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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO – UNINOVE
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
CAROLINE SOBRAL DE MELO RAMBO
ANÁLISE DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA (660nm) SOBRE A
EXPRESSÃO DE BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS NO PROCESSO DE
CICATRIZAÇÃO: ESTUDO COMPARATIVO ENTRE RATOS JOVENS E IDOSOS
São Paulo, SP
2013
ii
CAROLINE SOBRAL DE MELO RAMBO
ANÁLISE DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA (660nm) SOBRE A
EXPRESSÃO DE BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS NO PROCESSO DE
CICATRIZAÇÃO: ESTUDO COMPARATIVO ENTRE RATOS JOVENS E IDOSOS
Dissertação apresentada à Universidade Nove
de Julho para a obtenção do título de Mestre em
Ciências da Reabilitação. Orientador: Prof. Dr.
Paulo de Tarso Camillo de Carvalho
São Paulo, SP
2013
iii
iv
v
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Lúcio Rambo e Denise Rambo,
meu alicerce de amor mais puro,
minha eterna gratidão e admiração. Amo vocês.
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus, por iluminar o meu caminho, guiando sempre os meus passos.
À Nossa Senhora das Graças por me confortar nos momentos difíceis e
me cobrir com seu infinito amor.
Aos Meus pais Lúcio e Denise, e irmãos Elisabeth e Felipe pelo incentivo
e apoio incondicional.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Paulo de Tarso Camillo de Carvalho, por me
abrir as portas para a vida acadêmica, pela confiança oferecida, dedicação,
amizade, paciência e pela soma de fatores que me fizeram engrandecer
pessoalmente e profissionalmente. Registro aqui toda a minha admiração e
agradecimento pelo convívio e conhecimento adquirido.
Aos professores do Laboratório, Prof. Dr. José Antônio, Prof. Dr.
Rodolfo Vieira, Prof. Dr. Andrey, pela ajuda na realização das análises, e Prof.
Dr. Ernesto Júnior, Profa. Dra. Regiane Albertini, Prof. Dr. Rodrigo Labat e
Profa. Dra. Ana Paula, pelos ensinamentos transmitidos.
Às técnicas do laboratório Ângela e Luciana, que sempre estiveram
dispostas a me auxiliar nos experimentos.
Aos professores da Pós-graduação em Ciências da Reabilitação e
Biofotônica da Uninove, pelo convívio e enriquecedora colaboração
profissional.
Às amigas e amigos do laboratório, Araruna e Dora, pela grande
amizade, aprendizado e convívio diário, Deise, Flávia, Andréia, Dri, Paula,
Camila, Nadhia, Nickele, Agnelo, Marcelo, Bia, Martha, pela amizade,
experiências trocadas, e pelas palavras de carinho e força.
À Uninove pelo apoio e por ter me concedido a bolsa de estudos.
À Capes pelo auxílio financeiro.
Meus sinceros agradecimentos.
vii
“A gente sempre deve sair à rua como quem foge de casa,
Como se estivessem abertos diante de nós todos os caminhos do mundo.
Não importa que os compromissos, as obrigações, estejam ali...
Chegamos de muito longe,
de alma aberta e o coração cantando!”
Mário Quintana.
viii
RESUMO
Uma correlação inversa entre a idade e a cura de feridas tem sido discutida, no que
se diz respeito à associação do envelhecimento com uma diminuição gradual da
capacidade de cicatrização. A laserterapia de baixa potência tem sido indicada para
a cicatrização de feridas através da indução de um aumento na atividade mitótica,
número de fibroblastos, síntese de colágeno e neovascularização. Objetivamos
neste estudo analisar e comparar o efeito da laserterapia de baixa potência na
cicatrização de feridas cutâneas, utilizando um modelo experimental em ratos jovens
e idosos. Foram utilizados 60 ratos, machos, dos quais foram 30 jovens (30 dias) e
30 idosos (500 dias). Os animais foram distribuídos em quatro grupos experimentais,
e submetidos à ferida cutânea e tratamento com laser (660nm, 30 mW , 1.07 W/cm2
, 0.028 cm2 , 72 J/ cm2, 2 J). Foram realizadas análises para verificar os efeitos do
Laser no processo de reparação tecidual, sobre a expressão proteica das citocinas
TNF-α, IL-1β e IL-10 e expressão gênica das citocinas TNF-α e IL-1β, obtidas no
modelo de ferida cutânea. Os resultados mostraram que houveram diferenças
significativas entre os grupos controles jovem e idoso e seus respectivos grupos
tratados. Podemos concluir que a laserterapia acelerou o processo de reparação
tecidual, reduziu a expressão gênica e proteica das citocinas IL-1β e TNF-α e
aumentou a expressão proteica da citocina IL-10 em ambos os grupos tratados
(jovem e idoso), no entanto no grupo jovem tratado os resultados foram mais
expressivos.
Palavras - Chave: Cicatrização de feridas; laser de baixa potência; citocinas; idoso.
ix
ABSTRACT
An inverse correlation between age and wound healing has been discussed, as it
relates to the association of aging with a gradual decrease in healing capacity. Low-
level laser therapy has been indicated for wound healing by inducing an increase in
mitotic activity, a number of fibroblasts, collagen synthesis and neovascularization.
The aim of this study was to analyze and compare the effect of low level laser
therapy on wound healing using an experimental model in young and aged rats .A
total of 60 male rats, of which were 30 young (30 days) and 30 aged (500 days) was
used . The animals were divided into four experimental groups and underwent skin
wound and treatment with Laser (660nm, 30 mW, 1.07 W/cm2 , 0.028 cm2 , 72 J/
cm2, 2 J) . Analyses were conducted to verify the effects of LLLT in the tissue repair
process, in the gene expression and protein expression of TNF - α, IL - 1β and IL- 10
,obtained in skin wound model .The results showed that there were significant
differences between the young control group and the aged control group and their
respective trated groups ( young and aged).We conclude that low level laser therapy
accelerated the process of tissue repair , reduced gene and protein expression of IL -
1β and TNF - α and increased protein expression of IL - 10 in both treated groups
(young and aged) , however in young treated group the results were more
expressive.
Key Words: Wound; Healing; LLLT; Citokines; Aged.
x
SUMÁRIO
Lista de Figuras.................................................................................................... i
Lista de Tabelas.................................................................................................... ii
Lista de Abreviaturas e Siglas............................................................................ iii
1. Introdução...................................................................................................... 16
2. Revisão da Literatura.................................................................................... 20
2.1. Processo de Cicatrização de feridas normal................................... 20
2.2. Importância dos mediadores inflamatórios na resposta
inflamatória................................................................................................
21
2.3. Cicatrização no idoso........................................................................ 22
2.3.1. Alterações do Envelhecimento da Pele................................. 22
2.3.2. Impacto do envelhecimento na Cicatrização de feridas......... 23
2.3.3. Mediadores Inflamatórios no Processo de cicatrização do
idoso.............................................................................................
25
2.4. Laserterapia de Baixa Potência (LBP).......................................... 26
2.5 Atuação do Laser de baixa potência (LBP) no processo de
Cicatrização........................................................................................
28
2.6. Atuação da Laserterapia de baixa potência (LBP) em Mediadores
Inflamatórios......................................................................................
30
3. Objetivos.............................................................................................. 31
3.1 Objetivos Específicos................................................................... 31
4. Material e Métodos................................................................................ 31
4.1 Animais de experimentação..................................................... 31
4.2 Grupos experimentais............................................................. 32
4.3 Procedimentos............................................................................. 33
4.3.1 Produção das feridas cutâneas............................................. 33
4.3.2 Aplicação do Laser .............................................................. 34
4.3.3 Eutanásia.............................................................................. 36
4.3.4 Procedimentos Histológicos................................................. 37
4.3.5 Avaliação dos níveis de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-
1β e IL-10) da ferida cutânea- ELISA
37
4.3.6 RT- PCR em tempo real (qRT- PCR) das citocinas IL1-β e
TNF-α
38
4.3.7 Análise Estatística................................................................ 39
xi
5. Artigo Submetido................................................................................. 40
6. Discussão............................................................................................ 73
7. Conclusão............................................................................................ 78
8. Referências Bibliográficas……………………………………………………. 79
9. Anexos…………………………………………………………………………….. 87
i
Lista de Figuras
Figura 1. Composição dos grupos experimentais........................................ 33
Figura 2. Aplicação do Laser.......................................................................... 35
Figura 3. Tratamento com Laser de baixa potência...................................... 36
Figura 4. Microfotografias da pele de rato submetida à ferida cutânea
cirúrgica, 3 dias após a lesão.........................................................................
88
Figura 5. Microfotografias da pele de rato submetida à ferida cutânea
cirúrgica, 7 dias após a lesão.........................................................................
90
Figura 6. Microfotografias da pele de rato submetida à ferida cutânea
cirúrgica, 14 dias após a lesão.........................................................................
92
Figura 7. Comparações de médias e desvios padrão da expressão
proteica da interleucina-1β e Fator de necrose tumoral alfa, obtidos
utilizando o ensaio imunoenzimático.............................................................
93
Figura 8. Comparações de médias e desvios padrão da expressão gênica
da Interleucina-1β e fator de necrose tumoral alfa, obtidos utilizando a
Reação em cadeia da polimerase em tempo real...........................................
94
Figura 9. Comparação de médias e desvios padrão da expressão proteica
da Interleucina-10, obtida utilizando o ensaio imunoenzimático.
95
ii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Parâmetros do Laser.............................................................
