LUIZA SHEYLA EVENNI PORFIacuteRIO WILL

Caracterizaccedilatildeo Fiacutesico-Quiacutemica e Accedilotildees Farmacoloacutegicas Hepatoprotetora

Antinflamatoacuteria Proacute-Angiogecircnica Antioxidante e Anticoagulante da Fraccedilatildeo

Rica em Fucana 08 (FRF 08) da Alga marrom Lobophora variegata

NATAL

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIEcircNCIAS

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM BIOQUIacuteMICA

LUIZA SHEYLA EVENNI PORFIRIO WILL

Caracterizaccedilatildeo Fiacutesico-Quiacutemica e Accedilotildees Farmacoloacutegicas Hepatoprotetora Antinflamatoacuteria Proacute-Angiogecircnica Antioxidante e Anticoagulante da Fraccedilatildeo

Rica em Fucana 08 (FRF 08) da Alga marrom Lobophora variegata

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Departamento de Bioquiacutemica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito do Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo em Bioquiacutemica para obtenccedilatildeo do titulo de mestre em Bioquiacutemica

Orientadora Profordf Dra Edda Lisboa Leite

NATAL

2012

Ao meu eterno PAI bom e fiel DEUS que sempre me proporcionou momentos uacutenicos e inesqueciacuteveis nem todos foram bons mas mesmos os momentos considerados ruins eu tentei ver de uma forma diferente e aprender a retirar algo bom deles para crescer Agradeccedilo imensamente ao meu Senhor e oro por um mundo melhor e mais justo Onde as pessoas sejam julgadas pela honestidade integridade eacutetica e moral e natildeo pelas diferenccedilas que geram preconceitos

ldquoO senhor eacute meu pastor e nada me faltaraacuterdquo Salmo 22

ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo Filipenses 413

A Minha orientadora querida e amaacutevel Edda Lisboa Leite que em todos os momentos sempre com paciecircncia e ternura me orientou usando sua experiecircncia e palavras saacutebias E o que mais me contenta durante todos esses anos de convivecircncia eacute que vou poder levar valores e experiecircncias positivas para toda minha vida pois Edda sempre conduz seus alunos no caminho da moral e da eacutetica

ldquoUm mero professor apenas aponta o caminho das estrelas um

professor de verdade ajuda a alcanccedilaacute-lasrdquo

Liacutedia Vasconcelos

A minha famiacutelia Joatildeo Manuel de Sousa Will (pai) Raimunda Porfiacuterio Will (matildee)

Karhen Lola Porfiacuterio Will (irmatilde) Maria Porfiacuterio de Sousa (tia Lia) os quais sempre

estiveram comigo dando conselho me guiando e encorajando com paciecircncia e

muita calma em todos os momentos da minha vida Pela ajuda nas horas de

dificuldades sorrisos e palavras de consolo nos instantes de fraqueza e por tudo

que fizeram para me formar como pessoa Agradeccedilo a integridade e os valores que

minha famiacutelia me ensinou sempre valorizando a educaccedilatildeo e o respeito pelo

proacuteximo ensinamentos simples

ldquoPercebe e entende que os melhores amigos

Satildeo aqueles que estatildeo em casa esperando por ti

Acredita nos momentos mais difiacuteceis da vida

Eles sempre estaratildeo por perto pois soacute sabem te amar

E se por acaso a dor chegar ao teu lado vatildeo estar

Pra te acolher e te amparar

Pois natildeo haacute nada como um larrdquo Anjos de Resgate

Ao meu querido Allisson Jhonatan Gomes Castro que sempre me auxiliou e confortou quando precisei Cheio de atitudes nobres e imprevisiacuteveis que sempre foram importantes para mim Seu jeito sua integridade honestidade e inteligecircncia fazem com que a cada dia mais me orgulhe e admire essa pessoa incriacutevel

ldquoThe sun goes down

The stars come out

And all that counts

Is here and now

My universe

Will never be the same

Im glad you came helliprdquo

Glad You Came ndash The Wanted

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

LUIZA SHEYLA EVENNI PORFIRIO WILL

Caracterizaccedilatildeo Fiacutesico-Quiacutemica e Accedilotildees Farmacoloacutegicas Hepatoprotetora Antinflamatoacuteria Proacute-Angiogecircnica Antioxidante e Anticoagulante da Fraccedilatildeo

Rica em Fucana 08 (FRF 08) da Alga marrom Lobophora variegata

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Departamento de Bioquiacutemica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito do Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo em Bioquiacutemica para obtenccedilatildeo do titulo de mestre em Bioquiacutemica

Orientadora Profordf Dra Edda Lisboa Leite

NATAL

2012

Ao meu eterno PAI bom e fiel DEUS que sempre me proporcionou momentos uacutenicos e inesqueciacuteveis nem todos foram bons mas mesmos os momentos considerados ruins eu tentei ver de uma forma diferente e aprender a retirar algo bom deles para crescer Agradeccedilo imensamente ao meu Senhor e oro por um mundo melhor e mais justo Onde as pessoas sejam julgadas pela honestidade integridade eacutetica e moral e natildeo pelas diferenccedilas que geram preconceitos

ldquoO senhor eacute meu pastor e nada me faltaraacuterdquo Salmo 22

ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo Filipenses 413

A Minha orientadora querida e amaacutevel Edda Lisboa Leite que em todos os momentos sempre com paciecircncia e ternura me orientou usando sua experiecircncia e palavras saacutebias E o que mais me contenta durante todos esses anos de convivecircncia eacute que vou poder levar valores e experiecircncias positivas para toda minha vida pois Edda sempre conduz seus alunos no caminho da moral e da eacutetica

ldquoUm mero professor apenas aponta o caminho das estrelas um

professor de verdade ajuda a alcanccedilaacute-lasrdquo

Liacutedia Vasconcelos

A minha famiacutelia Joatildeo Manuel de Sousa Will (pai) Raimunda Porfiacuterio Will (matildee)

Karhen Lola Porfiacuterio Will (irmatilde) Maria Porfiacuterio de Sousa (tia Lia) os quais sempre

estiveram comigo dando conselho me guiando e encorajando com paciecircncia e

muita calma em todos os momentos da minha vida Pela ajuda nas horas de

dificuldades sorrisos e palavras de consolo nos instantes de fraqueza e por tudo

que fizeram para me formar como pessoa Agradeccedilo a integridade e os valores que

minha famiacutelia me ensinou sempre valorizando a educaccedilatildeo e o respeito pelo

proacuteximo ensinamentos simples

ldquoPercebe e entende que os melhores amigos

Satildeo aqueles que estatildeo em casa esperando por ti

Acredita nos momentos mais difiacuteceis da vida

Eles sempre estaratildeo por perto pois soacute sabem te amar

E se por acaso a dor chegar ao teu lado vatildeo estar

Pra te acolher e te amparar

Pois natildeo haacute nada como um larrdquo Anjos de Resgate

Ao meu querido Allisson Jhonatan Gomes Castro que sempre me auxiliou e confortou quando precisei Cheio de atitudes nobres e imprevisiacuteveis que sempre foram importantes para mim Seu jeito sua integridade honestidade e inteligecircncia fazem com que a cada dia mais me orgulhe e admire essa pessoa incriacutevel

ldquoThe sun goes down

The stars come out

And all that counts

Is here and now

My universe

Will never be the same

Im glad you came helliprdquo

Glad You Came ndash The Wanted

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

Ao meu eterno PAI bom e fiel DEUS que sempre me proporcionou momentos uacutenicos e inesqueciacuteveis nem todos foram bons mas mesmos os momentos considerados ruins eu tentei ver de uma forma diferente e aprender a retirar algo bom deles para crescer Agradeccedilo imensamente ao meu Senhor e oro por um mundo melhor e mais justo Onde as pessoas sejam julgadas pela honestidade integridade eacutetica e moral e natildeo pelas diferenccedilas que geram preconceitos

ldquoO senhor eacute meu pastor e nada me faltaraacuterdquo Salmo 22

ldquoTudo posso naquele que me fortalecerdquo Filipenses 413

A Minha orientadora querida e amaacutevel Edda Lisboa Leite que em todos os momentos sempre com paciecircncia e ternura me orientou usando sua experiecircncia e palavras saacutebias E o que mais me contenta durante todos esses anos de convivecircncia eacute que vou poder levar valores e experiecircncias positivas para toda minha vida pois Edda sempre conduz seus alunos no caminho da moral e da eacutetica

ldquoUm mero professor apenas aponta o caminho das estrelas um

professor de verdade ajuda a alcanccedilaacute-lasrdquo

Liacutedia Vasconcelos

A minha famiacutelia Joatildeo Manuel de Sousa Will (pai) Raimunda Porfiacuterio Will (matildee)

Karhen Lola Porfiacuterio Will (irmatilde) Maria Porfiacuterio de Sousa (tia Lia) os quais sempre

estiveram comigo dando conselho me guiando e encorajando com paciecircncia e

muita calma em todos os momentos da minha vida Pela ajuda nas horas de

dificuldades sorrisos e palavras de consolo nos instantes de fraqueza e por tudo

que fizeram para me formar como pessoa Agradeccedilo a integridade e os valores que

minha famiacutelia me ensinou sempre valorizando a educaccedilatildeo e o respeito pelo

proacuteximo ensinamentos simples

ldquoPercebe e entende que os melhores amigos

Satildeo aqueles que estatildeo em casa esperando por ti

Acredita nos momentos mais difiacuteceis da vida

Eles sempre estaratildeo por perto pois soacute sabem te amar

E se por acaso a dor chegar ao teu lado vatildeo estar

Pra te acolher e te amparar

Pois natildeo haacute nada como um larrdquo Anjos de Resgate

Ao meu querido Allisson Jhonatan Gomes Castro que sempre me auxiliou e confortou quando precisei Cheio de atitudes nobres e imprevisiacuteveis que sempre foram importantes para mim Seu jeito sua integridade honestidade e inteligecircncia fazem com que a cada dia mais me orgulhe e admire essa pessoa incriacutevel

ldquoThe sun goes down

The stars come out

And all that counts

Is here and now

My universe

Will never be the same

Im glad you came helliprdquo

Glad You Came ndash The Wanted

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

A Minha orientadora querida e amaacutevel Edda Lisboa Leite que em todos os momentos sempre com paciecircncia e ternura me orientou usando sua experiecircncia e palavras saacutebias E o que mais me contenta durante todos esses anos de convivecircncia eacute que vou poder levar valores e experiecircncias positivas para toda minha vida pois Edda sempre conduz seus alunos no caminho da moral e da eacutetica

ldquoUm mero professor apenas aponta o caminho das estrelas um

professor de verdade ajuda a alcanccedilaacute-lasrdquo

Liacutedia Vasconcelos

A minha famiacutelia Joatildeo Manuel de Sousa Will (pai) Raimunda Porfiacuterio Will (matildee)

Karhen Lola Porfiacuterio Will (irmatilde) Maria Porfiacuterio de Sousa (tia Lia) os quais sempre

estiveram comigo dando conselho me guiando e encorajando com paciecircncia e

muita calma em todos os momentos da minha vida Pela ajuda nas horas de

dificuldades sorrisos e palavras de consolo nos instantes de fraqueza e por tudo

que fizeram para me formar como pessoa Agradeccedilo a integridade e os valores que

minha famiacutelia me ensinou sempre valorizando a educaccedilatildeo e o respeito pelo

proacuteximo ensinamentos simples

ldquoPercebe e entende que os melhores amigos

Satildeo aqueles que estatildeo em casa esperando por ti

Acredita nos momentos mais difiacuteceis da vida

Eles sempre estaratildeo por perto pois soacute sabem te amar

E se por acaso a dor chegar ao teu lado vatildeo estar

Pra te acolher e te amparar

Pois natildeo haacute nada como um larrdquo Anjos de Resgate

Ao meu querido Allisson Jhonatan Gomes Castro que sempre me auxiliou e confortou quando precisei Cheio de atitudes nobres e imprevisiacuteveis que sempre foram importantes para mim Seu jeito sua integridade honestidade e inteligecircncia fazem com que a cada dia mais me orgulhe e admire essa pessoa incriacutevel

ldquoThe sun goes down

The stars come out

And all that counts

Is here and now

My universe

Will never be the same

Im glad you came helliprdquo

Glad You Came ndash The Wanted

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

A minha famiacutelia Joatildeo Manuel de Sousa Will (pai) Raimunda Porfiacuterio Will (matildee)

Karhen Lola Porfiacuterio Will (irmatilde) Maria Porfiacuterio de Sousa (tia Lia) os quais sempre

estiveram comigo dando conselho me guiando e encorajando com paciecircncia e

muita calma em todos os momentos da minha vida Pela ajuda nas horas de

dificuldades sorrisos e palavras de consolo nos instantes de fraqueza e por tudo

que fizeram para me formar como pessoa Agradeccedilo a integridade e os valores que

minha famiacutelia me ensinou sempre valorizando a educaccedilatildeo e o respeito pelo

proacuteximo ensinamentos simples

ldquoPercebe e entende que os melhores amigos

Satildeo aqueles que estatildeo em casa esperando por ti

Acredita nos momentos mais difiacuteceis da vida

Eles sempre estaratildeo por perto pois soacute sabem te amar

E se por acaso a dor chegar ao teu lado vatildeo estar

Pra te acolher e te amparar

Pois natildeo haacute nada como um larrdquo Anjos de Resgate

Ao meu querido Allisson Jhonatan Gomes Castro que sempre me auxiliou e confortou quando precisei Cheio de atitudes nobres e imprevisiacuteveis que sempre foram importantes para mim Seu jeito sua integridade honestidade e inteligecircncia fazem com que a cada dia mais me orgulhe e admire essa pessoa incriacutevel

ldquoThe sun goes down

The stars come out

And all that counts

Is here and now

My universe

Will never be the same

Im glad you came helliprdquo

Glad You Came ndash The Wanted

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

Ao meu querido Allisson Jhonatan Gomes Castro que sempre me auxiliou e confortou quando precisei Cheio de atitudes nobres e imprevisiacuteveis que sempre foram importantes para mim Seu jeito sua integridade honestidade e inteligecircncia fazem com que a cada dia mais me orgulhe e admire essa pessoa incriacutevel

ldquoThe sun goes down

The stars come out

And all that counts

Is here and now

My universe

Will never be the same

Im glad you came helliprdquo

Glad You Came ndash The Wanted

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

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FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

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expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

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iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

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Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

AGRADECIMENTOS

A Deus que sempre me fortaleceu me deu paz espiritual principalmente nos

momentos que mais precisei Ele estava sempre presente para me fortacer

A minha querida orientadora Edda Lisboa Leite que eu fico sem palavras e

emocionada para agradececirc-la pois ela eacute muito generosa boa paciente e

inteligentiacutessima e sempre estaacute disponiacutevel aos alunos

A Creuza Nascimento e a professora Dilma Ferreira Lima as quais tenho

enorme apreccedilo

Aos professores da banca de qualificaccedilatildeo Luiz Roberto Diz de Abreu Luciana

Guimaratildees Alves Filgueira e Katia Castanho Scortecci que com experiecircncia e

conhecimento contribuiacuteram para a construccedilatildeo deste trabalho

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientiacutefico e Tecnoloacutegico (CNPq) e

a Coordenaccedilatildeo de aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (CAPES) pelo

financiamento a pesquisa

A todos os professores do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN

A minha famiacutelia que sofreram junto comigo sempre acreditando em mim

Obrigado pela dedicaccedilatildeo e apoio

A Allisson Castro Aprendi que amar eacute algo especial com ele aprendi a

confiar mais - quem ama sempre espera

As minhas eternas amigas Rosana Monteiro (Rosatildeo) e Maria Luiza (Malu)

que permaneceram comigo me apoiando quando precisei compartilhando

momentos uacutenicos Amigos satildeo anjos de Deus e ldquoA amizade verdadeira eacute eterna natildeo

importa a distacircnciardquo

Aos meus amigos da graduaccedilatildeo e danccedila que compartilharam momentos

muito bons

Aos meus queridos docentes da graduaccedilatildeo que tiveram um papel

fundamental na minha construccedilatildeo profissional

A Mariacutelia Silva minha eterna amiga que apesar de natildeo querer admitir morre

de amores por mim Independente de tudo me ajuda e sempre estaacute feliz

A minhas amigas Kahena Florentin (Kakaacute) e Thuane Pinheiro (Tutu) que

aleacutem da graduaccedilatildeo tivemos essa etapa de construccedilatildeo juntas no laboratoacuterio

Momentos muito proveitosos e que aprendi muito com cada uma

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

Aos meus amigos Hugo Wescley e Thiago Costa (jaacute que os dois satildeo

inseparaacuteveis em todos os momentos) A amizade eacute algo precioso e vocecircs sabem

valorizar isso muito bem

A Celina Dore e Monique Gabriela (Moniquinha) que satildeo pessoas boas e

pacientes

A Joedyson Magalhatildees O conhecimento eacute uma essencialidade divirta-se

com ela

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Bioquiacutemica da UFRN em

especial a Acircngela Jonas Margarita Rogeacuterio Ricardo e Eliene

A todos que fazem e fizeram parte do laboratoacuterio de Glicobiologia Vegetal

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

ldquoA vida eacute para quem topa qualquer parada e natildeo para quem

para em qualquer topadardquo

Frases Bonitas

ldquoAs vezes eacute preciso parar e olhar para longe para podermos

enxergar o que estaacute diante de noacutesrdquo

John Kennedy

ldquoA palavra convence mas o exemplo arrastardquo

Vida Inteligente

ldquoA gratidatildeo eacute o uacutenico tesouro dos humildesrdquo

William Shakespeare

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de

RESUMO

Este estudo analisa a composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e os efeitos farmacoloacutegicos da FRF

