAVIS, G. E., PARCHET, J. M., VIANI, R. Chromatographic profile of

carbohydrates in commercial soluble coffees J. Agric. Food Chem. 1989, 37, 926 – 930.

BARROS, N.E.F., OLIVEIRA, E.M.M., MARIN,V.A. Applicability of the real-time

polymerase chain reaction based-methods in quantification of genetically modified organisms

in foods. Brazilian. Journal of Nutrition. v.21, p.85-92, 2008.

70

BASSO, A. D. Sombreamento do cafeeiro: experiment, necessidade e resultados. Boletim

Agro-ecológico. 3, n.11. 15-16. 1999.

BACHA, E. L. Política brasileira do café. In: MARTINS, M., JOHNSTON, E., (Ed.). 150

anos de café. Rio de Janeiro: Salamandra, 2000.

BRASIL. Resolução Normativa no 12/78. Aprova normas técnicas especiais do Estado de São

Paulo, relativa a alimentos e bebidas. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil,

Poder Executivo, Braasília, DF, Brasília 24 Jul. 1978. Seção 1, p. 11625.

BRASIL. Portaria nº 377, de 26 de abril de 1999. Institui normas básicas de alimentos. Diário

Oficial [da] República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braasília, DF, 29 de abr.

1999.

BRASIL. Instrução normativa nº 98, do Ministério de Estado da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento. Anexo 1. Regulamento técnico para o café torrado em grão e para o café

torrado e moído. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Poder Executivo,

Braasília, DF, Brasília, 16 de maio de 2010.

BRASIL. Instrução normativa Nº 7, do Ministério de Estado da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento. . Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Poder Executivo,

Braasília, DF, Brasília, 22 de Fev. 2013.

BRIANDET, R., KEMSLEY, E.K., WILSON, R.H. Approaches to adulteration detection in

instant coffees using infrared spectroscopy and chemometrics. Journal of the Science of

Food and Agriculture. v. 71, p. 359–366, 1996.

CANKAR, K., CHAUVENSY-ANCEL, V., FORTABAT, M., GRUDEN, K.,

KOBILINSKY, A., BERTHEAU, J. Y. Detection of nonauthorized genetically modified

organisms using differential quantitative polymerase chain reaction: application to 35S in

maize. Analytical Biochemistry. 376,189–199. 2008.

CRAIG, A. R., FRANCA, A. S., OLIVEIRA, L. S. Evaluation of the potential of FTIR and

chemometrics for separation between. Food Chemistry. v. 132, p. 1368-1374, dezembro

2012.

71

CESAR, C.L., LIMA, C.A.S., VARGAS, H., MIRANDA, L.C.M. On the use of

photoacoustic spectroscopy for investigating adulterated or altered powdered coffee samples.

Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 32, p. 1355–1358, 1984.

CASTELLÁ, G., CABAÑES, F. J. Development of a Real Time PCR system for detection of

ochratoxin A-producing strains of the Aspergillus niger aggregate. Food Control. v. 22, p.

1367-1372, fevereiro, 2011.

CLIFFORD, M. N.; WILLSON, K. C. Coffee – Botany, Biochemistry and Production of

Beans and Beverage, Ed. Chemical and Physical Aspects of Green Coffee and Coffee

Products, Croom Helm, London. p.461, 1985.

CESAR, C. L., VARGAS, C. H., LIMA, C A. S., FILHO, J. M., MIRANDA, C. M. On the use of

photoacoustic spectroscopy for investigating adulterated or altered powerd coffee samples. J.

Agric. Food Chem. 32, 1355-1358, 1984.

CHIARA MARTELLOSSI, C., TAYLOR, E. J., LEE, D., GRAZIOSI, G., DONINI, P. DNA

extraction and analysis from processed coffee beans. J. Agric. Food Chem. 53, 8432-8436,

2005.

