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BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR DDIISSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MMEESSTTRRAADDOO
ANÁLISE CARIOTÍPICA, HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FREQUÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS
RONs EM DUAS ESPÉCIES DE MELANOPLINAE (ORTHOPTERA: ACRIDIDAE)
JÉSSICA MIRANDA DO NASCIMENTO
RECIFE 2009
UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS
DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA
PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA EE BBIIOOLLOOGGIIAA MMOOLLEECCUULLAARR
DDIISSSSEERRTTAAÇÇÃÃOO DDEE MMEESSTTRRAADDOO
ANÁLISE CARIOTÍPICA, HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FREQUÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS RONs EM DUAS ESPÉCIES DE
MELANOPLINAE (ORTHOPTERA: ACRIDIDAE)
JÉSSICA MIRANDA DO NASCIMENTO
RECIFE 2009
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco como requisito para obtenção do grau de Mestre em Genética pela UFPE.
Orientador: Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes Co-orientador: Profª. Drª. Marília de França Rocha
Nascimento, Jéssica Miranda do Análise cariotípica, heterocromatina constitutiva e frequência de expressão das RONs em duas espécies de Melanoplinae (Orthoptera: Acrididae). / Jéssica Miranda do Nascimento. – Recife: A Autora, 2009. 75 folhas: il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Genética, 2009.
Inclui bibliografia.
1. Gafanhotos - Citogenética 2. Orthoptera 3. Acrididae. I Título. 595.727 CDU (2.ed.) UFPE 595.726 CDD (22.ed.) CCB – 2009- 045
À minha família e às minhas orientadoras, Maria José e Marília, com amor dedico.
“E um dia os homens descobrirão que esses discos voadores estavam apenas estudando a vida dos insetos...”
Mário Quintana
AAggrraaddeecciimmeennttooss
Em primeiro lugar a Deus pelo dom da vida, por sempre estar guiando meu caminho,
proporcionando alegrias e conforto nos momentos difíceis e por permitir a concretização de
mais uma etapa da minha vida profissional.
À minha família pelo amor, confiança, apoio, dedicação e pela torcida. Em especial, às
pessoas mais importantes da minha vida: meus avós, Maria e José Miranda; minha mãe,
Letícia; meus irmãos, Jonatha e Rebecca; meus tios, Betânia, Júlio, Otoniel (Tano), Kelly
e Socorro; meus primos Gabriel, Túlio, Maurício e Otoniel (Taninho) e minha cunhada
Diene.
À Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes pela orientação, dedicação, disponibilidade,
ensinamentos e pela confiança que me fez seguir para conclusão deste objetivo.
À Profª. Drª. Marília de França da Rocha pela co-orientação, amizade, carinho,
paciência, disponibilidade, incentivo e por sempre ter acreditado em mim, estimulando-me
nos momentos mais difíceis.
Ao CNPq pelo apoio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho (Processo
471485/2004-7).
Ao professor Dr. Carlos Salvador Carbonell da Universidade de Montevideo, Uruguai,
pela identificação taxonômica das espécies analisadas e pela disponibilidade.
Ao Professor Dr. Marcelo Guerra e à Drª. Ana Emília pela disponibilização do sistema
de captura de imagens do Laboratório de Citogenética Vegetal (Departamento de Genética/
CCB/ UFPE) e por viabilizar a realização da técnica de FISH. A Ituza e a Diogo pela ajuda
com a captura das imagens de fluorescência deste trabalho.
A Cirlene Maria da Silva pelo auxílio técnico, disponibilidade e, acima de tudo, pela
amizade depositada nestes dois anos.
A Camilla Vila Nova pela tradução e correção do texto em inglês.
Aos amigos, colegas e ex-colegas do Laboratório de Genética e Citogenética Animal
(UFPE): Adriana, Amanda, Angélica, Bárbara, Carolina (Carol), Cibele, Cybelle,
Danielle, Diogo, Evillis, Graciela, Guilherme, Iane, Jefferson, Marcela, Martin, Myrella,
Nara, Nayara, Pollyanna, Sárah, Thatiana e Tyago, minha sincera gratidão pela amizade,
disponibilidade, incentivo, pelas ajudas ao decorrer do trabalho e pelas divertidas conversas
no Laboratório.
A Ituza Celeste pela amizade, incentivo, companheirismo e cumplicidade desde os
tempos de graduação.
A Merilane Calixto pela amizade, estímulo, pelas longas conversas e confidências,
pelos momentos de lazer e, principalmente, por me incentivar nos momentos difíceis.
Às professoras Neide Santos e Vilma Loreto pela disponibilidade, conselhos e
ensinamentos.
Aos amigos e ex-colegas do Laboratório de Biodiversidade e Genética de Insetos
(UPE): Celso, Cristiane (Cris), Fernando, Maria Clara, Mônica, Nathália e Professora Rita
Moura.
Aos colegas de turma do curso de Mestrado: Betânia, Diego, Felipe, Gabriela, Geyner,
Ituza, Júlia, Marília, Nara, Petra, Rodrigo, Thatiana e Will.
A coordenação e secretaria do Programa de Pós-graduação em Genética (PPGG) pelo
auxílio prestado durante o mestrado.
Aos professores do PPGG, pela contribuição para a minha formação.
Aos funcionários do Departamento de Genética, em especial, Francisca (Fran),
Gilzinete (Dona Zizi) e Romildo pela atenção, disponibilidade e respeito.
A Aliny Costa e a Flávia Arruda pela amizade, companheirismo, estímulo,
conversas, farras e acima de tudo por nunca ter me negado ajuda nos momentos em que mais
precisei.
Aos amigos Camilla, Débora, Érika (Érikinha), Manuela (Manú), Márcia, Naara,
Raul e a família Tiné, Maria Juliana, Fernando e Fernandinho pela amizade, paciência,
incentivo, apoio e pelos maravilhosos momentos de lazer.
As minhas eternas amigas Andréa, Bruna, Érica, Francimary (Mary), Leila, Ligia
e Marilian pelo carinho, apoio, incentivo, confidências, farras, risadas... Amo vocês!
A todos que de alguma forma contribuíram para conclusão deste trabalho.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras ii
Lista de Tabelas iii
Introdução iv
Resumo
Abstract vi
viii
1. Revisão da Literatura 10
1.1. Considerações Gerais sobre a Família Acrididae 11
1.2. Caracterização Cariotípica em Acridoidea
1.2.1. Citogenética Convencional
1.2.1.2. Cromossomo Megamérico
1.2.2. Variabilidade Cariotípica
13
13
15
17
1.3. Heterocromatina Constitutiva (HC)
1.3.1. Considerações Gerais
1.3.2. Padrão de Distribuição e Qualificação da Heterocromatina
Constitutiva em Acridoidea
1.4. Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)
1.4.1. Considerações Gerais
1.4.2. Regiões Organizadoras de Nucléolos em Gafanhotos
20
20
24
30
30
32
2. Objetivos
2.1. Objetivo Geral
2.2. Objetivo Específicos
37
38
38
3. Materiais e Métodos 39
3.1. Materiais 40
3.2. Métodos 40
3.2.1. Processamento dos Espécimes
3.2.2. Preparações Citológicas
3.2.3. Coloração Convencional
3.2.4. Bandeamento C
3.2.5. Coloração CMA3/DA/DAPI
3.2.6. Impregnação com Nitrato de Prata (AgNO3)
40
41
41
41
41
42
3.2.7. Hibridização In Situ Fluorescente (FISH)
3.2.8. Documentação Fotográfica
42
43
4. Resultados
4.1. Baeacris punctulatus
4.2. Dichroplus fuscus
44
45
47
5. Discussão 57
6. Conclusões 62
7. Referências Bibliográficas 65
8. Anexo 74
8.1. Fotografias das Espécies Estudadas 75
i
LLiissttaa ddee AAbbrreevviiaattuurraass AgNO3 Nitrato de prata
AT Pares de bases Adenina e Timina
Ba(OH)2 Hidróxido de bário
CCB Centro de Ciências Biológicas
CMA3 Cromomicina A3
CMA3- Marcação CMA3 negativa
CMA3+ Marcação CMA3 positiva
DAPI 4’-6-diamidino-2-fenil-indol
DAPI- Marcação DAPI negativa
DAPI+ Marcação DAPI positiva
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNAr DNA ribossômico
ER Enzimas de Restrição
FISH Hibridização in situ fluorescente
G Cromossomo de tamanho grande
GC Pares de base Guanina e Citosina
HC Heterocromatina constitutiva
HCl Ácido clorídrico
HF Heterocromatina facultativa
M Cromossomo de tamanho médio
MM Mitramicina
P Cromossomo de tamanho pequeno
Pb Pares de bases
PEV Variegação por efeito de posição
RNA Ácido ribonucleico
RNAr RNA ribossômico
RON Região organizadora de nucléolo
SSC Solução salina citrato
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UFRPE Universidade Federal Rural de Pernambuco
UPE Universidade de Pernambuco
X Cromossomo X
ii
LLiissttaa ddee FFiigguurraass Figura 1. Células meióticas de Baeacris punctulatus coradas convencionalmente.
(a) Paquíteno; (b) diplóteno; (c) metáfase I; (d) metáfase II. Barra = 5 µm.
49
Figura 2. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração CMA3/DA/DAPI (c, d) em
cromossomos meióticos de Baeacris punctulatus. (a, b) Diplótenos; (c, d)
paquítenos. As cabeças de seta em c apontam os diminutos blocos CMA3+
pericentroméricos. A seta indica o bloco intersticial adicional. Barra = 5 µm.
50
Figura 3. Diferentes marcações das RONs ativas detectada pela impregnação
com AgNO3 em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, c, d) Zigótenos;
(b) diplóteno; (e, f) paquítenos iniciais. Barra = 5 µm.
51
Figura 4. Comparação entre as frequências de atividade das regiões
organizadoras de nucléolos (RONs) localizadas apenas em autossomos e em
autossomos e no cromossomo X em Baeacris punctulatus.
52
Figura 5. FISH com sonda de DNAr 45S em células meióticas de Baeacris
punctulatus. (a, b) Paquíteno; (c, d) metáfase II. Em a e c coloração com DAPI.
Barra = 5 µm.
53
Figura 6. Coloração convencional em células meióticas de Dichroplus fuscus.
(a) Paquíteno; (b) diacinese; (c) metáfase I; (d) anáfase I. Barra = 5 µm.
54
Figura 7. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração (CMA3/DA/DAPI) (c, d) em
células paquitênicas de Dichroplus fuscus. Em c paquíteno corado com CMA3 e
em d paquíteno corado com DAPI. As setas indicam os diminutos blocos
pericentroméricos de HC no bivalente G2. Barra = 5 µm.
55
Figura 8. Cromossomos meióticos de Dichroplus fuscus após impregnação com
AgNO3 (a, b) e FISH com sonda de DNAr 45S (c, d). (a) Zigóteno; (b, c, d)
paquíteno. Em c célula corada com DAPI. As setas indicam os sítios de DNAr
45S. Barra = 5 µm.
56
iii
LLiissttaa ddee TTaabbeellaass Tabela 1. Número de espécies analisadas, tipos de cariótipos e mecanismos
sexuais em Melanoplinae.
15
Tabela 2. Número de espécimes estudados de Baeacris punctulatus e
Dichroplus fuscus, locais de coleta e coordenadas geográficas.
40
Tabela 3. Comparação entre as freqüências de atividade das RONs em
Baeacris punctulatus.
46
INTRODUÇÃO
v
IInnttrroodduuççããoo
Acridoidea representa uma superfamília de gafanhotos com ampla distribuição
mundial. Estudos citogenéticos são amplamente realizados neste grupo, especialmente, em
acridomorfos das regiões Paleártica e Neotropical. Entretanto, para essa última, a maioria
destes estudos está restrita a análise convencional, revelando apenas número diplóide,
morfologia cromossômica e mecanismo de determinação sexual. Análises com colorações
diferenciais e técnicas moleculares têm sido realizadas em poucas famílias, sendo Acrididae e
Romaleidae as mais estudadas.
O cariótipo modal (2n=23,X0:24,XX) é considerado primitivo para Acrididae. Apesar
da conservação cariotípica deste grupo, variações em relação tanto ao número diplóide quanto
ao mecanismo sexual foram observadas. Melanoplinae merece destaque por ser a subfamília
com maior diversidade cariotípica dentro desta família. O gênero Dichroplus, por exemplo,
apresenta variação do número diplóide de 2n=23, como encontrado em D. elongatus, até
2n=8, sendo este o menor número cromossômico para Acridoidea e encontrado,
exclusivamente, em D. silveiraguidoi.
Quanto ao padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) e de regiões
organizadores de nucléolos (RONs), os acridídeos exibem uma grande variabilidade e
heterogeneidade. Contudo, a distribuição de HC pericentromérica e a presença de duas RONs
localizadas, geralmente, em cromossomos de tamanho médio e pequeno, são considerados os
padrões mais comuns para este grupo.
Apesar da grande variabilidade cariotípica encontrada nos melanoplíneos, poucos
estudos têm sido desenvolvidos neste grupo. A análise cariotípica em Baeacris punctulatus e
Dichroplus fuscus com técnicas mais refinadas, as quais permitem caracterizar a distribuição e
composição da HC, bem como a localização das RONs e dos sítios de DNAr, permitirá uma
melhor caracterização cromossômica dessas espécies. Estes dados poderão contribuir para
uma melhor compreensão dos padrões cromossômico-evolutivos dentro da subfamília
Melanoplinae.
RESUMO
vii
RReessuummoo
A subfamília Melanoplinae constitui um grupo de gafanhotos com a maior diversidade
cariotípica dentro de Acrididae. O objetivo principal deste trabalho foi estudar cromossomos
meióticos dos melanoplíneos Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus através de diferentes
técnicas citogenéticas. Baeacris punctulatus e D. fuscus apresentaram os cariótipos 2n=23,X0
e 2n=19,X0, respectivamente. Em D. fuscus, o bivalente P9 apresentou comportamento
megamérico durante o ciclo meiótico. A localização da heterocromatina constitutiva (HC) foi
preferencialmente pericentromérica, embora ocorram blocos adicionais nas duas espécies. A
coloração CMA3/DA/DAPI evidenciou blocos CMA3 positivos, correspondendo a HC
detectada pelo bandeamento C de todos os cromossomos, com exceção dos blocos terminais
de alguns cromossomos nas duas espécies e de um bloco CMA3 positivo intersticial sem
marcação para o bandeamento C em B. punctulatus. A coloração com DAPI foi uniforme em
B. punctulatus, enquanto que em D. fuscus, os blocos CMA3 positivos foram DAPI negativos.
A impregnação com AgNO3 e a FISH mostraram seis regiões organizadoras de nucléolos
(RONs) em B. punctulatus e duas, em D. fuscus. Na primeira espécie foi observada expressiva
variação na atividade das RONs. Os dados obtidos neste trabalho revelaram a existência de
uma grande variabilidade cariotípica, tanto em relação ao número diplóide quanto aos padrões
de localização e composição da HC e de distribuição das RONs, incluindo um padrão inédito
para Acridoidea referente ao número e frequência de atividade das RONs.
