UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE ... · efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade ... camarão, apontam este glicosaminoglicano

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LAIS CRISTINA GUSMÃO FERREIRA PALHARES

UM DERMATAM SULFATO ANTITROMBÓTICO DO

CAMARÃO Litopenaeus vanammei INIBE A INFLAMAÇÃO

E ANGIOGÊNESE

NATAL

2016




E ANGIOGÊNESE

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Suely Ferreira Chavante

NATAL

2016

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Palhares, Lais Cristina Gusmão Ferreira. Um dermatam sulfato antitrombótico do camarão Litopenaeus vanammei inibe a inflamação e angiogênese / Lais Cristina Gusmão Ferreira Palhares. – Natal, RN, 2016. 72 f.: il.

Orientadora: Profa. Dra. Suely Ferreira Chavante. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em Bioquímica. 1. Trombose. – Dissertação. 2. Inflamação. – Dissertação. 3. Neovascularização. – Dissertação. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616-005.6




E ANGIOGÊNESE

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Suely Ferreira Chavante

Aprovado em: 29 de Março de 2016.

Dedico este trabalho

Ao meu pai, Raimundo Palhares. Porque o senhor merece uma página

só sua! O senhor nunca mediu esforços para que eu alcançasse todos os

sonhos, não importando o quão impossíveis pudessem parecer. Espero um dia

poder recompensar ao menos, um décimo do seu investimento em mim. Sem

seu apoio incondicional jamais estaria aqui realizando mais esta conquista. Te

amo mais que tudo.

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, Sônia Andrade, que apesar da distância, foi alguém fundamental em minha

educação e bem-estar, sempre me confortando nos meus momentos de angústia.

Às minhas avós, Thereza Gusmão (in memoriam) e Maria do Socorro, que sempre acreditaram

e torceram por mim.

Aos meus irmãos, Sérgio Vasconcelos e Anderson Palhares que estiveram sempre ao meu lado,

mesmo distantes, e cuidaram de mim como se fossem meus pais.

À minha imensa e linda família que sempre foram carinhosos comigo e torceram pelas minhas

conquistas.

À professora Suely Chavante, por ter me dado a oportunidade de seguir o caminho que escolhi

me dando sempre oportunidades e acreditando no meu potencial. Obrigada pelos conselhos e

principalmente, pelo aprendizado diário. A senhora tem sido mais que uma orientadora, mas também

uma mãe em muitos momentos.

À minha amiga/orientadora Adriana Brito, sem a qual este trabalho não teria evoluído

tanto. Obrigada pela companhia, pelas conversas e pelos ensinamentos. Quando crescer, quero ser

igual à você.

Às professoras Giulianna Paiva e Fernanda Wanderley, pelo apoio e os ensinamentos ao

longo destes anos.

À professora Helena Nader e Mauro Sérgio Pavão, os quais me receberam em seus

laboratórios de braços abertos, permitindo que eu realizasse os experimentos cruciais, que tanto

agregaram valor ao meu trabalho.

À Ana Katarina, pela ajuda e ensinamentos do dia-a-dia do laboratório.

À Hilton Macêdo, meu companheiro de todos os momentos ao longo desta jornada, sempre me

trazendo paz e afastando tudo de ruim e pesado. Sem você tudo teria sido mais difícil.

Aos meus “maridos” da vida, Raphael Serquiz e Jefferson Duarte, por estarem sempre ao meu

lado, na saúde e na doença, na alegria e na tristeza, literalmente! Vocês são a família que criei aqui.

Obrigada por tudo!

Ao meu “marido” do mestrado, Vinícius Campelo por dividir as horas mais árduas, mas

também as mais divertidas diante desta batalha. Obrigada por sempre ouvir os desabafos e me

aconselhar.

Aos meus companheiros de turma, pelas longas conversas filosóficas no Bar do Thomas, (em

especial Juliana Gabriela rsrs), pela companhia na hora do café e por ter terem feitos as aulas e

apresentações de seminários muito mais divertidas.

À equipe do GAGs, que pra mim parece mais uma família. À Isabela Bonfim e Ramayana

Brito pela ajuda incondicional e pela oportunidade também, de poder ensinar o pouco que sei. Às

novas alunas, por terem paciência com meu jeito e tornarem o ambiente do laboratório tão

harmonioso.

À minha amiga Andressa Lira, que mesmo longe, foi minha companheira nas farras e nas

tristezas.

Às minhas amigas-irmãs, Lívia Lima, Vanessa Nascimento e Carla Dornelas, que mesmo

estando longe sempre torceram por mim e se fizeram presentes em minha vida de alguma forma, me

confortando nos momentos que mais precisei. Vocês são um presente de Deus em minha vida.

Ao meu gato Ben, por me fazer companhia durantes as longas madrugadas de estudo e

escrita.

Aos alunos, demais professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN,

que sempre estiveram a postos para ajudar ou emprestar materiais e pelas conversas na copa.

Ao pessoal da Faculdade de Bioquímica Médica da UFRJ que me ajudaram a realizar os

experimentos que contribuíram para que meu trabalho se tornasse tão bonito. Vocês foram muito

receptivos e atenciosos comigo, me fazendo me sentir em casa.

Às demais pessoas não citadas que direta ou indiretamente contribuíram para a produção

deste trabalho.

“É melhor atirar-se à luta em busca de dias melhores, mesmo correndo o risco de perder tudo, do que permanecer estático, como os

pobres de espírito, que não lutam, mas também não vencem, que não conhecem a dor

da derrota, nem a glória de ressurgir dos escombros. Esses pobres de espírito, ao final

de sua jornada na Terra não agradecem a Deus por terem vivido, mas desculpam-se

perante Ele, por terem apenas passado pela vida.”

Bob Marley

RESUMO

A inflamação é composta de uma reação vascular e outra celular,

conferindo diferentes reações de tecidos e células, tanto do ambiente

intravascular, como o do ambiente extravascular. À medida que o processo

inflamatório ocorre, proteases da coagulação, em especial a trombina (FIIa),

são capazes de desencadear diversas respostas celulares na biologia vascular

e por isso, frequentemente é observada a ativação de outros sistemas

biológicos, levando à complicações durante um evento inflamatório, como a

trombose e a angiogênese. Assim, moléculas antagonistas desses eventos são

modelos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos anti-

inflamatórios. Neste contexto, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs), os

quais interagem com diversas proteínas envolvidas em processos biológicos

importantes, incluindo inflamação e coagulação. Por essa razão, o presente

trabalho teve por objetivo avaliar os potenciais anti-inflamatórios,

antitrombótico, antiangiogênico, bem como anticoagulante de GAGs do tipo

dermatam sulfato (DS) extraídos do cefalotórax do camarão Litopenaeus

vannamei. O composto foi obtido após proteólise e purificação por

cromatografia de troca-iônica. Após total digestão por liases que digerem

compostos tipo DS (condroitinase ABC), sua natureza do tipo DS foi revelada,

sendo então denominado DSL. O composto do camarão mostrou reduzido

efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade

anti-IIa, diretamente e via Cofator II da heparina. Sobre a inflamação, o

composto apresentou significativo efeito inibitório com redução de citocinas

pró-inflamatórias. Potenciais inibitórios foram relatados no ensaio

antitrombótico e antiangiogênico, sendo este último dose-dependente. Quanto

à atividade anti-hemostática, o polissacarídeo não induziu efeito hemorrágico

significativo. Assim, os resultados exibidos pelo composto tipo DS isolado do

camarão, apontam este glicosaminoglicano como alvo biotecnológico com

perspectivas para o desenvolvimento de novas drogas multipotentes.

Palavras chaves: Anti-inflamatório. Neovascularização. Trombose. Trombina.

Coagulação. Glicosaminoglicano.

ABSTRACT

Inflammation is combined of a vascular and a cellular reaction, resulting in

different cells and tissue responses, both the intravascular and extravascular

environment. As the inflammatory process occurs, coagulation proteases, in

particular thrombin (FIIa), are able to initiate various cellular responses in

vascular biology and therefore is often observed activation of other biological

systems, leading to complications during an event inflammatory, such as

thrombosis and angiogenesis. Thus, antagonists molecules of these events are

interesting models for the development of novel anti-inflammatory drugs.

Thereby, it is worth stressing the glycosaminoglycans (GAGs), which are able to

interact with several proteins involved in important biological processes,

including inflammation and coagulation. Therefore, this study aimed to evaluate

the anti-inflammatory, antithrombotic and anti-angiogenic potentials, as well

anticoagulant of a dermatan sulfate-like GAG (DS) extracted from the

Litopenaeus vannamei cephalotorax. The compound was obtained after

proteolysis and purification by ion-exchange chromatography. After total

digestion by DS-like compounds digesting lyases (chondroitinase ABC), the DS-

like nature was revealed, and then called DSL. The shrimp compound showed

reduced anticoagulant effect by the aPTT assay, but high anti-IIa activity,

directly and through heparin cofactor II. On inflammation, the compound had a

significant inhibitory effect with the reduction of proinflammatory cytokines.

Potential Inhibitory were reported in the antithrombotic and anti-angiogenic

assay, the latter being dose dependent. As for anti-hemostatic activity, the

polysaccharides did not induced significant bleeding effect. Thus, the results

shown by the shrimp DS-like compound indicate this glycosaminoglycan as a

biotechnology target with prospects for the development of new multipotent

drugs.

Key-words: Anti-inflammatory. Neovascularization. Thrombosis. Thrombin.

Coagulation. Glycosaminoglycan.

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AT Antitrombina

CS Condroitim 4 e 6 sulfato

D4ST1 Dermatan 4- O -sulfotransferase 1

DEAE Dietilaminoetil acetato

DS Dermatam sulfato

DS-epi1 Dermatam sulfato epimerase 1

DS-epi2 Dermatam sulfato epimerase 2

EGF Fator de crescimento endotelial

F-0,5 Fração obtida após precipitação com acetona na proporção

de 0,5:1


de 0,7:1


de 1,0:1


de 2,0:1

F-3,0M Fração 3,0 molar

FIIa Fator dois ativado

FT Fator tecidual

FVa Fator cinco ativado

FGF Fator de crescimento fibroblástico

FXa Fator dez ativado

TGF-β Fator de crescimento tumoral beta

GAGs Glicosaminoglicanos

Glc Glicosamina

GlcA Ácido Glicurônico

HCII Cofator II da heparina

Hep Heparina

HL Heparinoide

HS Heparam sulfato

IdoA Ácido idurônico

IL-6 Interleucina-6

IL-8 Interleucina-8

IFN- β lnterferon beta

MPP Metaloproteinase de matriz

MTT [3-(4,5- Di-metiltiazol-2-il)-2,5- brometo difenil- tetrazolio)]

NF-κB Fator nuclear- ĸappaB

PAR-1 Receptor de ativação de proteases um

PAR-2 Receptor de ativação de proteases dois

PCI Proteína C inibitória

PDA 1,3- diaminopropano acetato

PG Prostaglandina

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

TSP-1 Trombospondina um

TSP-2 Trombospondina dois

TTPa Tempo de tromboplastina parcial ativa

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

Δ Presença de insaturação entre C-4 e C-5 do resíduo de

ácido urônico

ΔU,2S-GalNS Dissacarídeo insaturado dissulfatado

ΔU,2S-GalNS,6S Dissacarídeo insaturado trissulfatados

ΔU-GalNAc Dissacarídeo insaturado N-acetilado

ΔU-GalNAc,6S Dissacarídeo insaturado N-acetilado-6-sulfato

ΔU-GalNS Dissacarídeo insaturado N-sulfatado

ΔU-GalNS,6S Dissacarídeos insaturado N,6-dissulfatado

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Recrutamento leucocitário e a participação de moléculas de

adesão e

quimiocinas......................................................................................

17

Figura 02 Respostas celulares mediadas através dos receptores PAR.................................................................................................. 22

Figura 03 Representação esquemática dos efeitos do sistema fisiológico anticoagulante e fibrinolítico na coagulação e inflamação........................................................................................

23

Figura 04 Estrutura típica de um Dermatam Sulfato e suas variações na sequência típica de unidade dissacarídica....................................................................................

28

Figura 05 Distribuição dos GAGs no reino animal..............................................................................................

30

Figura 06 Perfil eletroforético em sistema PDA dos compostos do camarão obtidos da F-1,0A por cromatografia de troca-iônica, em DEAE-Sephacel.......................................................................................... 42

Figura 07 A análise por cromatografia de troca aniônica HPLC dos dissacarídeos formados após digestão do DSL pela condroitinase ABC.................................................................................................. 43

Figura 08 Atividade anticoagulante dos compostos tipo DS e heparina, mensurados através do Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa).............................................................................................. 44

Figura 09 Atividade anti-IIa direta e mediada pelo Cofator II da heparina dos compostos tipo DS e heparina........................................................................................... 45

Figura 10 Atividade hemorrágica dos compostos tipo DS e heparina, mensurada pelo potencial de sangramento. ......................................................................................................... 46

Figura 11 Avaliação do efeito de compostos tipo DS sobre o recrutamento de células polimorfonucleares (PMN), em modelo de inflamação de peritonite induzida por LPS.............................................................. 47

Figura 12 Produção de IL-1β, IL-6 e TNF-α estimuladas por LPS em camundongos C57BL/6, após tratamento com compostos tipo DS, 4h após indução da inflamação........................................................................................

48

Figura 13 Atividade antitrombótica induzida por FeCl3 do composto tipo Dermatam sulfato obtido do camarão (DSL)................................................................................................ 49

Figura 14 Formação de estruturas capilares em matrigel após tratamento

com diferentes doses do composto do camarão ou na dose de

100 μg/mL da heparina....................................................................

50

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 16

2. OBJETIVO .................................................................................................. 34

2.1 Objetivo geral: ....................................................................................... 34

2.2 Objetivos específicos: ......................................................................... ..34

3. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 34

3.1 Animais e cultura de células ................................................................. 35

3.2 Extração de glicosaminoglicanos e purificação dos compostos tipo DS

do camarão L. vannamei............................................................................. 35

3.3 Eletroforese ........................................................................................... 36

3.4 Despolimerização enzimática ............................................................... 36

3.5 Determinação do peso molecular ......................................................... 37

3.6 Atividade anticoagulante ....................................................................... 37

3.7 Inibição da trombina (fator IIa) .............................................................. 37

3.8 Inibição da trombina pelo Cofator II da heparina (HCII) ........................ 38

3.9 Efeito residual hemorrágico .................................................................. 38

3.10 Ensaio de formação capilar em membrana basal reconstituída

(Matrigel) ..................................................................................................... 40

3.11 Análise estatística ............................................................................... 40

4. RESULTADOS ........................................................................................... 41

4.1 Purificação do composto tipo DS a partir do camarão L. Vannamei. .... 41

4.2 Degradação enzimática ........................................................................ 43

4.3 Atividade anticoagulante ....................................................................... 44

4.4 Atividade anti-IIa direta e mediada pelo Cofator II da Heparina (HCII) . 44

4.5 Atividade hemorrágica .......................................................................... 45

4.6 Ensaio de peritonite aguda induzida por LPS ....................................... 46

4.7 Dosagem de citocinas ........................................................................... 47

4.8 Atividade antitrombótica por modelo de trombose arterial induzida por

FeCl3 ........................................................................................................... 48

4.9 Ensaio de formação capilar de células endoteliais em matrigel ............ 49

5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 51

6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 60

7. REFERÊNCIAS .......................................................................................... 61

16 Introdução

INTRODUÇÃO

A inflamação é um dos principais fenômenos fisiopatológicos

apresentados por um organismo, podendo ser causada por agentes físicos,

químicos ou biológicos. Estes indutores são responsáveis pela determinação

da área danificada, complexidade da patologia e o tipo de resposta imunológica

desencadeada (CORDEIRO, et al., 2007). A inflamação é caracterizada pela

resposta de um organismo lesado ao agente agressor, na intenção de eliminar

o mesmo e devolver à região seu estado original. Este processo de proteção

desenvolvido é caracterizado pelo recrutamento do sistema de defesa afim de

que o agressor seja identificado pelo organismo e os processos de defesa

comecem a ser desenvolvidos (GOTTE, 2003).

