UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · Primeiramente quero deixar registrado que esses agradecimentos não chegam nem perto da gratidão que tenho por essas pessoas e

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCINCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

PROGRAMA DE PS GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS

PURIFICAO E CARACTERIZAO ESTRUTURAL DE

HOMOGALACTANAS SULFATADAS ANTICOAGULANTES DA ALGA

VERDE Codium isthmocladum

DIEGO DE ARAUJO SABRY

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha

Natal-RN

2010

i

PURIFICAO E CARACTERIZAO ESTRUTURAL DE

HOMOGALACTANAS SULFATADAS ANTICOAGULANTES DA ALGA VERDE

Codium isthmocladum

por

Diego de Araujo Sabry

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha

Natal

2010

Dissertao apresentada ao Programa

de Ps-Graduao em Cincias

Biolgicas da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, como requisito

parcial obteno do ttulo de Mestre

em Cincias Biolgicas.

ii

Dedico esta Obra

A vida

iii

Dedico esta Obra

Aos meus pais, Hayd, Jos e Marinha, irmos, Gustavo, Rayner e Camila, por terem

me apoiado em tudo e me dado foras para perseverar, principalmente nos momentos

mais difceis.

iv

Dedico esta Obra

Ao meu orientador Hugo Alexandre de Oliveira Rocha pela fora, conselhos, apoio,

correes, confiana e amizade.

v

Dedico esta Obra

Aos meus verdadeiros amigos da VIDA pela fora, ajuda, solidariedade e

companheirismo.

vi

AGRADECIMENTOS

Primeiramente quero deixar registrado que esses agradecimentos no chegam

nem perto da gratido que tenho por essas pessoas e desde j peo desculpas por isso, e

caso tenha deixado algum de fora!

Agradeo a Deus, pelo simples fato de ter me colocado no caminho de pessoas

to especiais, e por sempre ter me guardado do mal.

Agradeo infinitamente aos meus pais, Jos e Hayd, que tanto lutaram para

me dar a melhor educao possvel. E me apoiaram nas minhas escolhas e me deram luz

para as decises mais difceis. Pelo amor incondicional e por sempre quererem o meu

bem, me aconselhando e me preparando para enfrentar esse mundo (s vezes cruel).

Obrigado por sempre estarem presente nos momentos bons, dividindo alegria, e nos

momentos ruins, me confortando. A despedida nunca fcil! Sei que nunca falo isso,

mas... EU AMO VOCS!! VOCS NO TEM IDEIA! OBRIGADO PELOS

CONSELHOS E PELO APOIO!! (Viver e no ter a vergonha de ser feliz! Cantar e

cantar e cantar a beleza de ser um eterno aprendiz! - Gonzaguinha)

vii

Agradeo ao meu irmo Guga, por todos os momentos alegres cheios de risadas e

pelas brigas que no fim serviram para nos aproximar ainda mais. Voc o irmo que eu

nunca poderia sonhar em pedir, e isso uma das maiores alegrias da minha vida! Voc

me fez tanta falta na minha sada de casa, mas o seu sambar me acompanhou em todos

os meus momentos difceis. Voc cativa as pessoas ao seu lado e pode ter certeza que eu

sou uma dessas pessoas. Sempre que precisar de mim, eu estou disposto a fazer de tudo

para te ajudar. VOC O CARA MAIS POMBO QUE EU CONHEO! E EU

TE AMO TANTO! OBRIGADO NO SER S UM IRMO DESTINADO PELA

GENTICA E SIM POR SER MUITO MAIS QUE QUALQUER IRMO!

BEIJO NA BOCHECHA NO, S UM ABRAO MESMO (PORQUE EU SOU

MACHO)!!! ( hoje o dia/ Da alegria/ E a tristeza/ Nem pode pensar em chegar! -

Caetano Veloso)

Agradeo ao meu prirmo Raineu, que trouxe a paz aqui para casa. Com seu

jeito nerd de ser, voc traz junto alegria e muita serenidade. Obrigado por me tirar de

casa e me levar para conhecer o mundo, que no se limita somente em festejar mas sim

te conhecer melhor e ver que o irmo mais velho que sempre quis ter. Mas voc poderia

ser menos puxa-saco (hehehe). OBRIGADO POR TODOS OS MOMENTOS

ALEGRES QUE VOC ME PROPORCIONOU! (Ando s, pois s eu sei/ Pra onde

ir, por onde andei/ Ando s/ Nem sei porqu/ No me pergunte o que eu no sei

Engenheiros do Hawaii)

Agradeo minha segunda me Marinha, que na ausncia da Hayd sempre me

guiou, me criou e me ensinou o certo e o errado na vida. Apesar de eu no dizer isso,

mas grande parte do que sou por causa de voc tambm! OBRIGADO POR

AJUDAR MINHA MAE EM ME TORNAR O QUE SOU!

Agradeo minha irmzinha Camiloca por ter renovado o nimo da casa.

Obrigado pelas danas, brincadeiras e discusses bestas. OBRIGADO POR SE

IMPORTAR COMIGO!!

viii

Agradeo Ruth que sempre me ajudou dividindo momentos maravilhosos bem

como momentos difceis. E sempre me incentivou a continuar lutando. Mesmo com

algumas briguinhas e vises diferentes, ela procurou me entender e me apoiar. No meu

tempo ausente, ela foi de fundamental importncia, pois era com ela que eu

desabafava, mesmo distante eu me sentia por perto. Partir to sofrido quanto ficar, a

diferena que quem fica sofre aos poucos constantemente e quem vai sofre

profundamente em vrias ocasies inesperadas. OBRIGADO POR SER VOC!!!

(One day, youll look to see Ive gone/ But tomorrow may rain, so, Ill follow the Sun...

Beatles)

Agradeo Dona Estelita por sempre me dar conselhos importantes e de apoiar

minhas convices. S no agradeo por me acordar cedo. LILIA, MUITO

OBRIGADO POR FAZER PARTE DA FAMLIA!!!

Agradeo tambm aos meus amigos Pica-pau (Raphael), Ngo (Renan), Modess

(Alcino), Melo (Fbio), Bilica (Fbio), Jebo (Daniel), No-Transante (Acarlton),

Lindo (Marcel), e Marreco (Pablo), pelos momentos de alegria descontrao e por

compartilharem os bons momentos, sem falar nos maus momentos! (TRISTE

DAQUELE QUE NO TEM AMIGOS!)

Agradeo galera de Cincias Biolgicas, tanto os professores quanto os alunos,

que me acolheram e me ensinaram muita coisa tanto dentro de sala quanto,

principalmente, fora dela.. MUITO OBRIGADO A TODOS!

Agradeo a Duda por, sem saber, ter aberto as portas do laboratrio. E assim eu

poder saber do que se trabalhava no BIOPOL, e quando fui entrevistado eu fazer o

marketing.

ix

Como no podia faltar quero agradecer a todos os que compem o BIOPOL, em

especial: Sara (pelos abraos), Mariana (por ser fofoqueira), Pop (pela alegria), Ivan

(pelas risadas), Nednaldo (pela amizade), Jailma (pela solidariedade), Leandro (pelas

conversas), Leonardo (ainda pelo salto no biotrio), Ruth (pelos ensinamentos),

Dayanne (por continuar no cantando), Gabriel (pela inocncia), Raniere (pela

aguinha), Railson (pelos pastis de Tangar), Arthur (por no ser to curioso) e aos

demais que passaram, fizeram e fazem parte dessa histria. BIOPOL, OBRIGADO

PELAS ALEGRIAS E ENSINAMENTOS!!!!!!

Agradeo especialmente ao meu orientador, amigo e conselheiro Hugo, por ter

me aceitado no laboratrio, por ter confiado na minha capacidade e no meu trabalho!

Sempre de bom humor, com um sorriso cativante e uma gargalhada contagiante. Mas

tambm sabe ser rigoroso e exigir quando sabe que ns podemos fazer mais! Sem ele no

conseguiria finalizar essa dissertao, muito menos aprender os primeiros passos do

pensamento cientfico. Hugo, apesar das nossas desavenas, voc muito importante

para mim. Desculpe pela sinceridade, mas era porque eu precisava ser. OBRIGADO

POR ABRIR TANTAS PORTAS PARA MIM!!!

Agradeo a Saroca pela amizade, pelo companheirismo, pelos fins de semana e

feriados ao som de Beach Boys, Creedence, Beatles, Chuck Berry, e pelo altrusmo,

pelas danas descontradas, pelos sinto muito e blusas justas. No agradeo pelos

tapas e belisces! Saroca, voc no tem idia de como voc especial para mim. Nunca

esquecerei do seu telefonema e das doces palavras que voc me disse! OBRIGADO

POR TODO CARINHO! (Wouldnt it be nice if we were older/ The we wouldnt have to

wait so long/ And wouldnt it be nice to live together/ In the kind of world where we

belong Beach Boys)

x

Agradeo a Nednaldo que sempre foi meu amigo, mas que no momento de

dificuldade no mediu esforos para me reerguer e me colocar no caminho, como se

tivesse sido enviado para me ajudar. Sei que vivo tirando onda contigo, mas s brinco

com quem eu gosto. OBRIGADO POR SER UM IRMO PARA MIM!! (Someone

told me long ago/ Theres a calm before the storm/ I knowI wanna know/ Have you ever

seen the rain? Creedence Clearwater Revival)

Agradeo a Profa. Helena Nader, por ter aberto as portas de seu laboratrio e

confiado em mim para realizar meus experimentos sem a interferncia de ningum.

Ainda no ncleo UNIFESP, agradeo a Marcelo e Duda, por terem aberto suas portas

em So Paulo e terem feito de So Paulo um pequeno pedao da amvel Natal.