Palavras-chave: Melanoplinae, cariótipo, HC, RONs.
ABSTRACT
ix
AAbbssttrraacctt
The subfamily Melanoplinae constitutes a group of grasshoppers with the bigger karyotypic
diversity inside Acrididae. The main objective of this work was to study meiotic
chromosomes of the melanoplines Baeacris punctulatus and Dichroplus fuscus through
different citogenetics techniques. Baeacris punctulatus and D. fuscus presented karyotypes
2n=23,X0 and 2n=19,X0, respectively. In D. fuscus, the bivalent P9 presented megameric
behavior during the meiotic cycle. The localization of the constitutive heterochromatin (CH)
was preferentially pericentromeric, although additional blocks occur in both species.
CMA3/DA/DAPI staining evidenced CMA3 positive blocks, corresponding to CH detected by
the C-banding of all chromosomes, except for the terminal blocks of some chromosomes in
both species and one CMA3 positive interstitial block without label for banding-C in B.
punctulatus. Staining with DAPI was uniform in B. punctulatus, while in D. fuscus, the CMA3
positive blocks were DAPI negative. The impregnation with AgNO3 and FISH showed six
nucleolar organizer regions (NORs) in B. punctulatus and two, in D. fuscus. In the first
species a significant variation in the activity of NORs was observed. Data obtained in this
work revealed the existence of a great karyotypic variability, as in relation to the diploid
number as regarding to patterns of CH localization and composition and of NORs
distribution, including a new pattern to Acridoidea referent to number and frequency of NORs
activity.
Key- words: Melanoplinae, karyotype, CH, NORs.
REVISÃO DA LITERATURA
11
11.. RReevviissããoo ddaa LLiitteerraattuurraa
1.1. Considerações Gerais sobre a Família Acrididae
Acridoidea corresponde a uma superfamília de gafanhotos com ampla distribuição
mundial. Esta superfamília está agrupada em seis famílias: Tristiridae, Pauliniidae,
Ommexechidae, Romaleidae, Pyrgomorphidae e Acrididae, sendo as duas últimas distribuídas
em todo mundo e as demais, Neotropicais. Acrididae é uma família bastante representativa,
possuindo cerca de 1.100 gêneros descritos em todo o mundo. Para região Neotropical, está
constituída por mais de 270 gêneros. Isso decorre provavelmente de sua ampla radiação
adaptativa em diversos habitats, desde florestas tropicais até condições semi-áridas
(Amedegnato, 1974; Carbonell, 1977; Kevan, 1982).
Acrididae possui dez subfamílias, as quais têm sido divididas em dois grupos. O
primeiro compreende Acridinae, Cyrtacanthacridinae, Gomphocerinae, Melanoplinae e
Oedipodinae, e apresenta distribuição mundial. O segundo, por sua vez, é composto por
Copiocerinae, Leptysminae, Ommatolampinae, Rhytidochrotinae e Proctolabinae, sendo
exclusivamente Neotropical (Carbonell, 1977).
A subfamília Melanoplinae compreende mais de 100 gêneros e 900 espécies,
distribuídas por todo o Novo Mundo e partes da Eurásia (Otte, 1995). Para região
Neotropical, está representada por 43 gêneros e 232 espécies (Cigliano, 2007). Melanoplinae
inclui os gêneros de maior diversidade e distribuição geográfica da acridinofauna das
Américas, com numerosas espécies de importância econômica (Michel e Terán, 2005a).
Amedegnato et al. (2003) sugeriram, através de uma análise filogenética molecular, que esses
gafanhotos tiveram origem na América do Sul e se dispersaram para a América do Norte e,
posteriormente, para a Eurásia.
O gênero Baeacris (Dichroplini) compreende nove espécies descritas: B. bogotensis
(Carbonell & Ronderos, 1973), B. descampsi (Carbonell & Ronderos, 1973), B. maquiritare
(Carbonell & Ronderos, 1973), B. morosus (Rehn, J.A.G., 1905), B. penianus (Ronderos,
1992), B. pseudopunctulatus (Ronderos, 1964) B. punctulatus (Thunberg, 1824), B.
talamancensis Rowell & Carbonell, 1977 e B. tarijensis (Ronderos, 1979). No entanto, apenas
B. pseudopunctulatus e B. punctulatus tem sido encontradas na região Nordeste do Brasil
(Carbonell, comunicação pessoal). A última espécie é aquela com mais ampla distribuição
geográfica dentro do gênero (Ronderos e Cigliano, 1991; Michel e Terán, 2005b).
12
Assim como a maioria das espécies de Melanoplinae, B. punctulatus é de difícil
identificação dentro do gênero, e encontra-se incluída no grupo punctulatus, um conjunto de
espécies com aspectos morfológicos uniformes, sendo separado pelas características do
complexo fálico (Michel e Terán, 2005b; Colombo et al., 2005). Devido a essa uniformidade,
B. punctulatus foi inicialmente descrita como pertencente ao gênero Dichroplus (Ronderos,
1964; Carbonell e Ronderos, 1973). Posteriormente, as espécies do grupo punctulatus foram
transferidas para o gênero Baeacris (Ronderos e Cigliano, 1991; Michel e Terán, 2005b).
Dichroplus, também percente à tribo Dichroplini, está constituído por 23 espécies. O
gênero é caracterizado por uma considerável uniformidade morfológica externa. Entretanto,
as espécies podem ser separadas por uma notável divergência na genitália masculina. Devido
à grande semelhança entre os espécimes, o status taxonômico deste grupo também é de difícil
interpretação. Consequentemente, muitas espécies designadas inicialmente como Dichroplus
têm sido recentemente transferidas para outros gêneros (Colombo et al., 2005; Carbonell e
Mesa, 2006). Ronderos e Cigliano (1991), por exemplo, descreveram o novo gênero
Ponderacris, incluindo as espécies Dichroplus auriventris (Bruner, 1913), D. bolivianus
(Ronderos e Carbonell, 1971), D. cuzcoensis (Ronderos e Carbonell, 1971), D. inca
(Ronderos e Carbonell, 1971) e D. peruvianus (Stal, 1878). Posteriormente, Cigliano (1997)
transferiu de Dichroplus para Ronderosia as espécies D. bergi (Stal, 1978), D. cinctipes
Bruner, 1906, D. dubius Bruner, 1906, D. paraguayensis Bruner, 1906, D. robustus Bruner,
1906, D. forcipatus Rehn, 1918, D. gracilis Bruner, 1911, D. malloi Liebermann, 1966 e D.
piceomaculatus Carbonell, 1972. Por esta razão, Dichroplus ainda não é satisfatoriamente
distinguido dos outros gêneros de Dichroplini (Colombo et al., 2005).
Os representantes do gênero Dichroplus são usualmente dominantes, tanto em número
de espécies quanto de indivíduos, em muitas comunidades de gafanhotos da Argentina,
Uruguai, partes da Bolívia, Paraguai, Chile e do sul do Brasil. Algumas espécies são de
grande importância econômica por serem consideradas pragas agrícolas. Dentre estas podem
ser destacadas D. elongatus e D. pratensis, as quais são consideradas grandes devastadoras de
diversas culturas (Cigliano et al., 2000; 2002).
13
1.2. Caracterização Cariotípica em Acridoidea
1.2.1. Citogenética Convencional
Estudos cromossômicos em representantes de Acridoidea da região Neotropical são
bastante numerosos. Estes estudos tiveram início com Saéz (1930) e, posteriormente, vários
trabalhos foram importantes para a análise da acridofauna desta região. Mesa et al. (1982)
reuniram dados cariológicos de 289 espécies desta superfamília, distribuídas em seis famílias:
214 espécies pertencentes à família Acrididae, 45 Romaleidae, 19 Ommexechidae, 8
Tristiridae, 2 Pauliniidae e apenas 1 Pyrgomorphidae.
Segundo Mesa et al. (1982) o cariótipo modal para os acridoideos Neotropicais é do
tipo 2n=23,X0(♂):24,XX(♀), com cromossomos de morfologia acrotelocêntrica. Apesar da
conservação cariotípica dos acridoideos, algumas espécies apresentam cariótipos derivados
devido a vários rearranjos estruturais. O número cromossômico dos representantes da
superfamília Acridoidea pode variar de 2n=8 em Dichroplus silveiraguidoi (Acrididae) até
2n=25 em Conometopus sulcaticollis (Ommexechidae). Quanto ao mecanismo de
determinação do sexo, além da predominância do mecanismo X0, a ocorrência dos sistemas
XY e X1X2Y também foi observada entre as espécies Neotropicais (Mesa et al., 1982).
A família Acrididae é a mais estudada citogeneticamente dentro de Acridoidea e exibe,
em geral, grande conservação cariotípica. A subfamília Leptysminae, por exemplo, apresenta
em sua maioria 2n=23,X0 e cromossomos acrocêntricos (Mesa et al., 1982). Este cariótipo
padrão também foi observado em Stenacris megacephala, Eumastusia koebelei (Mesa e
Fontanetti, 1983) e Belosacris coccineipes (Loreto e Souza, 2000). Rocha et al. (2004)
analisaram os cariótipos de Cornops aquaticum, C. frenatum frenatum, Stenopola dorsalis,
Stenacris xanthochlora e Tucayaca parvula. Todas as espécies mostraram 2n=23,X0:24,XX e
cromossomos acrotelocêntricos, demonstrando a preservação cariotípica dentro desta
subfamília. No entanto, apesar desta conservação, algumas espécies mostram redução do
número diplóide, como foi descrito para Leptysma argentina com 2n=21,X0 (Bidau e Hasson,
1984), Stenopola pallida e Tetrataenia surinama com 2n=21,X0 e 2n=19,X0, respectivamente
(Mesa et al., 1982).
Gomphocerinae é uma subfamília com ampla distribuição mundial. Para região
Neotropical, a maioria das espécies analisadas apresentaram cariótipo 2n=23,X0:24,XX e
cromossomos com morfologia acrotelocêntrica (Mesa et al., 1982; Vilardi, 1986; Remis,
1993). Uma exceção é o gafanhoto Scyllina signatipennis, o qual apresentou
14
2n=22,XY:22,XX, resultado de uma translocação X-autossomo (Mesa et al., 1982; Bidau,
1984). Recentemente, Loreto et al. (2008a) analisaram Rhammatocerus brasiliensis, R.
palustris, R. bruneri, R. pictus e Amblytropidia sp., todas com cariótipos similares
2n=23,X0:24,XX e cromossomos acrotelocêntricos.
A maioria dos gonfoceríneos da Região Paleártica e Neártica, no entanto, apresenta
cariótipos derivados, principalmente do tipo 2n=17,X0:18,XX e com três pares
cromossômicos com dois braços. Euchorthippus chopardi, E. pulvinatus, Stenobothrus
grammiaes, Omocestus panteli e O. raymondi são alguns exemplos de gonfoceríneos com
cariótipos 2n=17,X0, e que apresentam cromossomos metacêntricos (Santos et al., 1983;
Cabrero e Camacho, 1986a,b). Eclipophleps glacialis apresentou o cariótipo 2n=17,X0 e
cromossomos submetacêntricos (L1, L2 e M6), metacêntrico (L3), subacrocêntrico (M4) e
acrocêntricos (M5, P7 e P8). Rearranjos cromossômicos, tais como fusões e inversões, foram
responsáveis pela modificação do cariótipo modal nesta espécie (Bugrov, 1994).
Mudanças do cariótipo modal, também, têm sido observadas no gênero Chorthippus.
A maioria de suas espécies apresentou redução do número diplóide 2n=23 para 2n=17. São
exemplos as espécies Chorthippus paralellus, C. dorsatus, C. jucundus, C. apicalis, C.
nevadensis, C. binotatus e C. vagans (Santos et al., 1983; Cabrero e Camacho, 1986a,b).
Chorthippus brunneus e C. jacobsi também mostraram o cariótipo similar 2n=17,X0,
consistindo de três pares metacêntricos grandes, quatro acrocêntricos médios e um
acrocêntrico pequeno. O cromossomo X foi o maior acrocêntrico do complemento (Bridle et
al., 2002). A redução do número diplóide no gênero Chortippus pode ser considerada um
marcador cariotípico para suas espécies. Apenas C. hammarstroemi e C. schamidti foram
descritas com 2n=21,X0:22,XX e 2n=23,X0:24,XX, respectivamente, diferindo do cariótipo
padrão para este grupo (Bugrov, 1996).
O gênero Schistocerca, pertencente à subfamília Cyrtacanthacridinae, embora
apresente um grande número de espécies e uma ampla distribuição, principalmente nas
Américas, tem sido pouco estudado em nível cromossômico. Entre as espécies americanas,
apenas quatro foram estudadas citologicamente: S. cancellata, S. flavofasciata, S. pallens e S.
paranensis. Todas mostraram número diplóide 2n=23,24, mecanismo sexual X0:XX e
cromossomos acrocêntricos (Mesa et al., 1982; Souza e Melo, 2007).
A subfamília Melanoplinae merece destaque por apresentar grande diversidade
cariotípica. Dentre as espécies de Acrididae listadas por Mesa et al. (1982), cerca de 32%
apresentaram cariótipos derivados sendo concentrados em poucos gêneros pertencentes
principalmente a Melanoplinae. Esta subfamília apresentou 45 de suas 93 espécies descritas
com cariótipos derivados, incluindo espécies que apresentaram variação do número diplóide e
15
mecanismo sexual como, por exemplo, em Leiotettix sanguineus (2n=23,X0 e 2n=22,XY). Na
Tabela 1 estão representadas as espécies de Melanoplinae distribuídas por gêneros listadas por
Mesa et al. (1982), bem como os tipos de cariótipos (modal ou derivado) e mecanismos
sexuais.
Dichroplus é um gênero caracterizado por uma extrema diversidade cariotípica,
variando desde o cariótipo básico com 2n=23:24 encontrado, por exemplo, em D. elongatus
até o número extremamente reduzido 2n=8 em D. silveiraguidoi (Mesa et al., 1982; Colombo
et al., 2005). Além dos números diplóides limites para o gênero, têm sido descritas espécies
com 2n=18 (D. obscurus), 2n=19 (D. vittatus), 2n=21 (D. patruellis) e 2n=22 (D. posteri). O
mecanismo sexual X0 é o mais comum dentro do gênero. Contudo, os mecanismos XY e
X1X2Y também têm sido observados (Mesa et al., 1982).
Tabela 1. Número de espécies analisadas, tipos de cariótipos e mecanismos sexuais em Melanoplinae.