A principal característica do processo inflamatório é o recrutamento e

ativação de leucócitos, especialmente os neutrófilos polimorfonucleares (PMN)

(XIE, 1991; SLUITER, 1993; LAROUX, 2000), com o intuito de destruir

elementos estranhos, além de reparo e remodelagem do tecido inflamado

(JOHNSON, 1992). Os neutrófilos são as primeiras linhas de defesa do

organismo frente à patógenos invasores, como bactérias, e constituem de 40-

60% da população de células leucocitárias (HASHIMOTO, 2009). Os neutrófilos

se tornam ativados basicamente por partículas provenientes de agentes

infecciosos, citocinas ou quimiocinas, que os mobilizam para o sítio de

inflamação, onde são expostos à estímulos que culminarão na eliminação do

patógeno (HALLETT, 1995). O recrutamento dos leucócitos ocorrem em várias

etapas que, incluem o rolamento, seguido pela forte adesão ao endotélio e

transmigração para os tecidos lesados (Fig. 1). Tal mecanismo é possibilitado

pela presença de moléculas de adesão, como os membros da famílias das

selectinas (P-, E- e L-selectinas) (SPRINGER, 1994). Dentro de minutos que a

célula recebe o sinal ativador, ocorre a mobilização de grânulos intracelulares

que possuem receptores pré-formados para a membrana plasmática,

aumentando o número destes receptores na superfície do leucócito

possibilitando a ligação às selectinas, iniciando o processo de rolamento ou

transmigração (LEY, 2007).

17 Introdução

Fig. 1: Processo de recrutamento leucocitário e a participação de moléculas de adesão e

quimiocinas.

Figura adaptada: Eric J. Kunkel & Eugene C. Butcher, 2008.

A resposta inflamatória pode ainda ser classificada quanto à sua

complexidade, em dois tipos: resposta aguda ou crônica, distinguindo uma da

outra por período de instalação da resposta, bem como características clínicas

e laboratoriais (CONSOLARO, 2010). A inflamação aguda tem como resposta

inicial a migração neutrofílica e a secreção de mediadores inflamatórios,

caracterizando-se como uma resposta rápida do organismo com a duração de

alguns minutos à dias. Outro aspecto importante da inflamação aguda é a

ocorrência de sinais físicos com maior intensidade, sendo evidente o

aparecimento de vermelhidão (rubor), aumento da temperatura (calor), edema

(exsudação de líquido intersticial), e também de dor, sendo a perda da função

influenciada pelo tamanho e tipo de lesão (SANTOS JÚNIOR, 2003). Porém,

apesar de ser um mecanismo de defesa, a inflamação pode ser prejudicial ao

organismo por reações de hipersensibilidade ou lesionar tecidos e órgãos de

18 Introdução

maneira progressiva e permanente, caracterizando uma inflamação crônica. A

inflamação crônica tem por definição, a duração prolongada, sendo essa

duração de semana ou meses, onde a inflamação, a eliminação do agressor e

do tecido adjacente e também a tentativa de reparação do local agredido

acontecem de forma conjunta (FEGHALI; WRIGHT, 1997). Esse tipo de

resposta envolve, diferentemente da inflamação aguda, linfócitos e macrófagos

e frequentemente leva à formação de fibrose e angiogênese.

Independentemente do tipo de resposta, este fino processo é

desencadeado e sustentado através da expressão e secreção de quimiocinas,

as quais direcionam os leucócitos para o sitio de injuria, além de citocinas,

prostaglandinas e radicais livres. Citocinas são pequenos peptídeos liberados

por células que possuem um efeito especifico na interação e comunicação

entre determinadas células, podendo agir diretamente sobre as células que as

secretaram (sinalização autócrina), sobre células próximas (sinalização

parácrina), ou ainda sobre células distantes (sinalização endócrina). (ZHANG;

JIANXIONG, 2007). As citocinas podem ser produzidas por diversas

populações celulares, porém seus produtores principais são os linfócitos T

auxiliares e macrófagos, podendo ser divididas em duas classes: citocinas pró-

inflamatórias, que vão atuar induzindo a liberação de mediadores inflamatórios

como liberação de radicais livres (ROS), além de ativar células efetoras que

participam da inflamação; e as citocinas anti-inflamatórias, moléculas

imunorregulatórias que, em contrapartida, são capazes de controlar as

respostas pró-inflamatórias (WIESELER-FRANK, 2004).

Dentre as citonas pró-inflamatórias, as mais abundantes em eventos

inflamatórios são as IL-1β, IL-6 e TNF-α, as quais são responsáveis por induzir:

quimiotaxia e adesão leucocitária, ROS e enzimas bactericidas, retardo

apoptótico leucocitário e ainda produção de outros mediadores inflamatórios

(WRIGHT, 2010). Essas três citocinas são frequentemente secretadas em

conjunto e apresentam efeitos muitas vezes redundantes. Porém, a IL-1 é a

citocina central na resposta inflamatória, a qual possui efeitos diretos sobre o

recrutamento neutrofílico, ativação de linfócitos e indução de outros

mediadores inflamatórios (DINARELLO, 2009). Tanto a IL-1β (forma

19 Introdução

secretada), como a IL-1α (forma expressa na membrana) sinalizam através do

receptor IL-1RI, presentes em uma variedade de células, induzindo a

expressão de um arranjo de genes pró-inflamatórios tais como IL-6, TNF-α, IL-

8, IL-17 e a própria IL-1 (MILLS; DUNNE, 2009). Além disso, IL-1β é capaz de

provocar os sintomas clássicos da inflamação como dor e febre, e sua

produção excessiva está diretamente relacionada aos episódios de febre e

inflamação sistêmica, em certas doenças autoinflamatórias, ligadas a mutações

em genes que regulam a imunidade inata, tais como a síndrome de Muckle-

Wells e gota. Esta última, é uma doença em que IL-1β é induzida pelos cristais

de urato, causando resposta inflamatórias nas articulações (MASTERS et al.,

2010).

Outra citocina pirogênica (causa febre) é a IL-6, a qual é capaz de

induzir proliferação e diferenciação de células T, bem como a diferenciação de

células B para células secretoras de anticorpos e a diferenciação de linhagens

celulares mielóides em macrófagos (HIRANO, 1998). Essa interleucina é

secretada por macrófagos e monócitos em resposta à outras citocinas como IL-

11 e TNF- α e durante a resposta aguda apresenta um papel central em

restaurar a função hepática, sendo um dos principais fatores estimulantes na

produção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos (MICHALOPOULOS,

2007). A IL-6 induz a transcrição de fatores envolvidos em múltiplas vias

inflamatórias e parece ter um desempenho ativo também na inflamação

crônica, uma vez que o aumento nos seus níveis parece favorecer a

susceptibilidade a diabetes mellitus e artrite reumatoide juvenil

(RABINOVITCH, 1998; SRIRANGAN, S. E CHOY, 2015).

Por fim, o TNF-α é também responsável pela ativação de linfócitos, além

da estimulação da liberação de enzimas proteolíticas pelos macrófagos e

produção de outras citocinas inflamatórias como a IL-6 e IL-13 (FALEIRO;

ARAUJO; VARAVALLO, 2011). Embora os macrófagos sejam a fonte primária

de TNF-α, uma ampla variedade de tipos de células, incluindo linfócitos T

ativados, neutrófilos, queratinócitos e algumas células tumorais, podem

também sintetizar esta molécula (SIZOVA, 2008), justificando assim sua

atuação não só em doenças agudas, bem como em doenças inflamatórias

crônicas como o câncer e artrite reumatoide, doença na qual se encontra altos

20 Introdução

níveis dessa citocina nas articulações (FALEIRO; ARAUJO; VARAVALLO,

2011).

Deste modo, o papel que estes mediadores desempenham na

inflamação é apenas uma das partes de todo um conjunto necessário para que

ocorra o processo inflamatório, de fato. A reação inflamatória é composta de

dois componentes principais, sendo eles: uma reação vascular e outra celular,

que comportarão cada um deles diferentes reações de tecidos e células, tanto

do ambiente intravascular, como o do ambiente extravascular. (KUMAR;

ABBAS e FAUSTO, 2005; RUBIN et al., 2006). Por isso, frequentemente é

observada a ativação de outros sistemas biológicos, que levam à complicações

durante um evento inflamatório, como a trombose e a angiogênese.

À medida que o processo inflamatório ocorre, alterações na biologia

vascular são desencadeadas, dentre elas a ativação da coagulação e

angiogênese, tornado estes eventos totalmente interligados. Na tentativa de

eliminar o agente invasor, a resposta inflamatória acaba por lesar o tecido ou

órgão acometido por este agente e como consequência, frequentemente há a

exposição de moléculas capazes de desencadear a cascata da coagulação,

tais como o fator tecidual (FT), P-selectinas e fator de Von Willebrand (FvW). O

FT, também conhecido como fator III, é uma glicoproteína exposta em células,

com exceção de células endoteliais e sanguíneas, em reposta a injúria, bem

como a inúmeros estímulos extracelulares relacionados a resposta inflamatória

e tumoral incluindo LPS, TFN-α, IL-1, IL-2, IL-6 e IFN-γ (VERSTEEG et al,

2006). A exposição do FT, juntamente com a do colágeno, funciona como

estimulo pró-coagulante, onde então, uma complexa rede de serino-proteases,

atua como uma cascata amplificada, convertendo as pró-enzimas em suas

formas ativas, culminando na formação do coágulo. A trombina, também

conhecida como fator IIa, é a principal serino-protease da cascata da

coagulação que cliva o fibrinogênio em fibrina, o qual juntamente com as

plaquetas, constitui a base do coágulo (GRAY et al, 2012).

Apesar desta participação do FT na modulação da inflamação, o

principal mecanismo pelo qual a coagulação é capaz de desencadear

respostas celulares relacionadas à diversas patologias, é através da ativação

21 Introdução

de receptores ativadores de proteases (PAR), mediada pela trombina (CHU, et.

al., 2005). Receptores tipo PAR são receptores acoplados à proteína G que

possuem um mecanismo capaz de converter um evento de clivagem

proteolítica extracelular em um sinal transmembrana, modulando assim

respostas celulares. Existem quatro receptores PAR conhecidos; PAR-1, PAR-

2, PAR-3 e PAR-4, sendo apenas os subtipos -1 e -4 encontrados em

plaquetas humanas. Porém, apesar de os receptores PAR-1 and PAR-4 serem

sinalizados através das mesma família de receptores de proteína G-acoplada,

PAR-1 é capaz de se ligar à trombina com mais afinidade do que PAR-4,

mostrando assim a importância de PAR-1 nos eventos celulares mediados pela

trombina (NYLANDER, 2009).

Dentre os papéis celulares da trombina, o mais bem caracterizado é a

ativação plaquetária, no qual induz a alteração da forma das plaquetas e

liberação de ADP, serotonina e tromboxano A2, bem como quimiocinas e

fatores de crescimento. Além disso, mobiliza a molécula de adesão de P-

selectina e o Ligante de CD40 para a superfície plaquetária (SLUPSKY et. al.,

1998), ativando a integrina aIIb/B3, a qual se liga ao fibrinogênio e fator de von

Willebrand (vWF) para mediar a agregação plaquetária (HUGHES, 1998). A

ativação plaquetária por outro lado, desempenha um papel importante em

promover a geração de trombina que vai dar um suporte necessário para os

fatores pró-coagulantes interagirem com a fosfatidilserina carregada

negativamente (MONROE, 2002). Ademais, estudos recentes comportam

evidências de que exista uma comunicação cruzada significativa entre a

trombina e o ADP no contexto da ativação plaquetária e atividade pró-

coagulante (JIANG, 2013), corroborando assim com o potencial trombótico,

frequentemente observado, da trombina.

A ação direta da trombina não somente sobre as plaquetas, mas

também sobre diversos tipos celulares, conceitua uma ideia ainda pouco

estudada que vai além do seu papel sobre a coagulação. A ativação de

receptores PAR pela trombina, está relacionada com a expressão de uma

variedade de moléculas fisiopatológicas, tais como, interleucinas, moléculas de

adesão, fatores de crescimento e fatores angiogênicos, como demonstrado na

figura 2 (LEVI et al, 2003; ESMON et al, 2005 e TAYLOR et al, 2006).

22 Introdução

Cunningham e colaboradores demonstraram que a deficiência de PAR-1 na

glomerulonefrite mediada por anticorpo em modelo murino, apresenta um efeito

protetor sobre o desenvolvimento da inflamação. Tais evidências corroboram

crescentes estudos de que a inflamação é um potente ativador das vias da

coagulação e que mediadores inflamatórios são capazes de aumentar vários

fatores pró-coagulantes, inibir anticoagulantes endógenos e atenuar a resposta

fibrinolítica (VAN VEEN, 2007), mostrando a estreita relação existente entre

hemostasia e inflamação de forma bidirecional, uma vez que um evento pode

desencadear o outro e vice-versa.

Fig. 2: Respostas celulares mediadas através dos receptores PAR.

Fonte: Borensztajn, 2008. Interleucina (IL), fator tecidual (TF), proteína monócitica

quimioatraente-1 (MCP-1), molécula de adesão intercelular (ICAM), molécula de adesão

vascular (VCAM) e fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF).

Além disso, durante a inflamação mecanismos anticoagulantes são

frequentemente comprometidos, como os mediados através da antitrombina

(AT), inibidor da via do fator tecidual (TFPI) e proteína C ativada, como

mostrado na figura 3. Os níveis de AT são consideravelmente baixos durante

23 Introdução

um processo inflamatório, muito em parte pelo seu consumo e degradação pela

elastase de neutrófilos (VARY, 1992), comprometendo o mecanismo

anticoagulante, uma vez que sua ativação resulta na inibição das principais

proteases da coagulação, incluindo FXa e trombina (LIMA et al., 2011). Quanto

ao TFPI, um estudo mostrou que a administração de um TFPI recombinante

bloqueia a geração de trombina mediada durante a inflamação em humanos,

sugerindo uma importante aplicação deste inibidor na inflamação mediada pela

coagulação (DE JONGE, 2000). O prejuízo é ainda mais importante no

comprometimento do sistema da proteína C durante a inflamação. A proteína C

ativada se liga à trombina, através da trombomodulina, e a impede de se ligar à

seus receptores situados na superfície de plaquetas e células inflamatórias,

gerando uma sinalização pró-trombótica e pró-inflamatória. Além disso, estudos

mostram que a proteína C é capaz de inibir a produção de IL-6, IL-8, IL-1β e

TNF-α em cultura de macrófagos (OKAJIMA, 2001). Assim, todas essas

evidências juntas apontam que a sinalização autócrina ou parácrina mediada

por PAR pelas proteases pode indicar um mecanismo inflamatório que seja

talvez mais importante, do que a clivagem de fibrinogênio em si (CHEN, 2009).

24 Introdução

Fig. 3: Representação esquemática dos efeitos do sistema fisiológico anticoagulante

e fibrinolítico na coagulação e inflamação.

Fonte: Levi, 2004.

Ainda, durante a evolução do processo inflamatório, ocorre injúria

vascular e tecidual e por isso, frequentemente o reparo tecidual é ativado. Para

tanto, diversos sinais químicos são ativados para iniciar e manter a resposta de

reparo do tecido injuriado. Dentre essas respostas, é desencadeada a

neovascularização ou angiogênese, fenômeno no qual há a formação de novos

vasos, através de uma sequência de eventos biológicos mediados por um dado

estímulo. Inicialmente este processo se dá através da produção de fatores

angiogênicos, ativação de metaloproteinases e consequente degradação da

matriz extracelular com rearranjo da matriz, em seguida (MASOOD et al, 2001).

Este estímulo pode ser gerado a partir de condições fisiológicas, como reparo

tecidual e embriogênese, ou de estados patológicos como doenças

angioproliferativas, inflamação, trombose e o câncer (DVORAK et al, 2005).