COUILLEROT, O., BOUFFAUD, M., BAUDOIN, E., MULLER, D., CABALLERO-

MELLADO, J., MOËNNE-LOCCOZ, Y. Development of a real-time PCR method to

quantify the PGPR strain

Azospirillum lipoferum CRT1 on maize seedlings. Soil Biology & Biochemistry. 42, 2298-

2305. 2010.

COSTA, J., MAFRA, I. M., OLIVEIRA, B. P. P. High resolution melting analysis as a new

approach to detect almond DNA encoding for Pru du 5 allergen in foods. Food Chemistry.

133, 1062–1069. 2012.

DUARTE, G., MONTEIRO, M., MARQUES, V. X., FARAH, A. Variability on urinary

excretion of chlorogenic acid compounds and metabolites in humans after overnight fasting

and under controlled diets. The FASEB Journal, v. 30, p. 401-401, 2012.

72

DAGLIA, M., PAPETTI, A., GREGOTTI, C., BERT, F., GAZZANI, G. In vitro antioxidante

ande ex vivo protective activies of green and roasted coffee. Journal of Agricultural and

Food Chemistry. 48, 1449-1454, 2000.

DI PINTO, A., FORTE, V. T., GUASTADISEGNI, M. C., MARTINO, C., SCHENA, F. P.,

TANTILLO, G. A comparison of DNA extraction methods for food analysis. Food Control.

18, 76–80. 2007.

DOVERI, S., LEE, D. Development of Sensitive Crop-Specific Polymerase Chain

Reaction Assays Using 5S DNA: Applications in Food Traceability J. Agric. Food Chem.

55, 4640-4644. 2007.

DIETER KLEIN. Quantification using real-time PCR technology: applications and

limitations. TRENDS in Molecular Medicine. Vol.8 No.6 June 2002

FUCHS, M., CICHNA-MARKL, M., HOCHEGGER, R. Food Chemistry 130, 189–195.

2012.

FONTES, A.S., BENTO, A.C., MIRANDA, L.C.M., BAESSO, M.L. Thermal lens evaluation

of the presence of adulterants in brewed coffee. Analytical Sciences. v. 17, p. 526 - 529,

2001.

FARAH, A., DONAGELO, C. M. Phenolic compounds in coffee. Braz. J. Plant Physiol. v.

18, p. 23-36, 2006.

FARAH, A., MONTEIRO, A. M. C., CALADO, B. V., FRANCA, C. A, S., TRUGO, L. C.

Correlation between cup quality and chemical attributes of brazilian coffee. Analytical,

Nutritional and Clinical Methods. 98, 374-380. 2006.

FERREIRA, T., FARAH, A., OLIVEIRA, T., LIMA, N., VITÓRIO, F., OLIVEIRA, E.

Development of primer sets for detection of corn and barley in roasted coffee by real time pcr.

in:24th International Conference on Coffee Science, Association for the Science and

Information on Coffee (ASIC), San Rosé, Costa Rica, 2012, in press.

73

GERMINI, A., ZANETTI, A., SALATI, C., ROSSI, S., FORRÉ, C., SCHMID, S. et al.

Development of a seven-target multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic

soybean and maize in feeds and foods. J Agric Food Chem. v. 52(11), p. 3275-80, 2004.

GAGLIA, M., PAPETTI, A., GREGOTTI, C., BERTE, F., GAZZANI, G. In vitro

antioxidante and ex vivo protective activeis of green roasted coffee. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, v. 48, p. 1449-1454, 2000.

GIRARD, P., STOBER, P., BLANC, M., PRODOLLIET, J. J. Carbohydrate specification

limits for the authenticity assessment of soluble (instant) coffee: statistical approach AOAC

Int. 89, 999 – 1003. 2006.

HEID, C A., STEVENS, J., LIVAK, K. J., WILLIAMS, P. M. REAL TIME

QUANTITATIVE PCR. Genome Methods. Published by Cold Spring Harnor Laboratory

Press. May 11, 2011. In press.

