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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE MATERIAIS
KELLY CRISTINI BERTACHINI
ESTUDO DO USO DE PSEUDOBOEMITA NA LIBERAÇÃO DE ACICLOVIR
São Paulo
2015
KELLY CRISTINI BERTACHINI
ESTUDO DO USO DA PSEUDOBOEMITA NA LIBERAÇÃO DE ACICLOVIR
Dissertação de mestrado apresentado ao
Programa de Mestrado Profissional em
Engenharia de Materiais da
Universidade Presbiteriana Mackenzie,
como requisito parcial à obtenção do
título de Mestre Profissional em
Engenharia de Materiais.
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof. Dr. Antonio Hortêncio Munhoz Júnior
Universidade Presbiteriana Mackenzie
____________________________________
Leila Figueiredo de Miranda
Universidade Presbiteriana Mackenzie
____________________________________
Leonardo Gondin Andrade e Silva
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares – IPEN
KELLY CRISTINI BERTACHINI
ESTUDO DO USO DE PSEUDOBOEMITA NA LIBERAÇÃO DE ACICLOVIR
Dissertação de mestrado
apresentado ao Programa de Mestrado
Profissional em Engenharia de Materiais da
Universidade Presbiteriana Mackenzie,
como requisito parcial à obtenção do título
de Mestre Profissional em Engenharia de
Materiais.
ORIENTADOR: PROF. DR. ANTONIO HORTENCIO MUNHOZ JÚNIOR
São Paulo
2015
B536e Bertachini, Kelly Cristini
Estudo do uso de pseudoboemita na liberação de Aciclovir
/ Kelly Cristini Bertachini - 2015.
61f.: il., 30 cm
Dissertação (Mestrado em Engenharia de Materiais) –
Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo, 2015.
Orientação: Prof. Dr. Antônio Hortêncio Munhoz Junior
Bibliografia: f. 53-61
1. Pseudoboemita. 2. Aciclovir. 3. Liberação controlada. I.
Título.
CDD 620.5
AGRADECIMENTOS
A Deus sobre todas as coisas, pois a Fé e a esperança não foram perdidas.
À Universidade Presbiteriana Mackenzie e à Escola de Engenharia por me
proporcionar um excelente curso de pós-graduação.
Ao Dr. Antônio Hortêncio Munhoz Júnior, pela oportunidade dada e acreditada.
Ao MackPesquisa pela concessão da bolsa de pesquisa e pelo apoio aos estudos.
A Juliana Aparecida da Silva pelo apoio nos estudos em São Paulo e apoio na vida
cotidiana, pelo companheirismo e dedicação.
Ao Valentin Gabriel pelo companheirismo nas viagens, pelo gosto de viajar e
conquistar novos horizontes, pela sua dedicação, demonstração de amor, afeto e carinho.
Obrigada.
A minha família em especial pelo incentivo aos estudos, a minha mãe Ana Mariza
Sbrana Bertaquini, meu pai Paulo Roberto Bertaquini e meu irmão Paulo Fernando
Bertachini, minha madrinha Jane Mary Ferrari e Sidney Ferrari.
Aos queridos sobrinhos e amigos, Frederick Lawton Azevedo, Letícia Gabriela
Azevedo, Murilo Bertachini, Tiago Bertachini, Nilva Panigossi, Silvia Regina Teodoro.
Dedicatória
Dedico ao Valentin Gabriel, filho de alma e coração, valente e
destemido, mas sensível e humano, que você possa continuar o legado.
“No meio da dificuldade encontra-se a oportunidade”. Albert Eistein
“Triste época! É mais fácil desintegrar um átomo do que um preconceito”. Albert
Eistein
RESUMO
A pseudoboemita é um nanomaterial do tipo cerâmica fina, usada em sínteses farmacêuticas e
nanosistemas para liberação de moléculas. É um material que foi obtido pelo grupo de
engenharia de materiais da Universidade Presbiteriana Mackenzie por diferentes métodos,
precipitação e polimerização inorgânica. Este trabalho pesquisou a liberação controlada de
aciclovir com o uso de pseudoboemita, dando ênfase na determinação do teor de aciclovir em
ensaios realizados pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Foram
realizados ensaios “in vivo”, demonstrando o efeito da adição da pseudoboemita na liberação
controlada do fármaco. Sua liberação controlada foi avaliada pelos resultados da análise de
concentração do fármaco aciclovir no plasma sanguíneo de “wistar rats”, determinada por
CLAE em função do tempo de administração do fármaco nos ensaios “in vivo”. Concluiu-se
que a pseudoboemita teve um papel importante na liberação controlada em relação ao tempo,
demonstrando que teve maior eficiência comparando-se com a administração do fármaco em
“wistar rats” sem a pseudoboemita. Os resultados mostraram que a concentração de aciclovir
é menor nos ratos em que a gavagem foi com pseudoboemita.
Palavras-chave: Liberação Controlada de Fármacos, Nanomaterial, Nanotecnologia,
Nanocompósitos, Pseudoboemita, Aciclovir.
ABSTRACT
The pseudoboehmite is a nanomaterial of fine ceramics type, used in pharmaceutical
synthesis and nanosystems to release molecules. It is a material that was obtained by the
Mackenzie University materials engineering group by different methods, precipitation
and inorganic polymerization. This study investigated the controlled release acyclovir
using pseudoboehmite, with emphasis on the determination of acyclovir content in tests
carried out by liquid chromatography High Performance (HPLC). Assays were performed
"in vivo," demonstrating the effect of addition of pseudoboehmite in controlled drug
release. Its controlled release was assessed by the results of analysis of the drug
concentration of acyclovir in plasma of "wistar rats", determined by HPLC according to
the administration time of the drug in the tests "in vivo". It was concluded that the
pseudoboehmite has a role in the controlled release over time, showing that it has higher
efficiency compared with the drug administration "wistar rats" without pseudoboehmite.
The results showed that the concentration of acyclovir is lower in rats that were gavage
with pseudoboehmite.
Keywords: Drug Release System, Nanocomposites, Nanotechnology, Pseudoboehmite,
Acyclovir.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) de Amidon (1995). 7
Espectro 1 Espectro FT-IR espectro Captopril (a), EC (b) captopril – EC (1:1)
mistura (c)............................................................................................
9
Cromatograma 1 Solução padrão à concentração de 1 mg.mL de aciclovir. Fonte:
(NOVICKIS, 2009) 12
Esquema 1 Fórmula estrutural do fármaco aciclovir, 9-[(2-
hidroxietoxi)metil]guamina. Fonte: Soares (2003). 15
Micrografia 1 Microscopia eletrônica de varredura de amostra da
pseudoboemita. 16
Esquema 2 Difusão por solubilização e liberação de fármacos 18
Quadro 2 Principais diferenças entre adsorção física e adsorção química 18
Fotografia 1 HPLC, CLAE (Cromatógrafo Líquido de Alta Resolução) TSP com
detector UV.vis. 28
Gráfico 1 C Comparação entre as energias envolvidas na adsorção física e
química. 18
Cromatograma 2 R Relação de cromatogramas identificados nas devidas concentrações 32
Gráfico 2 C Dados obtidos da tabela de curva linear. 33
Cromatograma 3 Concentrações de aciclovir com pseudoboemita 34
Cromatograma 4 Concentração de aciclovir no plasma sanguíneo 35
Cromatograma 5 Concentração de aciclovir com pseudoboemita no plasma sanguíneo 35
Cromatograma 6 Limite de concentração próximo ao campo amostral 36
Gráfico 3 Linearidade das concentrações de ACV 37
Gráfico 4 Linearidade da concentração em relação ao tempo 38
Gráfico 5 Gráfico da linearidade da concentração 39
Difratograma 1 Difratograma de raio-X da pseudoboemita 30
Termograma 1 DTA e TG da pseudoboemita 31
Termograma 2 TG e DTG da pseudoboemita 31
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição dos 20 ratos em grupos n 26
Tabela 2 Concentração de aciclovir x área do pico dado 33
Tabela 3 Concentração de ACV em plasma sanguíneo 37
Tabela 4 C Concentração DO ACV em soro sanguíneo em mg.L-1 38
Tabela 5 C Concentração do ACV em soro sanguíneo 39
LISTA DE SIGLAS
ABC Associação Brasileira de Cerâmica
ACV Aciclovir
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
LCAP Alumino Calcium Phosphorous Oxide Ceramics
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid
FDA Food and Drugs Administration
OECD Organization for Economic Cooperation and Development
PSG Processo Sol-Gel
TCP Tricálcio de fosfato
UPM Universidade Presbiteriana Mackenzie
UV Vis Espectroscopia no Ultravioleta Visível
LOQ Limite de Quantificação Obtido
LOD Limite de Detecção Obtido
SPE Extração por Fase Sólida
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 3
1.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................... 4
1.2 OBJETIVO ESPECÍFICO...................................................................................... 4
1.3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 5
1.4 METODOLOGIA.................................................................................................... 5
2 REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA................................................................................................. 6
2.1 EXCIPIENTE (Liberação controlada de fármacos.)................................................ 8
2.2 Utilização de Polímeros na liberação controlada de farmacos................................. 8
2.3 Liberação e Dissolução............................................................................................. 9
2.3.1 Ensaios “in vitro”...................................................................................................... 11
2.3.2 Ensaios “in vivo” (Regulamentação das pesquisas em animais no Brasil)............... 13
2.4 Aciclovir................................................................................................................... 14
2.5 Pseudoboemita......................................................................................................... 15
2.6 Adsorção, Biodisponibilidade e Solubilidade.......................................................... 17
2.6.1 Biodisponibilidade................................................................................................... 19
2.6.2 Solubilidade............................................................................................................. 20
2.6.3 Difusão de Fármacos............................................................................................... 20
2.7 FARMOCINÉTICA............................................................................................... 21
2.8 Liberação Controlada na forma farmacêutica......................................................... 21
3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 23
3.1 Materiais................................................................................................................. 23
3.1.1 Poli(álcool vinílico) (PVAI)................................................................................... 23
3.1.2 Nitrato de Alumínio hexahidratado....................................................................... 23
3.1.3 Hidróxido de amônio (NH4OH)............................................................................. 23
3.1.4 Pseudoboemita........................................................................................................ 23
3.1.5 Fármaco aciclovir.................................................................................................... 24
3.2 Ratos Machos para experimental “in vivo”............................................................. 24
3.2.1 Estabelecimento das doses de ensaio e administração. Preparo para quantificação
por CLAE em ensaio “in vivo”................................................................................