25 Introdução

Para tanto, existem fatores angiogênicos e antiangiogênicos que juntos

desempenham um importante papel no equilíbrio neovascular.

Dentre estes estão o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular),

FGF (fator de crescimento fibroblástico), TGF-b (fator de crescimento tumoral

beta), IFN- β (interferon beta) e TNF-α (fator de necrose tumoral alfa). O VEGF

é o principal fator angiogênico e apresenta efeito proliferativo e migratório

através da interação com um dos seus receptores, o VEGFR-2 (DISTLER et al,

2003). O FGF-1 e FGF-2 são receptores do tipo tirosina-quinase e apresentam

ação mitogênica em células endoteliais, fibroblasto e outras células, além de

aumentar a expressão de VEGF e do fator ativador de plasminogênio. No

intuito de controlar a formação vascular e impedir sua manifestação

exarcebada, existem os fatores antiangiogênicos, como angiostatina,

endostatina e a trombospondina. Todos estes fatores juntos exercem um

controle do processo de neovascularização que pode ser desregulado por

inúmeras condições patológicas e levar à proliferação exarcebada de vasos

sanguíneos como acontece no câncer e em diversas doenças inflamatórias.

É amplamente aceito que a angiogênese é o resultado de um saldo

líquido entre as atividades exercidas por reguladores positivos e negativos. Tal

equilíbrio é conceitualmente muito semelhante ao do equilíbrio anti- e pró-

inflamatório, onde há mediadores que modulam uma adequada e específica

resposta inflamatória. De modo geral, os mediadores pró-inflamatórios são

capazes de promover a angiogênese, como por exemplo, IL–1β e TNF-α, que

atuam modulando efeitos pró-angiogênicos, estimulando a proliferação de

celulas endotelias, além de estimular a síntese de VEGF (WILSON, 2002). Os

monócitos/macrófagos e linfócitos T são descritos por participar ativamente no

processo angiogênico, secretando citocinas inflamatórias que podem controlar

a proliferação das células endoteliais, sobrevivência e apoptose, bem como sua

ativação e migração. Dentre estas, IL-1β, IL-6 e TNF-α são descritas como

moduladoras da proliferação de células endoteliais in vivo e IL-1β é ainda

limitante para o processo angiogênico (LINGEN, 2001).

26 Introdução

Além disso, estudos mostraram que monócitos quando expostos a

condições de hipóxia ou a doses de trombina, tiveram um aumento na

expressão de IL-1β (NALDINI, 2001). A IL-6 é capaz de estimular a secreção

do mais importante fator pró-angiogênico, VEGF, e é encontrada em altos

níveis em tumores em processo de neovascularização (HUANG, 2004;

QUTEBA 2006). Essas evidências consolidam a ideia de que a inflamação é na

verdade um processo multi sinalizador capaz de promover a coagulação,

angiogênese e até mesmo o câncer, e por isso, complicações além da questão

imunológica são frequentemente observadas durante sua manifestação clínica.

Dentro deste contexto, a trombina é capaz de modular a expressão de

moléculas importantes que participam da resposta inflamatória como, IL-6, IL-8

e IL-1β, os quais participam da liberação de micropartículas provenientes da

parede endotelial que são fatores-chaves envolvidos tanto na inflamação como

na coagulação e angiogênese (MARKIEWICZ et al., 2013). Além disso, através

de PAR-1, a trombina hiper-regula moléculas de adesão na superfície

endotelial como, MCP-1 (proteína quimioatraente monocitária-1), PDGF (fator

de crescimento derivado de plaquetas), ICAM-1 (molécula de adesão

intercelular-1) e P-selectina, e desencadeia a produção de autacóides e

quimiocinas que por sua vez ativam neutrófilos e monócitos. Tal mecanismo

leva à ligação, rolamento e à adesão de plaquetas e leucócitos à superfície

endotelial (CHEN, 2009; SPRONK, 2014), contribuindo para o mecanismo

inflamatório agudo.

De um modo geral, esses eventos fisiopatológicos descritos acima

apresentam como interseção o fato de serem ativados pela trombina. Assim,

biomoléculas capazes de inibir esses fatores, se tornam modelos interessantes

para o tratamento da inflamação, com efeitos diretos sobre suas complicações

como a angiogênese e trombose. Neste contexto, polissacarídeos sulfatos

obtidos de fontes naturais ganham destaque, uma vez que são capazes

interagir com uma gama de proteínas envolvidas nesses eventos (DREYFUSS,

et al. 2010).

27 Introdução

Dentre estes, destacam-se os glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs),

uma classe de polissacarídeos não ramificados apresentam repetições de

unidades dissacarídicas, constituídas por um resíduo de hexosamina

(glucosamina ou galactosamina) (ERNST et al., 1995) ligado a um açúcar não

nitrogenado (ácido idurônico, ácido glucurônico ou galactose). Assim, o tipo de

hexosamina e de açúcar urônico, a quantidade e posição de grupos sulfatos e o

tipo de ligação glicosídica (α ou β) (VOLPI; MACCARI et al., 2006) permitem

distinguir os diversos tipos de GAGs: condroitim 4 e 6 sulfato (CS-4 e CS-6),

dermatam sulfato (DS), heparam sulfato (HS), heparina e queratam sulfato

(DIETRICH; NADER; STRAUS, 1983; DIETRICH et al., 1999).

A capacidade de certos glicosaminoglicanos em interferir com a

coagulação sanguínea tem sido conhecida por mais de 100 anos (MCLEAN

1916), como demonstrado pela ampla utilização de heparina como agente

antitrombótico (RODEN, 1989). Durante anos, a heparina se tornou alvo de

pesquisa por seu vasto potencial biotecnológico, em especial no câncer e na

inflamação, bem como nas suas complicações como a angiogênese. Porém,

apesar de seu potencial na recessão de tumores e como um potente anti-

inflamatório, seu exacerbado efeito anticoagulante, alcançado pela

potencialização da AT, e suas complicações hemorrágicas limitaram seu uso

clinicamente. Deste modo, nos últimos anos diversos estudos foram voltados

para explorar e caracterizar outros GAGS frente aos seus efeitos

biotecnológicos, bem como elucidar suas peculiaridades estruturais.

Além da heparina, outro GAGS que apresenta algumas peculiaridades

estruturais em comum com estes compostos, e que vem ganhando destaque

devido ao seu papel em condições fisiopatológicas, é o DS. Esse

polissacarídeo é comumemte encontrado na pele, estimando-se entre 36 a

78% do conteúdo total de GAGS presente em amostras de fluidos de feridas

(PENC et al., 1998). Também conhecido como condroitim sulfato B (CS-B), o

DS é definido pela presença de N-acetil-galactosamina (GalNAc) e, assim

como heparina e HS também apresenta ácido idurônico (IdoA), caracterizando

assim sua unidade dissacarídica (TROWBRIDGE e GALLO, 2002).

28 Introdução

Durante a síntese de um GAG, enzimas específicas são necessárias,

para a formação das unidades dissacarídicas, como as transferases e

epimerazes (MALMSTROM et al., 2012). As cadeias de GAGs são ligada à

resíduos de serina em um core proteico por uma sequência tetrassacarídica de

GlcA-Gal-Gal-Xyl. O DS é sintetizado inicialmente como um CS, onde a

transferência do resíduo de GalNAc pela GalNAc I transferase para o

oligossacarídeo inicial é o primeiro passo para a polimerização da cadeia

(SILBERT; SUGUMARAN, 2002). A adição do resíduo de GalA é realizado pela

GalA I transferase, e a epimerização deste resíduo é alcançada pela liberação

do hidrogênio em C5 pela dermatam sulfato epimerase I, convertendo-o em

IdoA, finalizando assim o processo de formação da cadeia de DS

(MALMSTROM, 1984).

Uma vez formada a cadeia, as sulfotransferases são responsáveis por

adicionar grupamentos sulfatos nos resíduos da estrutura, tornando esses

compostos heterogêneos ainda quanto à posição e ao grau de sulfatação das

unidades dissacarídicas. As modificações de sulfatação podem ocorrer na

posição 2 do ácido idurônico (IdoA-2S) e/ou nas posições 4 e/ou 6 dos

resíduos de N-acetil-galactosamina (GalNac-4,6S). Assim, diferentes

combinações destes padrões de sulfatação, podem ser encontradas em

variadas fontes de DS, como mostrado na figura 4 (TAYLOR; RUDISILL;

GALLO, 2005).

Fig.4 Estrutura típica de um Dermatam Sulfato e suas variações na sequência típica de

unidade dissacarídica.

29 Introdução

Fonte: (AKATSU et al., 2011)

Nos tecidos, os GAGs encontram-se ligados covalentemente a um core

de proteínas, formando macromoléculas complexas, denominadas

proteoglicanos (PG) (VOLPI et al., 2005). Dessa forma, o dermatam sulfato é

frequentemente encontrado na matriz extracelular dos tecidos de vertebrados e

invertebrados como proteoglicano de dermatam sulfato (DSPG), participando

em diversos processos fisiopatológicos como a inflamação e a angiogênese

(PAVÃO et al., 1995). Há evidências na literatura de que DSPG é capaz de se

ligar à fibrilas de colágeno, participando assim no arranjo da matriz, sinalização

intercelular e integridade estrutural (ELEFTERIOU, 2001), além de se ligar à

fibronectina e trombospondina (WINNEMOLLER, 1992), participando ainda da

coagulação (MAIMONE; TOLLEFSEN, 1990).

De fato, essas cadeias de DS são capazes de interagir com uma gama

de proteínas ligantes de heparina (SUGAHARA et al. 2003), tais como fatores

de crescimento fibroblástico (FGF-2 e FGF-7), fator de crescimento hepático

(HGF) (Lyon, 2002) e cofator II da heparina (HCII) (PIKE, 2005). Interações

entre FGF e GAGs tem se mostrado estar associadas à respostas

biologicamente importantes como adesão celular, migração, proliferação e

diferenciação (TUMOVA, 2000). Juntamente com FGF-2 e HGF, o VEGF é um

importante mediador angiogênico e suas propriedades de ligante de GAGs tem

sido especialmente aplicadas como novas estratégias de tratamentos em

doenças com propriedades angioproliferativas (JOUNG, 2008).

Cadeias de DSPG também são descritas por interagirem em eventos

imunológicos, sendo capazes de se ligar à citocinas pró-inflamatórias,

quimiocinas e outros fatores pró-inflamatórios como TNF-α e IFN-γ (BROOKS,

2000). Quimiocinas, incluindo IL-8 e IL-6, são sintetizadas por células

endoteliais em reposta a citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β e TNF-α,

ou por células sub-endoteliais como macrófagos e tal aderência é mediada por

DS/HSPG presentes nas paredes do vaso os quais se ligam à GPCR´s dos

leucócitos (PARISH, 2006; COLDITZ, 2007).

30 Introdução

Estas evidências, juntamente com o fato de que a ocorrência de

compostos tipo DS pode ser observada a partir de Echinodermata dentro da

escala evolutiva do reino animal (Fig.5) (YAMADA; SUGAHARA; ÖZBEK,

2011), sugerem que a participação desde GAG esteja envolvida com processos

biológicos importantes relacionados ao desenvolvimento animal (PAVÃO et. al.,

1996). Esta participação muitas vezes pode estar relacionada com suas

características estruturais heterogêneas, como seus diferentes padrões de

sulfatação, obtidos após uma biossíntese complexa que ocorre de maneira

específica em diferentes tecidos e órgãos, bem como temporalmente durante o

crescimento e desenvolvimento embrionário (LIU; LINHARDT; ZHANG, 2014;

OHTAKE-NIIMI et al., 2010). Porém, quando se compara a complexidade

estrutural dos GAGS com a posição evolutiva pode-se observar que os animais

de maior escala evolutiva não necessariamente produzem GAGs mais

altamente sulfatados. Tem sido demonstrado que em animais como tubarões,

peixes-bruxa, caranguejos, lulas, moluscos, pepinos do mar, ascídias e

camarões há a presença de GAGs com alto grau de sulfatação (YAMADA;

SUGAHARA; ÖZBEK, 2011).

31 Introdução

Fig.5 Distribuição dos GAGs no reino animal.

Fonte: (YAMADA; SUGAHARA; ÖZBEK, 2011)

De um modo geral, os GAGS obtidos de invertebrados apresentam

peculiaridades estruturais, entretanto a maioria dos estudos referem-se aos

heparinoides, compostos tipo heparina e/ou heparam sulfato. Compostos tipo

HS de espécies de molusco da família Anomantidae mostraram conteúdos de

dissacarídeos com N-acetil-glucosamina pouco sulfatados e glucosamina 2-N-

sulfatada (FERREIRA; MEDEIROS; DIETRICH; NADER, 1993). Do camarão

Litopenaeus vanammei, um dos mais importantes produtos da carcinicultura do

país, foi isolado e caracterizado estruturalmente um composto com

características estruturais similares à heparina, com altos níveis de

glucosamina 3-O-sulfatada (CHAVANTE, 2014).

Já para compostos tipo DS, os principais estudos em invertebrados têm

sido realizados pelo grupo de Pavão e Colaboradores (PAVÃO et al., 1995,

1998; PEREIRA; MULLOY; MOURÃO, 1999; TOVAR et al., 2005; KOZLOWSKI

et al., 2011; PAVÃO, 2014). Os resultados desses estudos revelaram que DS

de diferentes espécies de tunicados apresentam um elevado conteúdo de

dissacarídeos dissulfatados. O DS obtido do corpo de ascídia da ordem

Phlebobranchia apresentou 53% de dissacarídeos dissulfatados, constituídos

principalmente pelas unidades IdoA(2S)-GalNAc(6S) (2,6-sulfatado), enquanto

que o DS obtido da ordem Stolidobranchia contém principalmente

dissacarídeos do tipo IdoA2S-GalNAc4S (2,4-sulfatado), que representam 76%

de suas unidades dissacarídicas (KOZLOWSKI et al., 2011).

Este padrão de sulfatação para DSs parece ser uma característica

conservada ao longo do filo Chordata, uma vez que dissacarídeos do tipo 2,4-

sulfatados são comumente presentes em diferentes tecidos como tendão,

cartilagem ou pele de vários animais (CHENG; HEINEGARD; MALMSTROM;

SCHMIDTCHEN; YOSHIDA; FRANSSON, 1994). E uma vez que uma das

habilidades de ascídias é a rápida regeneração vascular, a presença de DS,

juntamente com o fato de que em vertebrados este GAG está intimamente

32 Introdução

relacionado com processos de reparo tecidual, sugerem uma preservação

evolutiva do mesmo (PAVÃO, 1998).

Deste modo, tais evidencias estimularam o estudo dos potenciais

biotecnológicos do DS ao longo dos anos. A atividade antitrombótica do

dermatam sulfato foi demonstrada inicialmente, há 30 anos atrás, através do

modelo de estase sanguínea na veia jugular de coelho (FERNANDEZ et al.

1986). Apesar da atividade anticoagulante do DS ser relativamente baixa

quando comparado à heparina, sua atividade antitrombótica se apresenta

bastante significativa, com efeitos hemorrágicos reduzidos (PAVÃO, 2002);

DESNOYERS, 1989). Várias evidências apontam que a atividade

antitrombótica do DS parece estar principalmente relacionada com sua

capacidade de inibir a trombina, mediada pelo cofator II da heparina (HCII). O

HCII é uma serino-protease inibidora do plasma humano (serpina), homóloga à

antitrombina III (AT), que inibe especificamente a trombina. A especificidade

intrínseca de HCII pode ser uma vantagem, uma vez que sua deficiência não

parece aumentar o risco para trombose, porém ao mesmo tempo, seus níveis

no plasma previnem a trombose arterial (TOLLEFSEN, 2002; TAKAMORI,

2004). A interação do HCII com a trombina é aumentada cerca de 1000 vezes

na presença do DS ou heparina, formando um complexo ternário estável entre

a esta serpina e a protease (LIAW, 2001).