Cariótipo Mecanismo sexual Gêneros Números de espécies Modal (2n=23) Derivado X0 XY X1X2Y
Apacris 2 2 0 2 0 0 Atrachelacris 2 0 2 1 1 0 Bogotacris 1 1 0 1 0 0 Chlorus 4 1 3 4 0 0 Dichroplus* 34 14 20 18 15 2 Eurotettix 5 0 5 0 1 4 Leiotettix* 8 2 7 3 5 2 Nahuelia 1 1 0 1 0 0 Neopedies 5 5 0 5 0 0 Parascopas 4 3 1 4 0 0 Pedies 5 1 4 5 0 0 Propedies 6 6 0 6 0 0 Pseudoscopas 9 9 0 9 0 0 Scotussa 7 4 3 5 1 1
TOTAL 93 49 45 64 23 9 * Algumas espécies possuem polimorfismos para número diplóide e mecanismo sexual.
Fonte: Mesa et al. (1982).
1.2.1.2. Cromossomo Megamérico
O cromossomo megamérico é um marcador cariotípico frequentemente encontrado no
genoma de gafanhotos. Ele é caracterizado por sua natureza heterocromática e por sofrer
condensação precoce na prófase meiótica, sendo facilmente identificado durante o paquíteno e
diplóteno devido a sua heteropicnose positiva durante estas fases (White, 1973; Hewitt,
1979).
16
Geralmente, o megamérico é o terceiro menor cromossomo do complemento (ou seja,
o número 9 em um cariótipo básico com 2n=23,X0 ou o número 6 em cariótipo com
2n=17,X0) (Hewitt, 1979). Arcyptera microptera, A. tornasi, Callephorus compressicornis,
Sphingonotus azurescens são exemplos de espécies com o cariótipo 2n=23,X0 que possuem
um cromossomo megamérico correspondendo ao par P9. Myrmeleotettix maculatus,
Chorthippus parallelus, C. binotatus e Euchorthippus pulvinatus, por sua vez, possuem
2n=17,X0 e o megamérico corresponde ao par M6 (Santos e Giráldez, 1982; Santos et al.,
1983; Bella et al., 1990a).
A presença de cromossomo megamérico tem sido relatada em muitas espécies de
Acrididae, sendo considerada, em muitos casos, uma característica marcante de alguns clados
(Hewitt, 1979). Loreto et al. (2008a) observaram a presença de um megamérico no
gonfoceríneo Amblytropidia sp, correspondendo ao cromossomo M8. Anteriormente, Remis
(1989) também relatou a ocorrência deste tipo de cromossomo em Amblytropidia australis,
sendo este correspondente provavelmente ao par M8 ou M9.
Acrotylus insubricus e A. patruelis, ambas pertencentes à subfamília Oedipodinae,
exibem o cariótipo 2n=23,X0. Estas espécies apresentam um cromossomo megamérico, o
qual foi identificado pela condensação precoce durante a prófase I. Entretanto, foram
observadas diferenças em relação ao tamanho do par correspondente ao marcador, sendo em
A. insubricus o bivalente M9 e em A. patruelis, o P9 (Camacho e Cabrero, 1983).
Oedipoda charpentieri também possui o cariótipo básico 2n=23,X0. Nesta espécie, o
bivalente M6 é um megamérico. Contudo, o par correspondente a este marcador difere em
outras espécies do gênero (O. fuscocincta, O. coerulescens e O. germânica), nas quais o
bivalente megamérico é o par M9 (Santos et al., 1983; Camacho et al., 1986; Navas-Castillo et
al., 1987).
O bivalente M9 de Valanga nigrocornis (Cyrtacanthacridinae) também exibe
comportamento megamérico. Este cromossomo está envolvido em uma fusão cêntrica com o
bivalente M8, resultando na formação de um trivalente durante a meiose I. Devido à
similaridade em tamanho e morfologia (ambos são telocêntricos), os pares envolvidos neste
rearranjo só podem ser distinguidos por seu comportamento durante a prófase meiótica, na
qual é observado que o M9 se condensa precocemente. Como resultado da fusão ocorre a
formação de um cromossomo difásico (um cromossomo que possui um braço heterocromático
e o outro, eucromático) (Teoh e Yong, 1983).
No melanoplíneo Dichroplus vitattus, por sua vez, foi relatado que um cromossomo
megamérico está envolvido no rearranjo cromossômico que deu origem ao sistema neo-XY da
espécie. Bidau e Martí (2001) observaram que em células meióticas de machos, o bivalente
17
sexual neo-XY forma uma massa heteropicnótica positiva até o final da diacinese, onde esta
começa a ser descondensada. Na metáfase I, estes cromossomos apresentam heteropicnose
negativa, ao contrário do que ocorre em indivíduos neo-XY padrão. Os autores sugeriram que
a origem do mecanismo sexual de D. vitattus ocorreu a partir de uma fusão em tandem de dois
cromossomos X telocêntricos originais, seguida por uma outra fusão em tandem com um
pequeno bivalente megamérico e uma inversão pericêntrica, resultando em um neo-X
metacêntrico grande e um neo-Y telocêntrico pequeno.
Cromossomos megaméricos também são comuns em outras famílias de Acridoidea.
Em Atractomorpha, gênero pertencente à Pyrgomorphidae, a presença deste cromossomo foi
considerada como um marcador cariótipo para o grupo. Nankivell (1976) analisando espécies
do grupo crenaticeps de Atractomorpha (A. crenaticeps, A. similis, A. australis) observou o
comportamento megamérico do menor bivalente autossômico do complemento, o P9, em
todas as espécies. Rocha et al. (1997) também observaram a presença de cromossomo
megamérico nos romaleídeos Radacridium nordestinum e R. mariajoseae, correspondendo ao
par M9 nas duas espécies.
1.2.2. Variabilidade Cariotípica
Durante a evolução do genoma de gafanhotos diversas alterações cromossômicas tem
sido observadas. Dentre estas, as mais frequentes são inversões, translocações, fusões e
fissões cêntricas e presença de heterocromatina extra, sob a forma de cromossomo B e
segmentos supernumerários. Cada um desses tipos de variações pode ter um efeito peculiar
sobre vários fatores, tais como frequência e distribuição de quiasmas, fertilidade, tamanho do
corpo e sucesso no cruzamento; podendo se fixar na população e substituir a forma original ou
assumir uma forma polimórfica (Hewitt, 1979).
Inversões pericêntricas são bastante comuns em algumas populações naturais de
gafanhotos, as quais convertem a morfologia cromossômica de acrocêntrica para meta-
submetacêntrica, ou vice-versa. Inversões paracêntricas, em geral, têm sido descritas neste
grupo de insetos (White, 1973). Camnula pellucida (Nur, 1968), Boonacris alticola (Haines et
al., 1978) e Chorthippus jacobsi (Díez e Santos, 1993) são exemplos das poucas espécies que
apresentam polimorfismo para inversão paracêntrica.
Representantes do gênero Trimerotropis merecem destaque por apresentarem uma alta
frequência de inversões pericêntricas. Populações naturais de T. pallidipennis encontradas na
América do Sul, por exemplo, exibiram um alto grau de polimorfismo para este tipo de
18
inversão nos pares 4, 6, 7 e 8. A frequência de inversão pericêntrica nesta espécie pode ser
correlacionada a vários fatores, tais como altitude, latitude, longitude, temperatura e umidade,
e tem apresentado uma grande influência na frequência e distribuição de quiasmas (Vaio et
al., 1979; Confalonieri, 1994; Colombo e Confalonieri, 1996).
Abracris flavolineata (Ommatolampinae) apresenta morfologia cromossômica
diferente daquela comumente encontrada em representantes de Acridoidea. Esta espécie
apesar de possuir número diplóide de 2n=23,X0 mostrou cromossomos meta-
submetacêntricos e subtelocêntricos em todo complemento cariotípico. Esse padrão atípico foi
atribuído à adição de heterocromatina constitutiva e inversão pericêntrica (Cella e Ferreira,
1991).
O romaleídeo Xestotrachelus robustus também apresentou polimorfismo para inversão
pericêntrica. A espécie possui cariótipo 2n=23,X0 e seus cromossomos são divididos em três
pares grandes, cinco médios e três pequenos, onde dois bivalentes pequenos são meta-
submetacêntricos e os demais, acrocêntricos. Alguns espécimes da população da Chapada
Diamantina (Bahia) foram heterozigotos para inversão pericêntrica no par M8, sendo um
cromossomo acrocêntrico e o outro submetacêntrico. Na população de Buíque (Pernambuco),
alguns espécimes foram homozigotos para esse rearranjo (Souza et al., 2003).
Dichroplus pratensis, um gafanhoto com ampla distribuição na América do Sul,
apresenta cariótipo 2n=18,X0:18,XX e cromossomos acrocêntricos. Translocações
Robertsonianas são responsáveis por polimorfismos envolvendo os seis autossomos de
tamanho grande (G1-G6) nessa espécie. Heterozigotos e homozigotos para estas translocações
apresentaram uma diminuição na frequência média de quiasma por células, além da
redistribuição desses quiasmas (Martí e Bidau, 1995; 2001; Bidau e Martí, 2002).
Em Dichroplus silveiraguidoi, o número cromossômico extremamente reduzido é
resultante de uma série de fusões cêntricas e em tandem, além de inversões pericêntricas, a
partir de um possível ancestral com 2n=23. Apesar da redução brusca do número diplóide
nesta espécie, o conteúdo de DNA aparentemente não foi alterado (Cardoso et al., 1974; Saéz
e Pérez-Mosquera, 1977). Fusões cêntricas também foram descritas para Dichroplus
elongatus em duas diferentes populações da Argentina. A presença destas fusões espontâneas
teve influência na frequência e distribuição de quiasmas. As fusões foram consideradas
mutações espontâneas, porque a frequência das mesmas foi menor que 5% (Clemente et al.,
1996).
Um amplo polimorfismo cariotípico, envolvendo fusão cêntrica entre os autossomos 3
e 6, foi descrito para Leptysma argentina. Esse rearranjo acarretou alterações nas
características morfométricas, tamanho do corpo e sucesso de cruzamento em machos e
19
fêmeas. Leptysma argentina possui ainda polimorfismo para ocorrência de segmentos
supernumerários e de cromossomos B (Bidau e Hasson, 1984; Colombo et al., 2003).
Por outro lado, fissões cêntricas são responsáveis pela mudança do cariótipo básico
2n=23,X0 para 2n=25,X0 em Conometopus sulcaticollis e Oedipoda schochi schochi. Este
número diplóide (2n=25) é considerado o maior número cromossômico para família
Acrididae. Adicionalmente, O. s. schochi apresentou mudanças na morfologia cromossômica
de acrocêntrica para meta-submetacêntrica e subacrocêntrica, decorrentes de inversões
pericêntricas (Mesa et al., 1982; Türkoglu e Koca, 2002).
A grande maioria das espécies de gafanhotos apresenta o mecanismo sexual X0:XX,
cuja origem proposta foi a partir da perda do cromossomo Y do sistema XY:XX. Entretanto,
durante a evolução deste grupo diferentes rearranjos deram origem a outros sistemas simples e
múltiplos de determinação do sexo. Fusões cêntricas entre o X original e um autossomo,
deram origem ao mecanismo neo-XY e fusões sucessivas entre o neo-Y e um outro
autossomo originaram o sistema múltiplo X1X2Y (White 1973; Hewitt, 1979; Mesa et al.,
1982).
Bugrov (1995) analisando duas populações de Podisma sapporensis, provenientes da
Rússia, observou que o complemento cromossômico de P. sapporensis da população de
Sakhalin consiste de 2n=23,X0:24,XX, sendo todos os autossomos acrocêntricos e o X
submetacêntrico devido a uma inversão pericêntrica. Indivíduos da população de Kunashir,
por sua vez, apresentaram número diplóide 2n=20 e mecanismo sexual neo-XY, resultado de
uma translocação entre o X e um autossomo.
Sinipta dalmani, por sua vez, apresenta um polimorfismo para fusão cêntrica entre o X
e o M5, determinando a formação de um sistema neo-XY. Nesta espécie, tanto nos indivíduos
X0 como neo-XY, há formação de macroespermátides. Porém, foi observado que em
portadores da fusão a frequência média de produção de macroespermátides aumenta
significantemente, além da ocorrência da formação de microespermátides. Adicionalmente, S.
dalmani apresentou polimorfismo para inversão pericêntrica envolvendo o par M4. Este
polimorfismo também acarretou a produção de macroespermátides e afetou os caracteres
morfológicos dos espécimes, levando à diminuição do tamanho do corpo na condição
homozigota (Remis 1993; 1997).
Uma análise comparativa do comportamento meiótico dos bivalentes sexuais (neo-XY
e neo-XX) em D. vittatus, cuja origem foi a partir de fusões entre autossomo e cromossomo
X, revelou que a frequência média de quiasmas foi baixa em ambos os sexos, porém foi
ligeiramente mais alta em machos que em fêmeas. A distribuição de quiasmas foi basicamente
distal em ambos os sexos. Durante a meiose, a orientação do neo-XY mostrou-se bastante
20
irregular, tendo apenas 21% das metáfases I mostrando orientação padrão. Nas fêmeas, por
sua vez, o neo-XX apresentou um comportamento mais regular, mostrando apenas 17% das
células com orientação atípica (Bidau e Martí, 2001).
1.3. Heterocromatina Constitutiva (HC)
1.3.1. Considerações Gerais
Nas células eucarióticas, o material genético está organizado dentro de uma estrutura
complexa denominada cromatina. Esta pode ser diferenciada em dois tipos: eucromatina, a
qual apresenta um ciclo de condensação-descondensação em diferentes estágios do ciclo
celular e heterocromatina, que se mantém condensada durante todo ciclo celular (Wallrath,
1998; Dillon, 2004).
Brown (1966) classificou a heterocromatina baseado em seu comportamento em
heterocromatina facultativa (HF) e heterocromatina constitutiva (HC). A HF se refere às
regiões reversíveis do genoma, que podem mudar do estado heterocromático para
eucromatina, dependendo do estágio de desenvolvimento ou do tipo de célula. Difere da HC
por envolver cromossomos inteiros e por possuir composição de DNA semelhante à
eucromatina, não sendo nem rica em DNA satélite nem carente de genes (Brown, 1966;
Mattei e Luciani, 2003; Dillon, 2004). Exemplos de HF são o corpúsculo de Barr, o qual é
formado pela inativação de um ou mais cromossomos X em fêmeas de mamíferos, e a
inativação do conjunto cromossômico de origem paterna em alguns insetos fitófagos da
ordem Homoptera (Lyon, 1999; Sumner, 2003).
