UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE … Daniele Yuri... · Formulação do gel base de Carbopol ... Resultados do teste de recuperação da papaína a 2 e a 4% nas amostras

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA SAÚDE

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de

géis de papaína destinados ao tratamento de feridas

DANIELE YURI MIURA

Niterói

2012

ii

DANIELE YURI MIURA

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de

géis de papaína destinados ao tratamento de feridas

Niterói

2012

Dissertação apresentada à Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal

Fluminense para obtenção do título de

Mestre no Programa de Pós-Graduação em

Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde.

Orientadora:

Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro

Miura, Daniele Yuri

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao tratamento de feridas/Daniele Yuri Miura; orientadora: Débora Omena Futuro. – Niterói, 2012.

101f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2012. 1. Papaína. 2. Terapêutica. 3. Cicatrização de feridas. 4. Estabilidade de medicamento. I. Futuro, Débora Omena II. Título. CDD 615.1901

M685

iii

DANIELE YURI MIURA

Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de papaína destinados ao

tratamento de feridas

Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como

requisito para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde.

Aprovada em ____ / ____ / 2012.

Orientadora

Professora Dr.ª Débora Omena Futuro

Universidade Federal Fluminense

Banca Examinadora

Professora Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão


Professora Dr.ª Alessandra Lifsitch Viçosa

Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)

Membros Suplentes

Professora Dr.ª Kátia Gomes de Lima Araújo


Professora Dr.ª Zaida Maria Faria de Freitas

Universidade Federal do Rio de Janeiro

iv

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Luiz e Hitomi, pelo apoio incondicional e exemplo de vida.

Às minhas irmãs, Tatiana e Camila, pelo carinho e momentos de alegria.

Ao meu marido, Claudio, pelo amor, companheirismo, incentivo e paciência.

v

AGRADECIMENTOS

À Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro, minha orientadora, pela oportunidade, confiança e

ensinamentos. Minha gratidão por termos feito esta caminhada juntas.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde e seus

docentes, meu muito obrigada.

À Prof.ª Dr.ª Kátia Gomes de Lima Araújo, pelo conhecimento, entusiasmo e prestatividade;

obrigada pela imprescindível ajuda durante todo o projeto. Às alunas do LABIOTEC, por

serem sempre atenciosas quando necessitei de auxílio.

Ao Prof. Dr. Joel Maurício Corrêa da Rosa, pela valiosa contribuição nos estudos de

superfície de resposta, parte essencial deste trabalho. Muito obrigada por nos auxiliar nessas

análises.

À Dr.ª Valéria Gonçalves Costa, por compartilhar seus conhecimentos e colocar-se disponível

sempre que preciso. Muito obrigada por todo o suporte, atenção e gentileza, mesmo com todas

as adversidades. Ao seu aluno Ricardo, agradeço pela contribuição nos ensaios de reologia

realizados.

À Prof.ª Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão e à Prof.ª Dr.ª Samanta Cardozo Mourão, obrigada

por acompanharem este trabalho desde o princípio, por contribuírem com incentivos e

opiniões, e pelos materiais cedidos.

À Prof.ª Dr.ª Selma Rodrigues de Castilho, à Prof.ª Dr.ª Beatriz Guitton Renaud Baptista de

Oliveira, à aluna de mestrado Andrea Pinto Leite e aos demais integrantes do Grupo de

Pesquisa em Feridas, Biomateriais e Pesquisa Clínica, pelo apoio intelectual e incrível troca

de experiências, que foram essenciais para determinar os rumos deste trabalho.

vi

À Farmácia Universitária da Universidade Federal Fluminense por, além de ser parte

essencial da minha formação profissional e objeto do meu carinho, contribuir com o

empréstimo de matérias-primas e vidrarias para este projeto. Aos farmacêuticos Eliana de

Vares Cação e Nilo Jorge Picolli e ao Prof. Ronaldo Ferreira da Silva, meu muito obrigada.

Ao Prof. Dr. Wilson da Costa Santos, pela aquisição dos filtros para o fluorímetro, parte

essencial para o desenvolvimento da metodologia analítica deste trabalho. Muito obrigada.

Ao Prof. Déo Anselmo Pinheiro, por gentilmente ceder o Laboratório de Cosméticos para

produção das formulações analisadas neste projeto.

À Prof.ª Dr.ª Lenise Arneiro Teixeira e ao Prof. Dr. Geraldo Renato de Paula, do Laboratório

de Controle Microbiológico, pela disponibilidade na utilização de seus equipamentos.

Às alunas de estágio e iniciação científica, Carina Menegussi Dalvi, Hingred Bosch e Luiza

Mattos, pela ajuda e empenho em diversas etapas deste trabalho.

À CAPES, pela bolsa de estudos concedida.

À FAPERJ, pelo apoio financeiro.

Aos meus amigos, Luciana e João Márcio. Obrigada pelo incentivo e por tornarem tudo mais

divertido.

vii

“Digo o que penso, com esperança. Penso no que faço, com fé. Faço o que devo fazer, com

amor. Eu me esforço para ser cada dia melhor, pois bondade também se aprende.

Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar,

desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o

decidir."

Cora Coralina

viii

RESUMO

MIURA, D.Y. Desenvolvimento farmacotécnico e estudo de estabilidade de géis de

papaína destinados ao tratamento de feridas. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, Faculdade de Farmácia,

Universidade Federal Fluminense, 2012.

A papaína é uma enzima proteolítica, extraída do látex da espécie Carica papaya

Linne. Ela é utilizada no tratamento tópico de feridas como agente desbridante, podendo ser

aplicada em concentrações de 2 a 10%, dependendo da fase do processo de cicatrização.

Porém, sua baixa estabilidade é um fator limitante para aplicação em formulações.

O presente estudo analisou a influência dos adjuvantes técnicos EDTA dissódico,

cloridrato de cisteína e propilenoglicol no aumento da atividade proteolítica de géis de

Carbopol® 940 contendo papaína a 2 e a 4% (p/p). No estudo de formulação dos géis, as

formulações foram definidas por um desenho fatorial 33 e o efeito dos adjuvantes foi avaliado

através de um estudo de superfície de resposta. Para cada concentração de papaína, foram

selecionadas duas formulações para o estudo de estabilidade acelerada: a formulação com

melhor resultado de atividade proteolítica e aquela sem adição de adjuvantes. O estudo de

estabilidade acelerada foi realizado por sessenta dias a 5ºC ± 2ºC, 26ºC ± 2ºC e 45ºC ± 2ºC.

As quatro formulações apresentaram grande perda de atividade enzimática durante o tempo

do estudo, mesmo aquelas armazenadas a 5ºC ± 2ºC. Contudo, o armazenamento em

temperaturas mais altas intensificou a perda de atividade. Para os géis de papaína a 2%, o uso

de adjuvantes não foi eficiente na manutenção da atividade proteolítica. Já para os géis de

papaína a 4%, houve um intenso aumento na atividade com o uso de adjuvantes, porém este

efeito não foi mantido durante o tempo. Apesar destes resultados, o estudo indicou a

possibilidade de aprimoramento das formulações de gel de papaína com o uso de adjuvantes

técnicos, podendo gerar uma melhora no desempenho da atividade proteolítica dos produtos.

Palavras-chave: papaína, estabilidade, gel, estudo de formulação.

ix

ABSTRACT

MIURA, D.Y. Pharmacotechnical development and stability study of papain gels for

wounds treatment. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense,

2012.

Papain is a proteolytic enzyme extracted from latex of Carica papaya Linne. It is used

in the topical wounds treatment as a debriding agent and can be applied at concentrations of

2-10%, depending on the phase of the healing process. However, its low stability is a limiting

factor for use in formulations.

The present study examined the influence of technical adjuvants disodium EDTA,

cysteine hydrochloride and propylene glycol on increasing of proteolytic activity of

Carbopol® 940 gels containing 2 and 4% (w/w) of papain. In the gels preformulation study,

the formulations were defined by a 33 factorial design and the effect of adjuvants was

evaluated using a response surface study. For each concentration of papain, two formulations

were selected for the accelerated stability study: a formulation with best result of proteolytic

activity and that without adjuvants. The accelerated stability study was carried out for sixty

days at 5°C ± 2°C, 26ºC ± 2°C and 45ºC ± 2°C. The four formulations showed a large loss of

enzyme activity during the time of the study, even those stored at 5°C ± 2°C. However,

storage at higher temperatures increased the loss of activity. For gels with 2% papain, the use

of adjuvants was not efficient in maintaining the proteolytic activity. As for the gels with 4%

papain, there was an intense increase in activity with the use of adjuvants, but this effect was

not maintained over time. Despite these results, the study indicated the possibility of

improvement of papain gel formulations with the use of technical adjuvants, wich can provide

a better performance of the proteolytic activity of the products.

Keywords: papain, stability, gel, formulation study.

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades físicas da papaína. .............................................................................. 12

Tabela 2. Classificação dos géis segundo a natureza da fase coloidal. ................................... 22

Tabela 3. Classificação dos géis segundo o número de fases. ................................................. 22

Tabela 4. Classificação dos géis segundo a natureza da fase líquida. ..................................... 22

Tabela 5. Formulação do gel base de Carbopol® 940. ............................................................. 29

Tabela 6. Formulações de géis de papaína a 2 e a 4% preparadas para seleção do gel base

mais adequado. .................................................................................................................. 30

Tabela 7. Volumes utilizados das soluções das amostras e do padrão no teste de recuperação.

........................................................................................................................................... 34

Tabela 8. Formulações avaliadas no teste de especificidade. .................................................. 35

Tabela 9. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 2%. ............... 37

Tabela 10. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 4%. ............. 38

Tabela 11. Codificação das variáveis para o estudo de superfície de resposta, utilizando

pacote RMS do programa R. ............................................................................................. 39

Tabela 12. Composição das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, selecionadas para o

estudo de estabilidade acelerada. ...................................................................................... 40

Tabela 13. Parâmetros de avaliação das características sensoriais das formulações. .............. 42

Tabela 14. Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão

secundário 30.000 UI/mg. ................................................................................................. 46

Tabela 15. Resultados obtidos da avaliação da precisão intra-corrida para soluções de papaína

padrão 0,450; 1,500; e 3,750 UI/mL. ................................................................................ 48

Tabela 16. Resultados do teste de recuperação da papaína a 2 e a 4% nas amostras de gel de

Carbopol® 940. .................................................................................................................. 49

Tabela 17. Resultados experimentais da análise da interferência de diversos excipientes na

determinação da atividade da papaína em gel de Carbopol® 940. .................................... 50

Tabela 18. Resultados obtidos para o cálculo dos limites de detecção e quantificação da

papaína pelo método de microplacas. ............................................................................... 52

xi

Tabela 19. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína

2%...................................................................................................................................... 54

Tabela 20. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína

4%...................................................................................................................................... 60

Tabela 21. Resultados do teste de steepest ascent from ridge do gel de papaína a 4%. .......... 64

Tabela 22. Composição das formulações de gel de papaína selecionadas para o estudo de

estabilidade acelerada. ....................................................................................................... 65

Tabela 23. Avaliação das características sensoriais das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e

P4-28 no tempo zero. ........................................................................................................ 65

Tabela 24. Valores de pH das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero. ..... 67

Tabela 25. Resultados da análise de viscosidade aparente das formulações P2-01, P2-20, P4-

01 e P4-28 no tempo zero. ................................................................................................. 68

Tabela 26. Valores referentes à viscosidade aparente (no ponto de máximo gradiente de

cisalhamento) e tixotropia para as formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28. ................ 72

Tabela 27. Valores da atividade proteolítica das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no

tempo zero. ........................................................................................................................ 73

Tabela 28. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-01 em 60 dias............ 74




Tabela 32. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-01. ................ 80




Tabela 36. Avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60 dias, em

diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................................................... 85



xii





xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal

estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007). .............. 13

Figura 2. Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra. ........................ 32

Figura 3. Curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg. ....................................................... 46

Figura 4. Curva de unidades de fluorescência x tempo obtida da análise da formulação 1,

apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2). .................................. 50







Figura 8. Gráficos das curvas de contorno do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x

cloridrato de cisteína; (b) EDTA dissódico x propilenoglicol; (c) cloridrato de cisteína x

propilenoglicol. ................................................................................................................. 58

Figura 9. Gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína 2% - (a) EDTA dissódico x









Figura 12. Fotografias das formulações no tempo zero de análise - (a) P2-01; (b) P2-20; (c)

P4-01; (d) P4-28. ............................................................................................................... 67

Figura 13. Gráfico de viscosidade aparente x velocidade das formulações P2-01, P2-20, P4-

01 e P4-28 no tempo zero. ................................................................................................. 69

xiv

Figura 14. Reograma da formulação P2-01 no tempo zero de análise. ................................... 70




Figura 18. Fotografias das formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, entre os 7º e

60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ± 2ºC),

temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC). .............................................. 76

Figura 19. Fotografias das formulações de gel de papaína a 4%, P4-01 e P4-28, entre os 7º e

60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ± 2ºC),

temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC). .............................................. 79

Figura 20. Gráfico de viscosidade aparente da formulação P2-01, na velocidade de 100 rpm,

durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ..................................... 82







Figura 24. Gráfico da avaliação da atividade proteolítica da formulação P2-01 durante 60

dias, em diferentes temperaturas de armazenamento. ....................................................... 86







xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AA Adesivo acrílico

a.C. Antes de Cristo

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

app Tm Temperatura de desnaturação térmica aparente

Asn Asparagina

CCD Composite Central Design

CMD Concentração média determinada

CME Concentração média experimental

Cp Centipoise

CT Concentração teórica

CV Coeficiente de variação

Cys Cisteína

λmax Comprimento de onda de absorbância máxima

Da Dalton

d.C. Depois de Cristo

DCC Delineamento Composto Central

DMSO Dimetilsulfóxido

DP Desvio padrão

DPa Desvio padrão da interseção com o eixo y das 3 curvas de

calibração

DSC Calorimetria exploratória diferencial

DX Dextrana

EDTA Etilenodiaminotetracetato

FO First order

g Grama

GLU Glutaraldeído

His Histidina

HUAP Hospital Universitário Antônio Pedro

I Incolor

IC Inclinação da curva de calibração

INT Instituto Nacional de Tecnologia

LAMAP Laboratório de Processamento e Caracterização de Materiais

Poliméricos

xvi

LBNB Látex de borracha natural bicentrifugado

LD Limite de detecção estimado

LQ Limite de quantificação estimado

µL Microlitro

µm Micrometro

mg Miligrama

mL Mililitro

mPa.s Milipascal segundo

N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA Cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalnil-L-arginina 4-

metilcumarina-7-amido

nm Nanômetro

Pa Pascal

p/p Peso por peso

p/v Peso por volume

PEG Polietilenoglicol

psi Medida de pressão em libra por polegada quadrada

q.s. Quantidade suficiente

q.s.p. Quantidade suficiente para

R Coeficiente de correlação

R2 Coeficiente de correlação linear

rpm Rotações por minuto

s Segundo

SB Dispersão de silicone bicomponente

SM Dispersão de silicone monocomponente

SO Second order

TPP Tripolifosfato

TWI Two-way interactions

UI Unidade Internacional

UR Umidade relativa do ar

ŷ Valor estimado

xvii

SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO

1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3

aa 2.1 Pele

3

AA 2.1.1 Feridas

4

aa 2.1.1.1 Processo de cicatrização

5

2.1.1.2 Tratamento de feridas

7

2.2 Papaína

10

2.2.1 Características físicas da papaína

12

2.2.2 Estrutura molecular da papaína

12

2.2.3 A papaína no tratamento de feridas

13

2.2.4 Formulações e produtos com papaína utilizados no

tratamento de feridas

16

2.2.5 Estabilização da papaína

18

2.3 Géis

21

2.3.1 Carbômero (Carbopol®)

23

2.4 Reologia

24

2.4.1 Comportamento reológico de géis de Carbopol®

26

3. OBJETIVOS

27

3.1 Objetivo geral

27

3.2 Objetivos específicos

27

4. MATERIAIS E MÉTODOS

28

4.1 Materiais

28

4.1.1 Matérias-primas e Reagentes

28

4.1.2 Equipamentos

28

4.2 Métodos

29

4.2.1 Preparação do gel de Carbopol® 940 para incorporação da

papaína

29

4.2.2 Preparação dos géis de papaína a 2 e 4% para seleção do

gel base mais adequado

30

4.2.3 Determinação da atividade proteolítica da papaína

31

4.2.3.1 Validação da metodologia

33

aa 4.2.3.1.1 Curva de calibração

33

4.2.3.1.2 Precisão

33

4.2.3.1.3 Exatidão

34

4.2.3.1.4 Especificidade

35

4.2.3.1.5 Limites de detecção e quantificação

36

4.2.4 Estudo de formulação

36

xviii

4.2.4.1 Estudo de superfície de resposta

39

4.2.5 Estudo de estabilidade acelerada

40

4.2.5.1 Preparo das amostras

40

4.2.5.2 Condições do estudo

41

4.2.5.3 Características avaliadas

41

4.2.6 Análise estatística

43

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

45

5.1. Seleção do gel base de Carbopol®

940 para incorporação da

papaína

45

5.2 Validação da metodologia de determinação da atividade

proteolítica da papaína

46

5.2.1 Curva de calibração

46

5.2.2 Precisão

47

5.2.3 Exatidão

48

5.2.4 Especificidade

49

5.2.5 Limites de detecção e quantificação

52

5.3 Estudo de formulação

53

5.3.1 Gel de papaína a 2%

54


60

5.4 Estudo de estabilidade acelerada

64

5.4.1 Caracterização dos géis de papaína no tempo zero do

estudo de estabilidade acelerada

65

5.4.1.1 Características sensoriais

65

5.4.1.2 pH

67

5.4.1.3 Viscosidade aparente

68

5.4.1.4 Comportamento reológico

70

5.4.1.5 Atividade proteolítica

73

5.4.2 Avaliação das características sensoriais durante 60 dias de

armazenamento dos géis

74

5.4.3 Avaliação dos valores de pH durante 60 dias de


80

5.4.4 Avaliação da viscosidade aparente durante 60 dias de


81

5.4.5 Avaliação da atividade proteolítica durante 60 dias de


85

6. CONCLUSÕES

92

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

93

1

1. INTRODUÇÃO

Ferida pode ser descrita como qualquer tipo de alteração na integridade anatômica da

pele, resultante de trauma físico, químico, mecânico ou causado por afecção clínica. Ainda

nos dias atuais, as feridas representam um problema de saúde para o ser humano, com

repercussões físicas e psicoemocionais e diminuição na qualidade de vida e no convívio

social.

O tratamento de feridas é complexo, envolvendo aspectos sistêmicos e locais. A

terapia tópica é um fator essencial para o tratamento de feridas e envolve os processos de

limpeza, desbridamento e cobertura. O desbridamento consiste na remoção de tecidos

necrosados ou exudatos purulentos presentes no leito da ferida, que interferem no processo de

cicatrização. Pode ser realizado por técnicas mecânicas e/ou químicas. O desbridamento

mecânico apresenta as desvantagens de ser uma técnica cansativa, muito delicada,

normalmente traumática e causadora de sofrimento ao paciente. A opção pelo desbridamento

com enzimas proteolíticas apresenta-se vantajosa, com remoção rápida e seletiva, não-

traumática, sem causar prejuízos ao paciente.

Amplamente utilizada na prática clínica como agente desbridante, a enzima papaína,

oriunda do látex da espécie Carica papaya, apresenta também características

bactericida/bacteriostática, anti-inflamatória e bioestimulante. Outras vantagens do seu uso

são o baixo custo e a ausência de efeitos colaterais. A papaína pode ser utilizada em todas as

fases do processo cicatricial, sendo indicadas diversas concentrações dependendo do grau de

cicatrização da ferida: preparações a 2% para feridas com tecido de granulação, produtos com

4% a 6% de papaína em feridas que apresentem exsudato purulento, e formulações onde a

papaína encontre-se a 8 e a 10% quando a ferida apresentar tecido necrótico.

No Brasil, as preparações com papaína são provenientes da farmácia magistral e só

recentemente foram contempladas pelo Formulário Nacional, na forma farmacêutica em gel.

Não existem produtos industrializados a base de papaína para uso tópico em nosso país e não

foram encontrados registros de estudos de estabilidade de produtos nas concentrações

preconizadas pelo Formulário Nacional. Por tratar-se de uma enzima, a papaína apresenta

baixa estabilidade, tornando necessário que sejam feitos estudos mais aprofundados para

2

determinação de veículos compatíveis, adjuvantes técnicos necessários, condições de

armazenamento e estabilidade físico-química dessas formulações.