Diferentemente da heparina que se liga tanto à AT-III quanto ao HCII

para mediar sua atividade anticoagulante, o DS é capaz de inibir a trombina

exclusivamente através do HCII (PAVÃO, 2014), e por isso, tem-se relacionado

sua potente atividade antitrombótica à inibição da trombina via HCII. Uma alta

interação do DS com o HCII parece estar relacionada com motivos estruturais

específicos presentes nas cadeias de DS, como a presença de sulfatação no

C2 do IdoA e no C4 de GalNAc (MAIMONE E TOLLEFSEN, 1990), o que por

sua vez, pode refletir sua atividade antitrombótica. Um DS apresentando

dissacarídeos 2,4-sulfato obtido de P. nigra se mostrou eficaz em inibir a

trombina via HCII, ao passo que o DS do tipo 2,6-sulfato obtido de S. plicata

apresentou baixa atividade HCII (KOZLOWSKI et al., 2011). Porém, em um

estudo comparativo, estes dois DSs distintos estruturalmente obtidos de

ascídia, apresentaram significativo potencial antitrombótico, mesmo quando um

33 Introdução

destes polissacarídeos mostrava baixa atividade via HCII, porém habilidade de

inibir P-selectina, responsável por facilitar a interação entre plaquetas,

leucócitos e células endoteliais (KOZLOWSKI; PAVAO; BORSIG, 2011). Esta

evidência sugere outro mecanismo efetor antitrombótico, além da já descrita

relação de atividade via HCII e poder modulador da trombose para o DS.

Além disso, o conteúdo de IdoA em DSs sugere uma importância frente

à efeitos biológicos, uma vez que estudos sugeriram que as atividades de

inibição tumoral, trombótica e mesmo inflamatória estejam relacionadas com o

montante de IdoA na estrutura de DSs de fontes naturais distintas

(KOZLOWSKI; PAVAO; BORSIG, 2011). Estas interações sugerem que o DS

tenha uma participação na inibição da coagulação, além de promover a

estabilidade da matriz extracelular e reduzir a inflamação e angiogênese

(TROWBRIDGE AND GALLO 2002; SUGAHARA ET AL. 2003).

Deste modo, fontes alternativas de DS, sejam de origem sintética ou

natural, tem se tornado objeto de pesquisa. Apesar do estudo de DS obtidos de

diferentes espécies de invertebrados tenha sido ampliado nas últimas décadas,

ainda há poucos trabalhos que relatam a ocorrência de DS em fontes naturais,

bem como sua elucidação quanto aos seus potenciais biotecnológicos

(PAVÃO, 1995; MOURÃO 1998; CESARETTI et al. 2004; LUPPI et al. 2005;

VOLPI E MACCARI 2005, 2007). Em nosso laboratório, fomos capaz de isolar

um heparinoide (BRITO, et. al., 2008), bem como um GAG tipo condroitim

sulfato; (CAVALCANTE, 2015) do cefalotórax do camarão Litopenaeus

vanammei. Porém, pela primeira vez foi obtido um composto tipo DS, nunca

antes descrito em crustáceos (PALHARES, 2013). O L. vanammei é a principal

espécie da carcinicultura brasileira, uma atividade com grande relevância

econômica da região Nordeste, devido às suas condições ideais de cultivo

(QUAGLIA, 1993). O cafalotórax, conhecido popularmente como cabeça,

corresponde à aproximadamente 40% do peso total do camarão e, uma vez

que os camarões são descabeçados para exportação, durante a etapa de

processamento são geradas grandes quantidades de resíduos orgânicos

(GILDBERG; STENBERG, 2001). Esse lixo orgânico por sua vez, é enterrados

ou despejado em rios frequentemente, levando à graves problemas ambientais.

34 Introdução

Por isso, foi despertado o interesse em avaliar os potenciais anti-

inflamatório, antitrombótico e antiangiogênico, além de caracterizar a atividade

anticoagulante de um dermatam sulfato (DS), isolado do camarão branco do

Pacífico Litopenaeus vannamei.

34 Objetivos

OBJETIVO

OBJETIVO GERAL:

Caracterizar estruturalmente o composto tipo DS obtido do cefalotórax do

camarão Litopenaeus vannamei e avaliar seus potenciais anti-inflamatório,

antitrombótico e antiangiogênico bem como verificar sua interferência na

hemostasia.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Purificar os compostos tipo DS a partir do cefalotórax do camarão L.

vannamei;

Determinar a composição dissacarídica do composto tipo DS;

Verificar a atividade anticoagulante dos composto tipo DS;

Avaliar a atividade hemorrágica residual dos composto tipo DS;

Analisar o efeito antitrombótico in vivo do composto tipo DS;

Investigar o potencial anti-inflamatório do composto tipo DS

Avaliar o potencial antiangiogênico in vitro do composto tipo DS.

35 Materiais e métodos

MATERIAIS E MÉTODOS

1. Animais e cultura de células

Células endoteliais de aorta de Coelho (RAEC) foram cultivadas em

meio de cultura F12 (Invitrogen, San Diego,CA, USA), contendo 10% de soro

fetal bovino (Cultilab, Campinas, SP, Brazil) e 20 mM de bicarbonato de sódio.

Todas as culturas foram realizadas em placas de cultura (BD Falcon, San Jose,

CA, USA). Ratos machos da linhagem Wistar (entre 8 e 10 semanas de idade,

180-300 g) foram utilizados nos experimentos de hemorragia, enquanto que os

camundongos da linhagem C57BL/6 foram utilizados para os ensaios de

inflamação em modelo peritonite, ambos provenientes do biotério do

Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN). Todos os animais foram mantidos com livre acesso à água e

alimentos, em condições controladas de iluminação (ciclo de 12 horas

claro/escuro) e temperatura (25ºC). Os experimentos realizados com esses

animais foram previamente aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da

mesma universidade (Protocolo Nº 044/2010).

2. Extração de glicosaminoglicanos e purificação dos compostos tipo DS

do camarão L. Vannamei.

O processo de extração de GAGs do camarão foi realizado de acordo

com a metodologia descrita por Brito et al. (2008). Brevemente, o material

biológico (8,2 Kg de cefalotórax do camarão) foi triturado e delipidado com

acetona. A massa obtida após o processo de delipidação foi seca e triturada

para formação de um pó, o qual foi homogeneizado com NaCl 1,0M e

submetido à proteólise por 24 horas, a 60°C. Em seguida, a mistura foi filtrada

e a suspensão obtida foi complexada com resina de troca-iônica (Lewatit), a

qual foi eluída com NaCl 3,0M, obtendo-se um pool de GAGs que foi

denominado de Fração 3,0M (F-3,0M). A partir dessa fração, foi realizado

fracionamento com acetona, adicionando volumes crescentes (0,5V; 0,8V;


1,0V; 2,0V). Em seguida, o composto tipo DS foi purificado através da

cromatografia de troca-iônica em DEAE-Sephacel, eluída com NaCl nas

molaridades de 0,5, 0,8 e 1,0 M. Os eluatos foram analisados quanto a

presença de GAGs através da dosagem de ácido urônico por meio do ensaio

de Carbazol (Dische, 1947). O composto eluído com 1,0 M de NaCl foi

dessalado através de coluna de gel-filtração G-25, eluído com etanol 10%.

Após liofilização o composto purificado, DSL (40 mg) foi submetido à análises.

3. Eletroforese

O composto purificado foi avaliado por eletroferese em gel de agarose

(0,6%) em tampão Diaminopropano (PDA) 0,05 M, pH 9,0. O gel foi submetido

a 100 V em cuba refrigerada a 4°C utilizando-se como indicador de corrida o

vermelho de cresol. Após a corrida, o gel foi fixado com CETAVLON (0,1%) por

no mínimo 2 horas, seco sob corrente de ar quente e corado com azul de

toluidina 0,1%, em ácido acético 0,1% e etanol 50%. Depois de retirado o

excesso com solução descorante, o gel foi seco a temperatura ambiente.

4. Despolimerização enzimática

A digestão enzimática foi realizada como previamente descrito (LIMA,

HUGHES, et al., 2013). 100µg do composto tipo DS isolado do camarão foi

incubado com uma mistura de liases (heparinase, condroitinase AC e ABC de

Flavobaterium heparinum, liases que degradam compostos tipo

heparina/heparam sulfato, condroitim sulfato e dermatam sulfato,

respectivamente) tem um modo de a ( (2,5 mIU cada) e os dissacarídeos

produzidos foram submetidos à uma cromatografia de alta performance (HPLC)

do tipo 150×4,6 mm Phenosphere SAX (Phenomenex, Torrance, CA, EUA)

utilizando um gradiente de 0 à 1M de NaCl, durante 30 minutos com fluxo de

1mL/min e a detecção foi feita através de leitura de absorbância de UV à 232

nm.


5. Determinação do peso molecular

O peso molecular do composto tipo DS foi determinado através do GPC-

HPLC em coluna BioSep SECTM S-2000 LC (Phenomenex, Torrance, CA,

USA) utilizando eluição isocrática (Fase móvel de Na2SO4 0,3 M) em taxa de

fluxo de 1mL/min e detectado em UV a 205 nm. A coluna foi previamente

calibrada com polissacarídeos de pesos moleculares conhecidos (1.7, 4, 10,16

e 20 kDa).

6. Atividade anticoagulante

O ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) foi realizado

de acordo com as instruções do Kit APTTest (LABTEST). Heparina não-

fracionada, DS de mamíferos e o composto obtido do camarão foram diluídos

em solução salina para as concentrações apropriadas (gerando um volume de

10μL) e incubados com 90μL de plasma a 37°C. Após 3 minutos, 100 µL de

cefalina foram adicionadas e a mistura foi incubada a 37°C por 3 minutos.

Depois da incubação, 100 µL de cloreto de cálcio pré-aquecido foram

adicionados e o tempo de coagulação foi medido no coagulômetro Quick Timer

(Drake Eletrônica Comércio Ltda., São Paulo) em segundos. Todos os ensaios

de TTPa foram realizados em duplicata.

7. Inibição da trombina (fator IIa)

O ensaio anti-IIa foi realizado em microplaca de 96 poços de acordo com

as instruções do kit Actichrome Heparin (Anti-FIIa) assay (Sekisui Diagnostics,

ref: 820). 50 μL de trombina foram incubadas a 37°C por 2 min na presença de

concentrações crescentes do composto do camarão, DS de mamífero e

Heparina não-fracionada, diluídos previamente em plasma humano citratado

fresco e novamente diluídos em AT. 50 μL de Fator IIa (trombina) bovino

purificado foram adicionados a cada poço, homogeneizados e incubados a

37°C por exatos 2 min. Em seguida, 50 μL do substrato cromogênico para FIIa


foram adicionados, homegeneizados e incubados a 37°C por exatos 2 min.

Após incubação, 50 μL de ácido acético a 30% foram adicionados para

interromper a reação e a absorbância foi mensurada a 405 nm.

8. Inibição da trombina pelo cofator II da heparina (HCII)

O teste de inibição da trombina mediada pelo HCII na presença dos

GAGs foi realizado em microplaca de 96 poços com volume final de 100 µL de

acordo com Pavão, 1995. A concentração final dos reagentes incluídos foram:

70 nM cofator II da heparina (Sigma-Alderich, St Louis, MO, USA), 15 nM de

trombina (Seikisui Diagnostics, Stamford, CT), e 0–100 µg/ml do DS do

camarão, DS de mamíferos ou Heparina em 25 µl de 0.02 M Tris/HCl, 0.15 M

NaCl (pH 7.4) (TS/PEG). Em seguida, foi adicionado 25 µL de trombina e

incubados por 1 min a 37º C. Posteriormente, foi adicionado 25 µL do substrato

cromogênico N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroamilidahydrochloride (100 mM) e a

mistura foi incubada por mais 1 min a 37°C. Após a incubação foi adicionado

25 µL de ácido acético a 30% para parar a reação. A absorbância foi lida a 405

nm. O branco da amostra foi feito utilizando os mesmos reagentes.

9. Efeito residual hemorrágico

O efeito residual hemorrágico dos compostos foi avaliado utilizado o

modelo de cauda escarificada (DIETRICH, 1967). Após anestesia com

quetamina e xilasina na proporção de 1:1 (v/v), uma leve escarificação na

cauda dos ratos foi provocada com auxílio de um bisturi. Posteriormente, a

cauda escarificada foi mergulhada verticalmente em um tubo com 2 mL de

solução salina e foi observado o processo de sangramento durante cinco

minutos. Em seguida, a cauda foi retirada da solução e submetida a um

esfregaço com uma gaze e mergulhada em uma nova solução salina. Após

cinco minutos o processo é repetido mais uma vez. Ao fim dos três estímulos

mecânicos a cauda foi mergulhada em solução salina contendo heparina não-

fracionada ou o composto isolado do camarão, em concentração de 100 e


500µg/mL. Passados dois minutos a cauda foi retirada e lavada

abundantemente com solução salina e em seguida mergulhada. Foram

utilizados um total de 6 ratos por grupo e os resultados foram expressos como

a soma dos valores de proteína de cada tubo menos a quantidade de proteína

presente antes da exposição aos compostos.

10. Atividade antitrombótica em modelo de trombose arterial induzida por

FeCl3

50 µL de DSL (1 mg/kg-1) ou PBS foram injetados intravenosamente pela

veia caudal de 3 ratos Winstar para cada grupo, 10 minutos depois da indução

da trombose. Os ratos foram colados em posição de supino e a artéria carótida

comum (ACC) foi exposta. A trombose foi induzida sobrepondo um papel filtro

tipo Whatman saturado com 10% de FeCl3 sobre a ACC. Após 3 minutos, o

papel embebido em FeCl3 foi removido e a ACC foi irrigada com PBS

constantemente. O fluxo sanguíneo passou então a ser monitorado com um

probe de ultrassom (Transonic System, Ithaca, NY, USA) até completa oclusão

do vaso. (Kurz, 1990).

11. Ensaio de peritonite induzida por LPS

Camundongos da linhagem C57bl/6 foram injetados com 100 µL de

Lipopolissacarídeo (LPS) da cepa 055:B5 cepa (3,3 mg/Kg/animal) na cavidade

peritoneal. Após 5 minutos, foram injetados intravenosamente PBS, DS de

mamíferos ou DSL (1,5 mg/kg-1) 5. Decorridas 4h, os camundongos foram

eutanasiados e a cavidade peritoneal foi lavada com 2 mL de PBS contendo

0.5% soro de albumina bovina e 1 mM EDTA, afim de recuperar as células

presentes naquele espaço. Foram utilizados um total de 7 camundongos por

grupo. O Número total de celulas do lavado peritoneal foi contado em

hemocitômetro. A contagem diferencial dos leucócitos polimorfonucleares foi

determinado em preparações de cytospin, fixadas com eosina e hematoxilina.


12. Dosagem de citocinas pro-inflamatórias

Os lavados peritoneal de cada grupo tratado foi coletado após 4 horas

da indução da inflamação com LPS e armazenados à -80ºC. Os níveis de

interleucina 1-β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-α (TNF-

α) foram mensurados utilizando kit de ensaio imunoenzimático (ELISA)

(eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi

calculada em triplicata e a densidade ótica de cada poço (ensaio realizado em

placa de 96 poços inserida no kit) foi determinada a 450 nm. Os resultados

obtidos foram submetidos à análise estatística.

13. Ensaio de formação capilar em membrana basal reconstituída

(matrigel)

Matrigel purificado a partir de cauda de rato foi descongelado a 4°C e

plaqueado em placa de 24 poços e mantido a 37°C por 16h para polimerização.

RAEC (105 células) foram adicionadas no matrigel em meio de cultura F12,

contento 10% de soro fetal bovino (Invitrogen, San Diego,CA, USA), na

ausência ou presença de diferentes concentrações de heparina não-fracionada

ou do composto do camarão, e incubadas à 37°C e 5% CO2 por 24h. Cada

dose foi realizada em triplicata. A formação tubular foi examinada em

microscópio inverso a 100x de aumento. Quatro imagens foram

randomicamente capturadas em difrentes áreas. As estruturas capilares

formadas no matrigel foram quantificadas e analisadas utilizando o software de

imagem Image J (NIH, Bethesda, MD, USA).

