UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · Dedico esta pesquisa em primeiro lugar a Deus por ter me ... na preparação de amostras por Extração ... para o solvente. 82

ANDRÉA FRANCISCA FERNANDES BARBOSA

OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE

HIDROCARBONETOS POLICICLICOS AROMÁTICOS: APLICAÇÃO EM ÁGUA

DO RIO POTENGI

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Química (PPGQ) do Centro de Ciências

Exatas e da Terra da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como requisito parcial para a

obtenção do título de Doutor em Química.

Orientadores:

Profa. Dra. Fabiana R. G. e Silva Hussein

Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo

Prof. Dr. Djalma Ribeiro da Silva

NATAL - RN

2008

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial de Química

Barbosa, Andréa Francisca Fernandes. Otimização de metodologias para determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos:aplicação em água do Rio Potengi / Andréa Francisca Fernandes Barbosa. Natal, RN, 2009. 162 f. Orientadora: Fabiana Roberta Gonçalves e Silva Hussein Co-Orientador : Djalma Ribeiro da Silva C0-orientador: Jailson Vieira de Melo

Tese (Doutorando em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química. 1. Hidrocarboneto- Tese. 2. Hidrocarboneto – policíclicos - Tese 3. Análise de HPA’s -

Tese. 4. Policíclicos aromáticos - Tese. 5. Cromatografia Gasosa – Tese. I. Hussein, Fabiana Roberta Gonçalves e Silva. II. Silva, Djalma Ribeiro da. III. Melo Jailson Vieira. VI. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. V. Título.

RN/UFRN/BSE- Química CDU 661.715

___________________________________________________________________________

Andréa Francisca Fernandes Barbosa

DEDICATÓRIA

Dedico esta pesquisa em primeiro lugar a Deus por ter me dado a vida, aos meus

pais (Ana e José memória) pela educação, ao meu querido esposo Jardel pela

companhia e compreensão.

___________________________________________________________________ Andréa Francisca Fernandes Barbosa

AGRADECIMENTOS

- A Deus pela grande oportunidade de aprendizado que me deste nesta maravilhosa

vida.

- A meus queridos pais pela sua grande força, mesmo morando longe de mim.

- A minha prima Graça, esposo e filhos pelo grande apoio que me deram.

- Em memória ao meu irmão Joseano que muito amava.

- Aos meus primos e tios que muito me ajudaram dando uma grande força.

- Aos amigos universitários pela presença, amizade e companhia no dia-a-dia, Luciana

Galvão, Roberto, Rina, Conceição, Loilde, Sharon, Danyelle, Adriana, Fernanda,

Emily, Veva, Aécia e todos os outros.

- Aos amigos Funcionários da UFRN, Francisco, Alderi, Vera, Nice, Fernando, Alberto,

Nireide, Flávia, Severino e todos os outros.

- Em especial, em memória a funcionária Jesus pelo seu grande carisma.

- Aos professores que sempre auxiliaram no meu desenvolvimento e pela amizade,

Glícia, Verônica, Bartolomeu,Fátima, Nedja, e outros.

- A Rejânia pela sua grande força.

- Em especial, aos Professores Fabiana, Jailson e Djalma pela oportunidade e pelo voto

de confiança.

- Em especial, aos amigos que muito me ajudaram e pelo crédito de confiança: Katarina,

Débora, Adailton, Patrícia, Aline, Dayanne, Kate e Emanuel.

- A secretária da Pós Graduação em Química, Gisele, por sua gentil atenção.

___________________________________________________________________________


RESUMO

Este trabalho tem como objetivo detectar hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs) através de técnicas analíticas otimizadas, tais como: Cromatografia Gasosa com

Detector de Ionização de Chama (CGDIC), Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria

de Massa (CGEM), Espectroscopia de Fluorescência Molecular e Teor de Óleos e Graxas

(TOG). Aplicar a Quimiometria, Planejamento Fatorial 23, na preparação de amostras por

Extração Líquido-Líquido. A preparação da amostra utilizada foi à extração líquido-líquido e

nesta amostragem foi utilizado fatores para aplicação do planejamento fatorial 23, tais como:

a utilização do ultrassom, solventes (diclorometano, hexano e clorofórmio) e proporção de

solvente/amostra sintética. Esses fatores foram atribuídos dois tipos de níveis: positivo e

negativo. E foi utilizada a forma de cubo para melhor analisar as respostas. As respostas das

oito combinações foram obtidas na leitura do espectrofluorímetro. A otimização dos

equipamentos foram utilizados, e eles serviram na identificação dos HPA’s das amostras

coletadas no Rio Potengi. Na otimização do equipamento foi observado todos os 16 HPA’s e

nas amostras foi encontrados os HPA’s que foram provenientes da contaminação do Rio

Potengi. A contaminação por orgânicos vem através de lixos domésticos, lixos hospitalares, e

dentre outras contaminações que vem de indústrias que são instaladas em torno do Rio. O

planejamento fatorial foi de grande validade, pois foi observada uma maneira mais eficaz de

preparação de amostra. O planejamento fatorial da extração liquido-liquido mostrou uma

maneira de gastar menos solventes em menos tempo utilizando um solvente ideal, como

também uma forma de extrair mais analito da própria matriz água. No planejamento fatorial a

menor forma de extração foi a utilização do ultrasom, a proporção 1:3 que corresponde a um

de solvente e 3 de amostra e o melhor solvente foi o diclorometano que apresentou uma

viável extração, não descartando a possibilidade de utilização, também do hexano. O

clorofórmio além de ser tóxico não apresentou uma boa extração.

PALAVRAS CHAVE: Coleta de amostras; Planejamento Fatorial; Preparação da amostra;

Análise de HPA’s; Cromatografia Gasosa; Fluorescência.

___________________________________________________________________________ Andréa Francisca Fernandes Barbosa

ABSTRACT

This work aims to detect polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) through

optimized analytical techniques, such as gas chromatography with flame-ionisation detector

(CGFID), gas chromatography coupled to mass spectrometry (CGMS), Fluorescence

Spectroscopy of Molecular and Purpot of oils and greases (POG). Apply to chemometrics,

Factorial Planning 23, in the preparation of samples by liquid-liquid extraction. The sample

preparation was used for liquid-liquid extraction and factors in this sample was used for the

application of factorial planning 23, such as the use of ultrasound, solvents

(dichloromethane, hexane and chloroform) and ratio of solvent / synthetic sample. These

factors were assigned two types of levels: positive and negative. It was used to form the

cube to better analyze the answers. The responses of the eight combinations were obtained

in reading the spectrofluorimetric. The optimization of equipment were used, and they

served in the HPA's identification of the samples collected in Rio Potengi. The optimization

of the equipment was observed every 16's and PAH in the samples was found that the

HPA's came from contamination of the Rio Potengi. The contamination comes through

organic household waste, hospital waste, and among other contamination that comes from

industries that are installed around the River The factorial design of high validity, it was

observed a more effective sample preparation. The factorial design of liquid-liquid

extraction showed a way to spend less solvent in less time using an ideal solvent, but also a

way to extract more analyte from the matrix itself is water. In planning a smaller form

factor extraction was the use of ultrasound, the ratio 1:3 corresponding to a solvent and

sample 3 and the best solvent was dichloromethane who presented a viable extraction, not

discarding the possibility of using also the hexane. The chloroform and may be toxic not

had a good extraction.

PALAVRAS CHAVES: Collection of samples, Chemometrics, Sample Preparation,

Analysis of PAH's, Chromatography, Fluorescence.


LISTA DE FIGURAS

Pag.

Figura 1.1 Foto mostrando o Rio Jundiaí na cidade de Macaíba/RN com a

contaminação de esgotos.

25

Figura 1.2 Foto do Rio Potengi e do esgoto lançado diretamente nesse rio,

próximo ao passo da pátria, chamado de Riacho do Baldo.

25

Figura 1.3 Mapa do percurso do Rio Potengi. 26

Figura 2.1 Composição do óleo cru, (site: DICKINEIDER, 2008). 31

Figura 2.2 Ilustração de um rio que foi afetado pela poluição de óleo. 31

Figura 2.3 Representação da distribuição dos hidrocarbonetos no meio

aquático (YU, 2004).

32

Figura 2.4. Estrutura do HPA diagênico, perileno. 34

Figura 2.5. Estrutura do HPAs reteno 35

Figura 2.6. Concentração média de substancias orgânica e inorgânica na superfície

da água (ARTIOLA, 2004). 37

Figura 2.7. A estrutura do criseno. 38

Figura 2.8. A) Espectros de emissão e B) Espetro de excitação ambos do Criseno. 38

Figura 2.9. Sistemas esquemáticos da extração líquido-líquido. a) Mistura do

composto C na amostra A + B e b) Afinidade do analito A com o composto

C.

53

Figura 2.10. Diferença empírica entre a fluorescência e a fosforescência.

(ATKINS, 2002).

54

Figura 2.11. Diagrama de energias para uma molécula orgânica (LUMB,

1978).

56

Figura 2.12. Regiões da banda de excitação de um HPA genérico λaz, λmáx e

λverm, que corresponde aos comprimentos de onda utilizados para a excitação

das amostras.

59

Figura 2.13. Espectros de Excitação e Emissão da molécula do Fenantreno

(SÂMARA, 1999).

61

Figura 2.14. Espectro de fluorescência do pireno encontrado em urina

(WATSON et. al., 2004).

61


Figura 2.15. Instrumentação de medida de um Fluorímetro, (SILVA, 2004). 63

Figura 2.16. Espectro de emissão de uma lâmpada de Xenônio. 63

Figura 2.17. Detalhes das regiões ultravioleta e visível de uma lâmpada de

xenônio.

63

Figura 2.18. Esquema de uma coluna. 64

Figura 2.19. Aplicação da cromatografia liquida (SAUDERS, 1975). 65

Figura 2.20. Diagrama esquemático de um Cromatógrafo a gás. 66

Figura 2.21. Condições de injeção representativas com divisor de fluxo e sem

divisor de fluxo. Injeção numa coluna capilar (HARRIS, 2001).

68

Figura 2.22. Diagrama em bloco de um espectrômetro de massa. 72

Figura 2.23. Esquema de um funcionamento de um CGEM, (MASUCCI E

CALDWELL, 2003).

73

Figura 2.24. Representação esquemática do analisador quadrupolo. 76

Figura 2.25. Representação esquemática do analisador íon trap. 77

Figura 2.26. Espectrograma de um analito de acetaminafenol no CGEM. 77

Figura 3.1. Extração líquido-líquido com funil graduado em um frasco de

vidro de cor âmbar.

82

Figura 3.2. Banho de ultrasom utilizado para extração do analito da amostra

para o solvente.

82

Figura 3.3. Ilustração do aparato experimental para análise por

espectrofluorimetria: a) Espectrofluorímetro, b) amostrador da cubeta e c)

Cubeta de quartzo.

84

Figura 3.4. Cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama. 89

Figura 3.5. Equipamento analisador InfraCal TOG/TPH modelo HATR-T2 e

CH.

90

Figura 3.6. Cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa

marca THERMO ANALITICA modelo FOCUS.

92

Figura 4.1 Espectro de emissão de uma amostra de óleo cru solubilizada em

hexano sem e com exposição ao ultrassom em diferentes intervalos de tempo.

95

Figura 4.2 Resposta usada no planejamento fatorial. Área hachurada sob a

curva.

97


Figura 4.3. Espetros de emissão do planejamento fatorial 23 dos HPAs em

hexano (Hex) com comprimento de onda de excitação fixo de 282 nm.

99


Diclorometano (DCM) com comprimento de onda de excitação fixo de 282

nm.

100


Clorofórmio com comprimento de onda de excitação fixo de 282 nm.

101

Figura 4.6. Representação em forma de cubo dos resultados da tabela 4.5. 105

Figura 4.7. Representação em forma de cubo dos resultados da tabela 4.6. 105

Figura 4.8. Espectros de emissão de uma amostra sintética de HPAs, usando-

se comprimentos de onda fixos para excitação.

108

Figura 4.9. Espectro de uma amostra em vários tipos de resolução espectral. 109

Figura 4.10. Espectros de emissão de uma amostra de óleo cru em três tipos

de resoluções espectrais: 1,5, 3,0 e 5,0 nm.

110

Figura 4.11. Espectro de emissão de uma amostra de óleo cru em uma

resolução espectral de 5nm, ampliada da figura 4.10.

110

Figura 4.12. Espectro de emissão de uma amostra de óleo cru em uma resolução

espectral de 3nm, ampliada da figura 4.10.

111

Figura 4.13. Curva analítica da mistura dos HPAs em hexano e o limite de

quantificação e detecção.

112

Figura 4.14. Curva analítica da mistura dos HPAs em clorofórmio e o limite

de quantificação e detecção.

113

Figura 4.15. Espectro de emissão de padrões de HPAs e do óleo cru

excitados em 182 nm.

114

Figura 4.16. Locais de coleta das amostras de água no Rio Potengi e a

ferramenta de coleta.

116

Figura 4.17. Espectro de emissão das amostras de água do Rio Potengi com

excitação fixa de 260 nm.

117

Figura 4.18. Mapa do Rio Jundiaí em Macaíba/RN e logo seguindo o Rio

Potengi em Natal/RN onde foram feitos as coletas das amostras com matriz

118


água.

Figura 4.19. Espectro de emissão das amostras coletadas no Rio Potengi. 119

Figura 4.20. Espectro de emissão das amostras coletadas no Rio Potengi em

comprimento de onda de excitação fixo de 282 nm.

120

Figura 4.21. Espectro de excitação das amostras coletadas no Rio Potengi em

comprimento de onda de emissão fixo de 310 nm.

120

Figura 4.22. Cromatograma dos HPAs prioritários numa concentração de 40

mgL-1.

122

Figura 4.23.1. Cromatograma da amostra coletada no Rio Potengi ponto 3. 122




Figura 4.23.5. Cromatograma da amostra coletada no Rio Jundiaí ponto 8. 124



Figura 4.23.8. Cromatograma da amotra coletada Rio Jundiaí ponto 12. 126

Figura 4.24. Configuração do amostrador Al-AS 3000 para as análises de

HPAs.

128

Figura 4.25.1. Configuração do Cromatógrafo a gás para análise de HPAs. 129



Figura 4.25.4 Configuração do Cromatógrafo a gás para análise de HPAs. 130

Figura 4.26 Configuração do Espectrometro de Massa para análise de HPAs. 131

Figura 4.27 Cromatograma de alguns HPAs encontrados no rio Potengi do

ponto de amostragem na favela do maruim.

133

Figura 4.28 Cromatograma de alguns HPAs encontrados no Rio Potengi do

ponto de amostragem no náutico.

133

Figura 4.29 Cromatograma de alguns HPAs encontrados no rio Potengi do

ponto de amostragem na capitania dos portos.

134

Figura 4.30 Espectrosfluorímetros das amostras coletadas no Rio Potengi. 135

__________________________________________________________________________________ Andréa Francisca Fernandes Barbosa

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Alguns Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos derivados do

óleo poluente da água. 33

Tabela 2.2. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos indicados como

poluentes prioritários pela EPA,) 36

Tabela 2.3. Lista dos 16 HPAs prioritários com o grau de toxidade (BOEHM

et al., 2002)

39

Tabela 2.4. Propriedades físico – química dos HPAs 41

Tabela 2.5. Resultado de um Planejamento Fatorial 23 43

Tabela 2.6. Coeficientes de Contraste. 43

Tabela 2.7. Preservação e acondicionamento de amostras. 51

Tabela 2.8. Escala de tempo em que ocorrem as transições radiativas e não

radiativas 58

Tabela 2.9. Valores dos comprimentos de onda de excitação e emissão usadas

na obtenção dos espectros de luminescência. 60

Tabela 2.10. Parâmetros variáveis em colunas capilares em injetor Splitless 69

Tabela 2.11. Alguns detectores e suas características, (LEITE, 2002). 71

Tabela 2.12. Aspectos comuns do espectrômetro de massa (LEITE, 2002). 76

Tabela 4.1. Matriz do planejamento fatorial 23 para o sistema solvente

hexano/ diclorometano. 98

Tabela 4.2 Matriz do planejamento fatorial 23 para o sistema solvente

hexano/clorofórmio. 98

Tabela 4.3 Efeitos do sistema 102


Tabela 4.4. Resultados de TOG das amostras coletadas no Rio Jundiaí e

Potengi. 127

Tabela 4.5. Tempo de retenção e fragmentação dos íons dos 16 HPAs

prioritários. 132


LISTA DE QUADROS

Quadro 2.1. Planejamento fatorial 23 42

Quadro 3.1. Fatores e níveis do experimento, solventes hexano e

diclorometano. 86

Quadro 3.2. Planejamento Fatorial 23 para a extração líquido líquido. 86

Quadro 3.3. Fatores e níveis do experimento, solventes hexano e clorofórmio. 87

Quadro 3.4. Planejamento Fatorial 23 para a extração líquido líquido. 87

Quadro 4.1. Fatores e seus respectivos níveis para o planejamento fatorial 23

empregando os solventes hexano e diclorometano.

96

Quadro 4.2. Fatores e níveis para o planejamento fatorial 23 empregando os

solventes hexano e clorofórmio.

96


LISTA DE EQUAÇÕES

Pag.

Equação 2.1 40

xt.y = [ ] Equação 2.2 44

¥ y s ∑ N Equação 2.3 45

y (X1, X2, X3) = β0 + β1 X1 + β2 X2 + β3 X3 + β12 X12 + β13 X13 + β23

X23 + β123 X123 + ε (X1, X2, X3)

Equação 2.4

45

β X Equação 2.5 45

γ

ω Equação 2.6 47

Equação 2.7 47

Equação 2.8 48

% Equação 2.9 48

Equação 2.10 49

y = ax + b Equação 2.11 49


. . Equação 2.12 53

w´ = B´ρ´ Equação 2.13 55

I = k P0c Equação 2.14 58

Equação 2.15 74

∑ . Equação 4.1 102

∑ .

Equação 4.2 102

∑ Equação 4.3 103

y (X1, X2, X3) = β0 + β1 X1 + β2 X2 + β3 X3 + β12 X12 + β13 X13 + β23

X23 + β123 X123

Equação 4.4

103

Y(modelo) = 5547,77 + 2688,13.x1 – 7596,96.x2 + 7308,48.x3 –

3695,43.x12 + 993,50.x13 – 5201,71.x23 - 2011,76x123

Equação 4.5

104

Y(modelo) = 1386,746+ 793,473.x1 - 1150,708.x2 - 1013,568.x3 -

813,943.x12 - -901,163.x13 - 1244,538.x23 - 869,728.x123

Equação 4.6

104

Y = 202,19 + 24,08* X R = 0,99516 Equação 4.7 112


Y = 1226,53 + 433,00*x R = 0,99644 Equação 4.8 112

Equação 4.9 113

__________________________________________________________________________________


LISTA DE REAÇÕES

Pag.

M + e- M+ + 2e- Reação 2.1 72

SUMÁRIO

Pag.

