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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ESCOLA DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS

QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS

LÍLIA CALHEIROS DE OLIVEIRA BARRETTO

MICROENCAPSULAMENTO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EXTRAÍDOS DE

RESÍDUO DO PROCESSAMENTO DE CAJU (Anacardium occidentale L.)

RIO DE JANEIRO

2015

LÍLIA CALHEIROS DE OLIVEIRA BARRETTO

MICROENCAPSULAMENTO DE COMPOSTOS FENÓLICOS EXTRAÍDOS DE

RESÍDUO DO PROCESSAMENTO DE CAJU (Anacardium occidentale L.)

Orientadoras

Professora Suely Pereira Freitas, D.Sc.

Professora Jane de Jesus da Silveira Moreira, D.Sc.

Virgínia Martins da Matta, D.Sc.

RIO DE JANEIRO

2015

Aos meus pais, José Carlos Santana e Ida Maria Calheiros.

Ao meu esposo, Eduardo Faro Barretto.

Às minhas orientadoras, Suely Freitas, Jane Moreira e Virgínia da Matta.

Dedico esta tese.

AGRADECIMENTOS

Algum doutorando prestes a alcançar este almejado título ousou escrever suas notas de

agradecimento sem evitar que lágrimas caíssem? Todo sonho tem seu preço ou todo projeto,

caso assim desejem chamá-lo. Ao deixar a minha amada Aracaju, esposo, pais, irmão, avós,

tios e amigos, trouxe comigo a esperança do novo. Crescer em um ambiente desafiador. Ser

surpreendentemente acolhida por aqueles a quem denomino anjos.

Nossa evolução profissional exige muito mais que estudo, trabalho e suor, pois

somente através das pessoas e dos relacionamentos que conquistamos, vencemos nossas lutas

diárias. Aproveito então estas páginas iniciais da minha tese de doutorado para detalhar e

mostrar-lhes que ela não é exclusivamente minha. Sua construção está baseada em mãos

estendidas, abraços afetuosos e vínculos fraternos.

Primeiramente, gostaria de registrar a vocês, cariocas, que nada se compara a viver em

uma cidade onde o Cristo Redentor está sempre de braços abertos a nos receber. Agradeço a

Deus por todas as bênçãos e proteção no decorrer dessa imensa estrada. Sejam nos dias felizes

ou naqueles em que precisamos de mais força e perseverança, basta olhar para o alto e

lembrar que Ele continua a nos resguardar.

Faço das palavras de uma colega mestra quando da sua defesa sobre os seus: “Aos

meus pais, que nunca mediram esforços sobre a minha educação”. Feliz daquele que os tem

ao seu lado. Meu reconhecimento, amor e respeito à minha mãe, Ida Maria, e ao meu pai, José

Carlos.

Ao meu amado esposo, Dudu, que confiou e apostou neste sonho junto comigo. A

ausência em tantos momentos hoje é recompensada com a concretização deste sonho. Volto

para casa feliz, aliviada e, sobretudo, realizada. À Família Barretto, em nome dos meus

sogros, Sr. Eduardo e D. Ana, que muito me apoiaram nesta jornada.

À minha prima querida, Marília, que abriu as portas do seu lar e me recebeu com tanto

carinho, delicadeza e consideração. A vinda para o Rio não seria a mesma se você não

estivesse aqui.

À Profa. Dra. Suely Pereira Freitas, minha orientadora, pessoa de alma iluminada e

competência singular. Obrigada por me aceitar como sua aluna, presente divino em sê-la. Sou

eternamente grata por tudo o que fez por mim.

À Profa. Dra. Jane de Jesus da Silveira Moreira, grande amiga que vem

acompanhando a minha história desde o mestrado. Você é inspiração para muitos. Te admiro

e desejo que nossos caminhos continuem se cruzando sempre. Obrigada por, mais uma vez,

participar desta trajetória.

À Dra. Virgínia Martins da Matta, por ter abraçado este desafio comigo. Agradeço

pela atenção, confiança, amizade e, principalmente, pela paciência em sempre me receber nos

meus momentos de desespero e insegurança.

Ao Instituto Tecnológico e de Pesquisas do Estado de Sergipe, onde os primeiros

passos desse estudo foram dados. Às colegas Karina Magna Leão, Ana Virgínia Figueiredo e

Lúcia Calumby, registro meus sinceros agradecimentos.

À Embrapa Agroindústria de Alimentos que propiciou toda a infraestrutura de plantas

e laboratórios para que este projeto pudesse ser concluído.

Aos profissionais Dra. Renata Tonon, Dra. Leda Gottschalk, Dra. Regina Nogueira,

Dr. Edmar Penha, Dra. Flávia Gomes, Dra. Renata Torrezan, Dra. Ana Carolina Sampaio e

Dra. Melícia Galdeano, pela atenção em escutar as minhas dúvidas, respondê-las e sugerir

novos caminhos que contribuíram para a progressão desta tese.

À cordialidade e dedicação do Dr. Ronoel Godoy e sua equipe, em nome de Sidney

Pacheco, Manuela Santiago, Renata Borguini e Luzimar Nascimento.

Aos técnicos e analistas sempre prontos para ajudar Agnelli Holanda, Sérgio Pontes,

Luiz Fernando Menezes, William Ferreira, Érika Fraga e Mariana Mattos. Aos colegas de

laboratório, Diego e Nátali. Foi uma grande honra trabalhar, aprender e conviver com vocês.

Muito obrigada.

Tive a graça de ser presenteada com sua amizade. Minha querida “chefe”, Ana Paula

Gil Cruz, obrigada pela cooperação, solicitude e apreço. Guardarei com muito carinho todos

os momentos que vivenciamos juntas.

À Universidade Federal do Rio de Janeiro, à Escola de Química e ao Programa de pós-

graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. Com muito orgulho, visto a

camisa desta instituição. Aos colegas de curso, em especial à Marcella Souza, Nina Silva,

Leilson Oliveira e Regina de Paula.

Às Professoras que participaram da banca de qualificação desta tese, Dra. Maria Alice

Zarur Coelho, Dra. Sônia Couri e Dra. Mônica Pagani. Agradeço pelas observações e

sugestões que muito contribuíram para o aprimoramento deste estudo.

Aos docentes que compõem a banca de defesa, Dra. Maria Antonieta Peixoto Gimenes

Couto, Dr. Ricardo de Andrade Medronho, Dra. Cíntia Alessandra Matiucci Pereira, Dr.

Ricardo Sposina Sobral Teixeira e Dr. Marcelo Augusto Gutierrez Carnelossi, agradeço pela

leitura e sugestões que enriqueceram o encerramento desta tese.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

bolsa de estudos, suporte essencial para o estudante brasileiro de pós-graduação.

À Universidade Federal de Sergipe, berço da minha formação acadêmica. Ao

Departamento de Tecnologia de Alimentos, em nome dos Professores Gabriel Silva, João

Antônio Santos e Antônio Martins. À amiga Tamy Andrade, registro minha gratidão pela

parceria de trabalho e pesquisa.

Finalmente, à cidade do Rio de Janeiro que sempre me recebeu com “aquele abraço”

tão lindamente eternizado por Gilberto Gil. Ao inesquecível bairro de Copacabana, onde

aprendi e senti o verdadeiro significado de ser carioca. Sentirei saudades.

Muito obrigada!

RESUMO

BARRETTO, Lília Calheiros de Oliveira. Microencapsulamento de compostos fenólicos

extraídos de resíduo do processamento de caju (Anacardium occidentale L.). Rio de Janeiro,

2015. Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de

Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.

O êxito dos alimentos funcionais permanece como uma tendência global no âmbito da

indústria de alimentos, que inova constantemente quanto ao desenvolvimento destas

especialidades. Este estudo visou elaborar um extrato microencapsulado rico em compostos

fenólicos extraídos de resíduos provenientes do beneficiamento do pedúnculo do caju que

possa ser aplicado como ingrediente alimentício funcional. Foram aplicadas duas rotas

tecnológicas (hidroetanólica e hidrólise enzimática), a fim de avaliar as melhores condições

de extração dos compostos antioxidantes. A partir de um delineamento experimental 3³ do

tipo Box-Behnken, foram analisados os parâmetros pH, proporção solvente:bagaço e

porcentagem de etanol na solução para a extração hidroetanólica. Os fatores avaliados,

utilizando-se a enzima comercial Celluclast® 1.5 L para a hidrólise enzimática, foram: tempo

de trituração da amostra, proporção solvente:bagaço e concentração da enzima. Os parâmetros

de operação associados aos mais altos valores de atividade antioxidante, para ambos os

processos, foram escolhidos para avaliar as curvas de cinética de extração hidroetanólica e

enzimática. Nesta aplicou-se uma combinação das enzimas Celluclast® e β-glicosidase. A

rota hidroetanólica foi aplicada para obtenção do extrato microencapsulado por atomização.

Foram aplicados os agentes encapsulantes maltodextrina e goma arábica na concentração de

15 % (m/m). O produto microencapsulado apresentou comportamento higroscópico ajustado

pelo modelo de GAB (R² = 0,99). O diâmetro das micropartículas variou entre 1,98 e 20,2

µm, com destaque para a morfologia esférica e superfície rugosa. O perfil de compostos

fenólicos presentes no extrato microencapsulado foi mantido se comparado com a matéria-

prima, sendo identificados os seguintes ácidos fenólicos e flavonoides: ácido gálico, rutina,

quercetina e isoquercetina. Os dados de estabilidade indicaram que os compostos fenólicos

foram preservados até 45 dias, apresentando uma redução de 12 % a partir dos 60 dias de

estocagem. A rota hidroetanólica do processamento do bagaço do caju é uma alternativa

potencial para a separação de compostos fenólicos com possível ação biológica sobre a saúde

humana. A produção comercial deste extrato poderá contribuir para a agregação de valor à

cadeia agroindustrial do pseudofruto do caju.

Palavras-chave: Anacardium occidentale L., endoglucanase, β-glicosidase, extração

hidroetanólica, atomização.

ABSTRACT

BARRETTO, Lília Calheiros de Oliveira. Microencapsulamento de compostos fenólicos

extraídos de resíduo do processamento de caju (Anacardium occidentale L.). Rio de Janeiro,

2015. Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de

Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015.

The success of functional foods remains a global trend within the food industry which

constantly innovates due to the development of these specialties. This study aimed to develop

a microencapsulated extract rich in phenolic compounds obtained from the cashew apple

processing that can be applied as a functional food ingredient. Two technological routes were

applied (hydroethanolic extraction and enzymatic hydrolysis) to evaluate the best process

conditions for phenols extraction. A 3³ Box-Behnken experimental design was used to

evaluate the influence of the parameters pH, solvent:substrate ratio and ethanol concentration

for hydroethanolic extraction. The factors evaluated, using the commercial enzyme

Celluclast® 1.5 L for enzymatic hydrolysis were: grinding time, solvent:substrate ratio and

enzyme concentration. Parameters associated with the highest antioxidant activity values for

both processes were chosen to assess kinetics curves for hydroethanolic and enzymatic

extraction, where a combination of Celluclast® and β-glucosidase enzymes was applied.

Hydroethanolic route presented higher response values for extraction of phenolic compounds

and this was the technology applied to obtain the microencapsulated extract by spray drying.

The encapsulating agents maltodextrin and arabic gum were used at a 15 % concentration

(w/w). The microencapsulated product presented a hygroscopic behavior set by GAB model

(R² = 0.99). The microparticles diameter ranged from 1.98 to 20.2 µm presenting spherical

morphology and rough surface. The phenolic compounds profile was retained in the powder

when compared to the raw material. The following phenolic acids and flavonoids were

identified: gallic acid, rutin, quercetin and isoquercetin. Stability data indicated that phenolic

compounds have been preserved up to 45 days and a decrease of 12 % was registered after 60

days of storage. Hydroethanolic route for the cashew apple residue is a potential technology

for phenolic compounds separation, which possibly present biological action on human

health. Commercial production of this extract may contribute to adding value to agroindustrial

chain of cashew apple.

Keywords: Anacardium occidentale L., endoglucanase, β-glucosidase, hydroethanolic

extraction, atomization.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURAS

Figura 1. Cajus, com respectiva identificação da amêndoa e do pseudofruto. ........................ 25

Figura 2. Rota simplificada do ácido chiquímico, destacando a produção de compostos

fenólicos. Fonte: Adaptado de Mann (1987). ........................................................................... 28

Figura 3. Estrutura química de alguns flavonoides: (a) flavona; (b) flavonol; (c) flavanona e

(d) isoflavona. Fonte: Adaptado de Testai (2015). ................................................................... 29

Figura 4. Estruturas químicas de alguns ácidos fenólicos: (a) ácido protocatecuico; (b) ácido

cafeico; (c) ácido gálico; (d) ácido siríngico e (e) ácido clorogênico. Fonte: Adaptado de

Andjelkovic et al. (2006). ......................................................................................................... 30

Figura 5. Reações catalisadas pelas celulases. (1) Ação das endoglucanases e liberação de

oligossacarídeos; (2) ação das exoglucanases com formação da celobiose e (3) ação da β-

glicosidase, ou celobiase, e obtenção de glicose. Fonte: Adaptado de Farinas (2011). ........... 37

Figura 6. Sistema simplificado de um atomizador, com destaque para: (1) entrada do ar

aquecido; (2) câmara de secagem; (3) ciclone; (4) saída de ar frio e (5) saída do produto seco.

As setas vermelhas indicam a circulação do ar de secagem e as amarelas destacam a

circulação do produto. Fonte: Adaptado de GEA (2015). ........................................................ 41

Figura 7. Isoterma de sorção típica de um produto alimentício. Fonte: Andrade, Lemus e

Pérez (2011). ............................................................................................................................. 46

Figura 8. Diagrama simplificado do processo de obtenção do bagaço de caju. ...................... 51

Figura 9. Obtenção de bagaço de caju em escala piloto, com destaque para as operações: (a)

recepção da matéria-prima; (b) despolpamento do pedúnculo; (c) trituração do bagaço e (d)

embalagem a vácuo. ................................................................................................................. 52

Figura 10. Diagrama esquemático do sistema de atomização da Buchi. Fonte: Zareifard et al.

(2012). ...................................................................................................................................... 61

Figura 11. Relação entre o teor de fenólicos totais e atividade antioxidante (ABTS·+

) dos

extratos hidroetanólicos obtidos a partir do planejamento Box-Behnken. ............................... 71

Figura 12. Gráficos de Pareto – Planejamento Box-Behnken referente à extração

hidroetanólica para as respostas de fenólicos totais (a) e atividade antioxidante por ABTS·+

(b), com relação aos parâmetros pH (X1), proporção solvente:bagaço (X2) e porcentagem de

etanol na solução (X3)............................................................................................................... 72

Figura 13. Gráficos de Superfície de Resposta – Planejamento Box-Behnken referente à

extração hidroetanólica para as respostas de fenólicos totais (FT), relacionando os parâmetros:

S:B vs. pH (a) e S:B vs. porcentagem de etanol na solução (b). .............................................. 73


extração hidroetanólica para as respostas de atividade antioxidante (ABTS·+

), relacionando os

parâmetros: S:B vs. pH (a) e S:B vs. porcentagem de etanol na solução (b). .......................... 74

Figura 15. Relação entre o teor de fenólicos totais e atividade antioxidante (ABTS•+

) dos

extratos hidroetanólicos obtidos a partir do planejamento fatorial 2². ..................................... 77

Figura 16. Relação entre o teor de fenólicos totais e atividade antioxidante (ORAC) dos

extratos hidroetanólicos obtidos a partir do planejamento fatorial 2². ..................................... 77

Figura 17. Gráficos de Pareto – Planejamento fatorial 2² referente à extração hidroetanólica

em função dos resultados de fenólicos totais (a) e atividade antioxidante por ABTS·+

(b), com

relação aos parâmetros proporção solvente:bagaço (X1) e porcentagem de etanol na solução

(X2). .......................................................................................................................................... 78


em função dos resultados de atividade antioxidante por ORAC, com relação aos parâmetros

proporção solvente:bagaço (X1) e porcentagem de etanol na solução (X2). ............................ 79


) dos

extratos enzimáticos obtidos a partir do planejamento Box-Behnken. .................................... 82

Figura 20. Gráficos de Pareto – Planejamento Box-Behnken referente à hidrólise enzimática

em função dos resultados de fenólicos totais (a) e atividade antioxidante por ABTS·+

(b), com

relação aos parâmetros tempo de trituração do bagaço (X1); proporção solvente:bagaço (X2) e

concentração da enzima (X3). ................................................................................................... 83


hidrólise enzimática para fenólicos totais relacionando os parâmetros: S:B vs. tempo de

trituração (a) e S:B vs. enzima (%; b.s.) (b). ............................................................................ 84


hidrólise enzimática para atividade antioxidante por ABTS•+

relacionando os parâmetros: S:B

vs. tempo de trituração (a) e S:B vs. enzima (%; b.s.) (b). ....................................................... 85


) dos

extratos enzimáticos obtidos a partir do planejamento fatorial 2². ........................................... 88


extratos enzimáticos obtidos a partir do planejamento fatorial 2². ........................................... 89

Figura 25. Gráfico de Pareto – Planejamento fatorial 2² referente à hidrólise enzimática em

função dos resultados de fenólicos totais, com relação aos parâmetros proporção

solvente:bagaço (X1) e concentação de enzima (X2). ............................................................... 89

Figura 26. Gráficos de Pareto – Planejamento fatorial 2² referente à hidrólise enzimática em

função dos resultados de atividade antioxidante por ABTS·+

(a) e ORAC (b), com relação aos

parâmetros proporção solvente:bagaço (X1) e concentação de enzima (X2). ........................... 90

Figura 27. Cinética do transporte de compostos fenólicos no processo de extração

hidroetanólica do bagaço de caju.............................................................................................. 91

Figura 28. Cinética de extração hidroetanólica de fenólicos totais ajustada pelo modelo de

Fick, onde Y = (X – Xeq)/(X0 – Xeq). ........................................................................................ 92

Figura 29. Curva de distribuição normal entre os valores observados e os estimados pelo

modelo obtido para a cinética de extração hidroetanólica. ....................................................... 93

Figura 30. Cinética do transporte de compostos fenólicos no processo de extração enzimática

do bagaço de caju. .................................................................................................................... 94

Figura 31. Extrato microencapsulado derivado do bagaço de caju. ........................................ 98

Figura 32. Cromatogramas do extrato microencapsulado (a) e bagaço liofilizado (b) de caju e

principais compostos fenólicos identificados por CLAE-DAD. ............................................ 100

Figura 33. Cromatogramas do extrato microencapsulado (a) e bagaço liofilizado (b), ambos

hidrolisados, e principais compostos fenólicos identificados por CLAE-DAD. .................... 101

Figura 34. Regiões ampliadas do cromatograma do extrato microencapsulado de caju

hidrolisado. Intervalo de corrida entre 0,0 e 4,0 minutos (a) e 22,0 e 26,0 minutos (b),

destacando os picos das substâncias ácido gálico, isoquercetina e quercetina. ...................... 102

Figura 35. Espectro de absorção a 270 nm do pico que apareceu aos 10,7 minutos no

cromatograma do extrato microencapsulado de caju. ............................................................ 103

Figura 36. Distribuição do tamanho de partículas por difração a laser do extrato

microencapsulado de caju no tempo zero de estocagem. ....................................................... 106

Figura 37. Análise morfológica das microcápsulas derivadas do extrato do bagaço de caju

microencapsulado por atomização. Aumento de 1000x (a) e 2000x (b). ............................... 107

Figura 38. Comparação das micrografias dos agentes encapsulantes: goma arábica (a1) e

maltodextrina (b1) com dados reportados por Santos, Fávaro-Trindade e Grosso (2005) (a2) e

Otálora et al. (2015) (b2). ........................................................................................................ 108

Figura 39. Micrografias da polpa de caju desidratada por atomização contendo 15 % de goma

arábica com ar aquecido a 140 °C (B) e 150 °C (C). Ampliação de 1200 vezes. Fonte: Moraes

(2014). .................................................................................................................................... 109

Figura 40. Isoterma de sorção a 25 °C do extrato microencapsulado de caju com 15 % de

maltodextrina e goma arábica (1:1; m/m) ajustada pelo modelo de GAB. ............................ 111

Figura 41. Cinética de degradação dos compostos fenólicos totais durante os 60 dias de

estocagem do extrato microencapsulado de caju. ................................................................... 113

Figura 42. Balanço de massa global para produção do extrato de caju microencapsulado... 113

QUADROS

Quadro 1. Composição centesimal do pseudofruto do caju in natura. ................................... 25

Quadro 2. Compostos fenólicos e carotenoides em polpa e bagaço de caju. .......................... 33

Quadro 3. Frações de ácidos fenólicos livres (AFL), esterificados solúveis (AFS) e insolúveis

(AFI) presentes no bagaço e no extrato bruto concentrado do pedúnculo de caju (EBC). ...... 33

Quadro 4. Teores de ácido ascórbico, fenólicos totais e proantocianidinas de caju

minimamente processado e estocado em diferentes temperaturas por 24 horas. ..................... 34

Quadro 5. Concentração de compostos fenólicos em polpa de caju. ...................................... 35

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Delineamento fatorial Box-Behnken para a extração hidroetanólica com as

variáveis independentes originais e codificadas. ...................................................................... 53

Tabela 2. Planejamento fatorial completo 2² para a extração hidroetanólica com as variáveis

independentes originais e codificadas. ..................................................................................... 54

Tabela 3. Delineamento fatorial Box-Behnken para a hidrólise enzimática com as variáveis


Tabela 4. Planejamento fatorial completo 2² para a hidrólise enzimática com as variáveis


Tabela 5. Gradiente de eluição empregado na determinação dos compostos fenólicos em

CLAE-DAD. ............................................................................................................................. 65

Tabela 6. Soluções salinas e suas respectivas atividades de água. .......................................... 68

Tabela 7. Resultados do planejamento Box-Behnken referentes à extração hidroetanólica –

Respostas de fenólicos totais, atividade antioxidante por ABTS·+

e respectivos valores

estimados pelo modelo. ............................................................................................................ 70

Tabela 8. Resultados do planejamento fatorial 2² referentes à extração hidroetanólica –

Respostas de fenólicos totais e respectivos valores estimados pelo modelo. ........................... 75


Respostas de ABTS·+

e ORAC e respectivos valores estimados pelo modelo. ........................ 75

Tabela 10. Composição dos açúcares do bagaço do caju. ....................................................... 79

Tabela 11. Quantificação da atividade enzimática das enzimas aplicadas. ............................. 80

Tabela 12. Resultados da hidrólise enzimática com Celluclast® 1.5 L para as análises de

fenólicos totais e ABTS·+

e respectivos valores estimados pelo modelo. ................................ 81

Tabela 13. Resultados do planejamento fatorial 2² referentes à hidrólise enzimática –

Respostas de fenólicos totais e respectivos valores estimados1. .............................................. 87


Respostas de ABTS•+

e ORAC e respectivos valores estimados1. ........................................... 87

Tabela 15. Respostas de fenólicos totais para os ensaios em série da extração enzimática e

hidroetanólica. .......................................................................................................................... 96

Tabela 16. Dados da concentração do extrato hidroetanólico por evaporação rotativa. ......... 97

Tabela 17. Eficiência do microencapsulamento por atomização do extrato proveniente do

bagaço do caju. ......................................................................................................................... 99

Tabela 18. Estruturas químicas, espectros e tempos de retenção dos compostos identificados

nos extratos analíticos antes e após hidrólise ácida e comparação com os respectivos padrões.