Agradeo a Renan e Tarsis por serem to amigos e me ensinarem tanto sobre cincia e

sobre a vida! OBRIGADO POR ME ACOLHEREM TO BEM E POR SEREM

AMIGOS SEM SEREM OBRIGADOS A ISSO!!!

Agradeo ao Prof. Edvaldo por me receber na UFPR e me encaminhar para os

laboratrios que eu precisava ir. Agradeo a Profa. Dorli por me receber em seu

laboratrio e pelas roupas! :D Agradeo imensamente a Dani que me acolheu em seu

laboratrio (LME) e me apresentou os meus primeiros amigos na UFPR: Dilzete,

Fernando Japa, Olga, You, Val, Mari, Gabriel, Thiago, Fernanda, Luza, etc.

OBRIGADO POR ME FAZEREM ME SENTIR MENOS LONGE DE CASA E

DOS MEUS AMIGOS!

Agradeo ao Prof. Guilherme Sassaki por me receber e me deixar ficar em seu

laboratrio realizando parte dessa dissertao. E por nesse laboratrio eu conhecer

novos amigos: Lauro, Arquimedes, Fherzinha, Ferzona, Carol, Giovana (GG),

Daniel, Lorena, Nessa... OBRIGADO POR ME MOSTRAR QUE CINCIA

ALGO MAIOR QUE FICAR APENAS ESTUDANDO TRANCADO NO

LABORATRIO!!!

xi

Agradeo a Hugo, Nednaldo, Sara, Leonardo, Camila, Renan, Melo, Hayd,

Jos, Guga, Raineu e Ana Flvia pela ajuda num momento em que eu me perdi e

precisava de algum para me lembrar quem eu realmente sou. E sem eles no teria

concludo essa dissertao. MUITO OBRIGADO DE TODO O CORAO!!!

Agradeo aos vrios amigos do departamento (Ticiana, Norba, Phelippe Jack

Black, Rafinha, Roberta Belle de Jour, Virgnia) pelos diversos momentos bacanas

nos corredores e na ponte da Bioqumica.

MUITO OBRIGADO AOS DIVERSOS AMIGOS QUE FIZ PELO

CAMINHO! ESPERO REENCONTR-LOS!

Agradeo aos professores e funcionrios do Departamento de Bioqumica pelos

momentos compartilhados, em especial ao Seu Jonas, Seu Itamar, Seu Rogrio, Seu

Ricardo, Creuza, D. Margarita, Seu Marcos e D. ngela pelos momentos de

descontrao.

Agradeo ao Prof. Maurcio, Prof. Elizeu, Prof. Sueli e a Prof. Edda pelos

ensinamentos e pela confiana em meu trabalho.

Agradeo ao CNPq e CAPES pelo auxlio financeiro para a realizao desse

trabalho.

xii

Chorar no vai trazer de volta seu co, a no ser que suas lgrimas tenham cheiro de

rao. (Homer Simpson)(Homer Simpson)(Homer Simpson)(Homer Simpson)

Deus me enviou terra com uma misso. S Ele pode me deter, os homens nunca

podero. (Bob Marley)(Bob Marley)(Bob Marley)(Bob Marley)

So meus amigos aqueles que tem considerao por mim. (Vivian Medeiros)(Vivian Medeiros)(Vivian Medeiros)(Vivian Medeiros)

A estima vale mais do que a celebridade, a considerao mais do que a fama, e a honra

mais do que a glria. (Chamfort)(Chamfort)(Chamfort)(Chamfort)

No tenho a pretenso de que todas as pessoas que gosto, gostem de mim, nem que eu

faa a falta que elas me fazem. O importante pra mim saber que eu, em algum

momento, fui insubstituvel, e que esse momento ser inesquecvel. (Fernando Pessoa)(Fernando Pessoa)(Fernando Pessoa)(Fernando Pessoa)

Do you remember lying in bed with your covers pulled up over your head? Radio

playin' so no one can see. We need change, we need it fast! (R.A.M.O.N.E.S.)(R.A.M.O.N.E.S.)(R.A.M.O.N.E.S.)(R.A.M.O.N.E.S.)

Existem trs frases curtas que levaro sua vida adiante: No diga que fui eu!, Oh,

boa idia chefe! e J estava assim quando cheguei. (Homer Simpson)(Homer Simpson)(Homer Simpson)(Homer Simpson)

xiii

RESUMO Os polissacardeos sulfatados compem um grupo complexo de

macromolculas com uma gama de importantes atividades biolgicas, incluindo

atividade antiviral, anticoagulante, antiproliferativa, antitumoral e antioxidante.

Esses polmeros aninicos so amplamente distribudos em tecidos de

vertebrados e algas. As algas marinhas so as fontes, no-mamferas, mais

abundantes de polissacardeos sulfatados na natureza. Os mais conhecidos

extrados de algas vermelhas so homogalactanas, chamadas de

carragenanas, e de algas marrons so homo ou heteropolissacardeos,

chamadas de fucanas e fucoidanas, respectivamente, e os polissacardeos

sulfatados de algas verdes so compostas por polissacardeos contendo

galactose, glicose, arabinose e/ou cido glucurnico. H poucos estudos

descrevendo a presena de polissacardeos sulfatados em algas verdes. No

presente estudo, o extrato total de polissacardeos da alga verde Codium

isthmocladum foi obtido atravs de digesto proteoltica, e fracionado por

precipitao sequencial com acetona resultando em cinco fraes (F0,3V;

F0,5V; F0,7V; F0,9V e F1,2V). O teste de atividade anticoagulante de aPTT

mostrou que F0,5V desempenhou alta atividade anticoagulante. Esta foi,

posteriormente, fracionada por cromatografia de troca-inica em sete

polissacardeos: F0,3M; F0,5M; F0,7M; F1,0M; F1,5M; F2,0M e F3,0M. Os

polissacardeos eludos com F2,0M e F3,0M migraram como um nico

componente eletrofortico. No foi detectada contaminao protica. Anlises

qumicas mostraram que F2,0M e F3,0M so compostas por galactose. Esses

polissacardeos foram submetidos ao teste de aPTT, e mostraram alta

atividade anticoagulante com atividade maior que Clexane. Ambas

apresentaram um efeito dose-dependente. Anlises estruturais de F2,0M e

F3,0M mostraram que elas so homopolmeros ramificados constitudos de -

D-Galactopiranoses unidas por ligaes -1,6 (predominante) e -1,3. Alguns

resduos de galactose apresentam sulfatao em C4 ou em C6, e algumas

galactoses em posio no redutora apresentam piruvatao na forma de 3,4-

O-(1-carboxi)etilideno, cetal cclico com cinco membro.

Palavras chave: Homogalactana, aPTT, Chlorophyta, -D-Galactopiranose.

xiv

ABSTRACT

Sulfated polysaccharides comprise a complex group of macromolecules with a

range of important biological activities, including antiviral, anticoagulant,

antiproliferative, antitumoral and antioxidant activity. These anionic polymers

are widely distributed in tissues of vertebrates and algae. Seaweeds are the

sources, non-mammalian, most abundant sulfated polysaccharides in nature.

The best known extracted from red algae are homogalactans, called

carrageenan, and those from brown algae are homo or heteropolysaccharides,

called fucans and fucoidan, respectively, and sulfated polysaccharides of green

algae are composed of polysaccharides containing galactose, glucose,

arabinose and/or glucuronic acid. There are few studies describing the

presence of sulfated polysaccharides in green algae. In this study, the total

extract of polysaccharides of the green alga Codium isthmocladum was

obtained by proteolytic digestion and fractionated by sequential precipitation

with acetone resulting in five fractions (F0.3V, F0.5V, F0.7V, F0.9V and F1.2V).

Anticoagulant activity of aPTT showed that F0.5V exhibited high anticoagulant

activity. This fraction was then fractionated by ion exchange chromatography in

seven polysaccharides: F0.3M, F0.5M, F0.7M, F1.0M, F1.5M, F2.0M and

F3.0M. The polysaccharides eluted with F2.0M and F3.0M migrated as a single

electrophoretic component. Protein contamination was absent. Chemical

analysis showed that F2.0M and F3.0M are composed of galactose. These

polysaccharides were tested using the aPTT and showed high anticoagulant

activity with activity greater than Clexane . Both showed a dose-dependent

effect. Structural analysis of F2.0M and F3.0M showed that they are branched

homopolymers consisting of -D-galactopyranose linked by links -(13,6)-

(predominant), -(16) and -(13). Some residues of galactose are sulfated

in C4 or C6, and some galactose residues in non-reducing position present

pyruvate in the form of 3,4-O-(1'-carboxy)-ethylidene, a five membered cyclic

ketal.

