UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE … · 2017-11-04 · ... (GLUTs). O aumento da expressão de GLUT 1 e GLUT 3 encontra-se relacionado com o comportamento agressivo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

CLARISSA FAVERO DEMEDA

ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE 1 E 3

EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DE LÁBIO INFERIOR E SUA RELAÇÃO

COM PARÂMETROS CLÍNICO-PATOLÓGICOS

Natal - RN

2012

CLARISSA FAVERO DEMEDA

ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE 1 E 3

EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DE LÁBIO INFERIOR E SUA RELAÇÃO


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia Oral do

Departamento de Odontologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte como parte

dos requisitos para obtenção do Título de

Mestre em Patologia Oral

Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto

Co-Orientador: Prof. Dr. Cassiano Francisco Weege Nonaka

Natal - RN

2012

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Demeda, Clarissa Favero.

Estudo da imunoexpressão dos transportadores de glicose 1 e 3 em carcinomas epidermóides de lábio inferior e sua relação com parâmetros clínico-patológicos / Clarissa Favero Demeda. – Natal, RN, 2012.

140 f.; il.

Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto.

Co-orientador: Prof. Dr. Cassiano Francisco Weege Nonaka.

Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

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“O que fizeres de bom ecoará para sempre. Mesmo que te desconheçam, as futuras gerações te abençoarão o esforço. E onde estiveres, experimentarás indefinível sensação de paz. As tuas boas obras hão de sobreviver contigo”.

Carlos Baccelli

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Aos meus pais (Sergio e Clenice) que sempre foram meus exemplos de superação,

coragem e perseverança. Com eles aprendi que nada é impossível, basta lutar e se dedicar.

Aos meus irmãos (Vinícius e Vanessa) companheiros nas horas difíceis e boas, por

sempre estarem ao meu lado e me apoiando nas minhas decisões.

Ao meu grande amor e futuro marido, Rodrigo Vilar, pelo apoio incondicional que

sempre tem me dado e pelo seu companheirismo. Por sempre compreender quando não pude

estar presente.

Essa conquista só foi possível com a ajuda de vocês!!

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“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não

fosse por elas, eu não teria saído do lugar. As

facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as

críticas nos auxiliam muito.”

Chico Xavier

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Agradeço, primeiramente, a Deus e aos Irmãos de luz, que sempre guiaram meu

caminho, e nunca me deixaram desistir, por mais difícil que cada conquista pareça ser.

“Toda escritura inspirada por Deus é proveitosa...” – Paulo (II Timóteo, 3:16).

Aos meus pais pelo apoio, amor e suporte. Sem as suas palavras e carinhos não

conseguiria seguir em frente. Aos meus irmãos pelas boas risadas e pelas boas brigas, que

sempre nos ensinam a lidar melhor com a vida e pelas palavras de conforto. Minha família

sempre será meu alicerce!

A Rodrigo, meu querido, nosso amor superou grandes obstáculos, desde os tempos de

graduação até hoje, com sua ajuda aprendi a ser uma pessoa melhor, a ser mais justa,

compreensiva e aprender que sou capaz. Essas qualidades são suas, com você ao meu lado

pude aflorá-las em mim a cada dia. Muito obrigada!

A minha tia Clezita, por ser minha segunda mãe. Sempre presente quando precisei e

por sempre torcer pelas minhas vitórias. A Cristiane, D. Cida e Gabriel, mesmo longe penso

em vocês como minha família, o amor e o acolhimento que recebi de vocês em Bauru sempre

estão comigo.

As amigas, Natalia, Débora, Roberta, Isabel, Danielle que estão sempre comigo,

desde nossa infância, por dividirem momentos de descontração e amizade.

Agradeço, especialmente, ao Profº Drº Leão Pereira Pinto, meu orientador para vida.

Pessoa batalhadora, competente, atenciosa e exemplo de dedicação à profissão. Muito

obrigada por me mostrar o caminho da investigação científica e o amor por lecionar.

Ao Profº Drº Cassiano Francisco Weege Nonaka por ter compartilhado comigo a

idéia desse estudo. Pelos inúmeros ensinamentos, pelos seus puxões de orelha, por ter

despertado em mim a autocrítica e a dedicação em tudo aquilo que faço. Sua ajuda foi

fundamental para a conclusão desse trabalho. Certamente, os conhecimentos adquiridos ao

longo desses dois anos jamais serão esquecidos.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral pelo apoio,

sempre! A Profª Drª Lélia Batista, pelo exemplo de dedicação e amor a patologia oral, sem

os quais a pós-graduação não seria a mesma. A Prof. Drª Roseana Almeida de Freitas, pela

excelente coordenação, pelas palavras e conhecimentos compartilhados. A Profª Drª Lélia

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Maria por sua doçura e maneira harmoniosa de conquistar a todos. As Profªs Drªs Márcia

Miguel e Éricka Janine, por sempre estimularem a nossa busca pelo conhecimento e

crescimento acadêmico. Ao Profº Drº Costinha, pelo ótimo convívio e pelos incentivos. A

Profª Drª Ana Miriam, pelos conhecimentos transmitidos, para que possamos atender melhor

aos nossos pacientes. A Profª Drª Hébel Cavalcanti por sua simpatia e exemplo de luta.

Aos meus amigos da turma de mestrado, Edilmar, Dmitry, Pedro Carlos e Lucileide,

muito obrigada pelos momentos de convivência e pelas trocas de ensinamentos!! As minhas

queridas “xuxus” Ana Luiza, Bárbara, Denise, Natália e Rose!! Nada teria sido tão intenso

e tão agradável sem a convivência com vocês! Muito obrigada por estarem ao meu lado

nesses dois anos, vocês foram meus presentes durante essa trajetória, ajudaram a fazer os

dias difíceis mais alegres e fáceis. Desejo muito sucesso para todos! Que Deus os abençoe!!

Aos doutorandos: Keila, Águida, Joabe, Felipe, Emeline, Adriana, Fernando,

Marcelo, Pedro Paulo, Nazareno, Emília, Maiara, Rodrigo, Stefânia, Alessandra e Cida!

Pelos momentos de alegria, descontração e conhecimentos que dividimos. Agradeço, em

especial, a Cyntia e Ana Rafaela, por terem me ajudado com a escolha dos blocos e com o

desenvolvimento da pesquisa, pelos conselhos e conhecimentos divididos.

Aos funcionários, Canindé, Sandrinha, Gracinha, Lurdinha, Idel, Hévio, Ricardo e

Patrícia. Muito obrigada pela participação nesse período de aprendizagem, a ajuda de vocês

é fundamental para execução de nossas pesquisas.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio

financeiro para o desenvolvimento desse trabalho.

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RESUMO

O Carcinoma epidermóide (CE) está entre as lesões mais comuns localizadas na região

de cabeça e pescoço e apesar dos avanços nas modalidades de tratamento, o prognóstico ainda

é pobre. As células malignas apresentam um aumento na absorção de glicose, processo esse

mediado pelos transportadores de glicose (GLUTs). O aumento da expressão de GLUT 1 e

GLUT 3 encontra-se relacionado com o comportamento agressivo dessa lesão. O objetivo

desse estudo consistiu em avaliar, através de estudo imuno-histoquímico, a expressão dos

GLUTs 1 e 3 em CE de lábio inferior. A amostra foi composta por 40 casos de CE de lábio

inferior, dos quais 20 apresentavam metástase linfonodal regional e os 20 restantes com

ausência de metástase. Foram avaliados os percentuais de células imunomarcadas no front de

invasão e no centro do tumor, esses resultados foram relacionados com a presença e ausência

de metástase linfonodal, estadiamento clínico TNM e gradação histológica. O percentual de

marcação citoplasmática/membranar para GLUT 1 variou de 77,35% a 100%, já para GLUT 3

esse valor variou de 0,79% a 100%. Quanto à marcação nuclear para GLUT 1, este percentual

variou de 0 a 0,42%, no entanto, GLUT 3 apresentou apenas um caso com marcação nuclear.

Apesar da expressiva marcação das células tumorais frente aos marcadores estudados, não foi

possível observar relação estatisticamente significativa entre as variáveis estudadas e os

marcadores analisados, independente da região avaliada. Contudo, foi observada moderada

correlação positiva estatisticamente significativa entre as imunoexpressões

citoplasmática/membranar de GLUT 1 no front de invasão e no centro do tumor (r=0,679;

p<0,001). De forma similar, foi constatada moderada correlação positiva entre as

imunoexpressões nucleares de GLUT 1 no front de invasão e no centro tumoral(r=0,547;

p<0,001). Para GLUT 3, também foi observada moderada correlação positiva entre as

imunoexpressões membranar/ citoplasmática dessa proteína no front de invasão e no centro

tumoral (r=0,589; p<0,001). Foi observado, ainda, que a imunoexpressão de GLUT 1 em

relação a GLUT 3 foi maior tanto no front de invasão (p < 0,001) como no centro do tumor (p

<0,001). A partir desses resultados, conclui-se que a hipóxia tumoral é uma característica

marcante no CE de lábio inferior e GLUT 1 pode ser o principal responsável pela captação de

glicose para o interior das células malignas.

Palavras-chave: Carcinoma epidermóide; Neoplasia Labial; Proteínas

transportadoras; Estadiamento de Neoplasias; Imunoistoquímica.

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ABSTRACT

The Epidermoid Carcinoma (EC) is the most common lesions located in the region of

the head and neck and, despite advances in treatment modalities, the prognosis is still poor.

The malignant cells show an increase in glucose uptake, process mediated by glucose

transporters (GLUTs). Increased expression of GLUT 1 and GLUT 3 is related to the

aggressive behavior of this lesion. The aim of this study was to evaluate, through

immunohistochemistry, the expression of GLUTs 1 and 3 in EC of the lower lip. The sample

consisted of 40 cases of EC of the lower lip, of which 20 had regional lymph node metastasis

and the remaining 20 with absence of metastasis. The percentages of immunostained cells in

front of tumor invasion and in the center of tumor were evaluated. These results were related

to the presence and absence of lymph node metastasis, TNM classification and histological

grading. The percentage of cytoplasmic/membranous expression of GLUT 1 ranged from

77.35% to 100%, while for GLUT 3 this value ranged from 0.79% to 100%. As for nuclear

staining for GLUT 1, this percentage ranged from 0 to 0.42%, however. GLUT 3 showed only

one case with nuclear staining. Despite the significant expression of tumor cells related to the

proteins studied, we observed no statistically significant relationship between the variables

and the antibodies analyzed, regardless of the region evaluated. However, there was a

moderate positive correlation between cytoplasmic/membranous immunoexpressions of

GLUT 1 in invasion front and in the tumor center (r = 0.679, p <0.001). Similarly, moderate

positive correlation was found between the nuclear immunoexpressions of GLUT 1 in the

invasion front and in the tumor center (r = 0.547, p <0.001). For GLUT 3, was also observed

a moderate statistically significant positive correlation between cytoplasmic/membranous

expression in tumor invasion front and in tumor center (r = 0.589, p <0.001). We also

observed that the immunoreactivity for GLUT 1 was higher than GLUT 3 expression in

invasion front (p <0.001) and tumor center (p <0.001). From these results, this study suggests

that tumor hypoxia is a remarkable characteristic of the EC of the lower lip and GLUT 1 may

be primarily responsible for glucose uptake into the interior of the malignant cells.

Keywords: Squamous Cell Carcinoma; Lip Cancer; Transport Proteins; Sataging of

Neoplasms; Immunohistochemistry.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

Figura 1. Estrutura bidimensional dos GLUTs......................................................... 41

Figura 2. Modelo simplificado da estrutura do GLUT 1.......................................... 47

Figura 3. CE de lábio inferior de baixo grau, bem diferenciado. (H/E, 100×)......... 91

Figura 4. CE de lábio inferior de alto grau, pobremente diferenciado. (H/E,

200×).......................................................................................................... 91

Figura 5. Fotomicrografia demonstrando padrão de expressão de GLUT 1

localizado na periferia das ilhas tumorais. (ADVANCETM, 200×)........... 92


localizado no centro das ilhas tumorais*. (ADVANCETM, 100×)............ 92

Figura 7. Fotomicrografia demonstrando o padrão de expressão de GLUT 3 no

centro das ilhas tumorais. (ADVANCETM, 200×)..................................... 93

Figura 8. Fotomicrografia demonstrando a intensidade de expressão moderada de

GLUT 3 nas ilhas tumorais. (ADVANCETM, 200×)................................. 93

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando expressão citoplasmática/membranar de

GLUT 1. (ADVANCETM, 200×)............................................................... 94

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando expressão nuclear (seta) de GLUT 1.

(ADVANCETM, 200×)............................................................................... 94

Figura 11. Fotomicrografia demonstrando expressão citoplasmática/membranar de

GLUT 3. (ADVANCETM, 200×)............................................................... 95

Figura 12. Fotomicrografia demonstrando expressão nuclear de GLUT 3.

(ADVANCETM, 200×)............................................................................... 95

Quadro 1. Localização tecidual das principais isoformas de GLUT e suas

características funcionais........................................................................... 43

Quadro 2. Sistema de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizada

por SOBIN; WITTEKIND (2002)............................................................. 58

Quadro 3. Categorias de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio,

preconizadas por SOBIN; WITTEKIND (2002)....................................... 59

Quadro 4. Sistema de gradação histológica de malignidade no “front” de invasão

proposto por Bryne (1998)........................................................................ 60

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Quadro 5 Sistemade gradação histológica, proposto pela OMS (CARDESA et al.,

2005).......................................................................................................... 60

Quadro 6. Especificidade, nº catálogo, fabricante, diluição, recuperação antigênica

e tempo de incubação dos anticorpos primários a serem utilizados no

estudo.........................................................................................................� 63

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LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Distribuição dos casos de carcinoma de lábio inferior, segundo sexo e

faixa etária dos pacientes, de acordo com a presença e ausência de

metástase. Natal-RN 2012........................................................................

67

Tabela 2. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior,

segundo o estadiamento clínico TNM, de acordo com a presença e

ausência de metástase. Natal – RN, 2012................................................. 68

Tabela 3. Análise morfológica e gradação histológica de malignidade (BRYNE,

1998) dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior sem

metástase. Natal-RN, 2012....................................................................... 69

Tabela 4. Análise morfológica e gradação histológica de malignidade (BRYNE,

1998) dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior com

metástase. Natal-RN, 2012....................................................................... 70

Tabela 5. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística do grau

histológico de malignidade (BRYNE, 1998) em relação à metástase

linfonodal. Natal – RN, 2012.................................................................... 71

Tabela 6. Distribuição absoluta e relativa da relação entre o estadiamento clínico

TNM e a gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal –

RN, 2012................................................................................................... 71

Tabela 7. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística da relação

entre estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade

(BRYNE, 1998). Natal – RN, 2012.......................................................... 72

Tabela 8. Distribuição absoluta e relativa do grau histológico de malignidade

(CARDESA et al., 2005) em relação à metástase linfonodal. Natal –

RN, 2012................................................................................................... 72


histológico de malignidade (CARDESA et al., 2005) em relação à

metástase linfonodal. Natal – RN, 2012................................................... 72

Tabela 10. Distribuição absoluta e relativa da relação entre a gradação histológica de malignidade (CARDESA et al., 2005) e o estadiamento clínico TNM. Natal – RN, 2012........................................................................... 73

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histológico de malignidade (CARDESA et al., 2005) em relação ao

estadiamento clínico TNM. Natal – RN, 2012......................................... 73

Tabela 12. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística do padrão de

marcação para GLUT 1 em relação à metástase linfonodal e ao

estadiamento clínico TNM. NATAL – RN, 2012..................................... 74


marcação para GLUT 1 em relação às gradações histológicas de

malignidade. NATAL – RN, 2012............................................................ 75


marcação para GLUT 3 em relação à metástase linfonodal e ao

estadiamento clínico TNM. NATAL – RN, 2012..................................... 76


marcação para GLUT 3 em relação às gradações histológicas de

malignidade. NATAL – RN, 2012............................................................ 76

Tabela 16. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma

dos postos, estatística U e significância estatística (p) para o percentual

de positividade citoplasmática/membranar para GLUT 1 no front de

invasão e no centro tumoral em relação à metástase linfonodal. Natal,

RN – 2012................................................................................................. 77



de positividade nuclear para GLUT-1 no front de invasão e no centro

tumoral em relação à metástase linfonodal. Natal, RN – 2012................. 78



de positividade citoplasmática/membranar para GLUT-3 no front de

invasão e no centro tumoral em relação à metástase linfonodal. Natal,

RN – 2012................................................................................................. 79

Tabela 19. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para o percentual de positividade citoplasmática/membranar para GLUT-1 no front de invasão e no centro tumoral em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal, RN – 2012...................................................................................... 80

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tumoral em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal, RN – 2012..... 81




invasão e no centro tumoral em relação ao estadiamento clínico TNM.

Natal, RN – 2012...................................................................................... 82




invasão e no centro tumoral em relação à gradação histológica de

malignidade (BRYNE, 1998). Natal, RN – 2012..................................... 83




tumoral em relação em relação à gradação histológica de malignidade

(BRYNE, 1998). Natal, RN – 2012.......................................................... 84




invasão e no centro tumoral em relação em relação à gradação

histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal, RN – 2012.............. 85




invasão e no centro tumoral em relação à gradação histológica de

malignidade (CARDESA et al., 2005). Natal, RN – 2012....................... 86

Tabela 26. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para o percentual de positividade nuclear para GLUT-1 no front de invasão e no centro tumoral em relação em relação à gradação histológica de malignidade (CARDESA et al., 2005). Natal, RN – 2012............................................ 87

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invasão e no centro tumoral em relação em relação à gradação

histológica de malignidade (CARDESA et al., 2005). Natal, RN –

2012........................................................................................................... 88

Tabela 28. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação

de Spearman (r) e significância estatística (p) entre as imunoexpressões

citoplasmática/membranar e nuclear de GLUT 1 e GLUT 3 no front de

invasão e no centro tumoral. Natal, RN – 2012........................................ 89

Tabela 29. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de

acordo com os postos dos percentuais de imunoexpressão

citoplasmática/ membranar de GLUT 1 e GLUT 3 no front de invasão e

no centro tumoral. Natal, RN – 2012........................................................ 90

Tabela 30. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de

acordo com os postos dos percentuais de imunoexpressão nuclear de

GLUT 1 no front de invasão e no centro tumoral. Natal, RN – 2012....... 90

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

� AMP Do inglês Adenosine monophosphate, traduzido como

monofosfato de adenosina.

� ATP Do inglês Adenosine triphosphate, traduzido como trifosfato de

adenosina.

� BSA Do inglês bovin serum albumin, traduzido como albumina de soro

bovino.

� CE Carcinoma epidermóide.

� CEO Carcinoma epidermóide oral.

� C-MYC Fator de transcrição responsável pela regulação de 15% de todos

os genes.

� CO Câncer oral.

� DNA Do inglês, deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido

desoxirribonucléico.

� fMLP Do inglês formylmethionyl-leucil-fenilalanina, traduzido como

formilmetionil-leucil-fenilalanina.

� GLUT Do inglês glucose transporter, traduzido como transportador de

glicose.

� GLUT 1-14 Diferentes isoformas dos transportadores de glicose.

� HIF-1� Do inglês Hypoxia inducible factor - 1�, traduzido como fator

induzido por hipóxia- 1�.

� HepG2 Linhagem celular de hepatocarcinoma humano.

� INCA Instituto Nacional do Câncer.

� kD Do inglês kilodaltan, traduzido como quilodálton.

� Km Constante de Michaelis.

� LDHA Do inglês, Lactate dehydrogenase A, traduzido como lactato

desidrogenase A.

� mM miliMol.

� MS Ministério da Saúde.

� mRNA Do inglês menseger ribonucleic acid, traduzido como ácido ribonucléico mensageiro.

� Na+ Íons sódio.

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� NER Do inglês, Nucleotide excision route, traduzido como via de excisão de nucleotídeo.

� OMS Organização Mundial de Saúde.

� P53 Gene supressor tumoral.

� PHA Fitohemaglutinina.

� RAS Oncogene transdutor de sinal extracelular.

� SRC Oncogene responsável pela regulação do crescimento celular.

� TNM Do inglês Tumor-Node-Metastasis, refere-se ao sistema de

estadiamento clínico que avalia o tamanho do tumor,

envolvimento do linfonodo regional e envolvimento por

metástases à distância.

� UICC União Internacional Contra o Câncer.

� UV Termo referente à radiação ultravioleta.

� UVA Radiação ultravioleta tipo A.

� UVB Radiação ultravioleta tipo B.

� UVC Radiação ultravioleta tipo C.

� VEGF Do inglês Vascular endothelial growth factor, traduzido como

fator de crescimento endotelial vascular.

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SUMÁRIO

Página

1 INTRODUÇÃO........................................................................................ 27

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 30

2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL................................................... 31

2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO E CONSIDERAÇÕES

CLÍNICO-PATOLÓGICAS......................................................................

33

2.3 TRANSPORTADORES DE GLICOSE.................................................... 39

2.3.1 Estruturas dos GLUTs............................................................................ 40

2.3.2 Metabolismo da glicose no câncer.......................................................... 44

2.3.3 GLUT 1..................................................................................................... 46

2.3.4 GLUT 3..................................................................................................... 47

2.3.5 Expressão dos GLUTs 1 e 3 no câncer................................................... 49

3 PROPOSIÇÃO......................................................................................... 54

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 56

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS................................................................... 56

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO........................................................ 56

4.3 POPULAÇÃO............................................................................................ 57

4.4 AMOSTRA................................................................................................ 57

4.4.1 Critérios de inclusão da amostra............................................................ 57

4.4.2 Critérios de exclusão da amostra............................................................ 57

4.5 ESTADIAMENTO CLÍNICO TNM PARA CE LÁBIO

INFERIOR.................................................................................................

58

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO..................................................................... 59

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO....................................................... 61

4.7.1 Método imuno-histoquímico................................................................... 61

4.7.2 Análise imuno-histoquímica.................................................................... 63

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................ 64

5 RESULTADOS........................................................................................ 67

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA.................................................... 67

5.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS............................................................... 68

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5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS.......................................... 74

5.3.1 Análise da descritiva expressão de GLUT 1 e GLUT 3........................ 74

5.3.2 Avaliação da expressão de GLUT 1 quanto à presença ou ausência de metástase..............................................................................................

77

5.3.3 Avaliação da expressão de GLUT 3 quanto à presença ou ausência de metástase..............................................................................................

78

5.3.4 Avaliação da expressão de GLUT 1 quanto ao estadiamento clínico

TNM..........................................................................................................

80

5.3.5 Avaliação da expressão de GLUT 3 quanto ao estadiamento clínico

TNM........................................................................................................

81

5.3.6 Avaliação da expressão de GLUT 1 quanto à gradação histológica, proposta por Bryne (1998)......................................................................

82

5.3.7 Avaliação da expressão de GLUT 3 quanto à gradação histológica, proposta por Bryne (1998)......................................................................

84

5.3.8 Avaliação da relação da expressão de GLUT 1 quanto à gradação

histológica, proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005)....................