34
Tabela 2. Primers utilizados no RT- PCR em tempo real ( qRT- PCR)
37
iii
Lista de Abreviaturas e Siglas
AMs
cDNA
COX
DNA
DNase
dNTP
EGF
ELISA
EROs
FGF
GAPDH
HCl
InGaAIP
IL
IL -1
IL- 2
IL -4
IL-1β
IL-6
IL-8
IL-10
ICAM-1
iNOS
J
LBP
MEC
MMPs
MgCl2
mRNA
mW
Moléculas de Adesão
DNA complementar
Ciclo-oxigenase
Ácido Desoxirribonucleico
Desoxirribonuclease
Desoxinucleotídeo
Fator de crescimento epidérmico
Teste imunoenzimático
Espécies reativas de oxigênio
Fator de crescimento de fibroblastos
Gliceraldeído fosfato-3 desidrogenase
Ácido Clorídrico
Fosfeto- Indio- Gálio- Alumínio
Família das interleucinas
Interleucina -1
Interleucina -2
Interleucina- 4
Interleucina-1 beta
Interleucina-6
Interleucina- 8
Interleucina-10
Molécula de Adesão Intercelular-1
Síntese induzível de óxido nítrico
Joule
Laserterapia de Baixa Potência
Matriz Extracelular
Metaloproteinases da Matriz
Cloreto de magnésio
RNA mensageiro
milliwatt
iv
nm
PDGF
PGE2
PGI2
Real-time PCR
RNA
RS
TGF-β
TNF-α
TXA2
VCAM-1
VEGF
W
nanômetro
Fator de crescimento derivado de plaquetas
Prostaglandina E2
Prostaglandina 12
Reação em cadeia da transcrição reversa da polimerase
em tempo real
Ácido Ribonucleico
Espécies Reativas
Fator de crescimento transformador beta
Fator de Necrose tumoral Alfa
Tromboxano A2
Molécula de Adesão Celular Vascular
Fator de crescimento endotelial vascular
Watt
15
1. INTRODUÇÃO
A cicatrização de feridas é um processo complexo que tem atraído a atenção
de pesquisadores por muitos anos, principalmente sobre os fatores que retardam ou
impedem este processo. Uma correlação inversa entre a idade e a cura de feridas
tem sido discutida, no que se diz respeito à associação do envelhecimento com uma
diminuição gradual da capacidade de cicatrização, o que resulta em significativa
morbidade e mortalidade em idosos (SOYBIR et al., 2011).
O processo de cicatrização no idoso está associado com uma proteólise
aumentada e degradação de constituintes da matriz, devido ao excesso de
inflamação e leucócitos. A reepitelização e neovascularização atrasadas, são outras
características que alteram a relação de populações de macrófagos e comprometem
a migração de fibroblastos (ASCROFT; MILLS; ASHWORTH, 2002).
As estruturas da pele e funções normais sofrem uma mudança gradual à
medida que ocorre o envelhecimento, e devido a estas mudanças estruturais e
funcionais, os processos de reparação dos tecidos também são alterados. A taxa de
proliferação de fibroblastos diminui, o que, portanto, diminui a sua taxa e qualidade
da produção de colágeno. A contração da ferida ocorre de forma mais lenta, a
deposição de tecido conjuntivo é atenuada, e a resistência à tração da ferida é
diminuída (WORLEY, 2006).
Os fibroblastos são o principal tipo de célula na derme e desempenham um
papel fundamental na fisiologia da pele, isto é, na síntese e deposição de várias
proteínas da matriz extracelular (MEC). A atrofia geral da matriz extracelular e
número reduzido de fibroblastos estão ligados ao envelhecimento e enfraquecimento
da pele. Em particular, exposição a raios UV devido à absorção de energia de fótons
UV e consequente formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) levam a
alterações nas células da pele, que contribuem para manifestações clínicas como
formação de rugas, aspecto coriáceo, fragilidade, deficiência na cicatrização de
feridas e alta vulnerabilidade. Além de manter as propriedades mecânicas da pele,
fibroblastos dérmicos desempenham um papel importante no processo normal de
cicatrização de feridas (OPLANDER et al., 2011).
16
O colágeno é produzido pelos fibroblastos e sua função principal é a de atuar
como um andaime no tecido conjuntivo, especialmente nas suas formas tipo I, II e III.
Na cicatrização de feridas iniciais, o tipo III está presente em primeiro lugar, com a
proporção do tipo I aumentando com a formação, progressão e remodelamento da
cicatriz (HANGARAJ; HARDING; LEAPER, 2011).
O processo de cicatrização de feridas envolve os esforços coordenados de
vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais,
macrófagos, monócitos, neutrófilos e plaquetas. A migração, infiltração, proliferação
e diferenciação destas células culminará em uma resposta inflamatória, a formação
de tecido novo e em última análise, o fechamento da ferida.
Esse processo complexo é executado e regulado por uma rede igualmente
complexa de sinalização envolvendo inúmeros fatores de crescimento, citocinas e
quimiocinas. De particular importância é a família do fator de crescimento epidérmico
(EGF), fator de crescimento transformador beta (TGF-b), fator de crescimento de
fibroblastos (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), familia das
interleucinas (IL), e fator de neurose tumoral alfa (TNF-α) (BARRIENTOS et al.,
2008).
Citocinas pró-inflamatórias, em particular a interleucina IL-1 e TNF-α são
sobre-reguladas durante a fase inflamatória da cicatrização de feridas. A IL-1 é
produzida por neutrófilos, monócitos, macrófagos e, após a cicatrização da ferida, é
liberada imediatamente por queratinócitos. Além de ter um efeito parácrino, também
funciona de forma autócrina aumentando a migração e proliferação de queratinócitos
(RAJA et al., 2007).
Os efeitos de TNF-α exógenos são dependentes da concentração e duração
da exposição enfatizando a importância de equilibrar os sinais pró-inflamatórios
controlando a cicatrização de feridas. Em níveis baixos, o TNF-α pode promover a
cicatrização de feridas indiretamente, estimulando a inflamação e aumentando a
síntese de macrófagos e fatores de crescimento. No entanto, a níveis mais elevados,
o TNF-α tem um efeito prejudicial sobre a cicatrização. Além disso, TNF-α suprime a
síntese de proteínas da MEC e seus inibidores teciduais, aumentando a síntese de
metaloproteinases da matriz (MMPs) (BARRIENTOS et al., 2008).
A interleucina IL-10, por ser uma citocina anti-inflamatória é capaz de reduzir
a resposta inflamatória por meio da diminuição das citocinas pró-inflamatórias e da
supressão da ativação de monócitos (MARQUES; CIZZA; STERNBERG, 2007).
17
O envelhecimento tem sido associado a um aumento crônico dos níveis
circulantes de marcadores inflamatórios (ROUBENOFF, 2003). Esta inflamação
crônica é decorrente de elevados níveis sistêmicos de várias citocinas pró-
inflamatórias, tais como TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β, mesmo na ausência de condições
de doença aparentes (CHUNG et al., 2009).
Em níveis mais elevados esses mediadores podem danificar diretamente as
células, amplificando a cascata que provoca a resposta inflamatória (SARKAR;
FISHER, 2006). A ativação inflamatória generalizada ocorreria como consequência
da falha de mecanismos regulatórios que permitem que células imunes ativadas
continuem a produzir agentes catabólicos, mesmo depois de cessado o estímulo. A
exposição em níveis elevados dessas substâncias por um longo período contribui
para a fragilidade do idoso (ROUBENOFF, 2003).
Enfim, as alterações do envelhecimento da pele não somente têm um impacto
sobre a cicatrização de feridas, como também torna a pele do idoso mais susceptível
a lesões.
A Laserterapia de baixa potência (LBP) vem sendo proposta de forma positiva
e eficaz por muitos pesquisadores para promover a reparação de feridas cutâneas,
objetivando reduzir o período de cicatrização, bem como uma melhora no tipo de
cicatrização, levando o indivíduo a um retorno mais rápido de suas atividades.
Estudos têm mostrado que a LBP modula e acelera a cicatrização de feridas
através da indução de um aumento da atividade mitótica, atividade dos fibroblastos,
síntese de colágeno e neovascularização, bem como a redução da inflamação e do
stresse oxidativo (CARVALHO et al., 2006; FATHABADIE et al., 2013; DA SILVA et
al., 2013; DAWOOD, SALMAN, 2013; CARVALHO et al.,2010; GONÇALVES et al.,
2013).
Medrado et al. (2003), ao avaliarem os efeitos da laserterapia na cicatrização
de feridas de ratos, em elementos da matriz extracelular e miofibroblastos,
concluíram que o laser reduziu a reação inflamatória, induziu o aumento da
deposição de colágeno e uma maior proliferação de miofibroblastos em feridas
cutâneas experimentais.
Klebanov et al. (2005) compararam os efeitos do laser de He-Ne coerente e
da irradiação de luz de diodo não coerente (Led) sobre a cicatrizaçãoe a atividade
funcional de leucócitos exudativos de feridas cutâneas em ratos. Uma análise
comparativa mostrou que a atividade dos leucócitos foi semelhante nos grupos
18
irradiados com o Laser e Led e concluíram que tanto a irradiação coerente como a
não coerente tem efeitos muito próximos na cicatrização de feridas e atividade
leucocitária.
Santos et al. (2010) avaliaram e compararam os efeitos da laserterapia de
baixa potência (LBP) em retalhos cutâneos de ratos diabéticos e concluíram que a
LBP foi efetiva em aumentar a angiogênese em indivíduos irradiados.
Pelo exposto, o laser de baixa potência tem sido amplamente utilizado em
diversas condições inflamatórias no âmbito da pesquisa experimental, tornando-se
uma alternativa não invasiva e eficaz para o tratamento de feridas.
No entanto, diante das evidências na literatura de que o processo de
cicatrização de feridas no idoso é diferente do jovem, é questionável se irá ocorrer
uma alteração na resposta da cicatrização ao tratamento no indivíduo idoso, e se o
mesmo irá responder de forma semelhante ao tratamento com laser em comparação
com o jovem.