Deste modo, foi elaborado o presente trabalho, visando contribuir para um melhor

entendimento a respeito da estabilidade dos géis de papaína a 2 e a 4% (p/p), produtos

amplamente utilizados no tratamento de feridas.

3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Pele

A pele é considerada o maior e mais complexo órgão do corpo humano, representando

aproximadamente 15% do peso corporal, tendo a função de revesti-lo e delimitá-lo, além de

estar constantemente relacionada com atividades biológicas e bioquímicas (CAMARGO,

2006; HAX, 2009; DÂNGELO e FATTINI, 1998). Ela contém, pelo menos, cinco diferentes

tipos de células que contribuem para sua organização estrutural e demais tipos celulares,

provenientes dos sistemas circulatório e imunológico (HADGRAFT, 2004; MENON, 2002;

QUEIROZ, 2008). É composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme (CAMARGO,

2006; DÂNGELO e FATTINI, 1998).

A epiderme é a camada mais externa, composta por três diferentes linhagens de

células: queratinócitos, melanócitos e células de Langerhans. Ela é organizada em camadas e,

conforme as mais superficiais são eliminadas, as camadas mais profundas são restauradas por

divisão celular. Suas camadas são denominadas: germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e

córnea. A camada germinativa é a mais profunda, faz limite com a derme, e a camada córnea

é a mais superficial (BLANES, 2004). A camada córnea é constituída por células escamosas,

queratinizadas, impermeáveis, e proporciona proteção contra traumas físicos e químicos

(BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; SAMPAIO, CASTRO e RIVITTI, 1989). As diversas

camadas de queratinócitos, unidos uns aos outros, fornecem barreira às lesões, à

contaminação e à luz. A epiderme também evita a desidratação dos tecidos subjacentes, retém

fluidos e nutrientes dentro da pele e produz melanina, responsável pela cor da pele e proteção

dos tecidos subjacentes dos efeitos nocivos da luz ultravioleta (BLANES, 2004; CAMARGO,

2006; HAX, 2009).

A derme é uma espessa camada de tecidos conjuntivos fibrinosos de colágeno e

elastina, onde se apoia a epiderme e faz a união à hipoderme (BLANES, 2004; JUNQUEIRA

e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008). Nela, encontram-se os anexos da pele, vasos

sanguíneos, vasos linfáticos e nervos (HAX, 2009). Pode ser dividida em camada papilar,

mais externa, e camada reticular, mais interna (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004;

QUEIROZ, 2008). A derme contém diversos tipos de células, incluindo fibroblastos e

4

fibrócitos, macrófagos, mastócitos e leucócitos sanguíneos, particularmente neutrófilos,

eosinófilos, linfócitos e monócitos (BLANES, 2004).

A hipoderme, ou camada subcutânea, é rica em fibras e adipócitos. Atua como reserva

energética, isolante térmico e protege contra choques mecânicos (CAMARGO, 2006; HAX,

2009). Ela é formada por tecido conjuntivo frouxo e une de maneira pouco firme a derme aos

órgãos subjacentes (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004; QUEIROZ, 2008).

2.1.1 Feridas

Ferida pode ser denominada como uma interrupção da continuidade de um tecido

corpóreo, em maior ou em menor extensão, causada por qualquer tipo de trauma físico,

químico, mecânico ou desencadeada por uma afecção clínica (BLANES, 2004; CESARETTI,

1998).

As feridas podem ser classificadas em função de sua etiologia (aguda ou crônica); do

mecanismo da lesão (amputação, incisa, contusa, escoriação, lacerante ou puntiforme); do

grau de contaminação (limpa, limpa-contaminada, contaminada ou infectada); e do grau de

perda de tecido (feridas de espessura ou densidade parcial, ou feridas de espessura ou

densidade total) (PEREIRA, 2006).

Dentre as principais patologias relacionadas ao surgimento de feridas, está o diabetes.

Portadores dessa doença devem ser avaliados constantemente, já que o nível de glicemia está

fortemente relacionado a complicações vasculares, como a neuropatia periférica e a doença

vascular periférica. Complicações como essas estão associadas a lesões tissulares e

amputações de membros inferiores (MACIEL, 2008).

As neuropatias motora, sensitiva e autonômica aumentam os riscos do surgimento de

ulcerações, pois diminuem os mecanismos de proteção ao trauma, através da diminuição da

sensibilidade, diminuição da sudorese, modificação na regulação do fluxo sanguíneo e

deformidade nos pés (MACIEL, 2008).

Uma das complicações frequentes em pacientes com anemia falciforme é a úlcera de

membros inferiores. Elas ocorrem em 8 a 10% dos pacientes homozigotos. As ulcerações

formadas são dolorosas e podem ser únicas ou múltiplas. Acometem áreas com pouco tecido

subcutâneo e pele fina, como a região maleolar interna ou externa e tibial anterior. O

5

aparecimento pode ser espontâneo ou gerado por pequenos traumas. Não existe forma de

prevenção, a recorrência é frequente, a cicatrização é lenta e respondem pior ao tratamento

que úlceras de outras etiologias (PALADINO, 2007).

A insuficiência venosa crônica é a principal etiologia das úlceras venosas. Tais lesões

contribuem com cerca de 70% a 90% dos casos de úlceras de pernas e geram impacto

psicológico, dor, diminuição da qualidade de vida e altos custos ao sistema de saúde, pois os

pacientes costumam permanecer com a ferida por vários anos (BORGES, 2005; MACIEL,

2008).

Como consequência das doenças crônicas, as limitações físicas e a imobilidade são

importantes fatores de risco para as úlceras por pressão (MACIEL, 2008; THOMAS, 2006).

Elas são consideradas como indicadores da qualidade do cuidado com o paciente. Essa lesão é

definida como uma área localizada de dano da pele e tecido subjacente, causado por pressão,

cisalhamento, fricção ou a combinação destes fatores (CANNON e CANNON, 2004;

MACIEL, 2008). Essas lesões podem atingir qualquer área de proeminência óssea corporal,

porém as mais vulneráveis são as regiões sacra, calcânea e trocantérica (MACIEL, 2008;

REDDY et al., 2008; THOMAS, 2006). As úlceras por pressão ocorrem com frequência em

pacientes hospitalizados, com prevalência entre 3% e 12%, segundo dados americanos que

contabilizaram úlceras a partir do estágio II, lesão que envolve a epiderme e/ou a derme

(MACIEL, 2008). Consequentemente, elas constituem importante problema para pacientes e

instituições de saúde, pois, aumentam o risco de infecção, dificultam a recuperação,

prolongam a internação, geram custo elevado e contribuem para o aumento da taxa de

mortalidade (CANNON e CANNON, 2004; MACIEL, 2008; REDDY et al., 2008;

THOMAS, 2006).

2.1.1.1 Processo de cicatrização

A cicatrização de feridas é um processo dinâmico, contínuo e complexo, composto por

diversas fases sobrepostas (BLANES, 2004; CAMARGO, 2006; CESARETTI, 1998;

DECLAIR, 2002; HAX, 2009). Ela depende de vários fatores, locais e gerais, como:

localização anatômica, tipo de pele, raça, técnica cirúrgica utilizada (CAMARGO, 2006). São

utilizadas diferentes classificações didáticas para entendimento deste processo.

6

Morfologicamente, identificam-se três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e de

maturação (BLANES, 2004; CESARETTI, 1998; HAX, 2009).

A fase inflamatória é uma reação local não específica à lesão do tecido e/ou invasão

bacteriana (HAX, 2009). Ocorre vasoconstrição por 5 a 10 minutos imediatamente após a

lesão, propiciando o fechamento dos vasos danificados. Em seguida, há o aumento da

permeabilidade vascular, com a retração das células endoteliais, permitindo a passagem dos

elementos sanguíneos para a ferida; plasma, eritrócitos e leucócitos (diapedese) (BLANES,

2004). A vasodilatação com extravasamento de elementos para o exterior do vaso forma um

exsudato, que se manifesta clinicamente por inchaço, calor, rubor e dor; a intensidade

depende do tipo e do grau de agressão sofrida pela pele (BLANES, 2004; HAX, 2009). Estas

alterações correspondem à resposta vascular e são acompanhadas por uma resposta celular. Os

neutrófilos realizam a digestão de bactérias e tecidos desvitalizados, e os monócitos

transformam-se em macrófagos, auxiliando na fagocitose de bactérias e restos celulares

(SCHULTZ et al., 2003). Ocorre a liberação de mediadores celulares, que estimulam a

elaboração de substâncias responsáveis pelo fenômeno inflamatório (histamina, serotonina,

bradicinina, prostaglandinas e tromboxanos, linfocinas e interleucinas 1 e 2). Há também a

liberação do fator de crescimento pelas células epidérmicas e plaquetas (BLANES, 2004).

Na fase proliferativa, ocorre a reparação do tecido conjuntivo e do epitélio. A

reparação do tecido conjuntivo compreende a formação de tecido de granulação, com

proliferação endotelial e de fibroblastos, que surgem por volta do segundo e terceiro dia após

a lesão. Ocorre a transformação do fibrinogênio do exsudato inflamatório em fibrina, que

forma uma rede. Nesta rede de fibrina, há a deposição dos fibroblastos, que passam a

multiplicar-se e a secretar os componentes protéicos do tecido cicatricial (BLANES, 2004).

Observa-se também uma intensa proliferação vascular (BLANES, 2004; SCHULTZ et al.,

2003). Este tecido constituído por fibroblastos, substâncias produzidas por eles e vasos

sanguíneos é chamado de tecido de granulação, que apresenta aspecto granuloso e

avermelhado. Presente no tecido de granulação, o miofibroblasto é uma célula que confere

capacidade contrátil, reduzindo a área da lesão e facilitando a epitelização. Próximo ao 15º

dia, com o fim da atividade mitótica dos fibroblastos, eles passam a secretar as proteínas

presentes no tecido de granulação, produzindo os componentes da substância fundamental

(formada por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos) e colágeno (BLANES, 2004). Os

fibroblastos são células consideradas adaptativas, realizando função reguladora do equilíbrio

7

de colágeno, devido à sua dupla função de síntese e reabsorção do mesmo (HAX, 2009;

SIMÕES et al., 1985). Outro fenômeno importante desta fase, a formação do epitélio faz-se

pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme

por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente. Nos casos de feridas com perda

total da derme, a epitelização ocorre apenas das margens da mesma, pois não há anexos

cutâneos remanescentes (BLANES, 2004; HAX, 2009).

Na fase de maturação, observam-se dois eventos importantes: deposição, agrupamento

e remodelação do colágeno, e regressão endotelial. Ocorre o direcionamento das fibras de

colágeno, através das colagenases e outras proteases produzidas por macrófagos e células

epidérmicas (BLANES, 2004; SCHULTZ et al., 2003). A remodelação do colágeno tem

início na formação do tecido de granulação e permanece por meses após a reepitelização. Há a

diminuição de todos os elementos celulares e dos elementos do tecido conjuntivo, além da

redução progressiva de vasos neoformados (BLANES, 2004). A cicatriz se torna menos

espessa, mais plana, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (BLANES, 2004;

HAX, 2009; SCHULTZ et al., 2003).

2.1.1.2. Tratamento de feridas

O tratamento de feridas é uma prática observada desde os primórdios da humanidade,

sendo adaptado durante os séculos para apresentar melhores resultados. Foram descritas na

Alexandria, por volta de 3.000 a.C., feridas infectadas como aquelas com bordas

avermelhadas e que apresentavam calor. Para o tratamento, recomendava-se aplicação de

folhas de salgueiro, pão mofado ou levedo de cerveja. Os egípcios introduziram o uso de

minerais, como cobre e mercúrio, além do mel para o tratamento de feridas (GOMES e

CARVALHO, 2002).

Hipócrates (460 - 377 a.C.) sugeriu que as feridas deveriam ser tratadas com unguento

para promover supuração, remoção de tecido necrótico e redução de inflamação, buscando

eliminar o humor que estava em excesso no organismo. No início da era cristã, Cornelius

Celsus (53 a.C. - 7 d.C.) foi o primeiro a descrever os quatro sinais da inflamação e

diferenciou as condutas de tratamento de feridas, classificando soluções para uso tópico em:

adstringentes, cáusticos, erosivos e hemostáticos. Claudius Galeno (129 - 200 d.C.), líder da

escola médica de Alexandria, realizava a supuração de feridas com aplicação de unguentos e

8

utilizava substâncias promotoras da cicatrização (GOMES e CARVALHO, 2002; MACIEL,

2008).

No século XIV, o uso de armas de fogo nas guerras europeias gerou um novo tipo de

ferida, mais difícil de curar. Ambroise Paré, cirurgião francês (1510-1590), reformulou o

tratamento desse tipo de feridas. Ele substituiu o óleo fervente, que até então vinha sendo

utilizado, por pomada à base de terebentina, óleo de rosa e gema de ovo (BLANES, 2004;

GOMES e CARVALHO, 2002).

Entre o final do século XIX e o início do século XX, o tratamento de feridas baseava-

se em agentes tópicos com ação antimicrobiana e proteção com coberturas secas. O uso do

álcool e de antissépticos metálicos tornou-se mais comum. Entre os anos de 1920 e 1940,

foram introduzidas ao tratamento pomadas contendo enzimas, com o objetivo de realizar o

desbridamento químico das feridas. A partir de 1950, surgiram os primeiros estudos sobre a

eficácia da cicatrização de feridas em ambiente úmido. A partir de então, surgiu um novo

interesse no desenvolvimento de coberturas interativas, que promoviam um melhor ambiente

para a cicatrização (GOMES e CARVALHO, 2002; MACIEL, 2008).

Atualmente, apesar dos avanços tecnológicos e da maior disponibilidade de recursos,

ainda existem controvérsias a respeito da melhor terapia tópica para o tratamento de feridas. É

vivenciada pelos profissionais a dificuldade em decidir qual o melhor tratamento e qual o

produto mais eficaz, e associar os estudos desenvolvidos sobre o tratamento de feridas à

prática clínica (PEREIRA, 2006). O processo que tem sido adotado para auxiliar na escolha

do tratamento de feridas é a prática baseada em evidências, onde se valoriza a decisão com

base em evidências clínicas, originada de pesquisas sistemáticas. Nessa situação, pesquisa e

prática clínica estão associadas em um processo sistemático e contínuo de auto-aprendizado e

auto-avaliação. Tratamentos que não são baseados em evidências científicas não atingem

resultados desejados, submetendo o paciente a intervenções ineficazes (MACIEL, 2008;

PEREIRA, 2006).

Diversos fatores locais e sistêmicos estão envolvidos na cicatrização de feridas, como

doenças crônicas e infecciosas; questões socioeconômicas e psicológicas; traumas e cirurgias;

a necessidade de continuidade da utilização do curativo; avaliação do custo-benefício. A

escolha do tratamento deve ser adequada à natureza, à localização e ao tamanho da ferida.

Portanto, é essencial que o acompanhamento do paciente seja feito por uma equipe

9

multidisciplinar, para o controle dos fatores que interferem no processo cicatricial (FRANCO

e GONÇALVES, 2008; MACIEL, 2008).

Um fator importante é o nutricional, já que a cicatrização é um processo complexo,

que envolve fenômenos químicos, produção de colágeno e gasto de energia, proteínas,

vitaminas e minerais. Fatores psicológicos e sociais também podem influenciar no processo

de cicatrização, sendo importante reduzir situações estressantes e melhorar a qualidade de

vida do paciente (MACIEL, 2008).

A terapia tópica de feridas é baseada em estudos científicos sobre a fisiologia de

reparação tecidual. É preciso favorecer as condições locais através da terapia tópica para

viabilizar o processo fisiológico. Pode-se definir terapia tópica como o conjunto de condutas

que visam à cura precoce das feridas, compreendendo limpeza, desbridamento e cobertura

(BLANES, 2004; GOMES e CARVALHO, 2002).

A limpeza da ferida deve ser realizada com uso de técnica e fluido que minimize

trauma mecânico e químico. Entre os princípios da terapia tópica, um dos primeiros e mais

importantes componentes a serem considerados é a remoção não somente da necrose como

também de corpos estranhos do leito da ferida. O uso de antissépticos em feridas tem efeito

nocivo, pois, além da citotoxidade, contribuindo para o retardo da cicatrização, não é o

mecanismo mais eficiente para reduzir a contagem bacteriana nas lesões. Em feridas crônicas,

como úlceras de membros inferiores e por pressão, há colonização bacteriana, mas essa não

retarda o processo de cicatrização. Entretanto, a presença de tecido necrótico favorece a

infecção (BLANES, 2004; YAMADA, 1999).

O desbridamento consiste na remoção de tecidos necrosados aderidos ou de corpos

estranhos do leito da ferida, usando técnicas mecânicas e/ou químicas. Existem diversos

métodos de desbridamento, cujas indicações, contraindicações, vantagens e desvantagens

devem ser conhecidas para a escolha mais adequada às necessidades do paciente. Dentre os

métodos de desbridamento estão os desbridamento autolítico, desbridamento enzimático ou

químico, desbridamento mecânico e desbridamento cirúrgico/instrumental (BLANES, 2004;

YAMADA, 1999).

O procedimento de oclusão das feridas com coberturas visam manter as células viáveis

e permitir que elas liberem fatores de crescimento, estimulando sua proliferação. Algumas

características para a escolha da cobertura mais apropriada são: manter umidade na interface

10

ferida/cobertura, remover o excesso de exsudato, permitir a troca gasosa, promover

isolamento térmico, proporcionar proteção contra infecção, ser isento de partículas e

contaminantes e permitir a remoção sem causar traumas. Além dessas, devem apresentar

disponibilidade, flexibilidade, facilidade de manuseio e custo-eficácia. Os efeitos benéficos do

meio úmido incluem a prevenção de desidratação do tecido e morte celular; a angiogênese

acelerada; o desbridamento autolítico, pois eles retêm as enzimas e água que ajudam na

fibrinólise; e a redução da dor, atribuída à proteção das terminações nervosas que o meio

úmido fornece contra o ressecamento e a exposição. As coberturas podem ser classificadas

como primária, que são aquelas que permanecem em contato direto com a lesão, e secundária,

sendo aquelas que ficam sobre a cobertura primária, podendo ser gazes, chumaços, entre

outros. Para a escolha da cobertura mais apropriada é imprescindível conhecer as principais

categorias de produtos disponíveis, adequados à realidade de trabalho, assim como sua forma

de ação, indicações, contraindicações, vantagens e desvantagens (BLANES, 2004; DEALEY,

1996; PEREIRA, 2006).

O mercado mundial disponibiliza mais de 2.000 produtos para o tratamento de feridas,

tornando a escolha da cobertura correta uma tarefa difícil e desafiadora. Alguns exemplos de

coberturas utilizadas ultimamente são: filme de poliuretano, hidrocolóide, hidrogel, papaína,

carvão ativado e alginatos (BLANES, 2004; PEREIRA, 2006).

2.2 Papaína

A papaína é uma enzima de origem vegetal, encontrada nas folhas e nos frutos da

Carica papaya Linne. Ela é isolada a partir do látex do fruto verde dessa espécie

(CAPUCHO, 2007). A enzima é amplamente utilizada na indústria alimentícia, em

estabilização de cerveja e amaciamento de carnes (CHAMBERS et al., 1998; ESPÍN e

ISLAM, 1998; PAQUES e MACEDO, 2006). Na indústria farmacêutica, pode ser encontrada

em medicamentos para uso interno, para tratamento de problemas digestivos, e para uso

externo, destinados ao tratamento de lesões cutâneas (CHAMBERS et al., 1998; ESPÍN e

ISLAM, 1998; FERREIRA et al., 2005; PAQUES e MACEDO, 2006). Na produção de

cosméticos, é utilizada em preparações para clareamento da pele, esfoliantes e agentes

depilatórios. Também é empregada na remoção de proteínas das superfícies de lentes de

contato (TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). A papaína também tem

11

aplicações na indústria têxtil, na produção de seda, em curtumes, no tratamento de efluentes

industriais e domésticos, na indústria de borracha, entre outras (ESPÍN e ISLAM, 1998;

FERREIRA et al., 2005; PAQUES e MACEDO, 2006).