................................................................................................................................................ 104

Tabela 19. Distribuição do tamanho das micropartículas do extrato microencapsulado de caju

no tempo zero de estocagem. .................................................................................................. 106

Tabela 20. Parâmetros estimados para o modelo de distribuição de tamanho de partícula

RRB. ....................................................................................................................................... 107

Tabela 21. Parâmetros de ajuste da isoterma de sorção do extrato microencapsulado de caju

no tempo zero de estocagem. .................................................................................................. 110

Tabela 22. Estabilidade do extrato microencapsulado de caju em termos de fenólicos totais e

atividade antioxidante. ............................................................................................................ 112

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH – Dicloreto de 2,2’-azobis(2-amidinopropano);

ABTS – 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico);

AGE – Ácido gálico equivalente;

b.s. – Base seca;

CMC – Carboximetilcelulose;

COPPE – Instituto Alberto Luiz Coimbra de Pós-Graduação e Pesquisa de Engenharia;

DE – Dextrose equivalent;

DPPH – 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila;

EC – Enzyme commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology;

FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power;

FT – Fenólicos totais;

FW – Fresh weight;

IQ – Instituto de Química;

LDL – Low density lipoprotein;

m.s. – Massa seca;

MEV – Microscopia eletrônica de varredura;

mmHg – Milímetros de mercúrio;

MSR – Metodologia de superfície de resposta;

n.d. – Não detectado;

ORAC – Oxigen radical absorbance capacity;

PEAD – Polietileno de alta densidade;

ppm – Partes por milhão;

RSM – Response surface methodology;

SET – Single electron transfer;

TEAC – Trolox equivalent antioxidant capacity;

TROLOX – Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 21

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 23

2.1 Geral ............................................................................................................................... 23

2.2 Específicos ...................................................................................................................... 23

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 24

3.1 Caju (Anacardium occidentale L.) ............................................................................... 24

3.2 Derivados e coprodutos do processamento do caju ................................................... 25

3.3 Compostos fenólicos ...................................................................................................... 27

3.3.1 Compostos fenólicos de interesse na formulação de alimentos funcionais ....... 31

3.3.2 Compostos fenólicos presentes no pseudofruto do caju ...................................... 32

3.4 Tecnologias para aumentar a disponibilidade de compostos fenólicos .................... 35

3.4.1 Extração enzimática ............................................................................................... 36

3.4.2 Extração hidroetanólica ......................................................................................... 39

3.5 Microencapsulamento de extratos vegetais ricos em compostos bioativos .............. 40

3.5.2 Caracterização de extratos microencapsulados .................................................. 44

3.5.2.1 Distribuição do tamanho de partículas .............................................................. 44

3.5.2.2 Morfologia ......................................................................................................... 45

3.5.2.3 Isotermas de sorção ........................................................................................... 45

4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 49

4.1 Material .......................................................................................................................... 49

4.1.1 Matéria-prima ........................................................................................................ 49

4.1.2 Reagentes................................................................................................................. 49

4.1.3 Insumos ................................................................................................................... 49

4.2 Procedimento experimental ......................................................................................... 50

4.2.1 Obtenção do bagaço de caju .................................................................................. 50

4.2.2 Extração dos compostos fenólicos ......................................................................... 52

4.2.2.1 Extração hidroetanólica ..................................................................................... 52

4.2.2.2 Extração enzimática ........................................................................................... 55

4.2.3 Cinética de extração dos compostos fenólicos...................................................... 57

4.2.3.1 Cinética de extração hidroetanólica ................................................................... 57

4.2.3.2 Cinética de extração enzimática ........................................................................ 59

4.2.4 Processo de extração em série: Extração enzimática seguida da extração

hidroetanólica .................................................................................................................. 59

4.2.5 Concentração por evaporação a vácuo................................................................. 60

4.2.6 Microencapsulamento por atomização ................................................................ 60

4.2.7 Estabilidade dos extratos microencapsulados ..................................................... 62

4.3 Métodos analíticos ......................................................................................................... 62

4.3.1 Identificação dos açúcares presentes no bagaço do caju .................................... 62

4.3.2 Atividade enzimática .............................................................................................. 63

4.3.3 Determinação do teor de compostos fenólicos totais ........................................... 63

4.3.3.1 Identificação dos compostos fenólicos .............................................................. 64

4.3.4 Atividade antioxidante pelo método ABTS·+

....................................................... 65

4.3.5 Atividade antioxidante pelo método ORAC ........................................................ 66

4.3.6 pH............................................................................................................................. 66

4.3.7 Sólidos totais ........................................................................................................... 66

4.3.8 Distribuição do tamanho de partícula .................................................................. 67

4.3.9 Morfologia ............................................................................................................... 68

4.3.10 Isotermas de sorção .............................................................................................. 68

4.4 Análise dos dados .......................................................................................................... 69

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 70

5.1 Extração dos compostos fenólicos ............................................................................... 70

5.1.1 Extração hidroetanólica – Planejamento Box-Behnken ..................................... 70

5.1.2 Extração hidroetanólica – Planejamento fatorial completo 22........................... 74

5.1.3 Extração enzimática ............................................................................................... 79

5.1.3.1 Caracterização dos açúcares presentes no bagaço do caju ................................ 79

5.1.3.2 Quantificação da atividade enzimática .............................................................. 80

5.1.3.3 pH ...................................................................................................................... 81

5.1.3.4 Hidrólise enzimática – Planejamento Box-Behnken ......................................... 81

5.1.3.5 Hidrólise enzimática – Planejamento fatorial completo 22 ............................... 86

5.2 Cinética de extração dos compostos fenólicos ............................................................ 91

5.2.1 Cinética de extração hidroetanólica ..................................................................... 91

5.2.2 Cinética de extração enzimática............................................................................ 94

5.4 Concentração por evaporação a vácuo ....................................................................... 97

5.5 Microencapsulamento por atomização ....................................................................... 97

5.5.1 Identificação dos compostos fenólicos .................................................................. 99

5.5.2 Distribuição do tamanho de partículas .............................................................. 106

5.5.3 Morfologia ............................................................................................................. 107

5.5.4 Isotermas de sorção .............................................................................................. 110

5.5.5 Estabilidade do extrato microencapsulado de caju ........................................... 111

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 114

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................................... 115

8. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 116

1 Introdução

21

1. INTRODUÇÃO

A indústria brasileira de beneficiamento do caju está alicerçada na comercialização da

castanha, produto de alto valor agregado e de grande interesse para o mercado externo. A

região Nordeste é a principal produtora desta fruta e também grande consumidora dos

derivados do seu pseudofruto, a exemplo de sucos, polpas, néctares, sorvetes e doces.

No melhor cenário de aproveitamento do pedúnculo, a indústria absorve 20 % de toda

a produção desta matéria-prima. Ainda assim, o despolpamento do caju gera elevados

volumes de resíduos, com destaque para o bagaço de caju, o qual consiste em uma biomassa

rica em fibras, açúcares e vitaminas. Em menor escala, este é aproveitado regionalmente para

produção de outros derivados como hambúrgueres, biscoitos e farinhas.

Alternativas inovadoras para o aproveitamento de resíduos agroindustriais vêm sendo

estudadas, preconizando tecnologias e diretrizes que possam ser aplicadas pelas cadeias

produtoras de forma a integrar as linhas de produção. Estas atitudes contribuem tanto para a

preservação do meio ambiente, com redução do descarte dos refugos produzidos, quanto para

a geração de renda e consequente desenvolvimento econômico. Neste contexto, para um

melhor aproveitamento dos resíduos procedentes do processamento da polpa de caju, uma

nova abordagem deve ser considerada.

Os alimentos funcionais e os nutracêuticos estão entre os principais avanços do

mercado de alimentos industrializados. Continuamente surgem nas gôndolas de todo o mundo

novidades que sugerem a promoção da saúde e bem-estar daqueles que os consomem, sejam

nas formas prébióticas, probióticas ou simbióticas. Além do diferencial em termos de adição

de fibras, bactérias benéficas e frutooligossacarídeos, a aplicação de compostos bioativos em

alimentos propõe a substituição de aditivos sintéticos e melhoria do desempenho do

organismo humano.

Assim, um desafio atual da indústria de alimentos funcionais refere-se à

disponibilização de compostos bioativos extraídos de matrizes de baixo valor comercial,

valorizando a cadeia de processamento destas matérias-primas. Para que os compostos

bioativos possam estar disponíveis para o organismo, faz-se necessário aperfeiçoar os

processos de extração e purificação destas substâncias a partir de fontes naturais. Rotas

biotecnológicas, como as enzimáticas e as fermentativas, têm sido bastante aplicadas para este

fim.

1 Introdução

Além da viabilização de técnicas de extração financeiramente eficientes, outra etapa

desafiante para a indústria refere-se à concentração dos bioativos e sua respectiva oferta, seja

sob a forma de ingredientes de alto valor agregado ou de produtos sofisticados, que atendem a

nichos específicos de mercado.

Operações como ultrafiltração, liofilização e extração com fluido supercrítico são

aplicadas em pequena escala, pois apresentam altos custos de processo e manutenção. Em

maiores proporções, destaca-se o microencapsulamento por atomização, não somente por ser

economicamente viável em comparação às tecnologias citadas anteriormente, como também

por disponibilizar produtos de alta estabilidade com massas e volumes reduzidos.

Os principais compostos bioativos presentes no pseudofruto do caju são os compostos

fenólicos, com destaque para os ácidos fenólicos (p.ex., ácido gálico e ácido p-cumárico) e os

flavonoides (p.ex., miricetina-3-o-glicosídeo, quercetina-3-o-glicosídeo, quercetina-3-o-

galactosídeo e kaempferol-3-o-glicosídeo) (BATAGLION et al., 2015; MICHODJEHOUN-

MESTRES et al., 2009; BRITO et al., 2007).

Apesar de estudos anteriores destacarem quais os principais compostos presentes no

caju, as técnicas mais apropriadas para disponibilizar estes bioativos na forma de ingredientes

alimentícios ainda foram pouco exploradas. Algumas publicações mais recentes,

desenvolvidas pela Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza/CE), destacaram o

aproveitamento do bagaço do caju para a obtenção de pigmentos carotenoides (ABREU et al.,

2013).

Integrar a obtenção de produtos ricos em compostos fenólicos com o aproveitamento

de resíduos agroindustriais é uma solução sustentável que contribui diretamente com os

desafios de diferentes cadeias agrícolas e industriais (ZEPKA; MERCADANTE, 2009;

AZEREDO et al., 2006). Motivado por este desafio, o presente projeto visa aproveitar a

biomassa residual do processamento do suco de caju para a extração de compostos fenólicos,

por meio de diferentes rotas, e concentrá-los por microencapsulamento para obter um produto

rico em compostos fenólicos que possa ser aplicado como ingrediente funcional na indústria

alimentícia.

2 Objetivos

23

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Produzir um extrato microencapsulado concentrado em compostos fenólicos extraídos

do resíduo do processamento do pseudofruto do caju que apresente potencial antioxidante

para ser empregado na indústria alimentícia como ingrediente funcional.

2.2 Específicos

1. Obter extratos ricos em compostos fenólicos utilizando operações de extração

enzimática e hidroetanólica;

2. Caracterizar os extratos quanto ao teor de compostos fenólicos totais e atividade

antioxidante;

3. Concentrar os extratos;

4. Microencapsular os extratos concentrados;

5. Caracterizar os extratos microencapsulados quanto ao teor de compostos fenólicos

totais, atividade antioxidante, distribuição de tamanho de partícula, morfologia,

higroscopia e identificação dos principais compostos fenólicos;

6. Avaliar a estabilidade dos extratos microencapsulados quanto ao teor de compostos

fenólicos totais e atividade antioxidante.

3 Revisão Bibliográfica

24

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Caju (Anacardium occidentale L.)

O cajueiro é uma planta tropical, originária do Brasil, e produzida também na Índia,

Vietnã, Moçambique e Nigéria. O agronegócio do caju no mundo movimenta,

aproximadamente, 2,4 bilhões de dólares por ano. O Brasil apresenta uma área plantada

superior a 750 mil hectares, que responde por mais de 95 % da produção nacional, sendo os

estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte os principais produtores (OLIVEIRA et al.,

2002; IBGE, 2013).

A peculiaridade da indústria de beneficiamento de caju é que ela está voltada

essencialmente para o mercado externo. A demanda de países de alta renda per capita pela

amêndoa tem sido estável ou até ascendente nos últimos anos. Por essa razão, além de gerar

empregos no campo e na indústria, a exportação da amêndoa da castanha constitui uma

importante fonte de receita, com destaque para o estado do Ceará, cuja cadeia produtiva

alimenta um extenso parque industrial (ANDRADE NETO, 2006).

A produção nacional da castanha de caju gerou divisas da ordem de 130 milhões de

dólares anuais, entre os anos de 2012 e 2015, somente com a exportação. Estados Unidos,

Holanda e Canadá são os principais mercados consumidores deste produto, responsáveis por

cerca de 70 % das importações (SECEX/MDIC, 2015). Apesar da importância dessa atividade

agroindustrial, observa-se que o seu potencial econômico permanece pouco explorado

(OLIVEIRA; IPIRANGA, 2009).

O caju é constituído por duas partes: a castanha, que é o fruto propriamente dito, e o

pedúnculo floral ou pseudofruto, como apresentado na Figura 1 (LIMA et al., 2011). O

pedúnculo é a parte comestível in natura do caju e representa cerca de 90 % da massa total.

Os 10 % restantes correspondem ao fruto, de onde se extraem a amêndoa da castanha de caju

(ACC) e o líquido da castanha de caju (LCC) (PAIVA; GARRUTI; SILVA NETO, 2011).

A amêndoa, parte comestível da castanha após processo de torrefação ou fritura, é rica

em gorduras, proteínas, carboidratos, fósforo e ferro (BRASIL, 2009; MOURA, 2009). O

LCC é matéria-prima básica para a fabricação de vernizes, tintas, plásticos, lubrificantes e

inseticidas. Já o tanino, extraído da película da amêndoa, é muito utilizado na indústria


química, a exemplo da produção de resinas e curtimento de pele animal (BATTESTIN;

MATSUDA; MACEDO, 2004).

Figura 1. Cajus, com respectiva identificação da amêndoa e do pseudofruto.

O pseudofruto do caju apresenta estrutura carnosa e suculenta e é utilizado na

elaboração de polpas, sucos, néctares, refrigerantes, sucos clarificados (cajuína) e doces, em

escala industrial ou artesanal (MEDEIROS et al., 2012). O pseudofruto apresenta em sua

composição vitaminas, sais minerais, ácidos orgânicos e carboidratos, constituindo-se como

uma importante fonte nutricional (LAVINAS et al., 2006). A composição centesimal do

pseudofruto do caju está apresentada no Quadro 1.

Quadro 1. Composição centesimal do pseudofruto do caju in natura.

Componente (g.100g-1

) Resultado

Umidade 84,34

Proteínas 1,43

Lipídios 0,55

Resíduo mineral fixo 0,25

Carboidratos totais 13,43

VET (kcal.100g-1

) 64,4

VET: Valor energético total. Fonte: Adaptado de Alves, Alves e Naves (2013).

3.2 Derivados e coprodutos do processamento do caju

O caju é uma fruta ícone da economia do Nordeste, entretanto, o desenvolvimento de

derivados do pseudofruto do caju ainda é pouco explorado pela agroindústria que se dedica

principalmente ao beneficiamento por processos tecnológicos tradicionais. Sua importância

social e econômica têm merecido intensos esforços dos governos, instituições de pesquisa,

Foto

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rett

o.

Castanha

Pseudofruto


desenvolvimento e inovação (PD&I) e de organizações não governamentais que buscam

garantir a competitividade deste agronegócio (ROCHA et al., 2010).

Mesmo considerando o pioneirismo brasileiro da industrialização do pedúnculo do caju,

que tem o suco como principal produto com uma produção na ordem de 70 mil toneladas/ano,

esta economia absorve apenas 20 % da produção anual, devido aos desafios apresentados para

conservação dos pseudofrutos, como alto grau de perecibilidade e dificuldades na colheita

(SILVA NETO, 2011).

Supondo-se que a relação média entre o pseudofruto e a castanha é de 90:10 (m/m), é

possível estimar que um pomar que produza 200 quilos de castanha por hectare, por exemplo,

renderá, em paralelo, 1800 quilos do pseudofruto. Já a viabilidade do pedúnculo está baseada

nos valores pagos atualmente pelas multinacionais (R$ 0,50 por quilo de pedúnculo), o que

significa R$ 900,00 por hectare somente em pedúnculo, que era anteriormente desperdiçado.

Somando este valor ao rendimento obtido com 200 quilos da castanha, vendida a R$ 1,50 por

quilo, chega-se a R$ 1,2 mil, ou seja, quatro vezes mais do que o valor pago apenas pela

produção da castanha. Este saldo financeiro contribui para o aumento da renda dos produtores

e consequente fortalecimento da cadeia produtora deste fruto (FERREIRA, 2012).

O processamento do pseudofruto do caju vem atraindo investimentos de

multinacionais por ser uma matéria-prima de baixo custo que pode contribuir para a redução

de despesas operacionais, aumentando a competitividade se comparada com outras frutas

tropicais. Os novos consumidores da classe média emergente de todo o planeta apresentam

uma demanda progressiva por novos produtos estimulando as companhias de alimentos a

experimentar em larga escala sabores e ingredientes cujo apelo, até recentemente, era apenas

local (STROMAUG, 2014).

A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) tem desenvolvido

tecnologias, serviços e processos agroindustriais de derivados do caju, a exemplo de vinhos,

compotas, doces em massa, geleias, mel clarificado e rapadura (PAIVA; GARRUTI; SILVA

NETO, 2011).

O bagaço de caju é o principal resíduo obtido industrialmente após a extração da polpa

ou suco, podendo ser reprocessado em prensa expeller (do tipo parafuso sem fim) para

redução do tamanho da fibra (LIMA et al., 2014). Sucos probióticos (PEREIRA; MACIEL;

RODRIGUES, 2011), bebidas fermentadas (ARAÚJO et al., 2011b); reestruturados

empanados (OLIVEIRA et al., 2011); hambúrgueres (LIMA; BRUNO; SOUZA NETO,


2011) e geleias (ASSIS et al., 2007) são alguns exemplos de aplicações do bagaço caju na

produção de derivados alimentícios de maior valor agregado.

A extração de compostos funcionais presentes no pedúnculo também tem sido

reportada em trabalhos científicos que visam o aproveitamento do bagaço de caju como fonte

de oligossacarídeos prebióticos (RABELO; FONTES; RODRIGUES, 2009); frutose e glicose

(KUILA et al., 2011) e concentrado proteico (CAMPOS et al., 2005). Dentre outros produtos

que utilizaram esta biomassa como matéria-prima principal, destacam-se: bioetanol

(SHENOY et al., 2011); biogás (LEITÃO et al., 2011); enzimas (RODRIGUES; PINTO;

GONÇALVES, 2008) e xilitol (PAIVA et al., 2014).

3.3 Compostos fenólicos

Uma expressiva parte das propriedades benéficas de frutas, vegetais e grãos tem sido

atribuída a compostos químicos bioativos não nutrientes, comumente denominados de

fitoquímicos. As frutas, por exemplo, apresentam entre 5.000 e 25.000 fitoquímicos

individuais (ACOSTA-ESTRADA; GUTIÉRREZ-URIBE; SERNA-SALDÍVAR, 2014).

A constatação de que dietas ricas em frutas e vegetais, como as da população

mediterrânea contemporânea e asiática, reduzem o risco de doenças crônicas não

transmissíveis (p.ex. inflamações crônicas, doenças cardiovasculares, câncer e diabetes)

impulsionou pesquisas que relatam quais são os principais compostos bioativos atuantes em

alvos fisiológicos específicos e que, dessa forma, interferem nos processos patogênicos dessas

doenças. Dentre os compostos bioativos que apresentam efeitos protetores para a saúde

humana, destacam-se os compostos fenólicos (BASTOS; ROGERO, ARÊAS, 2009;

CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009; BORGES et al., 2010; ACOSTA-ESTRADA;

GUTIÉRREZ-URIBE; SERNA-SALDÍVAR, 2014).

Os compostos fenólicos são metabólitos secundários amplamente distribuídos no reino

vegetal. Estruturalmente, são definidos como substâncias que possuem um anel aromático

com um ou mais substituintes hidroxílicos (BRAVO, 1998). Os compostos fenólicos são

comumente encontrados em plantas, sejam comestíveis ou não, e têm sido reportados por

apresentarem efeitos biológicos múltiplos, incluindo atividade antioxidante (KAHKONEN et

al., 1999).

A rota do ácido chiquímico (Figura 2) é responsável pela biossíntese de diversos

compostos fenólicos nas plantas, incluindo ácidos fenólicos, flavonoides e taninos


condensados (STARCEVIC et al., 2008; MAEDA; DUDAREVA, 2012). Nesta rota,

carboidratos simples derivados da glicólise e da via das pentoses-fosfato são convertidos em

aminoácidos aromáticos, fenilalanina e triptofano, resultando nos compostos fenólicos

(MANDAL; CHAKRABORTY; DEY, 2010).

Figura 2. Rota simplificada do ácido chiquímico, destacando a produção de compostos

fenólicos. Fonte: Adaptado de Mann (1987).

Os compostos fenólicos podem ser classificados pelo número e arranjo dos seus

átomos de carbono. Os fenólicos que ocorrem naturalmente nos tecidos das plantas podem ser

classificados em dois grupos: os flavonoides e os não flavonoides (CROZIER; JAGANATH;

CLIFFORD, 2009).

O grupo dos flavonoides inclui mais de 8.000 compostos identificados e apresenta

como principais alimentos-fonte frutas e hortaliças, chás, cacau e soja (TAPAS; SAKARKA;

KAKDE, 2008). Os flavonoides são biossintetizados a partir das rotas do acetato ou do ácido

chiquímico, resultando em uma estrutura do tipo C6-C3-C6, a qual consiste de dois anéis

aromáticos e um anel heterocíclico (benzopirano) (JAGER; SAABY, 2011).

D-glicose

Fosfoenolpiruvato

Eritrose-4-fosfato

Deoxi-d-heptolusonato-

7-fosfato

Ácido 3-

dihidroquínico

Ácido 5-

dihidrochiquímicoÁcido chiquímico

Ácido 5-

fosfochiquímico

Ácido gálico

3-enolpiruvilchiquimato-

5-fosfato

Ácido

corísmico

Ácido

prefênico

Ácido

fenilpirúvicoFenilalanina

Ácido cinâmico

Ácido benzoico

Ácido salicílicoÁcido p-

hidroxibenzoico

Ácido p-cumárico Ácido cafeico Ácido ferúlico

p-cumaroil-CoA Chalconas

Malonil-CoA

Flavanona

Isoflavonas Flavonas

Dihidrokaempferol

Flavan-3-ol

Kaempferol

Dihidroquercetina

Quercetina

DihidromiricetinaMiricetina


De acordo com os graus de insaturação e oxidação do anel benzopirano, os

flavonoides são divididos em diversas classes. Em frutas e vegetais, estes compostos podem

apresentar estruturas complexas, devido à ocorrência comum dos flavonoides como derivados

glicosilados, onde um ou mais grupos hidroxila estão combinados a açúcares (REPOLLES;

HERRERO-MARTINEZ; RAFOLS, 2006).

Dentre os flavonoides presentes em alimentos, destacam-se as antocianinas, que

podem ser encontradas em alguns cereais e tubérculos (cebola roxa, berinjela, repolho,

rabanete) e, principalmente, em frutas vermelhas como cereja, morango, ameixa, uva, amora,

framboesa e açaí (ARAÚJO et al., 2011a; FERNANDES et al., 2014).

Outros flavonoides relevantes pelo potencial bioativo são as flavanonas, presentes nas

frutas cítricas (PETERSON et al., 2006; PLAZA et al., 2011); os flavanóis, encontrados no

cacau e chocolate (BORGES et al., 2011; MA et al., 2011); os flavonóis, encontrados em chás

e frutas (HOFFMANN-RIBANI; HUBER; RODRIGUEZ-AMAYA, 2009) e as isoflavonas,

as quais ocorrem principalmente na soja e em seus derivados (WEI, 2012; XIAO, 2012).

As catequinas integram o grupo dos flavanóis e são largamente encontradas em chás,

especialmente no chá verde, com destaque para os compostos catequina, galocatequina,

epicatequina, epigalocatequina, epicatequina galato e epigalocatequina galato

(MATSUBARA; RODRIGUEZ-AMAYA, 2006; SENGER; SCHWANKE; GOTTLIEB,

2010). As estruturas químicas de alguns flavonoides estão apresentadas na Figura 3.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 3. Estrutura química de alguns flavonoides: (a) flavona; (b) flavonol; (c) flavanona e

(d) isoflavona. Fonte: Adaptado de Testai (2015).


Os compostos fenólicos não flavonoides são subdividos em ácidos fenólicos e os

hidroxilados dos estilbenos, lignanas e cumarinas (RENTZSCH; WILKENS;

WINTERHALTER, 2009). Os ácidos fenólicos são compostos derivados do ácido

hidroxibenzoico e do ácido hidroxicinâmico (GIADA, 2013). Dentre os de destaque

encontrados em fontes alimentícias naturais, estão os ácidos cafeico, ferúlico, clorogênico,

elágico, sinápico e p-cumárico (YANG et al., 2001). Alguns destes compostos estão

apresentados na Figura 4.

(a) (b)

(c) (d)

(e)

Figura 4. Estruturas químicas de alguns ácidos fenólicos: (a) ácido protocatecuico; (b) ácido

cafeico; (c) ácido gálico; (d) ácido siríngico e (e) ácido clorogênico. Fonte:

Adaptado de Andjelkovic et al. (2006).