A HC, por sua vez, caracteriza-se pela condensação durante todo o ciclo celular, por
apresentar replicação tardia, baixa frequência de recombinação, pequeno acesso a nucleases,
alto grau de metilação e baixo de acetilação (Wallrath, 1998; Henikoff, 2000; Mattei e
Luciani, 2003; Grewal e Jia, 2007). Sua distribuição dentro do cariótipo não acontece por
acaso, sendo localizada em sítios e cromossomos específicos. Em geral, ocorre
preferencialmente nas regiões pericentroméricas, porém pode ocupar áreas terminais e menos
frequentemente, intersticiais (John et al., 1985; Sumner, 2003).
Outra característica distintiva da HC é a sua composição de DNA. Os segmentos de
HC nos cromossomos dos eucariotas contêm grande concentração de DNA altamente
repetitivo, também chamado de DNA satélite (Mattei e Luciani, 2003; Sumner, 2003). Essas
21
sequências podem variar em relação ao conteúdo (podendo ser rico em pares de bases AT ou
GC) e ao comprimento (podendo variar de 2pb a milhares de repetições de pares de base).
Embora exista essa correlação entre a HC e a presença de DNA satélite, nem toda
heterocromatina é composta por DNA altamente repetitivo (Sumner, 1990; 2003).
Embora a HC tenha sido considerada durante muitos anos como inativa ou mesmo
pobre em genes, atualmente tem sido comprovado que a mesma pode conter genes e outras
sequências funcionais do DNA (Sumner, 2003; Dillon, 2004). O cromossomo Y
heterocromático de Drosophila melanogaster, por exemplo, contém pelo menos nove genes,
dos quais seis são fatores de fertilidade (Carvalho et al., 2001). Esta evidência de
funcionabilidade da HC tem levado a importantes funções e efeitos na linhagem germinativa
e, com menor frequência, na linhagem somática; além de proteger as regiões eucromáticas do
genoma contra mutações, crossing-over e “elementos parasitas” como os retransposons;
estabilizar as sequências de DNA repetitivo dos telômeros; afetar a segregação cromossômica
e causar variegação por efeito de posição (Wallrath, 1998; Henikoff, 2000; Sumner, 2003).
Estudos realizados em vários organismos, especialmente em parasitas nematóides, têm
mostrado que quebras cromossômicas são bastante comuns em células somáticas, sendo
responsáveis pela perda e desintegração da maior parte da HC. Esta heterocromatina
eliminada é composta por segmentos de DNA satélite, os quais estão ausentes nas novas
células somáticas, porém conservadas nas células germinativas. Isto sugere que não somente
sequências repetitivas, mas também genes específicos imersos na HC são requeridos para
função da linhagem germinativa (Müller et al., 1996; Sumner, 2003).
A presença da HC pode também influenciar na ocorrência e localização de quiasmas,
alterando o número de quiasmas por bivalente, bem como ter um efeito negativo no
pareamento cromossômico e crossing-over. Em geral, a recombinação é ausente em regiões
de heterocromatina e isto é, frequentemente, associado à falta ou impedimento da formação
do complexo sinaptonêmico em tais regiões ou à diferenças na estrutura do complexo
sinaptonêmico nas regiões de HC (John, 1990; Sumner, 2003). Adicionalmente, a HC parece
ter um importante papel na função do centrômero. As proteínas da heterocromatina estão
associadas com repetições de DNA que envolve o centrômero e são requeridas para promover
a coesão das cromátides-irmãs e segregação cromossômica. Essas funções são mediadas pela
ação de proteínas especiais de ligação à HC, tais como a proteína HP1 (Dernburg et al., 1996;
Grewal e Moazed, 2003; Grewal e Jia, 2007).
O fenômeno denominado variegação por efeito de posição (PEV), o qual é causado
pela mudança de posição de sequências gênicas para as proximidades das regiões de HC, tem
sido descrito em vários organismos, desde leveduras até mamíferos. Este fenômeno foi
22
observado primeiramente em Drosophila, quando o gene white, requerido para pigmentação
vermelha do olho, foi colocado próximo da heterocromatina centromérica por inversão
cromossômica, produzindo um mosaicismo vermelho e branco dentro do olho dos indivíduos
mutados (Wallrath, 1998; Huisinga et al., 2006). Outro exemplo de PEV é a trans-inativação,
também observada em Drosophila, na qual a HC silencia genes no cromossomo homólogo via
pareamento somático (Dorer e Henikiff, 1997; Henikoff, 2000). Em leveduras, a PEV nos
centrômeros e telômeros está associada a mudanças na acetilação de histonas e à organização
dos nucleossomos. Na levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe, por sua vez, o
silenciamento está associado ao espalhamento da proteína Swi6 dentro da região silenciada
(Partridge et al., 2000).
As sequências de DNA repetitivo que compõem a HC podem ser diferenciadas em
duas formas: compacta (αHC) ou dispersa (βHC). Esta última representa o estado mais raro da
HC, que possui uma estrutura com unidades de repetições variadas, sendo rica em
retrotransposons. A β–heterocromatina consiste de fibras de cromatina relativamente
desorganizadas que se replicam tardiamente e formam uma barreira entre a -heterocromatina
cêntrica e a eucromatina. A αHC, por sua vez, está relacionada com as regiões detectadas pelo
bandeamento C, sendo constituída por repetições em tandem de sequências simples
(Holmquist et al., 1998).
Além da heterocromatina constitutiva associada aos cromossomos do cariótipo
normal, ditos cromossomos A, tais como a HC localizada pelo bandeamento C e a HC
associadas às regiões organizadoras de nucléolos (RONs), existe também a heterocromatina
supernumerária ou extra-cromossômica (Jones e Rees, 1982; Camacho et al., 2000). Este tipo
de heterocromatina pode ser observado sob a forma de segmentos supernumerários ou
cromossomos B. Os segmentos supernumerários, também chamados de segmentos extras, são
encontrados em plantas e animais, particularmente em insetos, e podem apresentar variações
quanto à natureza (heterocromáticos ou excepcionalmente eucromáticos), quantidade,
localização, distribuição e tamanho dos segmentos. Podem estar presentes em populações sob
forma polimórfica, caracterizando-se em indivíduos heterozigotos e homozigotos com e sem
segmentos. Dependendo da posição ao longo dos cromossomos, podem ser designados como
distal, intersticial, proximal ou extrínseco. Quanto ao número, pode apresentar variabilidade
entre as populações de uma mesma espécie ou entre indivíduos de uma mesma população
(Hewitt, 1979; Camacho et al., 1984; 2000). A presença de cromossomos portadores de
segmentos extras pode afetar a frequência de quiasmas no cromossomo portador ou nos
demais cromossomos do complemento, podendo também induzir a redistribuição dos
23
quiasmas nos pares que os possuem, além de influenciar na atividade das RONs (Jones e
Rees, 1982).
Os cromossomos B, também chamados de cromossomos supernumerários ou
acessórios, são cromossomos extras, geralmente pequenos e heterocromáticos, presentes no
cariótipo de algumas espécies. Ocorrem no genoma de vários taxa de animais e plantas,
podendo variar em diferentes células de um mesmo indivíduo. Nos animais, grande parte dos
exemplos conhecidos de cromossomos B tem sido relatada em insetos, principalmente em
coleópteros, dípteros e ortópteros. Este tipo de cromossomo pode variar quanto à morfologia,
tamanho, comportamento, frequência e padrão de bandeamento C. Estes cromossomos são
ditos estáveis, se todas as células dos indivíduos, que os possuem, apresentam o mesmo
número, e instáveis, se o número de cromossomos acessórios variar em diferentes células do
mesmo indivíduo. Por outro lado, também são caracterizados por não apresentarem um
padrão Mendeliano de herança e, geralmente, não pareiam com nenhum membro do
complemento A (Jones e Rees, 1982; Camacho et al., 2000). Nos indivíduos que apresentam
estes cromossomos acessórios, a frequência e distribuição de quiasmas pode ser aumentada ou
diminuídas, além de ocorrer a possibilidade de produção de micro e macroespermátides
(Bidau, 1987; Camacho et al., 2000).
Várias técnicas especiais de identificação cromossômica têm sido utilizadas para a
análise de regiões específicas de heterocromatina constitutiva. Dentre estas, o bandeamento C
é a mais utilizada por ser rápida e precisa para o estudo do padrão de distribuição da
heterocromatina em plantas e animais (Sumner, 1972). O uso desta técnica envolve exposição
do material biológico a uma solução ácida, depois a uma básica e, em seguida, a uma solução
salina em temperatura elevada. Esse material quando submetido à coloração com Giemsa,
marca regiões heterocromáticas mais fortemente, formando blocos escuros denominados
bandas C (C = constitutiva), porém não fornece dados a respeito da natureza da HC quanto à
sua composição de bases e também é inespecífica com relação ao DNA satélite (Sumner,
1990; 2003).
A coloração com fluorocromos base-específicos, por sua vez, permite a qualificação
da HC quanto à composição de bases. Esta técnica, além de diferenciar a HC, permite
verificar a sua variabilidade e heterogeneidade através do uso de corantes fluorescentes
específicos para os pares de bases AT ou GC (Schweizer, 1976; 1980). Estes corantes
fluorescentes associados a outras substâncias não fluorescentes, como Distamicina A, que
funcionam como contracorantes, permitem a qualificação da heterocromatina quanto à
composição de bases e podem ser divididos em dois grupos principais: 1) fluorocromos
específicos para sítios de DNA ricos em AT (Adenina e Timina) como, por exemplo, a
24
Quinacrina, Hoecht 33258 e o 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e 2) fluorocromos
específicos para sítios de DNA ricos em GC (Guanina e Citosina), tais como a Cromomicina
A3 (CMA3) e a Mitramicina (MM) (Schweizer, 1981).
A técnica de bandeamento por enzimas de restrição (ER) também tem sido utilizada na
caracterização da HC. Certas ER induzem a diferenciação linear similar ao bandeamento C,
enquanto outras são capazes de detectar classes de HC que não são detectadas por esta
técnica. O bandeamento por ER consiste no tratamento de preparações cromossômicas fixadas
com uma solução de endonucleases de restrição, seguidas por coloração, normalmente com
Giemsa, mas às vezes com um fluorocromo base-específico. O tamanho das bandas positivas
após digestão in situ dos cromossomos metafásicos podem variar de uma ER para outra. Isto
ocorre devido à existência de subclasses específicas do DNA repetitivo. Diferentes fatores
podem afetar a clivagem da heterocromatina por estas enzimas, sendo a compactação da HC e
o tamanho do sítio de restrição os mais importantes na determinação da quantidade de DNA
removível (López-Fernández et al., 1991; Rodríguez Iñigo et al., 1993).
A hibridização in situ fluorescente (FISH) permite localizar genes e sequências de
DNA ao longo dos cromossomos, podendo ser utilizadas diferentes sondas, tais como sondas
de sequências únicas e sondas de DNA repetitivo, incluindo o DNA ribossomal e DNA
satélite. A técnica fundamenta-se basicamente no pareamento de um determinado segmento
de DNA ou RNA (sonda) com uma sequência de nucleotídeos complementar do DNA de
interesse, com o intuito de visualizar a seqüência em sua posição exata. A FISH tem sido
utilizada na criação de novos tipos de marcadores cromossômicos para análise cariotípica
comparada, na construção de mapas físicos para diferentes espécies e na análise de estruturas
e rearranjos cromossômicos (Sumner, 2003; Guerra, 2004).
1.3.2. Padrão de Distribuição e Qualificação da Heterocromatina Constitutiva em
Acridoidea
A heterocromatina constitutiva é o mais dinâmico de todos os componentes
cromossômicos, podendo sofrer mudanças dentro de uma espécie ou entre espécies diferentes.
Estudos sobre a distribuição, variabilidade e heterogeneidade da HC têm sido realizados em
várias espécies de gafanhotos, demonstrando diferenças tanto em nível quantitativo quanto
qualitativo. A maior parte desses estudos é realizada através do bandeamento C. No entanto,
quanto ao uso de ER, FISH e coloração fluorocromos base-específicos, ainda são poucos os
25
estudos realizados (King e John, 1980; Cabrero e Camacho, 1986a; Rodríguez Iñigo et al.,
1996; Loreto et al., 2005).
Na família Ommexechidae, apenas Spathalium helios foi estudada através do
bandeamento C. A espécie apresentou blocos de HC na região pericentromérica dos onze
bivalentes autossômicos presentes no seu cariótipo. Nos pares 7 e 8 também foram
observados pequenos blocos terminais. Nenhuma marcação foi observada no bivalente sexual
neo-XY desta espécie (Mesa et al., 1990).
Atractomorpha similis, Monistria concinna e Pyrgomorpha conica, espécies
pertencentes à família Pyrgomorphidae, apresentaram padrão pericentromérico de HC em
todos os cromossomos. No entanto, A. similis exibiu vários blocos intersticiais e/ou terminais
adicionais em todo o complemento, sendo muitos destes, polimórficos em relação ao tamanho
e à ocorrência. O cromossomo megamérico desta espécie apresentou vários blocos
intersticiais, além do padrão pericentromérico. Neste bivalente há evidências de
heterogozidade no padrão de bandeamento C. Em M. concinna, por sua vez, foi observado
blocos intersticiais no cromossomo X e no bivalente 6, sendo este heterozigoto, e terminais
nos bivalentes 4 e 5 (King e John, 1980; Santos et al., 1983).
Para família Romaleidae, apenas nove espécies foram estudadas quanto à distribuição
e variabilidade da HC, até o momento. A maioria das espécies apresentou blocos
pericentroméricos em todos os cromossomos do complemento. Entretanto, blocos
intersticiais, terminais, proximais e distais também foram observados. Xyleus angulatus
exibiu blocos pericentroméricos em todos os cromossomos e intersticiais nos pares 1, 2, 3.
Adicionalmente, a espécie apresentou um cromossomo B instável, predominantemente
heterocromático, além de segmentos supernumerários heterocromáticos nos pares 5, 6, 7 e 11
e eucromático no par 10 (Souza e Silva Filha, 1993; Souza e Kido, 1995). Brasilacris gigas,
Phaeoparia megacephala e Xestotrachelus robustus também apresentaram HC
pericentromérica. No entanto, diferenças de tamanho dos blocos foram observadas entre os
cromossomos de P. megacephala. Os bivalentes 9 e 10 de X. robustus foram quase totalmente
heterocromáticos (Souza e Kido, 1995; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003). Zoniopoda
tarsata exibiu apenas blocos intersticiais nos bivalentes 1, 2, 3 e no cromossomo X. Esta
espécie também é polimórfica para presença de segmento supernumerário na porção proximal
do P11 e apresenta dois cromossomos B estáveis (Vilardi, 1986).