85


histológica, proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005)....................

87

5.3.10 Avaliação da correlação entre as imunoexpressões de GLUT 1 e GLUT 3.....................................................................................................

88

6 DISCUSSÃO............................................................................................. 97

7 CONCLUSÕES........................................................................................ 112

REFERÊNCIAS....................................................................................... 114

APÊNDICES............................................................................................ 131

ANEXOS................................................................................................... 139

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1 INTRODUÇÃO

O carcinoma epidermóide oral (CEO) é uma neoplasia maligna que se origina no

epitélio pavimentoso estratificado (BRENER et al, 2007), compreendendo cerca de 95% de

todas as lesões que acometem a região de cabeça e pescoço. Trata-se da lesão maligna mais

comumente encontrada no lábio inferior (ZINI; CZERNINSK; SAGAN-COHEN, 2010).

Quando o diagnóstico é realizado em estágios iniciais, o carcinoma epidermóide (CE)

de lábio inferior possui prognóstico favorável, com índice de sobrevida maior que 90% em

acompanhamento de 5 anos. A metástase em linfonodos regionais envolve cerca de 5 a 20%

de todos os casos diagnosticados (ZITSCH; LEE; SMITH, 1999). Os pacientes que

desenvolvem metástases cervicais tardias possuem pior prognóstico, considerando que apenas

30% a 70% atingem a sobrevida de 5 anos (HASSON, 2008).

Os tumores malignos em crescimento requerem a formação de vasos sanguíneos para

aumento na taxa de respiração e absorção de nutrientes (KUNKEL et al., 2007). A medida

que as células crescem, a demanda de energia aumenta, induzindo a formação de novos vasos,

com o objetivo de aumentar a quantidade de nutrientes e oxigênio disponíveis, possibilitando

seu desenvolvimento (ZHOU et al., 2008). Entretanto, esses processos não conseguem

acompanhar o crescimento das células neoplásicas, resultando em áreas de hipóxia

(MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005). Desta forma, as células neoplásicas passam por

mudanças para que possam se adaptar e sobreviver sob essas condições, o que pode levar a

um fenótipo mais agressivo, resultando em invasão e metástase (CHOI et al., 2007).

A regulação da expressão das proteínas transportadoras de glicose desempenha um

papel vital no fornecimento de glicose e outros açúcares nas células metabolicamente ativas

(MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005). Os transportadores de glicose (GLUTs) 1 e 3 foram

detectados em diversos tecidos humanos o que sugeriu serem eles os principais responsáveis

pela absorção de glicose (FUKUZUMI et al., 2000; MEDINA; OWEN, 2002; MENESES et

al., 2002; THORENS; MUECKLER, 2010). A superexpressão dessas proteínas já foi

identificada em diversos tumores malignos, como os carcinomas de pulmão (YOUNES et al.,

1997), mama (KANG et al., 2002), cólon (HARBER et al., 1998), esôfago (TOHMA et al.,

2005) e ovário (RUDLOWSKI et al., 2004). Em CEOs, tem sido observada uma associação

entre a superexpressão de GLUT 1 e a presença de metástase linfonodal e episódios de

recorrência (OLIVER et al., 2004).

28 �

Poucos estudos procuraram avaliar a associação de GLUT 1 e 3 com o CEO e, até o

momento, não há estudos na literatura sobre a expressão dessas duas proteínas no CE de lábio

inferior. Desta forma, o presente estudo se propõe avaliar a imunoexpressão dos GLUTs 1 e 3

em CEs de lábio inferior, com o objetivo de relacionar esses resultados com os aspectos

clínico-patológicos, em relação a presença e ausência de metástase em linfonodos regionais,

estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade. Por meio desta

investigação, pretende-se obter dados que facilitem a compreensão do comportamento

biológico da lesão estudada, bem como a utilização desses marcadores como indicadores do

prognóstico da doença.

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30 �

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL –

O câncer oral (CO) é um termo genérico que inclui tumores de diferentes tecidos

(WARNAKULASURIYA, 2009). É uma importante causa de morbidade e mortalidade em

todo o mundo (CASAL et al., 2010; ZINI; CZERNINSK; SAGAN-COHEN, 2010), cuja

incidência pode variar de acordo com a localização geográfica (BATISTA et al., 2010). Em

2004, cerca de 67.000 novos casos foram registrados nos países da União Européia (BOYLE;

FERLAY, 2005). No Brasil, o CO corresponde em média a 3% de todas as lesões malignas

(INCA, 2010).

O CEO também denominado carcinoma de células escamosas, carcinoma

escamocelular ou carcinoma espinocelular, corresponde a aproximadamente 90% de todos os

COs (BRENER et al. 2007). Trata-se de uma neoplasia maligna que se origina do epitélio de

revestimento afetando tanto a cavidade oral quanto o vermelhão do lábio (BATISTA et al.,

2010). Mundialmente, é um problema de saúde pública, contando com mais de 274.000 novos

casos diagnosticados por ano (PARKIN et al., 2002). Na Europa Central, a mortalidade atinge

cerca de 29 - 40 a cada 100.000 habitantes (DOBROSSY et al., 2004). Nos Estados Unidos,

essa lesão é diagnosticada em aproximadamente 12.000 americanos, resultando na morte de

mais de 5.000 pessoas por ano (KUPFERMAN; MYERS et al., 2006).

Na América do Sul, a maior incidência é no Brasil, apresentando-se numa proporção

de 8,3 a cada 100.000 habitantes. Corresponde ao sexto tumor mais comum, representando

2,6% de todas as malignidades, sendo que esse é o nono mais letal (MAROCCHIO et al.,

2010). Segundo estimativas realizadas pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA), em 2010

ocorreram cerca de 14.120 novos casos, dentre esses, 10.330 acometendo homens e o restante

em mulheres. Em relação à mortalidade, estima-se que chegará a uma faixa de 6.214 mortes

em todo o país.

Estudos apontam que o CEO é o sexto câncer mais comum no sexo masculino e o

nono em relação ao sexo feminino (INCA, 2010; OLIVEIRA; SILVA; ZUCOLOTO, 2006;

31 �

BRENER et al., 2007). Em todo o Brasil, os maiores valores das taxas médias anuais de

ocorrência da doença, ajustadas por idade a cada 100 mil homens, foram constatadas em São

Paulo (1997-1998: 7,6), Distrito Federal (1996-1998: 6,6) e Salvador (1997-2001: 4,6). Na

população feminina, as maiores taxas foram observadas em Natal (1998-1999: 3,3), São Paulo

(1997-1998: 2,3) e João Pessoa (1999-2000: 1,8) (INCA, 2010).

Dados epidemiológicos mostram que os pacientes acima de 40 anos são os mais

acometidos pelo CEO, apresentando maior incidência com o decorrer da idade (NEVILLE et

al., 2009). A incidência dessa neoplasia, em adultos jovens e mulheres, vêm crescendo

segundo levantamentos feitos na última década (OLIVEIRA; SILVA; ZUCOLOTO, 2006;

CURADO; HASHIBE, 2009; CASAL et al., 2010).

As variações nas taxas de incidência e mortalidade para o CEO podem variar de

acordo com a região e mesmo dentro de cada país. Essas variações ocorrem, principalmente,

pelas diferenças de hábitos, características sócio-econômicas, expectativa de vida, fatores

ambientais, cor da pele e qualidade de assistência médica nas diversas regiões (BRENER et

al.,2007). Costumes como, mascar e fumar tabaco, com ou sem o consumo de álcool, podem

agravar a ocorrência e distribuição da doença (ZINI; CZERNINSK; SAGAN-COHEN, 2010).

A carcinogênese oral é um processo complexo e multifásico que requer a

desestabilização de vários sistemas de controle e reparo que coordenam o comportamento das

células, envolvendo a ativação sequencial de oncogenes e, inativação de genes supressores de

tumores, numa população clonal de células (SCHLIEPHAKE et al., 2003; BETTENDORF;

PIFFKÒ; BÀNKFALVI, 2004). Tanto fatores extrínsecos, quanto intrínsecos podem estar

envolvidos nesse processo (SCULLY; BAGAN, 2009). Os três principais fatores

carcinogênicos são: os agentes químicos (fumo e álcool), físicos (radiação) e infecciosos

(vírus oncogênicos), responsáveis pela alteração da estrutura dos genes de diversas maneiras,

promovendo, por conseguinte, múltiplas alterações no genoma. O acúmulo dessas alterações

genéticas conduz ao desequilíbrio no ciclo celular, gerando danos ao DNA celular e a perda

do controle da divisão celular, favorecendo uma instabilidade nos genes (NAGPAL; DAS,

2003; CHOI, 2006).

Estima-se que a associação entre o uso de tabaco e o consumo de álcool aumenta a

ocorrência do CO em aproximadamente 80% (HERRERO et al., 2003). Outros fatores, como

o papiloma vírus humano, podem estar relacionados, particularmente para os carcinomas de

orofaringe em pacientes jovens (D’SOUZA et al., 2007). A radiação ultravioleta (UV) está

relacionada apenas com o surgimento de carcinomas em lábio (WARNAKULASURIYA et

al., 2009). Pacientes diagnosticados com CEO que tenham sido cronicamente expostos ao uso

32 �

do tabaco e álcool, possuem maior risco de recorrência e de aparecimento de novas lesões

primárias (BATISTA et al., 2010).

Clinicamente, o CEO pode ser caracterizado como uma lesão exofítica, apresentando

formação de massa fungiforme, papilar ou verrucosa, por vezes podendo se apresentar de

forma endofítica ou ulcerada (CAMPISI et al., 2006). Esta neoplasia ocorre principalmente na

língua e lábios, podendo acometer outros sítios como assoalho bucal, mucosa jugal, gengiva e

palato (KERDPON; SRIPLUNG, 2001; CHIDZONGA; MAHOMVA, 2006; JERJES et al.,

2010). A localização anatômica tem sido considerada fator de influência no prognóstico,

considerando-se que o tumor apresenta comportamento clínico diferente, conforme a região

acometida (DIB et al., 1994; COSTA et al., 2002). Lesões em língua com estadiamento

clínico T2 são mais prováveis de recorrer. A metástase está intimamente relacionada com a

proximidade anatômica com linfonodos cervicais (BATISTA et al., 2010).

Costa et al. (2002) observaram uma maior incidência do CE em lábio inferior, seguido

pela língua, assoalho bucal, palato mole e mucosa jugal. Brener et al. (2007) observaram que

a mucosa jugal foi o sítio mais acometido em pacientes acima de 60 anos. No entanto, em

pacientes jovens a lesão foi mais prevalente na língua, podendo ou não estar associada ao

assoalho bucal.

Em estudo realizado para investigar a existência da correlação entre o estadiamento

clínico TNM, localização anatômica e o prognóstico do CEO, Costa et al. (2008) observaram

que os pacientes com lesões localizadas em lábio inferior encontravam-se predominantemente

no estágio I, enquanto que aquelas em língua apresentavam-se em estágio III e IV. A maioria

dos casos acometendo o palato mole e assoalho bucal foram classificados como T4. Esses

achados sugerem que estas localizações possuem o pior prognóstico.

Histologicamente, o CEO caracteriza-se como uma proliferação de células epiteliais,

dispostas isoladamente ou em grupos celulares, podendo formar cordões e ninhos que

invadem o tecido conjuntivo. As células neoplásicas exibem hipercromatismo, pleomorfismo

nuclear e celular, aumento do número de figuras de mitose, típicas ou atípicas (NEVILLE et

al., 2009).

33 �

2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR E CONSIDERAÇÕES

CLÍNICO – PATOLÓGICAS –

O termo carcinoma de lábio é usado para se referir a tumores malignos que se

originam na porção do vermelhão (BARNES et al., 2005). O CE de lábio é uma das lesões

malignas mais frequentes da região de cabeça e pescoço, representando 95% de todos os casos

diagnosticados nesta localização (VARTANIAN et al., 2004), apresentando menor

agressividade, com índice de mortalidade que varia de 10 a 15% (KADEMANI, 2007).

O câncer de lábio é mais frequente em indivíduos de raça branca do sexo masculino,

entre a sexta e sétima décadas de vida (HASSON, 2008). Sua etiologia está relacionada com a

exposição crônica à radiação UV (LUNA-ORTIZ,et al., 2004; BATISTA et al., 2010). O sítio

mais frequentemente envolvido é o lábio inferior (CASAL et al., 2010), provavelmente

devido a sua localização anatômica ser mais exposta a radiação solar que a do lábio superior,

que é naturalmente mais protegido (BATISTA et al., 2010). Portanto, a exposição aos raios

UV leva a uma maior ocorrência do CE de lábio. O grau de risco para o desenvolvimento de

neoplasias malignas depende do tipo de radiação UV, da intensidade de exposição e da

quantidade de melanina na pele. A porção UV do espectro solar pode ser dividida em três

comprimentos de onda: UVA (315 nm – 400 nm), UVB (280 nm – 315 nm) e UVC (100 nm –

280 nm). Dentre estas, acredita-se que a UVB é responsável pela indução de tumores. A

radiação é responsável pela inibição da divisão celular, indução de mutações e, quando em

dose suficiente, morte celular (VISSCHER; WALL, 1998).

Para Xavier et al. (2009) a carcinogênese de lábio inferior constitui um modelo de

fotocarcinogênese, esse autor sugere que essa neoplasia parece surgir a partir de uma queilite

actínica, que constitui um lesão potencialmente maligna. A queilite actínica trata-se de uma

lesão de origem inflamatória e potencialmente maligna causada pela exposição prolongada e

crônica aos raios solares (BARNES et al., 2005; CAVALCANTI et al., 2008) e encontra-se

localizada principalmente no lábio inferior (NEVILLE et al., 2009).

A carcinogenicidade da radiação UVB é atribuída à formação de dímeros de

pirimidina no DNA. Em condições normais, esse tipo de lesão é corrigida pela via de excisão

de nucleotídeos (NER), a qual consiste em cinco etapas: 1. Reconhecimento da lesão do

DNA; 2. incisão da hélice lesada em ambos os lados da lesão; 3. remoção do nucleotídeo

lesado; 4. síntese de um retalho de nucleotídeo; e 5. sua ligação. A exposição solar excessiva

sobrecarrega a capacidade da via NER, em função disto, parte da lesão do DNA não é

34 �

removida. Os raios UVB também provocam mutações nos oncogenes e nos genes supressores

de tumor, como RAS e P53 (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010). O tempo necessário para a

ocorrência de transformação maligna induzida pelo sol varia entre 20 a 30 anos, mas tal

evolução pode acontercer mais rápido em alguns indivíduos (SOUZA et al., 2010).

Outro fator importante na etiologia do CE de lábio é o tabaco, pois o ato de fumar ou

mascar pode ocasionar reações oxidativas nos tecidos, resultando na produção de radicais

livres. A presença de oxigênio reativo pode causar danos às proteínas, carboidratos, lipídios e

DNA, gerando mutações e alteração do ciclo celular. As nitrosaminas, que são compostos

químicos presentes no tabaco, são os principais responsáveis pelos efeitos carcinógenos do

cigarro (LEITE; GUERRA; MELO, 2005). Fatores como susceptibilidade genética também

estão associados ao desenvolvimento da lesão (SOUZA et al. 2010).

Clinicamente, o CE de lábio inferior apresenta-se como uma lesão ulcerada de bordas

elevadas, endurecidas, rígidas, localizadas mais comumente na região lateral do lábio inferior,

local onde o paciente fumante apoia o cigarro. Ao exame microscópico, observa-se a presença

de células epiteliais com característica de malignidade, apresentando individualmente,

pleomorfismo celular e nuclear, alteração na relação núcleo-citoplasma, hipercromatismo,

disceratose, podendo apresentar ocasionais formações de pérolas córneas, nucléolos

proeminentes e figuras de mitose típicas e atípicas. A forma de crescimento pode variar de

pequenas ilhas e células individuais dispersas no estroma, até lençóis e cordões de células

epiteliais. Essas alterações são comuns a todas as lesões de CE, no entanto, quando localizado

em lábio inferior, pode-se observar a presença de degeneração basofílica das fibras colágenas,

o que caracteriza a elastose solar (HASSON, 2008; NEVILLE et al., 2009; SOUZA et al.,

2010).

O CE de lábio inferior, usualmente, tem um bom prognóstico, possivelmente como

resultado de um diagnóstico precoce, devido à localização do tumor e também pela baixa taxa

de metástase em linfonodos regionais (VARTANIAN et al., 2003). Essa lesão é, ainda, mais

facilmente percebida pelo paciente, favorecendo uma intervenção mais precoce (OLIVEIRA;

SILVA; ZUCOLOTO, 2006; MORSELLI et al., 2008). Quando a metástase linfonodal é

detectada, há uma significante queda no índice de sobrevida do paciente (HASSON, 2008).

A cirurgia é o tratamento de escolha para o CE de lábio inferior. A ressecção é o

procedimento cirúrgico mais indicado e depende do tamanho do tumor (NEVILLE et al.,

2009). Diferentes tipos de técnicas podem ser utilizadas, sendo que as lesões iniciais podem

ser tratadas tanto por criocirurgia como pela vermelhectomia. Para tumores relativamente

35 �

superficiais, as cirurgias que comprometem a estética e a função oral podem ser

contraindicadas (VENNES, 2001).

Associado a essas condutas pode ser realizado o esvaziamento cervical, mesmo na

ausência de metástases clinicamente identificáveis, pois a taxa de metástases ocultas é

superior a 30% (VANTANION et al., 2004). Não há consenso em relação a uma adequada

margem cirúrgica para os CEs de lábio. As recomendações podem variar de 3 a 10 mm. A

radioterapia tem sido usada em lesões mais avançadas, nas quais a cirurgia poderia resultar

em perda da função e estética. A radioterapia adjuvante tem demonstrado benefícios em

reduzir a recorrência local, esta por sua vez, está indicada nos casos de margens positivas,

invasão perineural e quando há evidência de metástase linfonodal (BABINGTON, et al.,

2003).

A taxa reduzida de mortalidade em pacientes com CE de lábio pode ser explicada pela

menor quantidade de vasos sanguíneos e linfáticos que se apresentam nessa localização

anatômica, podendo influenciar numa evolução menos agressiva do tumor (OLIVEIRA;

SILVA; ZUCOLOTO, 2006). As variáveis que vêm se mostrando importantes na

sobrevivência do câncer de lábio incluem tamanho do tumor, gradação tumoral, metástase em

linfonodo regional e recorrência da doença (ONERSI et al., 2000). Outros fatores, como idade

e modalidade de tratamento, também têm sido citadas como influentes no curso da lesão

(SOUZA et al., 2010).

A metástase à distância relacionada ao CE de lábio é muito rara e pode ser esperada

em casos de tumores avançados e com comprometimento de linfonodos regionais no

momento do diagnóstico. A sua incidência varia de 0,5-2% e costuma ser mais frequente nos

pulmões, nos ossos e no fígado. O estágio clínico IV é o grupo com maior risco de ocorrência

da lesão. Todos os pacientes com envolvimento linfonodal possuem um risco de

aproximadamente 10% de desenvolver metástase à distância (BETKA, 2001).

Vahtsevanos et al. (2007) realizaram uma análise retrospectiva de 186 casos

diagnosticados como CE de lábio e observaram que apenas 2,14% dos pacientes tiveram

metástase óssea a distância e um caso apresentou comprometimento de linfonodos axilares.

Estas lesões se encontravam nos estágios clínicos II-IV. O tempo para o desenvolvimento de

metástase óssea é, em média, de 13-35 meses e pode ser atribuída ao manejo inadequado

inicial ou ao comportamento clínico agressivo do tumor.

No entanto, para Hasson et al (2008), o risco de metástase para lesões localizadas em

lábio inferior é considerado nulo nos tumores que mostrarem invasão com espessura menor

36 �

que 2 mm, uma vez que esse risco é baixo para lesões entre 2-6 mm e alto para àquelas que

apresentarem valores acima de 6 mm.

O sistema de estadiamento clínico (TNM) utilizado para classificação dos tumores

malignos foi desenvolvido por Pierre Denoix, entre os anos de 1943 e 1952. É um sistema

universalmente aceito, utilizado para descrever a extensão anatômica do tumor. Foi

desenvolvido através da observação de que o prognóstico e o tratamento estão relacionados à

extensão do tumor no sítio primário (T), assim como para linfonodos regionais (N) e

avaliação da presença ou ausência de metástase à distância (M) (KREPPEL et al, 2010). Há

muitos anos o sistema de estadiamento clínico dos tumores TNM tem sido o padrão de

classificação adotado para caracterizar os tumores, propor a terapia mais adequada e, assim,

estimar a sobrevida dos pacientes. Os tumores presentes na cavidade oral e orofaringe devem

ser classificados antes do tratamento e após a ressecção para que se obtenha uma significante

informação prognóstica (LOURENÇO et al., 2007).

A partir de 1950, a União Internacional Contra o Câncer (UICC), juntamente com a

Organização Mundial de Saúde (OMS), nomeou comitês para que este sistema fosse

aprimorado (SOBIN; WITTEKIND, 2002). De acordo com a sexta edição da UICC, o

carcinoma da cavidade oral pode exibir mais de 40 combinações de extensão do tumor no

sítio primário, metástase em linfonodos regionais e à distância, o que oferece uma detalhada

descrição da sua extensão anatômica. Entretanto, para propósitos de tabulação e análise, uma

sumarização é necessária para obtenção de números homogêneos e categorias distintas em

relação à sobrevida. Desta forma, essas informações são reduzidas aos estadiamentos I, II, III,

IV (IVa, IVb e IVc) (KREPPEL, et al., 2010).

Os métodos de gradação histológica para os CEOs surgiram na tentativa de explicar o

comportamento biológico discrepante de tumores com características clínicas semelhantes.

Broders, em 1920, propôs uma gradação histológica baseada no grau de diferenciação celular,

sendo totalmente dissociada da história clínica. Ao longo dos anos, essa técnica foi sendo

aprimorada. Jakobsson et al. (1973) adotaram parâmetros que consideravam tanto a população

celular tumoral quanto a interface entre as células tumorais e o tecido do hospedeiro. Já em

1984, Anneroth e Hansen criaram um sistema multifatorial de gradação de malignidade com o

objetivo de propor uma gradação que não se restringisse apenas à avaliação das células

tumorais, o que teria um significado limitado e, em muitos casos, insuficiente para ser

utilizado como base para o prognóstico e tratamento (LOURENÇO et al., 2007).

Em 1989, Bryne et al. introduziram um novo método de gradação histopatológica.

Esse método é baseado em modificações do sistema proposto por Anneroth, Batsakis e Luna

37 �

(1987). Para a realização dessa gradação, foram utilizados espécimes de CEO provenientes de

biópsias excisionais, nos quais foram considerados os seguintes parâmetros: grau de

ceratinização, pleomorfismo celular, número de mitoses, padrão de invasão e infiltrado

inflamatório. Apenas as áreas mais invasivas, caracterizadas como front de invasão, foram

gradadas. Nessa nova classificação, as lesões recebem escores para cada uma das

características histopatológicas analisadas. Ao final, eles são somados, fornecendo o grau de

malignidade do tumor, em que um escore alto indica um prognóstico pobre.

