UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

NATHÁLIA REGINA SOBRAL PAIVA

EFEITOS DE UMA CEPA TÓXICA (CYLINDROSPERMOPSIS RACIBORSKII) NA

SOBREVIVÊNCIA DO COPÉPODO TROPICAL NOTODIAPTOMUS IHERINGI

NATAL-RN

2018

NATHÁLIA REGINA SOBRAL PAIVA

EFEITOS DE UMA CEPA TÓXICA (CYLINDROSPERMOPSIS RACIBORSKII) NA

SOBREVIVÊNCIA DO COPÉPODO TROPICAL NOTODIAPTOMUS IHERINGI

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à

Banca Examinadora do Bacharelado em Ciências

Biológicas, da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, em cumprimento às exigências

legais, como requisito à obtenção do título de

Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientadora: Profa. Dra. Renata de

Fátima Panosso.

Coorietador: Dr. Kemal Ali Ger.

NATAL-RN

2018

AGRADECIMENTOS

Gostaria de iniciar meus agradecimentos pelo Professor Guilherme Fulgêncio e à toda

família que fiz dentro do Ecotox-Lab. Foi lá que dei início à minha trajetória acadêmica

dentro do curso de Biologia da Universidade e de onde surgiu a minha paixão pelo universo

planctônico. “Seu Guila”, o senhor sempre esteve disponível, disposto a ouvir as necessidades

de cada um e a aprender conosco, ainda que, ironicamente, fosse o mais experiente. Sou muito

grata por você não ter exitado, em momento algum, em me apoiar quando decidi seguir outros

caminhos. Aline, Alê (Alexsandra), Thiago, Priscila, Ernani, Samuel, Jaísa, Ivanildo, nosso

agregado Raoni, e tantos outros que passaram pelo laboratório, eu sou muito grata a vocês.

Vocês fizeram da minha graduação os momentos mais saborosos. Já abro o sorriso só de

pensar em cada um de vocês. Obrigada por todos os conselhos. Todos aqueles nossos papos

cheios de vigor e empolgação sobre ciência, religião, política, vida extraterrena, séries,

relacionamentos, dúvidas existenciais...já sinto tanta falta de todos eles!

Ao LAMAq e a todos os que passei a conviver nestes novos caminhos, obrigada pela

acolhida! Renata, agradeço por se fazer tão presente, ainda quando distante. Como diz Thiago,

você é minha “mãe acadêmica”. E esse “título” não é à toa, você é, para mim, uma exemplar

referência feminina na ciência. Ao Ali, sou grata por estar sempre ao nosso lado. É o primeiro

a cobrar, mas também o primeiro a estender o braço e não deixar ninguém desistir. É bonito

ver a sua dedicação ao laboratório. A forma como você se mantém curioso e apaixonado pelo

que faz e descobre, ainda que tanto tempo tenha nesse universo, é admirável. Ewaldo, quando

eu entrei no laboratório, eu encontrei em você um amigo, além de um generoso parceiro de

trabalho. Não é novidade o quanto o admiro como pessoa e como profissional. Ingrid, você

chegou quando a gente mais precisava. Você é muito dedicada e muito disposta a apreender;

apesar de ter ficado com a responsabilidade de me ajudar, eu tenho a certeza que quem mais

aprendeu com toda essa convivência fui eu. Rayane e Maiara, obrigada por todos os

ensinamentos. A energia de vocês é muito bem-vinda no laboratório. Rayane, agradeço em

particular por ter cuidado tão bem das “minhas” amostras e ter assumido uma

responsabilidade que, a princípio, nem era sua. Walter, Aninha e Gabi, como poderia me

esquecer de vocês? Sinto falta de cada um no dia-a-dia do LAMAq.

Aos meus amigos do curso de ciências biológicas, agradeço por terem compartilhado

comigo tantos momentos de angústias e de felicidades. Sou muito grata em ter participado de

uma turma tão unida, honesta, estudiosa e generosa. Paolla Cynthia, Raquel e Ana, guardo

com carinho a lembrança das nossas madrugadas de trabalho. A garra de vocês nas

apresentações me fazia, também, forte. Let (Letícia), Nath (Nathália), Nanda (Fernanda), Juh

(Julianne), Júlio, Gracinha e tantos outros...admiro cada um de vocês! Cynthia e Paolla,

agradeço mais uma vez a vocês, bem como a Mizzi (Mizziara), por terem, junto comigo,

embarcado na Iniciativa Júnior da Biologia.

Ao Forró na UFRN e a todos os integrantes do projeto, agradeço por todos os

momentos de descontração, dança e sentimento que contribuíram para que os meus anos de

graduação fossem mais suaves e divertidos.

À minha família, minha eterna gratidão!

Aos organismos planctônicos que morreram

para que esta pesquisa fosse possível.

APRESENTAÇÃO

O presente trabalho tem como objetivo verificar o efeito da cianobactéria filamentosa

e produtora de neurotoxinas Cylindrospermopsis raciborskii na sobrevivência do copépodo

tropical Notodiaptomus iheringi. Ele propõe-se a ser um artigo com fins de publicação futura

na Revista Acta Brasiliensis. O artigo é dividido nas seguintes seções: Introdução, onde

constam a contextualização geral do tema, as limitações existentes na área de estudo, a

hipótese e o objetivo da pesquisa; Materiais e Métodos, os quais são subdivididos nas

seguintes subseções: Culturas de Microrganismos, Culturas de Fitoplâncton, Biomassa de

Carbono, Culturas de Zooplâncton, Experimento de Sobrevivência, e Análises Estatísticas;

Resultados e discussão, onde estão apresentados os resultados obtidos e a discussão embasada

na literatura pertinente; e Conclusões, seção cuja ideia geral dos resultados é apresentada

juntamente com as proposições para pesquisas futuras. Por fim, informações adicionais

(imagens, gráficos e experimento preliminar) pertinentes a este trabalho de conclusão de

curso, mas que não necessariamente estão integradas à proposta do artigo, estão dispostas nos

Apêndices.