Os compostos hidroxilados dos estilbenos englobam um grande grupo de bioativos

presentes nas plantas, no entanto poucos destes compostos são encontrados na dieta humana, a

exemplo do trans-resveratrol (trans- 3,5,4'–trihidroxistilbeno) e do seu glicosídeo natural, o

trans-piceido. Sua estrutura é caracterizada por dois anéis benzeno ligados por um etileno, o

qual forma uma estrutura planar de anéis separados por uma dupla ligação (KASIOTIS et al.,

2013). Os teores de estilbenos reportados em alimentos são geralmente menores que outros

compostos fenólicos, como flavonoides e taninos (XIE; BOLLING, 2014).


As hidroxicumarinas ou hidroxibenzopironas, lactonas derivadas do ácido o-

hidroxicinâmico, são encontradas nos órgãos das plantas e geralmente acumulam-se em

sementes, raízes, órgãos reprodutivos e células epidérmicas. Podem existir nas células nas

formas livres ou conjugadas a açúcares através de ligações glicosídicas (PETRUL’OVÁ-

PORACKÁ et al., 2013; WITAICENIS et al., 2013).

Ressalta-se que os compostos fenólicos exibem propriedade antioxidante reconhecida

sobre mecanismos tais como complexação de íons metálicos, captura de radicais livres,

decomposição de peróxidos, doação de elétrons ou do hidrogênio, inativação de espécies

reativas de oxigênio, absorção de radiações ultravioleta, entre outros (ANDRADE et al.,

2015).

3.3.1 Compostos fenólicos de interesse na formulação de alimentos funcionais

Os alimentos funcionais vêm sendo desenvolvidos por mais de 30 anos e rapidamente

se tornaram itens básicos de consumo nos mercados internacionais. O termo “alimento

funcional” foi primeiramente conceituado no Japão em 1984 (MARTIROSYAN; SINGH,

2015).

Como definição geral, os alimentos funcionais são descritos como aqueles que podem

proporcionar benefícios adicionais à saúde, além do seu valor nutricional básico (DIPLOCK

et al., 1999; SIRÓ et al., 2008). A adição de componentes que apresentem propriedades de

melhoria das condições fisiológicas, ou de redução do risco de evolução de certas doenças, é o

procedimento mais usual para a produção dos alimentos funcionais (HAO; BETA, 2012).

Os compostos fenólicos podem ser aplicados na indústria de alimentos como

ingredientes funcionais, uma vez que apresentam capacidade antioxidante (ACOSTA-

ESTRADA; GUTIÉRREZ-URIBE; SERNA-SALDÍVAR, 2014). Esta peculiaridade vem

sendo explorada para aumentar a funcionalidade de alguns alimentos, com efeito potencial à

saúde humana. Outra utilidade destes fitoquímicos refere-se à substituição de aditivos

sintéticos, como o butil-hidroxi-anisol (BHA) e o butil-hidroxi-tolueno (BHT), os quais são

reportados como substâncias nocivas associadas à exposição prolongada e evidência do

aparecimento de câncer em ratos e macacos (BRANEN, 1975; BAUER; HARBAUM-

PIAYDA; SCHWARZ, 2012).

No contexto da aplicação de compostos fenólicos extraídos de resíduos de frutas,

Lavelli et al. (2015) desenvolveram um purê de tomate fortificado com fibras antioxidantes


provenientes da casca da uva. Çam, Içyer e Ergodan (2014) produziram sorvetes enriquecidos

com compostos fenólicos extraídos da casca da romã e Sriwattana et al. (2015) elaboraram

uma bebida de morango concentrada fortificada com extrato da semente da longana, fruta

similar à pitomba brasileira.

Bebidas enriquecidas com compostos fenólicos, por exemplo, podem fornecer

combinações pretendidas de compostos fenólicos biodisponíveis, o que normalmente exigiria

um consumo de vários tipos de alimentos derivados de vegetais (BORGES et al., 2010).

Dionísio et al. (2015) reportaram que uma bebida funcional desenvolvida com polpa de caju e

batata yacón apresentaram propriedades hipoglicêmicas com potencial para o controle da

diabetes em ratos.

Dentre outros exemplos de alimentos funcionais enriquecidos com compostos

fenólicos, citam-se: farinha de soja enriquecida com antocianinas e outros fenólicos do mirtilo

(ROOPCHAND et al., 2013); chocolates com flavonoides extraídos da framboesa

(BELŠČAK-CVITANOVIĆ et al., 2012); chá verde pronto para beber enriquecido com

epigalocatequina galato (BAZINET et al., 2010) e vinhos produzidos a partir de uvas que

passaram por enriquecimento prévio do teor de resveratrol (BARREIRO-HURLE;

COLOMBO; CANTOS-VILLAR, 2008).

A incorporação de compostos fenólicos em produtos alimentícios, com o objetivo de

atribuir ou ampliar sua funcionalidade em termos de capacidade antioxidante, envolve o uso

de extratos concentrados obtidos, em geral, por microencapsulamento (ÇAM; IÇYER;

ERGODAN, 2014) e liofilização (ALEMÁN et al., 2015). Também são aplicados

ingredientes provenientes de operações de menor custo, como extratos aquosos

(GUNATHILAKE; RUPASINGHE; PITTS, 2013; BAIANO et al., 2015) e farinhas

(SECZYK; SWIECA; GAWLIK-DZIKI, 2015).

3.3.2 Compostos fenólicos presentes no pseudofruto do caju

O pseudofruto do caju é uma fonte importante de compostos fenólicos. Silva et al.

(2014) caracterizaram os teores de compostos fenólicos e de carotenoides na polpa e no

resíduo de caju fresco (Quadro 2) e verificaram maiores teores de antocianinas e de

flavonoides no bagaço do caju do que na polpa, sugerindo um potencial de utilização deste

coproduto para produção de suplementos nutracêuticos, aditivos alimentares ou produtos

farmacêuticos.


Quadro 2. Compostos fenólicos e carotenoides em polpa e bagaço de caju.

Análises Polpa Bagaço

Fenólicos totais (mg AGE.100 g-1

base seca) 5286,5a

6588,4b

Antocianinas (mg.100 g-1

base seca) 7,6a

14,7b

Flavonoides (mg.100 g-1

base seca) n.d. 44,9

β-caroteno (µg.100 g-1

base seca) 454,2a 179,1

b

Resultados expressos como média ± desvio-padrão (n = 3). n.d.: não detectado. Valores em uma mesma linha

que não são seguidos por uma mesma letra diferem significativamente entre si (p < 0,05). Fonte: Adaptado de

Silva et al. (2014).

O potencial antioxidante do caju também está relacionado com a presença de ácidos

fenólicos, dentre eles o ácido anacárdico, composto encontrado no Ginkgo biloba e associado

ao tratamento e prevenção de doenças cardiovasculares (HAMAD; MUBOFU, 2015;

AGOSTINI-COSTA et al., 2004). Broinizi et al. (2007) identificaram oito ácidos fenólicos no

pedúnculo do caju, sendo quatro derivados do ácido hidroxibenzoico (gálico, protocatecuico,

gentíssico e salicílico) e quatro derivados do ácido hidroxicinâmico (caféico, ferúlico,

cinâmico e p-cumárico), como apresentado no Quadro 3. Neste estudo, o ácido salicílico foi o

composto mais abundante em todas as frações, seguido do ácido p-cumárico.

Quadro 3. Frações de ácidos fenólicos livres (AFL), esterificados solúveis (AFS) e insolúveis

(AFI) presentes no bagaço e no extrato bruto concentrado do pedúnculo de caju

(EBC).

Ácidos fenólicos Bagaço (mg.g

-1) EBC (mg.g

-1)

AFL AFS AFI AFL AFS

Salicílico 1270 984 610 1660 741

Cinâmico - 0,1 - 19,6 0,2

Gentíssico - 0,1 - - 38,3

Protocatecuico - 0,2 - - 0,1

p-cumárico 20 0,1 0,01 145,2 0,1

Gálico 0,04 36 0,1 31,4 33,6

Ferúlico 0,02 0,05 0,03 0,15 0,05

Caféico 0,1 0,04 0,04 0,05 0,05

Total 2,8 mg AGE.100g-1

10,4 mg AGE.100g-1

EBC obtido por extração com éter etílico, etanol e água. AGE – ácido gálico equivalente. Fonte: Adaptado de

Broinizi et al. (2007).


Ao caracterizar duas diferentes variedades de caju provenientes da região de Yucatán,

México, Moo-Huchin et al. (2014) obtiveram resultados superiores para o caju vermelho

quando comparado ao amarelo: 54,2 % mais compostos fenólicos totais, 57,3 % mais

antocianinas e 481,42 % mais flavonoides totais.

Brito et al. (2007) também reportaram altos teores de flavonoides glicosilados quando

quantificaram flavonoides em caju por cromatografia líquida com arranjo de diodo e

espectrometria de massa e ionização por eletrospray, com destaque para os açúcares: 3-o-

galactosídeo, 3-o-glicosídeo, 3-o-ramnosídeo, 3-o-xilopiranosídeo, 3-o-arabinopiranosídeo e

3-o-arabinofuranosídeo, derivados da quercetina e da miricetina.

Em estudo sobre mudanças nos níveis de compostos bioativos e na capacidade

antioxidante de caju minimamente processado, Queiroz et al. (2011) avaliaram os teores de

ácido ascórbico, compostos fenólicos totais e proantocianidinas do caju submetido a

diferentes temperaturas de estocagem. Os resultados reportados por esses autores estão

apresentados no Quadro 4. Observou-se que, após 24 horas, as frutas mantidas a 2 °C, 27 °C e

40 °C não apresentaram uma diferença significativa (p < 0,05) dos compostos avaliados.

Destaca-se também que os valores iniciais obtidos para as proantocianidinas foram mantidos

estáveis a 2 °C e 27 °C, contudo houve uma redução de 25 % para a amostra mantida a 40 °C

em comparação ao controle, provavelmente devido à degradação destes compostos em

temperaturas elevadas.

Quadro 4. Teores de ácido ascórbico, fenólicos totais e proantocianidinas de caju

minimamente processado e estocado em diferentes temperaturas por 24 horas.

Condições de

estocagem

Ácido ascórbico

(mg.100g-1

)

Fenólicos totais

(mg AGE.100g-1

) Proantocianidinas

(mg.100g-1

) Solúveis Hidrolisáveis

Controle 163,3ª 12,8ª 18,5ª 9,3ª

2 °C 143,3b 14,5ª 21,0ª 8,5ª

27 °C 100,5c 17,0ª 21,2ª 8,4ª

40 °C 109,4c 10,5ª 16,9ª 2,5

b

AGE – ácido gálico equivalente. Resultados expressos como média ± desvio-padrão de dois experimentos

independentes (n = 2). Letras iguais na mesma coluna não diferem significativamente entre si de acordo com o

teste de Tukey ao nível de probabilidade de 5 %. Fonte: Adaptado de Queiroz et al. (2011).

Bataglion et al. (2015) desenvolveram um método de cromatografia líquida de ultra

eficiência acoplada a espectrometria de massa utilizando eletronebulização (electrospray


ionization) e quantificaram oito compostos fenólicos na polpa de caju, sendo a miricetina o

principal composto identificado. Os resultados deste estudo estão apresentados no Quadro 5.

Quadro 5. Concentração de compostos fenólicos em polpa de caju.

Compostos Concentração (µg.g-1

PL)

Ácido gálico 148,5

Ácido protocatecuico 2,7

Galato de etila 4,2

Ácido p-cumárico 2,5

Miricetina 192,0

Quercetina 23,1

Luteolina 3,7

Kaempferol 1,7

Total 378,4

PL – polpa liofilizada. Fonte: Adaptado de Bataglion et al. (2015).

3.4 Tecnologias para aumentar a disponibilidade de compostos fenólicos

A disponibilidade de compostos fenólicos é uma característica importante, já que esta

varia amplamente entre os diversos compostos. Não necessariamente os mais abundantes em

nossa dieta, ou os que apresentam maior capacidade antioxidante in vitro, são os mais

biodisponíveis. Um composto com alta atividade antioxidante pode, ao ser ingerido, ser pouco

absorvido, intensamente metabolizado ou rapidamente eliminado, resultando em baixa

atividade biológica. Ainda, os metabólitos produzidos pela atividade digestiva ou hepática

podem ser completamente inativos ou apresentar capacidade antioxidante maior que o

composto original (MANACH et al., 2004).

O consumo de compostos fenólicos livres ou conjugados depende do impacto à saúde

desejado. Na dieta humana, os compostos fenólicos conjugados podem apresentar, inclusive,

atividade preventiva contra o câncer de colón. Por outro lado, as formas livres são mais

rapidamente absorvidas no estômago e no intestino delgado e distribuídas por todo o corpo

com outros benefícios à saúde, como atividades de inibição contra a oxidação do colesterol

LDL (ACOSTA-ESTRADA; GUTIÉRREZ-URIBE; SERNA-SALDÍVAR, 2014).

Alguns flavonoides podem ser absorvidos pela rota gastrointestinal, desde que não

estejam glicosilados, e os glicosídeos podem ser absorvidos no intestino delgado, desde que


não estejam ligados a açúcares, tais como a ramnose, os quais só podem ser hidrolisados pela

microbiota do intestino grosso (cólon) (MANACH et al., 2004).

Uma estratégia para modificar a biodisponibilidade dos compostos presentes em

alimentos e extratos vegetais é promover a hidrólise visando aumentar a concentração das

substâncias ativas de interesse (GERMANO et al., 2006). Alguns estudos reportaram

diferenças na atividade e na biodisponibilidade de extratos vegetais hidrolisados e não

hidrolisados (RIVELLI, 2010). A quercetina, por exemplo, apresenta maior capacidade

antioxidante quando comparada à sua forma glicosilada (MUROTA; TERAO, 2003).

Diversas tecnologias de extração de compostos fenólicos a partir de fontes naturais

vêm sendo aperfeiçoadas com o objetivo de preservar as características desses compostos

como, por exemplo, alta pressão hidrostática (JUN et al., 2009); campo elétrico de alta

voltagem (BOUSSETTA et al., 2012); extração sólido-líquido (BUCIC-KOJIC et al., 2007);

extração líquido-líquido (BABU; RASTOGI; RAGHAVARAO, 2008); extração enzimática

(ZHANG et al., 2013); ultrassom (D’ALESSANDRO et al., 2012); membranas poliméricas

(SARMENTO et al., 2008) e ultrafiltração (NAWAZ et al., 2006).

Apesar de muitos processos de extração de bioativos a partir de diferentes fontes

naturais serem desenvolvidos, na maioria dos casos, compostos remanescentes são

encontrados interligados a suas respectivas matrizes, especialmente açúcares presentes nos

tecidos vegetais. Dessa forma, aplicam-se processos de biotransformação que são capazes de

clivar as ligações químicas entre os compostos fenólicos e os açúcares, elevando a

concentração de compostos fenólicos livres (NETTO, 2012). Dentre os processos de

biotransformação, destacam-se a fermentação e a hidrólise enzimática.

3.4.1 Extração enzimática

A extração de compostos fenólicos assistida por enzimas é um processo

biotecnológico que tem atraído a atenção de muitas pesquisas científicas nos últimos anos.

Este processo pode aumentar a recuperação destes bioativos, além de preservar as suas

propriedades funcionais (GOMEZ-GARCIA; MARTINEZ-AVILA; AGUILAR, 2012). No

mecanismo da hidrólise enzimática, as enzimas que degradam a parede celular vegetal

(celulases, hemicelulases e pectinases, por exemplo) tornam os materiais intracelulares mais

acessíveis para extração (LI; SMITH; HOSSAIN, 2006).


Na parede celular vegetal, microfibrilas de celulose estão integradas em uma matriz,

ligadas principalmente por hemicelulose e pectina. Algumas células vegetais podem conter

também lignina, um polímero de natureza não-polissacarídica (NUTT, 2006).

As enzimas do complexo celulolítico (celulases) são hidrolases que catalisam a

clivagem das ligações glicosídicas e são classificadas de acordo com seu local de atuação no

substrato celulósico. As endoglucanases (EC 3.2.1.4) agem de forma aleatória, clivando

ligações β-1,4, dentro da molécula da celulose. As celobiohidrolases (exoglucanases; EC

3.2.1.91) removem as unidades de celobiose a partir das extremidades da cadeia da celulose.

As β-glicosidases (EC 3.2.1.21), ou celobiases, clivam a celobiose e de pequenos

polissacarídeos em duas unidades de glicose (LEE et al., 2002; HAHN-HAGERDAL, et al.

2006). A ação destas enzimas está apresentada na Figura 5.

Figura 5. Reações catalisadas pelas celulases. (1) Ação das endoglucanases e liberação de

oligossacarídeos; (2) ação das exoglucanases com formação da celobiose e (3)

ação da β-glicosidase, ou celobiase, e obtenção de glicose. Fonte: Adaptado de

Farinas (2011).

Em contrapartida, a hidrólise de ligninas e hemiceluloses gera açúcares e subprodutos,

principalmente difenóis, derivados de fenilpropano, cetonas, furfural e ácido acético

(ODEGA; PETRI, 2010).

Celulose

2

Celobiose Glicose

1

3


Por ser um material lignocelulósico (18 % de celulose; 27 % de hemicelulose e 24 %

de lignina, em média), ao bagaço de caju é possível aplicar preparações enzimáticas

celulolíticas e hemicelulolíticas a fim de obter as melhores condições de hidrólise e,

consequentemente, um aumento considerável na extração dos compostos fenólicos (LIMA et

al., 2012; ROCHA et al., 2014; COSTA et al., 2015).

Preparações enzimáticas com atividade pectinolítica foram aplicadas para aumentar a

concentração de compostos fenólicos e modificar o perfil de antocianinas em vinhos tintos

(PARDO et al., 1999; BARREIRO; CHARAMELO; GONZÁLEZ-NEVES, 2006). A enzima

tanase, obtida da Paecilomyces variotii, foi utilizada na clivagem de ligações glicosídicas dos

compostos fenólicos presentes no suco de laranja (FERREIRA et al., 2013).

Para remover grupos terminais dos flavonoides presentes em chá mate, chá verde e

sucos de laranja e limão, Gonzáles-Barrio et al. (2004) avaliaram a atuação das enzimas

hespiridinase, naringinase, glicosidase e β-galactosidase. Fernández, Vega e Aspé (2015)

extraíram proantocianidinas de cascas e sementes de uvas a partir da hidrólise enzimática

utilizando três enzimas (pectinase, celulase e tanase), além de uma combinação enzimática

entre elas, para aumentar as concentrações de compostos fenólicos e reduzir a massa molar

das proantocianidinas extraídas.

Barbosa et al. (2010) reportaram o uso de um complexo enzimático pectinolítico para

obtenção de carotenoides provenientes do bagaço do caju, onde obtiveram um ganho

percentual global de 48 %, indicando uma ação considerável da pectinase na extração de

pigmentos de caju.

A enzima comercial ROHAPECT®PTE (atividade celulase, glucanase e xilanase) foi

utilizada em sementes de canola para liberação de compostos fenólicos, tocoferóis e

fosfolipídios, os quais estão relacionados à prevenção e tratamento de doenças crônicas,

cardio e neurodegenerativas, envelhecimento, câncer e artrite reumatoide (LI; SMITH;

HOSSAIN, 2006).

Segundo Hsieh e Graham (2001), as β-glicosidases (EC 3.2.1.21) são um grupo de

enzimas presentes em diversos sistemas celulares de plantas e de animais. Estas enzimas são

capazes de clivar as ligações β-glicosídicas de di e/ou oligossacarídeos ou outros conjugados

de glicose. Este grupo de enzimas tem sido foco de muitos estudos recentes em função da sua

importância em diversos processos biotecnológicos.


Wie et al. (2007) verificaram a ação da β-glicosidase proveniente de Aspergillus niger

na modificação de glicosídeos de saponinas de Platycodon grandiflorum, resultando no

aumento da atividade biológica destes compostos. Além disso, as β-glicosidases têm sido

empregadas com sucesso em estudos de hidrólise de glicosídeos fenólicos, como por

exemplo, os presentes em óleo de oliva (VIERHUIS et al., 2001), vinhos (LA TORRE et al.,

2004; TODARO et al., 2008) e soja (YANG et al., 2009).

3.4.2 Extração hidroetanólica

Os compostos fenólicos podem ser extraídos por vários solventes orgânicos, como o

metanol e o etanol, sendo este o método mais comum para isolar antioxidantes naturais, seja

por técnicas de extração sólido-líquido (JOKIC et al., 2010) ou extração líquido-líquido

(BABU; RASTOGI; RAGHAVARAO, 2008).

A operação unitária denominada extração sólido-líquido envolve uma separação

baseada na dissolução preferencial de um ou mais componentes provenientes de uma matriz

sólida que migram para um solvente líquido. Assim, o processo de extração ocorre como

resultado do efeito da seletividade do solvente para com o soluto, sendo necessário avaliar

qual solvente de extração será aplicado, considerando suas propriedades físico-químicas,

custo e toxicidade (TAKEUCHI et al., 2009).

Paz et al. (2015) obtiveram extratos hidroetanólicos com alta atividade antioxidante e

antibacteriana a partir de oito frutas tropicais (açaí, acerola, cajá, goiaba, graviola, manga,

abacaxi e tamarindo) previamente liofilizadas adicionando-as a uma solução de etanol:água

(1:1; v/v) a uma rotação de 100 min-1

por 1 hora em incubadora do tipo shaker a 25 °C. Os

extratos foram centrifugados (4000 min-1

por 30 minutos), filtrados e concentrados em

rotaevaporador a 40 °C e 40 bar.

Antocianinas e outros compostos fenólicos presentes no bagaço do mirtilo (Vaccinium

ashei) foram extraídos com uma solução hidroalcoólica (20 % etanol; v/v) e relação

substrato:solvente de 1:10 (massa:volume). Esta extração foi realizada a 22 °C por 24 horas,

sob agitação de 300 min-1

e o extrato foi posteriormente microencapsulado para avaliação de

suas possíveis propriedades promotoras de saúde (FLORES et al., 2015). Anteriormente, o

mesmo autor havia reportado três sistemas de solventes (acetona, etanol e metanol) também

para extração de antocianinas do mirtilo (FLORES et al., 2014).


Ham, Kim e Lim (2015) reportaram o uso de uma solução de etanol (50 %; v/v) para

obter um extrato rico em compostos fenólicos que atuasse como fonte natural de antioxidantes

a partir da farinha da casca da castanha-da-índia e obtiveram as maiores taxas de recuperação

quando utilizaram essa solução a uma temperatura de 82 °C por 30 minutos. Os autores

destacaram também que as menores taxas de recuperação desses compostos foram observadas

para o uso de água pura como solvente na temperatura de 25 °C, durante o mesmo intervalo

de tempo.

O uso de etanol na extração de antioxidantes também foi apresentado por Viacava,

Roura e Agüero (2015), os quais utilizaram metodologia de superfície de resposta (MSR) para

aperfeiçoar a obtenção de fenólicos da alface, sendo as melhores condições de processo

alcançadas quando foi utilizada uma solução de etanol 70 % (v/v) à temperatura de 32 °C por

2 horas.

Andrade et al. (2015) utilizaram os solventes orgânicos metanol e acetona para estudo

da extração de compostos fenólicos do resíduo da agroindústria do beneficiamento do caju e

descreveram que estes fitoquímicos foram eficientemente extraídos quando aplicada uma

solução de acetona:água (55:45; m/m) por 30 minutos a 30 °C e rotação de 150 min-1

,

resultando em um extrato com alta capacidade de sequestro de radicais DPPH.

Resíduos de solventes, como metanol ou acetona, podem permanecer nos produtos e

provocar toxicidade se ingeridos. Em contrapartida, o etanol é um solvente compatível com

alimentos e pode ser reduzido ou eliminado por processos de evaporação e secagem em spray

dryer ou liofilizador (FLORES et al., 2015). Assim, o álcool etílico permanece como mais

indicado para obtenção de extratos ricos em compostos fenólicos derivados do bagaço de caju

e que apresentem grau alimentício.

3.5 Microencapsulamento de extratos vegetais ricos em compostos bioativos

A tecnologia associada à modificação da liberação de princípios ativos, como

fármacos e pesticidas, corantes e aromatizantes é vasta. Entre essas operações, os sistemas

matriciais poliméricos são amplamente aplicados na forma de micropartículas (SUAVE et al.,

2006).