O látex da Carica papaya L. é um fluído de aparência leitosa, com comportamento

tixotrópico. Ele possui aproximadamente 15% de matéria seca, das quais 40% correspondem

a enzimas, principalmente cisteínas endopeptidases, que constituem mais de 80% da fração

total de enzimas (AZARKAN et al, 2003; CAPUCHO, 2007). A papaína consiste em uma

mistura de enzimas proteolíticas, papaína e quimopapaína, essencialmente. Essas enzimas são

capazes de hidrolisar polipeptídeos, amidas e ésteres, principalmente nas ligações envolvendo

aminoácidos básicos, leucina ou glicina, produzindo peptídeos de baixo peso molecular

(PINTO, 2005).

Além da papaína, são encontradas outras endopeptidases no látex da Carica papaya

L., como as quimopapaínas A e B, a endopeptidase papaia III, a endopeptidase papaia IV e,

acredita-se que, uma outra denominada endopeptidase Ω. Essas endopeptidases são um risco

para a própria planta; porém, elas estão presentes no látex como pró-formas inativas, que são

ativadas após a liberação do látex pela planta (CAPUCHO, 2007).

Dentre essas endopeptidases, a papaína é a que se encontra em menor quantidade

(aproximadamente 8%); contudo, é a mais facilmente purificada (CAPUCHO, 2007). Foi

isolada em forma cristalina a partir do látex fresco pela primeira vez em 1937, sendo o

processo aprimorado por Balls e Lineweaver (1939).

12

2.2.1 Características físicas da papaína

Algumas características físicas da papaína estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Propriedades físicas da papaína.

Propriedades físicas Características

Apresentação Pó amorfo de cor branca leitosa, com odor

forte e característico, similar ao enxofre.

Solubilidade Parcialmente solúvel em água e glicerol.

Insolúvel em álcool, éter e clorofórmio.

Massa molecular 23.406 Da

Ponto isoelétrico pH 8,75

λmax 278 nm

Temperatura ótima para atividade enzimática 65ºC

Faixa de pH ótimo para atividade enzimática 5,0 - 7,0

Faixa de pH da solução aquosa 2% 4,8 - 6,2

Fontes: FERREIRA et al., 2008; GLAZER e SMITH, 1961; KILARA, SHAHANI e WAGNER, 1977; MERCK

INDEX, 1996; MITCHEL, CHAIKEN e SMITH, 1970; SANCHEZ NETO et al., 1993; TRAVERSA,

MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007.

2.2.2 Estrutura molecular da papaína

A papaína é classificada como uma cisteína protease da família C1, pertencente à

classe das enzimas proteolíticas (DARDENNE et al., 2003). Sua estrutura está representada

na Figura 1. Ela consiste em uma única cadeia polipeptídica com 212 resíduos de aminoácidos

(TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). Possui um grupo nucleofílico

tiol essencial, do resíduo Cys-25, e um imidazol do resíduo His-159. A cadeia lateral do

resíduo Asn-175 é um importante sítio de ligação das cisteínas proteases. Esses três resíduos,

Cys-25, His-159 e Asn-175, formam a tríade catalítica da papaína (SANKALIA et al., 2006).

A papaína hidrolisa ligações peptídicas de aminoácidos hidrofóbicos na posição P2 e,

preferencialmente, aminoácidos básico na posição P1 (PINTO et al., 2007).

13

Figura 1. Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal

estão representados em verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007).

O grupo tiol do aminoácido cisteína (Cys-25) é fundamental para sua atividade

enzimática (FERREIRA et al., 2005; HOMAEI et al., 2010; SILVA, 2003). Esse radical deve

permanecer na sua forma reduzida, porém é facilmente oxidado a dissulfetos em soluções

aquosas ou em contato com substâncias compostas por iodo, oxigênio e ferro (FERREIRA et

al., 2005). Uma vez oxidado esse radical, a enzima perde sua atividade proteolítica. Para

manter o radical no estado reduzido, pode-se adicionar outro tiol como cisteína, glutationa,

mercaptoetanol, 2,3-dimercaptopropanol ou tioglicolato (SANKALIA et al., 2006; SMITH,

KIMMEL e BROWN, 1953). A papaína pode ser parcialmente ou completamente inativada

quando armazenada a temperatura ambiente por um mês (PINTO at al., 2007). Devido a essas

características, recomenda-se que o armazenamento da papaína obedeça a condições

específicas como abrigo de luz, umidade e calor (FERREIRA et al., 2005; SANCHEZ NETO

et al., 1993).

2.2.3 A papaína no tratamento de feridas

A utilização da papaína no tratamento de feridas tem sido amplamente estudada

quanto à sua ação e ao estabelecimento de protocolos para o tratamento de diversos tipos de

lesões. Ela se destaca como uma ótima alternativa para esses tipos de tratamento devido ao

seu baixo custo e ausência de efeitos colaterais (FERREIRA et al., 2005; HAX, 2009; SILVA,

2003).

14

A papaína promove desbridamento químico, ativa o processo de regeneração tecidual

e encurta o período de cicatrização, além de possuir ação bactericida, bacteriostática e anti-

inflamatória (FERREIRA et al., 2005; FERREIRA et al., 2008). Foi uma das primeiras

substâncias utilizadas no desbridamento (PIEPER e CALIRI, 2003). Ela também é capaz de

hidrolisar as ligações peptídicas do colágeno e da queratina na camada córnea da pele

(LOPES et al., 2008; TRAVERSA, MACHADO-SANTELLI e VELASCO, 2007). Além de

facilitar a cicatrização, ela promove o alinhamento das fibras de colágeno, resultando em um

crescimento mais uniforme do tecido e, consequentemente, em uma cicatriz mais plana, mais

próxima à estrutura original da pele (CAPUCHO, 2007; MONETTA, 1990; SANCHEZ

NETO et al., 1993).

O uso da papaína é consagrado na literatura internacional desde a década de 50

(FERREIRA et al., 2005). No Brasil, a primeira publicação científica dos resultados da

utilização da papaína no tratamento de feridas foi feita por Monetta (1987), usando

inicialmente o fruto in natura e, posteriormente, a solução da papaína em pó.

Monetta (1987) realizou um estudo com 15 pacientes com lesões abertas, num total de

23 lesões. Foi preparada a solução de papaína através da diluição de uma colher de café rasa

da enzima em 50 mL de água destilada. A aplicação foi feita após limpeza mecânica por

cobertura da lesão com gaze embebida na solução de papaína e, em áreas de tecidos

necrosados, foi feita cobertura com fina camada de papaína em pó. No estudo, foi utilizada

também a polpa do mamão verde. A limpeza foi feita com soro fisiológico, seguida de

aplicação da polpa na lesão e cobertura secundária de gaze seca. Somente no primeiro

paciente foi utilizado o mamão. No 5º dia, observou-se aumento de secreção sero-purulenta,

amolecimento do tecido necrosado, afrouxamento dos bordos com pequeno aumento do

tamanho da lesão e diminuição do alo de hiperemia ao redor da lesão. Dos 15 pacientes

acompanhados, 3 foram submetidos a enxerto de pele na fase de aparecimento do tecido de

granulação; 2 tiveram óbito, 1 caso suspenso no 13º dia devido à queixa de dor e 5 pacientes

receberam alta hospitalar com lesões já em fase de cicatrização. Cinco pacientes queixaram-se

de ardor moderado que diminuiu gradativamente, durando no máximo 20 minutos até cessar

totalmente. Não foram observadas reações alérgicas.

Em 1953, Guzman e Guzman realizaram uma experimentação in vitro das marcas de

papaína disponíveis no mercado, encontrando uma grande variação na atividade proteolítica.

Eles também aplicaram soluções de papaína em pacientes com úlceras, incluindo 12 pacientes

15

com queimaduras de segundo e terceiro graus majoritariamente infectadas. As soluções de

papaína (2-5%) foram aplicadas em curativos com gaze cirúrgica úmida ou a própria enzima

em pó foi colocada sobre a superfície úmida da ferida. Os curativos foram trocados a cada 24

horas, sendo a papaína reaplicada quando necessário. Dez dos 12 pacientes queimados

apresentaram bom desbridamento entre 24-48 horas.

Em 1995, foi publicado um estudo onde foi avaliada a ação da papaína em infecção de

vísceras e feridas abdominais abertas. Foram utilizadas soluções de papaína a 1, 2 e 4%. A

troca dos curativos era feita três vezes ao dia. Em todos os casos, após 72 horas, observou-se

diminuição acentuada da secreção e início de formação de tecido de granulação. A

cicatrização de todas as feridas ocorreu em tempo médio de 30 dias (FERREIRA et al., 2005;

PEREIRA e BACHION, 2005).

Foi relatado por Starley e colaboradores (1999) o uso tópico de uma pasta preparada

com polpa de mamão em queimaduras infectadas em pacientes pediátricos. O tratamento das

feridas durante algumas semanas tornam-nas suficientemente limpas para um enxerto. O

estudo mostrou a possibilidade do uso de enzimas na remoção de escaras, sem a necessidade

de intervenções cirúrgicas, diminuindo o tempo de internação do paciente. Um fator limitante

para o desbridamento enzimático é a sepse, sendo que o mamão contém carpaina e agliconas,

que possuem um amplo espectro de atividade antimicrobiana.

Um estudo descritivo e retrospectivo foi feito por Monetta (1998), onde a solução de

papaína foi utilizada para tratamento de úlceras diabéticas, venosas e de pressão, em

concentrações de 2% para lesões com tecidos viáveis e 10% em tecidos inviáveis. A média de

idade dos pacientes foi de 62 anos, com predominância de mulheres (58,5%). Observou-se

redução gradativa do tecido de necrose após o 14º dia até o 28º dia e, a partir do 7º dia, a

granulação e epitelização aumentaram nos três grupos de pacientes.

A ação proteolítica da papaína é observada somente em tecidos inviáveis, não

agredindo os tecidos sadios ao redor da lesão. Este fato deve-se à enzima α1-antitripsina, uma

antiprotease plasmática presente somente nas células sadias, que impede a ação proteolítica da

papaína (BLANES, 2004; FERREIRA et al., 2005).

O uso da papaína é indicado para todas as fases do processo de cicatrização, em

feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou sem necrose. Normalmente,

são utilizadas as concentrações de 2% (p/p), para feridas com tecido de granulação; 4% a 6%

16

(p/p), em feridas com exsudato purulento; e 8 a 10% (p/p), para tecido necrótico (FERREIRA

et al., 2005; HAX, 2009; PIEPER e CALIRI, 2003).

2.2.4 Formulações e produtos com papaína utilizados no tratamento de feridas

No tratamento de feridas, a papaína é utilizada em diversas formas farmacêuticas,

como solução aquosa, pó, gel e creme (FERREIRA et al., 2005).

No estudo realizado por Ferreira e colaboradores (2005), no período de 1987 a 2000,

foi relatado exclusivamente o uso da papaína em solução, diluída em água destilada ou soro

fisiológico 0,9%, com recomendação unânime de aplicação imediatamente após o preparo. De

Paola e colaboradores (1999) avaliaram a estabilidade de solução de papaína 2% (p/v), diluída

em água destilada. A solução foi armazenada em geladeira a 5ºC e em temperatura ambiente

(22ºC), mostrando uma perda de 50% da atividade quando em temperatura ambiente no

período de 8 a 10 horas de armazenamento. Quando armazenada em geladeira, após 52 horas,

a atividade enzimática permaneceu em torno de 60% da inicial.

Um fator importante no uso da papaína em pó e em solução é a segurança na

manipulação e aplicação, tanto do profissional quanto do paciente. Além da sua alta atividade

proteolítica, se inalada, pode causar doenças respiratórias como asma, pneumonia e enfisema.

É necessário ressaltar a necessidade da utilização de equipamentos de proteção individual,

como máscaras com filtros contra pós e óculos, além de ventilação adequada (FERREIRA et

al., 2005).

Foi desenvolvido e padronizado por Velasco (1993) um gel de papaína 0,4% (p/v) para

uso diário em pacientes com ferimentos, abscessos e úlceras, inclusive as úlceras por pressão.

Foram avaliadas quatro formulações de gel de papaína 0,4%, com temperaturas de

armazenamento de 5, 22 e 37ºC, durante cerca de dois meses. Em temperatura de 5ºC,

observou-se perda de 30% da atividade proteolítica; houve perda de 50% para a temperatura

de 22ºC; enquanto que, para a temperatura de 37ºC, ocorreu variação de 30 a 60% de redução

da atividade no período estudado.

A utilização da forma em gel se mostra vantajosa, já que mantém o ambiente da ferida

úmido, condição primordial para o processo de cicatrização. O gel também se distribui

facilmente, não excedendo os limites da lesão, além de apresentar fácil remoção pela lavagem

da ferida com água destilado ou soro fisiológico, sem deixar resíduos. A formulação da

17

papaína em gel apresenta a concentração como fator limitante, pois ela pode interferir na

viscosidade do veículo. Entretanto, não foi encontrada na literatura a concentração máxima de

papaína em gel que assegure a manutenção das características da formulação (FERREIRA et

al., 2005).

Em 2003, Traversa avaliou a estabilidade de formulações de papaína 0,8% (p/p) em

gel de Carbopol® 940 e em creme à base da cera emulsificante não-iônica Polawax

®. As

temperaturas de armazenamento utilizadas foram 4, 25 e 40ºC. Foram avaliados os seguintes

parâmetros: características sensoriais (cor, odor e uniformidade), valores de pH e viscosidade.

As maiores variações foram observadas nas formulações armazenadas a 40ºC, com alteração

de odor para as duas formulações na primeira semana, e de cor para a formulação a base de

Polawax® no 32º dia. Para a emulsão de Polawax

®, ocorreram também alterações de

viscosidade em todas as temperaturas, com variação de 48% em 40ºC.

Capucho (2007) estudou a estabilidade e a eficácia in vitro de formulações de papaína

1% em géis de Carbopol® 940, Natrosol

® 250 HHR e Pluronic

® F127. Os géis mostraram-se

estáveis quando armazenados a 4ºC por 6 meses. Entretanto, o acondicionamento em

temperaturas de 30ºC/70% UR e 40ºC/70% UR resultou em uma rápida redução da atividade

proteolítica em função do tempo de armazenamento. A avaliação in vitro das formulações foi

feita em gel de poliacrilamida, adicionado de gelatina como substrato, durante 6 horas a 37ºC.

O gel de papaína em Carbopol® 940 apresentou resultado mais eficaz para esta análise,

mesmo quando comparado com a solução extemporânea de papaína 1% em água. Foi

concluído, então, que este foi o polímero mais adequado para veicular a papaína.

Novas formas farmacêuticas têm sido estudadas para a aplicação da papaína, com

aumento de sua estabilidade. Ruas e colaboradores (2006) desenvolveram uma matriz

polimérica para obtenção de um adesivo de uso tópico com ação cicatrizante. Foram

analisadas duas dispersões de silicone: monocomponente (MED 6605) e bicomponente (MED

6640), sendo que a segunda alterou a atividade da enzima. A formulação de papaína 0,69%

(p/p) em dispersão em silicone monocomponente apresentou um melhor perfil de liberação.

Posteriormente, Zulli (2007) realizou a incorporação da papaína em diversas matrizes

poliméricas com o objetivo de obter um sistema de liberação controlada da enzima. Foram

utilizados os polímeros: látex de borracha natural bicentrifugado (LBNB), adesivo acrílico

(AA), dispersão de silicone monocomponente (SM) e dispersão de silicone bicomponente

(SB). As membranas de LBNB e de AA foram descartadas por apresentarem citotoxicidade.

18

Então, as membranas de silicone incorporadas com a papaína a 2%, foram submetidas ao

ensaio de liberação com células de difusão de Franz. Nos resultados, foi encontrada liberação

constante da papaína nas 12 horas iniciais do experimento.

No Brasil, as preparações de uso tópico com papaína são exclusivamente provenientes

da farmácia magistral. Somente recentemente foram inclusas no Formulário Nacional da

Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2011) as fórmulas de géis de papaína 2% a 10%, com

recomendação de armazenamento sob refrigeração. Por não apresentar forma industrializada,

não se encontram registros de estudos de estabilidade dessas formulações. Foi recomendado

por Sankalia e colaboradores (2006) que formulações farmacêuticas contendo papaína e

outras enzimas digestivas sejam armazenadas a 2 - 8ºC ou 8 - 25ºC, desde que, sob a condição

escolhida, mantenha-se um tempo de prateleira de um ano. Esses fatores são preocupantes,

pois se torna impossível assegurar a eficácia e a segurança do medicamento durante o tempo

de tratamento.

2.2.5 Estabilização da papaína

As enzimas têm sido muito utilizadas em cosméticos e medicamentos nos últimos

anos, além de serem estudadas como uma nova opção terapêutica com menos efeitos tóxicos.

Apesar desse potencial das enzimas, sua fragilidade apresenta-se como um problema. A

maioria das enzimas não é estável e, em temperatura ambiente, perdem sua atividade

biológica em aproximadamente um mês. Essa característica afeta a aplicação das mesmas em

produtos farmacêuticos (SIM et al., 2000; VARCA et al., 2007).

As aplicações da papaína são restritas devido à sua limitada estabilidade. Sim e

colaboradores (2000) avaliaram a conjugação da papaína com um biopolímero solúvel

produzido pelo fungo Schizophyllum commune, a SC-glucana, para aplicações cosméticas.

Foram realizadas também conjugações com a dextrana (DX) e o polietilenoglicol (PEG). Foi

observada uma melhora significativa na estabilidade da enzima conjugada com a SC-glucana,

sendo que 95% da atividade inicial manteve-se após um mês de armazenamento a 45ºC,

enquanto a conjugação com PEG e DX apresentaram atividade de 27% e 45%,

respectivamente. O complexo papaína/SC-glucana foi incorporado em uma loção base

cosmética na concentração de 1%, apresentando taxa de recuperação da atividade maior que

19

70%. A atividade enzimática na loção foi mantida por três meses de armazenamento a 45ºC;

pelo contrário, a papaína nativa em loção foi inativada rapidamente.

Pinto (2005) estudou o efeito da incorporação de polietilenoglicol à papaína. A

modificação da enzima foi realizada com polietilenoglicol modificado com peso molecular

médio de 5000, utilizando concentração de papaína a 5% (p/v). Foram avaliadas emulsões

acrescidas de papaína livre ou modificada, nas concentrações de 0,8% (p/p) e 22,06% (p/v),

respectivamente. As formulações foram armazenadas em temperatura de 5, 22 e 40ºC durante

90 dias. Foi observada uma mudança no perfil de liberação e na atividade da papaína

modificada, em relação à livre. A temperatura mais adequada para armazenamento das

formulações com papaína não modificada foi de 5ºC, enquanto para as com papaína

modificada foi de 22ºC. Os resultados confirmaram um aumento na estabilidade da papaína

modificada e o potencial para aplicação em formulações de uso tópico.

Outro estudo, realizado por Varca e colaboradores (2007), propôs a formação de

complexos de papaína com ciclodextrinas. As ciclodextrinas são amplamente utilizadas em

formulações farmacêuticas devido à sua habilidade de formar complexos com outras

moléculas, aumentando a estabilidade e a biodisponibilidade dos fármacos. A análise térmica

dos complexos de papaína/hidroxipropil-β-ciclodextrina e papaína/β-ciclodextrina mostrou

mudanças nos eventos endotérmicos e nos perfis citotóxicos, sendo que o último apresentou

maior eficiência na mudança das características da enzima.

A adição de compostos polihidroxilados em soluções enzimáticas mostrou aumento na

estabilidade das enzimas, provavelmente, pela interação dessas substâncias com a água do

sistema. Assim, diminuem-se as interações da proteína com a água, já que as substâncias

polihidroxiladas são preferencialmente hidratadas, e aumentam-se as interações hidrofóbicas

da estrutura protéica. O resultado é uma maior resistência à desnaturação térmica da estrutura

da proteína e da estabilidade da enzima (KILINÇ, ONAL e TELEFONCU, 2001).

Satish, Kumar e Prakash (2007) realizaram um estudo do efeito de vários co-solventes,

como sorbitol, sacarose, xilose e glicerol, na papaína. Foram utilizadas medidas de atividade,

espectroscopia de fluorescência e calorimetria exploratória diferencial (DSC). Nos estudos de

desnaturação térmica da papaína com diversas concentrações dos co-solventes, observou-se

mudança na temperatura de desnaturação térmica aparente (app Tm), sugerindo aumento da

estabilidade térmica da papaína na presença desses co-solventes. A estabilização máxima foi

20

observada com o sorbitol na concentração de 30%, quando a temperatura de transição térmica

aumentou em relação ao controle. Os resultados sugeriram um considerável aumento da

estabilidade da papaína na presença de todos os co-solventes estudados, como resultado da

hidratação preferencial.