ARTIGO A SER PUBLICADO NA REVISTA ACTA BRASILENSIS

<http://revistas.ufcg.edu.br/ActaBra/index.php/actabra>

1

Efeitos de uma cepa tóxica (Cylindrospermopsis raciborskii) na sobrevivência do

copépodo tropical Notodiaptomus iheringi

Nathália Regina Sobral Paivaª*, Renata Panossoᵇ, Kemal Ali Gerᵇ

aLaboratório de Microbiologia Aquática, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Natal, Brasil.

*natyspaiva@gmail.com bPrograma de Pós-Graduação em Ecologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Natal,

Brasil.

Resumo

Em lagos rasos de regiões semiáridas tropicais há expressiva coexistência de copépodos planctônicos com

florações de cianobactérias, apesar dos seus conhecidos efeitos potencialmente tóxicos em diferentes

organismos. O presente trabalho investigou o efeito da cianobactéria filamentosa Cylindrospermopsis raciborskii

produtora de neurotoxinas na sobrevivência do copépodo tropical Notodiaptomus iheringi. Em um experimento

in vitro indivíduos de N. iheringi foram expostos a 3 tratamentos (3 réplicas cada) quanto à suspensão alimentar:

100% Cryptomonas obovata, alimento considerado de boa qualidade; 100% C. raciborskii, alimento considerado

de baixa qualidade; e Privação Alimentar. Cerca de 8 indivíduos foram alocados em cada unidade experimental

(200 mL). A sobrevivência dos copépodos foi monitorada por 14 dias. A sobrevivência de N. iheringi exposto à

cianobactéria foi superior à dos animais em Privação Alimentar (66,67%). Não houve diferença significativa

entre a sobrevivência dos organismos expostos ao alimento de boa qualidade e à cianobactéria. Esses resultados

indicam que C. raciborskii pode suprir pelo menos parte das necessidades nutricionais do copépodo e apontam

também para a existência de tolerância de N. iheringi frente à C. raciborskii; o que explica, em alguma medida, a

coexistência dessas espécies nos ambientes naturais. Estudos futuros poderão comprovar se essa cianobactéria,

apesar de não exercer efeitos deletérios na sobrevivência, causa efeitos subletais ao copépodo.

Palavras-chave: Cianobactéria. Zooplâncton. Toxicidade. Interações tróficas. Águas interiores.

Effects of a toxic strain (Cylindrospermopsis raciborskii) on the survival of the tropical

copepod Notodiaptomus iheringi

Abstract

In shallow lakes of tropical semiarid regions there is an expressive coexistence of planktonic copepods with

cyanobacteria blooms, despite their potentially toxic effects on different organisms. The present study aims to

investigate the effect of filamentous cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, which produce

neurotoxins, on the survival of tropical copepod Notodiaptomus iheringi. In an in vitro experiment, N. iheringi

individuals were exposed to 3 treatments with 3 replicates each for food suspension: 100% Cryptomonas

obovata, good quality food; 100% C. raciborskii, poor quality food and Starvation. About 8 individuals were

allocated in each experimental unit (200 mL). Copepod survival was monitored during 14 days. The survival of

N. iheringi was higher when exposed to cyanobacteria than in Starvation treatment (66.67%). There was no

significant difference between the survival of organisms exposed to good and poor quality food. These results

indicate that C. raciborskii can provide at least part of nutritional needs of copepods and suggest the existence of

tolerance of N. iheringi to C. raciborskii; that explains, to a certain extant, the coexistence of those two species

in natural environments. Future studies can prove whether this cyanobacteria, besides having no negative effects

in survival, can cause sub-lethal effects on this copepod.

Keywords: Cyanobacteria. Zooplankton. Toxicity. Grazing. Inland Waters.

Introdução

Forças catalisadoras como a eutrofização cultural e o aquecimento global têm

impactado os ecossistemas aquáticos ao favorecerem tanto a expansão como a intensidade e a

duração de florações de cianobactérias nas últimas décadas (Paerl e Huisman, 2008; Paerl e

Huisman, 2009; Smith e Schindler, 2009; Paerl et al., 2011; Antunes et al., 2015). Dentre

outras características, a plasticidade ecofisiológica garante às cianobactérias respostas mais

eficientes a essas mudanças (Paerl e Huisman, 2009; Antunes et al., 2015). Atributos como

esse assumem grande relevância em virtude da prevalência de cianobactérias acarretar em

2

consequências tanto para o funcionamento de ecossistemas quanto para a saúde humana

(Smith e Schindler, 2009).