Keywords: Homogalactan. aPTT assay. Chlorophyta. -D-Galactopyranose.

xv

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS ................................................................ xviii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................ xx

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. xxi

LISTA DE ESQUEMAS.......................................................................................... xxii

1. INTRODUO ................................................................................................. 23

1.1. Algas verdes pertencentes ao gnero Codium......................................... 23

1.2. Alga verde Codium isthmocladum.. ............................................................. 25

1.3. Polissacardeos sulfatados de algas........................................................

1.4. Polissacardeos sulfatados extrados do gnero Codium............................

1.5 Galactanas sulfatadas extradas do gnero Codium...................................

1.6 Relao entre estrutura e atividade anticoagulante de galactanas sulfatadas

1.7 Galactanas de Codium isthmocladum.........................................................

26

27

28

30

31

2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 35

3. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................ 36

3.1 Materiais ......................................................................................................... 36

3.1.1 Material biolgico ......................................................................................... 36

3.1.2 Outros materiais .......................................................................................... 37

3.2 Mtodos .......................................................................................................... 39

3.2.1 Obteno dos polissacardeos sulfatados ............................................. 39

3.2.1.1 Digesto proteoltica (protelise) ............................................................... 39

3.2.1.2 Obteno do extrato total de polissacardeos ........................................... 39

3.2.1.3 Fracionamento com volumes crescentes de acetona .............................. 39

3.2.2 Eletroforese em gel de agarose ................................................................... 41

3.2.3. Cromatografias ............................................................................................ 41

3.2.3.1 Cromatografia lquida de troca-inica .................................................... 41

xvi

3.2.3.2 Cromatografia lquida de gel filtrao...................................................

3.2.3.3 Cromatografia lquida de alta performance (HPLC).................................

3.2.3.4 Cromatografia gasosa..........................................................................

3.2.3.5 Preparo das amostras para cromatografia gasosa acoplada a

espectrmetro de massa (CG-EM).........................................................................

42

42

43

44

3.2.4 Anlises qumicas ......................................................................................... 44

3.2.4.1 Quantificao de acares totais .............................................................. 44

3.2.4.2 Quantificao de sulfato ........................................................................... 45

3.2.4.3 Quantificao de protena ........................................................................

3.2.4.4 Dessulfatao por solvonlise....................................................................

3.2.4.4.1 Preparo do sal de piridina..................................................................

3.2.4.4.2 Solvonlise........................................................................................

45

45

45

45

3.2.5 Anlise estrutural por ressonncia magntica nuclear (RMN).....................

3.2.5.1 Ressonncia magntica nuclear unidimensional.............................

3.2.5.1.1 Ressonncia magntica nuclear unidimensional de prton (1H).............

3.2.5.1.2 Ressonncia magntica nuclear unidimensional de carbono (13C).........

3.2.5.2 Ressonncia magntica nuclear bidimensional......................................

3.2.5.2.1 Espectroscopia de correlao homonuclear (1H/1H) COSY..................

3.2.5.2.2 Espectroscopia de correlao homonuclear total (1H/1H) TOCSY..........

3.2.5.2.3 Espectroscopia de correlao heteronuclear (1H/13C) HSQC.................

3.2.5.2.4 Espectroscopia de correlao heteronuclear de ligao (1H/13C)

HMBC................................................................................................................

46

46

46

47

47

47

47

48

48

3.2.6. Atividade anticoagulante..........................................................................

3.2.7 Anlise estatstica .......................................................................................

49

49

4. RESULTADOS .................................................................................................. 50

4.1. Obteno e fracionamento do extrato total de polissacardeos da alga

Codium isthmocladum ......................................................................................

50

4.2. Eletroforese em gel de agarose e composio monossacardica da frao

F0,5V..............................................................................................................

50

4.3. Atividade anticoagulante da frao F0,5V.................................................. 52

xvii

4.4. Cromatografia lquida de troca-inica da F0,5V ......................................... 52

4.5 Atividade anticoagulante das fraes obtidas na cromatografia lquida de

troca-inica .......................................................................................................

54

4.6 Atividade anticoagulante dos polissacardeos F2,0M e F3,0M........................ 55

4.7 Cromatografia lquida de gel filtrao.........................................................

4.8 Cromatografia gasosa................................................................................

4.9 Anlises qumicas dos polissacardeos F2,0M e F3,0M...............................

4.10 Caracterizao estrutural de F2,0M e F3,0M por RMN e CG-EM.................

56

57

57

58

5. DISCUSSO ..................................................................................................... 68

6. CONCLUSES ................................................................................................. 74

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................. 75

xviii

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

AC. GLU cido glucurnico

ARA Arabinose

ET Extrato total

F0,3M Frao da troca inica eluda com 0,3M de NaCl






F0,3V Frao precipitada com 0,3 volumes de acetona





GAL Galactose

GLI Glicose

HCl cido clordrico

MAN Manose

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenil tetrazolium bromide)

NaCl Cloreto de sdio

NaOH Hidrxido de sdio

PDA 1,3 diamino propano acetato

PS Polissacardeos sulfatados

COSY Correlation spectroscopy

xix

TOCSY Total correlation spectroscopy

HSQC Heteronuclear single-quantum correlation

HMBC Heteronuclear multiple bound correlation

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a espectmetro de massa

HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia

xx

LISTA DE TABELAS

Tabela 01Tabela 01Tabela 01Tabela 01.... Relao das caractersticas qumicas de galactanas encontradas em

diversas espcies..............................................................................................

25

Tabela Tabela Tabela Tabela 00002222.... Anlise qumica e relaes molares dos acares e do sulfato

presentes nas fraes cetnicas da alga C.

isthmocladum...............................................................................................

29

Tabela Tabela Tabela Tabela 03030303.... Anlise qumica e relaes molares dos acares da frao cetnica

F0,5V da alga C.isthmocladum.......................................................................

47

Tabela Tabela Tabela Tabela 04040404.... Composio qumica parcial e relao molar dos polissacardeos

sulfatados F2,0M e F3,0M obtidos da troca-inica da F0,5V da alga C.

isthmocladum................................................................................................

53

Tabela Tabela Tabela Tabela 05050505.... Deslocamentos qumicos de prton dos resduos de F2,0M............ 59

Tabela Tabela Tabela Tabela 06060606.... Deslocamentos qumicos de carbono dos resduos de F2,0M......... 60

Tabela Tabela Tabela Tabela 07070707.... Anlise da metilao das galactanas sulfatadas e suas preparaes

qumicas............................................................................................................

62

xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Desenho esquemtico de um representante do gnero Codium

....................................................................................................................

19

Figura 02. Comportamento eletrofortico das fraes cetnicas da alga Codium

isthmocladum (Farias, 2006)........ .......................................................................

28

Figura 03. Viso geral da alga marinha verde Codium

isthmocladum.......................................................................................................

31

Figura 04. Comportamento eletrofortico das fraes cetnicas obtidas da alga

C. isthmocladum.....................................................................................................

46

Figura 05. Rendimento percentual dos polissacardeos obtidos da

cromatografia de troca-inica da F0,5V

...................................................................................

48

Figura 06. Comportamento eletrofortico dos polissacardeos obtidos da troca-

inica da F0,5V..............................................................................................

49

Figura 07. Atividade anticoagulante dos polissacardeos obtidos da

cromatografia lquida de troca-inica da F0,5V..............................................

50

Figura 08. Atividade anticoagulante das galactanas sulfatadas F2,0M e F3,0M.. 51

Figura 09. Espectro de ressonncia magntica unidimensional de prton (1H)

de F2,0M (A) e F3,0M (B)......................................................................................

54

Figura 10. Espectro de ressonncia magntica bidimensional de correlao

prton/prton (1H/1H) COSY e TOCSY de F2,0M..............................................

56

xxii

Figura 11. Espectro de ressonncia magntica bidimensional de correlao

prton/carbono (1H/13C) HSQC de F2,0M..........................................................

57

Figura 12. Espectro de ressonncia magntica bidimensional de ligao

prton/carbono (1H/13C) HMBC de F2,0M..........................................................

58

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 01. Obteno, purificao e anlise dos polissacardeos de Codium

isthmocladum............................................................................................................

40

Introduo 23


1. INTRODUO

1.1 Algas verdes pertencentes ao gnero Codium

O gnero Codium exclusivamente marinho, constitudo por 125 espcies,

que se distribuem em todos os mares, com exceo das regies polares

(PEDROCHE; SILVA; CHACANA, 2002). Popularmente, seus representantes

so denominados como espaguete do mar (spaghetti grass), dedos de

homens mortos (dead mans fingers), erva daninha japonesa (japanese

weed) e ladro de ostras (oyster thief) (TROWBRIDGE, 1998).

Os representantes do referido gnero ocorrem desde a franja do mesolitoral

at regies mais profundas (200 m), fixando-se a vrios tipos de substratos,

como rochas, razes de mangue, conchas velhas e vivas de moluscos como

ostras e mexilhes, cascos de barcos, entre outros (PEDROCHE; SILVA;

CHACANA, 2002).

O gnero caracteriza-se por apresentar talo multiaxial, de consistncia

esponjosa (GRAHAM; WILCOX, 2000), em que os filamentos cenocticos se

entrelaam formando um corpo vegetal macroscpico de forma definida (Figura

01). Seus representantes possuem hbito ereto ou prostrado, com marcada

diversidade morfolgica, podendo apresentar talo aplanado, pulvinado,

digitiforme, globular, petalide, membraniforme ou cilndrico. Alm disso, os

ramos podem ser livres ou anastomosados (PEDROCHE, 2001).

A regio medular densamente entrelaada por filamentos cilndricos, que

se alargam na extremidade originando os utrculos, caracterizando a camada

cortical (Figura 01). Os utrculos esto dispostos radialmente, portando longos

plos hialinos e caducos (VAN DEN HOEK; MANN; JAHNS, 1995; GRAHAM;

WILCOX, 2000; PEDROCHE, 2001). A parede celular constituda

principalmente por monossacardeo (-1,4 D-manose) ou pelo polissacardeo

arabinogalactana sulfatada e no por celulose (VAN DEN HOEK; MANN;

JAHNS, 1995; GRAHAM; WILCOX, 2000). O gnero homoplastdico (VAN

DEN HOEK; MANN; JAHNS, 1995; BOLD; WYNNE, 1985) com numerosos

cloroplastos discides sem pirenides, situados nos utrculos (GRAHAM;

WILCOX, 2000).