Uma formulação em spray foi desenvolvida por Jáuregui e colaboradores. (2009) para

cicatrização de feridas, contendo papaína 0,1% (p/v) imobilizada em gel de pectina 6% (p/v).

Ela apresentou maior estabilidade quando comparada a solução aquosa de papaína 0,1% em

temperaturas de 4 e 75ºC. A meia-vida da formulação papaína-pectina, a 4ºC, é de 15 dias,

comparada a 1,36 dias da solução. Quando sob pressão de 50 psi de ar ou gás nitrogênio, a

meia-vida do produto é estendida para 30 dias.

Foram desenvolvidas por Vasconcellos, Goulart e Beppu (2011) micropartículas de

quitosana contendo papaína para aplicação em formulações de liberação controlada. As

micropartículas de quitosana são amplamente utilizadas para liberação de fármacos, podendo

ser adaptadas para tratamentos específicos em alvos diferentes. Entretanto, a papaína pode

despolimerizar a quitosana, por isso a quitosana precisa estar em uma forma reticulada. As

micropartículas de quitosana foram reticuladas com glutaradeído (GLU) ou tripolifosfato

(TPP) e submetidas à sorção da papaína por 12 horas em solução de papaína 1% (p/v). Depois

de liofilizadas, as micropartículas foram submetidas aos testes de estabilidade e de liberação

in vitro. Elas foram estáveis por 7 dias, mantendo a atividade enzimática constante durante o

período do estudo, em temperatura de 37ºC. A taxa de liberação das micropartículas de

quitosana–GLU e quitosana–TPP em tampão fosfato (pH 7,4) mostrou-se similar, com perfil

ligeiramente crescente, indicando liberação constante da papaína durante as primeiras 25

horas. Os autores destacam as micropartículas de quitosana–GLU e quitosana–TPP como

fortes candidatas à aplicação em formas de liberação controlada da papaína, com preferência

para o uso do tripolifosfato, devido à sua menor toxicidade em relação ao glutaraldeído.

A papaína costuma ser utilizada como princípio ativo único. Porém, nos Estados

Unidos, encontram-se produtos de papaína associada à uréia e à clorofila. Esse produto é

comercializado com o nome de Panafil®. Além dele, há também a Accuzyme

®, produto com

papaína e uréia, e o produto italiano NouriFusion®, associação da papaína com as vitaminas

A, C e E. A função da uréia nesse tipo de formulação é facilitar a ação proteolítica da papaína,

alterando as estruturas tridimensionais das proteínas por romper suas ligações hidrogênio, e

expondo os sítios ativos da papaína por ação solvente. Ela também age na redução das pontes

21

dissulfeto das proteínas e expõe os resíduos de cisteína, que são os mais susceptíveis à ação da

papaína. Essa associação apresenta ação duas vezes mais efetiva na digestão de proteínas,

comparada à papaína isolada (CAPUCHO, 2007; FALANGA, 2002).

2.3 Géis

Os géis são formas farmacêuticas semi-sólidas, constituídas da suspensão de pequenas

partículas inorgânicas ou de grandes moléculas orgânicas interpenetradas por um líquido. São

destinados geralmente para uso externo, com indicação para administração de ativos em peles

mistas, oleosas e acnéicas, podendo também ter aplicação intranasal, intravaginal, retal, oral e

parenteral (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; CORRÊA et al., 2005; FERREIRA,

2008).

Os géis são considerados dispersões coloidais, pois contém partículas em dimensão

coloidal. Usualmente, diz-se que uma substância é coloidal quando suas partículas têm entre

1nm e 0,5µm (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000).

De modo geral, os géis têm ação epidérmica, pois apresentam baixo poder de

penetração na pele. Assim, são mais adequados para tratamentos superficiais dos tecidos.

Entretanto, já são descritos na literatura inúmeros exemplos de formulações em gel

empregadas como veículos para permeação cutânea, os chamados géis transdérmicos

(FERREIRA, 2008). Alguns exemplos de agentes utilizados para aumentar a permeação

cutânea são: tensoativos, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida, dimetilformamida,

álcool, acetona, propilenoglicol e polietilenoglicol (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR.,

2000).

Géis podem ser classificados pelos seguintes critérios: natureza da fase coloidal;

número de fases; e natureza da fase líquida. As classificações são apresentadas nas Tabela 2 a

Tabela 4.

22

Tabela 2. Classificação dos géis segundo a natureza da fase coloidal.

Tipo de gel Descrição Exemplos

Inorgânico Geralmente bifásico Gel de hidróxido de alumínio

Gel de bentonita

Orgânico Geralmente

monofásico

Gel de goma adraganta

Gel de carbômeros (Carbopol®)

FONTE: FERREIRA, 2008.

Tabela 3. Classificação dos géis segundo o número de fases.


Monofásico Uma fase Gel de alginato de sódio

Gel de carbômeros (Carbopol®)

Bifásico Duas fases Gel de hidróxido de alumínio

Gel de bentonita


Tabela 4. Classificação dos géis segundo a natureza da fase líquida.


Hidrogel Substâncias hidrofílicas Gel de carbômeros (Carbopol)

Gel de metilcelulose

Oleogel Substâncias lipofílicas Gel de parafina líquida

Gel de polietilenoglicol


Os géis hidrofílicos (hidrogéis) são mais utilizados, sendo relativamente pequena a

quantidade de preparações em oleogel (PRISTA et al., 2006). Os hidrogéis têm sido muito

usados em produtos cosméticos e como base dermatológica, pois apresentam fácil

espalhamento, não são gordurosos e podem veicular princípios ativos hidrossolúveis e

lipossomas (CORRÊA et al., 2005).

23

O gel é composto por agente gelificante, veículo e conservantes, podendo também

haver a presença de outros adjuvantes técnicos, como os umectantes. Os agentes gelificantes

são utilizados nas preparações farmacêuticas e cosméticas por conferirem aumento de

viscosidade. Essa elevação de viscosidade deve-se ao seu elevado grau de solvatação e

hidratação e à capacidade de reter moléculas dos líquidos nas suas cadeias macromoleculares

(FERREIRA, 2008).

Geralmente, são utilizados polímeros como substância formadora do gel, ou agente

gelificante. Dependendo das características do polímero, os géis podem apresentar natureza

iônica ou não-iônica. Os géis aniônicos são pH dependentes, apresentando-se mais estáveis

em pH neutro ou próximo do neutro. Já os géis de caráter não-iônico possuem estabilidade em

ampla faixa de pH, tornando possível a veiculação de substâncias ácidas (CORRÊA et al.,

2005).

Os agentes gelificantes podem ser divididos em três classes: derivados da celulose

(carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose);

polímeros não-celulósicos naturais ou semi-sintéticos (goma xantana, goma adraganta,

alginatos, pectina, ágar, ácido algínico); e polímeros derivados do ácido acrílico (Carbopol®

;

Aristoflex® AVC; Pemulen

®) (AULTON, 2005; FERREIRA, 2008; LOPES, LOBO e

COSTA, 2005; QUEIROZ, 2008).

2.3.1 Carbômero (Carbopol®)

As resinas de carbômero (carbômer ou Carbopol®) são os agentes gelificantes mais

utilizados e apresentam ampla aplicação nas áreas farmacêutica e dermocosmética. Existem

diversos tipos de Carbopol®, que devem ser escolhidos corretamente de acordo com a

característica desejada. Os géis de Carbopol® apresentam vantagens como: alta viscosidade

em baixas concentrações; amplo intervalo de viscosidade e comportamento de fluxo

característico; compatibilidade com muitos princípios ativos; propriedades bioadesivas; boa

estabilidade térmica; características sensoriais excelentes; e boa aceitação pelo paciente

(FERREIRA, 2008; ISLAM et al., 2004).

Eles são constituídos de polímeros de ácido acrílico de alto peso molecular com

ligação cruzada. Os géis de Carbopol® são preparados a partir da dispersão do polímero em

água, onde ele pode aumentar em até mil vezes do volume original. Para desenvolver o

24

completo potencial de viscosidade destes polímeros deve-se adicionar uma base orgânica ou

inorgânica, como a trietanolamina de alta pureza ou o hidróxido de sódio, à dispersão aquosa

do polímero (BONACUCINA, MARTELLI e PALMIERI, 2004; CORRÊA et al., 2005;

FERREIRA, 2008; QUEIROZ, 2008).

Os carbômeros são utilizados usualmente nas concentrações de 0,5 a 2,0%, podendo

variar de acordo com o tipo do carbômero. São incompatíveis com resorcinol, fenol,

polímeros catiônicos, ácidos fortes e altas concentrações de eletrólitos. Alcança-se a máxima

viscosidade na faixa de pH entre 6,0 e 11,0 (FERREIRA, 2008).

2.4 Reologia

O termo reologia, de origem do grego rheo (fluxo) e logos (ciência), foi criado por

Bingham e Crawford, e passou a ser adotado a partir de 1929. Ela pode ser definida como o

estudo das propriedades de fluxo e deformação da matéria (AULTON, 2005; CORRÊA et al.,

2005).

Na reologia, os materiais podem ser classificados como Newtonianos ou não-

Newtonianos, de acordo com suas características de fluxo. O fluxo Newtoniano é

caracterizado pela viscosidade constante, independente da velocidade de cisalhamento

aplicada; enquanto no fluxo não-Newtoniano, a viscosidade é alterada com o aumento da

velocidade de cisalhamento (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000).

Materiais compostos por partículas assimétricas, como é o caso da maioria dos

produtos farmacêuticos e cosméticos, apresentam fluxo não-Newtoniano. Dentre eles,

incluem-se as soluções coloidais, as emulsões, as suspensões líquidas e as pomadas (ANSEL,

POPOVICH e ALLEN JR., 2000; CORRÊA et al., 2005).

Os materiais de fluxo não-Newtoniano podem ser classificados em três tipos gerais:

plásticos, pseudoplásticos e dilatantes.

Materiais plásticos são também chamados de corpos de Bingham, em homenagem a

quem realizou grande parte dos primeiros estudos com esses materiais. O fluxo plástico não

tem início até que um determinado valor de tensão de cisalhamento tenha sido ultrapassado; a

tensões menores, o material se comporta como um sólido, ou seja, apresenta comportamento

elástico. O fluxo plástico é característico de pomadas e suspensões concentradas,

25

particularmente se a fase contínua for de alta viscosidade ou se a fase dispersa estiver

floculada (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; AULTON, 2005; FERREIRA, 2008).

O fluxo do material pseudoplástico inicia-se tão logo a tensão de cisalhamento é

aplicada. Conforme se aumenta a tensão de cisalhamento, a velocidade de cisalhamento

também aumenta. Apresentam este tipo de fluxo os hidrocolóides naturais ou quimicamente

modificados, os polímeros sintéticos e emulsões. Acredita-se que moléculas longas, de

elevada massa molecular, se embaracem quando estão em solução, com imobilização do

solvente entre elas. Então, sob influência da tensão, essas moléculas tendem a desembaraçar-

se e alinhar-se longitudinalmente entre si, deslizando umas sobre as outras. Desse modo,

oferecem menor resistência ao fluxo e, aliado à liberação do solvente, contribui para a

diminuição da viscosidade (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; AULTON, 2005;

FERREIRA, 2008).

Uma característica dos fluidos pseudoplásticos é a chamada tixotropia. Este termo

significa “mudar pelo toque” e é utilizado para descrever qualquer material que exiba um

decréscimo reversível na sua viscosidade aparente dependente do tempo, em condição

isotérmica. Em geral, sistemas tixotrópicos são formados por partículas assimétricas ou

macromoléculas, que são capazes de interagir por várias ligações secundárias, resultando em

uma frouxa estrutura tridimensional. Com aplicação do cisalhamento, essas ligações são

rompidas e o material flui de modo mais alinhado, o que diminui a sua viscosidade. Com a

retirada do cisalhamento, ocorre a reestruturação do material, que se expressa em aumento de

viscosidade. Praticamente todas as pomadas, géis, emulsões e suspensões apresentam

propriedade tixotrópica com mais ou menos evidência. (AULTON, 2005; FERREIRA, 2008).

O comportamento tixotrópico favorece a estabilidade do produto, com aumento do

tempo de prateleira, pois apresentam viscosidade constante durante o armazenamento,

dificultando a separação dos componentes da formulação. Outra vantagem das formulações de

uso tópico com comportamento tixotrópico é a capacidade de deformação durante a aplicação,

facilitando o espalhamento, seguida da recuperação da viscosidade quando se encerra a

aplicação, evitando que o produto escorra. Entretanto, não são desejáveis valores elevados de

tixotropia, pois a recuperação da estrutura do produto é lenta e pode causar um escorrimento

pela pele, nem valores baixos de tixotropia, já que podem dificultar a espalhabilidade do

produto, resultando em uma distribuição não uniforme (CORRÊA et al., 2005, GASPAR e

MAIA CAMPOS, 2003).

26

O fluxo dilatante é oposto ao fluxo pseudoplástico, observando-se um aumento de

viscosidade com o aumento da velocidade de cisalhamento. Eles apresentam aumento de

volume e espessamento quando submetidos ao cisalhamento. O efeito é reversível e, com a

remoção da tensão de cisalhamento, ocorre o restabelecimento da natureza fluida. É um

comportamento menos comum que os fluxos plástico e pseudoplástico, mas pode ser exibidos

por sistemas com alta porcentagem (aproximadamente 50%) de partículas pequenas,

defloculadas (ANSEL, POPOVICH E ALLEN JR., 2000; AULTON, 2005).

2.4.1 Comportamento reológico de géis de Carbopol®

As características reológicas são propriedades importantes, que devem ser

consideradas nos processos de fabricação, estocagem e aplicação de um produto. É necessário

que se conheça as velocidades de deformação das operações às quais esse produto estará

sujeito, como, por exemplo, no processo de mistura de substâncias, no envase em recipientes

e retirada de determinada embalagem (CORRÊA et al., 2005; FERREIRA, 2008).

As formas farmacêuticas semi-sólidas, em sua maioria, são destinadas ao uso externo.

Elas apresentam propriedade de adesão à superfície de aplicação durante certo período de

tempo antes de serem removidas. Esse comportamento permite que os semi-sólidos

mantenham a forma e adiram como um filme, até que uma força externa os façam deformar e

fluir. É desejável que produtos para uso externo espalhem facilmente, sem muito esforço, mas

não devem ser tão fluidos que escorram pela superfície da pele. É comum que esse tipo de

formulação apresente comportamento pseudoplástico (AULTON, 2005; CORRÊA et al.,

2005; FERREIRA, 2008; SOUTO et al., 2004).

O comportamento reológico de géis de Carbopol vem sendo amplamente estudado, em

relação à mudança de pH, temperatura, concentração e densidade. Este tipo de análise é

importante por estar diretamente relacionada às propriedades físicas, às características de

adesão, ao tempo de permanência na área de aplicação e à difusão e liberação do princípio

ativo pela microestrutura do gel. Os parâmetros citados e suas alterações podem influenciar na

aceitação do produto pelo consumidor (CORRÊA et al., 2005; ISLAM et al., 2004; KIM et

al., 2003).

27

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Desenvolver formulações de gel de papaína em concentrações de 2 e 4% e realizar o

estudo de estabilidade dos produtos selecionados.

3.2 Objetivos específicos

Estabelecer uma metodologia analítica para a determinação da atividade proteolítica

da papaína a 2 e a 4% em gel.

Desenvolver formulação de gel de Carbopol® 940 compatível com a papaína nas

concentrações de 2 e 4%.

Estudar a aplicação de adjuvantes técnicos para a manutenção da atividade proteolítica

da papaína em gel.

Estudar a estabilidade dos géis de papaína a 2 e 4 % que apresentem as melhores

resultados para a atividade proteolítica.

28

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais

4.1.1 Matérias-primas e Reagentes

Ácido acético glacial – Reagen.

Água ultrapura Milli-Q®.

Carbopol® 940 – Viafarma.

Cloridrato de L-cisteína anidro – Viafarma.

Cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-

CBZ-PHE-ARG-7-MCA), grau de pureza analítico – Sigma-Aldrich.

Dimetilsulfóxido (DMSO) – Sigma-Aldrich.

Etilenodiaminotetracetato (EDTA) dissódico – Farmos.

Fosfato de sódio dibásico anidro – Farmos.

Hidróxido de sódio pastilhas – Vetec.

Metilparabeno – Farmos.

Papaína 30.000 UI/mg, substância química de referência – Merck.

Papaína 6.000 UI/mg – Viafarma.

Propilenoglicol – Viafarma.

4.1.2 Equipamentos

Balança analítica – Gehaka AG 200.

Batedeira planetária – Skymsen BPS-05.

Leitor de fluorescência em microplacas – FLUOstar OPTIMA.

pHmetro – Schott Handylab 1.

29

Reômetro de disco oscilatório – Haake Mars, tipo cone-placa, acoplado ao cone

C35/2º TI (35 mm e 2 graus de inclinação).

Viscosímetro – Visco Basic Plus, Fungilab S.A., acoplado à haste R7.

4.2 Métodos

4.2.1 Preparação do gel de Carbopol® 940 para incorporação da papaína

Foram preparadas oito formulações de gel de Carbopol® 940, com variação na

concentração do polímero, nos valores de 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 e 2,0 %. A fórmula

do gel base é apresentada na Tabela 5.

Tabela 5. Formulação do gel base de Carbopol® 940.

Componentes Concentração (% p/p)

Carbopol® 940 0,60 – 2,00

Metilparabeno 0,10

Solução de NaOH 10% (p/v) q.s. pH 6,00

Água destilada q.s.p. 100,00

Em bécher de plástico, colocou-se aproximadamente 70% da água destilada. Foi

adicionado o metilparabeno e agitou-se. O Carbopol foi disperso na mistura anterior e deixado

em repouso por 24 horas. Após este período, a mistura foi agitada com espátula e adicionou-

se solução de hidróxido de sódio 10% até atingir pH 6,0. Acrescentou-se o volume restante de

água destilada e agitou-se até completa homogeneização. Em determinadas etapas do estudo

foi necessária a produção de géis de Carbopol em maiores quantidades, requerendo a

utilização de batedeira planetária para sua preparação.

30

4.2.2 Preparação dos géis de papaína a 2 e 4% para seleção do gel base mais adequado

A cada formulação de gel de Carbopol®, foi adicionada a papaína nas concentrações

de 2 e 4%, conforme descrito na Tabela 6, com finalidade de seleção do gel mais apropriado.

A todas as formulações, foram também acrescentados os adjuvantes técnicos EDTA

dissódico, cloridrato de cisteína anidro e propilenoglicol nas concentrações máximas

utilizadas no estudo, 0,08; 0,32; e 10%, respectivamente, para papaína 2%; e 0,16; 0,64 e

10%, respectivamente, para papaína 4%, com objetivo de estabelecer um limite mínimo de

Carbopol® que mantenha adequada a viscosidade do produto.

Cada formulação foi submetida à avaliação de alteração de viscosidade, através de

comparação visual com o gel base e entre as próprias.

Tabela 6. Formulações de géis de papaína a 2 e a 4% preparadas para seleção do gel base

mais adequado.

Concentração de Carbopol

® 940 (% p/p)

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

Concentração

de papaína

(% p/p)

2 P2C0,6 P2C0,8 P2C1,0 P2C1,2 P2C1,4 P2C1,6 P2C1,8 P2C2,0

4 P4C0,6 P4C0,8 P4C1,0 P4C1,2 P4C1,4 P4C1,6 P4C1,8 P4C2,0

As formulações que apresentaram menor perda de viscosidade foram submetidas à

avaliação de quatro voluntários da equipe de Enfermagem do Ambulatório de Feridas do

Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) para seleção da mais adequada à aplicação

clínica. O ensaio foi aprovado pelo Comitê de Ética, estando inserido no projeto

"Implementação e Avaliação de Ações Visando a Otimização da Assistência Farmacêutica",

coordenado pela Profª. Drª. Selma Rodrigues de Castilho, da Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal Fluminense (UFF) e financiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de

Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

Os géis foram dispensados em bisnagas de polietileno brancas, contendo 100 g cada.

As formulações foram aplicadas na região dorsal das mãos e avaliadas quanto à consistência e

31

à espalhabilidade. A formulação mais adequada é aquela que apresenta fácil aplicação e

remoção, porém não pode ser tão fluida que ultrapasse os limites da ferida.

4.2.3 Determinação da atividade proteolítica da papaína

A metodologia selecionada para realizar a medida da atividade proteolítica da papaína

baseia-se na espectrofluorimetria por método de microplacas, descrita por Pinto (2005).