O microencapsulamento, ou microencapsulação, aplicado na industrialização de

alimentos, é definido como o processo onde ingredientes alimentícios podem ser estocados

dentro de uma cápsula microscópica para proteção ou liberação posterior dos seus


componentes. Mais especificamente, a microencapsulação envolve pequenas partículas, um

líquido ou um gás no interior de uma camada ou de uma matriz. Tradicionalmente, este

processo não produz cápsulas maiores que três milímetros (JACOBS, 2014).

Dentre as técnicas de microencapsulação, destaca-se a secagem por atomização,

também conhecida como spray drying (MASTERS, 1994). O sistema de atomização é bem

estabelecido, direto e relativamente de baixo custo. Uma configuração tradicional de um

atomizador está apresentada na Figura 6.

Figura 6. Sistema simplificado de um atomizador, com destaque para: (1) entrada do ar

aquecido; (2) câmara de secagem; (3) ciclone; (4) saída de ar frio e (5) saída do

produto seco. As setas vermelhas indicam a circulação do ar de secagem e as

amarelas destacam a circulação do produto. Fonte: Adaptado de GEA (2015).

(1) (2) (4)

(5)

(3)


Neste equipamento, o líquido é atomizado em gotículas na parte superior da câmara de

secagem, escoando através de uma corrente de ar aquecido. Ambos, gotículas e ar, seguem na

mesma direção ou em direções opostas, em escoamento convectivo concorrente ou

contracorrente, respectivamente. A fase líquida é rapidamente aquecida e as moléculas do

líquido são transportadas para a superfície da gotícula e então transferidas para a fase gasosa.

As partículas em forma de pó são transportadas para um ciclone sendo coletadas no tanque de

produto, enquanto que o gás é dissipado para a atmosfera ou reciclado (JACOBS, 2014).

A proteção proporcionada pela parede polimérica das microcápsulas aumenta a

estabilidade de inúmeros compostos químicos e, consequentemente, o tempo de prateleira de

muitos produtos alimentícios, o que torna o processo de microencapsulação de grande

interesse para a indústria de alimentos. A seleção dos parâmetros de produção das

microcápsulas, bem como a definição do material formador da parede, dependem da função

que as microcápsulas desempenharão, do tamanho desejado, do meio de liberação e do

material a ser encapsulado (LEIMANN, 2008).

Na maioria dos processos de atomização na indústria de alimentos são utilizadas

formulações aquosas. Neste caso, o agente encapsulante, também denominado de material de

parede, deve ser solúvel em água, facilitando a dispersão deste na solução que alimentará o

sistema (LEIMANN, 2008).

Diversos agentes encapsulantes, como maltodextrina, amido modificado, goma

arábica, carboximetilcelulose (CMC), proteína isolada do soro de leite, proteína de soja e

zeína (proteína extraída do milho), vêm sendo utilizados no microencapsulamento de

derivados alimentícios. Dentre esses materiais, destacam-se a goma arábica e a maltodextrina

(BOONCHU; UTAMA-ANG, 2015; FLORES et al., 2015; SAIKIA; MAHNOT;

MAHANTA, 2015).

A goma arábica (goma acácia) é um exsudado das árvores de acácia (Acacia senegal e

Acacia seyal). As regiões mais importantes de crescimento das espécies desta árvore e nas

quais se produzem as melhores gomas são o Sudão e a Nigéria (BE MILLER; HUBER,

2010). Consiste principalmente de polissacarídeos de alta massa molar e seus sais de cálcio,

magnésio e potássio, os quais por hidrólise liberam arabinose, galactose, ramnose e ácido

glicurônico (FAO, 1999). Este material de parede apresenta boas propriedades emulsificantes

e reológicas atribuídas à fração proteica inerente à sua estrutura química (YADAV et al.,

2007; MONTENEGRO et al., 2012).


A maltodextrina é um oligossacarídeo de custo relativamente reduzido quando

comparado à goma arábica (PAI et al., 2015). Apresenta baixa higroscopicidade, sendo assim

um eficiente agente carreador (TONON; BRABET; HUBINGER, 2009). Quando usadas

como agente encapsulante, as maltodextrinas com baixo teor de dextrose equivalente (p. ex.,

MD 5) estão relacionadas a maiores temperaturas de colapso (perda da estrutura) do que

aquelas que apresentam teores mais elevados de dextrose equivalente (p. ex., MD 20)

(ISLAM et al., 2016).

Se comparada com a maltodextrina, a goma arábica apresenta elevado custo e

ocasionalmente tem sua importação comprometida pela dificuldade de fornecimento,

relacionada a problemas climáticos, econômicos e políticos da região africana produtora

(ANDRADE et al., 2013). Por isso, é comum a utilização de misturas de goma arábica com

diferentes materiais de parede, como maltodextrina, amidos modificados ou mesmo com

proteínas, que são materiais que apresentam boa capacidade de emulsificação, podendo suprir

a ausência de goma arábica na encapsulação de ingredientes (CARNEIRO, 2011).

Zheng et al. (2011) microencapsularam extratos fenólicos de bayberry (Myrica faya)

utilizando celulose etílica como material de cobertura. Por tecnologia de atomização,

Krishnaiah, Sarbatly e Nithyanandam (2012) produziram microcápsulas a partir da Morinda

citrifolia L. com alta atividade antioxidante, especialmente para aquelas onde somente a

maltodextrina foi utilizada quando comparada com outro material de parede utilizado, sendo

este a goma carragena.

Todisco, Costa e Clemente (2015) microencapsularam e avaliaram a estabilidade dos

compostos bioativos presentes na polpa de seriguela (Spondias purpurea L.). A polpa seca foi

obtida pela atomização de uma solução contendo 90 % da polpa integral da seriguela e 10 %

de maltodextrina (dextrose equivalente = 20), sendo o atomizador operado nas seguintes

condições: temperatura de entrada de 120 °C; temperatura de saída de 80 °C e fluxo de

alimentação de 240 mL.h-1

. Por outro lado, quando a maltodextrina foi utilizada como único

agente encapsulante para extratos de antocianinas extraídas do bagaço da uva, foram

verificadas perdas de material na câmara de secagem do atomizador e consequente

escurecimento do pigmento devido à caramelização dos açúcares (VALDUGA et al., 2008).

Bastos et al. (2012) produziram microencapsulados de suco de caju por técnica de

atomização utilizando isolados da proteína de quitosana e obtiveram alta estabilidade físico-


química (teor de vitamina C e análise de cor) deste novo material, que pode ser aplicado na

indústria como ingrediente alimentício.

Oliveira (2008) aplicou a goma de cajueiro (GC) como substituto de maltodextrinas

para produzir suco de caju atomizado e obteve resultados promissores para a proporção

coadjuvantes de secagem:sólidos de caju de 5:1 (m/m) e substituição de MD por GC de 50 %.

Já Moreira et al. (2009) propuseram utilizar a maltodextrina e a goma do cajueiro na

proporção de 20:80 (m/m), respectivamente, para produção de um extrato em pó da polpa de

acerola de baixa higroscopicidade por tecnologia de atomização.

Extratos microencapsulados ricos em compostos bioativos também podem ser

utilizados como aditivos alimentares naturais, sendo aplicados na elaboração de sorvetes

(ÇAM; IÇYERT; ERDOGAN, 2014), iogurtes (MARTINS et al., 2014), hambúrgueres

(SPINELLI et al., 2014) e óleos vegetais (CHATTERJEE; BHATTACHARJEE, 2013).

Também são reportadas aplicações de extratos antioxidantes microencapsulados na área de

cosméticos (BARROSO et al., 2014).

Assim, a operação de microencapsulamento por atomização é bastante apropriada para

estabilizar e estender a vida de prateleira dos compostos fenólicos (ÇAM; IÇYER;

ERGODAN, 2014). Além disso, os compostos fenólicos encapsulados também podem ser

usados na produção de aditivos alimentares naturais (CILEK et al., 2012).

3.5.2 Caracterização de extratos microencapsulados

3.5.2.1 Distribuição do tamanho de partículas

Existem múltiplas formas de representação do tamanho de uma partícula. Como a

esfera é uma forma regular e possui expressões matemáticas simples para cálculo de área e

volume em função de uma única dimensão característica (diâmetro) então as dimensões das

partículas irregulares são, em geral, relacionadas com o diâmetro da esfera equivalente de

mesma área superficial, volume ou massa (MASSARANI, 2002).

A difração a laser é uma técnica que mede as distribuições de tamanho das partículas

por medição da variação angular na intensidade da luz difundida à medida que um feixe de

laser interage com as partículas dispersas da amostra. Partículas grandes dispersam a luz em

pequenos ângulos em relação ao feixe de laser e partículas pequenas dispersam a luz em

ângulos grandes. Os dados sobre a intensidade da dispersão angular são então analisados para


calcular o tamanho das partículas responsáveis por criar o padrão de dispersão, com base na

teoria de difusão da luz de Mie. O tamanho das partículas é indicado como o diâmetro de uma

esfera de volume equivalente (PARIA; LIMA; PEREIRA, 2015).

3.5.2.2 Morfologia

A visualização das características superficiais e tamanhos de partículas torna-se

evidente ao se examinar as micrografias obtidas a partir de equipamentos específicos, como o

microscópio eletrônico de varredura (MEV). O princípio de um MEV consiste em utilizar um

feixe de elétrons de pequeno diâmetro para explorar a superfície de uma amostra, ponto a

ponto, por linhas sucessivas e transmitir o sinal do detector a uma tela catódica cuja varredura

está perfeitamente sincronizada com aquela do feixe incidente (DEDAVID; GOMES;

MACHADO, 2007).

Por um sistema de bobinas de deflexão, o feixe pode ser guiado de modo a varrer a

superfície da amostra segundo uma malha retangular. O sinal de imagem resulta da interação

do feixe incidente com a superfície da amostra. O sinal recolhido pelo detector é utilizado

para modular o brilho do monitor, permitindo o registro das observações (DEDAVID;

GOMES; MACHADO, 2007). Assim, o MEV forma imagens bidimensionais e de grande

efeito plástico, com uma notável profundidade de foco, permitindo avaliar a forma e a

superfície das micropartículas geradas por diferentes processos, a exemplo da secagem por

atomização (RITTER; MIOTTO, 2006).

3.5.2.3 Isotermas de sorção

Entre todos os fenômenos que regem a mobilidade de substâncias em meios porosos e

aquosos, o transporte difusivo de uma fase móvel (líquida ou gasosa) para uma fase sólida é

um fenômeno de interesse universal. Essa é a razão pela qual a isoterma, uma curva que

descreve a distribuição de uma substância entre duas fases, é uma ferramenta importante para

representar e prever a mobilidade desta substância no meio (LIMOUSIN et al., 2007).

A isoterma de sorção de alimentos descreve a relação termodinâmica entre a atividade

de água e o teor de umidade no equilíbrio de um produto a uma temperatura e pressão

constantes. As isotermas de sorção, também chamadas de curvas de equilíbrio higroscópico,

podem ser geradas por processos de adsorção ou dessorção, sendo a diferença entre estas duas


curvas definida como histerese (RESENDE et al., 2006; ANDRADE; LEMUS; PÉREZ,

2011).

Em materiais porosos, as isotermas de equilíbrio resultantes quase sempre apresentam

um formato do tipo sigmoidal, como apresentado na Figura 7, o qual pode ser dividido em

três partes. Na primeira etapa, onde a umidade relativa é baixa, as moléculas de água se

acumulam em uma camada na superfície dos poros (monocamada). Quando todas as

superfícies dos poros estão cobertas com uma camada das moléculas, a formação da próxima

camada se inicia. A transição é marcada pelo fato da curva apresentar o comportamento de

uma reta. A espessura da camada de água adsorvida aumenta para uma terceira ou quarta

camada com aumento da umidade dos poros. Finalmente, a condensação capilar é o último

mecanismo a ocorrer. O equilíbrio atingido durante um processo de secagem resulta em uma

isoterma de dessorção. Já o equilíbrio estabelecido durante o aumento da umidade relativa do

ar, ou seja, quando o material adquire umidade do ambiente, gera uma isoterma de adsorção.

As isotermas de dessorção sempre se encontram acima das isotermas de adsorção sob uma

mesma temperatura (HANSEN, 1986).

Figura 7. Isoterma de sorção típica de um produto alimentício. Fonte: Andrade, Lemus e

Pérez (2011).

Assim, quando um alimento é exposto a certa umidade, ele perde ou ganha água para

ajustar sua própria umidade a uma condição de equilíbrio com o ambiente (PARK; BIN;

Umidade relativa (%)

Teo

r d

e u

mid

ad

e (%

)

Adsorção

Dessorção


BROD, 2001). Nessa situação, a pressão parcial de vapor de água sobre o alimento iguala-se à

pressão de vapor de água no ar que circunda o alimento (CELESTINO, 2010).

Diversos modelos teóricos, semiteóricos e empíricos que descrevem o comportamento

de sorção de alimentos têm sido propostos pela literatura científica (YANNIOTIS;

BLAHOVEC; 2009). Na maioria dos trabalhos reportados na literatura, a escolha do modelo

mais apropriado se baseia no grau de ajuste dos dados experimentais e no significado físico do

modelo. Segundo Medeiros et al. (2006), os modelos cinéticos podem ser divididos em: (i)

modelos baseados na monocamada (modelo BET); modelos baseados em multicamadas ou

filme condensado (modelo GAB) e modelos semi-empíricos (p. ex., modelos Chirife e

Iglesias).

A equação de Brunauer, Emmett e Teller, conhecida como equação de BET (Equação

1), é recomendada para o ajuste de isotermas de sorção de alimentos, todavia este modelo

apresenta um intervalo limitado de atividade de água (0,3 ≤ aw ≤ 0,4). Duas constantes são

obtidas a partir da equação de BET, nomeadas de teor de umidade na monocamada (Xm) e

constante de ajuste (C). Apesar das limitações da análise de adsorção deste modelo, o

conceito da monocamada de BET norteia vários aspectos de interesse relacionados à secagem

de alimentos (TIMMERMANN; CHIRIFE; IGLESIAS, 2001; FADINI et al., 2006).

onde,

Xe – umidade de equilíbrio;

aw – atividade de água;

Xm – conteúdo de umidade na monocamada molecular;

C – constante de ajuste do modelo.

Por apresentar um número razoável de parâmetros (três), a equação de GAB

(Guggenheim-Anderson-deBoer) é utilizada para representar os dados experimentais em um

intervalo de atividade de água (aw) de interesse prático em alimentos (0,1 ≤ aw ≤ 0,9). Este é

um modelo relativamente simples e seus parâmetros possuem um significado físico (PEDRO;

TELIS-ROMERO; TELIS, 2010). O modelo de GAB é matematicamente expresso pela

Equação 2 (MAROULIS; TSARNI; MARINOS-KOURIS, 1988).

(Eq. 1)


onde,

Xe – umidade de equilíbrio;

aw – atividade de água;

Xm – conteúdo de umidade na monocamada molecular;

C e K – constantes de ajuste do modelo.

Para as diferentes condições de atividade de água, torna-se possível avaliar o

comportamento higroscópico de um produto mantido a uma mesma temperatura, obtendo-se

assim uma isoterma de sorção de umidade característica (FADINI et al., 2006).

(Eq. 2)

4 Material e Métodos

49

4. MATERIAL E MÉTODOS

O procedimento experimental e as determinações analíticas foram realizadas nas

seguintes instituições: (i) Embrapa Agroindústria de Alimentos (RJ); (ii) Laboratório

Bioetanol do IQ/COPPE/UFRJ; (iii) Laboratório de Processamento de Matérias-Primas

Vegetais da EQ/UFRJ; (iv) Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA/UFS) e (v)

Instituto Tecnológico e de Pesquisas do Estado de Sergipe (ITPS).

4.1 Material

4.1.1 Matéria-prima

Cajus frescos da espécie Anacardium occidentale L. foram adquiridos no Centro de

Abastecimento (CEASA) do Rio de Janeiro/RJ, sendo provenientes do município de

Petrolina/PE. As frutas foram transportadas para a Embrapa Agroindústria de Alimentos (RJ)

para obtenção do bagaço.

4.1.2 Reagentes

Todos os reagentes químicos utilizados apresentaram grau analítico. Os reagentes

Folin–Ciocalteu (2N), 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS), dicloreto

de 2,2’-azobis(2-amidinopropano) (AAPH), ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-

carboxílico (TROLOX), ácido gálico (pureza >98%) e os padrões cromatográficos (grau

CLAE) do ácido gálico, rutina, quercetina e isoquercetina foram adquiridos da Sigma

Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).

Os padrões dos açúcares D(+)-galactose, D(+)-glicose, D(+)-xilose, D(+)-manose,

D(+)-arabinose (pureza > 99,0 %) e a acetonitrila (grau CLAE) foram adquiridos na Merck

Millipore (Rio de Janeiro, Brasil). O álcool etílico P.A. (95 %), o álcool isopropílico P.A., a

acetona P.A., o ácido fosfórico P.A. e o carbonato de cálcio P.A. foram fornecidos pela Vetec

Química Fina Ltda. (Rio de Janeiro, Brasil). O cartucho Oasis® HLB foi adquirido na Waters

(Rio de Janeiro, Brasil). A água foi purificada em sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, EUA).

4.1.3 Insumos

O ácido tricloroisocianúrico 6 % foi adquirido na Solint (São Paulo, Brasil). As

enzimas Celluclast® 1.5 L, uma celulase obida do fungo filamentoso Trichoderma reesei, foi


adquirida na Novozymes (Dinamarca); e o extrato enzimático rico em β-glicosidase, obtido a

partir do fungo filamentoso Aspergillus awamori, conforme descrito por Gottschalk, Oliveira

e Bon (2010), foi cedido gentilmente pelo Laboratório Bioetanol do IQ/COPPE/UFRJ. Os

agentes encapsulantes aplicados foram maltodextrina DE5 (Globe® 1805,Corn Products

Brasil) e goma arábica instantânea (Vetec Química Fina Ltda., Brasil). Os filtros de seringa

(0,2 µm; diâmetro de 13 mm), com membrana de poliamida, foram adquiridos na Chromafil®

(Macherey-Nagel, Duren, Alemanha).

4.2 Procedimento experimental

4.2.1 Obtenção do bagaço de caju

Os cajus foram lavados em água corrente e imersos por 15 minutos em solução com

princípio ativo do ácido tricloroisocianúrico 6 %, equivalente a uma concentração de cloro

livre de 50 mg.L-1

, sendo então lavados em água corrente para eliminação do resíduo de cloro.

Os pedúnculos foram separados manualmente das castanhas e fracionados em pedaços na

etapa de corte. A trituração foi realizada em liquidificador semi-industrial (Tron, São Paulo,

Brasil) para obtenção da polpa de caju, a qual foi separada do bagaço por peneiramento (20

mesh).

O bagaço retido na peneira foi prensado manualmente utilizando-se uma bolsa filtrante

(modelo F-Screen, Technical Filter, São Paulo, Brasil) para remoção do excesso de líquido

(polpa), simulando as condições de processos industriais. O bagaço prensado foi condicionado

em embalagens de polipropileno e congelado em freezer a -18 °C até o momento das análises

de caracterização e da realização dos experimentos. Estas etapas estão ilustradas no diagrama

apresentado na Figura 8.

Para a obtenção de maiores volumes de bagaço, necessário quando da preparação do

extrato concentrado para secagem em atomizador, realizou-se o despolpamento do pedúnculo

em despolpadeira de frutas em escala piloto com capacidade de processamento de 500 kg.h-1

e

tela de 1,5 mm de abertura (Bonina, 0.25df, Bahia, Brasil).

O bagaço foi posteriormente homogeneizado em processador de alimentos

multifuncional com capacidade de operação de 7 kg por lote (Cutter mixer, modelo GUM-12,

Geiger, Paraná, Brasil), também em escala piloto (Figura 9). O bagaço triturado foi

acondicionado em embalagens PEBD (polietileno de baixa densidade) seladas a vácuo em


seladora semiautomática (modelo 200B II, Selovac, São Paulo, Brasil). Todas as amostras

foram armazenadas em câmara fria a -20 °C até o momento da realização dos processos ou

análises.

Figura 8. Diagrama simplificado do processo de obtenção do bagaço de caju.

Matéria-prima

Seleção

Descastanhamento

Lavagem

Sanificação

Corte

Trituração

Prensagem

Bagaço

Embalagem

Polpa

Estocagem


(a) (b)

(c) (d)

Figura 9. Obtenção de bagaço de caju em escala piloto, com destaque para as operações: (a)

recepção da matéria-prima; (b) despolpamento do pedúnculo; (c) trituração do

bagaço e (d) embalagem a vácuo.

4.2.2 Extração dos compostos fenólicos

Duas rotas tecnológicas específicas foram aplicadas visando obter o melhor

rendimento de extração de compostos fenólicos totais. As rotas utilizadas foram: (i) extração

sólido-líquido em uma mistura binária de etanol e água como solvente e (ii) extração

enzimática.

4.2.2.1 Extração hidroetanólica

Para selecionar a melhor condição da extração hidroetanólica, foi realizado um

delineamento fatorial incompleto 33do tipo Box-Behnken com triplicata no ponto central, de

acordo com a Tabela 1. As variáveis de resposta analisadas foram o teor de compostos

fenólicos totais e a capacidade antioxidante (ABTS·+

).


Os fatores operacionais pH (X1), proporção solvente:bagaço (m/m; X2) e porcentagem

de álcool etílico na solução (X3) foram avaliados. Os níveis aplicados para o pH variaram

entre 3,0 e 6,0; e a proporção solvente:bagaço variou entre 1:1 e 3:1. O teor de etanol aplicado

(30 % a 70 %, com 50 % no ponto central) foi baseado em dados reportados na literatura

(POMPEU; SILVA; ROGEZ, 2009; CRUZ et al., 2013).

A influência do pH foi avaliada com o objetivo de confirmar a relevância deste

parâmetro na extração dos compostos fenólicos do bagaço de caju, conforme reportado por

Pérez-Jiménez e Saura-Calixto (2006). Para ajuste do pH, foram utilizados ácido fosfórico e

carbonato de cálcio, para reduzi-lo ou aumentá-lo, respectivamente.

Tabela 1. Delineamento fatorial Box-Behnken para a extração hidroetanólica com as

variáveis independentes originais e codificadas.

Ensaio

Variáveis codificadas Variáveis originais

X1 X2 X3

pH S:B Etanol

(%)

1 -1 -1 0 3,0 1:1 50

2 1 -1 0 6,0 1:1 50

3 -1 1 0 3,0 3:1 50

4 1 1 0 6,0 3:1 50

5 -1 0 -1 3,0 2:1 30

6 1 0 -1 6,0 2:1 30

7 -1 0 1 3,0 2:1 70

8 1 0 1 6,0 2:1 70

9 0 -1 -1 4,5 1:1 30

10 0 1 -1 4,5 3:1 30

11 0 -1 1 4,5 1:1 70

12 0 1 1 4,5 3:1 70

13 0 0 0 4,5 2:1 50

14 0 0 0 4,5 2:1 50

15 0 0 0 4,5 2:1 50

Onde S:B é a proporção solvente:bagaço (m/m).

Após seleção dos principais parâmetros, foram realizados novos ensaios aplicando-se

um planejamento fatorial completo 2², com triplicata no ponto central, para a extração


hidroetanólica considerando como fatores independentes a proporção solvente:bagaço (m/m;

X1) e porcentagem de etanol na solução (X2). Os níveis empregados para a proporção

solvente:bagaço variaram entre 2:1 e 3:1. A proporção de etanol aplicada variou entre 30 % e

70 %, conforme ilustrado na Tabela 2. Além do teor de compostos fenólicos totais e atividade

antioxidante pelo método ABTS·+

, obteve-se também como variável de resposta a capacidade

antioxidante pelo método ORAC.

Tabela 2. Planejamento fatorial completo 2² para a extração hidroetanólica com as variáveis

independentes originais e codificadas.

Ensaio Variáveis codificadas Variáveis originais

X1 X2 S:B Etanol (%)

1 -1 -1 2:1 30

2 1 -1 3:1 30

3 -1 1 2:1 70

4 1 1 3:1 70

5 0 0 2,5:1 50

6 0 0 2,5:1 50

7 0 0 2,5:1 50

Onde S:B é a proporção solvente:bagaço (m/m).

Para ambos os planejamentos, 20 gramas do bagaço foram pesados em erlenmeyers de

250 mL e a solução de extração correspondente a cada ensaio foi adicionada à respectiva

amostra. Os erlenmeyers foram tampados e transferidos para incubadora shaker de bancada

(modelo CT-712T, CIENTEC, Brasil) com agitação orbital (150 min-1

) para o planejamento

Box-Behnken. As hidrólises referentes ao planejamento fatorial 2² foram realizadas em

incubadora shaker de bancada (modelo 50, Thermo Scientific™ Precision, EUA) com

agitação de 90 min-1

.

