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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A

DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE TUBERCULOSTÁTICOS (4-FDC) POR

CLAE/DAD E CLUE/DAD

AUTOR DISCENTE: MARCELO VÍTOR DE PAIVA AMORIM

ORIENTADOR: PROF. CÍCERO FLÁVIO SOARES ARAGÃO

NATAL-RN

2013

MARCELO VÍTOR DE PAIVA AMORIM

OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A

DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE TUBERCULOSTÁTICOS (4-FDC) POR

CLAE/DAD E CLUE/DAD

Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

NATAL-RN

2013

AGRADECIMENTOS

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Farmácia, de

fundamental importância para minha formação, especialmente ao meu orientador

Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão, por toda orientação, apoio e ensinamentos

fundamentais. Você contribuiu intensamente para a formação do meu conhecimento.

Obrigado!

As funcionárias do Programa de Pós-graduação em Farmácia, Fábia e

Aureliana, sempre gentis e prestativas, um apoio fundamental durante todo curso.

Aos colegas do laboratório de Controle de Qualidade do NUPLAM, Dayanne

Porto, Ana Angélica, Josinalva Silva, Liliane Cunha e Ingrid Queiroz pela amizade,

ajuda e apoio durante a realização deste trabalho.

Aos colegas de trabalho do NUPLAM, Anne, Andreza e Isabel, que me

apoiaram e me deram palavras de incentivo. Em especial ao Prof. Dr. Carlos Lima

pela amizade, incentivo, força e motivação, além de ter cedido às instalações do

laboratório e o apoio para a realização deste trabalho.

Gostaria de agradecer em especial aos meus colegas de laboratório do LCQ,

Profa. Dra. Ana Paula, Lilian, Thereza e Regina pelo apoio, amizade e troca de

experiências.

Aos meus amigos Bruno Gazola, Juliana Fernandes, Leonardo de Quadros,

Diego Dantas, Fabrícia Lima, Jessica Fonseca e Waldemar Alves pelo apoio,

companheirismo, amizade e todas as experiências que ajudaram a construir esse

caminho.

À minha querida família, pessoas maravilhosas que me acompanharam

sempre e me apoiaram. Em especial a João Batista, Juliene, Janaina e Leonardo,

meu alicerce e minha vida, que sempre me apoiaram durante toda caminhada.

Obrigado por todo carinho e amor, pelo incentivo para não desistir e seguir sempre

em frente. O otimismo de vocês me deu forças e me motivou a continuar sempre!

Obrigado, amo vocês.

Principalmente à Deus, por ter me concedido a graça da vida e a

oportunidade de concretizar mais um objetivo em minha vida.

E a todos aqui não citados, que de alguma forma contribuíram com uma

parcela especial para a realização deste trabalho.

RESUMO

A tuberculose é uma doença grave, porém curável em praticamente 100% dos casos

novos, desde que obedecidos os princípios da moderna quimioterapia. São

considerados fármacos de 1ª linha no tratamento à tuberculose: isoniazida,

pirazinamida, etambutol e rifampicina. De acordo com USP 33 - NF28 (2010) as

análises cromatográficas para 3 dos 4 fármacos (isoniazida, pirazinamida e

rifampicina) duram em média 15 minutos e mais 10 minutos para a obtenção do 4°

fármaco (etambutol) utilizando outra coluna, com outra mistura de fase móvel,

tornando esta aplicação na prática industrial desfavorável. Uma das alternativas é

utilizar o CLUE, o qual baseia-se nos mesmos princípios da CLAE, porém utiliza

fases estacionárias com partículas menores que 2 µm. Dessa forma pretende-se

com o presente estudo desenvolver e validar novos métodos analíticos para

determinação simultânea de tuberculostáticos por CLAE/DAD e CLUE/DAD. Para

isto, foi realizado um screening analítico, o qual verificou que é necessário um

gradiente de sistema de fase móvel A (tampão acetato:metanol 94:6 v/v) e B

(tampão acetato:acetonitrila 55:45 v/v). Posteriormente, ao desenvolvimento e

otimização do método em CLAE e CLUE com a obtenção dos valores de

adequabilidade do sistema dentro dos limites de aceitações vigente para ambos as

técnicas, as validações deram-se início. Soluções padrões e soluções testes dos

comprimidos foram preparadas e injetadas no CLAE e CLUE, contendo isoniazida,

pirazinamida, etambutol e rifampicina nas concentrações de 0,008, 0,043, 0,030 e

0,016 mg.mL-1, respectivamente. A validação dos métodos analíticos foram

realizadas para: especificidade / seletividade, intervalos da curva analítica,

linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão, precisão

(repetibilidade, precisão intermediária) e robustez. Os métodos foram adequados

para determinação dos 4 fármacos separadamente sem interferência nos demais.

Precisos, devido ao fato de que os métodos demonstraram que mesmo com

variação de dias, além da repetibilidade, os valores ficaram dentro da faixa

preconizada na legislação vigente. Lineares (R > 0,99), ou seja, os métodos foram

capazes de demonstrar que os resultados obtidos eram diretamente proporcionais à

concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Exatos,

uma vez que os métodos foram capazes de apresentar valores de coeficiente de

variação e porcentagem de recuperação dentro dos limites exigidos (98 a 102%). Os

métodos mostraram LD e LQ com níveis baixos demonstrando que os métodos

possuem elevada sensibilidade aos quarto fármacos. A robustez foi avaliada frente

às alterações de temperatura e fluxo, onde os métodos demonstraram-se robustos

apenas nas condições previamente estabelecidas de temperatura e fluxo, alterações

bruscas podem acarretar influência nos resultados dos métodos.

Palavras-Chave: Isoniazida, Pirazinamida, Etambutol, Rifampicina, Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência, Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência.

ABSTRACT

Tuberculosis is a serious disease, but curable in practically 100% of new cases,

since complied the principles of modern chemotherapy. Isoniazid (ISN), Rifampicin

(RIF), Pyrazinamide (PYR) and Chloride Ethambutol (ETA) are considered first line

drugs in the treatment of tuberculosis, by combining the highest level of efficiency

with acceptable degree of toxicity. Concerning USP 33 - NF28 (2010) the

chromatography analysis to 3 of 4 drugs (ISN, PYR and RIF) last in average 15

minutes and 10 minutes more to obtain the 4th drug (ETA) using a column and

mobile phase mixture different, becoming its industrial application unfavorable. Thus,

many studies have being carried out to minimize this problem. An alternative would

use the UFLC, which is based with the same principles of HPLC, however it uses

stationary phases with particles smaller than 2 µm. Therefore, this study goals to

develop and validate new analytical methods to determine simultaneously the drugs

by HPLC/DAD and UFLC/DAD. For this, a analytical screening was carried out,

which verified that is necessary a gradient of mobile phase system A (acetate

buffer:methanol 94:6 v/v) and B (acetate buffer:acetonitrile 55:45 v/v). Furthermore,

to the development and optimization of the method in HPLC and UFLC, with

achievement of the values of system suitability into the criteria limits required for both

techniques, the validations have began. Standard solutions and tablets test solutions

were prepared and injected into HPLC and UFLC, containing 0.008 mg/mL ISN,

0.043 mg/mL PYR, 0.030 mg.mL-1 ETA and 0.016 mg/mL RIF. The validation of

analytical methods for HPLC and UFLC was carried out with the determination of

specificity/selectivity, analytical curve, linearity, precision, limits of detection and

quantification, accuracy and robustness. The methods were adequate for

determination of 4 drugs separately without interfered with the others. Precise, due to

the fact of the methods demonstrated since with the days variation, besides the

repeatability, the values were into the level required by the regular agency. Linear

(R> 0,99), once the methods were capable to demonstrate results directly

proportional to the concentration of the analyte sample, within of specified range.

Accurate, once the methods were capable to present values of variation coefficient

and recovery percentage into the required limits (98 to 102%). The methods showed

LOD and LOQ very low showing the high sensitivity of the methods for the four drugs.

The robustness of the methods were evaluate, facing the temperature and flow

changes, where they showed robustness just with the preview conditions established

of temperature and flow, abrupt changes may influence with the results of methods.

Keywords: Isoniazid, Pyrazinamide, Ethambutol, Rifampicin, High Performance

Liquid Chromatography, Ultra Fast Liquid Chromatography.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura química dos quatro fármacos tuberculostáticos: isoniazida

(A), pirazinamida (B), etambutol (C) e rifampicina (D). .............................................. 23

Figura 2: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada de

isoniazida conforme alteração de pH. Gráfico gerado pelo MarvinSketcht. .............. 24

Figura 3: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada de

pirazinamida, conforme alteração de pH. Gráfico gerado pelo MarvinSketcht. ......... 26

Figura 4: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada do

etambutol, conforme alteração de pH. Gráfico gerado pelo MarvinSketcht. ............. 28

Figura 5: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada da

rifampicina, conforme alteração de pH. Gráfico gerado pelo MarvinSketcht. ............ 30

Figura 6: curva de Van Deemter para diferentes tamanhos de partículas (1,7; 3;

5 e 10 µm) (NOVÁKOVÁ et. al., 2006a). ................................................................... 34

Figura 9: Cromatogramas obtido por CLAE (A) Branco, (B) Solução teste dos

Excipientes, (C) Solução Padrão Isoniazida, (D) Solução Padrão de

Pirazinamida, (E) Solução Padrão de Etambutol, (F) Solução Padrão de

Rifampicina, (G) Solução Padrão dos quatros fármacos e (H) Solução teste de

comprimido do 4 em 1. Os picos representados como 1, 2, 3 e 4 correspondem a

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente. ........................ 62

Figura 10: Cromatogramas obtido por CLUE (A) Branco, (B) Solução teste dos

Excipientes, (C) Solução Padrão Isoniazida, (D) Solução Padrão de

Pirazinamida, (E) Solução Padrão de Etambutol, (F) Solução Padrão de

Rifampicina, (G) Solução Padrão dos quatros fármacos e (H) Solução teste de

comprimido do 4 em 1. Os picos representados como 1, 2, 3 e 4 correspondem a

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente. ........................ 63

Figura 11: Visão 3D dos espectros da solução padrão dos quatro fármacos

obtido por CLAE. ....................................................................................................... 64

Figura 12: Visão 3D dos espectros da solução padrão dos quatro fármacos

obtido por CLUE. ....................................................................................................... 64

Figura 13: Curvas analíticas das três injeções da solução padrão de isoniazida,

pirazinamida, etambutol e rifampicina por CLAE. ...................................................... 68

Figura 14: Gráficos da plotagem de resíduos dos fármacos por CLAE. .................... 70

Figura 15 - Curvas analíticas das três injeções da solução padrão de isoniazida,

pirazinamida, etambutol e rifampicina por CLUE. ..................................................... 73

Figura 16: Gráficos da plotagem de resíduos dos fármacos por CLUE. ................... 75

Figura 17: Cromatograma do Limite de Detecção Real pelo método 3 por CLAE.

Os picos de 1 a 4 representam isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina,

respectivamente. ....................................................................................................... 78

Figura 18: Cromatograma do Limite de Quantificação Real pelo método 3 por

CLAE. Os picos de 1 a 4 representam isoniazida, pirazinamida, etambutol e

rifampicina, respectivamente. .................................................................................... 78

Figura 19: Comparação dos cromatogramas entre CLUE (A) e CLAE (B) das

resultantes da solução padrão pela solução branco, Os picos de 1 a 4 referem-

se à isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente. ................ 93

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Condições cromatográficas para análise dos métodos analíticos 1 e 2

em CLAE. .................................................................................................................. 46

Tabela 2 - Condições cromatográficas para análise do método analítico 3 em

CLAE. ........................................................................................................................ 47

Tabela 3 - Condições cromatográficas para análise do método analítico 4 em

CLUE. ........................................................................................................................ 47

Tabela 4 – Concentrações de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina

para a linearidade dos métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente. ............ 51

Tabela 5 - Parâmetros de adequabilidade do sistema de solventes (métodos 1 e

2) por CLAE. .............................................................................................................. 57

Tabela 6 - Parâmetros de adequabilidade do sistema da especificidade da

solução padrão dos quatros fármacos pelo método 3 por CLAE. ............................. 65

Tabela 7 - Parâmetros de adequabilidade do sistema da especificidade da

solução padrão dos quatros fármacos pelo método 4 por CLUE. ............................. 65

Tabela 8 - Estudo da linearidade para os fármacos isoniazida e pirazinamida por

CLAE. ........................................................................................................................ 66

Tabela 9 - Estudo da linearidade para os fármacos etambutol e rifampicina por

CLAE. ........................................................................................................................ 67

Tabela 10 - Teste da ANOVA dos resultados obtidos na regressão linear dos

dados da linearidade das soluções padrão de isoniazida, pirazinamida,

etambutol e rifampicina por CLAE. ............................................................................ 69

Tabela 11 - Estudo da linearidade para os fármacos isoniazida e pirazinamida

por CLUE................................................................................................................... 71

Tabela 12 – Estudo da linearidade para os fármacos etambutol e rifampicina por

CLUE. ........................................................................................................................ 72

Tabela 13 - Teste da ANOVA dos resultados obtidos na regressão linear dos

dados da linearidade das soluções padrão de isoniazida, pirazinamida,

etambutol e rifampicina por CLUE. ............................................................................ 74

Tabela 14 – Estudo do LQ e LD dos quatros fármacos por CLAE e CLUE. .............. 77

Tabela 15 - Estudo da repetibilidade da solução padrão dos quatro fármacos por

CLAE. ........................................................................................................................ 79

Tabela 16 - Estudo da repetibilidade da solução padrão dos quatro fármacos por

CLUE. ........................................................................................................................ 80

Tabela 17 - Estudo da precisão intermediária nos dias 01 e 02 da solução teste

dos comprimidos por CLAE. ...................................................................................... 81

Tabela 18 - Estudo da precisão intermediária nos dias 01 e 02 da solução teste

do comprimido por CLUE. ......................................................................................... 81

Tabela 19 - Estudo da exatidão para isoniazida e pirazinamida por CLAE. .............. 83

Tabela 20 - Estudo da exatidão para etambutol e rifampicina por CLAE. ................. 84

Tabela 21 - Estudo da exatidão para isoniazida e pirazinamida por CLUE. .............. 85

Tabela 22 - Estudo da exatidão para etambutol e rifampicina por CLUE. ................. 86

Tabela 23 - Intervalo de recuperação do analito em função de sua concentração

na amostra. ............................................................................................................... 87

Tabela 24 - Adequabilidade do sistema no estudo da robustez da temperatura do

forno da coluna nos métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente. ................ 88

Tabela 25 - Adequabilidade do sistema no estudo da robustez do fluxo da fase

móvel nos métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente. ............................... 89

Tabela 26 - Estudo da validação dos métodos analíticos 3 e 4 para

tuberculostáticos por CLAE e CLUE, respectivamente. ............................................ 90

Tabela 27 - Estudo comparativo do volume gasto de fase móvel nas análises

entre CLAE e CLUE. ................................................................................................. 92

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ANOVA Análise de Variância

AOAC Association of Official Analytical Chemists

CDC Center for Disease Control and Prevention

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLUE Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência

CV Coeficiente de variação

DAD Detector de arranjo de fotodiodos

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Deoxyribonucleic acid

HETP Height Equivalent to a Theoretical Plate

ICH International Conference on Harmonisation

LD Limite de Detecção

LQ Limite de Quantificação

K Fator de capacidade

NUPLAM Núcleo de Pesquisa em Alimentos e Medicamentos

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

RE Resolução

RNA Ribonucleic acid

r Coeficiente de Correlação

SIDA Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida

SUS Sistema Único de Saúde

Tr Tempo de retenção

UV Ultravioleta

WHO World Health Organization

4-FDC 4 - Fixed Dose Combination

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 17

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................. 21

2.1 A tuberculose: situação atual no Brasil ......................................................... 21

2.2 Tratamento Farmacológico ........................................................................... 22

2.3 Tuberculostáticos ......................................................................................... 24

2.3.1 Isoniazida .................................................................................................. 24

2.3.2 Pirazinamida .............................................................................................. 25

2.3.3 Etambutol .................................................................................................. 27

2.3.4 Rifampicina ................................................................................................ 29

2.4 Métodos de cromatografia líquida ................................................................ 31

2.5 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) ....................................... 33