25
3.2.2 Obtenções de amostras (plasma), avaliação bioquímica – ensaio quantitativo pelo
método de CLAE. Determinação da presença do fármaco Aciclovir no plasma
sanguíneo..................................................................................................................
27
3.2.3 Método de preparo e análise por CLAE in vivo 28
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES........................................................................ 30
4.1 Curva de calibração do aciclovir ............................................................................. 32
4.2 Resultados das análises de aciclovir no plasma dos ratos....................................... 34
4.3 Limite de detecção e quantificação.......................................................................... 36
5 CONCLUSÕES...................................................................................................... 41
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 42
3
1 INTRODUÇÃO
A liberação controlada do fármaco é avaliada por meio de análises “in
vitro” e “in vivo”. No processo “in vitro” é definido um modelo matemático preditivo que
descreve a relação entre a propriedade in vitro de uma forma farmacêutica e uma resposta
“in vivo”.
No processo “in vitro”, a concentração do fármaco é determinada em
função do tempo utilizando um dissolutor com condições determinadas de pH e
temperatura. Já no estudo “in vivo”, são administrados aos animais (por exemplo, ratos),
concentrações variadas de aciclovir em pseudoboemita e analisados o teor de aciclovir no
plasma animal dos ratos por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE),
considerando o estudo de biodisponibilidade do fármaco. Neste trabalho, para analisar
qual o efeito gerado pela pseudoboemita, também foi administrado aos animais, aciclovir
sem a presença de pseudoboemita.
No estudo “in vivo” foi quantificada e determinada a concentração do
fármaco no metabolismo dos animais utilizado no presente estudo. Na liberação
controlada de fármaco, utilizando pseudoboemita na administração do aciclovir como
ativo espera-se que a adição de pseudoboemita promova a disponibilização controlada na
dose certa e constante, facilitando a dissolução do aciclovir no plasma animal em função
do tempo. Assim pretende-se melhorar a metabolização do aciclovir em presença da
pseudoboemita no organismo “in vivo”. Esse processo evita a excreção do mesmo, dando
maior eficiência do princípio ativo no organismo, diminuindo os problemas terapêuticos
crônicos, melhorando o uso em terapias como doenças da imunodeficiência (NOVICKS,
2009). O aciclovir é utilizado no tratamento de várias patologias como no tratamento de
pacientes com aids (HIV - Human Immunodeficiency Virus), os tipos I e II de herpes
simples e vírus de varicela zoster, dentre outros. (COUVREUR., 2006; VAUTHIER,
2006; MUNHOZ JÚNIOR et al., 2010).
A pseudoboemita é um composto de alumínio e possui uma estrutura
similar a boemita (MUNHOZ JÚNIOR, MIRANDA, UEHARA, 2006). É um pó
cerâmico sintético de pureza elevada. Dentre as diversas técnicas utilizadas para a síntese
de pós nanoparticulados de cerâmicas, o processo sol gel é o mais utilizado e estudado.
A grande vantagem deste processo é a obtenção de materiais com características e
propriedades pré planejadas, sendo possível, portanto, a realização de controle de suas
4
características físicas e químicas quanto a estequiometria, porosidade, estrutura cristalina
e tamanho das partículas (MUNHOZ JÚNIOR, MIRANDA, UEHARA, 2006). Por meio
da análise dessas nanopartículas, observou-se que a pseudoboemita é constituída por uma
superfície bastante porosa e viável como sistema de liberação controlada dos fármacos.
Utilizando o processo sol gel, a partir de reagentes de pureza alta, é
possível obter pseudoboemita pura, com área específica elevada e com total ausência de
contaminantes, tornando-a, portanto, promissora para aplicações como a liberação
controlada de fármacos (MUNHOZ JÚNIOR, MIRANDA, UEHARA, 2006; MUNHOZ
JÚNIOR et al., 2010). Demonstrou-se por meio de análises “in vitro”, que a
pseudoboemita formada pelo precursor nitrato de alumínio e obtida pelo processo sol gel
é bastante porosa e viável como sistema de liberação controlada dos fármacos aciclovir e
atenolol (NOVICKS, 2009). Neste presente estudo, a pseudoboemita será utilizada para
a liberação controlada do fármaco aciclovir em ensaios “in vivo”. Será obtido o teor de
aciclovir no plasma sanguíneo de ratos machos “wistar rats”.
As concentrações de aciclovir liberado pela pseudoboemita são
determinadas por meio de um padrão de aciclovir em solvente alcoólico, onde cinco
concentrações são analisadas em equipamento HPLC pelo método CLAE para obter a
curva de calibração que relaciona unidade de área com o teor de aciclovir na solução.
Preparou-se dois padrões com proximidades ao campo amostral das concentrações
encontradas em plasma sanguíneo de ratos machos. O ensaio utilizando CLAE favoreceu
o aumento da precisão do teor de aciclovir no plasma animal em ensaios “in vivo”.
1.1 OBJETIVO GERAL
Em vista da possível utilização da pseudoboemita como excipiente para
liberação controlada de fármacos, este trabalho teve como objetivo determinar a adsorção
e dessorção em pseudoboemita de um fármaco para verificar a possibilidade de utilizar
pseudoboemita na liberação controlada de fármacos.
1.2 OBJETIVO ESPECÍFICO
Avaliar o uso da pseudoboemita para liberação controlada de aciclovir
como excipiente farmacêutico utilizando a técnica CLAE “in vivo” em ratos machos
“Wistar rats”.
5
1.3 JUSTIFICATIVA
Novicks (2009) e Munhoz Júnior et al. (2010) demonstraram por meio de
análises “in vitro”, que a pseudoboemita obtida pelo processo sol gel era viável como
sistema de liberação controlada dos fármacos aciclovir e atenolol. Souza (2013) deu
continuidade ao estudo demonstrando que o material nanoparticulado utilizado não é
tóxico realizando ensaios in vivo em” wistar rats”. Portanto torna-se importante o estudo
do uso de pseudoboemita em aciclovir como liberação controlada e ampliando a
investigação “in-vitro” para “in vivo”. A quantificação do aciclovir no sangue de “wistar
rats” será realizada por CLAE em ensaios “in vivo”.
No laboratório de Engenharia de Materiais do Mackenzie já se encontra
em estudos a obtenção de micro e nanopartículas de pseudoboemitas obtidas por
tecnologia de Cerâmica Fina, via processo sol gel.
1.4 METODOLOGIA
Para o desenvolvimento deste trabalho foi realizado um levantamento
bibliográfico pela consulta em livros, periódicos, anais de congressos e em sites
especializados da internet.
Na parte experimental foram produzidas e caracterizadas pseudoboemitas
pelo processo sol gel.
Com relação aos procedimentos experimentais, a metodologia consistiu na
realização de ensaios em roedores “in vivo” utilizando ratos machos “wistar rats”.
Foi comparado o teor de aciclovir no sangue do grupo de ratos controle
com o teor de aciclovir no grupo dos ratos em que o aciclovir foi administrado com
pseudoboemita. No grupo de ratos controle foi administrado somente aciclovir.
A metodologia a ser seguida é oficialmente utilizada para análise do ativo
e já usada para detecção e quantificação de fármacos segundo a ANVISA (ANVISA,
2012).
6
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Dando continuidade ao estudo de excipientes e liberação controlada de
fármacos com o uso de aciclovir e pseudoboemita são apresentadas duas importantes
citações que definem a importância de suas funções, que são dados para as determinações
associadas a este conteúdo.