13. Análise estatística

Os dados foram apresentados quanto à sua significância e desvio

padrão para os números indicados de experimentos e avaliados por ANOVA

(Two-way e/ou One-way) e Tukey test para comparação das significâncias.

Foram considerados significativos estatisticamente os valores de P < 0,05.

41 Resultados

RESULTADOS

1. Purificação do composto tipo DS a partir do camarão L. vannamei

Os GAGs isolados do cefalotórax do camarão após proteólise e

complexação com resina de troca-iônica foram eluídos com NaCl 3,0M para

obtenção de um extrato bruto de polissacarídeos que foi denominado de fração

F-3,0M. Após o tratamento da F-3,0M com proporções crescentes de acetona,

obtiveram-se quatro populações polissacarídicas, as frações F-0,5A, F-0,8A, F-

1,2A e F-2,0A (Tabela 1). A F1,0A foi escolhida para posterior purificação, uma

vez que do cefalotórax do camarão Litopenaeus vanammei já foram isolados

um heparinoides da fração 0,5A (BRITO, et. al., 2008), bem como um GAG tipo

condroitim sulfato e um composto híbrido de hep/HS da fração 0,8A (BRITO, et.

al., 2014; CAVALCANTE, 2015). Além disso, a F-2,0A apresentou baixo

rendimento e não pôde ser utilizada.

A análise dessas frações por eletroforese em gel de agarose, no

sistema PDA, revela que todas apresentam uma banda com perfil de migração

semelhante à heparina/heparam sulfato (Hep/HS), indicando a presença de

heparinoides. Além da presença destes análogos de Hep/HS, as frações F-

1,0A e F-2,0A também apresentam compostos com um perfil de migração

semelhante a dermatam sulfato (DS) (Dados não mostrados).

Cabeças

(Kg)

Pó cetônico

(g) F-3,0M (g)

Frações Obtidas por

Tratamento com Acetona (mg)

F-0,5A F-0,8A F-1,2A

16,0 1.520,0 2,0353 85,0*

(13,38%)

358,0*

(56,35%)

192,3*

(30,27%)

Tabela 1: Rendimento das frações obtidas a partir da F-3,0M, após fracionamento com

acetona. *Os valores entre parênteses representam o rendimento percentual em relação ao total das

massas obtidas no fracionamento com acetona.

42 Resultados

Em um trabalho anterior, um estudo comparativo realizado previamente

(PALHARES, 2013) para separar os GAGs da fração F-1,0A, com diferentes

tipos de resina, foi estudado qual sistema de cromatografia de troca-iônica

apresentava maior eficácia na purificação dos compostos provenientes da F-

1,0A. E após análise, constatou-se que a eluição com NaCl em cromatografia

de troca-iônica DEAE-Sephacel foi a mais eficiente em separar os compostos e

assim, obter o composto em estudo. Durante o estudo, dosagem de urônico de

cada subfração foi realizada para quantificar os GAGs presentes em cada

subfração, sendo observado que a subfração eluída com NaCl 0,8M

representou 68,18% de rendimento, porém a subfração F1,0 (eluída com NaCl

1,0M) desta mesma cromatografia, foi a única que apresentou uma banda

eletroforética isolada (Fig. 6), caracterizando uma população de GAGs

aparentemente pura. O perfil de migração eletroforética entre HS e DS

apresentado pela subfração F1,0, despertou o nosso interesse em elucidar sua

composição dissacarídica e estudar alguns potencias desse GAG. Portanto, a

fração foi liofilizada e seu sal removido por meio de cromatografia de gel

filtração (Sephadex G-25) e submetido as análises subsequentes.

Fig. 6 Perfil eletroforético em sistema PDA dos compostos do camarão obtidos da F-1,0A por cromatografia de troca-iônica, em DEAE-Sephacel. Posteriormente os compostos foram dessalinizados em coluna de gel-filtração G-25 Sephadex. P- padrão contendo 5 µg de condroitim sulfato 4/6 (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS).

43 Resultados

2. Degradação enzimática

A composição dissacarídica do composto do camarão foi determinada

por despolimerização enzimática com uma mistura de liases (Heparinase e

condroitinase ABC). Quando submetido à heparinase o composto não sofreu

degradação, porém quando submetido à liase condroitinase ABC o composto

foi totalmente degradado à dissacarídeos. Uma vez que a condroitinase ABC

digere cadeias de GAGs do tipo DS, em sitio aleatórios, a natureza tipo

dermatam sulfato do composto foi revelada. Assim, a partir deste momento o

composto isolado do camarão passou a ser denominado DSL (DS-like). Os

produtos predominantes são dissacarídeos, que foram em seguida, analisados

em cromatografia de troca-iônica de alta performance (HPLC). A ação de

condroitinase ABC no DSL produziu apenas como produto dissacarídico o α-

ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(4SO4).

Fig.7 A análise por cromatografia de troca aniônica HPLC dos dissacarídeos formados após digestão do DS de camarão pela condroitinase ABC. O padrão de dissacarídeo ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(4SO4) (A) e do dissacarídeo formado pela ação exaustiva da condroitinase ABC sobre o dermatam sulfato de L. vanammei (B), foram aplicados a uma coluna 150x4.6 mm Phenosphere – SAX, ligado a um sistema de HPLC . A coluna foi eluída com um gradiente de NaCl tal como descrito sob "condições experimentais". O eluente foi monitorado por absorbância de UV a 232 nm.

44 Resultados

3. Atividade anticoagulante

A atividade anticoagulante do DSL foi investigada através do ensaio de

tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), que avalia a via intrínseca da

cascata de coagulação. A heparina comercial é capaz de prolongar o tempo de

coagulação em mais de 240s ainda numa baixa concentração de 5 μg/mL,

enquanto que o mesmo efeito só ocorre na concentração de 30 μg/mL para o

composto do camarão (Fig. 8). Já o DS de mamíferos necessitou de uma

concentração de 50 μg/mL para mostrar um discreto aumento no tempo de

coagulação, sendo este praticamente irrelevante.

0.0 0.2 0.4 0.60

40

80

120

160

200

240Heparina

DS

DSL

Concentração (mg/mL)

Te

mp

o (

s)

Fig. 8 Atividade anticoagulante do composto do camarão, mensurados através do Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). O tratamento tópico foi feito com DSL (▲); DS de

mamíferos (■) e heparina (●).

4. Atividade anti-IIa direta e mediada pelo cofator II da heparina (HCII)

Afim de investigar o mecanismo anticoagulante apresentado pelo DSL,

foram realizados os ensaios de inibição direta e via HCII sobre a trombina.

Tanto de forma direta, quanto indireta (via HCII) o DSL foi capaz de inibir a

trombina significativamente. A figura 9 mostra que o DSL perante o fator IIa, foi

capaz de atingir 80% no ponto de 1,0 μg/mL estabilizando sua atividade anti-

45 Resultados

IIa. Já através do HCII o DSL foi capaz de inibir cerca de 90% da atividade da

trombina em 100 μg/ml de concentração, enquanto DS de mamífero tem uma

CI50 para a inibição de trombina de 3,0 μg/mL.

A B

0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 1000

20

40

60

80

100

DS

DSL

Heparina

Concentração (g/mL)

Inib

ição

via

CH

II (

%)

0 1 2 3 4 50

50

100

150

Concentração (g/mL)

Inib

ição

da T

rom

bin

a (

%)

Fig. 9 Atividade anti-IIa direta (A) e mediada pelo Cofator II da heparina (B) mensurados utilizando substrato cromogênico como referido em métodos. Composto do camarão, DSL

(▲); DS de mamíferos (■) e heparina (●).

5. Atividade hemorrágica

Uma vez que o uso da heparina não-fracionada é capaz de levar a

disturbios na hemostasia, levando a eventos hemorrágicos, foi investigado o

efeito residual hemorrágico do DSL. Na concentração de 100μg/mL, foi

possível visualizar o potente efeito hemorrágico da heparina que apresenta

aproximadamente, o dobro da atividade hemorrágica do DS de mamíferos.

Diferentemente, o composto DSL, apresentou um insignificante potencial

hemorrágico, com praticamente ausência de atividade hemorrágica. Mesmo em

uma concentração 5 vezes maior (500 μg/mL), o DSL não mostrou mudança

significativa em seu efeito sobre o sangramento residual, quando comparado à

seu efeito na menor concentração (100 μg/mL), exibindo ainda menor atividade

que o DS de mamífero na concentração de 100μg/mL.

46 Resultados

0 10 20 30 40

0

1

2

3

4

5Heparina

Dermatam sulfato

DSL

DSL (500mg/mL)

Tempo (min)

Co

nc

en

tra

çã

o d

e p

rote

ína

(A

bs

)

Fig. 10 Atividade hemorrágica foi avaliada pelo tempo de sangramento. O tratamento foi feito pela administração tópica de solução salina contendo Heparina (100 µg/mL) (●); Dermatam Sulfato (100 µg/mL) (■); DSL (100 µg/mL) (▲); ou DSL (500 µg/mL) (▲). A potência de sangramento foi mensurada após 2 min seguida de lavagem com solução salina.

6. Ensaio de peritonite aguda induzida por LPS

Há inúmeras evidências de que a trombina é capaz de promover a

inflamação através da indução da expressão de citocinas pró-inflamatórias, e

moléculas de adesão, por ativação dos receptores PAR-1 e PAR-2

(BORENSZTAJN, 2008; LEVI et. al., 2003; ESMON et. al., 2005 E TAYLOR et.

al., 2006). Por isso, foi avaliada a eficiência do DSL em inibir o recrutamento de

leucócitos em modelo de peritonite induzida por LPS em camundongos. A

análise de leucócitos presentes na lavagem peritoneal mostrou um aumento de

cerca de três vezes no número de leucócitos totais nos camundongos tratados

com LPS em comparação com os controles (Fig. 11A). Dentro da contagem

diferencial, tanto o DSL quanto o DS de mamíferos foram eficazes em reduzir

significativamente o recrutamento de leucócitos, principalmente de PMNs,

chegando à aproximadamente 47% e 51% de inibição para o DSL e DS de

mamíferos, respectivamente (Fig. 11B).

47 Resultados

PBS c

ontrole

PBS

DS

DSL

0

2

4

6

*** ******

Nú

me

ro d

e c

élu

las d

o

lav

ad

o p

eri

ton

eal (x

10

6)

A B

PBS c

ontrole

PBS

DS

DSL

0

10

20

30

***

*** ***

PM

N n

o l

av

ad

o p

eri

ton

ea

l (%

)

LPS + LPS +

Fig.11 Recrutamento de células polimorfonucleares (PMN), em modelo de inflamação de peritonite induzida por LPS, é inibido pelo Dermatam sulfato de camarão (DSL). Os

camundongos foram injetados intraperitonealmente com 100 μL de LPS, 5 min antes da

injeção intravenosa de solução salina tamponada com fosfato (PBS), DSL ou DS de mamíferos (1,5 mg/kg-1). Após 4h, a lavado peritoneal foi avaliada quanto ao número total de células (A) e o percentual de PMN (B). PMNs foram identificados por coloração com hematoxilina e eosina.

A significância estatística foi determinada por ANOVA one-way ( *** P < 0,001 ). Barra: 20 μM.

7. Dosagem de citocinas

O lavado peritoneal dos animais utilizados no ensaio de peritonite foi, em

seguida, submetido à dosagem de citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-

α. Nos animais tratados com o DSL os níveis de IL-1β foram cerca de 60%

menor quando comparado aos animais controle (sem tratamento), enquanto

que para o TNF-α a inibição chegou à aproximadamente 74%. Para os níveis

de IL-6, o DSL mostrou-se eficaz em inibir em cerca de 40%, quando

comparado aos animais não-tratados. Para o DS de mamíferos foi observado

potencial de inibição das citocinas semelhante ao DSL.

48 Resultados

IL-1 IL

-6

TNF-

0.0

0.2

0.4

0.6PBS

DS

DSL

* *** ***

***

**Cit

ocin

as

(p

g/m

L)

Fig.12 Produção de IL-1β, IL-6 e TNF-α estimuladas por LPS em camundongos C57BL/6, após tratamento com DSL, DS de mamíferos ou sem tratamento (PBS), 4h após indução da inflamação. Os resultados representam as médias dos níveis de citocinas (pg/mL), bem como os desvios padrões entre os animais de cada grupo. *, ** e ***P-valores representam os

resultados de análise estatística (ANOVA Two-way).

8. Atividade antitrombótica por modelo de trombose arterial induzida por

FeCl3

Afim de determinar os efeitos do DSL sobre a trombose, foi realizado o

modelo de lesão induzida por FeCl3 na artéria carótida, onde o FeCl3 é capaz

de promover a formação de coágulos devido ao seu potencial de induzir a

formação de radicais livres pelas células endoteliais. Quando comparado com o

controle positivo (animais tratados com PBS), o tratamento com o DSL

provocou um aumento significante do tempo de oclusão do vaso, chegando a

prolongar em mais da metade o tempo de obstrução do vaso, e em alguns

casos foi observada apenas uma oclusão parcial do vaso, demonstrando um

potente efeito antitombótico.

49 Resultados

0 20 40 60 80

DSL

PBS

Tempo de oclusão (min)

Fig.13 Composto tipo Dermatam sulfato (DSL) reduz a trombose arterial induzida por FeCl3. Ratos foram injetados intravenosamente com PBS ou DSL (1,5mg/kg/por animal) e 5 min após, a formação dos trombos foi induzida por deposição de um papel de filtro embebido com 10% de FeCl3 na artéria carótida comum (ACC). Fluxo sanguíneo vascular foi monitorado com uma sonda de ultrassom até que a oclusão da ACC. O tempo de oclusão foi mostrado.

9. Ensaio de formação capilar de células endoteliais em matrigel

As células endoteliais são capazes de se organizar em redes

conectadas 2-D e formar capilares, nos estágios finais da angiogênese

(DREYFUSS et al., 2010). Deste modo, foi investigado se o DSL era capaz de

inibir a formação de capilares a partir de células endoteliais de coelho (RAEC),

em diferentes concentrações. A figura 14 mostra que em todas as doses

testadas, o DSL foi capaz de inibir a formação capilar, quando comparado ao

controle positivo (PBS), mostrando-se capaz de diminuir o número de

estruturas capilares, em todas as concentrações testadas, demostrando seu

potente efeito inibitório na formação de novos vasos de forma dose-

depentende, chegando a inibir 100% da formação capilar na maior

concentração testada (100 µg/mL).

50 Resultados

Fig. 14 Formação de estruturas capilares em matrigel após tratamento com diferentes doses do composto do camarão ou na dose de 100 μg/mL da heparina. A formação tubular foi examinada sob microscópio de luz invertida em objetiva de 100x (A). O número de estruturas capilares foi determinado através do softwere para análise de imagens (Image J). Meio de cultura F12 foi utilizado como controle positivo. P-valores representam os resultados

de análise estatística (ANOVA One-way).

51 Discussão

DISCUSSÃO

Dados da literatura revelam que a sinalização celular mediada pela

trombina, através de PAR, é capaz de estimular a produção de uma variedade

de moléculas biologicamente importantes tais como interleucinas, moléculas de

adesão, fatores de crescimento e fatores angiogênicos (LEVI et al, 2003;

ESMON et al, 2005, TAYLOR et al, 2006, ANGIOLILLO, 2010), que por sua vez

estão relacionadas com patologias como a inflamação e suas complicações

como a trombose e a angiogênese. Assim, estas evidências reforçam a ideia

de que a sinalização através das proteases de coagulação, como a trombina,

tem uma contribuição importante na resposta inflamatória (COUGHLIN, 2000),

e por isso, a identificação de novos alvos terapêuticos que possam atuar na

modulação simultânea destes eventos podem apresentar mais êxito do que

uma terapia alvo-específica (LEVI, 2009).