08 da alga marrom Lobophora variegata O fracionamento do extrato bruto foi feito

com a concentraccedilatildeo de 08 volumes de acetona obtendo a FRF 08 A

caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica mostrou que se tratava de uma fucana sulfatada Foi

verificada a atividade antinflamatoacuteria pelo modelo de edema de pata atraveacutes das

altas taxas de inibiccedilatildeo do edema e os melhores resultados foram na quarta hora

apoacutes a induccedilatildeo (100 plusmn 14 com a dose de 75 mgkg) e pela forte atividade inibidora

da enzima mieloperoxidase (9145 com a dose de 25 mgkg) A hepataproteccedilatildeo foi

demonstrada pelas dosagens de paracircmetros metaboacutelicos e enzimaacuteticos indicativos

de dano hepaacutetico como bilirrubina (reduccedilatildeo em 6881 7068 e 6821 para

bilirrubinas total direta e indireta respectivamente na dose de 75 mgkg) ALT AST

e γ-GT (diminuiccedilatildeo em 7693 4458 e 50 respectivamente na dose de 75

mgkg) pela anaacutelise das lacircminas histoloacutegicas do tecido hepaacutetico que confirmam

esse efeito hepatoprotetor dos poliacutemeros de carboidrato mostrando uma reduccedilatildeo no

dano tecidual causado por CCl4 e pela inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico do

citocromo P 450 (aumentando o tempo de sono em 546 e reduzindo o tempo de

latecircncia em 7143) A eficaacutecia sobre a angiogenese da FRF 08 foi examinada na

membrana corioalantoacuteica (CAM) de ovos fertilizados com a densidade dos capilares

avaliadas e pontuadas mostrando um efeito proangigecircnico em todas as

concentraccedilotildees de FRF testadas (10 microg-1000 microg) A FRF apresentou accedilatildeo

antioxidante sobre radicais livres (inibindo o Radical Superoacutexido em 5562plusmn210

Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica em 10015plusmn001 Radical Hidroxila em 4184plusmn0001 e

Peroacutexido em 7147plusmn269 todos na concentraccedilatildeo de 062 mgmL) A atividade

anticoagulante foi verificada com o prolongamento do tempo de tromboplastina

parcial ativada (aPTT) a 50 microg (gt240 s) mostrando que sua accedilatildeo ocorre na via

intriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Sendo assim nossos resultados indicam que

estes polissacariacutedeos sulfatados constituem um importante alvo farmacoloacutegico

Palavras-chave angiogecircnese anticoagulaccedilatildeo antioxidante atividade

antinflamatoacuteria hepatoproteccedilatildeo e polissacariacutedeos sulfatados

ABSTRACT

This study examines the physical and chemical composition and the pharmacological

effects of brown seaweed FRF 08 Lobophora variegata Fractionation of the crude

extract was done with the concentration of 08 volumes of acetone obtaining the

FRF 08 The physicochemical characterization showed that it was a fucana sulfated

Anti-inflammatory activity was assessed by paw edema model by the high rates of

inhibition of the edema and the best results were in the fourth hour after induction

(100 plusmn 14 at the dose of 75 mg kg) and by the strong inhibitory activity of the

enzyme myeloperoxidase (9145 at the dose of 25 mg kg) The hepataproteccedilatildeo

was demonstrated by measurements of enzymatic and metabolic parameters

indicative of liver damage such as bilirubin (reduction in 6881 7068 and

6821 for bilirubin total direct and indirect respectively at a dose of 75 mg kg)

ALT AST and γ-GT (decrease of 7693 4458 and 50 respectively at a dose of

75 mg kg) by analysis of histological slides of liver tissue confirming that

hepatoprotective effect the polymers of carbohydrates showing a reduction in tissue

damage caused by CCl4 and the inhibition of the enzyme complex of cytochrome P

450 (increasing sleep time in 546 and reducing the latency time in 7143) The

effectiveness of the FRF 08 angiogenesis was examined in chorioallantoic

membrane (CAM) of fertilized eggs with the density of capillaries evaluated and

scored showing an effect proangigecircnico at all concentrations tested FRF (10 mg-

1000 mg) The FRF showed antioxidant activity on free radicals (by inhibiting

Superoxide Radical in 5562 plusmn 210 Lipid Peroxidation in 10015 plusmn 001 Hydroxyl

Radical in 4184 plusmn 0001 and 7147 Peroxide in plusmn 269 at concentration of 062

mg mL) The anticoagulant activity was observed with prolongation of activated

partial thromboplastin time (aPTT) at 50 mg (gt 240 s) showing that its action occurs

in the intrinsic pathway of the coagulation cascade Thus our results indicate that

these sulfated polysaccharides are an important pharmacological target

Keywords angiogenesis anticoagulation anti-oxidant anti-inflammatory activity

hepatoprotection and sulfated polysaccharides

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi

baseada na morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp (Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

23

Figura 2 Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C

Rodofiacuteceas Fonte wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_naturais-macroalgasphp

24

Figura 3 Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

25

Figura 4 Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica 28 Figura 5 Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute

(2011) 30

Figura 6 Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que

envolvem o radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

35

Figura 7 Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio

por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

38

Figura 8 Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

40

Figura 9 Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan

amp Higgins (2003) 42

Figura 10 Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto

de mediadores inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo Adaptado de Esmon 2004

43

Figura 11 Fotografia da Alga Marrom Lobophora

variegata 46

Figura 12 Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora

variegata 49

Figura 13 Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

63

Figura 14 Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1 (eixo X)

64

Figura 15 RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em

ppm 65

Figura 16 RMN do 13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B

RMN do 13C Picos expresso em ppm

66

Figura 17 Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08

de L variegata e o restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

67

Figura 18 Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees na viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no

periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com

plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM)

Observado significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep

G2)helliphelliphellip

68

Figura 19 Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema

de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

69

Figura 20 Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da

alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram

expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante

em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo

(carragenana)

70

Figura 21 Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF

08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

71

Figura 22 Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

72

Figura 23 Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga

L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

73

Figura 24 FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de

fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

74

Figura 25 Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle Significante em plt 0001

76

Figura 26 Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana

corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

77

Figura 27 Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio

de pontuaccedilatildeo tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

77

Figura 28 Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina

Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

80

LISTA DE TABELAS

TABELA 1

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas Nitrogecircnio

34

TABELA 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA 56 TABELA 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08 62

TABELA 4 Atividade Antioxidante da FRF 08 78

LISTA DE ABREVIATURAS

γ-GT Gama glutamiltransferase ҡ-carragenana Carragenana Kappa Abs Absorbacircncia AINEs Anti-inflamaacutetorios natildeo esteroacuteidais ALT alanina aminotransferase ANOVA Anaacutelise de Variacircncia aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada

AST aspartato aminotransferase BHT Hidroxitolueno butilado

CCl3 Triclorometil CCl4 Tetracloreto de carbono

cm Centiacutemetros cm2 Centiacutemetros Quadrado COX-2 Cicloxigenase 2 CO2 Dioacutexido de carbono CS Condroitin Sulfato CTV Cetavlon CYP2E1 citocromo hepaacutetico P450 2E1 CYP citocromo P450 Cu+ Cobre C2 Carbono 2 C4 Carbono 4 C5 Carbono 5 C=O Carbonila C-H Metil DNA Aacutecido Desoxirribonucleico DS Dermatan Sulfato DPPH Difenil picrilhidrazil D2O Oacutexido de Deuteacuterio EDTA Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico ELISA Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima DMEM Meio Dulbecco Modificado por Eagle EPM Erro Padratildeo da Meacutedia ERNs espeacutecies reativas de nitrogecircnio EROs espeacutecies reativas de oxigecircnio FeSO4 sulfato de ferro Fe2+ Ferro FGF fator de crescimento fibroblaacutestico

FGF-2 fator de crescimento fibroblaacutestico 2 FRF 08 fraccedilatildeo rica em fucanas 08 g gramas GAGs Glicosaminoglicanos h Hora(s) HCl Aacutecido Cloridrico HepG2 HampE Hematoxilina e Eosina HGF Fator de crescimento hepatocitaacuterio HS Heparan Sulfato HSPGs fator de crescimento ligantes de heparina HTAB brometo hexadeciltrimetilamonio H1 Hidrogecircnio 1 H2 Hidrogecircnio 2

H3 Hidrogecircnio 3

H5 Hidrogecircnio 5

H4 Hidrogecircnio 4 H6 Hidrogecircnio 6 H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio H2SO4 Aacutecido Sulfuacuterico

IFNs interferons IFN-γ interferon gama IL-2 interleucina-2 IR Espectroscopia do Infravermelho

KBr Brometo de Potaacutessio KI Iodeto de Potaacutessio M Molar Mol MCA Membrana Corioalantoica MDA Malondialdeiacutedo MTT Brometo de Dimetil Difenil Tetrazolio mg miligramas

min Minuto(s) MHz Mega Hertz mL miliLitros mM miliMol MPO Mieloperoacutexidase N Normal NaCl Cloreto de Soacutedio NADP oxidase Nicotinamida adenina dinucleotiacutedeo fosfato oxidase NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotiacutedeo Reduzido NAPQI N-acetil-p-benzoquinoneimina Na2S2O3 Tiosulfato de Soacutedio

ηM nanoMol Nm nanometros NO Oacutexido niacutetrico ONOO- peroacutexinitrito O2bull

- superoacutexido bullOH radical hidroxila PBS Tampatildeo Fosfato Salino PDA Diamino propano acetato pH Potencial Hidrogecircniocircnico PMNs ceacutelulas polimorfonucleares ppm (δ) Partes pro milhatildeo PT Tempo de Protrombina

pv PesoVolume RLs radicais livres RMN Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear RT temperatura Ambiente SD Desvio Padratildeo S=O Sulfato TCA aacutecido tricloroaceacutetico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

U Unidades vv VolumeVolume ordmC Graus Celsius Porcentagem 1H Hidrogecircnio1

13C Carbono13 3T3 Fibroblasto Murino 5-HT 5-hidroxitriptamina

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 23 11 ALGAS MARINHAS 23

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA 23

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONShelliphelliphelliphelliphellip 25

12 HEPATOTOXICIDADE 27

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE NITROGEcircNIO (ERNS) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

34

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO 37

15 ANGIOGEcircNESE 39

16 COAGULACcedilAtildeO 41

2 OBJETIVOS 45 21 OBJETIVO GERAL 45

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 45

3 MATERIAIS 46 31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS 46

311 ALGAS 46

312 ANIMAIS 46

32 MATERIAL QUIacuteMICO E APARELHOS 47

4 MEacuteTODOS 49 41 EXTRACcedilAtildeO DA FRF 08 DA ALGA MARROM LOBOPHORA VARIEGATAhellip 49

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA 50

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS 50

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 50

423 DOSAGEM DE SULFATO 50

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS 50

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 51

426 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO (IF) 51

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN) 52

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL 52

43 VIABILIDADE CELULAR 52

44 ATIVIDADES IN VIVO 53

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO 53

4411 Edema de Pata Induzido por carragenana 53

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO) 53

442 DANO HEPAacuteTICO 54

4421 Hepatotoxicidade Induzida por Tetracloreto de Carbono (CCL4) 54

4422 Anaacutelises Histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas 55

4423 Tempo de sono induzido por Pentobarbital Soacutedico 55

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGENESE 56

45 ATIVIDADES IN VITRO 57

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES 57

4511 Atividade Antioxidante Total 57

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro 57

4513 Poder Redutor 58

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila 58

4515 Varredura do Peroacutexido 58

4516 Varredura de Peroacutexido de hidrogecircnio 59

4517 DPPH 59

4518 Sequestro de Radical Superoacutexido 60

4519 Inibiccedilatildeo de Peroacutexidaccedilatildeo Lipidica 60 452 Atividades Anticoagulantes 60

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS 61 5 RESULTADOS 62

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FISICO-QUIacuteMICA DOS POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

62

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS 67 521 VIABILIDADE CELULAR 67 53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA 68 531 EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA 69 532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) 70 54 HEPATOPROTECcedilAtildeO 71 541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO (CCL4) 72 542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO 75 55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE 76 56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES EM FUCANAS (FRF) 77 57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 80

6 DISCUSSAtildeO 81 7 CONCLUSOtildeES 90 REFEREcircNCIAS 92

23

INTRODUCcedilAtildeO

11 ALGAS MARINHAS

111 CONCEITO CLASSIFICACcedilAtildeO E IMPORTAcircNCIA

As algas satildeo organismos fotossintetizantes classificadas com base na

morfologia e tamanho em (i) microalgas e (ii) macroalgas (JOHN et al 2011)

conforme mostradas na Figura 1

As microalgas (fitoplacircncton) satildeo definidas como ceacutelulas fotossinteacuteticas

majoritariamente unicelulares e que podem viver em associaccedilotildees complexas

(colocircnias) Representam um grupo muito heterogecircneo compreendendo organismos

procarioacuteticos e eucarioacuteticos como as diatomaacuteceas (BRUTON et al 2009)

Atualmente as microalgas satildeo amplamente estudadas como possiacuteveis fontes de

combustiacuteveis (HARUN et al 2010)

As macroalgas segundo Bruton et al (2009) satildeo adaptadas ao ambiente

marinho e geralmente habitam zonas costeiras e satildeo consideradas pelos seus altos

teores de carboidratos que apresentam funccedilatildeo adaptativa (proteccedilatildeo)

FIGURA 1 ndash Classificaccedilatildeo das algas em Microalgas e Macroalgas A classificaccedilatildeo foi baseada na

morfologia e no tamanho A Microalga Oscillatoria sp (Cianobacteacuteria) B Macroalga Cladophora sp

(Chorophyta) Fonte Science Photo Library (em A) e www2ucaesgrup-

investmicrobentosPAGESfcladophorahtm (em B)

Existem trecircs classes de macroalgas (Figura 2) que satildeo definidas de acordo

com o pigmento presente em algas marrons ou feofiacuteceas - clorofila a e c e ausecircncia

B A

24

de clorofila b vermelhas ou rodofiacuteceas - clorofila a e ficobilinas e verdes ou

clorofiacuteceas - clorofila a e b (BOCANEGRA et al 2009 BEN ALI et al 2001)

FIGURA 2 ndash Classificaccedilatildeo das macroalgas A Clorofiacuteceas B Feofiacuteceas C Rodofiacuteceas Fonte

wwwcemufprbrmonitoringportuguesprojetomonitoramento_qualidade_ambiental_ecossistemas_n

aturais-macroalgasphp

Esses organismos marinhos sempre receberam atenccedilatildeo pois haacute milecircnios satildeo

utilizados como fonte de alimento Poreacutem durante os uacuteltimos anos essa atenccedilatildeo

aumentou pelo fato de serem compostos naturais e por possuiacuterem um nuacutemero

relevante de substacircncias dotadas de diversos tipos de bioatividades Podemos

destacar as vaacuterias atividades bioloacutegicas observadas como anti-inflamatoacuteria (SOUZA

et al 2012 PAIVA et al 2011) anticoagulante (ALVES et al 2012 AZEVEDO et

al 2009 LEITE et al 1998) antitumoral (DORE et al 2012 KAEFFER et al 1999

LEITE et al 1998) antiviral (TALARICO et al 2005 TEAS et al 2004) antilipecircmica

(PENGZHAN et al 2003) e antibacteriana (IMMANUEL et al 2004 SELVIN

LIPTON 2004 MAGALLANES et al 2003) Dessa forma torna-se de grande

interesse biotecnoloacutegico e farmacoloacutegico o estudo de compostos ativos extraiacutedos

desses organismos marinhos

C A

B

25

112 POLISSACARIacuteDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

Andrade et al (2004) Pereira et al (1999 2002) Dietrich et al (1995) e

Kloareg Dermaty e Mabeau (1986) mostraram que os polissacariacutedeos aacutecidos de

algas satildeo compostos por fucanas sulfatadas tambeacutem conhecidas como fucoidanas

Estas satildeo heteropoliacutemeros formados principalmente por α-L-fucose sulfatada com

os eacutesteres de sulfato nas posiccedilotildees 2 3 eou 4 dependendo da ligaccedilatildeo glicosiacutedica

entre os monocircmeros (HAHN et al 2012) contendo pequenas proporccedilotildees de outros

accediluacutecares neutros como manose e galactose mostrados na Figura 3

FIGURA 3 ndash Estrutura de monossacariacutedeos e da fucoidana Baseado em

wwwpearsonhigheredcommathewsch16fucosehtmmundodabioquimicablogspotcombr201107

entrada-de-diferentes-monossacarideoshtml e Cumashi et al (2007)

Dessa forma Dietrich et al (1995) e Leite et al (1998) mostraram em seus

estudos que as algas marrons continham uma variedade de polissacariacutedeos aacutecidos

Alguns seriam compostos exclusivamente por aacutecido urocircnico aacutecidos algiacutenicos outros

por fucose e sulfato (homofucanas) E as heterofucanas seriam compostas por

26

xilose fucose manose galactose aacutecido glucurocircnico e sulfato em diferentes

proporccedilotildees

Sendo assim as homofucanas se diferenciam das heterofucanas pela sua

composiccedilatildeo estrutural Nesta perspectiva Berteau e Mulloy (2003) relataram que as

fucanas seriam constituiacutedas por L-fucose sulfatada e que estas satildeo facilmente

extraiacutedas da parede celular das algas marrons compondo cerca de 40 do peso

seco da parede celular isolada

Segundo Queiroz (2010) Percival e Mc Dowell (1967) as fucanas ou

fucoidanas fazem parte da famiacutelia de polissacariacutedeos sulfatados com maior peso

molecular e satildeo largamente dispersas nas paredes celulares de algas marrons As

unidades de fucose repetidas seriam parte da composiccedilatildeoestrutura primaacuteria

Poreacutem outros accediluacutecares podem fazer parte do poliacutemero ramificado como glicose

manose galactose e aacutecido urocircnico

Pomin e Mouratildeo (2008) mostraram em estudos de espectroscopia de

Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) de alto campo que as fucanas sulfatadas de

algas marrons satildeo compostas igualmente por unidades alternadas de 23-disulfato

4-ligado e 2-sulfato unidades α-L-fucopiranosil 3-ligado Enquanto que a

heterogeneidade desses polissacariacutedeos resulta principalmente da ocorrecircncia de

ramificaccedilotildees de resiacuteduos de fucose natildeo sulfatadas (CHEVOLOT et al 1999