Nesse sentido, objetivamos neste estudo avaliar e comparar o efeito da
laserterapia de baixa potência na cicatrização de feridas cutâneas, utilizando um
modelo experimental em ratos jovens e idosos.
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Processo de Cicatrização de Feridas Normal
A cicatrização de feridas normal é uma resposta imune inata à lesão do tecido
, com o objetivo de restaurar a integridade do tecido e a função de servir como uma
barreira na pele. Este processo começa segundos após a lesão com a hemostasia,
seguida por três fases, isto é: inflamação, proliferação e remodelação do tecido. A
fim de parar a hemorragia, os microvasos lesionados contraem, a cascata de
coagulação é ativada, ocorre a agregação de plaquetas, e um coágulo de fibrina se
liga à ferida formando uma matriz provisória (SHAW, MARTIN, 2009).
Ocorre em seguida a liberação de numerosas citocinas, quimiocinas e fatores
de crescimento, incluindo o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF),
fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF), e fator de crescimento transformante - β (TGF- β), à partir do coágulo e
tecido circundante, promovendo a migração de células inflamatórias para o local da
lesão ( SHAW, MARTIN, 2009).
A fase inflamatória é caracterizada pela infiltração sequencial de neutrófilos,
monócitos e linfócitos. A principal função dos neutrófilos, cujo pico ocorre nas
primeiras 24 horas, é limpar a ferida fagocitando invasores infecciosos, e restos de
tecido desvitalizado. Dentro de 24-48 horas, os monócitos migram para dentro da
ferida, e diferenciam-se em macrófagos maduros. Os macrófagos parecem ser os
reguladores - chave da resposta de cicatrização e exercem várias funções
importantes: removem células em apoptose, ajudam a combater infecções e
secretam citocinas e fatores de crescimento que irão recrutar e ativar outras células
envolvidas no processo de reparação (EMING; KRIEG; DAVIDSON, 2007).
O papel dos linfócitos, que são as últimas células inflamatórias a entrar na
ferida ( 3 dias após uma lesão) , não tem sido claramente definido . No entanto, as
células T podem influenciar o processo de cicatrização de feridas, através de
interações diretas com macrófagos, plaquetas, queratinócitos e fibroblastos, e / ou
através da liberação de citocinas que podem desempenhar um papel na
remodelação dos tecidos (EMING; KRIEG; DAVIDSON, 2007).
20
Logo após a lesão, praticamente em paralelo com a inflamação, a
reepitelização é iniciada através da proliferação e migração dos queratinócitos. A
fase proliferativa, a qual é caracterizada pela substituição da matriz de fibrina
provisória pelo tecido de granulação, começa dentro de 72 horas após a lesão, e
dura cerca de 14 dias. Os fibroblastos proliferam em resposta a fatores de
crescimento, tais como TGF-β1, PDGF, e fator de crescimento de fibroblastos, e
sintetizam os componentes da matriz extra celular (MEC) , como por exemplo:
colágeno Tipo III e colágeno tipo I , glicosaminoglicanas e proteoglicanas (SHAW,
MARTIN, 2009).
Simultaneamente, a angiogênese é induzida por hipoxia. Os vasos
sanguíneos recém-formados invadem a NeoMatrix , e constroem uma densa rede de
capilares para suprir as células do leito da ferida com oxigênio e nutrientes (SHAW,
MARTIN, 2009).
Uma vez que o tecido de granulação é formado, alguns fibroblastos
diferenciam-se em miofibroblastos, que são elementos fundamentais para contração
da ferida e remodelação da MEC. Em torno do 8º dia , o processo de cicatrização da
ferida entra na fase de remodelação final, que pode persistir durante um ano ou
mais, e é essencial para o restabelecimento da funcionalidade do tecido completo
(SHAW, MARTIN, 2009).
Durante a remodelação, componentes da matriz extracelular são
constantemente degradados e recém-sintetizados, a fim de reconstituir o tecido
aproximando-o da arquitetura normal. A fração de colágeno tipo III diminui ao longo
do tempo, e é substituído pelo mais forte, o colágeno tipo I. Com a formação de
feixes de colágeno maiores, com mais ligações cruzadas intermoleculares, a
resistência à tração aumenta, mas não atinge mais de 80% da pele intacta (SHAW,
MARTIN, 2009).
2.2 Importância dos Mediadores Inflamatórios na Resposta Inflamatória
Os fatores humorais (mediadores químicos) desempenham um papel crucial
na iniciação e manutenção da resposta inflamatória. As suas funções atuam na
vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, quimiotaxia, adesão e
ativação de leucócitos, na toxicidade direta para o organismo invasor (ou para as
21
células) e para a matriz extracelular, na proliferação de fibroblastos, deposição de
colágeno e na angiogênese (SARKAR, FISHER, 2006).
Estes mediadores são os seguintes: [1] aminas vasoativas, tais como
histamina e serotonina, que medeiam a vasodilatação e aumentam a permeabilidade
vascular; [2] proteases de plasma que complementam mediando a permeabilidade
vascular , quimiotaxia , adesão de leucócitos, ativação, opsonização e fagocitose;
cininas, que aumentam a permeabilidade vascular e sistemas de coagulação que
geram trombina e fator Xa, que aumentam a permeabilidade vascular, a adesão de
leucócitos e de proliferação de fibroblastos; [ 3 ] metabólitos do ácido araquidônico ,
tais como prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas que medeiam aumento da
permeabilidade vascular , quimiotaxia e adesão de leucócitos ; [4 ] As citocinas , tais
como TNF -α, IL -1 , IL- 2, IL -4 , IL-6 e intérferons e quimiocinas , tais como a IL -8 e
MCP -1, que tem multifuncional propriedades que influenciam todos os aspectos de
processos inflamatórios ; [5 ] O óxido nítrico ( NO) , que atua como um vasodilatador
potente e também possui atividade anti-microbiana através da interação com
espécies reativas de oxigênio; [6] Radicais livres derivados de oxigênio que podem
ser libertados extracelularmente a partir de leucócitos, após a exposição à agentes
quimiotáticos, complexos imunes ou fagócitos (SARKAR, FISHER, 2006).
A Libertação extracelular de baixos níveis destes mediadores pode aumentar
a expressão das quimiocinas, citoquinas e moléculas de adesão de leucócitos
endoteliais amplificando a cascata que provoca a resposta inflamatória. Em níveis
mais elevados, esses mediadores podem danificar diretamente as células (SARKAR,
FISHER, 2006).
2.3 Cicatrização no Idoso
2.3.1 Alterações do Envelhecimento da Pele
No indivíduo idoso, as funções da pele deterioram-se devido a alterações
morfológicas e estruturais, influenciadas por fatores intrínsecos, como a composição
genética e alterações nos níveis hormonais e fatores extrínsecos como a exposição
solar e o tabagismo. Destacam-se como alterações epidérmicas relacionadas com o
envelhecimento, uma diminuição no número de células de Langerhans e
melanócitos, e achatamento da junção dérmico-epidérmica. Além disso, a
22
proliferação de queratinócitos é reduzida, e o tempo de rotação, ou seja, o número
de dias para a migração dos queratinócitos da camada basal para a superfície da
pele, é aumentada em 50%. A derme da pele envelhecida apresenta menos
fibroblastos, macrófagos e mastócitos, vascularização reduzida, e uma perda de
componentes da matriz extracelular, como colágeno e glicosaminoglicanas (SGONC,
GRUBER, 2013).
Além do desequilíbrio na produção e degradação do colágeno, a qualidade do
colágeno restante é também alterada, mostrando menos feixes de fibra e, com um
maior grau de desorganização. A morfologia da elastina é também desordenada,
resultando na diminuição da elasticidade da pele. Outras alterações relacionadas à
idade são a diminuição da sensação de leve toque e pressão, a secreção de sebo
reduzida e diminuição da capacidade de produzir a vitamina D (SGONC, GRUBER,
2013).
2.3.2 Impacto do envelhecimento na Cicatrização de feridas
As alterações relacionadas com o envelhecimento da pele são evidentes em
todas as fases de cicatrização de feridas. A mudança em qualquer uma das fases de
cicatrização de feridas leva a um atraso na cicatrização de 20-60% (SGONC,
GRUBER, 2013).
A hemostasia e inflamação, o passo inicial na cicatrização de feridas, é
caracterizada pela formação de coágulos de fibrina, a ativação de plaquetas e
subsequente liberação de mediadores que estimulam o influxo de células
inflamatórias. No indivíduo idoso, a adesão das plaquetas ao endotélio lesado e
liberação de fatores de crescimento, parece ser maior. Em resposta a mediadores
pró-inflamatórios libertados a partir das plaquetas e mastócitos residentes,
neutrófilos circulantes são recrutados para a ferida dentro de algumas horas após a
lesão. Simultaneamente, os monócitos começam a entrar na ferida e diferenciam-se
em macrófagos maduros (ASHCROFT; MILLS; ASHWORTH, 2002).
A Infiltração celular é regulada pela expressão da molécula de adesão, que é
modificada no indivíduo idoso, e pode afetar a resposta inflamatória precoce da
cicatrização de feridas. De fato, um aumento da resposta de neutrófilos no início, e
um retardo no influxo de monócitos com o aumento do número de macrófagos
23
maduros têm sido identificado em indivíduos idosos em comparação com os jovens
(ASHCROFT; HORAN; FERGUSON, 1998).
Considerando que os macrófagos desempenham um papel crucial para uma
cicatrização de feridas bem sucedida, tem sido demonstrado que a redução seletiva
de macrófagos leva a um fechamento atrasado da ferida, com a formação de tecido
de granulação diminuída, diminuição da angiogênese, redução da síntese de
colágeno e fator de crescimento, e redução no número de miofibroblastos ( MIRZA;
DIPIETRO; KOH, 2009).