A temperatura escolhida para ambos os planejamentos (50 °C) refere-se se à

temperatura de máxima atividade enzimática, que será apresentado posteriormente. Após 120

minutos, período de incubação idêntico ao da extração enzimática, os sólidos em suspensão

foram reduzidos através de filtração em funil de Buchner com papel de filtro quantitativo e os

extratos obtidos foram acondicionados em frascos âmbar e mantidos congelados a -18 °C até

o momento das análises.


4.2.2.2 Extração enzimática

Para avaliação da melhor condição de extração enzimática, foi realizado inicialmente

um delineamento fatorial incompleto 33do tipo Box-Behnken com triplicata no ponto central,

como apresentado na Tabela 3, similar ao da extração hidroetanólica. Os fatores avaliados

foram: (i) tempo de trituração da amostra – X1; (ii) proporção solvente:bagaço (m/m) – X2 e

(iii) concentração da enzima – X3, obtendo-se como variáveis de resposta o teor de compostos

fenólicos totais e a capacidade antioxidante (ABTS·+

).

A trituração do bagaço de caju foi realizada com a finalidade de romper a sua estrutura

fibrosa, de modo a facilitar a atuação dos catalisadores enzimáticos. O tempo de trituração foi

determinado mediante processamento do bagaço fresco em multiprocessador de alimentos

(modelo HC32, Black & Decker, Brasil) por intervalos de tempo de 0 minutos (sem

trituração) a 4 minutos (nível 1 do planejamento). As proporções solvente:bagaço foram as

mesmas adotadas para a extração hidroetanólica, variando de 1:1 a 3:1.

Para os testes do delineamento, utilizou-se o preparado enzimático comercial

Celluclast® 1.5 L. A proporção adicionada variou entre 10 % e 20 % em base seca da amostra

(323,4 e 646,7 UI de endoglucanase por grama de preparado enzimático, respectivamente)

(YANG et al., 2011). A enzima foi diluída no volume correspondente da solução aquosa

extratora de cada ensaio antes de ser adicionada ao bagaço previamente pesado (20 gramas

para cada amostra) e acondicionado em erlenmeyers de 250 mL. Os erlenmeyers foram

tampados e transferidos para incubadora shaker de bancada (modelo CT-712T, CIENTEC,

Brasil) com agitação orbital (150 min-1

). A temperatura foi mantida em 50 °C e o pH não foi

alterado.

O tempo de extração enzimática de 2 horas foi escolhido com base nos dados

reportados por Macedo et al. (2015) e Leitão et al. (2011). Após incubação, as amostras foram

aquecidas a 100 °C por 5 minutos e resfriadas em banho de gelo para inativação da enzima

(CÂMARA; MORAES, 2012). Os sólidos em suspensão foram separados através de filtração

em funil de Buchner com papel de filtro quantitativo e os extratos obtidos foram

acondicionados em frascos âmbar e mantidos congelados a -18 °C até o momento das

análises.


Tabela 3. Delineamento fatorial Box-Behnken para a hidrólise enzimática com as variáveis


Ensaio

Variáveis codificadas Variáveis originais

X1 X2 X3 Trituração

(minutos) S:B

Enzima

(% b.s.)

1 -1 -1 0 0 1:1 15

2 1 -1 0 4 1:1 15

3 -1 1 0 0 3:1 15

4 1 1 0 4 3:1 15

5 -1 0 -1 0 2:1 10

6 1 0 -1 4 2:1 10

7 -1 0 1 0 2:1 20

8 1 0 1 4 2:1 20

9 0 -1 -1 2 1:1 10

10 0 1 -1 2 3:1 10

11 0 -1 1 2 1:1 20

12 0 1 1 2 3:1 20

13 0 0 0 2 2:1 15

14 0 0 0 2 2:1 15

15 0 0 0 2 2:1 15

Onde S:B é a proporção solvente:bagaço (m/m) e b.s. representa a concentração da enzima em termos de base

seca da amostra.

Após a análise estatística dos dados obtidos no planejamento experimental Box-

Behnken, optou-se por um segundo delineamento do tipo fatorial completo. O preparado

enzimático comercial foi substituído por um extrato rico em β-glicosidase, enzima atuante no

rompimento da celobiose (YANG et al., 2009; SHIN; NAM; OH, 2013). As hidrólises foram

realizadas em incubadora shaker de bancada (modelo 50, Thermo Scientific™ Precision,

EUA) com agitação de 90 min-1

.

Assim como no planejamento realizado com o preparado enzimático Celluclast® 1.5

L, a temperatura foi mantida em 50 °C e o pH da solução não foi alterado. Após 120 minutos,

as amostras foram aquecidas a 100 °C por 5 minutos e resfriadas em banho de gelo para

inativação enzimática (CÂMARA; MORAES, 2012). Os sólidos em suspensão foram

separados através de filtração em funil de Buchner com papel de filtro quantitativo e os


extratos obtidos foram acondicionados em frascos âmbar e mantidos congelados a -18 °C até

o momento das análises. As proporções solvente:bagaço (X1) variaram entre 2:1 e 3:1 (m/m) e

as concentrações do extrato enzimático (X2) foram mantidas entre 10 % e 20 % em base seca

da amostra (84,3 e 168,6 UI de β-glicosidase por grama de preparado enzimático,

respectivamente) (Tabela 4). As variáveis de resposta obtidas foram teor de fenólicos totais e

atividade antioxidante pelos métodos ABTS·+

e ORAC.

Tabela 4. Planejamento fatorial completo 2² para a hidrólise enzimática com as variáveis


Ensaio Variáveis codificadas Variáveis originais

X1 X2 S:B Enzima (% b.s.)

1 -1 -1 2:1 10

2 1 -1 3:1 10

3 -1 1 2:1 20

4 1 1 3:1 20

5 0 0 2,5:1 15

6 0 0 2,5:1 15

7 0 0 2,5:1 15

Onde S:B é a proporção solvente:bagaço (m/m) e b.s. representa a concentração da enzima em termos de base

seca da amostra.

4.2.3 Cinética de extração dos compostos fenólicos

4.2.3.1 Cinética de extração hidroetanólica

Para a determinação da cinética da extração hidroetanólica, sete ensaios foram

conduzidos em incubadora shaker de bancada (modelo 50, Thermo Scientific™ Precision,

EUA) com agitação de 90 min-1

por 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 minutos, empregando-se os

parâmetros operacionais previamente selecionados após a análise estatística dos dados

experimentais. Após cada intervalo de tempo, as amostras foram filtradas em funil de Buchner

e os extratos obtidos foram avaliados quanto ao teor de compostos fenólicos totais.

Os dados cinéticos foram ajustados à segunda lei de difusão de Fick (Equação 3) para

se obter o coeficiente de difusão dos compostos nas condições operacionais do melhor ensaio

(PINHO; PRAZERES, 2008). Assumindo que as partículas do bagaço do caju apresentam

formato plano e que a variação da concentração dos compostos fenólicos ocorreu


unidirecionalmente, por transporte difusivo, a Equação 3 pode ser simplificada para a

Equação 4.

onde,

C – concentração do soluto (mg.L-1

);

Def – Difusividade efetiva (m2.s

-1);

t – tempo (s);

z – direção do transporte de massa (m).

Definindo Y como unidade adimensional e resolvendo a equação diferencial, por meio

de algoritmos de estimação não linear, obtém-se a solução expressa em uma série

convergente, conforme Equação 5.

onde,

Y – adimensional (concentração de fenólicos totais não extraídos no tempo t / concentração

máxima de fenólicos totais disponíveis para extração);

– concentração de fenólicos totais média;

Xeq – concentração de fenólicos totais no equilíbrio;

X0 – concentração de fenólicos totais no instante inicial;

i – número de termos na série;

L – semi-espessura da amostra (m).

A determinação da eficiência da extração foi calculada em relação aos teores de

compostos fenólicos totais, obtidos durante os 120 minutos de incubação em shaker,

paralelamente ao estudo da cinética.

(Eq. 3)

(Eq. 4)

(Eq. 5)


4.2.3.2 Cinética de extração enzimática

A cinética de extração enzimática foi avaliada misturando-se o preparado enzimático

comercial Celluclast® 1.5 L e o extrato rico em β-glicosidase na proporção 1:1 (m/m).

Aplicou-se a melhor condição de extração enzimática obtida no planejamento fatorial

completo 2², sendo 2:1 (m/m) a proporção solvente:bagaço e 10 % a concentração total da

mistura enzimática, expressa em base seca da amostra. Neste ponto ressalta-se que, embora a

proporção solvente:bagaço de 2:1 (m/m) tenha sido indicada no estudo estatístico como

suficiente atingir altas respostas em termos de compostos fenólicos totais e atividade

antioxidante, utilizou-se a proporção de 2,5:1 (m/m) nesta etapa, para facilitar a dispersão do

bagaço de caju no meio aquoso.

Oito ensaios foram conduzidos em incubadora shaker de bancada (modelo 50, Thermo

Scientific™ Precision, EUA) com agitação de 90 min-1

e temperatura de 50 °C pelos

intervalos de tempo de 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas. Após os ciclos de tempo previamente

determinados para cada ensaio, realizou-se a inativação enzimática de cada amostra

aquecendo-as a 100 °C por 5 minutos e resfriando-as em banho de gelo (CÂMARA;

MORAES, 2012).

Os sólidos em suspensão foram filtrados em funil de Buchner e os extratos obtidos

foram avaliados quanto ao teor de compostos fenólicos totais. Os dados cinéticos foram

ajustados à segunda Lei de Difusão de Fick, seguindo o mesmo procedimento estabelecido na

cinética de extração hidroetanólica. Relacionou-se a eficiência da extração com o teor de

compostos fenólicos totais quantificados durante as 6 horas de incubação em shaker.

4.2.4 Processo de extração em série: Extração enzimática seguida da extração

hidroetanólica

A partir dos resultados alcançados no estudo da cinética de extração enzimática, foi

aplicado um novo procedimento de extração de compostos fenólicos do bagaço de caju, o qual

combinava a hidrólise enzimática seguida da extração com etanol. Neste procedimento, o

bagaço de caju foi inicialmente submetido à extração enzimática (Celluclast®:β-glicosidase

na proporção 1:1 m/m) por 3 horas. A proporção solvente:bagaço utilizada na primeira fase

foi de 1,25:1 (m/m). Posteriormente, etanol foi adicionado à mistura e a extração com este

solvente foi estendida por mais 1 hora de processo. Nesta segunda etapa, adicionou-se o


solvente necessário para atingir a proporção solvente:bagaço de 2,5:1 (m/m), a mesma

utilizada no estudo anterior.

A eficiência do processo em série (Teste A) foi avaliada comparando-a com as

extrações enzimática e hidroetanólica isoladas (Testes B e C, respectivamente) e com um

branco (água:bagaço; 2,5:1 m/m), monitorando-se o teor de fenólicos totais em cada teste e

respectivas taxas de recuperação destes compostos (Equação 6).

Para cada processo, foram estabelecidas 4 horas totais de extração em incubadora

shaker de bancada (modelo 50, Thermo Scientific™ Precision, EUA) a 90 min-1

de agitação e

temperatura de 50 °C. O período total de 4 horas de extração foi escolhido a partir dos dados

cinéticos dos processos isolados: 3 horas na etapa de hidrólise enzimática e 1 hora na extração

hidroetanólica.

4.2.5 Concentração por evaporação a vácuo

O extrato hidroetanólico selecionado, com teor de sólidos solúveis da ordem de 3,0

°Brix, foi concentrado por evaporação a vácuo para viabilizar a secagem por atomização. A

concentração ocorreu em um evaporador rotativo (modelo RV 10, IKA, São Paulo, Brasil)

com banho-maria ajustado para 70 °C, rotação do balão de 70 min-1

, sistema de refrigeração

vertical e pressão de 700 mmHg, controlada por uma bomba de vácuo acoplada ao sistema. O

processo foi conduzido de forma a se obter uma solução concentrada com teor de sólidos

solúveis totais de 6,0 °Brix.

4.2.6 Microencapsulamento por atomização

A operação de microencapsulamento foi conduzida em escala laboratorial utilizando-

se um mini spray dryer (modelo B290, Buchi, Flawil, Suíça). Um diagrama esquemático

deste equipamento está apresentado na Figura 10. As condições de operação foram definidas

com base em Santiago (2014) e Silva et al. (2013), com destaque para: (i) temperatura do ar

de entrada de 160 °C (± 5 °C); (ii) temperatura do ar de saída de 90 °C (± 5 °C); (iii) pressão

de atomização de 5,0 bar; (iv) vazão média do ar de secagem de 700 L.h-1

; (v) vazão média de

alimentação de 17 mL.min-1

. Ao extrato previamente concentrado, foi adicionada

(Eq. 6)


maltodextrina (DE5) e goma arábica na proporção 1:1 e concentração de 15 % (m/m), de

acordo com Silva et al. (2013).

Figura 10. Diagrama esquemático do sistema de atomização da Buchi. Fonte: Zareifard et al.

(2012).

O rendimento do processo foi calculado por meio da Equação 7, como reportado por

Rocha et al. (2014). Este parâmetro é útil para avaliar a preservação dos compostos fenólicos

durante a secagem por atomização (PAINI et al., 2015).

onde,

A – massa do produto (pó) seco;

B – teor de sólidos totais da solução alimentadora.

A eficiência do microencapsulamento foi calculada de acordo com a Equação 8,

utilizando-se os resultados finais e iniciais dos compostos fenólicos totais (CHATTERJEE;

BHATTACHARJEE, 2013).

Duto de

entrada de ar

Painel de

controle

Ciclone de

saída do ar

Ciclone de

separação

Coletor do

produto

Câmara de

secagem

Bico de

aspersão

(Eq. 7)

(Eq. 8)


4.2.7 Estabilidade dos extratos microencapsulados

Os extratos microencapsulados foram acondicionados em embalagens laminadas e

seladas a vácuo, sendo estocados em estufa incubadora (modelo MA-415, Marconi, São

Paulo) a 25 °C por um período de 60 dias. Os extratos em pó foram avaliados ao longo desse

período em intervalos regulares de tempo (15 dias), quanto ao teor de compostos fenólicos

totais e capacidade antioxidante.

4.3 Métodos analíticos

4.3.1 Identificação dos açúcares presentes no bagaço do caju

Realizou-se a caracterização da parede celular do bagaço do caju em termos de

identificação e quantificação de carboidratos de acordo com o protocolo estabelecido pelo

NREL (National Renewable Energy Laboratory) e reportado por Sluiter et al. (2008).

Resumidamente, o bagaço de caju previamente liofilizado foi submetido à hidrólise com ácido

sulfúrico (72 %; v/v) por 60 minutos em banho a 30 ± 2 °C. As amostras foram diluídas a uma

concentração de ácido de 4 % e autoclavadas (121 °C por 1 hora). Após resfriamento, foram

filtradas a vácuo, sendo o filtrado neutralizado com carbonato de cálcio (5,0 ≤ pH ≤ 6,0) e

centrifugado (3.000 min-1

por 10 minutos). O sobrenadante foi separado e filtrado em filtro

0,2 µm em vials específicos para a cromatografia líquida.

Utilizou-se um cromatógrafo líquido de alta eficiência (ULTIMATE 3000, Thermo

Scientific Ltda., EUA) acoplado com um detector de índice de refração RI-101, Shodex,

Japão). O sistema de colunas utilizado era composto por cartucho deashing (4,6 mm × 30

mm, BioRad, EUA), pré-coluna Aminex Carbo P (4,6 mm × 30 mm, BioRad, EUA) e coluna

analítica Aminex HPX-87P (7,8 mm × 300 mm, BioRad, EUA).

As condições cromatográficas utilizadas foram: (i) fase móvel composta por água

deionizada (Milli-Q) grau reagente tipo I, apresentando, no mínimo, 18,0 megaohm.cm de

resistividade, desgaseificada e filtrada em filtro de 0,2 μm com fluxo de 0,6 mL.min-1

; (ii)

temperatura do forno de 80°C; (iii) temperatura do post-column cooler de 45ºC; (iv)

temperatura do amostrador automático de 15ºC; (v) temperatura do detector de 45ºC e (vi)

tempo de corrida de 22 minutos, como reportado por Sluiter et al. (2008). Os cálculos de

conversão da glicose em celulose (Equação 9) e das pentoses e hexoses em hemicelulose

foram realizados conforme descrito por Costa et al. (2015).


4.3.2 Atividade enzimática

As enzimas utilizadas neste estudo (Celluclast® 1.5 L e extrato enzimático rico em β-

glicosidase) foram analisadas quanto à atividade enzimática de CMCase e β-glicosidase. Para

a dosagem da CMCase (endoglucanase; EC 3.2.1.4), utilizou-se a metodologia descrita por

Ghose (1987). Resumidamente, a quantificação desta enzima ocorre pela dosagem dos

açúcares redutores produzidos pela degradação de carboximetilcelulose (CMC).

A determinação da atividade da β-glicosidase (1,4 β-D-glicosidase; EC 3.2.1.21) foi

realizada pela quantificação da glicose liberada na reação, utilizando-se celobiose como

substrato (WANDERLEY, 2012), de acordo com a metodologia proposta por Ghose (1987).

A quantificação da concentração de glicose foi realizada em analisador bioquímico (YSI

2700, Tecnal, Brasil).

Para ambas as atividades enzimáticas, foram utilizados controles da reação

colorimétrica para descontar as contribuições do extrato enzimático (branco da enzima) e do

substrato (branco da reação), separadamente, dos valores de absorbância obtidos (BASSO;

GALLO; BASSO, 2010). Considerou-se 01 unidade internacional (UI) equivalente à

quantidade de enzima capaz deliberar 1 µmol de açúcar redutor (glicose) por minuto nas

condições do teste (GONÇALVES, 2010).

4.3.3 Determinação do teor de compostos fenólicos totais

Os teores de compostos fenólicos totais foram determinados pelo método

colorimétrico baseado no procedimento descrito inicialmente por Singleton e Rossi (1965) e

modificado por Georgé et al. (2005), utilizando-se ácido gálico como padrão de referência. Os

extratos foram inicialmente diluídos em acetona P.A. (7 %; v/v) durante 30 minutos. Parte do

extrato acetônico foi submetida a uma extração em fase sólida em cartucho Oasis® HLB (fase

estacionária copolímero de poli-[divinilbenzenoN-vinilpirrolidona]) para remoção dos

compostos interferentes solúveis em água (açúcares redutores e ácido ascórbico).

(Eq. 9)


500 µL de cada extrato (antes e após eluição em cartucho) foram utilizados para

reação com 2,5 mL do reagente Folin-Ciocalteu previamente diluído em água (1:10; v/v). Esta

mistura foi incubada por 2 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, 2 mL de carbonato

de sódio (75 g.L-1

) foram adicionados e a nova mistura foi então incubada por 15 minutos a

50°C e finalmente resfriada em banho de gelo.

A absorbância (760 nm) de ambos os extratos foi medida imediatamente após o

resfriamento das amostras em espectrofotômetro UV/Visível (Bioespectro, modelo SP-200,

Curitiba, Brasil). O teor de compostos fenólicos totais foi expresso em mg de ácido gálico

equivalente.100 g-1

de amostra. A linearidade da curva padrão de ácido gálico foi obtida entre

50 e 500 mg.L-1

, que corresponde a valores de absorbância entre 0,1 e 0,6.

4.3.3.1 Identificação dos compostos fenólicos

A análise de perfil dos compostos fenólicos presentes no extrato microencapsulado de

caju no tempo zero de estocagem e no bagaço de caju in natura, previamente desidratado em

liofilizador de bancada por 24 horas (modelo L-101, Liotop, São Carlos, Brasil), foi realizada

por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector de arranjo de diodos

(DAD), segundo Godoy et al. (2013).

A preparação das amostras envolveu o uso de solução de extração metanol:água

(80:20, v/v) e aquecimento por 2,5 horas a 65°C. Após resfriamento, a cada amostra foram

adicionados 600 µL de solução de hidrólise NaOH 2 M, sendo agitadas vigorosamente em

vortex. Em seguida, foram adicionados 200 µL de ácido acético glacial e os extratos foram

novamente agitadas em vortex, sendo então filtrados com papel de filtro quantitativo e

transferidos para vial específico (2 mL) para injeção no cromatógrafo. Uma alíquota de 1 mL

de cada amostra foi utilizada para uma posterior hidrólise ácida, sendo adicionado 1 mL de

ácido clorídrico concentrado (P.A.). Essa mistura foi incubada a 85 °C por 30 minutos.

Assim, foram preparadas dois tipos de amostras para a caracterização cromatográfica (pré e

pós-hidrólise ácida). O objetivo da hidrólise ácida foi clivar as ligações glicosídicas para

liberar os compostos fenólicos que se apresentavam inicialmente glicosilados (MATTILA;

KUMPULAINEN, 2002).

Para a realização das análises cromatográficas, utilizou-se um cromatógrafo líquido

Alliance 2695 da Waters®, com detector de arranjo de diodos (DAD) 2996 da Waters® de

210 a 400 nm, coluna Thermo BDS Hypersil® C18 (100 × 4,6 mm × 2,4 μm); fase móvel: (A)


solução aquosa de ácido fosfórico a 1,5 % e (B) acetonitrila em modo gradiente (Tabela 5);

fluxo de 1,0 mL.min-1

; temperatura da coluna de 30°C; volume de injeção de 5 μL e tempo de

corrida de 30 minutos. A identificação dos compostos fenólicos, especificamente flavonoides

e ácidos fenólicos, foi realizada pela comparação dos tempos de retenção e dos espectros de

absorção na região do ultravioleta (UV; 270 nm) com os respectivos padrões comerciais

(SANTIAGO, 2014).

4.3.4 Atividade antioxidante pelo método ABTS·+

Para a avaliação da atividade antioxidante pelo método ABTS·+

, utilizou-se a

metodologia descrita por Re et al. (1999). O radical ABTS·+

foi diluído em etanol até se obter

uma medida de absorbância da ordem de 0,700 (± 0,02) a um comprimento de onda de 734

nm. A capacidade antioxidante da amostra foi calculada com relação à atividade do

antioxidante sintético Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), nas

mesmas condições do método e os resultados foram expressos em capacidade antioxidante

equivalente ao Trolox (μM TEAC.g-1

de amostra). As leituras de absorbância foram realizadas

em espectrofotômetro UV/Visível (Bioespectro, modelo SP-200, Curitiba, Brasil).

Tabela 5. Gradiente de eluição empregado na determinação dos compostos fenólicos em

CLAE-DAD.

Tempo (min) Ácido fosfórico (1,5 %; v/v) Acetonitrila

1 0,01 95 % 5 %

2 6 95 % 5 %

3 8 88 % 12 %

4 12 88 % 12 %

5 18 80 % 20 %

6 22 70 % 30 %

7 23 40 % 60 %

8 25 40 % 60 %

9 26 95 % 5 %

10 30 95 % 5 %


4.3.5 Atividade antioxidante pelo método ORAC

Para a quantificação da atividade antioxidante pelo método in vitro ORAC, utilizou-se

a metodologia proposta por Zulueta, Esteve e Frígola (2009), onde a leitura da fluorescência

foi realizada a 37 °C e os comprimentos de onda de excitação e emissão foram de 485 nm e

525 nm, respectivamente. As soluções de fluoresceína (78 nM) e AAPH (dicloreto de 2,2’-

azobis(2-amidinopropano; 221 mM) foram preparadas com solução tampão de fosfato de

sódio (75 mM; pH 7,4). Para cada análise, preparava-se também uma curva padrão de Trolox

(ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico). Utilizou-se um leitor de

microplacas Infinite (modelo 200, TECAN, Suíça) no modo fluorescência. Os dados de leitura

em relação ao tempo foram registrados em planilha do software Excel. A partir do programa

Graph Pad and Prism, foram obtidas as áreas abaixo das curvas relacionadas ao decaimento

da fluorescência das amostras.Os resultados foram expressos em µM TEAC.g-1

de amostra.

4.3.6 pH

A medida do pH foi realizada utilizando segundo a metodologia descrita pelo Instituto

Adolfo Lutz (Item/Método 017/IV, 2008).

4.3.7 Sólidos totais

A análise de sólidos totais foi realizada segundo a metodologia descrita pelo Instituto

Adolfo Lutz (Item/Método 015/IV, 2008), com base nos métodos padrões da AOAC (2000).