Introduo 24


Figura 01. Desenho esquemtico de um representante do gnero Codium (corte transversal do talo, adaptado de

Verbruggen, 2007).

Quanto importncia econmica, algumas espcies so utilizadas como

fonte de alimento para moluscos cultivados na Califrnia (USA)

(VERBRUGGEN et al., 2007). Esses mesmos autores tambm afirmam que

espcies de Codium so consumidas por seres humanos, entretanto no h

maior detalhamento sobre o assunto nesse artigo nem em outros que foram

pesquisados durante a produo deste texto. Alm disso, apesar de ainda no

serem utilizadas como fontes de matria prima, h um grande potencial

biotecnolgico para as algas desse gnero, pois grande o nmero de

publicaes que ressaltam a presena de molculas bioativas na composio

de algas do gnero Codium, tais como: glicoconjugado com atividade

anticoagulante (MATSUBARA et al., 2000), enzima com atividade fibrinoltica

(MATSUBARA et al., 1999), polissacardeos sulfatados com atividade

anticoagulante (COSTA et al., 2010) lipdeos com atividade antibitica

(SPAVIERI et al., 2009), compostos fenlicos com atividade antioxidante

(CELIKLER et al., 2009).

Introduo 25


No gnero Codium, alguns representantes so considerados verdadeiras

pragas em vrios habitats marinhos da regio temperada, devido ao grande

potencial invasor, dada a sua rpida propagao e crescimento (RANUS, 1971;

BGIN; SCHEIBLING, 2003; CHAVANICH et al. 2006). Cita-se como exemplo,

C. fragile, nativa do Japo, sendo considerada a espcie mais invasiva do

mundo. Ela foi introduzida em vrias partes do mundo e atualmente, alm da

sia, encontrada na Europa, costa leste e oeste da Amrica do Norte,

Austrlia, Nova Zelndia e frica do Sul (TROWBRIDGE, 1998; PRINCE;

TROWBRIDGE, 2004). Essa espcie tambm tem gerado grandes impactos

econmicos sobre as indstrias de moluscos e ostras em Massachussets

(USA). Seu efeito nocivo se d quando o peso da alga ultrapassa o peso do

hospedeiro (molusco ou ostra), ambos boiaro e sero transportados pelas

correntes e mars (RANUS, 1971).

A maioria dos representantes de Codium encontra-se distribuda na zona

temperada e subtropical de vrios pases como o Japo (19 espcies), frica

do Sul (19 espcies), Austrlia (18 espcies) e na costa do Pacfico do Mxico

(13 espcies) (GOFF et al., 1992; PEDROCHE, 2001; PEDROCHE; SILVA;

CHACANA, 2002). Na flora tropical e subtropical do Atlntico Ocidental, est

representado por 11 espcies infragenricos (WYNNE, 2005). No Brasil esto

registradas as seguintes espcies: C. decorticatum (Woodw.) M. Howe, C.

intertextum Collins & Herv., C. isthmocladum Vickers, C. profundum Silva &

Chacana, C. repens P. Crouan ex Vickers, C. spongiosum Harv., C. taylorii P.

C. Silva e C. tomentosum Stackhouse (OLIVEIRA FILHO, 1977; PEREIRA et

al. 2002a, CHACANA et al. 2003, YONESHIGUE-VALENTIN et al., 2006;

PEREIRA et al., 2007).

1.2 Alga verde Codium isthmocladum

A alga verde C. isthmocladum, objeto de estudo deste trabalho,

caracterizada por apresentar talo ereto, colorao verde-oliva, com at 20 cm

de altura, se fixar ao substrato por um apressrio basal discide, possuir

ramificao predominantemente dicotmica regular, podendo ser espaada ou

curta, sendo os ramos cilndricos, ramificados at a dcima segunda ordem.

Filamentos medulares incolores medindo cerca de 30 m de dimetro, com

Introduo 26


espessamento lenticular de, aproximadamente 27 m so caractersticos em C.

isthmocladum, assim como, utrculos individuais, clavados, cilndricos,

raramente piriformes, com aproximadamente 193 m de dimetro e

aproximadamente 623 m de comprimento. Os pices destes utrculos so

arredondados, truncados, espessados e lamelados, medindo por volta de 42

m de espessura e abaixo deles se encontram plos ou cicatrizes de plos,

que se distanciam entre si por aproximadamente 68 m. Gametngios

distribudos de 1 a 2 por utrculos, ovides, lanceovides a fusiformes, medindo

aproximadamente 83 m de dimetro e cerca de 199 m de comprimento,

distando em torno de 237 m do pice do utrculo (SILVA, 1960) (Figura 01).

1.3 Polissacardeos sulfatados de algas

Os polissacardeos sulfatados (PS) de algas so uma classe de compostos

que contm grupamentos sulfato hemi-ster ligados covalentemente a seus

resduos monossacardicos. O grau de substituio pode variar bastante, mas

sempre confere aos polissacardeos em questo, carter negativo. Essa

propriedade permite aos PS se associarem a diversas molculas bsicas,

incluindo protenas ou regies bsicas de protenas (BECKER et al., 2007). Os

PS possuem algumas funes em seus tecidos de origem, tais como

manuteno do equilbrio higroscpico e apresentam frequentemente uma

estrutura heterognea, o que torna muito difcil a determinao das

caractersticas estruturais sutis que cada polissacardeo pode apresentar

(MULLOY, 2005). Alm disso, muitas vezes, no possvel diferenciar se o

papel em processos fisiolgicos desempenhados pelos PS resulta de

interaes no-especficas entre os PS e regies bsicas de molculas,

principalmente protenas, ou se este papel fisiolgico consequncia de sutis e

especficas estruturas encontradas em cada polissacardeo (JONES; YAZZIE;

MIDDAUGH, 2004) ou um somatrio das duas alternativas anteriores.

Os diversos estudos de purificao e caracterizao estrutural dos PS de

algas sempre estiveram intimamente relacionados com as propriedades

farmacolgicas apresentadas por esses compostos, o que leva a um

conhecimento estrutural restrito desses polmeros, pois aqueles que no

apresentaram atividades nos estudos so na maioria das vezes descartados

Introduo 27


em detrimento dos que possuam potencial farmacolgico (ROCHA et al.,

2005a;2005b). Contudo, o conhecimento adquirido at o momento levou vrios

pesquisadores a fazerem uma constatao: as algas marinhas de diferentes

txons sintetizam diferentes polissacardeos (SHANMUGAM; MODY, 2000;

HAYAKAWA et al., 2000; ROCHA et al., 2006): as algas vermelhas

(Rhodophytas) sintetizam homo e heterogalactanas sulfatadas (SOUZA et al.,

2007); as algas marrons sintetizam homo e heteropolmeros de fucose,

conhecidos como fucanas e fucoidanas, respectivamente (ROCHA et al., 2006;

LI et al., 2008); nas algas verdes (Chlorophyta) h uma maior heterogeneidade

de PS, sendo estes compostos de arabinose, glicose, xilose, galactose,

manose, rhamnose e/ou cido glucurnico (HAYAKAWA et al., 2000;

MATSUBARA, 2004).

Os PS de algas vermelhas e marrons so os mais amplamente estudados,

por outro lado, comparativamente, h poucos relatos sobre os polissacardeos

sulfatados de algas verdes (MAO et al., 2006). Contudo, alguns estudos vm

mostrando que PS extrados de algas verdes apresentam grande potencial

farmacolgico, tais como: atividade anticoagulante (FARIAS, 2006;

HAYAKAWA et al., 2000), anti-herptica (GHOSH et al., 2004), induo da

agregao plaquetria (CIANCIA et al., 2007), gastroprotetor (HWANG et al.,

2008) antioxidante (QI et al., 2005), anti-inflamatria (GUZMAN et al., 2003;

YUAN; WALSH, 2006), imunomodulatria (GUZMAN et al., 2003),

antiproliferativa (YUAN; WALSH, 2006).

1.4 Polissacardeos sulfatados extrados do gnero Codium

As algas marinhas pertencendo classe Chlorophyta so amplamente

distribudas nas guas costeiras. Destacando-se aquelas pertencentes aos

gneros Caulerpa, Ulva e Codium, que vm atraindo a ateno de

pesquisadores para seus polissacardeos sulfatados e suas respectivas

atividades. Para compreender melhor as atividades dos polissacardeos

sulfatados necessria uma descrio detalhada de sua estrutura. Apesar da

grande complexidade dessas molculas, so poucas as caracterizaes

estruturais. Alguns trabalhos interessantes foram publicados descrevendo a

estrutura das ulvanas, heteroglucanas sulfatadas, extradas de algas do gnero

Introduo 28


Ulva (LAHAYE; BRUNEL; BONNIN, 1997; ROBIC et al., 2009). Por outro lado,

a estrutura dos polissacardeos de diversas outras espcies est longe de ser

detalhadamente caracterizada. No gnero Codium j foi relatada a presena de

glucana sulfatada, arabinana sulfatada, galactana sulfatada, arabinogalactana

sulfatada e galactana piruvatada e sulfatada em Codium fragile (OHTA et al.,

2009) e Codium vermilara (CIANCIA et al., 2007; ESTEVEZ et al., 2009).