2.6 Adequabilidade do Sistema .......................................................................... 35

2.7 Validação de métodos analíticos .................................................................. 37

3 OBJETIVOS ............................................................................................................ 41

3.1 Objetivo Geral............................................................................................... 41

3.2 Objetivos Específicos ................................................................................... 41

4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 43

4.1 Materiais ....................................................................................................... 43

4.1.1 CLAE para o método 1 e 2 ........................................................................ 43

4.1.2 CLAE para o método 3 .............................................................................. 43

4.1.3 CLUE para o método 4 .............................................................................. 44

4.2 Métodos ........................................................................................................ 44

4.2.1 Preparação do Tampão Acetato ................................................................... 44

4.2.2 Preparação da solução padrão das substâncias químicas de referência

para análise por CLAE do método 1 e 2 ....................................................... 44


para análise por CLAE do método 3 e 4 ....................................................... 45

4.3 Sistema Gradiente por CLAE ....................................................................... 45

4.4 CLAE – DAD ................................................................................................ 46

15

4.4.1 Desenvolvimento do método 3 por CLAE .................................................. 46

4.4.2 Preparação do sistema de fases móveis para métodos 3 e 4 ................... 46

4.4.3 CLUE-DAD ................................................................................................ 47

4.5 Desenvolvimento e Validação de Métodos ................................................... 48

4.6 Validação do método analítico ..................................................................... 48

4.6.1 Especificidade e Seletividade: ................................................................... 48

4.6.2 Curva analítica/linearidade: ....................................................................... 50

4.6.3 Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediaria): .................................. 51

4.6.4 Exatidão para CLAE e CLUE. .................................................................... 52

4.6.5 Limite de quantificação para CLAE e CLUE. ............................................. 52

4.6.6 Limite de detecção para CLAE e CLUE. .................................................... 52

4.6.7 Robustez para CLAE e CLUE.................................................................... 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 54

5.1 Métodos 1 e 2 por CLAE .............................................................................. 54

5.2 Desenvolvimento do método 3 por CLAE ..................................................... 57

5.3 Desenvolvimento do método 4 por CLUE .................................................... 60

5.4 Validação do Método Analítico ..................................................................... 60

5.4.1 Especificidade/Seletividade ....................................................................... 60

5.4.2 Linearidade/curva analítica ........................................................................ 66

5.4.3 Limite de Detecção (LD) e Quantificação (LQ) .......................................... 75

5.4.4 Precisão ..................................................................................................... 79

5.4.5 Exatidão ..................................................................................................... 81

5.4.6 Robustez ................................................................................................... 88

5.6 Comparação entre CLAE e CLUE ................................................................ 91

6 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 94

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 97

16

INTRODUÇÃO

17

1 INTRODUÇÃO

A tuberculose é uma doença grave, porém curável em praticamente 100% dos

casos novos, desde que obedecidos os princípios da moderna quimioterapia. Para

assegurar a cura, é necessário que seja feita uma associação medicamentosa

adequada em doses corretas, uso por tempo suficiente, com supervisão da tomada dos

medicamentos (BRASIL, 2002).

Os esforços para combater a doença por meio do uso de drogas contra a

tuberculose não estão livres de problemas. Existe o desenvolvimento da resistência

das drogas de primeira linha, rifampicina e isoniazida. Segundo SINGH et. al. (2001), a

resistência aos tuberculostáticos ocorre principalmente devido à prescrição

inapropriada ou a tomada de medicamentos, resultando em uma monoterapia, por este

motivo, a utilização dos fármacos em combinação, poderia possibilitar a redução da

prática da monoterapia.

Em virtude da frequência crescente de resistência, os Centers for Disease

Control and Prevention (CDC) nos EUA recomendaram que a terapia inicial consistisse

em um esquema de 4 fármacos (isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol ou

estreptomicina), enquanto se aguarda os resultados dos testes de sensibilidade

(BRASIL, 2002).

O tratamento da tuberculose é longo (mínimo de 6 meses) e por este motivo há

vários quadros de abandono do tratamento. Um estudo feito em 2002 (RABAHI et. al.,

2002), mostrou que a incidência global de não aderência foi de 5,1 abandonos por 100

pessoas/mês. Isto equivale a 27,3% de abandono entre todos aqueles que fizeram

tratamento nos anos de 1998, 1999 e 2000, resultado concordante com outros estudos,

cujos porcentuais encontrados variam entre 6,8% e 33,8%. Entre os fatores que podem

influenciar o abandono ao tratamento estão as variáveis relacionadas ao serviço de

saúde, ao médico e ao doente (RIBEIRO, 2000). A falha da quimioterapia pode ser

causada por (1) terapia irregular ou inadequada, resultando em micobactérias

persistentes ou resistentes, devido a pouca adesão do paciente ao esquema

terapêutico prolongado; (2) uso de um único fármaco, com necessidade de interrupção

devido à ocorrência de toxicidade ou hipersensibilidade, (3) esquema inicial

inadequado; ou (4) resistência primária do microorganismo.

18

Devido a isso, o Ministério da Saúde recomenda modificações no tratamento

para a tuberculose implementado pelo Programa Nacional de Controle da Tuberculose

(PNCT)/Ministério da Saúde (BRASIL, 2009).

A primeira mudança consiste na introdução do etambutol como o quarto fármaco

na fase intensiva de tratamento (dois primeiros meses) do esquema básico, e tem

como justificativa a constatação do aumento da resistência primária à isoniazida (de 4,4

para 6,0%) e a resistência primária à isoniazida associada à rifampicina (de 1,1 para

1,4%), observado no II Inquérito Nacional de resistência aos fármacos anti-TB realizado

em 2007-2008, em comparação com os resultados do I Inquérito Nacional, realizado no

período de 1995 a 1997 (BRASIL, 2009).

A segunda mudança consiste em introduzir a apresentação em comprimidos

com dose fixa combinada dos 4 fármacos (conhecidos como 4 em 1) para a fase

intensiva do tratamento. Os comprimidos são formulados com doses reduzidas de

Isoniazida e Pirazinamida em relação às atualmente utilizadas no Brasil.

O esquema básico do 4 em 1 é mundialmente utilizado, com excelentes

resultados quanto à efetividade, em particular pela maior adesão ao tratamento.

Espera-se que a introdução do quarto fármaco (etambutol) possibilite o aumento do

sucesso terapêutico e possa evitar o aumento da multirresistência (resistência a

rifampicina + isoniazida), além de fomentar um maior conforto ao paciente, pela

redução do número de comprimidos a serem ingeridos (BRASIL, 2009).

De acordo com USP 33 - NF28 (2010) as análises cromatográficas para os

fármacos pertencentes ao medicamento 4 em 1 duram em média 15 minutos, para a

detecção de três fármacos (isoniazida, pirazinamida e rifampicina) em um método

analítico e mais 10 minutos para a detecção do quarto fármaco (etambutol) em outro

método analítico. O mesmo ocorre com a monografia, para os quatro fármacos,

existente na Farmacopeia Internacional (WHO, 2006), a qual também relata a

existência de dois métodos analíticos de separação para um mesmo produto, o que os

tornam demorados, em aplicação de rotina, especialmente quando muitos lotes do 4

em 1 precisam ser analisados em curto período de tempo, o que normalmente ocorre

nas indústrias de medicamentos presentes nos países em desenvolvimento, os quais a

tuberculose é ainda um problema de saúde.

Como objetivo, a indústria farmacêutica visa aperfeiçoar técnicas para o maior e

melhor desempenho de suas análises em um curto espaço de tempo.

19

Há relatos na literatura da presença de métodos analíticos para identificação e

quantificação simultânea dos quatros fármacos em diversas técnicas, como

eletroforese de zona capilar (FARIA et. al., 2010), cromatografia em camada delgada

de alta performance (SHEWIYO et. al., 2012), entre outros. No entanto, na literatura

não foi encontrado nenhum estudo qualitativo e quantitativo por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência (CLAE) e Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE). Por esta

razão, com o presente trabalho teve-se o propósito de desenvolver, otimizar e validar

um método para determinação simultânea de tuberculostáticos por CLAE e CLUE.

Desta forma considerando a natureza do estudo e os métodos empregados para

o seu desenvolvimento, este trabalho foi organizado em quatro partes:

Desenvolvimento e otimização de método por CLAE;

Validação do método por CLAE;

Desenvolvimento e otimização de método por CLUE;

Validação do método por CLUE.

20

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

21

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 A tuberculose: situação atual no Brasil

A tuberculose pulmonar é uma doença de amplitude mundial, cujo principal

agente etiológico é o bacilo da Mycobacterium tuberculosis, identificado em 1882 por

Robert Kock. Esta enfermidade pode resultar da reativação de uma primo-infecção

passada ou pode ser decorrente de uma infecção recentemente adquirida (FLOXMAN

& RILEY, 2001). A predisposição à doença deve-se à interação entre fatores genéticos

e ambientais. Desde o início do século XX, a tuberculose se constitui em uma das

causas mais frequentes de morte nas regiões geográficas de clima temperado e a

segunda, depois da febre amarela, nas regiões tropicais. Após um longo período de

latência, a tuberculose pulmonar ressurge nos anos 80, tendo como pano de fundo

para explicar o seu retorno, tanto a sua presença em indivíduos com a Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (DALCOMO, 2000), quanto os problemas conjunturais

ligados à política econômica neoliberal que aumentou a diferença entre países

desenvolvidos e em desenvolvimento, favorecendo a sua inserção neste abismo social

(SENADO-DUMOY, 1999).

Estima-se que cerca de 3 milhões de pessoas morram por ano em consequência

da tuberculose pulmonar, número este superior às mortes por Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (SIDA), malária, diarreia, lepra e todas as outras doenças

tropicais combinadas (ZUMLA & GRANGE, 1998). No Brasil foram registradas mais de

100.000 mortes entre 1974 e 1995, tendo como fatores de risco consagrados pela

literatura, o etilismo, o tabagismo, o abandono do tratamento, e doenças debilitantes,

tais como o diabetes mellitus e a SIDA, além da desnutrição (BRASIL, 1997) e as

condições sócio-econômicas (VICENTIN et. al., 2002). Entre os principais fatores

relacionados com o desfecho da tuberculose pulmonar está a adesão ao tratamento,

que tanto pode ser responsável pela cura, quanto pelos casos de recidiva, tuberculose

pulmonar multirresistente ou morte.

22

2.2 Tratamento Farmacológico

A tuberculose é um dos maiores problemas de saúde global devido a sua fácil

forma de contágio, principalmente pelo ar. Embora a doença possa atingir qualquer

órgão do corpo, o bacilo se reproduz e cresce rapidamente em áreas com elevadas

concentrações de oxigênio, o que explica a maior frequência de ataques nos pulmões

(NEVES et al., 2012).

O tratamento da tuberculose pulmonar é longo (mínimo de seis meses). Entre os

fatores que podem influenciar o abandono ao tratamento estão as variáveis

relacionadas ao serviço de saúde, ao médico e ao doente (RIBEIRO, 2000). Por sua

vez, a recidiva tem como principal fator relacionado o esquema terapêutico não aderido

pelo paciente (OLIVEIRA & MOREIRA, 2000a).

Estudos feitos constataram que as chances de recidiva eram 17,6 vezes maiores

naqueles que abandonavam o esquema, principalmente por efeitos adversos ao

medicamento (OLIVEIRA & MOREIRA, 2000b).

Outros estudos mostraram que entre as condições associadas à Tuberculose

pulmonar multirresistente, em 45% dos casos, constatou-se o abandono ou

irregularidade na terapêutica (MELO et. al., 2003).

São considerados fármacos de 1ª linha no tratamento à tuberculose por

combinarem o maior nível de eficácia com grau aceitável de toxicidade: isoniazida,

rifampicina, etambutol, estreptomicina e pirazinamida. O tratamento para os casos

iniciais de tuberculose pulmonar se faz com isoniazida, rifampicina e pirazinamida,

durantes os 2 primeiros meses, e isoniazida e rifampicina por mais 4 meses. Suas

estruturas estão apresentadas na figura 1.

23

A

B

C

D

Figura 1 - Estrutura química dos quatro fármacos tuberculostáticos: isoniazida (A), pirazinamida

(B), etambutol (C) e rifampicina (D).

24

2.3 Tuberculostáticos

2.3.1 Isoniazida

A isoniazida é a hidrazida do ácido isonicotínico, descoberta em 1945 por

Chorine (MANDEL & PETRI, 1996). Sua fórmula química é C6H7N3O, possui peso

molecular de 137,14 g/mol, sua nomenclatura oficial: 4-hidrazida ácida

piridincarboxilica. Apresenta-se como um pó cristalino branco, solúvel em água,

ligeiramente solúvel em etanol e praticamente insolúvel em éter e benzeno. Suas

soluções em água a 10% possuem pH de 6,0 a 7,5. Apresenta valores de pka de 2,0 e

3,5. É pouco estável em H2O e muito estável em DMSO. Possui absorção máxima em

266, 265 nm (em HCl 0,01N) (MERCK, 2006; USP, 2010; MARTINDALE, 2007).

Na Figura 2 são demonstradas as quatro espécies ionizadas e a não-ionizada da

isoniazida, quando ocorre alteração de pH.

Figura 2: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada de isoniazida

conforme alteração de pH. Gráfico gerado pelo MarvinSketcht.

25

Dentre as formas apresentadas na Figura 2, o gráfico de cor alaranjada

representa a forma não-ionizada da molécula de isoniazida.

2.3.1.1 Mecanismo de Ação

Isoniazida é um fármaco conhecido por ser altamente ativo contra o

Mycobacterium tuberculosis e por ter outras atividades contra outras micobactérias

incluindo M. kansaii. É considerado como um bacteriostático contra organismos semi-

adormecidos e é menos eficaz do que a rifampicina e a pirazinamida (MARTINDALE,

2007).

Parece atuar pela inibição da síntese de ácido micólico, componente essencial

da parede celular das micobactérias, o que explicaria sua elevada seletividade sobre

este tipo de bactérias (TAKAYAMA et al., 1975). TIMMINS et al. (2004), sustentam que

metabólitos da isoniazida inibem enzimas chaves na respiração da micobactérias

aumentando seu poder bactericida.

M. tuberculosis adquire resistência rapidamente se somente a isoniazida for

utilizada no tratamento da infecção clínica. Pode ser ocasionado devido algumas cepas

perderem o gene para a produção da catalase. A resistência pode ser retardada se o

uso combinado da Isoniazida com outros anti-micobaterianos forem utilizados. A

resistência não é adquirida em casos de uso da isoniazida como profilático,

provavelmente devido à baixa carga da bactéria (MARTINDALE, 2007).

2.3.2 Pirazinamida

Foi descoberta durante a investigação de análogos da nicotinamida. É um

análogo pirazínico sintético da mesma; sua fórmula química é C5H5N3O, seu peso

molecular é de 123,11 g/mol, seu nome oficial é: pirazinacarboxiamida. Apresenta-se

em forma de pó cristalino praticamente branco a branco e inodoro. É solúvel em 1 para

67 partes de água, 1 para 175 partes de álcool desidratado, 1 para 135 partes de

clorofórmio, 1 para 1000 partes de éter, 1 para 72 partes em metanol e levemente

solúvel em álcool. Apresenta valor de pKa de 0,50 e possui absorção máxima em 269

nm (MERCK, 2006; USP, 2010).

26

Na Figura 3 são demonstradas as duas espécies ionizadas e a não-ionizada da

pirazinamida, quando ocorre alteração de pH.

Figura 3: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada de pirazinamida,



representa a forma não-ionizada da molécula da pirazinamida.