As amostras foram pesadas em cápsulas de vidro previamente aquecidas a 105 °C, por 2

horas, sob pressão reduzida, e resfriadas em dessecador até a temperatura ambiente. As

cápsulas contendo as amostras foram aquecidas em estufa a 105 °C por 24 horas, esfriadas em

dessecador até a temperatura ambiente e pesadas. Esta operação foi repetida até obtenção do

peso constante das amostras. O teor de sólidos totais foi calculado utilizando-se a Equação 10.

onde,

CAf – massa da cápsula com amostra no peso constante;

CA0 – massa da cápsula sem amostra;

m0 – massa da amostra inicial.

(Eq. 10)


4.3.8 Distribuição do tamanho de partícula

A distribuição do tamanho de partícula foi medida em um analisador de difração a

laser (Microtrac, modelo S3500, Estados Unidos). Uma pequena amostra do extrato de caju

microencapsulado foi suspendida em isopropanol com agitação magnética. A distribuição do

tamanho de partícula foi monitorada durante cada medição até o momento em que as leituras

sucessivas tornaram-se constantes (TONON; BRABET; HUBINGER, 2010). Esta técnica foi

aplicada no extrato microencapsulado de caju no tempo zero de estocagem, com o objetivo de

avaliar a estabilidade física das micropartículas e, principalmente, a possibilidade de

aglomeração (PELISSARI, 2014).

Os resultados desta análise foram ajustados aos modelos de distribuição de tamanho de

partículas Rosin-Rammler-Bennet (RRB; ROSIN; RAMMLER, 1933) e Gates-Gaudim-

Shumann (GGS; SCHUMANN, 1940). O modelo RRB apresenta dois parâmetros ajustáveis

(n e d’) e relaciona o diâmetro da partícula (dp) com a fração de partículas com diâmetros

menores que dp, como descrito na Equação 11.

onde,

Y – fração de partículas menor que um diâmetro dp;

dp – diâmetro da partícula (µm);

d’ – parâmetro que quantifica o diâmetro da partícula para Y = 0,632;

n – parâmetro adimensional que define a forma da curva de distribuição granulométrica.

Analogamente ao modelo RRB, o ajuste GGS caracteriza-se por possuir dois

parâmetros de ajuste (n e d’), conforme apresentado na Equação 12.

onde:

d’ – parâmetro que quantifica o diâmetro da partícula para Y = 1,0.

(Eq. 11)

(Eq. 12)


4.3.9 Morfologia

A morfologia das micropartículas foi observada em microscópio eletrônico de

varredura (Hitachi, modelo TM-3000, Japão). Pequenas quantidades do extrato

microencapsulado de caju no tempo zero de estocagem foram fixadas na superfície de fitas

dupla face e aderidas em compartimento metálico específico do equipamento. A morfologia

foi observada sistematicamente utilizando-se ampliações de 500, 1000, 2000 e 3000 vezes

(ALMEIDA et al., 2014).

4.3.10 Isotermas de sorção

A umidade de equilíbrio do extrato microencapsulado de caju foi determinada pelo

método gravimétrico estático, aplicando-se cinco soluções salinas supersaturadas que

correspondiam aos teores de atividade de água (aw) variando entre 0,093 e 0,903, conforme

apresentado na Tabela 6 (CATELAM; TRINDADE; ROMERO, 2011). Água pura também

foi utilizada para conferir uma atividade de água igual a 1,0.

Tabela 6. Soluções salinas e suas respectivas atividades de água.

Solução salina Atividade de água (aw)

Cloreto de lítio (LiCl) 0,093

Cloreto de magnésio (MgCl2) 0,327

Cloreto de potássio (KCl) 0,438

Cloreto de sódio (NaCl) 0,753

Cloreto de bário (BaCl2) 0,903

Fonte: Catelam; Trindade e Romero (2011).

Amostras em triplicata foram pesadas (aproximadamente 1 g cada) em pequenos

recipientes plásticos e armazenadas em dessecadores fechados hermeticamente, de forma que

o conteúdo permanecesse isolado do ambiente externo. Cada dessecador continha uma

solução salina específica. O tempo para atingir o equilíbrio, baseado no peso constante das

amostras, foi de oito dias e a temperatura do ambiente foi mantida em 25 °C (± 1 °C). As

umidades de equilíbrio em base seca foram calculadas pela Equação 13.

(Eq. 13)


em que:

Xe – umidade de equilíbrio em base seca (b.s.);

me – massa da amostra quando atingido o equilíbrio (g);

ms – massa seca da amostra (g).

Os parâmetros foram estimados pelo ajuste dos modelos GAB e BET aos dados

experimentais utilizando-se uma regressão não linear pelo algoritmo Hook-Jeeves e Quasi-

Newton com o auxílio do software Statistica (versão 8.0, StatSoft, Inc., Tulsa, EUA). O

coeficiente de determinação (R2), entre as respostas observadas e os valores previstos pelo

modelo, foi utilizado como critério para avaliar o ajuste do modelo aos dados experimentais.

4.4 Análise dos dados

Todas as determinações foram realizadas em triplicata. As médias dos valores

encontrados foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey ao nível de 5

% de probabilidade utilizando o programa estatístico Statistica (versão 8.0, StatSoft, Inc.,

Tulsa, EUA). Os resultados da atividade antioxidante pelo método ORAC foram analisados

pelo programa GraphPad and Prism (versão 5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

O coeficiente de Pearson foi utilizado para avaliar a correlação entre os teores de fenólicos

totais e a atividade antioxidante dos extratos utilizando o programa Microsoft Excel (versão

2007, Microsoft Corporation, EUA), como descrito por Infante et al. (2013) e Spagolla et al.

(2009).

5 Resultados e Discussão

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Extração dos compostos fenólicos

5.1.1 Extração hidroetanólica – Planejamento Box-Behnken

A quantificação dos compostos fenólicos totais e da atividade antioxidante (ABTS·+

)

das amostras obtidas na extração hidroetanólica, segundo delineamento experimental Box-

Behnken, está apresentada na Tabela 7.

Tabela 7. Resultados do planejamento Box-Behnken referentes à extração hidroetanólica –

Respostas de fenólicos totais, atividade antioxidante por ABTS·+

e respectivos

valores estimados pelo modelo.

Exp.

pH

S:B

Etanol

(%)

Fenólicos totais

(mg AGE.100g-1

)

ABTS·+

(µM TEAC.g-1

)

Valores

encontrados

Valores

estimados

Valores

encontrados

Valores

estimados

1 3,0 1:1 50 127,3 118,2 5,8 7,7

2 6,0 1:1 50 132,8 130,9 7,3 6,0

3 3,0 3:1 50 343,5 350,4 14,3 13,7

4 6,0 3:1 50 359,0 363,1 12,1 12,0

5 3,0 2:1 30 223,3 227,2 12,3 10,9

6 6,0 2:1 30 239,0 239,8 8,7 9,2

7 3,0 2:1 70 234,7 233,0 12,0 12,1

8 6,0 2:1 70 248,7 245,6 9,6 10,3

9 4,5 1:1 30 121,5 126,5 5,9 6,1

10 4,5 3:1 30 368,5 358,7 11,4 12,1

11 4,5 1:1 70 126,4 132,4 8,1 7,2

12 4,5 3:1 70 365,7 364,5 13,3 13,2

13 4,5 2:1 50 242,3 241,1 11,2 11,4

14 4,5 2:1 50 236,3 241,1 12,5 11,4

15 4,5 2:1 50 244,8 241,1 10,5 11,4

Exp. – Experimento; AGE – ácido gálico equivalente; S:B – proporção solvente:bagaço (m/m) e TEAC –

capacidade antioxidante equivalente ao Trolox.


A análise de correlação de Pearson mostrou uma correlação linear positiva (r = 0,821;

p < 0,05) entre os compostos fenólicos e a atividade antioxidante (ABTS·+

), como apresentado

na Figura 11. Observou-se um aumento linear da capacidade de reduzir o radical ABTS·+

em

função do aumento do teor de fenólicos totais. Os resultados obtidos corroboram com o

estudo apresentado por Vieira et al. (2011), que avaliaram o teor de fenólicos totais e a

atividade antioxidante de polpas de frutas, dentre elas a de caju, destacando que as polpas que

apresentaram os maiores teores de fenólicos totais foram as que apresentaram a maior

atividade antioxidante, tanto utilizando o radical DPPH, quanto o radical ABTS·+

.


) dos

extratos hidroetanólicos obtidos a partir do planejamento Box-Behnken.

Os gráficos de Pareto (Figura 12) representam os efeitos estimados dos parâmetros pH

(X1), proporção solvente:bagaço (X2) e porcentagem de etanol na solução (X3) sobre o teor de

fenólicos totais e atividade antioxidante pelo método ABTS·+

, respectivamente. O

comprimento de cada barra é proporcional ao efeito padronizado. As barras que ultrapassam a

linha vertical correspondem aos efeitos estatisticamente significativos a um nível de 95 % de

confiança (CALADO; MONTGOMERY, 2003). A proporção solvente:bagaço apresentou

uma alta significância estatística para a resposta teor de compostos fenólicos totais e foi a

única variável significativa para os resultados da atividade antioxidante (ABTS·+

).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

100 200 300 400

Ati

vid

ade

anti

oxid

ante

AB

TS

+

(µM

TE

AC

.g-1

)

Fenólicos totais (mg AGE.100g-1)


(b)

Figura 12. Gráficos de Pareto – Planejamento Box-Behnken referente à extração

hidroetanólica para as respostas de fenólicos totais (a) e atividade antioxidante por

ABTS·+

(b), com relação aos parâmetros pH (X1), proporção solvente:bagaço (X2)

e porcentagem de etanol na solução (X3).

A Figura 13 apresenta o gráfico de superfície de resposta referente à interação entre a

proporção solvente:bagaço (X2) e o pH (X1), quando a porcentagem de etanol foi mantida fixa

no ponto central (50 %; m/m) tendo como resposta o teor de fenólicos totais. Observou-se

também a interação entre a proporção solvente:bagaço (X2) e porcentagem de etanol na

solução (X3), quando o pH foi mantido em 4,5. Os maiores teores de fenólicos totais (> 350


mg GAE.100g-1

) foram observados quando a proporção solvente:bagaço estava acima do

ponto central (2:1; m/m).

(b)


extração hidroetanólica para as respostas de fenólicos totais (FT), relacionando os

parâmetros: S:B vs. pH (a) e S:B vs. porcentagem de etanol na solução (b).

Os gráficos de superfície de resposta para a atividade antioxidante (ABTS·+

) estão

apresentados na Figura 14. Os valores de pH não apresentaram influência sobre a atividade

antioxidante, entretanto as maiores respostas foram obtidas quando utilizou-se a proporção

solvente:bagaço acima de 2:1 (m/m), assim como foi observado para os compostos fenólicos

S:B pH

S:B Etanol (%)


totais. Maiores respostas também foram registradas quando a proporção de etanol na solução

estava acima do ponto central (50 %; m/m).

(a)

(b)


extração hidroetanólica para as respostas de atividade antioxidante (ABTS·+

),

relacionando os parâmetros: S:B vs. pH (a) e S:B vs. porcentagem de etanol na

solução (b).

5.1.2 Extração hidroetanólica – Planejamento fatorial completo 22

Após análise estatística dos resultados do planejamento Box-Behnken, um novo

planejamento foi executado considerando apenas os parâmetros proporção solvente:bagaço

S:B pH

S:B Etanol (%)


(X1) e concentração de etanol na solução (X2). Os resultados para as análises de fenólicos

totais e atividade antioxidante, pelos métodos ABTS·+

e ORAC, estão apresentados nas

Tabelas 8 e 9, respectivamente.


Respostas de fenólicos totais e respectivos valores estimados pelo modelo.

Exp.

S:B Etanol

(%)

Fenólicos totais (mg AGE.100g-1

)

Valores encontrados Valores estimados

1 2:1 30 312,0 375,3

2 3:1 30 400,1 463,4

3 2:1 70 637,5 700,8

4 3:1 70 503,7 567,0

5 2,5:1 50 609,0 526,6

6 2,5:1 50 611,8 526,6

7 2,5:1 50 612,3 526,6

Exp. – Experimento; AGE – ácido gálico equivalente e S:B – proporção solvente:bagaço (m/m).


Respostas de ABTS·+

e ORAC e respectivos valores estimados pelo modelo.

Exp.

S:B

Etanol

(%)

ABTS·+

(µM TEAC.g-1

) ORAC (µM TEAC.g-1

)

Valores

encontrados

Valores

estimados

Valores

encontrados

Valores

estimados

1 2:1 30 2,3 2,7 3,1 3,8

2 3:1 30 2,7 3,0 3,9 4,6

3 2:1 70 4,2 4,5 6,1 6,8

4 3:1 70 3,3 3,6 4,1 4,8

5 2,5:1 50 3,9 3,4 5,2 5,0

6 2,5:1 50 3,9 3,4 5,7 5,0

7 2,5:1 50 3,9 3,4 5,9 5,0

Exp. – Experimento; S:B – proporção solvente:bagaço (m/m) e TEAC – capacidade antioxidante equivalente ao

Trolox.

Foi observada uma baixa relação entre os valores de fenólicos totais estimados pelo

modelo e os obtidos experimentalmente, entretanto houve concordância para os resultados da

capacidade antioxidante pelos métodos ABTS·+

e ORAC. Ressalta-se que maiores teores de

fenólicos totais foram observados para o ensaio 3 do planejamento (637,5 mg AGE.100g-1

),


bem como para a triplicata do ponto central (~ 611,0 mg AGE.100g-1

), como apresentado na

Tabela 13. Comparando-se estes resultados com o obtido para a extração aquosa (122,9 mg

AGE.100g-1

), obtido nas mesmas condições do ponto central do planejamento fatorial 2²,

observou-se que as extrações hidroetanólicas contribuíram para aumentar a eficiência de

obtenção dos compostos fenólicos presentes no bagaço de caju.

Vieira et al. (2011) reportaram concentrações de fenólicos totais para extratos aquoso

e hidroalcoólico (20 % de etanol) obtidos da polpa de caju de 201,6 e 165,1 mg AGE.100g-1

de polpa, respectivamente, sugerindo que uma expressiva parte dos compostos fenólicos

apresenta alta polaridade, sendo portanto mais hidrossolúveis. Este comportamento, todavia,

não foi confirmado neste estudo, onde concentrações superiores a 50 % de etanol resultaram

em maiores teores de fenólicos totais no extrato obtido do bagaço do caju.

Ainda, na metodologia utilizada por Vieira et al. (2011), a extração foi conduzida

durante 1 hora e em temperatura ambiente, o que sugere que a ampliação do tempo para 2

horas e, principalmente, o aumento da temperatura para 50 °C favoreceram a extração dos

compostos fenólicos, obtendo-se um aumento de extração de 5,2 vezes para o ensaio de maior

resposta (ensaio 3; 637,5 mg AGE.100g-1

) e de 4,9 vezes para o valor médio do ponto central

(611,0 mg AGE.100g-1

), quando comparado à extração aquosa (122,9 mg AGE.100g-1

). Desse

modo, tanto o tempo, quanto a temperatura, foram fatores relevantes na obtenção de fenólicos

totais provenientes do bagaço do caju.

Infante et al. (2013) obtiveram extratos hidroalcoólicos (etanol:água; 80:20 v/v), em

temperatura ambiente, de bagaço de caju liofilizado e determinaram o teor de fenólicos totais

(1067,0 mg AGE.100g-1

m.s.) e atividade antioxidante pelos métodos DPPH (68,6 µM

TEAC.g-1

m.s.) e FRAP (219,03 µmol sulfato ferroso.g-1

m.s.), sugerindo que resíduos

agroindustriais, como o bagaço de caju, são capazes de preservar quantidades significativas de

substâncias antioxidantes. Os resultados reportados por esses autores são superiores aos

obtidos no presente trabalho (Tabela 12), o que pode ser explicado pelas características

iniciais das amostras, uma vez que foram utilizadas amostras liofilizadas enquanto que, neste

estudo, empregou-se bagaço de caju in natura.

A análise de correlação de Pearson mostrou uma correlação linear positiva (r = 0,994;

p < 0,05) entre os compostos fenólicos e a atividade antioxidante (ABTS·+

) para o

planejamento fatorial completo 2², como apresentado na Figura 15. Houve um aumento linear

da capacidade antioxidante (ABTS·+

) relacionada a uma maior concentração de fenólicos


totais. O mesmo comportamento foi reproduzido, quando comparado o teor de fenólicos totais

com a atividade antioxidante pelo método ORAC, com um coeficiente correlação de Pearson

de 0,961 (Figura 16). Infante et al. (2013) obtiveram um coeficiente de correlação de Pearson

de 0,97 entre fenólicos totais e DPPH e de 0,78 entre fenólicos totais e FRAP.


) dos

extratos hidroetanólicos obtidos a partir do planejamento fatorial 2².


extratos hidroetanólicos obtidos a partir do planejamento fatorial 2².

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

300 400 500 600 700

Ati

vid

ade

anti

oxid

ante

AB

TS

+

(µM

TE

AC

.g-1

)


r = 0,994

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

300 400 500 600 700

Ati

vid

ade

anti

oxid

ante

OR

AC

(µM

TE

AC

.g-1

)


r = 0,961


De acordo com os gráficos de Pareto (Figuras 17 e 18), nenhum dos parâmetros

avaliados, bem como as respectivas interações, foram estatisticamente significativos, ou seja,

não apresentaram efeito sobre o teor de fenólicos totais e atividade antioxidante por ABTS·+

e

ORAC. Isto indica que os intervalos selecionados para os fatores proporção solvente:bagaço

entre 2:1 e 3:1 (m/m) e porcentagem de etanol na solução entre 30 % e 70 %, estão,

provavelmente, na região mais favorável para as respostas avaliadas.

(b)


em função dos resultados de fenólicos totais (a) e atividade antioxidante por

ABTS·+

(b), com relação aos parâmetros proporção solvente:bagaço (X1) e

porcentagem de etanol na solução (X2).



em função dos resultados de atividade antioxidante por ORAC, com relação aos

parâmetros proporção solvente:bagaço (X1) e porcentagem de etanol na solução

(X2).

5.1.3 Extração enzimática

5.1.3.1 Caracterização dos açúcares presentes no bagaço do caju

A concentração dos monômeros identificados por cromatografia líquida de alta

eficiência, após hidrólise ácida do bagaço do caju, está apresentada na Tabela 10, totalizando

42,98 % de carboidratos presentes nesta biomassa.

Tabela 10. Composição dos açúcares do bagaço do caju.

Monômeros Concentração referente

à biomassa total (%)

Concentração referente

aos açúcares totais (%)

Glicose (%) 34,7 ± 0,6 80,8

Xilose (%) 1,5 ± 0,1 3,5

Galactose (%) 3,2 ± 0,2 7,5

Arabinose (%) 2,6 ± 0,1 6,1

Manose (%) 0,9 ± 0,04 2,1

Total 43,0 100


A quantificação de açúcares no bagaço do caju mostrou que este apresenta celulose,

hemicelulose e lignina em sua composição. Especificamente, foram obtidos 31,57 % de

celulose, 7,43 % de hemicelulose e 15,5 % de lignina, em termos de base seca da amostra.

Costa et al. (2015) obtiveram os seguintes resultados para a composição do bagaço de caju:

20,6 % de celulose; 10,2 % de hemicelulose; 35,3 % de lignina; 7,8 % de minerais; e 1,6 % de

cinzas, referentes à massa seca do bagaço. A alta porcentagem de lignina reportada por Costa

et al. (2015) pode estar relacionada com a metodologia analítica de identificação utilizada por

estes autores, a qual é aplicada para materiais lignocelulósicos mais complexos, (p. ex., cana-

de-açúcar).

A composição em açúcares foi determinante na escolha de enzimas celulolíticas

(Celluclast® 1.5 L e extrato enzimático rico em β-glicosidase) para a hidrólise do bagaço de

caju, com o objetivo de clivar ligações glicosídicas, tanto para liberação da glicose, quanto

dos compostos fenólicos conjugados à parede celular vegetal (ACOSTA-ESTRADA et al.,

2014; KRENEK; BARNES; TALCOTT, 2014). Leitão et al. (2011) também aplicaram

preparados enzimáticos comerciais de celulase e β-glicosidase para promover a hidrólise do

bagaço de caju com o objetivo de decompor a celulose, hemicelulose e pectina presentes na

estrutura desta biomassa.

5.1.3.2 Quantificação da atividade enzimática

A enzima comercial Celluclast® 1.5 L e o preparado enzimático obtido a partir do

fungo Aspergillus awamori foram analisados quanto às atividades enzimáticas de

endoglucanase e β-glicosidase. Os resultados estão apresentados na Tabela 11. Ressalta-se,

como esperado, uma diferença significativa de atividade em β-glicosidase entre os dois

complexos enzimáticos estudados.

Tabela 11. Quantificação da atividade enzimática das enzimas aplicadas.

Enzima Atividade enzimática

Celluclast® 1.5 L 1077,91 UI.g-1

para endoglucanase

Celluclast® 1.5 L 40,81 UI.g-1

para β-glicosidase

Extrato enzimático (A. awamori) 0,593UI.g-1

para endoglucanase

Extrato enzimático (A. awamori) 281,0 UI.g-1

para β-glicosidase


5.1.3.3 pH

O pH obtido para o bagaço de caju in natura foi de 4,73, apresentando-se na faixa

ótima das enzimas utilizadas neste estudo (4,5 < pH <5,0) (GOTTSCHALK; OLIVEIRA;

BOM, 2010; NOVOZYMES LATIN AMERICA LTDA.).

5.1.3.4 Hidrólise enzimática – Planejamento Box-Behnken

Os resultados determinados para fenólicos totais e atividade antioxidante (ABTS·+

) na

hidrólise enzimática do bagaço do caju, utilizando-se o preparado enzimático comercial

Celluclast® 1.5 L, estão apresentados na Tabela 12.

Tabela 12. Resultados da hidrólise enzimática com Celluclast® 1.5 L para as análises de

fenólicos totais e ABTS·+

e respectivos valores estimados pelo modelo.

Exp.

Trituração

(minutos)

S:B

Enzima1

(%, b.s.)

Fenólicos totais

(mg AGE.100g-1

)

ABTS·+

(µM TEAC.g-1

)

Valores

encontrados

Valores

estimados

Valores

encontrados

Valores

estimados

1 0 1:1 15 282,9 346,6 2,6 2,4

2 4 1:1 15 271,2 271,0 2,5 3,4

3 0 3:1 15 676,6 537,6 4,6 4,0

4 4 3:1 15 386,6 462,1 5,1 5,0

5 0 2:1 10 497,8 461,8 2,4 2,9

6 4 2:1 10 483,0 386,2 4,9 3,9

7 0 2:1 20 213,4 324,7 2,4 2,7

8 4 2:1 20 227,7 249,2 3,5 3,7

9 2 1:1 10 235,8 271,6 3,1 2,4

10 2 3:1 10 365,6 462,6 2,8 4,0

11 2 1:1 20 233,8 134,6 2,1 2,1

12 2 3:1 20 359,2 325,6 4,2 3,8

13 2 2:1 15 515,1 511,8 2,9 3,0

14 2 2:1 15 525,5 511,8 3,1 3,0

15 2 2:1 15 494,8 511,8 3,1 3,0

1Concentrações da enzima Celluclast® variaram entre 10 % e 20 % em termos de base seca da amostra,

equivalente a 323,4 e 646,7 UI de endoglucanase, respectivamente. Exp. – Experimento; AGE – ácido gálico

equivalente; S:B – proporção solvente:bagaço (m/m) e TEAC – capacidade antioxidante equivalente ao Trolox.


De acordo com a análise de correlação de Pearson, observou-se uma fraca correlação

(r = 0,42; p < 0,05) entre os compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante (ABTS·+

),

após a hidrólise enzimática com a Celluclast® (Figura 19). Este comportamento indica que,

apesar da presença de compostos fenólicos nos extratos enzimáticos obtidos, estes não estão

diretamente relacionados com sua atuação antioxidante.


) dos

extratos enzimáticos obtidos a partir do planejamento Box-Behnken.

Observou-se também que em determinados pontos do planejamento experimental

foram quantificados teores menores de fenólicos totais que apresentaram alta capacidade

antioxidante, como, por exemplo, para o ensaio 4 (386 mg AGE.100g-1

para fenólicos totais e

5,14 µM TEAC.g-1

para atividade antioxidante por ABTS·+

). O desempenho desta hidrólise

divergiu do verificado na extração hidroetanólica em termos de linearidade entre fenólicos

totais e atividade antioxidante (ABTS·+

).

Considerando apenas o teor de compostos fenólicos totais, a maior resposta foi obtida

no ensaio de número 3 (676,6 mg AGE.100g-1

), seguida do ponto central (511,8 mg

AGE.100g-1

), as quais foram 3,2 e 2,4 vezes maiores, respectivamente, quando comparados

ao extrato aquoso (209,6 mg AGE.100g-1

), obtido nas mesmas condições do ponto central.

