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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSECENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA APLICADAS

DANIELLE PACHECO ALVES

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE AMOSTRAS DE

ESCHERICHIA COLI UROPATOGÊNICA ISOLADAS DE HUMANOS E DE CÃES.

Niterói 2009

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CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE AMOSTRAS DE ESCHERICHIA COLI UROPATOGÊNICA ISOLADAS DE HUMANOS E DE CÃES.

Orientador: Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA

Niterói

2009

2

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do título de mestre.

3

A474 Alves, Danielle Pacheco.Caracterização fenotípica e genotípica de amostras de

Escherichia coli uropatogênica isoladas de humanos e de cães / Danielle Pacheco Alves – Niterói, 2009.

96 f

Dissertação (Mestrado em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas) – Universidade Federal Fluminense, 2009

1. E. coli; 2. humanos; 3. cães; 4. virulência;

5. trato urinário

CDD 589.95


Caracterização fenotípica e genotípica de amostras de Escherichia coli

uropatogênica isoladas de humanos e de cães.

Aprovada em 31 de março de 2009.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dra. ROSANA ROCHA BARROS

UFF

Prof. Dra. CLAUDIA REZENDE VIEIRA DE MENDONÇA SOUZA

UFF

Prof. Dr. JOÃO RAMOS COSTA ANDRADE

UERJ

Niterói

2009

4

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas, da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.

• AGRADECIMENTOS

À Deus, por me guiar e estar presente em todos os momentos de minha vida.

Ao Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira pela orientação, atenção,

crédito a min confiado e pela oportunidade de ampliar meus conhecimentos.

Ao Laboratório de Patologia do Departamento de Microbiologia do Hospital

Universitário Antônio Pedro e a Profa. Dra. Claudia Rezende Vieira de Mendonça

Souza por ceder gentilmente as amostras de UPEC de origem humana dos

pacientes desta unidade.

À todos os professores, colegas, técnicos e demais funcionários do

Departamento de Microbiologia e Parasitologia pelo apoio e atenção dispensada.

Aos Professores do Curso de Mestrado em Microbiologia e Parasitologia

Aplicadas por sua dedicação ao compartilhar seus conhecimentos.

Aos meus colegas de turma Ana Paula, Bárbara, Carlos, Cecília, Denise,

Flávia, Ivana e Matheus, pelos bons momentos que passamos juntos!

A todos os amigos do Laboratório de enteropatógenos e alimentos do

MIP/UFF pela cooperação, atenção, carinho, alegrias, tristezas e até confusões.

Sem vocês este trabalho não existiria!

Aos meus pais, Jorge Luiz Alves e Maria Regina Pacheco Alves por toda sua

dedicação e apoio em todos os momentos. Mesmo que o faça por todos os dias da

minha vida, não será o suficiente para agradecer tudo o que vocês fizeram por min.

Amo vocês!

À minha irmã Izabella Pacheco Alves por ter sempre um sorriso a oferecer e

por sempre se espelhar em mim, o que me motiva a fazer sempre o melhor.

5

Ao meu marido Marco Vinícius Ramos Ximenes pela cumplicidade, carinho,

paciência e presença em mais uma etapa da minha vida.

A minha madrinha, Margarida dos Santos Pacheco com quem sempre pude

contar e serei eternamente grata.

A minha tia Maria de Fátima Pacheco pelo estímulo, atenção e carinho de

sempre.

Aos meus avós, tios, tias e primos, pela estima recíproca e confiança de

sempre.

À Capes pelo apoio financeiro ao projeto.

6

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ILUSTRAÇÕES 10LISTA DE ABREVIATURAS 12RESUMO 14ABSTRACT 16

1 INTRODUÇÃO 171.1 Escherichia coli uropatogênica - UPEC 181.2 Fatores de virulência 201.2.1 Adesinas 211.2.2 Toxinas 221.2.3 Sideróforos e outros fatores 231.3 Antimicrobianos e aquisição da resistência 23

1.3.1 Resistência intrínseca aos antimicrobianos 26

1.3.2 Resistência adquirida aos antimicrobianos 27

1.3.3 Genética da resistência 28

1.3.4 Bioquímica da resistência 29

.1.4 Multirresistência bacteriana 31

1.5 ESBL – beta-lactamases de espectro estendido 32

1.6 Infecção hospitalar 35

1.7 Epidemiologia molecular 37

2 OBEJETIVO GERAL 38

2.1 Objetivos específicos 38

3 MATERIAL E MÉTODOS 40

3.1 Amostras clínicas 40

3.2 Confirmação da pureza e isolamento das amostras 41

3.3 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos 41

7

3.4 Detecção de amostras produtoras de ESBL 42

3.5 Sorotipagem 44

3.6 Produção de hemolisina 44

3.7 Seleção de amostras para avaliação do perfil

genotípico

44

3.8 Obtenção de DNA molde de isolamentos 45

3.9 Caracterização genotípica da virulência e da

resistência

45

3.10 Eletroforese em gel de agarose 46

3.11 Extração plasmidial 48

4 RESULTADOS 50

4.1 Perfil das amostras de origem humana 50

4.2 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos 52

4.3 Avaliação da Multirresistência 56

4.4 Perfil plamidial 58

4.5 Identificação de ESBL 62

4.6 Avaliação da produção de hemólise 64

4.7 Detecção de genes de resistência e de genes de

virulência

66

5 DISCUSSÃO 73

6 CONCLUSÕES 80

7 BIBLIOGRAFIA 81

8

Lista de Ilustrações:Página

Figura 01 Exemplificação da metodologia de Disco Aproximação.

Escherichia coli produtora da ESBL.

43

Figura 02 Resistência aos antimicrobianos em amostras humanas. 52Figura 03 Resistência aos Antimicrobianos em amostras caninas. 54Figura 04 Frequencia de Multirresistência em amostras humanas e

caninas.57

Figura 05 Gel de eletroforese de extração plasmidial ilustrando:

controle da extração R23, controle positivo R861 (indicados

respectivamente pelas setas) e amostras humanas

demonstrando a presença de plasmídeos de alto e baixo

peso molecular.

61

Tabela 01 Primers utilizados para detecção de genes de virulência e

resistência.47

Tabela 02 Características dos pacientes dos quais foram obtidas as

amostras UPEC em relação ao sexo do paciente51


amostras UPEC em relação à idade do paciente51


amostras UPEC em relação a localização do paciente51

Tabela 05 Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia

coli uropatogênica isoladas no Hospital Universitário

Antonio Pedro (HUAP), 2007-2008.

53

Tabela 06 Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia

coli uropatogênica isoladas no Laboratório Veterinário

Laborlife. 2007-2008.

55

Tabela 07 Classificação da resistência das amostras UPEC de origem

humana de acordo com as classes de antimicrobianos

testados.

56

Tabela 08 Classificação da resistência das amostras UPEC de origem

canina acordo com as classes de antimicrobianos testados.56

Tabela 09 Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC humanas. 59Tabela 10 Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC caninas. 60Tabela 11 Caracterização das amostras produtoras ESBL através de

sorotipagem e PCR.63

9

Tabela 12 amostras produtoras de α-hemólise fenotípica e presença

do gene HlyA.

65

Tabela 13 Divisão dos grupos de amostras para realização das PCRs. 66Tabela 14 Caracterização fenotípica e genotípica das amostras de

UPEC humanas.69 e 70

Tabela 15 Caracterização fenotípica e genotípica das amostras de

UPEC caninas.71 e 72

10

Lista de Abreviaturas

afa gene codificador de adesina afimbrial

blaCMY gene codificador de resistência a cefalosporinas

blaCTX gene codificador de beta lactamases de espectro estendido mediadas

pela enzima CTX

blashv gene codificador de beta lactamases de espectro estendido mediadas

pela enzima SHV

blaTem gene codificador de beta lactamases de espectro estendido mediadas

pela enzima TEM e aminopenicilinas

cnf gene codificador do fator citotoxico necrozante

CEP comitê de ética em pesquisa

CTI centro de tratamento intensivo

DNA ácido desoxirribonucléico

drfA17 gene codificador de resistência a trimetoprim

E. coli Escherichia coli

EDTA ácido etilenodiamino tetracético

ESBL beta-lactames de espectro estendido

EPEC Escherichia coli enteropatogênica

ExPEC Escherichia coli extra-intestinal

fimH gene codificador de fímbria tipo1

hlyA gene codificador de alfa-hemilisina

iroN sideróforo salmoquelina

HUAP Hospital Universitário Antonio Pedro

ITU Infecção do trato urinário

kb kilobase

kpsMTII gene capsular associado a aderência em cistite

11

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

MDa megadalton

MDR multirresistênte

MIP Depertamento de Microbiologia e Parasitologia

µL microlitro

Ml mililitro

µM micromolar

NR não realizado

PAI Ilhas de patogenicidade

Pap gene codificador do pilus associado a pielonefrite

Pb pares de base

PBS solução salina tamponada com fosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase

Ph potencial de hidrogênio

rmtb gene codificador de resistência a aminoglicosídeos

TBE tampão Tris – Borato - EDTA

TSA agar tripticase soja

TSB caldo tripticase soja

TSI agar ferro três açúcares

UPEC Escherichia coli uropatogênica

VF fatores de virulência

UV ultra-violeta

12

• RESUMO

As infecções no trato urinário (ITU) são frequentemente causadas por cepas de Escherichia coli uropatogênica (UPEC). Este patotipo é a principal causa de ITU na comunidade e um dos mais importantes no ambiente hospitalar. A localização, gravidade e sequelas destas infecções são determinadas pelo equilíbrio entre a virulência bacteriana e a resistência do hospedeiro. A multirresistência bacteriana aos antimicrobianos, que vem ocorrendo de modo crescente tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária, dificulta o combate a estes microrganismos. A produção de beta-lactamases de espectro estendido é um importante mecanismo de resistência em enterobactérias, visto que essas enzimas catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico, impossibilitando sua atividade antimicrobiana. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar comparativamente os perfis de virulência e resistência antimicrobiana de amostras de Escherichia coli isoladas de infecções do trato urinário de humanos e de cães. A resistência a 19 antimicrobianos foi avaliada em amostras de UPEC de origem humana (n=50) e de origem canina (n=50). Adicionalmente, testes fenotípicos de avaliação da produção de ESBL e de hemolisina foram realizados. O perfil genotípico das amostras foi avaliado através de detecção de genes específicos codificadores da virulência (afa, cnf, fimH, hly, kps e pap) e da resistência bacteriana (blaCMY , blaTEM , blaSHV , blaCTX , drf, rmtB) além da avaliação do perfil plasmidial. Pode-se observar multirresistência a antimicrobianos em 94% das amostras de origem humana, assim como em 74% nas de origem canina. Resistência simultânea a mais de 8 classes de antimicrobianos foi detectada em 4% e 10 % das amostras de origem humana e canina, respectivamente. Todas as amostras testadas foram sensíveis ao imipenem. A ocorrência de cepas produtoras de ESBL, detectadas em amostras de origem humana (n=4) e canina (n=3) foi principalmente mediada pela presença das enzimas Tem e Ctx, uma vez que nenhuma das amostras testadas apresentou o gene codificador da enzima Shv. O perfil genético de virulência foi diverso, ocorrendo amostras portadoras de apenas 1 gene de virulência (fimH - 14% das amostras de origem humana e 17% das amostras de origem canina testadas), até amostras que apresentaram todos os genes investigados ( 18% das amostras de origem humana e 17% das amostras de origem canina testadas). Várias destas amostras exibiram simultaneamente um padrão de multirresistência. A presença do gene hlyA foi comumente associada a xiv

XIII

presença dos genes pap e/ou cnf. Os resultados obtidos neste estudo reforçam a importância do monitoramento de amostras multirresistentes de modo a otimizar as estratégias de tratamento e controle da infecção.

Palavras-chave: E. coli; humanos; cães; virulência; trato urinário;

xv

14

• ABSTRACT

The urinary tract infections are often caused by urophatogenic Escherichia coli (UPEC) strains . This pathotype is the main cause of communitary UTI and one of the most important in the nosocomial infections. The location, severity and sequelae of these infections are determined by the balance between bacterial virulence and resistance of the host. The bacterial multidrug resistance to antibiotics, which is increasingly occurring in both human and veterinary medicine, hinders the fight against these organisms. The production of extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) is an important mechanism of resistance in Enterobacteriaceae, since these enzymes catalyze the hydrolysis of the beta-lactam ring, disabling its antimicrobial activity. This study searched in a comparative way the virulence and antimicrobial resistance profiles of Escherichia coli strains isolated from UTI in humans and dogs. Resistance to 19antimicrobial agents was assessed in samples of UPEC from human (n = 50) and canine origin (n = 50). Additionally, phenotypic tests for assessing the production of ESBLs and hemolysin production were done. The genotypic profile of strains was evaluated by plasmid extraction and by detection of specific virulence (afa, cnf, fimH, hly, kps and pap) and resistance (blaCMY, blaTEM, blaSHV, blaCTX, drf, rmtB) genes. Multiresistance was observed in 94% of strains of human origin, as well as in 74% strains of canine origin. Simultaneous resistance to more than 8 classes of antimicrobials was detected in 4% and 10% of samples of human and canine origin, respectively. All strains were sensitive to imipenem. The occurrence of ESBL-producing strains was detected in samples of human (n = 4) and canine (n = 3) origin and was mainly mediated by the presence of Tem and Ctx enzymes, since none of the strains tested had the blashv gene. The virulence genetic profile was diverse, including strains carrying only one virulence gene (fimH - 14% of human and 17% of canine tested strains) and strains that had all the searched genes (18% of human and 17% of canine tested strains).Several of these strains also exhibited a multiresistance pattern. The presence of hlyA gene was commonly associated with pap and/or cnf genes. The results of this study reinforce the importance of multiresistant strains monitoring to optimize the strategies for treatment and control of infection.

Key words: E. coli; humans; dogs; virulence; urinary tract

xvi

15

1. Introdução

Ao longo do tempo, tem havido uma batalha contínua entre o homem e

microrganismos patogênicos. Diversas patologias têm afetado porções substanciais

da população, provocando significativa morbidade e mortalidade. A partir de meados

do século 20 importantes avanços no desenvolvimento de drogas antibacterianas e

outros meios de controle de infecções, ajudaram a inverter este quadro a favor do

homem. No que diz respeito às infecções bacterianas, a situação melhorou

consideravelmente com a introdução da penicilina nos anos 40. No entanto, as

bactérias responderam a estes avanços manifestando diversas formas de

resistência. Com o aumento do uso de antimicrobianos, houve também um aumento

da complexidade de mecanismos de resistência expostos pelas bactérias. A

resistência bacteriana geralmente resulta em falha no tratamento, o que pode

acarretar em conseqüências graves, inclusive óbito (TENOVER, 2006).

Os microrganismos pertencentes a família Enterobacteriaceae são

importantes patógenos humanos, seja no meio ambiente e em ambientes

hospitalares, onde são causadores dos mais diversos tipos de infecção, tais como

infecções no trato urinário (ITU), pneumonias, septicemias e meningites. Tanto sua

patogenicidade quanto a alta incidência de resistência a antimicrobianos são fatores

preocupantes. (SADER et al, 2001).

16

1.1 Escherichia coli uropatogênica – UPEC

Escherichia coli é uma espécie da família Enterobacteriaceae, apresentando-

se como bastonetes, Gram negativos, facultativamente anaeróbios, móvel ou imóvel,

não-esporulado, capaz de fermentar a glicose com produção de ácido e gás

(SCHROEDER et al., 2002; FRANCO & LANDGRAF, 2002).

Trata-se de uma espécie bacteriana incrivelmente diversificada e com a

capacidade de colonizar e persistir em vários nichos, tanto no ambiente quanto no

hospedeiro. Tanto E. coli quanto outros microrganismos comensais da microbiota

intestinal de mamíferos, freqüentemente formam uma relação simbiótica benéfica

com seu hospedeiro, fornecendo nutrientes, regulação imune e proteção contra

patógenos externos (YAN & POLK, 2004). A maioria das amostras é constituída por

microragnismos comensais, contudo algumas cepas de E. coli podem assumir um

caráter mais patogênico, apresentando a capacidade de causar doenças graves,

tanto gastrintestinais quanto extra-intestinais no hospedeiro (KAPER et al, 2004).

De acordo com seus fatores de virulência e propriedades clinicas, cepas de E.

coli podem ser classificadas como patógenos comensais, intestinais ou extra-

intestinais (ABE et al, 2008). Cepas de E.coli que causam patologias no trato

intestinal são classificadas como E. coli diarreiogênica e cepas de E. coli causadoras

de infecções extra-intestinais, são chamadas de ExPEC – extraintestinal pathogenic

E. coli (KAPER et al, 2004). Dentro de cada um destes grandes grupos há conjuntos

de estirpes conhecidas como “patotipos” que compartilham de fatores de virulência

comuns e obtém semelhantes resultados em sua patogenicidade (MARRS et al,

2005). Vários patotipos de E.coli diarreiogênica dão origem a gastrenterites, mas

raramente causam doença fora do trato intestinal. ExPEC, ao contrário, mantém a

habilidade de existir no intestino sem nenhuma conseqüência, mas tem a

capacidade de se disseminar e colonizar outros nichos do hospedeiro, incluindo o

sangue, sistema nervoso central e o trato urinário, resultando em doença (TRAVIS

et al, 2008).

A capacidade de migrar e colonizar regiões periuretrais torna estas cepas

capazes de causar diversos tipos de infecção, fazendo desta, uma espécie

bacteriana muito versátil em sua patogenicidade (NATARO & KAPER, 1998).

17

Escherichia coli uropatogênica é freqüentemente associada com infecções do

trato urinário (ITU) e bacteremia em crianças e adultos, assim como sepse e

meningite em neonatos (RUSSO & JOHNSON, 2000). Compreendem a muitos

sorotipos, mas em torno de 75% destes pertencem a seis principais sorogrupos: O1,

O4, O6, O16, O18 e O25. Expressam diversos fatores de virulência, dentre os quais

adesinas (fímbrias), toxinas, proteínas fixadoras de ferro, antígenos O e K

(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005).