Pirazinamida tem efeito bactericida contra a M. tuberculosis, mas aparenta ter

nenhuma atividade contra outras micobactérias ou microorganismos in vitro. Ela é

27

quase que completamente inativa em pH neutro, mas é eficaz contra bacilos tubérculos

persistentes dentro de ambientes intracelulares acidificados dos macrófagos.

As respostas inflamatórias da quimioterapia aumentam o número de organismos

em ambientes acidificados. Assim que a inflamação desaparece e o pH aumenta, a

atividade esterilizante da pirazinamida diminui. Essa atividade pH dependente explica a

efetividade clínica da pirazinamida como parte inicial da fase de 8 semanas em um

regime de tratamento de curto prazo. A resistência contra a pirazinamida é adquirida

quando somente ela for utilizada no tratamento (MARTINDALE, 2007).

2.3.3 Etambutol

Apresenta-se em forma de pó cristalino branco, livremente solúvel em água e

solúvel em álcool etílico e metílico. Levemente solúvel em clorofórmio e éter (USP,

2010).

Etambutol é uma base fraca. A 20°C, apresenta pKa de 6,3, 6,6 e 9,5. Uma

solução a 2% em água tem um pH de 3,7 a 4,0 (MARTINDALE, 2007).

Na Figura 4 são demonstradas as quatro espécies ionizadas e a não-ionizada do

etambutol, quando ocorre alteração de pH.

28

Figura 4: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada do etambutol,



representa a forma não-ionizada da molécula do etambutol.


Etambutol é um bacteriostático ativo contra o crescimento do bacilo M.

tuberculosis. Os ácidos micólicos se agrupam aos grupos 5′-hidroxil dos resíduos de D-

arabinose da arabinogalactano e formam um complexo micolil-arabinogalactano-

peptidoglicano localizado na parede da célula. Etambutol inibe a síntese do

arabinogalactano pela inibição da arabinosiltransferase, especialmente às ligadas ao

Mycobacterium, impedindo, assim, o aumento da permeabilidade da parede celular

(CHEN et al., 2012). Cepas resistentes de M. tuberculosis são produzidas se o

etambutol é utilizado sozinho.

29

2.3.4 Rifampicina

A rifampicina é um fármaco semi-sintético, formado pela reação da 3-

formilrifampicina com a 1-amino-4-metilpiperazina em tetrahidrofurano (MERCK,

2006).

Esta molécula é caracterizada por conter uma cadeia alifática formando uma

ponte entre duas posições não adjacentes de um núcleo aromático. Sua fórmula

química e C43H58N4O12; possui peso molecular de 822.95 g/mol; seu nome oficial é 3-

[[(4-metil- 1-piperazinil)imino]metil]rifamicina (MERCK, 2006; MARTINDALE, 2007).

Apresenta-se como um pó cristalino, vermelho alaranjado. Pouco solúvel em

H2O e acetona, solúvel em acetato de etila, metanol, tetrahidrofurano (THF) e

facilmente solúvel em clorofórmio e DMSO. Apresenta absorção máxima em 237, 255,

334 e 475 nm (0,002 mg/mL em tampão fosfato pH 7,4). Suas suspensões de 1% em

água apresentam pH entre 4,5 a 6,5. Possui dois valores de pka, sendo o primeiro de

1,7 referente à hidroxila da posição quatro, e o segundo de 7,9 referente ao “N” 3 da

piperazina. Para conservar deve-se armazenar em temperatura que não exceda 40°C e

proteger da luz (MERCK, 2006).

Na Figura 5 são demonstradas as espécies ionizadas e a não-ionizada do

rifampicina, quando ocorre alteração de pH.

30

Figura 5: Esquema de distribuição de espécies ionizadas e não-ionizada da rifampicina,


Dentre as formas apresentadas na Figura 5 o gráfico de cor alaranjada

representa a forma não-ionizada da molécula da rifampicina.

A rifampicina possui dois polimorfos, forma I e II, os quais podem ser

responsáveis pelas diferentes pontes de hidrogênios, mudanças conformacionais e

estados ionizados, os quais permitem formar diferentes estruturas cristalinas

(HEWOOD et. al., 2000).

Desta forma, o parâmetro de polimorfismo da rifampicina deve ser bem

elucidado para que a forma mais apropriada seja utilizada nas formulações. Tal fato foi

confirmado por FREIRE et. al. (2009), onde a partir de dados de estabilidade térmica, a

mistura binária de diferentes polimorfos de rifampicina em formulações de isoniazida e

rifampicina indicaram diferentes perfis de estabilidade térmica, quando comparado com

o estudo do fármaco sozinho.

31


A rifampicina possui atividade bactericida contra uma ampla quantidade de

microorganismos e interfere na síntese de ácido nucleico por inibição do RNA

polimerase dependente de DNA. Tem a habilidade de promover a morte de

microorganismos intracelulares. Inclui atividade contra a M. tuberculosis e a M. leprae.

Possui a habilidade de eliminar organismos semi-adormecidos e persistentes.

Rifampicina possui ação contra gram-positivos, especialmente estafilococos, porém

menos ativo contra gram-negativos, sendo N. meningitidis, N. gonorrhoeae, H.

influenzae e Legionella spp. Também possui atividade contra C. trachomatis e contra

algumas bactérias anaeróbias (MARTINDALE, 2007).

Em elevadas concentrações, possui atividade contra vírus. Não possui atividade

contra fungos, no entanto tem sido relatado o aumento da atividade antifúngica da

anfotericina B. Uso com outros antimicrobianos pode aumentar ou antagonizar a

atividade bactericida da rifampicina (MARTINDALE, 2007).

Cepas de M. tuberculosis, M. leprae e outras bactérias susceptíveis tem

demonstrado resistência, no inicio e durante o tratamento. Portanto, no tratamento da

tuberculose, a rifampicina é utilizada em combinação com outro antimicrobiano para

retardar ou prevenir a resistência (MARTINDALE, 2007).

2.4 Métodos de cromatografia líquida

Cromatografia é um método comum empregado para separar uma fração

constituinte de uma mistura. A técnica de separação é normalmente baseada na

diferença de afinidade dos constituintes de uma amostra que flui através de uma fase

móvel, em comparação a uma fase estacionária. Desde 1906 quando a cromatografia

foi primeiramente definida, diversas técnicas têm sido usadas com sucesso na

pesquisa e na indústria, com diferentes tipos de usos e objetivos (THERMO, 2006).

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica cromatográfica

líquida amplamente utilizada que emprega alta pressão de fluxo de um líquido para

alcançar elevada resolução de separação. Devido à dinâmica da natureza, CLAE tem

32

sido utilizado em amplo campo, mas especificamente em análises farmacêuticas. A

cromatografia em fase reversa é o tipo mais comum de CLAE e é amplamente utilizada

para separar constituintes muito similares. Essa técnica geralmente emprega colunas

não-polares, comumente C-18, com solventes polares constituintes da fase móvel

(THERMO, 2006).

Quando se fala em análises farmacêuticas, a CLAE tem sido considerada líder

das tecnologias por mais de 30 anos. Tem como característica sinais quantitativos com

precisão e exatidão confiáveis, versatilidade, poder de resolução, robustez, de fácil uso

e boa compatibilidade com detectores UV e de espectrometria de massa (PIETERS et.

al., 2010).

Outras aplicações que a cromatografia pode ser usada na indústria farmacêutica

incluem: proteômica, desenvolvimento de fármacos, formulação de medicamentos e

métodos de controle de qualidade (THERMO, 2006).

O uso da CLAE para análise de fármacos vem sendo alvo de pesquisas durante

anos e vem sendo relatadas em artigos científicos, bem como em monografias nas

farmacopeias, por ser considerada uma técnica sensível e com elevada precisão e

exatidão.

SHEWIYO et. al. (2012) relata que métodos quantitativos validados baseados

em CLAE, cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE) e

espectrofotometria UV/Vis vem sendo relatadas na literatura para a identificação e

doseamento dos fármacos pertencentes ao 4 em 1 em formulações e em fluidos

biológicos. No entanto, a maioria dos métodos destacam apenas estudos individuais,

ou apenas em combinação de dois ou três fármacos, não havendo ainda publicações

de métodos para a determinação simultânea dos quatros fármacos.

Eficiência e velocidade tem se tornado de grande importância na área de

cromatografia líquida, tanto para Farmácia, Toxicologia ou Análises Clínicas, as quais

necessitam de melhorar o rendimento e reduzir os custos das análises (NOVÁKOVÁ et.

al., 2006a).

Usando o CLAE, o método mais simples de reduzir uma corrida analítica é

utilizar colunas mais curtas e aumentar a velocidade do fluxo. Este método pode ser

arriscado devido às misturas complexas dos compostos não serem separados

suficientemente e a eficiência da coluna acaba tornando-se menor. Um segundo modo

para diminuir o tempo de análise é diminuir o tamanho das partículas. Isto permite uma

33

análise mais rápida com alta eficiência, porém o lado negativo é a elevação da pressão

a valores superiores àqueles aceitáveis em sistemas de CLAE e colunas

convencionais. Fases estacionárias feitas de sílicas podem resistir a pressões acima de

30 MPa. Um terceiro modo é aumentar a temperatura. A viscosidade da fase móvel é

reduzida quando a temperatura é elevada e desta forma reforça a difusividade e a

coluna opera com níveis de fluxos maiores, assim, colunas mais longas e partículas

menores poderiam ser utilizadas. A desvantagem desta técnica seria a baixa

estabilidade de alguns compostos em temperaturas elevadas (NOVÁKOVÁ et. al.,

2006a).

Uma das alternativas para solucionar o problema seria a de utilizar a

Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência.

2.5 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE)

Um sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) é um dos

avanços mais recente das técnicas de separação, baseia-se nos mesmos princípios da

cromatografia líquida de alta eficiência, porém utiliza fases estacionárias com partículas

menores que 2 µm. O uso destas partículas juntamente com a alta velocidade linear da

fase móvel aumentam a resolução, a detecção e diminuem o tempo das análises (WU

et. al., 2008). Os ajustes nos sistemas envolvem uma bomba binária de alta fluidez, a

qual será capaz de trabalhar com pressões acima de 100 MPa (15.000 psi ou 400 kgf)

(NOVÁKOVÁ et. al.,2006b; PIETERS et. al.,2010).

As modificações requeridas em um sistema de CLUE são: capacidade de

trabalhar a pressões muito altas (100 MPa), volumes internos muito menores

(conexões, alça de amostragem, cela do detector, bombas), celas do detector sem

dispersão e com alta taxa de aquisição, melhoramento no sistema de controle e de

dados, colunas resistentes para trabalharem com altas pressões e com baixo volume

morto, injetores com precisão na faixa de volumes pequenos (MALDANE & JARDIM,

2009).

Quando comparado ao CLAE em questão de eficiência de análise, PIETERS et

al. (2010) relata que mesmo em condições isocráticas e em gradientes, o CLUE

preserva as elevadas resoluções quando ocorre um aumento drástico de velocidade de

análise.

34

De acordo com a equação de Van Deemter, a eficiência da cromatografia é

proporcional à diminuição do tamanho de partícula. De acordo com este modelo (Figura

6), o qual descreve a relação entre a altura equivalente dos pratos teóricos (HETP) e a

velocidade linear, um dos termos é dependente da granulometria da coluna analítica.

Diâmetros de partículas menores podem significativamente reduzir o HETP, produzindo

resultados de maior eficiência e um perfil mais plano da curva de Van Deemter.

Consequentemente, o aumento do fluxo da fase móvel não influencia negativamente a

eficiência, como observado em colunas para uso em CLAE, as quais possuem

diâmetro interno de partículas em torno de 5 a 10μm (NOVÁKOVÁ et. al., 2006a). E

quando se utiliza colunas de menor diâmetro interno em CLAE, o mesmo eleva muito a

pressão, deixando o sistema instável e diminuindo o tempo de utilidade das colunas.

Figura 6: curva de Van Deemter para diferentes tamanhos de partículas (1,7; 3; 5 e 10 µm)

(NOVÁKOVÁ et. al., 2006a).

NUGYEN et al. (2008) descreve uma transferência de um método convencional

já descrito na farmacopeia americana para o doseamento de comprimidos contendo

isoniazida, pirazinamida e rifampicina por CLAE, onde ocorreu uma diminuição do

tempo de análise requerido de 15 minutos para 2 minutos quando o método foi

35

transferido para o CLUE e que o tempo poderia ser reduzido ainda mais se o método

fosse utilizado com elevadas temperaturas (90°C).

No entanto, as farmacopeias ou monografias oficiais ainda não relatam o uso de

aparelhos mais sensíveis em análises farmacêuticas, como o CLUE. Desta forma,

propõe-se utilizar o CLUE-DAD para validar um método inovador na detecção em

plasma humano de fármacos tuberculostáticos (Isoniazida, Pirazinamida, Etambutol e

Rifampicina) e seus produtos de degradação frente a alterações físico-químicas com o

intuito de obter resultados mais confiáveis e eficientes, tendo em vista a grande

influência que os fármacos apresentam em contato com agentes externos e internos.

2.6 Adequabilidade do Sistema

Adequabilidade do sistema é amplamente conhecido como um componente

crítico em análises químicas e é frequentemente referenciado em guias e documentos

das agências regulatórias (BRISCOE et. al., 2007). Testar a adequabilidade do sistema

é parte integrante de muitos procedimentos analíticos. Os testes são baseados no

conceito de que o equipamento, a parte eletrônica, operações analíticas e as amostras

são analisadas e constituem um sistema integral que pode ser avaliado. Os parâmetros

de adequabilidade do sistema são estabelecidos a partir de procedimentos que

dependem do tipo de análise que está sendo validada (ICH, 1995).

Eficiência aparente, fator de retenção, resolução, retenção relativa, fator de

cauda são parâmetros geralmente empregados para assegurar o desempenho da

coluna. Os critérios de adequabilidade do sistema são requeridos nos procedimentos

cromatográficos e, estes dependem de diversos fatores, tais como a frequência do uso

do método, bem como o uso frequente do sistema cromatográfico. Dessa forma o

analista deve escolher uma forma adequada de monitorar os critérios (BRITISH, 2010).

O número de pratos teóricos, N, é indicativo da eficiência da coluna. Pode ser

expresso em números de pratos teóricos por coluna ou número de pratos teóricos por

metro. Seu valor depende da substância a ser analisada e das condições de análise

como fase móvel, temperatura e fase estacionária (BRASIL, 2010a; BRITISH, 2010).

Seu cálculo está diretamente relacionado ao quadrado do tempo de retenção e

inversamente ao quadrado da largura do pico, de acordo com a fórmula:

36

Onde:

t = tempo de retenção do pico;

W = largura do pico;

Wh/2 = largura à meia altura do pico.

A resolução, R, é o parâmetro cromatográfico que indica o grau de separação

entre duas substâncias em uma mistura (BRASIL, 2010a; BRITISH, 2010), devendo a

mesma apresentar valores acima de 2. A resolução é calculada seguindo a fórmula:

Onde:

t1 e t2 = tempo de retenção das duas substâncias na mistura;

W1 e W2 = larguras dos picos na linha de base;

W1,h/2 e W2,h/2 = às larguras dos picos à meia altura.

O fator de cauda, T, indica a simetria do pico, apresentando valor igual a 1

quando o pico for perfeitamente simétrico (BRASIL, 2010a; BRITISH, 2010). Valores

acima de 2 torna o pico inadequado. Este fator pode ser calculado pela expressão:

Onde:

W0,05 = largura do pico a 5% da altura;

f = valor da porção anterior do pico, em relação à largura a 5% da altura.

O fator de retenção, k, defini-se como a razão da quantidade de substância com

afinidade pela fase estacionária e quantidade com afinidade pela fase móvel (BRASIL,

2010a; BRITISH, 2010). O mesmo para se mostrar adequado, deve apresentar valores

acima de 2 e pode ser calculado por:

37

Onde:

k = fator de retenção;

t0 = tempo morto;

t = tempo de retenção da substância analisada.