PEREIRA et al 1999) levando a um padratildeo estrutural e de sulfataccedilatildeo espeacutecie

relacionado no esqueleto de accediluacutecar destes polissacariacutedeos (HAHN et al 2012) e

essa diversidade estrutural permite a diversidade de funccedilotildees farmacoloacutegicas com

diferentes niacuteveis de eficiecircncia

A anaacutelise de RMN de fucanas sulfatadas de espeacutecies de algas pardas

revelaram estruturas uacutenicas (POMIN MOURAtildeO 2008) A ocorrecircncia da O-

acetilaccedilatildeo esta comumente presente nesses poliacutemeros (CHIZHOV et al 1999)

demonstrando que as mesmas satildeo moleacuteculas complexas resultando numa

dificuldade adicional de se determinar sua estrutura Isso seria ocasionado pela

presenccedila de ramificaccedilotildees distribuiccedilotildees de sulfatos aleatoriamente diferentes tipos

de ligaccedilotildees glicosiacutedicas e tambeacutem pela presenccedila de acetilaccedilotildees metilaccedilotildees e

piruvilaccedilatildeo (CHIZHOV et al 1999 BILAN et al 2007)

Jiao et al (2011) mostraram que esses polissacariacutedeos sulfatados possuem

vaacuterias atividades bioloacutegicas incluindo atividade anticoagulante antiviral e

27

imunoinflamatoacuteria (QUEIROZ 2008 BOISSON-VIDAL et al 2000 LEITE et al

1998)

Percival e Mc Dowell (1967) e Dore et al (2012) verificaram que esta classe

de poliacutemeros apresenta atividade anticoagulante sendo um potente ativador tanto

de anti-trombina III quanto do cofator II da heparina Aleacutem disso existem relatos de

um grande nuacutemero de polissacariacutedeos sulfatados e outras substacircncias polianiocircnicas

como potentes inibidores in vitro de vaacuterios viacuterus incluindo importantes

patoacutegenos humanos como o viacuterus da imunodeficiecircncia humana herpes

viacuterus simplex citomegaloviacuterus humano o viacuterus da dengue e o viacuterus sincicial

respiratoacuterio (KAKUDA 2000 WITVROUW e DECLERQ 1997)

Estudos em nosso laboratoacuterio demonstraram o papel desses polissacariacutedeos

sulfatados como inibidores da atividade de transcriptase reversa do HIV (QUEIROZ

et al 2008) como agente antiinflamatoacuterio em um modelo de artrite induzida por

zymosan (PAIVA et al 2011) atividade anticoagulante (ALVES et al 2012 SOUZA

et al 2012 AZEVEDO et al 2009) antioxidante (DORE et al 2012 SOUZA et al

2007) e antitromboacutetica (ALVES et al 2012 DORE et al 2012) Existem ainda

outros relatos que demonstraram accedilatildeo bioloacutegica de polissacariacutedeos na funccedilatildeo

hepaacutetica (SAITO et al 2006) como antitumorais (JIANG et al 2010)

antiinflamatoacuterios (MAYER HAMANN 2005 KUDA et al 2007) Aleacutem de serem

antioxidantes (KUDA et al 2005 SOUZA et al 2007) esses poliacutemeros

apresentaram propriedades antiadesiva (CUMASHI et al 2007) fazendo com que

os possam ser usados como possiacuteveis faacutermacos hepatoprotetores antinflamatoacuterios

e anticacircncer

12 HEPATOTOXICIDADE

O fiacutegado eacute um oacutergatildeo bastante importante na manutenccedilatildeo da homeostasia do

organismo como um todo estando associado com vaacuterios processos no nosso

organismo (LISMAN 2010) como a detoxificaccedilatildeo hepaacutetica (KRAMER et al 2003)

As funccedilotildees baacutesicas do fiacutegado podem ser divididas em trecircs (i) vasculares de

armazenamento e filtraccedilatildeo do sangue (ii) metaboacutelicas relacionadas agrave maioria dos

sistemas metaboacutelicos do organismo e (iii) secretoras e excretoras responsaacuteveis

pela formaccedilatildeo da bile que flui pelos dutos biliares para o tubo gastrintestinal sendo

28

necessaacuterias para o processo de emulsificaccedilatildeo de gorduras (SANTOS OLIVEIRA

PIMENTA 2009)

No que se refere agrave funccedilatildeo (i) anteriormente mencionada o processo de

biotransformaccedilatildeo estaria relacionado pois esta eacute uma alteraccedilatildeo bioquiacutemica

especiacutefica com sequecircncias enzimaacuteticas ordenadas em cada etapa no qual o destino

do faacutermaco quando entra no organismo vai depender de alguns fatores como taxa

de absorccedilatildeo distribuiccedilatildeo regulaccedilatildeo de niacuteveis e excreccedilatildeo (AUDI PUSSI 2000)

influenciando a proporccedilatildeo do distuacuterbio

De maneira geral pode-se inferir que o fiacutegado desempenha vaacuterias funccedilotildees

diferentes (Figura 4) como metaboacutelica excretora e secretora (participando na

formaccedilatildeo da bile) armazenamento protetora circulatoacuteria coagulaccedilatildeo sanguiacutenea

siacutentese de compostos bioloacutegicos (proteiacutenas carboidratos e lipiacutedios) formaccedilatildeo de

corpos cetocircnicos desintoxicaccedilatildeo (biotransformaccedilatildeo) e metabolismo das drogas

(MOTTA 2000) aleacutem de funccedilatildeo endoacutecrina (PIETRANGELO 2007) e imunoloacutegica

(JESUS WAITZBERG CAMPOS 2000)

FIGURA 4 ndash Esquematizaccedilatildeo da funccedilatildeo hepaacutetica

Portanto a biotransformaccedilatildeo eacute um processo alternativo no qual os

metaboacutelitos formados apresentam propriedades distintas das drogas originais com

caracteriacutesticas mais hidrofiacutelicas objetivando facilitar a excreccedilatildeo pelo organismo

(MEYER 1996) Contudo as drogas nem sempre satildeo inativadas e seus metaboacutelitos

podem ainda apresentar atividade ou propriedades toacutexicas aumentadas (COSTA

OLIVEIRA PIMENTA 2004)

29

As enzimas satildeo as grandes responsaacuteveis pelas reaccedilotildees de biotransformaccedilatildeo

e se encontram distribuiacutedas em todo o organismo (sangue rins pulmotildees pele

tecido nervoso intestino delgado e fiacutegado) O fiacutegado eacute o oacutergatildeo que mais concentra

estas enzimas (WATKINS1992) A realizaccedilatildeo de testes bioquiacutemicos com o tecido

hepaacutetico permitiu constatar a presenccedila de diferentes enzimas nas fraccedilotildees soluacuteveis

(desidrogenases esterases e amidases) mitocondrial (monoaminoxidases) e

microssomal (sistema enzimaacutetico citocromo P450 e enzimas oxidativas (FUNASA

2002)

Esse processo estaria intimamente relacionado com toxicidade devido aos

metaboacutelitos toacutexicos poderem formar ligaccedilatildeo covalente eou natildeo-covalente com

moleacuteculas-alvo As interaccedilotildees natildeo-covalentes como peroxidaccedilatildeo lipiacutedica produccedilatildeo

de espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) reaccedilotildees causadoras de alteraccedilatildeo na

concentraccedilatildeo de glutationa e modificaccedilatildeo de grupos sulfidril poderiam resultar em

citotoxicidade (OSHIMA-FRANCO FRANCO 2003) Sendo assim o paracetamol

poderia ser usado para exemplificar mecanismos de lesatildeo celular (PARANAacute 2011)

Na figura 5 tecircm-se o esquema do metabolismo do paracetamol mostrando

que em doses terapecircuticas normalmente ocorre a sua conjugaccedilatildeo ao aacutecido

glicurocircnico ou ao sulfato para facilitar o processo de excreccedilatildeo (BESSEMS

VERMEULEN 2001) Poreacutem pequenas quantidades satildeo biotransformadas pelo

complexo enzimaacutetico citocromo P450 (CYP) em um intermediaacuterio reativo toacutexico o N-

acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI) que eacute processado pela ligaccedilatildeo a glutationa

Mas em caso de superdosagem a induccedilatildeo da enzima CYP e a depleccedilatildeo de

glutationa ou a inibiccedilatildeo de glucuronidaccedilatildeo faz com que esse metaboacutelito reativo natildeo

seja suficientemente neutralizado Assim o NAPQI reage com as cisteiacutenas das

proteiacutenas hepatocelulares levando a perda de funccedilatildeo celular e morte celular

(MOLING et al 2006)

30

FIGURA 5 ndash Metabolismo e risco de toxicidade do paracetamol Fonte Paranaacute (2011)

Sozio et al (2009) mostraram em seus estudos que o mecanismo de injuacuteria

hepaacutetica causada pela combinaccedilatildeo de obesidade e aacutelcool natildeo eacute bem compreendida

mas que ambas condiccedilotildees independentemente induzem a atividade do citocromo

hepaacutetico P450 2E1 (CYP2E1) Seria entatildeo possiacutevel que estas duas condiccedilotildees juntas

causassem um aumento na induccedilatildeo do CYP2E1 resultando em maior formaccedilatildeo de

espeacutecies de oxigecircnio o que levaria a injuacuteria hepaacutetica

Aleacutem disso tanto o aacutelcool quanto a obesidade levam ao aumento de produccedilatildeo

de citocinas proinflamatoacuterias como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) proteiacutena

1 quimiotaacutetil de monoacutecito e interleucinas sendo estas as grandes responsaacuteveis por

agravar a injuacuteria hepaacutetica pois geram resposta inflamatoacuteria nos hepatoacutecitos e

alteram o metabolismo lipiacutedico intra-hepaacutetico Sabe-se que o aacutelcool altera a

permeabilidade intestinal e seu efeito poderia influenciar a mediaccedilatildeo da endotoxina

agravando ainda mais a doenccedila hepaacutetica relacionada agrave obesidade (SOZIO

CHALASANI LIAGPUNSAKUL 2009)

Como mencionado anteriormente a elevaccedilatildeo na liberaccedilatildeo de algumas

citocinas inflamatoacuterias como TNF-α interferon gama (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2)

podem caracterizar o processo de dano hepaacutetico Isto se daacute devido agrave presenccedila do

infiltrado leucocitaacuterio onde estas ceacutelulas estatildeo envolvidas com o processo de morte

e necrose hepatocelular o que leva a fibrose no fiacutegado (SAITO et al 2006) e

31

elevaccedilatildeo de niacuteveis plasmaacuteticos de bilirrubina (WEDEMEYER MANNS 2008)

alanina aminotransferase-ALT (SRIVASTAVA et al 2007) aspartato

aminotransferase - AST (BAI CANFIELD STACE 1992) e gama glutamiltransferase

- γ-GT (GEUKEN et al 2004) Sendo assim estas proteiacutenas podem ser marcadores

do processo de dano hepaacutetico e possiacuteveis alvos de atuaccedilatildeo de compostos

hepatoprotetores

A bilirrubina eacute um dos produtos do catabolismo intracelular do heme da

hemoglobina que ocorre em um complexo enzimaacutetico ancorado na membrana do

retiacuteculo endoplasmaacutetico (GROTTO 2010) A hemoglobina proveniente da quebra

de eritroacutecitos maduros eacute a principal fonte (80-85) da produccedilatildeo total de bilirrubina e

o restante (15-20) eacute proveniente da destruiccedilatildeo prematura de eritroacutecitos receacutem-

formados e o maior componente eacute formado no fiacutegado derivado do heme natildeo

eritroacuteide e de hemoproteiacutenas hepaacuteticas como mioglobina citocromo e catalases

(MARTINELLI 2004)

No metabolismo da bilirrubina o fiacutegado ocupa papel central pois esse oacutergatildeo eacute

responsaacutevel por sua captaccedilatildeo conjugaccedilatildeo e excreccedilatildeo (MARTINELLI 2004) Aleacutem

disso a anaacutelise desses teores eacute uacutetil para o diagnoacutestico diferencial de doenccedilas onde

a elevaccedilatildeo da (i) bilirrubina total pode estaacute associada agraves hepatopatias e agraves

hemoglobinopatias (ii) bilirrubina direta agrave disfunccedilatildeo hepatocelular e (iii) bilirrubina

indireta agrave alteraccedilatildeo no transporte por mecanismo de competiccedilatildeo pelo siacutetio de

ligaccedilatildeo da albumina pela droga acidose metaboacutelica ou hipoalbuminemia (acesso em

BIOINFORME 2012)

A bilirrubina eacute classificada em direta (conjugada) e indireta (natildeo conjugada)

A forma natildeo conjugada eacute lipossoluacutevel se liga reversivelmente agrave albumina sendo

esse complexo a forma pela qual eacute transportada no sangue e a mesma apresenta

afinidade pelo tecido nervoso aleacutem disso as sulfonamidas e salicilatos competem

pela ligaccedilatildeo da bilirrubina com a albumina (MARTINELLI 2004)

A bilirrubina indireta chega aos sinusoacuteides hepaacuteticos onde eacute conjugada com

aacutecido glicurocircnico se transformando em bilirrubina conjugada (direta) Esta fraccedilatildeo por

sua vez eacute hidrossoluacutevel e apresenta afinidade por tecidos elaacutesticos (acesso em

BIOINFORME 2012) Dessa forma a bilirrubina total (BT) e bilirrubina direta (BD)

satildeo medidas diretamente no sangue enquanto os niacuteveis de bilirrubina indireta (BI)

satildeo derivadas das mediccedilotildees de BT e BD

32

As atividades das aminotransferases tambeacutem denominadas de enzimas de

lesatildeo (MEYER et al 1995) satildeo amplamente utilizadas como iacutendice sensiacutevel da

lesatildeo aguda dos hepatoacutecitos na praacutetica meacutedica mas natildeo sendo especiacutefica (LORENZ

et al 1996 GAW et al 2001) De acordo com Kaneco et al (1997) a alanina

aminotransferase (ALT) catalisaria a transaminaccedilatildeo reversiacutevel da L-alanina e 2-

oxoglutarato a piruvato e glutamato no citoplasma da ceacutelula sendo a atividade da

ALT indicadora de hepatopatias E como essa transaminase eacute bastante especiacutefica

em primatas catildees gatos coelhos e ratos eacute recomendada para apontar hepatopatias

em estudos toxicoloacutegicos nos quais se utilizam roedores e catildees como cobaias

Aleacutem disso o citoplasma do hepatoacutecito em catildees gatos e primatas seriam

ricos em alanina aminotransferase (Meyer et al 1995 Kerr 2002) e um dano agrave

membrana hepatocelular resultaria em um aumento da ALT seacuterica (MEYER et al

1995GAW et al 2001 KERR 2002)

A aspartato aminotransferase (AST) natildeo eacute uma enzima especiacutefica para o

fiacutegado e pode originar-se tanto em muacutesculos quanto em tecido hepaacutetico dessa

forma o seu aumento deve ser interpretado considerando esta inespecificidade

(KANECO et al 1997)

Pode-se ainda destacar que as transaminases catalisadoras por

transferecircncia do grupo amino interconversatildeo de aminoaacutecidos e alfa-ceto-aacutecidos e

estatildeo presentes em diferentes tecidos no qual a AST estaria no citosol e na

mitococircndria dos hepatoacutecitos

Fox e Campbell (2000) consideraram os exames bioquiacutemicos sanguiacuteneos de

ALT e AST informativos da avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda por AINEs e sua

elevaccedilatildeo em conjunto poderia indicar lesatildeo hepaacutetica significativa As causas de

lesatildeo hepaacutetica incluiriam a hepatite que natildeo leva em conta o agente causal e a

injuacuteria toacutexica que pode acompanhar qualquer uma das agressotildees ao fiacutegado

incluindo doses excessivas de drogas (BOOTH 1995 LORENZ et al 1996 GAW et

al 2001)

As enzimas γ-glutamil transferase e fosfatase alcalina seriam marcadores de

processos colestaacutesicos e importantes no diagnoacutestico das hepatopatias Os valores

elevados dessas enzimas satildeo observados em processos patoloacutegicos envolvendo o

fiacutegado Enquanto que a fosfatase alcalina encontrada em vaacuterios tecidos e no fiacutegado

eacute secretada pelos hepatoacutecitos e pelas ceacutelulas da mucosa do trato biliar estando a

33

gama glutamil transferase (γ-GT) envolvida na transferecircncia de um resiacuteduo γ-

glutamil de alguns peptiacutedeos para outros compostos (VASCONCELOS 2007)

Ainda eacute importante destacar que a atividade da fosfatase alcalina pode

indicar iacutendice de colestase e as atividades das aminotransferases datildeo uma medida

da integridade das ceacutelulas do fiacutegado (Traversa et al 2003)

Oshima-Franco e Franco (2003) mostraram que o organismo apresenta

formas de neutralizar metaboacutelitos intermediaacuterios reativos advindos de reaccedilotildees de

biotransformaccedilatildeo exposiccedilatildeo a viacuterus toxinas e radiaccedilotildees Dentre estas formas de

neutralizaccedilotildees destacam-se a deleccedilatildeo da ceacutelula danificada por apoptose ou

necrose com posterior substituiccedilatildeo da ceacutelula danificada por mitose Poreacutem a falha

destes mecanismos poderia provocar necrose tecidual fibrose ou mutagecircnese

A hepatotoxicidade dessa forma eacute um processo que causa lesotildees no fiacutegado

diminuindo a sua funccedilatildeo e vaacuterias as drogas estatildeo envolvidas nesse processo

hepatotoacutexico causando fiacutegado gordo granulomas e outros (MADDREY 2005) O

uso de vaacuterios medicamentos pode causar um dano hepatocelular caracteriacutestico pelo

aumento das transaminases ALT e AST ou colestaacutetico levando ao aumento de

bilirrubinas (principalmente da direta) da fosfatase alcalina e do ƴ-GT limitando o

uso e benefiacutecios destes faacutermacos (BERTOLAMI 2005)