A primeira citação de Soares (2003) que resume as funções dos excipientes
farmacêuticos:
Os produtos de uso farmacêutico, excipientes ou ativos, precisam atender a um
número de requerimentos com respeito a segurança de seu uso, estabilidade e eficácia
terapêutica. Em termos dos excipientes farmacêuticos, a propriedade fundamental destes
produtos se refere a sua inocuidade química, microbiológica e ausência de atividade
farmacológica, enquanto que alguns atributos físicos podem ter importância, como sabor
e cor que afetam a aceitação pelo paciente, ou ainda a textura e o conteúdo de água que
afetam os processos de fabricação.
A segunda citação refere-se a (ANVISA, 2003), glossário de
denominações comuns brasileiras, que define os excipientes farmacêuticos da seguinte
forma:
EXCIPIENTES – 1) Os excipientes são substâncias que, em concentrações presentes
em algumas formas farmacêuticas, não apresentam atividade farmacológica. Contudo,
isso não exclui a possibilidade de que determinados excipientes possam causar reações
alérgicas ou efeitos indesejáveis. Os excipientes são empregados para dotar as formas
farmacêuticas de características que assegurem a estabilidade, biodisponibilidade,
aceitabilidade e facilidade de administração de um ou mais princípios ativos. Na medida
que os excipientes afetam a liberação do princípio ativo, eles podem modificar a
magnitude (efetividade)potência) e o perfil temporal (farmacocinética) das ações
farmacológicas dos produtos farmacêuticos através de modificações na sua estabilidade.
Os excipientes servem, além disso, para dar uma forma ou consistência adequada a uma
preparação. 2) Certas farmacopéias não aceitam o uso de excipientes que possam
interferir nas provas e avaliações farmacopeicas descritas nelas, tal como acontece com a
Farmacopéia Britânica. 3) Os termos “ingrediente inativo” e “substância agregada” são
geralmente empregados nas farmacopéias, tanto que os outros sinônimos se empregam
com preferência na terminologia da tecnologia farmacêutica. Exemplos de excipientes:
desintegrantes, emulsificantes (emulsionantes), corantes, favorizantes, conservantes,
espessantes, etc.
7
Segundo o glossário de denominações comuns brasileiras (ANVISA,
2012), os excipientes são substâncias que, em concentrações presentes em algumas
formas farmacêuticas, apresentam inocuidade química, microbiológica e ausência de
atividade farmacológica, segundo Novickis (2010), suas funções são de otimizar a
estabilidade do fármaco, favorecer a biodisponibilidade (liberação do fármaco e
farmacocinética) e fornecer a melhor consistência para facilitar na manufatura dos
produtos farmacêuticos.
Em 1995 Amidon e colaboradores, elaboraram o chamado Sistema de
Classificação Biofarmacêutica (SCB), que subdivide os fármacos em 4 classes distintas,
levando em conta a relação solubilidade e a permeabilidade pelas membranas do Trato
Gastro Intestinal TGI (Quadro 1). Segundo o Sistema de Classificação Biofarmacêutica
(SCB), a dissolução e a permeação intestinal do fármaco podem limitar a absorção e,
conseqüentemente, a ação terapêutica. A classificação SCB auxilia para se prever o
comportamento ”in vivo” de um fármaco levando-se em conta o ensaio de dissolução
deste, ”in vitro” sendo também decisivo no desenvolvimento de metodologias para os
testes de dissolução (AMIDON et al; 1995 apud LIRA, 2004). O Quadro 1 apresenta o
sistema de classificação biofarmacêutica (SCB) de Amidon (1995).
Quadro 1 – Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) Amidon et al. (1995).
Classe Sulibilidade/Permeabilidade
I
II
III
IV
Solubilidade alta e permeabilidade alta
Solubilidade baixa e permeabilidade alta
Solubilidade alta e permeabilidade baixa
Solubilidade baixa e permeabilidade baixa
O aciclovir pertence a classe IV aliando solubilidade e permeabilidade
baixas. Novicks (2010) observou experimentalmente que a adição de pseudoboemita
afeta favoravelmente a liberação do aciclovir, facilitando a solubilização do fármaco.
8
2.1 EXCIPIENTES E LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS
Na definição de excipientes, as substâncias que podem ser sólidas, líquidas
e semi sólidas, em forma de géis em diversos estados, utilizados em medicamentos e
manipulação, ocorre a presença de excipientes que têm a função de somente diluir,
dissolver ou avolumar os princípios ativos em suas respectivas formas farmacêuticas.
Esses estão inseridos na concepção tradicional de excipiente. Entretanto, ocorre também
outra função mais importante, que é a melhoria do desempenho desses princípios ativos
dos fármacos, em termos de assegurar sua estabilidade, biodisponibilidade (liberação
controlada), aceitabilidade, facilidade de administração de um ou mais princípios ativos,
direcionamento e absorção em sítios específicos. (PIFFERI; SANTORO; PEDRANI,
1999; LIRA, 2004 ).
A pseudoboemita estudada no presente trabalho é um excipiente
modificador da liberação de fármacos (NOVICKS, 2009; MUNHOZ JÚNIOR et al.,
2010), que controla a liberação do fármaco ativando o processo de solubilização do
aciclovir.
2.2 UTILIZAÇÃO DE POLÍMEROS NA LIBERAÇÃO CONTROLADA DE
FÁRMACOS
A utilização de polímeros e matrizes poliméricas na esfoliação homogênea
de frações mássicas baixas (0,2 a 10% em massa) de lamelas de argilas dentro de matrizes
poliméricas, modificando as propriedades mecânicas, térmicas de barreira a gases dos
polímeros, resultando em materiais com propriedades melhoradas para diversas
aplicações, mantendo boas propriedades ópticas (evitando a opacificação de materiais).
A esfoliação de lamelas de argilas dentro de matrizes poliméricas é facilitada pela sua
organofilização, que promove melhoras na compatibilização entre as fases das lamelas
inorgânicas de argila e a matriz polimérica orgânica (SOARES, 2003).
As nanopartículas inorgânicas são partículas utilizadas em seu interesse
maior na área médica, a variação é dada pela morfologia das partículas com as substâncias
que recobrem a nanopartícula. As vantagens dos carregadores que são excelentes para
9
manter a integridade do material durante o processo de liberação do fármaco, faz com que
sua biodegradação no plasma e citoplasma do corpo humano não seja comprometida.
Essas partículas são acumuladas nas células ou circularão pelo plasma, ou serão
metabolizadas (CUNHA et al., 2009; CALLISTER, JUNIOR, 2008; RING, 1996).
Um exemplo de medicamentos revestido com blendas poliméricas é o
Captopril, com Etilcelolose (EC) (LEE, LIN; 2004).
No Espectro 1 são mostrados os espectros infravermelho com
transformada de Fourier de captopril, EC e da mistura EC e captopril onde são observados
os picos de 1747 e 1590 cm-1 correspondente a espectro FT-IR Captopril.
Espectro 1: Espectros FT-IR Captopril (a), EC (b) mistura captopril – EC
(1:1) (c).
No estado vibracional para o EC é mostrado o pico característico a 3478
cm-1, observa-se um pico característico do grupo hidroxila. Na possível distinção dos
picos espectrais na diferença das misturas pela determinação da intensidade na
sensibilidade do espectro IR nas bandas do Captopril (1747 cm-1) e EC (3478 cm-1).
2.3 LIBERAÇÃO E DISSOLUÇÃO
10
É constituído por um conjunto de fenômenos entre a relação da
administração de um ativo fármaco com excipiente, nos quais são estudadas a intensidade
e o tempo de absorção, ocorrendo a dissolução e a liberação ativa no organismo por
absorção. No ensaio in vitro o fármaco deve ser liberado em dissolutor sendo observada
a concentração do fármaco em função do tempo e desintegração do comprimido. A
liberação controlada ocorrerá em pH estável coerente a digestibilidade gastrointestinal.
Neste processo a substância solubilizará em um solvente sendo determinada a
concentração do fármaco por diferentes tempos no dissolutor.
O Fluxograma 1 apresenta o fármaco indicando o percurso e a distribuição
do fármaco disponibilizado no organismo O Fluxograma 1 apresenta as diferentes fases
do fármaco durante a disponibilização no organismo.
Fluxograma 1: O percurso e a distribuição do fármaco disponibilizado no
organismo nas diferentes fases.
1ᵃ. Fase Farmacêutica 2ᵃ. Fase Farmacocinética 3ᵃ. Fase
Farmacodinâmica
As três fases dos processos os quais fazem parte do percurso da
disponibilidade de ativos, são relativos ao organismo que será quantificado pela
distribuição “in vivo”, no qual o meio depende totalmente da interação veicular entre o
fármaco e seu sítio receptor com as alterações moleculares e celulares correspondentes
ao efeito farmacológico.
No sistema de dissolução “in vitro” é decisivo no desenvolvimento de
metodologias para os testes de dissolução (AMIDON et al., 1995 apud LIRA, 2004).
Desintegração e
desagregação,
liberação e
dissolução do
fármaco
Absorção, distribuição,
biotransformação e excreção Interação fármaco-
receptor.