Neste trabalho, é relatado o efeito anti-inflamatório, antiangiogênico e

antitrombótico de um composto do tipo DS, obtido do camarão Litopenaeus

vannamei, com reduzido efeito hemorrágico. Em um trabalho prévio, o

composto foi isolado e apresentou características de migração eletroforética

com uma única banda metacromática migrando entre HS e DS (PALHARES,

2013). Apesar da semelhança de comportamento eletroforético com outros

heparinoides obtidos de crustáceos (DIETRICH et al., 1999; CHAVANTE et al.,

2000; VOLPI, 1993), esse GAG se mostrou resistente ao tratamento com liases

que degradam especificamente heparina e/ou heparam sulfato. Por outro lado,

o tratamento com a condroitinase ABC (liase que digere DS), liberou uma única

população dissacarídica, indicando que o composto obtido do camarão tratava-

se de um GAG tipo DS (DSL). Estas enzimas quebram a ligação glicosídica β

(1→4) entre os resíduos de N-acetilgalactosamina (4-sulfatada ou 6-sulfatada)

e ácido idurônico (sulfatado ou não na posição C-2) da molécula, liberando

principalmente dissacarídeos insaturados N-acetilado,4-sulfatado (UA-

GalNAc(4SO4) e/ou N-acetilado,6-sulfatado (UA-GalNAc(6SO4) (LINHARDT

et. al., 1986; TROWBRIDGE; GALLO, 2002)). A condroitinase ABC de

52 Discussão

Flavobaterium heparinum tem um modo de ação distinto das demais, liberando

dissacarídeos insaturados a partir do terminal redutor das moléculas.

No intuito de caracterizar a composição dissacarídica do DS de

camarão, o mesmo foi submetido à análise dos dissacarídeos predominantes

em cromatografia de alta performance (HPLC) e assim, apresentou como

produto principal o dissacarídeo dissulfatado α-ΔUA(2SO4)-1→3-

GalNAc(4SO4). Composição dissacarídica semelhante foi observada em um

DS obtido da ascídia Styela plicata (PAVÃO, 1998), que contem 70% de

unidades tipo α-ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(4SO4) e o restante sendo composto

por dissacarídeos tipo α-ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(6SO4) e α-ΔUA(SO4)-1→3-

GalNAc(4,6SO4). Comparado ao DS de mamíferos, que é constituído

principalmente por dissacarídeos monossulfatados tipo α-ΔUA-1→3-

GalNAc(4SO4), esses resultados sugerem um padrão peculiar de sulfatação

nas unidades dissacarídicas de DS de invertebrados marinhos, o que poderia

estar relacionado à sua evolução. Em ascídias, por exemplo, a estrutura do DS

varia entre gêneros diferentes, predominando dissacarídeos tipo α-ΔUA(2SO4)-

1→3-GalNAc(4SO4) para o DS obtido de Styela plicata (ordem

Stolidobranchia), ao contrário daquele obtido para ascídia Phallusia nigra

(ordem Phlebobranchia), cuja GalNAc apresenta predominantemente

sulfatação em C6 (α-ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(6SO4)) (KOZLOWSKI, 2011).

Nesse trabalho, o autor também sugere que o aumento da atividade anti-

IIa via HCII, apresentado pelo DS de ascídia, esteja relacionado à ocorrência

do padrão de sulfatação do dissacarídeo α-ΔUA(SO4)-1→3-GalNAc(4SO4)

(KOZLOWSKI, 2011). Esses resultados corroboram com o fato de que

octassacarídeos e hexassacarídeos de DS, com regiões de sulfatação em C2

do IdoA e em C4 de GalNAc, ligam-se ao HCII com alta afinidade (MAIMONE e

TOLLEFSEN, 1990), reforçando a ideia de que a presença de 4-O-sulfatação

nos resíduos de N-acetil-β-D-galactosamina seja essencial para a atividade

anticoagulante do DS de mamíferos (MAIMONE e TOLLEFSEN, 1990; PAVÃO,

1998).

Apesar dessas evidências, o DS de camarão que também exibe um alto

conteúdo de N-acetilgalactosamina,4-O-sulfatada, inibiu cerca de 68% da

53 Discussão

atividade da trombina, via HCII, na concentração de 0,01ug/mL, ao contrário do

DS de mamífero que na mesma concentração atinge 90% de inibição.

Considerando que as cadeias do DSL são menores (12KDa) do que aquelas do

DS de mamífero (60KDa), supõe-se que essa diferença possa estar associada

ao tamanho necessário para que as cadeias de GAG se liguem ao HCII,

relação esta que já foi descrita por diversos autores (STUBBS, 1993). Há

também evidências na literatura de que esse cofator inibe de forma seletiva a

trombina através da formação de um complexo bimolecular de 1:1 e que requer

que a interação do GAG seja capaz de facilitar a exposição dos sítios de

ligação à trombina (O'KEEFFE, 2004). Por outro lado, o DSL (1,0 μg/mL) foi

capaz de atingir cerca de 80% de inibição direta sobre a trombina, atividade

que não é exibida pelos DS de mamíferos, mesmo numa concentração 4 vezes

superior.

Esses resultados indicam que o DSL tem vantagens potenciais sobre o

DS de mamíferos, pois além de inibir a trombina via HCII, é um inibidor direto

dessa protease e possivelmente seja capaz de impedir sua ligação com o

substrato. Essas evidências, somadas ao fato de que poucos DS descritos na

literatura (AKIYAMA, NOBUKO e YOSHIDA, 1982; MASCELLANI et. al., 1993;

MAAROUFI et. al., 2006; MONSOUR et.al., 2009) apresentam os dois

mecanismos de inibição da trombina, tornam o DSL capaz de produzir uma

resposta anticoagulante mais previsível do que muitos DSs.

Dentro desse contexto, também é importante destacar que o fato do DS

de ascídia apresentar unidades dissacarídicas dissulfatadas (2,4 sulfatado)

semelhante ao DSL, sem possuir potencial de inibição diretamente sobre a

trombina, sugere que outros requerimentos estruturais, além de uma sequência

dissulfatada específica sejam importantes na atividade anti-IIa.

No ensaio de TTPa, o DS do camarão apresentou atividade

anticoagulante significativamente maior do que a de DS de mamíferos, o qual

mostrou atividade quase insignificante. Porém, apesar de ser sugerido que a

presença de 4-O-sulfatação nos resíduos de N-acetil-β-D-galactosamina seja

essencial para a atividade anticoagulante do DS (MAIMONE e TOLLEFSEN,

1990; PAVÃO, 1998), quando comparado à heparina comercial, o composto do

54 Discussão

camarão necessitou de doses 6 vezes maiores para prolongar o tempo de

coagulação em mais de 240 s. O desempenho anticoagulante do DSL pode

ainda estar relacionado com outros fatores além do grau de sulfatação do

GAG, como diferenças de glicosilação da protease ligante de GAG

(HUNTINGTON, 2003) ou a conformação adquirida durante a interação GAG-

proteína e exposição de sítio ativo (AL DIERI, 2003; KAMP, 2001). Além disso,

ao contrário da heparina e seus miméticos que são capazes de se ligar não

somente ao HCII e trombina, mas também à AT e assim inibir proteases, em

especial os fatores Xa e IIa, a atividade anticoagulante de moléculas de DS é

exibida apenas através da inibição da trombina via interação com o HCII,

tornando-o uma molécula seletiva na coagulação (MAIMONE e TOLLEFSEN,

1990). Assim, esta especificidade de interação do DSL juntamente com o fato

de que a AT está presente no plasma numa concentração cerca de 2 vezes

maior que o HCII (MACINTOSH, JAKUBOWSKI e OWEN, 1984), favorecendo

a ação da heparina, sugerem uma justificativa para a menor atividade

anticoagulante comparada do DSL.

Além do papel da trombina na cascata da coagulação, sua habilidade

em agir como um dos mais potentes ativadores plaquetários, bem como

ativador de um dos principais reguladores da trombose, o inibidor fibrinolítico

ativado por trombina (TFPI) (RUSSELL et.al., 2003), corrobora seu potencial

pró-trombótico. Deste modo, moléculas capazes de atuar inibindo a trombina,

podem mostrar efeitos sobre a trombose. Por isso, foi realizado um ensaio de

trombose induzida por FeCl3 em modelo de lesão da artéria carótida, onde

observou-se que o DSL foi capaz de duplicar o tempo de oclusão do vaso

quando comparado ao grupo controle não tratado. Tal potencial antitrombótico

do DS do camarão parece estar coerente com sua potente atividade inibitória

da trombina, visto o papel desta protease na fisiopatologia da trombose.

Porém, apesar de a relação da atividade anti-IIa via HCII por DS ser descrita

como essencial para a atividade antitrombótica do mesmo (PAVÃO, 1998),

Kozlowski e colaboradores relataram um DS (2,6-sulfatado) obtido de ascídia

com baixa atividade via HCII, porém capaz de inibir P-selectinas, modulando

assim, o efeito trombótico. Esta evidência, levou os autores a sugerir outro

mecanismo para atividade antitrombótica de DSs, além da inibição via HCII da

55 Discussão

trombina, mas possivelmente também através da diminuição do acúmulo de

plaquetas no vaso mediado pelas P-selectinas.

Durante a trombose, devido ao constante estímulo vascular, pode-se

haver complicações levando ao surgimento de outras patologias. Existe uma

estreita relação entre trombose e inflamação e essa comunicação está

baseada na capacidade da trombina em induzir a expressão de uma ordem de

citocinas pró-inflamatórias (como IL-6 e IL8), quimiocinas (tais como MCP-1) e

moléculas de adesão celular, promovendo recrutamento de monócitos para o

vaso (LEVI et. al., 2004). Além disso, a ativação plaquetária pela trombina,

estimula a expressão de P-selectinas que são responsáveis por aderir as

plaquetas aos leucócitos e células endoteliais, além de estimular a expressão

de fator tecidual por monócitos, promovendo um ciclo de geração de trombina

(SHEBUSKI, 2002).

Por esta razão, foi testada a capacidade do DSL em modular o processo

inflamatório em modelo de peritonite aguda induzida por Lipopolissacarídeo

(LPS). Tanto o DS do camarão quanto o de mamíferos se mostraram eficientes

em reduzir, em mais da metade, o recrutamento leucocitário para o sítio de

injúria, em especial a população de leucócitos do tipo polimorfonucleares,

primeiros tipos celulares a migrarem em um processo inflamatório agudo, como

os neutrófilos (HALLETT; LLOYDS, 1995). Comportamento anti-migratório

semelhante foi observado para dois DSs obtidos de ascídias, que assim como

o DSL, apresentam em sua constituição dissacarídica unidades contendo 2-O

sulfatação do IdoA, diferindo entre eles apenas no padrão de sulfatação do

resíduo de GalNAc (4-O e 6-O sulfatados) (KOZLOWSKI; PAVÃO; BORSIG,

2011). Apesar destes dois DSs de ascídias serem capazes de se ligar a P- e L-

selectinas e inibir o recrutamento leucocitário, quando comparados ao DS do

camarão necessitam de uma dose cerca de três vezes maior (1,5 mg/kg-1 de

DSL versus 4,0 mg/kg-1 de DSs de ascídias) para promover um efeito anti-

migratório similar ao exibido pelo DSL, sugerindo que outras peculiaridades

estruturais estejam ainda relacionados à este efeito, e por isso estudos mais

aprofundados necessitam ser realizados.

56 Discussão

Além disso, sabe-se que diversos GAGs, incluindo DS presentes em

cadeias de PGs, são capazes de se ligar a citocinas e fatores de crescimento e

assim mediar respostas inflamatórias e progressão tumoral, respectivamente

(MULLOY, 2005). As citocinas têm sido descritas como alvos clínicos mais

utilizados para o diagnóstico e tratamento de doenças com caráter inflamatório

e imunológico. Dentre as diversas citocinas relacionadas com a resposta pró-

inflamatória (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IFN-γ e TNF-α) as IL-1β, IL-6, e

TNF-α são as mais frequentemente descritas e avaliadas na resposta

inflamatória aguda, estando seus níveis relacionado com a gravidade da

inflamação (ZHANG; JIANXIONG, 2007). Por isso, o lavado peritoneal foi

submetido à dosagem destas citocinas pró-inflamatórias. Nesse estudo, foi

demonstrado que a administração do DS do camarão reduziu

significativamente os níveis de todas as citocinas testadas, sendo o maior

potencial de inibição observado para o TNF- α. O DS de mamíferos apresentou

potencial de inibição das citocinas semelhante ao DSL. Estes dados sugerem

um mecanismo importante pelo qual os compostos desempenhem seu efeito

anti-inflamatório em diversos pontos da inflamação, uma vez que as citocinas

atuam em várias etapas do processo inflamatório. Esta modulação pode ser

mediada pelos DSs tanto através do potente efeito inibitório sobre a trombina, a

qual é capaz de estimular citocinas, ou ainda por uma possível interação direta

com estes mediadores inflamatórios, ocasionado sua inibição.

Esta primeira ideia é reforçada por dados na literatura que descrevem o

papel inflamatório da trombina. A ligação da trombina à PAR-1 é capaz de

induzir a produção de diversas citocinas e fatores de crescimento e, juntamente

com o complexo FT-VIIa ativando PAR-2, é capaz de promover a expressão de

TNF-α, IL-1β e IL-6, além de hiperregular a infiltração neutrofílica e a resposta

inflamatória por macrófagos (CUNNINGHAM, 1999). A segunda hipótese, seria

que o composto do camarão possa estar funcionado com um inibidor

competitivo, impedindo assim que a citocina exerça seu papel biológico.

Possivelmente, o caráter polianiônico do DSL associado as suas peculiaridades

estruturais facilitem uma interação direta com as citocinas, o que poderia

impedir que estes mediadores se liguem aos seus respectivos receptores e

exerçam sua função pró-inflamatória. Dados da literatura revelam que há uma

57 Discussão

ordem de preferência na qual as citocinas se ligam aos diferentes GAGs:

heparina > DS > HS = CS (PROUDFOOT, 2001) e tem sido descrito que isto

pode estar relacionado à flexibilidade dos resíduos de IdoA presentes na

molécula. Um estudo comparativo sobre o efeito de DS e CS na interação com

as citocinas mostraram valores de IC50 bastante distintos (22 versus 1200

µg/mL, respectivamente) (KUSCHERT, 1999), corroborando o potencial de

modulação apresentado aqui. O papel das citocinas sobre o processo

inflamatório é crucial para o sucesso deste evento e assim, estes dados

sugerem pela primeira vez um mecanismo de ação de modulação da

inflamação por DS, além da interação com P-selectinas já descrito

(KOZLOWSKI, 2011).

Além destas características inflamatórias avaliadas no ensaio de

peritonite, foi observado que os animais em experimento pertencente ao grupo

tratado com os compostos tipo DS, não apresentaram piloereção, sinal clínico

característico da febre, enquanto os animais sem tratamento, mostraram-se

estáticos e com piloereção visível. As reações frequentemente observadas em

doenças inflamatórias como a febre são moduladas por citocinas, dentre estas

as interleucinas IL-1β e IL-6, as quais atuam como mediadores pirogênicos,

promovendo a febre durante patologias agudas e crônicas (ISHIHARA;

HIRANO, 2002; MASTERS et al., 2010), no intuito de eliminar o agente

agressor. Deste modo, o papel inibitório exibido pelo DSL sobre estas citocinas

especificamente, pode ainda sugerir um desempenho antipirético, atenuando

uma das mais recorrentes manifestações clínicas da inflamação, a febre.

Porém, outros experimentos precisam ser realizados para elucidar tal resposta.