O tetracloreto de carbono foi utilizado em nossos estudos e esse composto

quiacutemico de acordo com Maddrey (2005) jaacute eacute estabelecido como hepatotoxina E

como vaacuterias outras drogas durante o seu metabolismo produz um intermediaacuterio

altamente reativo e toacutexico que satildeo produtos metaboacutelicos potencialmente danosos e

precisam ser rapidamente metabolizados em substacircncias menos nocivas para evitar

a lesatildeo As reaccedilotildees oxidativas iniciais do metabolismo desta droga e de outras como

paracetamol satildeo mediadas pelo complexo enzimaacutetico CYP que por sua vez

apresenta papel na produccedilatildeo dessas espeacutecies intermediaacuterias reativas (MADDREY

2005) sendo assim compostos que inibem o CYP podem ter a atividade

hepatoprotetora por esta via de ativaccedilatildeo

Dessa forma sabe-se que alguns polissacariacutedeos sulfatados contendo

fucose apresentam atividade protetora para o fiacutegado (ROSS et al 2012 HAYASHI

et al 2008 SAITO et al 2006) mas devido aos poucos trabalhos que relatam o

papel das fucanas na inibiccedilatildeo do dano hepaacutetico torna-se fundamental o estudo da

fraccedilatildeo rica em fucanas 08 (FRF 08) para verificar o seu possiacutevel mecanismo de

34

proteccedilatildeo hepaacutetica devido a este oacutergatildeo ser dinacircmico e envolvido em vaacuterias funccedilotildees

que permite a manutenccedilatildeo da vida

13 ESPEacuteCIES REATIVAS DE OXIGEcircNIO (EROS) E ESPEacuteCIES REATIVAS DE

NITROGEcircNIO (ERNS)

As espeacutecies reativas de oxigecircnio (EROs) tais como radical hidroxila (bullOH)

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) superoacutexido (O2bull-) e as espeacutecies reativas de

nitrogecircnio (ERNs) como o oacutexido niacutetrico (NO) e o peroacutexinitrito (ONOO-) visualizadas

na Tabela 1 (em vermelho bullOH H2O2 e O2bull- em roxo o NO e em verde o ONOO-)

satildeo espeacutecies reativas (ERs) que ocorrem naturalmente nos organismos vivos e

apresentam papel na modulaccedilatildeo da sinalizaccedilatildeo celular (DAS 1986) proliferaccedilatildeo

apoptose (KIM 2001) e proteccedilatildeo celular (ROSSI 1985) Contudo as ERs satildeo

tambeacutem a maior fonte de estresse celular por causar danos a proteiacutenas lipiacutedeos e

DNA (MANDA et al 2009)

Tabela 1 Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Espeacutecies Reativas

Nitrogecircnio

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio Espeacutecie Reativa

O2 + e-

rarr O2- Radical Superoacutexido

O2- + H2O rarr HO2

- + OH Radical Hidroperoxil

HO2- + e

- + H rarr H2O2 Peroacutexido de Hidrogecircnio

H2O2 + e-

rarr OH + OH- Radical Hidroxila

Formaccedilatildeo de Espeacutecies Reativas de Nitrogecircnio Espeacutecie Reativa

O2- + NO rarr

-OONO Peroxinitrito

Fonte Baseado em Koury e Donangelo (2003) Correia e Muscaraacute (2005)

Estas espeacutecies reativas podem ser geradas biologicamente por vaacuterias vias

tais como respiraccedilatildeo celular (BARREIROS DAVID DAVID 2006) e accedilatildeo de

enzimas como NADP oxidase xantina oxidase lipo e cicloxigenases e oacutexido niacutetrico

sintases (NAM 2012) O radical hidroxila pode ser gerado a partir da degradaccedilatildeo do

aacutecido peroxinitroso e de reaccedilotildees de reduccedilatildeo de peroacutexidos mediadas por metais

como ocorre com o peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001)

35

Estas reaccedilotildees podem envolver iacuteons metaacutelicos livres de proteiacutenas (como

hemoglobina transferrina ou ferritina) em leucoacutecitos e como ocorre na reaccedilatildeo de

Fenton (representada na Figura 6) no qual o Cu+ ou o Fe2+ promovem a produccedilatildeo

de bullOH a partir do peroacutexido de hidrogecircnio (NORDBERG 2001) Outra reaccedilatildeo que

pode ocorrer eacute a de Haberndash Weiss (Figura 6) no qual o radical hidroxil pode ser

formador a partir de outras espeacutecies reativas como o superoacutexido atraveacutes de reaccedilatildeo

com o peroacutexido de hidrogecircnio (KEHRER 2000)

FIGURA 6 ndash Reaccedilatildeo de Fenton e Haber-Weiss Esquematizaccedilatildeo de reaccedilotildees que envolvem o

radical hidroxil superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio Fonte

quimicaecienciasblogspotcombr200906reacao-fentonhtml

Alguns mecanismos de sinalizaccedilatildeo celular envolvem a siacutentese e utilizaccedilatildeo de

espeacutecies reativas de oxigecircnio como o superoacutexido e o oacutexido niacutetrico

(GAMALEY 1999 HANCOCK 2002) A exposiccedilatildeo das ceacutelulas a RLs EROs e as

ERNs podem ativar vias inflamatoacuterias (KHOO 2012) liberando citocinas que

ativam o sistema imune (MAO 2011) e aumentam a expressatildeo de moleacuteculas de

adesatildeo (NAM 2012) Aleacutem disso o processo inflamatoacuterio estaacute relacionado com a

siacutentese de ERNs e EROs como forma de defesa levando ao aumento de geraccedilatildeo

de EROs amplificando o processo inflamatoacuterio e a injuacuteria tecidual (MANDAL 2009)

O processo de explosatildeo respiratoacuteria seria a queima natildeo-mitocondrial de

oxigecircnio com concomitante produccedilatildeo de superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio como

produtos primaacuterios E radical hidroxil oxigecircnio singleto e aacutecido hipocloroso como

metaboacutelitos secundaacuterios com accedilatildeo bactericida ativaccedilatildeo e modulaccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Este processo seria induzido por partiacuteculas fagocitaveacuteis (bacteacuteria viacuterus materiais

agregados detritos celulares etc) e conduzido pela NADPH oxidase (ROSSI 1985)

36

O NO em grandes quantidades eacute fisiologicamente danoso pois possui um

potencial de conversatildeo para outras espeacutecies reativas de nitrogecircnio Sendo assim o

NO serve como substrato para nitraccedilatildeo nitrosilaccedilatildeo nitrosaccedilatildeo e oxidaccedilatildeo o que

conduz a quebra de simples e dupla fita de DNA desnaturaccedilatildeo proteica

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica lesotildees estas que podem levar ao aparecimento de um cacircncer

(CASTRO 2011 DENES et al 2010 HOFSETH 2008)

Dessa forma a toxicidade dos EROs e ERNs estaria relacionada com sua

capacidade de oxidar proteiacutenas desnaturando-as (KEHRER 2000) e de oxidar

polissacariacutedeos e aacutecidos graxos poliinsaturados das membranas (NORDBERG

2001) Sendo assim as espeacutecies reativas atacariam as duplas ligaccedilotildees desses

lipiacutedeos resultando em dano celular e disfunccedilatildeo tecidual (MANDAL 2009)

A remoccedilatildeo de um hidrogecircnio de uma destas duplas ligaccedilotildees levaria a

produccedilatildeo de peroxil lipiacutedico que remove o hidrogecircnio de outros lipiacutedeos produzindo

radicais lipiacutedicos hidroperoacutexidos (KEHRER 2000) Estes podem se decompor em

vaacuterias espeacutecies tais como o malondialdeiacutedo (VACA 1989) afetando entatildeo a accedilatildeo

de canais iocircnicos de proteiacutenas transportadoras e enzimas (CATALAacute 2012)

Nos organismos existe um complexo sistema endoacutegeno de defesa contra

ERO e ERN de accedilatildeo enzimaacutetica como as enzimas superoacutexido dismutase catalase e

glutationa peroxidase e natildeo enzimaacutetica como grupos sulfidrilas e vitaminas

(HEYLAND 2005 MANDAL 2009) Estes antioxidantes poderiam agir neutralizando

ou catabolizando radicais livres ou ainda quelando metais que agem formando

peroacutexidos (JACOB 1995)

Dessa forma os antioxidantes satildeo de grande interesse bioloacutegico uma vez que

estes apresentam potencial accedilatildeo farmacoloacutegica como anticacircncer antivascular

antinflamatoacuteria e outras atividades biologicamente importantes (LIEN 1999) Dentre

estes compostos podemos enfatizar alguns polissacariacutedeos sulfatados de algas

marinhas que apresentam esse tipo de atividade (SOUZA et al 2007) Sendo

assim torna-se de interesse verificar a capacidade antioxidante da FRF 08

podendo tambeacutem correlacionar esta com o potencial farmacoloacutegico que seraacute

averiguado

37

14 PROCESSO INFLAMATOacuteRIO

A inflamaccedilatildeo eacute uma reposta primaacuteria a infecccedilotildees ou injuacuterias que tem como

finalidade o reparo tecidual atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios como

aminas bioativas eicosanoacuteides citocinas quimiocinas e fatores de transcriccedilatildeo que

regulam processos como permeabilidade vascular e o recrutamento de ceacutelulas

polimorfonucleares - PMNs (RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010 CUZZOCREA

2005) Este processo envolve uma seacuterie de eventos complexos de forma organizada

e sequencial como dilataccedilatildeo de arteriacuteolas vecircnulas e capilares com subsequente

aumento da permeabilidade vascular exudaccedilatildeo de fluidos (incluindo proteiacutenas

plasmaacuteticas) e migraccedilatildeo leucocitaacuteria (DORWARD et al 2012 CUZZOCREA 2005)

As ceacutelulas da imunidade inata (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) efetuam

importantes papeacuteis na defesa contra patoacutegenos ou injuacuteria (TAKEUCHI AKIRA

2010) Isso ocorre atraveacutes de receptores em suas membranas que permitem um

estiacutemulo que desenvolve respostas inflamatoacuterias como os receptores de

reconhecimento padratildeo que reconhecem padrotildees moleculares associados a

patoacutegenos (PAIVA-OLIVEIRA et al 2012) e a padrotildees moleculares relacionados a

danos (MARTINON et al 2009 KONO ROCK 2008)

O estiacutemulo inflamatoacuterio reconhecido induz a codificaccedilatildeo de genes que

expressam proteiacutenas pro-inflamatoacuterias (citocinas interferons (IFNs) e quimiocinas)

que regulam a morte celular de tecido inflamado modificando a permeabilidade

vascular recrutando as ceacutelulas sanguiacuteneas ao local de injuacuteria e induz a siacutentese de

proteiacutenas de fase aguda (TAKEUCHI AKIRA 2010)

Este conjunto de reaccedilotildees eacute ilustrado na Figura 7 e induzem a adesatildeo

leucocitaacuteria ao endoteacutelio vascular permitindo a continuidade da resposta

inflamatoacuteria o translocamento de P-selectinas dos corpos de Weibel-Palade

leucocitaacuterios como sua ligaccedilatildeo a integrinas moleacutecula de adesatildeo celular vascular 1

moleacutecula de adesatildeo celular intracelular 1 moleacutecula de adesatildeo leucocitaacuteria endotelial

1 e E-selectinas presentes nas ceacutelulas endoteliais permitido seu rolamento ativaccedilatildeo

e adesatildeo (SHCHMID-SCHONBEIN 2006 MORAES PIQUERAS e BISCHOP-

BAILEY 2006 CUZZOCREA et al 2005)

38

FIGURA 7 ndash Processo Inflamatoacuterio mostrando a regulaccedilatildeo do movimento leucocitaacuterio por quimiocinas o rolamento a ativaccedilatildeo e aderecircncia assim como as selectinas integrinas e moleacuteculas de adesatildeo que permitem esse processo Fonte Luster (1998)

A persistecircncia desse processo leva a uma inflamaccedilatildeo crocircnica podendo

ocorrer dano tecidual e perda de funccedilatildeo pela persistecircncia da infecccedilatildeo de injuacuteria

local recorrente ou de deficiecircncia de mecanismos anti-inflamatoacuterios naturais

(RODRIGUEZ-VITA LAWRENCE 2010) Este tipo de inflamaccedilatildeo seria determinada

como o maior agente etioloacutegico do cacircncer a partir da inflamaccedilatildeo (KUNDU SURH

2012 POEHLMANN et al 2012) Dentre os tipos de cacircncer frequentemente

originados por processos inflamatoacuterios tecircm-se o cacircncer de estocircmago (MAGARI et

al 2005) fiacutegado (SUN KARIN 2012) proacutestata (PLATZ MARZO 2004) e pacircncreas

(FITZPATRICK 2001)

Durante a inflamaccedilatildeo crocircnica as vias celulares envolvidas com cinases

nucleares e citoplasmaacuteticas (ZHOU et al 2010 BEAVER et al 2009) e fatores de

transcriccedilatildeo (LING KUMA 2012) satildeo frequentemente desregulados levando a

39

expressatildeo anormal de genes pro-inflamatoacuterios envolvidos na transformaccedilatildeo maligna

Segundo Kundu e Surh (2012) outra via de promoccedilatildeo do cacircncer a partir da

inflamaccedilatildeo seria por meio da geraccedilatildeo de radicais livres onde muitas ceacutelulas do

sistema imune (como mastoacutecitos neutroacutefilos leucoacutecitos macroacutefagos monoacutecitos

eosinoacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas e ceacutelulas NKs) presentes no tecido inflamado geram

EROs ou ERNs aos quais causam danos ao DNA contribuindo para a

carcinogecircnese por ativar oncogenes (REUTER et al 2010) e inativar genes

supressores de tumor (FITZPATRICK 2001)

Alguns mecanismos de inflamaccedilatildeo contribuem para a carcinogecircnese entre

estes pode-se incluir a induccedilatildeo da instabilidade cromossomal alteraccedilotildees em

eventos epigeneacuteticos e subsequente expressatildeo gecircnica inapropriada aumento na

proliferaccedilatildeo celular evasatildeo da apoptose estimulaccedilatildeo da neovasculatura

intratumoral invasatildeo atraveacutes da membrana basal associada ao tumor e movimento

metastaacutetico (PORTA et al 2009 KUNDU SURH 2008 HUSSAIN HARRIS

2007) Por fim alguns agentes antitumorais podem agir tambeacutem como agentes anti-

inflamatoacuterios como ocorre com alguns inibidores da angiogenese devido aos

mesmos estarem diretamente relacionados com a manutenccedilatildeo do processo

inflamatoacuterio e com o crescimento e desenvolvimento de tumores soacutelidos (KUNDU

SURH 2008)

Nesse contexto a literatura revela que polissacariacutedeos apresentam accedilatildeo no

processo inflamatoacuterio Dessa forma a accedilatildeo de polissacariacutedeos obtidos de algas

marrons tem sido estudada em nosso laboratoacuterio no qual pode-se observar que as

fucanas inibem a migraccedilatildeo de leucoacutecitos e apresentam accedilatildeo sobre a artrite induzida

por zymosan (Paiva 2011)

15 ANGIOGEcircNESE

Os processos inflamatoacuterios e de angiogecircnese estatildeo associados pois a

angiopoietina-2 que regula a angiogecircnese pode super regular as respostas

inflamatoacuterias mostrando dessa forma que existe uma via de sinalizaccedilatildeo comum

para esses dois processos (FIEDLER et al 2006) o que torna relevante o seu

estudo

40

A formaccedilatildeo de novos vasos sanguiacuteneos pode ocorrer por dois mecanismos

(1) por meio da vasculogecircnese sendo referente aos eventos iniciais de crescimento

vascular e envolvendo a diferenciaccedilatildeo e reuniatildeo de precursores de ceacutelulas

endoteliais os angioblastos formando assim os vasos primitivos e (2) por meio da

angiogecircnese no qual a formaccedilatildeo de novos vasos ocorre a partir de vasos preacute-

existentes (METTOUCHI MENEGUZZI 2006 TRANQUIA TRACQUI 2000)

O equiliacutebrio entre fatores proacute- e anti- angiogecircnicos (Figura 8) regula o

crescimento de novos vasos sendo o estado proacute-angiogecircnico caracterizado pela

super expressatildeo de fatores que estimulam a formaccedilatildeo de vasos e sub-regulaccedilatildeo de

proteiacutenas anti-angiogecircnicas (BISCETTI et al 2009 SCHMITT)

FIGURA 8 ndash Fatores antiangiogecircnicos e angiogecircnicos e a regulaccedilatildeo da formaccedilatildeo de novos vasos no processo de tumorogenese Fonte blogdasbiblogspotcombr201104mais-uma-razao-para-nao-eliminar-ohtml

A angiogecircnese ocorre durante as fases embrionaacuterias para remodelamento da

vasculatura primitiva e na fase adulta durante o ciclo reprodutivo feminino

(ZYGMUNT et al 2003) em condiccedilotildees de fisiopatologias como durante a

inflamaccedilatildeo crocircnica (MARAGOUDAKIS PANOUTSACOPOU SARMONIKA 1988) e

no processo de tumorogecircnese (RIBATTI et al 2002 METTOUCHI MENEGUZZI

2006)

41

Dessa forma a angiogecircnese eacute fortemente associada aos processos

patoloacutegicos como o cacircncer onde eacute necessaacuteria para providenciar oxigecircnio e

nutrientes assim como para remover metaboacutelitos e para o processo de metaacutestase

(MAKRILI et al 2009)

16 COAGULACcedilAtildeO

A coagulaccedilatildeo eacute um processo que estaacute relacionado tanto com a inflamaccedilatildeo

(ESMON 2007) quanto com a angiogecircnese (SHOJI et al 1998) o que torna

relevante o seu estudo

Dessa forma a coagulaccedilatildeo sanguiacutenea ocorre em decorrecircncia agrave lesatildeo de um

vaso sanguiacuteneo juntamente com o espasmo vascular a formaccedilatildeo de tampatildeo

plaquetaacuterio e o crescimento eventual de tecido fibroso no coaacutegulo sanguiacuteneo

(MINORS 2007) para a prevenccedilatildeo da perda sanguiacutenea (manutenccedilatildeo da

hemostasia) Sob condiccedilotildees fisioloacutegicas normais os mecanismos anticoagulantes

promovem uma potente defesa contra complicaccedilotildees tromboacuteticas (ESMON 2004)

sendo fundamental para o processo de hemostasia (MORAN VIELE 2005)