11
A adsorção em superfícies podem melhorar a biodisponibilidade de
fármacos de solubilidade baixa em água (Classe II e IV da classificação SCB).
aumentando a área superficial do adsorvente responsável pela adsorção do fármaco,
melhorando a dissolução do meio. Esta técnica foi descrita inicialmente por Monkhouse
e Lach em 1972. Alguns adsorventes são: celulose microcristalina, compostos de
magnésio, alumínio, silicatos e caulim.
A liberação de fármacos a partir de cerâmicos, antiácidos, carbonato de
cálcio, carbonato de magnésio e sais de alumínio, podem diminuir a biodisponibilidade
de fármacos em função da adsorção do ativo ou do efeito quelante (“chelation”), exceto
o bicarbonato de cálcio (DUREJA; PHARAM ; MADAN, 2007).
No Quadro 1, tem-se a classificação de fármacos de um excipiente ideal.
Quadro 1: Características de um excipiente ideal Fonte: Pifferi, Santoro;
Pedrani (1999).
Fármaco toxicologicamente inativo
Quimicamente e fisicamente inerte à droga
Compatível com outros componentes da formulação
Incolor e sem sabor
Alta fluidez
Alta compressibilidade
Disponibilidade mundial e econômico
Garantia de qualidade
Fácil armazenamento
Desempenho consistente com fármaco específico
2.3.1 – Ensaios in vitro de pseudoboemita com aciclovir
Ensaio “in vitro” é determinado pela dissolução do Aciclovir e
pseudoboemita que é definido pelo fator tempo, pelo ganho ou perda de concentração.
No processo in vitro, Richard Novickis (2009) analisou o teor de aciclovir
em função do tempo para condições semelhantes (pH, temperatura) à dos ensaios “in
vivo”.
Novickis (2009) construiu uma curva de concentração utilizando um
dissolutor observando o patamar de liberação (dessorção), analisando a quantidade de
12
aciclovir liberado. Nos primeiros 15 minutos, resultando a absorbância praticamente nula
após este tempo.
Nos resultados determinados por UV-vis, Novickis, (2009) mostrou que
teve um aumento da concentração do aciclovir no pH = 7 .
As concentrações do aciclovir tornaram-se relativamente constantes,
acima do esperado, foi observado um aumento da solubilização de aciclovir pela presença
da pseudoboemita, o que pode ser colocado como hipótese o processo de filtração da
pseudoboemita, retendo partículas não solubilizadas do fármaco. A pseudoboemita sendo
levemente turva promoveu uma posterior solubilização do aciclovir, resultando
aparentemente um aumento de concentração de aciclovir no ensaio.
Neste caso segundo Novickis, (2009) os interferentes provocados pela
turbidez demonstraram aumento da concentração acima do esperado.
Novickis (2009) analisou o aciclovir por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência apresentados no cromatograma 1, onde utilizou um padrão de aciclovir
referência de 1 mg.mL-1 para comparação do mesmo.
Em uma solução de aciclovir em presença de pseudoboemita foi
identificado por comparação dos tempos de retenção a presença de aciclovir. No
cromatograma 1 observa-se que o tempo de retenção de aciclovir para as condições de
análise estudadas é de 7,6 minutos.
Cromatograma 1 : Solução padrão à concentração de 1 mg.mL de
Aciclovir. Fonte: (NOVICKIS, 2009)
13
Nas identificações, Novickis (2009) obteve o tempo de retenção para
aciclovir, de acordo com normas e dados da literatura (STULZER, et al., 2008)
A comparação destes cromatogramas utilizando a literatura (KULKAMP,
2003), permitiu dizer que o fármaco ainda está presente mesmo após as dessorções do
substrato da pseudoboemita, sendo este um indício de que se manteve a estabilidade
química.
2.3.2 – Ensaios ” in vivo”
Segundo norma da Anvisa para a administração por via oral do fármaco
em ratos por ensaios “in vivo”, segue o mesmo procedimento inicial da toxicidade em
ratos machos. O teste de toxicidade aguda é um pré requisito para agências reguladoras
dos países, como a Food and Drugs Administration (FDA) e (ANVISA) Agência
Nacional de Vigilância Sanitária, para a aprovação de novos fármacos aditivos
alimentares e outros. Para a realização deste teste, é necessário conduzí-lo de acordo com
protocolos internacionais preconizados por organizações como a Organization for
Economic Cooperation and Development: OECD (OGA; OGA; CAMAREO;
BATISTUZZO, 2008; ANVISA, 2010) Agência Nacional de Vigilância Sanitária e
Centro de Estudos com Animais. O comitê de ética no uso de animais da Universidade
Presbiteriana Mackenzie aprovou os procedimentos éticos do referido projeto pelo
documento CEUA No 120/11/2014.
Para o estudo “in vivo” da pseudoboemita em roedores, segue-se as
diretrizes do Guia OECD 423 (OECD, 2001; SOUZA, 2013), pois seus protocolos são de
grande aceitação pelos órgãos reguladores e atendem requisitos de experimentação e
critérios de bem estar animal.
Conforme o Guia OECD - 423/2001, no método, as doses fixas
administradas devem ser de 5, 50, 300, 2000 mg/kg/dia ou a máxima dose disponível que
foi de 16,4 mg/kg/dia. Utilizou-se 2 animais por dose e teve como princípios identificar
a concentração, identificar e quantificar a biodisponibilidade do fármaco. Para a
realização desse teste foi adotado o protocolo internacional preconizado pela Organização
para Cooperação Econômica e Desenvolvimento – Organization for Economic
14
Cooperation and Developmente: OECD, no qual serão seguidas diretrizes do Guia 407
(OECD, 2001). Seus protocolos são de grande aceitação pelos órgãos reguladores e
atendem requisitos de experimentação e critérios de bem estar animal.
Em relação ao número de animais, conforme, foram utilizados 2 grupos
(teste e controle), sendo cada grupo composto por 5 animais (ratos machos). Os grupos
teste são aqueles em que a gavagem foi realizada com a pseudoboemita e aciclovir. O
grupo controle é aquele em que o aciclovir foi administrado somente em água.
Em determinação a resolução da ANVISA (2010) , as pesquisas clínicas
no Brasil com medicamentos e produtos para a saúde, com a finalidade de registro futuro
devem ser submetidas à avaliação da (ANVISA) e dados pré clínicos e de estudos clínicos
de fases anteriores ao protocolo devem ser apresentados para dar subsídio à esta
avaliação. Portanto, as pesquisas em modelos animais fundamentam as pesquisas clínicas.
Sem pesquisa pré-clínica, não há a realização de ensaio clínico, não havendo,
conseqüentemente, nem a aprovação nem a liberação de medicamentos novos e produtos
para a saúde em nosso país. Há rigor na avaliação de protocolos de pesquisa envolvendo
seres humanos.
A regulamentação das pesquisas em animais no Brasil se iniciou em 1934. A
primeira lei que regulamentou a utilização de animais em pesquisa no mundo foi
publicada em 1876, no Reino Unido. Quase 60 anos depois, em 10 de julho de 1934, o
Chefe do Governo Provisório dos Estados Unidos do Brasil, o Sr. Getúlio Vargas,
publicou o Decreto Lei nº 24.645, regulamentado posteriormente pelo Decreto Lei nº
3.688 de 3 de outubro de 1941. Esta lei determina que todos os animais existentes no país
são tutelados pelo estado e penaliza quem aplicar ou fizer aplicar maus tratos aos animais.
O artigo 3º apresenta 31 incisos, que conceituam o que são maus tratos aos animais.
Com relação à pesquisa científica o inciso IV determina que é considerado
maus tratos “golpear, ferir ou mutilar voluntariamente qualquer órgão ou tecido, exceto a
castração, só para animais domésticos, ou outras operações praticadas em benefício
exclusivo do animal e exigidas para defesa do homem, ou do interesse da ciência. Ainda
é importante ressaltar que: praticar ato de abuso e crueldade; manter animais em locais
anti higiênicos, que impeçam a respiração, movimentos e descanso ou os privem de água
e luz; abandonar animal doente ou ferido, extenuado ou mutilado, bem como deixar de
ministrar a ele tudo o que humanitariamente possa prover; não dar morte rápida, livre de
15
sofrimento prolongado a todo animal cujo extermínio seja necessário para consumo ou
não.
2.4 ACICLOVIR
Aciclovir é um fármaco denominado 9-[(2-hidroxietoxi)metil]guamina
similar, porém sintético, aos nucleosídeos purínicos com atividade antiviral. É
considerado um dos agentes antivirais mais eficazes e mais seletivo contra todos os tipos
de herpes simples, tipo 1(HSV1) e tipo 2(HSV2) e também contra o vírus Varicella Zoster
(VZV), sendo as atividades bastante seletivas para as células infectadas (ELION, 1982).
Sendo de natureza hidrofílica e anfótera, o aciclovir possui valores de pKa=2,4 para a
protonação e pKa=9,2 para a desprotonação em razão do potencial hidrogeniônico e
hidroxiliônico (OH-) e (H+). A via oral é preferida em relação a parental em razão dos
riscos de toxicidade local, entretanto, quando administrado via oral é pouco absorvido
pelo trato gastrintestinal, com uma biodisponibilidade variando entre 15 - 30 %. Assim,
para a garantia de uma maior eficiência de absorção muitas vezes são utilizados métodos
com doses excessivas e, desta forma, muitas vezes atingindo o intervalo tóxico. O
Esquema 2 apresenta a fórmula do aciclovir.