As infecções do trato urinário acometem principalmente mulheres e crianças

(KAPER et al, 2004). E. coli é um dos mais comuns microrganismos isolados tanto

de infecções simples ou casos mais graves de infecções no trato urinário

(YAMAMOTO, 2007).

Recorrentemente ou reincidivamente, as ITUs são especialmente

problemáticas em alguns indivíduos, pois algumas cepas de UPEC podem agir como

patógenos oportunistas, aproveitando-se do comportamento e susceptibilidade do

hospedeiro, empregando um repertório diversificado de fatores de virulência a fim de

colonizar o tato urinário.

Acredita-se que o principal reservatório de UPEC seja o trato intestinal

humano, responsável por causar ITU a partir de bactérias provenientes da região

retal do próprio indivíduo (RUSSO et al., 1995; JOHNSON & DELAVARI, 2002). Em

alguns casos, a disseminação de um único grupo clonal de cepas pode ocorrer

dentro de uma comunidade através de alimentos contaminados ou outros

consumíveis (MANGES et al, 2001). Além disso, UPECs isoladas de paciente

sexualmente ativas, freqüentemente correspondem a isolados fecais de seus

parceiros, indicando que ITUs podem ser sexualmente transmissíveis (FOXMAN et

al, 2002; JOHSON & DELAVARI, 2002).

Uma vez dentro do aparelho urinário, UPEC coloniza preferencialmente a

bexiga causando cistite, mas pode também ascender até os rins através dos

ureteres causando pielonefrite. Em resposta à violação do trato urinário,

normalmente estéril, por UPEC, são desencadeadas respostas inflamatórias no

hospedeiro, levando a produção de citocinas, afluxo de neutrófilos, esfoliação de

células epiteliais na bexiga e geração de compostos reativos de oxigênio e

18

nitrogênio, juntamente a outros compostos antimicrobianos (BOWER et al, 2005;

MULVEY et al, 2000).

Dados recentes informam a publicação da seqüência genômica de isolados

de cistite e pielonefrite. Apesar de haver muitas semelhanças entre os isolados de

UPEC, características genômicas que são especificamente exclusivas de UPEC

ainda não foram bem identificadas. Comparando estirpes laboratoriais de isolados

de E. coli comensais, UPECs aportam mais genes que codificam virulência a partir

de antígenos capsulares, sistemas de aquisição de ferro, adesinas e toxinas

secretadas. Estes genes são freqüentemente codificados dentro de regiões referidas

como ilhas de patogenicidade (PAI) com conteúdo nucleotídico distinto de resto do

genoma (HACKER & KAPER, 2000, LLOYD et al, 2007).

1.2 Fatores de virulência

O conceito de virulência implica em bactérias que provocam doenças e se

diferem da microbiota endógena. Estas diferenças são denominadas fatores de

virulência. Escherichia coli uropatogênica tem servido como modelo para o estudo

da virulência bacteriana devido a uma série de fatores como: o trato urinário é

normalmente estéril acima do nível uretral e respostas para infecções sediadas

nesta região do hospedeiro podem estar diretamente relacionadas com as

propriedades das bactérias; a infecção está associada a condições clínicas de

gravidades variadas como pielonefrite aguda, cistite aguda e infecção assintomática;

os efeitos a longo prazo de uma infecção no tato urinário variam desde nenhum até

uma cicatriz renal, hipertensão e até mesmo insuficiência renal. Além disso,

algumas propriedades bacterianas contribuem para a virulência, uma vez que

algumas cepas causadoras de infecção têm a capacidade de persistir no trato

urinário mesmo na ausência de defeitos no fluxo urinário. A capacidade de produzir

19

sintomas é uma característica de cepas causadoras de pielonefrite, mas não de

algumas envolvidas em bacteriúria assintomática (SVANBORG-EDEN et al, 1987).

A presença de certos fatores de virulência em cepas de E. coli causando

ITUs, corroboram na designação de UPEC. Dentre estes fatores, pode-se incluir

certos antígenos somáticos (especialmente O1, O2, O4, O6, O7, O15, O18, O25,

O75 E O83), antígenos capsulares (K1 e K2), habilidade de aderir a células

uroepiteliais através de fimbrias (P, S e tipo1) ou adesina afimbrial (afã), presença

de OmpT (outer-membrane protein), produção de toxinas (alfa hemolisina, fator

citotóxico necroSante – CNF1 e toxina serina protease autotransporter – sat) e

produção de sideróforos como aerobactina (ABE et al, 2008). Dois fatores de

virulência muito expressado por E. coli uropatogênica incluem hemolisina e fimbria P

(DREWS et al, 2005).

1.2.1 Adesinas

A colonização do trato urinário depende da capacidade das cepas de UPEC

de se vincular a tecidos e células hospedeiras. A aderência também estimula a

entrada de UPEC nas células epiteliais do hospedeiro, um processo que parece

promover a sobrevivência de UPEC dentro do trato urinário. Os principais fatores de

aderência codificados por UPEC e muitos outros microrganismos, são organelas

filamentosas adesivas conhecidas como pili ou fímbria. As organelas adesivas

comumente elaboradas por UPEC são fímbria tipo 1 , P, S e F1C codificadas pelos

genes fim, pap, sfa e operon foc, respectivamente (BOWER et al, 2005).

Fímbrias e adesinas como as do tipo 1, P (Pap; pilus associado a pielonefrite),

fímbria S (Sfa) mediam o ataque da bactéria às células uroepiteliais no inicio da

infecção (DE GRAAF & MOOI, 1986). Um destes agentes de adesão, os pili tipo1,

uma adesina manose-sensível, tem sido mostrado como o mais comum fator de

virulência expressado em UPEC (GUNTHER et al, 2001). Além disso, pili também

são comumente encontrados tanto entre cepas UPEC como não-UPEC

20

(YAMAMOTO et al, 1995). Já as fímbrias P são as mais bem estudadas e as mais

importantes adesinas em infecções do trato urinário superior. Têm sido

demonstrado que estas adesinas são encontradas em aproximadamente 80% das

cepas de E.coli provenientes de casos de pielonefrite (YAMAMOTO et al, 1995).

1.2.2 Toxinas

A utilização da secreção de toxinas por bactérias patogênicas é um

mecanismo bem reconhecido. A maior parte das UPEC não possuem sistema de

secreção tipo III, que alguns patógenos usam para injetar moléculas efetoras em

células hospedeiras, ao invés disso, costumas utilizar os sistemas de secreção tipo I

e tipo IV (HENDERSON et al., 2004).

A alfa-hemolisina (Hly-A) e o fator citotoxico necrozante (CNF1) são duas

toxinas bem conhecidas apontadas como as causadoras diretas de citoxicidade nos

tecidos do hospedeiro (KEANE et al, 1987; DE RYCKE et al, 1987). A alfa-

hemolisina é codificada por 50% das amostras de UPEC e sua expressão está

associada ao aumento da gravidade clínica em pacientes com ITU (JOHNSON,

1991; MARRS et al, 2005). HlyA é uma toxina cálcio-dependente que forma poros na

célula hospedeira, levando à lise celular quando níveis altos são atingidos. Está

geralmente localizada em ilhas de patogenicidade (PAI) de UPEC junto a fimbria P

e/ou CNF1 (HACKER & KAPER, 2000). O fator citotoxico necrosante é conhecido

por facilitar a sobrevivência de UPEC durante a resposta inflamatória aguda,

modulando a função de leucócitos polimorfonucleares, incluindo a regulação da

fagocitose (DAVIS et al, 2005). Alem disso, CNF tem sido demonstrado capaz de

matar as células uroepiteliais através da apoptose (MILLS et al, 2000).

21

1.2.3 Sideróforos e outros fatores

Sideróforos e outros fatores dependentes do ferro são essenciais para o

crescimento bacteriano. Estes sistemas de captação de ferro contribuem para

resistência bacteriana, sobrevivência e crescimento no hospedeiro. IroN é um

sideróforo essencial para o crescimento bacteriano, o mesmo tem sido mostrado por

ser mais prevalente em isolados de E. coli proveniente de ITU ou bacteremia do que

em isolados fecais (RUSSO et al, 1999). Alem deste, outros fatores como Cápsula

do grupo II (KpsMTII) e proteína de membrana externa (OmpT) também são

importantes na patogênese das ITU’s (BAUER et al, 2002; KANAMARU et al, 2003).

1.3 Antimicrobianos e Aquisição da resistência

A maioria dos agentes antimicrobianos utilizados atualmente na medicina

humana e veterinária são substâncias de baixo peso molecular que podem inibir o

crescimento de bactérias ou até mesmo matá-las, mesmo em baixas concentrações.

Os primeiros antimicrobianos utilizaram substâncias ou parentes próximos de

substâncias que eram produzidas por fungos ou bactérias do solo e forneceram uma

vantagem seletiva aos antimicrobianos produzidos na luta por recursos e nichos

ecológicos. Assim, bactérias têm entrado em contato com substâncias

antimicrobianas há um longo tempo, antes dos primeiros agentes antimicrobianos

serem introduzidos na prática clínica (SCHWARZ & CHASLUS-DANCLA, 2001).

O uso incorreto de antimicrobianos associado à seleção natural dos

microrganismos, provavelmente resultou no fenômeno da resistência, tanto na

medicina humana quanto na veterinária. A resistência a drogas está relacionada

22

aouso excessivo de antibióticos e às aplicações sub-terapêuticas de antimicrobianos

para a prevenção de doenças e para a promoção do crescimento e da eficiência

alimentar em animais de produção (MENG et al, 1998).

A pressão seletiva sobre as cepas bacterianas, favorece a preservação das

cepas que sofrem mutação genética para a resistência em relação às cepas

sensíveis. A disseminação desses agentes ocorre, particularmente, quando as

medidas básicas no controle das infecções não são respeitadas (PADOVEZE &

OLIVEIRA, 2000).

A aquisição de resistência pode ser cromossômica (aquisição de genes ou

mutações) e extra-cromossômica (plasmídios etransposons). Um fator agravante é a

existência, em muitas espécies de bactérias, de plasmídios transportando genes

codificando resistência a drogas – plasmídios R ou fatores R - e que podem, através

do fenômeno da conjugação bacteriana, se autotransferir entre bactérias da mesma

espécie, de espécies relacionadas e mesmo de diferentes gêneros. A mobilidade de

tais genes funciona como um mecanismo amplificador do fenômeno da resistência a

antibióticos. A existência de tais genes não somente permite como favorece a

sobrevivência e a multiplicação de bactérias patogênicas durante a antibioticoterapia

(KONEMAN et al, 2001)

Depois da introdução das sulfonamidas na metade até o final da década de

30 e da penicilina no início da década de 40, as companhias farmacêuticas

introduziram uma série de antimicrobianos para combater as infecções bacterianas,

cujo agente etiológico mostrava-se resistente aos primeiros antimicrobianos

utilizados. Estes antimicrobianos incluíam, no final da década de 50, as penicilinas

semi-sintéticas para tratar Staphylococcus aureus resistente à penicilina e, nas

décadas de 60 até 80, cefalosporinas e aminoglicosídeos para microrganismos em

infecções hospitalares, principalmente bacilos Gram negativos. (REESE et al, 2002).

As enterobactérias possuem comumente um único e grande plasmídio R que

codifica para a resistência a vários antibióticos (KONEMAN et al, 2001).

Antimicrobianos tais como trimetoprim-sulfametoxazol, fluoroquinolonas e

Cefalosporinas de terceira geração geralmente são recomendados no tratamento de

infecções provocadas por E. coli, com exceção das amostras produtoras de toxina

Shiga. (SCHROEDER et al, 2002).

23

Diversos microrganismos patogênicos podem agora desafiar antimicrobianos

aos quais eram previamente susceptíveis. Há diversos exemplos: resistência à

meticilina entre Staphylococcus aureus e espécies coagulase-negativas, resistência

à terceira geração de cefalosporinas entre Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e

Enterobacter sp., resistência ao imipenem, às quinolonas e aos aminoglicosídeos

entre Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, e espécies de

Acinetobacter. Além disso, as bactérias Gram negativas estão desenvolvendo uma

gama sempre maior de mecanismos de resistência. Um dos mecanismos mais

relatados e potencialmente importantes é emergência de cepas produtoras de beta-

lactamases de amplo espectro entre Klebsiella spp. e Escherichia coli,

possivelmente relacionados à pressão seletiva a partir do uso generalizado de

cefalosporinas de última geração. A descoberta de que cepas de Neisseria

gonorrhoeae e de Haemophilus influenzae haviam adquirido plasmídeos com

codificação de β-lactamase demonstrou que a resistência não era apenas um

fenômeno restrito aos patógenos das infecções hospitalares (MURRAY, 1992).

Estudos recentes sugeriram que o uso de tetraciclinas, drogas à base de

sulfas, (GUERRA et al, 2006) cefalosporinas e penicilinas parecem ser os maiores

responsáveis pelo aparecimento e disseminação de amostras de E. coli resistentes

aos antimicrobianos. Porém, existe uma grande escassez de informações existentes

a respeito de amostras de E. coli resistentes a partir de fontes não hospitalares,

especialmente a partir de fontes animais (SCHROEDER et al, 2002).

Diversos motivos tornam a resistência bacteriana um motivo de grande

interesse da medicina humana e veterinária. Essa resistência freqüentemente

resulta em falha do tratamento, a qual pode ter graves conseqüências,

particularmente em pacientes críticos. A terapia antibacteriana empírica inadequada,

definida como o uso inicial de um agente antibacteriano ao qual o patógeno

bacteriano responsável pela infecção não é sensível, tem sido associada com o

aumento da taxa de mortalidade em pacientes com septicemia devido a amostras

resistentes de Escherichia coli.

A resistência aos antimicrobianos é também um problema para a saúde

animal. A monitorização da resistência restrita exclusivamente a patógenos animais

(exemplo, Moraxella bovis, Actinobacillus pleuropneumoniae e Pasteurella

multocida) é pobre quando comparada com a fiscalização de enteropatógenos

24

zoonóticos. Laboratórios de diagnóstico veterinário tipicamente analisam amostras

clínicas de forma limitada, muitas vezes sem identificá-las (MCEWEN & FEDORKA-

CRAY, 2002).

O uso de agentes antimicrobianos tanto em animais como em humanos de

forma abusiva resultou em uma resistência emergente e na disseminação desses

patógenos multirresistentes, que podem ser transmitidos por animais a seres

humanos através da cadeia alimentar e pelo crescente estreitamento de relações

entre humanos e animais de companhia. (WEGENER, 2003)

Na atualidade, a resistência aos antimicrobianos constitui um dos maiores

desafios à saúde pública (BYARUGABA, 2004). O entendimento das propriedades

farmacodinâmicas dos agentes antimicrobianos proporciona uma melhor escolha,

adaptando-os corretamente à situação clínica. Deve-se ainda selecionar agentes

que atingem uma concentração inibitória mínima adequada a fim de reduzir o

desenvolvimento da resistência (WISE, 2003), posto que atualmente as doenças

bacterianas ainda são tratáveis em sua maioria, contudo com a progressão da

resistência, o conceito de doença bacteriana não tratável pode tornar-se uma

realidade (REESE et al., 2002).

Determinados eventos, capazez de alterar o conteúdo genético das

bactérias, podem ser extrínsecos ou intrínsecos. Mecanismos intrínsecos são

mutações pontuais ou amplificações genéticas enquanto, a transferência horizontal

de genes de resistência entre bactérias da mesma espécie ou não, através de

transposons, integrons ou plasmídeos são mecanismos adquiridos, o resultado

desse conjunto de modificações genéticas correspondem à introdução de novos

antibióticos, gerando determinantes de resistência que são freqüentemente

modificados (LIVERMORE, 2004). Uma vez isso tenha acontecido, a restrição no

uso dos antimicrobianos não resultaria na queda da resistência.

1.3.1 Resistência Intrínseca aos Antimicrobianos

25

A resistência aos antimicrobianos é considerada intrínseca quando espécies

são naturalmente resistentes a determinados antimicrobianos, sem que,

essencialmente, tenha havido alguma mutação genética, transferência de material

cromossômico ou pressão seletiva (WILLIAMSON et al, 1983). Podemos observar a

resistência intrínseca em diversos microrganismos, como por exemplo, a maioria das

enterobactérias são intrinsecamente resistentes à eritromicina, enquanto a maioria

dos estreptococos são resistentes aos aminoglicosídeos.

Um importante determinante de resistência intrínseca nos microrganismos é a

ausência do sítio de ligação do antimicrobiano. Penicilinas e cefalosporinas inibem

as enzimas transpeptidases, as quais estão envolvidas na polimerização dos

peptídeoglicanos durante a biossíntese da parece celular bacteriana. A membrana

externa dos microrganismos gram negativos, composta por uma densa camada

lipopolissacarídica, é um forte determinante de resistência intrínseca, pois diversos

antimicrobianos são incapazes de penetrar e atingir seu alvo. Esse mecanismo é a

base da resistência intrínseca das enterobactérias a eritromicina e também da P.

aeruginosa a diversos antimicrobianos (WEINSTEIN et al, 1980).

1.3.2 Resistência Adquirida aos Antimicrobianos

A resistência adquirida aos antimicrobianos tem sido atualmente, um

problema detectado em vários ambientes aquáticos, incluindo rios, esgosto, água

potável (OZGUMUS et al, 2007). O aumento da introdução de agentes

antimicrobianos através da terapêutica médica, agricultura e pecuária animal têm

resultado em pressões seletivas sobre as populações bacterianas (COL &

O'CONNER, 1987). A aquisição e transferência da resistência aos antimicrobianos e

fatores de virulência por bactérias através da transferência horizontal da resistência,

plasmídeos R, transposons, e integrons são problemas crescentes em doenças

infecciosas. Os integrons são capazes de mobilizar e integrar-se a cassetes gênicos

26

codificando determinantes da resistência aos antibióticos, como resistência a

trimetoprim, aminoglicosídeos, clorafenicol ou tetraciclinas. Estudos anteriores

demonstram que Integrons de classe I e/ou classe II foram relatados em isolados

clínicos da família Enterobacteriaceae (LEVERSTEIN-VAN HALL et al., 2001), em

bactérias alimentares (SUNDE, 2005) e no ambiente (ROE et al, 2003).