Em ecossistemas aquáticos, florações de cianobactérias podem ser limitantes à

produção secundária zooplanctônica, comprometendo o fluxo de energia e de nutrientes ao

longo da cadeia trófica (Sunda et al., 2006; Brett et al., 2009). Em virtude do potencial tóxico,

da capacidade de formação de florações – filamentos ou agregados – e do baixo teor

nutricional, vários trabalhos experimentais têm mostrado que cianobactérias reduzem o fitness

das mais diversas espécies de zooplâncton (Wilson et al., 2006; Karjalainen et al., 2007), com

consequências que vão desde prejuízos ao crescimento e à reprodução (Soares et al., 2008;

Costa et al., 2013; Bednarska et al., 2014) até a sobrevivência desses organismos (DeMott e

Carmichael, 1991; Costa et al., 2013; Ger e Panosso, 2014). Em resposta a esses efeitos, o

zooplâncton possui estratégias, passivas ou ativas, de evitar (ex.: grandes cladoceros

generalistas) ou restringir (ex.: copépodos seletivos) a ingestão de células tóxicas ou, ainda,

de maximizar a tolerância aos compostos tóxicos por meio de mecanismos de detoxificação

(Ger et al., 2014; Ger et al., 2016a; Ger et al., 2016b). A maioria dos estudos utilizam

cladoceros generalistas de amplo tamanho corporal como modelos de herbívoros para a

investigação das respostas de fitness frente às cianobactérias (Ger et al., 2014). Entretanto, tais

cladoceros são incomuns ou raros em lagos rasos de regiões semiáridas tropicais (Sousa et al.,

2008), de modo que os padrões de respostas assumidos para o zooplâncton a partir desses

organismos não representam, necessariamente, as dinâmicas de interações planctônicas

predominantes em reservatórios de regiões semiáridas em situações cujas florações de

cianobactérias sejam dominantes (Ger et al., 2014). Consequências ao fitness de copépodos e

de pequenos cladoceros expostos às cianobactérias são ainda pouco exploradas (Wilson et al.,

2006; Ger et al., 2014).

Diferente dos cladoceros generalistas, copépodos podem maximizar a ingestão de

alimento ao selecionar o alimento de melhor qualidade nutricional por meio da detecção de

partículas com conteúdo tóxico, o que os fazem mais adaptados a coexistir com cianobactérias

(Ger et al., 2014). Além da toxicidade, esses dois grupos de herbívoros tendem a responder de

forma distinta à morfologia das cianobactérias; embora do ponto de vista metodológico seja

difícil discriminarmos efeitos da toxicidade e da interferência física das cianobactérias sobre o

fitness do zooplâncton (DeMott e Carmichael, 1991). Cladoceros apresentam dificuldade de

manusear filamentos (Bednarska et al., 2014) e podem ter o aparato de filtração entupido

(Gliwicz, 1990), enquanto que copépodos não só conseguem manuseá-los, como ingerí-los

(Engstrom-ost et al., 2000; Panosso et al., 2003; Rangel et al., 2016; Leitão, 2018). Essa

interação copépodo-cianobactéria filamentosa tem ganhado interesse em virtude da expansão

de cianobactérias como Cylindrospermopsis raciborskii, cuja dispersão parece estar associada

à capacidade de adaptação frente às mudanças climáticas (Padisák, 1997; Antunes et al.,

2015).

Por resistir a altas temperaturas e salinidades e por ser apta à atividade fotossintética

em irradiações mais pronunciadas, além das características que a garante vantagens

competitivas sobre produtores primários eucarióticos (Padisák, 1997; Paerl e Huisman, 2009;

Antunes et al., 2015; Burford et al., 2016), C. raciborskii ocorre em lagos rasos de regiões

semiáridas tropicais, inclusive, em coocorrência com copépodos (Bouvy et al., 1999). Nessas

regiões, florações são frequentes e duradouras e a ocorrência de rotíferos e copépodos em

ambientes naturais mesotróficos e eutróficos do semiárido é bastante expressiva (Sousa et al.,

2008). Copépodos do gênero Notodiaptomus sp., por exemplo, coexistem em altas densidades

com florações (Panosso et al., 2003; Sousa et al., 2008).

Apesar da tendência de coexistência de C. raciborskii-copépodo não apenas no

semiárido como em muitos outros ecossistemas aquáticos em virtude da dispersão de C.

raciborskii, pouco se sabe sobre as consequências de C. raciborskii sobre o fitness de

3

copépodos. Nós investigamos a hipótese de que C. raciborskii tende a reduzir a sobrevivência

do copépodo N. iheringi. Logo, o presente trabalho objetiva verificar o efeito da cianobactéria

filamentosa e produtora de neurotoxinas Cylindrospermopsis raciborskii na sobrevivência do

copépodo tropical Notodiaptomus iheringi.

Materiais e Métodos

Culturas de Microrganismos

Os cultivos de fitoplâncton e zooplâncton, utilizados nos experimentos do presente

trabalho, são mantidos no Laboratório de Microbiologia Aquática da UFRN

(LAMAq/UFRN), em temperatura de 23ºC (± 1 ° C), com intensidade luminosa de 50 μmol

quanta 𝑚−2𝑠−1 e fotoperíodo de 12h claro:12h escuro.

Culturas de Fitoplâncton

As cepas de Cryptomonas obovata (CCMA-UFSCar 148, WDCM 835) foram cedidas

da Universidade Federal de São Carlos (Brasil) (Ger e Panosso, 2014), enquanto que as de

Cylindrospermopsis raciborskii (ITEP-A3) foram isoladas do Riacho do Pau (Universidade

Federal de Pernambuco, Recife, Brasil) (Gugger et al., 2005) e cedidas pela Central de

Laboratórios de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Ambas foram

mantidas em fase de crescimento exponencial por diluição de rotina em meio fresco de

Cryptophyte de Wright (WC). Frequentemente, as cepas foram agitadas com a finalidade de

evitar aglomerações (Ger e Panosso, 2014).