Esquema 1 Fórmula estrutural do aciclovir, 9-[(2-
hidroxietoxi)metil]guamina. Fonte: Soares (2003).
O aciclovir é utilizado no tratamento de doenças como a Herpes e HPV,
quando administrado por via oral é parcialmente absorvido no trato gastrointestinal,
apenas 20% da dose é absorvida e as concentrações plasmáticas máximas são atingidas
em 1-2 h, sendo necessária a sua administração normalmente em duas vezes ao dia
(STULZER et al., 2007).
16
O aciclovir é um fármaco de Classe IV do sistema de classificação
biofarmacêutica segundo Amidon (1995). Um dos principais alvos de estudos em
tecnologia farmacêutica, por apresentar problemas de dissolução, são aqueles para
melhorar sua solubilidade, sem partir para modificações moleculares (LIRA, 2004).
2.5 PSEUDOBOEMITA
A pseudoboemita é um material sintético com estrutura muito próxima ao
do mineral boemita. Pseudoboemita e pseudoboemita fibrilar são caracterizáveis por
difração de raios X e por expalhamento de elétrons utilizando microscopia eletrônica de
transmissão. (SANTOS et al., 2009).
A produção de nanoparticulados inclui grande variedade de métodos
físicos, químicos e mecânicos. Dentre as diversas técnicas utilizadas para a síntese de pós
nanoparticulados de cerâmicas, o processo sol gel é o mais utilizado e estudado. Novicks
(2009) e Munhoz Júnior et al. (2010), realizaram análises microscópicas da
pseudoboemita em microscópio eletrônico de varredura, a fim de caracterizar a
morfologia de suas partículas. Em análise de microscopia eletrônica de varredura
utilizando detector de elétrons secundário (Micrografia 1), Novicks (2009) observou que
a pseudoboemita é constituída por uma superfície bastante porosa que aparenta ter uma
morfologia homogênea, o que favorece a adsorção quanto a sua maior superfície em
função do material ser microscopicamente amorfo. Esta porosidade alta do material
também foi confirmada pela obtenção de sua área específica pela técnica BET 277,5 m2/g
(KLOPROGGE et al., 2006; MACEPO et al., 2006)
Micrografia 1: Microscopia eletrônica de varredura de amostra da
pseudoboemita, Fonte: MUNHOZ JÚNIOR et al. (2010).
17
Mazalli (2005), demonstrou que no processo de obtenção de cerâmicas
pelo processo sol gel, utilizando precursores alcóxidos após a hidrólise, ocorreu o
fenômeno de formação do gel por reação de policondensação.
Kloprogge e colaboradores (2006), em estudo entre a boemita e
pseudoboemita mostraram que a diferença entre elas era que a célula unitária da
pseudoboemita é levemente maior que a boemita, podendo entender que sua forma
estrutural é do Al+3 “mal cristalizado” na composição de Al2O3.xH2O (2,0 > x >1,0) com
espaçamentos inter planares aumentados na direção [020] até o valor de 0,67 nm (6.7 Ā)
em comparação com 6.12 Ā para boemita (COELHO et al., 2008).
Segundo Novickis (2009) e Munhoz Júnior (2009), a pseudoboemita
quando calcinada pode fornecer as seguintes fases cristalinas da alumina:
Pseudoboemita gamma-alumina delta-alumina theta-alumina alpha-alumina.
A obtenção da pseudoboemita pela técnica sol gel em meio aquoso a partir
da polimerização inorgânica dos precursores que contenham alumínio e que contenham
hidroxílas, por exemplo, cloreto de alumínio hexahidratado (AlCl3.6H2O) e hidróxido de
amônio (NH4OH) pôde ser realizada. A adição destes reagentes formaram um gel pelo
íon hidroxônio (OH-) e o pH era elevado no meio básico, passando a ganhar um elétron,
passando de [Al(OH)2] + para [Al(OH)3]
+. A derivação da reação passou de dímero para
18
tetrâmeros e octâmeros, formando então um polímero linear da pseudoboemita também
chamado de pseudoboemita fibrilar (ALMEIDA FILHO et al., 1999).
2.6 ADSORÇÃO, BIODISPONIBILIDADE E SOLUBILIDADE
A adsorção é um processo similar ao de absorção, por meio da qual uma
substância no estado gasoso ou líquido torna-se ligado a um sólido. A superfície de
contato é determinada pelas ligações secundárias ou cruzadas sem sofrer reação química,
onde forma-se uma camada de interface. Sendo a superfície maior do material sólido,
maior será a natureza adsorvente (DUREJA; PHARAM; MADAN, 2007). A adsorção
pode ser física ou química sendo que a diferença entre elas é apresentada na Quadro 2.
Quadro 2 Principais diferenças entre adsorção física e adsorção química. Fonte:
MUNHOZ JUNIOR et al. (2010).
Adsorção física Adsorção química
Causada pela força de van der Walls Causada pelas forças eletrostáticas e ligações covalentes
Não há transferência de elétrons Há trasferência de elétrons
Calor de adsorção = 2 – 6 kcal/mol Calor de adsorção = 100 – 200 kcal/mol
Fenômeno geral para qualquer espécie Fenômeno específico e seletivo
A camada adsorvida pode ser removida por A camada adsorvida só é removida por aplicação
aplicação de vácuo de vácuo e aquecimento por temperatura acima
Formação de multicamadas da temperatura Somente a formação de monocamadas
crítica
Acontece somente abaixo da temperatura Acontece também a altas temperaturas
crítica
Lenta ou rápida Instantânea
Adsorvente quase não é afetado Adsorvente altamente modificado na superfície
No Quadro 2, são apresentadas as diferenças entre reações físicas e
químicas, em que as reações físicas é demostrada pela equação 1.
19
A + B = A.B (Equação 1)
Em que A é o adsorbato, B é o adsorvente e A.B é o composto adsorvido
ligado a forças químicas. A comparação entre as energias envolvidas na adsorção química
e física é apresentada no Gráfico 1.
Gráfico 1. Comparação entre as energias envolvidas na adsorção física e
química.
+
As mudanças de estados e reações são sempre exotérmica em relação as
entalpias em que a ΔH acompanha a adsorção. Este fenômeno de superfície está ligado a
tensão superficial das soluções, onde depende da temperatura de mudança de estado e
adsorção entre as concentrações de adsorvato e adsorbato juntamente com o fluído de
contato com o adsorvente. A fórmula representativa da variação de entalpia em relação a
troca de energias é sempre negativa, sendo no final maior que zero. (Equação 2)
ΔHads = ΔGads + TΔSads, (-ΔHads) >0 ( Equação 2 )
Em que: ΔHads é a variação de entalpia do adsorvente, ΔGads é a energia de
Gibbs de adsorção que é negativa e TΔSads é a variação do adsorbato sendo
necessariamente negativa.
Existem dois tipos conhecidos de adsorção: a adsorção física ou
fisiosorção e a adsorção química ou quimiosorção, os dois fenômenos podem ocorrer
juntos (CHEREMISINOFF; ELLERBUSSCH, 1978).
20
Os efeitos das forças de van der Walls são chamados de fisiosorção ou
fenômeno físico, sendo exotérmico e reversível, as forças de atração são consideradas
interações fracas, a energia produzida é fisicamente adsorvida e na condensação é
liberada. Neste processo a interação é eletrostática entre o particulado e o sólido
superficial.
2.6.1 Biodisponibilidade
A biodisponibilidade é a medida da quantidade de medicamento, contida
em uma fórmula farmacêutica, que chega à circulação sistêmica e a velocidade na qual
ocorre esse processo. Na farmacologia, o termo biodisponibilidade é usado para descrever
a fração de uma dose administrada de um fármaco que atinge a circulação sistêmica. É
uma das principais propriedades farmacocinéticas dos fármacos.
A biodisponibilidade é uma das ferramentas essenciais da famarcocinética,
já que seu valor deve ser considerado quando se calcula as doses para administração de
drogas por vias não intravenosas. Por definição, quando uma medicação é administrada
intravenosamente, sua biodisponibilidade é 100%. Entretanto, quando uma medicação é
administrada por outras vias (como a via oral, por exemplo), sua biodisponibilidade
diminui (em razão da absorção incompleta e ao metabolismo de primeira passagem).
Esse fenômeno de biodisponibilidade se expressa em relação à
administração intravenosa do princípio ativo (biodisponibilidade absoluta) ou a
administração, por via oral, de um produto de referência (biodisponibilidade relativa ou
comparativa).
A biodisponibilidade de um medicamento não deve ser confundida com a
fração biodisponível, a menos que se refira à biodisponibilidade absoluta (ANVISA,
1998).