1 INTRODUÇÃO GERAL 24

1.1 O RIO POTENGI 24

1.2 HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS 26

1.1 OBJETIVOS 28

1.2 GERAIS 28

1.3 ESPECÍFICOS 28

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 30

2.1 IMPACTO DOS CONTAMINANTES NO AMBIENTE MARINHO 30

2.2 CONTAMINANTE DO MEIO AMBIENTE AQUÁTICO 30

2.3. ORIGEM DOS HPAs 34

2.3.1. Origens primárias de HPAs 34

2.3.1.1. HPAs diagênicos 34 2.3.1.2. HPAs de combustíveis fósseis (petróleo e carvão) 35

2.3.1.3. HPAs biogênicos 35 2.4. TOXICOLOGIA DOS HPAs 35

2.5. CONSTANTES FISICO – QUIMICAS DE ALGUNS HPAs 38

2.6 NOÇÕES SOBRE EXPERIMENTOS FATORIAIS 42

2.6.1 Planejamento fatorial 23 42

2.6.1.1 Calculo dos Efeitos 44

2.6.1.2 Estimativa do Erro 45

2.6.1.3 Modelo Estatístico 45

2.7 VALIDAÇÕES DE MÉTODOS 46

2.7.1 Critérios de validação 46

2.7.1.1 Sensibilidade 46

2.7.1.2 Exatidão 47

2.7.1.3 Precisão 47

2.7.1.4 Limite de Detecção 48

2.7.1.5 Limite de Quantificação 48

2.7.1.6 Robustez 49

2.7.1.7 Linearidade 49

2.8 PROCEDIMENTO DE COLETA PARA ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DE

HPAs

50

2.8.1 Amostragem de Águas Superficiais 50

2.9 MÉTODOS UTILIZADOS NA ANÁLISE DE HPAs 52

2.9.1 Extração Liquido-Liquido 52

2.9.2 Constante de Distribuição (Coeficiente de Partição) 52

2.10. ESPECTROSCOPIA DE LUMINESCÊNCIA 53

2.10.1 Processo de fluorescência de uma molécula orgânica 55

2.10.1.1. Processos de desativação 57

2.10.1.2. A luminescência na Química Analítica 58

2.10.2. Espectros de fluorescência de moléculas de HPAs 59

2.10.3. Aplicação da fluorimetria 61

2.10.4. Instrumentação 62

2.11 CROMATOGRAFIA 67

2.11.1 Cromatografia Gasosa 66

2.11.1.1 Injeção da amostra 66

2.11.2 Colunas 68

2.11.3 Detectores 70

2.12 ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM) 71

2.12.1 Princípios de Espectrometria de Massa 72

2.13 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADO À ESPECTROMETRIA DE

MASSA (CGEM)

73

2.13.1 Principais Sistemas do CGEM 74

3.0 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 79

3.1 ORGANOGRAMA DA OTIMIZAÇÃO DOS MÉTODOS E APLICAÇÃO 80

3.2 METODOLOGIA PROPOSTA PARA DETERMINAÇÃO DE HPAs EM

ÁGUAS

80

3.3 AMOSTRAGEM 80

3.3.1 Coleta das amostras 80

3.3.1.1 Material 81

3.3.1.2 Procedimento 81

3.3.2 Preparação da amostra 81

3.3.2.1 Extração 81

3.4 EXPERIMENTOS DE LUMINESCÊNCIA 82

3.4.1 Materiais e reagentes 82

3.4.2. Otimização dos parâmetros do Espectrofluorímetro 83

3.4.2.1. Largura da fenda (nm) 83

3.4.2.2. Comprimento de Onda de excitação fixo (λexc;fixo) 85

3.4.3. Influência do ultrassom 84

3.4.4. Aplicação da metodologia de planejamento fatorial na otimização da

extração líquido-líquido dos HPAs

85

3.4.4.1 Materiais e reagentes 85

3.4.4.2 Ensaios para a extração em solvente hexano e diclorometano 85

3.4.4.3 Ensaios para extração em solvente hexano e clorofórmio 87

3.5 EXPERIMENTO POR CROMATOGRAFIA GASOSA COM DETECTOR DE

IONIZAÇÃO DE CHAMA

88

3.5.1 Material e reagentes 88

3.5.2 Procedimento 88

3.6 EXPERIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DOS HPAs VIA TEOR DE

ÓLEOS E GRAXAS (TOG)

89

3.6.1 Material e reagentes 89

3.6.2. Procedimento 90

3.6 EXPERIMENTO POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A

ESPECTROMETRIA DE MASSA - CGEM

91

3.7.1 Material e Reagentes 91

3.7.2 Procedimento 91

4.0 RESULTADOS E DISCUSSÕES 94

4.1 INFLUÊNCIA DO ULTRASSOM NA SOLUBILIDADE DOS HPAs DO

ÓLEO CRU EM HEXANO

94

4.2 APLICAÇÃO DA QUIMIOMETRIA PARA DETERMINAÇÃO DAS

MELHORES CONDIÇÕES DE EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO PARA

HPAs.

95

4.2.1 Otimização do processo de extração através de um Planejamento Fatorial

23

95

4.2.2 Determinação das Variáveis e a matriz do planejamento 96

4.2.3 Cálculo dos efeitos 102

4.2.4 Cálculo do erro 103

4.2.5 Descrição do modelo estatístico 103

4.4 VISÃO GEOMÉTRICA DOS RESULTADOS 104

4.5. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES NO

FLUORÍMETRO

107

4.5.1. Determinação do comprimento de onda fixo de excitação 107

4.5.2. Determinação da fenda de emissão e excitação do Espectrofluorímetro 108

4.6. PARÂMETROS DE DESEMPENHO ANALITICO DO FLUORÍMETRO 111

4.7 PADRÕES DE HPAs E O PETRÓLEO BRUTO 113

4.8. APLICAÇÃO DOS MÉTODOS OTIMIZADOS EM AMOSTRAS

COLETADAS NO RIO POTENGI.

114

4.8.1. Amostras extraídas com clorofórmio 114

4.8.2. Amostras extraídas com hexano – Primeira coleta 117

4.8.3. Amostras extraídas com hexano – Segunda coleta 119

4.9. OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO POR CGDIC E APLICAÇÃO EM

AMOSTRAS E PADRÕES

121

4.10.TEOR DE ÓLEOS E GRAXAS (TOG) 126

4.11.OTIMIZAÇÃO DA CONFIGURAÇÃO DO MÉTODO DO

CROMATÓGRAFO A GÁS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA.

127

4.11.1 Tempo de Retenção e Íons encontrados pelo Método FULLSCAN 131

4.12. APLICAÇÃO DE ANÁLISES DE ALGUMAS AMOSTRAS POR CGEM E

FLUORESCÊNCIA

132

5.0 CONCLUSÃO 137

5.1 PESPECTIVAS 140

6. REFERÊNCIAS 142

ANEXOS 153

1 ESPECTROS DE EMISSÃO DOS 16 HPAs PRIORITÁRIOS 153

2 ESPECTROS DE EXCITAÇÃO DOS PADRÕES DE HPAs 161

INTRODUÇÃO

UFRN - PPGQ - INTRODUÇÃO

_________________________________________________________________________24 Andréa Francisca Fernandes Barbosa

1.0 INTRODUÇÃO GERAL

O RIO POTENGI

A realidade evidenciada pelos fatos e pela imprensa mostra que o Brasil não cumpre

da forma desejada uma Política Nacional de Recursos Hídricos, apesar de toda a legislação

existente. A ausência de gerenciamento, o pouco caso com os mananciais de água potável, a

reiterada poluição de rios, mares, lagoas e lagos e a contaminação do lençol freático, são

realidades presentes no dia-a-dia, com pouca ou nenhuma interferência dos poderes públicos.

Desta forma, permite-se uma silente e desastrosa destruição do patrimônio hídrico nacional,

com prejuízos imensuráveis para todo o Brasil.

Reafirma-se que existe farta legislação a cerca das águas. A própria Lei 9.605/98 prevê

o crime de poluição, englobando o crime de poluição hídrica, com tipificação qualificada,

previsto no art. 54, § 2º, inciso III, da referida lei, desde que a poluição causada em

mananciais provoque a suspensão do abastecimento público de água em comunidades

(IBAMA, 2008).

Embora não seja o Rio Grande do Norte um estado entrecortado por caudalosos rios,

aqueles que o atravessam ou nascem em seu território possuem relevante significado para a

economia local, propiciando água para consumo humano, criação de animais, agricultura e

sustentação para fixação de indústrias. São dignos exemplos os rios Potengi, Açu, Seridó,

Piranhas, Mossoró, Ceará-Mirim, Pium (CAOPS, 2007).

O rio abordado neste trabalho é o Rio Potengi. Ele nasce no município de serra

calhada/RN e deságua na praia da redinha em Natal/RN. As Figuras 1.1 e 1.2 apresentam a

situação desse rio no que diz respeito à contaminação. A poluição do Rio Potengi é causada

por fontes antrópicas. A Figura 1.3 mostra o percurso do rio próximo à cidade de Natal-RN.



Figura 1.1 Foto mostrando o Rio Jundiaí na cidade de Macaíba/RN com a contaminação por esgotos.

Figura 1.2 Águas do Canal do Baldo sendo despejadas no Rio Potengi sem tratamento, contaminação

de esgotos.



Figura 1.3. Mapa do percurso do Rio Potengi.

HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS

Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos - HPAs têm recebido mais atenção desde

que foram encontrados no solo pela primeira vez (Blumer, 1975, p. 53-55) principalmente,

devido ao elevado impacto no meio ambiente e pelo potencial carcinogênico apresentado em

seres humanos.

Neste trabalho os HPAs foram analisados pela técnica de Fluorescência Molecular no

ultravioleta, que tem sido amplamente empregada, devido à rapidez e facilidade analítica, ao

custo relativamente baixo e a alta sensibilidade. Entretanto, esse método apresenta limitação

capaz de diferenciar hidrocarbonetos diferentes, (NEVES, 2006, p.10 - 15). Assim, para o



estudo dos HPAs das também foram utilizadas outras técnicas, tais como cromatografia

gasosa com detector de ionização de chama - CGDIC, cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massa – CGEM e teor de óleos e graxa – TOG, como será visto nos

capítulos que se seguem.



2. OBJETIVOS

2.1 GERAL

Aperfeiçoar metodologias para a contaminação de Hidrocarbonetos Policíclicos

Aromáticos (HPAs) e a partir dos mesmos avaliar a presença de HPAs ao longo do Rio

Potengi, relacionando-os a possíveis fontes poluidoras.

2.2 ESPECÍFICOS

Aplicar a Quimiometria, Planejamento Fatorial 23, na otimização da preparação de

amostras por Extração Líquido-Líquido.

Detectar hidrocarbonetos policíclicos aromáticos através de técnicas analíticas

otimizadas, tais como: Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CGDIC),

Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (CGEM), Espectroscopia de

Fluorescência Molecular e Teor de Óleos e Graxas (TOG)

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

UFRN – PPGQ - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA


2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 IMPACTO DOS CONTAMINANTES NO AMBIENTE MARINHO

Impactos dos contaminantes em ambientes aquáticos é o grau de contaminantes de

uma área com relação ao meio ambiente. Os dados dos locais de coletas podem ser analisados

como: pesquisa documental, entrevistas, inspeções, amostragens e ensaios.

A contaminação é uma propriedade ou situação que tem potencial para causar um mal.

O contaminante pode ser de natureza química (a presença de substância tóxica ou

carcinogênica), biológica (presença de bactéria patogênica) ou física (acumulação de um

explosivo ou gás inflamável). Num contexto mais específico, a norma (ABNT - NBR-10.004,

1987) Resíduos Sólidos define periculosidade dos resíduos, classificando-os como inertes,

não inertes ou perigosos, em função de características como inflamabilidade, corrosividade,

reatividade, toxicidade ou patogenicidade (MIRANDA, 2002, p. 25-40).

2.2. CONTAMINANTE DO MEIO AMBIENTE AQUÁTICO

O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos, que contêm uma grande

quantidade de contaminantes encontrados no meio ambiente. A figura 2.1 apresenta as

principais classes de substâncias encontradas no petróleo e que podem ser encontradas em

ambientes onde a exploração de petróleo é realizada. A composição do petróleo pode variar

dependendo do histórico geológico de cada depósito (KAIPPER, 2003).

As contaminações que provêem de poços de petróleos ou tubulações expostas podem

ocorrer devido ao arraste de fenômeno meteorológico. Portanto, vazamento ou operação

errônea dessas válvulas poderá contaminar o ambiente aquático. A figura 2.2 mostra o

impacto ambiental que o poluente pode provocar no âmbito aquático.

O óleo provoca uma série de efeitos nocivos aos seres vivos aquático. Esses efeitos

podem ser ampliados ou minimizados de acordo com alguns fatores, sejam eles ambientais ou

relativos às próprias características do produto envolvido.



A magnitude dos efeitos está também associada à permanência do óleo no meio

ambiente aquático que é ditada pelos processos de degradação da mistura, conhecidos como

agentes de intemperismo. Uma vez no rio, o óleo, figura 2.2, sofre uma série de alterações

físicas e químicas que, via de regra, o tornam menos tóxico (ZIOLLI, 1999, p.17-23).

Figura 2.1 Composição do óleo cru, ( DICKINEIDER, 2008).

Figura 2.2 Ilustração de um rio que foi afetado pela poluição com óleo.



Dos componentes do óleo cru apresentados na Figura 2.1 destacam-se os HPAs que

quando liberados na atmosfera tem grande afinidade por partículas orgânicas presentes no ar,

sendo depositadas no rio tanto por deposição seca como úmida. Pode haver solubilização de

compostos gasosos através da interface atmosfera-água. A grande quantidade de HPAs que

entra no ambiente aquático é apresentada por partículas atmosféricas, derramamento e

vazamento de óleo cru, indústrias e água de esgotos domésticos (GIESSING et. al., 2003,

p.599-615). Os HPAs lançados para a atmosfera permanecem por período curto e às vezes

longo dependendo da sua estrutura molecular. Na superfície da água, os HPAs podem sofrer

volatilização e fotodegradação, oxidação, biodegradação, unir partículas ou acumular no

organismo. Em sedimentos, os HPAs podem sofrer biodegradação ou acumulação em

organismos aquáticos. HPAs em solos podem ser biodegradados ou acumulados em plantas e

arrastados pelas águas contaminando os aquíferos. A Figura 2.3 mostra a distribuição dos

hidrocarbonetos no ambiente aquático (YU, 2004, p.36-41).

Figura 2.3 Representação da distribuição dos hidrocarbonetos no meio aquático (YU, 2004, p. 36-41).

Os HPAs são produtos primários de processos de combustão incompleta e sua estrutura é

formada de dois a seis anéis aromáticos acoplados. Os HPAs de baixo peso molecular (2 e 3

anéis) têm uma toxidade aguda significante Ziolli, (1999, p. 17-23), enquanto que HPAs de

mais altos pesos moleculares são cancerígenos. Alterações da matéria orgânica a baixas

temperaturas, tais como na formação de combustíveis fósseis, resultam em HPAs com 2 ou 3



anéis com ramificações de homólogos alquilados. Combustão a altas temperaturas produz

HPAs com 4, 5 ou 6 anéis na sua estrutura, sendo alguns produtos alquilados. Alguns HPAs

ocorrem naturalmente em minerais e outros são sintetizados por organismos ou bactérias,

algas ou fungos. As ocorrências desses processos naturais são normalmente baixas, quando

comparada àquelas de fontes antropogênicas. HPAs antropogênicos entram no ambiente

marinho através de uma variedade de rotas, incluindo a deposição atmosférica, esgotos

industriais e domésticos e derramamento direto de petróleo ou produtos de petróleo

(GARBADO et al, 2001, p.941-950). Eles também são encontrados normalmente aderidos ao

material particulado em suspensão ou ao sedimento devido a sua baixa polaridade, portanto

pouca afinidade pela água.

Na Tabela 2.1 estão alguns tipos de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos que são

encontrados no óleo bruto.

Tabela 2.1. Alguns Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos derivados do óleo poluente da água.

NOME ESTRUTURA

Naftaleno

Acenaftileno

Acenafteno

Fluoreno

Antraceno

Benzo (a) Pireno

Indeno (1,2,3 - cd) Pireno

Dibenzo (ch) Antraceno

Benzo (ghi) Perileno



Nos últimos anos se tem dado muita atenção aos hidrocarbonetos aromáticos, pois

alguns desses compostos apresentam-se altamente cancerígenos ou mutagênicos. Em

particular, o benzo(a)pireno foi identificado como o composto mais cancerígeno

(KUMMROW, 2004, p. 39;ARBEX, 2001, p. 46).

2.3. ORIGEM DOS HPAs

Os HPAs que ocorrem naturalmente, originam-se por 4 caminhos:

a) Diageneses de baixa temperatura da matéria orgânica;

b) através da formação do petróleo e carvão;

c) por meio da combustão incompleta da matéria orgânica em moderadas e altas temperaturas;

e

d) na biosínteses de plantas e animais.

2.3.1. Origens primárias de HPAs

2.3.1.1. HPAs diagênicos

Os HPAs diagênicos consiste nas mudanças ou transformações químicas, físicas e

biológicas sofridas pelo solo ou sedimento após a sua deposição, em geral, subaquática.

Ocorrem em microorganismo, como bactérias, embora que em processos não biológicos possa

ocorrer em grandes quantidades de matéria orgânica. O HPA diagênico mais comumente

encontrado é o perileno com cinco anéis aromáticos, mostrado na Figura 2.4.

Figura 2.4 Estrutura do HPA diagênico, perileno.



2.3.1.2. HPAs de combustíveis fósseis (petróleo e carvão)

Os HPAs petrogênicos são formados em pressões elevadas dentro de camadas

profundas da superfície terrestre, retidos nos sedimentos. Por exemplo, a matéria orgânica

biológica do plâncton (conjunto de diminutos seres vivos, vegetais e animais, algas

unicelulares, protozoários, larvas, etc), que flutuam passivamente nas águas dos oceanos ou

lagos, é convertida em petróleo. Os HPAs em alta abundância neste processo são os de 4, 5 e

6 anéis.

2.3.1.3. HPAs biogênicos

Certos compostos precursores de HPAs são biossíntese da natureza. O HPA mais

comum produzido por biogênese é o reteno mostrado na Figura 2.5 (BOEHM et. al., 2002, p.

2-4).

Figura 2.5. Estrutura do HPAs reteno

2.4. TOXICOLOGIA DOS HPAs

A toxicologia estuda os efeitos nocivos de substâncias estranhas sobre os seres vivos.

As substâncias de interesse incluem tantos os produtos químicos sintéticos quanto aqueles que

existem naturalmente no ambiente. Na toxicologia, os efeitos são determinados em geral pela

injeção ou pela administração oral da substância de interesse em animais, e observando-se

como a saúde desses animais é afetada (BAIRD, 2002, p. 335).



Um estudo no Laboratório de Saúde Pública do Rio de Janeiro com animais, feito por

Costa (2001, p.2-10) foi comprovado que os HPAs provocam cânceres de pulmão, bexica,

colo, reto e esôfago. A toxicologia afeta a vida humana pelos seguintes meios: gases, aerossol

e particulados citado no trabalho de HINWOOD e DIMARCO (2000, p.361-366). Na

TABELA 2.2 estão os HPAs indicados como poluentes prioritários pela Agencia de Proteção

Ambiental dos Estados Unidos – EPA, mostrando também os 8 HPAs que apresentam uma

grande probabilidade de carcinogênicos em seres humanos.

Tabela 2.2. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos indicados como

poluentes prioritários pela EPA, (YU, 2004, p.36-41).

Nome dos HPAs Abreviação Classificação carcinogênica

Acenafteno Acef D Acenaftileno Ace D Antraceno ant D Benzo(a)antraceno BaA P Benzo (a) pireno BaP P Benzo(b) fluoranteno BbF P Benzo(k) fluoranteno BkF P Benzo (g,h,i) Perileno Bpe P Criseno Chr P Dibenzo (a,h) Antraceno DbA D Fluoranteno Fth P Fluoreno Fl D Indeno (1,2,3 - c,d) Pireno IP P Naftaleno Na D Fenantreno Phe D Pireno Py D P - Probabilidade de carcinogênese Humana. D - dado insuficiente como estimativa do seu potencial carcinogênico

Na Figura 2.6 é mostrado o valor médio permitido da concentração de HPAs, em

inglês PAHs, na superfície da água. A faixa de concentração é 0,001 a 0,01 mgL-1.