As células de C. obovata cresceram isoladas, com formato esferoide (média de 12,5 ×

6,5 μm) (Leitão, 2018) e apresentando motilidade. Sob as condições de cultivo, a densidade

média de células (n=1997 células) foi de 1,92 células/μL (±0,31 células/μL, intervalo de

confiança (IC) a 95%).

Já as células de C. raciborskii constituíram filamentos cilíndricos, retos ou curvos e

longos. O comprimento médio dos 600 filamentos mensurados foi de 311,725 μm (± 17,15

μm, IC a 95%), com mínimo de 20 μm e máximo de 1475 μm. O diâmetro médio de 2,6 μm.

Quanto à densidade média de filamentos, o valor encontrado foi de 4 filamento/uL (± 1

filamento/uL, IC a 95%). Conforme Soto-Liebe et al. (2013), a cepa ITEP-A3 é capaz de

produzir tanto saxitoxina (STX), como neosaxitoxina (neoSTX). De acordo com Renato

Molica, em comunicação pessoal, além da produção dessas suas variantes, inóculos da cepa

ITEP-A3 utilizadas no experimento foram também capazes de produzir dc-saxitoxinas (dc-

STX) e ganiautoxinas (GTX).

Biomassa de Carbono

Os volumes de suspensão alimentar foram definidos por meio da estimativa da

concentração de carbono nos cultivos. A quantidade de carbono equivalente para C.

raciborskii foi de ~0.11 mg C·L-¹, enquanto que para C. obovata foi de 0.5 mg C·L-¹. Esses

valores foram obtidos pela multiplicação das densidades de células (C. obovata) ou filamentos

(C. raciborskii), quantificadas via câmara de Neubauer, pelo biovolume, sendo aplicada a

seguinte fórmula: pgC. cell-1

= 0.1204 × (µm3)1.051 (Rocha e Duncan, 1985). Para C.

raciborskii foi necessário, ainda, estimar a biomassa média medindo-se, com auxílio de uma

ocular milimetrada do microscópio óptico (Olympus Optical, modelo CX41RF), o tamanho

dos filamentos (Leitão, 2018). Para transformação das unidades visualizadas na “régua” da

4

ocular em comprimento real (µm), na magnificação de 200x, as unidades medidas foram

multiplicadas por 5 (fator de conversão).

Culturas de Zooplâncton

Os copépodos foram inicialmente isolados do reservatório Gargalheiras

(6°24′S;36°35′W), localizado no semiárido do Rio Grande do Norte, Brasil, o qual possui

registros de eutrofização e presença de florações de cianobactérias frequentes e duradouras

(Sousa et al., 2008). Após passarem por limpeza e adaptação, foram mantidos, em laboratório,

em beckers (2L) com água mineral comercial, sob regime de renovação semi-estático,

alimentação semanal (0.5 mg C·L-¹) e aeração constante - filtro de ventilação Millex FG de

0,2 μm (Millipore, EUA) (Ger et al., 2016).

Antes de iniciado o experimento, parte dos náuplios e das fêmeas grávidas foram

separados dos cultivos-estoque, porém mantidos sob as mesmas condições. Quando atingiram

a fase adulta ou estágios C4/C5, os N. iheringi puderem ser utilizados para experimento.

Experimento de Sobrevivência

Os organismos (copépodos adultos ou copepoditos nos estágios C4 e C5) foram

submetidos à privação alimentar durante 24h para esvaziamento do trato digestivo. No dia

seguinte, os organismos foram filtrados (malha de 200 µm), colocados em placas de Petri e

separados em gotas. O sexo dos indivíduos foi determinado a partir de visualização de

caracteres sexuais secundários em microscópio óptico (Leica, modelo DM500, aumento de

100x), os quais só puderam ser observados em copepoditos a partir do estágio C5 e adultos.

Para o experimento foram preparados 3 tratamentos (3 réplicas cada) quanto à

suspensão alimentar: 100% C. obovata (0.5 mg C·L-¹), 100% C. raciborskii (~0.11 mg C·L-¹)

e Privação Alimentar. Cada tratamento foi alocado em beckers de ~300 mL, contendo WC

modificado (200 mL) e 8 copépodos em cada (com pelo menos 2 machos e 2 fêmeas). As

unidades experimentais foram mantidas em laboratório com aeração constante e condições de

temperatura, incidência luminosa e ciclos de claro/escuro similares às de cultivo (Figura 1).

5

Figura 1. Desenho do experimento de sobrevivência. Indivíduos experimentais submetidos à privação

alimentar e, posteriormente, aos tratamentos: 100% C. obovata; 100% C. raciborskii; e Privação

Alimentar.

A frequência de alimentação foi diária, bem como o monitoramento de sobrevivência,

durante 14 dias. A renovação do meio WC ocorreu duas vezes ao longo do período de

experimento (8º e 12º dia). Os organismos que aparentavam mortalidade eram retirados dos

beckers para evitar a proliferação de bactérias e de protozoários sem que houvesse reposição.

Em dias alternados, foi realizado monitoramento qualitativo de: acúmulo de filamentos ou

células; conteúdo no trato digestivo dos copépodos; presença de protozoários (nanoflagelados

heterotróficos) e de bactérias. Para tanto, 150 µL de amostra de cada réplica foram retirados,

em dias alternados, para melhor visualização em microscopia óptica (Olympus optical,

modelo CX41RF, aumento de 400x). Também fizeram parte desse monitoramento qualitativo

a observação da presença de fêmeas grávidas e de náuplios em cada tratamento.