2.7 Validação de métodos analíticos

Cada vez mais são reconhecidos e exigidos aspectos como comparabilidade,

rastreabilidade e confiabilidade, para apontar a qualidade das medições realizadas no

laboratório, já que resultados não confiáveis podem acarretar em decisões errôneas

acerca das características do produto ocasionando prejuízo à saúde do usuário

(RIBANI et. al., 2004). Para garantir que métodos analíticos e bioanalíticos gerem

informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra testada, ele deve sofrer uma

avaliação denominada validação (LIMA, 2006).

Validação de métodos analíticos e bioanalíticos constitui-se como um ato

documentado que atesta se qualquer procedimento, processo, equipamento, material,

operação ou sistema realmente conduza aos resultados esperados. Portanto a

validação de procedimentos analíticos e bioanalíticos tem por objetivo demonstrar que

os métodos de ensaio utilizados apresentam resultados que permitam avaliar a

qualidade dos medicamentos, conforme os parâmetros especificados (BRASIL, 2003;

SWARTZ & KRULL, 1997).

A RDC N°17/2010, conceitua a validação como “ato documentado que atesta

que qualquer procedimento, processo, equipamento, material, atividade ou sistema

realmente e consistentemente leva aos resultados esperados”. Direcionando para os

métodos analíticos, a validação objetiva demonstrar que o método é adequado para a

finalidade a que se destina, assegurando assim a confiabilidade dos resultados

(BRASIL, 2010b; BRASIL, 2003).

A validação de um método analítico constitui um ponto vital para assegurar a

capacidade analítica, para isso o processo deve ser bem documentado e empregar

38

ferramentas estatísticas capazes de comprovar a veracidade das respostas analíticas

obtidas (BARROS, 2002). Diversas organizações nacionais e internacionais

disponibilizam diretrizes para a validação de métodos analíticos.

De acordo com a resolução (RE) N° 899/2003 (BRASIL, 2003), a validação deve

garantir através de estudos experimentais que o método atenda às exigências das

aplicações analíticas. Contudo, para realização da validação de um método analítico,

alguns parâmetros ou características de desempenho devem ser atendidos de acordo

com o método a ser analisado. Dentre eles temos: linearidade; faixa de trabalho;

intervalo; precisão; sensibilidade; exatidão; limite de quantificação e detecção; robustez

(BRITO et. al., 2003; INMETRO, 2003; BRASIL, 2003; RIBANI et. al., 2004).

Nos ensaios de linearidade, recomenda-se na RE N° 899/2003 que sejam

analisadas no mínimo cinco concentrações diferentes, variando de 80 a 120% da

concentração teórica do teste para determinação quantitativa do analito em matérias-

primas e formas farmacêuticas. Deve ser determinado o coeficiente de correlação, cujo

critério mínimo aceitável é de 0,99, e as respectivas curvas.

O intervalo ou faixa de trabalho é a faixa entre os limites de quantificação

superior e inferior de um método analítico onde foi demonstrado ser possível a

determinação com precisão, exatidão e linearidade exigidas, sob as condições

especificadas para o ensaio (BRASIL, 2003; INMETRO, 2003).

Pela precisão avalia-se a dispersão dos resultados entre ensaios independentes,

repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições

definidas (INMETRO, 2003). É considerada em três níveis: repetibilidade, feita em 3

concentrações (alta, média e baixa) e cada concentração em triplicata; precisão

intermediária, onde se recomenda um mínimo de dois dias diferentes com analistas

diferentes; e reprodutibilidade, em laboratórios diferentes (BRASIL, 2003).

A exatidão é expressa pela proximidade dos resultados obtidos com o valor

verdadeiro, sendo determinada após a linearidade. A robustez de um método é

avaliada durante o seu desenvolvimento, constatando a susceptibilidade do método

frente a pequenas e deliberadas variações nas condições analíticas (BRASIL, 2003).

Segundo KAMINSK e colaboradores (2009), é imprescindível assegurar que o

equipamento ou sistema analítico esteja adequadamente desenhado, calibrado e

testado antes de realizar a validação do método analítico. Este processo é conhecido

como qualificação do sistema analítico (KAMINSK et. al., 2009). A qualidade dos dados

39

analíticos representa um fator significante no processo de desenvolvimento de um

medicamento, portanto, a validação acarreta impacto direto na qualidade desses dados

(VALENTINI et. al., 2009).

É importante salientar que, segundo a RE N° 899/2003, um método descrito ou

não em farmacopeias ou formulários oficiais reconhecidos pela ANVISA, é necessário

validar seguindo um conjunto de parâmetros propostos pela ANVISA para cada

categoria de métodos analíticos (BRASIL, 2003).

40

OBJETIVOS

41

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Desenvolver, otimizar e validar método para determinação simultânea de

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina (4-FDC) por CLAE/DAD e CLUE/DAD.

3.2 Objetivos Específicos

Desenvolver sistema gradiente para detecção dos fármacos em CLAE/DAD;

otimizar e desenvolver método analítico para detecção simultânea de

tuberculostáticos por CLAE/DAD;

validar método analítico para analise simultânea de tuberculostáticos em CLAE e

CLUE, ambos DAD.

42

MATERIAL E MÉTODOS

43

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Materiais

As substâncias químicas de referência farmacopéica de isoniazida (pureza

100%), pirazinamida (pureza 99,5%), etambutol (pureza 100%) e rifampicina (pureza

98,5%) foram adquiridos da USP. Os reagentes grau-CLAE: metanol e acetonitrila

foram adquiridos da VETEC e J.T.BAKER, respectivamente. O Acetato de Amônio,

Acetato de Cobre II Monohidratado e Ácido Acético PA foram adquiridos da VETEC.

Água ultra-purificada foi obtida com o purificador de água Milli-Q Advantage® A10 do

NUPLAM/UFRN. Os comprimidos do 4 em 1 foram obtidos pelo NUPLAM/UFRN.

4.1.1 CLAE para o método 1 e 2

Os cromatogramas foram obtidos em um cromatógrafo Shimadzu, sistema de

bomba quaternário LC-20AT (Shimadzu, Tóquio, Japão) equipado com um

degaseificador (DGU-20A5), auto-amostrador SIL-20A, forno da coluna CTP-20A,

detector DAD SPD-M20A. A coluna do HPLC inicialmente utilizada foi uma Nucleosil

C18 da Macherey-Nagel (250 x 4.6 mm d. i.; diâmetro da partícula 5 m; granulometria

de 100 Å) com coluna guarda C-18 (Shimadzu Corporation, Tóquio, Japão).

4.1.2 CLAE para o método 3

Os cromatogramas foram obtidos em um cromatógrafo Shimadzu, sistema de

bomba quaternário LC-20AT (Shimadzu, Tóquio, Japão) equipado com um

degaseificador (DGU-20A5), auto-amostrador SIL-20A, forno da coluna CTP-20A,

detector DAD SPD-M20A. A coluna utilizada foi uma Purospher® STAR C8

(LiChroCART® 125 x 4 mm d. i.; diâmetro da partícula 5 m) da MERCK acoplada a

uma coluna guarda C8 LiChrospher® (LiCrhoCART®, 4 x 4 mm d.i) da MERCK.

44

4.1.3 CLUE para o método 4

O cromatógrafo utilizado foi o UFLC XR SHIMADZU equipado com

degaseificador DGU-20A3, sistema de bombas binário LC-20AD XR, auto amostrador

SIL-20AC XR, forno da coluna CTO-20AC, sistema de detecção DAD SPD-M20A e

módulo de comunicação com o computador CBM-20A. Foi utilizado uma coluna Shim-

pack com grupos octadecilsilano, modelo XR-ODS 30 mm x 2 mm (diâmetro interno) x

2,2 µm.

4.2 Métodos

4.2.1 Preparação do Tampão Acetato

Para preparar o Tampão Acetato, 50 g de Acetato de Amônio PA e 0,2 g de

Acetato de Cobre II Monohidratado foram dissolvidos em 1000 mL de água purificada,

com correção de pH para 5,0 com Ácido Acético PA (WHO, 2006).


para análise por CLAE do método 1 e 2

Para o desenvolvimento do método analítico, os padrões foram pesados nas

respectivas quantidades 8 mg de isonazida, 43 mg de pirazinamida, 30 mg de

etambutol e 16 mg de rifampicina. Após pesagem, os pós foram transferidos para balão

volumétrico de 100 mL. 10 mL de acetonitrila foi adicionada ao balão para solubilizar a

mistura dos padrões, uma vez que a rifampicina mostrou-se com baixa solubilidade em

solventes aquosos. Posteriormente o balão foi levado ao banho de ultrassom por 1

minuto e tampão acetato foi adicionado até completar volume. A solução foi

homogeneizada e filtrada em filtro de seringa LCR em PTFE 0,45µm, 20µL foi injetada

no cromatógrafo imediatamente.

45


para análise por CLAE do método 3 e 4

Para o desenvolvimento do método analítico, os padrões foram pesados nas

respectivas quantidades 8 mg de isonazida, 43 mg de pirazinamida, 30 mg de

etambutol e 16 mg de rifampicina. Após pesagem, os pós foram transferidos para balão

volumétrico de 100 mL. 50 mL de acetonitrila foram adicionadas ao balão para

solubilizar a mistura das substâncias químicas de referência, uma vez que a rifampicina

mostrou-se com baixa solubilidade em solventes aquosos. Posteriormente o balão foi

levado ao banho de ultrassom por 1 minuto e água purificada foi adicionada até

completar volume e homogeneizadas. Alíquota de 5 mL da solução foi retirada com o

auxílio de uma pipeta volumétrica de 5 mL e transferida para um balão volumétrico de

50 mL. Água purificada foi adicionada até completar volume. As amostras foram

filtradas em filtro de seringa LCR em PTFE 0,45µm e injetadas no cromatógrafo

imediatamente.

4.3 Sistema Gradiente por CLAE

Dois sistemas gradientes (Método 1 e 2) foram testados com o intuito de verificar

em qual solvente orgânico (Metanol ou Acetonitrila) os fármacos apresentavam mais

afinidade e a análise se mostraria mais eficiente e a partir dele, desenvolver o método e

consequentemente a sua validação de acordo com as condições demonstradas na

Tabela 1. Para isso, no primeiro sistema gradiente, o metanol foi utilizado como 100%

de Fase Móvel B e, no segundo sistema, a acetonitrila foi utilizada como 100% de Fase

Móvel B. Todas as soluções foram filtradas em membrana filtrante PTFE 0,45 µm e

degaseificadas. Foi utilizado comprimento de onda de 200 a 800 nm para verificar qual

o comprimento de onda seria o mais ideal para detecção simultânea dos fármacos.

46

Tabela 1 - Condições cromatográficas para análise dos métodos analíticos 1 e 2 em CLAE.

Gradiente da concentração dos screenings

Tempo, min Fase móvel A, % * Fase Móvel B, % (1 e 2)**

0 100 0

60 0 100

* Tampão Acetato; ** 1 – Metanol = Método 1. 2 – Acetonitrila = Método 2.

4.4 CLAE – DAD

4.4.1 Desenvolvimento do método 3 por CLAE

A partir dos resultados obtidos nos métodos 1 e 2, foi possível avaliar que todos

os fármacos eram obtidos através sistema de fase móvel em forma de gradiente. Desta

forma o método 2 foi otimizado para uma análise mais rápida gerando o método 3,

conforme Tabela 2. O método foi desenvolvido com temperatura controlada de 30°C,

fluxo de 0,8 mL.min-1, volume de injeção de 12 µL e comprimento de onda de 270 nm.

4.4.2 Preparação do sistema de fases móveis para métodos 3 e 4

Para a fase móvel A, uma mistura de tampão acetato (conforme item 5.2) e

metanol na proporção (94:6, v/v) foi produzida. Já a fase móvel B foi avaliada e houve a

necessidade da troca do solvente orgânico, devido o metanol não ser capaz de carrear

a rifampicina através da coluna, sendo assim a fase móvel B foi produzida misturando o

mesmo tampão com acetonitrila na proporção (55:45, v/v). Ambas as fases móveis

foram homogeneizadas, filtradas em membrana filtrante PTFE 0,22 µm e

degaseificadas.

47

Tabela 2 - Condições cromatográficas para análise do método analítico 3 em CLAE.

Gradiente de Concentração

Tempo, min

Fase Móvel A

Tampão Acetato e

Metanol (94:6, v/v), %

Fase Móvel B

Tampão Acetato e

Acetonitrila (55:45, v/v), %

0 100 0

6 100 0

7 0 100

20 0 100

4.4.3 CLUE-DAD

4.4.3.1 Desenvolvimento do método 4 por CLUE

O método analítico 4 foi desenvolvido com o auxílio do “software” SHIMADZU

Method Transfer Program, versão 1.0 da SHIMADZU Coorporation ®, como descrito na

Tabela 3. Para a preparação das fases móveis, as soluções foram misturadas em suas

proporções, como descrito no item 4.4.2. O método foi desenvolvido com temperatura

controlada de 30°C, fluxo de 0,5 mL.min-1, volume de injeção de 2 µL e comprimento de

onda de 270 nm.

Tabela 3 - Condições cromatográficas para análise do método analítico 4 em CLUE.

Gradiente de Concentração

Tempo, min

Fase Móvel A

Tampão Acetato e

Metanol (94:6), %

Fase Móvel B

Tampão Acetato e

Acetonitrila (55:45), %

0 100 0

1.9 100 0

2 0 100

4 0 100

48

4.5 Desenvolvimento e Validação de Métodos

Os parâmetros de validação dos métodos analíticos foram: especificidade /

seletividade, intervalos da curva analítica, linearidade, limite de detecção, limite de

quantificação, exatidão, precisão (repetibilidade, precisão intermediária) e robustez.

4.6 Validação do método analítico

A validação do método analítico foi realizada em CLAE e CLUE para os

seguintes parâmetros:

4.6.1 Especificidade e Seletividade:

o Solução Branco

o Solução padrão de tuberculostáticos separados;

o Solução padrão isoniazida + pirazinamida + etambutol + rifampicina;

o Solução teste dos Excipientes, fabricante A;

o Solução teste do comprimido de isoniazida + pirazinamida + etambutol +

rifampicina, fabricante A.

4.6.1.1 Preparação das Soluções para Especificidade e Seletividade

A preparação das amostras para a especificidade e seletividade, tanto por CLAE

e CLUE, foi realizada em triplicata.

a) Solução Branco para avaliação da especificidade/seletividade por CLAE e

CLUE

Alíquota de 50 mL de acetonitrila foi inserida em um balão volumétrico de 100

mL e foi adicionada água purificada até completar volume. 5 mL da solução anterior

foram transferidas para um balão volumétrico de 50 mL e água purificada foi adicionada

até completar volume.. A amostra foi homogeneizada, filtrada em filtro de seringa de

PTFE 0,22 µm e injetada no cromatógrafo imediatamente.

49

b) Solução padrão de tuberculostáticos separados para avaliação da

especificidade/seletividade por CLAE e CLUE

Foram pesados 8 mg de isoniazida, 43 mg de pirazinamida, 30 mg de etambutol

e 16 mg de rifampicina, e transferidos, separadamente, cada um para um balão

volumétrico de 100 mL. Alíquota de 50 mL de acetonitrila foram inseridas em cada

balão volumétrico, os quais foram levados ao banho de ultrassom por 1 min.

Posteriormente, foi água purificada adicionada até completar volume. 5 mL de cada

solução foram transferidas para balões volumétricos de 50 mL e água purificada foi

adicionada até completar volume. As amostras foram homogeneizadas, filtradas em

filtro de seringa de PTFE 0,22 µm e injetadas no cromatógrafo imediatamente.

c) Solução padrão de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina para

avaliação da especificidade/seletividade por CLAE e CLUE.