A atividade fagocítica de macrófagos de feridas de animais idosos é
significativamente reduzida em comparação com os animais jovens ( SWIFT et al.,
2001).
Isto pode também contribuir para o aumento da produção de citocinas pró-
inflamatórias, incluindo a interleucina IL -1, IL-6 e fator de necrose tumoral, e a
redução da secreção de VEGF (SWIFT; KLEINMAN; DIPIETRO, 1999).
O meio da fase de cicatrização da ferida é caracterizado por reepitelização,
formação de tecido de granulação e angiogênese envolvendo queratinócitos,
fibroblastos e células endoteliais. Todas essas células apresentam alterações no
indivíduo idoso, incluindo a diminuição da proliferação e migração, redução da
resposta aos fatores de crescimento e diminuição da secreção de citocinas,
resultando em um retardo do fechamento da ferida, diminuição da angiogênese e
deposição de MEC ( ASHCROFT; MILLS; ASHWORTH, 2002).
Em relação à fase de remodelação no indivíduo idoso, observou-se um
desequilíbrio entre MMPs e seus inibidores naturais resultando em atividade
proteolítica elevada e subsequente diminuição na deposição de colágeno (
ASHCROFT, MILLS, ASHWORTH, 2002). Feridas em um estágio final, mostraram
um atraso relacionado na remodelação do colágeno e uma menor organização de
fibras de colágeno em animais idosos comparados com animais jovens, no 11º
diaapós a lesão (REED et al., 2006).
Uma evidência adicional para a relação entre a inflamação e envelhecimento
é a presença de mediadores químicos da inflamação em doenças associadas com o
envelhecimento (SARKAR, FISHER, 2006).
24
2.3.3 Mediadores Inflamatórios no Processo de cicatrização do idoso
As citocinas desempenham um papel importante como mediadores pró-
inflamatórios e estudos documentaram aumento dos níveis séricos de citocinas pró-
inflamatórias, tais como IL- 1, IL -6 , TNF -a e IL -8 , em indivíduos idosos , em
comparação com indivíduos jovens ( SARKAR, FISHER, 2006).
A premissa da hipótese inflamatória relacionada com o idoso é baseada em
duas descobertas estabelecidas : (1 ) A desregulação do sistema imune no indivíduo
idoso (2 ) alteração do estado redox durante o envelhecimento. Ambos os processos
levam a aumentos no estado inflamatório sistêmico, devido à ativação de uma ampla
variedade de mediadores inflamatórios, através principalmente pelo desequilíbrio
redox, induzido pelo estresse oxidativo (CHUNG et al., 2009).
O envelhecimento tem sido associado a um aumento crônico dos níveis
circulantes de marcadores inflamatórios (ROUBENOFF, 2003). Esta inflamação
crônica é decorrente de elevados níveis sistêmicos de várias citocinas pró-
inflamatórias, tais como TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-1β, mesmo na ausência de condições
de doença aparentes (CHUNG et al., 2009).
Em níveis mais elevados esses mediadores podem danificar diretamente as
células, amplificando a cascata que provoca a resposta inflamatória (SARKAR,
FISHER, 2006). A ativação inflamatória generalizada ocorreria como consequência
da falha de mecanismos regulatórios que permitem que células imunes ativadas
continuem a produzir agentes catabólicos, mesmo depois de cessado o estímulo. A
exposição em níveis elevados dessas substâncias por um longo período contribui
para a fragilidade do idoso, e esta mudança relacionada com a idade para um
estado pró-inflamatório, tem sido associado a vários efeitos adversos, incluindo a
perda de massa muscular e aumento da incidência de deficiências e mortalidade
(ROUBENOFF, 2003).
Evidências recentes apoiam fortemente a ideia de que o processo inflamatório
molecular desempenha um papel central no processo de envelhecimento e as
doenças relacionadas com a idade. A expressão dos genes de IL-1b, IL-6, TNF-α, a
COX-2 e iNOS são aumentadas durante o envelhecimento (CHUNG et al., 2009).
Estudos confirmam o papel direto do TNF-α (fator de necrose tumoral) na
indução de um estado catabólico que causa fragilidade, além de sua associação na
25
patogênese da aterosclerose, DM tipo II e Doença de Alzheimer em idosos (LENG et
al., 2004).
Segundo Harris et al. (1999), idosos saudáveis com altos níveis circulantes de
TNF-α e IL-6 produzem morbidade e mortalidade, independente de comorbidade. Os
níveis circulantes de TNF-α representam o melhor indicador de mortalidade em
idosos frágeis, enquanto que níveis de IL-6 são um bom marcador para idosos
saudáveis.
Recentes estudos sugerem que a IL-10 é a citocina chave que pode suprimir
a imunidade mediada por células. É responsável pela maturação das células
dendríticas e tem sido encontrada em níveis elevados em idosos saudáveis (LENG
et al., 2004).
2.4 Laserterapia de baixa potência ( LBP)
O termo laser constitui-se de um acrônimo de “Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation“ ou “Luz Amplificada por Emissão Estimulada de
Radiação”. A Laserterapia de baixa potência (LBP) é uma modalidade de tratamento
atérmico que produz ações fotoquímicas, e induz quadro analgésico, cicatricial e
bioestimulatório (BASFORD, 1995).
A bioestimulação por laser é a aplicação de uma luz monocromática nos
tecidos, podendo influenciar a atividade celular com a estimulação ou inibição das
funções químicas e fisiológicas. A magnitude do efeito biomodulatório é influenciada
pelo comprimento de onda, fluência, densidade de potência, tipo de lesão e do
espectro de absorção do fotorreceptor (KARU, 1987).
Segundo Karu (1989) a interação da luz laser com os tecidos biológicos é
determinada pelo seu comprimento de onda e pelas características ópticas de cada
tecido. Cada tipo de laser resulta em um comprimento de onda específico e cada
comprimento de onda reage de uma maneira diferente em um determinado tecido.
O fenômeno fotobiomodulação pode ser explicado da forma que em baixas
intensidades de luz, predomina a conversão da energia absorvida por fotoreceptores
endógenos e também por moléculas fotoaceitadoras não especializadas.
A incidência da luz laser em uma ferida pode levar à excitação de cromóforos
específicos, destacando-se a hemoglobina e a melanina. Ambos são fortes
absorventes da irradiação e estão presentes em muitos tecidos em altas
26
concentrações; porém, há em concentrações menores, uma grande variedade de
outros cromóforos que também estão presentes e são importantes no sistema
biológico (HILLENKAMP, 1989). Consequentemente, ocorre a indução de reações
fotoquímicas específicas e aumento do fluxo de sangue, iniciando o efeito de
fotoestimulação que desencadeia o incremento do metabolismo celular (KARU,
1987). Sugere-se que o metabolismo celular é aumentado devido aos
fotorreceptores mitocondriais de luz monocromática, aumentando o metabolismo
respiratório de certas células, afetando assim, suas propriedades eletrofisiológicas.
O resultado final deste processo é a reparação tecidual e a estimulação do sistema
imune, linfático e vascular ( MESTER, 1985).
Os efeitos terapêuticos da Laserterapia de baixa potência (LBP) sobre os
diferentes tipos de tecido biológico são extensos. Estes têm sido demonstrados em
estudos in vivo e in vitro (SHEFER et al., 2008; SAYGUN et al., 2008; ILIC et al.,
2006; DENADAI et al., 2009).
Segundo Lacjaková (2010), os lasers vermelhos podem ser mais adequados
para o tratamento da pele do que os lasers infravermelhos, devido à sua fraca
profundidade de penetração nos tecidos. Deste modo, a maioria das células-alvo da
LBP estão localizadas na epiderme (células estaminais epidérmicas) e nas partes
superiores da derme (fibroblastos , macrófagos e células endoteliais) .
O tratamento com LBP tem demonstrado ser eficaz no controle da dor, nos
processos inflamatórios , assim como para estimular a produção de colágeno , a
proliferação de fibroblastos, e microvascularização locais. Além disso, tem sido
demonstrado que LBP também estimula o metabolismo celular e aumenta o
potencial de regeneração (CONLAN; RAPLEY, COBB, 1996; SILVEIRA; STRECK,
PINHO , 2007).
De acordo com Moriyama et al. (2009) a LBP é uma modalidade comumente
utilizada na prática clínica para desordens musculoesqueléticas, dor e inflamação.
Promove fotobiomodulação, estimulando ou inibindo efeitos, tendo assim o potencial
de modular ambos os processos inflamatórios e regenerativos.
27
2.5 Atuação do Laser de baixa potência (LBP) no processo de
Cicatrização
A maioria das intervenções terapêuticas são projetadas para facilitar o
processo de cicatrização de feridas, com ênfase na importância de proteger feridas
para evitar complicações (POSTEN et al., 2005).
A técnica Laser é um dos métodos utilizados para acelerar a recuperação da
funcionalidade do tecido no tratamento de tecidos feridos. Devido à eficácia dos
procedimentos com o Laser no processo de cicatrização, eles são recomendados
para a recuperação do tecido, induzindo vasodilatação, aumentando a oxigenação
dos tecidos e síntese de colágeno (GONÇALVES et al., 2010).
Segundo Enwemeka et al. (2004), todas as fases do processo de cicatrização
são positivamente afetadas com o tratamento a laser, com o comprimento de onda
e a densidade de energia sendo fatores cruciais para o sucesso do tratamento.
Ao realizar uma metanálise, Woodruff (2004) concluiu que no geral, os lasers
de baixa potência promovem a cicatrização de feridas em modelos de feridas
experimentais em animais e nos casos humanos de feridas e úlceras, alegando que
este resultado é consistente com vários estudos que indicam que a terapia a laser
acelera o processo de reparação tecidual.