O processo de coagulaccedilatildeo sanguiacutenea em todos os mamiacuteferos verifica-se de

forma similar e com mecanismos de accedilotildees combinadas com proteases celulares

(Gopinath 2008) Desta forma a injuacuteria tecidual eacute rapidamente localizada e

regulada em condiccedilotildees normais com formaccedilatildeo de coaacutegulo cessamento do

sangramento e posterior lise do coaacutegulo seguido da remodelagem tecidual (MORAN

VIELE 2005)

Este processo de formaccedilatildeo do coaacutegulo pode ocorrer por vias intriacutensecas e

extriacutensecas (Figura 9) que conduzem a conversatildeo de protrombina agrave trombina que

por sua vez leva o fibrinogecircnio a monocircmeros de fibrina formando um poliacutemero

insoluacutevel (GOPINATH 2008)

42

FIGURA 9 ndash Via intriacutenseca e extriacutenseca da cascata de coagulaccedilatildeo Fonte OrsquoRiordan amp

Higgins (2003)

Esse processo pode ser iniciado pela exposiccedilatildeo do sangue a fatores

teciduais que satildeo encontrados em ceacutelulas extravasculares ao redor dos vasos

sanguiacuteneos possibilitando um mecanismo raacutepido de selamento da injuacuteria e

integridade vascular (ESMON 2004) ou por ativaccedilatildeo de fatores de contato do

plasma os quais conduzem respectivamente a via extriacutenseca e intriacutenseca e as

duas vias terminam com a geraccedilatildeo da fibrina (ISKANDER CHENG 1999)

Reis (2003) mostraram que o processo de hemostasia eacute resultante do

equiliacutebrio entre proacute-coagulantes e anticoagulantes envolvendo vasos plaquetas

proteiacutenas da coagulaccedilatildeo e da fibrinoacutelise e anticoagulantes naturais Todos estes

componentes satildeo inter-relacionados e constituintes dos sistemas de coagulaccedilatildeo

anticoagulaccedilatildeo e fibrinoacutelise

Aleacutem disso como mencionado anteriormente existe correlaccedilatildeo entre este

processo com a inflamaccedilatildeo pois os mediadores inflamatoacuterios podem aumentar a

43

quantidade e a reatividade das plaquetas regular negativamente mecanismos

anticoagulantes naturais iniciar o sistema de coagulaccedilatildeo e facilitar a propagaccedilatildeo da

resposta coagulante A coagulaccedilatildeo por sua vez pode aumentar a resposta

inflamatoacuteria atraveacutes da liberaccedilatildeo de mediadores de plaquetas e da ativaccedilatildeo de

ceacutelulas promovendo a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e aumentado a resposta inflamatoacuteria

(ESMON 2004) A Figura 10 mostra o impacto da inflamaccedilatildeo nesse processo

FIGURA 10 ndash Efeitos da inflamaccedilatildeo no sistema de coagulaccedilatildeo mostrando o impacto de mediadores

inflamatoacuterios na regulaccedilatildeo da coagulaccedilatildeofonte Adaptado de Esmon (2004)

Entretanto a coagulaccedilatildeo tambeacutem pode estar envolvida com a formaccedilatildeo de

novos vasos sanguiacuteneos pois a ativaccedilatildeo da cascata da coagulaccedilatildeo culmina na

geraccedilatildeo de trombina e formaccedilatildeo de fibrina e ambas as substacircncias apresentaram

efeitos que auxiliam no crescimento e disseminaccedilatildeo neoplaacutesicos (SHOJI et al

1998)

Levando em consideraccedilatildeo as fucanas Grauffel et al (1989) demonstraram

que esses polissacariacutedeos sulfatados impedem a accedilatildeo de trombina sobre o

fibrinogecircnio de forma mais eficaz do que a heparina um polissacariacutedeo animal da

famiacutelia dos glicosaminoglicanos sulfatados que possui atividade anticoagulante

Nesse contexto Dore et al (2012) revelaram o potencial anticoagulante de

polissacariacutedeos sulfatados extraidos da alga marrom Sargassum vulgare entretanto

a accedilatildeo anticoagulante se restringiu a via intriacutenseca da coagulaccedilatildeo A literatura relata

44

que peso molecular ramificaccedilotildees densidade de cargas e estrutura tridimensional de

polissacariacutedeos sulfatados influencia nas suas interaccedilotildees com as proteiacutenas da

coagulaccedilatildeo sanguiacutenea (OLSON BJORK BOCK 2002) sendo assim o estudo

dessa atividade torna-se de grande interesse

Diante disso o estudo de compostos bioativos extraiacutedos de algas marinhas eacute

de relevante interesse Nessas perspectivas o uso de uma fraccedilatildeo rica em

polissacariacutedeos sulfatados extraiacutedos da alga marrom Lobophora variegata justifica-

se pela abundancia desta alga na costa norte-riograndense e pelos polissacariacutedeos

da fraccedilatildeo rica em fucana 08 (FRF 08) natildeo terem sido estudados quanto agrave

diversidade de accedilotildees farmacoloacutegicas

45

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVO GERAL

Caracterizar fiacutesico-quimicamente e analisar os efeitos das fucanas extraiacutedas da

alga marrom Lobophora variegata em atividades famacoloacutegicas

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

a) Extrair uma fraccedilatildeo rica em fucanas com acetona (FRF 08) da alga L

variegata

b) Caracterizar fiacutesico-quimicamente este polissacariacutedeo atraveacutes de dosagens

quiacutemicas (de accediluacutecares totais proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais)

eletroforese em gel de agarose espectroscopias de infravermelho e

ressonancia magneacutetica nuclear e cromatografia descendente em papel

c) Avaliar o potencial farmacoloacutegico da FRF 08 na Viabilidade Celular no

Processo Inflamatoacuterio na Hepatotoxicicidade na Angiogecircnese no

Estresse oxidativo e na Coagulaccedilatildeo Sanguiacutenea

46

3 MATERIAIS

31 MATERIAIS BIOLOacuteGICOS

311 ALGAS

A alga Lobophora variegata (JVLamouroux) (Figura 11) utilizada para os

experimentos foi coletada na praia de Buacutezios localizado no municiacutepio de Niacutesia

Floresta ndash RN devido a sua abundacircncia nessa regiatildeo durante periacuteodos de baixa

mareacute Posteriormente foi catalogada e identificada no Departamento de

Oceanografia e Limnologia da UFRN

O material em estudo apresenta a seguinte classificaccedilatildeo taxonocircmica

FIGURA 11 ndash Fotografia da Alga Marrom Lobophora variegata

312 ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar obtidos no bioteacuterio do

Departamento de Bioquiacutemica da UFRN com aproximadamente 60 dias de vida

pesando entre 180 e 220 g Todos os animais usados foram mantidos em gaiolas

individuais submetidos a raccedilatildeo e aacutegua ad libitum em condiccedilotildees controladas de

47

iluminaccedilatildeo (ciclo 12 horas claroescuro) e temperatura (23 degC) Todos os ensaios in

vivo passaram por aprovaccedilatildeo do comitecirc de eacutetica para uso de animais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN protocolo Nordm

0482011)

32 MATERIAIS QUIacuteMICOS E APARELHOS

Acetona Aacutecido sulfuacuterico (cromato produtos quiacutemicos SP) aacutecido fosfoacuterico

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Aacutecido 2-tiobarbituacuterico 98

(Sigma Aldrich Saint Louis MO USA) Aacutecido ascoacuterbico 99 (Sigma

Aldrich USA) Aacutelcool 70 Agarose Condrointin Sulfato Dermatan

Sulfato Heparan Sulfato Aacutecido tricloroaceacutetico (VETEC RJ Brasil)

Carbonato de soacutedio (VETEC RJ Brasil) Cloreto de soacutedio (VETEC RJ

Brasil) Carragenana kappa (Sigma Aldrich USA) Cloreto de ferro

(cromato produtos quiacutemicos SP Brasil) Cloridrato de naftiletilenodiamino

(Sigma Aldrich USA)

Etanol (Cromoline SP Brasil) Espironolacona EDTA (Cromoline SP

Brasil) Fenol Hidroacutexido de Soacutedio

Aacutecido Cloridrico Aacutecido Gaacutelico Diamino propano acetato (PDA) Aacutecido

Aceacutetico Azul de Toluidina Brometo de Potaacutessio (KBr) Cetavlon (CTV)

Acetato de Etila Piridina Nitrato de Prta Tiosulfato de soacutedio Fosfato de

Potaacutessio Brometo de Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-

dihifrocloreto

Placas de Culturas (BD) meios de cultura antibioacuteticos

Ampolas de vidro fogareiro eleacutetrico

Albumina α-tocoferol Coomassie Blue R Bacto Gelatina Brometo de

Haxadecaciltrimetil amocircnio O-dianisidina-dihifrocloreto Fucose Xilose

Galactose Manose Arabnose Aacutecido Glucurocircnico Glicose (Sigma Aldrich

Saint Louis MO USA)

Parafina Hematoxilina e Eosina (HampE) Formol (10)

Tetracloreto de carbono PA (Merck Darmstadt Germany) azeite de oliva

extravirgem (Gallo) Pentobarbital soacutedico

48

Ferrozina (Sigma Aldrich USA) Fosfato de Soacutedio Monobaacutesico (Nuclear

SP Brasil) Ferricianeto de Potaacutessio (Sigma Aldrich USA)110 ndash

Fenantrolina (Sigma Aldrich USA)

Heparina (Disotronreg Aristron) Hidroxitolueno butilado (BHT)

Molibdatdo de Amocircnio MTT (Sigma Aldrich USA)

Nitrito de soacutedio (Cromoline SP Brasil)

Peroacutexido de hidrogecircnio NaCl (Cromato produtos quiacutemicos SP Brasil)

PBS

Reagente de Folin-ciocaulteau

Sulfanilamida (Sigma Aldrich USA) Sulfato Ferroso (Cromoline SP

Brasil) Salina (soluccedilatildeo preparada em laboratoacuterio com NaCl 09 )

Kits comerciais para avaliaccedilatildeo bioquiacutemica

o Bilirrubinas ALT AST e ƴ-GT (Analisa)

o PT e aPTT (Labtest)

Aleacutem dos aparelhos usuais de laboratoacuterio podemos destacar

Agitador orbital mod 255-B da FANEM Ltda (Satildeo Paulo SP Brasil)

Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda (Satildeo Paulo

SP Brasil)

Bombas peristaacutelticas Microperpex S mod 2232 da LKB (Bromma Sueacutecia)

Centriacutefuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co Ltd (Toacutequio Japatildeo)

Espectrocircmetro de infravermelho modelo MB 104 da ABB Bomem

(Canadaacute)

Espectrocircmetro de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear modelo DRX 400 da

Bruker (EUA)

Medidor de pH Orion Research model 701 A digital lonalyzer (Cambridge

MA EUA)

Microacutetomo modelo 820 da American Optical Company (New York EUA)

Coagulocircmetro - CLOT DRAKE TIMER DIGITAL

Leitor de Placas - Leitora para ELISA seacuterie Expert Plus Biochrom (SP

Brasil)

Incubadora de CO2

49

4 MEacuteTODOS

41 EXTRACcedilAtildeO DA FRACcedilAcircO RICA EM FUCANAS 08 (FRF 08)

A alga utilizada neste estudo foi coletada limpa e seca em estufa a 45ordmC Em

seguida trituradas e submetidas a trecircs delipidaccedilotildees com trecircs volumes de acetona

durante 6 h para retirada de contaminantes lipiacutedicos e polifenoacutelicos Apoacutes este

procedimento a acetona foi descartada e o material obtido (poacute cetocircnico) foi seco a

temperatura ambiente

Cerca de 30 g de poacute cetocircnico (tecido seco) foi suspenso com 5 volumes de

NaCl 025 M (pH 80 ndash ajustado com NaOH) e submetido a proteoacutelise com 20 mg de

Maxatase uma protease alcalina de Esporobacillus (Biobraacutes Montes Claros MG

Brasil) Subsequentemente incubou-se por 24 h a 60 degC sob agitaccedilatildeo e ajustes

perioacutedicos do pH Ao final da proteoacutelise apoacutes a filtraccedilatildeo da mistura o filtrado obtido

foi precipitado com 10 volume de acetona em banho de gelo sob suave agitaccedilatildeo a

4 ordm C e deixada em repouso nesta temperatura por 24 h O precipitado formado foi

coletado por centrifugaccedilatildeo a 10000 x g por 10 min seco agrave vaacutecuo e ressuspenso em

aguaacute destilada descartando-se o precipitado enquanto que ao sobrenadante foi

adicionado 08 volumes de acetona (calculado a partir da soluccedilatildeo inicial)

precipitando os polissacarideos e obtendo uma fraccedilatildeo rica em fucana nomeada

(FRF08) de acordo com o volume de acetona utilizado (SILVA et al 2005) A FRF

08 foi caracterizada e utilizada nos ensaios farmacoloacutegicos (Figura 12)

Figura 12 ndash Esquema do Processo de Extraccedilatildeo da FRF 08 da alga Lobophora variegata

50

42 CARACTERIZACcedilAtildeO FISIacuteCO-QUIacuteMICA

421 DOSAGEM DE ACcedilUacuteCARES TOTAIS

A quantificaccedilatildeo dos accediluacutecares totais da FRF 08 foi realizada pelo meacutetodo do

fenolaacutecido sulfuacuterico de acordo com Dubois et al (1956) empregando-se como

monossacariacutedeo padratildeo L-fucose As leituras foram realizadas a 490 nm

422 DOSAGEM DE PROTEIacuteNAS TOTAIS

O conteuacutedo de proteiacutena da FRF 08 foi determinado com o reagente de

Coomassie Blue R segundo o meacutetodo de Spector (1978) e a leitura foi realizada a

595 nm empregando-se como padratildeo albumina de soro bovina

423 DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total foi determinado apoacutes hidroacutelise aacutecida (HCl 6N 6 h

100ordmC) por turbidimetria pelo meacutetodo da gelatina-baacuterio (Dodgson amp Price 1962) O

sulfato de soacutedio (1 mgmL) foi utilizado como padratildeo sendo submetido agraves mesmas

condiccedilotildees da amostra em estudo (FRF 08)

424 DOSAGEM DE FENOacuteIS TOTAIS

O conteuacutedo fenoacutelico total da FRF 08 em estudo foi determinado com o

reagente de FolinndashCiocalteu a partir do meacutetodo de Wolfe Wu e Liu (2003) com

algumas modificaccedilotildees Adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu (50 vv) em 05

mL da FRF 08 e incubou-se a soluccedilatildeo por 5 minutos a temperatura ambiente Em

seguida adicionou-se NaCO3 (7 pv) Incubou-se novamente por 30 min agrave 40 ordmC e

a leitura foi feita em espectrofotocircmetro a 765 nm A concentraccedilatildeo de compostos

fenoacutelicos totais na fraccedilatildeo polissacariacutedica da alga foi determinada como mg de

51

equivalente aacutecido gaacutelicomg de material seco tendo como paracircmetro uma curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico

425 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose (06) foi diluiacuteda em tampatildeo 13 diaminopropano acetato (PDA)

005 M e pH 90 Posteriormente foi colocado sobre lacircmina de vidro (75x 50x

02cm) ateacute o resfriamento e formaccedilatildeo do gel Aliacutequotas de 5 μl (50 μg da FRF 08 e

marcadores de corrida de glicosaminoglicanos - CS condroitin sulfato DS dermatan

sulfato e HS heparan sulfato) foram aplicadas no gel e submetidas agrave corrida

eletroforeacutetica (5 Vcm durante 1 h) A origem das aplicaccedilotildees corresponde ao poacutelo

negativo (Dietrich e Dietrich 1977) Apoacutes o tempo previsto de migraccedilatildeo eletroforeacutetica

para o sistema de tampatildeo PDA os compostos foram precipitados no gel de agarose

pela sua submersatildeo da lacircmina por um tempo miacutenimo de 2h a temperatura ambiente

em CETAVLON 01 (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamocircnio) O gel foi seco sob

uma corrente contiacutenua de ar quente e corado com azul de toluidina 01 numa

soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 1 e etanol 50 onde o excesso de corante foi removido

em soluccedilatildeo descorante uma soluccedilatildeo preparada a partir de aacutecido aceacutetico 1 em

etanol 50 A etapa de descoloraccedilatildeo do gel de agarose foi entatildeo repetida ateacute que o

fundo da lacircmina descora-se completamente Em seguida o gel foi entatildeo seco a

temperatura ambiente

426 ESPECTROSCOPIA DO INFRAVERMELHO (IR)

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectrofotocircmetro FT-IR

ABB Bomem modelo MB 104 de 4000 a 400 cm-1 Os polissacariacutedeos da FRF 08 (5

mg) foram analisados apoacutes secagem sob a forma de pastilha de KBr Realizado no

Departamento de Quiacutemica da UFRN

52

427 ESPECTROSCOPIA DE RESSONAcircNCIA MAGNEacuteTICA NUCLEAR (RMN)

O espectro da ressonacircncia magneacutetica nuclear (RMN) de 13C e 1H da FRF 08

foi obtido a partir da utilizaccedilatildeo de um espectrofotocircmetro (aparelho de NMR da marca

Bruker modelo DRX 400) em frequumlecircncia de 500 MHz com amostras dissolvidas em

D2O O deslocamentos quiacutemicos dos carbonos e hidrogecircnios dos aneacuteis glicosiacutedicos

satildeo expressos em ppm (δ) Realizado no Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e

Inorgacircnica da UFC pelo laboratoacuterio de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear

(CENAUREMN)

428 CROMATOGRAFIA DESCENDENTE EM PAPEL

Efetuou-se hidroacutelise da FRF 08 em soluccedilatildeo contendo HCl 2N por 2 horas a