O fenômeno de biodisponibilidade indica a velocidade e a extensão de
absorção de um princípio ativo em uma forma de dosagem, a partir de sua curva
concentração/tempo na circulação sistêmica ou sua excreção na urina. (ANVISA, 1999)
2.6.2 Solubilidade
Os princípios de solubilidade e o grau de dissolução de um soluto em um
solvente depende de vários fatores, entre eles a origem de interação entre o solvente e o
21
soluto e da temperatura. O efeito de solubilidade entre um soluto e solvente são
principalmente relacionados às moléculas apolares e polares (MASTERTON;
SLOWINSKI; STANITSKI, 1990).
2.6.3 Difusão de fármacos
O Esquema 2 apresenta a difusão entre o fármaco, o solvente e o soluto
tendo em vista as modificações de um material polimérico e a solubilização sem mudança
de estado químico.
Esquema 2: Difusão por solubilização e liberação de fármacos por meio
da solubilização de polímero e fármaco. Fonte: Martins Lopes, 2006.
A substância é contida na parte interna do polímero em tempo igual a zero
e após esse tempo determinado igual a t, o fármaco (soluto) difunde no solvente,
ocorrendo a solubilização.
O processo de difusão na liberação controlada de fármacos é descrito pela
primeira lei de Fick (Equação 3 )
J = - DKΔC (Equação 3)
L
em que, no caso de liberação de fármacos ;
J = fluxo de difusão (massa que difunde/tempo);
22
D = coeficiente de difusão (cm2/tempo);
K = constante conforme a geometria do dispositivo de liberação (obs: originário
da segunda lei de Fick que calcula a cinética de liberação pela forma).
ΔC = fluxo proporcional ao gradiente (delta concentração/distância em cm);
A difusão entre os fármacos é demonstrada pela lei de Fick, no qual o
movimento browniano, fundamentam os aspectos entre o soluto e o solvente.
2.7 FARMOCINÉTICA
A farmacocinética estuda a atividade do antimicrobiano no interior do
organismo a partir dos parâmetros de velocidade de absorção, distribuição e eliminação
do fármaco e de seus metabólitos. Com os conhecimentos de farmacocinética e das
características do microrganismo frente ao antimicrobiano é possível adequar posologia,
via de administração e intervalo entre cada dose, visando melhorar o resultado terapêutico
e, ao mesmo tempo, reduzir a probabilidade de desenvolver efeitos tóxicos potenciais.
2.8 LIBERAÇÃO CONTROLADA NA FORMA FARMACÊUTICA
A liberação de formas farmacêuticas também conhecida como
farmocinética, tendo como principal motivo intuito a não desagregação e a liberação do
fármaco lentamente (mudança de área quase nula não atingindo as condições de
equilíbrio) é expressa pela Equação 4.
W0 – Wt = Kt ( Equação 4 )
Sendo: W0 a quantidade inicial de fármaco na forma farmacêutica, Wt a quantidade que
resta de fármaco na forma farmacêutica ao fim do tempo t e K uma constante de
proporcionalidade.
23
Da Equação 4 quando dividida por W0 obtem-se a Equação 5.
ƒt = K0t ( Equação 5 )
Sendo ft =1 - (Wt/W0), em que ft representa a fração de fármaco liberado no
tempo t e K0 a constante de velocidade aparente de dissolução ou constante de liberação
de ordem zero.
Desse modo, um gráfico da fração liberada do fármaco versus tempo será
linear se as condições previamente estabelecidas forem cumpridas.
Esta relação pode ser utilizada para descrever a liberação controlada de
fármacos por vários tipos de formas farmacêuticas de liberação controlada. (Equação 6)
Qt = Qo + K0 t ( Equação 6 )
sendo Qt a quantidade de fármaco liberada no tempo t, Q0 a quantidade inicial de fármaco
na solução (na maior parte das vezes, Q0= 0) e K0 a constante de liberação de ordem zero.
Para achar a velocidade da reação divide-se a variação na concentração do
material pelo período de tempo no qual a variação ocorreu. Em razão do fato do material
estar sendo consumido nesta reação, obtem-se um resultado negativo. Por convenção os
dados de velocidade são colocados com o sinal positivo, nestes casos.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Poli(àlcool vinílico) (PVAI)
O PVAI tem a função de aumentar a viscosidade do meio na solução
precursora do nitrato de alumínio, a solução utilizada foi de 8 % em massa de PVAI em
água deionizada (fornecedor: LabSynth).
3.1.2 Nitrato de alumínio (AlNO3.9H2O)
O nitrato de alumínio foi utilizado para formação da solução precursora de
pseudoboemita, sendo a solução utilizada de 980 g/L (fornecedor: LabSynth)
24
3.1.3 Hidróxido de Amônio (NH4OH)
Para obtenção da pseudoboemita por polimerização inorgânica, com o
aumento do pH, formando um gel. A solução utilizada foi de NH4OH, 28 % em massa de
NH3 (fornecedor: LabSynth)
3.1.4 Pseudoboemita
Os géis de pseudoboemita foram sintetizados via processo sol gel utilizando-
se como precursores soluções de nitrato de alumínio nono-hidratado, Al(NO3)3·9H2O
(950 g/L) e hidróxido de amônio, NH4OH (28 % em massa). O uso bem sucedido desses
reagentes como precursores da pseudoboemita já havia sido reportado por Moroz et al
(2006). Segundo Moroz et al (2006), as pseudoboemitas obtidas a partir de nitrato de
alumínio são as que apresentam maior área específica.
Com o auxílio de uma bureta, o nitrato de alumínio foi gotejado sobre um
béquer contendo hidróxido de amônio com constante agitação até se atingir pH 7. A
solução de nitrato de alumínio foi adicionada a solução de álcool polivinílico (8 % em
massa).
As condições de manuseio e temperatura no preparo da reação de síntese foi
de (-5° C), sem utilizar agitação no meio. Após a formação do gel, foi envelhecido e
lavado durante a filtração com água destilada para a retirada dos subprodutos (NH4NO3).
O material particulado resultante da síntese do gel foi seco a 70 °C em estufa por 12 horas,
finalmente o material foi moído e peneirado em peneira com abertura de malha de 90
micrometros.
As pseudoboemitas foram caracterizadas por análises térmicas utilizando
razão de aquecimento de 20 º C/minuto em atmosfera de nitrogênio e difração de raios X
utilizando radiação cobre kα.
3.1.5 Fármaco Aciclovir
O fornecedor do fármaco Aciclovir utilizado no experimanto “in vivo” foi
fornecido pela Henrifarma.
25
3.2 RATOS MACHOS PARA EXPERIMENTAL “IN VIVO”
Os animais utilizados no processo “in vivo” foram adquiridos na
Universidade de São Paulo – SP, ao todo foram 20 ratos, levados e mantidos no Biotério
Central da Universidade Presbiteriana Mackenzie, em condições especiais controladas de
umidade, temperatura (21º ± 2º C) e ciclo de claro/escuro de 12 horas.
No processo em que os animais passaram pelo experimento, foram
alimentados com ração comercial própria para a espécie (ração para animais de
laboratório, marca Nuvital) e água.
A manutenção, alimentação, tratamento e eutanásia dos animais utilizados
seguiram normas éticas recomendadas. No procedimento de administração via oral até o
tempo de metabolização do Aciclovir e pseudoboemita, esses animais, no total 20 ratos
machos sofreram eutanásia, livre de sofrimento e dor, por sobrecarga anestésica de
Cetamina.
Foram tomadas medidas e procedimentos experimentais adotados para o
estudo, onde obedeceram às normas estabelecidas pela comissão de pesquisa e ética da
Universidade Presbiteriana Mackenzie. Estes foram aprovados pelo Comitê de Ética no
uso de animais da Universidade Presbiteriana Mackenzie – processo (CEUA) Comissão
de Ética no uso de Animais 120/11/2014.
3.2.1 Estabelecimento das doses de ensaio e administração.
Para o ensaio “in vivo” no teste proposto foram utilizados 20 ratos “wistar
machos”. Os animais após a chegada ao Mackenzie ficaram 5 dias de quarentena no
biotério da Universidade. Após esse período eles foram pesados e marcados. Caso o peso
estivesse abaixo do ideal, esperava-se uma semana e repetia-se a pesagem.
Eles foram alimentados com ração e água. No dia do procedimento a
alimentação permaneceu a mesma.
A gavagem foi feita em uma sala separada. A caixa toda era levada e os
ratos recebiam a gavagem de um em um. Ao final do procedimento eles retornavam ao
biotério para esperar o tempo de intervalo entre a gavagem e a eutanásia. Nesse período
a comida e água continuaram disponíveis.
26
No final do intervalo determinado (1, 2 ou 3 horas) cada rato era levado
para sala separada em uma gaiola individual enquanto os demais permaneciam no
biotério. A anestesia era administrada com agulha própria para insulina e seringa de 1
mL.
Os anestésicos admistrados foram uma mistura de cetamina, um anestésico
que atua nas viceras e xilazina, um relaxante muscular.
Após a administração do anestésico, se esperou o tempo adequado para
total sedação do animal e só então iniciou-se o processo de eutanásia.
Em uma tábua de madeira, o animal sedado foi preso pelas patas com fita
crepe. Com auxílio de tesoura e pinça cirúrgicas, o tronco do animal foi aberto, de modo
a revelar sua veia cava, localizada abaixo do fígado.