Rocha et al. (1997) identificaram diferenças na distribuição da HC entre Radacridium
mariajoseae e R. nordestinum. Em R. mariajoseae, foram observados blocos
pericentroméricos nos bivalentes 1, 10 e 11 e um bloco proximal no bivalente 2. O
cromossomo X apresentou blocos pericentromérico, proximal e distal, enquanto o bivalente 9,
26
o qual corresponde ao megamérico, exibiu bloco proximal, distal e instersticial. Em R.
nordestinum, o bandeamento C detectou pequenos blocos pericentroméricos em todos os
cromossomos e instersticial nos bivalentes 2 e 5. Segmentos supernumerários nos bivalentes
3, 4, 6, 7 e 10 foram encontrados nesta espécie. Em representantes do gênero Chromacris,
diferenças também foram identificadas. Chromacris nuptialis apresentou blocos de HC em
regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos. Os bivalentes 2 e 10 mostraram
blocos teloméricos e o par 9, intersticial. Chromacris speciosa, por sua vez, exibiu HC
pericentromérica em todos os cromossomos. Adicionalmente, foram observados blocos
proximais nos pares 3, 4, 5 e 6, teloméricos nos pares 1 e 2 e intersticiais nos pares 5, 7, 8 e
no cromossomo X (Loreto et al., 2005).
Apenas cinco espécies de Romaleidae foram analisadas através da coloração com
fluorocromos base-específicos. Em Xyleus angulatus, Phaeoparia megacephala e
Xestotrachelus robustus, os blocos positivos para o bandeamento C também foram CMA3+.
Entretanto, em P. megacephala o tamanho dos blocos CMA3+ foi menor nos cromossomos 1,
2, 3 e X, os quais apresentaram grandes blocos de HC detectados pelo bandeamento C (Souza
et al., 1998; Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003). A espécie Chromacris nuptialis
apresentou apenas o bivalente M6 com bloco CMA3+ na região pericentromérica. Enquanto,
em C. speciosa foi observado dois blocos CMA3+, sendo um localizado na região proximal do
M6 e o outro na região telomérica do G2 (Loreto et al., 2005). A coloração com DAPI foi
homogênea em todas as cinco espécies estudadas (Pereira e Souza, 2000; Souza et al., 2003;
Loreto et al., 2005).
Acrididae representa a família mais estudada através da técnica de bandeamento C,
especialmente para as espécies da região Paleártica (King e John, 1980; Santos et al., 1983;
Cabrero e Camacho, 1986a). King e John (1980) analisaram 21 espécies de acridídeos,
provenientes da Austrália, revelando a presença de blocos centroméricos em todos os
cromossomos do complemento e intersticiais em alguns cromossomos de todas as espécies.
Blocos de HC teloméricos foram menos frequentes entre as espécies estudadas. A presença de
cromossomo megamérico foi relatada para Aiolopus thalassinus, Calephorops viridis, Perala
niridis e Stenacatantops angustifrons. Estes cromossomos apresentaram, em adição aos
blocos de HC intersticiais fortes, blocos positivos menos intensos, dando uma aparência mais
escura quando comparado com outros elementos do complemento. Santos et al. (1983), por
sua vez, analisando 36 espécies de Acrididae da Espanha, observaram que a localização da
HC ocorre preferencialmente nas regiões centroméricas e teloméricas, sendo rara a presença
de HC intersticial.
27
O padrão de distribuição da HC também foi descrito para 20 espécies de
Gomphocerinae oriundos da Península Ibérica. Os cromossomos de todas as espécies
analisadas exibiram HC pericentromérica. No entanto, estes blocos foram pequenos,
restringindo-se apenas a HC centromérica (Omocestus raymondi e Chorthippus dorsatus), ou
grandes, estendendo-se do centrômero a região proximal (Stauroderus scalaris, C. binotatus e
C. brunneus). A maioria das espécies, entretanto, mostrou blocos pericentroméricos
intermediários (como, por exemplo, em Euchorthippus chopardi e C. jucundus). A presença
de HC intersticial ou distal também tem sido identificada, na maioria das vezes, em dois pares
cromossômicos diferentes dentro do mesmo complemento. Os cromossomos megaméricos de
Truxalis nasuta (bivalente 9) e E. pulvinatus (bivalente 6) apresentaram um bloco
pericentromérico médio e um intersticial (Cabrero e Camacho, 1986a).
Bridle et al. (2002), em uma análise comparativa entre Chorthippus brunneus e C.
jacobsi, observaram um padrão similar de distribuição nas duas espécies. Estas apresentaram
blocos de HC associados às regiões centroméricas de todos os cromossomos e intersticiais
localizados nos braços curtos dos bivalentes G2 e G3. Um polimorfismo, para presença de
segmentos supernumerários na região distal dos bivalentes M7 e P8, foi detectado nas duas
espécies. Todos os blocos identificados pelo bandeamento C responderam positivamente aos
fluorocromos CMA3 e Acridina-Orange. Estes revelaram, adicionalmente, uma marcação
distal no cromossomo X de C. brunneus. A coloração com o DAPI também corou as regiões
banda C positivas, com exceção dos blocos intersticiais dos bivalentes G2 e G3 e do bloco
distal do cromossomo X de C. brunneus.
Acrotylus insubricus, A. patruelis, Oedipoda charpentieri e O. schochi schochi, todos
representantes da subfamília Oedipodinae, exibiram blocos de HC na região pericentromérica
de todos os cromossomos e blocos adicionais em alguns elementos do complemento.
Acrotylus insubricus apresentou HC telomérica nos bivalentes M6, M7, M8 e M9. Oedipoda
charpentieri mostrou um bloco distal no bivalente M9. O cromossomo megamérico desta
espécie, o bivalente M6, exibiu um bloco distal e um intersticial pequeno. Oedipoda schochi
schochi, por sua vez, apresentou blocos distais nos bivalentes 5, 7 e 8, intersticiais nos
bivalentes 7 e 8 e o braço curto do bivalente 9 mostrou-se totalmente heterocromático. A
espécie A. pratruelis apresentou apenas polimorfismo para ocorrência de segmento
supernumerário no par 11. (Camacho e Cabrero, 1983; Navas-Castillo et al., 1987; Türkoglu e
Koca, 2002).
Estudos com diferentes técnicas para a caracterização da HC em Dociostaurus jagoi e
D. genei revelaram grande diferença no conteúdo da heterocromatina entre as duas espécies.
O bandeamento C evidenciou HC pericentromérica em todos os cromossomos de ambas as
28
espécies. Entretanto, os blocos foram considerados maiores em D. genei. Adicionalmente, D.
jagoi apresentou um bloco intersticial no cromossomo G1 e D. genei exibiu grandes blocos
distais em sete cromossomos, sendo cinco desses polimórficos para presença de segmentos
supernumerários. O uso de fluorocromos base-específicos revelou uma marcação na região
intersticial de G1 e na região centromérica de um bivalente pequeno em D. jagoi, enquanto em
D. genei foi observado um padrão complexo. Nesta espécie, a região proximal apresentou
blocos DAPI+ e a região pericentromérica da maioria dos cromossomos, blocos CMA3+. Os
segmentos supernumerários foram DAPI+ e CMA3-. O uso de enzimas de restrição nas duas
espécies, revelou que a porção centromérica foi extensivamente digerida pelas endonucleases
MboI e Sal3A, enquanto os segmentos supernumerários, pela AluI (Rodríguez Iñigo et al.,
1993). Em D. genei, a técnica de FISH evidenciou a presença de duas famílias de DNA
repetitivo, a DgT2 e DgA3, sendo a primeira representativa da família de sequências que
formam principalmente os blocos de HC pericentroméricos e a segunda, os blocos distais, os
quais correspondem aos segmentos supernumerários (Rodríguez Iñigo et al., 1996).
Eyprepocnemis plorans é a espécie mais estudada em relação à ocorrência e
variabilidade de heterocromatina extra em gafanhotos. Esta espécie apresenta ampla
distribuição ao longo da Península Ibérica, norte da África, Cáucaso, Turquia, Turcomenistão,
Irã e sudoeste da Arábia (Bakkali et al., 1999; Camacho et al., 2003). Mais de 50 tipos de Bs
tem sido descritos nas populações analisadas. Essa diferenciação tem sido caracterizada com
base no tamanho, morfologia, comportamento, frequência e padrão de bandeamento C
(Henriques-Gil et al., 1984; López-Léon et al., 1993; Bakkali e Camacho, 2004). O tipo B1 é o
mais comum nas populações da Espanha e Marrocos, sendo considerado o B original nestas
populações. No entanto, nas populações de Melilla, a forma mais frequente é a variante B16
(Henriques-Gil et al., 1984; Bakkali et al., 1999; Henriques-Gil e Arana, 1990; Bakkali e
Camacho, 2004). Eyprepocnemis plorans também apresenta polimorfismo para segmentos
supernumarários em populações naturais da Espanha. O segmento mais frequente está
presente na região proximal do bivalente P11 (Perfectti et al., 2000).
Quanto aos acridídeos Neotropicais, alguns gêneros foram analisados através do
bandeamento C e da coloração com fluorocromos base-específicos. As espécies Schistocerca
pallens e S. flavofasciata apresentaram um padrão similar de distribuição da heterocromatina.
Em ambas, o bandeamento evidenciou HC pericentromérica em todos os cromossomos.
Schistocerca flavofasciata exibiu ainda um grande bloco distal no bivalente 9. Em células
mitóticas de embrião de S. pallens, foram vistos blocos de HC intersticiais em dois bivalentes
autossômicos. Nesta espécie, a tríplice coloração CMA3/DA/DAPI revelou blocos CMA3+ na
29
região intersticial dos bivalentes M4, M5 e M6. Todos os cromossomos foram uniformemente
corados pelo DAPI (Souza e Melo, 2007).
Na subfamília Leptysminae, sete espécies foram caracterizadas em relação à HC.
Belosacris coccineipes, Stenacris xanthochlora e Tucayaca parvula apresentaram apenas HC
pericentromérica em todos os cromossomos do complemento (Loreto e Souza, 2000, Rocha et
al., 2004). Em adição aos blocos pericentroméricos, blocos distais foram observados em dois
cromossomos de tamanho médio em Cornops aquaticum e C. frenatum frenatum, e em dois
cromossomos, um de tamanho médio e outro pequeno, em Stenopola dorsalis (Rocha et al.,
2004). Leptysma argentina exibiu blocos pericentroméricos em todos os cromossomos,
intersticiais em três bivalentes médios e um bloco C negativo no bivalente 10.
Adicionalmente, a espécie foi polimorfica para segmentos heterocromáticos nos cromossomos
pequenos e para presença de um cromossomo B (Bidau e Hasson, 1984).
A coloração com fluorocromos base-específicos revelou marcação CMA3+ na região
pericentromérica nos bivalentes M6, P9 e P11 de Belosacris coccineipes (Loreto e Souza,
2000). Cornops f. frenatum apresentou blocos CMA3+ em todos os cromossomos. Cornops
aquaticum, por sua vez, mostrou blocos CMA3+ nos bivalentes M3, M5 e P9. Em Stenopola
dorsalis, a marcação foi identificada em cinco bivalentes médios. Stenacris xanthochlora e
Tucayaca parvula apresentaram blocos CMA3+ na região proximal do M8 e nas regiões
pericentroméricas dos bivalentes P9 e P10. Adicionalmente, T. parvula também apresentou
marcação na região proximal do M7. O DAPI corou uniformemente todos os cromossomos
dos leptysmíneos analisados (Loreto e Souza, 2000; Rocha et al., 2004).
Loreto et al. (2008b) observaram em Rhammatocerus brasiliensis (Gomphocerinae)
blocos pericentroméricos em todos os cromossomos, incluindo o polimórfico cromossomo B.
Contudo, as demais regiões deste cromossomo mostraram coloração intermediária entre a
eucromatina dos cromossomos A e a HC observada pelo bandeamento C. As regiões
pericentroméricas de todos os cromossomos, incluindo aquelas observadas no cromossomo B,
exibiram blocos CMA3+. O ommatolampíneo Abracris flavolineata, por sua vez, apresentou
blocos pericentroméricos de HC estendendo-se por todo o braço curto de todos os
cromossomos, exceto no bivalente M7, o qual apresentou apenas HC pericentromérica (Cella
e Ferreira, 1991).
Na região Neotropical, o gênero Dichroplus merece destaque pelo amplo
polimorfismo tanto para presença de cromossomos B como para segmentos supernumerários.
Bidau (1987) observou a ocorrência de Bs mitoticamente instáveis em D. pratensis. Nesta
espécie, o cromossomo B é um pequeno telocêntrico, parcialmente eucromático. O número de
Bs variou de 0 a 4, e esta variação foi inter e intrafolicular. A presença de Bs apesar de não
30
afetar o comportamento meiótico normal de D. pratensis, acarretou no aumento da produção
de macroespermátides, além de influenciar na frequência de quiasmas. Em D. elongatus, por
sua vez, foi observado polimorfismo para cromossomos B e segmentos supernumerários nos
bivalentes M6, P9 e P10 em populações naturais da Argentina. O cromossomo B nesta espécie
foi mitoticamente instável, podendo variar de 0 a 6 entre folículos testiculares. A ocorrência
dessa heterocromatina extra afetou a frequência e distribuição de quiasmas e, adicionalmente,
os cromossomos B tiveram influência sobre a fertilidade dos machos (Clemente et al., 1994;
Remis e Vilardi, 2004; Remis et al., 2004; Rosetti et al., 2007).
Em várias populações argentinas de Metaleptea brevicornis adspersa, a presença de
um isocromossomo B estável foi observada (Bidau, 1986; Pastori e Bidau, 1994, Grieco e
Bidau, 2000). No entanto, Grieco e Bidau (2000) identificaram a presença de dois cinetócoros
separados por um material axial de comprimento considerável neste cromossomo. Foram
propostas duas hipóteses alternativas para explicar a natureza dicêntrica do isocromossomo B:
1) a ocorrência de uma translocação de um braço inteiro entre dois cromossomos B
acrocêntricos ancestrais e 2) produção de uma permuta tipo U entre as cromátides de um
cromossomo B acrocêntrico, resultando em um isocromossomo B dicêntrico e um pequeno
fragmento acrocêntrico.
1.4. Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)
1.4.1. Considerações Gerais
O nucléolo é uma estrutura presente nas células eucarióticas, responsável pela síntese
de RNA ribossomal (RNAr) e biogênese dos ribossomos (Hadjiolov, 1985; Raska et al.,
2004). Esta organela consiste de três partes principais: os centros fibrilares, o componente
fibrilar denso e o componente granular. Os primeiros são áreas que contêm o DNAr e a RNA
polimerase I; o segundo localiza-se ao redor do centros fibrilares; e o terceiro forma a camada
mais externa do nucléolo e consiste de partículas pré-ribossomais (Olson et al., 2000; Sumner,
2003).