ILLY, E. Um dos prazeres simples da vida é bastante complicado: A saborasa complexidade

do café. Revista Scientific American Brasil, p. 48-53, 2002.

INTERNATIONAL COFFEE ORGANIZATION (ICO). Statistics. Historical Data.

Disponível em : <ttp://www.ico.org>. Acesso 09 de fevereiro de 2013.

JHAM, G. M.,WINKLER, J. k., BERHOW, M. A.,VAUGHN, S. V. ç-Tocopherol as a

Marker of Brazilian Coffee (Coffea arabicaL.) Adulteration by Corn. J. Agric. Food Chem.

55, 5995-5999. 2007.

KAWATA, M., MATSUMURA, Y., OIKAWA, T., KIMIZU, M., FUKUMOTO, F.,

KURODAA, S. Analysis of DNA extraction buffer components from plant tissue

by polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 318, 314–317. 2003.

KIM, C, S., LEE, C. H., SHIN, J. S., CHUNG, Y. S., HYUNG, N, I. A simple and rapid

method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.

Nucleic Acids Research. Vol. 25, No. 5 1085–1086. 1997.

74

LAUBE, I., HIRD, H., BRODMANN, P., ULLMANN, S., SCHÖNE-MICHLING, M.,

CHISHOLM, J., BROLL, H. Development of primer and probe sets for the detection of plant

species in honey. Food Chemistry. v.118, p. 979–986, setembro, 2010.

LOPEZ, F. C. Determinação quantitativa das principais substâncias utilizadas para fraudar o

café torrado e moído. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v. 34, p. 29-34, 1974.

LIFE TECHNOLOGIES. All Support Documents. Disponível em:

http://www.invitrogen.com/search/support/supportSearchAction.action?query=&supportSearc

hArea=All+Support+Documents&newSearch=true Acesso em 10 Jan. 2013.

MAY, D., OLIVEIRA, C. M. R., ROCHA, L. D., MARANHO, L. T. Efeito de extratos de

casca de café (Coffea arabica L.) na germinação e crescimento de pepino (Cucumis sativus

L.). Revista Brasileira de Biociências. v. 9, p. 180-186, abril, 2011.

MOREIRA, R. F. A., TRUGO, L. C., de MARIA, C. A. B., MATOS, AG. B., SANTOS,

S.M., LEITE, J. M. C. Discrimination of brazilian arábica green coffee samples by

chlorogenic acid composition. Archivos Latinoamericanos de Nutricion. v.51, n. 1, p.95-

99, 2001.

MULLIS, K. B., JOLLA, L., ERLICH, A., GELFAND, D. H. Process for amplifying,

detecting, and/or clonig nucleic acid sequences using a thermostable enzyme. United States

Patent. Patent number: 4,965,188. Oct. 23, 1990.

MORGANO, M. A., PAULUCI, L. F., MANTOVANI, D. M. B., MORY, E. E. M.

Derterminação de minerais em café cru. Ciência e Tecnologia de Alimentos. v. 22, p. 19-23,

2002.

MENEZES JÚNIOR, J. B. F.; BICUDO, B. A. A. Sobre um método microscópico para

contagem de cascas no café em pó. Revista do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, v. 11,

p. 13-47, 1958.

MENEZES JR., J. B. F. Fraudes no café. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 12, n. único, p. 111-144,

1952.

75

MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Laboratórios por areas de atuação. Disponível em:

http://www.agricultura.gov.br/portal/page/portal/Internet-MAPA/pagina-

inicial/vegetal/laboratorios/laboratorios-por-area-de-analise Acesso em 23 Mar. 2013.

MEYER, R., HÖFELEIN, C., LÜTHY, J., CANDRIAN, U. Polymerase chain reaction-

restriction fragment length polymorphism analysis: a simple method for species identification

in food. J AOAC Int. v.78, p. 1542-1551. 1995.

MURRAY, M. G., THOMPSON, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.

Nucleic Acids Research. 8, 4321-4325. 1980.