Bryne (1998) publicou uma revisão de seus estudos anteriores, no qual aprimorou o

seu sistema de gradação histopatológica, retirando o parâmetro “figuras de mitose”. Este

sistema mostrou ser uma importante ferramenta de prognóstico, sugerindo que a gradação do

front de invasão é um dado valioso para análise histológica. Nesta área há um menor grau de

diferenciação e um maior grau de dissociação celular do que as encontradas nas demais partes

do tumor. As regiões mais centrais e superficiais são menos relevantes para o comportamento

tumoral. Nesse novo sistema são analisadas, semi-quantitativamente, as seguintes

características morfológicas: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão

e a resposta inflamatória. Para cada parâmetro é atribuído um escore, que ao final é somado,

fornecendo o grau de malignidade do tumor. Esse método de gradação pode ser usado como

rotina, em espécimes submetidos a biópsia excisional e corados pela técnica

hematoxilina/eosina que incluam a zona de transição e o estroma tumoral. A autora conclui

que o sistema de gradação utilizando a análise do front de invasão, possui um alto valor

prognóstico como suplemento ao sistema de estadiamento clínico TNM.

A classificação histopatológica proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005) baseou-

se no grau de diferenciação celular e permitiu o agrupamento dos CEs em três categorias:

pouco, moderadamente e bem diferenciados. Os bem diferenciados foram assim denominados

quando sua arquitetura tecidual se assemelhou a um padrão normal do epitélio pavimentoso.

Já àqueles que se mostraram pouco diferenciados, caracterizaram-se pelo predomínio de

células imaturas, numerosas mitoses atípicas, bem como mínima ceratinização. Os CEs

moderadamente diferenciados apresentam pleomorfismo nuclear, atividade mitótica e pouca

ceratinização (LOURENÇO et al., 2007; CASAL et al., 2010).

Costa et al. (2002) realizaram estudo para investigar a existência de correlação entre o

estadiamento clínico TNM, a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998)

e a localização anatômica do CEO em 120 casos, concluindo que existe uma correlação

positiva entre os sistemas e esta pode ser evidenciada, também, entre o TNM e a localização

anatômica da lesão.

38 �

O valor da gradação histológica prosposta por Bryne et al. (1989), foi avaliado por

Sawair et al. (2003) em 102 casos de CE intraoral. Análises multivariadas mostraram que o

escore total de gradação foi associado com a sobrevida global, enquanto que o padrão de

invasão tumoral foi o achado mais valioso para estimar o envolvimento de linfonodos

regionais. O número de linfonodos positivos foi fortemente associado à recidiva regional,

enquanto que a modalidade de tratamento e as margens cirúrgicas foram relacionadas com

recidiva local. Os autores concluíram que a gradação histológica pode ser confiável e auxiliar

no plano de tratamento.

Em 2005, Costa et al. observaram, em estudo retrospectivo, uma correlação

estatisticamente significante do estadiamento clínico TNM com o grau de ceratinização,

pleomorfismo nuclear e infiltrado linfoplasmocitário, indicando que as áreas invasivas podem

ser primariamente responsáveis pelo comportamento clínico do tumor, sugerindo que esses

achados podem ter um papel importante para a escolha da terapia do CEO.

Larsen et al. (2009) avaliaram o valor prognóstico das características histológicas do

CEO relacionadas ao tumor primário. Para avaliação, foi utilizado o método de gradação

histológica proposta por Bryne (1998). Os parâmetros invasão neural e vascular, como

proposto por Anneroth, Batsakis e Luna (1987), foram avaliados separadamente. Os autores

observaram que a profundidade do tumor e a gradação histológica de malignidade são fortes

fatores prognósticos para metástase linfonodal, independentemente de outros achados

histológicos. Tanto o diâmetro como as margens tumorais podem ser fatores de previsão para

recorrência local na cavidade oral.

Batista et al. (2010) avaliaram 91 casos de CEO, dos quais 37 acometeram o lábio. Os

autores observaram que para os CEs de lábio, os estágios I e II foram os mais predominantes,

enquanto que, para as lesões intraorais, foram o T3 e T0. É válido ressaltar que o

estádiamento clínico III foi o mais comumente encontrado. Uma significante porcentagem

(33,3%) dos pacientes com CE intraoral, classificados como T1 e T2, apresentaram metástase

em linfonodos cervicais sendo que 18,7% foram a óbito. Já nos casos de CE localizados no

lábio, não foram observadas metástases ou mortes. Estas lesões apresentaram,

histopatologicamente, um maior número de casos com intenso infiltrado inflamatório peri-

tumoral, quando comparados aos casos de carcinomas intraorais, sugerindo uma melhor

resposta do organismo para os casos localizados em lábio. Com esses resultados, sugere-se

que os CEs de lábio apresentam características clínicas e microscópicas distintas dos CEs

intraorais, refletindo assim, um melhor prognóstico.

39 �

2.3 TRANSPORTADORES DE GLICOSE –

O transporte de glicose é fundamental para o metabolismo energético celular. A

habilidade da membrana plasmática em transportar glicose é uma característica comum a

todas as células, desde uma simples bactéria até um neurônio altamente especializado. A via

glicolítica é empregada por todos os tecidos para degradação de glicose e fornecimento de

energia, na forma de trifosfato de adenosina (ATP), bem como de intermediários para outras

vias metabólicas (SCHEEPERS; JOOST; SCHURMANN, 2004; KUMAR; ABBAS;

FAUSTO, 2010).

A glicose proveniente da dieta é transferida para o lúmen do intestino delgado e,

juntamente com a sintetizada pelo corpo, deve ser transportada da circulação para as células

alvo (MEDINA; OWEN, 2002). Entretanto, essa molécula não possui capacidade de se

difundir através dos poros da membrana, visto que seu peso molecular é de 180 g/mol, e o

peso máximo das partículas permeáveis é cerca de 100 g/mol. Desta forma, por tratar-se de

um composto hidrofílico, necessita da participação de proteínas específicas para seu

transporte, as quais compreendem dois grupos: os co-transportadores de glicose, que são

dependentes de íons sódio (Na+) e os transportadores de glicose (GLUTs), que se

caracterizam pela independência de Na+. Esses grupos são distintos estrutural e

funcionalmente (WOOD; TRAYHUM, 2003; SILVA, 2005).

Em algumas regiões, como nos túbulos proximais dos rins e no intestino delgado, o

transporte da glicose é exclusivamente dependente de Na+ e independente da influência de

insulina. (ALBERTS et al., 2009). Os GLUTs são as proteínas mais comumente estudadas

dentre os sistemas de transporte de glicose. Suas funções são independentes de energia, pois

têm a capacidade de transportar seu substrato, mesmo na presença de uma baixa concentração

do gradiente Na+, tornando-se mais efetivas quando a célula é exposta a um nível

razoavelmente constante do substrato (MUECKLER, 1994).

As células do tecido adiposo e muscular, por exemplo, possuem grandes estoques

intracelulares de GLUTs. Essas proteínas são estocadas em endossomos especializados até

que a célula seja estimulada por hormônios, como a insulina, a aumentar a razão de captação

de glicose. Então, vesículas de transporte brotam a partir dos endossomos e entregam grandes

quantidades dos transportadores para a membrana plasmática aumentando a entrada de

energia para o meio intracelular (ALBERTS et al., 2009). Uma vez liberadas essas proteínas

transportadoras, a glicose na célula por meio de difusão facilitada. A velocidade do transporte

40 �

de glicose, bem como de alguns outros monossacarídeos, é aumentada em 10 a 20 vezes pela

insulina, em relação à observada em sua ausência (SILVA, 2005).

Os GLUTs formam passagens seletivas entre o sangue, os fluidos extracelulares e o

citoplasma. A distribuição de toda a glicose sanguínea poderia ser controlada por uma

expressão tecido/específica e pela regulação das diferentes isoformas de GLUTs com

diferentes propriedades cinéticas. Este cenário parece demonstrar, pelo menos, em parte, o

mecanismo pelo qual a glicose é devidamente distribuída entre as diversas células e tecidos do

corpo, em diferentes condições metabólicas (MEDINA; OWEN, 2002).

2.3.1 Estrutura dos GLUTs –

Os GLUTs são proteínas intrínsecas da membrana, que se expressam de acordo com o

tecido nos quais se encontram e respondem à regulação metabólica e hormonal. Conforme a

demanda e a utilização de energia, a quantidade de transportadores pode variar (JUNG et al,

1998). Cada grupo de transportadores possui propriedades cinéticas únicas, caracterizando

suas funções e sua distribuição nos diferentes tecidos. A maioria das células expressa um

número diferente de GLUTs em proporções distintas (SILVA, 2005).

O primeiro transportador a ser isolado foi GLUT 1. Tal proteína foi encontrada na

linhagem celular HepG2, derivada de hepatoma humano, a qual exibe características

semelhantes às dos hepatócitos (MUECKLER et al. 1985). A identificação de outros

membros se deu nos 5 anos seguintes, acrescentando mais cinco isoformas (GLUT 1-4) e um

transportador de frutose (GLUT 5) (WOOD; TRAYHURN, 2003). O ritmo em que essas

novas proteínas foram identificadas e classificadas por grupos independentes gerou confusão

na sua terminologia (JOOST et al., 2002). Após inúmeras discussões, chegou-se a um

consenso, e os catorze membros descobertos foram denominados GLUT1-14 (THORENS;

MUECKLER, 2010).

Todas as isoformas compartilham características moleculares semelhantes, tendo um

domínio transmembrana longo e altamente conservado, associado a um domínio

citoplasmático menos conservado e assimétrico, e um extracelular (JUNG et al, 1998). O fato

do domínio transmembrana dividir uma estrutura similar entre os diferentes GLUTs sugere

que o formato do canal de transporte de glicose é basicamente idêntico entre as isoformas.

Entretanto, as sequências específicas de aminoácidos encontradas nos domínios

41 �

citoplasmáticos e extracelulares indicam que eles são responsáveis pela regulação

tecido/específica da função de transporte (MUECKLER, 1994; MEDINA; OWEN, 2002;

MACHADO; SCHAAN; SERAPHIM, 2006). A estrutura molecular básica dos GLUTs é

apresentada na Figura 1 (MACHADO; SCHAAN; SERAPHIM, 2006).

O domínio transmembrana é composto por 12 segmentos hidrofóbicos, inseridos na

porção lipídica da membrana plasmática, cujos aminoácidos formam alfa-hélices, contendo

um caminho preenchido por água por onde o substrato se movimenta. Esses segmentos estão

unidos por alças. O domínio citoplasmático contém um segmento N-terminal curto, uma alça

citoplasmática e um segmento C-terminal longo. Entre as diferentes isoformas de GLUT as

sequências transmembrana são homólogas, enquanto que as alças de conexão e as terminações

são altamente heterólogas, determinando as especificidades de cada uma (MEDINA; OWEN,

2002; MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005).

Figura 1. Estrutura bidimensional dos GLUTs. FONTE: Adaptado de

Machado;Schaan, Seraphim, 2006.

Estudos têm examinado as propriedades cinéticas das diversas isoformas e vêm

utilizando análogos de glicose, como o Fluor-Desoxiglicose e 3-Metilglicose, para o seu

rastreamento, pois a glicose é rapidamente metabolizada e o seu transporte nem sempre pode

ser analisado e delimitado (MEDINA; OWEN, 2002; TIAN et al., 2003). Essas análises

demonstraram que, em situações de equilíbrio, a constante de Michaelis (Km) para 3-O-

metilglicose para GLUT 1 é de 16.9-26.2 miliMol (mM), enquanto que, nas mesmas

42 �

condições, GLUT 4 tem Km de 1,8-4,8 mM e GLUT 3 tem Km de 10,6 mM. Isso significa

que os GLUTs 3 e 4 têm maior afinidade pela glicose do que a GLUT 1, garantindo o

transporte máximo de glicose para os tecidos que contém essa isoforma, mesmo quando sua

concentração está baixa (MEDINA; OWEN, 2002; SIMPSON et al, 2008).

A família de proteínas GLUT caracteriza-se por apresentar numerosos resíduos de

glicina e triptofano, os quais são considerados essenciais para a função dos GLUTs (JOOST et

al., 2002). Características estruturais e funcionais individuais de cada membro desta família

ainda não estão totalmente elucidadas. Os GLUT são categorizados em 3 classes (I-III), que

apresentam sequências de aminoácidos em comum (JOOST et al., 2002; WOOD;

TRAYHUM, 2003, MACHEDA ROGERS; BEST, 2005).

A classe I dos GLUTs contém as isoformas de GLUT 1-4 e 14 e caracteriza-se pela

sua estrutura, função e distribuição tecidual. O GLUT 1 é expresso particularmente no cérebro

(incluindo a barreira hematoencefálica) e eritrócitos. Níveis moderados são observados no

tecido adiposo, muscular e hepático. GLUT 3 tem uma alta afinidade por glicose e isso é

consistente com sua presença em tecidos onde a sua demanda é considerável, como por

exemplo o cérebro (WOOD; TRAYHUM, 2003). Durante o desenvolvimento embrionário, o

GLUT 3 está presente nas células que dão origem à placenta, no estágio de blastocisto e, após

a implantação (THORENS; MUECKLER, 2010). O GLUT 14 encontra-se expresso em

testículos e é uma proteína com alto grau de similaridade com GLUT 3. No entanto, seu papel

específico no metabolismo da glicose ainda é desconhecido (WU; FREEZE, 2002).

A classe II inclui o transportador de frutose (GLUT 5), GLUT 7 e GLUT 9

(THORENS; MUECKLER, 2010). No que diz respeito a classe III, sabe-se que compreende 5

membros: GLUT 6, GLUT 8, GLUT 10, GLUT 12 e GLUT 13. Uma característica dessa

classe é a localização da glicosilação na alça 9. Essa glicosilação localiza-se na alça 1 nas

outras duas classes e tem se mostrado funcionalmente importante para o GLUT 1 (WOOD;

TRAYHUM, 2003).

A expressão de diversas isoformas dos GLUTs em tecidos diferentes é um reflexo das

distintas características dos vários transportadores e é responsável pelo alto grau de

especificidade no controle da absorção de glicose em diferentes condições fisiológicas

(WOOD; TRAYHUM, 2003). O quadro 1 ilustra os principais representantes das três classes

da família GLUT e seus diferentes sítios de expressão.

A expressão dos GLUTs é regulada por diversos hormônios, como estrógeno,

glicocorticóides e hormônios da tireóide. A exposição prolongada à insulina, como acontece

no diabetes tipo II, por exemplo, pode gerar um aumento nos níveis de GLUT 1, o que resulta

43 �

em uma maior transcrição de ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) e em sua meia-vida

(MUECKLER, 1994; MEDINA; OWEN, 2002). O estrógeno pode ser responsável pelo

aumento da atividade metabólica, o que gera uma maior concentração de GLUT 1, com

consequente aumento no transporte de glicose (CAMPBELL; FEBBRAIO, 2001). No que diz

respeito aos glicocorticóides, observou-se que eles podem induzir a resistência à insulina. O

uso da dexametasona, por exemplo, resulta na diminuição na expressão de GLUT 1 em até

30%, o que possivelmente gera uma menor absorção de glicose (SAKODA et al., 2000).

Isoforma Classe Localização Características funcionais

do transporte

GLUT 1 I Eritrócitos, cérebro Glicose

GLUT 2 I Fígado, pancreas,

intestine

Glicose (baixa afinidade);

Frutose

GLUT 3 I Cérebro, células

inflamatórias

Glicose (alta afinidade)

GLUT 4 I Coração, cérebro,

músculos

Glicose (alta afinidade)

GLUT 5 II Intestino, testículos,

rins

Frutose, glicose ( baixa

afinidade)

GLUT 6 III Cérebro, baço,

leucócitos

Glicose

GLUT 7 II Nd* Nd*

GLUT 8 III Testículos, cérebro, Glicose

GLUT 9 II Fígado, rim Nd*

GLUT 10 III Fígado e pancreas Glicose

Quadro 1. Localização tecidual das principais isoformas de GLUT e suas características

funcionais. Nd*: Não determinado. FONTE: Adaptado de MEDINA; OWEN

(2002).

44 �

2.3.2 Metabolismo da glicose no câncer –

O primeiro estágio no metabolismo da glicose é chamado de glicólise. Trata-se de um

processo anaeróbico, no qual uma molécula de glicose é convertida em glicose – 1,6 –

bifosfato, gerando duas moléculas de piruvato, com produção de 2 moléculas de ATP. Em

presença de oxigênio, ou seja, em condições de normóxia, esse produto é convertido, no

interior da mitocôndria, pela atuação do complexo piruvato desidrogenase a dióxido de

carbono. Nesse processo, a porção acetil da enzima acetil-CoA, que por sua vez é responsável

pelo início do ciclo de Krebs, tem como resultado a produção de cerca de 30 moléculas de

ATPs. Na ausência de oxigênio, ou seja, em situações de hipóxia, o piruvato é convertido, no

citosol, pela enzima lactato desidrogenase (LDHA), a lactato, o qual será transportado para o

meio extracelular. (GATENBY; GILLIS, 2004; ORTEGA et al., 2009).

As células em estado metabólico altamente ativo, como as células tumorais, requerem

uma demanda de energia aumentada, necessitando de oxigênio para gerar energia, a partir da

glicose e outros substratos, através da fosforilação oxidativa (ZHOU et al., 2008; KUMAR;

ABBAS; FAUSTO, 2010). Além da geração de energia, as altas taxas de fluxo glicolítico em

células cancerígenas são necessárias para produção de moléculas precursoras que levam a

biossíntese de nucleotídeos, fosfolipídeos para membrana e outros componentes requeridos

durante a divisão celular (RUDLOWSKI et al., 2004; MARÍN-HERNÁNDEZ et al., 2010).

As células malignas possuem metabolismo acelerado e por isso, requerem aumento na

produção de ATP. O primeiro mecanismo para maior captação de energia é a formação de

novos vasos sanguíneos, os quais aumentam a quantidade de nutrientes e oxigênio disponíveis

e, assim, possibilitam o seu crescimento. Apesar disso, a angiogênese não consegue

acompanhar o crescimento das células neoplásicas, o que resulta então, em áreas de hipóxia

no microambiente tumoral (MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005).

O primeiro ponto de ataque da hipóxia é a respiração aeróbica celular, isto é, a

fosforilação oxidativa que ocorre nas mitocôndrias. À medida que a tensão de oxigênio dentro

da célula cai, há perda da fosforilação oxidativa com consequente diminuição da geração de

ATP, o que exerce efeitos difusos sobre muitos sistemas da célula. (KUMAR; ABBAS;

FAUSTO, 2010). A mudança para o metabolismo anaeróbico é controlada por metabólitos

das vias energéticas que atuam sobre as enzimas glicolíticas. A redução de ATP celular e

elevação associada do monofosfato de adenosina (AMP) estimulam as atividades de

fosfofrutoquinase e fosforilase. Isso resulta em uma taxa aumentada de glicólise anaeróbica,

45 �

que visa manter as fontes de energia da célula gerando ATP através do metabolismo de

glicose derivado do glicogênio. (GATENBY; GILLIES, 2004).

A conversão da glicose em ácido lático na presença de oxigênio é conhecida como

“Efeito de Warburg”. Este fenômeno foi primeiramente descrito em 1920, por Otto Warburg

levando a hipótese que as células tumorais poderiam possuir uma disfunção bioenergética nas

mitocôndrias, levando a um metabolismo alterado da glicose (ORTEGA et al., 2009). Uma

vez que a fosforilação oxidativa ocorre no interior da mitocôndria, diversos estudos têm

procurado estabelecer uma associação entre o comprometimento bioenergético mitocondrial e

o metabolismo da glicose (UNWIN et al., 2003; ISIDORO et al., 2005). Observou-se assim,

que o ciclo de Krebs, em tumores malignos, mostra-se defeituoso na conversão para o citrato,

o que impede a sua progressão (MARÍN-HERNÁNDEZ et al., 2010).

Gatenby e Gillies (2004) sugerem que a glicólise anaeróbica presente no câncer

persiste mesmo em condições de normóxia e sua correlação com a agressividade tumoral

indica que o fenótipo glicolítico confere uma significante vantagem proliferativa durante a

evolução do câncer.

Diversos mecanismos têm sido propostos para explicar o aumento da regulação da

glicólise anaeróbica, principalmente aqueles que envolvem a ativação de oncogenes e/ou

inativação de genes supressores de tumores, que incidem na atividade glicolítica. O gene C-

MYC, por exemplo, é conhecido por ativar a maioria dos genes de enzimas glicolíticas, como

a LDHA e, também, o GLUT 1, para aumentar a produção de lactato e melhorar a captação de

glicose, respectivamente (MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005).

O ambiente hipóxico, promove expressão do fator induzido por hipóxia 1� (HIF-1�)

responsável por mediar a resposta celular frente às baixas concentrações de oxigênio, atuando

como indutor de genes, como os que regulam o fator de crescimento endotelial vascular

(VEGF), GLUT e hexoquinase II (LU; FORBES; VERNAS, 2002). O aumento constitutivo

dos níveis de HIF-1� é associado ao aumento de consumo de glicose. Sugere-se que o

fenótipo maligno no câncer pode estar associado à desregulação desta proteína e a diminuição

na sua expressão diminui a sobrevivência em resposta a hipóxia (SEMENZA, 2003).

Um aumento persistente na glicólise resulta no acúmulo de fosfatos inorgânicos e

lactato, o que torna o microambiente celular ácido. As células normais não possuem

mecanismos para se adaptar a acidose extracelular, tornando-se impossibilitadas de sobreviver

nessas condições, enquanto que as células tumorais continuam a se proliferar (MEDINA;

OWEN, 2002). O ácido lático liberado pelas células tumorais possui capacidade mutagênica e

clastogênica, possibilitando a inibição do reparo ao DNA. Além disto, pode estar envolvido

46 �

na translocação dos GLUTs para a membrana plasmática, o que causa um aumento na

utilização de glicose pelas células. Assim, a demanda de energia é satisfeita por um aumento

na absorção de açúcar, que é acompanhada por uma maior expressão dos GLUTs

(MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005).

2.3.3 GLUT 1-

O GLUT 1 é uma proteína com peso molecular de 45-55 quilodáltons (kDa),

amplamente distribuída e expressa em numerosos tecidos adultos ou fetais, embora

frequentemente em baixas concentrações, e por vezes em associação com outras isoformas. É

também chamado de transportador de glicose de eritrócitos (MUECKLER, 1994; MEDINA;

OWEN, 2002). Seu gene está localizado no cromossomo 1p34.3 (KLEPPER; VOIT, 2002).

Este membro da família GLUT foi isolado em 1977 por Kasahara e Hinke, a partir da

membrana de eritrócitos humanos. Isso foi possível, pois esta proteína compreende cerca de

5% do total da membrana das células vermelhas, a maior concentração encontrada dos

GLUTs.

No adulto, é expressa principalmente em hepatócitos, particularmente aqueles que

circundam as vênulas hepáticas terminais. Um dos mais importantes papéis desta proteína é o

de promover o transporte de glicose em várias células formando uma barreira entre o tecido

corporal e o suprimento sanguíneo (CARRUTHERS, 2009).