A função primária da região nucleolar é, claramente, a síntese dos diferentes tipos de
RNAr e o processamento destes em pré-ribossomos. Contudo, outras funções podem ser
atribuídas a esta organela, tais como a inibição do pareamento de cromossomos homólogos e
formação do complexo sinaptonêmico (John, 1990). Um importante papel do nucléolo
31
também tem sido descrito na regulação do ciclo celular. Três reguladores do ciclo, cuja
atividade é regulada pelo sequestro no nucléolo, foram identificados: a Cdc 14, uma proteína
fosfatase necessária para promoção da saída da mitose; a Mdm2, um inibidor da proteína
supressora de tumor p53; e Pch2, uma proteína requerida para progressão do ciclo celular
meiótico em resposta a defeitos na recombinação e sinapse cromossômica (Visintin e Amon,
2000; Sumner, 2003).
As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) são segmentos específicos do
cromossomo que contêm cópias dos principais genes de DNAr que codificam RNA
ribossômico (Schwarzacher e Wachtler, 1983). Estes genes estão separados por espaçadores
transcritos internos e externos. Os primeiros são compostos por unidades de repetição ricas
em GC, motivo pelo qual as RONs, geralmente, apresentam marcações positivas quando
submetidas a coloração com o fluorocromo Cromomicina A3 (Torres et al., 1990; King,
1991).
Quatro tipos de RNAr são conhecidos em eucariotas, o 5S; 5,8S; 18S e 28S. O produto
desses genes associados a proteínas específicas é necessário na formação dos ribossomos. Os
RNAs 5,8S; 18S e 28S ribossômicos são sintetizados pelos genes presentes nas RONs e estão
organizados em tandem, dando origem a unidades que formam o RNAr 45S. O RNAr 5S, por
sua vez, é codificado por genes, que normalmente estão localizados em sítios distintos das
RONs, podendo ser encontrados em vários locos distribuídos em um ou mais cromossomos
(Sumner, 2003; Raska et al., 2004).
A análise das RONs pode proporcionar importantes informações sobre a organização
cromossômica e função gênica, além de ser um bom marcador cromossômico para diferenciar
espécies e até mesmo raças (Sumner, 1990). O estudo citológico das RONs teve um grande
avanço, a partir da década de 70, com o surgimento da técnica de impregnação com nitrato de
prata (AgNO3) desenvolvida por Goodpasture e Bloom (1975). A alta eficiência desta técnica
para identificação de RONs ativas é devido a grande afinidade dos sais de prata pelas
proteínas não-histônicas associadas aos sítios de DNAr (Sumner, 1990; Trerè, 2000). A
impregnação pelo nitrato de prata consiste em expor o material biológico a uma solução salina
a 60ºC e, em seguida, submetê-lo a uma solução de nitrato de prata e incubá-lo em câmara
úmida a 70° - 80°C (Rufas et al., 1987). Essa técnica permite uma diferenciação entre os
nucléolos ou remanescentes nucleolares, que se marcam em negro ou marrom escuro e a
cromatina dos cromossomos que, por sua vez, se diferencia em amarelo (Sumner, 1990). Cada
ponto marcado pela prata corresponde, ultraestruturalmente, ao centro fibrilar intimamente
associado ao componente fibrilar denso (Derenzini et al., 1990; Trerè, 2000).
32
O uso da impregnação com AgNO3 tem permitido identificar outros componentes
cromossômicos, além dos nucléolos, em insetos. Em gafanhotos, esta técnica tem revelado
diferentes estruturas, tais como cinetócoros, complexo sinaptonêmico, “cores” (esqueleto de
proteínas não-histônicas) e centríolos adjuntos das espermátides (estrutura protéica que está
unida ao núcleo e em volta do único centríolo presente em espermátides haplóides normais)
(Rufas et al.,1983; 1987).
A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda ribossômica combinada com a
impregnação com nitrato de prata, tem permitido o estudo mais preciso das RONs quanto à
variabilidade e atividade dos genes ribossomais. Apesar da correlação entre a marcação dos
remanescentes nucleolares corados pelo AgNO3 e a identificação dos mesmos com sondas de
DNAr, os resultados obtidos entre as duas técnicas podem diferir. Isto ocorre porque a FISH
localiza os sítios de DNAr independentes do seu estado de ativação, enquanto a impregnação
com AgNO3 permite localizar apenas as RONs com atividade transcricional na intérfase
anterior (Sumner, 1990; Moscone et al., 1996).
1.4.2. Regiões Organizadoras de Nucléolos em Gafanhotos
Em gafanhotos, as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) apresentam grande
variabilidade quanto à distribuição e número, podendo variar de um a cinco, embora a
presença de duas RONs por células seja a condição mais frequente. Geralmente, os
remanescentes nucleolares são facilmente localizados, através da impregnação com AgNO3,
durante o início da prófase meiótica (Rufas et al., 1985; Esponda et al., 1985). As RONs ainda
podem ser classificadas de acordo com sua expressão em primárias, as quais estão ativas em
todos os espermatócitos primários, e secundárias, apresentando atividade ocasional em
algumas células do indivíduo (Fernández-Piqueras et al., 1983; Santos et al., 1990). Quanto à
distribuição dentro do complemento cariotípico, três padrões básicos têm sido observados: 1)
restritas ao cromossomo X, 2) restritas aos autossomos e 3) presentes tanto no cromossomo X
quanto nos autossomos (Cabrero e Camacho, 1986b; Rocha et al., 1997; Souza et al., 1998;
Loreto e Souza, 2000; Bridle et al., 2002; Rocha et al., 2004; Souza e Melo, 2007).
Rufas et al. (1985) descreveram o padrão de distribuição de RONs em espermatócitos
de 21 espécies de gafanhotos acridoideos provenientes da Espanha. Neste estudo foi
observado uma grande variabilidade, tanto em relação ao número quanto à localização das
RONs. Todavia, a maioria das espécies apresentou dois remanescentes nucleolares por
células, localizados, preferencialmente, em autossomos de tamanho médio e pequeno. Apenas
33
Melanoplus frigidus, Eyprepocnemis plorans, Ramburiella hispanica, Chorthippus apicallis e
Gomphocerus sibiricus apresentaram RONs localizadas tanto em autossomos como no
cromossomo X. A presença de RONs localizadas em cromossomos megaméricos, também,
pôde ser observada, como por exemplo, nas espécies Arcyptera microptera e A. tornosi.
A espécie Eyprepocnemis plorans apresentou quatro RONs ativas, localizadas na
região proximal dos bivalentes P9, P10 e P11 e do univalente X (Cabrero et al., 1987). No
entanto, o emprego da FISH com sonda de DNAr revelou a presença de sítios ribossomais na
região pericentromérica de todos os cromossomos do complemento A e na metade distal do
cromossomo B em diferentes populações da Espanha (López-Léon et al., 1994) e Marrocos
(Bakkali et al., 2001). O maior número de sequências foi encontrado no cromossomo B,
seguido pelos cromossomos X, P9, P10 e P11, os quais correspondem as RONs primárias. Os
demais exibiram pequenas marcações, correspondendo a um baixo número de cópias de
DNAr. Os genes de RNAr presentes no cromossomo B foram inativos nas populações das
duas localidades. Por outro lado, apenas RONs primárias foram ativas nos espécimes da
Espanha, enquanto nas populações do Marrocos uma alta frequência de RONs secundárias
ativas foram observadas. Esta ativação pode ser devida a diferenças genéticas e/ou
ambientais, determinando as mudanças nos indivíduos do Marrocos (López-Léon et al., 1994;
Bakkali et al., 2001).
Uma análise comparativa através da técnica de FISH identificou diferenças no número
de RONs em cinco espécies da subfamília Eyprepocnemidinae. A espécie Eyprepocnemis
plorans, oriunda do Norte do Cáucaso, mostrou sítios de DNAr apenas nos pares P9 e P11. As
demais apresentaram um número variável de bivalentes com sequências ribossomais: um em
Thisoicetrinus pterostichus (P9), dois em E. unicolor (P9 e P10) e Hetracris adspersa (M8 e
P11) e três em Shirakiacris shirakii (P9, P10 e P11). A impregnação com AgNO3 detectou
atividade em todos os sítios de DNAr nas cinco espécies analisadas (Cabrero et al., 2003).
Cabrero e Camacho (1986b) realizaram uma análise do padrão de distribuição de
RONs em 20 espécies de gonfoceríneos da região Paleártica. Cerca de dez espécies
apresentaram RONs restritas aos autossomos, quatro restritas ao X e seis presentes tanto nos
autossomos como no cromossomo X. Em 17 espécies com 2n=17, as RONs primárias foram
identificadas preferencialmente nos cromossomos G2, G3 e no X, sendo a maioria localizada
em região intersticial. RONs secundárias foram encontradas em nove espécies, localizando-se
principalmente na região paracentromérica dos pares M4, M5, M6 e P8. Os cromossomos
megaméricos de Truxalis nasuta (M9) e Chorthippus apicalis (M6) mostraram RONs ativas
primárias, enquanto que nas espécies Euchorthippus pulvinatus, Omocestus bolivari, O.
34
llorenteae, Chorthippus binotatus e C. vagans, estes cromossomos exibiram RONs
secundárias.
O uso da FISH em Chorthippus brunneus e C. jacobsi revelou sítios de DNAr
associados a HC dos pares G2 e G3 nas duas espécies. Adicionalmente, C. brunneus
apresentou um sítio de DNAr extra na extremidade distal do cromossomo X. A análise destes
sítios ribossomais, através da impregnação com AgNO3, mostrou RONs ativas apenas na
região proximal dos bivalentes G2 e G3. Duas hipóteses foram levantadas para explicar a
inatividade das sequências de DNAr no cromossomo X de C. brunneus: 1) a ocorrência de
silenciamento de uma RON ancestral no cromossomo X e 2) a transposição de genes
ribossomais não funcionais de autossomos para o cromossomo X. Todos os sítios de DNAr
(ativos ou não) foram CMA3+ positivos (Bridle et al., 2002). Estudos semelhantes também
detectaram a presença de remanescentes nucleolares nos pares G2 e G3 em Chorthippus
parallelus e C. erythropus, tanto pela impregnação com AgNO3 quanto pela técnica de FISH.
Contudo, C. parallelus, assim como C. brunneus, exibiu sítios de DNAr na região distal do
cromossomo X (Gosálvez et al., 1988; Bella et al., 1990b; 2007).
Loreto et al. (2008a) descreveram o padrão de distribuição de RONs em cinco espécies
de gonfoceríneos Neotropicais. Em Rhammatocerus brasiliensis, R. brunneri, R. palustris, R.
pictus e Amblytropidia sp. foram detectadas RONs ativas na região pericentromérica do
bivalente P9. Rhammatocerus brasiliensis, por sua vez, exibiu adicionalmente RONs ativas
nos autossomos M4 e M6. A técnica de FISH confirmou as RONs ativas visualizadas pelo
AgNO3 em todas as espécies, não identificando nenhum sítio ribossomal adicional.
A presença de RONs em cromossomo megamérico também tem sido detectada em
algumas espécies. Em Oedipoda fuscocincta, o megamérico M9 apresentou uma constrição
secundária, na qual foi identificada a única RON presente em indivíduos padrões. No entanto,
em heterozigotos para ocorrência de segmentos supernumerários no cromossomo P10, a
impregnação com AgNO3 revelou a presença de uma RON extra neste segmento. Acredita-se
que esta heterocromatina extra tenha sido originada a partir da translocação de um segmento
do par P9 para região distal do P10, uma vez que só existe uma RON ativa nesta espécie
(Camacho et al., 1986). Oedipoda charpentieri, por sua vez, apresentou dois remanescentes
nucleolares associados à HC intersticial e distal do cromossomo megamérico M6 (Navas-
Castillo et al., 1987). Arcyptera tornosi exibiu duas RONs, uma localizada na HC pericêntrica
do par M3 e a outra, na HC distal do bivalente megamérico M9. O uso de fluorocromos base-
específicos identificou blocos CMA3+ e DAPI+ nas duas RONs presentes nesta espécie
(Gosálvez et al., 1987). Metaleptea brevicornis adspersa também apresentou uma RON ativa
no cromossomo megamérico M9 (Pastori e Bidau, 1994).
35
Rocha et al. (2004) identificaram a presença de três RONs nos leptysmíneos Cornops
aquaticum (M3, M5 e P9), C. frenatum frenatum (M3, M5 e P9), Stenacris xanthochlora (M8,
P9 e P10) e Tucayaca parvula (M8, P9 e P10), e apenas duas RONs em Stenopola dorsalis (M5 e
M6). Os remanescentes nucleolares de todas as espécies foram CMA3+. Belosacris
coccineipes, por sua vez, apresentou três RONs localizadas nos bivalentes P9, P10 e P11, as
quais também apresentaram riqueza em pares de bases GC (Loreto e Souza, 2000).
Em Schistocerca gregaria, uma espécie com ampla distribuição no Velho Mundo, a
impregnação com AgNO3 revelou RONs localizadas distalmente no cromossomo M6 e
proximalmente, no P9 (Rufas e Gosálvez, 1982). Contudo, as espécies americanas S.
flavofasciata e S. pallens apresentaram uma RON no bivalente M5 e duas nos bivalentes M5 e
M6, respectivamente, sendo todas localizadas nas regiões intersticiais. A coloração sequencial
AgNO3/CMA3/DA/DAPI mostrou que HC associada a RON foi CMA3+ em S. pallens.
Adicionalmente, a FISH com sonda de DNAr 45S confirmou a presença de sítios de DNAr
nos bivalentes M5 e M6 nesta espécie (Souza e Melo, 2007).
Em Stauroderus scalaris, a impregnação com AgNO3 identificou a presença de uma
única RON ativa na região pericentromérica do autossomo G3 (Cabrero e Camacho, 1986b;
López-Léon et al., 1999). Todavia, a análise com FISH, utilizando sonda de DNAr de
Triticum, revelou um caso extremo nesta espécie. S. scalaris apresentou sítios de DNAr na
heterocromatina associada à região pericentromérica de todos os cromossomos do
complemento. Embora, a marcação mais intensa tenha correspondido à única RON localizada
no bivalente G3. A inatividade da maioria das sequências ribossomais sugere a presença de
um alto número de cópias de genes de RNAr inativas nos blocos de HC pericentroméricos.
Foi proposto que esta inatividade baseia-se na hipótese que a ativação das RONs é realizada
sequencialmente em ordem de tamanho. Neste caso, o cromossomo G3 teria a capacidade de
fornecer RNAr suficientes para demanda celular nesta espécie (López-Léon et al., 1999).
A análise de distribuição das RONs em representantes da família Romaleidae está
restrita a poucos gêneros. Radacridium nordestinum e R. mariajoseae apresentaram apenas
uma RON, mas diferiram quanto aos cromossomos portadores. Na primeira espécie o
remanescente nucleolar está localizado na região intersticial do par G2, e na segunda, na
região proximal do cromossomo X. Os centríolos adjuntos, “cores” e os cinetócoros também
foram marcados através da impregnação com AgNO3 nas duas espécies (Rocha et al., 1997).