Para esta técnica utiliza-se um substrato sintético, o cloridrato de carbobenzoxi-L-

fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA), para

quantificação da atividade da papaína. O método permite a determinação mesmo quando a

papaína está incorporada em formulações. A hidrólise do substrato, catalisada pela papaína,

libera um produto fluorescente, a 4-metilcumarina-7-amido, que é detectável em baixas

concentrações.

O experimento foi realizado no aparelho FLUOstar OPTIMA, um leitor de

fluorescência em microplacas, na Central Analítica do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal

Fluminense. Foram utilizados os filtros de excitação e emissão de 360 e 460 nm,

respectivamente. O ensaio enzimático foi realizado em microplaca de 96 poços

As soluções utilizadas foram:

1) Solução tampão de fosfato-cisteína

Pesaram-se 3,55 g de fosfato de sódio dibásico anidro e dissolveu-se em 400 mL de

água Milli-Q em balão volumétrico de 500 mL. Adicionou-se 7,00 g de EDTA dissódico e

2,74 g de cloridrato de cisteína anidro, completou-se o volume com água Milli-Q e agitou-se

até completa dissolução. O pH foi ajustado para 6,0 (± 0,1) com solução de hidróxido de

sódio 10%.

2) Solução do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA

Pesaram-se exatamente 25 mg do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA e solubilizou-

se em 37,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) em frasco de vidro âmbar. Transferiu-se uma

alíquota de 400 µL da solução anterior para um balão volumétrico de 25 mL. Completou-se o

volume com solução tampão de fosfato-cisteína e agitou-se até completa homogeneização.

32

3) Solução de ácido acético 30%

Transferiu-se 30 mL de ácido acético glacial para balão volumétrico de 100 mL,

completou-se o volume com água purificada e agitou-se até completa homogeneização.

Em cada poço da microplaca, foram adicionados: 55 µL da solução tampão, 125 µL da

solução do substrato, 20 µL de papaína (amostra ou padrão) ou formulação contendo ou não

papaína e 40 µL de solução de ácido acético 30% para interromper a reação.

Durante todo o preparo da microplaca, todas as soluções e a placa foram mantidas em

banho de gelo. Posteriormente, a placa foi colocada em incubação a 40ºC no próprio aparelho

por 45 minutos. A reação foi interrompida com solução de ácido acético 30% de 15 em 15

minutos, iniciando no tempo zero e terminando em 45 minutos. O experimento foi realizado

em triplicata.

O esquema da microplaca está representado na Figura 2. Os poços em cor cinza

representam a análise de uma amostra: as quatro linhas são referentes ao tempo de reação (0,

15, 30 e 45 minutos) e as três colunas, às repetições (triplicata).

Figura 2. Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra.

Foi construída uma curva com a média dos valores de fluorescência em função do

tempo de reação, onde se obteve a velocidade da reação (aumento de fluorescência por

33

minuto). Deste modo, foi feita a relação da velocidade do aumento de fluorescência em

função da concentração de papaína.

4.2.3.1 Validação da metodologia

4.2.3.1.1 Curva de calibração

Pesaram-se exatamente 25 mg de papaína padrão secundário 30.000 UI/mg e

transferiu-se para balão volumétrico de 250 mL. Completou-se volume com solução tampão

(item 4.2.3) e agitou-se até completa homogeneização.

Foram transferidas alíquotas de 180, 300, 600, 1200 e 1500 µL da solução anterior

para balões volumétricos de 100 mL. Adicionou-se solução tampão até completar volume e

homogeneizou-se.

As soluções foram analisadas segundo procedimento descrito no item 4.2.3. As

concentrações finais de papaína nos poços da microplaca são: 0,45; 0,75; 1,50; 3,00 e 3,75

UI/mL, respectivamente.

4.2.3.1.2 Precisão

Foi avaliada a precisão intra-corrida (repetibilidade) do ensaio, onde foi verificada a

concordância entre os resultados em um curto período de tempo, com o mesmo analista e

mesma instrumentação. Foram utilizadas soluções padrão de papaína 30.000 UI/mg nas

concentrações de 0,45; 1,50 e 3,75 UI/mL nos poços. Realizaram-se 10 determinações de cada

amostra no mesmo dia e calculou-se o coeficiente de variação pra elas, segundo a Equação 1.

Equação 1:

CV (%) = DP x 100

CMD

Onde, CV é o coeficiente de variação, DP é o desvio padrão e CMD é a concentração

média determinada.

34

4.2.3.1.3 Exatidão

Segundo a Resolução nº 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)

(BRASIL, 2003), a exatidão pode ser calculada como porcentagem de recuperação de uma

quantidade conhecida do analito adicionado à amostra.

Para este teste, foram preparadas as seguintes soluções:

1) Solução de papaína padrão 30.000 UI/mg

Foram pesadas exatamente 25 mg de papaína padrão secundário 30.000 UI/mg.

Transferiu-se para balão volumétrico de 250 mL e dissolveu-se em solução tampão, descrita

no item 4.2.3.

2) Solução da amostra

Foram pesadas quantidades de amostras equivalentes a 25 mg de papaína 6.000

UI/mg. As amostras utilizadas foram: papaína 2% em gel de Carbopol 1,4%, e papaína 4% em

gel de Carbopol 1,8%, sem adição de adjuvantes. Essas amostras foram dissolvidas em

solução tampão (item 4.2.3) em balão volumétrico de 250 mL.

Foram transferidas quantidades destas soluções para balões volumétricos de 25 mL,

conforme descrito na Tabela 7, e completou-se o volume com a mesma solução tampão. As

amostras foram, então, submetidas à análise descrita no item 4.2.3.

Tabela 7. Volumes utilizados das soluções das amostras e do padrão no teste de recuperação.

Balão

volumétrico

(25 mL)

Volume adicionado (µL)

Solução 1

(padrão)

Solução 2

(amostra)

1 150 -

2 150 75

3 - 75

35

A exatidão pode ser determinada através da Equação 2, descrita a seguir.

Equação 2:

Exatidão = CME x 100

CT

Onde, CME é a concentração média experimental e CT é a concentração teórica.

4.2.3.1.4 Especificidade

O teste de especificidade tem como objetivo avaliar se o método tem capacidade de

medir exatamente o composto na presença de outras substâncias (BRASIL, 2003). Com isso,

foi analisada a interferência dos excipientes da formulação na determinação da atividade da

papaína.

Foram avaliadas as formulações de gel de Carbopol 1,4 e 1,8%, e as mesmas

acrescidas dos adjuvantes técnicos nas maiores concentrações utilizadas no estudo, conforme

descrito na Tabela 8.

Tabela 8. Formulações avaliadas no teste de especificidade.


1 2 3 4

EDTA dissódico - 0,08 - 0,16

Cloridrato de cisteína - 0,32 - 0,64

Propilenoglicol - 10 - 10

Gel de Carbopol 1,4% 100 q.s.p. 100 - -

Gel de Carbopol 1,8% - - 100 q.s.p. 100

Foram pesados exatamente 3,125 g de cada formulação em bécher de 20 mL. Diluiu-

se com aproximadamente 10 mL solução tampão (descrita no item 4.2.3), transferiu-se para

balão volumétrico de 50 mL e completou-se o volume com solução tampão. Foram

36

transferidos 1000 µL dessa solução para balão volumétrico de 25 mL e completou-se o

volume com a solução tampão citada anteriormente. Dessa segunda solução, foram

transferidos 300 µL para balão volumétrico de 25 mL e completou-se o volume com a mesma

solução. Posteriormente, as amostras foram submetidas ao procedimento descrito no item

4.2.3.

4.2.3.1.5 Limites de detecção e quantificação

Foram feitas três curvas de calibração com soluções de papaína padrão secundário

30.000 UI/mg nas concentrações de 0,075; 0,225; 0,750; 1,500; 3,000 e 3,750 UI/mL em cada

poço. Foi seguido o procedimento conforme item 4.2.3.

Os limites foram calculados através da inclinação e da média da interseção de y das

curvas, utilizando as Equação 3 e Equação 4.

Equação 3:

LD = DPa x 3

IC

Onde, LD é o limite de detecção estimado, DPa é o desvio padrão da interseção com o

eixo y das 3 curvas de calibração e IC é a inclinação da curva de calibração.

Equação 4:

LQ = DPa x 10

IC

Onde, LQ é o limite de quantificação estimado, DPa é o desvio padrão da interseção

com o eixo y das 3 curvas de calibração e IC é a inclinação da curva de calibração.

4.2.4 Estudo de formulação

Foram preparadas 27 formulações para cada concentração de papaína, 2 e 4%, com

variações nas concentrações dos adjuvantes técnicos selecionados: EDTA dissódico,

37

cloridrato de cisteína e propilenoglicol. O planejamento do experimento foi realizado por um

desenho fatorial 33. As formulações estudadas estão apresentadas nas Tabela 9 e Tabela 10.

Tabela 9. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 2%.

Formulações

Componentes (% p/p)

Papaína

6.000 UI/mg

EDTA

dissódico

Cloridrato

de cisteína Propilenoglicol

Gel Carbopol®

940 1,4%

(q.s.p.)

P2-01 2,00 - - - 100,00

P2-02 2,00 - - 5,00 100,00

P2-03 2,00 - - 10,00 100,00

P2-04 2,00 - 0,16 - 100,00

P2-05 2,00 - 0,16 5,00 100,00

P2-06 2,00 - 0,16 10,00 100,00

P2-07 2,00 - 0,32 - 100,00

P2-08 2,00 - 0,32 5,00 100,00

P2-09 2,00 - 0,32 10,00 100,00

P2-10 2,00 0,04 - - 100,00

P2-11 2,00 0,04 - 5,00 100,00

P2-12 2,00 0,04 - 10,00 100,00

P2-13 2,00 0,04 0,16 - 100,00

P2-14 2,00 0,04 0,16 5,00 100,00

P2-15 2,00 0,04 0,16 10,00 100,00

P2-16 2,00 0,04 0,32 - 100,00

P2-17 2,00 0,04 0,32 5,00 100,00

P2-18 2,00 0,04 0,32 10,00 100,00

P2-19 2,00 0,08 - - 100,00

P2-20 2,00 0,08 - 5,00 100,00

P2-21 2,00 0,08 - 10,00 100,00

P2-22 2,00 0,08 0,16 - 100,00

P2-23 2,00 0,08 0,16 5,00 100,00

P2-24 2,00 0,08 0,16 10,00 100,00

P2-25 2,00 0,08 0,32 - 100,00

P2-26 2,00 0,08 0,32 5,00 100,00

P2-27 2,00 0,08 0,32 10,00 100,00

38

Tabela 10. Formulações analisadas no estudo de formulação de gel de papaína 4%.

Formulações

Componentes (% p/p)

Papaína

6.000 UI/mg

EDTA

dissódico

Cloridrato

de cisteína Propilenoglicol

Gel de

Carbopol® 940

1,8% (q.s.p.)

P4-01 4,00 - - - 100,00

P4-02 4,00 - - 5,00 100,00

P4-03 4,00 - - 10,00 100,00

P4-04 4,00 - 0,32 - 100,00

P4-05 4,00 - 0,32 5,00 100,00

P4-06 4,00 - 0,32 10,00 100,00

P4-07 4,00 - 0,64 - 100,00

P4-08 4,00 - 0,64 5,00 100,00

P4-09 4,00 - 0,64 10,00 100,00

P4-10 4,00 0,08 - - 100,00

P4-11 4,00 0,08 - 5,00 100,00

P4-12 4,00 0,08 - 10,00 100,00

P4-13 4,00 0,08 0,32 - 100,00

P4-14 4,00 0,08 0,32 5,00 100,00

P4-15 4,00 0,08 0,32 10,00 100,00

P4-16 4,00 0,08 0,64 - 100,00

P4-17 4,00 0,08 0,64 5,00 100,00

P4-18 4,00 0,08 0,64 10,00 100,00

P4-19 4,00 0,16 - - 100,00

P4-20 4,00 0,16 - 5,00 100,00

P4-21 4,00 0,16 - 10,00 100,00

P4-22 4,00 0,16 0,32 - 100,00

P4-23 4,00 0,16 0,32 5,00 100,00

P4-24 4,00 0,16 0,32 10,00 100,00

P4-25 4,00 0,16 0,64 - 100,00

P4-26 4,00 0,16 0,64 5,00 100,00

P4-27 4,00 0,16 0,64 10,00 100,00

Foram pesados os componentes sólidos (papaína, EDTA dissódico e cloridrato de

cisteína) e transferiu-se para gral de porcelana. Triturou-se e, quando presente na formulação,

adicionou-se o propilenoglicol. O gel de Carbopol (descrito na Tabela 5) foi adicionado aos

poucos, sob mistura com pistilo de porcelana, até completa homogeneização. Quando

necessário, foi feito o ajuste para valor de pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio 10%.

39

Preparou-se 30 g de cada formulação, que foram armazenadas em frascos plásticos

transparentes envoltos em papel alumínio, por 48 horas em temperatura de 5ºC ± 2ºC.

Posteriormente, as formulações foram submetidas ao teste de determinação da atividade

proteolítica da papaína, descrito no item 4.2.3, com objetivo de selecionar aquelas com

melhores resultados de atividade.

4.2.4.1 Estudo de superfície de resposta

A análise estatística dos resultados do estudo de formulação dos géis de papaína a 2 e

4% foi realizada no programa R (versão 2.14), utilizando o pacote RMS. Este pacote é usado

para o estudo de superfície de resposta, que é uma metodologia onde se visa explorar

condições de operação ótimas através de métodos experimentais (LENTH, 2009). Neste caso,

a análise foi realizada para a procura da melhor combinação de adjuvantes técnicos que

favoreça a atividade proteolítica da papaína em gel.

As variáveis foram codificadas utilizando a função “coded.data” do pacote RMS.

Tratando-se de um experimento de Composite Central Design (CCD) ou Delineamento

Composto Central (DCC), a codificação das variáveis foi feita conforme descrito na Tabela

11.

Tabela 11. Codificação das variáveis para o estudo de superfície de resposta, utilizando

pacote RMS do programa R.

Variável Codificação Exemplo

Propilenoglicol

x1 -1 0%

x2 0 5%

x3 1 10%

Legenda: x1 - variável no menor nível / x2 - variável no

nível médio / x3 - variável no maior nível.

O estudo avaliou a influência de cada adjuvante técnico na atividade proteolítica da

papaína em gel e a interação entre eles. Para ajuste dos modelos, foram utilizadas as funções

40

FO (first order), SO (second order) e TWI (two-way interactions). Foram obtidos gráficos das

curvas de contorno e das superfícies de resposta para a análise de variáveis dois a dois.

Após esta avaliação, foi selecionada uma formulação, aquela mais favorável à

atividade proteolítica, para cada concentração de papaína para o estudo de estabilidade

acelerada. Para o gel de papaína 2%, a formulação selecionada foi a P2-20. Já para o gel de

papaína 4%, foi proposta a formulação P4-28, através dos resultados do estudo de steepest

ascent from ridge ou “caminho mais íngreme até o valor máximo”, cuja composição está

apresentada na Tabela 12 (item 4.2.5).

4.2.5 Estudo de estabilidade acelerada

As formulações selecionadas de acordo com o descrito no item 4.2.4.1, P2-20 e P4-28,

foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerada. Com objetivo de comparar o efeito dos

adjuvantes técnicos utilizados, também foram submetidas ao estudo as formulações P2-01 e

P4-01, contendo apenas papaína e gel de Carbopol.

Tabela 12. Composição das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, selecionadas para o

estudo de estabilidade acelerada.


P2-01 P2-20 P4-01 P4-28

Papaína 6.000 UI/mg 2,00 2,00 4,00 4,00

EDTA dissódico - 0,08 - 0,12

Cloridrato de cisteína - - - 0,05

Propilenoglicol - 5,00 - 3,58

Gel de Carbopol 1,8% q.s.p. 100 q.s.p. 100 q.s.p. 100 q.s.p. 100

4.2.5.1 Preparo das amostras

Foram pesados os componentes sólidos (papaína, EDTA dissódico e cloridrato de

cisteína) e transferidos para gral de porcelana para trituração. Adicionou-se o propilenoglicol,

quando presente na formulação. O gel de Carbopol foi adicionado aos poucos, sob mistura em

41

batedeira planetária, até completa homogeneização. Foi feito o ajuste para valor de pH igual a

6,0 com solução de hidróxido de sódio 10%, quando necessário. O gel foi fracionado em

porções de 100 g e acondicionado em bisnagas de polietileno brancas com 120 g de

capacidade.

4.2.5.2 Condições do estudo

As análises foram iniciadas após 48 horas do preparo, tempo necessário para

estabilização da formulação (CAPUCHO, 2007). Durante este tempo, as bisnagas foram

mantidas em refrigeração a 5ºC ± 2ºC, com objetivo de preservar as características da

papaína.

Após este prazo, as amostras foram acondicionadas em três diferentes temperaturas:

geladeira (5ºC ± 2ºC), ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC) (BRASIL, 2004;

BRASIL, 2005). As análises foram realizadas no tempo zero e nos 7, 15, 30 e 60º dias.

4.2.5.3 Características avaliadas

As formulações foram avaliadas quanto às características sensoriais (aspecto, cor e

odor), pH, viscosidade aparente, comportamento reológico e atividade proteolítica.

a) Características sensoriais

As características sensoriais (aspecto, cor e odor) foram avaliadas pelo mesmo

operador, de acordo com os parâmetros baseado nos descritos por Pinto (2005). Os

parâmetros utilizados estão na Tabela 13.

42

Tabela 13. Parâmetros de avaliação das características sensoriais das formulações.

Aspecto

Ho Homogêneo

He Heterogêneo, com presença de precipitados

Cor

I Incolor

LA Levemente amarelado

A Amarelado

A+ Cor amarela +

A++ Cor amarela ++

A+++ Cor amarela +++

A++++ Cor amarela ++++

A+++++ Cor amarela +++++

Odor

C Característico da papaína

LM Levemente modificado, indicando degradação da

papaína

M Modificado, caracterizando degradação da papaína

b) pH

A medida do pH foi realizada por potenciometria em pHmetro Schott Handylab 1. As

amostras foram retiradas do acondicionamento e analisadas após alcançarem a temperatura

ambiente.

c) Viscosidade aparente

A medida da viscosidade aparente foi realizada com o Viscosímetro Visco Basic Plus,

Fungilab S.A. Foi utilizado viscosímetro acoplado à haste R7. Cada amostra foi submetida à

avaliação da viscosidade aparente durante um intervalo de velocidade de 0,6 a 100 rpm,

realizada em triplicata. As análises foram realizadas em temperatura ambiente. As amostras

43

foram retiradas previamente das condições de armazenamento e deixadas em repouso até

alcançarem a temperatura desejada. Com os dados obtidos, foram feitos gráficos de

viscosidade (mPa.s) por velocidade (rpm).

d) Comportamento reológico

As formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 foram submetidas à caracterização do

comportamento reológico no tempo inicial do estudo de estabilidade acelerada. Foi utilizado

reômetro de disco oscilatório Haake Mars, tipo cone-placa, acoplado ao cone C35/2º TI (35

mm e 2 graus de inclinação). Esta analise foi realizada no Laboratório de Processamento e

Caracterização de Materiais Poliméricos (LAMAP), no Instituto Nacional de Tecnologia

(INT), sob a supervisão da Dr.ª Valéria Gonçalves Costa.

Os parâmetros de análise foram definidos através do software RheoWin 3. As análises

foram feitas a 25ºC, com tamanho da fenda (distância entre o cone e a placa) de 0,105 mm. O

tempo de análise foi definido em 120 segundos para a curva ascendente e 120 segundos para a

curva descendente, com leituras de 4 em 4 segundos, em um total de 60 leituras. A taxa de

cisalhamento foi estabelecida de 0 a 125 rpm (CORRÊA et al., 2005). As análises foram feitas

em triplicata.

Foram obtidas as curvas de fluxo (reogramas), a viscosidade aparente e a tixotropia

das formulações.

e) Atividade proteolítica

As amostras foram preparadas e analisadas de acordo com o descrito no item 4.2.3.1.4.

Foram preparadas três amostras para cada formulação avaliada, para cada temperatura de

armazenamento. A avaliação da atividade enzimática em microplaca foi realizada em

triplicata, conforme o esquema demonstrado na Figura 2.

4.2.6 Análise estatística

Os resultados foram avaliados quanto à estatística descritiva (média, desvio padrão,

erro padrão), através do programa Microsoft Office Excel 2007, e foram tratados através do

44

programa GraphPad InStat 3.00, sendo empregada a ANOVA de uma via, seguida pelo teste

de Student-Newman-Keuls para comparação entre os grupos de dados, adotando-se

significância de 5% (p<0.05).