A LBP vem sendo amplamente utilizada para o tratamento de uma variedade
de lesões da pele, tais como queimaduras, feridas cirúrgicas, feridas diabéticas e
ulceração. O aumento da produção de ATP, aumento do potencial de membrana
mitocondrial e sua atividade, a transformação dos fibroblastos em miofibroblastos, o
aumento da proliferação celular, a diferenciação celular e a produção de colágeno
são os efeitos biológicos fundamentais promovidos pelo LBP (PRABHU et al., 2012).
Medições semi – quantitativas de características histológicas relacionadas
com a inflamação, proliferação e remodelação foram realizadas em vários estudos,
para avaliar os efeitos da fotobiomodulação da LBP na progressão da cicatrização (
GONÇALVES et al., 2010; BYRNES et al., 2004; CHUNG et al., 2010).
É evidenciado na literatura que o LLLT atua de forma positive e eficaz na
cicatrização de feridas cutâneas, e esta afirmativa pode ser comprovada em vários
estudos (SILVEIRA et al., 2011; GONÇALVES et al., 2013; DAWOOD, SALMAN,
2013).
28
Tacon et al. ( 2011) ao avaliarem a atividade cicatrizante do laser diodo
Alumínio Gálio Índio Fósforo (AlGaInP), utilizando 660 nm e densidades de energia
de 3J/cm2 e 6J/cm2 em feridas cutâneas induzidas em ratos, obtiveram aumento da
angiogênese, diminuição do infiltrado de polimorfonucleares e hemorragia e estímulo
acentuado à fibroplasia nos grupos que utilizaram o Laser como forma de
tratamento.
Gál et al. (2006) avaliaram do ponto de vista histológico , o efeito da
irradiação laser de diodo na cicatrização de feridas cutâneas em ratos, utilizando
670 nm e 30 J/cm2 e concluíram que a estimulação do laser encurtou a fase
inflamatória , bem como acelerou a fase proliferativa, estimulando positivamente a
regeneração da epiderme lesionada.
Gonçalves et al. (2010), determinaram os efeitos do laser de arseneto de
gálio- alumínio( GaAlAs ) em feridas cutâneas em ratos Wistar. Foram analisadas as
concentrações de fibras de colágeno tipo I e III bem como a progressão do
fechamento das feridas, e os autores obtiveram resultados significativos no
fechamento da ferida e concentração do colágeno tipo I no grupo de animais que
receberam a densidade de energia de 4j /cm2.
Para muitos cientistas, a ideia de que a luz laser de baixa potência pode ser
terapêutica o suficiente para aliviar a dor e promover a reparação tecidual parece
absurda. Contudo, estudos indicam que os Lasers de baixa potência são capazes de
promover os processos de reparação de pele, ligamentos, tendões, ossos e da
cartilagem em animais experimentais, bem como de feridas e úlceras de uma grande
variedade de etiologias nos seres humanos (WOODRUFF et al., 2004).
Há pouca discordância na maioria dos experimentos com animais, que
sugerem que os lasers de baixa potência melhoram a cicatrização de feridas
promovendo a proliferação de células, acelerando a síntese do colágeno e da
promoção da formação de tecido de granulação, promovendo a formação de
procolágenos tipo I e tipo III, aumentando a síntese de ATP nas mitocôndrias,
ativando linfócitos, aumentando a sua capacidade de se ligar à patógenos
(WOODRUFF et al., 2004).
Em contraste, alguns relatórios clínicos sobre os efeitos do laser de baixa
potência permanecem contraditórios, com alguns estudos que relatam efeitos
benéficos na reparação de tecidos e outros mostrando nenhum efeito. Esta
contradição pode ser decorrente devido ao grande número de variáveis envolvidas
29
nos tratamentos com equipamentos de terapia a laser, ou seja: comprimento de
onda, potência, densidade de potência, energia, densidade de energia, a duração do
tratamento, o tempo de tratamento, tempo de intervenção pós-lesão, e o método de
aplicação (modo de contato versus modo sem contato) (WOODRUFF et al., 2004).
2.6 Atuação da Laserterapia de baixa potência (LBP) em Mediadores
Inflamatórios
Muitos estudos utilizaram o LBP em diversas condições inflamatórias, e
obtiveram resultados satisfatórios na mediação de quimiocinas, confirmando a
eficácia do LBP em promover a diminuição de citocinas inflamatórias (ALVES et al.,
2013; FERNANDES et al., 2012; FUKUDA et al., 2013; LARAIA et al., 2012).
Alves et al.( 2013), ao avaliarem o efeito da terapia com laser de baixa
potência, operado no nível 50 mW e 100 mW na inflamação das articulações em
ratos induzidos pela papaína, concluíram que ambas as modalidades de tratamento
a laser foram eficientes na redução da inflamação celular e diminuição da
expressão de IL-1β e IL-6.
Fernandes et al. (2012), verificaram o efeito da LBP sobre a expressão de IL -
1β no músculo tibial anterior de ratos após uma lesão aguda. Perceberam que
houve um decréscimo na expressão de IL- 1β após 7 dias no grupo LBP em
comparação com o grupo não tratado. Em conclusão, a LBP foi capaz de diminuir a
expressão de IL- 1β durante a reparação do músculo esquelético após uma lesão
aguda.
Fakuda et al.(2013), relataram que a aplicação do laser de baixa potência
diminuiu a liberação TNF- α e IFN- γ in vivo de células mononucleares do baço em
ratos, especialmente após duas sessões de exposição. No entanto, não obteve
modulação da libertação de IL -6 e TGF- β1.
Laraia et al. (2012), analisaram os efeitos da laserterapia de baixa potência (
LLLT ; 660 nm) sobre os níveis de expressão da proteína de mediadores
inflamatórios após o corte do tendão de Aquiles em ratos. Obteve nos grupos
tratados com LBP uma redução significativa de IL- 1β e IL- 6, em comparação com
os grupos controle, enquanto que a IL- 10 mostrou um aumento significativo no
grupo tratado em comparação com o grupo controle, e concluíram que o LBP é um
importante modulador de citocinas inflamatórias após a lesão no tendão de Aquiles.
30
Diante do exposto com relação à dificuldade de reparação ocasionada pelo
envelhecimento, da controvérsia de doses e parâmetros demonstrados pela
literatura, e ainda dos evidentes resultados da LBP na mediação da inflamação, em
variadas condições inflamatórias, nos leva a aprofundar neste estudo a ação da LBP
em citocinas inflamatórias de feridas cutâneas experimentais.
3. OBJETIVOS
Este estudo tem por objetivo avaliar e comparar o efeito da
Laserterapia de baixa potência na cicatrização jovem e tardia, utilizando um modelo
experimental de feridas cutâneas em ratos jovens e idosos.
3.1 Objetivos Específicos
Analisar os efeitos do Laser de baixa potência no processo de
reparação tecidual.
Analisar os efeitos do Laser de baixa potência sobre a expressão
proteica de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-10).
Analisar os efeitos do Laser de baixa potência sobre a expressão
gênica das citocinas IL1-β e TNF-α.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais de experimentação
Foram utilizados 60 ratos (norvergicos albinus), de linhagem Wistar, machos,
dos quais foram 30 jovens (30 dias) com massa corporal de 130 ± 20g, e 30 idosos
(500 dias) com peso corporal de 400 ± 50g, provenientes do Biotério da
Universidade Nove de Julho - UNINOVE, mantidos em condições controladas de
luminosidade e temperatura, com água e alimentação ad libitum.
Para compor os grupos experimentais foi realizado um cálculo amostral com
base nos estudos de Soybir et al., ( 2012) e Mogford et al., (2004), considerando a
aplicação do teste estatístico ANOVA para 3 tratamentos, com poder de teste de 80
31
e nível alfa de 0,05 resultando em uma amostra mínima de 60 animais, sendo um
número de 05 animais por grupo.
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Institucional (AN 0016/2011), e estão de acordo com as normas do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA e aos padrões de
experimentação animal do International Council for Laboratory Animal Science.
4.2 Grupos Experimentais
Os animais foram distribuídos de forma aleatória em quatro grupos
experimentais, sendo um número de 05 animais por subgrupo de acordo com os
tempos experimentais 3, 7, 14 dias, respectivamente (Figura 1).
G1- Grupo Controle idoso: Animais idosos que foram submetidos
apenas à lesão cutânea;
G1 (3 dias): 05 animais
G1 (7 dias): 05 animais
G1 (14 dias): 05 animais
G2 - Grupo Tratado idoso: Animais idosos que foram submetidos
à lesão cutânea e ao tratamento com Laser 660nm;
G2 (3 dias): 05 animais
G2 (7 dias): 05 animais
G2 (14 dias): 05 animais
G3 - Grupo Controle jovem: Animais jovens que foram
submetidos apenas à lesão cutânea;
G3 (3 dias): 05 animais
G3 (7 dias): 05 animais
G3 (14 dias): 05 animais
32
G4 - Grupo Tratado jovem: Animais jovens que foram
submetidos à lesão cutânea e ao tratamento com Laser 660nm;
G4 (3 dias): 05 animais
G4 (7 dias): 05 animais
G4 (14 dias): 05 animais
Figura 1. Composição dos grupos experimentais.
4.3 Procedimentos
4.3.1 Produção das feridas cutâneas
Após a pesagem, os animais foram anestesiados antes de cada lesão
cutânea, com uma solução de Ketamina 7% (Cetamin, Syntec, Cotia, SP) e Xilazina
0.3 % (Xilazin, Syntec, Cotia, SP) numa proporção de 2:1( 0.2 ml a cada 100g do
animal) por via intraperitoneal. Uma vez anestesiados, os animais foram
posicionados em decúbito ventral, o local foi esterilizado com o álcool-iodado, e foi
realizada a tricotomia na região do dorso do animal. Para realização a ferida, foi
utilizado um "punch" de 8mm de diâmetro permitindo a remoção de uma área
circular da pele. Foram realizadas duas feridas em cada animal, com a localização
para a porção média do plano sagital mediano (Figura 2).