Sugere-se que a estrutura dimensional do GLUT 1 é composta por inúmeras hélices

anfipáticas agrupadas na membrana, formando a parede de uma estrutura semelhante a um

barril contendo “poros” (Figura 2). Hidroxilas e amidas contendo cadeias laterais de

aminoácidos poderiam fornecer sítios para formação de pontes de hidrogênio entre a proteína

e a glicose. As propriedades gerais e cinéticas dos transportadores de membrana sugerem que

este “poro” pode não representar um caminho contínuo de substrato através da bicamada

lipídica. Assim, a sua passagem pode ser bloqueada em uma extremidade a qualquer instante.

Este é o pressuposto básico do modelo de conformação alternada para o transporte de glicose,

que afirma que os sítios de ligação, ou um sítio único, carregados ou descarregados de

substrato, são alternadamente expostos em uma das faces da membrana (MUECKLER;

MAKEPEACE, 2009).

47 �

O GLUT 1 é a isoforma mais encontrada no feto, o que reflete na observação de que

sua expressão é induzida pelo crescimento como uma consequência do aumento de energia e

da necessidade de biossíntese das células em divisão. Esse transportador é mais abundante na

infância e na fase de desenvolvimento (SILVA, 2005). A expressão do GLUT 1 tem se

mostrado aumentada quando em presença de insulina, hormônios de crescimento e hormônios

da tireóide. Na presença de níveis elevados de glicose sanguínea ocorre um aumento na

expressão de GLUT 1 para sua maior captação (MUECKLER, 1994; SILVA, 2005).

A superexpressão de GLUT 1 é frequentemente induzida por oncogenes, como o RAS

e SRC, durante a carcinogênese. Esta indução parece estar relacionada com a menor sobrevida

dos pacientes e pode ser importante para o crescimento tumoral (RUDLOWSKI et al., 2004;

MACHEDA; ROGERS; BEST, 2005; OHBA et al., 2010).

MMMMMM

Figura 2. Modelo da estrutura de GLUT 1. As cadeias laterais de aminoácidos

hidrofóbicos são representadas pela letra “H”. As cadeias laterais polares são

indicadas pelos símbolos -,+, �. FONTE: MUECKLER (1994)

2.3.4 GLUT 3-

O GLUT 3 é a isoforma mais encontrada nas células do parênquima cerebral do

adulto. Sua expressão foi detectada em diversas células humanas com requerimento de glicose

bem específicos, incluindo espermatozóides, embriões pré-implantados, células brancas do

sangue e uma gama de linhagens celulares de carcinomas. Encontra-se localizado no

48 �

cromossomo 12p13.3 (MUECKLER et al, 1994; MENESES et al., 2007; TSUKIOKA et al.,

2007;), como os localizados no cérebro (BOADO; BLACK; PARDRIGE, 1994), ovário

(YOUNES, et al. 1997), pulmão (ITO et al., 1998), intestino (NOGUCHI et al., 1999), mama

(MATSUZU et al., 2004) e na tireóide (SIMPSON et al., 2008).

Inicialmente, pensava-se que apenas GLUT 1 era responsável pelo transporte de

glicose no cérebro. Com a descoberta do clone de GLUT 3 ficou aparente que este órgão não

depende exclusivamente de GLUT 1. Estas proteínas são independentes de insulina, pois

mesmo na sua ausência, um transporte mínimo de glicose para as células pode ser mantido.

GLUT 3 está envolvido na captação de substrato mesmo na presença de baixas concentrações,

funcionando de forma mais eficaz que as outras isoformas. No cérebro, local onde há uma

menor concentração de glicose, há uma maior expressão de GLUT 3. (MUECKLER, 1994;

SILVA, 2005; SIMPSON et al., 2008).

A primeira observação de GLUT 3 em linhagem celular de células brancas ocorreu

quando se pesquisava a expressão desta proteína no cérebro humano (MANTYCH et al.,

1992). Posteriormente, foi demonstrada sua presença em linfócitos humanos,

monócitos/macrófagos, neutrófilos e plaquetas (THORENS; MUECKLER, 2010). Sua

localização é intracelular e pode ser recrutada para membrana plasmática após a ativação

celular. A insulina pode induzir esse processo nos linfócitos B e nos monócitos, porém é

incapaz nos linfócitos T e neutrófilos (FU et al, 2004). Ativadores apropriados como,

lipopolissacarídeos e formilmethionil-leucil-fenilalanina (fMLP) para neutrófilos e

monócitos/macrófagos, fitohemaglutinina (PHA) para linfócitos, podem ser responsáveis pela

ativação de GLUT 3 nas células brancas. Sua expressão também pode ser observada nas

plaquetas e o recrutamento de GLUT 3 para a membrana plasmática é estimulado pela

trombina (SIMPSON et al., 2008).

Um modelo para expressar a estrutura molecular desta proteína ainda não foi bem

estabelecido, e pode ser caracterizado pela presença de um alça extracelular, um segmento N-

terminal próximo a membrana e resíduos centrais de glicina. Como os outros membros de sua

classe possuem uma N-glicosilação na alça 1, essa característica é requerida para manter alta

afinidade no transporte de glicose (MUECKLER; MAKEPEACE, 2009).

A segunda região de interesse para esta proteína é a alça intracelular 6, que possui um

segmento terminal COOH em proximidade com o local de saída do “poro” do transportador.

A sequência de aminoácidos da família GLUT diverge, neste ponto, o que pode determinar a

disposição deste segmento relativo ao “poro” ou sua flexibilidade e, portanto, o transporte

cinético. No caso de GLUT 3 humano, esses segmentos incluem um pequeno número de

49 �

aminoácidos, principalmente a glicina, e resíduos capazes de ligar hidrogênio à glicose

(SIMPSON et al., 2008). GLUT 3 possui alta afinidade por glicose, quando comparado com

demais membros da sua classe (JOOST et al., 2002).

Um dos primeiros estudos in vivo, realizado por Bondy et al. (1992), demonstrou que

a expressão de mRNA para GLUT 3 foi muito baixa no cérebro de ratos pré-natais, enquanto

que a isoforma GLUT 1 foi predominante em células progenitoras neurais. GLUT 3 foi

detectado em células neuronais que tinham migrado para o córtex cerebral, o que poderia estar

relacionado a maturação neuronal e o estabelecimento de conexões sinápticas. O

estabelecimento de conectividade sináptica e da comunicação impulsiona a maior demanda de

energia para o cérebro (MCEWIN; REAGAN, 2004). Simpson, Carruther e Vanucci (2004)

demonstraram, que tanto GLUT 1 como GLUT 3 aumentam com a maturação cerebral,

juntamente com o aumento da utilização de glicose cerebral.

Em cada tipo de célula, a translocação de GLUT 3 ocorre em resposta ao aumento

substancial na necessidade de energia durante a ativação celular. No caso das plaquetas, por

exemplo, a ativação da trombina induz uma cascata de eventos dependentes de energia,

processo que, rapidamente triplica o consumo de ATP, levando a sua escassez na mitocôndria.

Este é reposto através da glicólise e, assim, a diminuição na concentração de energia

favorecerá a captação de glicose através de GLUT 3 (MACHEDA; ROGERS; BEST, et al.,

2005).

2.3.5 Expressão dos GLUTs 1 e 3 no câncer –

Nas células malignas não só há um aumento dos GLUTs constitutivamente expressos,

mas também pode haver a expressão de isoformas que normalmente não são encontradas em

um determinado tecido. Por exemplo, GLUT 3 é expresso no câncer de pulmão, ovário e

gástrico, mas não nos tecidos normais correspondentes (YOUNES et al., 1997). GLUT 1 é o

transportador de glicose mais expresso na maioria dos tumores e tem demonstrado relação

com um pobre prognóstico. A sua superexpressão permite o crescimento das células tumorais

sob condições de hipóxia (OLIVER et al., 2004), e tem sido encontrada em diversas linhagens

de canceres, incluindo carcinoma cervical, de ovário, coloretal, cerebral, mamário, entre

outros (RUDLOWSKI et al., 2003; MACHEDA; ROGERS; BEST 2005).

50 �

Em 1998, Grover-McKay et al., observaram, em estudos in vitro, com linhagens de

células de câncer de mama, associação entre o potencial invasivo e um nível aumentado da

proteína GLUT 1, ao mesmo tempo em que a expressão de outras isoformas de GLUT

diminuíram. Este estudo demonstrou, ainda, que a diferenciação para um fenótipo menos

agresivo leva a uma redução de 33% na expressão de GLUT 1 e de 40% na taxa máxima de

transporte de glicose.

Em células normais, GLUT 1 é o principal transportador de glicose quando os níveis

circulantes de glicose estão na faixa de 1-5 mM. No entanto, em situações de hipóxia e

diminuição do fluxo sanguíneo, o aumento da regulação de GLUT 1, bem como de outros

membros da família, como GLUT 3, poderia trazer uma vantagem de sobrevivência para as

células cancerígenas, aumentando a captação de glicose em ambientes de baixa concentração.

(MENESES et al., 2008).Diversos estudos vêm tentando relacionar a superexpressão de

GLUT 1 e 3 com o comportamento biológico agressivo nos tumores. Entretanto, o papel das

diferentes isoformas de GLUT no câncer humano ainda é incerto. (ZHOU et al., 2008;

FENSKE et al., 2009; AYALA et al., 2010).

Rudlowski et al. (2005) realizaram estudo no qual observaram expressão imuno-

histoquímica de GLUT 1 e GLUT 3 em tumores malignos e benignos de ovário. Esses autores

observaram positividade para GLUT 1 em carcinomas invasivos, embora a intensidade da

expressão dessa proteína não tenha sido associada ao subtipo histológico, estadiamento

clínico TNM do tumor e à sobrevida. Já para GLUT 3, observou-se sua fraca marcação

presente tanto em câncer de ovário, quanto em tumores benignos.

Zhou et al (2008) avaliaram a expressão imuno-histoquímica e genética de GLUT 1 e

3, em 38 casos de carcinomas de cabeça e pescoço, com o objetivo de determinar o

comportamento biológico desses tumores. Os níveis de expressão gênica para GLUT 1 e

GLUT 3 foram significativamente altos, quando comparados com o tecido normal adjacente à

lesão, o que poderia resultar num importante aumento da absorção de glicose pelas células

malignas. A elevada imunoexpressão de GLUT 1 foi associada com um índice de sobrevida

pobre, de apenas 3 anos em 62% dos casos. Assim, os autores concluíram que GLUT 1 possui

papel principal na captação de glicose nos carcinomas de cabeça e pescoço. No entanto, não

houve imunomarcação para a proteína GLUT 3, em nenhum dos casos, apesar da sua

expressão gênica ter sido observada. Desta forma, a expressão gênica de GLUT 3 entra em

contradição com seu nível de marcação imuno-histoquímica. Os autores acreditam que a

presença de expressão gênica de GLUT 3 está relacionada com à presença de células

inflamatórias localizadas ao redor dos tumores e não à sua expressão nas células neoplásicas.

51 �

Mochizuki et al. (2001) observaram que GLUT 1 e 3 foram fortemente expressos em

tumores malignos e em tecidos inflamatórios. O nível de expressão de GLUT 1 é maior em

tecidos tumorais, com um padrão de marcação predominantemente membranar, embora

também possa ser observado no citoplasma. Por sua vez, o GLUT 3 possui uma maior

expressão em lesões inflamatórias. (AIRLEY et al., 2001; ZHOU et al., 2008).

Em estudo para avaliar a expressão de GLUT 1 e 3 em CEOs tratados cirurgicamente,

Tian et al. (2004) observaram que a marcação para GLUT 1 esteve presente em 94,7% dos

casos, principalmente nos tumores bem diferenciados. Em relação à GLUT 3, expressiva parte

das lesões (84,2%) apresentaram marcação positiva, com predomínio nos CEOs de alto grau,

entretanto, nenhuma relação foi encontrada entre os padrões de marcação, diferenciação do

tumor e o estadiamento clínico TNM.

Ayala et al (2010), demonstraram a associação das características clínico-patológicas

de 142 casos de CEO com o padrão de expressão imuno-histoquímica das proteínas GLUT 1

e 3. A superexpressão de GLUT 1 foi observada em 50,3% dos casos, com padrão de

marcação membranar. A expressão nuclear foi observada em 49,7% dos casos analisados. O

GLUT 1 mostrou significante associação com o consumo de álcool. A superexpressão de

GLUT 3 foi detectada em 21,1% dos casos e a sua marcação membranar demonstrou

associação com o estadiamento clínico avançado dos tumores e o baixo índice de sobrevida. O

padrão de marcação foi mais evidente nas áreas neoplásicas centrais, bem como ao redor de

áreas necróticas. Esta localização distante do suprimento sanguíneo reitera o conceito de que a

expressão destas proteínas é induzida pela hipóxia (OLIVER et al., 2004).

A hipóxia tumoral leva a uma radioresistência e aumento na incidência de metástase

(GATENBY; GILLIES, 2004). A hipóxia é um fator determinante na resposta para

quimioterapias convencionais (KOUKOURAKIS et al, 2002). Isso é devido, em parte, a

dependência de oxigênio para sua citotoxicidade, mas também, à inerente quimiorresistência

que ocorre em consequência das mudanças no ciclo celular observadas na hipóxia tumoral

(OLIVER et al, 2004). Kunkel et al. (2007) avaliaram a marcação imuno-histoquímica de

GLUT 1 em 40 espécimes de biópsia de CEO que sofreram radioterapia prévia. A média do

índice de marcação foi de 64,2%. Contudo, os tumores que tiveram expressão imuno-

histoquímica maior que 65% de células imunomarcadas demonstraram maior resistência à

radiação. A sobrevida foi maior para àqueles pacientes que expressaram baixos índices de

marcação. Este estudo sugere que a proteína GLUT 1 pode ser um importante marcador para

indicar a radiorresistência em CEO e a modulação do transporte de glicose no tumor pode ser

uma nova estratégia para aumentar a efetividade da radioterapia nestas lesões.

52 �

Ohba et al. (2010) avaliaram a imunoexpressão de GLUT 1 no front de invasão em 24

casos de CEO. As análises dos resultados mostraram que todos os espécimes avaliados

obtiveram correlação entre a expressão de GLUT 1 e a profundidade do tumor. A taxa de

sobrevida dos pacientes foi significativamente menor entre àqueles cujos tumores

apresentaram maior expressão dessa proteína. Nenhuma associação significativa foi

observada entre a intensidade de marcação, idade e sexo do paciente, tamanho do tumor ou

metástase linfonodal. Os autores concluíram que os tumores com maior profundidade de

invasão e maior expressão de GLUT 1 possuem um pior prognóstico em decorrência de

metástases linfonodais, recorrência ou metástases a distância.

Para Eckert et al. (2008) os critérios utilizados atualmente para prognóstico como,

estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade podem não ser suficientes

para uma exata predição do CEO. Em estudo para avaliar a expressão da proteína GLUT 1 em

CEO, os autores avaliaram 42 espécimes. Desses, 32 casos mostraram fraca marcação para

GLUT 1, enquanto que 10 tumores tiveram imunoexpressão variando de moderada a forte. A

superexpressão dessa proteína está associada a um risco de 4,9 vezes maior do paciente ir a

óbito, quando comparados com os casos de fraca marcação. Esses resultados demonstram que

GLUT 1 pode ser um importante marcador prognóstico, para auxiliar na decisão terapêutica.

Diante do exposto, os autores observaram que há uma forte necessidade de desenvolver

estudos para a utilização de novos marcadores. Os GLUTs podem permitir a análise, em

estágios iniciais, do status de hipóxia tumoral para uma correta avaliação do prognóstico e

estratégia terapêutica.

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54 �

3 PROPOSIÇÃO

O presente estudo se propõe avaliar a imunoexpressão dos GLUTs 1 e 3 em CEs de

lábio inferior, com o objetivo de relacionar esses resultados com os aspectos clínico-

patológicos, em relação a presença e ausência de metástase em linfonodos regionais,

estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade. Por meio desta

investigação, pretende-se obter dados que facilitem a compreensão do comportamento

biológico da lesão estudada, bem como a utilização desses marcadores como indicadores do

prognóstico da doença.

�

��

56 �

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

A presente pesquisa foi submetida à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Liga

Norte Riograndense Contra o Câncer (LNRCC), do qual recebeu aprovação conforme parecer

de número: 082/082/2011 (ANEXO A). Os sujeitos desta pesquisa assinaram o termo de

consentimento livre e esclarecido (APÊNDICE 1), dando ciência de sua participação no

estudo.

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

O estudo em questão, caracterizou-se como uma pesquisa retrospectiva e descritiva,

caracterizada pela observação, análise, registro e quantificação das expressões dos GLUTs 1 e

3, por meio de imuno-histoquímica, em uma série de casos de CE de lábio inferior,

relacionando-os com os aspectos clínico-patológicos abordados no estudo.

4.3 POPULAÇÃO

A população objeto deste estudo foi constituída pelos casos de CE de lábio inferior no

período de 2004/2010, registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz

Antônio, Natal- RN.

57 �

4.4 AMOSTRA

A amostra foi constituída de 40 espécimes de CE de lábio inferior, dos quais 20

apresentaram metástase linfonodal regional, confirmada por meio de exame histopatológico, e

os 20 restantes encontram-se isentos de metástase linfonodal regional. As informações

inerentes ao estadiamento clínico TNM dos tumores foram obtidas dos respectivos

prontuários médicos, os quais permaneceram no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital

Dr. Luiz Antônio, Natal- RN, assim como, o material biológico resultante da terapêutica

cirúrgica instituída. Os dados clínicos foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 2).

4.4.1 Critérios de inclusão da amostra

Foram incluídos na amostra, os casos de CE de lábio inferior tratados por excisão

cirúrgica, sem radioterapia ou quimioterapia prévia, desde que os prontuários médicos dos

pacientes tivessem todos os dados clínicos necessários ao estudo. Para esta pesquisa, foram

considerados os espécimes que apresentaram quantidade suficiente de material biológico para

análise da gradação histológica de malignidade e estudo imuno-histoquímico.

Especificamente para constituição do grupo dos tumores com metástase linfonodal regional,

foram incluídos apenas os casos cujas metástases foram confirmadas por exame

histopatológico.

4.4.2 Critérios de exclusão da amostra

Os casos que não se ajustaram às exigências dos critérios de inclusão foram excluídos

da amostra.

58 �

4.5 ESTADIAMENTO CLÍNICO TNM PARA CE DE LÁBIO INFERIOR

Para o estadiamento clínico dos CE de lábio inferior, foram utilizados os parâmetros

elencados na sexta edição da Classificação TNM dos Tumores Malignos (SOBIN;

WITTEKIND, 2002), os quais são apresentados nos Quadros 2 e 3. Os dados inerentes ao

estadiamento clínico TNM foram coletados nos prontuários médicos dos pacientes tratados no

Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, e anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 2).

T – TUMOR PRIMÁRIO TX Tumor primário não pode ser avaliado

T0 Não há evidência de tumor primário Tis Carcinoma in situ T1 Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão

T2 Tumor com mais de 2 cm e até 4 cm em seu diâmetro maior T3 Tumor com mais de 4 cm em sua maior dimensão T4a Tumor que invade estruturas adjacentes: cortical óssea, nervo alveolar inferior, assoalho

da boca ou pele da face (queixo ou nariz) T4b Tumor que invade o espaço mastigador, lâminas pterigóides, base do crânio ou artéria

carótida interna

N – LINFONODOS REGIONAIS NX Linfonodos regionais não podem ser avaliados N0 Ausência de metástase em linfonodos regionais

N1 Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3 cm ou menos em sua maior dimensão

N2 N2a – Metástase em um único linfonodo homolateral com mais de 3 cm e até 6 cm em sua maior dimensão N2b – Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão N2c - Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão

N3 Metástase em linfonodo com mais de 6 cm em sua maior dimensão

M – METÁSTASE À DISTÂNCIA MX Metástase à distância não pode ser avaliada M0 Ausência de metástase à distância M1 Presença de metástase à distância

Quadro 2. Sistema de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por

SOBIN, WITTENKIND (2002).

59 �

ESTÁGIO CLASSIFICAÇÃO TNM

0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 II T2 N0 M0 III T1, T2

T3 N1 N0, N1

M0 M0

IVA

T1, T2, T3 T4a

N2 N0, N1, N2

M0 M0

IVB Qualquer T T4b

N3 Qualquer N

M0 M0

IVC Qualquer T Qualquer N M1

Quadro 3. Categorias de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por

SOBIN, WITTENKIND (2002).

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO

A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi submetida

a novos cortes com 5µm de espessura, os quais, por sua vez, foram estendidos em lâminas de

vidro e submetidos à coloração de rotina da hematoxilina e eosina. Sob microscopia de luz

(Olympus CX31, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN), os espécimes de CE de lábio inferior

foram examinados com aumentos de 100× e 400×. Após esta fase, foi realizada análise da

gradação histológica de malignidade dos espécimes, no front de invasão tumoral, de acordo

com o sistema proposto por Bryne (1998) (Quadro 4). Foi realizada ainda, gradação

histológica proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005), para essa análise toda a extensão da

lesão foi avaliada (Quadro 5).

60 �

Aspectos Morfológicos

Escore de Malignidade

1 2 3 4

Grau de Ceratinização

Altamente ceratinizado

(mais de 50% das células)

Moderadamente ceratinizado (20 a 50% das células)

Mínima ceratinização (5 a 20% das células)

Nenhuma ceratinização (0 a 5%

das células)

Pleomorfismo Nuclear

Pouco pleomorfismo nuclear (mais de 75% das

células maduras)

Moderado pleomorfismo

nuclear (50 a 75% das células maduras)

Abundante pleomorfismo (25 a 50% das células

maduras)

Pleomorfismo nuclear extremo (0 a 25% das

células maduras)

Padrão de Invasão

Bordas infiltrativas

bem delimitadas

Cordões, bandas e/ ou trabéculas

sólidas infiltrativas

Pequenos grupos ou cordões de

células infiltrativas

(N>15)

Dissociação celular difusa e pronunciada, em pequenos grupos

e/ou células individuais (N<15)

Infiltrado Inflamatório

Intenso Moderado Escasso Ausente

Quadro 4. Sistema de gradação histológica de malignidade no “front” de invasão proposto

por Bryne (1998).

Gradação histológica – OMS

Parâmetros Características

Pouco diferenciado Predomínio de células imaturas Numerosas mitoses típicas e atípicas Mínima ceratinização

Moderadamente diferenciado Certo grau de pleomorfismo nuclear e atividade mitótica Pouca ceratinização

Bem diferenciado Arquitetura tecidual semelhante ao padrão normal do epitélio escamoso

Quadro 5. Sistema de gradação histológica proposto pela OMS (CARDESA et al., 2005).