45

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Seleção do gel base de Carbopol® 940 para incorporação da papaína

O estudo da concentração de Carbopol® 940 necessária para a preparação dos géis de

papaína iniciou-se pela preparação de amostras nas duas concentrações de papaína, 2 e 4%,

com concentrações fixas de EDTA dissódico, cisteina e propilenoglicol, em géis onde a

concentração do agente gelificante encontrava-se entre 0,6 a 2,0% de Carbopol®. A papaína e

os adjuvantes foram adicionados a géis base previamente preparados. Observou-se que a

adição destes componentes resultava na perda da consistência do gel, podendo ocasionar sua

completa desorganização quando as preparações apresentavam concentrações menores de

1,0% de Carbopol®

940. As preparações que apresentavam aparência satisfatória foram

aquelas que possuíam 1,2 a 1,6% de Carbopol® 940 para a concentração de 2% de papaína e

1,8 a 2,0% de Carbopol® 940 para géis com 4% de papaína.

A consistência de um gel destinado a aplicação em feridas precisa atender às

expectativas dos profissionais que os administram durante a execução dos curativos diários

em pacientes com lesões. Considera-se necessário, portanto, a opinião de profissionais de

enfermagem que estivessem acostumados à prática destes procedimentos. Foi promovida uma

reunião com professores e profissionais de enfermagem do Ambulatório de Feridas do HUAP

para a eleição da formulação que apresentava a melhor consistência. Por consenso do grupo

de profissionais a melhor preparação deveria ser de fácil aplicação e remoção, mas que não

deve ser tão fluida que escorresse dos limites da ferida durante o período de ação do gel. A

consistência selecionada seria aquela que apresentava a viscosidade mínima para aceitação na

prática clínica.

As formulações P2C1,2; P2C1,4; P2C1,6; P4C1,8 e P4C2,0 foram encaminhadas para

a avaliação por parte da equipe de Enfermagem. A escolha dos enfermeiros do Ambulatório

de Feridas do HUAP, após análise sensorial, foi pelas formulações P2C1,4 e P4C1,8. Deste

modo, os estudos seguintes foram realizados com gel de Carbopol® 1,4% para papaína a 2%,

e gel de Carbopol® 1,8% para papaína a 4%.

46

5.2 Validação da metodologia de determinação da atividade proteolítica da papaína

5.2.1 Curva de calibração

Os resultados obtidos na curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg são

apresentados na Tabela 14 e na Figura 3.

Tabela 14. Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão

secundário 30.000 UI/mg.

Concentração

(UI/mL)

Velocidade*

(unidades de fluorescência/minuto)

0,450 105,86 (±27,41)

0,750 201,80 (±27,56)

1,500 388,68 (±41,32)

3,000 978,31 (±64,08)

3,750 1259,30 (±55,79)

*Média de três determinações.

Figura 3. Curva de calibração da papaína 30.000 UI/mg.

47

A partir da curva de calibração, foi obtida a Equação 5.

Equação 5:

y = 352,21x – 78,895 R2 = 0,9952

Onde, y é a velocidade do aumento de fluorescência por minuto, x é a concentração de

papaína em UI por mL e R2 é o coeficiente de correlação linear.

Segundo a Resolução nº 899 da ANVISA (BRASIL, 2003), linearidade é “a

capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos são

diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo

especificado”. A análise dos dados mostra aumento proporcional entre a velocidade da reação

e a concentração de papaína padrão utilizada. O coeficiente de correlação linear (R2) igual a

0,9952 corresponde ao valor de coeficiente de correlação (R) igual a 0,9976, atendendo o

critério mínimo para aceitação de valor de R ≥ 0,99.

5.2.2 Precisão

Na Tabela 15, são apresentados os resultados da precisão intra-corrida obtidos da

análise das soluções de papaína padrão secundário 30.000 UI/mg.

Pode-se considerar a precisão do método adequada, pois os valores dos coeficientes de

variação são menores do que 5%, valor máximo aceitável segundo a Resolução nº 899, da

ANVISA (BRASIL, 2003).

48

Tabela 15. Resultados obtidos da avaliação da precisão intra-corrida para

soluções de papaína padrão 0,450; 1,500; e 3,750 UI/mL.

Determinação

Concentração da solução padrão (UI/mL)

0,450 1,500 3,750

Concentração obtida (UI/mL)

1 0,5246 1,3275 3,7994

2 0,5238 1,3394 3,7852

3 0,5267 1,3415 3,7747

4 0,5263 1,3452 3,7665

5 0,5276 1,3697 3,7747

6 0,5272 1,3710 3,7705

7 0,5267 1,3727 3,7719

8 0,5269 1,3718 3,7725

9 0,5244 1,3744 3,7770

10 0,5228 1,3736 3,7725

Média 0,5257 1,3587 3,7765

DP* 0,0016 0,0171 0,0089

CV** (%) 0,30 1,26 0,24

*Desvio padrão **Coeficiente de variação

5.2.3 Exatidão

Os resultados obtidos no teste de recuperação das amostras de gel de papaína a 2 e a

4% estão na Tabela 16.

49

Tabela 16. Resultados do teste de recuperação da papaína a 2 e a 4% nas amostras de gel de

Carbopol® 940.

Amostra

Quantidade de

padrão adicionado

(UI/mL)

Quantidade de

padrão recuperado

(UI/mL)

Exatidão

(%)

Papaína 2% em gel de

Carbopol 1,4% 1,5 1,4564 97,09

Papaína 4% em gel de

Carbopol 1,8% 1,5 1,4608 97,39

O método mostrou excelente taxa de recuperação da papaína em gel de Carbopol®

940, para ambas as concentrações estudadas. O resultado é semelhante ao obtido por Pinto

(2005), que obteve 96,7% de recuperação da papaína 0,8% em gel com este método,

mostrando que a exatidão do teste mantém-se mesmo para concentrações de papaína mais

altas.

A metodologia empregada no presente trabalho demonstra uma enorme vantagem em

relação à descrita por Capucho (2007), que utiliza o método espectrofotométrico e tem a

caseína como substrato. No trabalho citado, foram obtidos resultados com soluções de

papaína padrão, com recuperação média de 113 e 115%, para exatidão intra e interensaio,

respectivamente. Porém, quando o método espectrofotométrico foi aplicado à formulação de

papaína 1% em gel de Carbopol® 940, a taxa de recuperação da foi de apenas 8,96%.

5.2.4 Especificidade

Os resultados da avaliação da interferência dos excipientes na determinação da

atividade proteolítica da papaína estão na Tabela 17.

50

Tabela 17. Resultados experimentais da análise da interferência

de diversos excipientes na determinação da atividade da papaína

em gel de Carbopol® 940.

Unidades de fluorescência

Tempo de reação

(minutos)

Formulação

1 2 3 4

0 1165,33 1073,33 1247,33 1251,00

15 1059,33 1407,00 1514,00 1567,67

30 968,33 1065,67 1159,67 1385,67

45 1163,67 1272,00 1428,33 1244,33

A partir desses valores, foram feitos gráficos de unidades de fluorescência x tempo de

reação, onde verificou-se a não existência de linearidade nas reações analisadas, como

demonstrado abaixo (Figura 4 a Figura 7).


apresentando a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2).

51





52



5.2.5 Limites de detecção e quantificação

Os resultados da análise dos limites de detecção e quantificação estão apresentados na

Tabela 18.

Tabela 18. Resultados obtidos para o cálculo dos limites de detecção e

quantificação da papaína pelo método de microplacas.

Curvas Interseção com o eixo y Inclinação da curva

(coeficiente angular)

1 -33,210 348,29

2 -48,472 362,01

3 -27,618 328,82

Média --- 346,37

Desvio padrão 10,7942 ---

53

Utilizando a Equação 3 e a Equação 4 (item 4.2.3.1.5), foram calculados os limites de

detecção e quantificação, com resultados de 0,094 e 0,312 UI/mL, respectivamente.

Esses valores demonstram que o método é bastante sensível, principalmente em

comparação com resultados do método espectrofluorimétrico utilizando a caseína como

substrato, que apresenta limite de detecção igual a 3420 UI/mL e limite de quantificação igual

a 10380 UI/mL (PINTO, 2005).

5.3 Estudo de formulação

O estabelecimento da composição dos géis analisados no estudo de formulação foi

baseado na formulação proposta por Capucho (2007), que avaliou o gel de papaína em

Carbopol® 940 constituído por: papaína - 1,00%; cloridrato de cisteína - 0,16%; solução de

EDTA 1% (p/v) - 4,00%; propilenoglicol - 5,00%; Nipaguard®

- 0,80%; Carbopol®

940 -

0,60%; solução de hidróxido de sódio 10% q.s. pH 6,5; e água destilada q.s.p. 100,00.

Foram utilizadas concentrações proporcionais dos adjuvantes técnicos em relação às

de papaína, estabelecendo assim o limite máximo de concentração do adjuvante utilizado no

desenho fatorial. A exceção foi o propilenoglicol que, por tratar-se de um líquido, seu uso em

altas concentrações afetaria extremamente a viscosidade do produto final. Assim, foram

utilizadas as mesmas concentrações de propilenoglicol tanto para os géis de papaína 2%

quanto os 4% (0, 5 e 10%).

A escolha do uso de EDTA dissódico e de cloridrato de cisteína justifica-se pelo

estudo anterior realizado por Capucho (2007) e pelas informações encontradas na literatura

sobre seu efeito na ativação e na proteção do sítio ativo da papaína (ARNON, 1970;

KIMMEL e SMITH, 1953; PINTO, 2005; SMITH, KIMMEL e BROWN, 1953). A escolha

do propilenoglicol, entretanto, é justificada pelas evidências encontradas em relatos

científicos de que substâncias polihidroxiladas aumentam a estabilidade da papaína (KILINÇ,

ONAL e TELEFONCU, 2001; SATISH, KUMAR e PRAKASH, 2007). O propilenoglicol é

comumente aplicado em formulações de géis hidrofílicos pelo seu efeito umectante e

escolheu-se estudar o seu efeito sobre atividade proteolítica.

54


Os resultados de atividade proteolítica dos géis submetidos ao estudo de formulação

para a papaína a 2% estão na Tabela 19. Foi realizada uma análise inicial dos resultados,

utilizando como parâmetro de comparação a formulação P2-01, preparação com papaína a 2%

que não possuía qualquer adjuvante técnico.

Tabela 19. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel

de papaína 2%.

Formulação

Concentração dos adjuvantes técnicos (% p/p) Atividade

proteolítica

(UI/mg)* EDTA dissódico

Cloridrato de

cisteína Propilenoglicol

P2-01 0 0 0 243,70

P2-02 0 0 5 238,71

P2-03 0 0 10 203,75

P2-04 0 0,16 0 230,26

P2-05 0 0,16 5 226,70

P2-06 0 0,16 10 246,66

P2-07 0 0,32 0 216,06

P2-08 0 0,32 5 218,42

P2-09 0 0,32 10 226,53

P2-10 0,04 0 0 211,35

P2-11 0,04 0 5 244,80

P2-12 0,04 0 10 222,67

P2-13 0,04 0,16 0 249,82

P2-14 0,04 0,16 5 234,38

P2-15 0,04 0,16 10 234,46

P2-16 0,04 0,32 0 224,59

P2-17 0,04 0,32 5 214,81

P2-18 0,04 0,32 10 212,97

P2-19 0,08 0 0 244,65

P2-20 0,08 0 5 233,15

P2-21 0,08 0 10 264,86

P2-22 0,08 0,16 0 217,65

P2-23 0,08 0,16 5 202,70

P2-24 0,08 0,16 10 210,13

P2-25 0,08 0,32 0 210,31

P2-26 0,08 0,32 5 225,90

P2-27 0,08 0,32 10 223,20


55

À primeira vista, observou-se a diminuição da atividade proteolítica em formulações

onde o único adjuvante técnico é o propilenoglicol. Este fenômeno é percebido nas

formulações P2-02 e P2-03, onde a atividade reduz quando comparado a P2-01, sendo que a

redução vista na última é altamente significativa (p<0,001).

Verificou-se também efeito negativo na atividade proteolítica para o cloridrato de

cisteína, podendo ser proporcional à concentração (P2-04 e P2-07). Foi possível conferir este

efeito na análise das formulações P2-13 e P2-16, um conjunto que varia na concentração de

cisteína, mas mantém fixos os outros parâmetros. Neste caso, houve uma diminuição

significativa da atividade enzimática (p<0,01).

Em relação ao uso do EDTA dissódico, porém, não foi possível observar um padrão de

comportamento; na menor concentração estudada (P2-10), notou-se uma queda na atividade

proteolítica (p<0,001), enquanto para a concentração mais alta (P2-19), verificou-se apenas

uma manutenção da atividade em relação à formulação P2-01 (p>0,05). Entretanto, quando

foi avaliado o conjunto de formulações P2-13 e P2-22, que diferem entre si pela concentração

de EDTA e mantém fixos os outros parâmetros, observou-se uma queda da atividade

proteolítica (p<0,001) relacionada ao aumento deste adjuvante.

Para melhor interpretação dos dados, os resultados foram submetidos a um tratamento

estatístico no programa R, com auxílio do pacote RMS. As formulações foram planejadas por

um desenho fatorial 33 e os resultados foram submetidos ao estudo de superfície de resposta.

O experimento planejado pode ser classificado como um Composite Central Design

(CCD) ou Delineamento Composto Central (DCC). O DCC é um dos mais populares

delineamentos para o estudo de superfície de resposta e é considerado ótimo. Ele apresenta

características interessantes na busca do ponto ótimo (aquele onde se encontra a melhor

resposta), como a necessidade de um número menor de tratamentos em relação aos fatoriais

completos e a capacidade de ser realizado sequencialmente, caminhando no sentido de

otimização do sistema, através da técnica de steepest ascent from ridge ou “caminho mais

íngreme até o valor máximo”. Esta técnica consiste em encontrar a região que contém o ótimo

e comparar o delineamento nesta área, de forma a chegar à combinação ótima, que maximize

os resultados do sistema (LENTH, 2009; MATEUS, BARBIN e CONAGIN, 2001; WANG,

2006).

56

Para verificar corretamente a influência de cada variável, é necessário que elas sejam

codificadas. Este é um fator imprescindível em um estudo de superfície de resposta, pois pode

alterar os resultados da análise de steepest ascent from ridge. É necessário utilizar um método

de codificação que faça com que todas as variáveis codificadas do experimento oscilem

dentro de uma mesma escala, para proporcionar a cada uma delas a mesma potência na

determinação do steepest ascent from ridge; ou seja, se os fatores não estiverem na mesma

escala, o resultado de steepest ascent from ridge obtido do ajuste do modelo dos valores

brutos será diferente daquele dos valores codificados. Os valores codificados podem,

posteriormente, ser decodificados e relacionados aos valores iniciais (LENTH, 2009).

No DCC, há um ponto central com a mesma distância para os outros pontos de análise;

por exemplo, as concentrações de propilenoglicol utilizadas (0, 5 e 10%), onde 5% é o ponto

central, que se distancia das concentrações extremas na mesma proporção. Deste modo, foi

utilizada a codificação de -1, 0, 1 para as variáveis, como se observa nos eixos “x” dos

gráficos das curvas de contorno e de superfície de resposta, apresentados nas Figura 8, 9, 10 e

Figura 11.

A análise das variáveis foi realizada em combinação dois a dois (EDTA dissódico x

cloridrato de cisteína, EDTA dissódico x propilenoglicol e cloridrato de cisteína x

propilenoglicol), onde foi possível verificar a interferência de cada adjuvante técnico e de

suas combinações na atividade proteolítica da papaína.

Nas formulações de gel de papaína a 2%, o parâmetro que apresentou maior

significância foi o cloridrato de cisteína. A presença dele influencia efetivamente a atividade

proteolítica do gel, produzindo um efeito negativo sobre ela. Não foram detectadas interações

significativas entre os adjuvantes técnicos.

Os resultados foram ajustados por uma função de 1ª ordem (FO), apresentando relação

linear. A função de 2ª ordem (SO) e as interações (TWI) não apresentaram significância, com

coeficiente de correlação (R2) igual a 0,2079. Isto significa que apenas 20,79% dos casos

poderiam ser explicados pelo modelo que inclui SO e TWI, o que o torna não aplicável.

As curvas de contorno pra o modelo do gel de papaína 2% são apresentadas na Figura

8.

A primeira curva de contorno (EDTA dissódico x cloridrato de cisteína – Figura 8a)

mostra que a atividade proteolítica do gel aumenta com o aumento do EDTA dissódico e a

57

diminuição do cloridrato de cisteína, com uma contribuição muito maior da cisteína para o

resultado.

Na segunda curva (EDTA dissódico x propilenoglicol – Figura 8b), verificamos a

ausência de interação entre os adjuvantes; ao fixar a concentração de um deles, pouca

alteração na atividade se observa.

Com a terceira curva (cloridrato de cisteína x propilenoglicol – Figura 8c), é possível

confirmar a influência majoritária da cisteína na atividade do gel, onde sua diminuição

favorece-a. Quanto ao propilenoglicol, pode-se novamente verificar a ausência de sua

influência no resultado.

Na Figura 9, são apresentados os gráficos das superfícies de resposta do gel de papaína

a 2%. Novamente, é possível observar a grande contribuição da presença de cisteína para a

queda da atividade proteolítica (Figura 9a e c). No entanto, o aumento da concentração de

EDTA mostra uma melhora na atividade do gel (Figura 9a e b), enquanto os resultados do

propilenoglicol reforçam sua ausência de efeito (Figura 9b e c).

Não foi possível definir um ponto ótimo, onde a combinação dos adjuvantes indicasse

uma atividade proteolítica máxima, devido à característica do modelo de atender a uma

função de 1ª ordem. Para realização do teste de steepest ascent from ridge, é necessário que o

modelo proposto obedeça a uma função de 2ª ordem.

Deste modo, analisando os resultados anteriormente apresentados, foi determinada a

formulação P2-20 como escolha para o estudo de estabilidade acelerada. Esta formulação foi

selecionada por apresentar a concentração máxima de EDTA dissódico utilizada no estudo e a

ausência de cloridrato de cisteína, que demonstraram ter efeitos positivo e negativo,

respectivamente, sobre a atividade proteolítica da papaína em gel na concentração de 2%.

Como o propilenoglicol não apresentou influência na atividade, foi selecionada a

concentração de 5%, quantidade usual para sua função de agente umectante em géis

(BRASIL, 2011; FERREIRA, 2008).

É essencial ressaltar, entretanto, que a influência de cada adjuvante técnico foi

avaliada somente 48 horas após o preparo dos géis. Deste modo, os resultados indicam a

natureza da influência de cada um deles no momento inicial do estudo, com pouco tempo de

preparo, e não como se comportarão ao longo de um período maior.

58



propilenoglicol.

59



propilenoglicol.

60


Os resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel de papaína a

4% são mostrados na Tabela 20. Assim como no estudo de formulação dos géis de papaína

2%, foi feita uma análise simples, através da comparação dos valores de atividade obtidos, em

relação à formulação P4-01, que não apresenta adição de adjuvante técnico.

Tabela 20. Resultados da atividade proteolítica do estudo de formulação do gel

de papaína 4%.

Formulação

Concentração dos adjuvantes técnicos (% p/p) Atividade proteolítica

(UI/mg)* EDTA

dissódico

Cloridrato de


P4-01 0 0 0 358,00

P4-02 0 0 5 344,02

P4-03 0 0 10 298,35

P4-04 0 0,32 0 279,46

P4-05 0 0,32 5 299,37

P4-06 0 0,32 10 322,57

P4-07 0 0,64 0 262,17

P4-08 0 0,64 5 260,71

P4-09 0 0,64 10 273,35

P4-10 0,08 0 0 347,23

P4-11 0,08 0 5 323,20

P4-12 0,08 0 10 309,53

P4-13 0,08 0,32 0 319,54

P4-14 0,08 0,32 5 279,71

P4-15 0,08 0,32 10 270,88

P4-16 0,08 0,64 0 260,07

P4-17 0,08 0,64 5 271,23

P4-18 0,08 0,64 10 223,73

P4-19 0,16 0 0 423,38

P4-20 0,16 0 5 377,91

P4-21 0,16 0 10 403,81

P4-22 0,16 0,32 0 333,25

P4-23 0,16 0,32 5 280,86

P4-24 0,16 0,32 10 247,09

P4-25 0,16 0,64 0 287,88

P4-26 0,16 0,64 5 250,67

P4-27 0,16 0,64 10 277,84


61

Em relação ao propilenoglicol, avaliando as formulações P4-02 e P4-03, foi possível

observar o mesmo comportamento relatado para os géis de papaína a 2%, havendo maior

diminuição da atividade proteolítica com a maior concentração do adjuvante (p<0,01).