MAY, D., OLIVEIRA, C.M.R., ROCHA, L. D., MARANHO, L. T. Efeito de extratos de

casca de café (Coffea arabica L.) na germinação e crescimento de pepino (Cucumis sativus

L.).Recebido: 01 de setembro de 2010 Recebido após revisão: 15 de dezembro de 2010

Aceito: 10 de janeiro de 2011 Disponível on-line em

http://www.ufrgs.br/seerbio/ojs/index.php/rbb/article/view/1712

NISHIJIMA, M., MACCHIONE, S., POSTALI, F. A. S. Análise de Concorrência no mercado

mundial de café verde. Rev. Econ. Sociol. Rural. Brasília, v. 50, n. 1, Mar. 2012.

NOGUEIRA, T., LAGO, L. C. Detection of adulterations in processed coffee with cereals and

coffee husks using capillary zone electrophoresis. J. Sep. Sci.v. 32, p. 3507 – 3511, julho

2009.

OLIVEIRA, R. C. S., FRANCA, A. S., AUGUSTI, R. Evaluation of the potential of SPME-

GC-MSnand chemometrics to detect adulteration of ground roasted coffee with roasted

barley. Journal of Food Composition and Analysis, v. 22, p. 257-261, maio, 2009.

OLEXOVÁ, L. et al. Detection of gluten-containing cereals in flours and ‘‘gluten-free’’

bakery products by polymerase chain reaction. Food Control. 17, 234–237. 2006.

PAULI, E, D., CRISTIANO, V., NIXDORF, S. L. Método para determinação de carboidratos

empregado na triagem de adulterações em café. Quim. Nova, Vol. 34, No. 4, 689-694. 2011

76

PROESTOS, C., CHORIANOPOULOS, N., NYCHAS, G-J. E., KOMAITIS, M. RP-HPLC

analysis of the phenolic compounds of plant extracts. Investigation of their antioxidant

capacity and antimicrobial activy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 53, p.

1190=1195, 2005.

PERRONE, D., FARAH, A., DONANGELO, C. M. Influence of coffee roasting on the

incorporation of phenolic compounds into melanoidins and their relationship with antioxidant

activity of the brew. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, p. 4265-4275,

2012.

PRODOLLIET, J., AND HISCHENHUBER, C.. Food authentication by carbohydrate

chromatography. Z Lebensm Unters Forsch A, 207 :1-12. 1998.

PAFUNDO, S., GULLÌ, M., MARMIROLI, N. SYBRGreenERTM Real-Time PCR to detect

almond in traces in processed food. Food Chemistry. v. 116, p. 811–815, março, 2009.

PIKNOVÁ, L.; BREZNÁ, B.; KUCHTA, T. Detection of gluten-containing cereals in food by

5’-nuclease real-time polymerase chain reaction. Journal of Food and Nutrition Research,

n. 3, v. 47, p 114-119, 2008.

RAQUEL D. C. C. BANDEIRA., ALINE T. TOCI., LUIZ C. TRUGO., ADRIANA FARAH.

Composição volátil dos defeitos intrínsecos do Café por CG/em-headspace. Quim. Nova.

v.32, p309-314. 2009.

ROCHA, E. M. P., FERREIRA, MA. A. T. Análise dos indicadores de inovação tecnológica

np Brasil: comparação entre um grupo de empresas privatizadas e o grupo geral de empresas.

Ciência e Informação. V. 30, p.64-69, 2001.

RUBAYIZA, A. B., MEURENS, M. Chemical discrimination of arabica and robusta coffees

by Fourier Transform Raman Spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

Colombia, v. 53, p. 4654-4659, maio, 2005.

REIS, N., FRANCA, A. S., OLIVEIRA, L. S. Discrimation roasted coffee, roasted corn and

coffee husks by Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy. LWT-Food

Sciense and Tecnology. 2012.