Foram pesados 8 mg de isoniazida, 43 mg de pirazinamida, 30 mg de etambutol

e 16 mg de rifampicina e transferidos para balão volumétrico de 100 mL. 50 mL de

acetonitrila foram inseridas ao balão volumétrico e, em seguida foi levado ao banho de

ultrassom por 1 min. Posteriormente, foi adicionada água purificada até completar

volume. Alíquota de 5 mL da solução anterior foram transferidas para um balão

volumétrico de 50 mL e água purificada foi adicionada até completar volume.. As

amostras foram homogeneizadas, filtradas em filtro de seringa de PTFE 0,22 µm e

injetadas no cromatógrafo imediatamente.

d) Solução teste de excipientes para avaliação da especificidade/seletividade

por CLAE e CLUE

Uma mistura de 90 mg de excipientes que compõe o comprimido do fabricante A

foram pesados e transferidos para um balão volumétrico de 100 mL. 50 mL de

acetonitrila foram inseridas e o balão volumétrico foi levado ao banho de ultrassom por

1 min. Posteriormente, foi adicionada água purificada até completar volume. Alíquota

de 5 mL da solução anterior foram transferidas para um balão volumétrico de 50 mL e

água purificada foi adicionada até completar volume. A amostra foi homogeneizada,

50

filtrada em filtro de seringa de PTFE 0,22 µm e injetada no cromatógrafo

imediatamente.

e) Solução teste do comprimido de isoniazida, pirazinamida, etambutol e

rifampicina para avaliação da especificidade/seletividade por CLAE e CLUE.

10 comprimidos de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina foram

pesados, triturados em graal e homogeneizados. Foi pesado uma quantidade

equivalente à 8 mg de isoniazida e transferido para balão volumétrico de 100 mL. 50

mL de acetonitrila foram inseridas e o balão volumétrico foi levado ao banho de

ultrassom por 1 min. Posteriormente, foi adicionada água purificada até completar

volume. Alíquota de 5 mL da solução anterior foi transferida para um balão volumétrico

de 50 mL e água purificada foi adicionada até completar volume. As amostras foram

homogeneizadas, filtradas em filtro de seringa de PTFE 0,22 µm e injetadas no

cromatógrafo imediatamente.

4.6.2 Curva analítica/linearidade:

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração da substância analisada, dentro de uma

determinada faixa de aplicação. A estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a

partir de um conjunto de medições experimentais pode ser efetuada utilizando o

método matemático conhecido como regressão linear, adotado na validação desta

metodologia (THOMPSON et al., 2002; RIBANI et al., 2004).

É possível calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de

correlação “r”. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva obtida,

pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos

experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados,

garantindo maior linearidade da curva obtida (RIBANI et. al., 2004).

Para o parâmetro linearidade, três curvas analíticas foram realizadas

empregando-se soluções padrão dos quatro fármacos em sete níveis de concentrações

diferentes, conforme descrito na Tabela 4, que correspondem à faixa de 70% a 130%

da concentração final.

51

Tabela 4 – Concentrações de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina para a

linearidade dos métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente.

Conc., % Isoniazida

µg.mL-1

Pirazinamida

µg.mL-1

Etambutol

µg.mL-1

Rifampicina

µg.mL-1

70 5,60 30,10 21,00 11,20

80 6,40 34,40 24,00 12,80

90 7,20 38,70 27,00 14,40

100 8,00 43,00 30,00 16,00

110 8,80 47,30 33,00 17,60

120 9,60 51,60 36,00 19,20

130 10,40 55,90 39,00 20,80

4.6.3 Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediaria):

4.6.3.1 Repetibilidade para CLAE e CLUE.

Foram efetuadas 6 determinações de uma mesma solução padrão contendo

100% da concentração nominal de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina,

conforme item 4.6.1.1 e subitem “c”.

4.6.3.2 Precisão intermediária para CLAE e CLUE.

Foram efetuadas com um mesmo analista, em dias diferentes, dia 1 e dia 2, o

qual realizou a determinação da solução padrão, em triplicata e a solução teste do

comprimido, em sextuplicata, cada um, de uma mesma amostra (Lote), conforme item

4.6.1.1. – subitens “c” e “e”.

52

4.6.4 Exatidão para CLAE e CLUE.

Foi determinada utilizando-se três concentrações (baixa, média e alta, sendo 80,

100 e 120%), contemplando a faixa de variação do procedimento, realizando-se três

determinações da solução padrão contendo os quatros ativos e seis determinações por

concentração da solução teste de excipientes com contaminação dos padrões de

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina nas suas respectivas concentrações

utilizadas na solução padrão para validação analítica por CLAE e CLUE, conforme item

5.6.1.1 e subitens “c” e “e”.

4.6.5 Limite de quantificação para CLAE e CLUE.

Foi estimado pela divisão da média do desvio padrão residual do intercepto com

o eixo Y (coeficientes lineares) das três curvas de calibração dos ensaios de

linearidade, pela média da inclinação das três curvas de calibração (média dos

coeficientes angulares), multiplicado por 10. Foi confirmado pela preparação de uma

solução com concentração estimada e avaliação visual do cromatograma obtido.

4.6.6 Limite de detecção para CLAE e CLUE.

Foi estimado pela divisão da média do desvio padrão residual do intercepto com

o eixo Y (coeficientes lineares) das três curvas de calibração dos ensaios de

linearidade, pela média da inclinação das três curvas de calibração (média dos

coeficientes angulares), multiplicado por 3. Foi confirmado pela preparação de uma

solução com concentração estimada e avaliação visual do cromatograma obtido.

4.6.7 Robustez para CLAE e CLUE.

Foi avaliada estatisticamente pela determinação da solução padrão de

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, conforme item 5.6.1.1 subitem “c”,

frente a pequenas variações nos seguintes parâmetros analíticos: temperatura da

coluna de 28 e 32 C° para CLAE e CLUE e fluxo da fase móvel de 0,7 e 0,9 mL.min-1

(CLAE) e 0,4 e 0,6 mL.min-1 (CLUE).

53

RESULTADOS E DISCUSSÃO

54

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Métodos 1 e 2 por CLAE

O desenvolvimento dos métodos 1 e 2 foi proposto com o objetivo de avaliar se

o sistema de fase móvel poderia ser capaz de promover afinidade dos fármacos com

os solventes e com a fase estacionária, ocasionando a separação dos compostos.

Para isso, uma solução contendo substâncias químicas de referência de

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina (80,0 µg.mL-1, 430,0 µg/mL mg.mL-1,

300,0 µg.mL-1 e 160,0 µg.mL-1, respectivamente) foi injetada no cromatógrafo,

utilizando metanol ou acetonitrila como fase móvel B.

Para avaliar se o sistema de gradiente realmente gerasse melhores condições

no comprimento de onda de 270 nm, os espectros dos quatros fármacos foram obtidos

através do DAD e estão representados na Figura 7.

Pode-se observar que os fármacos apresentam picos de absorção máxima

próximo de 270 nm, exceto a rifampicina, que apresenta no valor de 334 nm. No

entanto, mesmo não apresentando absorção máxima, a rifampicina absorve nesta

região, confirmando que o mesmo comprimento de onda adotado por WHO (2006) foi

adotado nas validações dos métodos 3 e 4.

Ambos os métodos foram capazes de realizar a separação, porém como

observado na Figura 8, houve uma grande queda da linha de base, o qual não tornava

o sistema de gradiente favorável para ser adotado como método analítico.

Também foi avaliado através do DAD, qual seria o comprimento de onda que

mais se adequava aos métodos para detecção de todos os fármacos simultaneamente,

uma vez que a USP (2010) cita o 238 nm para absorção de isoniazida, pirazinamida e

rifampicina e 200 nm para o etambutol; o WHO (2006) cita 270 nm para isoniazida,

pirazinamida e etambutol e 254 nm para rifampicina. Por esse motivo, a análise foi

realizada com comprimento de onda ente 200 a 800 nm.

55

200 300 400 nm

0

50

100

150

200

250

300

350

mAU 7.34/ 1.00

405

466

269

200 300 400 nm

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

mAU 7.92/ 1.00

295

231

381

404

278

311

455

200 300 400 nm

0

25

50

75

100

125

150

175

mAU

10.59/ 1.00

237

371

389

271

215

200 300 400 nm

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

200

mAU

32.30/ 1.00

466

242

258

334

Figura 7: Espectros da solução padrão de isoniazida (A), pirazinamida (B), etambutol (C) e

rifampicina (D) obtido por CLAE a partir do método 2.

A B

C

D

56

Figura 8: Cromatogramas obtidos por CLAE do método 1 (A) e do método 2 (B). Os picos de 1

a 4 referem-se à isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente.

Após as análises a adequabilidade do sistema dos métodos 1 e 2 foi avaliada

(Tabela 5), juntamente com o perfil dos cromatogramas para propor o melhor sistema

de solventes. Foi possível também avaliar o cut-off (volume morto) dos solventes

orgânicos nos cromatogramas das figuras 7 e 8, os quais não apresentaram influência

no tempo de retenção dos fármacos no comprimento de onda escolhido.

57

Tabela 5 - Parâmetros de adequabilidade do sistema de solventes (métodos 1 e 2) por CLAE.

Método 1 Temp,R

(min) Área Largura

Pratos teóricos

Fator de cauda

Resolução K

Isoniazida 8,111 2066527 0,368 7768,72 2,580 - 7,08

Pirazinamida 8,989 12047264 0,437 6768,69 2,869 2,180 9,89

Etambutol 14,332 3099707 0,884 4204,23 3,734 8,088 16,98

Rifampicina 43,869 2700288 0,370 224697 1,572 47,098 32,82

Método 2 Temp,R

(min) Área Largura

Pratos teóricos

Fator de cauda

Resolução K

Isoniazida 7,340 2000440 0,195 22705,87 1,563 - 5,87

Pirazinamida 7,919 8012365 0,246 16587,26 1,322 2,627 8,33

Etambutol 10,59 2513334 0,318 17707,13 2,553 9,472 15,81

Rifampicina 32,30 3545577 0,360 128890,7 1,432 64,019 30,34

Após a análise dos resultados obtidos na adequabilidade do sistema (tabela 5),

pôde-se verificar que o método 2 em que se utiliza a acetonitrila como solvente

orgânico presente nas fases móveis, mostrou-se mais eficiente, uma vez que a

resolução apresentou valores acima do limite mínimo (> 2) e foi superior ao método 1,

ou seja, os picos estão mais separados no métodos 2. O fator de cauda apresentou

valores abaixo do limite máximo (< 2), excluindo-se o etambutol, possibilitando a

formação de picos mais simétricos. Os pratos teóricos mostraram-se acima do limite

mínimo especificado (> 1000) para ambos os métodos, no entanto quando comparados

os métodos, o método 2 apresenta maior número de pratos teóricos,

consequentemente maior a sua eficiência da análise.

Além disso, o tempo de retenção dos fármacos foi menor, propiciando uma

análise mais rápida, principalmente para a Rifampicina.

5.2 Desenvolvimento do método 3 por CLAE

Para o desenvolvimento do método 3 por CLAE, após a obtenção dos resultados

dos métodos 1 e 2, a monografia de Isoniazida, Pirazinamida Rifampicina e Etambutol

para comprimidos existentes na Farmacopeia Internacional (WHO, 2006) serviu como

base para que a otimização e adequação do método, uma vez que a mesma, assim

como a USP, propõe a utilização de duas colunas para a análise dos fármacos, uma

58

para análise simultânea de isoniazida, pirazinamida e etambutol e outra para a

rifampicina.

A escolha da proporção do sistema de fase móvel foi realizada com auxílio do

WHO (2006), o qual relata um método capaz de obter isoniazida, pirazinamida e

etambutol simultaneamente.

SHEWIYO et. al., (2012) e WHO (2006) relatam que o método de isoniazida,

pirazinamida e etambutol usa uma coluna de 15 cm x 4,6 mm empacotada com sílica

quimicamente ligada ao grupamento octadecilsianol (tamanho de partícula de 5 µm). A

fase móvel é preparada dissolvendo 50 g de acetato de amônio e 0,2 g de acetato de

cobre II monohidratado em 1000 mL de água purificada, com correção de pH para 5,0

com ácido acético glacial. Misturar 940 mL desta solução com 60 mL de metanol, que

será usada como fase móvel e programador o comprimento de onda para 270 nm.

A utilização do acetato de cobre II é devido ao fato de que o etambutol não

absorve na luz ultravioleta, no entanto, com a adição deste reagente à fase móvel, o

etambutol forma um complexo com o cobre tornando-o absortivo na luz ultravioleta.

(SHEWIYO et. al., 2012)

SHEWIYO et. al., (2012) e WHO (2006) relatam ainda que o método para o

doseamento de rifampicina utiliza uma coluna de 25 cm x 4,5 mm com o mesmo

empacotamento da coluna utilizado no método anterior e a fase móvel é composta por

metanol e tampão fosfato 0,01 mol/L pH 7,0, numa razão de 6:4 (v/v), com detecção a

254 nm.

Desta forma, o desenvolvimento do método 3 foi realizado pela obtenção do

sistema de fase móvel proposto pelos métodos 1 e 2 e com comprimento de onda em

270 nm, devido ao fato deste ter mostrado ser o mais seletivo, quando comparado aos

demais, tanto com relação à resolução picos como a adequabilidade da linha da base,

concordando com o WHO (2006).

O sistema de fase móvel sofreu alterações no decorrer do desenvolvimento do

método, tendo em vista que se fosse utilizado acetonitrila em ambos os sistemas, a

resolução dos picos de isoniazida e pirazinamida diminuía e impossibilitava a análise.

Diversas proporções foram utilizadas na fase móvel A (90:10, 92:8, 94:6, 96:4, 98:2 de

tampão acetato:acetonitrila e tampão acetato:metanol). A proporção que apresentou

59

melhor resolução e simetria entre os picos de isoniazida e pirazinamida foi a de 94:6 de

tampão acetato e metanol.

Já para o sistema de fase móvel B, não foi necessário promover diversas

mudanças nas proporções dos solventes, no entanto, foi verificado que o sistema na

proporção de 55:45 de tampão acetato e metanol não era capaz de eluir a rifampicina

da fase estacionária. O inverso foi observado quando a acetonitrila foi utilizada. O

metanol era capaz de eluir a rifampicina, se fosse utilizado uma maior proporção de

metanol no sistema, no entanto, com adição de mais solvente orgânico, a mistura do

sistema de fase móvel B gerava bastantes bolhas, o qual mesmo com a

degaseificação, poderia formar falsos picos.

A proporção de 55:45 de sistema de fase móvel B foi determinada através do

tempo de retenção da rifampicina nos métodos 1 e 2. O que confirma com o sistema de

fase móvel proposto por MOHAN et. al., (2003), onde o mesmo relata que nesta

proporção há um aumento no tempo de retenção da rifampicina, porém ocorre uma

melhor separação das impurezas existentes na formulação.

Com a obtenção dos sistemas de fase móvel A e B, era necessário desenvolver

um novo gradiente para que ocorresse sucesso na análise. Desta forma, diversas

tentativas de gradiente foram utilizadas com base na formação da rampa do método 1

e 2. Análises com tempo acima de 20 minutos foram desenvolvidas, porém a grande

dificuldade encontrada era na obtenção do pico do etambutol sem que houvesse

interferência da alteração da linha de base devido ao gradiente de concentração da

fase móvel A para a B.

Após diversas tentativas o método 3 foi desenvolvido, conforme tabela 2, onde

houvesse variação de isocrático para gradiente e que os fármacos pudessem ser

detectados durante a execução na forma isocrática, o qual permitisse a maior

estabilização da linha de base, o qual propiciou uma análise com adequabilidade do

sistema dentro dos limites requeridos.

60

5.3 Desenvolvimento do método 4 por CLUE

O desenvolvimento do método 4 por CLUE foi proposto a partir da inserção do

método 3 no “software” Method Transfer Program versão 1.0 da SHIMADZU

Coorporation®, o qual gerou um possível método 4.

O método 4 proposto pelo software foi programado no CLUE e foi injetado uma

amostra, no entanto, não houve tempo suficiente para a detecção dos 4 fármacos e o

tempo necessário para a queda da linha de base promovido pelo gradiente de

concentração de fase móvel foi cortado ao meio, mesmo aumentando o fluxo da fase

móvel. Dessa forma, diversas tentativas para conseguir uma melhor estabilização da

linha de base e detecção de todos os fármacos foram realizadas, sem que houvesse

necessidade em alterar a proporção dos solventes no sistema de fase móvel A e B.