Análises Estatísticas

Experimentos de sobrevivência pressupõem análises de dados sobre o tempo

transcorrido até a ocorrência de um evento (Martínez-González et al., 2008). No caso do

presente trabalho, o tempo de experimento foi de 14 dias e o evento esperado era a

mortalidade dos copépodos em cada tratamento. Todavia, nem todos os indivíduos

experimentais chegaram a morrer ao final do tempo de observação, sendo desconhecido,

portanto, o tempo exato de sobrevivência desses organismos. É isso que diferencia análises de

sobrevivência das análises estatísticas clássicas, pois para estas últimas precisaria de que

todos os indivíduos tivessem chegado a óbito ao final do experimento. Nas análises de

sobrevivência, dados correspondentes aos indivíduos que não resultaram no evento esperado

são chamados de censurados, pressupondo-se a partir desses dados que os organismos se

comportariam da mesma forma que o observado no tempo de experimento até a ocorrência da

mortalidade (Martínez-González et al., 2008).

Para avaliar os efeitos dos tratamentos quanto à suspensão alimentar na probabilidade

de sobrevivência dos copépodos, foi realizada uma análise de sobrevivência via riscos

proporcionais de Cox (Cox PHA); um modelo que leva em consideração dados não

6

paramétricos (Martínez-González et al., 2008). O Cox PHA foi utilizado para analisar os

efeitos da qualidade dos tratamentos 100% C. raciborskii e Privação Alimentar em relação ao

tratamento de 100% C. obovata. Para tanto, foi utilizado o pacote Survival Analysis, versão

2.38 (Therneau T., 2015), disponível no R software (R Core Team, 2016).

A tabela 1 apresenta o resumo da análise dos riscos proporcionais de Cox, comparando

a taxa de risco estimada entre os tratamentos. O "coeficiente” indica o logaritmo (coeficiente

de regressão) e o "exp (coef)" a taxa relativa de risco real. Coeficientes mais negativos

direcionam para sobrevivências menores e menores razões de risco indicam um risco

aumentado de mortalidade em comparação ao tratamento de C. obovata. O valor de Z é uma

estatística sumária que mostra a razão de cada coeficiente de regressão (razão de risco) para

seu erro padrão, de modo que valores menos negativos de Z indicam tempos de sobrevivência

mais longos e valores mais negativos indicam menor sobrevida. O valor P indica a

probabilidade de que os efeitos de um determinado tratamento na probabilidade de

sobrevivência sejam significativos (definidos como P <0,001).

Resultados e discussão

A sobrevivência de N. iheringi no tratamento com C. raciborskii, ao final de 14 dias,

foi superior à encontrada pelos organismos submetidos ao tratamento de Privação Alimentar,

indicando que a cianobactéria supriu, pelo menos em parte, as necessidades nutricionais

mínimas requeridas para a sobrevivência dos copépodos. Até o 3º dia de experimento não

ocorreu mortalidade dos indivíduos em nenhum dos tratamentos. Organismos mortos foram

observados a partir do 4º dia, sendo constatados no tratamento de Privação Alimentar. Nos

demais, só a partir do 6º e do 11º dias para o tratamento de C. raciborskii e para o de C.

obovata, respectivamente. Ao final do 14º dia, foram contabilizados 23 organismos vivos no

tratamento de C. obovata (95,83%) e 18 organismos no tratamento de C. raciborskii (75%),

em contraste com o tratamento de Privação Alimentar que só apresentou 2 organismos vivos

(8,33%) (Figura 2).

Figura 2. Sobrevivência (%) do copépodo N. iheringi ao longo de 14 dias de experimento. Os

resultados são apresentados separadamente para cada tratamento (Privação Alimentar, 100% C.

obovata 100% e C. raciborskii). Cada ponto representa a média diária da sobrevivência em três

réplicas, iniciadas com 8 organismos cada. As barras indicam o intervalo de confiança a 95%.

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Méd

ia (

%)

de

So

bre

viv

ênci

a +

IC

Dias

Privação Alimentar

100% C. obovata

100% C. raciborskii

7

Não houve diferença significativa de sobrevivência de N. iheringi entre os tratamentos

de C. raciborskii e de 100% C. obovata (20,83%), porém o contrário foi observado entre o

tratamento de Privação Alimentar e o de C. raciborskii (66,67%) (p<0,001) (Tabela 1).

Tabela 1. O resumo da análise dos riscos proporcionais de Cox demonstra os efeitos da sobrevivência

do copépodo N. iheringi submetido aos tratamentos com C. raciborskii e Privação Alimentar em

relação ao tratamento de C. obovata.

Fator Coeficiente Exp(coef) Z Pr(>|z|)

100% C. raciborskii -0.07553 0.92725 -0.992 0.321

100% Privação Alimentar -0.49866 0.60734 -5.894 <0.001

O valor de “p”, representado por “Pr(>|z|)”, indica se houve efeito significativo dos tratamentos em

relação ao controle. O "coeficiente” e "exp (coef)" indicam o logaritmo (coeficiente de regressão) e a

taxa relativa de risco real comparado ao tratamento de 100% C. obovata, respectivamente. O valor Z é

um resumo estatístico (valores mais negativos indicam tempos de sobrevivência mais curtos).