Para a gradação histológica proposta por Bryne (1998), os escores obtidos em cada um

dos parâmetros foram somados, obtendo-se, dessa forma, o escore final de malignidade do

caso. As lesões que apresentaram escores finais entre 4 e 8 foram classificadas como de baixo

grau de malignidade. Por sua vez, os tumores com escore final igual ou superior a 9 foram

classificados como de alto grau de malignidade (SILVEIRA et al., 2010). Já para a gradação

histológica proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005) foi avaliado o grau de diferenciação

61 �

celular em toda a extensão do tumor. Posteriormente, os casos foram classificados como:

Pobremente diferenciados, moderadamente diferenciados ou bem diferenciados.

Destaca-se que as gradações histológicas de malignidade foram realizadas por dois

examinadores previamente treinados, sem que os mesmos tivessem conhecimento sobre os

dados clínicos da lesão. Os casos nos quais as gradações histológicas de malignidade,

determinadas pelos examinadores, encontravam-se discordantes foram resolvidos por

consenso. Os dados referentes as gradações histológicas de malignidade foram anotados em

fichas apropriadas (APÊNDICE 3).

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

4.7.1 Método imuno-histoquímico

A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi submetida

a cortes com 3µm de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro devidamente

preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao método da

imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano (ADVANCETM

HRP, Dako

North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando os anticorpos monoclonais anti-GLUT

1 e anti-GLUT 3 (Quadro 6).

Como controle interno, foram utilizados os eritrócitos existentes em cada espécime

para o anticorpo anti-GLUT 1 e as células inflamatórias adjacentes ao tumor para o anticorpo

anti-GLUT 3. O controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por

albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.

A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo:

� Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada);

� Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:

• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

62 �

• Álcool etílico 95°GL (5 minutos);


� Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°, à

temperatura ambiente (10 minutos);

� Lavagem em água corrente (10 minutos)

� Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

� Recuperação antigênica (Quadro 6);

� Lavagem em água corrente (10 minutos);


� Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes, em

proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos cada);



� Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);

� Incubação dos cortes com anticorpos primários, em solução diluente (Antibody diluent

with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA);


� Incubação com anticorpo secundário (ADVANCETM

HRP Link, Dako North America Inc.,

Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);


� Incubação com anticorpo polimerizado à peroxidase (ADVANCETM

HRP Enzyme, Dako

North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);


� Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB+

Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (7 minutos);


� Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

� Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5 minutos);


� Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:



• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

63 �

• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

� Três passagens em xilol (2 minutos cada);

� Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA).

Especificidade Nº catálogo Fabricante Diluição Recuperação

Antigênica Incubação

GLUT 1 GTX 15309 Gene Tex 1:400 Citrato, pH 6,0

Pascal, 121ºC, 3 min 60 minutos

GLUT 3 GTX 15311 Gene Tex 1:400 Citrato, pH 6,0

Pascal, 121ºC, 3 min 60 minutos

Quadro 6. Especificidade, nº catálogo, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários a serem utilizados no estudo.

4.7.2 Análise imuno-histoquímica

Após o processamento dos cortes histológicos e tratamento imuno-histoquímico, cada

espécime foi analisado sob microscopia de luz (Olympus CX41, Olympus Japan Co., Tokyo,

JPN), por dois examinadores previamente treinados.

A análise da expressão do GLUT 1 e GLUT 3 foi realizada de forma semi-

quantitativa, adaptando-se a metodologia utilizada no estudo de Ohba et al. (2010).

Primeiramente, ao longo do front de invasão e do centro do tumor, sob aumento de 40×,

foram selecionados 5 campos de maior imunorreatividade aos anticorpos anti-GLUT 1 e anti-

GLUT 3, para cada uma das regiões analisadas. Sob aumento de 200×, cada um destes

campos foi fotomicrografado (Olympus EVOLT E-330, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN) e

as imagens obtidas foram transferidas para um computador através do sistema Olympus

MasterTM 2.

Com auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®,

National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA), em cada um destes campos,

foi realizada contagem de cada uma das células tumorais que exibiram marcação simultânea

citoplasmática e/ou membranar, marcação nuclear e as células negativas. Com os dados

64 �

obtidos, para cada caso, foi estabelecido o total de células avaliadas, a partir da sua soma e

posteriormente, foram estabelecidos os percentuais de células tumorais exibindo positividade.

Os dados obtidos com essa avaliação foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 4).

Posteriormente, foi realizada a análise do padrão de marcação para os anticorpos anti-

GLUT 1 e anti-GLUT 3 nas ilhas tumorais. Sob um aumento de 40× e 200× as lesões foram

analisadas ao longo de toda sua extensão, quanto à presença de marcação na periferia das

ilhas tumorais, no centro, bem como na periferia/centro do tumor. Os dados referentes a esses

achados foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE 5).

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos pela técnica imuno-histoquímica foram digitados em planilha

eletrônica Excel (Microsoft Excel 2010®

) e posteriormente exportados para o programa

Statistical Package for the Social Sciences (versão 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA), onde

foram feitas as análises estatísticas apropriadas.

Para verificar possíveis diferenças entre o percentual de marcação de GLUT 1 e

GLUT 3 em relação ao estadiamento clínico, os casos pertencentes aos estágios I e II foram

reunidos em um único grupo, bem como aqueles correspondentes aos estágios III e IV.

De forma semelhante, os dados referentes à gradação histológica de malignidade

proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005) também foram agrupados, o primeiro grupo

correspondendo às lesões bem diferenciadas e o segundo caracterizado pelas lesões

moderadamente/pobremente diferenciadas.

A análise dos aspectos clínicos e morfológicos, bem como do padrão de marcação nas

ilhas tumorais para os anticorpos anti-GLUT 1 e anti-GLUT 3, foi realizada através do teste

não-paramétrico exato de Fisher.

Para análise do percentual de células positivas em relação aos aspectos clínico-

patológicos, foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney.

O teste de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar possíveis correlações

entre as imunoexpressões de GLUT 1 e GLUT3 nos carcinomas epidermóides de lábio

inferior.

O teste não-paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para avaliar possíveis diferenças

entre as expressões de GLUT 1 e GLUT 3, no front de invasão e no centro tumoral.

65 �

Para todos os testes utilizados, o nível de significância foi estabelecido em 5%

(p<0,05).

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67 �

5 RESULTADOS

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

A amostra deste estudo foi constituída por 40 casos de carcinoma epidermóide de

lábio inferior, dos quais 20 apresentaram presença de metástase e os 20 restantes com

ausência de metástase. Constatou-se que 67,5% dos pacientes eram do sexo masculino,

estabelecendo uma proporção homem:mulher de 2:1. A sétima década de vida foi a faixa

etária que mostrou maior prevalência, com uma média de idade de 67,5 anos (Tabela 1).

Tabela 1. Distribuição dos casos de carcinoma de lábio inferior, segundo sexo e faixa etária

dos pacientes, de acordo com a presença e ausência de metástase. Natal-RN 2012.

Dados clínicos Ausência de metástase Presença de metástase TOTAL

n % n % n %

Sexo

Feminino 7 35 6 30 13 32,5

Masculino 13 65 14 70 27 67,5

TOTAL 20 100 20 100 40 100

Faixa etária n % n % n %

21 - 30 anos 1 5 0 0 1 2,5

31 - 40 anos 1 5 0 0 1 2,5

41 - 50 anos 1 5 3 15 4 10

51 - 60 anos 3 15 4 20 7 17,5

61 - 70 anos 8 40 3 15 11 27,5

71 - 80 anos 3 15 5 25 8 20

81 - 90 anos 2 10 4 20 6 15

91 - 100 anos 1 5 1 5 2 5

TOTAL 20 100 20 100 40 100

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral - UFRN

68 �

Dentre os casos estudados, houve uma maior ocorrência do estágio II do estadiamento

clínico TNM (32,5%), seguido dos estágios III (27,5%) e IV (27,5%). Nas lesões com

metástase linfonodal, observou-se que 55% dos casos correspondiam ao estágio IV. Para o

grupo das lesões sem metástase, constatou-se um predomínio do estágio II, representando

65% dos casos analisados (TABELA 2).

Tabela 2.� Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior, segundo o

estadiamento clínico TNM, de acordo com a presença e ausência de metástase.

Natal – RN, 2012.

Estadiamento

clínico

Ausência de metástase Presença de metástase Total

n % n % n %

Estágio I 5 25 0 0 5 12,5

Estágio II 13 65 0 0 13 32,5

Estágio III 2 10 9 45 11 27,5

Estágio IV 0 0 11 55 11 27,5

TOTAL 20 100 20 100 40 100

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN

5.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS

Frente à avaliação morfológica dos casos, destacou-se a presença de hipercromatismo

celular, alteração da relação núcleo/citoplasma, pleomorfismo celular e nuclear, disceratose

com formações de pérolas córneas, figuras de mitose típicas e atípicas e nucléolos

proeminentes. Quanto ao padrão de invasão, pode-se perceber a presença de um crescimento

invasivo, em forma de lençóis de células epiteliais malignas com bordas infiltrativas, bem

como a presença de cordões sólidos e crescimento celular isolado. Observou-se, ainda,

infiltrado inflamatório variando de escasso a severo. Os parâmetros utilizados para gradação

histológica de malignidade, proposta por Bryne (1998), assim como os escores atribuídos a

cada lesão encontram-se nas Tabelas 3 e 4.

69 �

Tabela 3. Análise morfológica e gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998) dos

casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior sem metástase. Natal-RN, 2012.

Caso

Aspectos Morfológicos Escore

Total Gradação Grau de

ceratinização

Pleomorfismo

nuclear

Padrão de

invasão

Infiltrado

inflamatório

1 3 3 2 1 9 Alto grau

2 2 2 2 1 7 Baixo grau


4 2 2 3 2 9 Alto grau


6 3 2 2 2 9 Alto grau




10 2 2 2 1 6 Baixo grau

11 2 1 3 2 8 Baixo grau

12 2 3 1 1 7 Baixo grau

13 2 2 2 1 7 Baixo grau

14 1 3 2 1 7 Baixo grau

15 3 3 1 1 8 Baixo grau

16 1 3 3 1 8 Baixo grau

17 1 2 2 1 6 Baixo grau

18 4 2 4 1 11 Alto grau

19 2 2 2 2 8 Baixo grau

20 3 3 1 1 8 Baixo grau


70 �

Tabela 4. Análise morfológica e gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998) dos

casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior com metástase. Natal-RN, 2012.

Caso

Aspectos Morfológicos Escore

Total Gradação Grau de

ceratinização

Pleomorfismo

nuclear

Padrão de

invasão

Infiltrado

inflamatório

1 4 3 3 3 13 Alto grau

2 1 4 4 1 10 Alto grau

3 4 2 2 2 10 Alto grau

4 2 3 3 1 9 Alto grau

5 3 3 2 1 9 Alto grau

6 4 2 2 1 9 Alto grau




10 3 2 4 2 11 Alto grau

11 4 1 3 2 9 Alto grau

12 4 3 2 1 10 Alto grau

13 4 3 4 1 12 Alto grau

14 4 2 1 2 9 Alto grau

15 2 2 2 1 7 Baixo grau

16 1 3 2 1 7 Baixo grau

17 3 3 4 2 12 Alto grau

18 4 3 4 1 12 Alto grau

19 2 2 2 1 7 Baixo grau

20 3 3 4 1 11 Alto grau


Dos 40 casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior avaliados pela gradação

histológica de malignidade, proposta por Bryne (1998), 22 foram classificados como baixo

grau de malignidade (Figura 3), representando 55% do total da amostra. Avaliando os

carcinomas sem metástase, 80% das lesões foram caracterizadas como baixo grau. Já para os

casos com presença de metástase, 70% apresentaram alto grau de malignidade (Figura 4). O

teste exato de Fisher revelou associação estatisticamente significativa entre as lesões com alto

grau de malignidade e a presença de metástase (p=0,004) (Tabela 5).

71 �

Tabela 5. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística do grau histológico de

malignidade (BRYNE, 1998) em relação à metástase linfonodal. Natal – RN,

2012.

Metástase

Gradação histológica Total

n (%) p Baixo grau

n (%)

Alto grau

n (%)

Ausente 16 (80,0) 4 (20,0) 20 (100,0) 0,004

Presente 6 (30,0) 14 (70,0) 20 (100,0)


Ao relacionar esse sistema de gradação histológica de malignidade com o

estadiamento clínico TNM, observou-se que, dentre as lesões de baixo grau o estágio II foi o

mais prevalente, enquanto que nos casos com alto grau de malignidade o estágio clínico III foi

o mais evidente (Tabela 6).

Tabela 6. Distribuição absoluta e relativa da relação entre o estadiamento clínico TNM e a

gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998). Natal – RN, 2012.

Estadiamento

clínico

Gradação histológica Total

n (%) Baixo Grau

n (%)

Alto Grau

n (%)

Estágio I 4 (80,0) 1 (20,0) 5 (100,0)

Estágio II 10 (76,9) 3 (23,1) 13 (100,0)

Estágio III 3 (27,3) 8 (72,7) 11 (100,0)

Estágio IV 5 (45,5) 6 (54,5) 11 (100,0)


A maioria das lesões que se encontravam nos estágios I e II foram classificadas como

baixo grau de malignidade, enquanto que a maior proporção dos casos correspondentes às

lesões de alto grau encontravam-se nos estágios III e IV. O teste exato de Fisher verificou

associação estatisticamente significativa entre o grau de malignidade do tumor e o

estadiamento clínico TNM (p=0,012) (Tabela 7).

72 �

Tabela 7. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística da relação entre

estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade (BRYNE,

1998). Natal – RN, 2012.

Estadiamento clínico Gradação histológica

Total n (%)

p Baixo grau n (%)

Alto grau n (%)

Estágio I e II 14 (77,8) 4 (22,2) 18 (100,0) 0,012 Estágio III e IV 8 (36,4) 14 (63,6) 22 (100,0) Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN

A avaliação da gradação histológica de malignidade, proposta pela OMS (CARDESA

et al., 2005), demonstrou que 50% dos casos sem metástase foram bem diferenciados (Figura

3). Contudo, 65% dos casos com metástase eram moderadamente diferenciados (Tabela 8). O

teste exato de Fisher revelou associação estatisticamente significativa entre as lesões

moderadamente/ pobremente diferenciadas (Figura 4) e a presença de metástase (p=0,014)

(Tabela 9).

Tabela 8. Distribuição absoluta e relativa do grau histológico de malignidade (CARDESA et

al., 2005) em relação à metástase linfonodal. Natal – RN, 2012.

Metástase Gradação histológica

Total n (%)

BD n (%)

MD n (%)

PD n (%)

Ausente 10 (50,0) 8 (40,0) 2 (10,0) 20 (100,0) Presente 2 (10,0) 13 (65,0) 5 (25,0) 20 (100,0) Legenda: BD – Bem diferenciado; MD – Moderadamente diferenciado; PD – Pobremente diferenciado Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN


malignidade (CARDESA et al., 2005) em relação à metástase linfonodal. Natal –

RN, 2012.

Metástase Gradação histológica de malignidade OMS

Total n (%)

p BD n (%)

MD/ PD n (%)

Ausente 10 (50,0) 10 (50,0) 20 (100,0) 0,014 Presente 2 (10,0) 18 (90,0) 20 (100,0) Legenda: BD – Bem diferenciado; MD – Moderadamente diferenciado; PD – Pobremente diferenciado Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN

73 �

A Tabela 10 demonstra a distribuição dos casos de acordo com a gradação histológica

de malignidade proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005) e o estadiamento clínico TNM.

Pode-se observar que 88,8% dos casos moderadamente/ pobremente diferenciados encontram-

se nos estágios III e IV. O teste exato de Fisher não evidenciou associação estatisticamente

significativa entre as variáveis (p=0,093) (Tabela 11).

Tabela 10. Distribuição absoluta e relativa da relação entre a gradação histológica de

malignidade (CARDESA et al., 2005) e o estadiamento clínico TNM. Natal –

RN, 2012.

Estadiamento

clínico

Gradação histológica de malignidade OMS Total

n (%) BD

n (%)

MD

n (%)

PD

n (%)

Estágio I 3 (60,0) 2 (40,0) 0 (0,0) 5 (100,0)

Estágio II 5 (38,5) 6 (46,2) 2 (15,4) 13 (100,0)

Estágio III 2 (18,2) 8 (72,7) 1 (9,1) 11 (100,0)

Estágio IV 2 (18,2) 5 (45,5) 4 (36,4) 11 (100,0)



malignidade (CARDESA et al., 2005) em relação ao estadiamento clínico TNM.

Natal – RN, 2012.

Estadiamento

clínico

Gradação histológica de malignidade OMS Total

n (%)

p

BD

n (%)

MD/ BD

n (%)

Estágio I e II 8(44,4) 10 (55,6) 18 (100,0) 0,093

Estágio III e IV 4 (18,2) 18 (81,8) 22 (100,0)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN.

74 �

5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

5.3.1 Análise descritiva da expressão de GLUT 1 e GLUT 3

A expressão de GLUT 1 foi observada em todos os casos. Verificou-se que o padrão

de marcação mais evidente se encontrava localizado na periferia das ilhas tumorais,

apresentando intensidade forte (Figura 5). No entanto, a porção central apresentava-se

marcada fracamente, com as áreas de ceratinização demonstrando uma marcação variando de

fraca a ausente. Constatou-se ainda, casos em que a marcação era observada tanto na periferia,

quanto no centro das ilhas tumorais (Figura 6). O teste do Qui-quadrado não revelou

associação estatisticamente significativa do padrão de marcação para GLUT 1 com a

metástase linfonodal (p = 0,338) ou com o estadiamento clínico TNM (p=0,185) (Tabela 12).

Tabela 12. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística do padrão de marcação

para GLUT 1 em relação à metástase linfonodal e ao estadiamento clínico TNM.

NATAL – RN, 2012.

Parâmetros

Padrão de marcação para GLUT 1 Total

n (%) P Periferia

n (%)

Centro

n (%)

Periferia e centro

n (%)

Metástase

Ausente 16 (80,0) 3 (15,0) 1(5,0) 20 (100) 0,338

Presente 12 (60,0) 7 (35,0) 1 (5,0) 20 (100)

Estadiamento

Estágio I e II 15(83,3) 2 (16,7) 0 (0,0) 18 (100) 0,185

Estágio III e IV 13 (59,1) 7 (31,8) 2 (9,1) 22 (100)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – UFRN.

Na Tabela 13 podemos observar a relação entre a gradação histológica de malignidade

(BRYNE, 1998) e o padrão de marcação para GLUT 1 na ilhas tumorais. O teste do Qui-

quadrado não revelou associação estatisticamente significativa entre as variáveis analisadas

75 �

(p=0,522). Quando utilizada a gradação histológica de malignidade proposta pela OMS

(CARDESA et al., 2005), também não foi evidenciada associação estatisticamente

significativa, por meio do teste do Qui-quadrado (Tabela 13) (p=0,632).


para GLUT 1 em relação às gradações histológicas de malignidade. NATAL –

RN, 2012.

Gradação histológica


n (%) p Periferia

n (%)

Centro

n (%)

Periferia e centro

n (%)

Bryne (1998)

Baixo grau 17 (77,3) 4 (18,2) 1 (4,5) 22 (100) 0,522

Alto grau 11 (61,1) 6 (33,3) 1 (5,6) 18 (100)

Cardesa et al. (2005)

BD 9 (78,0) 2 (16,7) 1 (8,3) 12 (100,0) 0,632

MD/ PD 19 (67,9) 8 (28, 6) 1 (3,6) 28 (100,0)

Legenda: BD – Bem diferenciado; MD – Moderadamente diferenciado; PD – Pobremente diferenciado

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

A marcação para GLUT 3 foi predominantemente mais fraca, quando comparada com

a imunomarcação para GLUT 1. Os casos apresentando positividade para o anticorpo anti-

GLUT 3 demonstraram uma discreta marcação no centro das ilhas tumorais (figura 7). De

uma forma geral, a intensidade de marcação para esta proteína foi fraca, com escassos casos

apresentando marcação moderada (figura 8). Nas regiões centrais onde foi observada a

presença de áreas necróticas houve maior expressão de GLUT 3, com intensidade de

marcação forte. O teste do Qui-quadrado não revelou associação estatisticamente significativa

do padrão de marcação para GLUT 3 com a metástase linfonodal (p = 0,889) ou com o

estadiamento clínico TNM (p=0,675) (Tabela 14).

76 �


para GLUT 3 em relação à metástase linfonodal e ao estadiamento clínico TNM.

NATAL – RN, 2012.

Variável


n (%) P Periferia

n (%)

Centro

n (%)

Periferia e centro

n (%)

Metástase

Ausente 3 (15,0) 14 (70,0) 3 (15,0) 20 (100) 0,889

Presente 2 (10,0) 15 (75,5) 2 (15,0) 20 (100)

Estadiamento

Estágio I e II 3 (16,7) 13 (72,2) 2 (11,1) 18 (100,0) 0,675

Estágio III e IV 2 (9,1) 16 (72,7) 4 (18,2) 22 (100,0)


Na Tabela 15 podemos observar a relação entre a gradação histológica de malignidade

proposta por Bryne (1998) e o padrão de marcação para GLUT 3 na ilhas tumorais. O teste do

Qui-quadrado não revelou associação estatisticamente significativa entre as variáveis

analisadas (p=0,346). De forma similar, o teste do Qui-quadrado não revelou associação

estatisticamente significativa entre o padrão de marcação para GLUT 3 e a gradação

histológica proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005) (p=0,266) (Tabela 15).


para GLUT 3 em relação às gradações histológicas de malignidade. NATAL –

RN, 2012.

Gradação histológica Padrão de marcação para GLUT 3

Total n (%)

P Periferia n (%)

Centro n (%)

Periferia e centro n (%)

Bryne (1998) Baixo grau 4 (18,2) 14 (63,6) 4 (18,2) 22 (100,0) 0,346 Alto grau 1 (5,6) 15 (83,3) 2 (11,1) 18 (100,0) Cardesa et al. (2005) BD 3 (25,0) 7 (58,3) 2 (16,7) 12 (100,0) 0,266 MD/ PD 2 (7,1) 22 (78,6) 4 (14,3) 28 (100,0)



77 �

5.3.2 Avaliação da expressão de GLUT 1 quanto à presença ou ausência de

metástase

A análise da expressão de GLUT 1 no front de invasão tumoral revelou, para o grupo

dos carcinomas sem metástase, percentuais de positividade citoplasmática/ membranar

(Figura 9) que variaram de 77,35% a 100,0%, com mediana de 96,19%. No grupo das lesões

com metástase, estes percentuais variaram de 88,56% a 99,62%, com mediana de 97,79%. No

centro tumoral, os carcinomas sem metástase revelaram percentuais de positividade

citoplasmática/membranar para GLUT 1 que variaram de 95,67% a 99,99%, com mediana de

96,30%. Nos tumores com metástase, os percentuais variaram de 85,24% a 99,98%, com

mediana de 96,43%. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney não revelou diferença

estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão citoplasmática/ membranar

de GLUT 1 entre as lesões com e sem metástase linfonodal, tanto no front de invasão (p =

0,372) como no centro tumoral (p = 0,903) (Tabela 16).