100degC em ampolas de vidro Posteriormente realizou-se a neutralizaccedilatildeo

ressuspendendo a soluccedilatildeo com aacutegua destilada e secando no destilador

procedimento repetido trecircs vezes Depois a amostra (100 μg) e os padrotildees (10 μg)

foram aplicados em papel Whatman Ndeg1 Os padrotildees utilizados compreendem

xilose galactose aacutecido glucuronico fucose arabinose e glicose

A FRF 08 foi submetida agrave cromatografia descendente em papel utilizando o

solvente butanol piridina aacutegua na proporccedilatildeo de 2315 vvv por 18h Apoacutes este

processo os monossacariacutedeos foram detectados pelo poder redutor apoacutes a reaccedilatildeo

com o reagente de prata alcalina (TREVELYAN PROCTER HARRISON 1977)

43 VIABILIDADE CELULAR

A viabilidade celular foi realizada usando o ensaio do MTT de acordo com

metodologia de Mossman (1983) Linhagens de ceacutelulas 3T3 (fibroblastos murinos) e

HepG2 (human liver hepatocellular carcinoma) submetidas a incubaccedilatildeo com a FRF

08

O experimento foi efetuado em placa de 96 poccedilos com uma densidade de

3X104 ceacutelulas por poccedilo usando meio DMEM A FRF 08 em diferentes

concentraccedilotildees (25 50 e 100 microgmL) foi adicionada ao meio durante o periacuteodo de 24

53

horas para 3T3 e HepG2 a 37degC em estufa com atmosfera de CO2 a 5 Apoacutes

incubaccedilatildeo a soluccedilatildeo de MTT foi adicionada e depois de nova incubaccedilatildeo os cristais

de formazam (metaboacutelito do MTT) foram dissolvidos em etanol e efetuado a leitura

da absorbacircncia em leitor de ELISA no comprimento de onda de 540 nm

44 ATIVIDADES IN VIVO

As concentraccedilotildees usadas nos testes in vivo deste trabalho foram

selecionadas de acordo com o modelo estudo utilizado seguindo um perfil

semelhante ao da literatura

441 INDUCcedilAtildeO DA INFLAMACcedilAtildeO

4411 Edema da pata induzido por carragenana

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=5) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de soluccedilatildeo salina 09 ) No tempo de 30

min apoacutes o tratamento o edema foi induzido atraveacutes da aplicaccedilatildeo de 01 mL de

carragenana a 1 em soluccedilatildeo salina na regiatildeo sub-plantar da pata dianteira

esquerda dos ratos A variaccedilatildeo da espessura da pata foi aferida 30 minutos antes e

1 a 4 horas depois da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo com a utilizaccedilatildeo de paquiacutemetro digital

(WINTER RISLEY NUSS 1962) Por fim os animais foram eutanasiados A

inibiccedilatildeo do edema foi expressa tendo como paracircmetro o volume da pata dos

controles

4412 Atividade da Mieloperoxidase (MPO)

A MPO foi extraiacuteda de tecidos homogeneizados da pata induzida a

inflamaccedilatildeo por suspensatildeo em 1 mL de 05 (pv) de brometo

hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e em 50 mM de tampatildeo fosfato de potaacutessio (pH 60)

54

apoacutes sonicaccedilatildeo em um banho de gelo por 10 segundos A suspensatildeo foi

centrifugada a 40000 g por 15 mim a 4degC e o sobrenadante utilizado para o ensaio

sendo 01 mL deste misturado com 29 mL de tampatildeo fosfato (50 mM pH 60)

contendo 0167 mgmL de o-dianisidina dihidrocloreto e peroacutexido de hidrogecircnio A

anaacutelise da atividade foi feita a 460 nm em leitor de ELISA lendo 3 vezes a cada 30

segundos A atividade da MPO foi definida como a quantidade de enzima

degradando 1 micromol de peroacutexidomin a 37degC As unidades de MPO foram calculadas

considerando que 1 U MPO= a degradaccedilatildeo de 1 micromol de H2O2 levando a mudanccedila

na absorbacircncia de 113 x 10-2 nmmin (LI et al 2009)

442 DANO HEPAacuteTICO

4421 Hepatotoxicidade induzida por tetracloreto de carbono (CCl4)

Ratos da linhagem Wistar com 2 meses de idade foram anestesiados

divididos em 5 grupos iguais (n=6) e tratados com diferentes doses da FRF 08 (25

50 e 75 mgkg de peso animal em 1 mL de aacutegua destilada) Foi utilizado o meacutetodo

modificado de Zafar e Ali (1998) tendo este experimento a duraccedilatildeo de 3 dias

experimento 1ordm dia houve o preacute-tratamento (po) no 2ordm dia aleacutem do preacute-tratamento

houve a induccedilatildeo do dano hepaacutetico com tetracloreto de carbono (2 mLkg peso

animal diluiacutedo em azeite de oliva 11 sc) nos grupos controle positivo e testes e

no 3ordm dia houve coleta sanguiacutenea para a anaacutelise dos teores de bilirrubina total (BT)

direta (BD) e indireta (BI) alanina amino transferase (ALT) aspartato

aminotransferase (AST) e γ-glutamil transferase (γ-GT) atraveacutes de kits dessa forma

os animais foram anestesiados com quetamina (50) e xilazina (2) para esse

procedimento (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008)

Posteriormente foi feita a eutanaacutesia dos animais com uma superdosagem de

barbituacuterico ip (MANUAL DE UTILIZACcedilAtildeO DE ANIMAISFIOCRUZ 2008) para a

retirada de tecido hepaacutetico para anaacutelise histotoloacutegica no qual se utilizou como

criteacuterio a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito fibrose perivascular dilataccedilatildeo de

capilares e acuacutemulo de gordura

Os grupos controle positivo e negativo foram preacute-tratados com salina 09

apenas o controle positivo recebeu CCl4 diluido em azeite de oliva enquanto que no

55

controle negativo foi administrado somente o veiacuteculo (2 mLkg) Jaacute o terceiro quarto

e quinto grupos foram preacute-tratado com a FRF 08 nas doses de 25 50 e 75 mgkg e

estes trecircs grupos teste receberam CCl4 diluiacutedo em azeite (11)

4422 Anaacutelises histoloacutegicas das lacircminas hepaacuteticas

O tecido hepaacutetico empregado no estudo histoloacutegico foi coletado apoacutes a

eutanaacutesia dos ratos submetidos ao dano hepaacutetico induzido por CCl4 O oacutergatildeo foi

lavado em aacutegua corrente e seco para a posterior fixaccedilatildeo do material

A soluccedilatildeo fixadora foi feita com formol e aacutegua (19) e o tecido ficou embebido

nesta soluccedilatildeo por cerca de 30 horas Apoacutes a fixaccedilatildeo as amostras foram submetidas

agraves teacutecnicas rotineiras de desidrataccedilatildeo inclusatildeo em parafina e corte em microacutetomo

comum para a obtenccedilatildeo dos cortes histoloacutegicos para que a estrutura do tecido

hepaacutetico pudesse ser analisada atraveacutes da microscopia oacuteptica

A etapa da teacutecnica de coloraccedilatildeo foi feita apoacutes os cortes estarem montados em

lacircminas desparafinados e hidratados No qual foi usado como corante a

Hematoxilina e Eosina - HampE (PROPHET et al 1992) uma teacutecnica para coloraccedilatildeo

de ceacutelulas em geral que cora nuacutecleo em azul e citoplasma em rosa-avermelhado

Apoacutes esta etapa foi colocada uma lamiacutenula

4423 Tempo de sono induzido por pentobarbital soacutedico

Para verificar a possibilidade da influecircncia do sistema enzimaacutetico do

citocromo-P450 a FRF 08 foi testada no tempo de sono induzido por pentobarbital

soacutedico O teste foi realizado em ratos machos (n=5) que foram privados de comida

20h antes do experimento e tratados da seguinte forma grupo 1 foi tratado com

salina (10 mLkg ip) e grupos 2 e 3 receberam a FRF 08 nas doses de 50 e 75

mgkg ip respectivamente 2 h antes da administraccedilatildeo do pentobarbital soacutedico (40

mgkg ip) e a duraccedilatildeo do sono (min) em cada animal foi observada O tempo de

sono foi registrado como o periacuteodo apoacutes a perda do reflexo de endireitamento e a

recuperaccedilatildeo enquanto que o tempo de latecircncia foi o periacuteodo entre a administraccedilatildeo

do pentobarbital e o adormecimento dos animais (DARIAS et al 1998)

56

443 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

A atividade de induccedilatildeo da angiogecircnese foi avaliada a partir do meacutetodo da

Atividade da Membrana Corioalantoica (MCA) segundo Deocaris (2005) com

algumas modificaccedilotildees

A superfiacutecie dos ovos assim como todos os instrumentos (pinccedila cabo e

lacircminas) foram desinfetados com aacutelcool 70 O experimento se procedeu em 7

dias onde os ovos foram mantidos em incubadora a 37 degC No quarto dia 5 mL de

albumina foi aspirado No sexto dia um orifiacutecio de 15 cm2 foi aberto para a inserccedilatildeo

da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (10 100 e 1000 microgmL) em soluccedilatildeo de

agarose 25 (150 microL) sobre a membrana corioalantoica (MCA) assim como dos

controles (negativo e positivo) Como controle positivo (indutor da angiogecircnese) foi

usado a heparina e como controle negativo (inibidor da angiogecircnese) foi utilizado a

fenantrolina e a espironolactona na concentraccedilatildeo de 10 μgmL A agarose foi

utilizada como branco Esta abertura foi fechada e a incubaccedilatildeo continuou ateacute o

seacutetimo dia

As zonas neovasculares da MCA foram fotografadas analisadas e os

resultados expressos a partir de mensuraccedilatildeo por escore (Tabela 2) tendo como

paracircmetros para pontuaccedilatildeo a aacuterea do disco e a quantidade de neo-vasos

(BURGERMEISTER et al 2002)

Tabela 2 Escore para a atividade proangiogecircnica de FRF 08 na MCA

Valor do escore Efeito observado

0= Efeito antiangiogecircnico Natildeo visualizaccedilatildeo de aacutereas vasculares na

regiatildeo do disco ou em suas adjacecircncias 05 - 1 = Efeito angiogecircnico fraco a meacutedio Aacutereas com presenccedila de capilares

1 = Efeito angiogecircnico meacutedio Aumento na densidade de capilares efeito

este natildeo maior que o dobro da area do disco

2= Forte efeito angiogecircnico O dobro ou mais da aacuterea em torno do disco

com presenccedila de capilares

Fonte BURGERMEISTER et al (2002)

57

45 ATIVIDADES IN VITRO

451 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes da FRF 08 foram desenvolvidas em triplicata nas

concentraccedilotildees de 062 125 25 5 e 10 mgmL usando o aacutecido ascoacuterbico como

padratildeo antioxidante Tais concentraccedilotildees foram escolhidas de acordo com a literatura

e apitadas por padronizaccedilotildees realizadas em nosso laboratoacuterio

4511 Atividade Antioxidante Total

Aliacutequotas da soluccedilatildeo da FRF 08 (nas concentraccedilotildees acima estabelecidas)

foram misturadas com 1 mL da soluccedilatildeo reagente (06 M de aacutecido sulfuacuterico 28 mM

fosfato de soacutedio e molibdato de amocircnio 4 mM) Os tubos foram incubados a 95 degC

por 90 min e apoacutes o resfriamento a absorbacircncia foi determinada em comprimento de

onda maacuteximo de 695 nm (PIETRO PINEDA AGUILAR 1999) A capacidade

antioxidante total foi expressa em equivalecircncia ao aacutecido ascoacuterbico

4512 Quelaccedilatildeo do Ferro

A Atividade Quelante de Ferro (Fe2+) foi desenvolvida a partir do meacutetodo de

Saltarelli et al (2009) com algumas modificaccedilotildees Uma soluccedilatildeo contendo a FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) 2 mM de sulfato de ferro (FeSO4) e 5mM de

ferrosina foi incubada por 20 minutos a temperatura ambiente (RT) Posteriormente

foi adicionado aacutegua para completar o volume final de 2 mL O resultado foi

mensurado em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 562 nm

Para verificar a taxa de quelaccedilatildeo utiliza-se a seguinte foacutermula (QIAO et al

2009)

Taxa de quelaccedilatildeo () = [A0 ndash (A1 ndash A2)]A0 times 100 onde A0 eacute a absorbacircncia

do controle (aacutegua substituindo o extrato polissacariacutedico) A1 eacute a absorbacircncia do

sistema com a amostra e A2 eacute absorbacircncia do sistema em condiccedilotildees idecircnticas a A1

com aacutegua substituindo o FeSO4

58

4513 Poder Redutor

O poder redutor foi determinado como descrito por Yen e Chen (1995) com

algumas modificaccedilotildees Resumidamente FRF 08 (nas concentraccedilotildees estabelecidas)

foi adicionada em tampatildeo fosfato (02 M pH 66) e em seguida misturadas com

ferricianeto de potaacutessio (1 pv) e incubado a 50 degC por 20 min Posteriormente

0125 mL de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) (10 pv) foi adicionado agrave mistura para

parar a reaccedilatildeo Entatildeo a soluccedilatildeo foi misturada com cloreto feacuterrico (01 pv) e a

absorbacircncia foi mensurada a 700 nm

4514 Inibiccedilatildeo dos Radicais Hidroxila

O ensaio de sequumlestro do radical hidroxila (OH) foi desenvolvido a partir do

meacutetodo de Smirnoff e Cumbes (1989) com algumas modificaccedilotildees

O procedimento se deu com a mistura de 05 mL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) com 05 mL de aacutegua destilada PBS (20 mM pH 74)

e fenantrolina (25 mM) em etanol (99) A reaccedilatildeo foi iniciada com a inserccedilatildeo de

05 mL de sulfato de ferro e peroacutexido de hidrogecircnio (20 mM) Seguiu-se com a

incubaccedilatildeo a 37 degC por 90 minutos

A anaacutelise da reaccedilatildeo foi feita em espectrofotocircmetro no comprimento de onda

de 536 nm Para obter a taxa de inibiccedilatildeo () utilizou-se a seguinte foacutermula

Taxa de inibiccedilatildeo ()= 1 - ( Abs1 Abs2) times 100 onde Abs1 eacute a absorbacircncia

obtida da reaccedilatildeo com a fraccedilatildeo total polissacariacutedica e Abs2 a absorbacircncia da reaccedilatildeo

em que aacutegua destilada substitui o peroacutexido de hidrogecircnio

4515 Varredura do Peroacutexido

A atividade de varredura de peroacutexido foi mensurada de acordo com o meacutetodo

modificado de Smirnoff e Cumbes (1989) Os radicais peroacutexidos foram gerados

atraveacutes da mistura de FeSO4 e H2O2 A mistura reagente continha 1 mL de FeSO4

(15 mM) H2O2 (6 mM) salicilato de soacutedio (20 mM) e 100 microL da FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) ou do padratildeo antioxidante Apoacutes incubar por 1h em 37

59

ordmC a absorbacircncia do complexo salicilato hidroxilado foi mensurado em 562 nm A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = [1 ndash (A1 ndash A2) A0] times

100 onde A0 eacute a absorbacircncia do controle (sem extrato da FRF 08 ou padratildeo) A1 eacute

a absorbacircncia incluindo o extrato ou padrotildees e A2 eacute a absorbacircncia sem o salicilato

de soacutedio

4516 Varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio

A atividade de varredura do Peroacutexido de Hidrogecircnio foi mensurada de acordo

com o meacutetodo de Zhao et al (2006) modificado H2O2 (01 mM) e 100 microL da FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) e do padratildeo antioxidante foram misturados com

10 microL de molibidato de amocircnio (3) H2SO4 (2 M) e KI (18 M) A soluccedilatildeo foi

misturada e titulada com Na2S2O3 (5 mM) ateacute a coloraccedilatildeo amarela desaparecer A

porcentagem do efeito da varredura eacute calculada como

Atividade de varredura do peroacutexido de hidrogecircnio () = (V0 - V1 V0) times 100

onde V0 eacute o volume da soluccedilatildeo de Na2S2O3 usada para tratar a mostra controle na

presenccedila de peroacutexido de hidrogecircnio (sem extrato) V1 eacute o volume da soluccedilatildeo de

Na2S2O3 misturado com os extratos de FRF 08 ou padratildeo antioxidante

4517 DPPH

Para a anaacutelise da inibiccedilatildeo do radical DPPH foi incubado 01 mL de FRF 08

(nas concentraccedilotildees estabelecidas) com uma soluccedilatildeo etanoacutelica de DDPH (01 mM)

por 30 min a RT Seguiu-se com a anaacutelise da variaccedilatildeo da densidade oacuteptica em 517

nm O grupo controle consistiu da anaacutelise do DPPH mais veiacuteculo e o branco eacute o

composto teste em soluccedilatildeo com veiacuteculo Foi utilizada a foacutermula [1- (Aamostra-

Abranco)Acontrole] times 100 para obtenccedilatildeo da porcentagem de inibiccedilatildeo de formaccedilatildeo do

radical DPPH (YE et al 2008)

60

4518 Sequestro do Radical Superoacutexido

Os radicais superoacutexidos (ZHOU ZHENG 1991) foram gerados em 3 mL de

tris-HCl (16mM pH 80) que continham 78 mM de NADH (forma reduzida) 50 mM

de Nitroblue Tetrazolium (NBT) 10 mM de metasulfato de fenazina e FRF 08 (nas

concentraccedilotildees estabelecidas) A reaccedilatildeo de cor dos radicais superoacutexidos e NBTfoi

detectada por monitoramento da absorbacircncia a 560 nm O controle natildeo tinha NADH

e ele foi substituiacutedo pelo tris-HCl A capacidade de sequestro do radical superoacutexido

pela FRF 08 foi calculada pela seguinte equaccedilatildeo

Taxa de inibiccedilatildeo () = 1 ndash (Aamostra 560nmAcontrole 560 nm) times 100

4519 Inibiccedilatildeo de Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica

A inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi determinada pela quantificaccedilatildeo de

peroacutexido de lipiacutedio produto de decomposiccedilatildeo de MDA baseado na reaccedilatildeo de aacutecido

tiobarbituacuterico usando gema de ovo como substrato oxidaacutevel Em suma homogenato

de ovo (10 vv em PBS pH 74) e 05 mL de FRF 08 (nas concentraccedilotildees

estabelecidas) foram misturados depois 005 mL de FeSO4 foi adicionado para

ativar a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica Apoacutes incubar por 30 min 15 mL de TCA 20 (pv) e