Nossos resultados indicam não haver efeitos de toxicidade aguda de C. raciborskii na

sobrevivência de N. iheringi, refutando em certa medida a nossa hipótese de que a presença da

cianobactéria tenderia a reduzir a sobrevivência do copépodo. Ger e Panosso (2014), por outro

lado, observaram efeitos de toxicidade aguda a N. iheringi expostos à outra cepa de

cianobactéria (Microcystis aeruginosa), indicando que o copépodo N. iheringi parece ser mais

sensível à cianobactéria M. aeruginosa do que à C. raciborskii. Este padrão pode ser

explicado pelo fato de que cianobactérias filamentosas aparentam ser alimentos de melhor

qualidade que cianobactérias unicelulares, como demonstrado na metanálise realizada por

Wilson et al. (2006), a qual se utilizou de resultados na literatura para encontrar padrões de

resposta de crescimento populacional de herbívoros a dois tipos de dietas (cianobactérias e

fitoplâncton de boa qualidade).

O efeito de C. raciborskii vem sendo testado em organismos zooplanctônicos

pertencentes a outros grupos taxonômicos. Dentre cladoceros, por exemplo, dietas únicas de

C. raciborskii podem não causar efeito agudo em Daphinia magna (Soares et al., 2008),

padrão semelhante ao encontrado para N. iheringi no presente estudo. Já outros copépodos,

como Diaptomus birgei, sofreram efeitos de toxicidade aguda quando expostos a níveis

elevados (106 células mL−1) e intermediários (10

5 células mL−1) da cianobactéria tóxica

filamentosa Anabaena flos-aquae (Dolichospermum flos-aquae) (DeMott et al., 1991). Essa

comparação dos nossos resultados com trabalhos anteriores indica que os efeitos de

cianobactérias sobre o zooplâncton são espécie-específicos, variando tanto com a identidade

da cianobactéria ofertada como alimento, como com a espécie do zooplâncton-alvo. Essa

susceptibilidade diferencial já tinha sido demonstrada por DeMott et al. (1991) e Costa et al.

(2013).

Além da identidade taxonômica, efeitos quantitativos poderiam ser sugeridos como

um dos responsáveis pela ausência de efeitos tóxicos em nossos resultados. Experimentos

laboratoriais têm demonstrado que maiores concentrações de cianobactérias e/ou cianotoxinas

podem, consequentemente, acarretar em maiores comprometimentos ao fitness do

zooplâncton (DeMott et al., 1991; Engstrom-ost et al., 2015). Logo, poderia ser esperado que

se os copépodos fossem expostos a uma concentração de 0.5 mg C·L-¹ de C. raciborskii,

concentração que garante suprimento adequado de energia aos organismos para a reprodução

(Ger et al., 2016a), eles estariam mais susceptíveis ao potencial tóxico da cianobactéria e, com

isso, efeitos de toxicidade aguda pudessem ser constatados. No entanto, parece pouco

provável que maiores concentrações de C. raciborskii contribuíssem para uma resposta de

fitness diferente à obtida em nossos resultados, pois o montante de C. raciborskii a que N.

8

iheringi foram expostos em menores concentrações (~0.11 mg C·L-¹) foi resultado de um

somatório de exposição diária. Parece mais razoável que o não comprometimento da

sobrevivência de N. iheringi expostos à cianobactéria seja resultado de tolerância do

copépodo frente à cepa tóxica de C. raciborskii. Tolerância de N. iheringi à cianobactéria

unicelular M. aeruginosa já foi sugerida por Ger et al. (2016a).

Além do comparativo com a Privação Alimentar, os resultados de C. raciborskii para a

sobrevivência de N. iheringi em relação aos de C. obovata merecem ser discutidos. Apesar de

cianobactérias aparentarem ser nutricionalmente mais pobres que clorofitas e flagelados

(Wilson et al., 2006), C. raciborskii não aparentou causar efeitos negativos sobre a

sobrevivência dos N. iheringi, quando comparado ao alimento de boa qualidade. Porém, a

energia obtida pela ingestão de cianobactérias pode ser alocada para a conversão de

precursores químicos em componentes essenciais, favorecendo a sobrevivência do herbívoro

em detrimento do crescimento e da reprodução (Bednarska et al., 2014), ou mesmo em favor,

também, do crescimento somático (Karjalainen et al., 2007). Diversos estudos na literatura já

demonstraram efeitos subletais de C. raciborskii sobre cladoceros (Soares et al., 2008; Costa

et al., 2013; Bednarska et al., 2014). A partir do nosso monitoramento qualitativo algumas

consequências ao copépodo N. iheringi puderam ser também percebidas: em 100% C.

obovata, foram observadas fêmeas grávidas e náuplios diariamente, enquanto que, em 100%

C. raciborskii e em Privação Alimentar, as únicas fêmeas grávidas presentes corresponderam

as que nesse estado já se encontravam quando iniciado o experimento; os náuplios, por sua

vez, eram provenientes dessas mesmas fêmeas. Ausência similar de produção de ovos

também foi observada por Ger e Panosso (2014) e Ger et al. (2016a) em situações a que N.

iheringi foram submetidos à privação alimentar ou a dietas únicas de M. aeruginosa. Isso

pode indicar que apesar de não exercer efeitos deletérios sobre a sobrevivência, outras

variáveis de fitness poderiam melhor refletir a qualidade nutricional de C. raciborskii, uma

vez que permitiriam identificar alterações no comportamento e na fisiologia dos copépodos.

Vale salientar que a possibilidade de N. iheringi ter sobrevivido no tratamento com C.

raciborskii por efeitos de trophic upgrading, pressupondo ingestão de protozoários

(nanoflagelados heterotróficos) em vez do consumo direto de cianobactéria, foi descartada.