Tabela 16. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos

postos, estatística U e significância estatística (p) para o percentual de

positividade citoplasmática/membranar para GLUT 1 no front de invasão e no

centro tumoral em relação à metástase linfonodal. Natal, RN – 2012.

Localização/

Metástase n Mediana Q25-Q75

Média dos

postos

Soma

dos

postos

U p

Front de invasão

Presente 20 97,79 95,06–98,62 22,15 443,00 167,00 0,372

Ausente 20 96,19 91,83–98,54 18,85 377,00

Centro tumoral

Presente 20 96,43 93,63–98,36 20,28 405,50 195,50 0,903

Ausente 20 96,30 92,75–98,95 20,73 414,50


A avaliação dos percentuais de positividade nuclear para GLUT 1 (Figura 10), no front

de invasão tumoral, revelou, para o grupo dos carcinomas sem metástase, uma variação de 0%

78 �

a 0,39%, com mediana de 0,09%. Nas lesões com metástase, os percentuais variaram de 0% a

0,42%, com mediana de 0,03%. No centro tumoral, os percentuais de positividade nuclear

para GLUT 1, nos carcinomas sem metástase, variaram de 0% a 0,36%, com mediana de

0,06%. Nos tumores com metástase, estes percentuais variaram de 0% a 0,24%, com mediana

de 0,02%. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença

estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão nuclear de GLUT 1 entre as

lesões com e sem metástase linfonodal, tanto no front de invasão (p = 0,062) como no centro

tumoral (p = 0,320) (Tabela 17).



positividade nuclear para GLUT-1 no front de invasão e no centro tumoral em

relação à metástase linfonodal. Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U P

Front de invasão

Presente 20 0,03 0,00–0,16 17,08 341,50 131,50 0,062

Ausente 20 0,09 0,06–0,22 23,93 478,50

Centro tumoral

Presente 20 0,02 0,00–0,10 18,68 373,50 163,50 0,320

Ausente 20 0,06 0,01–0,10 22,33 446,50


5.3.3 Avaliação da expressão de GLUT 3 quanto à presença ou ausência de

metástase


dos carcinomas sem metástase, percentuais de positividade citoplasmática/membranar (Figura

11) que variaram de 1,49% a 95,39%, com mediana de 26,88%. Nos tumores com metástase,

estes percentuais variaram de 0,05% a 96,70%, com mediana de 23,98%. Na análise do centro

tumoral, a expressão de GLUT 3 revelou para os carcinomas sem metástase, percentuais de

imunopositividade citoplasmática/ membranar que variaram de 0,79% a 100,0%, com

79 �

mediana de 30,34%. Nos casos com metástase, os percentuais variaram de 4,68% a 85,65%,

com mediana de 19,05%. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir

diferença estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão

citoplasmática/membranar de GLUT 3 entre as lesões com e sem metástase linfonodal, tanto

no front de invasão (p = 0,482) como no centro tumoral (p = 0,499) (Tabela 18).



positividade citoplasmática/membranar para GLUT-3 no front de invasão e no

centro tumoral em relação à metástase linfonodal. Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U p

Front de invasão

Presente 20 23,98 10,91–50,83 19,20 384,00 174,00 0,482

Ausente 20 26,88 10,69–62,63 21,80 436,00

Centro tumoral

Presente 20 19,05 12,51–44,97 19,25 385,00 175,00 0,499

Ausente 20 30,34 15,16–61,12 21,75 435,00


�

�

Em relação à imunoexpressão nuclear de GLUT 3 (Figura 12), constatou-se

positividade em apenas 1 caso de carcinoma epidermóide de lábio inferior. Esta lesão foi

caracterizada pela presença de metástase linfonodal regional, categorizada com estadiamento

clínico III. Pela gradação histológica, proposta por Bryne (1998) foi classificada como alto

grau de malignidade, e segundo Cardesa et al. (2005), apresenta-se moderadamente

diferenciada. No caso em questão, observou-se percentual de positividade de 68,26% no front

de invasão tumoral e de 86,06% no centro tumoral, para todas as variáveis analisadas. Como

apenas este caso revelou imunopositividade nuclear para GLUT 3, não foram realizadas

análises estatísticas sobre a imunoexpressão desta proteína nessa localização celular.

80 �

5.3.4 Avaliação da expressão de GLUT 1 quanto ao estadiamento clínico TNM


dos carcinomas com estadiamento clínico I/II, percentuais de positividade citoplasmática/

membranar que variaram de 77,35% a 100,0%, com mediana de 95,55%. Para os tumores

com estadiamento III/IV, os percentuais variaram de 88,56% a 99,62%, com mediana de

97,79%. No centro tumoral, a análise da expressão de GLUT 1 revelou para os carcinomas

com estadiamento clínico I/II, percentuais de positividade citoplasmática/membranar que

variaram de 86,45% a 99,99%, com mediana de 96,64%. Para o estadiamento clínico III/IV,

estes percentuais variaram de 85,24% a 99,98%, com mediana de 96,27%. O teste não-

paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos

percentuais de imunoexpressão citoplasmática/membranar de GLUT 1 entre o estadiamento

clínico TNM I/II e III/IV, tanto no front de invasão (p = 0,341) como no centro tumoral (p =

0,523) (Tabela 19).




centro tumoral em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal, RN – 2012.

Localização/

Estadiamento n Mediana Q25-Q75

Média dos

postos

Soma dos

postos U p

Front de invasão

Estágio I/II 18 95,55 91,34–98,65 18,56 334,00 163,00 0,341

Estágio III/IV 22 97,79 95,64–98,56 22,09 486,00

Centro tumoral

Estágio I/II 18 96,64 94,80–99,05 21,81 392,50 174,50 0,523

Estágio III/IV 22 96,27 93,46–97,95 19,43 427,50


A avaliação dos percentuais de positividade nuclear para GLUT 1, localizada no front

de invasão tumoral, revelou, para os carcinomas com estadiamento clínico I/II, percentuais

81 �

que variaram de 0,00% a 0,39%, com mediana de 0,10%. Nos tumores com estadiamento

clínico III/IV, estes percentuais variaram de 0,00% a 0,42%, com mediana de 0,03%. O teste

não-paramétrico de Mann-Whitney revelou existir diferença estatisticamente significativa nos

percentuais de imunoexpressão nuclear de GLUT 1 entre o estadiamento clínico TNM I/II e

III/IV (p = 0,041) (Tabela 20).

No centro tumoral, os percentuais de positividade nuclear para GLUT 1 revelaram,

para os carcinomas com estadiamento clínico I/II, percentuais que variaram de 0% a 0,36%,

com mediana de 0,06%. Em relação ao estadiamento clínico III/IV, os percentuais variaram

de 0% a 0,24%, com mediana de 0,02%. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney não

revelou diferença estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão nuclear de

GLUT 1 entre o estadiamento clínico TNM I/II e III/IV (p = 0,286) (Tabela 20).




relação ao estadiamento clínico TNM. Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U p

Front de invasão

Estágio I/II 18 0,10 0,06–0,25 24,64 443,50 123,50 0,041

Estágio III/IV 22 0,03 0,00–0,16 17,11 376,50

Centro tumoral

Estágio I/II 18 0,06 0,02–0,10 22,67 408,00 159,00 0,286

Estágio III/IV 22 0,02 0,00–0,10 18,73 412,00


5.3.5 Avaliação da expressão de GLUT 3 quanto ao estadiamento clínico TNM

A análise da expressão de GLUT 3 no front de invasão tumoral revelou, para os

carcinomas com estadiamento clínico I/II, percentuais de positividade

citoplasmática/membranar que variaram de 1,49% a 95,39%, com mediana de 26,62%. Para o

82 �

estadiamento clínico III/IV, os percentuais variaram de 0,05% a 96,70%, com mediana de

26,54%. No centro tumoral, os carcinomas com estadiamento clínico I/II revelaram

percentuais de positividade citoplasmática/ membranar para GLUT 3 que variaram de 0,79%

a 100%, com mediana de 30,34%. Para as lesões com estadiamento clínico III/IV, os

percentuais variaram de 4,68% a 92,49%, com mediana de 19,59%. O teste não-paramétrico

de Mann-Whitney não revelou diferença estatisticamente significativa nos percentuais de

imunoexpressão citoplasmática/membranar de GLUT 3 entre o estadiamento clínico TNM I/II

e III/IV, tanto no front de invasão (p = 0,892) como no centro tumoral (p = 0,786) (Tabela

21).




centro tumoral em relação ao estadiamento clínico TNM. Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U p

Front de invasão

Estágio I/II 18 26,62 10,40–58,38 20,78 374,00 193,00 0,892

Estágio III/IV 22 26,54 11,39–53,89 20,27 446,00

Centro tumoral

Estágio I/II 18 30,34 11,59–49,87 21,06 379,00 188,00 0,786

Estágio III/IV 22 19,59 12,57–46,67 20,05 441,00


5.3.6 Avaliação da expressão de GLUT 1 quanto à gradação histológica, proposta

por Bryne (1998)

A análise do percentual de células imunomarcadas para GLUT 1 em relação à

gradação histológica de malignidade, no front de invasão tumoral, revelou para os carcinomas

com baixo grau de malignidade, percentuais de positividade membranar/citoplasmática que

variaram de 77,35% a 100,0%, com mediana de 96,85%. Para as lesões de alto grau de

malignidade, estes percentuais variaram de 88,56% a 99,43%, com mediana de 97,02. No

83 �

centro tumoral, os carcinomas apresentando baixo grau de malignidade revelaram percentuais

de positividade citoplasmática/ membranar para GLUT 1 que variaram de 88,81% a 99,99%,

com mediana de 96,64%. Para os tumores classificados como alto grau de malignidade, os


de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos percentuais

de imunoexpressão membranar/citoplasmática de GLUT 1 entre as lesões de baixo e alto grau

de malignidade, tanto no front de invasão (p = 0,447) como no centro tumoral (p = 0,071)

(Tabela 22).




centro tumoral em relação à gradação histológica de malignidade (BRYNE,

1998). Natal, RN – 2012.

Localização/

Gradação n Mediana Q25-Q75

Média dos

postos

Soma dos

postos U p

Front de invasão

Baixo grau 22 96,85 93,06–99,49 21,77 479,00 170,00 0,447

Alto grau 18 97,02 92,17–98,33 18,94 341,00

Centro tumoral

Baixo grau 22 96,64 95,75–99,45 23,52 517,50 131,50 0,071

Alto grau 18 95,93 92,46–97,65 16,81 302,50



de invasão tumoral, no grupo de carcinoma correspondente as lesões de baixo grau de

malignidade, revelou percentuais que variaram de 0,0% a 0,35%, com mediana de 0,06%.

Para as lesões de alto grau, os percentuais variaram de 0,0% a 0,42%, com mediana de 0,08%.

No centro tumoral, os percentuais de positividade nuclear para GLUT 1 no grupo de baixo

grau, variaram de 0% a 0,36%, com mediana de 0,03%. Em relação ao grupo das lesões com

alto grau de malignidade, os percentuais variaram de 0% a 0,36%, com mediana de 0,07%. O

teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente

significativa nos percentuais de imunoexpressão nuclear de GLUT 1 entre as lesões de baixo e

84 �

alto grau de malignidade, tanto no front de invasão (p = 0,373) como no centro tumoral (p =

0,345) (Tabela 23).




relação em relação à gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998).

Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U P

Front de invasão

Baixo grau 22 0,06 0,00–0,16 19,02 418,50 165,50 0,373

Alto grau 18 0,08 0,02–0,18 22,31 401,50

Centro tumoral

Baixo grau 22 0,03 0,00–0,10 18,93 408,00 163,50 0,345

Alto grau 18 0,07 0,01–0,13 22,42 412,00

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN

5.3.7 Avaliação da expressão de GLUT 3 quanto à gradação histológica, proposta

por Bryne (1998)

A avaliação da expressão de GLUT 3 no front de invasão tumoral revelou, para o

grupo dos carcinomas classificados como de baixo grau de malignidade, percentuais de

imunopositividade citoplasmática/membranar que variaram de 1,49% a 96,70%, com mediana

de 26,74%. Para lesões de alto grau, os percentuais variaram de 0,05% a 70,29%, com

mediana de 21,64%. No centro tumoral, os carcinomas de baixo grau de malignidade

apresentaram percentuais de positividade citoplasmática/ membranar para GLUT 3 que

variaram de 0,79% a 100%, com mediana de 28,71%. Para os tumores de alto grau, os


de Mann-Whitney não revelou diferença estatisticamente significativa nos percentuais de

imunoexpressão citoplasmática/membranar de GLUT 3 entre as lesões de baixo e alto grau de

85 �

malignidade, tanto no front de invasão (p = 0,384) como no centro tumoral (p = 0,550)

(Tabela 24).




centro tumoral em relação em relação à gradação histológica de malignidade

(BRYNE, 1998). Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U P

Front de invasão

Baixo grau 22 26,74 16,95–57,15 21,95 483,00 166,00 0,384

Alto grau 18 21,64 10,65–53,89 18,72 337,00

Centro tumoral

Baixo grau 22 28,71 10,09–53,74 19,50 429,00 176,00 0,550

Alto grau 18 30,65 15,34–44,52 21,72 391,00



histológica, proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005)

A análise do percentual de células imunomarcadas para GLUT 1 em relação à

gradação histológica proposta pela OMS (CARDESA, et al., 2005) no front de invasão

tumoral, revelou para os carcinomas bem diferenciados, percentuais de positividade

membranar/ citoplasmática que variaram de 77,35% a 99,62%, com mediana de 96,85%. Para

os tumores moderadamente/ pobremente diferenciados, esse percentual variou de 88,56% a

100%, com mediana de 97,02%. No centro tumoral, os carcinomas bem diferenciados

revelaram percentuais de positividade citoplasmática/ membranar para GLUT 1 que variaram

de 88,81% a 99,98%, com mediana de 96,08%. Os percentuais, para as lesões

moderadamente/ pobremente diferenciadas, variaram de 85,24% a 99,99%, com mediana de

96,46%. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença

estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão membranar/ citoplasmática

86 �

de GLUT 1 entre as lesões bem diferenciadas e as moderadamente/ pobremente diferenciadas,

tanto no front de invasão (p = 0,965) como no centro tumoral (p = 0,906) (Tabela 25).



positividade citoplasmática/ membranar para GLUT-1 no front de invasão e no

centro tumoral em relação à gradação histológica de malignidade (CARDESA et

al., 2005). Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U p

Front de invasão

BD 12 96,85 91,59–99,23 20,38 244,50 166,50 0,965

MD/ PD 28 97,02 93,44–98,51 20,55 575,50

Centro tumoral

BD 12 96,08 92,75–99,29 20,83 250,00 164,00 0,906

MD/ PD 28 96,46 93,63–98,52 20,36 570,00

Legenda: BD – Bem diferenciado; MD – Moderadamente diferenciado; PD – Pobremente diferenciado Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.


de invasão tumoral, no grupo de carcinomas bem diferenciados, revelou percentuais que

variaram de 0% a 0,35%, com mediana de 0,07%. Para os tumores moderadamente e

pobremente diferenciados, os percentuais variaram de 0% a 0,42%, com mediana de 0,06%.

No centro tumoral, os percentuais de positividade nuclear para GLUT 1 nas lesões bem

diferenciadas variaram de 0% a 0,42%, com mediana de 0,07%. Esse percentual, para os

carcinomas moderadamente e pobremente diferenciados, variou de 0% a 0,36%, com mediana

de 0,03%. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou não existir diferença

estatisticamente significativa nos percentuais de imunoexpressão nuclear de GLUT 1 entre as

lesões bem diferenciadas e as moderadamente/ pobremente diferenciadas, tanto no front de

invasão (p = 0,976) como no centro tumoral (p = 0,533) (Tabela 26).

87 �




relação em relação à gradação histológica de malignidade (CARDESA et al.,

2005). Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U P

Front de invasão

BD 12 0,07 0,00–0,21 20,42 245,00 167,00 0,976

MD/ PD 28 0,06 0,00–0,16 20,54 575,00

Centro tumoral

BD 12 0,07 0,00–0,13 22,25 267,00 147,00 0,533

MD/ PD 28 0,03 0,01–0,10 19,75 553,00




histológica, proposta pela OMS (CARDESA et al., 2005)

A avaliação da expressão de GLUT 3 no front de invasão tumoral revelou, para os

carcinomas bem diferenciados, percentuais de positividade citoplasmática/ membranar que

variaram de 1,49% a 96,70%, com mediana de 49,20%. Nos tumores moderadamente/

pobremente diferenciados, os percentuais variaram de 0,05% a 92,03%, com mediana de

25,61%. No centro tumoral, os carcinomas bem diferenciados revelaram percentuais de

positividade citoplasmática/ membranar para GLUT 3 que variaram de 0,79% a 92,49%, com

mediana de 25,02%. Nas lesões moderadamente/ pobremente diferenciadas, os percentuais

variaram de 3,07% a 100%, com mediana de 29,86%. O teste não-paramétrico de Mann-

Whitney revelou não existir diferença estatisticamente significativa nos percentuais de

imunoexpressão citoplasmática/ membranar de GLUT 3 entre as lesões bem diferenciadas e

moderadamente/pobremente diferenciadas, tanto no front de invasão (p = 0,316) como no

centro tumoral (p = 0,791) (Tabela 27).

�

88 �



positividade citoplasmática/ membranar para GLUT-3 no front de invasão e no

centro tumoral em relação em relação à gradação histológica de malignidade

(CARDESA et al., 2005). Natal, RN – 2012.

Localização/


Média dos

postos

Soma dos

postos U P

Front de invasão

BD 12 49,20 7,65–72,76 23,33 280,00 134,00 0,316

MD/ PD 28 25,61 10,75–50,83 19,29 540,00

Centro tumoral

BD 12 25,02 7,63–75,64 19,75 237,00 159,00 0,791

MD/ PD 28 29,86 13,52–43,72 20,82 583,00

Legenda: BD – Bem diferenciado; MD – Moderadamente diferenciado; PD – Pobremente diferenciado.


5.3.10 Avaliação da correlação entre as imunoexpressões de GLUT 1 e GLUT 3

Foram analisadas possíveis correlações entre as imunoexpressões de GLUT 1 e GLUT

3, nas regiões de front de invasão e no centro do tumor, nos carcinomas epidermóides de lábio

inferior. O teste de correlação de Spearman revelou moderada correlação positiva

estatisticamente significativa entre as imunoexpressões citoplasmática/membranar de GLUT 1

no front de invasão e no centro tumoral (r = 0,679; p < 0,001). De forma similar, foi

constatada moderada correlação positiva estatisticamente significativa entre as

imunoexpressões nucleares de GLUT 1 no front de invasão e no centro tumoral (r = 0,547; p

< 0,001). Em relação ao GLUT 3, foi observada moderada correlação positiva

estatisticamente significativa entre as imunoexpressões membranar/ citoplasmática desta

proteína no front de invasão e no centro tumoral (r = 0,589; p < 0,001) (Tabela 28).

89 �

Tabela 28. Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de

Spearman (r) e significância estatística (p) entre as imunoexpressões

citoplasmática/ membranar e nuclear de GLUT 1 e GLUT 3 no front de invasão

e no centro tumoral. Natal, RN – 2012.

GLUT 1 cito/

memb front

GLUT 1 cito/

memb centro

GLUT 1 nuc

front

GLUT 1 nuc

centro

GLUT 3 cito/

memb front

GLUT 3 cito/

memb centro

GLUT 1 cito/

memb front

r

p

0,679

< 0,001

- 0,244

0,128

- 0,154

0,342

- 0,075

0,645

0,042

0,795

GLUT 1 cito/

memb centro

r

p

- 0,288

0,072

- 0,164

0,311

0,052

0,749

- 0,029

0,858

GLUT 1 nuc

front

r

p

0,547

< 0,001

- 0,045

0,783

0,088

0,589

GLUT 1 nuc

centro

r

p

- 0,038

0,814

- 0,010

0,949

GLUT 3 cito/

memb front

r

p

0,589

< 0,001

GLUT 3 cito/

memb centro


Legenda: GLUT 1 cito/memb front – Imunoexpressão citoplasmática/ membranar de GLUT 1 no front tumoral

GLUT 1 cito/memb centro-Imunoexpressão citoplasmática/ membranar de GLUT 1 no centro tumoral

GLUT 1 nuc front – Imunoexpressão nuclear de GLUT 1 no front tumoral

GLUT 1 nuc centro – Imunoexpressão nuclear de GLUT 1 no centro tumoral

GLUT 3 cito/memb front – Imunoexpressão citoplasmática/ membranar de GLUT 3 no front tumoral

GLUT 3 cito/memb centro – Imunoexpressão citoplasmática/ membranar de GLUT 3 no centro tumoral

90 �

Foram analisadas, ainda, possíveis diferenças entre as imunoexpressões de GLUT 1 e

GLUT 3 no front de invasão e no centro tumoral. O teste não paramétrico de Wilcoxon

revelou maior imunoexpressão de GLUT 1 em relação a GLUT 3, tanto no front de invasão

(p<0,001) como no centro do tumor (p<0,001) (TABELA 29). Por outro lado, não foi

observada diferença estatisticamente significativa na imunoexpressão nuclear de GLUT 1

entre as regiões de front de invasão e centro tumoral (p=0,077) (Tabela 30).

Tabela 29. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de acordo com

os postos dos percentuais de imunoexpressão citoplasmática/ membranar de

GLUT 1 e GLUT 3 no front de invasão e no centro tumoral. Natal, RN – 2012.

Localização

Postos

p* GLUT 1 > GLUT 3

n (%)

GLUT 1 < GLUT 3

n (%)

GLUT 1 = GLUT 3

n (%)

Front de invasão 39 (97,5) 1 (2,5) 0 (0,0) < 0,001

Centro tumoral 39 (97,5) 1 (2,5) 0 (0,0) < 0,001


* Wilcoxon signed rank test.

Tabela 30. Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior de acordo com

os postos dos percentuais de imunoexpressão nuclear de GLUT 1 no front de

invasão e no centro tumoral. Natal, RN – 2012.

Postos

p* GLUT 1 front >

GLUT 1 centro

n (%)

GLUT 1 front <

GLUT 1 centro

n (%)

GLUT 1 front =

GLUT 1 centro

n (%)

22 (55,0) 14 (35,0) 4 (10,0) 0,077


* Wilcoxon signed rank test.

91 �

�

Figura 3. CE de lábio inferior de baixo grau, bem diferenciado. (H/E, 100×)

�

Figura 4. CE de lábio inferior de alto grau, pobremente diferenciado. (H/E, 400×)

92 �

�


localizado na periferia das ilhas tumorais. (ADVANCETM, 200×)

*

*

�


localizado no centro das ilhas tumorais *. (ADVANCETM, 100×)

93 �

�

Figura 7. Fotomicrografia demonstrando padrão de expressão de GLUT 3 no

centro das ilhas tumorais. (ADVANCETM, 200×)

�Figura 8. Fotomicrografia demonstrando a intensidade de expressão moderada

de GLUT 3 (ADVANCETM, 200×)

94 �

�

Figura 9. Fotomicrografia demonstrando expressão citoplasmática/membranar


�

Figura 10. Fotomicrografia demonstrando expressão nuclear (seta) de GLUT 1.