RUIZ-MATUTE, A. I., MONTILLA, A., DEL CASTILLO, M. D., MARTINEZ-CASTRO,

77

I., SANZ, M. L. A GC method for simultaneous analysis of bornesitol, other polyalcohols and

sugars in coffee and its substitutes. J. Sep. Sci. 30, 557 – 562. 2007.

REN, X., ZHU, X., WARNDORFF, M., BUCHELI, P., SHU, Q. DNA extraction and

fingerprinting of commercial rice cereal products. Food Research International. 39, 433–

439. 2006.

REISCHL, U., WITTWER, C. T., COCKERILL, F. Rapid cycle real-time pcr:

methods and applications; Microbiology and Food Analysis. New York: Springer-Verlag,

2002.

SANGER, M.; HARTGE, E.-U.; WERTHER, J.; OGADA, T.; SIAGI, Z. Combustion of

coffee husks. Renewable energy. v. 23, p. 103-121, 2001.

SENBETA, F., DENICH, M. Effects of wild coffee management on species diversity in the

Afromontane rainforests of Ethiopia. Forest Ecology and Management. 232, 68–74. 2006.

SALDAÑA, M. D. A., MAZZAFERA, P., MOHAMED, R. S. Extração de alcaloides: caféna

e trigonelina dos grãos de café de café com C supercrítico. Ciência e Tecnologia de

Alimentos. v. 17, p. 371-376, 1997.

SMITH. A history of coffee. In: Clifford MN, Wilson KC, editors. Coffee, botany,

biochemistry and production of coffee beans and beverage. London/Sydney: Croom

Helm; 1985. p. 48–97.

SPANIOLAS, S., TSACHAKI, M., BENNETT, M. J., TUCKER, G. A. Evaluation of DNA

extraction methods from green and roasted coffee beans. Food Control. 19, 257–262. 2008.

SOUZA, Cyllene de Matos Ornelas da Cunha Corrêa de ; ABRANTES, Shirley de Mello

Pereira ; CAVADOS, Clara de Fátima Gomes . Avaliação da Qualidade do café torrado e

moído comercializados no município do Rio de Janeiro. Higiene Alimentar, São paulo, v. 16,

p. 61-69, 2005.

TOCI, A. T., FARAH, A. Volatile compounds as potential defective coffee beans’ markers.

Food Chemistry, v. 108, n. 3, p. 1133-1141, Junho. 2008.

THE LANCET. Coffee and its adulterations. Vol. 61, Issue 1548, p. 418. (1853).

78

TOLEDO, J. L., BARBOSA, A. T. Classificação e Degustação do Café, Sebrae: Rio de

Janeiro, 1998.

VALASEK, M. A., REPA, J. J. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ 29: 151–

159, 2005.

WANG, N., LIM, L. T. fourier transform infrared and physicochemical analyses of roasted

coffee. J. Agric. Food Chem. 60 (21), pp 5446–5453. 2012.

WAGNER, D.B., FURNIER, G. R., SAGHAY-MAROOF, M. A., WILLIANS, S. M.,

DANCIK, B. P., ALLARD, R. W. Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jak

pines and their hybrids. Poceedings of the National Academy of Sciense USA. 84, 2097-

2100. 1987.

YANAGIMOTO, K., KWANG-GEUN, L., OCHI, H., SHIBAMOTO, T. Antioxidant

acitivity of heterocyclic compounnds found in coffee volatiles produced by Maillard reaction.

Journal of Agricultura and Food Chemistry. v. 50, p. 5480-5484, 2002.

YUAN, C. C., PETERSON, R. J., WANG, C., GOODSAID, F., WATERS, D J. 5’ nuclease

assays for the loci CCR5-1/D32, CCR2-V64I, and SDF1-G801A related to pathogenesis of

AIDS. Clinical Chemistry 46:1 24–30. 2000.

ZIMMERMANN, A., LUTHY, J., PAULI, U. Quantitative and qualitative evaluation of nine

different extraction methods for nucleic acids on soya bean. Zeitschrift fur Lebensmitte-

Untersuchung und-Forschung A. 207, 81-90. 1998.