Da mesma maneira que no CLAE, um gradiente de fase móvel composto por

zona isocrática e de gradiente também foi gerado para o CLUE, com tempos mais

curtos na mudança de fase móvel e mais longos nas zonas isocráticas, conforme

tabela 3, com diminuição do volume de injeção da amostra e fluxo da fase móvel, o

qual propiciou uma análise com adequabilidade do sistema dentro dos limites

requeridos.

Com o desenvolvimento dos métodos 3 e 4, as validações de ambos os métodos

foram realizadas em sequência.

5.4 Validação do Método Analítico

5.4.1 Especificidade/Seletividade

A validação do método analítico foi realizada em CLAE e CLUE para os

seguintes parâmetros:

o Solução Branco

o Solução padrão isoniazida;

o Solução padrão pirazinamida;

o Solução padrão etambutol;

o Solução padrão rifampicina;

o Solução padrão isoniazida + pirazinamida + etambutol + rifampicina;

61

o Solução teste dos Excipientes, fabricante A;

o Solução teste do comprimido de isoniazida + pirazinamida + etambutol +

rifampicina, fabricante A.

Como observado nos cromatogramas obtidos por CLAE e CLUE nas Figuras 9 e

10, não foi observado nenhum pico na solução do branco e solução teste dos

excipientes no mesmo tempo de retenção dos picos dos padrões dos fármacos

demonstrando que os constituintes que compõem a fase móvel, os diluentes, bem

como os excipientes presentes na forma farmacêutica não interferem na identificação e

quantificação dos fármacos.

Os espectros em 3D foram obtidos ambos de soluções padrões contendo os

quatro fármacos e estão apresentados nas figuras 11 e 12. Concordando com o estudo

dos comprimentos de ondas, uma vez que na faixa de UV/Vis todos os fármacos

possuem absorção.

62

5.4.1.1 Cromatogramas da Especificidade por CLAE

Figura 7: Cromatogramas obtido por CLAE (A) Branco, (B) Solução teste dos Excipientes, (C) Solução Padrão Isoniazida, (D) Solução

Padrão de Pirazinamida, (E) Solução Padrão de Etambutol, (F) Solução Padrão de Rifampicina, (G) Solução Padrão dos quatros fármacos

e (H) Solução teste de comprimido do 4 em 1. Os picos representados como 1, 2, 3 e 4 correspondem a isoniazida, pirazinamida, etambutol

e rifampicina, respectivamente.

63

5.4.1.2 Cromatogramas da Especificidade por CLUE

Figura 8: Cromatogramas obtido por CLUE (A) Branco, (B) Solução teste dos Excipientes, (C) Solução Padrão Isoniazida, (D) Solução

Padrão de Pirazinamida, (E) Solução Padrão de Etambutol, (F) Solução Padrão de Rifampicina, (G) Solução Padrão dos quatros fármacos

e (H) Solução teste de comprimido do 4 em 1. Os picos representados como 1, 2, 3 e 4 correspondem a isoniazida, pirazinamida, etambutol

e rifampicina, respectivamente.

64

Figura 9: Visão 3D dos espectros da solução padrão dos quatro fármacos obtido por CLAE.

Figura 10: Visão 3D dos espectros da solução padrão dos quatro fármacos obtido por CLUE.

65

Um estudo dos parâmetros da adequabilidade do sistema (Tabelas 6 e 7) foi

realizado com o propósito de verificar se o método encontra-se dentro dos padrões

exigidos para ser validado. Admitiram-se os mesmos limites requeridos dos

parâmetros de adequabilidade do sistema para uma análise cromatográfica usados na

CLAE e na CLUE.

Tabela 6 - Parâmetros de adequabilidade do sistema da especificidade da solução padrão

dos quatros fármacos pelo método 3 por CLAE.

Tabela 7 - Parâmetros de adequabilidade do sistema da especificidade da solução padrão

dos quatros fármacos pelo método 4 por CLUE.

De acordo com a Tabela 6, pode-se observar que todos os fármacos

apresentaram os parâmetros de adequabilidade do sistema dentro dos limites

exigidos para uma análise cromatográfica por CLAE. O mesmo foi observado para a

análise cromatográfica por CLUE (Tabela 7), onde todos os fármacos apresentaram

pratos teóricos, fator de cauda e resolução dentro dos limites exigidos, demonstrando,

assim, que ambos os métodos foram capazes de gerar resultados que garantem a

análise.

Amostra Tempo,

min Conc,

mg.mL-1 Área Largura

Pratos Teóricos

Fator de

cauda Resolução K

Isoniazida 3,264 0,008 172181 0,406 1036,13 1,400 - 2,254

Pirazinamida 4,112 0,043 2151056 0,409 1620,20 1,308 2,081 3,112

Etambutol 9,955 0,030 254769 0,749 2826,39 1,017 10,096 8,955

Rifampicina 16,877 0,016 477409 0,300 50642,5 1,117 13,197 15,877

Amostra Tempo,

min Conc,

mg.mL-1

Área Largura

Pratos Teóricos

Fator de

cauda Resolução K

Isoniazida 0,486 0,008 31752 0,094 1003,43 1,359 - 2,036

Pirazinamida 0,597 0,043 426581 0,091 1686,65 1,979 2,002 2,733

Etambutol 2,053 0,030 63030 0,196 1748,06 1,528 10,123 11,828

Rifampicina 3,671 0,016 40428 0,093 25093,47 1,651 11,199 21,945

66

Também é observado uma redução da largura de todos os picos, que pode

estar relacionado à menor quantidade de fármaco que foi injetado no CLUE (2 µL), em

comparação ao do CLAE (12 µL).

Quando se compara os números de pratos teóricos, os valores obtidos na

CLUE mostraram-se próximos para os 2 primeiros fármacos (isoniazida e

pirazinamida) no CLAE, no entanto, os demais fármacos (etambutol e rifampicina)

mostraram valores mais baixos no CLUE em comparação ao CLAE, isto ocorreu

devido ao fato que o valor dos números de pratos teóricos é diretamente proporcional

ao tempo de retenção do fármaco ao quadrado, logo, quando ocorre um maior tempo

de retenção, maior será a capacidade que a coluna tem de promover uma melhor

eficiência na separação dos constituintes da amostra.

5.4.2 Linearidade/curva analítica

É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados

obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro

de um intervalo especificado. É recomendado que a linearidade seja determinada pela

análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes (BRASIL, 2003). Dessa forma, um

estudo contemplando 7 concentrações foi realizado e está apresentado nas Tabelas 8

e 9, para CLAE e 11 e 12 para CLUE. As curvas de calibrações foram construídas e

estão apresentadas nas Figuras 13 para CLAE e 15 para CLUE.

Um estudo de ANOVA foi realizado para verificar se a curva de calibração

apresentava-se linear ou com falta de ajuste, bem como uma avaliação dos resíduos

para verificar se os mesmos apresentavam-se homogêneos.


por CLAE.

ISONIAZIDA PIRAZINAMIDA

Área %

Área %

70

113929 69,68

70,42

1498392 69,60

70,26 114758 70,18 1520393 70,62

116738 71,39 1519283 70,57

80

130928 80,07

80,89

1708283 79,35

80,29 131928 80,68 1748383 81,21

133928 81,91 1729292 80,32

67

90

147837 90,42

91,34

1934393 89,85

90,90 149873 91,66 1946738 90,43

150321 91,93 1989873 92,43

100

163868 100,22

100

2142385 99,51

100 163417 99,94 2168493 100,73

163216 99,82 2147368 99,75

110

178739 109,32

109,88

2329393 108,20

108,66 179910 110,03 2348393 109,08

180322 110,28 2340002 108,69

120

195443 119,53

119,84

2549303 118,42

118,80 194544 118,98 2559494 118,89

197837 121,00 2563930 119,10

130

213029 130,29

130,18

2790393 129,62

128,88 212098 129,72 2759433 128,18

213442 130,54 2773820 128,85

Tabela 9 - Estudo da linearidade para os fármacos etambutol e rifampicina

por CLAE.

ETAMBUTOL RIFAMPICINA

Área %

Área %

70

158273 70,31

71,19

312938 68,46

69,51 160283 71,20 310929 68,02

162227 72,06 329382 72,05

80

177839 79,00

79,55

369839 80,91

79,85 179039 79,53 360499 78,86

180382 80,13 364738 79,79

90

209182 92,92

90,06

403930 88,36

90,03 200039 88,86 420393 91,97

198982 88,39 410293 89,76

100

226434 100,59

100

446718 97,72

100 220237 97,83 464333 101,58

228638 101,57 460239 100,68

110

247839 110,10

109,24

501823 109,78

110,32 244495 108,61 500083 109,40

245393 109,01 510983 111,78

120

269938 119,91

120,44

554838 121,38

119,94 273029 121,29 540933 118,34

270392 120,11 549083 120,12

130

291238 129,37

129,22

590833 129,25

130,58 293049 130,18 600019 131,26

288393 128,11 599903 131,24

68

Figura 11: Curvas analíticas das três injeções da solução padrão de isoniazida, pirazinamida,

etambutol e rifampicina por CLAE.

O estudo da linearidade/curva analítica para a isoniazida, pirazinamida,

etambutol e rifampicina por CLAE mostrou resultados bastante satisfatórios uma vez

que as curvas analíticas apresentaram com coeficiente de correlação (r) acima de

0,99 (0,9985 para isoniazida, 0,9982 para pirazinamida, 0,9959 para etambutol e

0,9956 para rifampicina).

Além disso, o teste ANOVA demonstrou que não será necessário realizar

ajustes nas curvas, uma vez que o F obtido foi maior que o F-crítico (tabelado) para

todos os fármacos, cujos resultados são demonstrados na Tabela 10.

60 70 80 90 100 110 120 130 140

100000

150000

200000

Linear Regression for Data1_iso:

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 3094,04762 1415,18628

B 1610,0619 13,87704

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,9993 1271,85202 21 <0.0001

------------------------------------------------------------

Curva de Calibração Isoniazida, CLAE

Áre

a,

mA

U

Concentração Teórica, %

60 70 80 90 100 110 120 130 140

1500000

2000000

2500000

Linear Regression for Data1_pira:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 65466,52381 20139,26021

B 20806,01905 197,48169

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99915 18099,4962 21 <0.0001

Curva de Calibração Pirazinamida, CLAE

Áre

a,

mA

U


60 70 80 90 100 110 120 130 140

150000

200000

250000

300000

Linear Regression for Data1_eta:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 3894,69048 3294,0505

B 2211,20595 32,30082

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99798 2960,4193 21 <0.0001

Curva de Calibração Etambutol, CLAE

Áre

a,

mA

U


60 70 80 90 100 110 120 130 140

300000

400000

500000

600000

Linear Regression for Data1_rifa:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -5863,7381 7182,44567

B 4631,36548 70,42967

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99781 6454,98627 21 <0.0001

Curva de Calibração Rifampicina, CLAE

Áre

a,

mA

U


69

Tabela 10 - Teste da ANOVA dos resultados obtidos na regressão linear dos dados da

linearidade das soluções padrão de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina por

CLAE.

Isoniazida gl SQ MQ F F tabelado

Regressão 1 8388,165761 8388,165761 13467,29

4,38

Resíduo 19 11,83423922 0,622854696

Total 20 8400

Pirazinamida gl SQ MQ F

Regressão 1 8385,62538 8385,625 11083,9024

Resíduo 19 14,37461974 0,756559

Total 20 8400

Etambutol gl SQ MQ F

Regressão 1 8366,051622 8366,051622 4682,255

Resíduo 19 33,94837834 1,786756755

Total 20 8400

Rifampicina gl SQ MQ F

Regressão 1 8363,240546 8363,240546 4322,74

Resíduo 19 36,75945384 1,934708097

Total 20 8400

A partir dos resultados obtidos pela CLAE, pôde-se verificar que o método

apresenta linearidade adequada, tendo em vista que o mesmo foi capaz de

apresentar r dos 4 fármacos com valores acima de 0,99.

Acrescentando a este fator, os gráficos de resíduos (Figura 14) para os quatro

fármacos, obtidos através da análise estatística, mostraram que a distribuição é

aleatória e sem tendências, com magnitude de ± 3,0%. Considera-se um resíduo de

baixa magnitude consistente e sem presença de tendência no seu sinal quando os

dados apresentarem magnitude em torno de ± 3,0%, para o teste de teor de princípio

ativo (ERMER & MILLER, 2005).

Logo o método 3 possui a habilidade de, dentro de certa faixa (70 a 130 %),

obter resultados que são diretamente, ou por meio de cálculos matemáticos,

proporcionais à concentração (quantidade) do analito na amostra (BRASIL, 2003).

70

Figura 12: Gráficos da plotagem de resíduos dos fármacos por CLAE.

A seguir serão apresentados os valores obtidos no estudo da linearidade/curva

de calibração dos 4 fármacos por CLUE.

71


por CLUE.

ISONIAZIDA PIRAZINAMIDA

Área %

Área %

70

19985 69,05

69,71

277985 69,66

70,87 20174 69,70 275865 69,13

20369 70,33 294575 73,82

80

24001 82,92

81,63

324556 81,33

82,33 23874 82,48 328568 82,34

23011 79,50 332512 83,33

90

26100 90,17

90,57

360245 90,28

91,80 26023 89,91 368565 92,36

26525 91,64 370121 92,75

100

28741 99,30

100

401120 100,52

100 28545 98,62 395852 99,20

29542 102,07 400063 100,26

110

31965 110,44

110,07

430241 107,82

109,91 31758 109,72 442152 110,81

31855 110,06 443336 111,10

120

34858 120,43

119,85

475581 119,18

119,85 34202 118,17 478965 120,03

35009 120,95 480121 120,32

130

38011 131,33

131,31

510112 127,84

129,07 37958 131,14 516333 129,40

38045 131,44 518585 129,96

72

Tabela 12 – Estudo da linearidade para os fármacos etambutol e rifampicina

por CLUE.

ETAMBUTOL RIFAMPICINA

Área %

Área %

70

40325 70,04

70,19

27955 69,40

69,07 40658 70,61 27852 69,14

40252 69,91 27666 68,68

80

45985 79,87

80,69

32322 80,24

79,62 46858 81,38 31936 79,28

46535 80,82 31953 79,32

90

52425 91,05

91,13

36558 90,76

90,67 53001 92,05 36012 89,40

51985 90,29 36998 91,85

100

57844 100,47

100

40428 100,37

100 57021 99,04 40887 101,51

57854 100,48 39521 98,11

110

63526 110,33

111,37

45223 112,27

11,12 64858 112,65 44855 111,36

63985 111,13 44201 109,73

120

70141 121,82

121,70

49652 123,27

121,55 70069 121,70 48225 119,72

70002 121,58 49001 121,65

130

75642 131,38

131,27

52012 129,13

129,72 75888 131,81 52326 129,93

75200 130,61 52401 130,09

73

Figura 13 - Curvas analíticas das três injeções da solução padrão de isoniazida, pirazinamida,

etambutol e rifampicina por CLUE.

O estudo da linearidade/curva analítica para a isoniazida por CLUE mostrou

resultados bastante semelhantes ao estudo por CLAE. Mesmo apresentando CV

acima de 3,0%, no caso da pirazinamida, o método foi capaz de gerar coeficiente de

correlação (r) acima de 0,99 (0,9963 para isoniazida; 0,9950 para pirazinamida;

0,9986 para etambutol e 0,9965 para rifampicina). Além disso, o teste ANOVA

também demonstrou que não será necessário realizar ajustes, uma vez que o F

obtido para todos os fármacos também foi maior que o F-crítico (tabelado), conforme

Tabela 13.

Desta forma, o método 4 também possui a habilidade de, dentro de certa faixa

(70 a 130 %), obter resultados que são diretamente, ou por meio de cálculos

matemáticos, proporcionais à concentração (quantidade) do analito na amostra

(BRASIL, 2003).