Além disso, outra condição crescente nos dias atuais e o uso abusivo desses

medicamentos, de forma inadequada e excessiva. O uso por longo prazo também é

outro fator importante por oferecer um risco mais elevado para a seleção de cepas

resistentes do que o uso por curto prazo ou a profilaxia (LIVERMORE, 1995).

Outros fatores que também são importantes para a disseminação da

resistência são os aspectos ambientais e sócio-econômicos, que também

contribuem para uma pressão seletiva, reforçando a capacidade da bactéria de

desenvolver resistência, pois tais condições estimulam mudanças no

comportamento bacteriano a fim de garantir sua sobrevivência.

1.3.3 Genética da resistência

Há diferentes mecanismos e caminhos através dos quais as bactérias podem

trocar informação genética. Plasmídeos, transposons e cassetes gênicos/ integrons

são distribuídos verticalmente durante a divisão da célula hospedeira, mas também

podem ser transferidos horizontalmente entre bactérias da mesma espécie ou

gênero e de espécies ou gêneros diferentes através de transdução, conjugação ou

da transformação (SCHWARZ & CHASLUS-DANCLA, 2001).

A transdução é um processo de transferência mediado por um bacteriófago,

também referidos como “ vírus-bacterianos”, que infectam bactérias por injeção de

seu DNA, que pode direcionar a produção de novas partículas na célula hospedeira

incluindo a expressão de genes, ou pode se integrar ao DNA cromossômico da

célula hospedeira e permanecer em estado inativo. A conjugação descreve a

autotransferência de um plasmídeo conjugativo ou um transposon de uma célula

27

doadora para uma célula receptora, e o contato entre o doador e o receptor é um

dos principais requisitos para a conjugação. A transformação descreve a

transferência de DNA livre para células competentes, sendo a principal forma de

introduzir plasmídeos em um novo hospedeiro sob condições in vitro. Já sob

condições in vivo, a transformação desempenha apenas um papel limitado na

transferência de genes de resistência (BENNETT, 1995).

Nem todos os genes de resistência que podem ser transferidos entre bactérias

são expressos ou até mesmo mantidos. Na realidade, parece haver alguns limites na

gama de genes de resistência que podem ser reunidos e expressos nas bactérias.

Entretanto, a capacidade das mesmas adquirirem genes de resistência de outros

microrganismos - incluindo aqueles que constituem a microbiota residente dos seres

humanos e dos animais - sob pressão seletiva do uso de agentes antimicrobianos,

não deve ser subestimada (LEUNG et al, 1997).

Outra forma de aquisição de resistência são as mutações, nas quais erros

podem levar a uma parcial ou completa deleção de genes individuais. Como

resultado, os alvos dos antimicrobianos podem ser alterados, drogas podem ser

inativadas e bombas de efluxo podem ser expressas ou suprimidas e o sistema de

difusão da droga (porinas e transportes ativos) pode ser perdido ou ativado. Genes

de resistência ou seus repressores podem também ser expressos ou suprimidos

pela aquisição de seqüências de inserção (LIVERMORE, 2004). Essas mutações

nos genes de resistência podem aumentar o espectro de atividade, como ocorre nas

ESBLs.

1.3.4 Bioquímica da resistência

Diversos mecanismos bioquímicos podem levar à resistência bacteriana,

dentre eles as bombas de efluxo, as enzimas modificadoras, as alterações no sítio

de ação dos antimicrobianos e as alterações na permeabilidade da membrana.

28

Algumas proteínas transportadoras encontradas tanto em bactérias Gram

negativas quanto em bactérias gram positivas, estão envolvidas na extrusão de

substratos tóxicos do interior da célula para o meio externo, sendo conhecidas como

bombas de efluxo. Estas podem ser específicas para um substrato ou podem

transportar uma gama de compostos estruturalmente diferentes (incluindo

antimicrobianos de diversas classes) podendo ser associadas a multirresistênciaàs

drogas (MDR). Embora os genes que codifiquem bombas de efluxo possam ser

encontrados em plasmídeos, a presença destes no cromossomo fornece à bactéria

um mecanismo intrínseco que permite a sua sobrevivência em ambientes hostis

como a presença de antimicrobianos (WEBBER & PIDDOCK, 2003).

A inativação de antimicrobianos é ocasionada por enzimas modificadoras que

promovem a inativação dos mesmos. Com isso, os antimicrobianos têm sua ação

neutralizada não exercendo sua função sobre os microrganismos alvo. Um

importante exemplo de enzimas modificadoras de antimicrobianos são as Beta-

lactamases de espectro estendido e as cloranfenicol acetilases. As beta-lactamases

de espectro estendido inativam os antimicrobianos β-lactâmicos através de hidrólise

enquanto as cloranfenicol acetilases inativam o cloranfenicol por acetilação

(TRABULSI & ALTERTHUM, 2002).

Tipicamente, o antimicrobiano tem como alvo um componente celular

bacteriano o qual é chamado sítio de ação. Alterações nos sítios de ação ocasionam

uma redução da eficácia do antimicrobiano sobre o microrganismo (WALSH et al,

1996).

Através do mecanismo de alteração na permeabilidade da membrana a

entrada do antimicrobiano na célula bacteriana é impedida, seja por uma mudança

na composição da membrana celular, ou por estruturas específicas da mesma. As

bactérias Gram negativas possuem uma membrana externa que promove uma

barreira efetiva contra pequenas moléculas, como os antimicrobianos. As bactérias

que possuem essa segunda membrana devem possuir um mecanismo que permita

a entrada dos nutrientes necessários. Para esse propósito, essas membranas

possuem proteínas chamadas de porinas, as quais produzem canais aquosos não

específicos de difusão através da membrana, provocando a saída dos

antimicrobianos da célula bacteriana. Esse tipo de mecanismo de resistência parece

ser o único mecanismo natural ou intrínseco que as bactérias apresentam. Contudo,

29

a perda de porinas não é um mecanismo eficiente para manter os antimicrobianos

do lado de fora da célula. Em Escherichia coli, por exemplo, somente aumenta a

MIC da tetraciclina em cinqüenta por cento, o que pode representar resistência

(NIKAIDO, 1994).

1.4 Multirresistência Bacteriana

A multirresistência normalmente resulta da acumulação de mutações

múltiplas e/ou presença de genes de resistência (nos integrons), mas crescimento

em sítios específicos (biofilmes) e mutações únicas (alterações na permeabilidade

da membrana ou expressão de sistemas de efluxo) também podem promover

multirresistência (POOLE, 2003).

Amostras multirresistentes já foram relatadas em diversos países. Grande

parte das amostras isoladas apresentava, concomitantemente, resistência à

tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, estreptomicina, fluoroquinolonas e trimetoprim-

sulfametoxazol (CHANG et al, 2000).

Talvez, o maior problema observado em amostras de E. coli multirresistentes

seja a disseminação da resistência às quinolonas e às fluoroquinolonas. Estudos

moleculares revelam que todas as amostras resistentes às quinolonas apresentam

mutações nos genes gyrA e parC, responsáveis pela codificação das enzimas DNA

girase e topoisomerase IV, respectivamente, mas pode haver mutações nos genes

gyrB e parE, porém com menor frequencia. Há ainda outros mecanismos de

resistência as fluoroquinolonas, como diminuição da produção de proteínas porinas

e a expressão de genes que codificam bombas de efluxo (YANG et al, 2004). A

presença de integrons, também está associada a multirresistência em bactérias

entéricas. Estudos relatam a presença de diversos integrons em amostras

multirresistentes de E. coli. Esses integrons continham genes de resistência aos

aminoglicosídeos, trimetoprim e β-lactâmicos (CHANG et al, 2000; YANG et al,

2004).

30

Devido à ausência de regras que regulamentem o uso correto dos

antimicrobianos, tanto na Medicina humana quanto na Medicina Veterinária na

maioria dos países em desenvolvimento, o uso de medicamentos se torna

inapropriado e abusivo, facilita a disseminação de microrganismos multirresistentes

acarretando conseqüências graves aos seres humanos e aos animais (YANG et al,

2004).

Torna-se fundamental a conscientização de todos sobre este problema e a

difusão dos conceitos de controle da resistência, que consistem no uso mais

cauteloso dos antimicrobianos em seres humanos e animais, dando abordagens

adequadas de orientação, programas de controle de antimicrobianos, administração

menos prolongada possível e uso de agentes de menor espectro. É importante

ressaltar a importância de diagnósticos mais rápidos e tratamentos imediatos com

antimicrobianos eficazes.

Em diversos países muitas estratégias tem sido utilizadas afim de otimizar o

controle de uso dos antimicrobianos, limitar a propagação de microrganismos

resistentes e tratar as infecções com o mínimo montante de antibióticos possível pra

efeito de cura. Esses programas envolvem métodos em comum, dentre os

quais:vigilância do uso de antibióticos e taxas de resistência, orientações para

otimizar o uso de antibióticos em tratamentos, educação de profissionais e da

população, prevenção e controle de infecção, com imunização, participação

financeira de indústrias na mobilização de recursos e desenvolvimento de

medicamentos, regulamentação de questões centrais, com restrição a prescrições e

à publicidade, auditoria com avaliação das intervenções, do cumprimento e feed

back médico e cooperação internacional (RAGHUNATH, 2008).

1.5 ESBL - Beta-lactamases de espectro estendido

31

Dentre as bactérias gram negativas, a produção de beta-lactamases de

espectro estendido é o mais importante mecanismo de resistência contra os agentes

beta- lactâmicos (SANDERS & SANDERS, 1992). As beta-lactamases são enzimas

que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico, impossibilitando, assim, a sua

atividade antimicrobiana. A prevalência crescente de amostras produtoras de beta-

lactamases de espectro estendido, ESBL, representa um impacto significativo na

prescrição de antimicrobianos, considerando-se que a produção dessas enzimas

constitui o principal mecanismo de resistência das enterobactérias (SADER et al,

2002). Membros da família enterobacteriaceae comumente expressam Beta-

lactamases codificadas por plasmídeos que conferem resistência às penicilinas, mas

não às cefalosporinas de amplo espectro (BUSH et al, 1995; LIVERMORE, 1995).

Pelo uso extensivo de antimicrobianos beta-lactâmicos de amplo espectro na

década de 1980, um novo grupo de enzimas logo nomeadas de Beta-lactamases de

espectro estendido (ESBL) foi detectado em cepas de Serratia marcescens e

Klebsiella pneumoniae na Alemanha (KNOTHE Et al, 2003). Mais tarde, essas

enzimas foram classificadas em dois grande grupos, não relacionados entre si,

embora algumas enzimas dos dois grupos, ajam sobre o mesmo substrato (o

antibiótico Beta-lactâmico), ligando-se a estes antibióticos em sítios completamente

distintos. Este grupo de enzimas foi primeiramente referido como resultado de genes

presentes em plasmídeos, como o TEM-1, TEM-2 e SHV-1, os quais sofreram

mutações semelhantes, resultando em substituições no aminoácido terminal e no

sítio ativo dessas enzimas. Essas mutações causaram modificações estruturais no

sítio ativo, ocasionando acréscimo de sua ação sobre as cefalosporinas. Como

resultado, sua ação não se restringe apenas às penicilinas e cefalosporinas de

primeira e segunda geração mas, também, sobre as cefalosporinas de amplo

espectro (oxiamino-cefalosporinas)( Cefotaxima, Ceftazidima, Ceftriaxona) e

monobactâmicos (Aztreonam). Os plasmídios que carregam os genes que codificam

a produção de ESBL geralmente contêm genes de resistência a outros

antimicrobianos, como aminoglicosídeos, sulfonamidas, tetraciclinas e cloranfenicol.

(SADER et al, 2002; STURENBURG & MACK, 2003).

As ESBLs podem ser bloqueadas por inibidores de Beta-lactamases como o

clavulanato, sulbactam e tazobactam. Contudo, são ineficazes contra a classe C

dessas enzimas, que também apresentam resistência a drogas não Beta-lactâmicas,

32

causando um grande problema na terapêutica a ser utilizada nesses casos. Apesar

de nos últimos anos, ter havido desenvolvimento de inúmeros fármacos com o

propósito de possuírem resistência à ação hidrolítica das Beta-lactamases, a

utilização indiscriminada desses fármacos também têm favorecido a seleção de

bactérias produtoras de ESBL (MEDEIROS, 1997).

A primeira mutação em ESBL foi a enzima denominada SHV-2, encontrada

em uma cepa de Klebsiella pneumoniae, na Alemanha em 1983 (LIVERMORE,

1995) e a primeira ESBL mutante identificada um ano depois em um hospital

universitário na França, a qual foi posteriormente caracterizada molecularmente

como TEM / CTX (SANDERS et al, 2000). A partir desses achados hospitalares, o

fenômeno tem se tornado cada vez mais comum, inclusive em ambientes

ambulatoriais. Além disso, ESBLs já foram encontradas em diversos gêneros de

enterobactérias, como em E. coli.

Atualmente as ESBLs representam o maior grupo de beta-lactamases

estudado mundialmente e têm sido motivo de extensivas investigações

microbiológicas, bioquímicas, genéticas e epidemiológicas (BUSH et al, 1995; REIS

et al, 1998; SADER & JONES, 1994)

As ESBL “clássicas” são enzimas codificadas por plasmídeos, como as

famílias: Temoniera (TEM), Sulfidril variável (SHV) e oxacilina (OXA). Dentro dessas

famílias maiores estão incluídas as duas primeira variantes de Beta-lactamases

identificadas (SIROT et al,1987). Embora essas variantes ainda se mantêm nos dias

atuais como as mais isoladas, nos últimos anos houve uma explosão no

aparecimento de outras ESBLs (CTX-M, PER, VEB, GES, TLA e BES). Como

resultado disso, mais de 370 variantes são conhecidas atualmente. (STURENBURB

et al, 2005)

As ESBLs têm mostrado variável expressão fenotípica. Enquanto uma ESBL

pode ter maior capacidade para hidrolisar drogas como a ceftriaxona ou a

cefotaxima, outra pode ter maior capacidade para hidrolisar a ceftazidima ou

aztreonam. A detecção laboratorial de cepas produtoras de ESBL é muito

desafiadora, pois são necessários múltiplos substratos de detecção específicos

(BUSH et al, 1995) De modo geral, os métodos de triagem se baseiam no padrão de

sensibilidade das amostras. Testes especiais têm sido designados especificamente

33

para a detecção e/ou confirmação da produção de ESBL. Entre estes testes estão o

teste de disco-difusão utilizando pontos de corte (breakpoints) indicativos da

produção de ESBL estabelecidos pelo CLSI, o teste de adição de ácido clavulânico

Oxoid (Basingstoke, Inglaterra) e o Etest ESBL Screen (AB Biodisk, Solna, Suécia).

Alguns relatos mostram que o ácido clavulânico é um inibidor mais potente do que

sulbactam para enzimas TEM e SHV com espectro ampliado. Desta maneira, o

ácido clavulânico é o composto mais utilizado nestes testes. (SADER et al, 2003).

A produção de ESBLs tem sido um problema, principalmente em K.

pneumoniae e, em menor grau em E. coli. Porém ESBLs foram encontradas em

Citrobacter diversus, C. freundii, E. cloacae. Enterobacter aerogenes, Proteus

mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, em várias espécies de Salmonella e Serratia

marcescens bem como K. oxytoca (SIROT et al, 1992, CHANAL et al, 1996).

Os microrganismos produtores de ESBL são usualmente encontrados no

ambiente hospitalar, principalmente em centros de tratamento intensivo (CTI).

Embora seu aparecimento venha aumentando em ambientes cirúrgicos, pediátricos,

neonatais, além dos oncológicos. Alguns estudos têm demonstrado a exitência de

fatores de risco independentes entre si, associados a produção de ESBL, dentre

eles destacam-se: o tempo de permanência do paciente em ambientes hospitalares,

principalmente em CTI; casos de hospitalização anterior, onde foram administrados

diversos antimicrobianos para erradicação de infecção (principalmente

cefalosporinas de amplo espectro); além da utilização procedimentos invasivos,

intubações e doenças severas (DALMARCO et al, 2006).

1.6 Infecção Hospitalar

A Infecção Hospitalar constitui um sério problema de saúde pública,

principalmente porque contribui para o aumento da taxa de morbidade e mortalidade

de pacientes hospitalizados, além de aumentar o tempo de internação destes

pacientes e conseqüentemente o custo do tratamento (JARVIS, 1987).

34

Pode ser considerada infecção hospitalar, toda aquela adquirida após

admissão do paciente, e que se manifesta durante a internação ou após a alta,

quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares.

Para ser considerada hospitalar a infecção: não deve estar presente ou em

incubação por ocasião da admissão; se estiver em incubação à admissão, deve

estar relacionada a prévia hospitalização na mesma instituição; se estiver presente

na admissão, deve estar temporalmente associada com prévia hospitalização ou a

um procedimento realizado em instituição de saúde. Estas infecções são geralmente

provocadas pela própria microbiota bacteriana humana, que se desequilibra com os

mecanismos de defesa imunológica em decorrência da doença, dos procedimentos

invasivos e do contato com a microbiota hospitalar (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA

SAÚDE, 2007).

Dentre as ExPEC, cepas de UPEC são mais comumente associadas a

doenças humanas. Essas bactérias são a principal causa de ITU na comunidade e

uma grande porção de ITU hospitalar, representando uma porção substancial nos

custos médicos e em morbidade mundial (FOXMAN, 2003).