15 mL de aacutecido tiobarbituacuterico 08 (pv) foram adicionados e a mistura resultante foi

aquecida a 95 degC por 15 min e centrifugada agrave 2000 g por 10 min A absorbacircncia do

sobrenadante foi determinada em comprimento de onda maacuteximo de 532 nm

(ZHANG amp YU 1997) A inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi calculada como se

segue Taxa de inibiccedilatildeo () = [1 - (Aamostra ndash Abranco da amostra)Acontrole] times 100 onde

Acontrole eacute a absorccedilatildeo do grupo de controle no sistema de geraccedilatildeo de radicais

hidroxila Aamostra a absorccedilatildeo da amostra do grupo teste e Abranco da amostra eacute a

absorbacircncia somente da amostra O α-tocoferol foi utilizado com padratildeo

452 ATIVIDADES ANTICOAGULANTES

As atividades anticoagulantes de Tempo de tromboplastina parcialmente

ativada (aPTT) e Tempo de protrobina (PT) foram realizadas por meio dos reagentes

61

de aPTT e PT de kits comerciais (Labtest SP - Brasil) para a anaacutelise da accedilatildeo da

FRF 08 no sistemas intriacutenseco e extriacutenseco respectivamente da cascata de

coagulaccedilatildeo As anaacutelises seratildeo feitas por meio da utilizaccedilatildeo de coagulocircmetro As

concentraccedilotildees (de 312 625 125 25 e 50 μgμL) usadas neste estudo foram

determinadas atraveacutes da literatura adaptada por uma varredura feita em nosso

laboratoacuterio

46 ANAacuteLISES ESTATIacuteSTICAS

As Anaacutelises Estatiacutesticas deste trabalho mostra os resultados expressos como

meacutedia plusmn EPM Para anaacutelises dos dados utilizou-se o meacutetodo de variacircncia ANOVA

seguida do teste de Tukey-Kramer para diferenccedila entre os grupos de tratamento e

controles adotando-se p lt0005 como significante

62

5 RESULTADOS

51 EXTRACcedilAtildeO E CARACTERIZACcedilAtildeO FIacuteSICO-QUIacuteMICA DOS

POLISSACARIacuteDEOS DA ALGA PARDA LOBOPHORA VARIEGATA

O processo de extraccedilatildeo dos polissacariacutedeos sulfatados da alga L variegata

foi realizado de acordo com a metodologia descrita levando-se em consideraccedilatildeo que

este estudo aplica a combinaccedilatildeo da metodologia envolvendo a proteoacutelise a partir de

enzimas tais como maxatase e precipitaccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees de

acetona (03 05 08 1 15 A fraccedilatildeo usada em nosso estudo foi o polissacariacutedeo

com 08 volume de acetona (FRF)

As dosagens quiacutemicas permitiram a verificaccedilatildeo dos teores de accediluacutecares totais

proteiacutenas totais sulfato e fenoacuteis totais

Tais resultados conforme mostra a Tabela 3 revelam altos teores de

carboidratos (4891plusmn 089) baixa contaminaccedilatildeo proteica (08plusmn 003) altos teores

de sulfatos (3411 plusmn 001) e baixos teores fenoacutelicos de 000001 mg mg de aacutecido

gaacutelico (valor tatildeo baixo que foi considerado insignificante)

Tabela 3 Dosagens Quiacutemicas de Accediluacutecares Totais Proteiacutenas totais Sulfato e Fenoacuteis

Totais da FRF 08

Dosagens Quiacutemicas Valor (expresso em 1 ou

2 mgmg de aacutecido gaacutelico)

Accediluacutecares totais 1a

4891 plusmn 089

Proteiacutenas totais 1b

08 plusmn 003

Sulfato 1c

3411 plusmn 001

Fenoacuteis Totais 2d

000001 mgmg de aacutecido gaacutelico

a Meacutetodo de acordo com Dubois Gilles Hamilton Rebers amp Smith (1956)

b Meacutetodo de acordo com

Spector (1978) c Meacutetodo de acordo com Dodgson amp Price (1962)

d Meacutetodo de acordo com Wolfe Wu

e Liu (2003) Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM

A eletroforese em gel de agarose da FRF 08 permitiu observar um padratildeo

polidisperso para a FRF 08 (5 μL da amostra em estudo numa concentraccedilatildeo de 10

mgmL) Este resultado eacute mostrado na Figura 13 no qual os glicosaminoglicanos

(CS condroitin sulfato DS dermatan sulfato e HS heparan sulfato) foram usados

como marcadores de corrida

63

FIGURA 13 ndash Eletroforese em gel de agarose da FRF 08 O L corresponde a FRF 08 e P indica os

polissacariacutedeos usados como marcadores da corrida (CS DS e HS)

Dessa forma foi verificado que a FRF 08 teve mobilidade ateacute o marcador DS

apresentando dessa forma polidispersatildeo entre os marcadores de HS e DS A

presenccedila da metacromasia quando corado frente ao azul de toluidina serviu para

indicar a presenccedila de sulfato nessa fraccedilatildeo dado este condizente com a dosagem de

sulfato referida anteriormente

A espectroscopia do Infravermelho (IR) foi realizada (Figura 14) para

identificar a presenccedila de alguns grupos funcionais permitindo verificar algumas

bandas importantes caracteriacutesticas da fucana

Dessa forma foi verificada a presenccedila das bandas em 3414 2925 1619

1423 1261 1037 e 832 como picos importantes pois estes satildeo respectivamente

indicativos de hidroxilas (OH) grupamento metil (C-H) carboxila (COOH) carboxila

(COOH) sulfatos (S=O) carbonila (C=O) e sulfato em posiccedilatildeo axial (C-O-S sulfato

axial secundaacuterio)

CS DS HS

64

FIGURA 14 ndash Infravermelho da FRF 08 da alga marrom L variegata Valores expresso em

percentagem de transmitacircncia (eixo Y) e nuacutemero de onda cm-1

(eixo X)

3414 = OH

2925 = C-H 1619 = COOH

1423 = COOH

1261 = S=O 1037 = C=O

832 = C-O-S

65

A Espectroscopia de Ressonacircncia Magneacutetica Nuclear (RMN) do 1H (Figura

15) e do 13C (Figura 16) tambeacutem foram realizadas

FIGURA 15 ndash RMN do 1H da FRF 08 da alga L variegata Picos expresso em ppm

O espectro de RMN de 1H (Figura 15) da FRF 08 apresentou picos

caracteriacutesticos de unidades de α-L-fucose Os proacutetons anomeacutericos do polissacariacutedeo

satildeo observados na regiatildeo 50 Sinais do grupo metil (CH3) da fucose foram obtidos

na regiatildeo de 174 (H6 menor) e na regiatildeo 145 (H6 maior) O sinal em 48

corresponde a β-D-xilose e 431 eacute atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-

4 Outros picos como os em 58 eacute indicativo do H1 enquanto que os 456 442 e

407 correspondentes a H2 H5 e H4 respectivamente formam o anel de proacutetons

58 (H1)

H

H

50 (proacutetons

anomeacutericos)

48 (β-D-xilose)

456 (H2)

442 (H5)

407 (H4)

174 (CH3 proacutetons H6 (menor) da fucose)

145 (H6 (maior) 1-3 ligado)

431 (Proacutetons de

Galactose ou Metil em

CH4)

Anel de proacutetons (H2-H5)

341-491

66

FIGURA 16 ndash RMN do

13C da FRF 08 da alga L variegata A Espectro (DEPT) B RMN do

13C

Picos expresso em ppm

A RMN de 13C (Figura 16) confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero

estudado Sendo assim o Espectro (DEPT) na Figura 16 A diferencia os grupos

CH CH2 e CH3 Na FRF 08 em estudo observa-se um dos DEPT a 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e a 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose Enquanto que a RMN de 13C (Figura 16 B) mostrou picos caracteriacutesticos em

866 (C-2) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo a 13 fucose e sinais em 823 e 687

confirmando unidades de szlig-D-galactose O pico em 773 corresponde ao (C-3) e em

182 ao (C-6) da fucose

Ademais foi realizada a cromatografia descente de papel (Figura 17) e a sua

anaacutelise permitiu verificar a presenccedila de alguns monossacariacutedeos tais como resiacuteduos

de fucose glicose xilose e galactose

625 (CH2 da

galactose)

182 (C-6) correspondente ao

CH3 da fucose

A

B

67

FIGURA 17 ndash Cromatografia descendente em Papel Retacircngulo roxo indica a FRF 08 de L variegata e o

restante da figura corresponde aos monossacariacutedeos padrotildees (1Xilose 2 Galactose 3 Aacutecido

Glucurocircnico 4 Fucose 5 Arabnose 6 Manose 7 Glicose) A seta preta indica o sentido da corrida

52 ATIVIDADES FARMACOLOacuteGICAS

521 VIABILIDADE CELULAR

O ensaio de viabilidade celular foi realizado para verificar se a FRF 08

apresentava toxicidade para as ceacutelulas normais ou tumorais ou se a FRF 08

mantinha a viabilidade dessas ceacutelulas estaacutevel Este ensaio eacute muito importante pois

como o objetivo do trabalho foi de verificar atividades farmacoloacutegicas eacute interessante

verificar o seu perfil numa ceacutelula para averiguar a possibilidade de manipulaccedilatildeo de

um faacutermaco

Nesse sentido a FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees (25 50 e 100 μgmL)

foi incubada com as ceacutelulas das linhagens 3T3 (fibroblastos murino) e Hep G2

(carcinoma hepatocelular) por um periacuteodo de 24 horas (Figura 18)

Analisando a linhagem de fibroblastos empregada verificou-se que com a

concentraccedilatildeo de 25 μgmL e 50 μgmL a taxa de viabilidade celular natildeo apresentou

diferenccedila estatiacutestica com relaccedilatildeo ao controle Resultados que revelam que a FRF

08 com estas concentraccedilotildees manteacutem uma taxa de viabilidade celular significativa e

portanto uma baixa toxicidade para ceacutelulas normais A concentraccedilatildeo de 100 μgmL

apresentou uma taxa de viabilidade celular de 845plusmn09 (plt 005)

1 2 3

4

5

6

7

FRF 08

O

R

I

G

E

M

68

FIGURA 18 ndash Viabilidade da FRF 08 Anaacutelise do efeito da FRF 08 em diferentes concentraccedilotildees na

viabilidade de ceacutelulas da linhagem 3T3 e Hep G2 no periacuteodo de 24 horas Os dados foram expressos

em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle (DMEM) Observado

significacircncia em plt 005 (3T3) e plt 001 (Hep G2)

A FRF 08 quando incubada com a linhagem celular Hep G2 apresentou na

concentraccedilatildeo de 25 μgmL uma viabilidade de 5425plusmn0226 (p lt 001)

demonstrando que essa concentraccedilatildeo seria toacutexica para a viabilidade dessa linhagem

celular de carcinoma hepaacutetico Para as concentraccedilatildeo de 50 e 100 μgmL natildeo foi

observada diferenccedila em relaccedilatildeo ao controle indicando que com estas

concentraccedilotildees a manutenccedilatildeo da taxa de viabilidade celular estaacutevel denotando uma

baixa toxicidade para ceacutelulas hepaacuteticas ao contraacuterio da concentraccedilatildeo anterior que

apresentava um perfil toacutexico

53 ATIVIDADE ANTINFLAMATOacuteRIA

A possiacutevel atividade antinflamatoacuteria da FRF 08 foi analisada atraveacutes do

modelo de induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo aguda induzido por carragenana (edema de pata)

e pela inibiccedilatildeo da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

69

531 EDEMA DA PATA INDUZIDO POR CARRAGENANA

A FRF 08 apresentou significante atividade antinflamatoacuteria no modelo de

edema de pata nas trecircs diferentes doses testadas (25 50 e 75 mgkg) Uma forte

atividade antiedematosa foi verificada com a reduccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura da

pata frente ao controle positivo desde a primeira hora sendo intensificado nas

horas subsequentes Esses dados podem ser observados na Figura 19

FIGURA 19 ndash Edema de Pata Anaacutelise da inibiccedilatildeo da variaccedilatildeo da espessura do edema de pata induzido por ҡ-carragenana pela FRF 08 em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo ao controle positivo (carragenana) Significante em plt 005 plt 001 plt 001 O tempo 0 horas foi o momento da induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo

Dessa forma foi visto que na quarta hora de atividade houve uma restauraccedilatildeo

as condiccedilotildees normais no qual o perfil apresentado foi semelhante ao do controle

negativo (grupo sem induccedilatildeo do processo inflamatoacuterio) Posteriormente a taxa de

inibiccedilatildeo do edema plantar (Figura 20) foi calculada tendo como paracircmetro o controle

positivo Os resultados mostraram que todas as doses testadas inibiram

significantemente o edema

70

FIGURA 20 ndash Taxa de inibiccedilatildeo do edema plantar induzido por carragenana FRF 08 da alga L variegata foi testada em diferentes doses Os dados foram expressos em meacutedia plusmn EPM em com plt 005 considerado significante em relaccedilatildeo a porcentagem do controle positivo (carragenana)

A dose de 25 mgkg inibiu em 891plusmn100 o edema na quarta hora de

experimento sendo este valor de 911plusmn71 e 1000plusmn14 para as doses de 50

mgkg e 75 mgkg respectivamente Sendo assim a FRF 08 apresentou uma

significante atividade antiedematosa Os resultados desta atividade mostram ser

tempo dependente No entanto o perfil das diferentes concentraccedilotildees FRF 08

apresentou ausecircncia de dose-dependecircncia jaacute que natildeo houve diferenccedila estatiacutestica

entre os valores

532 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO)

A mieloperoxidase (MPO) estaacute associada com formaccedilatildeo de espeacutecies reativas

de oxigecircnio e oxidaccedilatildeo de membranas estando elevadas em condiccedilotildees

inflamatoacuterias Sendo assim a atividade de MPO foi verificada e apresentou nas trecircs

doses testadas da FRF 08 uma significante atividade inibidora da enzima

mieloperoxidase (Figura 21)

71

FIGURA 21 ndash Atividade Inibidora da Mieloperoxidase (MPO) Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 em diferentes doses Valores expresso em Unidade de MPO mg de proteiacutena meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

Esses resultados mostram que todas as concentraccedilotildees reduziram

significativamente (p lt 0001) a MPO As concentraccedilotildees de 25 50 e 75 mgkg

apresentaram uma atividade de 00013 plusmn 00 00012 plusmn 00005 e 00015 plusmn 00005

respectivamente sem diferenccedila estatiacutestica entre si Sendo assim os resultados

obtidos se mostraram significativos para a inibiccedilatildeo desta enzima inflamatoacuteria uma

vez que a taxa de inibiccedilatildeo dos grupos testes apresentou-se semelhante ao controle

negativo e isso corrobora para o excelente resultado obtido na inibiccedilatildeo do edema de

pata

54 HEPATOPROTECcedilAtildeO

A possiacutevel accedilatildeo hepatoprotetora da FRF 08 foi verificada atraveacutes do modelo

de induccedilatildeo de hepatotoxicidade por tetracloreto de carbono (CCl4) seguido das

dosagens de bilirrubinas e enzimaacuteticas bem como da anaacutelise histoloacutegica dos

fiacutegados A inibiccedilatildeo do complexo enzimaacutetico CYP tambeacutem pode ser um indicativo de

hepatoproteccedilatildeo pois o CYP estaacute associado com a biotransformaccedilatildeo de compostos

em intermediaacuterios reativos altamente instaacuteveis e danosos

72

541 HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR TETRACLORETO DE CARBONO

(CCL4)

Analisando atividade hepatoprotetora das fucanas sulfatadas em diferentes

doses foi verificada a accedilatildeo da FRF 08 a partir de dosagens dos teores de bilirrubina

(Figura 22) e das enzimas ALT AST e γ-GT (Figura 23) realizados atraveacutes kits

Essas dosagens foram efetuadas porque em caso de dano hepaacutetico essas

substacircncias se elevam no plasma servindo como paracircmetro de lesotildees hepaacuteticas

FIGURA 22 ndash Dosagem de Bilirrubina Anaacutelise da accedilatildeo de FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos de Bilirrubina Total (BT) Direta (BD) e Indireta (BI) Expresso em concentraccedilatildeo (mgdL) meacutedia plusmn EPM considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A anaacutelise dos dados permitiu verificar que frente ao controle positivo

empregando as doses de 25 50 e 75 mgkg houve reduccedilatildeo da dosagem de

bilirrubina total em 2327 5248 e 6881 respectivamente Na bilirrubina direta

essas mesmas doses reduziram este modulador hepaacutetico respectivamente em

5294 6471 e 7059 quando comparadas ao controle positivo Um perfil

semelhante foi encontrado na bilirrubina indireta que frente ao controle positivo teve

reduccedilatildeo de 1325 4834 e 6821 para as respetivas doses de 25 50 e 75

73

mgkg Dessa forma os melhores resultados foram obtidos com a maior dose

testada (75 mgkg) e um perfil dose-dependente ficou demonstrado Devido aos

valores dos melhores resultados se aproximarem do controle negativo pode-se

inferir que houve restauraccedilatildeo das condiccedilotildees proacuteximas agraves normais

Em continuidade as dosagens enzimaacuteticas (Figura 23) de ALT AST e γ-GT

foram realizadas pois estes paracircmetros de lesatildeo hepatocelular se encontram

elevadas quando ocorre injuacuteria no fiacutegado

FIGURA 23 ndash Dosagens Enzimaacuteticas de ALT AST e γ-GT Anaacutelise da FRF 08 da alga L variegata em diferentes doses nos niacuteveis seacutericos das enzimas (ALT AST e γ-GT) Expresso em concentraccedilatildeo (UmL) meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o controle positivo (C+) Significante em plt 0001

A dosagem enzimaacutetica mostrou que a ALT nas concentraccedilotildees de 25 50 e 75

mgkg respectivamente diminuiu em 7021 7214 e 7693 em relaccedilatildeo ao

controle positivo A AST apresentou com as mesmas doses reduccedilotildees de 1955