Os gráficos de Pareto (Figura 20) apresentam os efeitos estimados dos parâmetros

tempo de trituração do bagaço (X1); proporção solvente:bagaço (X2) e concentração da

enzima (X3) sobre o teor de compostos fenólicos totais e atividade antioxidante (ABTS·+

) dos

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

200 300 400 500 600 700

Ati

vid

ade

anti

oxid

ante

AB

TS

+

(µM

TE

AC

.g-1

)


r = 0,42


extratos enzimáticos. Os parâmetros proporção solvente:bagaço (X2) e concentração da

enzima (X3) influenciaram significativamente os teores de fenólicos totais, enquanto que, em

termos de capacidade antioxidante (ABTS·+

), somente o parâmetro proporção solvente:bagaço

(X2) foi significativo.

(a)

(b)

Figura 20. Gráficos de Pareto – Planejamento Box-Behnken referente à hidrólise enzimática

em função dos resultados de fenólicos totais (a) e atividade antioxidante por

ABTS·+

(b), com relação aos parâmetros tempo de trituração do bagaço (X1);

proporção solvente:bagaço (X2) e concentração da enzima (X3).

Os gráficos de superfície de resposta referentes às interações entre os parâmetros

avaliados estão apresentados nas Figuras 21 e 22. Os maiores valores de resposta para


fenólicos totais e atividade antioxidante por ABTS·+

foram obtidos quando o parâmetro

proporção solvente:bagaço estava acima do ponto central (2:1 a 3:1; m/m). Por sua vez, o

tempo de trituração da amostra não foi significativo para as variáveis de resposta consideradas

neste estudo.

(a)

(b)


hidrólise enzimática para fenólicos totais relacionando os parâmetros: S:B vs.

tempo de trituração (a) e S:B vs. enzima (%; b.s.) (b).

Tempo

(min)

S:B

S:B Enzima (%)


(a)

(b)


hidrólise enzimática para atividade antioxidante por ABTS•+

relacionando os

parâmetros: S:B vs. tempo de trituração (a) e S:B vs. enzima (%; b.s.) (b).

Macedo et al. (2015) investigaram a influência de complexos enzimáticos celulolíticos

e pectinolíticos na hidrólise do bagaço de caju para obtenção de carotenoides e obtiveram um

aumento de 79 % destes compostos quando aplicaram a enzima comercial Pectinex Batch AR

(Novozymes Latin America Ltda.), a qual apresentava uma alta atividade de pectinesterase.

Entretanto, estes autores também reportaram uma recuperação de carotenoides totais na

ordem de 70 % quando utilizaram uma mistura entre a Pectinex Batch AR e a Celluclast® na

S:B Tempo

(min)

S:B

Enzima (%)


proporção 1:1 (m/m), evidenciando uma ação de sinergismo entre enzimas do complexo

pectinolítico e celulolítico.

Costa et al. (2015) relataram o uso simultâneo de um complexo celulolítico (NS22074,

Novozymes) e uma β-glicosidase (NS50010, Novozymes) para hidrólise do bagaço de caju,

obtendo rendimentos de 76,2 % e 33,1 % para os monômeros glicose e xilose,

respectivamente. Todavia, no estudo conduzido por Costa et al. (2015) o tempo de hidrólise

estabelecido foi de 72 horas. Leitão et al. (2011) reportaram a aplicação de um complexo

enzimático (mistura de arabinase, β-glucanase, celulase, hemicelulase, pectinase e xilanase;

NS 50012 da Novozymes) a uma concentração de 2.000 ppm (b.s.) e tempo de hidrólise de 2

horas para obter maiores taxas de liberação de açúcares redutores do bagaço de caju seco.

5.1.3.5 Hidrólise enzimática – Planejamento fatorial completo 22

A partir dos resultados observados no planejamento Box-Behnken, foi proposto um

novo planejamento estatístico (fatorial completo 2²), com modificação do complexo

enzimático, utilizando-se um preparado enzimático produzido em escala de bancada e rico em

β-glicosidase, com o objetivo de favorecer a hidrólise da parede celular e, como

consequência, aumentar os teores de fenólicos totais e atividade antioxidante.

Os parâmetros razão solvente:bagaço (X1) e concentração de enzima (X2) foram

avaliados. Os resultados obtidos para fenólicos totais e atividade antioxidante pelos métodos

ABTS·+

e ORAC estão apresentados nas Tabelas 13 e 14, respectivamente. Constatou-se uma

forte relação entre os valores de fenólicos totais estimados pelo modelo e os obtidos

experimentalmente, assim como para os resultados da capacidade antioxidante pelos métodos

ABTS·+

e ORAC.

Quando comparado aos resultados obtidos no processo de extração hidroetanólica,

observou-se que a adição das enzimas não foi eficaz para a liberação dos compostos fenólicos

nas condições operacionais analisadas. Ainda, comparando-se o valor médio do teor de

fenólicos totais no ponto central (294,3 mg AGE.100g-1

) com o extrato aquoso (123,0 mg

AGE.100g-1

), obteve-se um aumento de 2,4 vezes, valor idêntico ao determinado no

planejameno Box-Behnken.



Respostas de fenólicos totais e respectivos valores estimados1.

Exp.

S:B Enzima

(%; b.s.)

Fenólicos totais (mg AGE.100g-1

)

Valores encontrados Valores estimados

1 2:1 10 271,8 285,1

2 3:1 10 235,0 248,3

3 2:1 20 297,6 310,9

4 3:1 20 248,4 261,7

5 2,5:1 15 291,6 276,5

6 2,5:1 15 293,5 276,5

7 2,5:1 15 297,7 276,5

1Concentrações do preparado enzimático rico em β-glicosidase variaram entre 10 % e 20 % em termos de base

seca da amostra, equivalente a 84,3 e 168,6 UI de β-glicosidase, respectivamente. Exp. – Experimento; AGE –

ácido gálico equivalente; S:B – proporção solvente:bagaço (m/m).


Respostas de ABTS•+

e ORAC e respectivos valores estimados1.

Exp.

S:B

Enzima

(%; b.s.)

ABTS·+

(µM TEAC.g-1

) ORAC (µM TEAC.g-1

)

Valores

encontrados

Valores

estimados

Valores

encontrados

Valores

estimados

1 2:1 10 2,5 2,8 6,1 5,7

2 3:1 10 1,5 1,7 2,6 2,1

3 2:1 20 2,7 2,9 5,5 5,1

4 3:1 20 1,8 2,0 4,8 4,4

5 2,5:1 15 2,6 2,3 4,0 4,3

6 2,5:1 15 2,7 2,3 3,5 4,3

7 2,5:1 15 2,6 2,3 3,7 4,3

1Concentrações do complexo enzimático rico em β-glicosidase variaram entre 10 % e 20 % em termos de base

seca da amostra, equivalente a 84,3 e 168,6 UI de β-glicosidase, respectivamente. Exp. – Experimento; S:B –

proporção solvente:bagaço (m/m) e TEAC – capacidade antioxidante equivalente ao Trolox.

Obteve-se uma correlação linear positiva (r = 0,965; p < 0,05) entre o teor de

compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante (ABTS·+

), como apresentado na Figura

23. Isto indica que houve um aumento da capacidade antioxidante (ABTS·+

) do extrato, ao

mesmo tempo em que a concentração de compostos fenólicos totais cresceu.



) dos

extratos enzimáticos obtidos a partir do planejamento fatorial 2².

No entanto, quando relacionados os resultados obtidos para fenólicos totais e atividade

antioxidante pelo método ORAC (Figura 24), foi constatada uma fraca correlação de Pearson

(r = 0,233; p < 0,05), sugerindo um comportamento similar ao da hidrólise enzimática com

Celluclast® onde, em determinadas condições, foram observados teores menores de fenólicos

com capacidade antioxidante mais alta. Como os princípios dos dois métodos de determinação

da atividade antioxidante são distintos, podem ocorrer diferenças nas respostas, porém estes

são dados que necessitam de estudos mais aprofundados, avaliando-se também o perfil de

compostos fenólicos correspondente.

Os gráficos de Pareto (Figuras 25 e 26) demonstraram que nenhum dos parâmetros

avaliados, e respectivas interações, foi estatisticamente significativo, ou seja, no intervalo

estudado, não foram registrados efeitos significativos sobre o teor de fenólicos totais e na

atividade antioxidante, medida por ABTS·+

e ORAC. Dessa forma, a proporção

solvente:bagaço (X1) entre 2:1 e 3:1 (m/m) e a concentação de enzima (X2) entre 10 % e 20 %

(b.s.) se encontram, provavelmente, na região operacional mais favorável para a extração de

compostos fenólicos totais.

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

220 240 260 280 300 320

Ati

vid

ade

anti

oxid

ante

AB

TS

+(µ

M T

EA

C.g

-1)


r = 0,965



extratos enzimáticos obtidos a partir do planejamento fatorial 2².

Figura 25. Gráfico de Pareto – Planejamento fatorial 2² referente à hidrólise enzimática em

função dos resultados de fenólicos totais, com relação aos parâmetros proporção

solvente:bagaço (X1) e concentação de enzima (X2).

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

220 240 260 280 300 320

Ati

vid

ade

anti

oxid

ante

OR

AC

(µM

TE

AC

.g-1

)


r = 0,233


(a)

(b)

Figura 26. Gráficos de Pareto – Planejamento fatorial 2² referente à hidrólise enzimática em

função dos resultados de atividade antioxidante por ABTS·+

(a) e ORAC (b), com

relação aos parâmetros proporção solvente:bagaço (X1) e concentação de enzima

(X2).

Estes resultados sugerem que a hidrólise enzimática com o preparado enzimático rico

em β-glicosidase contribuiu para a liberação de compostos fenólicos em menores quantidades,

mas que apresentaram atividade antioxidante relevante. Com o objetivo de alcançar respostas

superiores às obtidas neste planejamento experimental, o extrato enzimático comercial


Celluclast® 1.5 L e o preparado rico em β-glicosidase foram utilizados simultaneamente no

estudo da cinética de extração dos compostos fenólicos por rota enzimática.

5.2 Cinética de extração dos compostos fenólicos

5.2.1 Cinética de extração hidroetanólica

Os parâmetros aplicados no estudo da cinética de extração hidroetanólica foram

selecionados a partir das condições experimentais da maior resposta, obtidas no planejamento

fatorial completo 2². Utilizou-se a proporção solvente:bagaço 2:1 (m/m), no entanto optou-se

por aplicar uma concentração de etanol na solução de 50 % ao invés de 70 %, já que não

houve diferença significativa entre as respostas dos teores de compostos fenólicos totais no

planejamento fatorial 2². Além disso, uma redução de 20 % na concentração de etanol implica

diretamente em economia de processo, pois menos insumo será utilizado. A curva da cinética

de extração hidroetanólica está apresentada na Figura 27.

Figura 27. Cinética do transporte de compostos fenólicos no processo de extração

hidroetanólica do bagaço de caju.

A curva cinética da extração hidroetanólica foi ajustada a um polinômio de segunda

ordem, obtendo-se um coeficiente de regressão (R²) igual a 0,94. De acordo com a equação

polinomial de segundo grau (Equação 14), onde 540,8 é a interseção da curva no eixo y (x = t

= 0), a qual apresenta seu ponto máximo quando a derivada é nula, resolve-se:

y = -0,0086x2 + 1,883x + 540,8R² = 0,9406

500

550

600

650

700

0 20 40 60 80 100 120

Fen

ólico

s to

tais

(mg A

GE

.100g

-1)

Tempo (minutos)


, então

Portanto, o maior valor na concentração de fenólicos totais foi obtido após 100

minutos de processo (19,86 % superior em relação ao tempo zero). A partir de 107 minutos,

não se observou uma variação significativa das respostas monitoradas. Assim, definiu-se este

intervalo como limite superior para a extração hidroetanólica de compostos fenólicos do

bagaço de caju aplicando-se as condições operacionais previamente determinadas neste

estudo.

Comparando-se os valores absolutos dos compostos fenólicos totais, após 80 minutos

(633,5 mg AGE.100g-1

) e 100 minutos (636,0 mg AGE.100g-1

) de extração, considerou-se

que o período de tempo de 80 minutos seria suficiente para atingir altos valores de resposta,

além de reduzir o tempo de processo, refletindo em redução de custos inerentes à operação.

Pelo método dos mínimos quadrados, ajustou-se um modelo cinético à solução da segunda lei

de Fick (Figura 28), sendo obtido um valor de coeficiente de difusão (Def) de 3,68 × 10-10

m².s-1

. Observou-se também uma distribuição normal entre os valores observados e os

estimados pelo modelo, como apresentado na Figura 29.

Figura 28. Cinética de extração hidroetanólica de fenólicos totais ajustada pelo modelo de

Fick, onde Y = (X – Xeq)/(X0 – Xeq).

(Eq. 14)

(Eq. 15)

(Eq. 16)

Y

T (min)


Figura 29. Curva de distribuição normal entre os valores observados e os estimados pelo

modelo obtido para a cinética de extração hidroetanólica.

Teoh e Mashitah (2013) reportaram um valor de coeficiente de difusão de 1,96 × 10-10

m².s-1

e 1,76 × 10-10

m².s-1

quando avaliaram a extração hidroetanólica (metanol:água; 70 %

v/v) de compostos bioativos obtidos de cogumelos (Schizophyllum commune e Pycnoporus

sanguineus, respectivamente).

Em estudo sobre a cinética de extração de compostos fenólicos a partir da uva por

processo de ultrassom, Tao, Zhang e Sun (2014) relataram valores de coeficiente de difusão

na ordem de 10-11

m².s-1

. Ferreira (2013) obteve um coeficiente de difusão de 1,50 × 10-15

m².s-1

quando avaliou a extração de fibras solúveis a partir do bagaço da uva branca

Chardonnay. Mascheroni et al. (2013) reportaram valores na ordem de 10-13

m².s-1

para a

difusividade de compostos de própolis em embalagens para alimentos com propriedades

antimicrobianas.

Verificou-se, portanto, que o valor do coeficiente de difusão foi superior ou da mesma

ordem de grandeza que os reportados na literatura para diferentes compostos bioativos,

evidenciando o potencial de aplicação do bagaço de caju na produção de ingredientes

funcionais relativos à presença de compostos fenólicos.

Val

ore

s obse

rvad

os

Valores estimados


5.2.2 Cinética de extração enzimática

O uso simultâneo do preparado enzimático Celluclast® 1.5 L e do extrato rico em β-

glicosidase favoreceu o rompimento da parede celular do bagaço do caju. Portanto, a hipótese

de que a celulase (endoglucanase) agiria como um catalisador auxiliar na hidrólise da

celulose, facilitando a clivagem da celobiose pela β-glicosidase, foi confirmada nas condições

operacionais selecionadas. No entanto, o teor de fenólicos totais obtido por extração

enzimática foi ainda inferior (394,6 mg AGE.100g-1

para 3 horas de extração) ao obtido no

processo hidroetanólico (633,5 mg AGE.100g-1

para 80 minutos de extração).

O comportamento da liberação dos compostos fenólicos totais do bagaço de caju para

o solvente aquoso por hidrólise enzimática aplicando-se a enzima Celluclast® e o extrato rico

em β-glicosidase na proporção de 1:1 (m/m), indicou que, após um período aproximado de

3,5 horas de hidrólise, as taxas de difusão reduziram. Portanto, este foi o intervalo de tempo

recomendado para o processo, com taxa de recuperação da ordem de 342 % em comparação

com o valor inicial. Como apresentado na Figura 30, o decréscimo da quantificação de

fenólicos totais pode estar associado a períodos mais longos de tempo que repercutiram na

instabilidade destes compostos.

Figura 30. Cinética do transporte de compostos fenólicos no processo de extração enzimática

do bagaço de caju.

A cinética de extração enzimática se ajusta a um polinômio de segunda ordem e o

coeficiente de regressão (R²) obtido foi 0,90. De acordo com a equação polinomial de

y = -21,5x2 + 157,0x + 97,1R² = 0,9

0

100

200

300

400

0 2 4 6

Fen

ólico

s to

tais

(mg A

GE

.100g

-1)

Tempo (h)


segundo grau (Equação 17), onde 97,1 é a interseção da curva no eixo y (x = t = 0), a qual

apresenta seu ponto máximo quando a derivada é nula, resolve-se:

Assim, o intervalo de tempo onde foram obtidos os maiores teores de compostos

fenólicos totais, de acordo com as condições operacionais definidas para a hidrólise

enzimática, foi de 3,65 horas. Entretanto, em termos de significância estatística (p < 0,05), os

valores de resposta quantificados no intervalo de tempo de 3 horas não se diferenciaram,

sendo então estipulada esta duração de tratamento enzimático para o desenvolvimento das

etapas posteriores. Ressalta-se que o valor do coeficiente de difusão obtido (4,12 × 10-10

m².s-

1) foi similar ao calculado na cinética de extração hidroetanólica (3,68 × 10

-10 m².s

-1).

Fasawang e Anprung (2014) reportaram uma maior recuperação de açúcares redutores

quando ampliaram o tempo de hidrólise enzimática de 0,5 para 4 horas, utilizando uma

pectinase comercial (Pectinex® Ultra SP-L), com o objetivo de aumentar o rendimento de

extração de compostos bioativos, inicialmente glicosilados, presentes na polpa de lichia.

Fernández, Vega e Aspé (2015) estabeleceram um ciclo de extração de 3 horas para

avaliar a ação das enzimas pectinase, celulase e tanase com a finalidade de extrair

proantocianidinas a partir de sementes e cascas de uva. Apesar do impacto econômico

negativo que uma alta concentração enzimática pode causar a um processamento industrial,

eles destacaram que, ao aplicar uma dosagem de 10 %, expressa em termos de base seca da

amostra, constataram um efeito favorável na liberação dos fenólicos em questão.

O estudo conduzido, que preconizou a aplicação de complexos enzimáticos com a

finalidade de aumentar o rendimento da extração de compostos fenólicos do bagaço de caju,

gerou resultados ainda não conclusivos e que demandam uma continuidade, de forma a

viabilizar esta tecnologia, testada em escala de bancada, para a realidade da indústria

alimentícia, considerando não somente moderações econômicas em termos de investimentos

que propiciem o aproveitamento deste resíduo como também promovam o desenvolvimento

tecnológico da indústria brasileira diretamente envolvida no beneficiamento do caju.

(Eq. 17)

(Eq. 18)

(Eq. 19)


5.3 Processo de extração em série: Extração enzimática seguida da extração

hidroetanólica

Os teores de fenólicos totais dos extratos obtidos nos processos de extração em série

(Teste A), extração enzimática (Teste B), extração hidroetanólica (Teste C) e do branco, bem

como as respectivas taxas de recuperação destes compostos, estão apresentados na Tabela 15.

O período de extração foi de 4 horas, mantido em todos os testes. Como no estudo

cinético da extração enzimática, a melhor resposta foi alcançada no tempo de 4 horas, este

tempo foi estabelecido para que a etapa de hidrólise enzimática do Teste A tivesse a mesma

duração. Adicionalmente, a proporção solvente:bagaço permaneceu 2,5:1, a mesma aplicada

na extração enzimática isolada.

Tabela 15. Respostas de fenólicos totais para os ensaios em série da extração enzimática e

hidroetanólica.

Teste Descrição S:B Fenólicos totais

(mg AGE.100g-1

)

Recuperação

(%)

A 3 horas – Celluclast:β-glicosidase

1

1 hora – Etanol (50 %)

1,25:1

1,25:1 496,4 167 %

B 4 horas – Celluclast:β-glicosidase1 2,5:1 212,0 14 %

C 4 horas – Etanol (50 %) 2,5:1 563,5 203 %

Branco 4 horas – Água 2,5:1 186,1 -

AGE – ácido gálico equivalente. 1Proporção Celluclast:β-glicosidase de 1:1 (m/m). S:B – Proporção

solvente:bagaço (m/m).

De acordo com as taxas de recuperação dos compostos fenólicos, notou-se que,

mesmo com a integração da hidrólise enzimática com a extração hidroetanólica, respeitando-

se o balanço de massa e os parâmetros operacionais para todos os testes, a operação que

envolveu somente a extração hidroetanólica manteve-se como a mais competitiva para

produzir extratos ricos em compostos fenólicos provenientes do bagaço do caju.

Assim, para a realização das etapas subsequentes, utilizou-se o extrato hidroetanólico

elaborado nas condições operacionais selecionadas para o estudo da cinética de extração, isto

é, proporção solvente:bagaço de 2:1 (m/m), concentração de etanol na solução de 50 % e

tempo de extração de 80 minutos a 50 °C em incubadora shaker.


5.4 Concentração por evaporação a vácuo

A Tabela 16 apresenta os dados do processo de concentração do extrato hidroetanólico

do bagaço de caju, submetido a concentração por evaporação rotativa sob pressão reduzida

(700 mmHg) a 70 °C e agitação de 70 min-1

. Neste procedimento, o solvente foi evaporado e

recuperado por condensação utilizando-se resfriamento em banho de gelo. O rendimento do

extrato concentrado obtido foi de 61,32 %. Como esperado, o teor de compostos fenólicos

totais no extrato concentrado foi 67,84 % maior que no extrato hidroetanólico, valor

proporcional à remoção do solvente.

Tabela 16. Dados da concentração do extrato hidroetanólico por evaporação rotativa.

Amostra Massa (g) Fenólicos totais (mg AGE.100g-1

)1

Extrato hidroetanólico 1.060,0 259,56 ± 20,67

Extrato concentrado 650,0 435,65 ± 19,66

Solvente recuperado 300,0 -

1Resultados expressos como média ± desvio padrão (n = 3); AGE – ácido gálico equivalente.

5.5 Microencapsulamento por atomização

Os agentes encapsulantes maltodextrina e goma arábica foram adicionados ao extrato

concentrado na proporção 1:1 (m/m), obtendo-se uma mistura denominada de solução

alimentadora, onde 15 % equivaliam à massa do agente encapsulante. A quantidade de sólidos

totais foi então elevada de 2,78 g.100g-1

para 12,43 g.100g-1

. Esta solução alimentadora

apresentou um teor de sólidos solúveis de 19,1 °Brix.

O rendimento do processo de microencapsulamento por atomização foi de,

aproximadamente, 60 %. O balanço de massa das correntes de entrada e saída sugerem que

houve perda de material na câmara de secagem por retenção do material nas paredes. Ainda

assim, o rendimento obtido foi superior ao reportado por Santiago (2014), de 50 %, quando

desidratou suco de romã por atomização. Neste trabalho, foi ressaltado que as formulações

contendo goma arábica apresentaram maior facilidade de recolhimento do pó aderido às

paredes do equipamento. Esta característica reforça a escolha deste agente encapsulante na

produção do microencapsulado proveniente da extração hidroetanólica do bagaço de caju,

onde também foi possível recolher o produto aderido ao coletor do atomizador (Figura 31).


Figura 31. Extrato microencapsulado derivado do bagaço de caju.

Silva et al. (2014) também recomendaram o uso da goma arábica (15 %; m/m) como o

agente encapsulante mais efetivo na preservação de compostos bioativos presentes no camu-

camu, em comparação com a maltodextrina. Contudo, as limitações econômicas relacionadas

com a aquisição da goma arábica, como alto custo e restrições de disponibilidade, motivam

estudos que a substituem por outros materiais, a exemplo da maltodextrina (MOREIRA et al.,

2009).

De acordo com Valduga et al. (2008), as melhores condições de retenção de

antocianinas totais a partir do bagaço da uva “Isabel” foram obtidas quando aplicadas

proporções iguais de goma arábica e maltodextrina (50:50) na concentração de 30 % (m/m).

Como a goma arábica aumenta a temperatura de transição vítrea (Tg) do pó, os autores

observaram que este agente encapsulante propiciou uma menor perda do material por

aderência às paredes do coletor do equipamento.

Ferrari et al. (2011) compararam o uso da maltodextrina (DE 20) com a goma arábica

para microencapsular suco de amora por atomização e reportaram que ambos apresentaram

uma retenção de antocianinas acima de 70 %.

De acordo com o balanço de massa do processo de microencapsulamento, como

apresentado na Tabela 17, destaca-se que a eficiência desta operação, em termos de fenólicos

totais em base seca de amostra, foi de 78,4 %. Paini et al. (2015) reportaram valores de

eficiência de microencapsulamento de compostos fenólicos extraídos do bagaço de azeitona

entre 65 e 77 %.