A ITU representa o principal tipo de infecção hospitalar e é uma das principais

causas de consulta na prática médica, com cerca de 40% dos processos infecciosos

nosocomiais e a grande maioria das ITUs são causadas por bactérias (TORTORA et

al, 2002). O estabelecimento da etiologia das ITU tem demonstrado que a

enterobactéria Escherichia coli permanece o uropatógeno predominantemente

isolado em comunidades com casos de infecções agudas, seguida da prevalência

de Klebsiella, Enterobacter e Proteus (GRUDE et al, 2001).

É importante conhecer o modo de disseminação das bactérias

multirresistentes, e isto pode ser feito através de uma avaliação microbiológica.

Quando se sabe o modo de disseminação da bactéria, podem ser tomadas medidas

de controle mais adequadas (RAVANELLO, 2003). Merecem atenção especial os

CTI´s que são considerados epicentros de resistência bacteriana, sendo a principal

fonte de surtos de bactérias multirresistentes (TEIXEIRA et al, 2004).

Existem várias medidas para minimizar a infecção hospitalar e o surgimento

de resistência a antimicrobianos, mas as duas medidas fundamentais são: medidas

de barreira e higiene, para evitar a transmissão de bactérias de um paciente para o

35

outro e o uso adequado de antibióticos para dificultar o surgimento de

microrganismos multirresistentes (SADER, 2003). A maioria dos trabalhos acerca do

isolamento e identificação de cepas bacterianas multirresistentes foi realizada em

pacientes hospitalizados, entretanto, acredita-se que microrganismos resistentes

possam ser agentes de infecções de trato urinário, também na comunidade.

1.7 Epidemiologia molecular

Os mecanismos genéticos envolvidos na resistência são diversos e sua

disseminação é possível graça a alta eficiência de sistemas de transferência de

elementos genéticos móveis (SCHWARZ & CHASLUS-DANCIS, 2001) Nos últimos

anos, tem sido estabelecida a importância dos Integrons – sistemas móveis de

expressão genética - na disseminação de resistência em E.coli (GUERRA et al,

2003; WHITE et al, 2002). A caracterização destes mecanismos de resistência

proporciona informações adicionais acerca da importância epidemiológica da

resistência antimicrobiana, uma vez que estudos anteriores já demonstraram que foi

encontrada 76% de resistência em isolados de E.coli estudados, com uma

prevalência de 72% de multirresistência (GUERRA et al, 2006).

Métodos genotípicos como a determinação do perfil plasmidial, ribotipagem,

avaliação do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP), amplificação de

segmentos do DNA utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a análise

da fragmentação do DNA, após digestão com enzimas de restrição, através de

eletroforese em gel de campo pulsado (Pulsed-field Gel Electrophoresis) são

recomendados para tipagem de microrganismos com propósitos epidemiológicos.

Estes métodos são menos sujeitos a variações e apresentam maior poder

discriminatório e reprodutibilidade, e em alguns casos permitem estabelecimento de

banco de dados para caracterização dos microrganismos (BELKUM et al, 2001).

A utilização de técnicas moleculares é de relevante importância nos estudos

de amostras de Enterobactérias, uma vez que permitem estabelecer o grau de

36

similaridade entre as mesmas, possibilitando a caracterização de surtos de infecção,

a detecção de possíveis fontes de transmissão e os aspectos epidemiológicos de

disseminação.

37

2. Objetivo Geral

Caracterizar comparativamente os perfis de virulência e resistência

antimicrobiana de amostras de Escherichia coli isoladas de infecções do trato

urinário de humanos e de cães.

2.1 Objetivos Específicos

Determinar diferenças fenotípicas no perfil de resistência bacteriana entre

amostras de ITU humanas e caninas.

Comparar a ocorrência de ITU por UPEC em amostras provenientes de

pacientes ambulatoriais e de pacientes internados.

Detectar a produção de beta-lactamases de espectro estendido em amostras

de UPEC de origem humana e de origem canina.

38

Identificar a presença de genes de virulência e resistência em amostras de

UPEC isoladas de humanos e de cães.

Comparar o perfil de virulência e de resistência bacteriana em amostras de

origem humana e canina.

39

3. Material e Métodos

3.1 Amostras clínicas

Foram estudadas 100 amostras de Escherichia coli isoladas de infecção

urinária de humanos e de cães. As amostras humanas de pacientes internados e

ambulatoriais (n=50) foram oriundas de Hospital Universitário Antônio Pedro,

Niterói/RJ, no período de dezembro de 2007 a agosto de 2008. As amostras caninas

(n=50) foram fornecidas pelo Laboratório Veterinário Laborlife no mesmo período.

Este projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Medicina / UFF e aprovado para utilização das amostras humanas

(CEP – CAAE- 0003.0.258.000-08).

40

3.2 Confirmação da pureza e identificação das amostras

As amostras foram semeadas e incubadas a 35ºC durante 24 horas em Ágar

Cled. Após o crescimento, as colônias típicas foram semeadas nos meios Ágar TSI -

Triplo Açúcar e Ferro (HIMEDIA-Munbai, Índia), Ágar SIM - Sulfato Indol Motilidade,

e Ágar Citrato de Simmons (MERCK-Darmstadt, Alemanha) para a confirmação

bioquímica correspondente à espécie: fermentação da glicose (com produção de

gás) e lactose, ausência de produção de H2S, produção de indol, mobilidade e

ausência de utilização de citrato..

3.3 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos

Amostras clínicas de humanos e cães foram avaliadas pelo método de

difusão em disco para testar a sensibilidade aos antimicrobianos, utilizando-se

critérios aprovados pelo CLSI. A determinação da susceptibilidade bacteriana a um

agente patogênico, é particularmente importante na seleção do antimicrobiano mais

apropriado ao tratamento de determinada doença. O teste de Difusão em Disco ou

antibiograma constitui um dos métodos utilizados com este objetivo. Este método

consiste na colocação de discos com concentrações conhecidas de determinado

antimicrobiano, na superfície de uma placa contendo um meio sólido apropriado

(Agar Mueller Hinton) e previamente inoculado com o microrganismo cuja

susceptibilidade se pretende testar. O antimicrobiano difunde-se a partir do disco

para o meio, formando um gradiente de concentração que decresce desde o

perímetro do disco até distâncias mais elevadas. Os microrganismos multiplicam-se

exponencialmente em toda a superfície da placa, à exceção das zonas à volta do

disco impregnado do antimicrobiano ao qual são sensíveis. As zonas em que o seu

crescimento é inibido ou a sua morte são provocadas pela concentração do

antimicrobiano, tornam-se visíveis através de uma zona clara que rodeia o disco e a

41

que se dá o nome de halo de inibição ou zona de inibição. Foram utilizados discos

comerciais de acordo com as normas de procedimento do CLSI, 2007. Os

antimicrobianos testados de uso humano foram Ácido Nalidíxico, Imipenem,

Cefepime, Cefoxitina, Ceftriaxona, Cefalotina, Amoxilina-ácido-clavulânico,

Aztreonama, Ampicilina, Sulfametoxazol, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Amicacina,

Gentamicina, Tobramicina e Tetraciclina. Os antimicrobianos testados de uso

exclusivamente veterinário serão Enrofloxacina, Florfenicol e Ceftiofur (SENSIFAR-

São Paulo, Brasil). As amostras utilizadas como controle dos TSAs foram E. coli

ATCC25922 e E. coli ATCC35218.

3.4 Detecção de amostras produtoras de ESBL

As amostras humanas e caninas que apresentaram resistência aos β-

Lactâmicos, principalmente às Cefalosporinas e aos Monobactâmicos foram

testadas para a produção de ESBL. (amostra controle: Escherichia coli ATCC

25922). O método de triagem utilizado foi de disco-aproximação (figura 1), um teste

muito utilizado, uma vez que pode ser realizado em qualquer laboratório de

microbiologia. Também conhecida como “Double-disc synergism”, neste teste utiliza-

se no centro de uma placa (150 mm) de ágar Muller-Hinton, previamente inoculada

com a cepa a ser estudada ajustada para a escala 0.5 de Mc Farland e coloca-se no

centro do ágar um disco de amoxacilina/ ácido clavulânico e, ao redor deste, os

antimicrobianos marcadores (Cefoxitina, Aztreonam, Ceftazidima e Cefoxitina) na

distância de 20 a 30 mm de centro a centro, em relação ao disco central Após

incubação por 18 a 20 horas de 33 a 35º.C, deve ser procedida a leitura dos halos. A

formação de uma zona fantasma “Ghost Zone” entre qualquer antimicrobiano

marcador e o disco contendo ácido clavulânico é positiva para presença de ESBL

(SOUZA JÚNIOR et al, 2004)).

Para realização deste teste foram utilizados os seguintes antimicrobianos:

- Ácido clavulânico: amoxacilina + ácido clavulânico

42

- Monobactâmico: Aztrenama

- Cefalosporina de 3ª geração: Cefotaxima

- Cefalosporina de 3ª geração: Ceftazidima

- Cefalosporina de 4ª geração: Cefepime

Figura 1: Exemplificação da metodologia de Disco Aproximação.* Escherichia coli produtora da ESBL. AMC = Amoxacilina + Ácido Clavulânico; CTX = Cefotaxima; ATM = Aztreonam; CAZ = Ceftazidima; CPO = Cefpodoxima. A seta negra, demonstra o aparecimento do fenômeno conhecido como Zona Fantasma “Ghost Zone”, que

caracteriza a produção de ESBL pela cepa bacteriana isolada (DALMARCO et al, 2006).

3.5 Sorotipagem

Os isolados positivos para ESBL no teste fenotípico foram submetidos à

sorotipagem para identificação do antígeno somático (O) e do antígeno flagelar (H).

Esta etapa foi realizada em colaboração com a Dra. Kinue Irino e sua equipe no

laboratório de Enterobactérias do Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo.

43

3.6 Produção de hemolisina

A partir do estoque à -20ºC, as amostras foram inoculadas TSB e incubadas a

37ºC por 6 horas. Após esse período, o crescimento uma alíquota do crescimento foi

semeado em forma de spot (5µl em cada quadrante) em placas de Agar sangue

Triptose (HiMedia, Mumbai, Índia), suplementado com CaCl2 a 10 mM e 5% de papa

de hemácias previamente lavadas 3 vezes em PBS, obtidos de sangue desfibrinado

de carneiro. As placas foram incubadas a 37ºC e foram realizadas leituras após 3

horas da inoculação e após 18 horas da inoculação para detecção de α-hemólise e

entero-hemólise respectivamente (BEUTIN, 1991).

Os controles utilizados para os testes e também inoculados às placas com as

amostas foram U441 – α hemólise, EC784 – entero-hemólise e C600 – negativo)

3.7 Seleção das amostras para avaliação do perfil genotípico

Para realização das PCRs a fim de determinar o perfil genotípico da virulência

e da resistência, foram selecionadas amostras representativas através dos seguintes

critérios. Primeiramente as amostras foras agrupadas em relação à resistência aos

antimicrobianos da seguinte forma: resistentes a 1 classe, resistentes a 2 classes,

resistentes a 3-4 classes, resistentes a 5-7 classes e resistentes a 8-10 classes. A

partir desse agrupamento, a seleção das amostras obedeceu aos seguintes critérios:

um mínimo de duas amostras por grupo; em grupos de até dez amostras foram

selecionadas cinco amostras; em grupos de mais de dez amostras foram

selecionadas 50% do número total de amostras; a seleção das amostras ocorreu de

modo aleatório, por sorteio.

44

3.8 Obtenção do DNA molde de isolamentos

As amostras isoladas em estoque foram inoculadas em 2mL de TSB e

incubadas à 37ºC por 4-6 horas sob agitação. Foram semeados em meio TSA e

novamente incubados 37ºC por 4-6 horas. Um raspado do crescimento foi

ressuspenso em 200µL de PBS, posteriormente foi aquecido por 10 minutos à 100ºC

e sofreu rápida centrifugação (spin). O DNA extraído foi utilizado na pesquisa por

fatores de virulência e de resistência através da reação em cadeia da polimerase. O

tempo entre as extrações e a sua utilização em reações foi em média de 15-20 dias.

3.9 Caracterização genotípica da virulência e da resistência

Ensaios de PCR foram realizados para amplificação dos genes pap, afa, sfa,

HlyA, Cnf1, KpsMTII, FimH, blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, rmtB, drfA17 e blacmY.

As amplificações foram executadas em dois termocicladores modelos PTC

100 (MJResearch, Watertown, MA, EUA) e Multi Gene II / TC050A (Labnet

Inetrnation, Edison, NJ, EUA). Os iniciadores e os protocolos para as reações de

PCR utilizados são apresentados na tabela 1.

As seguintes amostras de E.coli foram utilizadas como controles positivos:

J96 (pap), KS52 (afa), RS218 (Kps), U4-41 (hlyA) e MR219 (cnf). Devido à ausência

controles positivos para os demais genes, as amostras consideradas positivas em

testes fenotípicos foram testadas através das PCRs para estes genes e resultados

positivos ou negativos após três ensaios foram considerados válidos.

45

A amostra DH5α foi utilizada como controle negativo em todas as reações,

exceto para o gene fimH, para o qual foi utilizada a amostra EPEC atípica 2.3 da

coleção do laboratório de enteropatógenos do MIP/UFF.

Os reagentes utilizados nas reações de amplificação foram do fabricante

Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) e suas concentrações de acordo com as referências.

3.10 Eletroforese em gel de agarose

O produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose

(Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 1% em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE; Tris-base

89mM, ácido bórico 89mM, EDTA 2mM). A corrida eletroforéica foi feita no mesmo

tampão e a voltagem utilizada foi de 100V mantendo-se a amperagem em torno de

100mA, por 50 minutos utilizando fonte modelo EPS250 (CBS, Scientific Company,

DelMar, CA, EUA) e cuba modelo MGU-502T (CBS, Scientific Company, DelMar,

CA, EUA) .. Nos “slots” do gel foram aplicados os controles, os amplicons e o

marcador de peso molecular (1 kb plus DNA ladder; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA),

sendo este adequado para mapear fragmentos de DNA fita dupla de 100 pb a 12 kb.

Concluída a corrida eletroforética, o gel foi retirado da cuba e corado com brometo

de etídio e visualizado em transiluminador UV modelo TCX 26.M (Vilber Lourmat,

Marne-la-Vallée, França).

46

Gene Descrição Primer Sequëncia Temperatura de

anelamento

Tamanho Referëncia

blacmy-2 / blacmy-7

Resistencia cefalosporinas

cmy25f-1 CAA TGT GTG AGA AGC AGT C 50ºC 1432bp Sidjabat et al, 2006.cmydr-1 CGC ATG GGA TTT TCC TTG CGT

drfA17 Resistência trimetoprim drfa17-f GAA CCT TGA CCG AAC GC 50ºC 454bp Sidjabat et al, 2006.drfa17-r GTT GCG GCT TTG TGG AAT AC

rmtB Resistencia aminoglicosideos rmtB-fw ATG AAC ATC AAC GAT GCC CT

55ºC 769bp Yan et al, 2004.

rmtb-rv CCT TCT GAT TGG CTT ATC CAblaSHV ESBL s1 ATG AGT TAT ATT AGA ATG GT 58ºC 860bp Wiegand et al, 2007;

Fu et al, 2007.s2 GTT AGC GTT GCC AGT GCT CGblaCTX-M ESBL ctx-ma CGC TTT GCG ATG TGC AG 54ºC 550bp Wiegand et al, 2007;

Bonnet et al, 2003.ctx-mb ACC GCG ATA TCG TTG GTblaTEM Resistencia a

Ampicilina ;ESBLt1 ATT CTT GAA GAC GAA AGG GCC TC 55ºC 1100bp Wiegand et al, 2007.t3 TTG GTC TGA CAG TTA CCA ATG C

kpsMTII Gene capsular associado a aderência em casos de

cistite

kpsII-r GCG CAT TTG CTG ATA CTG TTG 63ºC 272bp Johnson & Stell, 2000; Tiba et al, 2008..

kpsII-f CAT CCA GAC GAT AAG CAT GAG CAfimH Fimbria tipo 1 fimH-f AAC AGC GAT GAT TTC CAG TTT GTG TG 60ºC 465bp Usein et al, 2001.

fimH-r ATT GCG TAC CAG CAT TAG CAA TGT CCCnf1 Fator necrozante

citotoxicocnf-s TTA TAT AGT CGT CAA GAT GGA 50ºC 693bp Eric Oswald (personal

comunication); Usein et al 2001.cnf-as CAC TAA GCT TTA CAA TAT TGA

Afa1 adesina afa-1 GCT GGG CAG CAA ACT GAT AAC TCT C 65ºC 750bp Le Bouguenec et al, 1992.afa-2 CAT CAA GCT GTT TGT TCG TCC GCC G

hlyA Alfa hemolisina hlyA-f16 CAG TCC TCA TTA CCC AGC AAC 52,6 ºC 355bp Beutin et al, 2004.hlyA-b14 ACA GAC CCC TTG TCC TGA AC

pap Pilus associado a pielonefrite

pap1 GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G 65ºC 328bp Le Bouguenec et al, 1992.pap2 ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A

Tabela 1 - Primers utilizados para detecção de genes de virulência e resistência

47

3.10 Extração Plasmidial

Os genes que conferem resistência aos antimicrobianos comumente estão

contidos em Plasmídeos que podem ser transferidos a outras bactérias. Baseado

nisso, a determinação do perfil plasmidial é um importante parâmetro na avaliação

do perfil de resistência bacteriana, sugerindo se esta é cromossômica ou adquirida.