3257 e 4458 frente ao grupo controle positivo O γ-GT nas doses de 25 50 e

75 mgkg apresentou uma diminuiccedilatildeo de 20 30 e 50 respetivamente em

relaccedilatildeo ao controle positivo Resultados esses que mostram um perfil semelhante ao

anterior pois a maior dose testada (75 mgkg) apresentou melhor reduccedilatildeo nos niacuteveis

seacutericos de todas as enzimas testadas e um perfil dose dependente

Nessa perspectiva para uma anaacutelise mais precisa foram verificadas lacircminas

histoloacutegicas do tecido hepaacutetico (Figura 24) que tambeacutem serve como paracircmetro de

anaacutelise de dano tecidual

74

FIGURA 24 ndash Anaacutelise Histoloacutegica hepaacutetica A Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos natildeo submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Negativo B Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) Controle Positivo C Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 25 mgkg FRF 08 25 mgkg D Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 50 mgkg FRF 08 50 mgkg E Cortes histoloacutegicos de fiacutegado de ratos submetidos agrave hepatotoxicidade com tetracloreto de carbono (CCl4) e tratado com FRF 08 na dose de 75 mgkg FRF 08 75 mgkg Seta vermelha Indica a integridade do nuacutecleo do hepatoacutecito Seta Preta Indica a integridade do ducto biliar Seta amarela Indica a dilataccedilatildeo do capilar Seta rosa Indica o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras citoplasmaacuteticas Seta verde Indica morte celular Corado com HampE Aumento 40 X 10

A B

C D

E

75

Os resultados encontrados nessas lacircminas confirmam o efeito hepatoprotetor

dos poliacutemeros de carboidrato da FRF 08 podendo ser visualizados na Figura 24

Essa figura mostrou alguns paracircmetros para verificar o estado do tecido hepaacutetico

como integridade do nuacutecleo espessura dos capilares e acuacutemulo de gordura que

apresentam papel na fibrose hepaacutetica patoloacutegica Tais resultados servem para

indicar intensidade do dano comprovando se houve ou natildeo proteccedilatildeo

Na Figura 24 A observa-se que o tecido encontrava-se integro apresentando

integridade nuclear (seta vermelha) um ducto biliar com ausecircncia de fibrose

perivascular (seta preta) e ausecircncia de vesiacuteculas lipiacutedicas citoplasmaacuteticas e

capilares com dilataccedilatildeo normal Isso condiz com um tecido sadio caracteriacutestico do

controle negativo que natildeo teve o fiacutegado submetido a lesatildeo hepaacutetica induzida por

tetracloreto de carbono (CCl4) Na seccedilatildeo B pode-se verificar um tecido lesionado

apresentando como caracteriacutesticas o acuacutemulo de vesiacuteculas de gorduras (seta rosa)

assim como capilares bem dilatados (seta amarela) e morte celular (seta verde) que

mostra o efeito citotoacutexico do composto indutor da hepatotoxicidade nas ceacutelulas

hepaacuteticas

Na Figura 24 C D e E temos os animais submetidos agrave hepatotoxicidade com

CCl4 e tratados respectivamente com 25 50 e 75 mgkg por peso corpoacutereo no qual

foi vistos progressiva hepatoproteccedilatildeo com o aumento da concentraccedilatildeo de fucanas

sulfatadas e estas permitiram a diminuiccedilatildeo do tamanho das vesiacuteculas de gorduras

(seta rosa) assim como reduziram a dilataccedilatildeo dos capilares (seta amarela) no qual a

maior concentraccedilatildeo restaurou as condiccedilotildees normais quando comparado ao controle

negativo (natildeo submetido ao dano hepaacutetico) E esses dados confirmam um potente

efeito hepatoprotetor da FRF 08

542 TEMPO DE SONO INDUZIDO POR PENTOBARBITAL SOacuteDICO

Os resultados que mostram a influecircncia da FRF 08 o tempo de sono e tempo

de latecircncia (Figura 25)

76

FIGURA 25 ndash Tempo de Sono e Tempo de Latecircncia Estudo da accedilatildeo da FRF 08 da alga L variegata

em diferentes doses no tempo de sono e de latecircncia de animais tratados com pentobarbital soacutedico

Expresso em meacutedia plusmn EPM Considerado significante quando plt005 quando comparado com o

controle Significante em plt 0001

Os resultados mostraram que a FRF 08 nas doses de 50 e 75 mgkg

aumentaram o tempo de sono em 546 (126 plusmn 23 min) e 361 (111 plusmn 11 min)

respectivamente em relaccedilatildeo ao controle (815 plusmn 63 min) Tais resultados

demonstram a reduccedilatildeo no tempo de latecircncia de 7134 (113 plusmn 013 min com 50

mgkg) e 4286 (216 plusmn 025 min com 70 mgkg) quando comparado com o controle

positivo (35 plusmn 05 min) Esse conjunto de resultados mostram uma possiacutevel accedilatildeo

destes polissacariacutedeos na inibiccedilatildeo da enzima CYP 450

55 ATIVIDADE DE INDUCcedilAtildeO DE ANGIOGEcircNESE

No ensaio de angiogecircnese (Figura 26) realizado foi analisado o perfil da FRF

08 em relaccedilatildeo a proliferaccedilatildeo de vasos E todas as concentraccedilotildees da FRF 08

apresentaram um perfil proacute-angiogecircnico assim como a heparina (controle positivo)

77

FIGURA 26 ndash Atividade Angiogecircnica d a FRF 08 da alga L variegata na membrana corioalantoica de ovos galinaacuteceos fertilizados A Agarose (Branco) B Heparina C Espirolactona D Fenantrolina E FRF 08 001 mg F FRF 08 01 mg G FRF 08 1 mg

Esses resultados foram analisados no Image J para verificar a do disco de

agarose e suas adjacecircncias dados estes permitiram identificar o perfil angiogecircnico

da amostra em diferentes concentraccedilotildees (Figura 27)

FIGURA 27 ndash Atividade Angiogecircnica de FRF 08 Os resultados foram obtidos por meio de pontuaccedilatildeo

tendo como paracircmetro a quantidade de vasos na regiatildeo de aplicaccedilatildeo do disco de agarose

56 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES

As atividades antioxidantes realizadas nesse estudo satildeo mostradas na Tabela

4

A B C D

E F G

FRF 08 (mgovo)

78

Tabela 4 ndash Atividades Antioxidantes da FRF 08

Concentraccedilatildeo (mgmL)

062 125 25 5 10

Poder Redutor Relativo ao Aacutecido Ascoacuterbico ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 4956plusmn018 5042plusmn007 5212plusmn001 5649plusmn079 6287plusmn014

Varredura do Radical Superoacutexido ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 5562plusmn210 5213plusmn210 4186plusmn226 3566plusmn130 2984plusmn079

Inibiccedilatildeo Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 10015plusmn001 10025plusmn0002 10145plusmn001 10925plusmn155 12905plusmn005

Atividade Antioxidante Total ao Aacutecido Ascoacuterbico (mgmL)

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 075plusmn0002 117plusmn0003 186plusmn0001 305plusmn004 486plusmn0002

Quelaccedilatildeo de Ferro()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 658plusmn017 1195plusmn073 2494plusmn0001 2748plusmn147 2829plusmn130

Varredura de DPPH ()

Atividade (meacutedia plusmn EPM) 1868plusmn101 2285plusmn017 2472plusmn056 2564plusmn028 2639plusmn020

Inibiccedilatildeo do Radical Hidroxila ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

4184plusmn0001 5217plusmn0005 3672plusmn006 3372plusmn0005 2216plusmn0002

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

4359plusmn001 6279plusmn005 4184plusmn0001 3793plusmn001 2927plusmn004

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

7147plusmn269 9560plusmn005 8841plusmn406 8362 5822

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8399plusmn583 10514plusmn067 10695plusmn037 10265plusmn749 10960plusmn007

Inibiccedilatildeo do Peroacutexido de Hidrogecircnio ()

Atividade da FRF 08

(meacutedia plusmn EPM)

6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001 6190plusmn0001

Atividade do Aacutecido

Ascoacuterbico (meacutedia plusmn EPM)

8095plusmn0002 9048plusmn003 9524plusmn0005 100plusmn0002 100plusmn0003

Esses resultados revelam que a Atividade Antioxidante Total da FRF 08 teve

uma atividade equivalente agrave atividade do Aacutecido Ascoacuterbico de 075 plusmn 0002 mgmL na

concentraccedilatildeo de 062 mgmL Portanto percebeu-se uma forte accedilatildeo antioxidante

79

total com uma significante atividade relativa ao aacutecido ascoacuterbico apresentando

assim potencial atividade antioxidante

A Quelaccedilatildeo Feacuterrica mostrou um fraco poder de quelaccedilatildeo do ferro (2829 plusmn

13 (concentraccedilatildeo de 10 mgmL)

O poder redutor que mostra a capacidade de compostos em reduzir o iacuteon

ferroso de Fe3+ a Fe2+ Observou-se que na concentraccedilatildeo de 10 mgmL uma

atividade de 6287 plusmn 014 equivalente ao Aacutecido Ascoacuterbico

A inibiccedilatildeo dos radicais hidroxila foi outra atividade realizada Essa atividade

mostrou que a concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou uma forte taxa de inibiccedilatildeo

de radicais hidroxila (627 plusmn 33) tendo como o padratildeo o Aacutecido Ascoacuterbico que na

mesma concentraccedilatildeo apresentou uma atividade de 521 plusmn 02

A varredura do peroacutexido que na concentraccedilatildeo de 125 mgmL apresentou

uma forte taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido (956 plusmn 005 ) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade 1051 plusmn 067

Dessa forma a varredura do peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem foi analisada e na

mesma concentraccedilatildeo dos dois resultados anteriores (125 mgmL) houve uma forte

taxa de inibiccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio (619 plusmn 62) com o padratildeo Aacutecido

Ascoacuterbico na mesma concentraccedilatildeo apresentando uma atividade de 9047 plusmn 09

Ademais foi feito o ensaio antioxidante de DPPH desenvolvida com o radical

DPPH ao qual possui um proacuteton radical livre apresentando uma absorccedilatildeo

caracteriacutestica ao comprimento de onda de 517 nm com coloraccedilatildeo roxa mudando de

cor sob accedilatildeo de antioxidantes E a FRF 08 mostraram inibir o radical DPPH (263 plusmn

02 com 1 mgmL) com um perfil concentraccedilatildeo dependente

Atividade de sequestro do radical superoacutexido foi analisada e observou-se

significante inibiccedilatildeo do acircnion superoacutexido na menor concentraccedilatildeo das fucanas

testada (5562 plusmn 21 com 062 mgmL)

O ensaio de inibiccedilatildeo de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica tambeacutem foi realizado e a menor

concentraccedilatildeo testada (062 mgmL) foi capaz de inibir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em

100

80

57 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE Uma vez que as fucanas podem apresentar atividade anticoagulante

resolvemos entatildeo verificar a atividade da FRF 08 sobre as vias de coagulaccedilatildeo

realizando os testes de aPTT e PT (Figura 28)

FIGURA 28 ndash Atividades anticoagulantes Anaacutelise do Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada (aPTT) e Tempo de Trombina (PT) da FRF 08 Valores expressos em meacutedia plusmn EPM

No ensaio de aPTT foi verificado um aumento no tempo de coagulaccedilatildeo frente

ao controle e um perfil dose dependente no qual a maior concentraccedilatildeo (50 μgμL)

teve uma atividade no tempo de 250 segundos sugerindo que esta concentraccedilatildeo

promoveu o aumento maacuteximo no tempo de coagulaccedilatildeo detectado pelo teste Isso

mostrou que a accedilatildeo anticoagulante ocorre na via intriacutenseca e comum da cascata de

coagulaccedilatildeo

Entretanto a alga estudada natildeo apresentou atividade para PT em nenhuma

das doses testadas indicando que a forma de accedilatildeo natildeo ocorre pela via extriacutenseca

da cascata de coagulaccedilatildeo

81

6 DISCUSSAtildeO

A acetona em diferentes concentraccedilotildees decresce a constante dieleacutetrica da

aacutegua promovendo diferentes populaccedilotildees de polissacariacutedeos sulfatados que

precipitam gradualmente (DORE et al 2012) A fraccedilatildeo obtida na concentraccedilatildeo de

acetona 08 (FRF 08) demonstrou altos teores de fucose e sulfato

As anaacutelises das dosagens quiacutemicas de accediluacutecares proteiacutenas sulfatos

compostos fenoacutelicos revelaram uma taxa de accediluacutecares totais de alta (4891 plusmn 089)

e baixo teor proteacuteico (08 plusmn 004) mostrando que o meacutetodo de extraccedilatildeo eacute eficiente

Aleacutem disso as anaacutelises mostraram uma significativa quantidade de sulfato (3411 plusmn

001) E um significante grau de sulfataccedilatildeo pode implicar em uma atividade

bioloacutegica significativa (Bezerra 2008) O teor de compostos fenoacutelicos foi tatildeo baixo

que natildeo pode influenciar nas atividades antioxidantes observada demonstrando que

a accedilatildeo redutora foi atribuiacuteda aos polissacariacutedeos sulfatados da FRF 08

A eletroforese em gel de agarose da fraccedilatildeo FRF 08 apresentou um padratildeo

polidisperso Estudos feitos em nosso laboratoacuterio mostraram que a polidispersatildeo

ocorreu em outras fraccedilotildees polissacariacutedicas de L variegata (03-15) comum em

polissacariacutedeos de algas A predominacircncia de fucanas na fraccedilatildeo FRF 08 seu

significativo grau de sulfataccedilatildeo e baixa polidispersatildeo foram detectados por este

meacutetodo (DIETRICH et al em 1995) A presenccedila de grupos sulfatos foi comprovada

pela metacromasia observada pela mudanccedila de coloraccedilatildeo do corante azul de

toluidina o qual apresentava a coloraccedilatildeo azul que se modificou para arroxeada

(BEZERRA 2008)

O IR mostrou que as bandas em 3414 e 2925 correspondentes a hidroxilas

(OH) e grupamento metil (C-H) das unidades de fucose respectivamente

(LIMA 2009) O pico assimeacutetrico em 1618 e o simeacutetrico em 1428 indicam a

presenccedila de grupos carboxilas na FRF 08 (MAO et al 2004) Enquanto que a

banda em 126099 refere-se a presenccedila de grupos sulfatos (S=O) caracteriacutesticos de

fucanas (KARMAKAR et al 2009 BERNARDI amp SPRINGER 1962) A banda

10369 eacute um sinal caracteriacutestico da presenccedila da carbonila (C=O) da funccedilatildeo orgacircnica

aldeiacutedo (BERNARDI amp SPRINGER 1962) Por fim um sulfato (CndashOndashS) adicional eacute

encontrado na banda de 832 indicando que esse grupo sulfato estaacute em posiccedilatildeo

axial (BILAN et al 2006) no carbono 4 da fucose (MARQUES 2007)

82

Na RMN do 1H foi verificado os proacutetons anomeacutericos na regiatildeo de 50 ppm

(Marques et al 2012) Segundo Pereira (1999) o sinal em 528 seria um indicativo

de H1 e em 174 mostra sinal intenso de metil (CH3) proacutetons H6 menor

(KARMAKAR 2009) Sinal do H6 maior (13-ligado) da fucose foi obtido na regiatildeo

145 (KARIYA et al 2004) O sinal em 48 corresponde a β-D-xilose e 431 eacute

atribuido aos proacutetons de galactose ou metil em C-4 (Marques et al 2012) O anel de

proacutetons (H2-H5) entre 341 e 491 pmm (KARMAKAR 2009) eacute formado pelos sinais

observados em 456 407 e 442 caracteriacutesticos de H2 (ALVES et al 1997) H4 e

H5 (VILELA-SILVA et al 1999) respectivamente

A RMN de 13C confirmou a presenccedila de fucose no poliacutemero estudado Sendo

assim o Espectro (DEPT) da FRF 08 em estudo mostrou sinais em 625 ppm

indicativo de ndashCH2 da galactose e em 182 ppm (C-6) correspondente a -CH3 da

fucose (MARQUES et al 2012) Enquanto que a RMN de 13C mostrou picos

caracteriacutesticos em 866 (C-2) (BILAN et al 2005) 841 ppm possivelmente atribuiacutedo

a 13 fucose e sinais em 823 e 687 confirmando unidades de szlig-D-galactose O

pico em 773 corresponde ao (C-3) e em 182 ao (C-6) da fucose (MARQUES et al

2012)

A pesquisa por polissacariacutedeos de origem natural vem sendo intensificada

nos uacuteltimos anos uma vez que estes apresentam accedilatildeo eficiente no processo

inflamatoacuterio sendo possivelmente potenciais substitutos de compostos com accedilotildees

diversas como os anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais ou AINES (SILVA et al 2005

SOSTRES et al 2010)

Sabe-se que a carragenana age induzindo a inflamaccedilatildeo de uma forma

bifaacutesica Na primeira fase ao qual se daacute na primeira hora ocorre a liberaccedilatildeo de

histaminas 5-hidroxitriptamina (5-HT) e bradicinina (NANTEL et al 1999) Anti-

inflamatoacuterios natildeo-esteroidais como indometacina e aspirina natildeo satildeo eficazes na

reduccedilatildeo do processo de inflamaccedilatildeo nessa fase A segunda fase ocorre no periacuteodo

de 1 a 6 horas apoacutes a induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo sendo esta correlacionada com altos

niacuteveis de prostaglandinas cicloxigenases induziacuteveis (COX-2) e infiltraccedilatildeo e ativaccedilatildeo

de neutroacutefilos no local de edema o que levaria a produccedilatildeo de espeacutecies reativas de

oxigecircnio e outros mediadores inflamatoacuterios como o NO Nesta fase inibidores como

a indometacina agem de forma predominante (SEIBERT et al 1994 ANANTHI et

al 2010) No modelo de inflamaccedilatildeo aguda a injeccedilatildeo de ҡ-carragenana na pata de