Figura 2.6 Concentração média de substancias orgânica e inorgânica na superfície da água (ARTIOLA,

2004, p.284).

Os contaminantes cancerígenos segundo ARBEX (2001, p.46) são os benzo (a)pireno

e o dibenzo(a,h)antraceno e os não cancerígenos, mas contaminantes do meio ambiente, são

os benzo(g,h,i)perileno, naftaleno, fluoranteno e pireno, que contribuíram para o valor do

índice de periculosidade em concentrações menores.

O benzo-pireno é um composto de grande poder carcinogênico e mutagênico e foi

encontrado no Mar Mediterrâneo. A concentração na superfície do sedimento no Golf de Lion

foi de 1 a 36 ppb e no Mar Adriático em frente a lagoa da Veneza foi de 20 ppb (FOSSI et. al.,

2000, p.861-874).

Como constituinte de misturas complexas de HPAs o criseno é considerado lipofílico,

tóxico ao meio ambiente. A origem antropogênica do criseno inclui a queima de combustíveis

fósseis citado por GRETE et. al. ( 2004, p. 81-90), incinerações e processos associados com a

produção industrial de ferro, alumínio e aço. O criseno apresentado na Figura 2.7 possui 4

anéis aromáticos.



Figura 2.7. A estrutura do criseno.

As amostras de bile de peixes foi utilizada para determinar o criseno, na qual foi

analisado pelo espectrofluorímetro. Os espectros de emissão e excitação do criseno com

comprimento de onda de excitação λexc 272 nm e emissão λem 374 nm estão mostrados na

Figura 2.8.

.

Figura 2.8. A) Espectros de emissão e B) Espetro de excitação ambos do Criseno.

2.5. CONSTANTES FÍSICO – QUÍMICAS DE ALGUNS HPAs

Em pesquisa sobre hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em águas naturais, foi

observado à ocorrência de carcinogênise para alguns HPAs (SAMARA, 1999, p. 417-428).

Na tabela 2.3 o autor citou que alguns HPAs teriam probabilidades de carcinogêneses e não

carcinogêneses e outros não tinham ainda explicação de sua toxidade.



Koa = coeficiente de octanol/água

Os HPAs possuem algumas características gerais, tais como: sólidos à temperatura

ambiente, altos pontos de ebulição e fusão, baixa solubilidade em água; solúveis em solventes

orgânicos e altamente lipofílicos (afinidades por fases orgânicas). Essa última característica é

expressa através do coeficiente de partição octanol-água (Koa), Equação 2.1, que são elevados

Tabela 2.3. Lista dos 16 HPAs prioritários com o grau de toxidade (BOEHM et al., 2002, p. 2-4).

HPAs Estrutura Koa Classificação do potencial

carcinogênico *IARC/US EPA

Acenafteno

2100 mutagênico

Acenaftileno

12000 mutagênico

Fluoreno

15000 mutagênico

Naftaleno 23000 tóxico

Antraceno 28000 mutagênico

Fluoranteno

340000 Carcinogênico e Mutagênico

Fenantreno

29000 Tóxico e mutagênico

Benzo(a)antraceno

400000 Carcinogênico e mutagênico

Benzo(b)fluoranteno


Benzo(k)fluoranteno


Criseno


Pireno


Benzo(ghi)perileno

10000000 Carcinogênico

Benzo(a)pireno


Dibenzo(a, h)antraceno 10000000 Carcinogênico e mutagênico

Indeno(1,2,3 - cd)pireno 50000000 Carcinogênico



(entre 3,4 a 7,1) os quais indicam que os HPAs podem ser absorvidos através de diversos

tecidos biológicos, como por exemplo, a pele. O coeficiente de partição octanol-água está

relacionado com o fator de bioconcentração da substância dado como:

Equação 2.1.

Koa – coeficiente de partição octanol: água

[ ]o – concentração da substância na fase octanol

[ ]a – concentração da substância na fase aquosa

A seguir está expressa a relação do log Koa com a polaridade da substãncia:

Log Koa> 4-5: substâncias apolares – maior lipofilicidade;

1< Log Koa < 4: substâncias medianamente polares e

Log Koa < 1: substâncias polares – maior solubilidade.

A solubilidade em água dos HPAs diminui com o aumento do tamanho da molécula e,

com exceção do naftaleno que é relativamente solúvel (32mg/L), os HPAs têm baixa

solubilidade em água como mostrado na tabela 2.4. Como os coeficientes de partição entre

carbono orgânico e água (Kca) para HPAs são elevados então esses analitos tendem a

concentrar-se em sedimentos ou ficam associados á matéria orgânica em suspensão.

A pressão de vapor dos HPAs é um fator chave que determina se os mesmos estariam

presentes principalmente na fase vapor ou tende a associar-se com partícula do ar, uma vez

que eles estão suspensos na atmosfera. A constante de Henry é usada como medida da

tendência da volatilização dos compostos dissolvidos na água para a atmosfera. Como reflexo

desses fatores, HPAs de 2 ou 3 anéis tendem a concentrar-se na fase gasosa do ar, aqueles

com 4 anéis distribuem-se entre as fases e 5 anéis ou mais concentram-se principalmente no

material particulado atmosférico (são partículas que ficam em suspensão na atmosfera). Na

Tabela 2.4 podem ser observadas essas variações (COSTA, 2001, p.2-10).



Tab

ela

2.4

Prop

rieda

des f

ísic

o –

quím

ica

dos H

PAs.

HPA

s M

M

(u.m

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Pf

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217,

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4,89

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naft

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15

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8,9.

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92

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16

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11

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MM

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assa

mol

ecul

ar;



NOÇÕES SOBRE EXPERIMENTOS FATORIAIS

Experimentos delineados em esquemas fatoriais são aqueles que envolvem

combinações entre os níveis de dois ou mais fatores. Na literatura especializada, os esquemas

fatoriais não são considerados delineamentos experimentais, mas sim delineamentos de

tratamento (RODRIGUES e IEMMA, 2005, p. 4-6).

Em um planejamento de qualquer experimento, uma das atitudes que se deve tomar

seria, quais são os fatores e as respostas de interesse. Os fatores, em geral, são as variáveis

que o pesquisador tem condições de controlar (BARROS et. al., 2003, p.95-103).

2.6.1 Planejamento fatorial 23

Planejamento fatorial 23 é um método estatístico ou matemático utilizado como forma

de minimizar a quantidade de experimentos químicos. Então, em um planejamento fatorial é

preciso ter níveis positivos e negativos (os níveis são parâmetros menores e maiores do

experimento químico) e fatores que poderiam influenciar o meio estudado.

Na Tabela 2.5 estão dispostos os ensaios de ordem padrão. Todas as colunas

começam com níveis (-) nível inferior seguido de nível superior (+). No quadro 2.1 tem-se um

resultado de um planejamento fatorial 23.

Quadro 2.1 Planejamento fatorial 23

Código Fatores Níveis

(-) (+)

X1 Tempo (min) 40 60

X2 Catalisador (tipo) A B

X3 Concentração (molL-1) 1.0 1.5



Tabela 2.5. Resultado de um Planejamento Fatorial 23. Ensaio x1 x2 x3 Rendimanto (%) Média

1 - - - 56 52 54

2 + - - 85 88 86,5

3 - + - 49 47 48

4 + + - 64 62 63

5 - - + 65 61 63

6 + - + 92 95 93,5

7 - + + 57 60 58,5

8 + + + 70 74 72

A partir da matriz do planejamento fatorial da tabela 2.5 pode-se formar a

tabela 2.6 dos coeficientes de contraste, multiplicando os sinais das colunas apropriadas

para obter as colunas correspondentes às interações (MENDHAM, 2002, p. 16-18).

Tabela 2.6. Coeficientes de Contraste.

Média X1 X2 X3 X12 X13 X23 X123 Y

+ - - - + + + - 54

+ + - - - - + + 86,5

+ - + - - + - + 48

+ + + - + _ - - 63

+ - - + + - - + 63

+ + - + - + - - 93,5

+ - + + - - + - 58,5

+ + + + + + + + 72



2.6.1.1 Calculo dos Efeitos

No calculo dos efeitos é necessário utilizar o resultado da tabela 2.6

denominada de Y. Então, a Tabela de coeficientes de contraste será transformada em

uma matriz X com elementos +1 ou -1, com os quais podemos calcular todos os efeitos,

fazendo o produto Xt.y, onde y é vetor coluna contendo os rendimentos médios dos

ensaios e Xt é a trasposta de X equação 2.2.

538,5

91,5

-55,5

Xt.y = 35,5

-34,5

-3,5

3,5

0,5

A soma das médias são divididas por 8 (que são oito experimentos) e os efeitos

dividido por 4 (efeitos que são 4 sinais positivo e 4 sinais negativos).

Y 67,31

X1 22,88

X2 -13,88

X3 = 8,88

X12 -8,63

X13 -0,88

X23 0,88

X123 -0,13

Equação 2.2



2.6.1.2 Estimativa do Erro

A estimativa do erro é calculada através da diferença entre duplicatas das respostas do

planejamento fatorial ao quadrado e dividindo esse valor por duas vezes a quantidade de

experimentos, como na Equação 2.3:

Equação 2.3

2.6.1.3 Modelo Estatístico

O modelo estatístico de um planejamento fatorial pode ser construído através de

variáveis codificadas que são três: X1, X2 e X3. A Equação 2.4 seguiu com a seguinte notação.

y (X1, X2, X3) = β0 + β1 X1 + β2 X2 + β3 X3 + β12 X12 + β13 X13 + β23 X23 + β123 X123 + ε (X1, X2,

X3) Equação 2.4

Os coeficientes (β’s) representam valores populacionais dos efeitos, por unidade das

variáveis codificadas e podem ser calculados pela Equação 2.5. Substituindo os dados da

Tabela 2.6 na Equação 2.2 e dividindo tudo por 8 obtemos a estimativa desses coeficientes.

β 0 67,3

β 1 11,4

β 2 -6,9

= β3 ≈ 4,4 Equação 2.5

β12 -4,3

β13 -0,4

β23 0,4

β123 -0,1



2.7 VALIDAÇÕES DE MÉTODOS

A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através da sua

comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está cada vez mais conhecida e exigida.

Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos

financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo método analítico gere informações

confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada

Validação. A validação de um método é um processo contínuo que começa no planejamento

da estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferência

(RIBANI et. al., 2004, p. 771-780).

O conceito de validação atribuído por RIBEIRO et. al. (2008, p 164-171), é que o bom

desempenho de uma técnica analítica depende de dois fatores: a qualidade das medidas

instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos envolvidos no seu processamento.

Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um método durante as operações de

rotina de um laboratório é estabelecendo os limites destes parâmetros por meio da estimativa

das figuras de mérito.

2.7.1 Critérios de validação

Os parâmetros de validação de métodos analíticos envolvem

especificidade/seletividade, função da resposta (gráfico analítico), intervalo de trabalho,

linearidade, sensibilidade, exatidão, precisão (repetitividade, precisão intermediária e

reprodutividade), limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ) e robustez (BRITO et.

al., 2003, p. 129-146).

2.7.1.1 Sensibilidade

A sensibilidade é a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de

confiança, duas concentrações próximas. Sob o ponto de vista prático, a sensibilidade é o

coeficiente angular do gráfico analítico, expresso na equação 2.6:



Equação 2.6

S = sensibilidade

dγ = variação da resposta

dω = variação da concentração

2.7.1.2 Exatidão

A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados e um valor aceito como referencia. A exatidão é expressa como o percentual de

resposta obtida através da fortificação de uma amostra testemunha. A fortificação consiste na

adição de uma solução padrão de resíduos do analito de concentração conhecida em uma

amostra testemunha, e através da análise desta amostra, pode-se verificar se a marcha analítica

determina o princípio ativo quantitativamente (VIEIRA ; LICHITIG, 2004, p. 698-700).

2.7.1.3 Precisão

O parâmetro que avalia a proximidade entre várias medidas na mesma amostra é a

precisão do processo analítico. Usualmente, é expressa como o desvio-padrão, variância ou

coeficiente de variação (CV) de diversas medidas. O CV é dado pela equação 2.7:

Equação 2.7

s = desvio-padrão e M = média.



2.7.1.4 Limite de Detecção

O limite de detecção do equipamento (LDE) é definido como a concentração do

analito que produz um sinal de três a cinco vezes a razão sinal/ruído do equipamento. O limite

de detecção do método (LDM) é definido como a concentração mínima de uma substância

medida e declarada com 95% ou 99% de confiança de que a concentração do analito seja

maior que zero. O limite de detecção pode ser expresso pela Equação 2.8.

Equação 2.8

s = desvio-padrão da resposta; S = sensibilidade do aparelho.

Considerando o tratamento estatístico, utiliza-se o "teste de hipótese" para estimar o

LD, então se aplica a equação 2.9 utilizando-se os valores obtidos para as várias medidas do

branco.

Equação 2.9

t n, 95% = valor Tabelado em função de n (número de análises); sb = desvio-padrão do branco; S

= sensibilidade do aparelho.

2.7.1.5 Limite de Quantificação

O limite de quantificação é definido como a menor concentração do analito que pode

ser quantificada na amostra com exatidão e precisões aceitáveis, nas condições experimentais

adotadas. Pode ser estimado por meio do sinal/ruído, do desvio-padrão e por processos

estatísticos. O limite de quantificação pode ser expresso pela Equação 2.10.



Equação 2.10

s = desvio-padrão da resposta; S = sensibilidade do método.

2.7.1.6 Robustez

A robustez de um método de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta em face

de pequenas variações. Um método diz-se robusto se revelar praticamente insensível a

pequenas variações que possam ocorrer quando esse está sendo executado (INMETRO,

2007).

2.7.1.7 Linearidade

Linearidade é a habilidade de um método analítico em produzir resultados que sejam

diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, em uma dada faixa de

concentração. A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta medida e

a concentração do analito. A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e

formulada como expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser

determinado na amostra real (INMETRO, 2007). A equação da reta que relaciona as duas

variáveis segue na Equação 2.11.

y = ax + b Equação 2.11

Onde:

y = resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc.);

x = concentração;

a = coeficiente angular: expressa a inclinação da curva aos eixos = sensibilidade;

b = coeficiente linear: expressa a intersecção da curva aos eixos.



A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico dos resultados dos

ensaios em função da concentração do analito ou então calculada a partir da equação da

regressão linear, determinada pelo método dos mínimos quadrados.

O coeficiente de correlação linear (r) é freqüentemente usado para indicar o quanto

pode ser considerada adequada à reta como modelo matemático.

2.8 PROCEDIMENTO DE COLETA PARA ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DE HPAs

2.8.1 Amostragem de Águas Superficiais

De um modo geral, a amostragem (é o procedimento desde a coleta até a análises do

elemento a ser estudado) é obtida mergulhando-se o frasco de coleta com a boca voltada

contra a corrente do líquido a ser analisado. Na coleta de volumes grandes de amostra, utiliza-

se um recipiente para transporte de material quimicamente inerte. Quando houver a

necessidade de coletar amostras em vários recipientes para transporte, o volume de cada um

deles deve ser distribuído entre todos os frascos, para garantir a homogeneização da amostra

(CONTEC - N 1372, 2006). Devem-se tomar os seguintes cuidados na coleta:

1 – Se for empregado um mesmo recipiente para transporte em várias amostragens sucessivas

em pontos diferentes, o recipiente de transporte deve ser lavado com a amostra do local

antes de nova coleta.



2 – Amostragens realizadas em pontes e margens de difícil acesso, utiliza-se recipiente de

transporte com peso. Arremessa-se o recipiente de transporte até um local distante da

margem e prende-se a extremidade livre da corda em um ponto fixo.

3 – Para análises de hidrocarbonetos, óleos e graxas, coletam-se as amostras individualmente

e não são subdivididas ou somadas no laboratório.

A preservação e o condicionamento das amostras são feitos conforme transcrito na

tabela 2.7. A conservação e condicionamento de HPAs são feitos em frascos de vidros de cor

âmbar do recipiente protegendo da fotodegradação provocada pelo meio ambiente, pois em

frascos de plásticos os analitos orgânicos ficam agregados na superfície.

Tabela 2.7 Preservação e Acondicionamento de Amostras.

Parâmetro Recipiente

Volume

mínimo

(mL)

Preservação

Prazo

máximo para

análise

Observação

HPAs Va 1000 4ºC 14 d

Recipiente com

tampa rosqueada e

batoque de tetra

flúor polietileno

envolto com folha

de alumínio

(amostras não

corrosivas). Em

presença de cloro

residual, adicionar

100 mL de Na2S2O3

por litro de amostra. Fonte CONTEC – N 1372; P – plástico; V – Vidro; Va – Vidro âmbar; HPAs = hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos



2.9 MÉTODOS UTILIZADOS NA ANÁLISE DE HPAs

2.9.1 Extração Líquido-Líquido

As extrações líquido-líquido são realizadas através de três operações fundamentais

citada por Aquino (2000, p. 1-2) 1) a fase aquosa e a fase orgânica, sendo imiscíveis, devem

ser dispersas em volumes definidos; 2) as fases devem entrar em contato da forma mais

eficiente possível, para que possa haver a extração do todo ou da maior parte do analito; e 3)

as fases precisam ser fisicamente separadas, para detecção adequada do analito (VLASTIMIL,

1991, p. 477-577).

O analito pode ser extraído direto da fase extratora ou deve ter suas características

previamente alteradas de acordo com sua interação com esta fase (HARRIS, 2001, p. 15-17).

Quando se trata de íons livres, por exemplo, estes não podem ser diretamente extraídos pela

fase orgânica, já que íons formam ligações íon dipolo com a água, impedindo sua passagem

para fase extratora. Torna-se necessário, portanto, a neutralização das cargas do analito

mediante a formação de quelatos, complexos de associações iônicas ou micelas. Desta forma,

um agente com carga é suficientemente eletrofílico significando a quebra da ligação íon

dipolo e produzindo um composto mais hidrofóbico, favorecendo assim a extração (IRVING,

1970, p. 111). Quando se trata de extrações manuais, geralmente nos deparamos com algumas

inconveniências, tais como, alto consumo de amostras, reagentes e soluções extratoras. Esta

última possui limitações particulares, já que as normas ambientais de controle de

contaminantes estão cada vez mais rígidas em relação ao descarte de compostos orgânicos,

devido ao perigo que estes compostos representam. O analista também fica exposto a uma alta

quantidade de solventes orgânicos que, em geral, são tóxicos. Antes de serem analisados os

HPAs devem passar por processo de extração com solvente de forma a permitir sua

identificação segundo a norma (ISO 7981-1, 2005; ISO 7982-2, 2005).

2.9.2 Constante de Distribuição (Coeficiente de Partição)



A constante de distribuição estabelece um sistema de duas fases líquidas, constituídas

de dois componentes imiscíveis ou ligeiramente miscíveis. Quando é adicionada uma terceira

substância solúvel em ambas as fases, essa substância distribui-se entre as fases, alcançando

um estado em que a razão permanece constante a uma temperatura constante. Na mistura de

solventes com a amostra, após misturados uma das soluções é coletada em um frasco ou balão

de fundo redondo, que se constitui o extrato que é analisado, então obtêm sua concentração.

Dessa maneira, conhecendo-se a concentração do analito na fase orgânica e na fase aquosa é

possível determinar-se o fator ou coeficiente de distribuição figura 2.8 a) e b) e equação 2.12

(SILVA, 2006, p. 105-112).

a) b)

Figura 2.8. Sistemas esquemáticos da extração líquido-líquido. a) Mistura do composto C na amostra A + B e b) Afinidade do analito A com o composto C.

