UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE … Anézia Lima... · e ferramentas para alcançar mais esta vitória em minha vida. ... conquistada nestes dois anos, ... ion-exchange

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

ANÉZIA LIMA CHAVES RIBEIRO

IMPLEMENTAÇÃO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO

SIMULTÂNEA DE GLIFOSATO E AMPA (ACIDO AMINOMETILFOSFÔNICO) EM

ÁGUAS NATURAIS POR IC/CONDUTOMETRIA

NITERÓI-RJ

2011





Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal Fluminense, Como requisito

parcial para a obtenção do Grau de Mestre em

Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. SILVANA VIANNA RODRIGUES

Niterói

2011

II

II

III





Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal Fluminense, como requisito

parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área

de Concentração: Ciências Aplicadas a Produtos

para Saúde.

Aprovada em dezembro de 2011.

Niterói

2011

IV

Dedico todo o mérito deste trabalho a Deus, e

às pessoas que sempre estiveram ao meu lado

me encorajando nas horas difíceis: minha mãe

Dina, meus filhos Sarah, Amanda, Matheus e

ao meu esposo Sérgio por todo amor e carinho.

Amo vocês!

V

AGRADECIMENTOS

A Deus que me permitiu trilhar os caminhos da pesquisa e por ter me dado forças nos

momentos em que os obstáculos pareciam intransponíveis, transmitindo perseverança

e ferramentas para alcançar mais esta vitória em minha vida.

Ao meu esposo Sérgio pelo privilégio de tê-lo ao meu lado, pela compreensão, amor e

apoio em todos os momentos abdicando de seus projetos em favor dos meus. Eu te

amo meu querido!

Aos meus amados filhos Sarah, Amanda e Matheus pelo carinho, amor, e por tantas

alegrias proporcionadas, é um privilégio poder ser a mãe de vocês.

A minha mãe pelo apoio em todos os momentos difíceis de minha vida.

A minha querida orientadora professora Drª Silvana Vianna Rodrigues meu expressivo

agradecimento, que por duas vezes aceitou me orientar, me apoiou com todo o seu

conhecimento e confiança possibilitando a execução deste projeto.

À Juliana de Freitas colaboradora da Metrohm, pelo apoio e por todas as suas decisivas

participações na condução deste projeto, no planejamento e programação do gradiente,

a sua contribuição foi fundamental para que este trabalho pudesse ter sido realizado.

À Universidade Federal Fluminense, a Faculdade de Farmácia e o Departamento de

Química, pela oportunidade que me concedeu de realizar este trabalho.

À Coordenadora do mestrado querida professora Dra. Kátia pelo carinho e dedicação e

estímulo para que eu caminhasse com este estudo. A todos os docentes da pós-

graduação em especial à profª Drª Vilma Blondet e ao prof.Dr. Wilson da Costa Santos.

VI

À secretária da pós-graduação Adelina, pela delicadeza e carinho.

À Sueli Apati pelo apoio na condução deste trabalho.

Ao prof. Dr. Anderson Araújo Rocha, do Departamento de Química Analítica da

Universidade Federal Fluminense pela participação na execução do projeto.

Ao Professor Dr. Alberto Garcia Figueiredo Junior e sua equipe pelas coletas das

amostras de água superficial.

À Wânia Quintão e Lelo Coimbra pelo carinho, pela amizade e por me apoiar neste

projeto e oferecer-me oportunidades fundamentais, sem as quais, o meu sonho não

tornaria realidade.

As amigas da república: Percilene, Luciana, Carol, Adriana e Brígida, pela amizade

conquistada nestes dois anos, vocês foram durante o mestrado a minha “segunda

família”.

Aos colegas da farmácia do Hospital Antônio Bezerra de Farias, que me apoiaram e

não mediram esforços para me ajudar nas trocas de plantões; sem a colaboração de

todos vocês, eu não teria chegado até aqui, meus sinceros agradecimentos.

À Tânea, que não mediu esforços em me ajudar a finalizar este trabalho.

A equipe do laboratório de cromatografia da professora Silvana - UFF: Carlos, Dani,

Rafael, Cássia, Messias, Carol , Roberta e Jonas. Em especial ao Vinicius, pela

paciência, carinho, amizade, companheirismo e apoio incondicional nos momentos

difíceis. Você é muito especial!

A todos aqueles que de alguma forma também me apoiaram durante a execução deste

trabalho e cujos nomes não foram citados aqui. MUITO OBRIGADA!

VII

RESUMO

O glifosato é um herbicida organofosforado amplamente utilizado que constitui um poluente potencial do meio ambiente; ácido aminometilfosfônico (AMPA) é o seu principal metabólito. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método direto rápido e sensível para a quantificação dos herbicidas, a fim de monitorar seus resíduos na água de diferentes fontes. Além disso, este estudo teve como objetivo elaborar um procedimento para a determinação simultânea de glifosato, AMPA e F-, Cl-, Br-, NO3

-, SO4

2- e PO43- na água. Em ambos os casos, foram usados a cromatografia de troca

iônica com detecção condutométrica. A determinação de glifosato pode ser realizada em modo isocrático (6,0 mmol L-1 Na2CO3 e 2,0 mmol L-1 NaHCO3), enquanto a separação simultânea de glifosato, AMPA e ânions foi realizada por gradiente com as seguintes fases móveis: A: 15,0 mmol L-1 NaOH + 1,0 mmol L-1 Na2CO3 e B : Na2CO3 -15,0 mmol L-1. A confirmação de espécies AMPA (m / z = 110) e glifosato (m / z = 168) foi realizada pelo IC-MS. A determinação do isótopo 31P por ICPMS permitiu a determinação indireta destas espécies e um teste de recuperação resultou em cerca de 105%. O método foi validado utilizando matrizes de agua ultrapura, agua superficial, mineral e água subterrânea. Por eluição isocrática, os limites de detecção (LODs) encontrados para o glifosato foram: 10 µgL-1 em água ultrapura , 54 µgL-1 em água subterrânea. Para a determinação simultânea de glifosato e AMPA, os LODs foram: 9,6 µgL-1 , 9,8 µgL-1 (água ultrapura), 9,5 µgL-1 , 60 µgL-1 (água mineral), 12,4 , 29,7 µgL-1 (agua superficial) respectivamente para glifosato e AMPA. A determinação de glifosato por IC/Condutimetria mostrou-se adequada à aplicação em águas naturais, alcançando valores de LD muito abaixo dos permitidos pela legislação vigente (500 µgL-1; Portaria MS 518 de 25/03/2004 e Resolução CONAMA 396 de 03/04/2008) e, também outros órgão internacionais como EPA, sem necessidade de preparação prévia da amostra como extração, pré-concentração e derivatização.

VIII

ABSTRACT

Glyphosate is a widely used organophosphorated herbicide, which constitutes a potential pollutant of the environment; aminomethylphosphonic acid (AMPA) is its main metabolite. The purpose of this study was to develop a direct, rapid and sensitive method for quantification of the herbicide in order to monitor its residues in water from different sources. Furthermore, this study aimed to draw up a procedure for the simultaneous determination of glyphosate, AMPA and F-, Cl-, Br-, NO3

-, SO42- and PO4

3- in water. In both cases, ion-exchange chromatography with conductimetric detection were used. The determination of glyphosate could be performed in isocratic mode (6.0 mmol L-1 Na2CO3 and 2.0 mmol L-1 NaHCO3), while the simultaneous separation of glyphosate, AMPA and anions was performed by gradient elution with the following mobile phases: A - 15.0 mmol L-1 NaOH + 1.0 mmol L-1 Na2CO3 and B - 15.0 mmol L-1 Na2CO3. Confirmation of species AMPA (m/z = 110) and glyphosate (m/z = 168) were carried out by IC-MS. The determination of the isotope 31P by ICPMS allowed the indirect determination of these species and a recovery test resulted in about 105%. The method was validated using ultrapure, river, mineral and groundwater. With isocratic elution, limits of detection (LODs) of 10 µg L-1 in ultrapure water and 54 µg L-1 in groundwater were found for glyphosate. For the simultaneous determination of glyphosate and AMPA, LODs were, respectively, 9.6 µg L-1, 9.8 µg L-1 (ultrapure water), 9.5 µg L-1, 60 µg L-1 (mineral water), 12.4 µg L-1, 29.7 µg L-1 (river water). The determination of glyphosate IC / Conductimetry proved to be suitable for application in natural waters, reaching LD values far below those allowed by legislation (500 µg L-1), MS portaria 518 of 25/03/2004 and CONAMA Resolution 396 of 03 / 04/2008), and also other international bodies such as EPA, without previous sample preparation and extraction, pre-concentration and derivatization.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 3.1 - Estrutura dos compostos Glifosato e ácido aminometilfosfônico

(AMPA)

24

Figura 3.2 - Rotas de decomposição microbiológica do glifosato.......................... 26

Figura 3.3 -Constantes de dissociação ácida do glifosato. (modificada)............... 27

Figura 3.4 -Constantes de dissociação ácida do AMPA. (modificada)................... 28

Figura 5.1 - Equipamento de Cromatógrafo de íons Metrohm.............................. 41

Figura 5.2 - Localização dos pontos de amostragem de aguas superficiais......... 46

Figura 5.3 - Localização dos poços de monitoramento de água subterrânea........ 47

Figura 6.1 – Cromatograma obtido por eluição isocrática na técnica CI/condutimetria:

em preto água ultrapura, em vermelho padrão de glifosato 125 µg L-1

(Condições: T = 27 ºC, Vazão = 0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1

e NaHCO3 2,0 mmol L-1.).................................................................................

49

Figura 6.2 - Cromatograma obtido por IC/MS do padrão de glifosato 500 µg.L-1

(Condições: T= 27ºC, Vazão=0,8 mL.min-1, eluente: Na2CO3 6,0

mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1, n = 2)............................................

49

Figura 6.3 - Zoom do Cromatograma na faixa de tempo de retenção do

glifosato para padrões de glifosato 250 (verde); 500 (vermelho) e

1000 µg L-1 (preto). Condições: T = 27 ºC, Vazão = 0,8 mL min-1,

eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0mmolL-1...........................

50

X

XI

Figura 6.4 - Cromatograma do padrão de glifosato 500 µg L-1 (6),e dos ânions

na concentração de 1000 µg L-1: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3)

brometo e nitrato; (4) sulfato e (5) fosfato. (Condições: T = 27 ºC,

Vazão = 0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3

2,0 mmol L-1; Detecção: IC/condutometria)..........................................

51

Figura 6.5 - Cromatograma do padrão de glifosato 500 µg L-1 (7), e dos ânions

na concentração de 1000 µg L-1: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3) brometo

(4) nitrato; (5) sulfato e (6) fosfato. (Condições: T = 27 ºC, Vazão =

0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol

L-1; Coluna: 25 cm; Detecção: IC/condutometria.................................

52

Figura 6.6 - Cromatograma do padrão de glifosato 500 µg L-1 (8), e dos ânions

na concentração de 1000 µg L-1: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3, 4)

brometo; (5) nitrato; (6) sulfato e (7) fosfato. (Condições: T = 27 ºC,

Vazão = 0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 2,0 mmol L-1 e NaHCO3

2,0 mmol L-1; Coluna: 25 cm; Detecção: IC/condutometria)................

52

Figura 6.7 Cromatograma obtido por CI/condutimetria na determinação de

ânions (Fluoreto e cloreto 100 µgL-1 brometo, nitrato e sulfato 200

µgL-1 e fosfato 300 µgL-1) e glifosato (500 µg.L-1). Sinais: 1

fluoreto; 2 cloreto; 3 ou 4 brometo; 5 nitrato; 6 sulfato; 7 fosfato; 8

glifosato.................................................................................................

53

Figura 6.8 - Cromatograma obtido por CI/condutimetria na determinação de

ânions (Fluoreto e cloreto 100 µg gL-1 brometo, nitrato e sulfato 200

µg gL-1 e fosfato 300 µg gL-1) e glifosato (500 µg gL-1). Sinais: 1

fluoreto; 2 cloreto; 3 brometo; 4 nitrato; 5 sulfato; 6 fosfato; 7 glifosato

54

Figura 6.9 - Cromatograma de padrões de AMPA (5) e glifosato (8), ambos em

XII

500 µg L-1, e dos ânions (Fluoreto e cloreto 100 µ gL-1 brometo,

nitrato e sulfato 200 µ gL-1 e fosfato 300 µ gL-1): Sinais: (1) fluoreto;

(2) cloreto; (3) brometo (4) nitrato; (6) sulfato e (7) fosfato.

(Condições: T = 27 ºC; Vazão = 0,75 mL min-1; Coluna: 25 cm;

Detecção: IC/condutometria).

56

Figura 6.10 - Cromatograma obtido por IC-MS confirmando a presença de

AMPA (m/z= 110, 10 minutos) e glifosato (m/z= 168, 30 minutos) no

ensaio apresentado na figura 6.11........................................................

56

Figura 6.11 - Cromatograma obtido por IC/Condutimetria utilizando padrões de

glifosato e AMPA 300 µg L-1 em matriz de água ultrapura com as

seguintes condições cromatográficas: A - NaOH 15,0 mmol L-1 +

Na2CO3 1,0 mmol L-1 pH 12,09 e B - Na2CO3 15,0 mmol L-1 pH 11,4.

Sinais: A glifosato; B, AMPA; C, AMPA (1) e Glifosato (2)...................

57

Figura 6.12 - Ilustração da IC e acompanhamento do pH em diferentes pontos do

equipamento durante uma corrida cromatográfica...........................

58

Figura 6.13 - Curvas analíticas das moléculas AMPA e glifosato para a técnica

de ICP-MS.............................................................................................

60

Figura 6.14 - Curvas analítica para fósforo inorgânico em matriz aquosa na

técnica de ICP-MS................................................................................

60

Figura 6.15 - Determinação de fósforo em ICP-MS para eluição de AMPA e

glifosato (1 mg L-1)................................................................................

61

Figura 6.16 - Determinação de fósforo em ICPMS para eluição de: (1) AMPA, (2)

fosfato e (3) glifosato (1 mg L-1)..............................................................

62

XIII

Figura 6.17 - Recuperação, em termos de fósforo inorgânico (ICPMS), em

amostras de AMPA, glifosato e na mistura destes ...............................

63

Figura 6.18 - Cromatogramas obtido no método isocrático, em matrizes de água

subterrânea. Amostra isenta de glifosato (preto); amostra contendo

glifosato com fortificação de 125 µg.L-1(vermelho) (Condições T=

27ºC, Vazão=0,8 mL.min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e

NaHCO3 2,0 mmol L-1. Detecção: IC/Condutimetria)..........................

64

Figura 6.19 - Cromatogramas obtidos em matriz de água mineral: em preto, sem

fortificação e em vermelho fortificada com 300 µg L-1 de glifosato e

AMPA. (Condições: Condições: T = 27 ºC; Vazão = 0,75 mL min-1;

eluição; gradiente 3, Coluna: 25 cm; Detecção: IC/condutometria) ....

65

Figura 6.20 - Cromatogramas obtidos em matriz de água superficial: (Preto) no ponto

S6, sem fortificação; (vermelho) “pool” de águas dos pontos S1, S2, S3,

S4, S5 e S6, fortificado com 300 µg L-1 de glifosato e AMPA (sinal 1) e

glifosato e (sinal 2 ). Condições iguais às realizadas na figura 6.19..............

65

Figura 6.21 - Curvas analíticas de glifosato em matriz água ultrapura (A) e água

subterrânea (B), obtidas por eluição isocrática, detecção

condutométrica......................................................................................

67

Figura 6.22 - Curvas analíticas de glifosato nas matrizes: água ultrapura (A) água

mineral (B) água superficial (C), obtidas por eluição por gradiente,

detecção condutométrica. ....................................................................

68

Figura 6.23 - Curvas analíticas de AMPA nas matrizes: água ultrapura (A) e água

mineral (B), obtidas por eluição por gradiente, detecção

condutométrica .....................................................................................

69

XIV

Figura 6.24 - Curva analítica de AMPA na matriz de água superficial (C) obtida

por eluição por gradiente , detecção por condutometria....................

70

Figura 6.25 - Curva analítica de glifosato em matriz água ultrapura obtida por

eluição isocrática e IC-MS ...................................................................

70

Figura 6.26 - Cromatograma obtido para a amostra P7C1 nas seguintes

condições: T= 27ºC, Vazão=0,8 ml/min, Eluição isocrática: Na2CO3

6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1. Em vermelho, amostra pura

mostrando o pico do glifosato, em preto a mesma amostra fortificada

com padrão de glifosato 500 µg L-1......................................................

75

Figura 6.27 - Cromatograma obtido por IC/MS, modo SIM, m/z = 168, para a

amostra P7C1; sinal do glifosato aproximadamente em 11 minutos.

(Condições: T= 27ºC, Vazão=0,8 ml/min, Eluição isocrática: Na2CO3

6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1) ..................................................

75

XV

LISTA DE TABELAS

TABELA 3.1 - Propriedades físico-químicas do glifosato…………………………… 27

TABELA 3.2 - Resumo das técnicas de análise dos compostos glifosato e

AMPA em água relatadas na literatura..............................................