Tambm foi relatada a presena de arabinana sulfatada e arabinogalactana

sulfatada em Codium dwarkense (SIDDHANTA et al., 1999); e ainda, foi

relatada a presena de arabinanas sulfatadas em Codium divaricatum, C.

adhaerence e C. latum (HAYAKAWA et al., 2000) e a presena de galactanas

sulfatadas em Codium cylindricum e galactanas sulfatadas e piruvatadas em

Codium yezoense (BILAN et al., 2007) e Codium isthmocladum (FARIAS et al.,

2008). Outros autores direcionam seus estudos para as propriedades

biolgicas desses polissacardeos extrados de Codium sp. Muitas dessas

atividades se assemelham quelas atribudas a polissacardeos de algas de

outros gneros (ver tpico 1.3). Destaca-se aqui, para o gnero Codium, as

atividades: anticoagulante (MATSUBARA et al., 2001), anti-angiogncia

(MATSUBARA et al., 2003), antioxidante (COSTA et al., 2010) e

antiproliferativa (COSTA et al., 2010; SABRY, 2008).

1.5 Galactanas sulfatadas extradas do gnero Codium

Recebe a denominao de galactana, aquele polissacardeo que

apresenta galactose como monossacardeo predominante em sua estrutura. As

galactanas sulfatadas esto entre os polissacardeos sulfatados mais

abundantes encontrados na natureza. Eles ocorrem em altas concentraes

nas algas vermelhas (SILVA, 2010), em algumas espcies de algas verdes

(COSTA, 2010), no molusco Pomacea lineata (CRUZ et al., 2010), no ourio-

do-mar Glyptocidaris crenularis (CASTRO et al., 2009) e em angiospermas

marinhas (AQUINO et al., 2005) (Tabela 01). Nesse panorama as algas do

gnero Codium vm se destacando, pois apesar dos trabalhos no se deterem

especificamente na busca de galactanas sulfatadas, e sim se concentrarem na

busca de polissacardeos com potencial biotecnolgico/farmacolgico, eles

vm evidenciando a presena de diferentes galactanas sulfatadas em vrias

Introduo 29


algas desse gnero (BILAN et al., 2007; CIANCIA et al., 2007 FARIAS et al.,

2008; ESTEVEZ et al., 2009; OHTA et al., 2009).

At o presente momento foram publicados apenas quatro trabalhos

descrevendo a estrutura de galactanas sulfatadas extradas do gnero Codium:

Codium fragile (OHTA et al., 2009), C. vermilara (CIANCIA et al., 2007), C.

yezoense (BILAN et al., 2007), e C. isthmocladum (FARIAS et al., 2008). Esses

trabalhos mostram que as espcies desse gnero sintetizam galactanas

sulfatadas, porm com caractersticas estruturais peculiares a cada espcie

(Tabela 01). E apenas Ohta e Ciancia exploraram o potencial biolgico dessas

galactanas, avaliando atividade antiviral e anticoagulante, respectivamente.

Na tabela 01 esto relacionadas as galactanas sulfatadas e/ou

piruvatadas obtidas de algas verdes do gnero Codium, do molusco Pomacae

lineata, do ourio Glyptocidaris crenularis e da angiosperma marinha Ruppia

maritima. A tabela contm as principais caractersticas dessas galactanas,

como a composio monossacardica, tipo de ligao, teor de sulfato e de

piruvato e peso molecular (PM). O massa molecular dessas galactanas variam

de 11 kDa (C. fragilea) a 2.500 kDa (P. lineata). Com relao composio,

todas as galactanas listadas apresentam galactose como monossacardeo

principal, podendo apresentar outros monossacardeos em sua estrutura, como

arabinose (C. fragile e C. vermilara) e n-acetilglucosamina (P. lineata). O tipo

de ligao presente em todas as galactanas listadas -1,3, podendo

apresentar tambm ligaes -1,6 (P. lineata) ou -1,4 (R. maritima) e

ramificaes do tipo -1,6 (C. fragile, C. yezoense, C.isthmocladum). Todas as

galactanas presentes na tabela apresentam grupamento sulfato em sua

estrutura, esse sulfato encontra-se, na maioria dessas galactanas, na posio

C4, porm pode acontecer tambm nas posies C2 e C6. Assim como o

grupamento sulfato, o grupamento piruvato est presente na estrutura da

maioria dessas galactanas, com exceo das espcies G. crenularis e R.

maritima. Na maioria das galactanas do gnero Codium na tabela, o piruvato

encontrado na forma de 3,4-O-(1-carboxi)etilideno, um cetal cclico com cinco

membros, com exceo de C. yezoense e P. lineata que apresentam o piruvato

ligado a C4 e C6.

Introduo 30


Tabela 01. Relao das caractersticas qumicas de galactanas encontradas em diversas

espcies

Espcies Composio

Monossacardica

Tipo de

Ligao

Sulfato

(%)

Posio

do

Sulfato

Piruvato

(%)

Posio

do

Piruvato

PM

(kDa)

Codium fragilea Gal:Arab (3:1) 1,3 20,3 C4 5 3,4 11

Codium vermilarab Gal:Arab (1:1) 1,3 30,4 C4 1,4 3,4 66

Codium fragilec Gal 1,3 (1,6) 11 C4 12,3 3,4 140

Codium yezoensed Gal 1,3 (1,6) 28 C4 15 4,6 nd

Codium isthmocladume Gal 1,3 (1,6) nd C4 (C6) nd 3,4 14

Pomacae lineataf Gal:NAcGlu 1,3-1,6 nd C4 (C6) 0,5 4,6 2.500

Glyptocidaris crenularisg Gal 1,3 nd C2 - - 500

Ruppia maritimah Gal 1,3-1,4 10,3 C2-C4 - - nd

a ,b = Ciancia, 2007; c = Ohta, 2009; d = Bilan, 2007; e = Farias, 2008; f = Cruz, 2010; g = Castro, 2009; h = Aquino, 2005;

PM = peso molecular; nd = no descrito; Gal = galactose; Arab = arabinose; NAcGlu = N-Acetilglucosamina.

Apesar da ocorrncia de estudos propondo a estrutura de galactanas

sulfatadas de algas verdes do gnero Codium e de artigos descrevendo

atividades biolgicas para galactanas deste gnero, ainda no h relatos

publicados que descrevam correlao entre estrutura e atividade

farmacolgica.

1.6 Relao entre estrutura e atividade anticoagulante das galactanas sulfatadas

Com o crescimento das pesquisas de prospeco de polissacardeos

como novos frmacos, surgiu a necessidade no s de testar se determinado

polissacardeo apresenta uma determinada atividade farmacolgica, mas

tambm surgiu a necessidade de compreender como essa atividade

desempenhada. O grande desafio de se trabalhar com polissacardeos

sulfatados propor sua estrutura. Isso devido muito complexidade dessas

molculas. E ainda mais desafiador correlacionar a estrutura desse

polissacardeo com alguma atividade farmacolgica que ele possa

desempenhar como, por exemplo, a atividade anticoagulante.

Alguns trabalhos relacionam somente o peso molecular e o grau de

sulfatao com a atividade anticoagulante dos polissacardeos sulfatados. A

presena do sulfato indiscutvel para interao com protenas responsveis

Introduo 31


pelo processo de coagulao, como mostram alguns trabalhos (MULLOY,

2005). Fucanas, polissacardeos sulfatados contendo -L-fucose, de mesmo

peso molecular apresentaram maior atividade anticoagulante em testes de

inibio de trombina por co-fator II da heparina (HC-II), quando continham

maior grau de sulfatao (NISHINO; NAGUMO, 1992). E quando esse grau de

sulfatao era menor que 20%, em fucanas de baixo peso molecular de

Ascophyllum nodosum, a atividade anticoagulante foi nula (HAROUN-

BOUHEDJA et al., 2000). Porm essa densidade de carga pela presena do

sulfato, isoladamente, no determinante para que um polissacardeo

apresente atividade anticoagulante (PEREIRA et al., 2002b). Alm da

distribuio de sulfato foi observado que as galactanas precisam apresentar

cadeias maiores que a heparina para inibirem o processo de coagulao, isso

indica que cada polissacardeo forma um complexo particular com proteases

plasmticas (MELO et al., 2004). Outra caracterstica estrutural importante a

ligao glicosdica, sendo -1,3 e -1,4 as mais relevantes para a observao

da atividade anticoagulante. Contudo a espcie monossacardica no influencia

a atividade (CHAIDEDGUMJORN, 2002).

1.7 Galactanas de Codium isthmocladum

H alguns anos, polissacardeos sulfatados da alga verde Codium

isthmocladum vm sendo objetos de estudo de um nico grupo de

pesquisadores, que atualmente se encontra no laboratrio Biotecnologia de

Polmeros Naturais, do Depto. de Bioqumica, da UFRN. Este grupo

demonstrou que possvel obter cinco fraes ricas em polissacardeos

sulfatados atravs de um fracionamento sequencial com acetona do extrato

bruto rico em polissacardeos. Estas fraes foram denominadas de F0,3V;

F0,5V; F0,7V; F0,9V e F1,2V (FARIAS et al., 2008).

Farias e colaboradores confirmaram a presena de polissacardeos

sulfatados nas fraes cetnicas por diversas tcnicas, como eletroforese em

gel de agarose (Figura 02). A composio monossacardica dessas fraes

tambm foi mostrada por esses autores: galactose, manose e arabinose foram

encontradas em todas as fraes, contudo suas propores entre as fraes

no foi semelhante, F0,3V e F0,5V apresentaram arabinose como constituinte

Introduo 32


em maior quantidade, j em F0,7V e F0,9V manose foi majoritria, porm a

quantidade de galactose foi semelhantes de manose. Em F1,2V a quantidade

de arabinose foi bem maior do que a dos demais acares (Tabela 02)

(FARIAS, 2006).