Ainda durante a inflamação diversos mecanismos de resposta ao trauma

e/ou infecção executam um papel crucial, tais como a coagulação e fibrinólise,

ativação do sistema complemento e diferenciação de células T, além da

proliferação endotelial e angiogênese no reparo tecidual, entre outros (ESMON,

2003). Por conseguinte, o DS do camarão foi avaliado quanto ao seu efeito

sobre a angiogênese e mostrou potente capacidade inibitória na formação

capilar quando comparado ao controle positivo. Tal efeito foi dose dependente,

mostrando atividade antiangiogênica em todas as doses testadas, chegando a

uma total inibição na formação vascular na maior dose. O ensaio de

58 Discussão

toxicicidade avaliado por MTT (dados não mostrados), mostrou que nestas

concentrações o DS do camarão foi incapaz de apresentar efeito citotóxico

sobre as células endoteliais. No ensaio de MTT, a redução do tetrazólio em

cristal de formazam através das enzimas mitocondriais é possível apenas em

células viáveis. Assim, pode-se inferir que os compostos não apresentam o

potencial antiangiogênico, por inibir a viabilidade celular e que outros

mecanismos de inibição estariam envolvidos.

Apesar de se mostrar como um resultado preliminar, uma vez que se

trata de um único teste in vitro, o ensaio em matrigel pode sugerir que a

potente inibição da trombina mediada pelo DS do camarão, constitui um fator

positivo para a inibição da neovascularização. Esta protease é capaz de

modular mecanismos diretamente relacionados com a angiogênese, tais como:

a proliferação de células endoteliais, a ativação do principal fator pró-

angiogênico (VEGF), expressão dos receptores intimamente relacionados com

o estímulo angiogênico (KDR e flt-1) (MARAGOUDAKIS; TSOPANOGLOU;

ANDRIOPOULOU, 2002), bem como ativação plaquetária, a qual resulta na

liberação de grânulos que contêm fatores pró-angiogênicos (ITALIANO et al.,

2008). Não obstante, a trombina atua ainda estimulando a produção de

citocinas como, IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, além de metaloproteinases de matriz

(MMPs) (DREYFUSS et al., 2010), as quais participam ativamente do processo

de remodelagem tecidual durante a angiogênese. Estas afirmações,

corroboram com os dados aqui demonstrados, uma vez que o DSL foi capaz de

inibir a produção tanto de IL-6, IL-1β, bem como de TNF-α, o que pode

contribuir para o expressivo efeito antiangiogênico do composto.

Outro mecanismo sugerido de atuação antiangiogênica para o DSL é

que este composto seja capaz de interagir diretamente com fatores

angiogênicos e/ou seus receptores, inibindo os efeitos mitogênicos

normalmente exercidos por esta interação, ao competir pela ligação dos fatores

aos seus respetivos receptores e promovendo assim seu efeito pró-

angiogênico. Outro GAG obtido do camarão L. vannamei, um heparinoide com

características estruturais peculiares, também mostrou potente efeito

antiangiogênico, através da interação com os fatores FGF-2, EGF e VEGF

(DREYFUSS et al., 2010), mediadores importantes do processo angiogênico.

59 Discussão

Apesar da correlação entre o potencial antiangiogênico e insignificante

conteúdo de grupos 2-O-sulfato descrita na literatura (COHEN et. al, 1995), o

potente efeito sobre a neovascularização mostrado pelo DS isolado da mesma

espécie, sugere que o conteúdo ou a posição de grupamentos sulfato, não seja

uma condição ditatória para este potencial biológico.

Além de todos os potenciais aqui reportados, o DSL do camarão

mostrou reduzido potencial de sangramento, quando comparado à heparina

padrão e até mesmo ao DS de mamíferos. O DSL chegou a apresentar

praticamente ausência de sangramento e mesmo em uma dose 5 vezes maior,

manteve o efeito hemorrágico menor do que o apresentado pelo DS de

mamíferos na concentração de 100μg/mL. A forte ligação da heparina a

receptores que foram expostos durante uma ferida, resulta em incontrolável

hemorragia, implicando uma limitação para os diversos e potentes atividades

biotecnológicas descritas para a heparina, inclusive a anti-inflamatória. Tem

sido descrito que este efeito está relacionado com a presença de sulfatação no

C6 dos resíduos de glucosamina (DIETRICH, 1979). Deste modo, a baixa

atividade hemorrágica apresentada pelos DSL é um indicativo de que esse

composto não se liga com o mesmo grau de afinidade aos referidos receptores.

A grande heterogeneidade estrutural dos GAGs podem afetar suas

afinidades de se ligarem a proteínas, fazendo assim, com que estas moléculas

possam promover efeitos biológicos e por sua vez, exibir potenciais

biotecnológicos. Por isso, novas pesquisas a cerca destes polissacarídeos

sulfatados, em especial aqueles com pouca elucidação sobre distribuição,

estrutura e interação biológica, se fazem imprescindíveis. Os resultados aqui

mostrados, sugerem que este DS isolado do camarão apresente propriedades

biológicas que favorecem seu uso como potentes candidatos no tratamento da

inflamação, bem como suas complicações como a trombose e angiogênese,

sem apresentar complicações hemorrágicas. Além disso, a composição

estrutural peculiar do composto tipo DS nunca antes descrito na literatura para

crustáceos, aponta esta molécula como um notável alvo biotecnológico com

perspectivas de aplicações a serem exploradas.

60 Conclusão

CONCLUSÃO

Com base nos dados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:

O dermatam sulfato isolado do camarão L. vanammei é constituído

principalmente por dissacarídeos dissulfatados (2,4-sulfatado), estrutura

peculiar identificada pela primeira vez em crustáceos.

A atividade anticoagulante do DSL é mediada pela inibição da trombina,

principalmente via HCII.

O potencial do DSL em inibir a migração leucocitária pode estar

diretamente associada à sua capacidade de inibir a trombina e

consequentemente reduzir os níveis de algumas citocinas pró-

inflamatórias.

Experimentos in vivo mostram que o DSL apresenta atividade

antitrombótica.

O composto tipo DS inibe o processo de angiogênese in vitro.

O DSL exibe um reduzido efeito hemorrágico.

Esta molécula pode ser um alvo biotecnológico interessante para o

estudo de moduladores de processos fisiopatológicos nos quais a

trombina está envolvida como trombose, inflamação e angiogênese.

61 Referências

REFERÊNCIAS

ABE K, SHOJI M, CHEN J, et al. Regulation of vascular endothelial growth

factor production and angiogenesis by the cytoplasmic tail of tissue factor. Proc

Natl Acad Sci USA 1999;96:8663–8668.

AKATSU, C. et al. Dermatan sulfate epimerase 2 is the predominant isozyme in

the formation of the chondroitin sulfate/dermatan sulfate hybrid structure in

postnatal developing mouse brain. Glycobiology, v. 21, n. 5, p. 565–574, 2011.

AKIYAMA, F., NOBUKO, S. E YOSHIDA, K. Anticoagulant Activity of Dermatan

Polysulfates. Jounal of Experimental Medicine, p. 359–365, 1982.

ALTINBAS, M. et al. A randomized clinical trial of combination chemotherapy

with and without low-molecular-weight heparin in small cell lung cancer. J.

Thromb. Haemos t. 2004;2, 1266–127

BACHLI, E.B. et al. Factor Xa and thrombin, but not factor VIIa, elicit specific

cellular responses in dermal fibroblast s. J. Thromb. Haemos 2003;t.1, 1935–

1944.

BARLEON, B. et. al. Migration of human mono-cytes in response to vascular

endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1.

Blood. 1996;87:3336-3343.

BASELGA, J. Why the epidermal growth factor receptor? The rationale for

cancer therapy. Oncologist 2002;7:2-8.

BELTING M, DORRELL MI, SANDGREN S, et al. Regulation of angiogenesis

by tissue factor cytoplasmic domain signaling. Nat Med 2004;10:502–509.

BLINDER, M.A, ANDERSSON T.R, ABILDGAARD U & TOLLEFSEN D.M

Heparin cofactor IIOslo. Mutation of Arg-189 to His decreases the affinity for

dermatan sulfate. J Biol Chem 1989;264 , 5128 – 5133.

BORENSZTAJN, K. et al. Factor Xa stimulates proinflammatory and profibrotic

responses in fibroblasts via protease-activated receptor -2 activation. Am. J.

Pathol. 2008;172, 309 – 320.

62 Referências

BRITO, A.S. et. al. A non-hemorrhagic hybrid heparin/heparan sulfate with

anticoagulant potential. Carbohydrate Polymers 99. 2013;372– 378

BRITO, A.S. et. al. Anti-inflammatory properties of a heparin-like

glycosaminoglycan with reduced anti-coagulant activity isolated from a marine

shrimp. BioMed Chem 2008;16 :9588–95.

BROWDER, T., FOLKMAN, J. & PIRIE-SHEPHERD, S. The hemostatic system

as a regulator of angiogenesis. J. Biol. Chem. 2002;75, 1521–1524.

CAPILA I, LINHARDT RJ Heparin-protein interactions. Angew Chem Int Ed

Engl 2002;41: 391–412.

CARMELIET, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature.

2005;438:932-936.

CHAVANTE, S. F. ; SANTOS, E. A, OLIVEIRA, F. W. ; GUERRINI, M., CASU,

B., DIETRICH, C. P ; NADER, H. B. A novel heparan sulphate with high degree

of n-sulphation and high heparin cofactor-ii activity from the brine shrimp

Artemia franciscana. International Journal of Biological Macromolecules, v.

27, p. 49-57, 2000.

CHAVANTE, S. F., BRITO, A. S. ; LIMA, M., YATES, E., NADER, H. B.,

GUERRINI, M., TORRI, G., BISIO, A. A heparin-like glycosaminoglycan from

shrimp containing high levels of 3-O-sulfated d-glucosamine groups in an

unusual trisaccharide sequence. Carbohydrate Research v. 2014. 390, p. 59-

66.

CHEN J, BIERHAUS A, SCHIEKOFER S, et al. Tissue factor — a receptor

involved in the control of cellular properties, including angiogenesis. Thromb

Haemost 2001;86:334–345.

CHENG, F. et. al. Patterns of uronosyl epimerization and 4-/6-O-sulphation in

chondroitin/dermatan sulphate from decorin and biglycan of various bovine

tissues. Glycobiology 1994, 4:685-696.

CHU, A.J. Tissue factor mediates inflammation. Arch Biochem Biophys. 2005

Aug 15;440(2):123-32.

63 Referências

COHEN, T., GITAY-GOREN, H., SHARON, R., SHIBUYA, M., HALABAN, R.,

LEVI, B. Z., NEUFELD, G. VEGF121, a vascular endothelial growth factor

(VEGF) isoform lacking heparin binding ability, requires cell-surface heparin

sulfates for efficient binding to the VEGF receptors of human melanoma cells.

Journal of Biology Chemistry. 1995; 270: 11322–6.

CONSOLARO, R. B. Inflamação: História, Tipos e Causas. Uningá Review, p.

53–56, 2010.

CRUZ, WO & DIETRICH, CP. - Antihemostatic effect of heparin counteracted

by adenosine triphosphate. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1967. 126: 420-426.

DE JONGE, E, DEKKERS, P. E, CREASEY, A. A, HACK, C. E, PAULSON, S.

K, KARIM, A, KESECIOGLU, J., LEVI, M, VAN DEVENTER, S. J, VAN DER

POLL, T. Tissue factor pathway inhibitor dose-dependently inhibits coagulation

activation without influencing the fibrinolytic and cytokine response during

human endotoxemia. Blood. 2000 Feb 15;95(4):1124-9.

DINARELLO, C. A. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-

1 family. Annual Review of Immunology. 2009. 27, 519-550.

DISTLER, J.H., HIRTH, A., KUROWSKA-STOLARSKA, M., GAY, R.E., GAY,

S., DISTLER, O. Angiogenic and angiostatic factors in the molecular control of

angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 2003;47:149-161.

DREYFUSS JL, et. al.. Diferences in the expression of glycosaminoglycans in

human fibroblasts de rived from gingival over growths is related to TGF-beta up-

regulation. Growth Factors 2010;28 :24–33.

DREYFUSS, J. L. et al. A heparin mimetic isolated from a marine shrimp

suppresses neovascularization. Journal of Thrombosis and Haemostasis, v.

8, n. 8, p. 1828–1837, 2010.

DREYFUSS, JL. et. al. Heparan sulfate proteoglycans: structure , protein

interactions and cell signaling. Academic Bras Cienc 2009;81:409–29.

64 Referências

DVORAK HF, BROWN LF, DETMAR M, DVORAK AM. Vascular permeability

factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and

angiogenesis. Am J Pathol. 1995;146:1029-1039.

EBRABEM, Q, MINAMOTO, A, HOPPE G. Triamcinolone acetonide inhibits IL-

6- and VEGF-induced angiogenesis downstream of the IL-6 and VEGF

receptors.

ENHOLM B, PAAVONEN K, RISTIMAKI A, et al. Compari-son of VEGF, VEGF-

B, VEGF-C and Ang-1 mRNA regulation by serum, growth factors,

oncoproteins-a and hypoxia. Oncogene. 1997;14:2475-2483.

ESMON, C. T.; ESMON, C. T. Inflammation and thrombosis. Journal of

thrombosis and haemostasis : JTH, v. 1, n. 7, p. 1343–8, 2003.

ESMON, C.T, Biochem. Soc. Trans 2005;33:401.

FALEIRO, L. R.; ARAUJO, L. H. R.; VARAVALLO, M. A. A terapia anti-TNF-a

na artrite reumatóide. Semina: Ciências Biológicas e da Saúde, v. 32, n. 1, p.

77–94, 2011.

FEGHALI, C. A; WRIGHT, T. M. Cytokines in acute and chronic inflammation.

Frontiers in bioscience : a journal and virtual library, v. 2, p. d12–d26, 1997.

FERREIRA,T.M., MEDEIROS, M.G., DIETRICH, C.P., NADER, H.B. Structure

of heparan sulfate from the fresh water mollusk Anomantidae sp: sequencing of

its disaccharide units. Int Journal of Biochemistry. 1993; 25:1219-25.

GILDBERG, A.; STENBERG, E. A New Process for Advanced Utilization of

Shrimp Waste. Process Biochemistry. 2001. 36: 809-812.

GRAY, HOGWOOD E MULLOY, R. Lever et al. (eds.), Heparin - A Century of

Progress, Handbook of Experimental Pharmacology 207, DOI 10.1007/978-3 -

642-23056-1_3, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012.

HALLETT, M. B.; LLOYDS, D. Neutrophil priming: the cellular signals that say

“amber” but not “green”. Immunology Today, v. 16, n. 6, p. 264–268, 1995.

65 Referências

HIRANO, T. Interleukin 6 and its Receptor: Ten Years Later. International

Reviews of Immunology. 1998. Volume 16, Issue 3-4.

HUANG, Y. C, LI Z, HARDER, S. D, SOUKUP, J. M. Apoptotic and

inflammatory effects induced by different particles in human alveolar

macrophages. Inhal Toxicol. 2004 Dec 15;16(14):863-78.

ISHIHARA, K.; HIRANO, T. Molecular basis of the cell specificity of cytokine

action. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, v. 1592, n. 3,

p. 281–296, 2002.

ITALIANO, J. E. et al. Angiogenesis is regulated by a novel mechanism: Pro-

and antiangiogenic proteins are organized into separate platelet α granules and

differentially released. Blood, v. 111, n. 3, p. 1227–1233, 2008.

JOHNSON, H.J.Characterization of epiphycan, a small proteoglycan with a

leucine-rich repeat core protein. J Biol Chem. 1997;272, 18709–18717.

KLERK, C.P. et al. The effect of low molecular weight heparin on survival in

patients with advanced malignancy. J. Clin. Oncol. 2005;23, 2130– 2135

KOZLOWSKI, E. O. et al. Dermatan sulfate in tunicate phylogeny: order-specific

sulfation pattern and the effect of [→4IdoA(2-sulfate)β-1→3GalNAc(4-sulfate)β-

1→] motifs in dermatan sulfate on heparin cofactor II activity. BMC

biochemistry, v. 12, n. 1, p. 29, 2011.