60 70 80 90 100 110 120 130 140

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Curva de Calibração Isoniazida, CLUE

Linear Regression for Data1_iso:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 55,52381 411,96083

B 290,18333 4,03961

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99816 370,23621 21 <0.0001

------------------------------------------------------------

Áre

a, m

AU

Concentração Teórica, %60 70 80 90 100 110 120 130 140

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

Linear Regression for Data1_pira:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 19703,11905 6280,8702

B 3815,08929 61,589

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99753 5644,72504 21 <0.0001

------------------------------------------------------------

Curva de Calibração Pirazinamida, CLUE

Áre

a,

mA

U


60 70 80 90 100 110 120 130 140

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

75000

80000

Curva de Calibração Etambutol, CLUE

Linear Regression for Data1_eta:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -605,88095 508,3416

B 587,0369 4,9847

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99932 456,85526 21 <0.0001

Áre

a,

mA

U


60 70 80 90 100 110 120 130 140

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

Curva de Calibração Rifampicina, CLUE

Linear Regression for Data1_rifa:

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A -794,69048 563,42644

B 411,75357 5,52485

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99829 506,36094 21 <0.0001

Áre

a, m

AU


74

Tabela 13 - Teste da ANOVA dos resultados obtidos na regressão linear dos dados da

linearidade das soluções padrão de isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina por

CLUE.

Isoniazida gl SQ MQ F F tabelado

Regressão 1 8369,236791 8369,236791 5169,015

4,38

Resíduo 19 30,76320891 1,619116258 Total 20 8400

Pirazinamida gl SQ MQ F

Regressão 1 8358,609472 8358,609472 3837,0

Resíduo 19 41,39052792 2,178448838 Total 20 8400

Etambutol gl SQ MQ F

Regressão 1 8388,54141 8388,54141 13909,41575

Resíduo 19 11,45858961 0,603083664 Total 20 8400

Rifampicina gl SQ MQ F

Regressão 1 8371,302248 8371,302248 5542,411

Resíduo 19 28,69775178 1,510407988 Total 20 8400

Estatisticamente, as médias analisadas na ANOVA da regressão linear para

todos os fármacos e em ambos os métodos apresentaram um valor de F calculado

superior ao valor de F crítico, indicando assim que a regressão obtida pode ser

considerada preditiva e que os métodos encontram-se de acordo com as

especificações da legislação nacional vigente (BRASIL, 2003; INMETRO, 2003).

Acrescentando a este fator, os gráficos de resíduos (figura 16) para os quatro

fármacos mostraram o mesmo perfil de distribuição aleatória que foi encontrado no

CLAE e, também não apresenta tendência, com magnitude de resíduos para todos os

fármacos de ± 3,0%.

75

Figura 14: Gráficos da plotagem de resíduos dos fármacos por CLUE.

5.4.3 Limite de Detecção (LD) e Quantificação (LQ)

O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as

condições experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003). Já o limite de quantificação é

a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com

precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas

(BRASIL, 2003).

A seguir são detalhadas algumas técnicas que podem ser aplicadas para

avaliar os limites de quantificação e detecção (ERMER & MILLER, 2005):

- definição visual;

- cálculo do desvio padrão de uma solução branco;

- cálculo através da razão sinal ruído;

- cálculo através do desvio padrão residual de uma regressão.

76

A definição visual pode ser usada com métodos instrumentais e não

instrumentais. O limite de quantificação é geralmente determinado pela análise de

amostras com concentrações conhecidas do analito e pelo estabelecimento de um

nível mínimo o qual o analito pode ser quantificado com precisão e exatidão (ICH,

1996).

Para estimar o LD e LQ através de uma solução branco é importante que o

cromatógrafo esteja livre de inclinações significantes ou ocorra um aumento da linha

de base durante a análise. O cálculo é baseado em uma simples medição da razão

sinal-ruído de um pico usando a ferramenta “peak-to-peak” (ERMER, 2005).

Essa técnica somente pode ser aplicada para procedimentos analíticos que

exibam ruído de linha de base. A determinação da razão sinal-ruído é realizado pela

comparação dos sinais das amostras com concentrações baixas do analito com o os

sinais da solução branco. Em geral emprega-se a razão sinal-ruído típico de 10:1

(ICH, 1996).

Os limites de detecção e quantificação teóricos também podem ser estimados

através do desvio padrão residual de uma regressão, onde utiliza-se as fórmulas

abaixo (ERMER, 2005):

Onde DPa é desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3

curvas de calibrações construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao

suposto limite de quantificação e IC é a inclinação da curva de calibração. Os

resultados dos limites de detecção e quantificação para os 4 fármacos foram obtidos

das curvas de calibração obtidas para os 4 fármacos e estão apresentados na tabela

25.

Os LD e LQ teóricos foram calculados e a partir da concentração teórica,

soluções padrões foram preparadas e injetadas no cromatógrafo para avaliar a se a

concentração teórica correspondia à concentração real. Os resultados estão

apresentados na tabela 14.

77

Tabela 14 – Estudo do LQ e LD dos quatros fármacos por CLAE e CLUE.

Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ)

CLAE CLUE

Amostra LD

Estimado, %

LD Real,

%

LQ Estimado,

%

LQ Real,

%

LD Estimado,

%

LD Real,

%

LQ Estimado,

%

LQ Real,

%

Isoniazida 2,415 3,500 3,659 4,500 1,782 2,000 2,701 3,000

Pirazinamida 1,605 2,000 2,432 3,500 0,723 1,000 1,096 1,200

Etambutol 2,409 3,500 3,650 4,500 0,993 1,900 1,505 2,500

Rifampicina 5,889 6,000 8,924 9,000 0,958 1,000 1,452 2,000

A partir dos resultados encontrados, percebe-se que os valores do LD e LQ

estimado para ambas as técnicas são próximos, no entanto o valor real para LD e LQ

apresentam-se superiores aos valores estimados. É também importante notar a

diferença entre os valores encontrados no CLAE em comparação aos valores do

CLUE. Uma vez que todos os valores por CLUE apresentaram-se menores,

assumindo assim, que o método 4 garante que o equipamento possui a capacidade

de ser mais sensível na presença dos fármacos antituberculostáticos. Tal fato também

é evidenciado por THAKKAR et. al., (2011), o qual apresenta valores de LD e LQ,

para o Aripripazol, para o CLUE, quando comparado ao CLAE.

Os cromatogramas obtidos pelo método 3 estão representados nas Figuras 17

e 18.

78

0 5 10 15 20

-300000

-150000

0

Inte

sin

dade, m

AU

Tempo, min

4 6 8 10 12

-4000

-2000

0

270 nm

Figura 15: Cromatograma do Limite de Detecção Real pelo método 3 por CLAE. Os picos de

1 a 4 representam isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente.

0 5 10 15 20

-300000

-200000

-100000

0

100000

270 nm

Inte

nsid

ad

e, m

AU

Tempo, min

4 6 8 10 12

-4000

-3000

-2000

-1000

0

1000

Figura 16: Cromatograma do Limite de Quantificação Real pelo método 3 por CLAE. Os picos

de 1 a 4 representam isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente.

1

2

3

4

1 2

3

4

79

5.4.4 Precisão

A precisão mede a proximidade dos resultados obtidos em uma série de

medidas de uma amostragem múltipla de uma amostra, ou seja, testar a variação que

pode existir quando ocorre mudanças de dias, equipamentos ou analistas, além da

repetibilidade que expressa a precisão nas mesmas condições de operação em curto

intervalo de tempo, usando amostras homogêneas e autênticas (BRASIL, 2003).

Como citado anteriormente, a precisão foi analisada em duas etapas, precisão

inter-corrida e intra-corrida.

5.4.4.1 Repetibilidade

Os valores da repetibilidade (precisão intra-corrida) são demonstrados nas

Tabelas 15 e 16 correspondendo às análises por CLAE e CLUE, respectivamente.

Tabela 15 - Estudo da repetibilidade da solução padrão dos quatro fármacos por CLAE.

ISONIAZIDA PIRAZINAMIDA ETAMBUTOL RIFAMPICINA

Área

1 177370 2127109 261014 507764

2 170193 2128179 259886 516100

3 172457 2146025 261100 520466

4 169388 2160919 257398 529177

5 169498 2118115 249197 515115

6 164156 2167703 254199 511137

Média 169843 2141342 255465 514959

Desvio padrão 3226 20076 7099 10431

CV, % 1,89 0,93 1,77 1,98

80

Tabela 16 - Estudo da repetibilidade da solução padrão dos quatro fármacos por CLUE.

ISONIAZIDA PIRAZINAMIDA ETAMBUTOL RIFAMPICINA

Área

1 30121 426581 60030 40428

2 30608 410573 59042 40887

3 29331 415945 59069 41191

4 29858 420274 59562 40156

5 30002 409426 57009 40508

6 30582 404182 58685 41700

Média 30087 414496 58899 40811

Desvio padrão 479 8111 1037 567

CV, % 1,59 1,95 1,76 1,38

A repetibilidade consiste na concordância entre os resultados de medições

sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de medição

(mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas

condições; mesmo local; repetições em um curto intervalo de tempo) (RIBANI et al.,

2004), este parâmetro é de fundamental importância, uma vez que atesta que o

método é seguro para diversas medições intra-dia.

O critério de aceitação preconizado para a repetibilidade é de não apresentar

CV maior que 5,0% (BRASIL, 2003), logo, os resultados encontrados mostraram que

os métodos por CLAE e CLUE estão adequados para o uso em rotina.

5.4.4.2 Precisão Intermediária

Os valores da precisão intermediária (precisão inter-corrida) são demonstrados

nas Tabelas 17 e 18 para análise por CLAE e CLUE, respectivamente.

81

Tabela 17 - Estudo da precisão intermediária nos dias 01 e 02 da solução teste dos

comprimidos por CLAE.

PRECISÃO INTERMEDIÁRIA POR CLAE

Dia 01 Dia 02

Área Média % Média CV, % Área Média

% Média

CV, % CV 12, %

Isoniazida 166624 101,91 4,36 160511 98,17 4,13 4,50

Pirazinamida 2149268 100,33 0,86 2147759 100,26 0,73 0,76

Etambutol 231996 103,06 3,25 221705 98,49 3,91 4,16

Rifampicina 466041 101,96 2,07 460716 100,79 1,83 1,96

Tabela 18 - Estudo da precisão intermediária nos dias 01 e 02 da solução teste do

comprimido por CLUE.

PRECISÃO INTERMEDIÁRIA POR CLUE

Dia 01 Dia 02

Área Média % Média CV, % Área Média % Média CV, % CV 12, %

Isoniazida 28453 98,30 3,42 28364 98,00 4,16 3,63

Pirazinamida 379522 95,11 1,48 371800 93,18 1,55 1,80

Etambutol 53522 92,96 1,59 53748 93,35 2,23 1,86

Rifampicina 38423 95,39 2,41 39173 97,25 1,12 2,05

A precisão intermediária é um parâmetro que indica o efeito das variações

dentro do laboratório devido a eventos como diferentes dias, diferentes analistas,

diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores. A precisão intermediária

demonstra de forma precisa a variabilidade dos resultados em um único laboratório e

o seu objetivo é verificar que o método analítico em validação fornecerá os mesmos

resultados no mesmo laboratório (RIBANI et. al., 2004).

Dessa forma, foi possível garantir, com a precisão intermediária, que o método

é capaz de ser representativo quando ocorrer eventos no laboratório, já que os

valores do CV para todos os fármacos apresentaram-se abaixo de 5%.

5.4.5 Exatidão

Para calcular a exatidão do método, 3 níveis de concentração foram

determinados dentro da faixa linear do método. Dessa forma, foram preparadas

soluções testes de excipientes contaminadas com os padrões de isoniazida,

pirazinamida, etambutol e rifampicina nas suas respectivas concentrações conforme a

solução padrão nas concentrações de 80, 100 e 120%, em sextuplicata para cada

82

concentração e, injetadas no cromatógrafo. Nesse teste foi avaliado o coeficiente de

variação e a porcentagem de recuperação das amostras para cada nível, como

demonstrado nas Tabelas 19 e 20 para o estudo em CLAE e a 21 e 22 para o estudo

em CLUE.

O fator de recuperação é definido como a quantidade de substância de

interesse presente ou adicionada na amostra, que é passível de extração e

quantificação. A informação da recuperação pode ser obtida tanto com a adição de

substância padrão de referência ou de composto puro (RIBANI et. al., 2004; ERMER

& MILLER, 2005).

83

Tabela 19 - Estudo da exatidão para isoniazida e pirazinamida por CLAE.

Isoniazida

Área % S CV (%) % de Rec. CV da % de Rec.

80

130928 80,07

80,69 0,49 0,611

100,09

0,611

131929 80,68 100,86

132392 80,97 101,21

132592 81,09 101,36

132938 81,30 101,63

131029 80,13 100,17

100

163868 100,22

99,73 0,38 0,38

100,22

0,38

163417 99,94 99,94

163216 99,82 99,82

162903 99,63 99,63

161982 99,07 99,07

163000 99,69 99,69

120

195443 119,53

120,27 0,84 0,70

99,61

0,70

194544 118,98 99,15

197837 121,00 100,83

196743 120,33 100,27

197383 120,72 100,60

197993 121,09 100,91

Pirazinamida


80

1708283 79,74

80,08 0,82 1,03

99,67

1,03

1740933 81,26 101,58

1729292 80,72 100,90

1719171 80,25 100,31

1702922 79,49 99,36

1692823 79,01 98,77

100

2142385 100,00

99,81 0,92 0,92

100,00

0,92

2168493 101,22 101,22

2147368 100,23 100,23

2132933 99,56 99,56

2129392 99,39 99,39

2109292 98,45 98,45

120

2549303 118,99

120,17 1,04 0,86

99,16

0,86

2559494 119,47 99,56

2563930 119,68 99,73

2573933 120,14 100,12

2590393 120,91 100,76

2610293 121,84 101,53

84

Tabela 20 - Estudo da exatidão para etambutol e rifampicina por CLAE.

Etambutol

Área % S CV,% % de Re.

CV da % de Rec.

80

177839 79,00

80,05 1,03 1,29

98,75

1,29

179039 79,53 99,42

180382 80,13 100,16

177999 79,07 98,84

182922 81,26 101,57

183000 81,29 101,62

100

226434 100,59

100,36 1,67 1,67

100,59

1,67

221394 98,35 98,36

228638 101,57 101,57

229000 101,73 101,73

221029 98,19 98,19

229037 101,74 101,74

120

269938 119,91

1129,80 0,87 0,72

99,93

0,72

273029 121,29 101,07

270392 120,11 100,09

268398 119,23 99,36

267383 118,78 98,98

268938 119,47 99,56

Rifampicina

Área % S CV,% % de Rec.

CV da % de Rec.

80

369839 80,91

80,29 0,95 1,18

101,13

1,18

360499 78,86 98,58

364738 79,79 99,74

370192 80,98 101,23

364839 79,81 99,77

371928 81,36 101,70

100

449858 98,41

100,42 1,56 1,55

98,41

1,55

464333 101,58 101,58

460239 100,68 100,68

463849 101,47 101,47

465544 101,48 101,84

450293 98,51 98,51

120

554838 121,38

119,52 1,24 1,04

101,15

1,04

540933 118,34 98,61

549083 120,12 100,10

543403 118,88 99,06

540398 118,22 98,52

549348 120,18 100,15

85

Tabela 21 - Estudo da exatidão para isoniazida e pirazinamida por CLUE.