Ensaios de atividade anticoagulante mostraram que as fraes F0,9V e

F0,5V eram, respectivamente, as que apresentavam a primeira e a segunda

melhores atividades (FARIAS, 2006). A frao F0,9V foi submetida a

purificao por cromatografia de troca inica e assim foi obtida uma populao

de -homogalactanas, que foi dividida em sub-populaes de galactanas

sulfatadas denominadas de Gal1 e Gal2. Estas so estruturalmente

semelhantes, a diferena entre elas est no fato de Gal2 ser mais sulfatada

que Gal1. Anlises estruturais mostraram que elas so compostas por

unidades de galactose sulfatadas na posio 4 e unidas por ligaes -1,3.

Porm, algumas unidades podem ser sulfatadas ou substitudas na posio 6.

Piruvato tambm foi identificado em alguns resduos, este forma um anel

externo a galactose ligando-se aos seus carbonos 3 e 4 (FARIAS et al, 2008).

F0,5V foi submetida purificao de seus polissacardeos sulfatados e

caracterizao parcial destes. Duas homogalactanas foram purificadas, e

apresentaram atividade antiproliferativa frente a linhagens celulares HeLa,

PC3, Panc1 e HL60 in vitro (SABRY, 2008). Contudo, suas estruturas no

foram determinadas nem sua atividade anticoagulante.

Introduo 33


TABELA 02. Analise qumica e relaes molares dos acares e do sulfato presentes nas fraes

cetnicas da alga Codium isthmocladum

Fraes Acar total % Protena

% Galactose1 Manose1 Arabinose1 SO3Na

2

F 0,3V 14,4 0,6 1 0,5 2,0 2,0

F 0,5V 44,7 1,3 1 5,0 8,5 3,0

F 0,7V 47,3 1,5 1 1,2 0,1 0,4

F 0,9V 56,9 1,1 1 1,2 0,2 0,5

F 1,2V 16,8 0,8 1 5,6 0,5 1,0

1 relao molar de acar, tendo a galactose como referncia 2 relao molar sulfato/acar (soma dos monossacardeos) Tabela retirada de Farias, 2006

Introduo 34


CRU 0,3V 0,5V 0,7V 0,9V 1,2V

+

Or

Uma vez que Farias (2006) demonstrou que a frao cetnica F0,5V

apresentou uma alta atividade anticoagulante, seria importante isolar os

polissacardeos presentes na mesma frao e avali-los individualmente para

identificar o polissacardeo anticoagulante, e ento caracteriz-lo qumica e

estruturalmente esse polissacardeo anticoagulante.

Figura 02. Comportamento eletrofortico das fraes cetnicas da alga Codium isthmocladum (Farias, 2006). Alquotas de 5l (50g) das fraes provenientes do fracionamento com acetona foram aplicadas em laminas de agarose em tampo PDA 0,05 M, pH 9,0. Aps precipitao com CETAVLON as laminas foram coradas com azul de toluidina. CRU, extrato bruto de polissacardeos; Or, origem. (Figura extrada de Farias, 2006)

Introduo 35


Diante do exposto nossos objetivos foram:

Objetivo Geral:

Purificar e caracterizar estruturalmente polissacardeos sulfatados com alta

atividade anticoagulante da alga verde Codium isthmocladum;

Objetivos especficos:

Obter um extrato rico em polissacardeos da alga verde C. isthmocladum e

a partir dele, utilizando a metodologia descrita por Farias (2006), fracionar este

extrato e obter a frao F0,5V;

Purificar os polissacardeos presentes na frao F0,5V;

Caracterizar quimicamente e estruturalmente esses polissacardeos;

Avaliar a atividade anticoagulante desses compostos.

Material e Mtodos 36


3. MATERIAIS E MTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Material Biolgico

i) Alga Marinha

Para este estudo foi escolhida a alga marinha Codium isthmocladum

Vickers (Chlorophyta, Cordiaceae (Fig 03).

Gnero: Codium

Espcie: Codium isthmocladum

Figura 03. Viso geral da alga marinha verde Codium isthmocladum.

(http://www.mariculturetechnology.com/images/Codium.jpg)

Codium isthmocladum foi coletada em local de fcil acesso, na Praia de

Pirambzios (6L/35S), litoral sul do Estado do Rio Grande do Norte,

observando-se mars entre 0,0-0,3m e temperatura no intervalo de 25C a

32C. O material coletado foi armazenado em sacos plsticos e levado ao

laboratrio onde, foi descontaminado de incrustaes calcrias, epfitas e

pequenos invertebrados com gua corrente. Aps descontaminao, o material

foi desidratado em estufa aerada a 50C, triturado em liquidificador



convencional e submetido macerao com dois volumes de lcool etlico 96

durante 24 horas, para retirada de contaminantes lipdicos e pigmentos.

Decorrido este perodo, o material foi seco temperatura ambiente e o

resultante deste processo denominado, p delipidado (LEITE et al., 1998).

3.1.2 Outros materiais

i) Reagentes

1,3 diamino propano, da Aldrich Chemical Co. Inc. (Milwake, WI, EUA).

Acetona, metanol, etanol, acetato de etila, piridina, lcool isoproplico e CTV

da CRQ (Diadema SP).

cido actico, cloreto de sdio da VETEC (Rio de Janeiro RJ).

cido sulfrico, cido clordrico da QEEL (So Paulo SP).

Agarose da Bio Agency (So Paulo SP).

lcool 96, da Sertanejo (Natal RN).

Azul de toluidina, xido de deutrio, piruvato de sdio, vermelho de cresol,

coomasie blue R 250, D-galactose, D-glicose, D-manose, D-arabinose, cido

D-glucurnico, D- xilose e L-fucose da Sigma Chemical Company (St. Louis,

MO, EUA).

Maxatase (protease alcalina P 126), da BIOCON do Brasil Industrial Ltda ( Rio

de Janeiro, RJ, Brasil).

Meio DMEM da CUTILAB, Campinas-SP

Resina de troca-inica Lewatite da Bayer, gentilmente cedida por Acar

Guarani S/A (Olmpia, So Paulo, lote AD001, safra 95/96.

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) da

Invitrogen (Carlsbad, Califrnia, USA)



Todos os demais materiais e reagentes utilizados foram da melhor

qualidade disponvel.

ii) Aparelhos

Agitador orbital modelo 255-B da FANEM Ltda (So Paulo, SP, Brasil);

Banhos e estufas de temperatura controlvel da FANEM Ltda (So Paulo, SP,

Brasil);

Cmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por

Jaques (1968) (Tcnica Permatron Ltda., So Paulo, SP, Brasil);

Centrfuga refrigerada CR21 da Hitachi Koki Co. Ltda. (Tquio, Japo);

Espectrofotmetro Femto 700 plus da Femton Ind. Com. Instrumentos Ltda

(So Paulo, Sp, Brasil);

Cromatgrafo a gs (CG) Varian;

Fonte de corrente contnua regulvel desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa,

Tcnica Permatron Ltda. (So Paulo, SP, Brasil);

Coagulmetro Drake (So Paulo, SP, Brasil);

Medidor de pH PHTEK, modelo Meter PHS 3B (Tquio, Japo);

Cromatgrafo lquido de alta eficincia da Merck;

Equipamento de Ressonncia Bruker, modelo DRX 400, srie AVANCE;

MestRec verso 4.9.9.9.

Equipamento de CG-EM da marca Varian (Palo Alto, CA), modelo Saturn

2000R.



3.2 Mtodos

3.2.1 Obteno dos polissacardeos sulfatados

3.2.1.1 Digesto proteoltica (protelise)

O p delipidado foi submetido a digesto proteoltica com enzima

maxatase, em soluo salina de NaCl 0,25 M com pH ajustado para 8,0, ento

a mistura foi deixada por 12h a 60C. Em seguida, a mistura foi submetida a

uma centrifugao, 10.000 x g, durante 15 minutos a 4C e o sobrenadante foi

filtrado. Ao final, o volume do sobrenadante foi registrado e reservado para ser

imediatamente utilizado no fracionamento com volumes crescentes de acetona.

3.2.1.2 Obteno do extrato total de polissacardeos

O sobrenadante obtido na etapa anterior foi dividido em alquotas e a

uma destas foram adicionados dois volumes de metanol, deixando-se esta

mistura temperatura de 4C durante 24 horas. Aps esse perodo, o material

foi centrifugado (10.000 x g, durante 15 minutos a 4C). O sobrenadante foi

descartado e o precipitado, denominado de extrato total de polissacardeos, foi

seco a presso reduzida, triturado, pesado e utilizado para os procedimentos

posteriores.

3.2.1.3 Fracionamento com volumes crescentes de acetona

Ao restante das alquotas obtidas na protelise foram adicionados

volumes crescentes de acetona. As fraes foram obtidas medida que se

adicionou a acetona e verificou-se a turvao da mistura. Para se obter as

fraes referentes, cada mistura foi mantida por 24 horas a 4C.

Posteriormente, foram centrifugadas (10.000 x g, durante 15 minutos a 4C) e

secas a presso reduzida (FARIAS et al., 2008). O fracionamento com acetona

proporcionou cinco fraes cetnicas correspondentes aos volumes de acetona



adicionados (F0,3V; F0,5V; F0,7V; F0,9V e F1,2V). A metodologia completa

est mostrada no Esquema 1.