Davidov-Pardo, Arozarena e Marín-Arroyo (2013) destacaram a aplicação de

maltodextrina no microencapsulamento de extratos de semente de uva e registraram eficiência

de processo variando de 68 a 91 %. Este resultado indica que é possível modificar alguns

parâmetros operacionais, como vazão e temperatura do ar e vazão de alimentação, quando se

deseja aumentar a recuperação do produto final.

Tabela 17. Eficiência do microencapsulamento por atomização do extrato proveniente do

bagaço do caju.

Amostra Sólidos totais

(g.100g-1

)

Fenólicos totais

(mg AGE.100g-1

)1 Eficiência (%)

Base úmida Base seca

Solução alimentadora 12,4 435,7 ± 19,6 35,1 78,4

Extrato microencapsulado 99,2 2725,7 ± 86,6 27,5

1Resultados expressos como média ± desvio padrão (n = 3); AGE – ácido gálico equivalente.

5.5.1 Identificação dos compostos fenólicos

Foram identificados quatro compostos fenólicos (ácido gálico, rutina, isoquercetina e

quercetina) no extrato microencapsulado de caju (Figura 32), sendo estes característicos deste

pseudofruto e previamente reportados pela literatura (MAHAJAN; CHAUDHARI, 2012;

MICHODJEHOUN-MESTRES et al., 2009; BRITO et al., 2007).

A caracterização cromatográfica do bagaço de caju in natura, submetido à

desidratação por liofilização está apresentada na Figura 32. Comparando-se os cromatogramas

obtidos, observou-se que o perfil cromatográfico foi mantido, mesmo após a submissão do

bagaço de caju a processos que envolveram o uso de solvente orgânico (etanol) a temperatura

de 50 °C por 80 minutos, além do aquecimento em evaporador rotativo a 70 °C e secagem por

atomização a 160 °C.

Os cromatogramas das amostras hidrolisadas (hidrólise ácida) estão apresentados na

Figura 33. As regiões ampliadas dos picos identificados nas amostras hidrolisadas estão

demonstradas na Figura 34. O pico da rutina não apareceu nas amostras submetidas à

hidrólise. Além disso, o pico da quercetina apresentou-se mais evidente nas amostras

hidrolisadas.


Figura 32. Cromatogramas do extrato microencapsulado (a) e bagaço liofilizado (b) de caju e

principais compostos fenólicos identificados por CLAE-DAD.

AU

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

Tempo (minutos)

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0

Áci

do

gáli

co

Der

ivad

o d

o á

cid

o

hid

roxib

enzo

ico

Ru

tin

a

Isoq

uer

ceti

na

Qu

erce

tin

a

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Tempo (minutos)

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0

Áci

do g

áli

co

Der

ivad

o d

o á

cid

o

hid

roxib

enzo

ico

Ru

tin

a

Isoq

uer

ceti

na

Qu

erce

tin

a

(a)

(b)


Figura 33. Cromatogramas do extrato microencapsulado (a) e bagaço liofilizado (b), ambos

hidrolisados, e principais compostos fenólicos identificados por CLAE-DAD.

AU

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Tempo (minutos)

0,00 5,00

10,00 15,00 20,00 25,00 30,00

Áci

do g

áli

co

Der

ivad

o d

o á

cid

o h

idro

xib

enzo

ico

Qu

erce

tin

a

Isoq

uer

ceti

na

(a)

AU

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Tempo (minutos)

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0

Áci

do g

áli

co

Der

ivad

o d

o á

cid

o h

idro

xib

enzo

ico

Isoq

uer

ceti

na

Qu

erce

tin

a

(b)


(a)

(b)

Figura 34. Regiões ampliadas do cromatograma do extrato microencapsulado de caju

hidrolisado. Intervalo de corrida entre 0,0 e 4,0 minutos (a) e 22,0 e 26,0 minutos

(b), destacando os picos das substâncias ácido gálico, isoquercetina e quercetina.

Como a rutina é um flavonoide glicosídico da quercetina (BECHO; MACHADO;

GUERRA, 2009), é possível confirmar que a solução de ácido clorídrico atuou na hidrólise da

AU

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

22,0 23,0 24,0 25,0

Isoquercetina

Quercetina

Tempo (minutos)

AU

-0,08

-0,04

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

Tempo (minutos)

1,50 2,00 2,50 3,00 3,50

Ácido gálico


212,2

272,6

376,3 396,8 411,3 440,4 462,3

484,2

532,9 547,6 568,4

AU

-0,004

0,000

0,004

0,008

0,012

nm 220,0 300,0 380,00 460,00 540,00

rutina, liberando a quercetina. Dessa forma, comprova-se a presença da rutina no extrato

microencapsulado de caju.

Constatou-se ainda, de acordo com os cromatogramas apresentados na Figura 33, que

um composto específico, apesar de não ter sido identificado por comparação de espectros de

absorção com o padrão, foi destacado por aparecer no tempo de retenção próximo aos 10,7

minutos para as duas amostras. Denominou-se esta substância como derivada do ácido

hidroxibenzoico, visto que os espectros de absorção desses picos eram muito similares aos

espectros dos ácidos gálico e siríngico (Figura 35), os quais são também procedentes desta

substância, de acordo com a rota do ácido chiquímico (HELENO et al., 2015).

Figura 35. Espectro de absorção a 270 nm do pico que apareceu aos 10,7 minutos no

cromatograma do extrato microencapsulado de caju.

Na Tabela 18, estão apresentadas as estruturas químicas, tempos de retenção e

espectros de absorção (UV/Visível a 270 nm) dos padrões comerciais do ácido gálico e dos

flavonoides rutina, quercetina e isoquercetina, bem como os tempos de retenção e espectros

obtidos nos cromatogramas gerados nas análises do extrato microencapsulado de caju e

comparação com o bagaço de caju in natura previamente liofilizado. Algumas das

propriedades biológicas dessas substâncias também são abordadas a seguir.

AU

0,000

0,004

0,008

Tempo (minutos)

9,0 10,0 11,0 12,0


Tabela 18. Estruturas químicas, espectros e tempos de retenção dos compostos identificados

nos extratos analíticos antes e após hidrólise ácida e comparação com os

respectivos padrões.

Composto Espectros de absorção da região do UV (270 nm)

Extrato Extrato hidrolisado Padrão

Ácido gálico

Derivado do ácido

hidroxibenzoico

N/A

Rutina

N/A

Isoquercetina

Quercetina

N/A – Não se aplica.

2,955 Extracted

215,8

271,4

376,3411,3440,4462,3484,2

532,9 568,4

AU

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

0,026

0,028

0,030

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

2,941 Extracted

214,6

272,6

355,0 430,7473,2486,6 545,1

AU

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

0,026

0,028

0,030

0,032

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

3,120 Extracted

215,8

271,4

462,3484,2 568,4

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

0,30

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

10,698 Extracted

212,2

272,6

376,3396,8411,3440,4462,3

484,2

532,9

568,4

AU

-0,004

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

10,601 Extracted

215,8

273,8

388,4423,4468,3486,6

545,1 583,1

AU

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

19,462 Extracted

254,8

358,4

411,3440,4462,3

484,2

532,9

568,4

AU

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

0,026

0,028

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

19,215 Extracted

255,9

353,8

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

21,589 Extracted

254,8

346,6

411,3440,4462,3

484,2

532,9

568,4

AU

-0,010

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

0,026

0,028

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

22,314 Extracted

253,6364,3

468,3486,6

545,1583,1

AU

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

19,771 Extracted

254,8

352,6

455,0 486,6

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

24,811 Extracted

254,8 376,3

440,4462,3

484,2

532,9

568,4

AU

-0,010

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

0,026

0,028

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

24,785 Extracted

254,8 364,3

468,3486,6

545,1 583,1

AU

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

0,090

0,100

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

24,780 Extracted

214,6

253,6

363,3

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

2,20

2,40

2,60

2,80

3,00

3,20

3,40

3,60

3,80

nm

250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00

24,8 min

19,5 min 19,2 min

10,7 min 10,6 min

3,0 min 2,9 min 3,1 min

21,6 min 22,3 min 19,8 min

24,8 min 24,8 min


Verificou-se que o extrato microencapsulado derivado do bagaço de caju obtido no

presente trabalho apresentou capacidade antioxidante caracterizada pela presença de ácidos

fenólicos e flavonoides característicos de frutas, os quais podem apresentar propriedades

funcionais quando para o organismo humano.

O ácido gálico apresenta um alto potencial antioxidante e ampla biodisponibilidade.

Tanto o ácido gálico, quanto seus derivados destacam-se pelo comportamento antioxidante

originando uma gama de atividades biológicas, incluindo antitumoral, antimicrobiana,

antimelanogênica e anticolesterolêmica (BADHANI; SHARMA; KAKKAR, 2015). A

presença do ácido gálico na polpa, casca e bagaço de caju foi previamente reportada na

literatura científica (BATAGLION et al., 2015; MOO-HUCHIN et al., 2015; BROINIZI et

al., 2007). Ressalta-se que o processo de secagem por atomização preservou a integridade

desta substância, o que é favorável para a manutenção do potencial antioxidante do extrato

microencapsulado de caju.

A quercetina, um dos flavonoides mais estudados, pertence ao grupo dos flavonois,

juntamente com o kaempferol. Acredita-se que a quercetina pode atuar na proteção contra

algumas doenças degenerativas, pois previne a peroxidação lipídica (BONA, 2010; BENTZ,

2009). A rutina, ou quercetina-3-O-rutinosídeo, é um flavonol que apresenta a propriedade de

sequestrar radicais livres (NIJVELDT et al., 2001). Sua ingestão em concentrações toleradas

por humanos e ratos está associada à inibição de trombose (JASUJA et al., 2012). Embora a

quercetina-3-O-rutinosídeo seja uma forma importante da quercetina encontrada nos

alimentos, a sua biodisponibilidade é de apenas 20 % quando comparada com a quercetina-4’-

glicosídeo. A quercetina-3-O-rutinosídeo pode ser transformada em quercetina-3-glicosídeo

(isoquercetina) pela perda da molécula de ramnose. A quercetina-3-o-glicosídeo e 4’-

glicosídeo apresentam alta biodisponibilidade (BEHLING et al., 2004).

O método cromatográfico utilizado nesta identificação (CLAE-DAD) é vantajoso, pois

prevê a aquisição de espectros em múltiplos comprimentos de onda, todavia somente é

possível identificar um determinado composto comparando-o ao espectro de um padrão

externo. Em situações onde os padrões não estão disponíveis, recomenda-se aplicar outros

métodos, quando disponível, em especial a identificação cromatográfica por espectrometria de

massa (PACHECO et al., 2015; LANÇAS, 2009).


5.5.2 Distribuição do tamanho de partículas

A distribuição do tamanho de partículas do extrato de caju microencapsulado está

apresentada na curva da Figura 36, onde se observa uma distribuição unimodal do tipo normal

ou Gaussiana. Este perfil distributivo também foi reportado por Silva et al. (2012) em

secagem por atomização de suco de camu-camu.

Figura 36. Distribuição do tamanho de partículas por difração a laser do extrato

microencapsulado de caju no tempo zero de estocagem.

O diâmetro médio e a variação do tamanho das micropartículas estão apresentados na

Tabela 19.

Tabela 19. Distribuição do tamanho das micropartículas do extrato microencapsulado de caju

no tempo zero de estocagem.

Distribuição de tamanho Diâmetro (µm)1

D10 1,98 ± 0,02

D50 7,81 ± 0,03

D90 20,20 ± 0,40

Diâmetro volumétrico médio 11,17 ± 0,34

1Resultados expressos como média ± desvio padrão (n = 3). D10, D50 e D90 correspondem, respectivamente, a 10

%, 50 % e 90 % das partículas com diâmetros máximos especificados na coluna diâmetro.

Estes valores estão dentro do esperado para processos de microencapsulamento de

extratos vegetais por atomização, os quais podem variar entre 10 e 100 µm (NUNES et al.,

2015). Estudos que aplicaram condições operacionais similares reportaram tamanho médio de


partículas de 13 a 16 µm para polpas de amora e açaí, respectivamente (TONON, 2009;

FERRARI; RIBEIRO; AGUIRRE, 2012).

Os dados experimentais foram mais bem ajustados ao modelo RRB, apresentando

coeficiente de correlação linear R² = 0,95. De acordo com o método dos mínimos quadrados,

os parâmetros do modelo foram determinados, sendo obtidos os resultados apresentados na

Tabela 20.

Tabela 20. Parâmetros estimados para o modelo de distribuição de tamanho de partícula

RRB.

Parâmetros n d'

Valores 1,20 14,63

5.5.3 Morfologia

Na Figura 37 estão apresentadas as imagens microscópicas das partículas do extrato de

caju microencapsulado (ampliadas 1000 e 2000 vezes). As partículas mostraram-se

predominantemente esféricas, com superfície rugosa e sem presença de rachaduras, no entanto

é possível observar que algumas apresentaram superfície completamente lisa.

(a) (b)

Figura 37. Análise morfológica das microcápsulas derivadas do extrato do bagaço de caju

microencapsulado por atomização. Aumento de 1000x (a) e 2000x (b).

O aspecto rugoso das microcápsulas é esperado em processos de secagem por

atomização e está relacionado com a redução do tamanho das partículas que se expandem ao

serem aquecidas e retraem ao resfriar rapidamente (DAVIDOV-PARDO; AROZARENA;

MARÍN-ARROYO, 2013). Morfologias similares também foram reportadas por Nunes et al.


(2015) para microencapsulamento de extratos aquosos de erva-mate utilizando maltodextrina

como agente encapsulante.

Tonon, Brabet e Hubinger (2009) reportaram a prevalência do aspecto rugoso na

superfície do suco de açaí em pó microencapsulado por atomização aplicando-se temperatura

do ar de secagem de 170 °C. Em contrapartida, grande parte das microcápsulas secas a 202 °C

apresentaram uma superfície lisa, indicando que o aumento da temperatura favorece a

obtenção de microcápsulas com esta característica, o que poderia aprimorar os atributos de

escoamento do material. No entanto, temperaturas elevadas favorecem a degradação de

compostos bioativos presentes nestas matérias-primas, o que não é desejável quando o

interesse é preservá-los por longos períodos de estocagem.

Uma comparação das micrografias dos agentes encapsulantes goma arábica e

maltodextrina com dados reportados na literatura está apresentada na Figura 38.

(a1) (a2)

(b1) (b2)

Figura 38. Comparação das micrografias dos agentes encapsulantes: goma arábica (a1) e

maltodextrina (b1) com dados reportados por Santos, Fávaro-Trindade e Grosso

(2005) (a2) e Otálora et al. (2015) (b2).


A goma arábica é caracterizada por apresentar concavidades com níveis diferentes de

profundidade, além de agrupamento de microcápsulas de tamanhos variados. Neste material

de parede, as partículas também possuem superfície rugosa. Observou-se que a maltodextrina

apresentou formato e tamanho irregulares, como também reportado por Otálora et al. (2015).

Esta caracterização sugere que houve uma homogeneização adequada entre o extrato

concentrado de caju, proveniente da extração hidroetanólica, com os materiais de parede

maltodextrina e goma arábica, promovendo assim o encapsulamento dos compostos fenólicos.

Moraes (2014) produziu polpa desidratada de caju por atomização e utilizou goma

arábica nas concentrações de 15 % e 25 % (m/m) com temperaturas de entrada de 140 °C e

150 °C. De acordo com os resultados da morfologia, por microscopia eletrônica de varredura

(MEV), o autor destacou que o tratamento com concentração de 15 % (m/m) do agente

carreador resultou em partículas grandes, amorfas e com forte atração entre si, enquanto que o

aumento da concentração de goma arábica para 25 % (m/m) resultou em partículas com

características semelhantes, mas que se apresentavam mais dispersas (Figura 39).

Figura 39. Micrografias da polpa de caju desidratada por atomização contendo 15 % de goma

arábica com ar aquecido a 140 °C (B) e 150 °C (C). Ampliação de 1200 vezes.

Fonte: Moraes (2014).

As micrografias obtidas neste trabalho apresentaram menor aglomeração das

micropartículas se comparadas com aquelas reportadas por Moraes (2014). Este

comportamento pode estar relacionado com o uso da goma arábica como agente encapsulante,

confirmando relatos da literatura (MONTENEGRO et al., 2012). Ressalta-se também que

houve semelhança entre as micrografias, relacionada ao tamanho diversificado das partículas,


bem como a presença de formas irregulares, incluindo a existência de partículas com

superfície rugosa.

5.5.4 Isotermas de sorção

O modelo de GAB foi o que melhor se ajustou aos dados experimentais de sorção do

extrato microencapsulado de caju. Os parâmetros do modelo estão apresentados na Tabela 21,

bem como o coeficiente de regressão (R²). Moura et al. (2004) também reportaram que o

modelo de GAB foi o que melhor descreveu os dados da isoterma de sorção para a polpa de

caju.

Tabela 21. Parâmetros de ajuste da isoterma de sorção do extrato microencapsulado de caju

no tempo zero de estocagem.

Modelo T (°C) Parâmetros

C K Xm R²

GAB 25 22,06 -18,56 0,050 0,99

A isoterma de sorção de água do extrato microencapsulado de caju está apresentada na

Figura 40, podendo ser classificada como do tipo III de acordo com a definição da IUPAC

(1985), característica de microencapsulados ricos em carboidratos.


Figura 40. Isoterma de sorção a 25 °C do extrato microencapsulado de caju com 15 % de

maltodextrina e goma arábica (1:1; m/m) ajustada pelo modelo de GAB.

A curva apresentou um comportamento linear no intervalo de aw entre 0,1 e 0,5, no

qual se registrou uma pequena variação da umidade de equilíbrio. A partir da aw superior a

0,5, a curva apresenta um comportamento exponencial típico de produtos de baixa

higroscopicidade na temperatura ambiente. A redução da higroscopicidade está relacionada

com a presença da goma arábica, conforme reportado por Oliveira, Costa e Afonso (2014) e

Oliveira et al. (2013).

5.5.5 Estabilidade do extrato microencapsulado de caju

Após os 60 dias de armazenamento do extrato microencapsulado, observou-se uma

redução de 12 % do teor de compostos fenólicos totais e de 40 % e 34 % da atividade

antioxidante pelos métodos ABTS·+

e ORAC, respectivamente (Tabela 22), sugerindo que a

utilização de embalagem laminada e submetida a vácuo não foi satisfatória para a preservação

destes compostos. A temperatura de 25 °C também pode ter contribuído para o aumento da

velocidade de degradação destes bioativos. Entretanto, para os mesmos parâmetros, os

resultados não diferiram significativamente até os 45 dias de estocagem. Assim, foi possível

garantir a estabilidade do produto durante este período. Ainda de acordo com a Tabela 21,

destaca-se que o teor de sólidos totais reduziu em 4 %, confirmando que o extrato

C:1C:2 C:3

C:4

C:5

C:6

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

aw

0

1

Ueq

C:1C:2 C:3

C:4

C:5

C:6


microencapsulado produzido apresentou baixa higroscopicidade, pois houve pequeno

aumento da umidade do produto.

Tabela 22. Estabilidade do extrato microencapsulado de caju em termos de fenólicos totais e

atividade antioxidante.

Tempo

(dias)

Fenólicos totais

(mg AGE.100g-1

)

ABTS·+

(µM TEAC.g-1

)

ORAC

(µM TEAC.g-1

)

Sólidos totais

(g.100g-1

)

0 2747,6ª 24,7a 41,1ª 99,2

15 2724,6ª 20,3ª 38,9ª 98,9

30 2632,9ª 19,6ª 35,7ª 98,3

45 2492,7ª,b 17,5

a,b 31,7ª

,b 96,9

60 2410,4b 14,9

b 27,1

b 94,8

Respostas expressas em termos de base seca da amostra. Letras iguais na mesma coluna não diferem

significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey ao nível de probabilidade de 5 %.

Correlacionando-se as respostas obtidas para o teor de compostos fenólicos totais e as

de atividade antioxidante pelos métodos ABTS·+

e ORAC (Tabela 21) observou-se que,

quando o teor de compostos fenólicos decresceu, a capacidade antioxidante do extrato

microencapsulado também reduziu linearmente, apresentando coeficiente correlação de

Pearson de 0,98 tanto entre fenólicos totais e atividade antioxidante por ABTS·+

, quanto entre

fenólicos totais e atividade antioxidante por ORAC.

A degradação dos compostos fenólicos totais apresentou-se como uma cinética de

primeira ordem (Figura 41), com coeficiente de regressão linear superior a 0,90 (R² = 0,95).

Este comportamento está de acordo com os dados apresentados por Tonon, Brabet e Hubinger

(2010) referentes ao estudo de estabilidade de antocianinas no suco de açaí microencapsulado

durante os primeiros 60 dias de estocagem tanto a 25 °C quanto a 35 °C.


Figura 41. Cinética de degradação dos compostos fenólicos totais durante os 60 dias de

estocagem do extrato microencapsulado de caju.

Os resultados do estudo de estabilidade conferem ao produto uma qualidade para a sua

comercialização com restrição para o tempo de armazenamento de até 45 dias. Por fim,

realizou-se também um balanço de massa global considerando todas as etapas operacionais

apresentadas neste estudo (Figura 42). A partir de 1 (uma) tonelada de caju fresco, estimou-se

uma produção de 22,3 kg de extrato microencapsulado.

Figura 42. Balanço de massa global para produção do extrato de caju microencapsulado.

y = -116,04x + 2889,9

R² = 0,9537

2000

2200

2400

2600

2800

0 dias 15 dias 30 dias 45 dias 60 dias

Fen

óli

cos

tota

is

(mg

AG

E.1

00g

-1)

Tempo (dias)

Caju

Bagaço

Extrato hidroetanólico

Extrato concentrado

Microencapsulado

1 ton

270 kg

491,4 kg

301,2 kg

22,3 kg

6 Conclusões

6. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que é possível obter um extrato

rico em compostos fenólicos a partir do bagaço residual da extração do suco de caju.

Na proporção solvente:bagaço 2:1 (m/m); porcentagem de etanol na solução de 50 %

(m/m) e tempo de extração de 80 minutos, obteve-se um extrato com elevado teor de

compostos fenólicos com taxa de recuperação de cerca de 200 %.

O uso do etanol na solução extratora foi importante para aumentar a eficiência do

processo de extração dos compostos fenólicos se comparado com a hidrólise enzimática.

Adicionalmente, o processo em série (hidrólise enzimática seguida da extração

hidroetanólica) não favoreceu a recuperação dos compostos fenólicos.

O uso da goma arábica e maltodextrina no microencapsulamento do extrato do bagaço

do caju contribuiu para a preservação dos compostos fenólicos, com destaque para o ácido

gálico e para os flavonoides rutina, quercetina e isoquercetina.

O estudo de estabilidade validou os processos de extração hidroetanólica,

concentração por evaporação rotativa e secagem por atomização para o aproveitamento do

resíduo do processamento do caju, sendo adequados para a obtenção de compostos fenólicos,

agregando valor a este coproduto. No entanto, para aumentar a vida de prateleira do extrato

microencapsulado, novas condições de armazenamento deverão ser avaliadas.

A rota hidroetanólica foi adequada para a obtenção de um extrato a partir do coproduto

do processamento do caju, concentrado em compostos bioativos, e com possível ação

biológica sobre a saúde humana.

As condições operacionais desenvolvidas neste estudo sinalizam uma viabilidade

técnica para produção de um extrato microencapsulado funcional, de modo a contribuir para a

agregação de valor à cadeia agroindustrial de beneficiamento do pseudofruto do caju.

7 Sugestões para trabalhos futuros

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Os resultados obtidos são promissores, entretanto, novos estudos podem ainda ser

realizados visando o aperfeiçoamento do processo e a obtenção do produto em escala

comercial. Para isto, sugere-se:

1. Aperfeiçoar a hidrólise enzimática por meio de um pré-tratamento apropriado do

bagaço ou combinação de outros biocatalisadores. Em paralelo, aprofundar estudo de

caracterização da estrutura do bagaço do caju, que justifique a utilização de outros

preparados enzimáticos (p.ex., pectinases);

2. Avaliar outras técnicas de concentração do extrato hidroetanólico, como o uso de

membranas que pode contribuir para a redução do consumo de energia;

3. Utilizar a cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa para

identificação e quantificação dos compostos fenólicos presentes no extrato

microencapsulado;

4. Realizar avaliação da atividade biológica in vitro do extrato microencapsulado;

5. Aplicar o extrato microencapsulado em um produto alimentício, por exemplo, sucos

ou bebidas isotônicas, e analisar a interação entre os compostos fenólicos e o produto

final. Paralelamente, avaliar as características sensoriais do produto desenvolvido;

6. Reproduzir o processo de microencapsulamento em escala piloto para obter dados para

ampliação de escala.

8 Referências

8. REFERÊNCIAS

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