Xyleus angulatus apresentou três RONs localizadas na região proximal dos cromossomos G3,
M4 e X. As RONs nesta espécie correspondem a áreas de heterocromatina CMA3+. A
utilização da técnica de FISH com sonda pTa71 de trigo (Triticum aestivum) revelou
marcações nas regiões proximais dos pares G3 e M4 e no cromossomo X, coincidindo com as
36
RONs identificadas pelo AgNO3 (Souza et al., 1998). Phaeoparia megacephala apresentou
uma RON na região proximal do bivalente M6, a qual foi CMA3+ (Pereira e Souza, 2000).
Em Xestotrachelus robustus, o uso da impregnação com AgNO3 e FISH com sonda de
DNAr 45S de Arabidopsis thaliana detectaram a presença de apenas uma RON na região
pericentromérica do bivalente M5. Um bloco CMA3+ também foi identificado nesta região
(Souza et al., 2003). As espécies Chromacris nuptialis e C. speciosa, por sua vez,
apresentaram uma RON localizada no bivalente M6. A FISH confirmou a presença de sítios
ribossomais apenas no M6 e revelou localização exata dos mesmos, sendo localizado na
região pericentromérica em C. nuptialis e na região proximal em C. speciosa (Loreto et al.,
2005).
OBJETIVOS
38
22.. OObbjjeettiivvooss
2.1. Objetivo Geral
Realizar uma análise citogenética-comparativa nas espécies de gafanhotos Baeacris
punctulatus e Dichroplus fuscus (Acrididae: Melanoplinae) por meio de diferentes
técnicas citogenéticas.
2.2. Objetivos Específicos
1. Descrever o número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de
determinação sexual de Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus;
2. Analisar comparativamente os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva
(HC) e sua variabilidade;
3. Caracterizar a HC quanto à composição de pares de bases através do uso dos
fluorocromos base-específicos Cromomicina A3 (CMA3) e 4’-6-diamidino-2-fenil-
indol (DAPI);
4. Identificar as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) através da impregnação com
nitrato de prata (AgNO3) e por hibridização in situ fluorescente (FISH).
MATERIAIS E MÉTODOS
40
33.. MMaatteerriiaaiiss ee MMééttooddooss
3.1. Materiais
Neste trabalho foram estudados cromossomos meióticos obtidos de 76 espécimes
machos de melanoplíneos: 45 indivíduos de Baeacris punctulatus (Thunberg, 1824) e 31 de
Dichroplus fuscus (Thunberg, 1815). Os gafanhotos foram coletados com auxílio de rede
entomológica em diferentes localidades dos Estados de Pernambuco e da Bahia (Tabela 2). A
identificação taxonômica das espécies analisadas foi realizada pelo professor e entomólogo
Carlos Salvador Carbonell, da Universidade de La Republica, Montevidéu, Uruguai. Todos os
exemplares foram depositados na coleção entomológica do Laboratório de Genética e
Citogenética Animal, do Departamento de Genética, CCB, UFPE.
Número de espécimes Locais de coleta Coordenadas B. punctulatus D. fuscus
3 10 Bezerros/PE 8º14’0’’ S: 35º47’49’’ W 1 0 Bonito/PE 8º28’13’’ S: 35º43’43’’ W 5 11 Caruaru/PE 8º17’0’’ S: 35º58’34’’ W 6 0 Goiana/PE 7º33’38’’ S: 35º0’9’’ W 3 0 Igarassu/PE 7º50’31’’ S: 34º54’23’’ W 1 0 Itamaracá/PE 7º44’52’’ S: 34º49’32’’ W
11 2 Mucugê/BA 13º0’19’’ S: 41º22’15’’ W 5 2 Rio de Contas/BA 13º34’44’’S: 41º48’41’’ W
10 4 Saloá/PE 8º58’33’’ S: 36º41’15’’ W 0 2 Vitória de Santo
Antão/PE 8º7’5’’ S: 35º17’29’’ W
3.2. Métodos
3.2.1. Processamento dos Espécimes
Os exemplares machos de B. punctulatus e D. fuscus foram sacrificados com éter para
retirada dos testículos. Este material foi fixado em solução Carnoy (etanol: ácido acético 3:1),
identificado e acondicionado em freezer.
Tabela 2. Número de espécimes estudados de Baeacris punctulatus e Dichroplus fuscus, locais de coleta e coordenadas geográficas.
41
3.2.2. Preparações Citológicas
As preparações citológicas foram realizadas empregando a técnica clássica de
esmagamento de folículos testiculares, que consiste em fragmentar folículos em uma gota de
ácido acético a 45% e esmagá-los entre a lâmina e lamínula. As lâminas a serem utilizadas nas
diferentes técnicas de análise citogenética, com exceção da coloração convencional, foram
mergulhadas em nitrogênio líquido para retirada das lamínulas e envelhecidas três dias à
temperatura ambiente antes de serem submetidas às técnicas de bandeamento.
3.2.3. Coloração Convencional
Para coloração convencional foi usado o corante orceína lacto-acética a 2%. Neste
caso, o corante foi adicionado à lâmina antes do esmagamento dos folículos testiculares. As
lâminas foram vedadas com esmalte para evitar a evaporação do corante. Este método foi
usado para determinar o número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de
determinação do sexo de cada espécie estudada.
3.2.4. Bandeamento C
O bandeamento C foi realizado segundo Sumner (1972), com algumas modificações
em relação ao tempo de exposição às diferentes soluções. As lâminas foram pré-tratadas com
uma solução ácida (HCl 0,2 N) por 30 minutos em temperatura ambiente e depois lavadas
com água destilada. Em seguida, mergulhadas em solução saturada de hidróxido de bário
(Ba(OH)2) a 60°C por um minuto. Após lavagem em HCl (0,2 N) e em água destilada para a
retirada de todo resíduo de Ba(OH)2, as lâminas foram mergulhadas em solução salina (2 x
SSC) a 60°C por 45 minutos e novamente lavadas com água destilada. A coloração foi
realizada com solução de Giemsa a 5% diluída em tampão fosfato pH 6,8 por 5 minutos. Na
seqüência, as lâminas foram lavadas com água destilada e montadas com bálsamo do Canadá.
3.2.5. Coloração CMA3/DA/DAPI
A coloração com fluorocromos base-específicos foi realizada segundo o método
descrito por Schweizer (1976), com pequenas modificações. Duas gotas da solução de CMA3
(0,5 mg/ml) foram colocadas sobre cada lâmina. O material foi coberto com uma lamínula e
incubado em uma caixa fechada por 40 minutos. Após este período a lâmina foi lavada com
42
água destilada. Em seguida, foram adicionadas duas gotas da solução de Distamicina A (0,1
mg/ml) e o material foi coberto com lamínula. A lâmina ficou incubada por 30 minutos e
depois foi lavada. Por fim, foram adicionadas duas gotas da solução de DAPI (2 µg/ml) e
novamente a lâmina foi coberta com lamínula, incubada por 20 minutos e depois lavada. Após
as colorações, a lâmina foi montada com meio de montagem com glicerol/tampão
Macllvaine/MgCl2. Todo o procedimento foi realizado no escuro e as lâminas acondicionadas
em caixa fechada, até o momento de serem analisadas em microscópio de fluorescência.
3.2.6. Impregnação com Nitrato de Prata (AgNO3)
Para impregnação com nitrato de prata (AgNO3) foi utilizado o método desenvolvido
por Rufas et al (1987), com pequenas modificações. As lâminas foram pré-tratadas com
solução salina (2 x SSC) a 60°C por 10 minutos. Em seguida, foram submetidas a uma
solução de nitrato de prata (1 g/ml) com pH 3,0 ajustado com ácido fórmico e incubadas a 70°
em câmara úmida pré-aquecida por três minutos. Depois de lavadas com água destilatada, as
lâminas foram montadas com bálsamo do Canadá.
3.2.7. Hibridização In Situ Fluorescente (FISH)
A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia
de Moscone et al. (1996), com pequenas modificações. Os sítios de DNAr 45S foram
localizados usando a sonda R2, um fragmento de 6.5 kb da unidade repetitiva do DNAr 18S-
5,8S-25S de Arabidopsis thaliana. A sonda foi marcada por nick translation (Invitrogen) com
digoxigenina-11-dUTP (Roche). As lâminas, previamente preparadas e armazenadas no
freezer, foram fixadas em Carnoy 3:1 por 15 minutos, desidratadas em etanol 70% e 100%,
por 5 minutos cada e secas na estufa a 60 ºC por 30 minutos. Em seguida, foram pré-tratadas
com RNAse a 37 ºC por 1 hora, lavadas em 2 x SSC, tratadas com proteinase K por 20
minutos, fixadas em paraformaldeído por 10 minutos, desidratadas em etanol 70% e 100%
por 5 minutos cada e deixadas para secar por pelo menos 90 minutos. A mistura de
hibridização continha 50% de formamida (v/v), 5% de dextran sulfato (w/v), 2 x SSC de 2–5
ng/µl de cada sonda. Cada lâmina recebeu 10 µl da mistura de hibridização e foi coberta com
uma lamínula. O conjunto sonda-cromossomo foi desnaturado a 75 ºC por 5 minutos e
colocado para hibridizar a 37 ºC por 18 horas. Os banhos pós-hibridização foram realizados
em 2 x SSC (2 vezes de 5 minutos cada) e 0,1 x SSC (2 vezes de 5 minutos cada). A sonda foi
detectada com anti-digoxigenina conjugada com FITC produzido em ovelha (Roche) e o sinal
43
amplificado com anticorpo contra anticorpos de ovelha, produzido em coelho, conjugado com
FITC (Dako). Todas as preparações foram contra-coradas e montadas com 2 µg/ml de DAPI
em Vectashield (Vector).
3.2.8. Documentação Fotográfica
A captura de imagens das células meióticas foi realizada com uma câmera digital
Olympus D-535 ZOOM acoplada a ocular do microscópio Leica WILD MPS 52. Para a
coloração com fluorocromos, foi utilizado o microscópio Leica DMRB. As imagens foram
capturadas com o uso do programa IM50. Para a FISH, por sua vez, foi utilizado um
fotomicroscópio de epifluorescência Leica DMLB, acoplado com uma câmera de vídeo Cohu.
As imagens das melhores células foram capturadas usando programa QFISH da Leica. Todas
as pranchas foram montadas com o auxílio do programa Corel Photo-Paint 12.
RESULTADOS
45
44.. RReessuullttaaddooss
4.1. Baeacris punctulatus
A espécie Baeacris punctulatus apresentou número diplóide 2n=23 e mecanismo
sexual do tipo X0. Todos os cromossomos do complemento exibiram morfologia acrocêntrica
e foram agrupados em três pares grandes (G1 – G3), cinco médios (M4 – M8) e três pequenos
(P9 – P11). O cromossomo X apresentou tamanho médio (Figura 1). Este cromossomo mostrou
heteropicnose positiva durante o início da meiose (Figura 1a, b), heteropicnose negativa em
metáfase I (Figura 1c) e isopicnose em metáfase II (Figura 1d). O bivalente P10 também
apresentou blocos heteropicnóticos positivos durante a prófase (Figura 1b).
A análise da heterocromatina constitutiva (HC), através do bandeamento C, revelou
pequenos blocos pericentroméricos em todos os autossomos do complemento, com exceção
do bivalente 10, o qual apresentou um grande bloco de HC nesta região. Este padrão
encontrado no P10 corresponde ao bloco heteropicnótico positivo observado durante o início
da prófase I. O cromossomo X também apresentou um pequeno bloco na região
pericentromérica e adicionalmente, assim como o bivalente M4, apresentou um pequeno bloco
terminal. O bivalente G2 exibiu um bloco proximal (Figura 2a, b).
A tríplice-coloração CMA3/DA/DAPI identificou diminutos blocos CMA3 positivos
(CMA3+) na região pericentromérica de todos os autossomos e na região proximal do
bivalente G2, os quais corresponderam aos blocos visualizados pelo bandeamento C. O bloco
de HC pericentromérico presente no cromossomo X também foi CMA3+. (Figura 2c). Por
outro lado, os blocos terminais de HC dos cromossomos M4 e X foram neutros para o CMA3.
O tamanho das marcações fluorescentes de todos os cromossomos foi bem menor quando
comparados aos blocos de HC. Adicionalmente, um cromossomo de tamanho médio
apresentou um bloco intersticial CMA3+, o qual não coincidiu com nenhum bloco detectado
pelo bandeamento C (Figura 2c). A coloração com DAPI mostrou-se homogênea em todos os
cromossomos do complemento (Figura 2d).
Baeacris punctulatus apresentou um padrão de distribuição de regiões organizadoras
de nucléolos (RONs) bastante diferenciado. Os remanescentes nucleolares foram observados
em cinco bivalentes autossômicos e no cromossomo X. A impregnação com AgNO3 permitiu
detectar, em diferentes subfases da prófase meiótica (leptóteno – diplóteno), uma variação na
atividade das RONs (uma a seis) nesta espécie (Figura 3). Para avaliar a frequência de
atividade das RONs foram analisadas 568 células, marcadas pelo AgNO3, de diferentes
46
indivíduos. Para esta contagem foi levada em consideração a presença visível do cromossomo
X. A Tabela 3 mostra as frequências total e parcial de atividade das RONs. O número mais
frequente observado foi de três RONs por célula (34,33%), seguido por duas e quatro RONs
(25,35%). A presença de uma ou seis RONs ativas foi bastante baixa, compreendendo 1,76 e
1,59%, respectivamente. A identificação exata dos autossomos portadores das RONs não foi
possível através da análise com impregnação com AgNO3, uma vez que a maioria das células
analisadas estavam em estágios meióticos bastante iniciais. No entanto, nos diplótenos
analisados foi visto que os remanescentes nucleolares estavam presentes em cromossomos de
tamanho grandes e/ou médios.
O cromossomo X pode ou não estar envolvido no conjunto de RONs ativas (Figuras 3
e 4; Tabela 3). Das 568 células analisadas, 365 mostraram atividade do cromossomo X, o que
correspondeu à cerca de 64%. Foi observado que em 100% das células com apenas um
remanescente nucleolar, este sempre correspondia a um bivalente autossômico. Das 144
células com 2 RONs 59,03% apresentaram RONs ativas apenas em autossomos e 40,97% em
autossomos e no cromossomo X. A partir de três RONs ativas, a frequência de atividade
apenas em autossomos diminui (33,85%) e aumenta de forma significativa a atividade do X
(66,15%), chegando a atingir 100% das células com seis RONs ativas (Figura 4; Tabela 3).