(ADVANCETM, 200×)

95 �

�

Figura 11. Fotomicrografia demonstrando expressão citoplasmática/membranar


�

Figura 12. Fotomicrografia demonstrando expressão nuclear de GLUT 3.

(ADVANCETM, 200×)

�

�

��

97 �

6 DISCUSSÃO

O CEO é uma importante causa de morbidade e mortalidade que ocorre em todo o

mundo. No Brasil, corresponde a 3% de todas as neoplasias malignas, representando o oitavo

tipo de câncer mais comum (SILVERMAN, 2001; BATISTA et al., 2010). De acordo com

estimativas do INCA, em 2010 surgiram cerca de 14.120 novos casos. Desses, 73%

acometeram o sexo masculino. Para fins epidemiológicos e clinico-patológicos, o câncer oral

pode ser dividido em 3 categorias: carcinomas da cavidade oral, dos lábios (superior e

inferior) e carcinoma derivado da orofaringe. Os tumores intra-orais e os de orofaringe são os

mais comuns entre os homens, com uma proporção de 2:1 (NEVILLE; TERRY; DAY, 2002).

O foco deste estudo foi avaliar as lesões localizadas exclusivamente em lábio inferior.

O CE de lábio corresponde a 90% de todos os tumores da cavidade oral. Essa lesão

afeta, predominantemente, homens caucasianos (99,4%), com pico de incidência entre a

sétima e oitava décadas de vida (GUTIÉRREZ-PASCUAL, et al., 2011). A etiopatogenia do

CE de lábio é influenciada por diversos fatores, como exposição excessiva à radiação UV, o

tabaco, predisposição genética e a progressão de lesões pré-cancerígenas (queilite actínica e

xeroderma pigmentoso). O lábio inferior é o sítio anatômico mais acometido, essa maior

incidência está relacionada a sua maior exposição solar, quando comparado com o lábio

superior (SALGARELI et al., 2009).

Com o intuito de avaliar a incidência da CE de lábio, Czerninski, Zini e Sgan-Cohen

(2010) analisaram todos os casos de neoplasias malignas localizadas na região de cabeça e

pescoço no período de 1970-2006. O número total de casos diagnosticados como CE de lábio

foi de 4337, que correspondem a 66,5% de todos os casos de câncer oral. Em 2006, Oliveira,

Silva, Zucoloto, avaliaram 340 casos de CE e observaram que a localização mais prevalente

foi a língua, seguida do assoalho bucal e lábio inferior. A divergência encontrada entre

diversos estudos demonstra que a prevalência do CE de lábio inferior difere geograficamente.

Sua prevalência é mais relevante em países tropicais e pode ser fortemente influenciada por

fatores sócio-econômicos e culturais (SOUZA et al., 2010).

No presente estudo, constatou-se uma maior prevalência da lesão em pacientes do

sexo masculino (67,5%) na sétima década de vida, com uma idade média de 67,5 anos. Esses

achados são condizentes com diversos estudos descritos na literatura (VARTANIAN et al.,

2004; KORNEVS et al., 2005; WARNAKULASURIYA, 2009; CARVALHO et al, 2011).

98 �

O prognóstico do CE de lábio inferior é excelente. Diante de um diagnóstico precoce,

90% dos pacientes atingem uma sobrevida de 5 anos. No entanto, é estimado que 5-20% dos

pacientes pode desenvolver metástase linfonodal. O tamanho do tumor, a diferenciação

celular, a profundidade de invasão e a presença de invasão vascular e perineural são os

principais fatores de risco para metástase (HASSON, 2008).

Na tentativa de esclarecer o comportamento biológico dos carcinomas, os autores têm

procurado desenvolver sistemas de gradação histológica de malignidade que possam melhorar

a compreensão a respeito das lesões, com o intuito de adotar as medidas terapêuticas mais

indicadas (BRODERS, 1920; BRYNE et al., 1989; BRYNE, 1998; CARDESA et al., 2005).

O sistema de estadiamento clínico TNM vem sendo amplamente utilizado para definir a

extensão do tumor e determinar as opções de tratamento, apresentando inúmeras qualidades

por avaliar as características fundamentais do câncer como: extensão local, disseminação

regional e metástase à distância (COSTA et al., 2001; SAWAIR et al., 2003).

Em 2010, Kreppel e colaboradores realizaram estudo para avaliar o impacto no

prognóstico do estadiamento clínico TNM e concluíram que este método é válido como

indicador de prognóstico em relação à sobrevida livre da doença. O estadiamento clínico

TNM pode tratar-se de um dos melhores indicadores de prognóstico para o CEO

(HERMANECK et al., 1996; COSTA et al., 2000). Para Carinci et al.(1999), bem como para

Lacy e colaboradores (1999), a classificação TNM possui forte correlação com o prognóstico

do CEO, no entanto, para Dib e colaboradores (1994), o estadiamento TNM é um indicador

de prognóstico importante apenas nos seus extremos, os estágios I e IV, apresentando falhas

nos estágios intermediários.

Nesta pesquisa, pode-se observar uma maior incidência do estágio II entre os casos de

CE de lábio inferior sem metástase. Contudo, naquelas lesões que apresentaram envolvimento

linfonodal, o estágio IV foi o mais prevalente. Esse fato pode ser explicado em virtude do

estudo possuir uma amostra intencional, composta por 20 casos de CE de lábio inferior com

envolvimento de linfonodos regionais e 20 casos de CE de lábio inferior com ausência de

metástase. Entretanto, os achados estão em concordância com o estudo de Souza et al. (2010),

os quais observaram associação entre a ausência de metástase linfonodal e os estadiamentos

clínicos T1 e T2. Já para as lesões metastáticas, os estágios T3 e T4 foram os mais

encontrados.

Uma das críticas relativas ao estadiamento clínico TNM é o fato de não utilizar as

características histológicas dos tumores como auxiliares na predição do prognóstico. Desta

forma, tem sido proposta a associação da gradação histológica de malignidade com o

99 �

estadiamento clínico para prever o comportamento tumoral e a escolha do tratamento

(SAWAIR, 2003).

Bryne et al. (1989) desenvolveram um sistema de gradação histológica baseado no

front de invasão tumoral, já que nessa área há uma perda da adesão celular, resultando na

progressão tumoral. Diante do fato de que as neoplasias malignas são constituídas de

populações celulares heterogêneas, percebeu-se que as células tumorais das áreas mais

invasivas diferem das demais áreas, apresentando um comportamento mais agressivo. Esse

sistema, inicialmente, procurou avaliar os seguintes parâmetros: grau de ceratinização,

pleomorfismo celular, número de figuras de mitoses, padrão de invasão e infiltrado

inflamatório. Em 1998, Bryne propôs um aprimoramento de seu estudo retirando o parâmetro

“figuras de mitose”. Esse método é de fácil avaliação e reprodutibilidade, apresentando-se

como um importante fator de prognóstico, podendo ser usado como um suplemento ao

estadiamento clínico TNM (BRYNE, 1998; BÀNKFALVI; PIFFKO, 2000).

Em nosso estudo, utilizamos o método de gradação histológica de malignidade

proposto por Bryne (1998), por estarmos de acordo com o autor a respeito da importância do

front de invasão tumoral como uma importante ferramenta de prognóstico. Dentre os casos

avaliados no presente estudo, observou-se que 80% das lesões com ausência de envolvimento

linfonodal foram classificadas como tumores de baixo grau de malignidade. Já naquelas que

apresentaram comprometimento de linfonodos regionais, 70% tratavam-se de lesões de alto

grau de malignidade. Quando esses dados foram comparados, por meio do teste exato de

Fisher, percebeu-se uma associação estatisticamente significativa em relação à presença ou

ausência de metástase e o grau histológico de malignidade (p=0,004). Desta forma, conclui-se

que as lesões de alto grau apresentam maior frequência de envolvimento linfonodal do que as

lesões de baixo grau de malignidade. Esses dados estão em concordância com os resultados de

Abreu et al. (2004).

Foi analisado, ainda, o método de gradação histológica de malignidade proposto pela

OMS (CARDESA et al., 2005). Esse método é baseado no grau de diferenciação celular, no

qual os tumores são classificados como bem diferenciados, moderadamente diferenciados e

pobremente diferenciados. As lesões bem diferenciadas lembram o epitélio de mucosa

normal. Já as moderadamente diferenciadas apresentam pleomorfismo nuclear distinto e

atividade mitótica, usualmente apresentando escassa ceratinização. Nos tumores pobremente

diferenciados, há uma predominância de células imaturas, com numerosas figuras de mitose

típicas e atípicas. (CARDESA et al., 2005; LOURENÇO et al., 2007).

100 �

Apesar de alguns autores acreditarem que os métodos de gradação histológica de

malignidade possui capacidade prognóstica limitada (DIB et al., 1994; YAZDI; KHALILI,

1999) quando comparado ao padrão de invasão, em nosso estudo observamos que a maioria

dos casos os quais apresentavam metástase foram identificados como

moderadamente/pobremente diferenciados e encontravam-se entre os estadiamentos clínicos

III e IV. No entanto, não foi encontrada relação estatisticamente significativa entre as

variáveis estudadas.

Ao comparar os estadiamentos clínicos com a gradação histológica de malignidade de

Bryne (1998), utilizada em nosso estudo, pode-se constatar que as lesões de alto grau de

malignidade estavam classificadas em estádios mais avançados (estádios III e IV),

observando-se associação estatisticamente significativa entre esses achados (p=0,012).

Autores relatam a estreita correlação entre o estadiamento clínico TNM e a gradação

histológica de malignidade (OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996; NETO; QUADROS,

1998). Para Oliver; Helfrick; Gard (1996) há um aumento no índice de mortalidade do CEO

nos estágios mais avançados do estadiamento clínico (T3 e T4), apresentando um pior

prognóstico quando comparados com as lesões nos estágios T1 e T2.

Chang e colaboradores (2010) testaram a validade do padrão de invasão tumoral e a

gradação histológica de malignidade como fatores de prognóstico. O padrão de invasão foi

associado à presença de metástase à distância e com a recorrência do tumor. Entretanto, não

houve correlação significante entre a gradação histológica de malignidade e os parâmetros

clínicos como sexo, tamanho e extensão do tumor. Já a gradação histológica de malignidade e

o padrão de invasão tumoral foram associados à sobrevida, concluindo, desta forma, que estes

são parâmetros de prognósticos.

Em estudo sobre a correlação entre a classificação TNM, gradação histológica e

localização anatômica em CEO, Costa e colaboradores (2005) constataram que a maioria dos

casos classificados clinicamente como T1 e T2 exibiram gradação histológica de malignidade

entre grau 1 e 2. Os casos classificados clinicamente como T3 exibiram gradação histológica

de malignidade entre grau 2 e 3. Os autores concluíram que o estadiamento clínico TNM teve

uma correlação estatisticamente significativa com o grau de ceratinização, pleomorfismo

nuclear e infiltrado linfoplasmocitário, bem como com os escores de malignidade. Desta

maneira, as áreas invasivas do tumor podem ser primariamente responsáveis pelo

comportamento clínico do tumor.

Capote Moreno et al. (2010) avaliaram 402 casos de CEO e CE de orofaringe com o

intuito de verificar os fatores de prognóstico que poderiam influenciar na metástase

101 �

linfonodal. Características como padrão de invasão, gradação histológica, status da margem e

invasão perineural foram correlacionados com metástase contralateral. Esses achados

demonstraram que esses parâmetros podem ser importantes fatores de prognóstico.

Os tumores malignos possuem necessidades metabólicas especiais para o

desenvolvimento tumoral (DANG; SEMENZA, 1999). Diversos estudos têm mostrado

evidências a respeito do metabolismo anormal da glicose nas células cancerígenas

(GATENBY, GILLIES, 2008; ORTEGA, 2009; MARÍN-HERNÁNDEZ, 2010). Esse

fenômeno pode ser explicado por inúmeros mecanismos, entre os quais as mudanças genéticas

relacionadas à alta taxa de proliferação celular, o que gera um aumento no seu metabolismo

(VANDER HEIDEN; CANTLEY; THOMPSON, 2009). Outra importante razão para

mudanças no metabolismo é a adaptação das células ao microambiente tumoral. Devido ao

rápido crescimento tumoral, áreas de hipóxia são frequentemente encontradas

(RADEMAKERS et al., 2011). A hipóxia ocorre em tumores onde a distância para o

suprimento sanguíneo é maior que 100-200 µm. Desta forma, a sobrevida do tumor depende,

em parte, da habilidade de recrutar novos vasos sanguíneos através de fatores angiogênicos,

bem como da capacidade das células tumorais realizarem glicólise anaeróbica como principal

fonte de energia (DANG, SEMENZA, 1999). Clinicamente relevante, a hipóxia tem sido

detectada em 50% de todos os tumores (VAUPEL, MAYER, HÖCKEL, 2004).

Usualmente, a hipóxia é uma característica importante em tumores sólidos e

carcinomas de cabeça e pescoço avançados, com influência negativa no prognóstico

(KAANDERS et al., 2002; JASSEN et al., 2004). Diversos fatores podem contribuir para a

hipóxia tumoral, incluindo: inabilidade da angiogênese em acompanhar o desenvolvimento

tumoral, crescimento vascular desorganizado resultando em áreas isquêmicas e, por fim, o

aumento da pressão hidrostática no interior do tumor, resultando na compressão

microvascular (HELDIN et al., 2004). É comumente aceito que as células cancerígenas

mantenham o seu metabolismo glicolítico aumentado para se adaptar às condições de hipóxia.

Tem sido proposto que o fluxo de glicose pode melhorar a eficiência da sua utilização pelas

células, em um microambiente no qual sua concentração é limitada. Desta maneira, esse

processo representa uma adaptação metabólica das células cancerígenas (KONDOH, 2008).

A hipóxia e o aumento do transporte de glicose para o interior celular pode ser uma

marca importante para o câncer e é regulada por diversos marcadores, como os GLUTs

(VANDER HEIDEN; CANTLEY; THOMPSON, 2009). Os GLUTs 1 e 3 são responsáveis

por mediar a absorção da glicose nas células cancerígenas, regulando o metabolismo

energético (CARVALHO et al., 2011). Estudos recentes demonstraram que o aumento na

102 �

expressão desses marcadores tem sido encontrado em diversos tumores, incluindo: mama,

pulmão, ovário, entre outros (RUDLOWSK et al., 2004; MENESES et al., 2007;

ANDERSEN et al., 2010). E, ainda, estão relacionados ao comportamento biológico agressivo

dos tumores (CHUNG et al., 2004). Com base nessas observações, o presente estudo buscou

avaliar a imunoexpressão de GLUT 1 e 3 em CEs de lábio inferior, com o intuito de obter

uma melhor compreensão do comportamento biológico da lesão estudada, bem como a

utilização desses marcadores como indicadores do prognóstico da doença.

Na presente pesquisa foi avaliado o padrão de marcação para GLUT 1 e 3 nas ilhas

tumorais. Em relação a GLUT 1, foi observado que a maioria dos casos apresentavam

expressão de GLUT 1 mais marcante na periferia dos tumores e ausência de marcação nas

áreas de ceratinização. Nas ilhas tumorais que apresentavam células pouco diferenciadas, a

porção interna também se apresentava fortemente marcada. Esses dados estão de acordo com

os achados na literatura (REISSER et al., 1999; KUNKEL et al., 2003; ZHOU et al., 2007; LI

et al., 2010). No entanto, não encontramos relação estatisticamente significativa entre as

variáveis estudadas, presença ou ausência de metástase, estadiamento clínico TNM e gradação

histológica de malignidade (BRYNE, 1998; CARDESA et al., 2005). Esses resultados

também foram encontrados em carcinoma localizado no ovário, endométrio e coloretal

(HARBER et al., 1998; WANG et al., 2000; KALIR et al., 2002).

Todavia, muitos estudos têm demonstrado que o padrão de marcação para GLUT 1

deve ser mais evidente nas áreas neoplásicas centrais, bem como ao redor de áreas necróticas,

como os observados em carcinomas cervicais e de pulmão (AIRLEY et al., 2001; MAROM et

al., 2001; TSUKIOKA et al., 2007). Isso se deve ao fato dessa localização encontrar-se mais

distante do suprimento sanguíneo. Assim sendo, a hipóxia induziria uma maior expressão

dessa proteína (OLIVER et al., 2004; AYALA et al., 2010). Kunkel e colaboradores (2007)

acreditam que a distinta localização da marcação de GLUT 1 encontrada, não pode ser

explicada pelo menor gradiente de concentração de oxigênio entre o tumor e o estroma.

Reisser et al. (1999) observaram que as concentrações de glicogênio no interior das

células era responsável por alterações na absorção de glicose. Desta forma, as células que

apresentam fraca marcação para GLUT 1 ou até mesmo ausência nas áreas centrais do tumor

estariam utilizando seus estoques de glicogênio para produção de energia, demonstrando que

o mecanismo de transporte facilitado da glicose pode mudar para o metabolismo intracelular

do estoque de glicogênio. Assim, a concentração de glicogênio parece ser inversamente

proporcional à expressão de GLUT 1 (GROBHOLZ et al., 1994; ECKERT et al., 2008;

OHBA et al., 2009).

103 �

Nosso estudo avaliou ainda o padrão de expressão para GLUT 3 nas ilhas tumorais,

tendo constatado que este transportador se encontra presente no centro das ilhas, resultado

oposto ao observado em GLUT 1. Assim, pode-se supor que GLUT 3 possui papel principal

na absorção de glicose nessa região, a qual se encontra distante do suprimento sanguíneo. A

necessidade aumentada de captação de substrato irá favorecer a expressão de determinados

tipos de GLUTs. Desta forma, GLUT 3 será expresso pelas células que possuem necessidade

energética aumentada. As populações celulares que apresentam esse fenótipo são melhores

adaptadas para manter a absorção de substrato, mesmo em concentrações muito baixas. Isso

se deve por GLUT 3 possuir uma maior afinidade pela glicose, em consequência de um baixo

Km (GATENBY; GILLIES, 2004; SIMPSON et a., 2008).

No presente estudo, pode-se observar que todos os casos avaliados obtiveram

marcação positiva para as proteínas estudadas, indicando o aumento no consumo de glicose

pelas células do carcinoma epidermóide de lábio inferior, processo necessário para

proliferação celular e que reflete a necessidade energética das células malignas e a sua

adaptação a condições adversas (OLIVER et al., 2004).

Para um melhor estudo dos casos, as lesões foram avaliadas no centro tumoral, o qual

corresponde à região central dos tumores, e no front de invasão tumoral. A região central do

tumor encontra-se distante do suprimento sanguíneo, presente no estroma, e desta forma, essa

região poderia ter uma necessidade aumentada de absorção de glicose. Para Rademakers et al.

(2011), a expressão de GLUT 1 pode aumentar à medida que as células distanciam-se dos

vasos sanguíneos. Esse padrão reflete a importância deste marcador na via glicolítica em

condições de hipóxia. No entanto, o front de invasão tumoral representa a região onde há um

aumento na proliferação celular (BRYNE, 1998), o que permite especular que essas células

poderiam apresentar um aumento na necessidade de absorção de glicose, mediado por GLUTs

(KATO et al., 2007).

Em nossa pesquisa, as regiões foram analisadas quanto à localização celular da

marcação, seja ela membranar/citoplasmática ou nuclear para ambos os marcadores. Para

GLUT 1, a região com predomínio de marcação foi a citoplasmática/membranar, tanto no

centro, quanto no front de invasão tumoral. Os testes estatísticos não revelaram significância

estatística em relação às variáveis estudadas, presença ou ausência de metástase, estadiamento

clínico TNM e gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998; CARDESA et al., 2005).

Todavia, obteve-se uma alta porcentagem de marcação, como pode ser observado em nossos

resultados, demonstrando o aumento no fluxo glicolítico para o interior celular, através do

104 �

transporte facilitado realizado por GLUT 1. O tamanho da amostra pode ter favorecido a

ausência de significância estatística para os fatores clínico-patológicos avaliados.

A positividade de GLUT 1 nas células malignas revelada pela imuno-histoquímica

indica um aumento na capacidade proliferativa e na necessidade energética. O aumento no

consumo de energia é necessário para a proliferação tumoral e reflete na sua adaptação a

condições adversas. Apesar disso, as consequências do aumento no transporte da glicose

ainda não estão completamente elucidadas (OLIVER et al., 2004).

Roh e colaboradores (2009) avaliaram a importância prognóstica dos marcadores de

hipóxia em 43 casos de carcinomas de língua apresentando estadiamento clínico T2. Foram

realizadas análises de correlação entre os achados clínico-patológicos e os marcadores de

hipóxia. O GLUT 1 foi correlacionado apenas com a espessura do tumor e envolvimento

linfonodal, sugerindo que essa proteína pode ser usada como um fator preditivo de metástase

linfonodal em pacientes com carcinoma de língua. De forma semelhante ao nosso estudo, os

autores concluíram que a pequena quantidade de casos avaliados pode ter contribuído para os

resultados de forma negativa, pois foram incluídos apenas os casos de CE de língua em

pacientes no estágio T2.

Baer et al. (2002) observaram uma superexpressão de GLUT 1 em 100% dos 48 casos

de carcinoma de laringe, para esses autores, GLUT 1 não pode ser utilizado como um

indicador de prognóstico e a sua expressão não influencia os índices de sobrevida. A

descoberta de que GLUT 1 é abundantemente expresso pelo CE mostra-se semelhante aos

achados da nossa pesquisa e esses resultados têm sido detectados, também, em quase todos os

casos de CE de pele e pulmão (YOUNES et al., 1997; ITO et al., 1998).

O GLUT 1 é altamente expresso em CE de cabeça e pescoço. A sua expressão

aumenta gradativamente em lesões displásicas e é sustentada em lesões estabelecidas como o

CE, indicando que mudanças bruscas nos níveis de GLUT 1 representam eventos iniciais

durante o desenvolvimento do CE de cabeça e pescoço (REISSER et al., 1999). Em contraste

aos achados anteriores, Carvalho et al. (2011) constataram que GLUT 1 é um marcador

confiável para o diagnóstico de lesões pré-malignas da região orofaríngea e o aumento na sua

expressão em CEO é associado com pobre prognóstico. De forma semelhante, Andersen et al.

(2010) verificaram a correlação entre o aumento da expressão de GLUT 1 e o grau histológico

de malignidade e pobre sobrevida em carcinoma de pulmão. Em seu estudo, a marcação para

GLUT 1 foi predominantemente homogênea e localizada na membrana celular.

Ohba et al. (2010) revelaram em seu estudo que a expressão de GLUT 1 no front de

invasão tumoral foi correlacionada com a profundidade de invasão do CEO. Todavia, não

105 �

foram encontradas correlações positivas da expressão desse marcador com metástase

linfonodal, idade, gênero, sítio de localização do tumor e tamanho tumoral, de forma

semelhante aos nossos achados.