Com o auxílio de uma agulha de 0,70x30 mm e uma seringa de 5 mL, foi
coletado 4 mL de sangue do animal. Em alguns casos, quando não era possível coletar
esse volume, um pouco de sangue foi coletado diretamente do coração. O sangue foi
transferido para um tubo hemo roxo com EDTA e após a adição do sangue este era
armazenado em uma geladeira.
Ao final da eutanásia, o rato era colocado em um saco plástico branco para
material infectante e colocado no freezer para encaminhamento do próprio biotério.
No final da eutanásia de todos os animais, o sangue foi centrifugado para
separação do soro. Esse foi armazenado em eppendorfs e colocado em um freezer para
posterior análise.
Os ratos foram divididos em 4 grupos e separados 5 em 5 com dose de
aciclovir e pseudoboemita, que foram administradas oralmente por gavagem com doses
de ensaio predeterminadas, conforme apresentado na Tabela 3. Foram administrados 16,4
mg de aciclovir/kg de rato em 1 ml de água destilada. Utilizou-se 100 mg de
pseudoboemita em gel.
Após a administração, os animais foram observados por um período total
de 8 horas, o teor de aciclovir no plasma foi analisado pela técnica de CLAE em função
do tempo. Os períodos propostos tiveram efeito da concentração em função do tempo,
demonstrando uma diminuição da concentração por CLAE.
Durante o experimento, cada grupo de ratos foi mantido em uma gaiola de
polipropileno com maravalha limpa.
27
Tabela 1: Distribuição dos 20 ratos em grupos, n = número de animais;
procedimento de gavagem e método CLAE para ensaio “in vivo”
Na tabela 1 são apresentados os grupos grupos para a gavagem e os ensaios “in
vivo”.
ENSAIOS No DE RATOS DATA ADMINISTRAÇÃO aciclovir
GRUPO 1
(n=5)
5 06/06/2015 16,4 mg/kg
GRUPO 2
(n=5)
5 06/06/2015 16,4 mg/kg+Pseudoboemita
GRUPO 3
(n=5)
5 23/06/2015 16,4 mg/kg
GRUPO 4
(n=5)
5 23/06/2015 16,4 mg/kg +pseudoboemita
3.2.2 Obtenção das amostras (plasma): avaliação bioquímica – ensaio quantitativo
pelo método de CLAE. Determinação da presença do fármaco aciclovir no plasma
sanguíneo.
Foi realizado o teste para detecção e quantificação do aciclovir no plasma
dos ratos.
Neste teste foram utilizados 20 ratos wistar, machos. Estes foram
divididos em 4 grupos todos tratados com dose única de aciclovir (ACV) (16,4 mg/kg) +
água destilada e outro grupo tratado com dose única de uma mistura de ACV +
pseudoboemita + água destilada por gavagem. O peso de cada rato foi em torno de 300
gramas.
Após 1 hora e meia, os animais foram anestesiados com cloridrato de
cetamina 10 % por via intraperitonial. As amostras de sangue foram colhidas com
28
anticoagulantes (EDTA 1 mg/ mL) e centrifugadas a 1500 rpm para obtenção do plasma.
As amostras foram agitadas em agitador magnético da marca Vortex por 15 segundos e
filtradas com auxílio de cartuchos acoplados em uma cuba coletora de amostra, onde foi
efetuado o vácuo.
O tempo de retenção do ACV puro e sua concentração plasmática foi
determinada por CLAE para sua comparação e detecção.
Os procedimentos descritos anteriormente foram realizados
individualmente e em local isolado, a fim de evitar qualquer estresse nos demais animais.
Em todos os grupos foi realizado jejum prévio às coletas.
As amostras foram analisadas imediatamente com o preservante e o preparo
com (E.D.T.A) em temperatura de 20 °C em análise por CLAE.
As amostras de plasma dos animais de todos os grupos posteriormente foram
analisadas por CLAE com detector de UV vis para determinação da quantidade do
aciclovir no plasma em função do tempo de absorção no organismo como um todo.
Nas análises por CLAE, para a determinação de aciclovir foram utilizados
kits de SPE (Extração por Fase Sólida) comerciais da marca Strata Phenomenex e
extraídos em microvials com tampa de teflon. Os valores foram determinados por
equipamento automatizado por software da marca TSP, capaz de medir com exatidão na
absorbância de 254 nm (Fotografia 1) a qual é a banda característica para detecção de
aciclovir. Foram analisados padrões de aciclovir nas mesmas condições para construir
uma curva de calibração para determinar o teor de aciclovir no plasma dos “wistar rats”.
Fotografia 1: Cromatógrafo Líquido de Alta Resolução (CLAE) TSP com
detector UV-vis. Fonte: UPM – Mackenzie
O equipamento utilizado (Fotografia 1) demonstrou ter um desempenho
eficiente para análise de aciclovir em plasma sanguíneo e em soro.
29
Para a determinação da curva de concentração de aciclovir no plasma, fez-
se um gráfico em função do tempo de administração nos “wistar rats”.
3.2.3 Método de preparo e análise por CLAE, para ensaios “in vivo”.
A análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE), ocupa uma
grande gama de fármacos, por ter uma seleção de métodos nas Farmacopeias Brasileiras
e Europeias e é utilizado com freqüência em ensaios de validação farmacêutica, possui
boa robustez, sensibilidade e é utilizado para análise de instabilidade de materiais.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), como um método de
comparação, tem sido aplicado à determinação quantitativa de analitos nas amostras. A
aplicação da metodologia Cromatografia Líquida de Alta Eficiência clássica, consiste no
uso de cromatogramas obtidos de um único comprimento de onda. A fase estacionária
consiste em um meio, sólido adsorvente empacotado em uma coluna de metal do tipo
inoxidável, com diâmetros e comprimentos diferentes e a fase móvel consiste em
solventes aquosos, para a formação de um gradiente de separação, podendo ser isocrático,
onde este eluente é bombeado por meio de uma bomba unitária, binária ou quaternária,
no caso para fármacos, a melhor é a quaternária pela formação do gradiente e eficiência
alta, pressurizada, fornecendo uma vazão de fase móvel adequada para a análise
(LANÇAS, 2006).
Os experimentos foram feitos no Laboratório do Mackenzie, com os
equipamentos iniciais de preparo e dissolutor no laboratório de química. O Cromatógrafo
utilizado foi da marca Thermo Separation Products (TSP) com software acoplado, no
estilo robótico com amostrador automático para melhor repetibilidade, com fase reversa
C-18 (nano octadecilsiloxano) da marca NST (Nano Separation Technologies) de 25 cm,
0,5 nm e detector UV vis de duplo feixe.
Inicialmente foram preparados padrões do fármaco aciclovir para determinar
o tempo de retenção do ativo em solução de HCl 0,1 M, as concentrações foram de 0;5;
1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mg.mL-1 determinando assim, os limites de detecção e quantificação
do fármaco, o desvio padrão foi automaticamente calculado pelo software OCS-2 (TSP).
As condições de ensaio para o aciclovir foram com detector UV vis 254
nm. A fase móvel utilizada era constituída de água ultra pura e acenotinitrila
(95:5 v/v), utilizando bomba quaternária sob fluxo de 0,8 mL/min. O tempo de retenção
30
do aciclovir foi de 7,5 min com pico simétrico, para fluxo isocrático (STULZER, et al.
2007).
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os resultados dos ensaios de caracterização da pseudoboemita mostraram
pelo difratograma de raios X que somente uma fase (pseudoboemita) está presente na
amostra (Difratograma 1).
31
Difratograma 1. Difratograma de raios X da pseudoboemita
A análise térmica diferencial-DTA e termogravimétrica-TG (Termograma
1) mostraram que o material apresentou uma perda de massa em torno de 100 º C em
razão da água adsorvida e uma perda de massa em torno de 438 º C de acordo com a DTG
(Termograma 2) devido a transformação de fase de pseudoboemita em gamma alumina.
Ainda de acordo com o Termograma 1, observou-se em torno de 1200º C a última
transformação de fase da alumina com a formação da fase alpha alumina.
Termograma 1. DTA e TG da pseudoboemita
32
Termograma 2. TG e DTG da pseudoboemita
33
4.1 CURVA DE CALIBRAÇÃO DO ACICLOVIR
A curva de calibração foi obtida em função da área do pico para as
seguintes concentrações: 1,0 g.L-1, 2,0 g.L-1, 3,0 g.L-1, 4,0 g.L-1 e 5,0 g.L-1 . Também
foram obtidos os respectivos tempo de retenção, tr0.
No Cromatograma 2 são apresentados os resultados das análises de
aciclovir utilizados para a confecção da curva de calibração do teor de aciclovir.
No gráfico 2 são mostrados os resultados dos teores de aciclovir para a
confecção da curva de calibração e apresentados na Tabela 4. No Gráfico 2 observou-se
que foi obtida uma linearidade 0,96 dos dados experimentais.
Cromatograma 2: Relação dos cromatogramas identificados nas devidas
concentrações de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0 g.L-1 de aciclovir com as respectivas áreas dos picos.
