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Universidade Federal do Triângulo MineiroCurso de Graduação em Biomedicina
Indução de resistência ao benzonidazol em isolados humanos de Trypanosoma cruzi
Aluno: Rodrigo Nunes Cal
Orientador: Prof. Dr. André Luiz Pedrosa
Co-orientadora: Profa. Dra. Eliane Lages-Silva
Introdução• A doença de Chagas humana: - É uma das doenças tropicais mais comuns na América
Latina, sua incidência só não é maior que a da febre amarela e da esquistossomose.
- Prevalência do sul EUA até a Patagônia.
- Estimativa de infectados: 18 milhões.
- População em risco: 100 milhões.
- Brasil: área endêmica (1/4 do território); 6 milhões de infectados; 25 milhões de pessoas expostas ao risco de infecção.
- Causa cerca de 50.000 mortes anualmente no continente americano.
• Agente causador: Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi 10.500 genes
XVII Ciclo de Análises do Curso de Biomedicina - 2007
T. cruzi e doença de Chagas• Reservatórios: homem, mamíferos domésticos e silvestres.
• Modo de transmissão: picada do "barbeiro", transfusão sanguínea, via congênita e oral, acidentes de laboratório e transplante.
http://www.travelclinicoregon.com/maps/mape.jpg
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Tratamento• Drogas utilizadas no tratamento: benzonidazol, nifurtimox, fármacos
antifúngicos da classe dos azóis (cetoconazol, itraconazol, econazol e miconazol).
• Os fármacos disponíveis atualmente para o controle da doença, apresentam baixa eficiência e/ou fortes efeitos colaterais.
Nifurtimox Benzonidazol
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Resistência/suscetibilidade a drogas em T. cruzi
• FILARDI & BRENER (1987): caracterização de cepas do parasito que são naturalmente resistentes ou sensíveis ao tratamento com benzonidazol e nifurtimox.
• MURTA et al. (1998): a resistência natural do T. cruzi ao benzonidazol e ao nifurtimox pode explicar a baixa taxa de cura de pacientes chagásicos.
• MURTA et al. (2006): identificação de genes que são diferencialmente expressos nas cepas resistentes e suscetíveis das populações de T. cruzi.
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Justificativa • A doença de Chagas é, segundo a Organização Mundial de Saúde,
uma doença negligenciada: -ausência de medicamentos totalmente eficazes contra a doença. -falta de investimento em novos alvos terapêuticos.
• A descrição de cepas do T. cruzi que adquirem resistência após o tratamento do paciente com benzonidazol pode torná-lo sem utilidade em um futuro próximo.
• O estudo de cepas de T. cruzi resistentes ao tratamento com benzonidazol pode esclarecer os mecanismos de ação de várias drogas tripanossomicidas.
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Objetivos
-Selecionar cepas de T. cruzi antes e após o tratamento com benzonidazol.
-Comparar o crescimento do parasito em meio LIT e LIT-Mod na presença e ausência de benzonidazol.
-Estudar alterações nos perfis biológico e genético das cepas selecionadas.
-Determinar um perfil de resistência/suscetibilidade a droga em T. cruzi.
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Materiais e métodos Isolamento e manutenção das cepas de T.cruzi :• Cepas isoladas antes do tratamento dos pacientes: 1230 e 1206.• Cepas isoladas após o tratamento dos pacientes: 3314 e 3306.• Os parasitos foram inicialmente cultivados em meio LIT (Liver Infusion
Tryptose).
Curvas de crescimento : • O crescimento in vitro das cepas de T. cruzi foi avaliado pelo inóculo de
2,0 x 106 formas epimastigotas nos meios LIT e LIT modificado (substituição do soro bovino por 3% de urina humana) na presença e ausência de diferentes concentrações de soro de cão tratado com 1000 mg/kg de benzonidazol.
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Protocolo para indução de resistência ao benzonidazol :
• As cepas 3314 e 3306 foram inoculadas em meio LIT contendo diferentes concentrações de soro de cão tratado com benzonidazol (1%, 2%, 3%, 4% e 5%).
• Os parasitos sobreviventes da cepa 3314 foram novamente inoculados em meio contendo a droga (0,2%, 0,5%, 1% e 2%).
Eletroforese em campo pulsátil :
• Os cromossomos de T. cruzi foram separados de acordo com o seu tamanho por eletroforese em campo pulsátil (PFGE) e os perfis de separação foram determinados após coloração das bandas cromossômicas com brometo de etídio.
Materiais e métodos
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Resultados
103
104
105
106
107
108
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Meio LIT
103
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106
107
108
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Meio LIT-Mod
Crescimento in vitro das cepas de T. cruzi em meio LIT e LIT-Mod
cepa 1230 ()
cepa 1206 () Pré-tratamento
Pós-tratamento cepa 3306 ()
cepa 3314 ()
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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 1230
103
104
105
106
107
108
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 3314
Símbolos: meio LIT () LIT+ 5% BZ ()
LIT-Mod () LIT-Mod+ 5% BZ ()
Avaliação da suscetibilidade das cepas de T. cruzi ao benzonidazol
Resultados
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Símbolos meio LIT () LIT+ 5% BZ ()
LIT-Mod () LIT-Mod+ 5% BZ ()
103
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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 1206
103
104
105
106
107
108
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 3306
Avaliação da suscetibilidade das cepas de T. cruzi ao benzonidazol
Resultados
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Símbolos: meio LIT () LIT+1% de BZ () LIT+2% de BZ () LIT+3% de BZ () LIT+4% de BZ () LIT+5% de BZ ( | )
103
104
105
106
107
108
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 3306
103
104
105
106
107
108
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 3314
Indução de resistência in vitro ao benzonidazol em T. cruzi
Resultados
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104
105
106
107
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19Dias
Par
asito
s/m
L
Cepa 3314
Indução de resistência in vitro ao benzonidazol em T. cruzi
Símbolos: meio LIT ()
LIT+0,2% de BZ ()
LIT+0,5% de BZ ()
LIT+1% de BZ ()
LIT+2% de BZ ( | )
Resultados
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Caracterização genética por PFGE
cepa 1206
cepa 3306
cepa 3314
Análise por eletroforese em campo pulsátil de cepas de T. cruzi cultivadas em meio LIT normal.
Resultados
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DiscussãoCepas 1206 e 1230 maior crescimento em meio LIT e LIT-Mod:
- Tratamento alterou as características de crescimento das cepas
Indução de resistência ao BZ nas cepas 3306 e 3314:- protocolos relacionados à indução de resistência aos fármacos da classe dos azóis, nifurtimox e benzonidazol (NOZAKI et al., 1996; BUCKNER et al., 1998).
Não houve diferenças cariotípicas das cepas estudadas antes e após o tratamento dos pacientes com benzonidazol:
-Alterações no cariótipo foram relatadas em T. cruzi durante a seleção a resistência à droga (NOZAKI et al., 1996).
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Conclusões O meio LIT-Mod pode substituir o meio LIT para o cultivo in vitro de T.
cruzi.
O tratamento do paciente com benzonidazol alterou as características de crescimento do parasito.
Não houve diferenças no cariótipo molecular entre as cepas isoladas de um mesmo paciente.
A resistência ao benzonidazol parece ter surgido de eventos moleculares intrínsicos e não pela seleção de subpopulações resistentes do parasito.
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