Os isolados foram submetidos à extração plasmidial através do método

descrito por (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). As amostras foram cultivadas em 2

mL de TSB em tubos 16x100 por 18-24 horas à 37ºC sob agitação constante de

150rpm. Uma alíquota de 1,5 mL foi transferida para um microtubo e centrifugada, à

4ºC, por 30 segundos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi aspirado, de forma a não

deixar resíduos de meio no microtubo e o “pellet” ressuspenso em 100 µL de

solução I (Glicose 50 mM; Tris-HCl [pH 8,0] 25 mM; NaEDTA [pH 8,0] 10 mM)

gelada (mantida em gelo) e homogeneizado em vortex. Depois de completa

dispersão do “pellet”, 200 µL de solução II (NaOH 0,2N; SDS 1% [p/v]), recém

preparada, foram adicionados. Os microtubos foram agitados cinco vezes por

inversão rápida e mantidos em gelo por 10 minutos. Após este tempo, 150 µL da

solução III (Acetato de Sódio 3M pH 4,8) gelada, foram adicionados e os tubos,

novamente, agitados 5 vezes por inversão rápida, mantendo-os no gelo por 5

minutos. Os microtubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos à 4ºC. Uma

alíquota de 450 µL do sobrenadante límpido foi transferida para novo microtubo com

900 µL de etanol absoluto (temperatura ambiente) e levada ao vortex, sendo deixada

em repouso por 2 minutos. Centrifugou-se os microtubos a 14.000 rpm por 5 minutos

e todo o sobrenadante foi removido. Um mililitro de álcool 70º GL foi adicionado ao

“pellet” e a suspensão foi homogeneizada por inversão rápida cinco vezes.

Posteriormente, os microtubos foram submetidos à nova centrifugação a 14.000 por

dois minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e os microtubos, deixados abertos

em temperatura ambiente, por 5-10 minutos, para evaporação do álcool. Para

dissolver o DNA, foram adicionados 50 µL de tampão TE (Tris 10mM; EDTA 1 mM;

pH 8,0) e os microtubos, levados ao vortex em baixa rotação para uma suave

homogeneização. O material extraído foi conservado à -20ºC.

48

As amostras controles R23 (não carreadora de plasmidios) e R861

(plasmídios de 4,3; 22; 39 MDa (baixo peso molecular) e 91 MDa (alto peso

molecular)) foram submetidas à extração junto com os isolados.

Para corrida de eletroforese em gel de agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA,

EUA) a 0,8% em tampão TBE (Tris-Borato-EDTA; pH 8,2), uma alíquota de 15 µL da

solução de DNA foi misturada a 5 µL de corante Azul de Bromofenol e

homogeneizada. Nos poços do gel, foram adicionados 15 µL da mistura e a corrida

foi realizada a 80V até o corante atingir a parte inferior do gel, que, posteriormente,

foi corado com brometo de etídio e visualizado em transiluminador U.V.

49

4. Resultados

4.1 Perfil das amostras de origem humana

As amostras humanas obtidas no Hospital Universitário Antônio Pedro,

localizado no município de Niterói, foram analisadas segundo alguns critérios, dentre

os quais: o sexo dos pacientes, onde predominaram amostras coletadas de

pacientes do sexo feminino (84%), frente a apenas 16% de amostras de pacientes

do sexo masculino (tabela 2).

A idade dos pacientes foi mais um dos fatores analisados. Pode-se observar

que a maioria das amostras (46%) foi proveniente de pacientes acima de 50 anos,

ou seja, acima de meia-idade. Já os pacientes na idade adulta entre 26 e 50 anos

totalizaram 34% das amostras e as crianças foram a minoria, com apenas 20% do

total recolhido. (tabela 3)

Segundo o local de precedência do paciente no HUAP, obtivemos 58% de

amostras de pacientes ambulatoriais e 42% de amostras oriundas de pacientes

internados no Hospital (tabela 4).

50

Tabela 2 – Características dos pacientes dos quais foram obtidas as amostras UPEC em relação ao sexo do paciente

Sexo Numero de amostras Total %

Feminino 42 84%

Masculino 8 16%

Tabela 3 - Características dos pacientes dos quais foram obtidas as amostras UPEC em relação à idade do paciente

Idade Numero de amostras Total%

0 a 25 anos 10 20%

26 a 50 anos 17 34%

Acima de 50 anos 23 43%

Tabela 4 - Características dos pacientes dos quais foram obtidas as amostras UPEC em relação a localização do paciente

Localização Numero de amostras Total%

ambulatório 29 58%

internados 21 42%

51

4.2 Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Dentre as amostras humanas os maiores índices de resistência foram para os

antibióticos Ampicilina ([aminopenicilina] 68%), Cefalotina ([cefalosporina de 1ª

geração] 78%) e Amicacina ([aminoglicosídeo] 66%). Não foi observada resistência

ao antibiótico Imipenem (Ccrbapenêmico) (Figura 2; Tabela 5).

Pode-se observar ainda, que foi encontrada resistência aos antibióticos de

uso veterinário testados para as amostras humanas, dentre estes Ceftiofur (34%,)

Enrofloxacino ( 38%) e Florfenicol ( 24%).

R e sis tê n c ia a A n tim ic r o b ia n o s - A m o s tr as H u m an as

0 %

1 0 %

2 0 %

3 0 %

4 0 %

5 0 %

6 0 %

7 0 %

8 0 %

9 0 %

Ampicilina

Amoxacilina

Cefalotina

Cefoxitin

a

Ceftriax

onaCefti

ofur

Cefepime

Aztreonama

Imipenem

Amicacin

a

Gentamicina

Tobramicina

Ciprofloxacin

o

Enroflox

acino

Clorafenico

l

Florfen

icol

Tetraci

clina

Trimeto

prin + sulfa

Ác. Nalidíxico

A ntib ióticos

Resis

tência

Figura 2 - Resistência aos antimicrobianos em amostras humanas

52

Tabela 5 - Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia coli uropatogênica isoladas no Hospital Universitário Antonio Pedro (HUAP), 2007-2008.

Antibióticos Cepas resistentes

Nº %

Ampicilina 34 68%

Amoxacilina 15 30%

cefalotina 39 78%

Cefoxitina 6 12%

Ceftriaxona 11 22%

Ceftiofur 17 34%

Cefpime 9 18%

Aztreonama 2 4%

Imipenem 0 0%

Amicacina 33 66%

Gentamicina 17 34%

Tobramicina 17 34%

Ciprofloxacino 21 42%

Enrofloxacino 19 38%

Clorafenicol 17 34%

Florfenicol 12 24%

Tetraciclina 24 48%

Trimetiprin + sulfa 32 64%

Ácido nalidíxico 17 34%

53

Dentre as amostras caninas os maiores índices de resistência foram para os

antibióticos: Ácido nalidíxico ([quinolona] 64%), Cefalotina ([cefalosporina de 1ª

geração] 58%) Tetraciclina (46%) e Ampicilina ([aminopenicilina] 44%). Assim como

nas amostras humanas, não foi observada resistência ao antibiótico Imipenem

(Carbapenêmico). Os Antibióticos de uso veterinário Ceftiofur, Enrofloxacino e

Florfenicol obtiveram índices baixos de resistência, sendo eles 16%, 30% e 14%

respectivamente. (Figura 3; tabela 6)

R e s i s t ê n c i a a A n t i m i c r o b i a n o s - A m o s t r a s C a n i n a s

0 %

1 0 %

2 0 %

3 0 %

4 0 %

5 0 %

6 0 %

7 0 %

Ampicilina

Amoxacilin

a

Cefalotina

Cefoxitin

a

Ceftriaxona

Ceftiofur

Cefepime

Aztreonama

Imipenem

Amicacina

Gentamicina

Tobramicina

Ciprofloxacin

o

Enrofloxacin

o

Clorafenicol

Florfenicol

Tetracicl

ina

Trimetop

rin + sulfa

Ác. Nalidíxic

o

A n t ib ió tic o s

Resis

tência

Figura 3: Resistência aos Antimicrobianos em amostras caninas.

54

Tabela 6- Perfil de suscetibilidade de amostras (n=50) de Escherichia coli uropatogênica isoladas no Laboratório Veterinário Laborlife. 2007-2008.

Antibióticos Cepas resistentes

Nº %

Ampicilina 22 44%

Amoxacilina 7 14%

Cefalotina 29 58%

Cefoxitina 4 8%

Ceftriaxona 8 16%

Ceftiofur 8 16%

Cefpime 14 28%

Aztreonama 4 8%

Imipenem 0 0%

Amicacina 16 32%

Gentamicina 6 12%

Tobramicina 15 30%

Ciprofloxacino 17 34%

Enrofloxacino 15 30%

Clorafenicol 13 26%

Florfenicol 7 14%

Tetraciclina 23 46%

Trimetiprin + sulfa 17 34%

Ácido nalidíxico 32 64%

55

4.3 Avaliação da Multirresistência

Após a realização dos antibiogramas das amostras humanas e caninas

podemos determinar um perfil de multirresistência entre as mesmas, sendo

consideradas multirresistentes as amostras que apresentaram resistência a duas ou

mais classes de antibióticos (Tabela 7; Tabela 8).

Como já era esperado, o índice de multirresistência foi maior em amostras de

origem humana do que em amostras de origem canina, com índices de 94% e 74%

dos totais individuais de 50 amostras, respectivamente. (Figura 4)

Resistência em amostras humanasQuantidade de

amostras Porcentagem

Não apresentaram resistência 1 2%

Resistentes a 1 classe 2 4%

Resistentes a 2 classes 6 12%

Resistentes a 3-4 classes 12 24%



Resistência em amostras caninasQuantidade de

amostras Porcentagem

Não apresentaram resistência 9 18%

Resistentes a 1 classe 4 8%

Resistentes a 2 classes 5 10%




Tabela 8 - Classificação da resistência das amostras UPEC de origem canina acordo com as classes de antimicrobianos testados.

Tabela 7 – Classificação da resistência das amostras UPEC de origem humana de acordo com as classes de antimicrobianos testados.

56

Figura 4 - Frequencia de Multirresistência em amostras humanas e caninas

Multirresistência

94%

74%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Amostras Humanas

Amostras Caninas

Amostras

%

57

4.4 Perfil Plasmidial

A fim de detectar e presença de plasmídeos foi realizada a extração

plasmidial das amostras consideradas multirresistentes segundo o método de

SAMBROOK & RUSSEL, 2001. (Figura 5).

Pode-se observar que a presença da plasmídeos de baixo peso molecular foi

mais freqüente do que a presença de plasmídeos de alto peso molecular tanto em

amostras UPEC de origem humana quanto em amostras caninas. A presença de

plasmídeos foi mais comum em amostras de UPEC provenientes de humanos,

principalmente associadas a presença de mutirresistência dessas amostras.

Nas amostras de UPEC de origem humana foi detectada a presença de

plasmídeos de alto peso molecular (72%) e de baixo peso molecular, sendo mais

freqüente a presença dos plasmídeos de baixo peso molecular (84%)em número de

dois ou três plasmídeos na mesma amostra, como por exemplo, nas amostras H12,

H15, H46 dentre outras descritas (Tabela 9) .

A frequência de plasmídeos de baixo peso molecular também bastante

elevada em amostras caninas (84%), nas quais se pode notar também a presença

de dois e/ou três plasmídeos em uma única amostra, embora este fato tenha

ocorrido com menor frequencia do que nas amostras de humanos (Tabela 10).

58

Tabela 9: Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC humanas

Amostras humanas Pasmídeos alto peso Plasmídeos baixo peso

H1 0 1H2 0 2H3 1 1H4 1 1H5 1 3H6 1 2H7 1 1H8 1 3H9 0 1

H10 1 1H11 1 1H12 0 3H13 0 1H15 1 3H16 1 1H18 1 1H19 1 1H20 1 1H21 0 1H22 1 1H23 1 1H24 0 1H25 1 3H26 1 1H27 1 1H28 1 0H29 1 3H30 1 1H31 1 1H33 0 0H34 0 0H35 1 1H36 1 1H37 1 0H38 0 0H39 1 1H40 0 1H41 1 2H42 1 2H43 1 1H44 0 0H45 0 0H46 1 2H47 1 1H48 1 1H49 1 1H50 0 0

59

Tabela 10: Perfil de extração plasmidial de amostras UPEC caninas

Amostras caninas Pasmídeos alto peso Plasmídeos baixo pesoA2 0 1A3 0 0A4 0 1A5 1 1A6 1 1A7 0 0A8 0 3A9 0 0A10 1 1A12 1 1A13 0 0A16 1 1A17 0 0A18 1 1A21 1 1A22 0 1A23 1 0A26 0 1A27 1 1A28 1 1A29 1 2A31 0 1A32 0 1A33 1 1A34 1 1A35 1 1A36 0 0A37 1 1A40 0 2A41 1 1A42 0 1A43 0 1A44 1 1A45 0 1A46 0 1A47 1 1A48 1 1A50 0 0

60

Figura 5: Gel de eletroforese de extração plasmidial ilustrando: controle da extração R23, controle positivo R861 e amostras humanas demonstrando a presença de plasmídeos de alto e baixo peso molecular.

R23 R861 H16 H15 H13 H12 H11 H10 H9 H8 H6 H5 H4 H3 H2 H1

4,3MDa22MDa39MDa

91MDa

61

4.5 Identificação de ESBL

As amostras resistentes às aminopenicilinas e cefalosporinas foram

submetidas à confirmação da presença de beta lactamases. Dentre as amostras

UPEC de origem humana, foram encontradas quatro amostras positivas no teste

fenotípico de disco-aproximação e dentre as amostras caninas foram encontradas

três amostras positivas no teste fenotípico.

Sete amostras apresentaram distintos antígenos somáticos, contudo houve

amostras que apresentaram mesmo antígeno flagelar. Dentre as sete amostras

sorotipadas 03 (aproximadamente 43%) foram consideradas não tipáveis e uma

amostra (14%) apresentou-se rugosa, o que impediu a sorotipagem somática.

Outras três amostras apresentaram antígenos somáticos diferenciados entre si (O4,

O11 e O8). O sorogrupo nove do antígeno flagelar (H9) foi o mais freqüente, estando

presente em duas amostras caninas, o que representa aproximadamente 29% do

total analisado. Outros sorogrupos presentes foram H49 na amostra A21, H14 na

amostra H15, H1 na amostra H21, H15 na amostra H39 e H4 na amostra H49

(Tabela 11).

Todas as amostras consideradas positivas para ESBL no teste fenotípico

foram submetidas ao teste genotípico de PCR a fim de detectar a presença dos

genes específicos: blaCTX-M, blaTEM e blaSHV (Tabela 11).

Dentre as amostras de UPEC humanas, H21, H39 e H49 apresentaram os

genes blaCTX-M e blaTEM, somente H15 não amplificou nenhum desses genes.

Entretanto, nenhuma das amostras amplificou o gene SHV (Tabela 11).

As amostras de UPEC caninas A31 e A41 foram positivas para o gene blaCTX-

M, enquanto A21 não amplificou este gene. Já no caso do gene blaTEM, as amostras

A21 e A41 foram positivas e apenas na amostra A31 não houve amplificação deste

gene. Assim como no caso das amostras humanas as amostras caninas também

não amplificaram o gene SHV (Tabela 11).

62

Tabela 11 - Caracterização das amostras produtoras ESBL através de sorotipagem e perfil genético.

Amostra Sorotipagem Perfil genético

blaCTX-M blaTEM blaSHV

A21 OR:H49 - + -

A31 ONT:H9 + - -

A41 ONT:H9 + + -

H15 ONT:H14 - - -

H21 O4:H1 + + -

H39 O11:H15 + + -

H49 O8:H4 + + -

63

4.6 Avaliação da produção de Hemólise

Todas as amostras foram submetidas ao teste fenotípico de alfa e entero -

hemólise.

Dentre as amostras humanas pode-se observar α-hemólise em 20% das

amostras (n=10) e pode-se observar entero-hemólise somente em 6% das amostras

(n=3).

Dentre as amostras caninas podemos observar α-hemólise em 36% das

amostras (n=18); e entero-hemólise em 6% das amostras (n=3).

As amostras de UPEC que apresentaram hemólise em seu perfil fenotípico

foram testadas para a presença do gene HlyA, que codifica α-hemolisina. Dentre as

amostras humanas, 69% amplificaram o gene e dentre as amostras caninas

somente 28% amplificaram o gene. Desta forma pode-se observar que as amostras

humanas analisadas representaram alta positividade no teste genotípico, ou seja, a

maioria dessas amostras expressa o gene que determina sua característica

fenotípica. Já nas amostras caninas, houve uma positividade bem menor dentre as

testadas, o que pressupõem uma baixa expressão genética (Tabela 12).

64

Tabela 12 - Amostras produtoras de α-hemólise fenotípica e presença do gene hlyA

α-hemóliseAmostra fenótipo genótipo

H1 + +H7 + -H10 + +H17 + +H21 + +H31 + +H32 + -H34 + +H38 + +H39 + +H47 + +H50 + -A1 + -A3 + -A4 + -A9 + +A11 + -A14 + -A15 + -A16 + -A17 + -A18 + -A22 + +A23 + -A24 + +A25 + -A30 + +A35 + -A39 + -A40 + +A42 + +

H: Amostras de origem humana

A: Amostras de origem canina

65

4.7 Detecção de genes de resistência e de genes de virulência

Amostras previamente isoladas neste estudo foram submetidas à avaliação

do perfil genotípico através da Reação em Cadeia da Polimerase de acordo com seu

perfil de sensibilidade e demais testes fenotípicos, a fim de confirmar características

já demonstradas fenotipicamente e/ou detectar os genes responsáveis por estas

características. Além disso, serão pesquisados os genes de virulência a fim de fazer

uma associação entre a patogenicidade das amostras e a expressão de resistência

das mesmas.

Para seleção das amostras avaliadas genotipicamente foram obedecidos

critérios estabelecidos na metodologia desse estudo e descritos no item 3.7: Seleção

das amostras para avaliação do perfil genotípico. A partir dessa seleção prévia das

amostras, os dados obtidos estão demonstrados na tabela a seguir (Tabela 13). De

acordo com a seleção descrita, a técnica de PCR foi realizada com um total de 28

amostras de UPEC humanas e 23 amostras de UPEC caninas.

Tabela 13 – Divisão dos grupos de amostras para realização das PCRs.