37

TABELA 5.1 – Programa otimizado para eluição por gradiente dos componentes

glifosato, AMPA, F-, Cl-, Br-, NO3-, SO42- e PO43- por CI com

detecção condutimétrica.....................................................................

43

TABELA 6.1 - Determinação de fósforo nas moléculas orgânicas pela técnica

de ICPMS, usando como referência a curva analítica de P

inorgânico (figura 1)………………………………………………………

61

TABELA 6.2 - Concentrações testadas nas amostras submetidas ao teste de

recuperação de fósforo e determinadas no ICPMS...........................

63

TABELA 6.3 - Desempenho analítico do método proposto - Determinação do

glifosato por eluição isocrática............................................................

72

TABELA 6.4 Desempenho analítico do método proposto – Determinação

simultânea de glifosato e AMPA por eluição por gradiente................

72

XVI

LISTA DE APÊNDICES

Apêndice A1: Concentrações do padrão de Glifosato que compõem a curva analítica elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com glifosato obtidos por eluição isocrática.............................................

89

Apêndice A2: Concentrações do padrão de Glifosato que compõem a curva a analítica elaborada com matriz em água subterrânea fortificada m

com glifosato obtidas por eluição isocrática.........................................

89 Apêndice A3: Concentrações do padrão de Glifosato que compõem a curva

analítica elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com glifosato obtidas por eluição isocrática, IC-MS.................................


analítica elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato, obtida por eluição por gradiente........................................................................

90

Apêndice A5: Concentrações do padrão de AMPA que compõem a curva

analítica elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato, obtida por eluição por gradiente.........................................................................


analítica elaborada com matriz em água mineral, obtida por eluição por gradiente....................................................................

91

Apêndice A7: Concentrações do padrão de AMPA que compõem a curva

analítica elaborada com matriz em água mineral, obtida por eluição por gradiente.........................................................................

92

Apêndice A8: Concentrações do padrão de Glifosato que compõem a curva

analítica elaborada com matriz em água superficial, obtida por eluição por gradiente.........................................................................

92 Apêndice A9: Concentrações do padrão de AMPA que compõem a curva

analítica elaborada com matriz em água superficial, obtida por eluição por gradiente.........................................................................

93

XVII

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPA - Ácido Aminometilfosfônico

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

APA - Área de Proteção Ambiental

HCl - Ácido clorídrico

H3PO4 - Ácido fosfórico

EDTA - Ácido etileno diamino tetraacético

NaHCO3 - Bicarbonato de sódio

Na2CO3 - Carbonato de sódio

CONAMA - Conselho Nacional do Meio ambiente

CEE - Comunidade Econômica Européia

CNBF - Cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoreto

IC - Cromatografia de íons

CLAE - Cromatografia a líquido de alta eficiência

GC - Cromatografia a gás

DL50 - Dose letal

EFS/SPE - Extração em fase sólida

EPSPS - Enolpiruvil chiquimato-fosfato sintase

ELISA - Enzyme-linked immunosorcent assay

USEPA - Agencia de Proteção Ambiental dos Estados Unidos

FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e

Alimentação

FMOC-CL - Fluorenilmetilcloroformato

XVIII

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

LD - Limite de Detecção

LQ - Limite de Quantificação

Na2HPO4 - Fosfato monobásico de sódio

NH4OH - Hidróxido de amônio

KOH - Hidróxido de potássio

NaOH - Hidróxido de sódio

NH4NO3 - Nitrato de amônio

POEA - Polioxietileneamina

RPM - Rotações por minuto

TFAA - Anidrido trifluor acético

TFE - Trifluoretanol

UV/vis - Ultravioleta/visível

XIX

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES……………………………………………………………… X LISTA DE TABELAS……………………………………………………………………..... XV LISTA DE APÊNDICES……………………………………………………………………XVI LISTA DE ABREVIATURAS……………………………………………………………….XVII 1 INTRODUÇÃO………………………………………................................................ 21 2 OBJETIVO………………………………………...…………………………………….. 23 3 REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………………….. 24 3.1 O HERBICIDA GLIFOSATO...................................................................................... 24 3.1.1 Degradação do glifosato……………………………………………………. 25 3.1.2 Propriedades físico-químicas do glifosato………………………………... 26 3.1.3 Legislação............................................................................................... 29 3.1.4 Efeitos tóxicos do glifosato…………………………………………………. 29 3.2 CROMATOGRAFIA………………………………………………………………………… 31 3.2.1 Cromatografia de íons............................................................................ 31 3.3 MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DE GLIFOSATO E AMPA........................... 33 4 ÁREA DE ESTUDO

39

5 METODOLOGIA……………………………………………………………………….. 40 5.1 EQUIPAMENTOS E REAGENTES............................................................................ 40 5.2 DETERMINAÇÃO DE GLISOFATO E AMPA POR IC/CONDUTIMETRIA.................. 42 5.2.1 Eluição isocrática…………………………………………………………….. 42 5.2.2 Eluição por gradiente............................................................................... 43 5.3 ESPECTROMETRIA DE MASSAS............................................................................. 44 5.4 APLICAÇÃO EM AMOSTRAS DE ÁGUAS.................................................................. 44 5.4.1 Procedimentos de coleta das amostras…………………………………… 45 5.4.2 Locais de Amostragem……………………………………………………….. 45 5.4.2.1 Águas minerais....................................................................................... 45 5.4.2.2 Águas superficiais………………………………………………….……… 46 5.4.2.3 Águas subterrâneas……………………………………………………….. 47

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO………………………………………………………. 48 6.1 DETERMINAÇÃO DE GLISOFATO EM ÁGUA COM ELUIÇÃO ISOCRÁTICA……. 48 6.1.1 Presença de ânions comuns (F-, Cl-, Br-, NO3-, SO42-,PO43-)…….… 50

XX

6.2 ELUIÇÃO POR GRADIENTE PARA OTIMIZAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DE GLISOFATO...............................................................................................................

53

6.3 DETERMINAÇÃO DO PRINCIPAL METABÓLICO DO GLISOFATO: AMPA.............. 54 6.4 DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO POR ICPMS……………………………………….. 59 6.5 VALIDAÇÃO METODOLÓGICA…………………………………………………………. 64 6.6 6 Determinação de glifosato e AMPA em amostras de águas naturais.......... 74 7 CONCLUSÕES e PERSPECTIVAS…………………………………………………… 76 8 REFERÊNCIAS………………………………………………………………………… 78 9 APÊNDICES……………………………………………………………………………. 89

21

1 INTRODUÇÃO

Segundo a Organização para a Agricultura das Nações Unidas (FAO), pesticidas

são substâncias ou uma mistura destas, destinados ao uso nos setores de produção,

armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção

de florestas nativas ou plantadas e de outros ecossistemas, cuja finalidade seja alterar

a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa dos seres

vivos considerados nocivos (BRASIL. Legislação Brasileira. Decreto nº 4074, 4 de

janeiro de 2002; OGA et al., 2008).

Definição semelhante à da FAO é usada na legislação brasileira, para

agrotóxicos, que substituiu o termo defensivo agrícola, para evidenciar a toxicidade

desses produtos para o meio ambiente e à saúde humana. Estes produtos também são

utilizados como desfolhantes, dessecantes, estimulantes e inibidores do crescimento

das plantas, além de serem também aplicados no combate a insetos domésticos e no

controle de vetores nos programas de saúde pública (OGA et al.,2008).

O homem vem interferindo nos ecossistemas por meio da aplicação direta destas

substâncias de acordo com seus interesses e necessidades.

A água é um recurso natural essencial para o desenvolvimento e manutenção da

vida na terra. É um bem social, indispensável à qualidade de vida da população, que

apresenta usos intensivos e diversificados; é vital para a manutenção dos ciclos

biológicos, geológicos e químicos que mantêm em equilíbrio os ecossistemas.

A preocupação com a contaminação de ambientes aquáticos aumenta

principalmente quando a água é usada para o consumo humano e, neste sentido, o

mesmo deve ser o foco das ações; sendo assim, o monitoramento de pesticidas no

22

ambiente é uma ferramenta importante no gerenciamento dos riscos ambientais

decorrentes do uso desses produtos, na identificação de áreas potencialmente

contaminadas e na avaliação da qualidade da água (RIBEIRO et al., 2007).

Muitas são as consequências indesejáveis do uso de pesticidas, dentre elas

podem ser citadas a presença de resíduos destas substâncias no meio ambiente, no

solo, água, alimentos, no leite materno, além da contaminação ocupacional (OGA et al.,

2008).

Além dos perigos aos seres humanos, nos aspectos ocupacionais, alimentares e

de saúde pública, Oga e colaboradores (2008), relatam que os pesticidas são

responsáveis por inúmeros casos de intoxicação.

O herbicida glifosato destaca-se como um dos principais agrotóxicos

empregados em toda agricultura brasileira e mundial (ARAÚJO et al., 2001). É relevante

que haja uma preocupação com os efeitos que os pesticidas causam aos seres

humanos, e há necessidade da definição de políticas públicas que levem em

consideração não só a questão econômica, mas principalmente, a saúde da população.

Conforme a Constituição Federal de 1988 em seu artigo 196, “a saúde é direito

de todos e dever do Estado, garantido mediante políticas sociais e econômicas que

visem à redução do risco de doença e de outros agravos“. Com o entendimento que o

consumidor é o elo mais fraco na cadeia de consumo, ele encontra-se a mercê de uma

série de riscos. Cabe, portanto ao Estado monitorar e fornecer água com qualidade

sanitária para o consumo humano.

O controle dos resíduos de agrotóxicos no meio ambiente, principalmente na

água, é fundamental e, diante do exposto, é cada vez mais necessário o

desenvolvimento de métodos analíticos que permitam o monitoramento destas

substâncias, e que tais metodologias possam aliar rapidez e eficiência, dentre outras

características positivas.

23

2. OBJETIVO

A proposta deste estudo foi desenvolver um método analítico simples e de baixo

custo, além de rápido e com sensibilidade suficiente para ser aplicável à determinação

simultânea de glifosato e um metabólito deste (ácido aminometilfosfônico - AMPA),

destinado ao seu monitoramento no meio ambiente e na água para consumo humano.

Os objetivos específicos podem ser definidos como:

• Avaliar o comportamento de separação dos analitos glifosato e

AMPA em coluna de troca iônica para diferentes fases móveis;

• Desenvolver uma metodologia analítica para quantificação das

substâncias glifosato e AMPA em água por condutimetria, após separação

cromatográfica de íons;

• Validar a metodologia com auxílio da técnica de Espectrometria de

Massa e caracterizar as figuras de mérito do método;

• Aplicar a metodologia otimizada em amostras de água

(subterrânea, superficial e envasada para o consumo humano).

24

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 O HERBICIDA GLIFOSATO

O glifosato N-(fosfonometil)-glicina é um herbicida organofosforado não inibidor

da colinesterase, pertencente ao grupo químico das glicinas substituídas, o ácido

aminometilfosfônico (AMPA) é o seu principal metabólito (OGA et al., 2008). O glifosato,

que tem sido utilizado na agricultura durante os últimos anos, é um agrotóxico sistêmico

não seletivo, pós-emergente, com largo espectro de ação e excelente desempenho no

controle de uma variedade de ervas daninhas. Este composto apresenta forte retenção

sobre o solo, uma meia vida em torno de 47 dias e alta solubilidade em água. A

solubilidade em água indica a tendência de um pesticida de ser lixiviado

superficialmente do solo, por águas de chuva ou de irrigação e atingir águas superficiais

(QIAN et al., 2009). A fórmula estrutural do glifosato e do AMPA é mostrada na figura

3.1.

O

P

O

OH

OH NHOH

OH P

OH

O

NH2

Glifosato AMPA

Figura 3.1 - Estrutura dos compostos Glifosato e ácido aminometilfosfônico (AMPA).

25

Conforme OGA e colaboradores (2008), os organofosforados exercem sua ação

principalmente por inibição enzimática e a acetilcolinesterase constitui o principal alvo

da toxicidade destes pesticidas. A inibição da acetilcolinesterase leva ao acúmulo nas

terminações nervosas da acetilcolina, que é o mediador químico necessário para a

transmissão do impulso nervoso em todas as fibras ganglionares do sistema nervoso

autônomo.

Em vegetais, o glifosato é absorvido através de suas folhas e dos caulículos

novos, depois é transportado por toda a planta; atua como um inibidor da enzima 5-

enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase (EPSPs), afetando a biossíntese de

aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina, e tirosina), considerados essenciais

para as plantas, provocando a redução da síntese proteica, a interrupção do

crescimento e morte celular. Esta via é um mecanismo exclusivo para os vegetais, os

sintomas de sua ação sobre as plantas incluem “amarelamento” dos meristemas,

seguido de necrose e morte em dias ou semanas. (AMARANTE JUNIOR et al., 2002).

3.1.1 Degradação do glifosato

A degradação de um pesticida ocorre quando há alteração na estrutura

molecular do composto e, para os que estão presentes no solo, este processo pode ser

devido a fatores abióticos ou bióticos. No caso do glifosato, o principal meio de

degradação é através da ação de microrganismos presentes no solo e na água.

A degradação do glifosato no solo pode seguir duas principais rotas de

biodegradação. A primeira via, consiste na clivagem da ligação C-P do glifosato, pela

ação da enzima C-P liase, produzida pela bactéria Anthrobacter atrocyaneus, gerando a

sarcosina, que entra no metabolismo destes microrganismos, se degradando. A

segunda rota envolve a clivagem da molécula produzindo AMPA, a partir da bactéria

Flavobacterium sp (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002). As rotas de degradação

microbiológica estão representadas na figura 3.2.

26

O

P

O

OH

OHNH

OH

Glifosato

C-P liase

O

OHNH CH3

O

P

O

OH

OHNH

OH

Glifosato

Anthrobacter atrocyaneus Flavobacterium sp

NH2 P

O

OHOH

ácido aminometilfosfônico (AMPA)

NH2 CH3

Metilamina

Metilamina dehidrogenase

OH

H

Formaleído

C-P liase

Sarcosina

Figura 3.2 - Rotas de decomposição microbiológica do glifosato.

De acordo com Chen e colaboradores (2009), extratos de solos fortificados com

glifosato foram degradados a AMPA após 10 horas sendo que, em solos ácidos, os

quais apresentam maior concentração de matéria orgânica resultaram em menor

degradação do glifosato em relação a solos neutros.

3.1.2 Propriedades físico-químicas do glifosato

As propriedades físico-químicas e a classificação toxicológica do glifosato estão

descritas na tabela 3.1.

27

TABELA 3.1: Propriedades físico-químicas do glifosato

Propriedades Características

Aparência em condições ambientais Sólido cristalino

Nomenclatura IUPAC [N-(fosfonometil)-glicina]

Peso molecular 169,1 g/ mol-1

Solubilidade em água 12 g L-1 (20 °C)

Solubilidade em solventes orgânicos Insolúvel

Ponto de fusão 200 °C

Categoria iônica Anfótero

Classe toxicológica III

Segundo AMARANTE JÚNIOR et al., (2002), o glifosato é bastante estável em

presença de luz, inclusive em temperaturas superiores a 60 °C. Esta substância

apresenta as seguintes constantes de dissociação ácida: pK1 = 0,8; pK2 = 2,16; pK3 =

5,46 e pK4 = 10,14, como mostrado na figura 3.3. Em pH superior a 11,0, pode-se

considerá-lo como completamente dissociado.

P

OH

OH

O

N+

H2O

OH

pK1

0,8P

OH

O-

O

N+

H2O

OH

P

OH

O-

O

N+

H2O

OH

pK2

2,2 P

OH

O-

O

N+

H2O

O-

P

OH

O-

O

N+

H2O

O-

pK3

5,4 P

O-

O-

O

N+

H2O

O-

P

O-

O-

O

N+

H2O

O-

pK4

10,2 P

O-

O-

O

N

H O

O-

+ H+

+ H+

+ H+

+ H+

Figura 3.3 - Constantes de dissociação ácida do glifosato (adaptada de AMARANTE JUNIOR et

al., 2002).

28

O AMPA apresenta três constantes de dissociação ácida: pK1 = 1,8; pK2 = 5,4;

pK3 =10,0, e suas respectivas espécies pertencentes a estes equilíbrios são descritas

na figura 3.4.

pK1

1,8

P

OH

O-

O

H3N+

pK2

5,4

pK3

10,0

+ H+

+ H+

+ H+

P

OH

OH

O

H3N+

P

O-

O-

O

H3N+

P

O-

O-

O

H2N

P

O-

O-

O

H3N+

P

OH

O-

O

H3N+

Figura 3.4 - Constantes de dissociação ácida do AMPA (adaptada de CHEN et al., 2009).

Estes dois compostos, dependendo do pH, são ânions polivalentes e,

consequentemente podem ser fortemente retidos na coluna de troca iônica.

Como mostra a Figura 3.3, em pH abaixo de 0,8, a maior parte do glifosato se

apresenta com uma carga positiva, correspondente à protonação no grupo amino. Em

pH 0,8, valor da primeira constante, 50% das moléculas sofreram uma dissociação no

grupo fosfato e, por consequência, a molécula tem carga liquida zero. Acima do pH 2,2

é favorecida a dissociação no grupo carboxílico, conferindo uma carga negativa à

molécula. No pH 5,4, tem-se partes iguais das moléculas com uma e duas cargas

negativas e, a partir do pH 10,2, passa a predominar a molécula com 3 cargas

negativas, devido à desprotonação do nitrogênio.