Após a confecção das feridas os animais foram colocados em gaiolas limpas,
sendo cinco em cada uma, com água e ração apropriada à vontade. Os animais que
Grupos
n=60 G1
Controle Idoso
15
animais G1
3 dias
n=5
G1
7 dias
n=5
G1
14 dias
n=5
G2
Laser
Idoso
15 animais G2
3 dias
n=5
G2
7 dias
n=5
G2
14 dias
n=5
G3
Controle Jovem
15 animais G3
3 dias
n=5
G3
7 dias
n=5
G3
14 dias
n=5
G4
Laser jovem
15 animais
G4
3 dias
n=5
G4
7 dias
n=5
G4
14 dias
n=5
33
morreram durante o procedimento foram substituídos para dar continuidade à
pesquisa.
Foi utilizado como medicamento analgésico a dipirona sódica por 2 dias após
a confecção das feridas cutâneas na dose de 0,1 ml/ animal, de 4/4 horas para evitar
que os animais sentissem dor.
4.3.2 Aplicação do Laser
Foi utilizado o Laser, DMC® modelo Photon Laser III (DMC - São Carlos, SP,
Brasil), com potência de 30 mW (densidade de potência de 1,07 W/cm2), área do
feixe de 0,028cm2, e comprimento de onda de λ 660nm, meio ativo de Fosfeto
Indio-Gálio-Alumínio (InGaAlP). A aplicação no experimento em vivo aconteceu sob
forma de um único ponto pelo método transcutâneo; com energia total de 2 joules
por ferida ,densidade de energia de 72 J/cm2, tempo de 67 segundos (Tabela 1). Foi
utilizada uma cartolina preta com uma abertura central (8mm de diâmetro) que ficou
posicionada na região da ferida para impedir a incidência da luz nas regiões
circunvizinhas (Figura 2). Os parâmetros utilizados levaram em consideração os
estudos de Posten et al. (2005). A aplicação foi iniciada após a confecção das
lesões cutâneas, e em dias alternados, nos grupos experimentais 2 e 4 até o dia da
eutanásia de cada grupo (Figura 3). O número de aplicações do laser, nos grupos
que receberam tratamento (G2 e G4) em seus respectivos tempos experimentais
foram: 3 dias ( 2 aplicações, dose acumulada de 4J), 7 dias( 4 aplicações, dose
acumulada de 8J), 14 dias (7 aplicações, dose acumulada de 14 J).Os grupos G1 e
G3 não receberam tratamento e foram adotados como grupos-controle comparativo
para a análise histológica e molecular.
Todos os procedimentos metodológicos referentes à execução do
experimento foram realizados por um mesmo executor.
34
Tabela 1.Parâmetros do Laser
Compriment
o de
onda:nm
Frequênci
a
Densidad
e de
Potência:
W/cm2
Potênci
a de
Saída:
mW
Área
do
feixe
: cm2
Densidad
e de
Energia:
J/cm2
Energia
Total
Entregu
e :
Joules
Tempo de
irradiação
por
tratamento
: segundos
660 Contínuo 1,07 30 0,028 72 2 67
Figura 2. Cartolina preta com uma abertura central utilizada para impedir a
incidência da luz nas regiões circunvizinhas (Fonte: Arquivo pessoal).
35
Figura 3. Tratamento com Laser de baixa potência (Fonte: Arquivo pessoal).
4.3.3 Eutanásia
No final de cada período, 3º, 7º e 14º dias, respectivamente, os animais dos
Grupos G1, G2, G3 e G4 foram identificados, pesados e, posteriormente,
eutanasiados com o uso de Tiopental sódico (Cristália Itapira – SP, Brasil) numa
dose de 0.05 ml/100g.
Após a eutanásia, seguindo os tempos indicados, as áreas incisadas foram
cirurgicamente removidas com margem de 1cm de pele em torno da lesão com
profundidade até a fáscia. As amostras resultantes (duas de cada animal), foram
congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a - 80 ° C e distribuídas, sendo
uma para a realização dos procedimentos histológicos , e a outra para a análise da
expressão proteica por meio do Elisa e expressão gênica por meio do RT PCR.
36
4.3.4 Procedimentos Histológicos
As amostras congeladas em nitrogênio líquido foram incluídas em OCT
(Tissue-Tek; Sakura Finetek USA) e preparados cortes de 4 µm de espessura em
criostato (Leica Modelo CM 1850, Wetzlar, Germany).O material foi corado com
Hematoxilina e Eosina (HE) para determinar em cada tratamento o processo de
reparação tecidual.
4.3.5 Avaliação dos níveis de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β e
IL-10) da ferida cutânea- ELISA
A dosagem das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-10 das amostras foram realizadas
pelo teste imunoenzimático (ELISA), seguindo instruções do kit comercial (R&D
Systems, Minneapolis, Minnesota USA). Para tanto, placas de 96 poços foram
sensibilizados com 100μl de anticorpo monoclonal para cada citocina: anti-IL1β
diluídos em tampão carbonato de sódio (0,1M, pH 9,6), enquanto anti IL-10 e TNF-α
foram diluídos em tampão fosfato de sódio (0,2M, pH 6,5). As placas foram
incubadas (4ºC) por 18h. Para o bloqueio, as placas foram lavadas com PBST
(Sigma - St Louis MO USA) -solução PBS contendo 0,05% de Tween 20- por 4
vezes e depois preenchidas com 300 μl/poço de solução de bloqueio (3% gelatina
em PBST, Sigma) à 37ºC por 3 horas e submetidas a novo ciclo de lavagens. A
seguir, 100μl das amostras devidamente diluídas ou dos padrões das citocinas
recombinantes foram adicionados à placa e deixados por 18 h em temperatura de
4ºC. Após lavagem, 100μl dos respectivos anticorpos biotinilados específicos de
detecção para cada citocina foram acrescentados e deixados por 1 h em
temperatura ambiente. Após lavagem das placas, o volume de 100μl de
estreptavidina – peroxidase foi adicionado e deixado por 1 h em temperatura
ambiente (22 ºC) seguida de novas lavagens. A reação foi revelada pela adição de
100 μl/poço da solução de 3.3’5.5’ tetrametilbenzidina (TMB) e interrompida pela
adição de 50 μl/poço de ácido sulfúrico (2 N). A leitura foi realizada em
espectrofotômetro Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de
onda de 450nm com correção a 570nm. As concentrações de citocinas nas
amostras foram calculadas a partir das curvas padrão obtidas a partir das citocinas
recombinantes( MAFRA DE LIMA et al., 2010).
37
4.3.6RT- PCR em tempo real ( qRT- PCR)das citocinas IL1-β e TNF-α
Os procedimentos para utilização desta técnica foram realizados no
Departamento de Ciências da Reabilitação do Centro Universitário Nove de Julho
(UNINOVE), onde foram analisadas a expressão gênica das citocinas IL1-β e TNF-
α.O tecido das feridas, após removido foi imediatamente congelado em nitrogênio
líquido e mantido a -80°C até o processamento. O RNA total foi extraído usando o
reagent 26 Trizol (Gibco BRL, EUA) de acordo com instruções do fabricante. Após
tratamento com DNAase, a síntese dos cDNAs foram processadas pelo método da
transcriptase reversa empregando a enzima SuperScript (Invitrogen) a partir de 2 µg
de RNA total e na presença de mistura de primers randômicos e oligodT. Os
experimentos de Real-Time PCR foram programados da seguinte maneira: 1 ciclo de
desnaturação inicial de 10 min a 95°C, e 40 ciclos de amplificação (30 seg de
desnaturação a 95°C e 1 min de anelamento e extensão a 60°C). As sequências dos
primers que foram utilizados estão descritos na tabela 2. Os resultados foram
interpretados usando a fórmula que relaciona a expressão do gene de interesse
comparado aquela do gene controle ß-actina. Todos os pares de oligonucleotídeos
foram desenhados baseando-se nas sequências obtidas de dados utilizando o
primer Express Software (Applied Biosystem).
Tabela 2. Primers utilizados no RT- PCR em tempo real ( qRT- PCR)
IL- β:GenBank® accession number M98820, (forward primer:
5′CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3′; reverse primer: 5′-
GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3′).
TNF-α: (forward primer: 5′- CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3′; reverse primer: 5′-
CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3′).
Beta actina: (forward primer: 5′-AAGATTTGGCACCACACTTTCTACA-3′; reverse
primer: 5′- CGGTGAGCAGCACAGGGT-3′).
38
4.3.7 Análise Estatística
Os dados obtidos foram tabulados em Software Microsoft Excel 2007 e
inicialmente avaliados quanto a sua normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk,
concluindo como resultado a distribuição normal. Foi então aplicado o teste de
análise de variância ANOVA “post hoc test” de Tukey para comparações entre os
períodos de 3, 7, e 14 dias dentro de cada grupo, bem como entre os grupos. Todos
os dados foram expressos como média e desvio padrão. Foi utilizado o software
GraphPad Prism 5, tomando-se como hipótese de nulidade p<0,05.
39
5. ARTIGO SUBMETIDO
O artigo “Comparative analysis of low-level laser therapy (660 nm) on
inflammatory biomarker expression during the skin wound-repair process in young
and aged rats” foi submetido à revista Wound Repair and Regeneration (Factor de
impacto: 2.757, Qualis: A1).