Identificação de amostras estudadas por grupos para PCR

Humanos Caninas

Resistentes a 1 classe H14 e H17 A24, A30,

Resistentes a 2 classes H5, H31, H33, H47, H48. A6, A8, A34, A40, A42,

Resistentes a 3-4 classes H1, H3,H4, H13, H24, H42, A2, A29, A47, A48, A50

Resistentes a 5-7 classesH2, H10, H12, H21, H27, H34,

H35, H36, H37, H38, H45, H46, H49,

A5, A7, A9, A10, A13, A21, A22, A33, A46, ,

Resistentes a 8-10 classes H15, H39 A31, A45 .

66

A presença de genes de resistência no DNA molde extraído tanto de

amostras de UPEC humanas quanto de amostras UPEC caninas, foi avaliada

através da utilização de primers específicos para o perfil fenotípico da resistência

previamente avaliado através de TSA. Os genes avaliados foram selecionados de

acordo com o perfil de resistência, onde os três grupos de antimicrobianos que

obtiveram maior índice de resistência fenotípica foram associados a presença de

genes específicos e a presença destes confirmada através da técnica de PCR.

Esses genes e suas descrições foram os seguintes: blacmy-2 / blacmy-7 resistência

a cefalosporinas, blaTEM resistência as aminopenicilinas, drfA17resistência a

trimetoprim e rmtB resistência aos aminoglicosídeos.

O gene blaTEM apresentou um considerável índice de amplificações dentre os

DNAs das amostras que apresentaram resistência fenotípica às aminopenicilinas.

Todas as amostras caninas testadas tiveram seus DNAs amplificados pelo primer

específico e o índice de amplificações em amostras de origem humana foi de

aproximadamente 76%. Nenhum dos demais genes selecionados para

caracterização genotípica da resistência apresentou amplificações de DNA a partir

dos iniciadores utilizados neste estudo. Todas as amostras selecionadas para esta

avaliação tiveram seu DNA amplificado por um iniciador universal de DNA

bacteriano, conforme a seguinte descrição: rrsB-F TGCAAGTCGAACGGTAACAG /

rrsB-R AGTTATCCCCCTCCATCAGG (dados não informados).

Todas as amostras selecionadas para avaliação genotípica foram testadas

para confirmação da presença dos genes de virulência pap, afa, kps, cnf e fimH .

Foi observado que um total de 100% das amostras humanas e caninas

apresentaram pelo menos um dos genes de virulência testados. A maioria das

amostras apresentou mais de um gene de virulência em seu perfil. O gene fimH foi o

mais freqüente dentre todas as amostras estudadas, estando presente em 100% das

amostras de ambos os grupos (Tabela 14 e 15).

A presença do gene hlyA foi comumente associada a presença dos genes

pap e/ou cnf. A distribuição dos genes de virulência ocorreu de maneira bastante

uniforme, havendo poucos casos de amostras com apenas um dos genes avaliados

e surpreendentemente essas amostram demonstraram perfis de fenotípicos de

resistência bastante amplos, com resistência a 5 a 6 classes de antimicrobianos, ou

67

seja, amostras multirresistentes nesses casos, não podem ser consideradas como

de alto índice de virulência (tabela 14 e 15).

68

Continua...* Genes re resistência: blaTEM

** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyANR – não realizado; AMB – ambulatório; INT - internados

69

Triagem hospitalar perfil genotípicoAmostras Local Sexo Idade fenótipo de resistência

MDRQuantidade de classes

Resistência * Virulência **

H1 AMB F 40 cfl, ami, gen, tob, cip, + 3 classes NR cnf, kps, hlya, fimhH2 AMB F 38 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, tet, sul nal + 7 classes + kps, fimhH3 AMB F 49 amp, amc, cfl, ami, clo, + 4 classes + kps, fimhH4 INT F 21 amp, cfl, cft, gen, tob, clo + 4 classes + pap, kps, fimhH5 AMB F 14 amp, sul + 2 classes + cnf, kps, fimhH6 AMB F 38 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, cip, enr, tet, nal + 6 classes NR NRH7 AMB F 37 amp, amc, cfl, ami, gen, sul + 4 classes NR NRH8 AMB F 44 cft, ami, tob, tet + 3 classes NR NRH9 AMB F 52 amp, amc, cfl, cfo, cro, cft, ami, tob, cip, tet, sul + 6 classes NR NRH10 AMB F 3M amp, amc, cfl, cep, tob, clo, sul + 5 classes + pap, kps, hlya, fimhH11 AMB F 77 cft, ami, gen, cip, enr, flo, tet, sul, nal + 7 classes NR NRH12 AMB F 80 amp, cfo, ami, cip, enr, tet, sul, nal + 7 classes + fimhH13 AMB M 49 amp, ami, gen, tob, tet, sul + 4 classes - fimhH14 AMB F 80 ami, tob - 1 classe NR pap, kps, fimhH15 INT F 9 amp, cfl, cro, cft, azt, ami, gen, tob, cip, enr, tet, sul, nal + 8 classes - fimhH16 INT F 33 amp, cfl, ami, tet, sul + 5 classes NR NRH17 INT F 24 cfl - 1 classe NR pap, kps, hlya, fimhH18 AMB F 54 amp, amc, cfl, sul + 3 classes NR NRH19 AMB F 66 amp, amc, cfl, cep, gen, enr, sul, nal + 6 classes NR NRH20 AMB F 37 amp, cfl, cft, ami, cip, enr, sul + 5 classes NR NRH21 AMB M 2M amp, cfl, cro, cft, gen, tob, tet, sul + 5 classes - pap, cnf, kps, hlya, fimhH22 AMB F 39 cfl, cft, ami, tob, cip, enr + 3 classes[ NR NRH23 AMB F 7 amp, amc, cfl, cfo, cft, ami, gen, tob, cip, clo, tet, sul + 7 classes NR NRH24 AMB F 9 gen, sul, nal + 3 classes NR pap, afa, kps , fimhH25 INT F 41 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo sul + 6 classes NR NRH26 AMB F 64 amp, cfl, cfo, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, tet, sul + 7 classes NR NR

Tabela 14: Caracterização fenotípica e genotípica das amostras de UPEC humanas.

Triagem hospitalar perfil genotípicoAmostras Local. Sexo Idade fenótipo de resistência Multirresistência Quantidade

de classesResistência

*Virulência **

H27 AMB F 52 amp, cfl, cfo, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo, sul

+ 6 classes - pap, kps, fimhH28 AMB F 76 amp, amc, cfl, cfo, cro, cft, ami, gen,

tob, cip, enr, clo, flo, tet, sul+ 7 classes NR NR

H29 INT F 53 amp, cfl, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo, sul, nal

+ 7 classes NR NRH30 INT F 40 amp, cfl, ami, clo, tet + 5 classes NR NRH31 AMB M 77 cfl, ami + 2 classes NR pap, afa, cnf, kps, hlya,

fimhH32 INT F 46 0 - 0 NR NRH33 AMB F 51 amp, ami + 2 classes + pap, afa, cnf, kps, fimhH34 INT F 37 amp, cfl, ami, clo, tet + 5 classes + pap, cnf, kps, hlya, fimhH35 INT F 49 amp, cfl, ami, cip, enr, tet, sul, nal + 7 classes + afa, kps, fimhH36 INT F 61 amp, cfl, ami, gen, cip, enr, tet, sul, nal + 7 classes + pap, afa, cnf, kps, fimhH37 INT M 77 cfl, ami, gen, cip, enr, clo, flo, tet, sul,

nal+ 7 classes + kps, fimh

H38 AMB M 22 amp, cfl, tet, sul, nal + 5 classes + pap, cnf, kps, hlya, fimhH39 INT F 67 amp, amc, cfl, cro, cft, cep, azt, cip,

enr, clo, flo, tet, sul, nal+ 8 classes + afa, hlya, fimh

H40 INT F 69 cfl, cfo, cro, cft, ami, gen, tob, cip, enr, clo, flo, tet

+ 4 classes NR NRH41 INT F 70 cfl, cep, ami, cip, enr, flo, nal + 5 classes NR NRH42 AMB F 56 amp, cfl, cep, tet, sul + 4 classes + pap, cnf, kps, fimhH43 INT F 85 amp, amc, cfl, cep, clo, flo, tet, sul + 5 classes NR NRH44 INT M 47 cro, nal + 2 classes NR NRH45 AMB F 40 amp, cfl, cep, clo, tet, sul + 5 classes - afa, cnf, fimhH46 INT F 71 amp, amc, cfl, cep, clo, flo, tet, sul, nal + 6 classes + pap, kps, fimhH47 INT F 60 cfl, cep, ami + 2 classes NR pap, kps, hlya, fimhH48 AMB F 85 cfl, ami + 2 classes NR kps, fimhH49 INT M 55 amp, amc, cfl, cro, cft, ami, cip, enr, flo,

sul, nal+ 7 classes + fimh

H50 INT M 14 cfl, ami, flo + 3 classes NR NR

* Genes re resistência: blaTEM

** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyANR – não realizado; AMB – ambulatório; INT - internados

70

Perfil genotípicoAmostras Fenótipo de resistência Multirresistência n de classes Resistência * Virulência **

A1 cro - 0 NR NRA2 ctr, ami, tob, tet, nal + 4 classes - fimhA3 amp, cro, enr, flo, nal + 5 classes NR NRA4 amo, cfl,cfo, ctf,cep, ami, tob,

cip, enr, flo, tet+ 6 classes NR NR

A5 cro, gen, tob, cip, enr, tet, nal + 5 classes NR fimhA6 cfl, nal + 2 classes NR cnf, fimhA7 amp, cfl, ami, cip, sul, nal + 6 classes + fimhA8 ami, nal + 2 classes NR kps, fimhA9 amc, cfl, cro, cft, tob, cip, enr,

clo, tet, nal+ 7 classes + pap, cnf, hlya, fimh

A10 amp, cfl, cft, ami, tob, cip, enr, clo, tet, nal

+ 7 classes + kps, fimhA11 ami - 1 classe NR NRA12 amp, cfl, cip, enr, tet, sul, nal + 6 classes NR NRA13 amp, amc, cfl, ami, tob, tet, sul, + 5 classes + pap, kps, fimhA14 0 - 0 NR NRA15 0 - 0 NR NRA16 ami, flo, nal + 3 classes NR NRA17 0 - 0 NR NRA18 cfl, ami, gen, flo, nal + 4 classes NR NRA19 0 - 0 NR NRA20 amp - 1 classe NR NRA21 cfl, cfo, cro, cft, cep, azt, gen tob,

cip, clo, flo, tet, nal+ 7 classes NR fimh

A22 amp, amc, cfl, gen, tob, cip, enr, tet, sul, nal

+ 7 classes + pap, cnf, kps, hlya, fimhA23 amp, cfl, cft, cep, ami, gen, tob,

cip, clo, tet, sul, nal+ 8 classes NR cnf, kps, fimh

A24 nal - 1 classe NR pap, cnf, kps, hlya, fimhA25 0 - 0 NR NR

71

* Genes re resistência: blaTEM continua..** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyA

perfil genotípicoAmostras fenótipo de resistência Multirresistência n de classes resistência virulência

A26 amp, cfl, ami, sul, nal + 5 classes NR NRA27 amp, tob, cip, enr, tet, nal + 5 classes NR NRA28 cfo, cep, tob, cip, enr, clo, tet,

sul, nal+ 6 classes NR NR

A29 amp, amc, clo, sul, nal + 4 classes + cnf, kps, fimhA30 ami - 1 classe NR pap, cnf, kps, hlya, fimhA31 amp, amc, cfl, cro, cft, cep, azt,

tob, cip, enr, tet, sul, nal+ 8 classes + cnf, fimh

A32 amp, cfl, cep, gen, tob, cip, enr, tet, sul, nal

+ 7 classes NR NRA33 amp, cfl, cro, cft, tob, cip, enr,

tet, sul+ 6 classes + pap, cnf, kps, fimh

A34 amp, cfl + 2 classes + cnf, fimhA35 amp, cfl, clo, tet, nal + 5 classes NR NRA36 cfl, tet, nal + 3 classes NR NRA37 cfl, tet, nal + 3 classes NR NRA38 0 - 0 NR NRA39 0 - 0 NR NRA40 cfl, ami + 2 classes NR cnf, kps, hlya, fimhA41 amp, cfl, cro, cft, cep, azt, cip,

enr, clo, tet, sul, nal+ 8 classes NR NR

A42 cfl, cep, ami, + 2 classes NR pap, cnf, kps, hlya, fimhA43 amp, cfl, cep, azt, ami, clo, tet,

sul, nal+ 8 classes NR NR

A44 amp, cfl, cfo, ami, clo, flo, tet, nal

+ 6 classes NR NRA45 amp, amc, cfl, cep, tob, cip, enr,

clo, tet, sul, nal+ 8 classes + pap, cnf, fimh

A46 amp, cfl, cep, cip, enr, clo, tet, sul, nal

+ 7 classes + cnf, fimhA47 cfl, cep, flo, sul, nal + 4 classes NR pap, cnf, kps, fimhA48 cfl, cep, sul, nal + 3 classes NR cnf, kps, fimhA49 0 - 0 NR NRA50 amp, cfl, cep, clo, nal + 4 classes + pap, cnf, fimh

72

* Genes re resistência: blaTEM

** Genes de virulência: pap, afa, sfa, kps, cnf, fimH, hlyA

5. Discussão

A última década tem proporcionado novas perspectivas para os

mecanismos de interação parasita-hospedeiro no trato urinário. A redução da

defesa do hospedeiro parece diminuir a exigência da virulência bacteriana,

considerando que a resistência do hospedeiro torna-o susceptível à infecção

por bactérias com maior virulência. Num hospedeiro resistente, a virulência

bacteriana pode ser definida como a soma das propriedades exigidas para

colonizar o trato urinário e induzir a lesões teciduais. A resistência induzida

pela exposição natural à infecção ou imunização pode ser protetora em

modelos experimentais, mas sua importância ainda não está definida.

(SVANBORG-EDEN et al, 1987).

A localização, gravidade e seqüelas da infecção no tato urinário são

determinadas pelo equilíbrio entre a virulência bacteriana e a defesa do

hospedeiro. Embora a doença seja um resultado da interação entre a virulência

bacteriana e a resistência do hospedeiro, estes componentes são discutidos

separadamente com maior clareza. (SVANBORG-EDEN et al, 1987).

Neste estudo, a virulência e a resistência bacteriana foram avaliadas em

amostras de UPEC derivadas de humanos e de cães. A resistência aos

antimicrobianos ocorreu tanto em amostras de origem humana quanto em

amostras de origem canina, demonstrando a disseminação de resistência em

ambos os grupos. Ao abordar o impacto da terapêutica antibiótica sobre o

desenvolvimento da resistência, deve-se compreender não só o processo de

seleção, mas desenvolvimento de resistência e a complexa evolução ecológica

dos determinantes da resistência envolvidos. Vale ressaltar que ao longo do

tempo, em resposta ao desenvolvimento dos antibióticos, as bactérias têm

evoluído e otimizado seu arsenal genético para lidar com a ação dos

antibióticos (BARBOSA & LEVY, 2000).

A disseminação da resistência em espécies animais vem aumentando

ao longo dos anos. Estudos anteriores demonstram que a nível mundial, a

utilização de antimicrobianos em animais para fins de saúde foi estimado em

27000 toneladas/ano das quais, 50% para fins terapêutico e o restante para

finalidades aditivas alimentares (BOATMAN , 1998). Diversos estudos discutem

sobre a resistência crescente aos antimicrobianos de cepas bacterianas

isoladas de várias espécies animais (JOINT EXPERT TECHNICAL ADVISORY

COMMITTEE ON ANTIBIOTIC RESISTANCE 1999; WHO, 1999). A resistência

aos antimicrobianos entre enteropatógenos zoonóticos e comensais é de

interesse à saúde sública, pois essas bactérias são, na maioria, transferidas

aos humanos através da cadeia alimentar, assim como podem ser transferidos

genes de resistência de bactérias comensais a enteropatógenos zoonóticos

(SALYERS & SHOEMAKER, 1995). Existem consideráveis evidências que o

uso dos antimicrobianos seleciona microrganismos e promove a resistência em

bactérias comensais e em enteropatógenos zoonóticos (DAWSON et al, 1984;

DUNLOP et al, 1998; BAGER et al, 1997).

Consideráveis índices de resistência foram atribuídos a antibióticos das

classes de aminopenicilinas, cefalosporinas e quinolonas em amostras de

origem canina. Em amostras de origem humana destacou-se a resistência as

classes de aminopenicilinas, cefalosporinas e aminoglicosídeos,

demonstrando que cepas de UPEC são capazes de driblar variados

mecanismos de ação antimicrobinana. Outros grupos já demonstram a

emergência de E. coli multirresistente associada a infecções hospitalares e

caninas em diversos países, com isolados que demonstraram resistência a

cefalosporinas de espectro estendido (SIDJABAT et al, 2006). Apesar do

desenvolvimento de novos beta-lactâmicos e fluoroquinonas, os

aminoglicosídeos ainda são muito utilizados no tratamento de infecções graves

causadas por microrganismos gram negativos e a resistência bacteriana a

esses medicamentos têm sido relatada desde sua introdução no uso clínico

74

(GALIMAND et al, 2003). Além disso, estudos já relaram a presença de

plasmídeos carreando genes responsáveis pela resistência a quinolonas

(JONES et al, 2008).

Entre os antibióticos testados, o imipenem, foi o antibiótico que revelou o

melhor índice de sensibilidade (100%) em ambos os grupos de amostras

testadas. Essa classe de antibiótico é um bactericida, notável pelo seu amplo

espectro de atividade, agindo pela inibição da síntese da parede celular e

representa uma outra modificação na estrutura do beta-lactâmico. Vários

autores demonstraram que a combinação do Imipenem com a cilastatina de

sódio previne a degradação dessa combinação nos rins, com atividade contra

98% dos organismos isolados a partir de pacientes hospitalizados (NICOLLE,

2003) .