29

3.1.3 Legislação

A regulamentação destas substâncias em água potável, superficial e subterrânea

tem atraído atenção considerável de órgãos governamentais em nível mundial; o seu

monitoramento é recomendado pela Agencia de Proteção Ambiental dos Estados

Unidos - Environmental Protection Agency (EPA), que estabeleceu o limite de 700 µg L-

1 em água potável (BARCELÓ, 1993). Já a Comunidade Econômica Européia (EEC)

fixou o limite máximo individual de pesticidas 0,1 µg L-1 em água potável para a maioria

dos agrotóxicos, desde que a concentração total destas substâncias não ultrapasse 0,5

µg L-1 (Council Directive, 1998). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA), através da Portaria MS 518 de 25/03/2004, fixou o limite máximo de glifosato

em 500 µg L-1 em água potável. O Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA),

em sua resolução de número 396 (03/04/2008) estabeleceu um limite de 500 µg L-1

para a mistura glifosato e AMPA, em se tratando de água para o consumo humano.

3.1.4 Efeitos tóxicos do glifosato

Sob o ponto de vista toxicológico a classificação dos agrotóxicos é feita em

função do perigo que a substância representa. Conforme a dose letal (DL50) oral e

dérmica para ratos, os pesticidas podem ser classificados em quatro categorias. O

glifosato é classificado como classe III (BRASIL, 2002).

Segundo Garrido e Sonego (2003) o grau de toxicidade destas substâncias

também pode ser destacado com uma faixa colorida no rótulo das embalagens que

conforme a cor é indicada a classe toxicológica:

• Classe I - produtos extremamente tóxicos. Apresenta no rótulo do produto

uma tarja vermelha.

• Classe II - produtos altamente tóxicos. Apresenta no rótulo do produto uma

tarja amarela.

• Classe III - produtos moderadamente tóxicos. Apresenta no rótulo do produto

uma tarja azul.

30

• Classe IV - produtos pouco tóxicos. Apresenta no rótulo do produto uma tarja

verde.

Os poluentes, quando introduzidos no ambiente, podem causar dois tipos de

efeitos na saúde humana: a toxicidade aguda, ou efeitos imediatos resultantes da

exposição em curto prazo, e a toxicidade crônica, ou efeitos devido a exposições mais

prolongadas. Existe ainda a possibilidade da persistência de resíduos destas

substâncias no sangue, na carne, na urina e nas fezes de animais, levando à

recontaminação do solo (ROMANO et al.; 2009). Ainda segundo estes autores, este

herbicida pode levar a distúrbios reprodutivos e interferir no padrão hormonal dos

mamíferos, podendo afetar a síntese, a secreção, o transporte e o metabolismo dos

hormônios naturais do organismo, mesmo em quantidades mínimas.

A toxicologia do glifosato tem sido avaliada em uma variedade de organismos

incluindo mamíferos, pássaros, peixes, insetos e a microflora. Estudos in vivo e in vitro

em animais sugerem fortemente que estas substâncias podem ser teratogênicas,

mutagênicas e carcinogênicas (SUN et al., 2010). Testes realizados em ratos

demonstraram que ocorre diminuição de espermatozóides e do peso dos fetos, além de

aborto e tumores em vários órgãos. Diferentes sintomas têm sido observados mediante

a exposição ao glifosato: irritação da pele e dos olhos, depressão cardíaca, dor

gastrintestinal (COX, 1988 e 1995).

A absorção cutânea dos organofosforados é maior em temperaturas elevadas ou

quando existem lesões na pele. Estudos in vitro com tecidos humanos relatam que a

absorção cutânea do glifosato é menor que 2%. Após a absorção, os organofosforados

são biotransformados e distribuídos por todos os tecidos, sendo que no caso do

glifosato apenas 1% é biotransformado em AMPA. A excreção ocorre principalmente

através da urina e das fezes (OGA et al., 2008).

Não existe antídoto para o glifosato, o tratamento é sintomático e depende da

quantidade ingerida e da gravidade do quadro clínico, sendo importante o

monitoramento hemodinâmico, do balanço hidroeletrolítico, das funções respiratórias,

renal e hepática (OGA et al., 2008).

Pesquisas mostram que defensivos agrícolas comercializados à base de

glifosato apresentam substâncias inertes surfactantes (polioxietileneamina - POEA), que

31

podem ser mais tóxicas que o princípio ativo, e na maioria das vezes não são

especificadas no rótulo do produto. O surfactante serve para auxiliar a aderência e

penetração do herbicida na membrana celular das folhas pulverizadas. Há um

sinergismo na associação destas duas substâncias elevando a toxicidade final do

produto (VERA et al., 2010).

A exposição ocupacional e/ou ambiental e alimentar ao glifosato podem causar

inúmeros efeitos sobre a saúde. Diferentes sintomas têm sido observados:

desregulação endócrina, redução da enzima aromatase, responsável pela síntese de

estrógenos (ROMANO, et al., 2009). Dentre outros ainda podem ser citados, danos

hepáticos e renais, irritações sobre a pele, mucosas e olhos, depressão cardíaca, dor

gastrintestinal, hipóxia, hipotensão, hematúria, pneumonia, dermatite de contato,

necrose das membranas mucosas e melena (COX, 1995; OGA et al., 2008).

No Brasil tem sido detectada a presença de agrotóxicos no leite materno e em

vários alimentos como: alface, banana, batata, tomate, morango entre outros. Existe a

possibilidade de ocorrência de anomalias congênitas devido à exposição a estas

substâncias (BRASIL. Legislação Brasileira, 1997; 2008).

3.2 CROMATOGRAFIA

3.2.1 Cromatografia de íons

Cromatografia de íons (Ion Chromatograpy - IC) é um termo utilizado para as

várias técnicas de Cromatografia em fase líquida de Alta Eficiência - CLAE (HPLC, do

inglês: High Performance Liquid Chromatography) na qual especíes de analitos iônicos

ou substâncias que se dissociam facilmente na fase móvel, são separadas em sitios

catiônicos ou aniônicos da fase estacionária (PAPADOYANNIS ; SAMANIDOU, 2004).

Em 1975, Small e colaboradores introduziram a cromatografia de íons operada

sob altas pressões, combinada com um método químico de redução da condutividade e

detecção condutimetrica. Estes detectores se baseiam na mensuração da

condutividade. Como todos os íons são eletroquimicamente condutores, os detectores

de condutividade tem a vantagem de uma boa sensibilidade e detecção universal.

32

Os métodos de cromatografia de íons estão atualmente dentre os melhores

disponíveis, pois apresentam uma ampla faixa de aplicação, principalmente no

monitoramento de sistemas aquosos, amostras ambientais de água, solo e água

potável e também podem ser usados na investigação de aditivos alimentares, bebidas,

cosméticos, produtos farmacêuticos entre outros. A cromatografia de íons desempenha

um papel importante em análises abrangentes com técnicas de detecção hifenadas,

incluindo ionização a pressão atmosférica (API), plasma indutivamente acoplado (ICP),

espectrometria de emissão atômica (AES) e espectrometria de massa com plasma

indutivamente acoplado (ICPMS), (SARZANINI, 2002).

A detecção de íons pode ser feita utilizando vários detectores; as técnicas de

detecção podem ser subdivididas em três amplas categorias:

a) Detecção eletroquimica, usando condutividade, amperometria ou

potenciometria.

b) Detecção espectroscópica, utilizando ultravioleta/visível (UV/vis), índice de

refração, fluorescência, absorção atômica ou emissão atômica.

c) Técnicas baseadas em reações pós-coluna.

A medição da detecção por condutividade é dificultada pela alta condutividade do

eluente. Com o objetivo de eliminar a influência do eluente, dita condutividade de fundo

(background) e com isso aumentar a sensibilidade de detecção do analito, Small e

colaboradores (1975) propuseram o uso de uma segunda coluna de troca iônica. Assim

a técnica da cromatografia de íons pode ser dividida em: ”técnica de coluna simples”

(sem supressão) e “técnica de supressão” (PAPADOYANNIS; SAMANIDOU, 2004).

Na cromatografia de íons sem supressão química, a condutividade de fundo é

suprimida eletronicamente; o eluente deve ter a mais baixa condutividade possível. O

eluente contendo os analitos sai da coluna de separação e não é alterado

quimicamente (EITH et al., 2006; 2007).

Na técnica de supressão, também conhecida como cromatografia de íons

suprimida, o supressor é inserido entre a coluna de separação e o detector; o objetivo é

reduzir quimicamente a condutividade de fundo do eluente, e ao mesmo tempo

converter os analitos, quando possível, numa forma mais condutiva, para aumentar a

sua detectabilidade.

33

No caso da detecção de ânions a supressão é realizada com um trocador de

cátions na forma de H+ fortemente ácida. Se o eluente for, por exemplo, NaHCO3 e a

amostra contiver o íon cloreto, tem-se as seguintes reações:

R-SO3- H++ Na+ + HCO3

- � R-SO3

- Na+ + H2O + CO2 (1)

R-SO3- H++ Na+ + Cl- � R-SO3

- Na+ + H+ + Cl- (2)

Neste caso o eluente bicarbonato de sódio é neutralizado (equação 1), uma vez

que os íons sódio são substituidos por prótons e, com isso, a condutividade do eluente

diminui sensivelmente. O analito (Cl-) não é alterado (equação 2), mas seu contra-íon

Na+ é trocado por H+, que tem uma condutividade equivalente consideravelmente

maior. O efeito total observado é o de aumento da sensibilidade da detecção (EITH et

al., 2006-07).

3.3 MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DE GLIFOSATO E AMPA

A caracterização e o gerenciamento dos riscos ambientais do glifosato e do AMPA em

níveis de resíduo são grandes desafios analíticos devido às características peculiares

apresentadas por estas duas substâncias, como: elevada solubilidade em água, (QIAN

et al., 2009) alta polaridade (CORBERA et al., 2005), pouca solubilidade em compostos

orgânicos tais como acetona e etanol entre outros (AMARANTE JUNIOR et al., 2002),

caráter iônico, baixa volatilidade (COUTINHO et al., 2008) semelhanças químicas entre

as duas substâncias (SUN et al., 2010), tamanho reduzido da molécula (IBANEZ et al.,

2006; SUN et al., 2010; AMARANTE JUNIOR et al., 2002), complexação com íons

metálicos (IBANEZ et al., 2006) e sua estrutura zwitteriônica (PIRIYAPITTAYA et al.,

2008; HANKE et al., 2008; AMARANTE JUNIOR et al., 2001). Além disso, a ausência

de grupos químicos adequados, como cromóforos ou grupos fluoróforos em sua

estrutura, também dificulta a análise pelos sistemas convencionais de detecção, como

detectores UV-visível e fluorescência (COUTINHO et al., 2008) e exigem etapas iniciais

de derivatização a fim de obterem derivados que respondam a estes detectores (QIAN

34

et al., 2009; PIRIYAPITTAYA et al., 2008 ; HANKE et al., 2008; CHANG e WEI, 2005).

Vários fatores podem influenciar no processo de derivatização e diminuir a

recuperação do analito como: pH, temperatura, tempo, concentração do derivatizante, e

a quantidade de etapas envolvidas. Além disso, muitas vezes estas etapas são

complexas, envolvem uma variedade de produtos químicos, são demoradas e tediosas

(QIAN et al., 2009). A presença de cátions multivalentes na água, como cobre e ferro,

resulta na formação de complexos estáveis com glifosato e AMPA, que não são

derivatizados (HANKE et al., 2008).

Métodos de cromatografia a gás (GC) são aplicados após derivatização, com o

objetivo de transformar glifosato e AMPA em derivados menos polares, suficientemente

voláteis e termicamente estáveis para melhorar a sua detectabilidade (AMARANTE

JUNIOR et al.,(2002); SUN et Al.,(2010)). Existem trabalhos usando detecção por

fotometria de chama (KATAOKA et al.,1996) e por espectrometria de massa - MS

(BORJESSON; TORSTENSSON, 2000).

O caráter polar dos dois analitos, combinado com a compatibilidade da

realização de derivatização em amostras aquosas faz com que a cromatografia a

líquido seja preferível à cromatografia a gás (CORBERA et al., 2006).

As técnicas de HPLC/UV e HPLC/fluorescência têm sido usadas, com o auxílio

de derivatizantes (SUN et al., 2010; QIAN et al., 2009; PATSIAS et al., 2001;

PIRIYAPITTAYA et al., 2008 ; CORBERA et al., 2005). Obtém-se boa sensibilidade,

como por exemplo, na derivatização com CNBF (4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifluoreto), que

é conhecida por ter boa atividade e seletividade por compostos contendo aminoácidos:

a reação se dá com aminas em baixa concentração, formando derivados estáveis

(QIAN et al., 2009). Porém, fatores adversos também são observados. HANKE et al.,

(2008) afirmam que, na derivatização com FMOC-CL (9-fluorenilmetil-cloroformato), o

derivatizante reage não só com os analitos e outras aminas, mas também com a água,

e ocorre a formação de 9,fluorenilmetanolcloro-formato (FMOC-OH), que é menos

solúvel na água que os analitos e pode precipitar na coluna, reduzindo a ionização e

afetando a sensibilidade do método. Alguns autores utilizam cromatografia de troca

iônica e derivatização pós-coluna com detecção por fluorescência (PATSIAS et al.,

2001; PIRIYAPITTAYA et al., 2008).

35

Patsias et al., (2001) determinaram glifosato e AMPA por cromatografia a líquido

e derivatização pós coluna. Entretanto estes autores relatam uma baixa recuperação

para o AMPA. Métodos LC-MS-MS, também tem sido utilizados, com separação em

fase reversa e uso de FMOC-Cl como derivatizante (IBÁNEZ et al., 2006; HANKE et al.,

2008).

O acoplamento da cromatografia de troca iônica (IC) com detector

condutométrico, amperométrico, coulométrico, ou a hifenação IC-ICP-MS são

alternativas que dispensam a etapa de derivatização e vem sendo utilizadas. ZHU et al.,

(1999) usaram detecção condutométrica, eliminação de compostos orgânicos da matriz

com diclorometano e pré-concentração no evaporador rotatório, obtendo então um LD

para o glifosato de 42 µg L-1. SÁNCHEZ-BAYO et al., (2010) concentraram as amostras

por extração em fase sólida em discos de poliestireno-divinil benzeno e, com detector

amperométrico alcançaram limites de detecção de: 0,3 µg mL-1 para o glifosato e 0,05

µg mL-1 para o AMPA. Os autores mantiveram o eluente NaOH 0,1M (pH 13,0) em

atmosfera de nitrogênio, para evitar a captura de CO2 do ar e formação de CO32-

evitando assim a diminuição do pH da fase móvel, que afeta a retenção dos analitos.

POPP et al., (2008), utilizando uma coluna de troca catiônica, e hifenação IC-ICP-DRC-

MS, alcançaram LDs operacionais de 42 e 33 µg L-1 respectivamente para glifosato e

AMPA; para atingir o limite de detecção de 0,1 µg L-1 estabelecido pela Comunidade

Européia os autores incluíram duas etapas de pré-concentração na análise.

Recentemente têm sido desenvolvidos métodos diretos de determinação por IC,

onde as amostras são analisadas sem pré-tratamento. COUTINHO et al, 2008.,

analisaram diretamente glifosato e AMPA em água, com detecção coulométrica,

atingindo limites de detecção de 38 e 240 µg L-1, respectivamente, sem pré-

concentração; a resposta eletroquímica obtida para o AMPA foi quase uma ordem de

grandeza inferior à do glifosato. Guo e colaboradores (2007), usando injeção de

grandes volumes (500 µL), analisaram glifosato, AMPA e mais dois outros compostos

por IC-ICP-MS, obtendo limites de detecção entre 1,1 e 1,4 µg L-1 respectivamente para

glifosato e AMPA. Segundo os autores, a hifenação com o ICP-MS tem a vantagem da

detecção de elementos específicos e uma boa sensibilidade, no entanto, a

determinação de fósforo em nível residual por essa técnica é um desafio, já que o P fica

36

apenas 35% ionizado no argônio. Há também a limitação decorrente de que fases

móveis contendo sódio não são interessantes, pois sua entrada constante pode

modificar a condição do plasma e também causar obstrução dos orifícios do cone de

amostragem e skimmer (GUO et al., 2007).