Esquema 01. Obteno, purificao e anlise dos polissacardeos de Codium

isthmocladum

Codium isthmocladum

P de Alga

Protelise

Delipidao

F0,3M F0,5M F0,7M F1,0M F1,5M F2,0M F3,0M

Precipitado

Sobrenadante

F0,3V F0,5V F0,7V F0,9V F1,2V

Fracionamento com acetona

Lewatite

RMN

CG/CG-

HPL

Eletroforese em gel de agarose

Cromatografia lquida de gel filtrao

Anlises

Atividade anticoagulante



3.2.2 Eletroforese em gel de agarose

A agarose foi preparada na concentrao 0,6% em tampo 1,3 diamino

propano acetato (PDA) e colocado sobre lminas de vidro medindo 7,5 X 7,5 X

0,1. Cinco microlitros de cada frao na concentrao de 10 mg/mL foram

aplicados em canaletas no gel e submetidos a corrente contnua de 100V

durante uma hora, em cuba resfriada a 4C; a origem corresponde ao plo

negativamente eletrizado do tampo. Aps a corrida eletrofortica, os

compostos foram precipitados com CETAVLON 0,1% por no mnimo 2 horas, a

temperatura ambiente. Para revelao das bandas de migrao, o gel foi

submetido a uma corrente de ar quente contnua para ser desidratado

homogeneamente e posteriormente corado com azul de toluidina 0,1%, numa

soluo de cido actico 1% e etanol 50%. O excesso de corante foi removido

por uma soluo de cido actico 1% em etanol 50% (soluo descorante). A

revelao das bandas polissacardicas foi realizada devido capacidade do

azul de toluidina interagir com o sulfato presente nos polissacardeos e os

compostos ricos em sulfato desenvolverem uma colorao azul-violcea

caracterstica (DIETRICH, C; DIETRICH, S, 1977).

3.2.3 Cromatografias

3.2.3.1 Cromatografia lquida de troca-inica

Aps o fracionamento com acetona, os polissacardeos foram

purificados com a utilizao de cromatografia de troca inica. A resina Lewatite

foi previamente ativada com HCl 2M e NaOH 2M. Aps a ativao a resina

carregada positivamente, foi submetida a um processo de complexao com os

polissacardeos sulfatados, sob agitao durante 18 horas.

A frao F0,5V, obtida por precipitao com volumes crescentes de

acetona, foi complexada com a resina de troca-inica Lewatite na proporo de

10g da F0,5V/300mL de resina, em NaCl 0,25M. A eluio do material

complexado foi realizada por step wise utilizando molaridades crescentes de

NaCl (0,3M; 0,5M; 0,7M, 1,0M; 1,5M; 2,0M e 3,0M). As fraes obtidas foram



precipitadas com 4 volumes de metanol a 4C e coletadas por centrifugao

(10.000 x g, durante 15 minutos a 4C). Em seguida as fraes foram

precipitadas foram secas a presso reduzida, pesadas e submetidas a

anlises. Essas fraes obtidas foram denominadas de acordo com a

molaridade nas quais foram descomplexadas da resina.

3.2.3.2 Cromatografia lquida de gel filtrao

As massas moleculares de F2,0M e F3,0M foram determinadas por

cromatografia de gel filtrao. A fase estacionria utilizada foi o gel Sephadex

G-100. A fase mvel utilizada foi NaCl 150 mM em cido actico 200 mM. A

coluna (130 x 1 cm) foi calibrada utilizando padres de dextran com as

seguintes massas moleculares: 10, 40, 70, 147 e 500 kDa, e uma curva de

eluio (tempo de reteno versus massa molecular) foi construda e sua

equao foi utilizada para a determinao da massa molecular das amostras.

3.2.3.3 Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

Esta tcnica foi utilizada para se quantificar o piruvato presente nas

amostras. Para tal, F2,0M e F3,0M foram hidrolizados com TFA 1M (120C,

6h). Aps o tempo de hidrlise o TFA foi evaporado, e ento ressuspendeu-se

o material com gua deionizada. Em seguida filtrou-se o material em filtros de

seringa de 0.22 m.

O material filtrado de F2,0M e de F3,0M foi submetido cromatografia

lquida de alta performance em coluna LiChroCART 250-4 LiChrospher 100

NH2 (10 m) e H2SO4 0,05M foi utilizado como fase mvel em um fluxo de 0,6

mL/min com monitoramento em 220 nm. Como padro de deteco foi utilizado

piruvato de sdio, a curva padro variou de 0,1 a 12,8mM (OHTA, 2009).



3.2.3.4 Cromatografia gasosa

Os monossacardeos constituintes, bem como as suas propores,

foram determinados utilizando-se essa cromatografia gasosa. Os

polissacardeos F2,0M e F3,0M foram submetidos a um processo de acetilao

descrito por Sassaki et al. (2008), para volatilizar as amostras, e ento

determinar a composio monossacardica. O material foi hidrolisado para a

liberao das unidades monossardicas, e em seguida adicionado NaBH4 (pH

8-9, 100C por 10min). Na sequncia, o material foi neutralizado com cido

actico e evaporado em fluxo direcionado e contnuo de ar, posteriormente

adicionou-se metanol (200 L), o material foi seco como descrito anteriormente.

Esse passo foi repetido, pelo menos, duas vezes.

O material seco foi solubilizado com piridina (100 L) seguida da adio

de anidrido actico (100 L). Aps solubilizao este material foi levado a

estufa por 30 min (100 C). Em seguida, adicionou-se clorofrmio (1 mL) e o

material foi lavado exaustivamente com sulfato de cobre para se retirar o

material polar restante na soluo. Ao final da lavagem com sulfato de cobre,

adicionou-se sulfato de sdio anidro (1 mg) e transferiu-se o sobrenadante para

um tubo, que l permaneceu secando temperatura ambiente.

O material acetilado foi ressuspendido em acetona e aplicado em

cromatgrafo a gs da marca Varian (Palo Alto, CA). A composio

monossacardica foi determinada pela comparao dos tempos de reteno

dos monossacardeos presentes na amostra com o tempo de reteno de

padres de monossacardeos, como: galactose, glucose, arabinose, manose,

fucose e xilose. As anlises de CG-EM foram realizadas no cromatgrafo

Varian 3800 em coluna capilar de slica fundida revestida com DB-225MS (30

mm 0,25 mm d.i.). O gs He foi utilizado como gs de arrasto a um fluxo de 1

mL/min.

3.2.3.5 Preparo das amostras para cromatografia gasosa acoplada a

espectrmetro de massa (CG-EM)

Essa metodologia foi utilizada como parte da caracterizao. Para tal os

polissacardeos F2,0M e F3,0M, e seus respectivos derivados dessulfatados,



foram inicialmente submetidos a um processo de metilao como descrito por

Ciucanu & Kerek (1984). Eles foram solubilizados em DMSO PA (15 mg/mL),

em seguida, adicionou-se iodeto de metila (1mL) e posteriormente, NaOH

pulverizado (30 mg). A soluo ficou sob agitao mecnica vigorosa por 30

min ou at se solidificar para ento repousar por 12 h. Em banho de gelo,

solubilizou-se o material com H2O e o pH bsico da soluo foi levado a

neutralidade com auxlio de cido actico, em seguida foi realizada uma dilise

para a retirada do DMSO. O retido na membrana foi liofilizado e solubilizado

em clorofrmio. Aps a metilao os polissacardeos foram submetidos a

hidrlise cida (c. frmico 45%, 15 h,100 C) seguida de adio de gua e

ento foram liofilizados. O material liofilizado foi acetilado como descrito acima

no item 3.2.3.4.

O material metilado e acetilado foi ressuspendido em acetona e aplicado

em aparelho de CG-EM da marca Varian (Palo Alto, CA), modelo Saturn

2000R.

3.2.4 Anlises qumicas

3.2.4.1 Quantificao de acares totais

A dosagem de acares totais foi realizada de acordo com Dubois et al.

(1956), mtodo fenol/cido sulfrico, utilizando como padro D-galactose,

sendo as leituras realizadas a 490 nm.

3.2.4.2 Quantificao de sulfato

O teor de sulfato total das fraes polissacardicas foi quantificado

atravs de teste de turbidimetria pelo mtodo de gelatina-brio (DODGSON;

PRICE,1962). Aps hidrlise cida (HCl 4N, 6 horas, 100C) e neutralizao na

presena de NaOH. Sulfato de sdio (1,0 mg/mL) foi empregado como padro.



3.2.4.3 Quantificao de protena

A quantidade de protena foi determinada pelo mtodo de Spector (1978)

com o reagente Comassie blue R 250 atravs das leituras realizadas a 595 nm.

3.2.4.4 Dessulfatao por solvonlise

3.2.4.4.1- Preparo do sal de piridina

O processo de solvonlise foi conduzido com os polissacardeos na

forma de sal de piridina. Este sal foi formado atravs da solubilizao das

fraes em gua e adio de resina catinica DOWEX 50x8 na forma H+, sob

agitao magntica a temperatura ambiente por 30 minutos. O pH do

sobrenadante ficou entre 1-2. O filtrado (obtido por filtrao presso reduzida)

foi neutralizado (em capela) com piridina, at pH 7,0 e liofilizado em seguida

(NAGASAWA; INOUE; TOKUYASU, 1979).

3.2.4.4.2 Solvonlise

O polissacardeo, na forma de sal de piridina, foi solubilizado em uma

mistura de dimetilsulfxido e metanol, cuja proporo foi de 9:1 v/v,

respectivamente, respeitando-se a relao de 10 mg de polissacardeo para 3

mL de mistura (NAGASAWA et al., 1979).

A soluo resultante foi mantida a 100 C durante 4 horas. Aps o

resfriamento, a frao solvonolisada foi submetida a dilise exaustiva contra

gua destilada e posteriormente liofilizada. O polissacardeo dessulfatado foi

submetido metilao conforme descrito no item 3.2.3.5.