[ ]org. Concentração da substância na fase orgânica [ ]aq. Concentração da substância na fase aquosa

2.10. ESPECTROSCOPIA DE LUMINESCÊNCIA

A luminescência é um fenômeno que pode ser descrito, de maneira genérica, como um

tipo de emissão de luz em que um corpo absorve luz e logo depois a emite, durante curto

Equação

2.12



intervalo de tempo. Há vários tipos de luminescência, conforme a fonte de energia usada para

a excitação, como eletroluminescência, radioluminescência, quimiluminescência,

fotoluminescência, catodoluminescência, bioluminescência, termoluminescência,

triboluminescência, sonoluminescência, fosforescência e fluorescência (LUMB, 1978, p 94;

SMAILI, 2001, p. 67). O tipo de luminescência que será abordado nesta tese é a

fotoluminescência, mais especificamente a fluorescência.

A fluorescência pode ser atômica ou molecular, a primeira analisa o elemento

químico, enquanto que a outra analisa a molécula.

A fluorescência molecular é uma técnica promissora na análise de amostras de meio

ambiente. Entre os benefícios da espectroscopia de fluorescência tem-se a adaptabilidade para

medidas de campo, a alta sensibilidade para uma grande quantidade de analito e simplicidade

(RENEE et. al., 1999, p. 61-72).

A radiação fluorescente, espontaneamente emitida pela amostra, após sua excitação

cessa imediatamente depois da radiação excitadora desaparecer. Esse comportamento é

observado na Figura 2.9 comparando com a fosforescência que possui um tempo de vida de

decaimento radiativo muito maior (ATKINS, 2002, p. 268-269).

Figura 2.10. Diferença empírica entre a fluorescência e a fosforescência. (ATKINS, 2002, p. 268-269).

O método de fluorescência foi o primeiro método a ser usado para detecção do

benzo(a)pireno e outros HPAs. É capaz de medir quantidades na ordem de nanogramas de

HPAs, mas não é seletivo, pois determina a concentração dos HPAs totais presente (USEPA,

1999, p.13; PEER, 2002, p. 28-30).



A fluorescência é um fenômeno de emissão que ocorre entre estados eletrônicos de

mesma multiplicidade de spin envolvendo processos do estado excitado singlete S1 para o

estado fundamental S0. Essa condição é geralmente válida para moléculas em solução, mas

não é necessariamente verdadeira quando na fase de vapor, na qual moléculas não podem

perder sua energia vibracional através de colisões. A fluorescência passa por um tempo de

decaimento bastante curto, da ordem de 10-9 a 10-6 s para a maioria das moléculas orgânicas.

A probabilidade da ocorrência da transição S1→ S0 é determinada pelo coeficiente de

Einstein, na equação 2.13 (MARTINS, 2001, p.7-10).

ρ´ → densidade de energia da radiação à freqüência de transição

B´ → coeficiente de emissão estimulada de Einstein

w´ → taxa de emissão estimulada

Quando os hidrocarbonetos aromáticos (FABIAN et. al., 2000, p. 120-128) são irradiados

com luz ultravioleta, eles emitem luz no comprimento de onda do visível e ultravioleta, sendo

a intensidade desta fluorescência proporcional à concentração de óleo.

2.10.1 Processo de fluorescência de uma molécula orgânica

w´ = B´ρ´ Equação 2.13



Figura 2.11. Diagrama de energias para uma molécula orgânica (LUMB, 1978, p.94).

O diagrama geral de energias para uma molécula orgânica está apresentado na Figura

2.10. O processo dessa figura ocorre da seguinte forma: A radiação eletromagnética é

absorvida, passando do estado fundamental para o estado excitado (S0 – S2), havendo um

relaxamento vibracional, na qual esta radiação absorvida é emitida sob a forma de luz

(fluorescência (S1 – S0) e fosforescência (T1 – S0)). Ao absorver uma radiação ultravioleta,

uma molécula sofre transições eletrônicas, transições vibracionais e rotacionais. Essas

transições levam a um estado excitado da molécula, promovendo um de seus elétrons para um

orbital de maior energia. Em moléculas orgânicas, os tipos de transições mais importantes

para o estado singleto excitado são:

a) n →π*: quando um elétron de um orbital não-ligante salta para um orbital π antiligante;

b) π →π*: quando um elétron de um orbital π ligante salta para um orbital π antiligante.

A transição π →π* produz fluorescência mais intensa do que a transição n →π*

(VINADÉ, 2005, p.153). As transições diferem-se completamente pelo baixo coeficiente de

extinção, baixo rendimento fluorescente, mas tem uma alta taxa de cruzamento intersistema e

assim um alto rendimento fosforescente. A fosforescência pode ocorrer em fase líquida em



temperatura ambiente. O efeito de um solvente polar na transição n → π* é mais significativo

do que na transição π →π* pois pode reverter à posição do menor estado excitado, transição n

→π* da transição π →π*.

Conforme mostrado na figura 2.11, a excitação de uma molécula orgânica pode ser

conseguida pela absorção envolvendo duas transições, uma centrada no comprimento de onda

λ1 (S0→S1) e a segunda no comprimento de onda menor λ2 (S0→S2). Observe que o processo

de excitação resulta numa forma excitada da molécula para qualquer dos estados excitados

vibracionais. Note ainda que a excitação direta do estado tripleto não está mostrada porque

essa transição não ocorre de modo espontâneo, uma vez que esse processo envolve mudança

de multiplicidade, um evento que, conforme mencionamos têm probabilidade de ocorrência

baixa (uma transição de baixa probabilidade desse tipo é chamada proibida) (LUMB, 1978, p.

94).

2.10.1.1. Processos de desativação

Os processos proibidos por multiplicidade de spin são mais lentos e, portanto, as

moléculas nestes estados eletrônicos excitados são mais susceptíveis de serem desativadas

através de processos não radiativos, como por exemplo, colisões com impurezas como o

oxigênio molecular. Isto explica, em parte, o fato de que emissão do tipo fosforescência em

moléculas orgânicas aromáticas só pode, em geral, ser observada em ausência de oxigênio

molecular, ou em temperaturas baixas que diminuem a possibilidade de desativação de

colisões por formação de complexos de contato com outros supressores. Os processos mais

rápidos por multiplicidade de spin mesmo que sejam não radiativos, são permitidos. Esses

processos estão apresentados na figura 2.11 e detalhada na tabela 2.8 do diagrama de energia

para uma molécula orgânica, com seus respectivos tempos de vida (ATVARS ; MARTELLI,

2002).



Tabela 2.8. Escala de tempo em que ocorrem as transições radiativas e não radiativas (ATVARS ; MARTELLI, 2002).

Processo Notação

Variação da

multiplicidade

de spins

Regra de

seleção

Tempo de

vida (s)

Absorção S0,v →S1,v 1→1 Permitida 10-15

Fluorescência S1,v →S0,v 1→1 Permitida 10-9 a 10-6

Fosforescência T1,v →S0,v 3→1 Proibida 10-3 a 1

Conversão interna S1,0 →S0,v 1→1 Permitida 10-13 a 10-11

Cruzamento intersistema S1,v →T1,v 1→3 Proibida 10-9 a 10-7

Relaxamento vibracional S0,v →S0,v 1→1 Permitida 10-15 a 10-13

Relaxamento vibracional S1,v →S1,v 1→1 Permitida 10-15 a 10-13

Relaxamento vibracional T1,v →T1,v 3→3 Permitida 10-15 a 10-13

S0,v = Singleto (0 – fundamental; v – vibracional); S1,v = Singleto (1 – excitado; v – vibracional); T1,v (1 – excitado; v – vibracional);

2.10.1.2. A luminescência na Química Analítica

Se a absorbância de uma solução é pequena nos comprimentos de onda de excitação e

emissão, então a intensidade de emissão (I) é proporcional à energia radiante da luz incidente

(P0) e a concentração das espécies que estão emitindo (c), Equação 2.14:

Assim como a lei de Beer revela que a absorbância é proporcional a concentração, a equação

2.13 revela que a emissão é proporcional a concentração nas medidas analíticas de emissão

(HARRIS, 2001, p. 30). A intensidade I é obtida através da integração da área do espectro, ou

seja, ela é proporcional a superfície sob a curva de emissão.

I = k P0c Equação 2.14



2.10.2. Espectros de fluorescência de moléculas de HPAs

Os espectros de excitação são produzidos pela medida da intensidade de

luminescência, mantendo-se constante o comprimento de onda de emissão e varrendo-se de

excitação. Espectros de emissão são obtidos de forma contrária, mas através do mesmo

princípio, mantendo-se a excitação constante e varrendo-se o espectro de emissão

(TREVISAN, 2003, p. 10).

Geralmente se obtêm os espectros de excitação, com a finalidade de escolher o

comprimento de onda máximo de emissão. Após a identificação da banda de maior

intensidade do espectro de excitação, são obtidos espectros de emissão. Em seguida, são

observados espectros de fluorescência, excitando-se a amostra em comprimento de onda

menor comparado aqueles que serão observados nos espectros de emissão. Os valores dos

comprimentos de onda de fluorescência, usados para determinação do espectro de excitação, e

dos comprimentos de onda de excitação, usados na determinação dos espectros de

fluorescência, estão resumidos na tabela 2.9 para alguns HPAs (MARTINS, 2001, p. 7-10).

Na Figura 2.11 é mostrada uma banda de excitação para HPAs genéricos onde foi escolhido

o comprimento de onda máximo para a escolha da banda de emissão e os comprimentos de

onda de excitação, destacados de cor azul e vermelha, são usados para avaliar a ocorrência do

deslocamento espectral. Assim poderá ser observado melhor o comprimento de onda de

emissão utilizando esses comprimentos de onda. Na Tabela 2.9 observam-se esses valores em

torno do comprimento de onda máximo.



Figura 2.12 Regiões da banda de excitação de um HPA genérico λaz, λmáx e λverm, que corresponde aos comprimentos de onda utilizados para excitação das amostras.

Tabela 2.9. Valores dos comprimentos de onda de excitação e emissão usadas na

obtenção dos espectros de luminescência. Comprimentos de onda (nm)

Molécula Emissão Excitação

Antraceno 405 355, 360*, 365

1-metil-antraceno 405 355, 362*, 367

2-metil-antraceno 409 355, 360*, 365

9-metil-antraceno 416 365, 370*, 375

1,2-benzantraceno 388 285, 290*, 295

2,3-benzantraceno 478 291, 295*, 298

Fenantreno 350 290, 295*, 299

Pireno 374 333, 337*, 340

Naftaleno 336 270, 275*, 280

1-metil-naftaleno 339 276, 283*, 288

2-metil-naftaleno 338 284, 288*, 290

* Corresponde ao máximo de intensidade da banda de excitação da transição eletrônica de menor energia.

O espectro de excitação e emissão (fluorescência) da molécula do fenantreno está

apresentado na Figura 2.12. O que se pode observar é que o espectro de emissão dá-se em

comprimentos de onda maiores do que o de absorção. Na Figura 2.13 é apresentado o espetro

de emissão (fluorescência) da molécula de pireno de uma amostra de urina, na qual é

observado o espectro da amostra em relação ao padrão do composto e o deslocamento

espectral em função do comprimento de onda de excitação. Isto significa que o pireno da

amostra pode ocorrer em comprimentos de onda menores ou maiores devido ao efeito de

outros compostos ou solventes que pode modificar o espectro.



Figura 2.13. Espectros de Excitação e Emissão da molécula do Fenantreno (SÂMARA, 1999, p. 417-

428).

Figura 2.14. Espectro de fluorescência do pireno encontrado em urina

(WATSON et. al., 2004, p. 127-142).

2.10.3. Aplicação da fluorimetria

O método espectroscópico por fluorescência molecular (Sluszini et. al., 2004, p.145-

152) é considerado muito sensível para determinação dos HPAs e teria uma excelente



sensibilidade na determinação de muitos compostos fluorescentes (farmacêuticos, biomédica,

etc) especialmente para hidrocarbonetos aromáticos.

Alguns exemplos de espectroscopia de fluorescência retratados (Renne et. al., 1999,

p.61-72) são tidos como potenciais analitos, incluindo material orgânico dissolvido (MOD),

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e pesticidas. MOD e os HPAs são

naturalmente fluorescentes em soluções aquosas e seu alto rendimento quântico molecular

permite detecção de traços, sem pré-tratamento da amostra ou concentração.

O campo de aplicação das análises fluorimétricas tem sido ampliado nas últimas

décadas por sua excelente sensibilidade e muito boa seletividade.

A principal aplicação na análise qualitativa é na cromatografia em papel, coluna ou

camada delgada para localizar e caracterizar as espécies separadas; utilizando neste processo,

a fluorescência natural das espécies ou usando um reagente apropriado, que forma com a

espécie um composto fluorescente.

Na análise quantitativa, os métodos fluorimétricos são aplicados a determinações de

compostos orgânicos, inorgânicos e bioquímicos (VINADÉ, 2005, p. 153).

2.10.4. Instrumentação

A diferença entre o espectrofotômetro e o espectrofluorímetro está na disposição

perpendicular (900) entre os feixes incidentes e transmitidos. As propostas da configuração em

900 do feixe incidente é a de gerar o sinal de fluorescência da amostra (MANUAL RF-

5301PC, 1995, p. 25-30).

Os componentes de um espectrofluorímetro estão mostrados na Figura 2.14. Um

espectrofluorímetro típico consiste de uma fonte de luz, apenas monocromadores e um

detector. A fonte de luz é geralmente uma lâmpada de Deutério ou Xenônio Figura 2.15 e

2.16 que emitem radiação eletromagnética na região do ultravioleta. Uma segunda fonte de

luz, geralmente uma lâmpada de Tungstênio, é usada para comprimentos de onda na região do

visível. O monocromador é uma rede de difração; sua função é separar o feixe de luz em

seus comprimentos de onda constituintes. Um sistema de fendas focaliza o comprimento de

onda desejado sobre a amostra. O detector é geralmente uma célula fotomultiplicadora

(aparelho muito sensível no qual, os elétrons emitidos pela superfície fotossensível colidem

com uma segunda superfície, chamados dinodo, que é positivo em relação ao emissor



fotosensível). Frequentemente são operadas no modo de contagem de fótons, para dar

melhores relações sinal-ruído, embora em instrumentos mais modernos estejam sendo usados

fotodiodos, que permitem o registro rápido tanto de espectros de excitação como de emissão e

é particularmente útil em cromatografia e eletroforese (MANUAL RF-5301PC, 1995, p. 25-

30).

Figura 2.16. Espectro de emissão de uma

lâmpada de deutério.

Figura 2.17. Detalhes das regiões

ultravioletas e visíveis de uma lâmpada de

xenônio.

Figura 2.15. Instrumentação de medida de um Fluorímetro, (SILVA, 2004, p.105-112).

900



2.11 CROMATOGRAFIA

Dentre os métodos modernos de análise química, a cromatografia sem dúvida é o que

ocupa lugar de merecido destaque no que concerne à separação, identificação e quantificação

de espécies químicas (RICHARDSON et. al., 2002, p. 1083). Os componentes a serem

separados são distribuídos entre duas fases: uma fase fixa denominada de fase estacionária e a

outra que passa através dela, sendo por isso, denominada de fase móvel. A fase móvel na

cromatografia pode ser líquida ou gasosa e a fase estacionária é normalmente um líquido

viscoso que cobre o interior de um tubo capilar ou a superfície de partículas sólidas

empacotadas dentro da coluna.

O percolador que entra na coluna é chamado de eluente e o que sai é chamado de eluato,

veja o esquema na Figura 2.17.

Eluição é o processo de passagem do líquido ou gás por uma coluna cromatográfica. As

colunas podem ser de dois tipos: Empacotadas ou Tubulares abertas.

Colunas empacotadas são preenchidas com partículas contendo uma fase estacionária.

Coluna tubular abertas é um capilar oco estreito com fase estacionária cobrindo as

paredes internas (HARRIS, 2001, p.15-17.

O método cromatográfico é classificado quanto ao tipo de superfície, como:

(a) Cromatografia em coluna: um tubo geralmente de vidro ou metal;

(b) Cromatografia planar: superfície plana, geralmente uma placa de vidro ou metal,

impregnada com a fase estacionária, ou então uma folha de papel de filtro embebida

com solvente apropriado.

De acordo com a fase móvel utilizada, a cromatografia em coluna poderá ser classificada

em três grandes grupos:

(a) cromatografia líquida – quando a fase móvel é um líquido;

Coluna Eluato (saída)

Eluente (entrada)

Figura 2.18. Esquema de uma coluna.



(b) cromatografia gasosa – quando a fase móvel for um gás e

(c) cromatografia com fluido supercrítico – quando gás ou líquido no estado supercrítico

for utilizado como fase móvel (LANÇAS, 1993, p.1-3).

A figura 2.18 revela que vários procedimentos de cromatografia líquida tendem a ser

complementares, a ponto de suas áreas de aplicação estar relacionadas. Assim, para solutos

com pesos moleculares acima de 10.000, a cromatografia por exclusão é usada com

freqüência, embora esteja tornando-se possível lidar com estes compostos também por

cromatografia de partição em fase reversa. Para espécies iônicas com pesos moleculares mais

baixos, a cromatografia de troca iônica é amplamente usada. Espécies pequenas e polares,

mas não iônicas, são as mais indicadas para os métodos de partição. Além disso, esse

procedimento é freqüentemente útil para separação de membros de uma série homóloga. A

cromatografia por adsorção é muitas vezes a escolhida para a separação de espécies não

polares, de isômeros estruturais e de classes de compostos, como os hidrocarbonetos alifáticos

e alcoóis alifáticos (SKOOG et. al., 2002, p. 641-678).

Figura 2.19. Aplicação da cromatografia liquida (SAUDERS, 1975, p.81).



2.11.1 Cromatografia Gasosa

Na cromatografia gasosa (CG) a amostra é vaporizada e injetada no topo de uma

coluna cromatográfica (septo – um disco de borracha) dentro de uma câmara aquecida, na

qual se evapora rapidamente. O vapor é arrastado na coluna pelo gás de arraste He, N2 ou H2,

e os constituintes separados fluem para o detector, cuja resposta é mostrada num computador

ou registrador, como mostrado na figura 2.19 (SKOOG et. al., 2002, p. 641-678).

Figura 2.20. Diagrama esquemático de um Cromatógrafo a gás.

1 – Reservatório de gás e controle de vazão/pressão;

2 – Injetor (vaporizador) de amostra;

3 – Coluna cromatográfica e forno da coluna;

4 – Detector;

5 – Processador de sinal (amplificação) e

6 – Registro de sinal (Registrador ou computador).

2.11.1.1 Injeção da amostra

A amostra (gasosa ou líquida) é injetada por uma seringa pelo septo de borracha de

silicone para um tubo de vidro silanizado aquecido (Liner – capilar de vidro utilizado no



injetor) (HARRIS, 2001, p.15-17). O gás de arraste conduz a amostra vaporizada para a

coluna cromatográfica. Para a cromatografia analítica, o volume injetado está no intervalo de

normalmente 0,1 – 2,0 µL para amostra do estado líquido. Amostras decompostas e

componentes não-voláteis se acumulam lentamente dentro do liner de vidro, que deve ser

trocado periodicamente.

(a) Injetor com divisor de fluxo

Se os constituintes de interesse representam mais de 0,1 % da amostra, normalmente

prefere-se o modo de injeção com divisor de fluxo para introduzir a amostra dentro da

coluna. Para um trabalho de alta resolução são obtidos melhores resultados com a menor

quantidade da amostra (≤ 1µL) que pode ser detectada adequadamente – contendo de

preferência ≤ 1ng de cada componente. Uma injeção completa contém muito material para

uma coluna de 0,32 mm de diâmetro ou menos. Uma injeção com divisor de fluxo transfere

apenas 0,2 - 2% da amostra para a coluna.