Também têm sido descritos na literatura métodos diretos para a determinação de

AMPA e glifosato por IC/condutometria (BAUER et al., 1999; MARQUES et al., 2009;

DIMITRAKOPOULOS et al., 2010). BAUER e colaboradores utilizaram IC-ES-MS na

análise de micropoluentes em água incluindo: EDTA, glifosato e AMPA. MARQUES et

al., (2009) determinaram apenas o glifosato em amostras de água superficial utilizando

IC/condutimetria com eluição isocrática usando solução de KOH 10,0 mmol L-1 até 5

minutos, seguido por gradiente entre 5 e 35 minutos com solução de KOH 35,0 mmol

L-1, retornando condição inicial entre 35 e 37 minutos; o tempo de retenção do

glifosato foi próximo de 27 minutos; atingiram o LD de 15,4 µg L-1 para o glifosato por

injeção direta da amostra. DIMITRAKOPOULOS et al., 2010, determinaram o glifosato e

AMPA condutimetricamente em água potável e de nascente , utilizando eluição

isocrática, tendo como fase móvel uma solução de KOH 14 mmol L-1; também por

injeção direta, atingiram o LD de 0,54 µg L-1 para o glifosato.

Outras técnicas também têm sido usadas na determinação de glifosato e AMPA:

eletroforese capilar - CE (SEE et al., 2010 e CHANG e WEI, 2005), ensaio

imunoenzimático - ELISA (RUBIO et al., 2003) e voltametria (GARCIA e

ROLLEMBERG, 2007).

A tabela 3.2 mostra um resumo das técnicas de análise dos compostos glifosato e Ampa em água relatadas na literatura.

37

TA

BE

LA 3

.2:

Res

umo

das

técn

icas

de

anál

ise

dos

com

post

os g

lifos

ato

e A

MP

A e

m á

gua

rela

tada

s na

lite

ratu

ra

Téc

nica

Ana

lito

Ext

raçã

o

Lim

peza

Der

ivat

izaç

ão

LD

Ref

erên

cia

E

letr

ofor

ese

capi

lar

UV

glifo

sato

A

MP

A

glif

osin

ato

--

----

FM

OC

-Cl

nã

o in

form

ado

CH

AN

G,Y

.S.,

WE

I, Y

.M.

(200

5)

G

C-M

S

glifo

sato

A

MP

g

lifos

inat

o

NaO

H 0

,2 m

mol

L-1

iso

PC

F

Glif

osat

o: 1

2pg

AM

PA

:

8pg

Glif

osin

ato:

20p

g

Kat

aoka

et a

l., (

1996

)

GC

-MS

gl

ifosa

to

AM

PA

cl

ean-

up”

com

res

inas

C

hele

x 10

0 e

AG

1-X

8 T

FA

A

TF

E

AM

PA

e g

lifos

ato:

0,1

µg

L-1

Bor

jess

on e

T

orst

enss

on (

2000

) H

PLC

/UV

C

olun

a C

18 (

fase

rev

ersa

) gl

ifosa

to

Filt

raçã

o/ce

ntrif

ugaç

ão

CN

BF

9

µg

L-1

Qia

n et

al.,

(200

9)

LC/U

V

Col

una

C18

(fa

se r

ever

sa)

glifo

sato

A

MP

A

Pré

-co

ncen

traç

ão

duas

ext

raçõ

es c

/ di

clor

omet

ano

fluor

eto

de 4

-m

etox

iben

zeno

-su

lfoni

la

0,

1 µ

g L-1

(am

bos)

S

un e

t al.,

(20

10)

HP

LC

Flu

ores

cênc

ia

Col

una

catiô

nica

glifo

sato

A

MP

A

S

PE

2

: der

ivat

izaç

ões

Hip

oclo

rito

de

sódi

o e

tam

pão;

e

OP

A

glifo

sato

: 0,

02 µ

gL-1

AM

PA

: 0,1

µg

L-1

Pat

sias

et a

l.,(2

001)

HP

LC

Flu

ores

cênc

ia

Col

una

Kro

mas

il® 1

00

NH

2

glifo

sato

A

MP

A

--

----

FM

OC

-Cl

glifo

sato

: 2,

0 µ

gL-1

AM

PA

: 4,0

µg

L-1

Cor

bera

et a

l., (

2006

)

HP

LC/

Flu

ores

cênc

ia

Col

una

catiô

nica

glifo

sato

A

MP

A

--

----

F

MO

C-C

l gl

ifosa

to:

0,22

µg

L-1 A

MP

A:

3,40

µg

L-1

Piri

yapi

ttaya

et a

l.,

(200

8)

LC

/MS

/MS

gl

ifosa

to

AM

PA

gl

ifosi

nato

S

PE

FM

OC

-Cl

glifo

sato

: 0,2

ng

L-1

AM

PA

: 0,2

ng

L-1

glifo

sina

to:

0,6

ng L

-

Han

ke e

t al.,

(20

08)

LC-E

SI-

MS

/MS

co

luna

C18

gl

ifosa

to

S

PE

FM

OC

-Cl

gl

ifosa

to:

5ng

L-1

Ib

ánez

et a

l., (

2006

)

IC-E

S/M

S

Col

una

aniô

nica

M

icro

polu

ente

s po

lar

--

----

----

--

gl

ifosa

to :

1 µ

g L-1

. B

auer

et a

l., (

1999

)

Con

tinua

38

IC

-IC

P-D

RC

-MS

C

olun

a ca

tiôni

ca

glifo

sato

A

MP

A

Pré

-con

cent

raçã

o co

m

resi

nas:

Che

lex

100

e A

G1-

X8

--

---

glifo

sato

: 43

µg

L-1

AM

PA

: 33

µg

L-1

Pop

p et

al.,

(20

08)

IC/IC

P/M

S

Col

una

aniô

nica

gl

ifosa

to

fosf

ato

----

--

----

--

glifo

sato

e fo

sfat

o: 0

,7µ

g L-1

G

uo e

t al.,

(20

05)

IC/IC

P/M

S

Col

una

aniô

nica

G

lifos

ato

glifo

sina

to

fosa

min

a

ete

fon

--

----

----

--

Glif

osat

o:1,

2 µ

g L-1

G

lifos

inat

o: 1

,3 µ

g L-1

F

osam

ine

: 1,1

µg

L-1

Ete

fon:

1,4

µg

L-1

Guo

et a

l., (

2007

)

IC/c

ondu

t. C

olun

a an

iôni

ca

glifo

sato

--

----

--

----

gl

ifosa

to:

15,4

µg

L-1

Mar

ques

et a

l., (

2009

)

IC

/con

dut.

Col

una

aniô

nica

gl

ifosa

to

Elim

inaç

ão d

e or

gâni

cos

com

di

clor

omet

ano

----

--

glifo

sato

: 42

,0 µ

g L-1

Zhu

et a

l., (

1999

)

IC/c

oulo

mét

rica.

C

olun

a an

iôni

ca

glifo

sato

A

MP

A

--

----

----

--

glifo

sato

: 38

µg

L-1

AM

PA

: 240

µg

L-1

Cou

tinho

et a

l., (

2008

)

IC

/con

dut.

Col

una

aniô

nica

gl

ifosa

to

AM

PA

----

--

--

----

G

lifos

ato:

0,5

4 µ

g L-1

AM

PA

D

imitr

akop

oulo

s et

al.,

(201

0)

IC U

v/de

tect

or

elet

roqu

ímic

o C

olun

a an

iôni

ca

glifo

sato

A

MP

A

amitr

ol

Pré

con

cent

raçã

o e

m

mem

bran

as

----

--

glifo

sato

: 0,3

µg

mL-1

AM

PA

: 0,0

5 µ

g m

L-1

Sán

chez

-Ba

yo e

t al.,

(201

0)

39

4. ÁREA DE ESTUDO

O estudo foi realizado no município de Itaboraí durante o ano de 2009 e 2011.

No entorno da área de estudo esta sendo construído um complexo petroquímico

formado por uma refinaria, onde ocorrerá a separação do petróleo em frações; e por

uma central petroquímica formada por unidades geradoras de produtos petroquímicos

de primeira geração como: eteno, propeno, butadieno, benzeno.

A escolha da área de estudo levou em consideração a possibilidade de um

impacto ambiental devido à construção de um complexo petroquímico, no entorno de

uma área urbana, e dos rios Macacu e Caceribu e, a cerca de 1 km de uma Área de

Proteção Ambiental (APA).

O complexo petroquímico ocupa uma área de 45 milhões de metros quadrados

no município de Itaboraí/RJ. Itaboraí está a 17 metros ao nível do mar, a uma distância

aproximada de 40 km da capital Rio de Janeiro, localizado próximo aos Portos de

Itaguaí (103 km) e dos terminais de Angra dos Reis (157 km), Ilhas d’Água e Redonda

(30 km).

O rio Macacu nasce na serra dos Órgãos, dentro dos limites do Parque Estadual

dos Três Picos, no município de Cachoeiras de Macacu, possuindo uma extensão de

74 km até a sua junção com o rio Guapimirim, cuja foz se encontra na Baía de

Guanabara, na APA de Guapi-Mirim.

40

5. METODOLOGIA

5.1 EQUIPAMENTOS E REAGENTES

Para a metodologia proposta utilizou-se um Cromatógrafo de íons marca

Metrohm® com módulo de supressão (833 IC), amostrador automático (838 IC),

degaseificador (837 IC), detector condutimétrico (819 IC) e Supressor de CO2 (Figura

5.1). Foram testadas duas colunas de troca iônica (aniônica): METROSEP A SUPP 5-

150 e METROSEP A SUPP 5-250, ambas da empresa Metrohm.

Para a determinação hifenada IC-MS utilizou-se um Espectrômetro de massa tipo

quadrupolo marca Agilent G 1956B MSD-SL, modo de ionização API-ES G 1948, faixa

de varredura de m/z 50 a 200 no modo full Scan; para o monitoramento seletivo de íons

no modo SIM utilizou-se m/z = 168 para o glifosato e m/z = 110 para o AMPA, com

polaridade negativa.

A determinação de fósforo no eluído foi realizada por Espectrometria de Massa

com Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS). O equipamento utilizado foi um Agilent

7500 Series com nebulizador concêntrico e câmara de nebulização tipo Scott

(refrigerada à 2ºC, com sistema Peltier). Os parâmetros operacionais foram: potência

(W) 1500, gás do plasma 15 L min-1, gás nebulizador 0,9 L min-1, taxa de aspiração da

amostra 0,4 mLmin-1. A determinação do analito foi realizada a partir do isótopo 31P,

utilizando calibração externa (50 a 1000 µgL-1), cuja curva analítica foi preparada a

partir do padrão monoelementar de fósforo (Phosphorus, 1000 µgmL-1, CAS # H2O

[7732-18-5], P [7732-14-0], Perkin Elmer®).

41

Figura 5.1 – Equipamento de Cromatografia de Íons Metrohm®

No preparo de padrões e soluções eluentes foram utilizados micropipetas de

volume variável (Eppendorf®), tubos de polipropileno (TPP®), vidraria aferida (balões

volumétricos entre outros) e balança analítica com precisão 0,01 mg (CP225D,

Sartorius®). A filtração de soluções ou amostras foi realizada com membrana filtrante de

0,45 µm de acetato de celulose marca Millipore®.

Todas as soluções foram preparadas utilizando reagentes de grau analítico

(P.A.) e água ultrapura (Milli-Q Gradient, - MILLIPORE), sendo desgaseificadas antes

da aplicação, por 15 minutos em banho ultra-sônico.

Os reagentes Na2CO3, NaHCO3, NaOH e H2SO4 foram adquiridos da Merck®. Os

padrões dos ânions fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato foram adquiridos

da empresa Isosol®. Os eluentes necessários para a IC foram preparados pela

dissolução da quantidade adequada Na2CO3, NaHCO3 e NaOH em água ultrapura.

O padrão de glifosato CAS #:1071-83-6 foi adquirido da empresa Chem Service®

e o AMPA, da empresa Sigma Aldrich®, com purezas certificadas e rastreáveis de

99,5% e 99%, respectivamente. As soluções padrão de estoque preparadas foram

acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas na temperatura de 5 ºC.

42

5.2. DETERMINAÇÃO DE GLISOFATO E AMPA POR IC/CONDUTIMETRIA

Do ponto de vista de separação cromatográfica, o trabalho pode ser dividido em

duas fases distintas. Inicialmente, foi desenvolvida uma metodologia de determinação

de glifosato em água, na presença de ânions comuns: fluoreto, cloreto, brometo, nitrato,

sulfato e fosfato. Em uma segunda fase, uma metodologia foi estudada para

determinação simultânea do glifosato e do seu principal metabólito o AMPA, além dos

ânions comuns acima citados.

5.2.1 Eluição isocrática

A metodologia foi utilizada sob condições cromatográficas otimizadas para

determinação do glifosato, sem interferência dos ânions comuns, com coluna

METROSEP A SUPP 5-150 e eluição isocrática com uma solução 6,0 mmol L-1 em

Na2CO3 e 2,0 mmol L-1 em NaHCO3 (Eluente 1). A supressão química foi realizada com

H2SO4 100 mmol L-1 e o experimento foi conduzido em temperatura controlada de 27°C.

A vazão do eluente foi fixada em 0,8 mL min-1, sendo a alça de amostragem de 100 µL.

O tempo total da corrida foi de 17 minutos.

A separação simultânea de glifosato e ânions comuns foi testada por separação

isocrática usando coluna METROSEP A SUPP 5-250. Dois experimentos foram feitos: o

primeiro, com a fase móvel já descrita e o segundo, com solução 2 mmol L-1 em

Na2CO3 e NaHCO3 , contendo 5% de acetona (Eluente 2), sendo a vazão fixada, em

ambos os casos, em 0,8 mL min-1.

5.2.2 Eluição por gradiente

Visto que a eluição isocrática, para separar os constituintes de interesse, resultou

43

num tempo de retenção muito alto para o glifosato, investiu-se na opção de eluição por

gradiente. Foram feitas várias tentativas com diferentes condições cromatográficas, até

se chegar a duas metodologias: a primeira foi capaz de separar simultaneamente tanto

os ânions comuns (fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato), quanto o

glifosato (Método Gradiente 1), e a segunda resultou na separação de todos os íons

anteriores e também do principal produto de degradação do glifosato: o AMPA (Método

Gradiente 2).

Em todos os casos, os parâmetros alça de amostragem (100 µL), temperatura

(27°C) e supressor químico (H 2SO4 100 mmol L-1) permaneceram inalterados com

relação ao aplicado na eluição isocrática. A supressão sequencial de CO2 foi utilizada.

Para eliminar efeitos do sistema cromatográfico, todos os cromatogramas foram

subtraídos de um obtido a partir de água ultrapura (“branco”), realizado no mesmo dia e

sob as mesmas condições de ensaio.

O Método Gradiente 2 foi resultado de pequenas variações testadas a partir das

fases móveis NaOH 15,0 mmol L-1 + Na2CO3 1,0 mmol L-1 pH 12,09 (A) e Na2CO3 15,0

mmol L-1, pH 11,41 (B) , até se chegar a uma separação satisfatória para determinação

simultânea do glifosato e AMPA. A tabela 5.1 resume a condição otimizada, realizada a

vazão de 0,7 mL min-1 e tempo total de 50 minutos.

Tabela 5.1 : Programa otimizado para eluição por gradiente dos componentes glifosato,

AMPA, F-, Cl-, Br-, NO3-, SO4

2- e PO43- por CI com detecção condutimétrica.

Tempo (min) % A % B

0 – 16 100 0

16 – 22 100 – 20 0 – 80

22 - 35 20 80

35 - 36 20 - 100 80 – 0

36 - 50 100 0

44

5.3. ESPECTROMETRIA DE MASSA

Com o objetivo de confirmar a presença das substâncias em questão (glifosato e

AMPA) na separação cromatográfica, foi utilizada a técnica de Espectrometria de

Massa, tanto para identificação das moléculas de forma direta, como de forma indireta,

pela determinação de fósforo, presente nas duas espécies.

Desta forma, a confirmação das massas molares equivalentes a AMPA (m/z =

110) e glifosato (m/z = 168) foi realizada pela hifenização IC-MS. Cabe ressaltar que a

detecção condutimétrica também foi realizada ao final da separação cromatográfica,

antes da amostra ser analisada pela espectrometria de massa.

A técnica de Espectrometria de Massa com Plasma Indutivamente Acoplado

(ICP-MS) também foi aplicada para certificar a presença das moléculas, a partir da

determinação do elemento traçador destas, o fósforo (m/z = 31). Por questões de

logística, não foi possível hifenar a cromatografia e ICP-MS, pois os equipamentos

estavam em laboratórios distintos. Assim sendo, frações do eluído da CI foram

coletados em volume suficiente para posterior determinação do fósforo. A detecção

condutimétrica após a separação cromatográfica auxiliou na decisão das amostragens.

5.4. APLICAÇÃO EM AMOSTRAS DE ÁGUAS

As metodologias desenvolvidas foram aplicadas visando determinar os analitos

em amostras de água de diferentes origens: Subterrânea, Superficial, Água mineral

destinada ao consumo humano e água ultrapura.

O fato das amostras de água subterrânea pertencer a um projeto de pesquisa

alheio ao cronograma deste trabalho, a disponibilidade das mesmas ocorreu na época

em que a metodologia isocrática tinha sido otimizada e, desta forma, foi realizada a

determinação de glifosato e ânions, uma vez que o analito AMPA não foi separado na

eluição isocrática.

Com relação às demais amostras, foi possível realizar a metodologia de eluição

por gradiente e, portanto, a determinação de glifosato, AMPA e ânions comuns

(fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato).