A presença do cloridrato de cisteína mostrou efeito negativo, assim como para as

formulações de papaína a 2%. Foi observada a diminuição da atividade nas formulações

avaliadas P4-04 (p<0,001) e P4-07 (p<0,001), porém esta não foi proporcional à concentração

da cisteína, com redução de 21,94 e 26,77%, respectivamente. A tendência pode ser verificada

também quando avaliamos dois conjuntos P4-13 e P4-16 (p<0,05), e P4-22 e P4-25 (p<0,05),

que variam na concentração de cisteína e mantém fixos os outros valores. Nota-se que ocorre

diminuição na atividade com o aumento do adjuvante, tanto entre eles, quanto em relação à

formulação P4-01.

A análise das curvas de contorno e das superfícies de resposta do gel de papaína a 4%

(Figura 10 e Figura 11) demonstra um aumento da atividade proteolítica com o aumento da

concentração de EDTA (Figura 10a e b; e Figura 11a e b) e com a diminuição da

concentração de cisteína (Figura 10a e c; e Figura 11a e c), conforme também foi observado

para o gel de papaína a 2%. Neste caso, o propilenoglicol apresentou efeito na atividade,

principalmente pela sua interação com o EDTA dissódico, que podemos observar nas Figura

10b e Figura 11b. Essa interação se mostra mais efetiva em concentrações altas de EDTA e

concentrações baixas de propilenoglicol. Já em relação à cisteína, observa-se que a influência

do propilenoglicol é insignificante.

62



propilenoglicol.

63



propilenoglicol.

64

Como o ajuste do modelo para os géis de papaína 4% foi feito através de uma função

de 2ª ordem, tornou-se possível aplicar o teste de steepest ascent from ridge. Os resultados

encontram-se na Tabela 21.

Tabela 21. Resultados do teste de steepest ascent from ridge do gel de papaína a 4%.

Distância

Valores codificados Valores decodificados

ŷ x1 x2 x3

EDTA

dissódico*

Cloridrato de

cisteína* Propilenoglicol*

1 0,00 0,000 0,000 0,000 0,08000 0,32000 5,000 274,260

2 0,50 0,181 -0,444 -0,141 0,09488 0,17792 4,295 304,056

3 1,00 0,463 -0,840 -0,283 0,11704 0,05120 3,585 346,046

Legenda: x1 - EDTA dissódico / x2 - cloridrato de cisteína / x3 - propilenoglicol / ŷ - valor estimado da atividade

proteolítica da papaína em gel (UI/mg). * Resultados expressos em % (p/p).

Deste modo, com indicação estimada de um ponto ótimo de resposta, foi proposta a

formulação P4-28 para o estudo de estabilidade acelerada, contendo os adjuvantes técnicos

nas seguintes concentrações: EDTA dissódico 0,12%; cloridrato de cisteína 0,05%; e

propilenoglicol 3,58%.

5.4 Estudo de estabilidade acelerada

Foram selecionadas quatro formulações para o estudo de estabilidade acelerada: P2-

01, P2-20, P4-01 e P4-28 (Tabela 22). As amostras foram submetidas ao estudo de

estabilidade acelerada de 60 (sessenta) dias, sob as condições descritas no item 4.2.5.2. Os

resultados das avaliações realizadas estão descritos a seguir.

65

Tabela 22. Composição das formulações de gel de papaína selecionadas para o


Formulação

Concentração de

papaína (% p/p)

Concentração dos adjuvantes técnicos (% p/p)

EDTA

dissódico

Cloridrato de


P2-01 2 0,00 0,00 0,00

P2-20 2 0,08 0,00 5,00

P4-01 4 0,00 0,00 0,00

P4-28 4 0,12 0,05 3,58

5.4.1 Caracterização dos géis de papaína no tempo zero do estudo de estabilidade

acelerada

As formulações foram preparadas e acondicionadas em geladeira (5ºC ± 2ºC) por 48

horas, tempo necessário para estabilização da formulação, descrito por Capucho (2007). Após

este prazo, foram realizadas as análises no chamado tempo zero.

5.4.1.1 Características sensoriais

As formulações foram avaliadas em seu aspecto, cor e odor. Os resultados são

apresentados na Tabela 23. Todas as formulações apresentaram aspecto heterogêneo, ausência

de cor e odor característico da papaína.

Tabela 23. Avaliação das características sensoriais das

formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.

Característica Formulação

P2-01 P2-20 P4-01 P4-28

Aspecto He He He He

Cor I I I I

Odor C C C C

Legenda: He – heterogêneo / I – incolor / C – característico.

66

O aspecto heterogêneo dos géis desenvolvidos (Figura 12), caracterizado pela presença

de precipitados brancos, deve-se à papaína. Segundo Arnon (1970), a papaína apresenta

solubilidade em água igual a 10 mg/mL. A quantidade da enzima utilizada nas formulações é

superior a esta concentração, tornando sua solubilidade no meio apenas parcial. Foi descrito

por Pinto (2005), durante sua avaliação de estabilidade, um gel de papaína homogêneo e

transparente; esta formulação, porém, utilizava uma concentração de apenas 0,8% de papaína,

quantidade que atende à solubilidade citada anteriormente. Já Capucho (2007), na avaliação

prévia de suas formulações de géis de papaína com diferentes polímeros, descreve géis

opacos, levemente amarelados. Nos seus estudos, foi utilizada papaína a 1%, concentração

levemente acima da solubilidade da enzima, considerando o conteúdo total de água na

formulação. Ela realizou um estudo de uniformidade de conteúdo através da análise de dez

alíquotas de 1,0 g da formulação, obtendo coeficiente de variação igual a 4,96% e,

confirmando assim, a homogeneidade do princípio ativo no produto.

Avaliando isso, a formulação de papaína na forma farmacêutica gel apresenta uma

limitação de concentração, uma vez que um gel de característica heterogênea pode acarretar

em instabilidade da formulação e falta de precisão na dose administrada. Os géis de papaína,

entretanto, são amplamente utilizados para o tratamento de feridas (FERREIRA, 2005),

estando inclusive descritos no Formulário Nacional da Farmacopéia Brasileira em

concentrações de papaína que variam de 2 a 10%, alcançando valores muito superiores aos

utilizados neste estudo e, portanto, com maior tendência à separação de fases. Deste modo,

apesar da característica heterogênea descrita, optou-se por continuar os experimentos com as

formulações selecionadas.

67

Figura 12. Fotografias das formulações no tempo zero de análise - (a) P2-01; (b) P2-20; (c)

P4-01; (d) P4-28.

5.4.1.2 pH

A avaliação do pH das quatro formulações está na Tabela 24. Observa-se uma queda

dos valores de pH quando a concentração de papaína aumenta (formulações P4-01 e P4-28),

considerando seu pH levemente ácido. Também é possível notar um valor inferior para a

formulação P4-28, devido ao fato de ser a única que possui o cloridrato de cisteína na sua

composição; o cloridrato de cisteína anidro utilizado no estudo apresenta pH entre 1,5 e 2,0,

de acordo com o laudo do fabricante.

Tabela 24. Valores de pH das formulações P2-01, P2-

20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.

Formulação Valor de pH

P2-01 6,44

P2-20 6,48

P4-01 6,21

P4-28 6,10

68

5.4.1.3 Viscosidade aparente

As quatro formulações foram analisadas quanto às suas viscosidades aparentes, em

intervalo de velocidade de 0,6 a 100 rpm utilizando um viscosímetro tipo Brookfield. Os

resultados estão na Tabela 25 e na Figura 13. Para efeito de comparação, foram selecionados

os valores de viscosidade na velocidade de 100 rpm, pois estes apresentaram um percentual de

torque do aparelho mais próximo a 50%, o que possibilita uma melhor precisão na medida.

Tabela 25. Resultados da análise de viscosidade aparente das

formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.

Velocidade

(rpm)

Formulação

P2-01 P2-20 P4-01 P4-28

Viscosidade (mPa.s)*

0,6 815.673 (±127.148) 1.371.952 (±93.368) 1.899.618 (±185.360) 1.395.425 (±166.446)

1 658.683 (±81.728) 935.426 (±61.396) 1.276.980 (±61.395) 1.011.623 (±59.527)

1,5 521.756 (±53.286) 669.623 (±41.869) 902.013 (±41.687) 716.728 (±40.729)

2 431.130 (±38.681) 528.693 (±33.881) 703.522 (±32.513) 558.118 (±31.908)

2,5 365.745 (±29.037) 437.123 (±24.894) 577.945 (±27.738) 460.882 (±28.178)

3 319.793 (±23.098) 373.713 (±21.717) 495.577 (±23.054) 394.351 (±22.014)

4 257.565 (±15.333) 294.060 (±17.162) 389.912 (±18.056) 307.531 (±16.348)

5 216.127 (±10.462) 242.069 (±15.661) 322.688 (±15.538) 253.222 (±13.928)

6 187.666 (±8.805) 209.272 (±12.647) 276.683 (±14.002) 215.827 (±12.569)

10 125.202 (±6.427) 138.068 (±8.068) 182.313 (±9.836) 141.194 (±8.979)

12 108.638 (±5.269) 118.542 (±7.515) 156.983 (±8.677) 121.792 (±8.193)

20 73.186 (±3.346) 79.781 (±3.390) 104.289 (±6.385) 80.812 (±5.763)

30 53.297 (±2.295) 58.073 (±2.141) 75.847 (±4.954) 58.315 (±4.494)

50 36.214 (±1.973) 39.247 (±1.415) 50.829 (±3.829) 39.072 (±3.249)

60 31.315 (±2.013) 34.239 (±1.193) 44.717 (±2.627) 33.777 (±2.713)

100 21.559 (±1.460) 23.395 (±877) 30.341 (±1.924) 23.226 (±1.946)


69

Dentre os géis de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, não foi possível observar diferença

significativa (p>0,05) entre os valores de viscosidade. Já nos géis de papaína 4%, P4-01 e P4-

28, a segunda formulação apresentou uma viscosidade significativamente inferior (p<0,01),

que pode ser justificada pela presença do cloridrato de cisteína. Como relatado no item

5.4.1.2, a cisteína apresenta pH extremamente ácido, o que influencia diretamente na

formação da estrutura polimérica do gel. Segundo Ferreira (2008), o máximo de viscosidade e

transparência nos géis de Carbopol é alcançado em pH igual a 7,0; porém, aceitáveis

viscosidade e transparência iniciam em pH 4,5 a 5,0 e estendem-se até pH 11,0. Isto ocorre

devido à mudança estrutural dos polímeros de Carbopol frente ao uso de alcalinizante, que

ocorre pela neutralização dos seus grupos carboxilas, levando a uma distensão das moléculas.

Apesar de também apresentar propilenoglicol em sua composição, que levaria a um aumento

da viscosidade, o efeito negativo da cisteína sobre ela predominou, resultando em valores

comparáveis aos dos géis de papaína a 2%, que apresentam cerca de 20% a menos de

polímero.

Figura 13. Gráfico de viscosidade aparente x velocidade das formulações P2-01,

P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.

70

Como visto na Figura 13, todos os géis apresentaram comportamento pseudoplástico,

onde a viscosidade aparente diminui gradualmente, à medida que aumenta a velocidade de

cisalhamento. Portanto, eles atendem ao comportamento mais comum e desejável para uma

formulação semi-sólida de uso externo, necessário para que o produto espalhe facilmente

sobre a pele, porém não escorra (ANSEL, POPOVICH e ALLEN JR., 2000; AULTON,

2005).

5.4.1.4 Comportamento reológico

Foram obtidos os reogramas das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28, que se

encontram na Figura 14 a Figura 17. Os resultados de viscosidade aparente e tixotropia estão

demonstrados na Tabela 26.

Pode-se observar nos reogramas das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 que não

existe uma relação linear entre a tensão de cisalhamento e a taxa de cisalhamento,

caracterizando as mesmas como fluidos não-newtoniano. Nota-se também, confirmando os

resultados mostrados no item 5.4.1.3, o comportamento pseudoplástico de todas as

formulações.

Figura 14. Reograma da formulação P2-01 no tempo zero de análise.

71



72


Tabela 26. Valores referentes à viscosidade aparente (no ponto de máximo gradiente de

cisalhamento) e tixotropia para as formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28.

Formulação Viscosidade

aparente* (Pa.s)

Tixotropia*

(Pa/s)

P2-01 2,11 (±0,04) 1205,53 (±497,91)

P2-20 2,18 (±0,02) 3088,33 (±698,62)

P4-01 2,56 (±0,02) 8282,00 (±580,53)

P4-28 2,37 (±0,03) 3687,67 (±341,53)


Os reogramas mostram ainda que todas as formulações analisadas apresentam

tixotropia, que é característica de fluidos pseudoplásticos (FERREIRA, 2008; GASPAR e

MAIA CAMPOS, 2003). Segundo BORGHETTI e KNORST (2006), a tixotropia pode ser

caracterizada quando, em ciclos de velocidades de cisalhamento crescentes-decrescentes, o

braço descendente da curva é deslocado para posição inferior. Ela indica o desmonte da

estrutura tridimensional do sistema, tornando o produto mais fluido quando submetido à

pressão externa.

Através da análise dos reogramas, observamos que o referente à formulação P4-01

apresenta maior tixotropia, enquanto o da formulação P2-01 apresenta a menor. A constatação

73

visual confirma-se pelos valores na Tabela 26. A formulação P4-01 possui a maior

viscosidade aparente, o que resulta em um retorno mais lento à sua estrutura original,

conforme se diminui o cisalhamento. O oposto ocorre para a formulação P2-01, que tem a

menor viscosidade aparente, que recupera sua estrutura mais rapidamente.

Os resultados da viscosidade aparente das formulações foram semelhantes aos

apresentados no item 5.4.1.3, com exceção da formulação P4-01, que mostrou valor menor

que na análise anterior; diferença esta causada, provavelmente, pelo tipo de aparelho utilizado

em cada estudo.

5.4.1.5 Atividade proteolítica

Os valores da atividade proteolítica inicial das formulações P2-01, P2-20, P4-01 e P4-

28 estão representados na Tabela 27.

Tabela 27. Valores da atividade proteolítica das formulações

P2-01, P2-20, P4-01 e P4-28 no tempo zero.

Formulação Atividade proteolítica

(UI/mg)*

P2-01 240,72 (±1,35)

P2-20 243,66 (±2,80)

P4-01 334,72 (±2,87)

P4-28 453,00 (±22,86)


As formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, não apresentaram diferença

significativa entre si quanto à atividade proteolítica (p>0,05). Os resultados também foram

semelhantes aos obtidos no estudo de formulação (item 5.3.1). Neste caso, o uso de

adjuvantes técnicos não mostrou ser vantajoso em relação à formulação somente com o

princípio ativo, considerando apenas a análise no tempo zero de estudo.

Em relação aos géis de papaína a 4%, observa-se uma diferença significativa entre os

valores de atividade obtidos (p<0,001). Com a proposta da formulação P4-28, proveniente do

74

estudo de superfície de resposta (item 5.3.2), foi possível intensificar a atividade proteolítica

do gel em, aproximadamente, 135% em relação à formulação sem adição de adjuvantes

técnicos (P4-01). O resultado, inclusive, superou a expectativa criada pela análise de “steepest

ascent from ridge”, que indicou um resultado estimado da atividade proteolítica para a

formulação proposta igual a 346,046 UI/mg. Foi demonstrada, então, a eficiência do uso dos

adjuvantes técnicos no aumento da atividade proteolítica do gel de papaína a 4%, quando

considerado o tempo inicial de análise.

A comparação entre os géis de papaína a 2 e a 4% sem acréscimo de adjuvantes (P2-

01 e P4-01) nos mostra que a atividade proteolítica não aumenta proporcionalmente em

relação à concentração da papaína 6.000 UI/mg na formulação.

5.4.2 Avaliação das características sensoriais durante 60 dias de armazenamento dos

géis

Os resultados da avaliação das características sensoriais das formulações estudadas

estão representados na Tabela 28 a Tabela 31.

Tabela 28. Avaliação das características sensoriais da formulação P2-01 em 60 dias.

Condição de armazenamento

Geladeira (5ºC ± 2ºC) Ambiente (26ºC ± 2ºC) Estufa (45ºC ± 2ºC)

Início Tempo (dias) Tempo (dias) Tempo (dias)

0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60

Aspecto He He He He He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho

Cor I I I I I I LA LA LA LA LA A A

Odor C C C C LM C LM LM LM C LM LM LM

Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / C –

característico / LM – levemente modificado.

75





0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60


Cor I I I I I I LA LA LA LA LA A A

Odor C C C C LM C LM LM LM C LM LM M

Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / C –

característico / LM – levemente modificado.

Os géis de papaína a 2%, quando acondicionados a 5ºC ± 2ºC, apresentaram alteração

somente no odor após 60 dias de armazenamento. Os géis acondicionados a 26ºC ± 2ºC

sofreram alterações a partir do 15º dia de armazenamento, com modificações na cor e no odor.

Já naqueles acondicionados a 45ºC ± 2ºC, foram observadas alterações desde o 7º dia de

armazenamento na cor, e do 15º dia no odor. O comportamento entre eles foi semelhante,

exceto por uma alteração de odor mais intensificada na formulação P2-20 no 60º dia, quando

acondicionada a 45ºC ± 2ºC.

Foi observado que os géis acondicionados em temperaturas mais altas, 26ºC ± 2ºC e

45ºC ± 2ºC, apresentaram aspecto homogêneo, com ausência dos precipitados brancos

notados naqueles armazenados em geladeira (5ºC ± 2ºC). Sugere-se que, com o aumento da

temperatura, aumenta-se a solubilidade da papaína no meio, possibilitando sua total dispersão

no gel.

O aspecto dos géis P2-01 e P2-20 podem ser visualizados na Figura 18.

76

Figura 18. Fotografias das formulações de gel de papaína a 2%, P2-01 e P2-20, entre

os 7º e 60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ±

2ºC), temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC).

77





0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60


Cor I I I LA A A A A+ A+ A+ A+ A++ A+++

Odor C C C LM LM LM LM LM M LM LM LM M

Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / A+ –

cor amarela + / A++ – cor amarela ++ / A+++ – cor amarela +++ / C – característico / LM – levemente

modificado / M - modificado.





0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60


Cor I I I LA A A+ A++ A++ A++ A+++ A+++ A++++ A+++++

Odor C C LM LM LM LM LM M M LM M M M

Legenda: He – heterogêneo / Ho – homogêneo / I – incolor / LA – levemente amarelado / A – amarelado / A+ –

cor amarela + / A++ – cor amarela ++ / A+++ – cor amarela +++ / A++++ – cor amarela ++++ / A+++++ – cor

amarela +++++ / C – característico / LM – levemente modificado / M - modificado.

Para os géis de papaína a 4%, observou-se o início das alterações nas características

sensoriais em prazo inferior aos géis de papaína a 2%. Mesmo com acondicionamento a 5ºC ±

2ºC, a formulação P4-28 apresentou alteração no odor no 15º dia de armazenamento,

enquanto a P4-01 teve alterações na cor e no odor no 30º dia. As evidentes alterações no odor

dos géis P4-28 podem estar relacionadas à presença do cloridrato de cisteína, que possui um

cheiro característico forte, semelhante ao enxofre.

Ambas as formulações, quando acondicionadas em temperatura ambiente e estufa

(26ºC ± 2ºC e 45ºC ± 2ºC, respectivamente), mostraram alterações na cor e no odor desde o 7º

dia de armazenamento, sendo as das acondicionadas em estufa mais intensas.

78

Em comparação com a formulação P4-01, as modificações ocorridas na formulação

P4-28 foram mais intensas em todas as temperaturas de acondicionamento, tanto para o

parâmetro cor quanto odor. A intensa modificação da coloração pode ser constatada na Figura

19. Este fato pode ser atribuído à presença do cloridrato de cisteína, utilizado também pela sua

função antioxidante na formulação. A cisteína é um antioxidante que atua por mecanismo

preventivo, ou seja, interfere na iniciação da reação radicalar em cadeia (BERNARDI, 2007;

CARDOSO, 1996; FERREIRA, 2008). Em presença de ar ou em solução aquosa alcalina ou

neutra, ela sofre processo de oxidação, convertendo-se em cistina (MENDES, 2008). O pH

dos géis, próximo ao neutro, além da presença de ar no interior das bisnagas pode ter

influenciado no processo de oxidação da cisteína. Deve-se também considerar o fator

temperatura, que potencializou as alterações sensoriais das formulações, principalmente

daquela contendo cisteína. Portanto, mesmo sofrendo maiores alterações na cor e no odor e

indicando maiores percentuais de perda de atividade (ver item 5.4.5), os géis P4-28

apresentaram valores superiores de atividade proteolítica em relação aos géis P4-01.