Respostas de melhoria de fitness para cladoceros, como Daphinia magna, já foram

demonstradas por Bec et al. (2006), ao inserirem nanoflagelados heterotróficos

(Paraphisomonas sp.) em tratamentos com Daphinia magna exposta a cianobactérias como

M. aeruginosa. Todavia, de acordo com as nossas observações em microscopia óptica, o

experimento ocorreu sem contaminação por protozoários (nanoflagelados heterotróficos) ou

bactérias que pudessem interferir nos resultados. A presença de bactérias foi identificada,

apenas, em associação a organismos mortos. Além disso, os tratos digestivos dos N. iheringi

expostos à C. raciborskii foram observados, com frequência, cheios, o mesmo que ocorreu

com os organismos submetidos à C. obovata. Nos dois casos, a presença de conteúdo no trato

digestivo dos copépodos sugere a ingestão de alimento. Já o trato digestivo de N. iheringi

submetidos à privação alimentar foi encontrado, na maioria das vezes, vazio. Também não

foram observados acúmulos de filamentos de cianobactéria e de células de C. obovata nas

unidades experimentais, sugerindo, mais uma vez, que ambos estavam sendo consumidos. A

capacidade de copépodos ingerirem filamentos de C. raciborskii já foi demonstrada em

trabalhos experimentais anteriores (Rangel et al., 2016; Leitão, 2018).

Esse foi um dos poucos estudos que associaram repostas de copépodos à cianobactéria

filamentosa C. raciborskii. Compreender a dinâmica de interações como essa, que parecem já

se estabelecer em lagos rasos de regiões semiáridas tropicais, pode permitir entender o

funcionamento de ecossistemas aquáticos impactados pelas forças de eutrofização e do

aquecimento global, fornecendo bases para a implementação de futuras medidas de manejo da

qualidade de corpos aquáticos.

9

Conclusões

No presente estudo demonstramos que uma cepa de C. raciborskii, produtora de

neurotoxinas, não causa efeitos agudos na sobrevivência do copépodo N. iheringi, pelo menos

nas condições analisadas. Em virtude de não ter havido, na presença de dietas únicas de C.

racirborskii, efeitos deletérios significativos (toxicidade aguda) sobre a sobrevivência de N.

iheringi, é válido investigar, em estudos subsequentes, as possibilidade de: haver distinções

de tolerância por gênero; ocorrer toxicidade aguda em maiores concentrações de C.

raciborskii; acarretar em efeitos subletais aos copépodos. Sugere-se utilizar a taxa de

produção de ovos e o sucesso de eclosão como medidas de fitness para testar os possíveis

efeitos subletais aos copépodos.

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13

APÊNDICE A – Ensaio Preliminar

Antes de se chegar à metodologia e ao desenho experimental utilizados no

experimento de sobrevivência deste trabalho de conclusão de curso, alguns ensaios prévios

foram executados nas dependências do Laboratório de Microbiologia Aquática

(LAMAq/UFRN). Observamos, a partir desses ensaios, que havia ocorrência de bactérias e

protozoários nas unidades experimentais. O meio utilizado nesses primeiros experimentos foi

a água mineral comercial já utilizada nos cultivos do laboratório. Logo, procurando evitar que

respostas advindas de um experimento de sobrevivência a que copépodos estariam expostos à

cianobactéria pudessem ter interferência desses outros microrganismos, a exemplo de

possíveis efeitos de trophic upgrading (Bec et al., 2006), outro ensaio foi realizado.

O referido ensaio preliminar foi executado com o objetivo de entender se: a) o uso do

meio WC modificado autoclavado como meio para o experimento, diferente da água mineral

comercial utilizada no cultivo, favoreceria a ocorrência de bactérias e protozoários

(nanoflagelados heterotróficos); b) os protozoários nanoflagelados estavam associados à

presença ou simples inoculação de N. iheringi ou, ainda, c) se a presença dos protozoários

nanoflagelados estava associada à presença de C. raciborskii.

Para tanto, as nossas hipóteses foram as de que houvessem bactérias e protozoários em

3 e 4, mas não em 1 e 2 (h1), a concentração de bactérias e protozoários em 3 fosse igual ou

superior a 4 (h2), ocorresse acúmulo de filamentos de C. raciorskii em 2 (h3) (Figura A-1).

Metodologia

Esse experimento foi precedido de privação alimentar por 24h com organismos

mantidos em beckers com 600 mL WC modificado. O experimento foi configurado para 4

tratamentos quanto à suspensão alimentar e presença/ausência de copépodos, a saber: 1 -

Privação Alimentar + N. iheringi; 2 - 100% C. raciborskii ; 3 - 100% C. raciborskii + N.

iheringi; 4 - 100% C. raciborskii + N. iheringi (1 dia). Beckers (250 - 300 mL) com meio Wc

modificado autoclavado (100 mL) contendo 5 organismos em cada, com exceção do

tratamento sem copépodos, mantidos durante 7 dias de experimento (Figura A-1).

14

Figura A-1. Desenho do experimento do experimento preliminar. Indivíduos experimentais

submetidos à privação alimentar e, posteriormente, aos tratamentos: 1 – Privação Alimentar e 2 –

Tratamentos (4): 1 Privação Alimentar + copépodos; 2 - 100% C. raciborskii; 3 - 100% C. raciborskii

+ copépodos; 4 - 100% C. raciborskii + copépodos (1 dia).

A concentração de carbono nos tratamentos com C. raciborskii foi de ~0.11 mg C·L-¹.