45

5.4.1. Procedimentos de coleta das amostras

Todas as amostras ambientais foram coletadas em duplicata, acondicionadas em

frasco de vidro âmbar com capacidade para 60 mL, para evitar a quebra dos frascos, os

mesmo foram protegidos com plásticos. Após coletadas, as amostras foram mantidas

em gelo durante o transporte ao laboratório, onde foram armazenadas ao abrigo da luz,

e em freezer com temperatura próximo de -18ºC. As amostras foram preservadas com

Na2S2O3 para remover o cloro residual e eliminar perdas devido à degradação do

glifosato que ocorre em presença de cloro residual. Conforme método USEPA nº 547,

as amostras assim preservadas tem estabilidade de até 18 meses.

Os materiais e vidrarias utilizados na coleta foram criteriosamente limpos, sendo

previamente lavados com água/detergente (Extran), água destilada e água ultrapura.

Os materiais de vidro foram secos em estufa a 240ºC por 4 horas, enquanto que os de

plástico e Teflon foram secos a 105ºC por 1 hora.

Com o objetivo de monitorar possíveis interferências na metodologia, uma

amostra de água ultrapura, branco de campo, foi colocado junto aos frascos enviados

ao campo para submeter a possíveis interferências da amostra, durante o

armazenamento, transporte, conservação e em todos os procedimentos analíticos.

Uma alíquota de água ultrapura foi tratada exatamente como a amostra, definido

como reagente ‘branco’ de laboratório, incluindo exposição a todos os objetos de vidro,

equipamentos, solventes, reagentes, normas internas de descontaminação. Este foi

analisado diariamente com o objetivo de verificar interferentes no ambiente de

laboratório.

Todas as amostras foram filtradas através de membrana filtrante de 0,45 µm e,

utilizando alça de injeção de 100µL, foram estudadas em triplicata diretamente no

sistema de cromatografia de íons sem derivatização e sem pré-concentração.

5.4.2. Locais de Amostragem

5.4.2.1. Águas minerais

46

As amostras de água mineral foram selecionadas de forma aleatória; para esta

metodologia foram utilizadas três marcas diferentes de água mineral: A1 (fabricação:

28/02/2011, validade: 28/02/2012, lote: NW32F7CC4R); A2 (fabricação: 03/03/2011,

validade 03/12/2011, lote nº5), e A3 (fabricação: 25/01/2011, validade: 25/01/2012, lote

nº NWJPPC7PJJ); todas foram adquiridas no comércio local de Niterói /RJ no mês de

abril (04/04/2010).

5.4.2.2. Águas superficiais

Amostras de água superficial foram coletadas no mês de abril de 2011 em 6

pontos do Rio Macacu: S1, S2, S3, S4, S5, S6, (Figura 5.2).

Figura 5.2 - Localização dos pontos de amostragem das amostras superficiais.

47

5.4.2.3. Águas subterrâneas

As amostras de águas subterrâneas foram coletadas município de Itaboraí

durante o ano de 2009 e 2010. Foram feitas 4 campanhas: nos meses de novembro

(30/11/2009), janeiro (18/01/20100), maio (26/05/2010) e agosto (27/08/2010).

Os pontos amostrados foram: P1, P2, P3,P4,APA (Figura 5.3).

Figura 5.3 - Localização dos poços de monitoramento de água subterrânea.

48

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1. DETERMINAÇÃO DE GLIFOSATO EM ÁGUA COM ELUIÇÃO ISOCRÁTICA

Após testes com diferentes fases móveis, usando uma coluna METROSEP A SUPP

5-150, chegou-se a uma metodologia otimizada para a eluição isocrática de glifosato,

usando como eluente uma mistura 6,0 mmol L-1 em Na2CO3 e 2,0 mmol L-1 em NaHCO3.

A injeção de uma solução padrão de glifosato 250 µg L-1 resultou no aparecimento de

sinais, nos tempos aproximados de 3, 6 e 12 minutos, sendo que este último

apresentou certa assimetria (Figura 6.1). Zhu e colaboradores (1999), usando como

fase móvel a mistura Na2CO3 (9 mmoL-1) e NaOH (4 mmoL-1), com detecção por

IC/condutometria, obtiveram cromatograma semelhante, também com 3 sinais e

assimetria, os dois primeiros sinais são comuns na água ultrapura, o glifosato foi

quantificado pelo último.

A detecção do glifosato por espectrometria de massa no modo negativo permitiu a

identificação do glifosato, no tempo de 11 minutos, pelo íon de m/z = 168, confirmando

o tempo de retenção determinado na detecção condutométrica, como pode ser

observado pela sobreposição de réplicas de injeção do padrão do glifosato 500 µg L-1

(Figura 6.2).

49

Figura 6.1 – Cromatograma obtido por eluição isocrática na técnica CI/condutimetria: em preto

água ultrapura, em vermelho padrão de glifosato 125 µg L-1 (Sinal 1= glifosato) (Condições: T =

27 ºC, Vazão = 0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1.).

Figura 6.2 - Cromatograma obtido por IC/MS do padrão de glifosato 500 µg.L-1 (Condições: T=

27ºC, Vazão = 0,8 mL.min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1, n = 2).

50

A determinação na técnica hifenada IC-MS foi realizada em duplicata e,

conforme pode ser verificado na figura 6.2 houve a confirmação da massa 168 no

tempo de 11 minutos. A partir desta referência, realizou-se por IC/condutometria a

injeção de padrões de glifosato a 250, 500 e 1000 µg L-1, confirmando a

reprodutibilidade dos tempos de retenção e a proporcionalidade das áreas com a

concentração (Figura 6.3).

Figura 6.3 – Zoom do cromatograma na faixa de tempo de retenção do glifosato para padrões

de glifosato 250 (verde); 500 (vermelho) e 1000 µg L-1 (preto). (Condições: T = 27 ºC, Vazão =

0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1.; Detecção:

IC/condutometria)

6.1.1. Presença de ânions comuns (F-, Cl-, Br-, NO3-, SO4

2-,PO43-)

Para verificar a possibilidade de comprometimento da determinação de glifosato

por parte dos ânions comumente encontrados na água, um estudo foi realizado através

da eluição cromatográfica de uma solução contendo glifosato, na concentração de 500

µg L-1, na presença de 1000 µg L-1 dos demais ânions comuns. A figura 6.4 apresenta o

cromatograma resultante.

51

Figura 6.4 - Cromatograma do padrão de glifosato 500 µg L-1 (6), e dos ânions na concentração

de 1000 µg L-1: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3) brometo e nitrato; (4) sulfato e (5) fosfato.

(Condições: T = 27 ºC, Vazão = 0,8 mL min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol

L-1.; Detecção: IC/condutometria).

Como constatado, demonstrou-se não haver interferências de ânions comuns

inorgânicos (fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato) na determinação do

glifosato em água. Entretanto, a resolução entre brometo e nitrato não foi adequada

(sinal 3 do cromatograma da figura 6.4).

Uma alternativa para aumentar a eficiência da separação é mudar o

comprimento da coluna e, neste raciocínio, optou-se então por usar uma coluna mais

longa, de 25 cm (METROSEP A SUPP 5-250), no lugar da coluna de 15 cm. As

condições experimentais foram mantidas e o resultado obtido é apresentado na figura

6.5. A eluição do glifosato se deu em cerca de 25 minutos, entretanto, a separação dos

ânions ainda não foi suficiente.

Novamente, com o objetivo de buscar uma boa separação no início da

cromatografia, diminuiu-se a força do eluente, usando como fase móvel uma mistura de

NaHCO3 e Na2CO3, ambos em 2 mmol L-1. O resultado (figura 6.6) foi uma boa

separação dos ânions fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e fosfato, mas o

glifosato foi eluído somente aos 72 minutos.

52


de 1000 µg L-1: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3) brometo (4) nitrato; (5) sulfato e (6) fosfato.


L-1; Coluna: 25 cm; Detecção: IC/condutometria).


de 1000 µg L-1: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3, 4) brometo; (5) nitrato; (6) sulfato e (7) fosfato.


L-1; Coluna: 25 cm; Detecção: IC/condutometria).

53

6.2. ELUIÇÃO POR GRADIENTE PARA OTIMIZAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DE

GLIFOSATO

Uma vez que a eluição isocrática apresentou um tempo de eluição para o

glifosato relativamente longo (72 min), o estudo foi conduzido no sentido de usar uma

eluição por gradiente. Inicialmente, testou-se o gradiente binário: A - 2,5 mmol L-1 em

Na2CO3 e 2,0 mmol L-1 em NaHCO3 (pH = 10,3); B - 6,0 mmol L-1 em Na2CO3 e 2,0

mmol L-1 em NaHCO3 (pH = 10,5), a uma vazão de 0,75 ml min-1. A figura 6.7 apresenta

o programa de gradiente realizado e o cromatograma resultante.

Gradiente 1 A: Na2CO3 2,5 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1 pH: 10,3; B: Na2CO3

6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1 pH: 10,5 Programa de Gradiente t(min) % B 0-26 0 26-27 0-100 27-40 100 41-50 0

Figura 6.7 – Cromatograma obtido por CI/condutimetria na determinação de ânions (Fluoreto e

cloreto 100 µgL-1 brometo, nitrato e sulfato 200 µgL-1 e fosfato 300 µgL-1) e glifosato (500 µg.L-

1). Sinais: 1 fluoreto; 2 cloreto; 3 ou 4 brometo; 5 nitrato; 6 sulfato; 7 fosfato; 8 glifosato.

Com relação aos ânions, verifica-se uma boa separação destes e o tempo de

retenção do glifosato ficou em torno de 39 minutos. Em um segundo experimento, o

eluente A foi mantido (Na2CO3 2,5 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1) e alterou-se o

eluente B (Na2CO3,15 mmol L-1), visando o aumento de sua força iônica e diminuição

do tempo de retenção do glifosato. A vazão foi de 0,70 mL min-1. O programa de

gradiente e o cromatograma resultante são apresentados na figura 6.8. O tempo de

retenção do glifosato diminuiu aproximadamente para 32 minutos.

54

Gradiente 2 A: Na2CO3 2,5 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1 pH:10,3 B: Na2CO3 15,0 mmol L-1 pH:11,3 Programa de Gradiente

t(min) % B 0-16 0 16-22 80 22-35 80 35-36 0 36-50 0

Figura 6.8 – Cromatograma obtido por CI/condutimetria na determinação de ânions (Fluoreto e

cloreto 100 µgL-1 brometo, nitrato e sulfato 200 µgL-1 e fosfato 300 µgL-1) e glifosato (500 µgL-

1). Sinais: 1 fluoreto; 2 cloreto; 3 brometo; 4 nitrato; 5 sulfato; 6 fosfato; 7 glifosato.

6.3. DETERMINAÇÃO DO PRINCIPAL METABÓLITO DO GLIFOSATO: AMPA

Em função de sua instabilidade, o glifosato pode se converter a outras espécies,

sendo o seu principal metabólito o ácido aminometil fosfônico (AMPA). Caso a única

fonte deste composto seja o próprio herbicida, o AMPA pode se tornar um traçador do

glifosato. A separação simultânea e detecção de glifosato e AMPA tem sido feita

principalmente por métodos que envolvem derivatização pré-coluna, seja na separação

por cromatografia a gás (KATAOKA et al., 1996; BORJESSON e TORSTENSSON,

2000) ou, em métodos mais recentes, por cromatografia a líquido em fase ligada, com

detector UV (QIAN et al., 2009; SUN et al., 2009), de fluorescência (CORBERA et al.,

2006), ou com hifenação LC-MS-MS (HANKE et al., 2008, IBÁNEZ et al., 2006). A

separação por cromatografia de troca iônica, com derivatização pós-coluna e detecção

por fluorescência também foi testada, usando coluna de troca catiônica

(PIRIYAPITTAYA et al., 2008).

Assim sendo, é interessante verificar a possibilidade de uma determinação

simultânea, sem derivatização, destes compostos, por cromatografia de íons e detecção

condutométrica. Pelas características da molécula AMPA, o seu comportamento na

55

cromatografia de íons com troca aniônica é de apresentar menor afinidade à fase

estacionária e, portanto, ser eluída mais rápido do que o glifosato (GUO et al. ,(2005-

2007); MARQUES et al., (2009); COUTINHO et al., (2008); DIMITRAKOPOULOS et al.,

(2010)).

Um teste inicial com o objetivo de determinar AMPA na presença dos ânions

comuns foi conduzido com um gradiente já testado (A - 2,5 mmol L-1 em Na2CO3 e 2,0

mmol L-1 em NaHCO3 (pH = 10,3); B - 15,0 mmol L-1 em Na2CO3 (pH = 11,3) e não se

conseguiu detectar o analito.

A separação cromatográfica de compostos iônicos através de troca iônica é

dependente das afinidades entre os íons da fase móvel (tanto do eluente quanto do

analito) e os sítios iônicos da fase estacionária. A retenção dessas duas substâncias

(AMPA e glifosato) está condicionada tanto à força do eluente quanto a mudanças de

pH, já que ambas sofrem várias dissociações ácidas, além de formarem zwiterions. O

pH do eluente A (pH = 10,3) foi bem próximo ao pK da última dissociação do AMPA

(pK3 = 10,0). A elevação do pH deste eluente poderia favorecer a retenção deste

analito, garantindo que a maioria das moléculas tivessem carga -2. De fato, SÁNCHEZ-

BAYO e colaboradores (2010) usaram NaOH 0,1 mol L-1 (pH 13) e

DIMITRAKOPOULOS e colaboradores (2010), gradiente de KOH 12 – 40 mmol L-1, na

separação de glifosato e AMPA, usando respectivamente detecção amperométrica e

condutimétrica.

Testou-se, então, a substituição de NaHCO3 por NaOH (15 mmol L-1), cujo pH

ficou próximo de 12 e resultou na eluição do AMPA em 12,9 minutos, sem interferência

e com resolução para os ânions fluoreto, cloreto, brometo nitrato, sulfato e fosfato,

conforme pode ser constatado na figura 6.9. O glifosato, nesta mesma corrida

cromatográfica, foi eluído em 30 minutos.

56

Gradiente 3 A - NaOH 15,0 mmol L-1 + Na2CO3 1,0 mmol L-1 pH 12,1 B - Na2CO3 15,0 mmol L-1 pH 11,4

Programa de Gradiente

t(min) % B 0-16 0 16-22 80 22-35 80 35-36 0 36-50 0

Figura 6.9 - Cromatograma de padrões de AMPA (5) e glifosato (8), ambos em 300 µg L-1, e dos

ânions (Fluoreto e cloreto 100 µgL-1 brometo, nitrato e sulfato 200 µgL-1 e fosfato 300 µgL-1):

Sinais: (1) fluoreto; (2) cloreto; (3) brometo (4) nitrato; (6) sulfato e (7) fosfato. (Condições: T =

27 ºC; Vazão = 0,75 mL min-1; Coluna: 25 cm; Detecção: IC/condutometria).

A presença do AMPA e glifosato neste experimento foi confirmada pela técnica

IC-MS, conforme apresentado na figura 6.10, identificando o íon de m/z igual a 110 em

13 minutos e o íon de m/z igual a 168 em 30 minutos.

Figura 6.10 – Cromatograma obtido por IC-MS confirmando a presença de AMPA (m/z= 110, 10

minutos) e glifosato (m/z= 168, 30 minutos) no ensaio apresentado na figura 6.11.

Nestas condições glifosato foi observado apenas um sinal, tanto na IC como na

IC-MS, pode ser visto na figura 6.11.

57

Figura 6.11 - Cromatograma obtido por IC/Condutometria utilizando padrões de glifosato e AMPA 300 µg

L-1 em matriz de água ultrapura com as seguintes condições cromatográficas: A - NaOH 15,0 mmol L-1 +

Na2CO3 1,0 mmol L-1 pH 12,09 e B - Na2CO3 15,0 mmol L-1 pH 11,4. Sinais: A glifosato; B, AMPA; C,

AMPA (1) e Glifosato (2).

A

B

C

58

A inclusão do NaOH 15,0 mmol L-1, por ser um eluente fraco, ocasionou um

aumento moderado na força do eluente, entretanto a elevação do pH, por tornar o

AMPA totalmente dissociado, parece ter sido fundamental para a detecção deste

analito.

A presença do íon carbonato 15 mmol L-1, no eluente B do gradiente 3 (figura

6.11), além de aumentar a força de eluição, elevou o pH a 11,4 e garantiu que o

glifosato (pk3 = 10,2) ficasse totalmente dissociado. Entretanto, com o aumento da

força iônica do eluente B, a sua condutividade aumentou tanto que, para manter a

eficiência da supressão, foi necessária a inclusão de estágios de troca da unidade

supressora aos 21 e 39 minutos durante a corrida, e também a utilização da supressão

sequencial de CO2, que reduziu ainda mais a condutividade de fundo, permitindo uma

separação cromatográfica com melhor desempenho.

Como pode ser visto na figura 6.9, há um alargamento do sinal do AMPA,

fenômeno relatado também por Bauer e colaboradores (1999). Tais autores sugeriram a

hipótese de que o grupo amino do AMPA pudesse estar protonado no módulo

supressor, interagindo com ele. No presente trabalho mediu-se o pH em vários pontos

do sistema cromatográfico, conforme registrado na figura 6.12.