(b) Injetor sem divisor de fluxo

Para análises de constituintes que são menos que 0,01% da amostra é apropriado uma

injeção sem divisor de fluxo. O liner de vidro é um tubo reto, vazio sem nenhuma câmara de

mistura. A Figura 2.20 mostra as condições de injeção.

(c) Injeção na coluna

A injeção na coluna é usada para amostras que se decompõem acima dos seus pontos

de ebulição e é melhor do que as injeções com e sem divisor de fluxo para análise

quantitativa. A solução é injetada diretamente dentro da coluna, sem passar pelo injetor

quente.



Figura 2.21. Condições de injeção representativas para a injeção com divisor de fluxo.

Injeção sem divisor de fluxo e injeção numa coluna capilar (HARRIS, 2001, p. 15-17).

2.11.2 Colunas

São encontrados dois tipos genéricos de colunas em cromatografia gasosa, empacotada

e capilar ou tubular aberta. Sendo a coluna empacotada até recentemente tendo sido a mais

utilizada. Atualmente, entretanto, esta situação está mudando rapidamente e parece provável

que em um futuro próximo, as colunas empacotadas serão substituídas pelas colunas tubulares

abertas.

Colunas cromatográficas variam em comprimento de 2 a 50 m ou mais. Elas são

construídas de aço inoxidável, vidro, sílica fundida ou teflon (DIGITAL ENGINEERING,

2004). As colunas mais utilizadas para orgânicos em cromatografia têm um comprimento de

30 m e são de sílica fundida.

A temperatura da coluna é uma importante variável que deve ser controlada para

trabalhos precisos. Assim, a coluna é comumente montada dentro de um forno termostatizado.

A temperatura ótima da coluna depende do ponto de ebulição da amostra e do grau de

separação requerido. Grosseiramente, uma temperatura igual ou ligeiramente superior ao

ponto de ebulição médio de uma amostra resulta em um tempo de ebulição razoável (2 a 30

min). Para amostras com larga faixa de ebulição, é melhor empregar uma programação de

temperatura, na qual a temperatura da coluna é aumentada continuamente ou em passos,

conforme se procede à separação (SKOOG et. al., 2002, p.641-678)..



(a) Colunas Capilares

Felizmente, o uso de colunas recheadas tem diminuído nos últimos anos devido o uso

crescente de colunas capilares. Estas colunas são baseadas na interação entre a mistura e a

fase estacionária na forma de um filme fino e homogeneamente depositado na superfície

interna de um tubo longo e fino (capilar).

Com o desenvolvimento destas colunas e seu uso generalizado, um número maior de

colunas pode ser hoje encontrado tabela 2.10, o que ainda coloca o iniciante diante do

problema da escolha da coluna. Nestas colunas capilares a fase estacionária é ligada a parede

interna do tubo. Dois tipos principais são usados:

1 – Colunas capilares com paredes recobertas quando a fase estacionária é ligada

diretamente á parede interna do tubo.

2 – Colunas capilares com suporte recoberto quando uma camada de suporte sólido é

depositada na parede interna do tubo e recoberta com a fase estacionária (MENDHAM et. al.,

2002, p. 160).

Tabela 2.10. Parâmetros variáveis em colunas capilares em injetor Splitless (CIENFUEGO, 2002, p.92).

Comprimento (m) 5 10 15 25 30 50 60 100 Diâmetro interno (mm) 0,1 0,2 0,25 0,32 0,53 0,75

Fase não-polar Intermediário especial muito polar

Temperatura máxima (ºC) 200 a 250 0C - moderada >450

Espessura do filme (µm) 0,2 1,5 3 5

Filme poliimidas alumínioCarga máxima (ng) 10 1000 Eficiência (prato/m) 5000 20000

Regras para a escolha da coluna:

(a) Semelhantes separam semelhantes, ou seja, coluna polar para composto polar e coluna

apolar para composto apolar;

(b) Colunas longas têm tempos longos de eluição e alta resolução;



(c) Menor diâmetro leva a maior eficiência; e

(d) Espessura do filme – a espessura do filme deve ser da ordem de 1 µm porque

espessuras maiores tornam instável o filme, com formação de pequenas poças do

líquido e perda de fase estacionária por arraste (sangria) (DIGITAL ENGINEERING,

2004,).

2.11.3 Detectores

Na escolha do detector deve-se levar em conta a espécie química a ser analisada, o

custo e a sensibilidade. No mercado há os denominados detectores universais e os

específicos, assim como os detectores destrutivos e os não destrutivos. A maioria das

análises pode ser feita com os detectores universais DIC (detector de ionização de chama) ou

o DCT (detector por condutividade térmica). Já os detectores específicos, como DFI

(detector por fotoionização) normalmente possuem maior detectabilidade e requerem um

pouco mais de cuidados analíticos e de operação. Quanto aos detectores não destrutivos, a

questão segurança e higiene são primordiais para a saúde do analista. Portanto, sistemas de

exaustão devem ser projetados para a proteção principalmente do analista e, também, do

ambiente de análise (LEITE, 2002, p. 160-173). A Tabela 2.11 dispõe de algumas

características dos detectores utilizados em cromatografia.



Tabela 2.11. Alguns detectores e suas características, (LEITE, 2002, p. 160-173).

Detector LD Detecta D Não detecta ou baixa

resposta

DCT 104 a 105 Maioria dos compostos

inclusive água e gases % / ppm -

DFI 106 a 107 A maioria dos compostos %/ ppm/

ppb

Gases nobres, amônia,

CO, CO2, H2S, SO2, NO,

N2O, H2O, gases fixos,

outros

DCE 103 Halogenados, aldeídos,

nitratos, organometálicos

ppm/ppb/

ppt Hidrocarbonetos

DFC 103 Fosforados a 525 nm,

sulforados a 393 nm ppb/ ppts seletivo

DIC 107 insaturados ppm/ ppb seletivo

DNF 104 a 105 Nitrogenados e fosforados ppb/ ppt seletivo

DEQ 104 halogenados ppm/

ppb seletivo

DCE – Detector por Captura de Elétrons; DFC – Detector Fotométrico de Chama; DNF – Detector de

Nitrogênio e Fósforo; DEQ – Detector Eletroquímico; LD – Linearidade Dinâmica é obtida pela relação entre

o maior ponto (massa ou concentração) e o menor ponto da curva de calibração do detector, haja linearidade;

D – Detectabilidade; varia de acordo com a natureza da amostra e das condições analíticas utilizadas

2.12 ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM)

É um detector potente para as análises qualitativa e quantitativa de constituintes em

cromatografia gasosa ou líquida. Na espectrometria de massas, as moléculas gasosas são

ionizadas (geralmente para formarem cátions), aceleradas por um campo elétrico, e então

separadas de acordo com sua massa. O processo de ionização geralmente confere energia

suficiente para quebrar a molécula numa variedade de fragmentos. Um espectro de massas é

um gráfico que mostra a abundância relativa de cada fragmento que atinge o detector do

espectrômetro de massa (HARRIS, 2001, p.15-17).



O EM apresenta uma opção interessante em relação aos cromatógrafos, pois o tempo

muito curto de análise permite que um espectrômetro analise seqüencialmente um número

elevado de pontos do processo.

O diagrama de blocos da Figura 2.21 apresenta o princípio de funcionamento de um

espectrômetro de massas.

Figura 2.22. Diagrama em bloco de um espectrômetro de massa.

2.12.1 Princípios de Espectrometria de Massas

Na cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CGEM), a amostra, que sai

da coluna cromatográfica (por exemplo, moléculas de identidade M), contendo o analito, é

levada á fonte de ionização, que sofre impacto por feixe de elétrons de alta energia,

produzindo o íon positivo, M+, chamado íon molecular, como na reação 2.1.

O íon molecular (M+) é produzido em diferentes estados de energia. A energia interna é

dissipada por reações de fragmentação, e os fragmentos de menores massas são ionizados e

convertidos a íons. O íon M+ permite determinar diretamente a massa molecular do composto

ou o número inteiro mais próximo deste, e os demais íons com razão massa/carga (m/z),

fornecem informações importantes para a elucidação da estrutura.

Gerador de íons

Separação dos íons

DetectorEntrada da amostra

Controle e tratamento de

dados

Pré-vácuo Alto vácuo

M + e- M+ + 2e- Reação 2.1



2.13 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADO À ESPECTROMETRIA DE MASSA

(CGEM)

O CGEM é uma combinação sinergética de duas técnicas analíticas poderosas. O

cromatógrafo a gás separa os componentes da mistura em certo tempo de retenção e o

espectrômetro de massas proporciona informação que ajuda na identificação estrutural de

cada componente (KITSON et. al., 1996, p. 3-20).

Os métodos CGEM são rotineiramente usados na identificação qualitativa de compostos

desconhecidos e correção quantitativa desses compostos, isto é uma ferramenta poderosa na

identificação de compostos complexos. A espectrometria de massas conjuga alto vácuo e altas

voltagens com a manipulação de uma quantidade pequena de amostra de uma só vez,

enquanto a cromatografia a gás opera na pressão atmosférica em modo contínuo. O esquema

da Figura 2.22 mostra como segue o funcionamento de um CGEM. A amostra é introduzida

através de um injetor e arrastada por um gás inerte (hélio) e separada na coluna, o vapor passa

por uma linha de transferência que entra em contato com a fonte de íons e os íons ressonantes

passam por lentes que possuem freqüência, hermeticamente padronizada de fábrica seguindo

por um analisador e multiplicador de elétrons, e por fim, observada em um sistema de dados

(MASUCCI ; CALDWELL, 2003, p. 339).

Figura 2.23. Esquema de funcionamento de um CGEM, (MASUCCI E CALDWELL, 2003, p. 339).



2.13.1 Principais Sistemas do CGEM

(a) Partes Principais de um Espectrômetro de Massa

- Fonte de íons onde ocorre a conversão das moléculas do analito em íons; as mais comuns

ionizações de amostra, as quais ocorrem na fonte de íons, são:

1.1) Impacto de Elétron (IE) um feixe de elétrons livres, obtidos por emissão termoiônica

de filamento aquecido, é dirigido para uma “nuvem” de moléculas. A formação de

íons a partir das moléculas é efetuada pela excitação dos níveis eletrônicos e

vibracionais da molécula, que provocam desestabilização da mesma, seguida (na

escala de tempo de microssegundos) de dois efeitos:

a) Ionização (perda de um elétron), formando um íon positivo, porém ainda com

excesso de energia; e

b) fragmentação de íons com excesso de energia que tendem a se romper.

1.2) Ionização Química (IQ) técnica de ionização muito útil como ferramenta de

quantificação e explicação estrutural.

a) Analisador de massas, responsável pela separação e medição das massas dos íons

formados;

b) detector, normalmente um multiplicador de elétrons, responsável pela transformação

dos íons em sinal elétrico (fluxo de elétrons) para posterior envio ao sistema de dados.

Os íons então são separados de acordo com a razão m/z. O intervalo de massa de

interesse é examinado, causando uma separação de íons num domínio de espaço e tempo. E a

relação carga/massa é calculada de acordo com a equação 2.15.

Equação 2.15



B – campo magnético; r – raio da trajetória; e – carga do elétron; e V – voltagem

Os cromatográfos a gás com detector de massas possuem vários tipos de analisadores onde

os mais comuns são o quadrupolo e o íon trap, na tabela 2.12. Observando a tabela o

quadrupolo como o íon trap teriam as mesmas características, o que mostra que ambos são

muito úteis em grande número de aplicações.

No quadrupolo, os íons produzidos pela fonte são imediatamente acelerados em direção ao

analisador de massas (eixo z), que estará sujeita à ação de campos elétricos produzidos por

potenciais aplicados às barras e, subseqüentemente, separados de acordo com suas massas,

figura 2.23

No íon trap, aplica-se uma baixa voltagem alternada (de rádio freqüência RF) no eletrodo

central. Conseguindo-se, assim, manter os íons positivos oscilando em órbitas no centro do

íon trap. Por uma questão de inércia, os íons mais leves (menos relação massa/carga) oscilam

em órbitas menores. A voltagem alternada (RF) do eletrodo do anel vai aumentando

gradualmente. Cada íon ao atingir a voltagem que desestabiliza (voltagem ressonante) é

ejetado do íon trap. Os íons ejetados para cima são neutralizados no filamento. Os íons

ejetados para baixo choca-se com o multiplicador de elétrons sendo detectado o sinal da

resposta, figura 2.24.

Na figura 2.25 mostra-se um espectrograma de uma molécula de acetaminafeno, que se

podem observar seus íons principais (OLIVEIRA et. al., 2005, p.37).



Tabela 2.12. Aspectos comuns do espectrômetro de massa (LEITE, 2002, p.160-173). Caracteristica Magnético Quadrupolo Íon Trap TOF Intervalo de massa em daltons (mol/L)

1 -50 2 -4000 10 - 2000 Nenhum limite

Aquisição FULLSCAN - SIM

FULLSCAN - SIM

FULLSCAN - SIM

FULLSCAN

Resolução Alta 0,001 m/z 1000

Massa unitária 1 m/z 1000

Massa unitária 1 m/z 1000

alta

Massa exata Exata (1 mgL-1)

trivial trivial Exata (5 mgL-1)

Limite de detecção baixo

10-15 –10-14

10-13 – 10-12

10-13 – 10-12

-

Linearidade (ordem de magnitude)

3–4

4 - 5 3–4

Varredura Baixa rápida rápida Ultra rápida

Figura 2.24. Representação esquemática do analisador quadrupolo.



Figura 2.25. Representação esquemática do analisador íon trap

.

Figura 2.26. Espectrograma de um analito de acetaminafenol no CGEM.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

UFRN – PPGQ - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL


3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 ORGANOGRAMA DA OTIMIZAÇÃO DOS MÉTODOS E APLICAÇÃO

OTIMIZAÇÃO

METODOLOGIA

APLICAÇÃO

PREPARAÇÃO DE AMOSTRA

PLANEJAMENTO FATORIAL 23

CGEM

MODO FULLSCAN SIM

FLUORIMETRIA

FENDAS COMPRIMENTOS DE ONDA

CGDIC

ULTRASSOM

PROPORÇÃO

SOLVENTE

SEM

COM

1:3

1:1

CLOROFÓRMIO

DICLOROMETANO

HEXANO

TEMPO (MIN)

10

20

30

40

50



3.2 METODOLOGIA PROPOSTA PARA DETERMINAÇÃO DE HPAs EM ÁGUAS

3.3 AMOSTRAGEM

3.3.1 Coleta das amostras

As coletas foram feitas no rio potengi em pontos diferentes de amostragem, local que,

foi observado a presença de contaminação de embarcações, lixos domésticos, hospitalares e

industriais. Na marcação dos pontos, foi utilizado Global Position Sistem (GPS).

Extração líquido líquido

Análise por luminescência

Análise por TOG

Análise por CGEM

Análise por CGDIC

Resultado das amostras

Coleta das amostras



3.3.1.1 Material

(a) GPS;

(c) frasco de vidro âmbar de 1l;

(d) isopor com capacidade de 100 l;

(e) Barco de pescador pequeno com motor; e

(f) Máquina fotográfica digital:

3.3.1.2 Procedimento

Antes de realizar a coleta, na maré baixa, foram marcados os pontos de amostragem

usando o GPS. Os pontos críticos e coletas das amostras foram fotografados. As amostragem

seguiram da Praia do Y até a Ponte de Igapó, totalizando 10 pontos. A coleta foi feita na

superfície do rio, numa profundidade de aproximadamente 3 cm. Cada amostra coletada foi

armazenada em frascos de vidro de cor âmbar e colocada em um isopor com gelo para

conservação.

3.3.2 Preparação da amostra

3.3.2.1 Extração

Na preparação da amostra, foi usado um funil de decantação graduado para a extração

líquido líquido, tal como apresentado na Figura 3.1. A extração foi realizada em triplicata

utilizando hexano como solvente na proporção de 1:2 de hexano: água, como também um

banho de ultrasom, durante 10 min, para favorecer o processo de separação. Depois o líquido

extraído foi adicionado em um frasco de vidro de cor âmbar, com muito cuidado para misturar

as fases separadas. A figura 3.1 mostra o funil de extração e o frasco de armazenamento do

analito extraído e a figura 3.2 mostra o banho de ultrassom utilizado.



Figura 3.1. Aparato experimental empregado nos ensaios de extração líquido líquido

Figura 3.2. Banho de ultrassom utilizado para extração dos analitos.

3.4 EXPERIMENTOS DE LUMINESCÊNCIA

3.4.1 Material e reagentes

(a) Banho de ultrassom;

(b) cubeta;

(c) funil de separação;

(d) becker de 500 ml;



(e) parafilme;

(f) frascos de vidro de cor âmbar;

(g) mistura dos padrões de HPAs; e

(h) amostras do rio potengi.

3.4.2. Otimização dos parâmetros de análise por luminescência

A espectrofluorímetria foi para determinação da fenda e comprimento de onda específico

para HPAs o equipamento utilizado foi do tipo Shimadzu modelo RF-5301PC como porta

amostra uma cubeta de quartzo figura 3.3. Os parâmetros envolvidos nesta otimização foram:

(a) Tipo de espectro;

(b) comprimento de onda de excitação fixo ou de emissão fixo;

(c) intervalos de comprimento de onda de emissão ou excitação: emissão de 300 até 700

nm; excitação: de 200 até 380 nm;

(d) intervalo de intensidade de 0 até 1000;

(e) velocidade de varredura: baixa;

(f) largura da fenda (nm) de excitação e emissão;

(g) sensibilidade: Alta;

(h) tempo de resposta: alto; e

(i) lâmpada de Xenônio.

3.4.2.1. Largura da fenda (nm)

O tamanho da fenda é um dos parâmetros mais fundamental para a análise por

espectrofluorimetria. Neste estudo foram utilizados três tipos de fendas em uma amostra de

óleo cru por extração líquido líquido com hexano. Os tamanhos da fenda selecionadas foram

1,5; 3,0 e 5,0 nm para excitação e emissão e avaliou-se a resposta experimental através do

resultado do espectro de emissão.



3.4.2.2. Comprimento de Onda de excitação fixo (λexc;fixo)

O comprimento de onda de excitação ótimo foi escolhido através da varredura do

espectro de emissão utilizando clorofórmio como solvente partindo do intervalo de 300 até

700 nm. Os ensaios com hexano foi usado um λexc;fixo de 282 nm obtido a partir da literatura

(CASTILLO et. al., 2004, p. 213-220).

Figura 3.3. Ilustração do aparato experimental para análise por espectrofluorimetria: a)

Espectrofluorímetro, b) amostrador da cubeta e c) Cubeta de quartzo.

3.4.3. Influência do ultrassom

A concentração óleo cru/ hexano foi de 0,0096g/40 ml a fim de se determinar um tempo

ótimo de separação do analito para a fase do solvente utilizando banho de ultrassom. Os

tempos utilizados foram 10, 20, 30, 40 e 50 min e as leituras foram feitas no

a)

b) c)



espectrofluorímetro. A resposta experimental deste ensaio foi observada pela análise dos

espectros de emissão, comparando-se com solvente hexano e com a extração sem ultrassom.

3.4.4. Aplicação da metodologia de planejamento fatorial na otimização da extração

líquido líquido dos HPAs

3.4.4.1 Materiais e reagentes

(a) Funil graduado;

(b) ultrassom;

(c) frascos de vidros de 50 mL de cor âmbar;

(d) becker de 500 mL; e

(e) amostra sintética de HPAs (água ultrapura com padrões de HPAs).