Isoniazida


80

23901 81,56

80,15 1,24 1,64

101,95

1,54

23874 81,47 101,84

23195 79,15 98,94

23210 79,20 99,01

23100 78,83 98,54

23652 80,71 100,89

100

28741 98,08

99,64 1,51 1,86

98,08

1,51

28895 98,60 98,60

29542 100,81 100,81

29585 100,96 100,96

28756 98,13 98,13

29663 101,23 101,23

120

34858 118,95

119,36 0,72 0,60

99,13

0,60

34685 118,36 98,64

35009 119,47 99,56

34952 119,28 99,40

35021 119,51 99,59

35325 120,55 100,46

Pirazinamida


80

324556 81,33

80,99 0,43 0,53

101,67

0,53

324568 81,34 101,67

321655 80,61 100,76

324252 81,26 101,57

323544 81,08 101,35

320459 80,31 100,39

100

401120 100,53

100,24 1,30 1,299

100,52

1,29

395,58 99,20 99,20

400063 100,26 100,26

406522 101,88 101,88

392368 98,33 98,33

403985 101,24 101,24

120

475581 119,18

120,15 0,50 0,42

99,32

0,42

478965 10,03 100,03

480121 120,32 100,27

480633 120,45 100,37

480004 120,29 100,24

481232 120,60 100,50

86

Tabela 22 - Estudo da exatidão para etambutol e rifampicina por CLUE.

Etambutol

Área % S CV,% % de Re.

CV da % de Rec.

80

45836 79,61

80,65 0,61 0,76

99,51

0,76

46852 81,37 101,72

46535 80,82 101,03

46652 81,03 101,28

46252 80,33 100,42

46315 80,44 100,55

100

57844 100,47

99,92 0,56 0,56

100,47

0,56

57021 99,04 99,04

57854 100,48 100,48

57421 99,73 99,73

57365 99,63 99,63

57691 100,20 100,20

120

70141 121,82

121,41 0,69 0,57

101,52

0,57

70069 121,70 101,42

70002 121,58 101,32

70235 121,99 101,66

69858 121,33 101,11

69125 120,06 100,05

Rifampicina

Área % S CV,% % de Rec.

CV da % de Rec.

80

32322 80,24

80,15 0,74 0,92

100,30

0,92

31936 79,28 99,10

31953 79,32 99,16

32511 80,71 100,89

32685 81,14 101,43

32315 80,22 100,28

100

40428 100,37

100,10 1,45 1,45

100,37

1,45

40887 101,51 101,51

39521 98,11 98,11

40528 100,61 100,61

40872 101,47 101,47

39689 98,53 98,53

120

49012 121,68

120,64 0,86 0,71

101,40

0,71

48225 119,72 99,77

49001 121,65 101,37

48562 120,56 100,47

48236 119,75 99,79

48535 120,49 100,415

87

Através dos dados obtidos nas Tabelas 19, 20, 21 e 22, pôde-se verificar que

os métodos 3 e 4 apresentaram exatidão aceitável. A Farmacopeia Brasileira 5ª

edição e a ANVISA (BRASIL, 2003) não preconizam o critério de aceitação para o

teste da exatidão, dessa forma adotou-se a Farmacopeia Americana, onde a mesma

cita que na exatidão, o coeficiente de variação da porcentagem de recuperação não

deve ultrapassar os 2% da concentração teórica (USP, 2010).

Os critérios estabelecidos pela Association of Official Analytical Chemists

AOAC (2002), baseados no estudo desenvolvido por Horwitz (Trombeta de Horwitz)

(1995), também indicam um intervalo de recuperação aceitável relacionando com os

níveis de concentração dos analitos conforme descrito na Tabela 23 (BRITO et al.,

2003).

Tabela 23 - Intervalo de recuperação do analito em função de sua

concentração na amostra.

Concentração do analito (%) Intervalo de recuperação (%)

≥ 10 98 – 102

≥ 1 97 – 103

≥ 0,1 95 – 105

≥ 0,01 90 – 107

≥ 0,001 – 0,00001 80 – 110

≥ 0,000001 60 – 115

≥ 0,0000001 40 – 120

(Adaptado de HORWITZ, 1982; BRITO et. al., 2003)

Desta forma, o método 3 por CLAE e o método 4 por CLUE cumpre com as

exigências, uma vez que o maior CV da porcentagem de recuperação encontrado

dentre os quatro fármacos foi de 1,65% na concentração de 100% para o etambutol

por CLAE e de 1,86% para a concentração de 100% da isoniazida por CLUE.

88

5.4.6 Robustez

Quanto à robustez, não foi realizado mudanças em outros parâmetros devido

às mudanças já observadas no desenvolvimento do método. Uma vez que pequenas

mudanças na proporção da fase móvel já alterariam os valores de adequabilidade do

sistema, ultrapassando-os.

Por esse motivo, apenas as variação dos parâmetros de temperatura da coluna

e fluxo da fase móvel nos métodos 3 e 4 foram realizadas e estão apresentadas nas

Tabelas 24 e 25.

Observou-se que os métodos apresentaram variações nos tempos de retenção

dos compostos, antecipando suas eluições. As mudanças também influenciaram

negativamente nas resoluções dos picos, concluindo-se desta forma a importância no

bom desempenho do equipamento, uma vez que mesmo com ambos os

equipamentos (CLAE e CLUE) estando com qualificação em dia, conseguiram

detectar a sutil mudança, principalmente da resolução entre os picos de isoniazida e

rifampicina.

Propõe-se a modificação de outros parâmetros para avaliar se o mesmo perfil é

observado ou não.

Tabela 24 - Adequabilidade do sistema no estudo da robustez da temperatura do forno da

coluna nos métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente.

Robustez

Temperatura (°C)

Tempo de retenção Resolução

Substâncias 28°C 30°C 32°C 28°C 30°C 32°C

Méto

do

3

Isoniazida 3,304 3,264 3,223 - - -

Pirazinamida 4,178 4,112 4,109 1,898 2,081 1,763

Etambutol 9,991 9,955 9,900 11,02 10,096 10,78

Rifampicina 16,84 16,877 16,12 13,87 13,197 13,02

Mé

tod

o 4

Isoniazida 0,490 0,486 0,478 - - -

Pirazinamida 0,601 0,597 0,590 1,97 2,002 1,89

Etambutol 2,098 2,053 2,091 10,02 10,123 9,87

Rifampicina 3,701 3,671 3,655 11,01 11,199 12,03

89

Tabela 25 - Adequabilidade do sistema no estudo da robustez do fluxo da fase móvel nos

métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente.

Robustez

Fluxo (mL.min-1)

Tempo de retenção Resolução

Substâncias 0,7 0,8 0,9 0,7 0,8 0,9

Mé

tod

o 3

Isoniazida 3,377 3,264 3,025 - - -

Pirazinamida 4,278 4,112 4,032 1,986 2,081 1,883

Etambutol 10,021 9,955 9,590 12,66 10,096 9,89

Rifampicina 16,98 16,877 15,89 13,23 13,197 12,87

0,4 0,5 0,6 0,4 0,5 0,6

Mé

tod

o 4

Isoniazida 0,594 0,486 0,432 - - -

Pirazinamida 0,703 0,597 0,548 1,873 2,002 1,732

Etambutol 2,132 2,053 1,982 12,32 10,123 9,45

Rifampicina 3,921 3,671 3,430 14,94 11,199 10,84

5.5 Resumo das validações por CLAE e CLUE

A tabela 26 lista todos os parâmetros, bem como seus resultados, que foram

avaliados durante a validação dos métodos 3 e 4 por CLAE e CLUE, respectivamente.

90

Tabela 26 - Estudo da validação dos métodos analíticos 3 e 4 para tuberculostáticos por CLAE e CLUE, respectivamente.

Substância tR

Linearidade Limites teóricos Exatidão Precisão

Intervalo

(µg/mL) Equação r

LD

(µg/mL)

LQ

(µg/mL)

Concentração teórica (µg/mL)

Recuperação

(%)

Dia 1 Dia 2 Repetibilidade

Concentração teórica (µg/mL)

Recuperação + CV

(%)

Recuperação+ CV

(%)

CV (%)

CL

AE

ISN 3,26 5,6 – 10,4 y = 1610,06x

+ 3094,04 0,9985 0,1928 0,2920

6,40 100,88 ± 0,61 8,0 101,91 ± 4,36 98,17 ± 4,13 1,89 8,00 99,72 ± 0,38

9,50 100,22 ± 0,70

PYR 4,11 30,1 – 55,9 y = 20806,06x

+ 65466,52 0,9982 0,6880 1,0449

34,40 100,09 ± 1,03

43,00 100,33 ± 0,86 100,26 ± 0,73 0,93 43,00 99,80 ± 0,92

51,60 100,14 ± 0,86

ETA 9,95 21 - 39 y = 2211,20x

+ 3894,69 0,9959 0,7200 1,0950

24,00 100,06 ± 1,29

30,00 103,06 ± 3,25 98,49 ± 3,91 1,77 30,00 100,36 ± 1,67

36,00 99,83 ± 0,72

RIF 16,87 11,2 – 20,8 y= 4631,36x –

5863,73 0,9956 0,9408 1,4272

12,80 100,35 ± 1,18

16,00 101,96 ± 2,07 100,79 ± 1,83 1,98 16,00 100,41 ± 1,55

19,20 99,59 ±1,04

CL

UE

ISN 0,486 5,6 – 10,4 y = 290,18x +

55,52 0,9963 0,1424 0,2160

6,40 100,19 ± 1,54 8,0 98,30 ± 3,42 98,00 ± 4,16 1,59 8,00 99,63 ± 1,51

9,50 99,46 ± 0,60

PYR 0,597 30,1 – 55,9 y = 3815,08x + 19703,11

0,9950 0,3108 0,4712

34,40 101,23 ± 0,53

43,00 95,11 ± 1,48 93,18 ± 1,55 1,95 43,00 100,23 ± 1,29

51,60 100,12 ± 0,42

ETA 2,053 21 - 39 y = 587,03x –

605,88 0,9986 0,297 0,4500

24,00 100,75 ± 0,76

30,00 92,96 ± 1,59 93,35 ± 2,23 1,76 30,00 99,92 ± 0,56

36,00 101,18 ± 0,57

RIF 3,671 11,2 – 20,8 y= 411,76x –

794,69 0,9965 0,1520 0,2320

12,80 100,19 ± 0,92

16,00 95,39 ± 2,41 97,25 ± 1,12 1,38 16,00 100,10 ± 1,45

19,20 100,53 ±0,71

91

5.6 Comparação entre CLAE e CLUE

Dentre os fatores mais importantes no estudo comparativo entre os dois

equipamentos (CLAE e CLUE), relatam-se o volume gasto de fase móvel e o

tempo gasto para a realização de uma análise, como demonstrado na Tabela

27.

Devido à grande diminuição no tempo de análise e ao fluxo de fase

móvel, o volume de fase móvel gasto na análise do CLUE chegou a ser de

aproximadamente 88% a menos, quando comparado à análise por CLAE,

excluindo-se o volume gasto de fase móvel para estabilizar o sistema e a

coluna. Quando se extrapola esse valor para o estudo completo da validação

(com um total de aproximadamente 95 análises, compreendendo a

especificidade/seletividade, linearidade, exatidão, precisão e robustez, com

suas respectivas réplicas), percebe-se a grande diferença, principalmente em

relação à economia da análise, uma vez que ocorre uma redução dos custos

de aproximadamente 88% em uma validação por CLUE quando se compara a

uma validação por CLAE, devido ao custo dos reagentes para a produção da

fase móvel, os quais possuem alto valor agregado.

Outro fator importante que é observado representa o fato do volume de

injeção necessário. Esse fator auxilia principalmente em estudos com matrizes

complexas, os quais na maioria das vezes se obtêm um baixo volume de

recuperação. Dessa forma, estudos em matrizes biológicas vêm sendo

aplicados com maior ênfase na utilização por CLUE (PAGLIA et. al., 2012;

BOELAERT et. al., 2013; ALWIS et. al., 2012; LIU et. al., 2012; PROENÇA et.

al., 2012).

THAKKAR et. al., (2011) e ORTEGA et. al., (2010) relatam um estudo

comparativo entre CLAE e CLUE utilizando outros fármacos, no entanto a

conclusão para todos os autores é a mesma, onde o CLUE apresenta maior

sensibilidade aos fármacos, ocorre uma grande diminuição do tempo de análise

e a análise torna-se menos dispendiosa.

92

Tabela 27 - Estudo comparativo do volume gasto de fase móvel nas análises entre

CLAE e CLUE.

Parâmetro CLAE CLUE

Tempo de Análise 20 minutos 4 minutos

Fluxo de fase móvel 0,8 mL,min-¹ 0,5 mL,min-¹

Volume de injeção 12 µL 2 µL

Volume de fase móvel gasto em uma análise 16 mL 2 mL

Volume de fase móvel gasto na Especificidade/Seletividade

384 mL 48 mL

Volume de fase móvel gasto na Linearidade 336 mL 42 mL

Volume de fase móvel gasto na Exatidão 288 mL 36 mL

Volume de fase móvel gasto na Precisão 288 mL 36 mL

Volume de fase móvel gasto na Robustez 192 mL 24 mL

Coluna utilizada C8 - 125 mm x

4 mm x 5 µm

C18 - 30 mm x 2 mm x 2,2 µm

A Figura 19 representa os cromatogramas resultantes das diferenças

entre a solução padrão e a solução branco, por CLAE e CLUE, o qual

representa a grande diferença do tempo necessário para realizar a análise em

cada equipamento.

93

Figura 17: Comparação dos cromatogramas entre CLUE (A) e CLAE (B) das

resultantes da solução padrão pela solução branco, Os picos de 1 a 4 referem-se à

isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina, respectivamente.

CONCLUSÕES

94

6 CONCLUSÕES

O sistema de gradiente para detecção dos 4 fármacos tuberculostáticos foi

desenvolvido e mostrou que o sistema de fase móvel constituinte de

Tampão Acetato, Metanol e Acetonitrila eram capazes de identificar e

quantificar os tuberculostáticos. Quando os métodos 1 e 2 foram

comparados, o método 2 mostrou ser mais adequado, no entanto houve a

necessidade de usar o metanol como constituinte orgânico na fase móvel A,

devido à mesma proporcionar uma melhora resolução entre os picos de

isoniazida e pirazinamida e, a acetonitrila na fase móvel B;

Após a obtenção do sistema de fase móvel (fase móvel A: tampão

acetato:metanol 94:6 v/v; fase móvel B: tampão acetato:acetonitrila 55:45

v/v), o método analítico foi otimizado, com base na WHO (2006) e houve o

desenvolvimento e validação do método por CLAE;

A validação dos métodos analíticos por CLAE e CLUE foi realizada com a

determinação da especificidade/seletividade, linearidade, precisão, limite de

detecção e limite de quantificação, exatidão e robustez;

Os métodos apresentaram-se adequados para determinação dos 4

fármacos, onde nenhum fármaco mostrou interferência nos demais;

Os métodos mostraram-se precisos, devido ao fato de que os métodos

demonstraram que mesmo com variação de dias, além da repetibilidade,

usando amostras homogêneas e autênticas, os valores ficaram dentro da

faixa preconizada na legislação vigente;

Os métodos mostraram-se lineares (coeficientes de correlação superiores a

0,99), ou seja, os métodos foram capazes de demonstrar que os resultados

obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na

amostra, dentro de um intervalo especificado;

95

O LD e LQ teóricos apresentaram valores próximos dos reais, no entanto,

quando comparado as duas técnicas, o CLUE apresentou maior

sensibilidade aos fármacos;

Os métodos mostraram-se exatos, uma vez que os métodos demonstraram

que os mesmos foram capazes de apresentar valores de coeficiente de

variação e porcentagem de recuperação dentro dos limites exigidos (98 a

102%);

A robustez foi avaliada frente às alterações de temperatura e fluxo, onde os

métodos demonstraram-se robustos apenas nas condições previamente

estabelecidas de temperatura e fluxo, alterações bruscas podem acarretar

influência nos resultados dos métodos, desta forma propõe-se a mudança

de outros parâmetros para avaliar se ocorre a formação do mesmo perfil;

Houve uma grande diferença entre os métodos por CLAE e CLUE, quando

relacionado ao tempo e aos custos das análises. Tendo em vista que a

mesma validação analítica realizada no CLUE proporcionou uma economia

de 88% do sistema de fase móvel o que gera uma grande economia para a

pesquisa e a indústria. Além de realizar as análises em curto espaço de

tempo, também de ter apresentado resultados mais sensível dos fármacos.

96

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

97

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