3.2.5 Anlise estrutural por ressonncia magntica nuclear (RMN)

As anlises estruturais por ressonncia magntica nuclear uni e

bidimensionais foram realizadas em equipamento da marca BRUKER, modelo

DRX 400, srie AVANCE, em tubo (widebore probe) de 5 mm de dimetro

externo, em gua deuterada (D2O) 99%, a temperaturas que variaram de 25 a



70C. Os deslocamentos qumicos, expressos em (ppm), foram determinados

utilizando acetona como padro interno tanto para as anlises de 13C (d = 30,2

ppm) quanto para 1H (d = 2,224 ppm). Os seguintes experimentos

bidimensionais 1H-1H COSY, 1H-1H TOCSY, 1H-13C HMBC e 1H-13C HMQC

foram utilizados para o assinalamento dos deslocamentos qumicos dos

compostos isolados.

A maioria dos espectros, uni e bidimensionais, foram analisados

utilizando o software MestReC verso 4.9.9.9.

3.2.5.1 Ressonncia magntica nuclear unidimensional

3.2.5.1.1 Ressonncia magntica nuclear unidimensional de prton (RMN 1H)

Para as anlises de RMN de 1H foi promovida a troca de hidrognios das

hidroxilas por deutrio e remoo das molculas de gua presentes atravs da

dissoluo das amostras em D2O, congelamento e liofilizao. Este processo

foi repetido por, no mnimo, 3 vezes. Os espectros foram obtidos na frequncia

base de 400,13 MHz, janela espectral de 8250,8 Hz, intervalo de aquisio de

4 s, intervalo entre os pulsos de 1 s, sendo realizadas, no mnimo, 16

aquisies. A resoluo dos espectros foi de 16K.

3.2.5.1.2 Ressonncia magntica nuclear unidimensional de carbono-13

(RMN 13C)

Os espectros de RMN de 13C, desacoplados de 1H, foram obtidos na

frequncia base de 100,61 MHz, janela espectral de 31750 Hz, intervalo de

aquisio de 0,6 s, intervalo entre os pulsos de 0,1 s, sendo realizadas, no

mnimo, 2000 aquisies. A resoluo dos espectros foi de 32 K.



3.2.5.2 Ressonncia magntica nuclear bidimensional

3.2.5.2.1 Espectroscopia de correlao homonuclear (1H/1H) COSY

(COrrelation SpectroscopY)

Esta uma tcnica homonuclear utilizada para correlacionar os

deslocamentos qumicos dos ncleos de 1H que esto acoplados um com o

outro. Assim, nos carboidratos, o H-1 de um monossacardeo apresenta

acoplamento com H-2 da mesma unidade, sendo possvel observar esta

interao na forma de um pico cruzado, e assim determinar o deslocamento

qumico de H-2 a partir de H-1. Dessa forma a partir do sinal de H-2 pode ser

determinado o H-3 e assim sucessivamente ao longo do anel, se as constantes

de acoplamento permitirem. Assim, como cada unidade monossacardica

apresenta um padro de constantes de acoplamento caractersticos, possvel

determinar o tipo de acar presente na estrutura. As condies de aquisio

dos espectros de COSY utilizadas foram conforme descritas no manual da

Bruker. A resoluo dos espectros foi de 1024 (F2) x 1024 (F1) K, com janela

espectral de 4125,4 (F2) x 4125,4 (F1) Hz.

3.2.5.2.2 Espectroscopia de correlao homonuclear total (1H/1H) TOCSY

(TOtal Correlation SpectroscopY)

Nesta tcnica homonuclear os picos cruzados so gerados no s pelos

prtons vicinais, mas sim, por todos os ncleos do sistema spin acoplado.

Desta forma temos os picos cruzados correspondentes interao H-1 com H-

2, assim como, H-1 com H-3, H-1 com H-4 e assim sucessivamente, se as

constantes de acoplamento permitirem. As condies de aquisio dos

espectros de TOCSY utilizadas foram conforme descritas no manual da Bruker.

A resoluo dos espectros foi de 1024 (F2) x 1024 (F1) K, com janela espectral

de 4125,4 (F2) x 4125,4 (F1) Hz.



3.2.5.2.3 Espectroscopia de correlao heteronuclear (1H-13C) HSQC

(Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy)

Esta tcnica heteronuclear permite determinar quais tomos de

hidrognio esto ligados a qual tomo de carbono. No espectro observada a

correlao dos deslocamentos qumicos de prtons e carbonos que dividem

uma mesma ligao. As condies de aquisio dos espectros de HSQC

utilizadas foram conforme descritas no manual da Bruker. A resoluo dos

espectros foi de 1024 (F2) x 512 (F1) K, com janela espectral de 4085 (F2) x

15923 (F1) Hz.

3.2.5.2.4 Espectroscopia de correlao heteronuclear (1H-13C) HMBC

(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Nesta tcnica heteronuclear pode-se observar o acoplamento escalar de 1H-13C sobre duas ou trs ligaes entre 0 e 10 Hz, comparvel com

acoplamento 1H-1H. No espectro observada a correlao dos deslocamentos

qumicos de prtons e carbonos que compartilham ligaes vicinais. As

condies de aquisio dos espectros de HMBC utilizadas foram conforme

descritas no manual da Bruker. A resoluo dos espectros foi de 1024 (F2) x

512 (F1) K, com janela espectral de 4085 (F2) x 15923 (F1) Hz.

3.2.6 Atividade anticoagulante

Para avaliar a atividade anticoagulante, utilizou-se uma curva de doses

crescentes com as seguintes massas: 1; 2,5; 5, 10 e 20 g de cada um dos

polissacardeos F2,0M e F3,0M. Os polissacardeos foram solubilizados em

plasma humano e ento submetidos ao teste de coagulao atravs de kits

comerciais de aPTT (tempo de tromboplastina parcialmente ativada) e PT

(tempo de protrombina). Os testes foram realizados em coagulmetro Drake.



3.2.7 Anlise estatstica

Os experimentos realizados so expressos como mdia desvio

padro. Para testar as diferenas entre as concentraes utilizadas, bem como

diferentes tratamentos do mesmo polissacardeo, foi utilizado o teste de anlise

paramtrica de anlise de varincia (ANOVA; GraphPad Instat 3.05, 32 bit for

Win95/NT; GraphPad Software Inc.) O teste de Student-Newman-Keuls (Nvel

de significncia de p

Resultados 50


4. RESULTADOS

4.1 Obteno e fracionamento do extrato total de polissacardeos da alga

Codium isthmocladum

Como mostrado na Introduo, a alga Codium isthmocladum j foi objeto

de estudo do nosso grupo. Para dar continuidade aos nossos estudos com

essa alga foi necessrio reproduzir a metodologia de extrao de

polissacardeos utilizada anteriormente e avaliar se os dados obtidos se

assemelharam ao observado anteriormente. Para tal, obteve-se o extrato total

de polissacardeos por digesto proteoltica que foi submetido a um

fracionamento com volumes crescentes de acetona de acordo com o

estabelecido por Farias (2006). Com esse fracionamento foram obtidas cinco

fraes cetnicas da alga Codium isthmocladum, denominadas: F0,3V; F0,5V;

F0,7V; F0,9V e F1,2V (Esquema 1).

4.2 Eletroforese em gel de agarose e composio monossacardica da

frao F0,5V

Para verificar se a migrao das fraes cetnicas foram semelhantes

quelas obtidas por Farias (2006) (Figura 02), foi realizada eletroforese em gel

de agarose em tampo PDA pH 9,0 (Figura 04). Cada uma dessas fraes

apresentou polissacardeos sulfatados. Entretanto a distribuio desses

polissacardeos no foi uniforme, observando-se a presena de bandas

eletroforticas em algumas fraes cetnicas que no so observadas em

outras fraes. Os polissacardeos sulfatados presentes em F0,3V e F1,2V

apresentam pouca metacromasia com azul de toluidina. Contudo as

semelhanas entre estas duas fraes limitam-se a isto. Enquanto os

polissacardeos de F0,3V apresentam um perfil bastante polidisperso, os

polissacardeos sulfatados de F1,2V apresentaram-se com uma banda

concentrada em uma regio da lmina. Um fato interessante que as fraes

F0,7V e F0,9V apresentam uma banda na mesma regio que a observada para

F1,2V. J os polissacardeos sulfatados de F0,5V apresentaram uma migrao

bastante polidispersa. Contudo, duas bandas de maior intensidade podem ser

Resultados 51


observadas (Figura 04), indicando a presena de, pelo menos, duas famlias

polissacardicas nesta frao. Comparando-se a figura 02 com a figura 04

observa-se que so semelhantes.

Figura 04. Comportamento eletrofortico das fraes cetnicas obtidas da alga C. isthmocladum. Alquotas de 50g das fraes provenientes do fracionamento com acetona foram aplicadas em lminas de agarose em tampo PDA 0,05M pH 9,0. Aps a corrida, foram precipitadas com CETAVLON, secas e coradas com azul de toluidina 0,1%. Or = origem.

Outro passo utilizado para confirmar a identidade da frao F0,5V foi a

determinao da composio monossacardica desta frao. Os dados obtidos

podem ser observados na Tabela 03. A determinao da composio da F0,5V

realizada por duas tcnicas diferentes (cromatografia descendente em papel e

cromatografia gasosa) mostrou uma maior proporo de galactose em relao

aos outros dois monossacardeos encontrados (manose e arabinose). Estes

resultados so diferentes daqueles (Tabela 03, primeira linha) obtidos por

Farias (2006).

TABELA 03. Analise qumica e relaes molares dos acares e do sulfato presentes nas

fraes cetnicas da alga Codium isthmocladum

Or ET 0,3V 0,5V 0,7V 0,9V 1,2V

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · Primeiramente quero deixar registrado que esses agradecimentos não chegam nem perto da gratidão que tenho por essas pessoas e