Embora a frequencia de pacientes hospitalizados tenha sido menor que

a de pacientes ambulatoriais, nesse grupo também prevaleceu a presença de

pacientes do sexo feminino e de idade adulta, principalmente com idades

acima dos 50 anos. As amostras de pacientes do sexo masculino de idade

adulta presentes neste grupo, foi marcada pela multirresistência, com

resistência a até 7 classes de antimicrobianos. Além disso, como já era

esperado, o ferfil genotípico de virulência desse grupo foi também bastante

amplo, com a presença de diversos genes de virulência em uma mesma

amostra. O gene mais freqüentemente observado dentre essas amostras foi o

FimH, seguido por pap e Kps. O aparecimento de resistência em patógenos

hospitalares tem-se mostrado associada com o uso inadequado de antibióticos

na terapia e profilaxia e situações semelhantes podem ser encontradas na

comunidade (MCGOWAN, 1996).

E. coli é frequentemente resistente à Aminopenicilinas, tais como

Amoxilina e Ampicilina, além das Cefalosporinas de estreito espectro. A

resistência é tipicamente devido a aquisição de plasmídeos que codificam as

beta-lactamases, tais como TEM-1, TEM-2 e SHV-1, as quais hidrolizam e

inativam essas drogas. Algumas amostras de E. coli adquirem resistência à

terceira geração de Cefalosporinas e Monobactâmicos (por exemplo, o

Aztreonam), através da aquisição das ESBLs (β-Lactamases de amplo

espectro), que comumente surgem através de mutações nas enzimas TEM-,

75

SHV- ou CTX-M. As ESBLs não são ativas contra as Cefamicinas. Contudo, a

resistência às Cefamicinas e a outros β-Lactâmicos pode surgir como resultado

de mudanças em proteínas (porinas) localizadas na membrana externa

(proteínas formadoras de canais pelos quais drogas e outras moléculas

penetram no interior da célula bacteriana). Tais mudanças podem diminuir ou

até mesmo impedir a entrada de pequenas moléculas hidrofílicas, como as

drogas β-Lactâmicas, para o interior da célula. A perda do principal canal

formado pelas porinas (OmpF) pode reduzir a entrada das Cefamicinas na

célula bacteriana, aumentando ainda mais o espectro de resistência da bactéria

(TENOVER, 2006).

A produção de ESBL por cepas de UPEC neste estudo, foi

principalmente decorrente da presença de TEM e CTX, uma vez que nenhuma

das amostras testadas apresentaram o gene codificador da enzima SHV, ou

seja, nesse grupo de amostras esse mecanismo não foi comum entre as

amostras testadas. Pode-se observar ainda, a positividade tanto fenotípica

quanto genotípica para ESBL em amostras caninas, as quais apresentaram

antígenos somáticos não tipáveis, porém duas das três amostras apresentaram

mesmo antígeno flagelar e mesma enzima moduladora, a CTX. Uma das

amostras oriundas de humanos testada não amplificou nenhum dos genes

codificadores de ESBL, o que nos leva a crer que esta amostras de UPEC se

utiliza de outro possível mecanismo enzimático não estado nesse estudo.

Outras três amostras de UPEC humana apresentaram positividade para ambos

os genes CTX e TEM. Embora essas variantes sejam muito isoladas, sabe-se

que nos últimos anos houve uma explosão no aparecimento de outras ESBLs

(PER, VEB, GES, TLA e BES). Como resultado disso, mais de 370 variantes

são conhecidas atualmente (STURENBURB et al, 2005) o que amplia a

possibilidade de identificação das mesmas.

A ocorrência da resistência entre as amostras parece estar associada ao

número de plasmídeos encontrados, já que a frequencia de amostras

resistentes foi tão comum quanto a frequencia da presença de plasmídeos de

alto e de baixo peso molecular nas mesmas. Pode-se sugerir que em algumas

poucas amostras que não apresentaram nenhum tipo de plasmídeo, ocorreu

outro tipo de mecanismo de transferência da resistência. Sidjabat et al,

76

corroboram com esta premissa, afirmando em estudos anteriores que a

transferência horizontal de genes entre bactérias através de elementos

genéticos móveis como plasmídeos, tansposons e integrons têm facilitado a

disseminação de resistência a múltiplos antibióticos entre enterobactérias

(SIDJABAT et al, 2006). Além disso, a presença de apenas um dos genes

buscados em amostras de UPEC humanas nesse estudo, sugere que nessas

amostras o mecanismo de codificação da resistência ocorre mediado por

outros genes não avaliados.

O perfil genotípico das amostras de UPEC humanas e caninas foi

semelhante, pois ambas tiveram seus DNAs amplificados pelo iniciador do

gene que codifica resistencia a aminopenicilinas (blaTEM), contudo seu perfil de

virulência não foi tão semelhante. A presença de adesina afimbrial codificada

pelo gene afa ocorreu nas amostras oriundas de humanos, mas não nas

amostras caninas. Além disso, o perfil de virulência confirmado pela presença

de genes específicos foi mais amplo em amostras humanas, embora as

amostras caninas também tenham apresentado uma vasta gama de genes de

virulência como demonstrado na tabela 14.

Através de testes fenotípicos e genotípicos pode-se avaliar que a

produção de hemolisina nas amostras (n=50) de UPEC humanas foi de 26% e

nas amostras de caninos foi de 42%, sendo a maioria das amostras produtoras

de alfa-hemólise. A análise genotípica através de um iniciador pra alfa-

hemolisina, toxina comumente presente em cepas de UPEC (YAMAMOTO,

2007), demonstrou que dentre as amostras de origem humana 9 das 13

amostras testadas, e consideradas positivas em teste fenotípico realizado

previamente, expressam o gene hlyA (índice = 69%) e dentre as amostras

caninas apenas 6 das 21 amostras testadas e positivas em teste fenotípico

(índice = 28%). As amostras que apresentaram perfil fenotípico entero-

hemolítico e perfil genotípico alfa-hemolítico foram também testadas

genotipicamente para entero-hemólisina através de reação para o gene ehxA

(dados não informados) (PATON & PATON, 1998). Posto que, as reações

entero-hemolíticas não apresentaram amplificação, pode-se pressupor que as

amostras em questão sejam realmente alfa-hemolíticas, porém serão

necessários testes adicionais para melhor esclarecer a questão.

77

Análises do perfil genotpico da virulência das amostras apontam a

associação da produção de alfa-hemolisina através do gene hlyA a pap, cnf

e/ou kps, tanto em amostras de origem humanas quanto em amostras de

origem canina. hlyA é normalmente codificada por PAIs de UPEC , juntamente

com pap e cnf (HACKER & KAPER, 2000). Tal fato corrobora a estudos

anteriores que revelam a presença de hlyA muitas vezes associada a pap, e/ou

cnf, mas não a afa (YAMAMOTO et al , 1995a; TERAI et al, 1997).

A frequência do fator citotoxico necrosante codificado pelo gene cnf foi

maior em amostras de origem canina, sendo detectado em aproximadamente

74% das amostras, contra apenas 36% das amostras de origem humana.

Este fator é conhecido por facilitar a sobreviveência de UPEC durante a

resposta inflamatória aguda, modulando a função de leucócitos, incluindo a

baixa da fagocitose (DAVIS et al, 2005). Além disso foi demonstrado que o

fator citotóxico necrozante é capaz de matar as células uroepiteliais humanas

através de um mecanismo apoptótico (MILLS et al, 2000).

O fator capsular tipo II representou mais um fator de virulência muito

comum entre cepas de UPEC, tendo sido encontrado em aproximadamente

79% das amostras humanas e em 57% das amostras caninas. Esse resultado

já era esperado, visto que se trata de um potencial fator da virulência em UPEC

como já descrito em estudos anteriores (YAMAMOTO, 2007).

Nas ultimas décadas têm havido um grande número de investigações

acerca de fatores de virulência em UPEC e o estabelecimento dessas

propriedades em infecções sintomáticas agudas como cistite, pielonefrite,

assim como em infecções assintomáticas. No entanto, a maioria das

conclusões sobre estas investigações são baseadas em observações

epidemiológicas sobre indícios do papel direto de um único fator de virulência

na patogênese de uma ITU, sendo essas características de virulência capazes

de superar as defesas do hospedeiro ou lesar tecidos (YAMAMOTO, 2007).

Nesse estudo observou-se a presença de inúmeros fatores de virulência

simultaneamente em uma amostra e a associação de altos índices de

resistência antimicrobiana das amostras. A partir das observações aqui

estudadas pode-se indagar a presença de plasmídeos como possível

mecanismo de transferência horizontal entre essas amostras e a associação da

78

presença de diversos fatores de virulência como potenciais mecanismos

atuando diretamente na potencialização de sua patogenicidade. É certo que

para realizar tais afirmações, várias interações precisam ser esclarecidas e

técnicas na abordagem desse estudo realizadas a fim de contribuir para o

entendimento desses dinâmicos mecanismos.

79

7. Conclusões

• Amostras de UPEC isoladas de humanos e de cães apresentaram um

alto índice de resistência antimicrobiana.

• Amostras de UPEC de origem humana foram mais comuns em

pacientes do sexo feminino, adultos e ambulatoriais.

• A produção de beta-lactamases de espectro estendido foi detectada em

amostras de origem humana e canina.

• Amostras de UPEC isoladas de humanos e de cães apresentaram um

alto índice de resistência antimicrobiana sendo, no entanto, mais intenso

dentre as primeiras.

• A base genética da multirresistência presente nas amostras estudadas é

muito diversificada, uma vez que foi baixa a ocorrência dos genes

avaliados.

• Amostras UPEC de origem humana e canina estudadas exibiram um

variado perfil genotípico de virulência.

80

8. Bibliografia

- ABE C.M.; SALVADOR F.A.; FALSETI I.N.; VIEIRA M.A.M.; BLANCO J.;

BLANCO J.E.; BLANCO M.; MACHADO A.M.O.; ELIAS W.P.;

HRNANDES R.T.; GOMES T.A.T. Uripathogenic Escherichia coli (UPEC)

strains may carry virulence properties of diarrhoeagenic E. coli. Immunol

Méd Microbiol. 52: 397-406, 2008.

- BAGER F, MADSEN M, CHRISTENSEN J, AARESTRUP FM. Avoparcin

used as a growth promoter is associated with the occurrence of

vancomycin-resistant Enterococcus faecium on Danish poultry and pig

farms. Prev Vet Med. 31(1-2):95-112. 1997.

- BARBOSA, T.M.; LEVY, S.T. The impact of antibiotic use on resistance

development and persistence. Drug Resistance Updates. 3, 303–311.

2000.

- BAUER R.J.; ZHANG L.; FOXMAN B.; SIITONEN A.; JANTUNEN M.E.

SAXEN H. MARRS C.F. Molecular epidemiology of three putative

virulence genes for Escherichia coli urinary tract infection – usp, iha,

anda iron (E. coli). J. Infect Dis; 185: 1521-4, 2002.

81

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9234429?ordinalpos=4&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum



- BELKUM, A.V.; Struelens, M.; Visser, A.; Verbrugh, H.; Tibayrenc, M.

Role of Genomic Typing in Taxonomy, Evolutionary Genetics, and

Microbial Epidemiology. Clin Microbiol Rev. 14(3): 547–560, 2001.

- BEUTIN, L. The different hemolysins of Escherichia coli . Med Microbiol

Immunol.;180(4):167-82. Review. 1991.

- BENNETT, P.M. The spread of drug resistance, in: Baumberg S., Young

J.P.W., Wellington E.M.H., Saunders J.R. (Eds.), Population Genetics in

Bacteria, University Press, Cambridge, pp. 317- 344. 1995.

- BOATMAN M. Survey of antimicrobial usage in animal health in the

European union, Boatman consulting. (by order of FEDESA) 1998.

- BOWER, J.M. ; ETO, D.S. and MULVEY, M.A. Covert operations of

uropathogenic Escherichia coli within the urinary tract. Traffic 6, 18–31.

2005.

- BUSH, K.; JACOB, G.A. & MEDEIROS, A.A. A functional classification

scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure.

Antimicrob. Agents Chemother., 39: 1211-33, 1995.

- BYARUGABA, D. K. A view on antimicrobial resistance in developing

countries and responsible risk factors. International Journal of

Antimicrobial Agents, 24(2) 105-110. 2004.

- CHANAL, C.; SIROT, D.; ROMASZKO, J.P.; BRET, L.; SIROT, J. Survey

of prevalence of extended spectrum beta-lactamases among

enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother. 38(1):127-32. 1996.

82




http://www3.interscience.wiley.com/journal/118668889/abstract?CRETRY=1&SRETRY=0#fn1%23fn1


- CHANG, C.Y.; CHANG, L.L.; CHANG, Y.H.; LEE, T.M.; CHANG, S.F.

Characterisation of drug resistance gene cassettes associated with class

1 integrons in clinical isolates of Escherichia coli from Taiwan, ROC. J

Med Microbiol. 2000 Dec;49(12):1097-102

- CHEN S.L.; HUNG C.S.; XU J.; REGSTAD C.S.; MAGRINI V.; SABO A.

Identification of genes subject to positive selection in uropathogenic

strains of Escherichia coli: a comparative genomics approach. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 10: 5977-82, 2006.

- CLSI – Clinical and laboratorial Standards Institute. Fourteeth

Informational Supplement. M100-S14, Wayne, Pa. CLSI, 2007.

- COL, N.F.; O’CONNOR, R.W. Estimating worldwide current antibiotic

usage: Report of task force I. Rev. Infect. Dis. 9, S232-243. 1987.

- DALMARCO, E.M.; BLATT S.L.; CÓRDOVA C.M.M. Identificação

Laboratorial de β-Lactamases de Espectro Estendido (ESBLs) –

Revisão. RBAC, vol. 38(3): 171-177 2006.

- DAWSON, K.A.; LANGLOIS, B.E.; STAHLY, T.S.; CROMWELL, G.L.

Some characteristics and antibiotic resistance of anaerobic bacteria from

the ceca and colons of pigs fed chlortetracycline-containing and

unmedicated diets. Appl Environ Microbiol.;47(1):210-2. 1984.

- DAVIS, J.M.; RASMUSSEN, S.B.; O’BRIEN A.D. Citotoxic necrotizing

factor type 1 production by uropathogenic Escherichia coli modulates

polymorphonuclear leukocyte function. Infect Immun, 68: 5869-80, 2005.

83






- DE GRAAF, F.K. and MOOI, F.R. The fimbrial adhesins of Escherichia

coli. Adv. Microb Physiol, 28: 65-143, 1986.

- DE RYCKE, J.; GUILLOT, J.F.; BOIVIN, R. Cytotoxins in non-

enterotoxigenic strains of Escherichis coli isolated from feces of diarrheic

calves. Vet. Microbiol. 15-:137-50, 1987.

- DREWS, S.J.; POUTANEN, S.M.; MAZZULLI, T.; MCGEER, A.J.;.

SARABIA, A.; PONG-PORTER, S.; RZAYEV, Y.; WILLEY, B.; GREEN

K. AND LOW, D.E. Decreased prevalence of virulence factors among

ciprofloxacin-resistant uropathogenic Escherichia coli isolates, J. Clin.

Microbiol. 43 pp. 4218–4220. 2005,

- DUNLOP, R.H.; MCEWEN, S.A.; MEEK, A.H.; CLARKE, R.C.; BLACK,

W.D.; FRIENDSHIP, R.M. Associations among antimicrobial drug

treatments and antimicrobial resistance of fecal Escherichia coli of swine

on 34 farrow-to-finish farms in Ontario, Canada. Prev Vet Med. 1998 Mar

27;34(4):283-305.

- FOXMAN, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence,

morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49(2):53-70. Review. 2003.

- FOXMAN, B.; MANNING, S.D.; TALLMAN, P.; BAUER, R.; ZHANG, L.;

KOOPMAN, J.S.; GILLESPIE, B.; SOBEL, J.D. AND MARRS, C.F.

Uropathogenic Escherichia coli Are More Likely than Commensal E. coli

to Be Shared between Heterosexual Sex Partners. Am J Epidemiol;

156:1133-1140. 2002.

- FRANCO, B. D. G. M. e LANDGRAF, M. Microbilogia dos Alimentos. 2

ed. São Paulo: Editora Atheneu, 194p, 2002.

84






- GALIMAND, M.; COURVALIN, P.; LAMBERT, T. Plasmid-Mediated High-

Level Resistance to Aminoglycosides in Enterobacteriaceae Due to 16S

rRNA Methylation. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. p. 2565–

2571. 2003.

- GRUDE, N.; TVETEN, Y.; KRISTIANSEN, B.E. Urinary Tract Infections

in Norway: Bacterial Etiology and Susceptibility. A Retrospective Study of

Clinical Isolates. 2001. Disponível em:

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi.

- GUERRA, B.; JUNKER, E.; SCHROETER, A.; HELMUTH, R.; GUTH,

B.E.C.; BEUTIN, L. Phenotypic and genotypic characterization of

antimicrobial resistence in Escherichia coli O111 isolates. J. Antimicrob.

Chemotherapy. 57, 1210-1214, 2006.

- GUERRA, B.; JUNKER, E.; SCHROETER, A. Phenotypic and genotypic

characterization of antimicrobial resistence in German Escherichia coli

isolates from cattle, swine and poutry. J. Antimicrob. Chemother. 52:489-

492, 2003.

- GUNTHER N.W.; LOCKATELL V.; JOHNSON D.E.; MOBLEY H.L.; In

vivo dynamics of type 1 fi mbria regulation in uropathogenic Escherichia

coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun; 69:2838–

46, 2001.

- HACKER J. and KAPER J.B. Pathogenicity islands and the evolution of

microbes. Annu. Rev Microbiol. 54: 641-79, 2000.

- JAMES, P.; NATARO, J.P.; JAMES, B.K.. Diarrheagenic Escherichia coli.

Clinical Microbiology Reviews. V11. p. 403-403, 1998.

85

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

- JARVIS, W.R. – Epidemiology of nosocomial infections in pediatric

patients. Pediat Infect Dis J, v. 6, p. 344-351, 1987.