3.4.4.2. Ensaios para a extração em solvente hexano e diclorometano

O planejamento fatorial 23 foi feito utilizando os fatores que podem influenciar no

sistema de extração líquido-líquido, que são: 1) Ultrasson; 2) Proporção dos solventes e 3)

solventes. Para a realização dos 8 ensaios foi feito um sorteio para se determinar experimentos

empregados. As respostas experimentais no planejamento foram obtidas através de medidas

no espectrofluorímetro cujos dados obtidos foram plotados no software OriginPro 7.5 e

calculado a área. Os dados do planejamento fatorial 23 estão no Quadro 3.1 e 3.2. Essa

seqüência foi utilizada para o solvente hexano/diclorometano



Quadro 3.1. Fatores e níveis do experimento, solventes hexano e diclorometano.

Codificação Fator Níveis

-1 +1

X1 Solvente Hexano Diclorometano

X2 Proporção 1:3 1:1

X3 Ultrassom Sem com

Quadro 3.2. Planejamento Fatorial 23 para a extração líquido líquido.

Ensaio Ultrasom (X1) Proporção (X2) Solvente (X3)

1 - - -

2 + - -

3 - + -

4 + + -

5 - - +

6 + - +

7 - + +

8 + + +

O planejamento fatorial 23 das respostas foram analisadas no software Statistica 6.0

para determinação da superfície de resposta, das curvas de níveis e dos perfis de probabilidade

normal. A superfície de resposta mostra a relação da influência dos parâmetros em três

dimensões (3D), As curvas de níveis mostra a relação das respostas em duas dimensões (2D)

e o gráfico de probabilidade normal mostra a dispersão dos valores com relação aos níveis. O

que pode ser observado nas respostas desses valores é a influência entre diversos fatores e se

as combinações apresentam influências significativas. Os resultados estatísticos precisam de

avaliações críticas e bom senso na observação dos resultados.

Sequência de análise dos ensaios 7 6 4 2 1 8 3 5



3.4.4.3. Ensaios para extração em solvente hexano e clorofórmio

O item 3.2.4.1 foi utilizado para o sistema hexano e clorofórmio mudando apenas a

seqüência do sorteio dos fatores, Quadro 3.3 e 3.4.

Quadro 3.3. Fatores e níveis do experimento, solventes hexano e clorofórmio.

Codificação Fator Níveis

-1 +1

X1 Solvente Hexano Clorofórmio



Quadro 3.4. Planejamento Fatorial 23 para a extração líquido líquido.

Ensaio Ultrasom (X1) Proporção (X2) Solvente (X3)

1 - - -

2 + - -

3 - + -

4 + + -

5 - - +

6 + - +

7 - + +

8 + + +

Sequencia de análise dos ensaios 1 3 4 2 7 5 8 6



3.5. EXPERIMENTOS POR CROMATOGRAFIA GASOSA COM DETECTOR DE

IONIZAÇÃO POR CHAMA

3.5.1. Material e reagentes

(a) Frascos (no inglês: vials) de cor âmbar de 2 mL;

(b) seringa;

(c) mistura de padrões de HPAs; e

(d) amostras do rio potengi.

3.5.2. Procedimento

O método cromatográfico para os HPAs foi feito (SILVA, et al., 2006) e estudado

conforme a adaptação da coluna e também a configuração utilizada para uma melhor

separação dos 16 HPAs prioritários. O equipamento utilizado está apresentado na Figura 3.4.

A metodologia empregada está apresentada a seguir:

A programação do forno passou por um processo de aquecimento em duas rampas,

que foram:

(a) Temperatura inicial de 80ºC durante 1 min (isotérmica);

(b) Incremento da temperatura de 80 até 230 0C com taxa de aquecimento de 8 º

C/min e permanência na temperatura final durante 1 min;

(c) Incremento da temperatura de 230 0C até 300 0C com taxa de aquecimento de 15 0C/min e permanência nesta temperatura por 1 min.

A temperatura do injetor foi de 200 ºC, utilizando o modo sem divisor de fluxo (inglês

splitless);

A temperatura base do detector FID foi de 350 ºC;



Os gases utilizados para acender a chama foram ar e H2 numa vazão de 350 mlmin-1 e

35 mlmin-1. O N2 foi utilizado como gás de arraste; e

A coluna para separação dos analitos foi do tipo RTX-5 (5% difenil + 95 %

polidimetilsiloxano) com dimensão de 30 mm x 0,25 mm x 0,25 µm.

Figura 3.4. Cromatógrafo a gás com detector de ionização por chama.

3.6 EXPERIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DOS HPAs VIA TEOR DE ÓLEOS E

GRAXAS (TOG)

3.6.1. Material e reagentes

(a) Micropipeta na faixa de 100 uL;

(b) becker de 500 mL;

(c) lenços de papel;

(d) funil de decantação de 100 mL;

(e) erlenmeyer 250 mL;

(f) amostras do rio potengi; e

(g) amostras do óleo cru.



3.6.2 Procedimento

O analisador InfraCal TOG/TPH, figura 3.5, foi o instrumento utilizado em nosso

trabalho para medir o teor de hidrocarbonetos totais extraídos com hexano (hidrocarbonetos

ou óleos e graxas de composição). Este instrumento utiliza a região do infravermelho médio

para obtenção das medidas. O detector é usado no analisador TOG/TPH para medir

concentrações de HPAs em 3400 nm com uma referência em 2700 nm (InfraCal®TOG/TPH;

2003, p. ___).

Os analitos orgânicos foram extraídos com hexano de grau HPLC antes de serem

levado para o analisador InfraCal TOG/TPH.

Com o auxílio de uma seringa de 100 microlitros foram coletados 50 microlitros da fase

orgânica e espalhada sobre a plataforma do equipamento, para então ser realizada a leitura no

espectrofotômetro e obter o resultado da concentração do teor de óleos e graxas da amostra. A

análise foi feita em triplicata e os resultados obtidos foram expressos como a média dos

valores medidos.

Figura 3.5 Equipamento analisador InfraCal TOG/TPH modelo HATR-T2 e CH.



3.7 EXPERIMENTO POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A

ESPECTROMETRIA DE MASSA - CGEM

3.7.1 Material e Reagentes

(a) Francos (vials) de cor âmbar de 2mL;

(b) seringa;

(c) padrões de HPAs individual; e

(d) amostras do rio potengi.

3.7.2. Procedimento

O CGEM da marca THERMO ANALÍTICA FOCUS/POLARIS Q, Figura 3.6, foi

utilizado na otimização de um método para analisar os HPAs. O método foi baseada na norma

EPA 7285 para orgânicos semi-voláteis e adaptados ao equipamento do CGEM. Após a

otimização foi feito a análise dos HPAs individuais, fazendo-se uma varredura como forma de

identificar, qual o tempo de retenção de cada um, e então, serem escolhidos os íons principais

referente a cada HPA e os respectivos tempos de retenção. Em seguida, os padrões de HPAs

serão idebtificados segundo o modo monitoramento dos íons principais (Selected Ion

Monitoring – SIM), onde se otimiza apenas com os íons referentes a cada HPA com seu

respectivo tempo de retenção. A coluna utilizada neste Cromatógrafo a gás foi do tipo 5%

fenil + 95% polidimetilsiloxano adequada para orgânicos polinucleares.



Figura 3.6. Cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa marca

THERMO ANALITICA modelo FOCUS.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

UFRN – PPGQ RESULTADOS E DISCUSSÃO


94

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 INFLUÊNCIA DO ULTRASSOM NA SOLUBILIDADE DOS HPAs DO ÓLEO

CRU EM HEXANO

Ensaios a diferentes tempos de exposição ao ultrassom, de uma solução de óleo

cru em hexano, foram feitos como forma de avaliar as condições ideais para dissolução

dos HPAs no solvente em estudo. A eficiência do tratamento foi avaliada através da

comparação entre as intensidades da fluorescência dos HPAs na solução, com e sem

exposição ao ultrassom.

A figura 4.1 apresenta os resultados, obtidos por espectrofluorimetria, onde cada

curva representa o espectro de uma amostra previamente tratada a um tempo diferente

de exposição ao ultrassom. A figura mostra uma semelhança entre os resultados obtidos

com a exposição da amostra ao ultrassom, porém com uma diferença grande em relação

à amostra não submetida ao ultrassom. A semelhança entre as intensidades da

fluorescência após os diferentes tempos de exposição ao ultrasson indica que a

solubilização total ocorre em um curto intervalo de tempo. A grande diferença entre os

resultados das amostras com e sem tratamento indica a necessidade da exposição ao

ultrassom para a solubilização total dos HPAs no hexano.



95

300 400 500 6000

100

200

300

400

500

600Espectro de Emissão

λfixo de excitação= 282 nm

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de onda (nm)

amostra (Petróleo)/ultrasom 10 min amostra (Petróleo)/ultrasom 30 min amostra (Petróleo)/ultrasom 40 min amostra (Petróleo)/ultrasom 50 min amostra (Petróleo)/ultrasom 20 min amostra (Petróleo)/sem ultrasom Solvente (hexano)

Figura 4.1 Espectro de emissão de uma amostra de óleo cru solubilizada em hexano sem e com exposição ao ultrassom em diferentes intervalos de tempo.

4.2 APLICAÇÃO DA QUIMIOMETRIA PARA DETERMINAÇÃO DAS

MELHORES CONDIÇÕES DE EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO PARA HPAs.

4.2.1 Otimização do processo de extração através de um Planejamento Fatorial 23

A otimização por quimiometria permite controlar os parâmetros do processo de

extração e tem como nítida vantagem a maximização da eficiência de recuperação do

analito. Com a otimização, os parâmetros poderão ser controlados e as vantagens com

relação à máxima extração, serão maiores. Dentre outras coisas poderá ser observado,

através da técnica quimiométrica, se a extração é eficaz em um volume de amostra



96

maior com um volume de solvente menor e avaliar o tipo de solvente que mais contribui

no processo. Os solventes utilizados neste trabalho foram: o clorofórmio, o hexano e o

diclorometano.

Conforme experimentos realizados no item 4.1, a solubilidade dos HPAs no

hexano aumenta com a exposição ao ultrassom. O tempo de exposição ao ultrassom na

etapa de extração líquido-líquido (água-hexano) foi de 10 minutos.

Para este estudo utilizou-se uma amostra sintética contendo uma mistura padrão de

16 de HPAs num volume de 1000 mL. Essa amostra foi extraída com os solventes já

mencionados para o estudo do planejamento fatorial.

4.2.2 Determinação das Variáveis e a matriz do planejamento

A fim de encontrar as melhores condições para a extração líquido-líquido dos

HPAs, em meio aquoso, foi utilizado o planejamento fatorial 23 (8 experimentos). Para

tanto foram estudados, como fatores, os diferentes tipos de solvente, suas misturas em

diferentes proporções e tratamento com ultrassom. Os Quadros 4.1 e 4.2 mostram os

fatores e os níveis para dois diferentes planejamentos fatoriais 23.

Quadro 4.1. Fatores e seus respectivos níveis para o planejamento fatorial 23 empregando os solventes

hexano e diclorometano.

Codificação Fatores Níveis

-1 +1

X1 Solvente Hexano Diclorometano



Quadro 4.2. Fatores e níveis para o planejamento fatorial 23 empregando os solventes hexano e

clorofórmio.

Variáveis Fator Níveis

-1 +1

X1 Solvente Hexano Clorofórmio




97


A matriz do planejamento fatorial 23 foi uma alternativa para observar a

influência dos fatores entre si, e foi utilizado para padronizar o sistema de preparação de

amostra. A matriz do planejamento fatorial foi desenvolvida de acordo com os Quadros

4.1 e 4.2. Nas tabelas 4.1 e 4.2 as respostas experimentais correspondem às áreas das

bandas de emissão dos espectros de fluorescência dos HPAs. Nestas tabelas também

podem ser observados os valores de Y(exp), médias entre as duas respostas. A matriz de

planejamento completa, na qual são apresentados os oito ensaios em que cada um deles

é resultado da combinação dos três fatores e dos dois níveis. Também é apresentada a

interação entre os fatores e os sinais correspondentes às suas diversas combinações.

A resposta, de cada experimento do planejamento fatorial, foi obtida através da

integração da área sob a curva do espectro de emissão, como mostrado através da região

hachurada na figura 4.2. A integração foi feita utilizando-se o software microcal origin.

350 400 450 500 5500

50

100

150

200

250

300

350

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de Onda (nm)

AM061

Figura 4.2 Resposta usada no planejamento fatorial. Área hachurada sob a curva.



98

Tabela 4.1 Matriz do planejamento fatorial 23 para o sistema solvente hexano/diclorometano. no

Exp. média Variáveis R1 R2 Y(exp.)X1 X2 X3 X12 X13 X23 X1231 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 689,47 691,38 690,432 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 703,13 699,65 701,393 1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 3782,55 3848,37 3815,464 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1782,52 1797,26 1789,895 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1432,34 1371,66 1402,006 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 4768,10 4792,51 4780,317 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 10934,90 10878,96 10906,938 1 1 1 1 1 1 1 1 20285,45 20306,07 20295,76

Tabela 4.2 Matriz do planejamento fatorial 23 para o sistema solvente hexano/clorofórmio. no

Exp. média Variáveis R1 R2 Y(exp.)

X1 X2 X3 X12 X13 X23 X1231 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 689,47 691,38 690,432 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 703,13 699,65 701,393 1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 965,35 940,31 952,834 1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 900,58 901,27 900,935 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1432,34 1371,66 1402,006 1 1 -1 1 -1 1 -1 -1 4768,10 4792,51 4780,317 1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 909,97 919,6 914,798 1 1 1 1 1 1 1 1 763,73 738,89 751,31

A Figura 4.3 mostra que a intensidade da fluorescência realmente varia com em

função da combinação dos fatores, sendo a maior resposta observada no ensaio 08, nível

positivo para todos os fatores. A segunda maior resposta foi o experimento 7 sem uso

do ultrassom, proporção 1:3 e no meio diclorometano. Claramente, observando a área

da mesma figura observa-se que a proporção 1:1 tem uma influencia muito grande na

resposta, pois os experimentos 6 e 7 não foram muito correspondente.



99

300 350 400 450 500 5500

50

100

150

200

250

300

350

400

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de Onda emissão (nm)

experimento 7 experimento 8 experimento 6 experimento 5 BcoDCM

Tabela 4.1

Figura 4.3. Espetros de emissão do planejamento fatorial 23 dos HPAs em Diclorometano (DCM) com comprimento de onda de excitação fixo de 282 nm.

A figura 4.4 mostra os espectros de emissão da amostra sintética extraída em

hexano. O que se pode observar que o experimento 3 apresenta uma grande

significância de resposta. Essa resposta seria a presença do ultrassom e proporção 1:3.

Algo muito interessante é que em todos os casos do experimento a estrutura das áreas

são as mesmas, isto mostra que existe a possibilidade da extração de todos os HPAs nos

experimentos. O hexano é um bom solvente de extração, mas ele apresenta uma

volatilidade muito grande com relação aos demais solventes, exigindo mais cuidados

com o experimento no sentido de minimizar erros nas medidas e problemas ambientais.



100

350 400 450 500 5500

20

40

60

80

100

120

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de Onda emissão (nm)

experimento 4 experimento 3 experimento 2 experimento 1 branco hexano

Tabela 4.1 e 4.2

Figura 4.4 Espetros de emissão do planejamento fatorial 23 dos HPAs em hexano (Hex) com comprimento de onda de excitação fixo de 282 nm.

A Figura 4.5 mostra os espectros com os resultados obtidos em clorofórmio

utilizadas no planejamento fatorial 23 e que não apresentou condições favoráveis para o

experimento, pois a área apresentou valores muito menores. Considerando-se ainda que

o clorofórmio é um reagente muito tóxico, e além disso o mais volátil dos três, estas

informações corroboraram para que o mesmo não fosse utilizado no procedimento dos

experimentos. Observando as áreas desta figura, todos os experimentos, apresentam-se

valores correlatos. Este resultado pode indicar a saturação do solvente pelo HPA e

também, o fato do clorofórmio ser o solvente mais polar entre os usados, que este esteja

absorvendo muita água que pode inibir o processo de fluorescência dos HPAs extraídos.



101

240 260 280 300 320 340 360 3800

20

40

60

80

100

120

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de Onda Emissão (nm)

experimento 7 experimento 8 experimento 6 experimento 5

Solvente: ClorofórmioTabela 4.2

Figura 4.5 Espetros de emissão do planejamento fatorial 23 dos HPAs em Clorofórmio com comprimento de onda de excitação fixo de 282 nm.

Cabe ressaltar que os solventes hexano, clorofórmio e diclorometano vêm sendo

muito utilizados por muitos autores, bem como a mistura de hexano e diclorometano,

que mostram ser mais eficientes do que eles separados. Não foi encontrada referência

que fizesse comparação entre os diversos solventes utilizados. Na literatura foi

encontrada comparação entre solventes alcoólicos em que também foi feito tratamento

estatístico semelhante ao realizado neste trabalho (Neves, 2006, p. 33-40), ou seja, com

o objetivo de escolher as melhores condições de trabalho.

Os autores XU et al, (1995, p. 307-312) utilizaram mapa de contorno, para

explicar a matriz de emissão com relação ao comprimento de onda, e diagrama de bloco

para explicar a região de interação. A literatura, desses autores mencionados, foi uma

ferramenta muito útil nas respostas obtidas desse trabalho realizado.



102

4.2.3 Cálculo dos efeitos

O cálculo dos efeitos é baseado nos níveis dos fatores e suas interações com

relação à resposta de cada experimento. Então a Equação 4.1 mostra como é calculado

o efeito do planejamento fatorial para média dos oito experimentos e a equação 4.2

mostra o cálculo para os níveis dos efeitos. Yexp é a resposta de cada experimento e Xi

são as variáveis dos níveis correspondentes a cada experimento.

Equação 4.1

Equação 4.2 A Tabela 4.3 mostra o resultado dos efeitos dos fatores, que a partir deles pode

se observar o grau de significância relacionando-se com o erro.

Tabela 4.3 Efeitos do sistema.

Hexano\DCM hexano/clorofórmio

b0 5547,77 b0 1386,75 b1 2688,13 b1 793,47 b2 -7597 b2 1150,71 b3 7308,48 b3 -1013,6 b12 -3695,4 b12 813,94 b13 993,5 b13 -901,16 b23 -5201,7 b23 -1244,5 b123 -2011,8 b123 -869,73



103

4.2.4 Cálculo do erro

O erro é calculado através da variância como forma de observar a significância

dos valores obtidos, tal como as pequenas oscilações que ocorre em cada etapa dos

experimentos. A Equação 4.3 mostra como calcular o erro dos experimentos. O erro foi

calculado para observar se os efeitos foram significativos ou não num intervalo de

confiança de 95%. Então os valores de distribuição de t de Student foram de 8 graus de

liberdade para uma probabilidade de 5% ou 2,3. Sendo que para nossos valores o erro

foi insignificante, pois apresentou um valor muito pequeno, então não precisou tirar

nem um dos valores dos efeitos. Isto ocorreu, portanto por apresentar valores repetidos

de medidas de cada experimento, isto é a repetição não foi autentica.

Equação 4.3

4.2.5 Descrição do modelo estatístico

O modelo estatístico do planejamento fatorial pode ser construído através de

variáveis codificadas que são X1, X2 e X3 e os βs são valores populacionais dos efeitos.

β0 é um termo constante, é a media de todas as respostas e os demais coeficientes são a

metade dos efeitos calculados. Na Equação 4.4 mostra o modelo estatístico do

planejamento fatorial da extração líquido-líquido.

y (X1, X2, X3) = β0 + β1 X1 + β2 X2 + β3 X3 + β12 X12 + β13 X13 + β23 X23 + β123 X123

Equação 4.4

Na Tabela 4.3 são mostrados os efeitos que correspondem aos coeficientes,

chamados de estimadores dos parâmetros populacionais. Os efeitos foram calculados



104

para obtenção do Y(modelo). Quando o modelo experimental corresponder ao modelo

teórico significa que todos os parâmetros foram significativos e os fatores foram

correspondentes entre si. As Equações 4.1 e 4.2 mostram a equação do formato do

modelo teórico.