Figura 6.12 – Ilustração do CI e acompanhamento do pH em diferentes pontos do equipamento

durante uma corrida cromatográfica.

59

No tempo de retenção do AMPA, devido à troca de cátions Na+ por H+, o pH do

eluente ficou em torno de 5,5 na saída do módulo supressor de condutividade; após a

passagem pelo módulo supressor de CO2, o pH subiu para 6,5. Assim, no módulo do

supressor de condutividade, o pH é próximo ao pK2 do AMPA e, consequentemente,

coexistem aproximadamente em igual quantidade duas espécies, que podem ter

interações diferentes com supressor, alargando a zona de distribuição do analito. Após

passar pelo módulo de supressão de CO2, na entrada do detector, a um pH = 6,5, além

do alargamento do sinal também há perda de sensibilidade em relação ao glifosato, já

que neste pH parte do AMPA tem carga líquida igual a zero.

6.4. DETERMINAÇÃO DE FÓSFORO POR ICP-MS

A quantificação das espécies AMPA e glifosato pode ser realizada também pela

determinação do elemento fósforo, comum em ambas as moléculas. Esta determinação

pode ser feita por ICP-MS, que apresenta como principal vantagem sua elevada

sensibilidade e como limitação a falta de capacidade de especiação entre fósforo

orgânico e inorgânico. Entretanto, a técnica de ICP-MS poderá ser usada pós-coluna

cromatográfica. Neste estudo, as determinações foram realizadas, em função da

logística, com as técnicas em separado, visto que os equipamentos se encontravam em

laboratórios distintos, impedindo a hifenação (IC-ICP-MS).

Inicialmente, uma curva analítica (figura 6.13) a partir de fósforo inorgânico em

matriz aquosa foi preparada e submetida à leitura no ICPMS. As figuras de mérito

obtidas neste cenário foram: Limite de detecção (LD = 3.σ10 leituras do branco . (tgα)-1) igual a

0,42 µg.L-1; Limite de quantificação (LQ = 3,3 . LD) igual a 1,39 µg.L-1; Concentração

equivalente ao background (BEC = CPSbranco . [P1] . (CPSP1)-1) igual a 3,60 µg.L-1.

Adicionalmente, a calibração apresentou um ótimo coeficiente de determinação.

60

y = 2608,2x - 10536R2 = 0,9998

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 200 400 600 800 1000 1200

[P, ug/L]

CP

S

Figura 6.13 - Curva analítica para fósforo inorgânico em matriz aquosa na técnica de ICP-MS.

Pelo fato do fósforo estar ligado a uma molécula orgânica tanto no AMPA como

no glifosato, curvas analíticas a partir de padrões destas moléculas foram preparadas e

submetidas à técnica de ICP-MS, a fim de avaliar o comportamento do fósforo. Na

ocasião, foram elaborados padrões variando de 10 a 500 µg.L-1 para as curvas

analíticas (figura 6.14).

y = 2166,1x - 2779,5

R2 = 1

y = 2357,1x - 9307

R2 = 0,9999

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 100 200 300 400 500 600

[P, ug/L]

CP

S

AMPA

Glifosato

Linear (AMPA)

Linear (Glifosato)

Figura 6.14 - Curvas analíticas das moléculas AMPA e glifosato para a técnica de ICPMS.

61

Pode ser verificado que a inclinação das curvas analíticas é bastante próxima

para as duas moléculas e, comparadas à de fósforo inorgânico, a perda de

sensibilidade é pouca significativa. Isto permite inferir que a fonte de fósforo não vem a

ser preocupante na técnica de ICPMS, o que pode ser explicado pela elevada

temperatura atingida no plasma. A tabela 6.1 resume as características analíticas

obtidas nos três casos.

Tabela 6.1: Características analíticas para as curvas analíticas preparadas a partir de

fósforo inorgânico, AMPA e glifosato para a técnica de ICPMS.

Características analíticas P inorgânico P AMPA P glifosato

Sensibilidade 2608 2166 2357

Coeficiente de correlação (R2) 0,9998 1,0000 0,9999

BEC - background equivalent concentration (µg.L-1) 3,60 4,24 7,32

Uma vez que os equipamentos CI e ICPMS não estavam em linha, um primeiro

experimento foi o de realizar coletas sucessivas do eluído da coluna cromatográfica, a

fim de correlacionar o sinal do analito no detector condutimétrico com a presença de

fósforo no coletado. Para garantir um volume mínimo de amostra a ser submetida ao

ICPMS, estipulou-se a coleta do eluente com a amostra a cada 2 minutos. A

determinação de fósforo por ICP-MS em função do tempo de amostragem é

apresentado na figura 6.15.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

tempo (min)

CP

S

Figura 6.15 - Determinação de fósforo em ICP-MS para eluição de AMPA e glifosato (1 mg L-1).

62

Pode ser verificado dois sinais distintos nos tempos de aproximadamente 15 e 31

minutos que, conforme sugestão dos resultados da cromatografia, podem ser inferidos

aos compostos AMPA e glifosato, respectivamente. Um segundo experimento foi

realizado adicionando-se fosfato à amostra original contendo as duas substâncias e

realizando a coleta sucessiva de forma equivalente. A figura 6.16 apresenta os

resultados obtidos.

Um terceiro sinal pode ser identificado, que sai entre os dois obtidos

anteriormente, equivalente ao fósforo inorgânico, eluído a aproximadamente 27

minutos, corroborado pela técnica de cromatografia de íons.

Figura 6.16 - Determinação de fósforo em ICP-MS para eluição de: (1) AMPA, (2) fosfato e (3)

glifosato (1 mg.L-1).

Uma vez identificado os tempos de amostragem fez-se um estudo de

recuperação quantitativa tanto de AMPA e glifosato em separado, como da mistura das

substâncias. O procedimento de separação cromatográfica foi realizado no modo

gradiente, em condições otimizadas previamente definidas, e as coletas realizadas nos

tempos de eluição de cada um, coletando 2,0 mL de amostra para submissão ao ICP-

MS. Os ensaios foram realizados em duplicata. A tabela 6.2 resume as concentrações

testadas e respectivos teores obtidos no ICP-MS, assim como a incerteza associada

63

nas replicatas. Na figura 6.17, são apresentados os percentuais de recuperação nos

ensaios.

Tabela 6.2: Concentrações testadas nas amostras submetidas ao teste de recuperação de

fósforo e determinadas no ICPMS.

AMPA Glifosato Mistura

[P, µg.L-1] amostra 1192 1129 2305

[P, µg.L-1] recuperado, Md ± SD 1266 ± 8,1 1184 ± 22,6 1255 ± 4,5 e 1211 ± 80

RSD % 0,6 1,9 0,4 e 6,6

Figura 6.17: Recuperação, em termos de fósforo inorgânico (ICPMS), em amostras de AMPA,

glifosato e na mistura destes.

O ensaio apresentou boa repetibilidade, com baixo desvio padrão relativo e os

percentuais de recuperação em todos os ensaios ficaram em torno de 105 %, o que

pode ser considerado muito bom dentro do número de etapas envolvidas no

procedimento completo.

64

6.5. VALIDAÇÃO METODOLÓGICA Para que um novo método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis

sobre a amostra, há a necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas,

através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade (Ribani et al., 2004).

O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a

finalidade que se destina, reproduzindo resultados confiáveis. Deve-se garantir, por

meio de estudos experimentais que o método atenda a exigências das aplicações

analíticas, assegurando confiabilidade dos resultados. Conforme a Resolução ANVISA

RE nº 899, de 29 de maio de 2003 deve apresentar: seletividade, linearidade, precisão,

sensibilidade, limite de quantificação e exatidão adequadas à análise.

Seletividade é a capacidade de um método quantificar com segurança o analito

na presença de interferentes existentes na amostra, sendo conveniente a utilização de

testes de pureza de pico, como por exemplo, com auxílio de detector de arranjo de

fotodiodos ou espectrometria de massas (PASCHOAL et al., 2008).

A figura 6.18 mostra dois cromatogramas obtidos em matrizes de água

subterrânea, pelo método isocrático. Observa-se uma amostra isenta de glifosato, em

preto, e em vermelho a mesma amostra fortificada com 125 µgL-1 de glifosato. O tempo

de retenção do glifosato é de aproximadamente 11 minutos e pode ser constatado que

não há interferência no sinal.

Figura 6.18: Cromatogramas obtido no método isocrático, em matrizes de água subterrânea.

Amostra isenta de glifosato (preto); amostra contendo glifosato(1) com fortificação de 125 µg.L-

1(vermelho) (Condições T= 27ºC, Vazão=0,8 mL.min-1, eluente: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3

2,0 mmol L-1,Detecção: IC/Condutimetria).

65

Para as amostras de água mineral e superficial, a metodologia empregada foi a

de gradiente e o estudo da seletividade foi realizado tanto para AMPA como para

glifosato. As figuras 6.19 e 6.20 mostram cromatogramas obtidos nestas matrizes sem e

com fortificação..

Figura 6.19: Cromatogramas obtidos em matriz de água mineral: em preto, sem fortificação e

em vermelho fortificada com 300 µg L-1 de AMPA (1) e glifosato (2). (Condições: Condições: T

= 27 ºC; Vazão = 0,75 mL min-1; eluição; gradiente 3, Coluna: 25 cm; Detecção:

IC/condutometria).

Figura 6.20: Cromatogramas obtidos em matriz de água superficial: (Preto) no ponto S6, sem

fortificação; (vermelho) “pool” de águas dos pontos S1, S2, S3, S4, S5 e S6, fortificado com 300

µg L-1 de AMPA (sinal 1) e glifosato e (sinal 2 ). Condições iguais às realizadas na figura 6.19.

66

Linearidade é a capacidade de um de um método analítico em fornecer

resultados que sejam diretamente proporcionais à concentração do composto de

interesse, dentro de uma faixa de concentração (INMETRO, 2003). Desta forma, para

avaliar a linearidade foram preparadas curvas analíticas nas matrizes de estudo, ou

seja, água subterrânea, água superficial, água mineral e água ultra pura.

Para a elaboração das curvas analíticas, uma solução estoque de 10.000 µg L-1

foi preparada para posterior preparo dos pontos da curva. Para cada nível de

concentração, três soluções-padrão independentes foram preparadas. Na metodologia

de determinação de glifosato por eluição isocrática IC/condut foram feitas fortificações

com padrão de glifosato em matriz de água ultrapura e de água subterrânea em vários

níveis de concentração: 40, 80, 100, 200, 300, 400 e 500 µgL-1 e 100, 200, 250, 400,

500, 1000 µgL-1, respectivamente, para as matrizes água ultrapura (Apêndice A1) e

água subterrânea (Apêndice A2). Para a determinação por IC-MS (Apêndice A3) foi

elaborada uma curva em matriz de água ultrapura nas concentrações de (50, 100, 200,

280, 300 e 500 µgL-1).

Para a construção das curvas analíticas da metodologia de separação

simultânea do glifosato e AMPA utilizando eluição por gradiente, foram preparadas

soluções em matrizes de: água ultrapura (Apêndice A4 e A5); água mineral (Apêndice A6

e A7) e água superficial (Apêndice A8 e A9) para glifosato e AMPA. No caso da matriz de

água ultrapura, foram adicionados, além de glifosato e AMPA, os ânions fluoreto e

cloreto a 100 µgL-1, brometo, nitrato e sulfato a 200 µgL-1 e fosfato a 300 µgL-1, para

melhor simular a composição de matrizes reais. Nas matrizes de água mineral e

superficial, só foi feita a fortificação com glifosato e AMPA, porque ânions como cloreto,

fosfato e sulfato costumam estarem presentes.

A linearidade foi avaliada por meio do coeficiente de determinação (R2). Neste

trabalho, foi possível identificar a influência do método de separação cromatográfica

(isocrática ou por gradiente) e do tipo de detecção (condutométrica ou MS) na figura de

mérito em questão.

No caso do glifosato, a detecção condutométrica, em todas as condições

67

cromatográficas e em todas as matrizes, resultou em um coeficiente de determinação a

0,99 (figuras 6.21 e 6.22, método isocrático e por gradiente, respectivamente). Para o

AMPA, foi observado um R2 superior a 0,99 para as matrizes de água ultrapura e água

mineral, conforme apresentado na figura 6.23.

Figura 6.21: Curvas analíticas de glifosato em matriz água ultrapura (A) e água subterrânea (B),

obtidas por eluição isocrática, detecção condutométrica.

68

Figura 6.22 - Curvas analíticas de glifosato nas matrizes: água ultrapura (A) água mineral (B)

água superficial (C), obtidas por eluição por gradiente, detecção condutométrica.

69

Figura 6.23 - Curvas analíticas de AMPA nas matrizes: água ultrapura (A) e água mineral (B),

obtidas por eluição por gradiente, detecção condutométrica.

Estes valores estão em conformidade com o esperado pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA 2003). Somente para duas curvas não foram obtidos

coeficientes de determinação superiores a 0,99: AMPA em água superficial (figura 6.24)

e glifosato na detecção por IC-MS (figura 6.25).

70

Figura 6.24- Curva analítica de AMPA na matriz de água superficial, obtida por eluição por

gradiente, detecção por condutometria.

Figura 6.25: Curva analítica de glifosato em matriz água ultrapura obtida por eluição isocrática

e IC-MS.

Pode ser verificado que em água superficial, na faixa de 30 a 300 µg L-1 de

AMPA não foi obtida linearidade adequada. Considerando-se a faixa de 80 a 300 µg L-1,

com uma curva analítica de 3 pontos, o coeficiente de determinação subiu para 0,998.

O fato deste efeito só ter sido observado na matriz de água superficial sugere se tratar

de um efeito de matriz, cuja compreensão necessita estudos mais aprofundados.

Na detecção por IC/MS, a linearidade para o glifosato no método isocrático não

foi adequada (R2 = 0,97 em água ultrapura). Uma possível explicação para a perda de

linearidade na detecção por IC/MS pode ser a ocorrência de fenômenos não

reprodutíveis na interface, principalmente a baixas concentrações.

71

Para o cálculo da repetitividade do método cromatográfico empregado, foi

avaliada a proximidade dos resultados obtidos nas réplicas de cada ponto utilizadas

para o cálculo da linearidade. A precisão do método analítico pode ser expressa pelo

desvio padrão relativo (RSD (%)) ou coeficiente de variação (CV) de uma série de

medidas (ANVISA, 2003). A ANVISA sugere que o RSD (%) entre as injeções seja

inferior a 5%. As áreas dos sinais das réplicas de cada ponto e o cálculo do desvio

padrão relativo (RSD (%)) são apresentados nos apêndices (Apêndice A1 a A9). O

RSD (%) encontrado para a maioria das réplicas de cada ponto foi inferior que 4%.

O Limite de Detecção (LD) é o menor sinal que pode ser detectado do analito na

amostra, enquanto que Limite de Quantificação (LQ) é a menor concentração que pode

ser determinada com confiabilidade, depois de ser submetida a todo o processo

analítico (INMETRO, 2007). Os LDs foram calculados por dois métodos: no método 1,

estimou-se a concentração do analito capaz de produzir um sinal cuja altura seja 3

vezes o valor do ruído da linha base; o LQ foi considerado como o sinal de altura igual a

10 vezes o ruído. O segundo método de cálculo foi baseado nos parâmetros da curva

analítica, segundo a fórmula: LD = 3,3.(sb/m), onde sb é o desvio-padrão do coeficiente

linear da reta e m, o seu coeficiente angular. O LQ neste segundo método foi calculado

como 10.(sb/m).

As tabelas 6.3 e 6.4 resumem o desempenho analítico dos métodos de eluição

isocrática e por gradiente. Como se pode observar, em matriz de água ultrapura, o

limite de detecção (LD) do glifosato com detecção condutométrica esteve entre 10 e 15

µg L-1, considerando os métodos isocrático e por gradiente. Pelo método de eluição por

gradiente, o LD em água mineral foi próximo ao da água ultrapura e, em água

superficial, foi aproximadamente duas vezes maior (12,4 - 20 µgL-1). Em matriz de água

subterrânea, só foi aplicado o método isocrático, que resultou num LD maior (54 - 63 µg

L-1).

Com relação ao AMPA, estudado nas matrizes de água ultrapura, mineral e

superficial, obteve-se um LD de 9,8 µg L-1 para a primeira matriz (equivalente ao

glifosato), enquanto que, em água mineral o limite de detecção foi de 60 µg L-1 e, para

água superficial, de 29,7 µg L-1, ambos pelo método 2.

72

TABELA 6.3: Desempenho analítico do método proposto - Determinação do glifosato por

eluição isocrática

Matriz Água

ultrapura

Água subterrânea Água ultrapura

Método IC – condut. IC- condut. IC-MS

Coeficiente de correlação R2 R2 = 0,9983 R2=0,9943 R2 = 0,9717

Faixa linear (µg L-1) 40 a 500 µg L-1 100 a 1000 µg L-1 50 a 400 µg L-1

Equação da reta Y = 439,33 x Y = 381,44 x - 12177 Y = 1826,2 x + 62784

Limite de detecção (LD) (µg L-1) 10a 15b 54a 63b - 71b

Limite de quantificação (LQ) (µg L-1) 35a 47b 181a 190b - 215b

Média dos RSD (%) 0,98 0,92 2,58

a: método 1; b: método 2

TABELA 6.4: Desempenho analítico do método proposto – Determinação simultânea de

glifosato e AMPA por eluição por gradiente.