- JOINT EXPERT ADVISORY COMMITTEE ON ANITBIOTIC

RESISTANCE, 1999, The Use of Antibiotics in Food-Producing Animals:

Antibiotic Resistant Bacteria in Animals andHumans. Canberra:

Commonwealth of Australia.

- JONES, G.L.; WARREN, R.E.; SKIDMORE, S.J.; DAVIES, V.A.;

GIBREEL, T.; UPTON, M. Prevalence and distribution of plasmid-

mediated quinolone resistance genes in clinical isolates of Escherichia

coli lacking extended-spectrum beta-lactamases. J Antimicrob

Chemother. 2008 Dec;62(6):1245-51. Epub 2008 Sep 30.

- JONHSON, J.R. Virulence factors in Escherichia coli urinary tract

infection. Clin. Microbiol. Rev. 4:80-128, 1991.

- JOHNSON, J.R.;DELAVARI, P. Concurrent fecal colonization with

extraintestinal pathogenic Escherichia coli in a homosexual man with

recurrent urinary tract infection and in his male sex partner. Clin. Infect.

Dis. 35, E65–E68, 2002.

- KANAMARU S.; KURAZONO H.; ISHITOYA S.; TERAI A.; HABUCHI T.;

NAKANO M. Distribution and genetic association of putative

uropathogenic virulence factors, iron, iha, kpsMT, ompT and usp in

Escherichia coli isolated from urinary tract infection in Japan. J. Urol.

170: 2490-3, 2003.

- KAPER, J.B.; NATARO, J.P.; MOBLEY, H.L.T. Pathogenic Escherichia

coli. Nat Rev Microbiol 2: 123-40, 2004.

86




- KEANE W.F.; WELCH R. GEKKER G.; PETERSON P. K. Mechanism of

Escherichia coli alpha-hemolysin induced injury to isolated renal tubular

cells. Am J Pathol. 126: 350-7, 1987.

- KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCHRECKENBERGER,

P.C.; WINN Jr., W.C. Diagnóstico Microbiológico. 5.ed., Rio de Janeiro:

MEDSI, 2001.

- LEUNG, M.; SHANNON, K.; FRENCH, G. Rarity of transferable beta-

lactamase production by Klebsiella species. J Antimicrob Chemother.

39(6):737-45. 1997.

- LIVERMORE, D.M. B-Lactamases in laboratory and clinical resistance,

Clin. Microbiol. Rev. 8 557-584. 1995.

- LIVERMORE, D.M. The need for new antibiotics, Clin. Microbiol. Infect.

10 (Suppl. 4), pp. 1–9. 2004.

- LLOYD, A.L.; RASKO, D.A. AND MOBLEY, H.L. T. Defining genomic

islands and uropathogen-specific genes in uropathogenic Escherichia

coli. J. Bacteriol. 189, 3532–3546. 2007.

- LEVERSTEIN-VAN HALL, M.A.; BOX, A.T.A.; BLOK, H.E.M.; PAAUW,

A.; FLUIT, A.C.; VERHOEF, J. Evidence of extensive interspecies

transfer of integron-mediated antimicrobial resistance genes among

multidrug-resistant Enterobacteriaceae in a clinical setting. J. Infect. Dis.

186, 49-56. 2001.

- MANGES, A.R.; JOHNSON, J.R.; FOXMAN, B.; O'BRYAN, T.T.;

FULLERTON, K.E.; RILEY, L.W. Widespread distribution of urinary tract

87

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Riley%20LW%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Fullerton%20KE%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22O'Bryan%20TT%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Foxman%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Johnson%20JR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Manges%20AR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract



infections caused by a multidrug-resistant Escherichia coli clonal group.

N. Engl J Med.. 345(14):1007-13, 2001.

- MARRS, C.F.; ZHANG L.; FOXMAN B. Escherichia coli mediated urinary

tract infections: are there distinct uropathogenic E. coli (UPEC)

pathotypes? FEMS Microbiol. Lett. 252, 183–190, 2005.

- MCEWEN S.A.; FEDORKA-CRAY P.J. Antimicrobial Use and Resistance

in Animals. Clin. Infect. Dis. 34(3):93-106, 2002.

- MCGOWAN JE, JR. Antimicrobial resistance in hospital organisms and

its relation to antibiotic use. Rev Infect Dis 1983; 5: 1033–1048. 22.

Baquero F. Antibiotic resistance in Spain:What can be done? Task Force

of the General Direction for Health Planning of the Spanish Ministry of

Health. Clin Infect Dis; 23: 819–823.1996.

- MENG, J. et al. Antibiotic resistance of Escherichia coli O157:H7 and

O157:NM isolated from animals, food and humans. Journal of Food

Protection, v.61, n.11, p.1511- 1514, 1998.

- MILLS, M.; MEYSIC, K.C.; O’BRIEN A.D. Cyitotoxic necrotizing factor

type 1 of uropathogenic Escherichia coli kills cultured human uroepithelial

5637 cells by na apoptotic mechanism. Infect Immun. 68: 5869-80, 2000.

- MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, disponível em

www.anvisa.gov.br/legis/portarias/2616_98, acesso em 11 de abril de

2007 às 24h.

- MOURA, K. K. V., SILVA A. A. Infecção Hospitalar: a solução em nossas

mãos. Ciência Hoje, 29, 2001.

88

http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/2616_98

- MULVEY, M.A. ; SCHILLING, J.D.; MARTINEZ, J.J. AND HULTGREN

S.J. Bad bugs and beleaguered bladders: interplay between

uropathogenic Escherichia coli and innate host defenses. Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 97, 8829–8835. 2000.

- MURRAY, P. R. Microbiologia Médica. Editora Guanabara. 1992.

- NATARO, J.P. and KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical

Microbiology Reviews, p. 403-403, Vol. 11, N.2, 1998.

- NICOLLE, L.E. Urinary Tract Infection: Traditional Pharmacologic

Therapies. Disponível em: www.medline.com.br.

- NICOLE, L.E. Asymptomatic bacteriuria: when to screen and when to

treat. Infectious Disease Clinics of North America. Vol. 17 (2), 2003.

- NIKAIDO, H. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability

barriers and active efflux. Science. 15;264(5157):382-8. Review. 1994.

- ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, disponível em www.opas.org.br,

acesso em 11 de abril de 2007 às 17h.

- OZGUMUS, O.B.; CELIK-SEVIM, E.; L ALPAY-KARAOGLU, S.;

SANDALLI, C.; SEVIM, A. Molecular Characterization of Antibiotic

Resistant Escherichia coli Strains Isolated from Tap and Spring Waters in

a Coastal Region in Turkey. The Journal of Microbiology. p. 379-387,

2007.

- PADOVEZE, M.C. & OLIVEIRA, E.L. Bactérias multirresistentes. 2000.

89

http://www.opas.org.br/



http://www.medline.com.br/

- PATON, A. W. & PATON J. C. Detection and Characterization of Shiga

Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2,

eaeA, Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb O111, and rfb O157. J. Clin.

Microbiol.. 36: 598-602, 1998.

- PEREIRA, A.S.; CARMO FILHO, J.R.; TOGNIM, M.C. Avaliação da

acurácia de testes laboratoriais para detecção de amostras de Klebsiella

pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido. J. Bras.

Patol. Med. Lab., 2003, vol.39, no.4, p.301-308. ISSN 1676-2444.

- POOLE, K. Overcoming multidrug resistance in gram-negative bacteria.

Curr Opin Investig Drugs. 4(2):128-39. Review. 2003.

- RAGHUNATH, D. Emerging antibiotic resistance in bacteria with special

reference to India. J Biosci.33(4):593-603. 2008.

- RAVANELLO, M. L. Medidas de Controle de Infecções em Unidades de

Terapia Intensiva Prática Hospitalar, 30, 15-17, 2003.

- REESE, R. E.; BETTS, R. F. AND GUMUSTOP, B. Manual de

Antibióticos. 3º ed. Editora Médica e Científica Ltda – MEDSI, Rio de

Janeiro, pp.357-368, 2002.

- REIS, A.O.; GALES, A.C. & SADER, H.S. Avaliação da acurácia do teste

de adição clavulanato em disco para a detecção de amostras de

Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBL. J. Bras. Patol., 34: 85-93,

1998.

90




- ROE, M.T.; VEGA, E.; PILLAI, S.D. Antimicrobial resistance markers of

Class 1 and Class 2 integron bearing Escherichia coli from irrigation

water and sediments. Emerg. Infect. Dis. 9, 822-826. 2003.

- RUSSO, T.A.; STAPLETON, A.; WENDEROTH, S.; HOOTON, T.M.

AND STAMM. W.E. Chromosomal restriction fragment length

polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent

urinary tract infections in young women. J. Infect. Dis. 172:440-445,

1995.

- RUSSO, T.A.; CARLINO, U.B.; MONG, A.; JODUSH, S.T.; Identification

of genes in an extraintestinal isolate of Escherichia coli with increased

expression after exposure to human urine. Infect Immun;67: 5306–14.

1999.

- RUSSO, T.A., JOHNSON, J.R. Proposal for a new inclusive designation

for extraintestinal pathogenic isolates of Escherichia coli: ExPEC. J.

Infect. Dis. 181, 1753–1754, 2000.

- SADER, H.S. Bactérias Multirresistentes: Microbiologia, Epidemiologia e

Controle Prática Hospitalar, 30, 19-21, 2003.

- SADER, H.S. & JONES, R.N. In vitro antimicrobial activity of cefpirome

against ceftazidime-resistant isolates from two multicenter studies. Eur.

J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 13: 675-9, 1994.

- SADER, H. S.; GALES, A. C.; PFALLER, M. A.; MENDES, R. E.; ZOCCOLI, C.; BARTH, A.; JONES, R. N. Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals: summary of results from three years of the SENTRY antimicrobial surveillance program. Braz. J. Clin. Microbiol., v.5, p.200-214, 2001.

91

- SADER, H.S.; JONES, R.N.; ANDRADE-BAIOCCHI, S.; BIEDENBACH,

D.J. SENTRY Participants Group (Latin America). Four-year evaluation

of frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility patterns of

bacteria from bloodstream infections in Latin American medical centers.

Diagn MicrobiolInfect Dis. 44(3):273-80. 2002.

- SALYERS, A.A.; SHOEMAKER, N.B. Conjugative transposons: the force

behind the spread of antibiotic resistance genes among Bacteroides

clinical isolates. Anaerobe. 1(3):143-50. No abstract available. 1995.

- SAMBROOK, J. & RUSSELL, D.W. Molecular cloning: A laboratory

manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

- SANDERS, C.C.; SANDERS, W.E.JR. beta-Lactam resistance in gram-

negative bacteria: global trends and clinical impact. Clin Infect Dis. 1992

Nov;15(5):824- 39.

- SCHROEDER, C.M.; MENG, J.; ZHAO, S.; DEBROY, C.; TORCOLINI,

J.; ZHAO, C.; MCDERMOTT, P.F.; WAGNER, D.D.; WALKER, R.D.;

WHITE, D.G. Antimicrobial resistance of Escherichia coli O26, O103,

O111, O128, and O145 from animals and humans. : Emerg Infect

Dis.8(12):1409-14, 2002.

- SCHWARZ, S. CHASLUS-DANCLA, E. Use of antimicrobials in

veterinary medicine and mechanisms of resistence. Vet. Res. 32:201-

225, 2001.

- SIDJABAT, H.E.; TOWNSEND, K.M.; HANSON, N.D.; BELL, J.M.;

STOKES, H.W.; GOBIUS, K.S.; MOSS, S.M. TROTT, D.J. Identification

of blaCMY-7 and associated plasmid-mediated resistance genes in

92




multidrug-resistant Escherichia coli isolated from dogs at a veterinary

teaching hospital in Australia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 57,

840–848. 2006.

- SIROT, D.; SIROT, J. LABIA, R.; MORAND, A.; COURVALIN, P.;

DARFEUILLE-MICHAUD, A.; PERROUX, R.; CLUZEL, R. Transferable

resistance to third-generation cephalosporins in clinical isolates of

Klebsiella pneumoniae: identification of CTX-1, a novel beta-lactamase. J

Antimicrob Chemother. 20(3):323-34. 1987;

- SIROT, D.L.; GOLDSTEIN, F.W.; SOUSSY, C.J.; COURTIEU, A.L.;

HUSSON, M.O.; LEMOZY, J.; MEYRAN, M.; MOREL, C.; PEREZ, R.;

QUENTIN-NOURY, C. Resistance to cefotaxime and seven other beta-

lactams in members of the family Enterobacteriaceae: a 3-year survey in

France. Antimicrob Agents Chemother.36(8):1677-81. 1992.

- SOUZA JÚNIOR, M.A.; FERREIRA, E.S.; CONCEIÇÃO, G.C.

Betalactamases de espectro ampliado (ESBL): um importante

mecanismo de resistência bacteriana e sua detecção no laboratório

clínico. Newslab. 63ªed, 2004.

- SVANBORG-EDÉN, C.; DE MAN, P.; JODAL, U.; LINDER, H.;

LOMBERG, H. Host parasite interaction in urinary tract infection. Pediatr

Nephrol. 1(4):623-31. Review. 1987.

- STURENBURG, E.; MACK, D. Extended-spectrum beta-lactamases:

implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection

control. J Infect. 47(4):273-95. 2003.

93





- STURENBURG, E.; SOBOTTKA, I.; LAUFS, R.; MACK, D. Evaluation of

a new screen agar plate for detection and presumptive identification of

Enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases.

Diagn Microbiol Infect Dis. 51(1):51-5. 2005.

- SUNDE, M. Prevalence and characterization of class 1 and class 2

integrons in Escherichia coli isolated from meat and meat products of

Norwegian origin. J. Antimicrob. Chemother. 56, 1019-1024. 2005.

- TEIXEIRA, P. J. Z., HERTZ, F. T., CRUZ, D. B. Pneumonia associada à

ventilação mecânica: impacto da multirresistência bacteriana na

morbidade e mortalidade. J. bras. pneumol.,30 (6), 540-548, 2004.

- TENOVER, F. Mechanismis of antimicrobial resistance in bacteria.

American Journal of Infection Control. 34:S3-S10, 2006.

- TORTORA, J.; FUNKE, B.; CASE, C. Microbiologia. 6ª edição, São

Paulo, Artmed, p.827, 2002.

- TRABULSI, L. R; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4ª. ed. São Paulo:

Editora Atheneu, v. 1. p. 718 , 2005.

- VAN BELKUM, A., STRUELENS, M., DEVISSER, A., VERBRUGH, H. &

TIBAYRENC, M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary

genetics, and microbial epidemiology. Clin Rev Microbiol 14, 547±560,

2001.

- WALSH, C.T.; FISHER, S.L.; PARK, I.S.; PRAHALAD, M.; WU, Z.

Bacterial resistance to vancomycin: five genes and one missing

hydrogen bond tell the story. Chem Biol.3(1):21-8. Review. 1996.

94



- WILES, T.J., KULESUS, R.R.; MULVEY, M.A. Origins and virulence

mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. Experimental and

Molecular Pathology 85 11–19, 2008.

- WISE, R. The relentless rise of resistance? Journal of Antimicrobial

Chemotherapy 54(2):306-310. 2004

- WEBBER, M. A.; PIDDOCK, L. J. V. The importance of efflux pumps in

bacterial antibiotic resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy.51,

9–11. 2003.

- WEGENER, H.C. Antibiotics in animal feed and their role in resistance

development. Current opinion in Microbiology. V6, I5, P439-445.2003.

- WEINSTEIN, R.A.; NATHAN, C.; GRUENSFELDER, R.; KABINS, S.A.;

Endemic aminoglycoside resistance in gram-negative bacilli:

epidemiology and mechanisms J Infect Dis. 141(3):338-45. 1980

- WHITE, D.G.; ZHAO, S.; McDERMOTT, P.F. et al. Characterization of

antimicrobial resistance among Escherichia coli O111 isolates of animal

and human origin. Microb. Drug Resist. 8:139-46, 2002.

- WILLIAMSON, R.; CALDERWOOD, S.B.; MOELLERING, R.C. JR.;

TOMASZ, A. Studies on the mechanism of intrinsic resistance to beta-

lactam antibiotics in group D streptococci. J Gen Microbiol. 129(3):813-

22. 1983.

95



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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kabins%20SA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Gruensfelder%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Nathan%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Weinstein%20RA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

- WORLD HEALTH ORGANIZATION. Informal Information Meeting on

Antimicrobial Resistance Surveillance in Foodborne Pathogens. Geneva:

WHO. 1999.

- YAMAMOTO S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia

coli. J Infect Chemother 13: 68-73, 2007.

- YAMAMOTO, S.; TSUKAMOTO, T.; KURAZONO, H.; TAKEDA, Y.;

YOSHIDA, O. Distribution of virulence factors in Escherichia coli isolated

from urine of cystitis patient. Microbiology and Immunology 39, 401–404.

1995.

- YAMAMOTO, S.; TERAI, A.; YURI, K.; KURAZONO, H.; TAKEDA, Y.;

YOSHIDA, O.; Detection of urovirulence factors in Eschericiha coli by

multiplex polymerase chain reaction. FEMS Immunol Med Microbiol

12:85–90./3.1995.a

- TERAI, A.; YAMAMOTO, S.; MITSUMORI, K.; OKADA, Y.; KURAZONO,

H.; TAKEDA, Y.; YOSHIDA, O. Escherichia coli virulence factors and

serotypes in acute bacterial prostatitis. Int J Urol 4:289–97. 1997.

- YAN, F.; POLK, D.B. Commensal bacteria in the gut: learning who our

friends are. Curr. Opin. Gastroenterol. 20, 565–571, 2004.

- YANG, Y.L.; LAUDERDALE, T.L.; LO, H.J. Molecular mechanisms of

fluoroquinolone resistance in Klebsiella. Curr Drug Targets Infect

Disord;4(4):295-302. Review. 2004.

96



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