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72
6. DISCUSSÃO
O processo de cicatrização tem um papel essencial na resposta protetora da
lesão epidérmica por meio da reparação tecidual (BARRIENTOS et al., 2008). No
indivíduo idoso, as funções da pele deterioram-se devido às alterações morfológicas
e estruturais, a proliferação de queratinócitos, fibroblastos, macrófagos e mastócitos
é reduzida, a vascularização é diminuída, e há uma perda de componentes da matriz
extracelular, como colágeno e glicosaminoglicanas( SGONC, GRUBER, 2013).
Nos últimos anos, a fototerapia por luzes coerentes (lasers) destaca-se como
um bioestimulador para o reparo tecidual, aumentando a circulação local, a
proliferação celular e a síntese de colágeno (CARVALHO et al.,2010; DAWOOD,
SALMAN, 2013; GONÇALVES et al., 2013).
O presente estudo foi idealizado com o objetivo de analisar e comparar o
processo de reparação de feridas cutâneas, induzidas em um modelo experimental
de ratos jovens e idosos, diante das evidências afirmadas na literatura de que o
processo de cicatrização no indivíduo idoso é diferente do jovem.
Observamos neste estudo uma diferença evidente do processo de reparo
entre feridas cutâneas de ratos jovens e idosos, em tempos experimentais de 3, 7 e
14 dias.
Durante a evolução do processo de reparo, os eventos que se sucedem são a
infiltração de neutrófilos, infiltração de macrófagos, fibroplasia e deposição de matriz
extracelular, angiogênese, cicatrização e reepitelização. Podemos destacar como
mediadores importantes na regulação destes eventos, as citocinas e fatores de
crescimento. Citocinas (principalmente IL-1 e TNF-α), atuando sobre os receptores
das células endoteliais, induzem a produção de óxido nítrico (NO) bem como a
expressão de moléculas de adesão para neutrófilos (BALBINO; PEREIRA; CURI,
2005).
Observamos nos três períodos ( 3, 7 e 14 dias) , uma diferença significante na
concentração das citocinas inflamatórias entre os grupos controle idoso e jovem,
portanto mais significativa no tempo experimental de 3 dias. O grupo controle idoso
demonstrou maior concentração de IL-1 β e TNF-α em relação ao grupo controle
jovem. Estes resultados corroboram com estudos descritos por Sarkar et al., 2006,
onde documentaram que o aumento dos níveis séricos de citocinas pró-
inflamatórias, tais como IL- 1, IL -6 , TNF -a e IL -8 , em indivíduos idosos , em
73
comparação com indivíduos jovens, foi evidente durante a inflamação aguda,
indicando que o envelhecimento está associado com uma resposta inflamatória
crônica de baixo grau ( SARKAR, FISHER, 2006).
Em relação à atuação do LBP em mediadores inflamatórios no período de 3
dias, observamos em nossos resultados a sua eficácia no início do processo de
cicatrização de feridas no animal idoso, que foi evidente no grupo tratado idoso,
apresentando uma diferença significante das citocinas IL-1 β e TNF em comparação
com o grupo controle idoso.
Segundo Harris et al. (1999), os níveis circulantes de TNF-α representam o
melhor indicador de mortalidade em idosos frágeis. Observamos que em nossos
resultados, houve também uma diferença significativa entre as concentrações de
TNFα nos grupos tratado idoso e tratado jovem, onde o grupo tratado jovem
apresentou uma diminuição mais significativa da concentração desta citocina em
relação ao grupo tratado idoso. A indicação deste resultado nos leva a refletir que
talvez sejam necessárias modificações nos parâmetros do LBP para o tratamento do
idoso, sugerindo desta forma que a dose utilizada no idoso seja diferenciada, para
que o mesmo obtenha um resultado igualmente satisfatório. Observamos que este
mesmo resultado repetiu-se no período de 7 dias.
Na análise histológica, no período experimental de 3 dias, foi observado nos
grupos controle jovem e tratado jovem, um espessamento epitelial evidente com
visível proliferação de epitélio delgado a partir das margens da ferida, células da
linhagem fibroblástica e macrofágica, presença de leucócitos e processo inflamatório
crônico e intensa angiogênese. Em contrapartida, nos grupos controle idoso e
tratado idoso, o epitélio foi evidente somente próximo às bordas da lesão, foi
observado um intenso exsudato inflamatório agudo e vasos sanguíneos dilatados,
porém sem sinais de angiogênese. Estes resultados comprovam a chegada
antecipada de células inflamatórias nos grupos controle jovem e tratado jovem e
demonstram um atraso da cicatrização nos grupos controle idoso e tratado idoso e
corroboram com o estudo de Ashcroft et al (2002), que descreve que a diminuição
da proliferação e migração de células inflamatórias e consequente retardo da
angiogênese contribuem para o processo de cicatrização tardia em idosos, levando
a uma reepitelização e neovascularização atrasadas.
Foi evidente a ação da LBP no período experimental de 3 dias, principalmente
no grupo tratado jovem em comparação com o grupo jovem controle, evidenciando
74
uma aceleração do processo de reparo com a chegada antecipada de um maior
número de células inflamatórias no local da lesão, e intensa presença de exsudato
plasmático fibrinóide e áreas de hialinização de colágeno. A eficácia da LBP no
presente estudo corrobora com o trabalho de Medrado et al. (2003), que ao avaliar
os efeitos da LBP na cicatrização de feridas em ratos em períodos de 24, 48 e 72
horas, concluíram que nos animais tratados houve redução da reação inflamatória,
aumento da deposição de colágeno e uma maior proliferação de miofibroblastos em
feridas cutâneas experimentais.
No presente estudo, observamos no período de 7 dias, intensa angiogênese
indicando processo de reparação em todos os grupos, porém esta foi mais evidente
nos grupos controle jovem, tratado jovem e tratado idoso. Foi observado
especialmente no grupo tratado idoso, um processo de reparo tecidual intenso na
derme, com intensa angiogênese e reepitelização intensa nas bordas da ferida
cirúrgica. Estes resultados apoiam o estudo de Tacon et al.( 2011), que após análise
histológica, obtiveram a atividade cicatrizante evidenciada pelo aumento da
angiogênese e diminuição do infiltrado inflamatório no 5º dia em feridas de ratos que
receberam Laser AlGaInP 660nm com densidades de energia de 3J/cm2 e 6J/ cm2.
Observamos também neste mesmo período de 7 dias, que a LBP reduziu de
forma significante a concentração das citocinas inflamatórias (IL-1 β e TNFα ) em
animais idosos( grupo tratado idoso), principalmente a citocina TNFα , que reduziu
drasticamente no grupo tratado idoso em comparação com o grupo controle idoso.
Segundo Ashcroft et al (1998), a alteração da infiltração de células em
indivíduos velhos, pode afetar a resposta inflamatória precoce da cicatrização de
feridas. Em um estudo comparativo entre feridas de indivíduos velhos e jovens,
ocorreu um aumento da resposta de neutrófilos iniciais, e um retardo no influxo de
monócitos com o aumento do número de macrófagos maduros.
Os nossos resultados mostraram no grupo controle idoso, áreas de
inflamação crônica com predomínio de macrófagos e células plasmáticas, além de
células gigantes multinucleadas na derme, principalmente nos tempos experimentais
de 7 e 14 dias. Estes eventos são elucidados no estudo de Sarkar e Fisher (2006),
que descrevem que as indicações de inflamação crônica, a infiltração de macrófagos
e os níveis de mediadores químicos pró-inflamatórias circulantes, são observados
em doenças associadas à idade. Segundo estes autores, a presença destes
macrófagos ativados, por um lado pode ser benéfica, enquanto eles também podem
75
revelar-se prejudiciais. Os macrófagos ativados podem ao mesmo tempo liberar
materiais tóxicos que são prejudiciais para os tecidos viáveis do hospedeiro, e
também possuem potencial fagocítico e uma capacidade para destruir agentes
patogênicos invasores. Porém em um estado de inflamação persistente, os eventos
danosos podem sobrecarregar os efeitos protetores, mudando, assim, o saldo da
degeneração crônica ( SARKAR, FISHER, 2006).
Macrófagos derivados de monócitos começam a se acumular localmente
entre o segundo e o quinto dias após a lesão, sendo suas funções primárias auxiliar
os neutrófilos na fagocitose de microorganismos, debris teciduais, e remover
neutrófilos senis. A participação mais relevante dos macrófagos na inflamação e
reparo tissular é a produção e liberação local de diversos fatores de crescimento e
citocinas, cruciais na maturação da reação inflamatória e na iniciação do processo
de cura da ferida (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
A IL-1, IL-6, IL-8 e o TNF-α, entre outros mediadores inflamatórios, fazem
parte da família das quimiocinas, que influenciam a migração de macrófagos
(BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005). A interleucina IL-10, por ser uma citocina
antiinflamatória é capaz de reduzir a resposta inflamatória por meio da diminuição
das citocinas pró-inflamatórias e da supressão da ativação de monócitos. Da mesma
forma que para os neutrófilos, a IL-10 possui efeitos inibitórios sobre a quimiotaxia
de macrófagos (SATO; OHSHIMA; KONTO, 1999).
Foi observado em nosso estudo, nos tempos experimentais de 3, 7 e 14 dias
,um aumento significante da concentração da citocina IL-10 nos grupos que
utilizaram a LBP( tratado jovem e tratado idoso) em comparação com os grupos
controle( controle jovem e controle idoso). Entretanto, observamos que o grupo
tratado jovem apresentou um aumento mais pronunciado desta citocina anti-
inflamatória em relação ao grupo tratado idoso. Este acontecimento, novamente
sugere que uma nova proposta de dosimetria da LBP poderia ser utilizada no animal
idoso, podendo alcançar dessa forma resultados mais relevantes.