Os organismos do tratamento 4, passadas 24h, foram retirados do experimento e tiveram o

conteúdo do trato digestivo já verificado, ainda que não tivessem mortos. Apenas uma réplica

de cada tratamento foi utilizada para este ensaio. A frequência de alimentação foi diária, bem

como o monitoramento de sobrevivência, durante 7 dias. Os organismos que aparentavam

mortalidade foram retirados dos beckers para evitar a proliferação de bactérias e de

protozoários. Diariamente, foi realizado monitoramento qualitativo de: acúmulo de

filamentos; conteúdo no trato digestivo dos copépodos; presença de protozoários

(nanoflagelados heterotróficos) e de bactérias. Para tanto, amostras de cada réplica foram

retiradas, quando necessário, para melhor visualização em microscopia óptica (Olympus

optical, modelo CX41RF, aumento de 400x).

As unidades experimentais foram mantidas em laboratório com aeração constante,

temperatura de 23ºC (± 1 ° C), intensidade luminosa de 50 μm mol quanta 𝑚−2𝑠−1 e

fotoperíodo de 12h claro:12h escuro (condições similares às de cultivo).

Resultados Qualitativos

Com base nesse experimento preliminar, alguns dados qualitativos puderam ser

constatados. Diferente de nossas hipóteses, bactérias e protozoários (nanoflagelados

heterotróficos) não foram detectados ao longo do experimento em nenhum dos tratamentos.

15

Bactérias só foram observadas em associação com organismos mortos. Filamentos de C.

raciborskii, por sua vez, só foram acumulados no tratamento com a cianobactéria na ausência

do copépodo (2), conforme esperado. Nos demais tratamentos esse acúmulo não pôde ser

constatado, sugerindo que os filamentos estavam sendo consumidos. Copépodos em

tratamentos com C. raciborskii encontravam-se com o trato digestivo, frequentemente, cheio,

quando comparados aos N. iheringi submetidos à privação alimentar. Ao final do ensaio

preliminar, todos os organismos permaneceram vivos.

A partir desse ensaio, o meio WC modificado mostrou-se adequado para a realização

de experimentos, uma vez que não foi observado um crescimento de bactérias e protozoários

(nanoflagelados heterotróficos) nas unidades experimentais, descartando influencia desses

microrganismos em futuros resultados. Em vista disso, o experimento de sobrevivência pôde

ser executado.

16

¹Ferrão-Filho, A. da S; Soares, M.C.S.; Magalhães, V.F. de; Azevedo, S.M.F.O. 2010. A rapid bioassay for

detecting saxitoxins using a Daphnia acute toxicity test. Environmental Pollution, 158(6): 1084-1093. DOI:

https://doi.org/10.1016/j.envpol.2010.03.007

APÊNDICE B – Dimensões dos Filamentos de C. raciborskii

No presente trabalho, os tamanhos dos filamentos de C. raciborskii foram mensurados

com fins de calcular a biomassa de carbono, referente a ~0.11 mg C·L-¹, para a suspensão

alimentar de C. raciborskii utilizada no experimento de sobrevivência. O comprimento médio

dos 600 filamentos mensurados foi de 311,725 μm (± 17,15 μm, IC a 95%), com mínimo de

20 μm e máximo de 1475 μm. De acordo com o gráfico, o comprimento dos filamentos

aparentou não ter grandes variações ao longo de todo o experimento (Figura B-1) O diâmetro

médio dos filamentos de C. raciborskii foi de 2,6 μm.

Figura B-1. Distribuição da média do comprimento de 600 filamentos de C. raciborskii medidos ao

longo do experimento de sobrevivência. As barras indicam a média do comprimento de filamentos de

C. raciborskii para cada dia de medição. As linhas indicam o intervalo de confiança a 95%.

Esses valores foram semelhantes aos encontrados na literatura. No trabalho de Leitão

(2018), onde a mesma cepa de C. racirboskii (ITEP-A3) cresceu sob condições similares, a

média de comprimento foi de 549 µm (±101 µm, IC a 95%) e do diâmetro foi de 2,5 μm. Costa

et al. (2013) encontraram valores similares para outra cepa de C. racirboskii (T3) produtora

de saxitoxina (comprimento médio de 520 μm; mín.: 200 μm e máx.: 840 μm), com diâmetro

de 2,5 μm. Ferrão-Filho et al. (2010)¹, ao utilizarem a cepa CYRF-01 de C. racirboskii

(STX+), encontrou valores de tamanho de filamentos que variaram entre 77-310 μm, com

média de 172,75 μm (± 15,44 μm, IC a 95%, n = 50).

0

100

200

300

400

500

600

0 1 2 3 5 6 7 8 9 10 12 13

Tam

anh

o m

éd

io d

e f

ilam

en

tos

de

Cyl

(u

m)

+ IC

Tempo (d)

17

APÊNDICE C – Filamento de C. raciborskii

Figura C-1. Tricoma solitário de C. raciborskii com células cilíndricas e heterocito apical.

Microscópio óptico (Olympus optical, modelo BX41TF, objetiva de imersão, aumento de 1000x).

18

APÊNDICE D – Experimento de Sobrevivência

Figura D-1. Experimento de Sobrevivência (dia 0). Unidades experimentais correspondentes aos 3

tratamentos (3 réplicas cada) quanto à suspensão alimentar: 100% C. obovata; 100% C. raciborskii; e

Privação Alimentar.

19

APÊNDICE E – Notodiaptomus iheringi

Figura E-1. Fêmea grávida de Notodiaptomus iheringi no tratamento 100% C. obovata. Microscópio

óptico (Leica, modelo DM500, aumento de 200x).

Figura E-2. Macho de Notodiaptomus iheringi. Microscópio óptico (Leica, modelo DM500, aumento

de 100x).