Y(modelo) = 5548 + 1344X1 – 3798X2 + 3654X3 – 1848X12 + 497X13 – 2601X23 -

1006X123 Equação 4.5

Y(modelo) = 1387 + 397X1 - 507X2 + 575X3 - 450X12 + 407X13 - 622X23 -

435X123 Equação 4.6

4.4 VISÃO GEOMÉTRICA DOS RESULTADOS

Os vértices de um cubo são utilizados para colocar adequadamente os resultados

do planejamento fatorial 23, que pode ser verificado na representação da Figura 4.6 e

4.7.



105

Figura 4.6 Representação em forma de cubo dos resultados da tabela 4.5.

Figura 4.7 Representação em forma de cubo dos resultados da tabela 4.6.



106

Observando o cubo da figura 4.6 o uso do ultrassom, que possui nivel positivo

(+), apresenta resultados elevados em todos os ensaios. No entanto, a conbinação de

outros fatores, tais como, solvente diclorometano com nivel positivo (+) e proporção 1:3

com nível positivo (+) são mais característicos. O diclorometano possui um poder de

extração bem melhor do que o hexano, isso se deve ao valor do indíce polar. O hexano

apresenta um índice polar bastante baixo com relação ao diclorometano. O hexano

também apresenta uma toxidade maior por ser um solvente muito volátil.

Os vértice do cubo aumenta no sentido do quadrado 1, 2, 3 e 4 para o sentido do

quadrado 5, 6, 7 e 8, de frente para trás do cubo, como também no sentido do quadrado

1, 2, 5 e 6 para 3, 4, 7 e 8, de baixo para cima do cubo. Isso indica a influência dos

fatores. O aumento dos valores de frente para trás do cubo deve se a influência do fator

diclorometano e o aumento dos valores de baixo para cima do cubo é devido a

influência da proporção 1:3.

O cubo da Figura 4.7 mostra que o uso do ultrassom nivel positivo (+), o

solvente hexano nivel negativo (-) e a proporção 1:3 nivel positivo (+) apresenta um

valor maior do que os demais. Neste contexto pode se observar a influência do solvente

no processo. E o segundo resultado maior mostra a ausência do ultrassom nivel negativo

(-), o uso do solvente hexano nivel negativo (-) e a proporção 1:3 nivel positivo (+).

Também pode se observar a presença do solvente hexano. Em ambos os resultados

maiores pode se observar a influência muito forte do uso do solvente hexano e a

proporção 1:3.

Nos demais resultados pode se observar a estabilidade dos valores mostrando

que houve uma saturação dos analitos na solução.

O uso do clorofórmio não foi muito eficaz, por ele ser muito tóxido e não

contribuir bem na extração dos analitos da matriz água.



107

4.5. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES NO

FLUORÍMETRO

4.5.1. Determinação do comprimento de onda fixo de excitação

O espectro de excitação sempre aparece em comprimentos de onda menores

enquanto o espectro de emissão aparece em comprimentos de onda maiores como

mostra na revisão da literatura. Por exemplo, quando for analisar um espectro de

excitação, deve-se fixar o comprimento de onda de emissão. Se o comprimento de onda

fixo de emissão for de 400 nm o espectro de excitação será num intervalo de 220 nm até

350 nm; se o comprimento de onda fixa de excitação for de 280 nm, então o espectro de

emissão será num intervalo de comprimentos de onda acima de 300 nm. Mas como o

objetivo do trabalho é a verificação dos HPAs por Fluorescência (emissão), portanto

será determinado o melhor comprimento de onda fixo de excitação para os HPAs.

Observando a Figura 4.8 o melhor espectro de emissão foi num comprimento de

onda fixo de 260 nm. Pois aparecem todas as transições relativas ao espectro dos

orgânicos totais, podendo analisar a emissão a partir de 300 nm. Para escolha desse

comprimento de onda foi utilizado como referência os padrões de HPAs.



108

340 360 380 400 420 440 460 480 5000

100

200

300

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de Onda de Emissão

220 λmáxexitação

240λmáxexitação

260λmáxexitação

280λmáxexitação

300λmáxexitação

307λmáxexitação

320λmáxexitação

340λmáxexitação

360λmáxexitação

380(10)λmáxexitação

400(11)λmáxexitação

λmáx,emissão = 410 nm

Figura 4.8. Espectros de emissão de uma amostra sintética de HPAs, usando-se comprimentos de onda

fixos para excitação.

4.5.2. Determinação da resolução espectral de emissão e excitação do

Espectrofluorímetro

O tamanho da resolução espectral é um parâmetro de grande importância,

principalmente para a resolução do espectro. Geralmente, um tamanho maior de

resolução espectral não deixa bem definido as transições do analito a ser estudado,

principalmente em espectros de bandas estreitas, pois a dispersão de luz é muito grande,

como apresentado na Figura 4.9. As resoluções espectrais menores também apresentam

suas limitações, mostrando espectros com transições bem definidas dos analitos, no

entanto a intensidade da luz é muito fraca. Portanto, devido a essas limitações, as

resoluções espectrais intermediárias são mais utilizadas.

O espectro de emissão foi obtido utilizando-se três tipos de resoluções espectrais

do espectrofluorímetro para determinar qual delas apresentava a melhor resposta.

Investigando a Figura 4.10, observa-se que os espectros de emissão são equivalentes



109

para as resoluções espectrais de 3 e 5 nm, mas a resolução espectral de 5 nm, Figura

4.11 tem a maior intensidade, no entanto é preferível usar a resolução espectral de 3 nm

para emissão e excitação da amostra, tendo em vista que pode haver saturação no

espectro quando se analisa HPAs que possuem alta intensidade de emissão, Figura

4.12. A resolução espectral de 1,5 nm não apresentou espectros de emissão e excitação

com intensidade muito baixa, sendo difícil de visualizar as transições bem definidas.

Figura 4.9. Espectro de uma amostra em vários tipos de Resoluções espectrais.



110

300 350 400 450 500 5500

200

400

600

800

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


Fenda de 1,5 nm Fenda de 3,0 nm Fenda de 5,0 nm

Figura 4.10. Espectros de emissão de uma amostra de óleo cru em três tipos de resoluções

espectrais: 1,5, 3,0 e 5,0 nm.

300 350 400 450 500 5500

200

400

600

800

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


Fenda de 5 nm

Figura 4.11 Espectro de emissão de uma amostra de óleo cru em uma resolução espectral de

5nm, ampliada da figura 4.10.



111

300 350 400 450 500 5500

20

40

60

80

100

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


Fenda de 3 nm

Figura 4.12 Espectro de emissão de uma amostra de óleo cru em uma resolução espectral de

3nm, ampliada da figura 4.10.

4.6. PARÂMETROS DE DESEMPENHO ANALITICO DO FLUORÍMETRO

A faixa analítica de trabalho foi construída com 6 soluções padrões de

concentrações entre 5 a 180 µgL-1 de HPAs em hexano, Figura 4.13. Através da curva

analítica foi obtido o fator de correlação, Equação 4.4. Para calcular o limite de

quantificação 0,0786 ugL-1 e o limite de detecção 0,0272 µgL-1 foi feito a análise do

hexano no espectrofluorímetro 10 vezes e calculado a média e o desvio padrão. Esses

valores serviram para o cálculo do sinal analítico onde o limite de quantificação é 10

vezes o sinal/ruído do desvio padrão do branco (hexano) e o limite de detecção é 3

vezes o sinal/ruído do desvio padrão do branco (hexano) ambos somado com a média

(MYCOTOXINS, 2008). A faixa analítica de trabalho do padrão em clorofórmio foi

construída com 6 soluções padrões de HPAs de concentrações entre 8 a 61 µgL-1,

Figura 4.14. O fator de correlação para a curva em clorofórmio está na Equação 4.3.



112

Y = 202,19 + 24,08* X R = 0,99516 Equação 4.7

Y = 1226,53 + 433,00*x R = 0,99644 Equação 4.8

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

1000

2000

3000

4000

5000Á

rea

Concentração (ugL-1)

Y = 202,18809 + 24,07895 * X R = 0,99516

LQ = 0,0786 ugL-1 LD = 0,0272 ugL-1

Figura 4.13. Curva analítica da mistura dos HPAs em hexano e o limite de quantificação e

detecção.



113

0 10 20 30 40 50

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

22000

24000

y = 1226,53 + 433,00*x R = 0,99644

Áre

a

Concentração (ugL-1) Figura 4.14. Curva analítica da mistura dos HPAs em clorofórmio e o limite de quantificação e

detecção.

O limite de detecção (LD) representa a mais baixa concentração da substância

em exame que pode ser detectada com certo limite de confiabilidade utilizando um

determinado procedimento experimental. O limite de quantificação representa a mais

baixa concentração do analito que pode ser quantificada com certa confiabilidade,

utilizando uma marcha analítica específica (VIEIRA ; LICHITIG, 2004, p. __).

Equação 4.9 Sm = Sinal analítico Sbr = sinal do branco (desvio padrão) m = inclinação da curva padrão

4.7. PADRÕES DE HPAs E O PETRÓLEO BRUTO

Em um espectrofluorímetro foram feitos a análise dos padrões e do óleo cru

como referência da presença de HPAs, que servirão como comparação com a matriz



114

(amostra de água) do Rio Potengi. Na Figura 4.15 pode ser observado o espectro de

emissão dos padrões de HPAs e também da amostra de óleo cru. Neste caso observa-se

que tanto os padrões quanto o óleo emitem na mesma região do espectro, indicando a

presença de HPAs na constituição do óleo. O espectro de emissão das amostras

apresenta uma soma de todas as transições, por isso ocorre uma banda grande e larga.

300 350 400 450 500 5500

50

100

150

200

250

300

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

Comprimento de Onda λ(nm)

Hexano Padrão de 20 ugL-1

Padrão de 100 ugL-1

Padrão de 180 ugL-1

DTNESM QBEM

Figura 4.15. Espectros de emissão de padrões de HPAs e do óleo cru excitados em 282 nm.

4.7. APLICAÇÃO DOS MÉTODOS OTIMIZADOS EM AMOSTRAS COLETADAS

NO RIO POTENGI.

4.7.1. Amostras extraídas com clorofórmio

As amostras de água obtidas a partir da coleta na superfície das margens do Rio

Potengi, Figura 4.16, foram extraídas utilizando-se clorofórmio como solvente e

analisadas no espectrofluorímetro. Os resultados estão dispostos na Figura 4.17.



115

Também foram analisadas soluções de nitrato para saber se este estava influenciando

nos resultados dos orgânicos. Na literatura foi estudada a interferência dos ácidos

húmicos nos resultados de HPAs, mas o que pode ser observado é que eles não

influenciaram na resposta, porque estes apresentam fluorescência numa região de

comprimentos de onda maiores, em torno de 600 nm como pode ser observado na

Figura 4.17. Também pode ser observado no espectro que as amostras (Mucuripe, canal

do baldo, depósito Naval de Natal, Tavares de Lira Saída do curtume e praia do Y), em

comprimentos de onda de 350 a 450, apresentaram formatos de espectros de analitos de

HPAs que provavelmente serão: antraceno, Benzo(a)antraceno, Pireno, Criseno,

Fluoranteno e Dibenzo(a,h)antraceno enquanto que na região de 300 a 350 nm são

característico aos HPAs de Acenaftileno, Fenantreno e Naftaleno. Essas informações

estão apresentadas no anexo 1. No laboratório da Analytical Solution foram feitas as

análises de HPAs desses pontos em CGEM, mas só foram encontrados os seguintes

analitos nos respectivos pontos:

(a) Naftaleno 0,26 µgl-1 e Fenantreno 0,17 µgl-1 no ponto de mucuripe;

(b) naftaleno 0,09 µgl-1, fenantreno 0,39 µgl-1, antraceno 0,05 µgl-1, fluoranteno

0,03 µgl-1, pireno 0,08 µgl-1, benzoantraceno 0,03 µgl-1, criseno 0,02 µgl-1 -

Tavares de Lira; e

(c) naftaleno 0,07 µgl-1 na praia do Y.

Supõe-se que os demais analitos não foram encontrados devido ao tempo de

análise e conservação da amostra, pois teve se que enviar de Natal para São Paulo.

Os resultados das concentrações dos HPAs totais pelo especfluorímetro de cada

ponto foram:

(a) Mucuripe 34 µgl-1;

(b) canal do baldo 24,75 µgl-1;

(c) depósito Naval de Natal 43,94 µgl-1;

(d) tavares de Lira 23,13 µgl-1;

(e) saída do curtume 41,23 µgl-1; e

(f) praia do Y 15,66 µgl-1.



116

A saída do maruim e o centro náutico não foram encontrados a presença de

HPAs.

Essas quantidades são provenientes de embarcações e também de lixos

domésticos que são lançados no Rio Potengi. Além de HPAs também podem existir

outros materiais orgânicos que florescem neste comprimento de onda. Os HPAs

também podem existir em alimentos como carnes defumadas, manteigas, bebidas

(cachaça), dentre outros.

Figura 4.16 Locais de coleta das amostras de água no Rio Potengi e a ferramenta de coleta.



117

300 400 500 600 7000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


Saída do Maruim Rua Chile - Centro Náutico Mucuripe - próximo a farinha do peixe Canal do baldo Depósito Naval de Natal Tavares de Lira Saída do Curtume Praia do Y Nitrato

Figura 4.17 Espectro de emissão das amostras de água do Rio Potengi com excitação fixa de

260 nm.

4.8.2. Amostras extraídas com hexano – Primeira coleta

As amostras foram coletas no rio potengi num total de 10 pontos distintos e no

leito do rio. Os locais foram marcados com GPS (Global Position Sistem) para

identificar os pontos coletados na primeira coleta. As amostras para HPAs foram

coletadas em frascos âmbar de vidro e conservadas em gelo (aproximadamente 4ºC) no

isopor. A Figura 4.18 mostra o percurso onde foram coletadas as amostras no Rio

Potengi. Esse percurso sai da Praia do Y próximo a praia da redinha até a ponte velha

(ponte de Igapó).



118

Figura 4.18. Mapa do Rio Potengi em Natal/RN onde foram feitas as coletas das amostras com

matriz água.

Nas amostras de 1 a 6 dos pontos(Mucuripe, canal do baldo, depósito Naval de

Natal, Tavares de Lira Saída do curtume e praia do Y), coletadas no leito do Rio

Potengi em maré baixa, não foi verificada a presença de HPAs. Esse resultado pode ser

confirmado pelo espectro de emissão da Figura 4.19.



119

350 400 450 5000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100Extraídos com solvente hexano

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


am1em282 am2em282 am3em282 am4em282 am5em282 am6em282 Hexano

Figura 4.19. Espectro de emissão das amostras coletadas no Rio Potengi.

Um possível motivo para a ausência dos HPAs no leito do rio seria a correnteza

elevada e o grande volume d’água, apesar da baixa maré no momento da coleta,

causando tanto a dispersão quanto diluição desses analitos. Esses valores estão em

concordância com os resultados de TOG (teor de óleos e graxas) que apresentou

concentrações menores do que 10 µgl-1.

4.8.3. Amostras extraídas com hexano – Segunda coleta

Depois de 4 meses da primeira coleta no leito do rio e em maré baixa foram

feitas outras coletas em um número menor de pontos, mas em locais críticos, na

extremidade do rio. Também com cuidados no armazenamento (frasco de vidro de cor

âmbar e conservação a 4 oC numa caixa de isopor). As amostras quando extraídas foram



120

analisadas em um espectrofluorímetro e os resultados obtidos estão apresentados na

Figura 4.20, espectro de emissão e Figura 4.21 espectro de excitação. Os pontos de

coletas foram: Mucuripe, canal do baldo, depósito Naval de Natal, Tavares de Lira e

Saída do curtume

350 400 450 500 5500

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100In

tens

idad

e (u

.a.)


amostra 3 amostra 4 amostra 6 amostra 7 amostra 8 Hexano

Figura 4.20 Espectros de emissão das amostras coletadas no Rio Potengi em comprimento de

onda de excitação fixo de 282 nm.

230 240 250 260 270 2800

10

20

30

40

50

60

70

Inte

nsid

ade

(u.a

.)


Amostra 3 Amostra 4 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8

Figura 4.21 Espectros de excitação das amostras coletadas no Rio Potengi obtidos em

comprimento de onda de emissão fixo de 310 nm.



121

4.9. OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO POR CGDIC E APLICAÇÃO EM AMOSTRAS

E PADRÕES

Neste estudo foram avaliados alguns métodos citados na literatura para análise

de HPAs, mas nem todos foram satisfatórios, então foi necessário fazer uma adaptação

de um dos métodos para enquadrar-se ao equipamento CGDIC do fabricante THERMO.

Com este método foi analisado um padrão de HPAs de 40 mgl-1 e obtido o

cromatograma da Figura 4.22. Esse cromatograma foi comparado com o artigo de

(SILVA et al, 2006), que apresentou semelhança com os resultados publicados.

No Rio Potengi foram coletadas, em 8 pontos, as amostras de água e

conservadas em temperatura de 4oC em caixa de isopor contendo gelo. As Figuras

4.23.1 até 4.23.8 representam oito pontos de coleta dispostos ao longo dos Rios Jundiaí

e Potengi. As análises não indicaram a presença de HPAs. Os cromatogramas de 3 a 8

são referentes às amostras dos pontos de coleta: Mucuripe, canal do baldo, depósito

Naval de Natal, Tavares de Lira e Saída do curtume. Os resultados das amostras de 10 a

12, considerados como pontos críticos, no Rio Jundiaí, também não indicaram a

presença de HPAs. A amostra 10 foi coletada próxima a currais de animais e esgoto e

em maré baixa; a amostra 11 foi coletada próxima a esgotos de indústrias têxteis, mas

também não foi encontrado traços de matéria orgânica; e a amostra 12 foi coletada

próxima a viveiros de camarões, e também não foi detectada a presença de HPAs.



122

5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

40000000

Benz

o(g,

h,i)p

erile

noD

iben

zo(a

,h)a

ntra

ceno

Benz

o(a)

pire

noBe

nzo(

k)flu

oran

teno

Benz

o(b)

Fluo

rant

eno

Cris

eno

Pire

noBe

nzo(

a)an

trace

no

Fena

ntre

no

Inde

no(1

,2,3

-cd)

Pire

no

Fluo

reno

Antra

ceno

Fluo

reno

Acen

afte

noAc

enaf

tilen

o

Naf

tale

no

Volta

gem

(mV)

Tempo de Retenção (min)

(Padrão de HPAs 40 mg/l)

Figura 4.22 Cromatograma dos HPAs prioritários numa concentração de 40 mgL-1.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

20000000

Vol

tage

m (m

V)


amostra 3

Figura 4.23.1 Cromatograma da amostra coletada no Rio Potengi ponto 3.



123

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

1400000

1600000

1800000

2000000

2200000

2400000

2600000

2800000

3000000

3200000

3400000

3600000

3800000

4000000

Volta

gem

(mV

)

Tempo (min)

amostra 4


0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Vol

tage

m (m

V)


amostra 6

Figura 4.23.3. Cromatograma da amostra coletada no Rio Potengi ponto 6.



124

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

Volta

gem

(mV

)


amostra 7


0 5 10 15 20 25 30

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Volta

gem

(mV

)


amostra 8

Figura 4.23.5 Cromatograma da amostra coletada no Rio Jundiaí ponto 8.