Fonte: HPLC – Detector UV vis -245 nm - UPM – Mackenzie – SP, 2015
34
Tabela 2. Concentração do aciclovir x área do pico dado. Resultados das análises
por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
Concentração de aciclovir (g.L-1). Área do pico (unidades)
1 142.965
2 241.796
3 499.521
4 556.234
5 726.250
A linearidade obtida da curva de concentração para análises de aciclovir foi de
0,96.
Gráfico 2. Curva de calibração de aciclovir na concentração em função da
área do pico.
y = 148101x - 10949R² = 0,9693
0
100.000
200.000
300.000
400.000
500.000
600.000
700.000
800.000
0 1 2 3 4 5 6
área
concentração
ACV
35
4.2 RESULTADOS DAS ANÁLISES DE ACICLOVIR NO PLASMA DOS RATOS.
Foram obtidos os resultados para análise de aciclovir utilizando a técnica
de CLAE com e sem a peseudoboemita.
No cromatograma 3 está indicando a concentração padrão do aciclovir no
plasma dos ratos após 1 hora de injeção
Cromatograma 3: concentração de aciclovir padrão após 1 hora, injeção
1. Tr0: 6,891.
A partir das análises do soro sanguíneo foram determinadas as
concentrações de aciclovir no plasma dos ratos analisados, para os ratos que foram
administrados por gavagem aciclovir com e sem o excipiente pseudoboemita.
No cromatograma 4 apresenta-se o resultado do ensaio de aciclovir com
pseudoboemita em ratos na análise do plasma sanguíneo após tempo de gavagem de 2
horas
36
Cromatograma 4: Resultado da concentração de aciclovir no plasma
sanguíneo da amostra de sangue do rato 5 após 2 horas de gavagem no dia 23/06/2015.
Cromatograma 5 Concentração de aciclovir no plasma sanguíneo da amostra de
sangue do rato 5 após 3 Horas de gavagem no dia 23/06/2015
No cromatograma 5 são apresentados os resultados ensaio de aciclovir com
pseudoboemita em ratos por análise do plasma sanguíneo após tempo de gavagem de 3
horas
Nos cromatogramas 4 e 5 o tempo de retenção foi comparado com os
padrões, principalmente com a mesma resolução, mesma absortividade molar e mesma
intensidade x área do pico. Em todos os cromatogramas observou-se uma grande
quantidade de picos em razão da complexidade da composição do plasma de ratos.
37
No mesmo campo amostral demonstrou-se áreas muito próximas, desvio
padrão de 0,7 % em unidade de área a 4 mg. L-1 , comparando com esses dados
determinou-se o campo amostral entre padrões e as amostras de soro e plasma sanguíneo.
Nos ensaios em plasma sanguíneo houve uma dificuldade na detecção pela
quantidade de matéria orgânica presente no sangue, 80% de orgânico e biológico.
Alguns picos sobrepostos e entupimentos atrapalharam as resoluções, pois
não é um ensaio indicado para sangue concentrado pelo método de Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE), houve um grau elevado de dificuldade na análise. Neste caso
utilizou-se filtros porosos e diluições para avaliação dos resultados.
4.3 LIMITE DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
Na Tabela 3 estão representados os resultados a partir da determinação em
CLAE e o tempo do padrão de comparação nas proximidades do campo amostral do
aciclovir, com concentração de 4 mg. L-1.
No cromatograma 6 são mostrados o tempo de retenção igual a 7,119
próximo ao campo amostral das amostras de soro e plasma sanguíneo.
Cromatograma 6:. Limite de Quantificação próximo ao campo amostral,
concentração 4 mg.L-1
38
Tabela 3: Concentração de ACV em plasma sanguíneo em mg/l-1, ensaios (17/06/2015).
Ensaios Horas Concentração T. ret. ACV Diluição
rato 1(ACV) 1 5,400 7,000 1:1
rato 3(ACV) 2 4,125 6,795 1:1
rato 4(ACV) 3 4,000 7,188 1:1
rato 1(ACV+PSEU) 1 2,780 7,674 1:1
rato 2(ACV+PSEU) 2 1,920 6,210 1:1
rato 5(ACV+PSEU) 3 1,215 6,213 1:1
No gráfico 3, apresenta-se a curva de concentração em relação ao tempo
de gavagem do ACV e a liberação controlada do fármaco. Observa-se que para os casos
em que a gavagem foi realizada com pseudoboemita o teor de aciclovir no plasma
sanguíneo é menor.
Gráfico 3: Concentrações de ACV em plasma sanguíneo (pontos azuis:
gavagem com aciclovir e água; pontos laranjas: gavagem com acicolvir e
pseudoboemita).
Na tabela 4, as concentrações de aciclovir para gavagem com
pseudoboemita iniciaram com 5,84 mg.L-1 e finalizaram com 2,24 mg. L-1, monstrando
0
1
2
3
4
5
6
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
con
cen
traç
ão d
e ac
iclo
vir
(mg/
L)
tempo (horas)
39
que o tempo de adsorção no plasma sanguíneo com pseudoboemita mais eficaz. Com os
dados da Tabela 4 foi obtido o Gráfico 4.
Tabela 4: Concentração de aciclovir em soro sanguíneo em mgL-1, ensaios
realizados dia 22/06/2015
Ensaios Horas Concentração T. ret. ACV diluição
Rato 1(ACV) 1 5,380 6,943 1:1
Rato 2(ACV) 2 5,360 6,790 1:1
Rato 3(ACV) 3 4,140 6,213 1:1
Rato 4(ACV+PSEU) 1 5,840 6,989 1:1
Rato 5(ACV+PSEU) 2 4,480 7,000 1:1
Rato 6(ACV+PSEU) 3 2,240 6,948 1:1
No Gráfico 4, obtido a partir dos dados da Tabela 4, apresenta-se a curva de
concentração em relação ao tempo de gavagem do ACV e a liberação controlada do
fármaco.
Gráfico 4: Concentração de aciclovir em relação ao tempo de gavagem no
plasma (pontos azuis: gavagem com aciclovir e água; pontos laranjas: gavagem com
acicolvir e pseudoboemita).
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
con
cen
traç
ão d
e ac
iclo
vir
(mg/
L)
tempo (horas)
40
Na tabela 5 analisados o soro preparado com perclórico, aciclovir e
pseudoboemita com aciclovir demonstraram maior liberação pela maior absorção.
Tabela 5: Concentração do ACV em soro sanguíneo com preparo de ácido
Perclórico após centrifugação na data 06/07/2015.
Ensaios Horas Concentração T. ret. ACV diluição
rato 1 (ACV) 1 2,780 6,303 1:1
rato 2 (ACV) 2 1,630 6,497 1:1
rato 3 (ACV) 3 1,400 6,489 1:1
rato 4 (ACV+PSEU) 1 2,790 6,896 1:1
rato 5 (ACV+PSEU) 2 0,630 6,565 1:1
rato 6 (ACV+PSEU) 3 0,600 6,464 1:1
No grafico 5 apresenta-se a concentração em relação ao tempo em horas
de gavagem do aciclovir e aciclovir com a pseudoboemita (dados da Tabela 5).
Gráfico 5: Curva da concentração de aciclovir em relação ao tempo de
gavagem no soro extraído com ácido perclórico. (pontos azuis: gavagem com aciclovir e
água; pontos laranjas: gavagem com acicolvir e pseudoboemita).
41
.
Cabe observar que as concentrações de aciclovir no plasma dos diferentes grupos
de wistar rats para um mesmo intervalo de tempo não são iguais.
Os ratos dos diferentes grupos possuem idades diferentes e portanto metabolismo
diferente segundo Andreollo e colaboradores (2012), na idade adulta a cada mês do animal é
equivalente a 2,5 anos humanos. Assim sendo uma diferença de alguns meses na idade dos ratos
significa uma grande diferença de idade e consequentemente de metabolismo.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
con
cen
traç
ão d
e ac
iclo
vir
(mg/
L)
tempo (horas)
42
5. CONCLUSÕES
O método de cromatografia líquida de alta eficiência mostrou-se adequado para
quantificar o teor de aciclovir nas concentrações estudadas. A curva de calibração de teor de
aciclovir em função da área do cromatograma mostrou uma linearidade com coeficiente de
correlação de 0,96.
A análise de aciclovir no soro dos “wistar rats” embora tenha apresentado um
grande número de picos permitiu a quantificação de aciclovir em função do tempo de retenção
observado em torno de 7 minutos.
Nos ensaios “in vivo”, concluiu-se que, a concentração do fármaco aciclovir com
o excipiente pseudoboemita mostrou uma concentração menor do fármaco no plasma dos “ wistar
rats”. Tal fato sugere que a presença de pseudoboemita tenha promovido a melhor adsorção do
aciclovir pelos ratos reduzindo a concentração do aciclovir no plasma sanguíneo.
Os ensaios com o soro, tiveram uma resposta adequada ao tempo em relação a
concentração, comprovado nos ensaios de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
Cálculos de repetibilidade mostraram que o desvio padrão do teor de aciclovir analisado ficou
abaixo de 1%.
43
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