KOZLOWSKI, E. O.; PAVAO, M. S. G.; BORSIG, L. Ascidian dermatan sulfates

attenuate metastasis, inflammation and thrombosis by inhibition of P-selectin.

Journal of Thrombosis and Haemostasis, v. 9, n. 9, p. 1807–1815, 2011.

KUMAR, V.; ABBAS A. K.; FAUSTO, N. Robbins e Cotran Patologia Estrutural

e Funcional. 7ª. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005.

LEVI, M., Med. Progr. 2003;1:8.

LEY, K., LAUDANNA, C., CYBULSKY, M.I., NOURSHARGH, S. Getting to the

site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review.

2007;7:678–89.

66 Referências

LIMA, M. A. et al. Low molecular weight heparins: Structural differentiation by

spectroscopic and multivariate approaches. Carbohydrate Polymers, v. 85, n.

4, p. 903–909, 2011.

LIMA, M. A., et al. Antithrombin stabilisation by sulfated carbohydrates

correlates with anticoagulant activity. Med Chem Comm. 2013;4(5), 870–

873.

LISS C, FEKETE, M. J, HASINA R, LAM C. D, LINGEN, M. W. Paracrine

angiogenic loop between head-and-neck squamous-cell carcinomas and

macrophages. Int J Cancer. 2001 Sep;93(6):781-5.

LIU, L.; LINHARDT, R. J.; ZHANG, Z. Quantitative analysis of anions in

glycosaminoglycans and application in heparin stability studies. Carbohydrate

Polymers, v. 106, n. 1, p. 343–350, 2014.

MAAROUFI, R.M., JOZEFONWICZ, M., TAPON-BRETAUDIÈRE, J., FISCHER,

A. M. Thrombin inhibition by antithrombin in the presence of oversulfated

dermatan sulfates. Carbohydrate Research. 2006;341(5):672–6.

MACDONALD, N.J, et al. Endostatin binds tropomyosin. A potential

modulator of the antitumor activity of endostatin. Journal of Biology

Chemistry. 2001;276:25190-25196.

MACINTOSH, S., JAKUBOWSKI, H., OWEN, W. G. Regulation of clearance

and inhibition of intra-vascular thrombin. Fed. Proc. 1984. 43, 1946.

MAIMONE, M., AND TOLLEFSEN, D.M. Journal of Biology Chemistry. 1990;

265,18263–18271.

MAIMONE, M.M & TOLLEFSEN, D.M Structure of a dermatan sulfate

hexasaccharide that binds to heparin cofactor II with high affinity. J Biol Chem.

1990;265 ,18263 –18271.

MALMSTROM A, BARTOLINI B, THELIN MA, PACHECO B & MACCARANA M

Iduronic acid in chondroitin/dermatan sulfate: biosynthesis and biological

function. J Histochem Cytochem 2012;60, 916– 925.

67 Referências

MALMSTROM, A. Biosynthesis of Dermatan Sulfate. 198411. v. 259, n. 1, p.

161–165.

MANSOUR, M. B. Hassine, M; Jandrot-Perrus, M; Chaubet, F; Maaroufi, R.

Characterization of a novel dermatan sulfate with high antithrombin activity from

ray skin (Raja radula). Thrombosis Research. 2009;123 887-894.

MARAGOUDAKIS, M. E. TSOPANOGLOU N. E. AND ANDRIOPOULOU P.

Mechanism of thrombin-induced angiogenesis. Biochemical Society

Transactions. 2002. Volume 30, part 2.

MARAGOUDAKIS, M. E.; TSOPANOGLOU, N. E.; ANDRIOPOULOU, P.

Mechanism of thrombin-induced angiogenesis. Biochem Soc Trans, v. 30, n.

2, p. 173–7., 2002.

MARKIEWICZ, M., RICHARD, E., MARKS, N., e LUDWICKA-BRADLEY, A.

Impact of Endothelial Microparticles on Coagulation, Inflammation, and

Angiogenesis in Age-Related Vascular Diseases. Journal of Aging Research.

2013, Article ID 734509, 11 pages.

MASCELLANI, G., LIVERANI, L., BIANCHINI, P., PARMA, B., TORRI, G.,

BISIO, A. Structure and contribution of the heparin cofactor II-mediated

inhibition of thrombin of naturally oversulphated sequence of dermatan

sulphate. Biochemichal Journal. 1993; 296:639–48.

MASOOD, R; Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an autocrine growth

factor for VEGF receptor positive human tumors. Bood Journal. 2001;98:

1904-1913.

MASTERS, S. L. et al. Horror Autoinflammaticus: The Molecular

Pathophysiology of Autoinflammatory Disease. Inflammation. p. 621–668,

2010.

MICHALOPOULOS, G. K. Liver Regeneration. Journal of cellular physiology,

v. 207, n. 1, p. 12–22, 2007.

MILLS, K. H. G.; DUNNE, A. Immune modulation: IL-1, master mediator or

initiator of inflammation. Nature medicine, v. 15, n. 12, p. 1363–1364, 2009.

68 Referências

MONROE, D. M., HOFFMAN, M., ROBERTS, H. R. Platelets and thrombin

generation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002 Sep 1;22(9):1381-9.

Review.

MONZAVI-KARBASSI, B. et. al. Kieber-Emmons T. Chondroitin sulfate

glycosaminoglycans as major P-selectin ligands on metastatic breast cancer

cell lines. Int J Cancer. 2007;120:1179–1191.

NADER, H. ; CHAVANTE, S. F. ; SANTOS, E. A ; OLIVEIRA, F. W. ;

JERONIMO, S. M. ; PAIVA, J. F. ; MEDEIROS, G. F ; CASTRO, R. A. ;

DIETRICH, C. P . Heparan sulfate and heparins similar compounds performing

the same functions in vertebrates and invertebrates. Brazilian Journal of

Medical and Biological Research , v. 325, p. 529-538, 1999.

NALDINI, A., PUCCI, A., CARRARO, F. Hypoxia induces the expression and

release of interleukin 1 receptor antagonist in mitogen-activated mononuclear

cells. Cytokine. 2001 Mar 21;13(6):334-41.

NIERODZIK, M.L & KARPATKIN, S. Thrombin induces tumor growth,

metastasis, and angiogenesis: Evidence for a thrombin-regulated dormant

tumor phenotype. Cancer cell. 2006. 335-10.

NYLANDER, M. The role of platelet thrombin receptors PAR1 and PAR4 in

platelet activation. [s.l: s.n.].

OHTAKE-NIIMI, S. et al. Mice deficient in N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O-

sulfotransferase are unable to synthesize chondroitin/dermatan sulfate

containing N-acetylgalactosamine 4,6-bissulfate residues and exhibit decreased

protease activity in bone marrow-derived mast cells. Journal of Biological

Chemistry, v. 285, n. 27, p. 20793–20805, 2010.

OKAJIMA K. Regulation of inflammatory responses by natural anticoagulants.

Immunology Review. 2001 Dec;184:258-74. Review.

PAV??O, M. S. G. et al. A unique dermatan sulfate-like glycosaminoglycan from

ascidian: Its structure and the effect of its unusual sulfation pattern on

anticoagulant activity. Journal of Biological Chemistry, v. 270, n. 52, p.

31027–31036, 1995.

69 Referências

PAV??O, M. S. G. et al. Highly sulfated dermatan sulfates from ascidians.

Structure versus anticoagulant activity of these glycosaminoglycans. Journal of

Biological Chemistry, v. 273, n. 43, p. 27848–27857, 1998.

PAV??O, M. S. G. Structure and anticoagulant properties of sulfated

glycosaminoglycans from primitive Chordates. Anais da Academia Brasileira

de Ciencias, v. 74, n. 1, p. 105–112, 2002.

PAVÃO, M. S. G. Glycosaminoglycans analogs from marine invertebrates:

structure, biological effects, and potential as new therapeutics. Frontiers in

cellular and infection microbiology, v. 4, n. September, p. 123, 2014.

PENC, S. F. et al. Dermatan sulfate released after injury is a potent promoter of

fibroblast growth factor-2 function. Journal of Biological Chemistry, v. 273, n.

43, p. 28116–28121, 1998.

PEREIRA, M. S.; MULLOY, B.; MOURA, P. A S. Structure and Anticoagulant

Activity of Sulfated Fucans. The Journal of biological chemistry, v. 274, n.

12, p. 7656–7667, 1999.

QUAGLIA, L. J. C. Estudo da qualidade da água do canal de Taperoá

(Valença-BA): implicações na carcinicultura marinha. Tese de Mestrado. (Curso

de Mestrado em Produção Aquática do Instituto de Biologia da Universidade

Federal da Bahia). P, 118. 1993.

QUTEBA, E., ATSUSHI, M., GEORGE, H., BELA, A., JONATHAN, E. S.

Triamcinolone acetonide inhibits IL-6- and VEGF-induced angiogenesis

downstream of the IL-6 and VEGF receptors. Investigative Ophthalmology &

Visual Science. 2006;

RABINOVITCH, A. An update on cytokines in the pathogenesis of insulin-

dependent diabetes mellitus. Diabetes/Metabolism Reviews, v. 14, n. 2, p.

129–151, 1998.

RASENTE, R. EGITTO, P. CALABRESE, G.C. Low molecular mass dermatan

sulfate modulates endothelial cells proliferation and migration. Carbohydrate

Research 356 2012;233–237.

70 Referências

RAUCH, BH.et al. Factor Xa releases matrix metalloproteinase-2(MMP-2) from

human vascular smooth muscle cells and stimulates the conversion of pro-

MMP-2 to MMP -2: role of MMP-2 in factor Xa-induced DNA synthesis and

matrix invasion. Circ. Res. 2002;90, 1122 – 1127

SAINSON, R.C. et al. Cell-autonomous notch signaling regulates endothelial

cell branching and proliferation during vasculartubulogenesis. FASEB Journal.

2005;19:1027-1029.

SAMPAIO, L. et. al. Heparins and heparans sulfates. Structure, distribution and

protein interactions. In: Verli H, ed. Insights into Carbohydrate Structure and

Biological Function. 1st edn .Kerala: TransworldResearch Network, 2006: 1–

24 .

SANTOS JÚNIOR, J.C.M. Rubor, calor, tumor e dor e o paciente grave.

Revista Brasileira de Coloproctologia. 2003. v. 23 n. 3, p. 206-210.

SENGER DR, VAN DE WATER L, BROWN LF, et al. Vascular permeability

factor (VPF, VEGF) in tumor biology. Cancer Metastasis Rev. 1993;12:303-

324.

SIEMEISTER, G.Reversion of deregu-lated expression of vascular endothelial

growth factor in human renal carcinoma cells by von Hippel-Lindau tumor

suppressor protein. Cancer Res. 1996;56:2299-2301.

SILBERT, J. E.; SUGUMARAN, G. Biosynthesis of Chondroitin/Dermatan

Sulfate. IUBMB life, v. 54, p. 177–186, 2002.

SIMONCINI, T. “Mechanisms of action of estrogen receptors in vascular cells:

relevance for menopause and aging,” Climacteric, 2009. vol. 12, no. 1, pp. 6–

11,

SIZOVA, L. Approaches to the treatment of early rheumatoid arthritis with

disease-modifying antirheumatic drugs. British Journal of Clinical

Pharmacology, v. 66, n. 2, 2008.

SLUPSKY JR, KALBAS M, WILLUWEIT A, HENN V, KROCZEK RA, MÜLLER-

BERGHAUS G. Activated platelets induce tissue factor expression on human

71 Referências

umbilical vein endothelial cells by ligation of CD40. Thrombosis Haemostasis.

1998. Dec;80(6):1008-14.

SOLER, R.Urinary glycosaminoglycans as biomarker for urothelial injury: is it

possible to discriminate damage from recovery? Urology 2008;72 :937–42

SRIRANGAN, S. AND CHOY, E. H. The role of Interleukin 6 in the

pathophysiology of rheumatoid arthritis. Life Sciences, v. 140, p. 29–36, 2015.

STUBBS, M. T. e BODE, W. A player of many parts: the spotlight fails on

thrombin´s structure. Thrombosis Research. 1993. 69, 1-58.

SUGAHARA K & MIKAMI T. Chondroitin/dermatan sulfate in the central

nervous system. Curropin Struct Biol. 2007;17, 536–545.

TAYLOR, K. K.; RUDISILL, J. A.; GALLO, R. L. Structural and sequence motifs

in dermatan sulfate for promoting fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and FGF-7

activity. Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 7, p. 5300–5306, 2005.

Taylor, K.R., and Gallo, R.L., FASEB J., 2006;20, 9.

TERSARIOL, I.S., NADER, H.B., AND DIETRICH, C.P. The antihemostatic

activity ofheparin correlates to the inhibition of myosin ATPase. Arq. Biol.

TecnoL 1987;30, 110.

THAIRU N, KIRIAKIDIS S, DAWSON P, PALEOLOG E. Angiogenesis as a

therapeutic target in arthritis in 2011: learning the lessons of the colorectal

cancer experience. Angiogenesis. 2011;14: 223-234.

TIEDEMANN, K, et. al. A Regulation of the chondroitin/dermatan fine structure

by transforming growth factor-beta1 through effects on polymer-modifying

enzymes. Glycobiology 2005;15, 1277 – 1285.

TOVAR, A. M. F. et al. Dermatan sulfate is the predominant antithrombotic

glycosaminoglycan in vessel walls: Implications for a possible physiological

function of heparin cofactor II. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular

Basis of Disease, v. 1740, n. 1, p. 45–53, 2005.

72 Referências

TROWBRIDGE, J. M.; GALLO, R. L. Dermatan sulfate: new functions from an

old glycosaminoglycan. Glycobiology, v. 12, n. 9, p. 117R–125R, 2002.

TROWBRIDGE, J.M E GALLO, R.L. Dermatan Sulfate: new functions of an old

glycosaminoglican. Carbohydrate Polymers 99 2013;372– 378.

VAN VEEN, S. Q., MEIJERS, J. C., LEVI, M., VAN GULIK, T. M.,

BOERMEESTER, M. A. Effects of intra-abdominal administration of

recombinant tissue plasminogen activator on coagulation, fibrinolysis and

inflammatory responses in experimental polymicrobial peritonitis. Shock. 2007

May;27(5):534-41.

VANDERSCHUEREN, et. al. From Prolonged Febrile Illness to Fever of

Unknown Origin. Arch International Medicine. 2003. 163: 1033-41.

VARY, T.C. e KIMBALL, S. R. Regulation of hepatic protein synthesis in chronic

inflammation. American Journal of Physiology. 1992. 262, 445-452.

VERSTEEG, H. H., e RUF, W. Emerging insights in tissue factor-dependent

signaling events. Seminaries of Thrombosis and Hemostasis. 2006;32, 24.

VILLENA J, BRANDAN E. Dermatan sulfate exerts an enhanced growth factor

response on skeletal muscle satellite cell proliferation and migration. J Cell

Physiol. 2004;198:169–178.

WALTENBERGER, J. Different signal transduc-tion properties of KDR and Flt1,

two receptors for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem.

1994;269:26988-26995.

WIESELER-FRANK, J., MAIER, S.F., WATKINS, L.R. Glial activation and

pathological pain. Neurochemical International. 2004, 45:389–395.

YAMADA, S., SUGAHARA, K. & OZBEK, S. Evolution of glycosaminoglycans:

comparative biochemical study. Commun Integr Biol 2011;4, 150–158.

YAMADA, S.; SUGAHARA, K.; ÖZBEK, S. Evolution of glycosaminoglycans:

Comparative biochemical study. Communicative and Integrative Biology, v.

4, n. 2, p. 150–158, 2011.

73 Referências

ZACHARSKI, L. et. al. Cellular localization of enzymatically-active thrombin in

intact tissue by hirudin binding. Thromb. Haemost. 1995;73, 793–797.

ZHANG, J.-M. AND A.; JIANXIONG. Cytokines, Inflammation and Pain. Int

Anesthesiol Clin., v. 45, n. 2, p. 27–37, 2007.

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