A introdução da técnica de tomografia por emissão de pósitrons (PET) utilizando

análogos de glicose, como o FDG, criou uma nova possibilidade para avaliação de lesões

malignas. O estudo de Nguyen e colaboradores (2007) demonstrou que a absorção de FDG é

um marcador de prognóstico mais importante para carcinoma de pulmão do que a avaliação

da expressão de GLUT 1.

Kunkel et al. (2007) observaram que as lesões de CEO com um índice de marcação

superior a 65% para GLUT 1 apresentavam uma maior radiorresistência. A sobrevida foi

maior para aqueles pacientes com baixa expressão desse marcador. Nesse estudo, diversos

padrões de marcação celular foram observados, incluindo citoplasmática ou membranar, ou

ainda, a combinação desses dois padrões. Entretanto, a localização celular da marcação não

foi associada à resposta à radiação nem ao curso clínico da lesão. Eckert e colaboradores

(2008) também não observaram relação entre a intensidade de marcação de GLUT 1 com a

gradação histológica de malignidade do CEO, estadiamento clínico e a presença de metástase

linfonodal.

Eckert et al. (2011) avaliaram a co-expressão de GLUT 1 e HIF-1� em CEO. Os

autores não observaram associação entre a expressão de GLUT 1 com a localização do tumor,

estadiamento clínico, gradação histológica de malignidade e o tipo de ressecção cirúrgica e

tratamento. Contudo, a expressão de GLUT 1 mostrou-se relacionada à recorrência da lesão e,

ainda, aqueles pacientes que apresentaram um baixa expressão de GLUT 1 tiveram um risco

diminuído de recorrência, enquanto que aqueles com maior expressão desse transportador

tiveram um risco de 68.4% de recorrência. O estudo da co-expressão de GLUT 1 e HIF-1�

demonstrou que GLUT 1 pode afetar o prognóstico da lesão de uma maneira dependente ou

independente de HIF-1�. Isso ocorre, pois as células malignas objetivam obter uma maior

quantidade de glicose. A localização celular de sua marcação foi encontrada em diversas

regiões simultaneamente.

Na presente pesquisa, foi avaliada, ainda, a presença de marcação para GLUT 3 em

casos de CE de lábio inferior. Esse marcador tem mostrado-se importante em células que

apresentam necessidades específicas de absorção de glicose (SIMPSON et al., 2008). De uma

forma geral, a marcação para GLUT 3 foi menor do que a de GLUT 1. Todas os casos

analisados apresentaram positividade para GLUT 3, no entanto, não se pôde encontrar relação

estatisticamente significativa entre as variáveis estudadas: presença ou ausência de metástase,

106 �

estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade (BRYNE, 1998;

CARDESA et al., 2005), com a expressão deste marcador, independente da região avaliada,

seja ela o centro ou o front tumoral. A escassa quantidade de casos analisados pode estar

relacionada a esses resultados. De forma semelhante ao GLUT 1, a localização celular

predominante de marcação para GLUT 3 foi a citoplasmática/membranar. A expressão de

GLUT 3 é mais restrita que a de GLUT 1, tanto em tecidos benignos, quanto em malignos, e

poucos tumores apresentam superexpressão para GLUT 3 (YOUNES ET AL., 1996).

Uma ampla variedade de estudos tem demonstrado uma forte relação entre GLUT 3, a

carcionogênese, o desenvolvimento tumoral e o pior prognóstico de uma gama de lesões

(AIRLEY; MOBASHERI, 2007; RIEDL et al., 2007). Para uma ótima absorção de glicose,

adaptações celulares adicionais podem ser requeridas à medida que há um aumento na

necessidade de consumo de energia. A competição celular por este recurso energético

limitado aumenta a expressão de diversos marcadores e favorece um fenótipo com uma

acentuada expressão de GLUTs. Essa superregulação é observada na carcinogênese de câncer

gástrico, carcinoma de mama e orofaríngeo (YOUNES et al., 1997; GROVER-MCKAY et al.,

1998; SAKASHITA et al., 2001). Tanto GLUT 1, quanto GLUT 3 podem estar envolvidos

nos mecanismos que favorecem o crescimento tumoral (TIAN et al., 2004).

Com o objetivo de determinar o significado biológico da expressão de GLUT 1 e

GLUT 3 em carcinomas de pulmão, Younes et al. (1997) observaram que 100% do casos

diagnosticados como CE foram positivos para GLUT 1, enquanto que apenas 24%

apresentaram-se positivos para GLUT 3. Foi observado, ainda, que 25% dos casos positivos

para GLUT 1 também foram positivos para GLUT 3. Esta positividade para GLUT 1 pode

indicar que a superexpressão de GLUT 3 em carcinoma de pulmão ocorre após expressão de

GLUT 1. A superexpressão desses marcadores foi correlacionada com o baixo índice de

sobrevida dos pacientes, principalmente nos tumores bem e moderadamente diferenciados.

Apesar dos resultados negativos para GLUT 1 encontrados por Baer e colaboradores

(2002), os autores observaram que a imunorreatividade para GLUT 3 em CE de laringe

constitui um significante indicador de prognóstico. Esses achados confirmam que, para alguns

tumores, a positividade para GLUT 3 possui implicações mais sérias no prognóstico dos

pacientes do que a positividade para GLUT 1. Contudo, Zhou et al. (2007) não observaram a

presença da expressão de GLUT 3 pela técnica imuno-histoquímica em carcinomas de cabeça

e pescoço. No entanto, esses autores constataram que os genes para GLUT 1 e GLUT 3 são

comumente expressos nessas lesões. Esses resultados levam à conclusão de que a expressão

elevada de GLUT 1 tem como papel principal o aumento de absorção de glicose nos

107 �

carcinomas de cabeça e pescoço. Além desses achados, a expressão de GLUT 1 pode ser

correlacionada com o envolvimento linfonodal e estadiamento clínico.

Tian et al. (2004) consideram que níveis elevados de GLUT 1 e 3 podem contribuir

para o acúmulo de FDG em CEO. Esses autores observaram que 94% das lesões avaliadas

apresentavam marcação membranar para GLUT 1. Já para GLUT 3, 84% dos tumores foram

positivos. Foi verificada correlação positiva entre a expressão de GLUT 1 e a agressividade

do tumor. Todavia, não foram encontradas relações entre o padrão de expressão e a

diferenciação do tumor e o estadiamento clínico. Para Mellanen e colaboradores (1994), os

níveis de expressão dos genes dos GLUTs variam de acordo com o grau de malignidade do

CE. Para as lesões de alto grau, observa-se maiores índices de GLUT 1, enquanto que GLUT

3 apresenta-se em menor quantidade nas lesões de baixo grau.

Ayala e colaboradores (2010) também avaliaram o potencial de prognóstico de GLUT

1 e GLUT 3 em CEO. Esses autores constataram uma elevada marcação de GLUT 1

localizada na membrana e no citoplasma em 50% dos casos analisados. Em relação à GLUT

3, sua expressão foi detectada em 21% das lesões. A expressão membranar de GLUT 3 foi

associada ao estadiamento clínico avançado dos tumores, bem como com a sobrevida livre da

doença desfavorável. Desta forma, aqueles indivíduos os quais apresentaram elevados níveis

de GLUT 3 tiveram um maior risco de recorrência. Vale ressaltar ainda que, para ambas as

proteínas, não houve associação entre o sítio primário do tumor e o envolvimento linfonodal.

Também não foram encontradas relações entre as expressões de GLUT 1 e GLUT 3 nos CEO.

Higash et al. (1997) avaliaram 34 tumores localizados no pâncreas, dentre os quais

adenocarcinoma ductal e cistoadenocarcinoma mucinoso, no entanto, não encontraram casos

positivos para GLUT 3. Em contraste, Marom et al. (2001) constataram positividade para

GLUT 3 em 56% dos casos de carcinoma de pulmão avaliados.

Além da predominante marcação citoplasmática/membranar para GLUT 1 e 3, esta

pesquisa constatou, ainda, a presença de marcação nuclear, com percentuais que variaram de

0% a 0,42%, em relação a expressão de GLUT 1. A expressão nuclear de GLUT 1 foi

encontrada, de uma forma geral, nos casos com menor grau de agressividade, ou seja, aquelas

lesões com ausência de metástase linfonodal, bem diferenciadas e categorizadas no

estadiamento clínico I/II. No entanto, não foi possível observar relação estatisticamente

significativa entre esses achados, em razão da escassa presença de marcação nuclear nas

lesões avaliadas. Observou-se ainda que a marcação nuclear de GLUT 1 foi maior no front de

invasão tumoral. Esse aspecto pode ser justificado de acordo com Bryne (1998) o qual afirma

que os tumores consistem de populações celulares heterogêneas no front de invasão tumoral.

108 �

Em relação à GLUT 3, apenas um caso apresentou marcação nuclear. Essa lesão, de

natureza agressiva, foi caracterizada como de alto grau, moderadamente diferenciada,

apresentando presença de metástase linfonodal com estadiamento clínico III. Estudos

complementares incluindo um número maior de casos são necessários para uma melhor

compreensão acerca desses achados.

De forma semelhante, Ayala e colaboradores (2010) também observaram a presença

de marcação nuclear em 49,7% dos espécimes positivos para GLUT 1. Esses resultados

demonstraram associação significante com o consumo de álcool. Os autores constataram uma

marcação constante e bem delimitada. Assim, acredita-se que existe a possibilidade de

expressão nuclear dessa proteína. Até o momento, não há estudos que justifiquem a presença

de marcação nuclear de GLUT 1 e 3 em tumores. A alta demanda energética das células

tumorais proliferativas pode estar relacionada a esses achados.

Atualmente, tem sido sugerida a presença de danos mitocondriais nas células

cancerígenas, constituindo a perda de função mitocondrial alvo de grande interesse

(ORTEGA et al., 2009). Otto Warburg (1956) foi o primeiro a sugerir que, mesmo em

presença de oxigênio, as células cancerígenas consomem grandes quantidades de energia e

produzem lactato, em contraste com as células normais. Perdas na função bioenergética das

mitocôndrias podem ser responsáveis pelo metabolismo alterado do oxigênio. Tem sido

demonstrado que essas alterações promovem a descarboxilação do piruvato para acetona,

inibindo a oxidação do piruvato pela desidrogenase. Desta forma, o ciclo de Krebs, nos

tumores, torna-se truncado, impedindo a progressão do metabolismo aeróbico da glicose (BI

et al., 2006; DEBERARDINIS et al., 2008).

Deficiências nos complexos de enzimas da cadeia respiratória e da fosforilação

oxidativa nas células cancerígenas tem sido descritas como importantes fatores na perda de

função mitocondrial. Além disso, alterações ultraestruturais profundas podem ser observadas

e uma série de mutações vem sendo encontradas no DNA mitocondrial em diferentes tipos de

carcinomas (CAREW; HUANG, 2002). Pode-se sugerir que a expressão nuclear dos GLUTs

nas lesões estudadas é , de alguma forma, resultado de mutações presentes nas mitocôndrias,

as quais levariam a uma perturbação no metabolismo energético das células, podendo ser

responsável pela translocação dessas proteínas para o núcleo. Pode-se dizer, ainda, que os

fatores responsáveis pela transcrição dos GLUTs, como o HIF-1�, os quais se encontram

ativados no interior do núcleo celular, podem sofrer alterações genéticas inerentes às células

cancerígenas, podendo ser responsáveis pela expressão precoce dessas proteínas no núcleo e

109 �

não apenas na membrana celular. Entretanto, é necessária a realização de novos estudos, com

uma maior quantidade de casos, para uma melhor investigação desses achados.

Um fato interessante encontrado neste estudo foi a constação da marcação para GLUT

1 e GLUT 3 de forma homogênea em relação às regiões do tumor avaliadas, bem como o seu

percentual de expressão semelhante em todas as regiões do tumor, seja ela no front ou no

centro tumoral. Desta forma, foi possível observar correlação positiva estatisticamente

significativa entre a expressão citoplasmática/membranar de GLUT 1 no front de invasão e no

centro tumoral. De forma semelhante, obteve-se correlação positiva estatisticamente

significativa entre a expressão nuclear de GLUT 1. Para GLUT 3, observou-se correlação

positiva entre as expressões citoplasmática/membranar, no front de invasão e no centro

tumoral. Esses achados sugerem que, as expressões dos GLUTs não são alteradas em

decorrência da região do tumor, seja ela no front de invasão, ou no centro tumoral,

demonstrando que quando há aumento na expressão de GLUT 1 e 3 no front de invasão, essa

superexpressão também ocorrerá no centro tumoral.

Para Vaupel, Thews, Hoeckel (2001), a hipóxia tumoral pode ser classificada,

também, como hipóxia por difusão limitada, podendo ser causada por um aumento nas

distâncias de difusão, resultando na privação crônica de oxigênio e nutrientes. Na maioria dos

tumores essa situação coexiste com a hipóxia aguda e, como consequência, os tumores

desenvolvem um fenótipo mais agressivo, podendo apresentar uma maior expressão de

proteínas responsáveis pela captação de glicose. Wouters et al. (2004) afirmam que, na

maioria dos tumores, os níveis de oxigênio são heterogêneos, diferindo de uma região para

outra, em contraste com os achados do nosso estudo. Contudo, de forma descritiva, observou-

se que as células epiteliais malignas que se apresentavam dispersas de forma isolada no

estroma tumoral exibiram uma marcação para GLUT 1 mais fraca quando em proximidade

aos vasos sanguíneos, em comparação com aquelas presentes no interior do tumor.

Warburg (1956) observou que a privação de oxigênio é danosa para a respiração

celular. Se um tecido embrionário, por exemplo, for exposto à deficiência de oxigênio por

algumas horas e a seguir os níveis de oxigênio são repostos, cerca de 50% ou mais da

respiração celular continuará comprometida. A causa dessa destruição é a ausência de energia.

A carcinogênese pode ser responsável por essa injúria ao metabolismo energético. É

entendido que a inibição da respiração aeróbica permanece nas células, mesmo após o

aumento na concentração de oxigênio e continua através das divisões celulares seguintes. Não

obstante, a glicólise anaeróbica possui uma capacidade inferior de produzir energia. Desta

110 �

forma, pode haver a necessidade da maior expressão de proteínas capazes de captar glicose

para o interior da célula, aumentando, assim, a absorção desse substrato.

Para Gatenby e Gillies (2004), o aumento da glicólise no câncer representa uma

solução evolutiva para o crescimento em ambientes restritos e sua persistência em tumores

malignos primários ou metastáticos indica que ela continua a conferir vantagens proliferativas

às células, mesmo estando totalmente transformadas. Assim, os autores sugerem que a

glicólise aumentada é um componente essencial para o fenótipo maligno e, portanto, uma

característica do câncer. Concluem ainda que o aumento na absorção de glicose e o controle

do fluxo glicolítico é dependente da superexpressão dos GLUTs 1 e 3, bem como das

hexoquinases I e II.

Os marcadores prognósticos como estadiamento clínico TNM, gradação histológica de

malignidade e presença ou ausência de metástase podem não ser suficientes para uma exata

predição do prognóstico do CEO. Como consequência, é importante o desenvolvimento de

novas pesquisas para a descoberta de novos marcadores. No momento, o estudo dos GLUTs 1

e 3 tem se mostrado promissor. No entanto, os mecanismos responsáveis pela entrada de

glicose nas células cancerígenas ainda permanecem pouco esclarecidos. A hipóxia tumoral é

um importante fator ambiental no controle da expressão dos GLUTs (HARRIS, 2002).

Contudo, a função dos GLUTs 1 e 3 na carcinogênese do CE ainda é controversa, e até o

momento não se tem conhecimento de outros estudos que relacionem a expressão desses

marcadores com o CE de lábio inferior. Sendo assim, faz-se necessário a realização de novas

pesquisas para maiores esclarecimentos a respeito da importância de GLUT 1 e 3 com o

prognóstico dessas lesões.

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112 �

7 CONCLUSÕES

Frente aos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:

1– A hipóxia tumoral é uma característica marcante no CE de lábio inferior e a super-

expressão de GLUT 1 sugere que esse transportador é o principal responsável pela captação

de glicose para o interior das células epiteliais malignas do tumor, indicando aumento na

necessidade energética na lesão estudada;

2 – A localização da marcação celular predominante, tanto para GLUT 1 quanto para

GLUT 3, foi a citoplasmática/membranar demonstrando que esses marcadores são

responsáveis por mediar o transporte de glicose para meio intracelular, possibilitando, assim,

o seu metabolismo;

3 – Apesar da expressão imuno-histoquímica de GLUT 1 ser mais evidente que a de

GLUT 3 no CE de lábio inferior, não foi observada associações estatisticamente

significativas, entre as expressões desses marcadores com a presença e ausência de metástase

linfonodal, estadiamento clínico TNM e gradação histológica de malignidade;

4 – GLUT 1 encontra-se predominantemente expresso na periferia das ilhas tumorais,

enquanto que a marcação para GLUT 3 está localizada no centro do tumor. Assim, sugere-se

que esses transportadores estão envolvidos com a captação de glicose nas regiões que

apresentam uma maior demanda energética;

5 – Foi observada correlação positiva estatisticamente significativa entre a expressão

citoplasmática/membranar e nuclear de GLUT 1 no front de invasão e no centro tumoral,

enquanto que, para GLUT 3, observou-se correlação positiva apenas entre as expressões

citoplasmática/membranar, no front de invasão e no centro tumoral. Esses achados nos levam

a acreditar que a região tumoral, seja ela front de invasão ou centro, não influencia no padrão

de expressão de GLUT 1 e GLUT 3.

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114

REFERÊNCIAS

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131

APÊNDICE 1 –

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE 1 E 3 EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DE LÁBIO INFERIOR E SUA RELAÇÃO


TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

A) OBJETIVO E JUSTIFICATIVA DA PESQUISA:

Obrigado (a) pela sua participação como voluntário (a) em nossa pesquisa.

A presente pesquisa tem por objetivo desenvolver um estudo para avaliar a presença

de proteína relacionadas com a maior agressividade do Carcinoma Epidermóide de Lábio

inferior em pacientes atendidos no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e no Serviço de

Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, em Natal-RN.

B) RISCOS POSSÍVEIS E BENEFÍCIOS ESPERADOS:

Os sujeitos desta pesquisa não serão expostos a nenhum risco, visto que os mesmos

não serão chamados para execução da pesquisa, em nenhum momento. Esclareço que os

benefícios esperados envolvem o melhor conhecimento da doença, do perfil da população do

Rio Grande do Norte acometida pelo carcinoma epidermóide de lábio e, por conseguinte, um

tratamento mais adequado, sendo que os resultados obtidos serão publicados para o

conhecimento na literatura científica pertinente.

C) PROCEDIMENTOS:

Para realização desta pesquisa, serão coletados os dados clínicos contidos nos

prontuários (fichas clínicas) no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e laudos

histopatológicos arquivados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz

Antônio. Será realizado também, um processamento laboratorial das peças cirúrgicas

coletadas, no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

132

D) RESSARCIMENTO:

Não está previsto nenhum ressarcimento ou indenização para os participantes desta

pesquisa, uma vez que o estudo será realizado com dados obtidos em prontuários (fichas

clínicas) e laudos histopatológicos, que se encontram arquivados nos Serviços de Cirurgia de

Cabeça e Pescoço, e, de Anatomia Patológica do Hospital Dr. Luiz Antônio, respectivamente,

além de análise das lâminas será realizada através da técnica imuno-histoquímica e western

blot processadas no Laboratório do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de

Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

E) ACESSO ÀS INFORMAÇÕES:

Você poderá desistir de participar da pesquisa em qualquer momento, mesmo que

tenha assinado este Termo de Consentimento. As informações obtidas de cada participante

são confidenciais e somente serão usadas com o propósito científico, sem divulgação de

nomes. O pesquisador, os demais profissionais envolvidos nesse estudo e o Comitê de Ética

em Pesquisa da Liga Norte-Rio-Grandense Contra o Câncer (LNRCC), terão acesso aos

arquivos dos participantes, para verificação de dados, sem, contudo, violar a parte

confidencial.

E) CONSENTIMENTO:

Declaro que, após ter lido e compreendido as informações contidas neste documento,

concordo em participar deste estudo. Portanto, autorizo o uso dos dados contidos nos

prontuários e nos laudos histopatológicos já mencionados, além da análise imuno-

histoquímica de fragmento da minha peça cirúrgica, sem o que fica prejudicada a utilização

dos prontuários e laudos para os fins especificados.

Autorizo também a publicação do referido trabalho, de forma escrita, sem citar meu

nome. Concedo também o direito do uso para fins de ensino e divulgação em revistas

científicas, desde que mantido o sigilo sobre minha identidade. Estou ciente que minha

participação deverá ser de livre e espontânea vontade.

Em caso de alguma dúvida sobre a conduta ética nesta pesquisa posso entrar em

contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Rio-Grandense Contra o Câncer

(LNRCC), pelos telefones 4009-5494 / 4009-5440 ou com o próprio pesquisador no endereço

já mencionado ou, ainda, no Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, localizado no

Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço supracitado, pelo telefone (84)

3215.4108.

133

Natal, _____/_____/_____.

Concordo com os termos deste documento, razão pela qual estou de acordo:

Nome do paciente: _______________________________________________________

Endereço:______________________________________________________________

RG: ________________ Órgão expedidor: _____________ CPF:__________________

Assinatura: _____________________________________________________________

________________________________________________

Professor Dr. Leão Pereira Pinto

(Pesquisador responsável)

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OBSERVAÇÃO: Segue, em anexo, envelope com endereço para remessa desta correspondência após a sua assinatura.

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134

APÊNDICE 2– Ficha para coleta de dados clínicos referentes aos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior.

CASO Nº do registro Sexo Idade Presença ou ausência de metástase

Estadiamento TNM

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135

APÊNDICE 3– Ficha para coleta de dados referentes à análise da gradação histológica de malignidade dos carcinomas epidermóides de lábio inferior.

CASO Grau de ceratinização

Pleomorfismo nuclear

Padrão de Invasão

Infiltrado inflamatório

Escore Total Gradação

Histológica Bryne (1998)

Gradação Histológica OMS (CARDESA et al.,

2005)

136

APÊNDICE 4– Ficha para coleta de dados referentes à análise do percentual de células tumorais imunopositivas para GLUT 1 e 3 nos carcinomas epidermóides de lábio infeior.

Legenda: M – Marcação membranar e/ou citoplasmática; M+C + N– Marcação membranar e/ou citoplasmática e nuclear; Neg – Ausência de marcação

Anticorpo: ( ) GLUT 1 ( ) GLUT 3

Região tumoral: ( ) Front de invasão ( ) Centro tumoral

CAMPO/ CASO

1 2 3 4 5 TOTAL M+C M+C+N Neg M+C M+C+N Neg M+C M+C+N Neg M+C M+C+N Neg M+C M+C+N Neg M+C M+C+N Neg

137

APÊNDICE 5 – Ficha para coleta de dados referente ao padrão de marcação nas ilhas tumorais.

Anticorpo: ( ) GLUT 1 ( ) GLUT 3

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ANEXO A- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte Riograndense Contra o Câncer.

140

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE … · 2017-11-04 · ... (GLUTs). O aumento da expressão de GLUT 1 e GLUT 3 encontra-se relacionado com o comportamento agressivo