Assim como para os géis de papaína a 2%, quando armazenados a 26ºC ± 2ºC e 45ºC

± 2ºC, nas formulações P4-01 e P4-28 foi verificada ausência de precipitados brancos, que

estão presentes nos géis armazenados em geladeira. Apesar da maior concentração do

princípio ativo em relação a P2-01 e P2-20, provavelmente o aumento de temperatura foi

suficiente para aumentar a solubilidade da papaína e fornecer géis homogêneos.

79

Figura 19. Fotografias das formulações de gel de papaína a 4%, P4-01 e P4-28, entre

os 7º e 60º dias do estudo de estabilidade, nos armazenamentos em geladeira (5ºC ±

2ºC), temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e estufa (45ºC ± 2ºC).

80

5.4.3 Avaliação dos valores de pH durante 60 dias de armazenamento dos géis

Os valores de pH das formulações, nas diferentes condições de armazenamento, estão

apresentados na Tabela 32 a Tabela 35.

Não foram verificadas grandes variações nos valores de pH das formulações avaliadas.

Os maiores percentuais de variação foram observados para os géis de papaína a 2%, P2-01 e

P2-20, quando acondicionados em estufa (45ºC ± 2ºC), após 60 dias de armazenamento, com

valores de 4,35 e 5,25%, respectivamente.

Tanto para os géis de papaína a 2% quanto para os géis a 4%, foram notadas maiores

variações de pH nas formulações sem adição de adjuvantes técnicos. A formulação que

apresentou menor variação durante os 60 dias, em todas as temperaturas de

acondicionamento, foi a P4-28; esta também foi a única formulação que apresentou aumento

dos valores de pH, provavelmente devido à degradação do cloridrato de cisteína.

Tabela 32. Valores de pH e seus percentuais de variação para formulação P2-01.




0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60

pH 6,44 6,27 6,25 6,28 6,18 6,24 6,30 6,32 6,20 6,27 6,32 6,30 6,16

% variação - 2,64 2,95 2,48 4,04 3,11 2,17 1,86 3,73 2,64 1,86 2,17 4,35





0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60

pH 6,48 6,36 6,35 6,38 6,36 6,38 6,34 6,39 6,35 6,40 6,35 6,36 6,14

% variação - 1,85 2,01 1,54 1,85 1,54 2,16 1,39 2,01 1,23 2,01 1,85 5,25

81





0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60

pH 6,21 6,11 6,12 6,13 6,09 6,11 6,11 6,12 6,09 6,10 6,11 6,11 6,08

% variação - 1,61 1,45 1,29 1,93 1,61 1,61 1,45 1,93 1,77 1,61 1,61 2,09





0 dias 7 15 30 60 7 15 30 60 7 15 30 60

pH 6,10 6,15 6,14 6,14 6,19 6,13 6,15 6,15 6,22 6,12 6,12 6,13 6,12

% variação - 0,82 0,66 0,66 1,48 0,49 0,82 0,82 1,97 0,33 0,33 0,49 0,33

5.4.4 Avaliação da viscosidade aparente durante 60 dias de armazenamento dos géis

Como descrito no item 5.4.1.3, foram selecionados os valores de viscosidade aparente na

velocidade de 100 rpm para realizar a avaliação dos resultados. Esses resultados estão

expostos na Figura 20 a Figura 23.

As formulações de gel de papaína a 2% não mostraram muita variação de viscosidade

aparente durante os 60 dias de estudo, nas condições determinadas. Inicialmente, verifica-se

que não há diferença significativa (p>0,05) entre os valores de viscosidade aparente das

formulações P2-01 e P2-20.

Observa-se uma alteração significativa da P2-01 somente no 7º dia de análise, quando

houve o aumento dos valores de viscosidade dos géis armazenados em temperatura ambiente

(26ºC ± 2ºC) (p<0,001) e em estufa (45ºC ± 2ºC) (p<0,001). Esta alteração, porém, foi

pontual e não foi notado nenhum padrão de relação com o tempo e a temperatura. Um

82

comportamento semelhante é observado para a formulação P2-20, onde há pequena oscilação

dos valores de viscosidade, porém sem relação com o tempo e a temperatura.

Corrêa e colaboradores (2005), em estudo com géis de Carbopol® 940 a 0,5 e 1,0%,

armazenados a 25 e 40ºC durante 28 dias, relataram que a temperatura e o tempo de

armazenamento não influenciam na viscosidade aparente dos géis. Em resultados obtidos por

Pinto (2005) no estudo de estabilidade de papaína 0,8% em gel de Carbopol ® 940 0,6%,

houve pouca variação nos dados de viscosidade aparente durante 90 dias de armazenamento

em geladeira (5ºC ± 1ºC), com valores entre 6300 a 7100 Cp, sem relação específica com o

tempo.

Realizando a comparação das viscosidades aparentes dos géis P2-01 e P2-20

armazenados em estufa (45ºC ± 2ºC), no 60º dia, com a viscosidade aparente inicial de cada,

verifica-se uma maior manutenção do resultado relativo à segunda formulação, com 8,00 e

1,14% de variação, respectivamente. Este fato pode ser atribuído à presença do

propilenoglicol no gel P2-20. O propilenoglicol mostrou não interferir diretamente na

atividade proteolítica da papaína, porém atua como agente umectante na formulação. Com

esta ação, ele é responsável pela retenção da água no produto, garantindo a conservação da

sua viscosidade e, consequentemente, uma boa estabilidade física para o mesmo (CORRÊA et

al., 2005).


durante 60 dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.

83



Para as formulações de gel de papaína a 4%, nota-se, entre elas, uma diferença

significativa dos valores de viscosidade aparente somente para os géis armazenados em

geladeira (5ºC ± 2ºC) no tempo zero (p<0,01) e no 7º dia (p<0,05). A formulação P4-01

apresenta valores superiores de viscosidade, com manutenção do valor inicial (p>0,05) até o

7º dia de armazenamento em geladeira. Enquanto isso, a P4-28 se aproxima da viscosidade

dos géis de papaína 2%. Como foi explicado no item 5.4.1.3, este fato pode estar relacionado

à presença do cloridrato de cisteína, que apresenta pH extremamente ácido, diminuindo a

viscosidade do gel.

Assim como nos géis de papaína a 2%, comparando-se as viscosidades aparentes dos

géis P4-01 e P4-28 armazenados em estufa (45ºC ± 2ºC), no 60º dia, com a viscosidade

aparente inicial de cada, há maior manutenção da viscosidade da formulação composta por

propilenoglicol. Neste caso, observam-se variações mais distintas, iguais a 18,18% para P4-

01, e 5,64% para P4-28.

.

84





85

5.4.5 Avaliação da atividade proteolítica durante 60 dias de armazenamento dos géis

Os resultados obtidos no teste de atividade proteolítica da papaína são apresentados a

seguir (Tabela 36 a Tabela 39 e Figura 24 a Figura 27).


diferentes temperaturas de armazenamento.

Dia

Atividade proteolítica (UI/mg)*


Geladeira

(5ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Ambiente

(26ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Estufa

(45ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

0 240,72 (±1,35)

7 260,81 (±4,58) 108,34 228,32 (±21,22) 94,85 216,70 (±2,93) 90,02

15 257,19 (±2,86) 106,84 229,04 (±5,39) 95,15 205,21 (±2,18) 85,25

30 212,65 (±3,02) 88,34 206,41 (±6,53) 85,74 197,09 (±1,78) 81,87

60 209,78 (±5,42) 87,15 205,33 (±3,12) 85,30 195,24 (±1,82) 81,11




Dia



Geladeira

(5ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Ambiente

(26ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Estufa

(45ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

0 243,66 (±2,80)

7 233,48 (±13,62) 95,82 227,35 (±4,04) 93,31 205,01 (±6,14) 84,14

15 232,07 (±5,44) 95,24 227,98 (±20,86) 93,57 205,25 (±5,22) 84,23

30 221,80 (±7,89) 91,03 207,58 (±6,17) 85,19 204,02 (±5,06) 83,73

60 209,66 (±5,30) 86,05 206,93 (±1,39) 84,93 203,07 (±4,40) 83,34


Na análise dos géis de papaína a 2%, verifica-se que, durante o estudo de estabilidade

acelerada, a formulação proposta para melhorar a atividade proteolítica da papaína não se

mostrou vantajosa. Como visto no item 5.4.1.5, no tempo inicial do estudo, os géis P2-01 e

86

P2-20 não apresentaram diferença significativa (p>0,05) quanto à atividade proteolítica. Este

comportamento foi alterado somente para os géis armazenados em geladeira, nos 7º e 15º

dias, quando a formulação P2-01 apresentou aumento significativo (p<0,001 e p<0,01,

respectivamente) da atividade em relação à P2-20.


dias, em diferentes temperaturas de armazenamento.



87

Tanto para a formulação P2-01, quanto para a P2-20, verifica-se maior perda de

atividade proteolítica conforme aumenta-se a temperatura de armazenamento. Este fato já era

esperado, já que com o aumento da temperatura, se favorece a degradação da papaína. Em

estudo realizado por Capucho (2007), foram armazenadas amostras de papaína de dois

fornecedores distintos, em temperaturas de 4ºC, 30ºC (70% UR) e 40ºC (70% UR) durante 30

dias. Após este tempo, as matérias-primas acondicionadas a 4ºC não apresentaram perda de

atividade, enquanto aquelas armazenadas em temperaturas superiores tiveram redução de

23,06 até 61,54% da atividade.



Dia



Geladeira

(5ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Ambiente

(26ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Estufa

(45ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

0 334,72 (±2,87)

7 363,82 (±17,43) 108,69 269,48 (±7,00) 80,51 212,82 (±8,47) 63,58

15 312,24 (±15,31) 93,28 234,72 (±12,60) 70,13 211,65 (±9,48) 63,23

30 263,63 (±3,16) 78,76 232,76 (±1,55) 69,54 208,50 (±5,54) 62,29

60 237,23 (±27,44) 70,87 229,47 (±16,90) 68,55 205,27 (±21,69) 61,32




Dia



Geladeira (5ºC

± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Ambiente

(26ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

Estufa

(45ºC ± 2ºC)

% da

atividade

inicial

0 453,00 (±22,86)

7 302,37 (±7,29) 66,75 300,34 (±10,67) 66,30 271,25 (±12,55) 59,88

15 317,03 (±3,25) 69,98 281,25 (±10,33) 62,09 264,98 (±0,63) 58,50

30 270,97 (±0,86) 59,82 270,74 (±16,70) 59,77 254,12 (±12,16) 56,10

60 264,55 (±12,84) 58,40 263,38 (±7,65) 58,14 239,61 (±5,27) 52,89


88

Ao contrário do ocorrido com o gel de papaína a 2% proposto (P2-20), a formulação

P4-28 mostrou-se eficiente em melhorar a atividade proteolítica do gel, como observamos no

tempo inicial de análise (item 5.4.1.5). Contudo, durante o tempo do estudo de estabilidade

acelerada, não houve manutenção desse benefício. Mesmo o gel armazenado em geladeira

(5ºC ± 2ºC) apresentou uma perda de 33,25% da atividade inicial ainda no 7º dia. Após os 60

dias de estudo, observou-se perda de quase 50% da atividade no gel acondicionado em estufa

(45ºC ± 2ºC).

Apesar do grande percentual de perda, a formulação P4-28 ainda apresentou valores

absolutos de atividade proteolítica maiores que os obtidos na formulação sem adjuvantes

técnicos, P4-01, principalmente para aqueles armazenados em maiores temperaturas. Para as

formulações acondicionadas em temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC) e em estufa (45ºC ± 2ºC),

os valores superiores de atividade dos géis P4-28 foram observados até o 30º dia (p<0,05 e

p<0,01, respectivamente). A exceção foram os géis armazenados em geladeira, no 7º dia de

análise, quando a formulação P4-01 apresentou um valor significativamente maior (p<0,001).

Assim como no gel de papaína a 2% sem adjuvantes (P2-01), foi observado no gel P4-01 um

aumento da atividade proteolítica no 7º dia, para a amostra armazenada em geladeira (5ºC ±

2ºC). Este acréscimo foi suficiente para superar a atividade do gel P4-28, porém este fato foi

pontual e não se repetiu para os outros dias.

Do mesmo modo que nos géis de papaína a 2%, verificou-se a influência da

temperatura na manutenção da atividade proteolítica dos géis, onde o aumento da temperatura

resultou em maior perda de atividade. Esta relação ficou mais evidente na formulação P4-01,

onde os valores da atividade enzimática dos géis acondicionados em geladeira foram

significativamente maiores do que aqueles armazenados em estufa, até o 60º dia do estudo

(p<0,05).

Para a formulação P4-28, exceto no 15º dia de análise (p<0,01), nota-se ausência de

diferença significativa (p>0,05) entre os valores de atividade dos géis armazenados em

geladeira (5ºC ± 2ºC) e em temperatura ambiente (26ºC ± 2ºC). A comparação entre os géis

armazenados em geladeira e em estufa (45ºC ± 2ºC) demonstra que, a partir do 30º dia de

armazenamento, não existe diferença significativa (p>0,05) entre os valores de atividade

proteolítica. Esta evidência pode estar relacionada ao uso do EDTA dissódico e do cloridrato

de cisteína que, segundo Ferreira (2008), atuam como antioxidantes sinergistas e, desta ação,

houve a diminuição do efeito da temperatura na degradação da papaína.

89





Em estudos prévios (CAPUCHO, 2007; PINTO, 2005; VELASCO, 1993), foi visto

que os géis de papaína sofrem ação do tempo e da temperatura, resultando em perda da

atividade proteolítica.

90

Capucho (2007) avaliou a estabilidade da papaína em géis de Pluronic® F127 e

Carbopol® 940, armazenados a 4, 30 e 40ºC durante oito meses. Ela concluiu que as

formulações armazenadas a 4ºC foram estáveis por 6 meses, sendo que o gel de Carbopol®

940 proporcionou maior estabilidade que o Pluronic® F127; as formulações armazenadas a 30

e 40ºC mostraram perda considerável e suas análises foram interrompidas no 4º mês. Durante

o período do estudo, a atividade proteolítica do gel de papaína em Carbopol® 940 decaiu em

um intervalo de 450 a 350 UI/grama de formulação. Esta pequena redução, contudo, pode

estar relacionada não à estabilidade da formulação, e sim à baixa capacidade de recuperação

do método analítico utilizado.

No estudo de estabilidade realizado por Pinto (2005), com gel de papaína 0,8% em

Carbopol® 940, verificou-se uma redução significativa da atividade proteolítica da formulação

armazenada somente em geladeira (5ºC ± 1ºC), durante 90 dias. No 7º dia, havia 90,30% da

atividade inicial; nos 15º e 30º dias, 82,72%; no 60º dia, 67,07%; e no 90º dia, 70,09%. Seus

resultados mostram perda superior aos encontrados para as formulações P2-01, P2-20 e P4-

01. Neste caso, pode-se supor que o uso do cloridrato de cisteína a 0,16% tenha afetado o

resultado; como foi observado nos estudos de superfície de resposta (itens 5.3.1 e 5.3.2), a

cisteína influencia negativamente a atividade proteolítica da papaína.

É importante ressaltar que, em todos os estudos anteriores, a máxima concentração de

papaína avaliada em formulações foi de 1%, sendo mais usual a 0,8% (CAPUCHO, 2007;

JÁUREGUI et al., 2009; PINTO, 2005; RUAS et al., 2006; SIM et al., 2000; TRAVERSA,

2003; VELASCO, 1993). A exceção foi o experimento feito por Zulli (2007), com matrizes

poliméricas incorporadas com papaína a 2%; entretanto, não foi realizado um estudo de

estabilidade dessas membranas. Em baixas concentrações, a enzima tem aplicação para uso

cosmético, e não como um medicamento para o tratamento de feridas.

Recentemente, foram inclusas as fórmulas de gel de papaína 2% a 10% ao Formulário

Nacional da Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2011). Elas são compostas por papaína (2 a 10

g) e gel de carbômer (q.s.p. 100 g), com ajuste para valor de pH igual a 5. Ressalta-se o

cuidado com a conservação da papaína, com informação de inativação da mesma por agentes

oxidantes como ferro, oxigênio e iodo. Recomenda-se acondicionamento sob refrigeração, em

embalagem plástica perfeitamente fechada. As indicações são para úlceras por pressão,

diabética, venosa, arterial e queimaduras. A finalidade das fórmulas é para uso externo, com

91

aplicação sobre a lesão, seguida de oclusão, e troca do curativo após um dia com lavagem

com soro fisiológico.

Entretanto, o Formulário Nacional não faz nenhuma referência quanto à estabilidade

desses produtos (BRASIL, 2011). As formulações P2-01 e P4-01 reproduzem aquelas

recomendadas pelo Formulário Nacional, com exceção da presença de propilenoglicol; o gel

de carbômer descrito no Formulário possui propilenoglicol a 5% em sua composição. Porém,

como foi observado durante o presente estudo, a presença deste adjuvante técnico não

influencia a atividade proteolítica da papaína; ele tem papel importante apenas na manutenção

da viscosidade do produto.

Quando são avaliados os resultados do estudo de estabilidade dos géis de papaína a

2%, constata-se que a formulação P2-20, proposta para otimização da atividade proteolítica,

não apresentou o resultado esperado. Em comparação com o gel P2-01, este obteve melhor

desempenho durante os 60 dias de análise, mostrando que a adição dos adjuvantes técnicos é

dispensável neste caso. Para os géis de papaína a 2%, portanto, a comparação com as

formulações avaliadas mostra que a fórmula proposta pelo Formulário Nacional apresenta-se

como a melhor opção.

Já para os géis de papaína a 4%, com a formulação P4-28 proposta, observou-se uma

intensa melhora em relação àquela sem adição dos adjuvantes técnicos (P4-01). Este aumento

da atividade proteolítica, entretanto, não foi mantido durante o estudo de estabilidade, com

queda acentuada logo no 7º dia de análise. Apesar da queda significativa, o gel P4-28 ainda

apresentou melhores resultados em relação ao P4-01. Neste caso, comparando-se os

resultados dos géis analisados, o uso dos adjuvantes mostrou que a fórmula descrita no

Formulário Nacional pode ser aprimorada, gerando um melhor desempenho quanto à

atividade proteolítica da papaína.

92

6. CONCLUSÕES

O método de determinação da atividade proteolítica da papaína através da medida da

fluorescência em microplacas, utilizando o cloridrato de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-

arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA) como substrato, é aplicável a

formulações em gel de Carbopol® 940 contendo papaína nas concentrações de 2 e 4%.

Com os estudos de formulação, verificou-se a necessidade de adequação da

concentração de Carbopol® 940 de acordo com as concentrações de papaína e dos adjuvantes

técnicos, para que o produto apresente uma viscosidade adequada para o uso.

Na análise pontual após 48 horas de preparo dos géis de papaína a 2 e a 4%,

considerando as concentrações utilizadas de cada adjuvante técnico, o EDTA dissódico

apresentou influência positiva na atividade proteolítica da enzima, enquanto o cloridrato de

cisteína teve influência negativa. O propilenoglicol não interferiu nos resultados.

Durante os 60 dias de análise, as quatro formulações avaliadas no estudo de

estabilidade acelerada apresentaram boa estabilidade física, com manutenção dos valores de

viscosidade aparente e pH, porém observou-se considerável perda dos valores de atividade

proteolítica, mesmo para aqueles armazenados a 5ºC ± 2ºC.

O uso do adjuvante técnico, EDTA dissódico não demonstrou eficiência na

manutenção da atividade proteolítica da papaína em concentração igual a 2% veiculada em

gel de Carbopol® 940, nas condições avaliadas no estudo de estabilidade acelerada.

Para o gel de papaína a 4%, utilizando os adjuvantes nas concentrações ideais

apontadas pelo estudo de superfície de resposta, houve um aumento considerável na atividade

proteolítica inicial, porém não ocorreu a manutenção esta atividade ao longo do tempo do


Os géis de papaína a 2 e a 4% devem ser armazenados em baixa temperatura (5ºC ±

2ºC) na tentativa de reduzir a perda da atividade enzimática dos produtos.

93

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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