Glifosato MATRIZ Água ultrapura Água mineral Água superficial

Coeficiente de correlação R2 R2 = 0,9986 R2 = 0,9992 R2 = 0,9978

Faixa linear (µg L-1) 30 - 300 µg L-1 40 - 300 µg L-1 30 - 300 µg L-1

Equação da reta Y = 860,7x - 257,15 Y=841,19 x-10946 Y=736,02x–1450,06

Limite de detecção (LD) (µg L-1) 15a 9,6b 9,8a 9,5b 20a 12,4b

Limite de quantificação (LQ) (µg L-1)

Média dos RSD (%)

50a 29b

3,0

33a 28,9b

3,0

67a 37,6b

3,3

AMPA MATRIZ Água ultrapura Água mineral Água superficial

Coeficiente de correlação R2 R2 = 0,9986 R2 = 0,9944 R2 = 0,9983

Faixa linear (µg L-1) 30 - 300 µg L-1 30 - 300 µg L-1 100 - 300 µg L-1

Equação da reta Y = 617,34x - 5710,8 Y=337,31x- 2831,3 Y= 208,2x – 1843,7

Limite de detecção (LD) (µg L-1) 13a 9,8b 60a 60b 37a 29,7b

Limite de quantificação (LQ) (µg L-1) 44 a 29,7b 138a 125a 90,2b

Média dos RSD (%) 4,1 2,9 3,4

a: método 1; b: método 2

73

Os LDs obtidos neste trabalho foram mais baixos que os obtidos por

IC/coulometria (COUTINHO et al. 2008), principalmente para o AMPA (38 e 240 µg L-1

para glifosato e AMPA em água mineral, por análise direta, após injeção de 20 µL de

amostra). O acoplamento IC/ condutometria, com análise direta foi feito por MARQUES

et al.(2009), mas apenas para a determinação de glifosato em água potável. O LD

obtido foi de 15,4 µg L-1, bem próximo ao deste trabalho. GARCIA e ROLLEMBERG

(2007) determinaram apenas glifosato em águas naturais por voltametria, obtendo LD

de 59 µg L-1. A determinação direta de glifosato e AMPA por IC/Condutometria foi feita

por DIMITRAKOPOULOS et al., 2010, que obtiveram um LD de 0,54 µg L-1 para o

glifosato em águas potáveis, graças à injeção de um volume (1 mL) de amostra 10

vezes maior que o usado neste trabalho. No entanto, a metodologia desenvolvida por

estes autores não permitiu a quantificação de AMPA; segundo os autores, que usaram

KOH como eluente, houve co-eluição do AMPA com carbonato presente nas matrizes

naturais e, apesar da presença de um supressor de CO2 no sistema, ainda haveria uma

quantidade de carbonato residual; o volume de injeção também interferiu na retenção

relativa AMPA – carbonato. No presente trabalho, no entanto, observou-se linearidade

na determinação de AMPA em matrizes de água ultra-pura e mineral, em

concentrações semelhantes às de DIMITRAKOPOULOS et al., 2010, apesar do eluente

usado conter carbonato.

Segundo Stalikas (2001), aproximadamente 60% do tempo total de uma análise

são gastos com a preparação e pré- tratamento da amostra, sendo que estas etapas de

preparação são as maiores fontes de erro em um procedimento analítico. As

metodologias apresentadas neste trabalho para a quantificação de glifosato e AMPA

não requerem qualquer preparação da amostra como reação de derivatização, etapas

de limpeza ou extração da amostra, apresentando a vantagem de um menor consumo

de produtos químicos e, por serem métodos diretos, tem reduzidos tempos totais de

análise. O equipamento utilizado é relativamente barato, o custo dos reagentes é baixo

(Na2CO3, NaHCO3 e NaOH), além de poluírem menos o ambiente ao serem

comparados com os métodos que usam derivatizantes. O único pré-tratamento foi a

filtração da amostra.

Cabe ressaltar ainda que os limites de detecção obtidos atendem à legislação

74

brasileira - Portaria MS 518 de 25/03/2004 e Resolução CONAMA 396 de 03/04/2008.

Outra vantagem da metodologia desenvolvida neste trabalho é que o método

implementado permite a detecção por IC-MS e a hifenação IC-ICP-MS, que é uma

alternativa para a obtenção de baixos valores de limites de detecção por permitir a

análise direta com injeção de grandes volumes. Guo e colaboradores (2007) obtiveram

limites de detecção entre 1,1 e 1,4 µg L-1, para glifosato e AMPA por análise direta,

usando injeção de grandes volumes (500 µL), e hifenação IC-ICP-MS. Neste trabalho, a

potencialidade do acoplamento IC-ICP-MS foi estudada em caráter exploratório.

6.6 Determinação de glifosato e AMPA em amostras de águas naturais

Águas subterrâneas

As amostras foram analisadas em triplicata. Foi encontrada a presença do

glifosato em água subterrânea, no ponto de monitoramento P7C1, na concentração de

239,7 µg L-1, com um desvio padrão de 3,69 determinada por IC/condutometria. A figura

6.26 mostra, em vermelho, o cromatograma obtido para a amostra; em preto vê-se a

mesma amostra fortificada com glifosato na concentração de 500 µg L-1. Observa-se

que houve um aumento no sinal do glifosato no mesmo tempo de retenção da amostra

pura. Esta análise foi avaliada por IC/MS, que também comprovou a presença de

glifosato na amostra, como pode ser visto por IC-MS utilizando monitoramento seletivo

de íons (SIM), no modo negativo, obtido através da amostra P7C1, na figura 6.27.

Os resultados encontrados estão dentro da faixa permitida pela legislação

brasileira vigente. Portaria MS 518 de 25/03/2004 e Resolução CONAMA 396 de

03/04/2008.

75

Figura 6.26: Cromatograma obtido para a amostra P7C1 nas seguintes condições: T= 27ºC,

Vazão=0,8 ml/min, Eluição isocrática: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1. Em

vermelho amostra pura mostrando o pico do glifosato, em preto a mesma amostra fortificada

com padrão de glifosato 500 µg L-1.

Figura 6.27: Cromatograma obtido por IC/MS, modo SIM, m/z = 168, para a amostra P7C1;

sinal do glifosato aproximadamente em 11 minutos. (Condições: T= 27ºC, Vazão=0,8 ml/min,

Eluição isocrática: Na2CO3 6,0 mmol L-1 e NaHCO3 2,0 mmol L-1)

Águas superficiais e minerais

Não foi detectada a presença de glifosato ou de AMPA nas amostras analisadas

Glifosato

76

7. CONCLUSÕES e PERSPECTIVAS

Ao atingir a significativa marca de 7 bilhões de pessoas ao redor do mundo, o

homem se depara cada vez mais com o desafio da alimentação e a busca por uma

agricultura mais produtiva vai de encontro ao uso, de forma crescente, de agrotóxicos.

Por outro lado, a aplicação destas substâncias químicas não pode ser feita de

forma indiscriminada e as entidades governamentais têm estabelecidos limites de

concentração toleráveis para o passivo ambiental. Desta forma, somente com um

monitoramento adequado é que será possível atingir metas de produção alimentícia

sem trazer efeitos colaterais ao meio ambiente.

Neste contexto, o presente trabalho se propôs a desenvolver uma metodologia

para quantificação residual da substância glifosato e seu principal metabólito, o ácido

metilênico fosfônico (AMPA), na presença de ânions comuns de águas superficiais de

baixa salinidade.

Estabeleceu-se a metodologia isocrática, que foi capaz de separar o glifosato e

sem a interferência dos ânions comuns: fluoreto, cloreto, brometo, nitrato, sulfato e

fosfato. O sinal do glifosato foi confirmado pela hifenação com IC-MS.

Estabeleceu-se a metodologia IC/condutometria por gradiente, que permitiu a

separação simultânea do glifosato, AMPA e dos ânions comuns. Para a metodologia

por gradiente os sinais do AMPA e glifosato foram confirmados pela hifenação IC-MS.

A metodologia isocrática foi validada em água ultrapura e água subterrânea.

A metodologia por gradiente foi validada em matrizes de água ultrapura, água

mineral e água superficial.

O método desenvolvido é eficiente na quantificação dos analitos, pois, mesmo

77

diante da extensa literatura a respeito, foram obtidos LQ e LD comparáveis aos da

literatura.

Demonstrou-se que a metodologia é adequada para a determinação dos dois

analitos (glifosato e AMPA) em uma mesma analise, representando uma relação

custo/beneficio. A metodologia para determinação do glifosato e AMPA por

IC/condutometria apresentou algumas vantagens sobre a detecção por métodos que

envolvem derivatização:

• Analise direta e rápida, ou seja, não são necessárias reações de

derivatização da amostra;

• Sem etapas de extração/limpeza da amostra;

• Sem a necessidade de pré-concentração.

Os estudos exploratórios com a técnica ICP-MS, onde se determinou o fósforo em

sua forma inorgânica demonstraram enorme potencial para a hifenização IC-ICPMS, o

que permitiria associar alta sensibilidade (ICP-MS) a especiação de espécies.

Considerando que esta metodologia é rápida e demonstrou atender a legislação

vigente a mesma poderá ser utilizada no monitoramento de água naturais.

78

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMARANTE JÚNIOR, O. P.; SANTOS, T. C. R. DOS; BRITO, N. M.; RIBEIRO, M. L.

Glifosato: Propriedades, toxicidade, usos e legislação: breve revisão . Quim. Nova .

Campinas – SP, v. 25, n. 4, p. 589-593, 2002.

________. Métodos de extração e determinação do herbicida glifosato: breve revisão .

Quim. Nova . v. 25, n. 3, p. 420-428, 2002.

ANVISA. Resolução nº 899 de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos

analíticos e bioanalíticos. 2003. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm>. Acesso em: 23 out. 2010.

ARAÚJO, S. M. M.; LEMOS, R. N. S.; QUEIROZ, M. E. R.; NUNES G.S. Pesticidas: R.

Ecotoxicol e Meio Ambiente. Curitiba, v. 11, jan./dez. 2001.

Barceló, D.; Environmental Protection Agency and other methods for the determination

of priority pesticides and their transformation products in water. Journal of

Chromatography A. v. 643p.117-143, 1993.

BAUER, K.H.; KNEPPER, T, P.; MAES, A.; SCHATZ, V.; VOIHSEL, M. Analysis of polar

organic micropollutants in water with ion chromatography–electrospray mass

spectrometry. Journal of Chromatography A . v. 837, p.117–128, 1999.

BORJESSON, E.; TORSTENSSON, L. New methods for determination of glyphosate

and (aminomethyl)phosphonic acid in water and soil . Journal of Chromatography A .

v. 886, p.207-216, 2000.

79

BO, Li.; XIAOJUN, D.; DEHUA, G.; SHUPING J. Determination of Glyphosate and

Aminomethylphosphonic Acid Residues in Foods Using High Performance Liquid

Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry. Chinese Journal Of

Chromatography . v. 25 (4) p.486–490, 2002.

BRASIL. Constituição (1988). Constituição da República Federativa do Brasil . Texto

consolidado até a Emenda Constitucional nº 52 de 08 de março de 2006. Seção II - da

Saúde. Brasilia: Senado Federal, 2006.

BRASIL. Decreto- lei nº 4074 de 04 de janeiro de 2002. Dispõe sobre a pesquisa, a

experimentação, a produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o

armazenamento, a comercialização, a propaganda comercial, a utilização, a

importação, a exportação, o destino final dos resíduos e embalagens, o registro, a

classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização de agrotóxicos, seus componentes

e afins, e dá outras providências. Brasília, 4 de janeiro de 2002. Disponível em: <

http://www.mma.gov.br/port/conama/legiabre.cfm?codlegi=515>. Acesso em: 08 dez.

2009.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Manual de Vigilância

da Saúde de Populações Expostas a Agrotóxicos . Organização Pan- Americana de

Saúde/Organização Mundial de Saúde. Brasília, 1997.

BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria MS n.º 518/2004 / Ministério da Saúde,

Secretaria de Vigilância em Saúde, Coordenação - Geral de Vigilância em Saúde

Ambiental – Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2005.

BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria nº Portaria nº 3, de 16 de janeiro de 1992.

Secretaria de Vigilância Sanitária. Disponível em:<http://e-

legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct. php?id=560> . Acesso em: 08 dez. 2009.

80

BRASIL. Resolução (RE) nº 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação do

“Guia para a validação de métodos analíticos e bioa náliticos”. Diário oficial da

República Federativa do Brasil, Brasilia, DF, 02 de junho de 2003.

COX, C. Glyphosate, Part 1: Toxicology. Journal of Pesticide Reform . v. 15, n.3,

1995.51.

________. Glyphosate (Roundup). Journal of Pesticide Reform . V.18, n.3, UPDATED

1/02, 1988.

CHANG, S. Y.; WEI, M.Y. Simultaneous Determination of Glyphosate, Glufosinate, and

Aminomethylphosphonic Acid by Capillary Electrophoresis after 9-Fluorenylmethyl

Chloroformate Derivatization. Journal of the Chinese Chemical Society . v. 52,p.785-

792, 2005.

CHEN, Z.; HE, W.; BEER, M.; MEGHARAJ,M.; NAIDU, R.; Speciation of glyphosate,

phosphate and aminomethylphosphonic acid in soil extracts by ion chromatography with

inductively coupled plasma mass spectrometry with an octopole reaction system.

Elsevier Talanta v. 78 p. 852–856, jan. 2009.

COMPERJ - Complexo Petroquímico do Rio de Janeiro . Disponível em:

<http://www.comperj.com.br/Localizacao.aspx>. Data do acesso: 05 out. 2011.

CONSLEG - European Communities – Council Directive 91/414/EEC, 2003.

CORBERA, M.; HIDALGO,M.; SALVADÓ,.V. Extraction and Pre concentration of the

Herbicide Glyphosate and its Metabolite AMPA Using Anion-Exchange Solid Phases

Microchimica Acta. v. 153, p.203–209, mar. 2006.

COUTINHO,C.F.B.; COUTINHO,L.F.M.; MAZO,L.H.; NIXDORF, S.L.; CAMARA,C.A.P.;

Rapid and direct determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in water

81

using anion exchange chromatography with coulometric detection. Journal of

Chromatography A . v.1208 p.246–249, set. 2008.

COX, C. Glyphosate, Part 1: Toxicology. Journal of Pesticide Reform , Northwest

Coalition for Alternatives to Pesticides, Eugene, OR. v 15, Number 3, Fall 1995.

DELAPLANE, K.S.; Pesticide Usage in the United States: History, Benefits, Risks, and

Trends. Cooperative Extension Service, The University of Georgia, Athens, Georgia

1996. Disponível em:< http://ipm.ncsu.edu/safety/factsheets/pestuse.pdf> Acesso em:08

dez. 2009.

DIMITRAKOPOULOS, I.K., THOMAIDIS, N. S.; MEGOULAS, N. C.; KOUPPARIS M. A.

Effect of suppressor current intensity on the determination of glyphosate and

aminomethylphosphonic acid by suppressed conductivity ion chromatography. Journal

of Chromatography A . V. 1217, p.3619-362, mar. 2010.

DORES, E. F. G. C.; Contaminação de águas superficiais e subterrâneas p or

pesticidas em Primavera do Leste, Mato Grosso 2004. 282 f. Tese (Doutorado em

química) - Universidade Estadual Paulista, São Paulo, 2004.

EITH, C.; KOLB, M.; RUMI, A.; SEUBERT, A. Práticas em Cromatografia de Íons

Metrohm Ltda . Suíça, 2006-2007, 160 p.

FUR, E. Le.; COLIN, R.; CHARRÊTEUR, C.; DUFAU, C.; PÉRON, J.,J. Determination of

glyphosate herbicide and aminomethylphosphonic acid in natural waters by liquid

chromatography using pre-column fluorogenic labeling. Part I: Direct determination at

the 0.1µ/L level using FMOC. Analusis . v. 28, p.813-818, 2000.

GARCIA, A. F.; ROLLEMBERG, M. DO C. Determinação voltamétrica do herbicida

glifosato em águas naturais utilizando eletrodo de cobre. Quim. Nova . V. 30, n. 7, p.

1592-1596, 2007.

82

GARRIDO, L. R.; SONEGO, O. R. Uvas Viníferas para Processamento em Regiões

de Clima Temperado. Porto Alegre: EMBRAPA, 2003, p. 10 -16.

GAUCH, R.; LEUENBERGER, U.; MULLER, U.; The determination of the herbicide

glyphosate and its chief metabolite aminomethylphosphonic acid (AMPA) in drinking

water with the aid of HPLC Z Lebensm Unters Forsch German 188(1): p.36-8, 1989.

GROB, R.; BARRY,E.F. Modern practice of gas chromatography . 4th ed. USA.

edited by Robert. 2004.