Além disso, observamos também que nos períodos de 3, 7 e 14 dias, tanto o
grupo tratado jovem, como principalmente o grupo tratado idoso apresentaram
redução da expressão das citocinas IL-1 β e TNFα em comparação com o grupo
controle jovem e controle idoso, respectivamente. Dessa forma, os nossos
resultados confirmam a eficácia da LBP em promover a diminuição de citocinas
76
inflamatórias, e corroboram com estudos evidenciados na literatura que aplicaram a
LBP em diversas condições inflamatórias e obtiveram resultados satisfatórios na
mediação de fatores humorais (ALVES et al., 2013; FERNANDES et al., 2013;
FUKUDA et al., 2013; LARAIA et al., 2012).
O estudo experimental de Kondo et al. (2010) utilizando camundongos,
demonstrou que as citocinas pró-inflamatórias IL-1 e TNF-α eram sobre-reguladas
em ambos os níveis de proteína e mRNA nos sítios de ferimento , implicando que
elas poderiam se tornar marcadores úteis para determinação da cicatrização da
ferida na idade. Analisando a expressão gênica pelo método Rt-PCR, observamos
que em nosso estudo, os níveis de mRNA das citocinas IL-1β e TNF-α foram
elevados no grupo controle idoso em todos os períodos experimentais (3, 7 e 14
dias) em comparação com o grupo controle jovem, e percebemos que este mesmo
fato se confirmou na análise proteica destas citocinas.
Ainda, analisando a expressão gênica, foi evidente que a LBP demonstrou ser
eficaz na mediação dos níveis de mRNA nos grupos tratado jovem e tratado idoso,
principalmente no grupo tratado idoso, que obteve uma diferença significativa nos
níveis de mRNA em todos os períodos experimentais (3, 7 e 14 dias) em
comparação com o grupo controle idoso.
Seguindo o processo de reparação de feridas, por volta do décimo dia, o leito
da ferida está totalmente preenchido pelo tecido de granulação, com uma rede
capilar atravessando-o e, a rede linfática em franca regeneração. O tecido de
granulação vai sendo enriquecido com mais fibras de colágeno e começa a adquirir
a aparência de massa fibrótica característica da cicatriz. Com a evolução do
processo, acentua-se a deposição de colágeno e a maioria das células
desaparecem (observa-se a apoptose de fibroblastos e células endoteliais) formando
finalmente a cicatriz. Ao final desta etapa, os anexos da pele, como folículos pilosos
e glândulas sofrem regeneração limitada, e as cicatrizes são hipo-vascularizadas
devido ao desaparecimento dos neocapilares ( BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Em nossos resultados, no período de 14 dias, observamos no grupo controle
jovem e tratado jovem, o tecido conjuntivo com densidade celular (principalmente
fibroblastos) e vascular típico do processo de reparo e uma completa reepitelização
das feridas, mostrando epitélio normal e presença de ligação epitelial, como folículos
pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas. Ao Contrário dos grupos
controle idoso e tratado idoso, que apresentaram células da linhagem fibroblástica
77
assemelhando-se a fibrócitos, indicando baixa atividade metabólica, e ausência de
anexos epiteliais, indicando um retardo no processo de reepitelização. Dessa forma,
identificamos alterações em todas as fases do processo de reparação no animal
idoso em comparação com o animal jovem.
7. CONCLUSÃO
Identificamos alterações em todas as fases do processo de reparação tecidual e
aumento da expressão proteica e gênica das citocinas IL-1β e TNF-α em animais
idosos (grupo controle idoso) em comparação com animais jovens (grupo controle
jovem).Concluímos que o animal idoso respondeu de forma diferente ao tratamento
em comparação com o animal jovem. Assim, a LBP:
Atuou de forma eficaz modulando a inflamação e acelerando o processo de
reparação tecidual.
Reduziu a expressão proteica das citocinas IL-1β e TNF-α em ambos os
grupos tratados (jovem e idoso).
Aumentou a expressão proteica da citocina IL-10 em ambos os grupos
tratados (jovem e idoso) em comparação com seus respectivos grupos
controle, no entanto, no grupo jovem tratado os resultados foram mais
expressivos.
Reduziu a expressão gênica das citocinas IL-1β e TNF-α em ambos os
grupos tratados (jovem e idoso).
78
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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86
9. ANEXOS
87
Figura 4. Microfotografias da pele de rato submetida à ferida cutânea cirúrgica, 3
dias após a lesão. A e B são seções de pele do grupo controle de ratos jovens, C e
D são seções da pele do grupo controle de ratos idosos, E e F são seções da pele
dos ratos jovens submetidos à terapia com laser de baixa potência (LBP), e G e H
são seções da pele de ratos idosos submetidos à LBP. Nota-se a formação de
crosta, compreendendo fibrina e leucócitos (Cr) e as áreas de inflamação aguda
acompanhada por exsudação de plasma (IE). Áreas de angiogênese são aparentes,
indicando o processo de reparo (cabeças de seta). Vasos sanguíneos dilatados
podem ser vistos mostrando a intensa migração de células imunes , ou a diapedese,
e extravasamento de plasma (Pe). A inflamação crônica que consiste principalmente
de macrófagos e células plasmáticas (Mp) está presente. Os cortes foram corados
com hematoxilina e eosina e vistos com uma objectiva de 10 ×. Barra de escala de
60 μm. 509x763mm (48 x 48 DPI).
88
Figura 5. Microfotografias de pele de rato submetida à ferida cutânea cirúrgica , 7
89
dias após a lesão , mostrando os mesmos campos visuais. A e B são seções da pele
do grupo controle de ratos jovens , C e D são seções da pele do grupo controle de
ratos idosos , E e F são seções da pele dos ratos jovens submetidos a terapia com
laser de baixa potência (LBP) e G e H são seções da pele de ratos idosos
submetidos a LBP . Nota-se a reepitelização da ferida ( Re ) mostrando o epitélio
típico da pele. A formação de crosta, compreendendo fibrina e leucócitos (Cr) e as
áreas de inflamação aguda acompanhada por exsudação de plasma (IE). Áreas de
angiogênese são aparentes, indicando o processo de reparo (cabeças de seta). A
inflamação crônica que consiste principalmente de macrófagos e células plasmáticas
(Mp) está presente. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina e vistos
com uma objectiva de 10 ×. Barra de escala de 60 μm. 509x763mm (48 x 48 DPI).
90
Figura 6. Microfotografias da pele de rato submetida à ferida cutânea cirúrgica, 14
91
dias após a lesão. São mostrados os mesmos campos visuais. (AB) grupo jovem
controle, (CD) grupo Idoso controle, (EF) grupo jovem tratado com LBP, (GH) grupo
idoso tratado com LBP. Observe a completa re-epitelização da ferida (Ep),
mostrando epitélio normal do intestino delgado e, em alguns casos, o epitélio mostra
claramente sinais de aumento da espessura devido à imaturidade no grupo dos
idosos (It). Observe a presença de ligação epitelial, como folículos pilosos, glândulas
sebáceas e glândulas sudoríparas (Ea), evidente em animais jovens. Algumas áreas
isoladas de inflamação crônica composta por macrófagos e células plasmáticas
(Mp). Nota-se que o tecido mostra processo de reparação tecidual precoce (seta).
Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina e vistos com uma objectiva de
10 × . Barra de escala 60μm 508x762mm (72 x 72 DPI).
Figura 7. Comparações de médias e desvios padrão da expressão proteica da
interleucina-1β e Fator de necrose tumoral alfa, obtidos utilizando o ensaio
imunoenzimático. Os painéis A e D representam as expressões nas feridas 3 dias
após a lesão, os painéis B e E representam as expressões nas feridas 7 dias após a
lesão, e os painéis C e F representam as expressões nas feridas 14 dias após a
92
lesão. * Denota p <0,05 e ** denota p <0,001, utilizando teste de Tukey com
comparações em relação ao grupo controle de ratos jovens; # denota p <0,05 e # #
denota p <0,001 utilizando teste de Tukey com comparações em relação ao grupo
controle de ratos idosos e ɸ denota p <0,05 utilizando teste de Tukey comparando o
grupo tratado de ratos jovens com o grupo tratado de ratos idosos. 189x132mm (144
x 144 DPI).
Figura 8. Comparações de médias e desvios padrão da expressão gênica da
Interleucina-1β e fator de necrose tumoral alfa, extraídos das feridas cutâneas e
quantificados utilizando a reação em cadeia da polimerase em tempo real. Os
painéis A e D representam as expressões nas feridas 3 dias após a lesão, os painéis
B e E representam expressões nas feridas 7 dias após a lesão, e os painéis C e F
representam as expressões nas feridas 14 dias após a lesão. * Denota p <0,05 e **
denota p <0,001 utilizando teste de Tukey com comparações em relação ao grupo
controle de ratos jovens; # denota p <0,05 e # # denota p <0,001 pelo teste de Tukey
com comparações em relação ao grupo controle de ratos idosos e ɸ denota p <0,05
pelo teste de Tukey comparando o grupo tratado de ratos jovens que receberam a
93
LBP, com o grupo tratado de ratos idosos que receberam a LBP. 193x129mm (144 x
144 DPI).
Figura 9. Comparação de médias e desvios padrão da expressão proteica da
Interleucina-10, obtida utilizando o ensaio imunoenzimático. O painel A representa a
expressão nas feridas 3 dias após a lesão, o painel B representa a expressão nas
feridas 7 dias após a lesão, e o painel C representa a expressão nas feridas 14 dias
após a lesão. * Denota p <0,05 e ** denota p <0,001 pelo teste de Tukey com
comparações em relação ao grupo controle de ratos jovens; # denota p <0,05 e # #
denota p <0,001 pelo teste de Tukey com comparações em relação ao grupo
controle de ratos idosos e ɸ denota p <0,05 pelo teste de Tukey comparando o grupo
tratado de ratos jovens que receberam a LBP, com o grupo tratado de ratos idosos
que receberam a LBP. 239x82mm (114 x 114 DPI).
94