125

0 5 10 15 20 25 30

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Volta

gem

(mV

)


amostra 10

Figura 4.23.6. Cromatograma da amostra coletada no Rio Jundiaí ponto 10.

0 5 10 15 20 25 30

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Volta

gem

(mV

)


amostra 11

Figura 4.23.7 Cromatograma da amostra coletada no Rio Jundiaí ponto 11.



126

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

18000000

20000000

Volta

gem

(mV

)


amostra 12

Figura 4.23.8. Cromatograma da amotra coletada Rio Jundiaí ponto 12.

4.10 TEOR DE ÓLEOS E GRAXAS (TOG)

O analisador InfraCal TOG/TPH é padronizado com amostras de óleo cru e

extraído com hexano de grau HPLC, como é sugerido no manual de instrução do

equipamento. A resposta é dada em µgl-1.Os resultados desse equipamento é dado em

concentração. Os hidrocarbonetos extraídos pela energia de infravermelho por absorção

em um comprimento de onda específico e quantidade de energia absorvida é

proporcional a concentração do óleo e graxa do solvente. Os resultados das amostras do

rio jundiaí e potengi segue na Tabela 4.4. Esses valores foram coletados no leito e na

superfície do rio e em maré alta e baixa. Os valores são bastante imprevisíveis no que

diz respeito a um local que existe muitas influências do meio. Comparando os valores

com os cromatogramas do item 4.8 e com o espectro de emissão da figura 4.24 observa-

se que não poderá existir HPAs nestes pontos de coletas, apenas outros tipos de

orgânicos que não são luminescentes e o detector de ionização de chama do

cromatógrafo não foi possível determinar.



127

Tabela 4.4. Resultados de TOG das amostras coletadas no Rio Jundiaí e Potengi.

Pontos 1ª Coleta 2a Coleta Pontos 1ª Coleta 2a Coleta E01C 3,5 2,6 E01V 6,3 4 E02C 3 0,6 E02V 5,6 3,7 E03C 3 6,5 E03V 7 1,5 E04C 2 2 E04V 9,3 2 E05C 2,3 1 E05V 8,6 2,3 E06C 1,7 2,5 E06V 2,3 2 E07C 2 3 E07V 7 1,3 E08C 5,3 2,6 E08V 6,7 2,7 E09C 3 7,5 E09V 8,7 0,7 E10C 3 1,5 E10V 2 5,7 E11C 1,7 2,5 E11V 4,7 5,3 E12C 2 1,5 E12V 3,3 8 Data 4/10/2007 14/11/2007 Data 4/10/2007 14/11/2007

C - Maré Alta V - Maré Baixa

4.11. OTIMIZAÇÃO DA CONFIGURAÇÃO DO MÉTODO DO CROMATÓGRAFO

A GÁS POR ESPECTROMETRIA DE MASSA.

A otimização do método do cromatógrafo a gás acoplado a espectrometria de

massa foi-se necessário devido o fato de que outros métodos e normas encontrados na

literatura não foram favoráveis às condições de análise impostas pelo software

XCALIBU.

O amostrador AI/AS 3000 foi configurado para fazer várias lavagens na amostra

a ser injetada e também no solvente depois da injeção da amostra, para não contaminar

a amostra seguinte, Figura 4.24. Isso foi feito para evitar a contaminação de uma

amostra pela outra. A figura 4.25.1 mostra a configuração do forno utilizada para o

método empregado nas análises do CGEM:

(a) Temperatura inicial de 40 0C num tempo de aquecimento de 4 min; e

(b) Temperatura final de 270 0C num tempo de 5 min e rampa de aquecimento de

10oC/min.

A Figura 4.25.2 mostra a configuração da temperatura do injetor que é de 250 oC com fluxo de 30 mL/min num modo sem divisão de fluxo (inglês: splitless) onde

toda a amostra e solvente são utilizados na injeção sem discarte.



128

A Figura 4.29.3 mostra a configuração do gás carriado o qual segue num modo

de fluxo constante e a Figura 4.25.4 mostra que a temperatura de transferência do

cromatógrafo a gás ao espectrômetro de massa é de 280 oC.

A Figura 4.26 representa a configuração para o funcionamento do PolasrisQ, o

espectrometro de massa da THERMO circulado em vermelho. As condições de uso são:

1 – A temperatura da zona de aquecimento é de 200 oC;

2 – o tempo no cromatograma vai ser escaniado apartir de 4 min que está atribuído a

saída do solvente observado no segmento 1; e

3- o autotune do software CGEM significa o autoajuste de parãmetros, como atribuição

e abudancia das massas (relação da abudancia dos íons) e a forma dos picos (LANÇAS,

2004, p. 1-3).

No modo de varredura (inglês: scan mode) pode ser escolhido o tipo de

varredura do cromatograma e do espectro. O modo varredura completa (inglês:

FULLSCAN) é o mais utilizado, pois faz uma varredura completa no cromatograma e

espectro. Quando definidos os tempos de retenção e os íons de cada analito a amostra

deverá ser analisada no modo de monitoramento da seleção dos íons (inglês: SIM –

Selected Ion Monitoring), pois facilita na identificação ideal do analito a ser estudado.

Com esta metodologia foi possível identificar todos os 16 HPAs prioritários

como também identificá-los nas amostras estudadas.

Figura 4.24. Configuração do amostrador Al-AS 3000 para as análises de HPAs.



129

Figura 4.25.1. Configuração do forno do Cromatógrafo a gás para análise de HPAs.

Figura 4.25.2. Configuração do injetor do Cromatógrafo a gás para análise de HPAs.



130

Figura 4.25.3. Configuração do arraste do gás do Cromatógrafo a gás para análise de HPAs.

Figura 4.25.4. Configuração da linha de transferência do Espectrômetro de massa para o Cromatógrafo a

gás para análise de HPAs.



131

Figura 4.26. Configuração do Espectrometro de Massa para análise de HPAs.

4.11.1 Tempo de Retenção e Íons encontrados pelo Método FULLSCAN

Os resultados das análises dos 16 HPAs foram identificados individualmente no

CGEM com analisador de capturas de íons (inglês: íon trap), onde os resultados foram

comparados com a norma EPA 8170C e a biblioteca NIST do softeware do XCALIBU,

tabela 4.5. Como na biblioteca a maioria das análises são feitas em CGEM com

analisador quadrupolo, então a diferença foi mínima entre eles. Tendo todos os tempos

de retenção dos analitos e seus respectivos íons, quando for analisar as amostras utiliza-

se o mesmo método, apenas altera-se o modo de varredura para o modo SIM, assim

facilita na identificação do analito na amostra.



132

Tabela 4.5. Tempo de retenção e fragmentação dos íons dos 16 HPAs prioritários.

Nome do composto Tempo de

Retenção (min)

Fragmentação

Ion Principal Ion Secundário

Pireno 24,51 212 206; 208

Acenaftileno 17,28 164 160; 158

Fenantreno 21,18 188 184; 160

Fluoranteno 24,01 212 180; 208

Acenafteno 17,71 164 162; 160

Antraceno 21,29 188 184; 160

Benzo (a) Antraceno 27,43 240 236; 232

Benzo (b) Fluoranteno 30,90 264 260; 232

Benzo (k) Fluoranteno 31,00 264 260; 256

Criseno 27,54 240 237; 212

Fluoreno 18,88 176 170; 146

Indeno (1,2,3 – cd) Pireno 39,13 288 280; 284

Naftaleno 13,54 136 108; 54

Benzo (g, h, i) Perileno 41,15 288 284; 280

Dibenzo (a, h) Antraceno 39,37 292 288; 284

Benzo(a) Pireno 32,29 264 132; 260

4.12. APLICAÇÃO DE ANÁLISES DE ALGUMAS AMOSTRAS POR CGEM E

FLUORESCÊNCIA

Os métodos otimizados na preparação da amostra, Fluorescência e CGEM foram

aplicados em amostras coletadas no rio potengi e obtido os resultados discutidos logo

em seguida.

Na amostra 1 coletada próximo a favela do maruim foi encontrado HPAs

acenaftileno, benzo(a)antraceno e Indeno(1,2,3-cd)pireno figura 4.27;

Na amostra 2 coletado próximo ao centro náutico, HPAs encontrados

acenaftileno, Figura 4.28; e



133

Na amostra 3 coletado próximo a capitania dos portos foi encontrado HPAs

benzo(a)antraceno e Indeno(1,2,3-cd)pireno, Figura 4.29;

Esses HPAs são provenientes da contaminação que existe nas margens do rio, tal

como, lixos domésticos, óleos de embarcação e outros. E comparando esses resultados

com os espectros de emissão pode ser observado a presença dos HPAs pela região que

houve a emissão, portando vale lembrar que a Fluorescência apresenta HPAs totais.

9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 480

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

Volta

gem

(mV)


AM1 - Favela do Maruim

Acen

aftil

eno

- 17,

50

Ben

zo(a

)ant

race

no -

27,3

1

Inde

no(1

,2,3

- cd)

pire

no -

39,1

4

Figura 4.27. Cromatograma de alguns HPAs encontrados no rio Potengi do ponto de amostragem na

favela do maruim.

9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

Vol

tage

m (m

V)


AM2 - Náutico

Ace

nafti

leno

- 17

,52

Figura 4.28. Cromatograma de alguns HPAs encontrados no rio Potengi do ponto de amostragem no

centro náutico.



134

9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 480

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

Vol

tage

m (m

V)


AM3 - Capitania dos Portos

Ben

zo(a

)ant

race

no -

27,4

6

Inde

no(1

,2,3

- cd

)pire

no -

39,1

7

Figura 4.29. Cromatograma de alguns HPAs encontrados no rio Potengi do ponto de amostragem na

capitania dos portos.

Os espectro de emissão da Figura 4.30 mostra a existência de HPAs pelo

resultado obtido. Calculando a área pode-se obter a concentração de cada região, que

segue:

(a) Favela do maruim 4,60 µgl-1;

(b) Náutico 65,35 µgl-1;

(c) Capitania dos portos 4,21 µgl-1;

(d) Estação Ferroviária 1,48 µgL-1; estação Ferroviária 71,30 µgl-1; e

(e) Próximo a ponte nova 1,75 µgl-1;

No rio jundiaí próximos aos viveiros de camarões encontrou-se uma

concentração de 40,29 µgl-1; dejetos da indústria téxtel de Jundiai 1,64 µgl-1; e Esgoto

Jundiai 66,22 µgl-1. Na estação ferroviária foi encontrado dois valores, pois alguns

pontos deste local existiam áreas que estavam com característica comprometida em

relação a poluição, mas são valores que podem variar devido as condições do meio,



135

como, maré alta ou maré baixa, vento, sol, chuva, organismos vivos que podem

degradar esta matéria orgânica.

350 400 450 500 5500

20

40

60

80

100In

tens

idad

e de

Flu

ores

cênc

ia


Favela do maruim Náutico Capitania dos Portos Estação Ferroviária Estação Ferroviária Ao lado da ponte próximo aos viveiros de camarões Indústrias téxteis esgotos Jundiai

Figura 4.30. Espectros de emissão das amostras coletadas no rio potengi.

CONCLUSÃO

UFRN – PPGQ CONCLUSÃO DOS RESULTADOS

________________________________________________________________________137 Andréa Francisca Fernandes Barbosa

5 CONCLUSÃO

Como o objetivo é diminuir o tempo da preparação da amostra, então o melhor tempo

de ultrassom foi o de 10 min comparado com os demais tempos utilizados.

O planejamento fatorial 23 cujos fatores foram: ultrassom, proporção de

solvente/amostra e solvente. O estudo destes foram bastante significativos com a utilização do

cubo que obtemos como resultado final:

(a) Pode observar uma diferença entre os solventes, no qual, a melhor análise foi com

o diclorometano não descartando a possibilidade do hexano que apresentou valores

muito bons;

(b) A proporção 1:3 mostrou em quase todos os ensaios estatísticos valores

representativos quando na sua interação entre os fatores;

(c) A utilização do ultrassom em combinação com o solvente diclorometano e

proporção 1:3 mostrou-se bastante representativa para o parâmetro estatístico do

cubo.

A análise de luminescência do óleo cru apresentou a mesma faixa de comprimento de

onda da mistura dos padrões de HPAs.

A otimização dos principais parâmetros ópticos foi analisada por luminescência

utilizando o fluorímetro. Um deles foi a resolução espectral onde a melhor foi a de 3 nm para

excitação e emissão apresentaram valores adequados para a análise dos espectros.

O comprimento de onda fixo de excitação, o mais adequando foi de 260 nm para o

clorofórmio e para o hexano foi um comprimento de onda de 282 nm. Esses comprimentos de

onda foram possíveis observar melhor todas as transições do analito estudado no solvente. A

diferença entre os comprimentos de onda é o efeito do solvente que varia quando o mesmo é

mudado. O comprimento de onda para o hexano foi o mesmo para o diclorometano, apenas o

efeito do solvente que deslocou um pouco o espectro de emissão, mas que apresentou um

adequado comprimento de onda para as análises.



As amostras coletadas na superfície e no leito do Rio Potengi, nas duas coletas feitas,

não apresentaram a presença de HPAs totais, nem pela análise de luminescência e nem pela

análise de cromatografia com detector de ionização de chama.

As respostas das análises de TOG mostraram valores de concentração de orgânicos

muito pequenos, mas que não são HPAs, tendo em vista que os mesmos foram da maré baixa

e alta mostrando se diferentes, devido à diluição dos compostos.

Amostras coletas na extremidade do Rio Potengi foram observadas a presença de

bastante matéria orgânica pelas análises de luminescência. Também foram feitas uma

investigação da existência de nitratos e ácidos húmicos, que não foram observados a

influência deles. Pelo espectro de emissão os nitratos não apresentaram luminescência e os

ácidos húmicos apresentam luminescência na faixa de 550 até 600 nm.

Em contrapartida pelas análises de CGEM, laboratório da Analitical solution, dessas

amostras foram observados que houve a presença de HPAs em alguns pontos coletados, que

foram:

(a) No ponto 4, local de mucurupi próximo a farinha do peixe foram obtidos dois

tipos de HPAs que são: naftaleno e fenantreno;

(b) No ponto 8, Tavares de lira (próximo aos arcos) foram obtidos: naftaleno,

fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzoantraceno e pireno; e

(c) No ponto 9 praia do y apenas naftaleno.

Todos esses HPAs são provenientes de óleos de embarcação e de contaminações de lixos

domésticos, industriais e hospitalares.

Na curva de calibração do hexano foi encontrado limites de detecção de 0,027 µgl-1 e

limites de quantificação de 0,078 µgl-1 e o coeficiente de correlação de 0,996, na qual servirão

para a quantificação das amostras que estão contaminadas com HPAs totais em limites de

concentrações baixas.

Comparação dos resultados das técnicas de quantificação das amostras pelo espectro

de luminescência e CGEM:



(a) No ponto 4 por luminescência foi encontrado uma concentração de HPAs totais e

outros orgânicos uma concentração de 24,75 µgl-1 enquanto que no CGEM foi

uma concentração total de 0,43 µgl-1;

(b) No ponto 8 por luminescência foi encontrado uma concentração de 23,13 ugL-1

enquanto no CGEM 0,69 µgl-1; e

(c) No ponto 9 por luminescência foi encontrado uma concentração de 15,66 µgl-1

enquanto no CGEM 0,07 µgl-1.

Os resultados de luminescência comparado com o CGEM foram totalmente diferentes,

pois na luminescência apresentam todos os orgânicos que apresentam luminescência nesta

região e o CGEM é uma técnica quantitativa.

As outras amostras foram encontrados orgânicos pela luminescência, mas não foram

encontrados no CGEM. As amostras para a análise de CGEM foram transportadas para um

laboratório localizado em São Paulo, então o tempo de análise pode ter influenciado na

reposta. Os resultados encontrados nas outras amostras por luminescência foram:

(a) Ponto 6 concentração de 43,94 µgl-1 canal do baldo;

(b) Ponto 7 concentração de 23,13 µgl-1 próximo ao deposito naval; e

(c) Ponto 8 concentração de 41,23 µgl-1 praia do y.

A otimização do método para a utilização do CGEM para HPAs foi satisfatória, pois

as amostras de HPAs apresentaram-se picos que poderão ser identificados facilmente. A

configuração inicial em fullscan foi apenas para fazer uma varredura em todo o espectro para

saber o tempo de retenção e os íons principais para cada HPAs. O tempo de retenção e os íons

de cada um deles foram utilizados na identificação dos HPAs das amostras no modo SIM

(Selected íon monitoring).

A otimização do método para o CGDIC também foi satisfatória na identificação dos

HPAs totais dos padrões que também foi utilizado na identificação das amostras.



5.1 PERSPECTIVAS

Aplica a quimiometria em parâmetros de métodos do equipamento de CGEM e

Fluorescência, bem como CGDIC. Utilizando parâmetros de temperatura, tempo, quantidade

de amostra injetada, vazão de gás, isso para o CGEM e CGDIC;

No Fluorímetro os parâmetros a serem estudados seriam o tamanho das fendas de

excitação e emissão variando as, usar o modo sincronizado, variar comprimentos de onda e

fazer estudos a baixas temperaturas para o modo de fosforescência;

Utilizar nas análises de HPAs o modo CGEM/EM para observar a melhor maneira de

filtração dos íons;

Procurar utilizar outros modos de preparação de amostragem SPE – extração em fase

sólida, como forma de minimizar mais ainda a quantidade de solvente e obtenção da maior

concentração do analito, como também aplicar a quimiometria.

REFERÊNCIAS

UFRN – PPGQ – REFERÊNCIAS

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__________________________________________________________________________________151


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ANEXO

ANEXOS

_______________________________________________________________________________153


7.1 ESPECTROS DE EMISSÃO DOS 16 HPAs PRIORITÁRIOS

ANEXOS

_______________________________________________________________________________154


ANEXOS

_______________________________________________________________________________155


ANEXOS

_______________________________________________________________________________156


ANEXOS

_______________________________________________________________________________157


ANEXOS

_______________________________________________________________________________158


ANEXOS

_______________________________________________________________________________159


ANEXOS

_______________________________________________________________________________160


ANEXOS

_______________________________________________________________________________161


7.2 ESPECTROS DE EXCITAÇÃO DOS PADRÕES DE HPAs

Os espectros da figura 7.1 correspondem à excitação das amostras padrões AM011,

AM021, AM031 e AM41 em solvente de hexano. Que corresponde aos espectros de emissão

da figura 35 em comprimento de onda fixo de 400 nm de emissão.

220 240 260 280 300 320 340 360 3800

20

40

60

80

100

120

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Comprimento de Onda excitação (nm)

AM011 AM021 AM031 AM041

Solvente: Hexano

Figura 7.1. Espetros de excitação em hexano dos padrões de HPAs.

Os espetros de excitação da mistura de HPAs, nomeados por AM051, AM061,

AM071 e AM081, em diclorometano foram analisados em comprimento de onda fixo de 400

nm. Esses espectros foram obtidos empregando a maior transição do espectro de emissão

mostrado na figura 7.2.

ANEXOS

_______________________________________________________________________________162


220 240 260 280 300 320 340 360 3800

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


AM051 AM061 AM071 AM081

Solvente: Diclorometano

Figura 7.2. Espetros de excitação dos HPAs em diclorometado

Os espectros de excitação da mistura de HPAs extraídos com clorofórmio estão apresentados na figura 7.3 e nomeados AM091, AM101, AM111 e AM121.

240 260 280 300 320 340 360 3800

20

40

60

80

100

120

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


AM091 AM101 AM111 AM121

Solvente: Clorofórmio

Figura 7.3. Espectros de excitação do planejamento fatorial 23 dos HPAs em clorofórmio com comprimento de onda de emissão fixo de 400.

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