GUO, Z-X.; CAI Q. YANG, Z., Determination of glyphosate and phosphate in water by

ion chromatography—inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Journal

of Chromatography A . v.1100, p.160–167, 2005.

________. Ion chromatography/inductively coupled plasma mass spectrometry for

simultaneous determination of glyphosate, glufosinate, fosamine and ethephon at

nanogram levels in water. Rapid Commun Mass Spectrom. v.21,p.; 1606–1612,

2007.

HANKE, I.; SINGER, H.; HOLLENDER, J. Ultratrace-level determination of glyphosate,

aminomethylphosphonic acid and glufosinate in natural waters by solid-phase

extraction followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry: performance

tuning of derivatization, enrichment and detection. Anal Bioanal Chem. v. 391, p.2265–

2276, 2008.

IBÁNEZ.M.; POZO,O.J.; SANCHO,J.V.; LÓPEZ, F.J.;FELIX, H.; Re-evaluation of

glyphosate determination in water by liquid chromatography coupled to electrospray

tandem mass spectrometry . Journal of Chromatography A Spain. v. 1134 p. 51–55

jul. 2006.

83

INMETRO-Instituto Nacional de Metrologia, Normatização e Qualidade Industrial.

Orientações sobre validação de métodos de ensaios q uímicos . DQO- CGRE-

008,2007.

KAPINUS, E.N.; REVELSKY, I.A.; ULOGOV, V.O.; LYALIKOV, Yu. A. Simultaneous

determination of fluoride, chloride, nitrite, bromide, nitrate, phosphate and sulfate in

aqueous solutions at 10−9 to 10−8% level by ion chromatography. Journal of

Chromatography B. v 800 ,p.321–323, 2004.

KATAOKA, H.; RYU, S., SAKIYAMA, N.; MAKITA, M. Simple and rapid determination of

the herbicides glyphosate and glufosinate in river water, soil and carrot samples by gas

chromatography with flame photometric detection. Journal of Chromatography A

Japan . v.726 p. 253-258, Set.1996.

KOMATSU, E.; VAZ, J. M. Otimização dos parâmetros de extração para determinação

multiresíduo de Pesticidas em amostras de água empregando microextração em fase

sólida. Quim. Nova . São Paulo - SP, v. 27, n. 5, p. 720-724, 2004.

MARQUES, M.N., PASSOS, E.A., SILVA, M.T.S., CORREIA, F.O., SANTOS A.M.O.,

ALVES,J.P.H Determination of Glyphosate in Water Samples by IC. Journal of

Chromatographic Science. Aracaju-SE v. 47 p.822-824 Out. 2009.

MARTHA, J.M. WELLS, L. Z. Y.; Solid-phase extraction of acidic herbic. Journal of

Chromatography A USA. v. 885 p. 237–250, 2000.

National Primary Drinking Water Standards, US Envir onmental Protection Agency

(EPA). (2003). Disponível em: <http://www.epa. gov/safewater/consumer/pdf/mcl.pdf>.

Acesso em: 10 jul. 2011.

OGA, S; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Fundamentos de Toxicologia .

3. ed. São Paulo: Atheneu, 2008, p. 623-639.

84

PAPADOYANNIS, I.N.; SAMANIDOU, V.F. Ion Chromatography Principles, Suppressed

and Nonsuppressed. Encyclopedia of Chromatography . 2004, p. 858-861.

PASCHOAL, R. A. J.; RATH, S.; AIROLDI, S. P. F. Validação de métodos

cromatográficos para a determinação de resíduos de medicamentos veterinários em

alimentos. Quim. Nova. v 31, n.5, p. 1190-1198, 2008

PATSIAS, J., PAPADOPOULOU, A., PAPADOPOULOU-MOURKIDOU, E. Automated

trace level determination of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid in water by

on-line anion-exchange solid-phase extraction followed by cation exchange liquid

chromatography and post-column derivatization. Journal of Chromatography A

Greece . v.932 p. 83–90, Aug. 2001.

PIRYAPITTAYA, M.; JAYANTA,S.; MITRA,S.;LEEPOPATPIBOON, N.; Micro-scale

membrane extraction of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in water followed

by high-performance liquid chromatography and post-column derivatization with

fluorescence detector. Journal of Chromatography A. v. 1189 p. 483–492 fev.2008.

POPP, M.; HANN, S.; MENTLER, A. ;FUERHACKER,M.; STINGEDER,G.;

KOELLENSPERGER, G.; Determination of glyphosate and AMPA in surface and waste

water using high-performance ion chromatography coupled to inductively coupled

plasma dynamic reaction cell mass spectrometry (HPIC–ICP–DRC–MS). Anal Bioanal

Chem. Austria . v.391 p. 695–699, April 2008.

QIAN, K.; TANG, T.; SHI, TY.; WANG, F.; LI, JQ.; CAO, YS . Residue determination of

glyphosate in environmental water samples with Highperformance liquid

chromatography and UV detection after derivatization with 4 chloro

3,5dinitrobenzotrifluoride . Analytica Chimica Acta . v. 635 n.2, p.222-226, 2009.

85

QUEIROZ, E.C.; SILVAN, M. CARVALHO, D.; LANÇAS, M.F.; Comparison between

solid-phase extraction methods for the chromatographic determination of

organophosphorus pesticide in watter. J. Environ. Sci. Health. B 36(5), p. 517–

527,2001.

QUEIROZ, G.M. P.; SILVA, M. R. DA.; BIANCO, R.J.F.; PINHEIRO, A.; KAUFMANN V.

Transporte de glifosato pelo escoamento superficial e por lixiviação em um solo

agrícola. Quim. Nova. v.34, n.2,p.190-195, 2011.

QUEIROZ, S. C.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F. Métodos de extração e/ou

concentração de compostos encontrados em fluidos biológicos para posterior

determinação cromatográfica. Quim. Nova. Campinas - SP, v. 24, n.1, p. 68-76, 2001.

QUEIROZ, S.C.N.; FERRACINI,V.L.; ROSA,M.A..; ANDRADE, J. A.; JARDIM, I.C.S.F.;

Métodos para a Determinação de Multirresíduos de Ag rotóxicos em Produtos

Agrícolas . Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Brasil, 2008.

RIBANI, M. BOTTOLI, C.B.G. COLLINS, C.H. JARDIM, I.C.S.F.; MELO L.F.C.

Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quim. Nova . Campinas v.27,

n.5 p. 771-780,2004.

RIBEIRO, M.L., LOURENCETTI, C., PEREIRA, S.Y.,MARCHI,M.R.R. DE.,

Contaminação de Águas Subterrâneas por Pesticidas Quim. Nova, Campinas v. 30, n.

3, p. 688-694, 2007.

ROMANO, R. M.; ROMANO, M. A.; OLIVEIRA, C. A. Glifosato como desregulador

endócrino químico, Ambiência. Revista do Setor de Ciências Agrárias e Ambientais .

V. 5 N. 2, Maio/Ago. 2009.

RUBIO, F.; LINDA, J.; VELDHUIS, B.; CLEGG, S.; FLEEKER,J.R.,HALL,J. C.

Comparison of a Direct ELISA and an HPLC Method for Glyphosate Determinations in

86

Water Journal of Agricultural and Food Chem. V.51,p. 691-696 2003.

SABIK, H, JEANNOT, R, RONDEAU, B. Multiresidue methods using solid-phase

extraction techniques for monitoring priority pesticides, including triazines and

degradation products, in ground and surface waters. Journal of Chromatogrphy. A

Amsterdam. v.885, p.217-236, 2000.

SMALL, H.;STEVENS,T.S.; BAUMAN,W.C.; Novel ion exchange chromatography

method using condutimetric detection. Analytical Chemistry . V. 47 n. 11, sept. 1975.

SÁNCHEZ-BAYOA, F.; HYNEB, R. V.; DESSEILLEB, K. L.; An amperometric method

for the detection of amitrole, glyphosate and its aminomethyl-phosphonic acid metabolite

in environmental waters using passive samplers. Analytica Chimica Acta . V. 675,

p.125–131, 2010.

SANCHO, J.V.; HERNFINDEZ, A. F; LOPEZ A.F.J.; HOGENDOORN, B. E.A;

DIJKMAN,H.E. Rapid determination of glufosinate, glyphosate and

aminomethylphosphonic acid in environmental water samples using precolumn

fluorogenic labeling and coupled-column liquid chromatography. Journal of

Chromatography A Spain. v.737 p. 75-83, 1996.

SANTOS, V.M.R.; DONNICI,L.C.; COSTA, J.B.N.DA, CAIXEIRO, J.M.R.; Compostos

organofosforados penta valentes: Histórico, métodos sintéticos de preparação e

aplicações como inseticidas e agentes tumorais. Quim. Nova. Vol. 30, No. 1, p.159-

170, 2007.

SEE, H.H.; HAUSER,C.P.;IBRAHIM,W.A.W.;SANAGI,M.M. Rapid and direct

determination of glyphosate, glufosinate, and aminophosphonic acid by online

preconcentration CE with contactless conductivity detection. Journal Electrophoresis.

V.31, p.575-582, set 2009.

87

SHARMA, S. D.; SINGH, M.; Surfactants Increase Toxicity of Glyphosate and 2,4-D to

Brazil Pusley. HortScience. V.36(4),p.726–728, 2001.

SKOOG D.A; WEST D.M; HOLLER F. J; CROUCH S.R. Fundamentos de Química

Analítica . 8. ed. São Paulo: Cengage Learning, 2008.

STALIKAS, C. D.; Analytical methods to determine phosphonic and amino acid group-

containig pesticides. Journal of Chromatography A . v.907, n.1-2, p.1-19,2001.

STERTZ, S. C.; FREITAS, R. J. S. Teor de Dissulfeto de Carbono em Agrião d’água

(Nasturtiun Officinale R. Be.) Obtido pelos Sistemasde Cultivo Orgânico, Convencional

e Hidropônico, Pesticidas R. Ecotoxicol e meio ambiente. Curitiba, v 13,p. 45-52,

jan/dez.2003 Disponível em : <:http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs2/index.php/pesticidas/article/

viewFile/3164/2537> . Acesso em: 24 jul. 2009.

SUN, Y.; WANG, C.; WEN , Q.; WANG, G.; WANG, H.; QU,Q.; HU, X. Determination of

Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Water by LC Using a New Labeling

Reagent, 4-Methoxybenzenesulfonyl Fluoride. Chromatographia. V. 72, p.679-686, oct.

2010.

USEPA. METHOD 547. Determination of glyphosate in drinking water by direct-

aqueousinjection Hplc, post-column derivatization, and fluorescence detection U.S.

Environmental Protection Agency, 16 p., 1990.

USEPA. METHOD 551.1 Determination of chlorination disinfection by products,

chlorinated solvents, and halogenated pesticides/herbicides in drinking water by liquid-

liquid extraction and gas chromatography with electron-capture detection. U.S.

Environmental Protection Agency, 70 p., 1995.

VALENTE, A.L. P.; AUGUSTO F. Microextração por fase sólida. Química nova .

Campinas – SP, v.23, n.4, p.523-530, 2000.

88

VELASCO. L. O. M. de; CAPANEMA. L. X. L. de Agroquímica . BNDES Setorial, Rio de

Janeiro, n. 24, p. 71-72, set. 2006.

VERA, S.M.; LAGOMARSINO, L.; SYLVESTER, M.; PÉREZ, G.; RODRÍGUEZ, P.;

MUGNI, H.; SINISTRO, R.; FERRARO, M.; BONETTO, C.; ZAGARESE, H.;

PIZARRO,H.; New evidences of Roundup (glyphosate formulation) impact on the

periphyton community and the water quality of freshwater ecosystems. Ecotoxicology.

v.19, p.710-721, 2010.

The EU-MRLs set in Regulation (EC) No 396/2005 from the European Union

pesticide data base. Disponível em: < http://ec.europa.eu/

sancopesticides/public/index.cfm>. Acesso em: 10 jul. 2011.

WILLIAMS, G. M.; KROES, R.; MUNRO, I. C. Safety Evaluation and Risk Assessment of

the Herbicide Roundup and Its Active Ingredient, Glyphosate, for Humans. Regulatory

Toxicology and Pharmacology . v.31, p.117–165, 2000.

WINFILD,T.W.; BASHE.W.J.; BAKER. T.V. USEPA Method 547, EPA/600/4-90/020, jul

1990.

ZHU, Y.; ZHANG, F.; TONG, C.; LIU, W. Determination of glyphosate by ion

chromatography. Journal of Chromatography A China .v.850 p. 297–301. 1999.

89

Apêndice A1: Concentrações do padrão de Glifosato que compõem a curva analítica

elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com glifosato obtidos por eluição

isocrática.

Padrões de Glifosato - µg/L

Padrões P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7

Concentrações 40 80 100 200 300 400 500

Áreas 15356 30645 40178 85627 130061 180386 220873

Áreas 15721 30128 40483 84575 132217 179456 222896

Áreas 15756 30440 40717 84952 131804 179871 214196

Desvio Padrão 222 260 270 533 1144 466 4553 Média 15611 30404 40459 85051 131361 179904 219322

RSD % 1,4 0,9 0,7 0,6 0,9 0,3 2,1


elaborada com matriz em água subterrânea fortificada com glifosato obtidas por

eluição isocrática.


Padrões P1 P2 P3 P4 P5 P6

Concentrações 100 200 250 400 500 1000

Áreas 24 883 50 970 89969 152796 179123 369977

Áreas 24279 50913 89402 155923 175497 367118

Áreas 24491 50326 88813 154488 175932 360325

Desvio Padrão 150 415 578 1565 1980 4958 Média 24385 50620 89395 154402 176851 365807 RSD% 0,6 0,8 0,6 1,0 1,1 1,4

90


elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com glifosato obtidas por eluição

isocrática, IC-MS.



Concentrações 50 100 200 280 300 400

Áreas 106080 303160 446560 568910 653420 755550

Áreas 93717 292480 397190 592670 641390 76003

Desvio Padrão 8742 7552 34910 16801 8506 3168 Média 99899 297820 421875 580790 647405 757790 RSD% 0,1 2,5 8,3 2,9 1,3 0,4


elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com fluoreto, cloreto, brometo,

nitrato, sulfato e fosfato, obtido por eluição por gradiente.



Concentrações 30 40 80 100 200 300

Áreas 23846 33401 69979 83730 159713 259916

Áreas 26244 36815 73433 86226 172313 260642

Áreas 24895 35258 71256 84978 166013 263279

Desvio Padrão 1202 1709 1746 1248 6300 1770

RSD% 4,8 4,9 2,4 1,5 3,8 0,7

Média 24995 35158 71556 84978 166013 261279

91

Apêndice A5: Concentrações do padrão de AMPA que compõem a curva analítica

elaborada com matriz em água ultrapura fortificada com fluoreto, cloreto, brometo,

nitrato, sulfato e fosfato, obtido por eluição por gradiente.

Padrões de AMPA - µg/L


Concentrações 30 40 80 100 200 300

Áreas 13269 18055 46189 53616 109730 182160

Áreas 14143 19855 42930 56848 111399 173052

Áreas 13856 19105 46448 55232 119068 191268

Desvio Padrão 445 904 1961 1616 4980 9108

RSD% 3,2 4,8 4,3 2,9 4,4 5,0

Média 13756 19005 45189 55232 113399 182160


elaborada com matriz em água mineral, obtida por eluição por gradiente.


Padrões P1 P2 P3 P4 P5

Concentrações 40 80 100 200 300

Áreas 20049 56075 78452 156240 241116 Áreas 19047 54272 73580 158428 239061 Áreas 21051 57878 80324 154052 243171 Desvio Padrão 1002 1803 3481 2188 2055

RSD% 5,0 3,2 4,5 1,4 0,9 Média 20049 56075 77452 156240 241116

92


elaborada com matriz em água mineral, obtida por eluição por gradiente.



Concentrações 30 40 80 100 200 300

Áreas 8257 11315 23263 29740 64588 98830

Áreas 8045 10950 22500 29260 62293 94889

Áreas 8469 11680 24026 30230 66877 102771

Desvio Padrão 212 365 763 485 2292 3941

RSD% 2,6 3,2 3,3 1,6 3,5 4,0

Média 8257 11315 23263 29743 64586 98830


elaborada com matriz em água superficial, obtida por eluição por gradiente.



Concentrações 30 40 80 100 200 300

Áreas 19694 26833 62785 73331 140648 220351

Áreas 17760 24542 60646 70665 143616 230284

Áreas 19628 26124 64924 75997 137680 213418

Desvio Padrão 1675 1173 2139 2666 2968 8477

RSD% 0,1 4,5 3,4 3,6 2,1 3,8

Média 18694 25833 62785 73331 140648 221351

93


elaborada com matriz em água superficial, obtida por eluição por gradiente.


Padrões P1 P2 P3

Concentrações 100 200 300

Áreas 19478 38791 60117

Áreas 18805 37852 64172

Áreas 20151 39730 59062

Desvio Padrão 673 939 2698

RSD% 3,5 2,4 4,4

Média 19478 38791 61117

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE … Anézia Lima... · e ferramentas para alcançar mais esta vitória em minha vida. ... conquistada nestes dois anos, ... ion-exchange