A técnica de FISH permitiu a identificação de seis sítios de DNAr, sendo localizados
nas regiões pericentroméricas dos três bivalentes grandes (G1 – G3), em dois bivalentes de
tamanho médio e no cromossomo X. Os sinais de hibridização apresentaram pequenas
diferenças em relação ao tamanho, sendo maiores nos cromossomos grandes e menores nos
bivalentes médios e no X (Figura 5). O número de sítios ribossômicos identificados pela FISH
coincidiu com os remanescentes nucleolares marcados pela impregnação com AgNO3.
Nº de RONs ativas
Nº de cél. analisadas
Freq. total de RONs (%)
N° de cel. com o X ativo
Freq. de RONs apenas autossomos (%) para cada conjunto de RONs ativas
1 10 1,76 0 100 2 144 25,35 59 59,03 3 195 34,33 129 33,85 4 144 25,35 112 22,22 5 66 11,62 56 15,15 6 9 1,59 9 0
Total 568 100 365 -
Tabela 3. Comparação entre as frequências de atividade das RONs em Baeacris punctulatus.
47
4.2. Dichroplus fuscus
A espécie Dichroplus fuscus apresentou número diplóide 2n=19 e mecanismo sexual
do tipo X0. Os cromossomos foram agrupados em dois pares grandes (G1 – G2), quatro
médios (M3 – M6) e três pequenos (P7 – P9). O cromossomo X foi considerado um dos
menores médios. Os pares G1 e G2 mostraram morfologia meta-submetacêntrica e os demais,
acrocêntrica (Figura 6). O cromossomo X apresentou heteropicnose positiva durante o início
da meiose (Figura 6a), heteropicnose negativa em diacinese e metáfase I (Figura 6b, c) e
isopicnose em fases adiantadas (Figura 6d). Adicionalmente, blocos heteropicnóticos
positivos foram visualizados em alguns bivalentes autossômicos. Durante o ciclo meiótico,
também foi observado comportamento megamérico do bivalente P9 (Figura 6a).
O bandeamento C revelou grandes blocos pericentroméricos de heterocromatina
constitutiva (HC) nos bivalentes de tamanho médio e pequeno, sendo diminutos no bivalente
G2. Estes bivalentes também apresentaram pequenos blocos terminais adicionais, com
exceção do bivalente G2, o qual apresentou um grande bloco. O bivalente G1, por sua vez, não
apresentou nenhum bloco de HC detectável pelo bandeamento C. O cromossomo X
apresentou um grande bloco na região pericentromérica e um pequeno na região terminal. O
cromossomo megamérico P9 foi quase inteiramente heterocromático, mostrando grandes
blocos pericentromérico e terminal (Figura 7a, b). Este padrão, assim como o encontrado nos
demais bivalentes, corresponde aos blocos heteropicnóticos observados durante a prófase I da
meiose.
A tríplice-coloração CMA3/DA/DAPI evidenciou blocos CMA3 positivos (CMA3+) na
HC pericentromérica dos bivalentes médios e pequenos e do cromossomo X, coincidindo com
o padrão detectado pelo bandeamento C. Os blocos terminais dos pares G2, M5, M6 e P7 foram
CMA3+, enquanto que os blocos dos pares M3, M4, P8, P9 e o do cromossomo X foram neutros
(Figura 7c). Todos os blocos CMA3+ foram DAPI negativo, indicando ausência de riqueza de
pares de base AT nesta espécie (Figura 7d). O bivalente G1 não exibiu nenhuma marcação
fluorescente (Figura 7c, d).
A impregnação com AgNO3 evidenciou a presença de duas regiões organizadoras de
nucléolos (RONs), localizadas nos bivalentes M3 e P7 (Figura 8a, b). Adicionalmente, o
AgNO3 marcou os cinetócoros e as regiões de HC em todos os cromossomos (Figura 8b).
Entretanto, o tamanho dos blocos marcados pelo AgNO3 foi menor quando comparado com
aqueles marcados pelo bandeamento C. O uso da hibridização in situ fluorescente (FISH)
permitiu detectar sítios de DNAr na região pericentromérica do bivalente M3 e na região
48
proximal do bivalente P7, coincidindo com a marcação observada através da impregnação
com AgNO3 (Figura 8c, d).
49
Figura 1. Células meióticas de Baeacris punctulatus coradas convencionalmente. (a) Paquíteno; (b) diplóteno; (c) metáfase I; (d) metáfase II. Barra = 5 µm.
50
Figura 2. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração CMA3/DA/DAPI (c, d) em cromossomos meióticos de Baeacris punctulatus. (a, b) Diplótenos; (c, d) paquítenos. As cabeças de seta em c apontam os diminutos blocos CMA3
+ pericentroméricos. A seta indica o bloco intersticial adicional. Barra = 5 µm.
51
Figura 3. Diferentes marcações das RONs ativas detectada pela impregnação com AgNO3 em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, c, d) Zigótenos; (b) diplóteno; (e, f) paquítenos iniciais. Barra = 5 µm.
52
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6
Número de RONs ativas
Freq
üênc
ia d
e ativ
idad
e (%
)Autossomos Autossomos + X
Figura 4. Comparação entre as frequências de atividade das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) localizadas apenas em autossomos e em autossomos e no cromossomo X em Baeacris punctulatus.
53
Figura 5. FISH com sonda de DNAr 45S em células meióticas de Baeacris punctulatus. (a, b) Paquíteno; (c, d) metáfase II. Em a e c coloração com DAPI. Barra = 5 µm.
54
Figura 6. Coloração convencional em células meióticas de Dichroplus fuscus. (a) Paquíteno; (b) diacinese; (c) metáfase I; (d) anáfase I. Barra = 5 µm.
55
Figura 7. Bandeamento C (a, b) e tríplice coloração (CMA3/DA/DAPI) (c, d) em células paquitênicas de Dichroplus fuscus. Em c paquíteno corado com CMA3 e em d paquíteno corado com DAPI. As setas indicam os diminutos blocos pericentroméricos de HC no bivalente G2. Barra = 5 µm.
56
Figura 8. Cromossomos meióticos de Dichroplus fuscus após impregnação com AgNO3
(a, b) e FISH com sonda de DNAr 45S (c, d). (a) Zigóteno; (b, c, d) paquíteno. Em c célula corada com DAPI. As setas indicam os sítios de DNAr 45S. Barra = 5 µm.
DISCUSSÃO
58
55.. DDiissccuussssããoo
De acordo com análise cromossômica convencional Baeacris punctulatus apresentou
número diplóide de 2n=23,X0 e Dichroplus fuscus, 2n=19,X0. O padrão cariotípico
observado em B. punctulatus está de acordo com o que tem sido descrito para a maioria das
espécies de Acridoidea (Mesa et al., 1982). A redução do número cromossômico em D. fuscus
decorre provavelmente de duas fusões cêntricas entre acrocêntricos ancestrais resultando em
dois pares de cromossomos com dois braços (meta-submetacêntricos). Reduções do número
diplóide também foram descritas para outras espécies do gênero Dichroplus, o qual tem sido
caracterizado por ser o mais diverso cariotipicamente dentro da subfamília Melanoplinae. No
entanto, apenas em D. pratensis foi descrito o cariótipo 2n=19,X0 (Mesa et al., 1982;
Colombo et al., 2005).
Dichroplus representa um gênero com ampla diversidade cariotípica variando de
2n=23, observado em D. elongatus, até 2n=8, em D. silveiraguidoi. Fusões cêntricas
representam os principais mecanismos responsáveis pela redução do número diplóide neste
grupo. Por outro lado, muitos cariótipos derivados conservam o número de braços
cromossômicos, em decorrência da formação de cromossomos meta-submetacêntricos.
(Bidau, 1990, 1991; Martí e Bidau, 2001; Bidau e Martí, 2004; Colombo et al., 2005). A
espécie D. silveiraguidoi é uma exceção dentro do gênero, uma vez que o número diplóide e
número de braços cromossômicos foram bastante reduzidos (Cardoso et al., 1974; Saéz e
Pérez-Mosquera, 1977).
O padrão pericentromérico, observado em B. punctulatus e D. fuscus, é considerado o
mais comum entre as espécies de Acrididae. Blocos proximais e terminais foram observados
em ambas as espécies estudadas, o que também ocorre com menor frequência em alguns
acridídeos (King e John, 1980; Cabrero e Camacho, 1986a; Rocha et al., 2004; Loreto et al.,
2005). Por outro lado, D. fuscus exibiu blocos de HC bem maiores quando comparados com
aqueles observados em B. punctulatus. A ausência ou diminuição da HC pericentromérica nos
cromossomos G1 e G2, respectivamente, de D. fuscus, pode estar associada à perda de
heterocromatina, decorrente de rearranjos do tipo fusões cêntricas, entre os maiores
cromossomos do complemento, envolvidas na origem desses cromossomos com dois braços.
Rocha et al. (1997) também observaram a presença de cromossomos sem blocos de HC em
Radacridium mariajoseae, que apresentou HC restrita apenas a seis cromossomos.
Em D. fuscus, o bivalente P9 correspondeu a um cromossomo megamérico. Esse tipo
cromossômico tem sido descrito em diferentes espécies de gafanhotos (Camacho et al., 1986;
Rocha et al., 1997; Loreto et al., 2008a). O padrão de bandeamento C em D. fuscus revelou
59
grandes blocos pericentromérico e terminal de HC no bivalente P9. Esta grande quantidade de
HC também tem sido observada em megaméricos de outras espécies, tais como Aiolopus
thalassinus, Perala niridis, Oedipoda charpentieri e Radacridium mariajoseae (King e John,
1980; Navas-Castillo et al., 1987; Rocha et al., 1997).
Apesar da presença do cromossomo megamérico ter sido relatada para vários
acridoideos, ainda não se sabe qual o seu papel biológico. No entanto, devido à similaridade
deste marcador com o cromossomo X (em relação à transcrição, replicação e alociclia),
acredita-se que sua função seja similar a inativação do cromossomo X durante a
espermatogênese, sendo o megamérico um portador de genes cuja inatividade durante a
meiose seja necessária em algum processo particular (Hewitt, 1979).
A coloração CMA3/DA/DAPI tem revelado uma ampla heterogeneidade na
composição de pares de bases da HC entre os acridoideos. Vários padrões têm sido descritos
para este grupo, contudo, o padrão CMA3+ apresenta predominância entre as espécies (John et
al., 1985; Souza et al., 2003; Rocha et al., 2004; Loreto et al., 2005; 2008b). As duas espécies
analisadas neste trabalho mostraram diferenças quanto à composição da HC. Em B.
punctulatus, os blocos CMA3+ foram muito pequenos e com localização pericentromérica em
todos os cromossomos e na região proximal do bivalente G2, indicando riqueza de pares de
bases GC na heterocromatina dessa espécie, diferente dos blocos terminais do M4 e do X, que
foram neutros para o CMA3. Por outro lado, a presença de um grande bloco CMA3+ na região
intersticial de um bivalente médio, não coincidindo com nenhum bloco positivo para o
bandeamento C, sugere a ocorrência de uma classe de DNA distinta nesta região.
Diferente de B. punctulatus, D. fuscus mostrou um padrão de qualificação da HC no
qual grandes blocos foram CMA3+. Esse padrão correspondeu aos blocos visualizados pelo
bandeamento C indicando ampla riqueza de pares de base GC na heterocromatina dessa
espécie. Padrões semelhantes foram descritos para os romaleídeos Xyleus angulatus,
Phaeoparia megacephala e Xestrotrachelus robustus (Souza et al., 1998; Pereira e Souza,
2000; Souza et al., 2003). A presença de HC neutra nas duas espécies estudadas também tem
sido decrita para outros acridídeos, como por exemplo, em Belosacris coccineipes, Cornops
aquaticum e Stenopola dorsalis e Schistocerca pallens (Loreto e Souza, 2000; Rocha et al.,
2004; Souza e Melo, 2007).
Em gafanhotos, especialmente em espécies representantes das famílias Romaleidae e
Acrididae, as RONs estão frequentemente localizadas em um ou dois pares de autossomos de
tamanho médio e pequeno (Rufas et al., 1985; Cabrero e Camacho, 1986b; Rocha et al., 2004;
Loreto et al., 2005). Neste estudo, as espécies analisadas diferiram tanto em relação ao
número quanto a distribuição e localização das RONs. Dichroplus fuscus mostrou duas RONs
60
com localização nos pares M3 e P7, padrão comum em diferentes espécies de Acridoidea. Em
contraste, B. punctulatus apresentou RONs ativas em cinco pares de autossomos e no
cromossomo X. Padrão de distribuição de RONs envolvendo mais de dois pares
cromossômicos é menos frequente nessa superfamília. São exemplos de espécies com 5
RONs Eyprepocnemis plorans, com 4 RONs Gomphocerus sibiricus e Heteracris litoralis e
com 3 RONs Rhammatocerus brasiliensis (Rufas et al., 1985; Loreto et al., 2008a).
A impregnação com nitrato de prata (AgNO3) tem revelado a ocorrência de variação
na atividade de transcrição de sítios de DNAr em vários organismos. Em B. punctulatus
ocorreu uma ampla variação na frequência de atividade das RONs, de uma até seis RONs
ativas por célula. A frequência de atividade de três foi a condição mais comum dentre as
células analisadas correspondendo a 34,33%. Contudo, o mecanismo exato pelo qual a
atividade das RONs é reprimida não está totalmente esclarecido, embora a metilação pareça
desempenhar um importante papel neste processo (Zurita et al., 1998; Bakkali et al., 2001;
Guillén et al., 2004).
A comparação em B. punctulatus entre a frequência da atividade das RONs
localizadas apenas em autossomos com aquelas presentes tanto em autossomos como no
cromossomo X, sugere que a atividade dos genes para DNAr do cromossomo X parece ter
correlação com o aumento do número de RONs autossômicas ativas. A presença de atividade
nucleolar do X foi observada em células com no mínimo duas RONs ativas, tendo um
aumento significativo da frequência de atividade deste cromossomo a partir de três RONs
ativas. Isto indica que em células com apenas uma ou duas RONs, a atividade do X não se faz
tão necessária.
Segundo Zurita et al. (1998), a variabilidade na atividade das RONs segue uma
hierarquia de tamanho, ou seja, as RONs que possuem maior número de genes de RNAr
teriam uma maior habilidade para recrutar os fatores de transcrição. Para estes autores, a partir
do momento que os primeiros fatores de transcrição vão se ligando, eles vão ativando de
maneira cooperativa os sítios adjacentes. Desta forma, a ativação de um determinado número
de RONs depende da necessidade celular no dado momento, sugerindo a existência de um
controle gênico para cada ciclo celular.
Em B. punctulatus, a FISH permitiu identificar os sítios de DNAr nos bivalentes G1,
G2 e G3, em dois bivalentes médios e no cromossomo X. Este padrão coincidiu com o número
máximo de RONs detectadas pelo AgNO3 e representa um dado inédito dentro de Acridoidea
da região Neotropical, tanto no que se refere a quantidade de cromossomos portadores de
RONs como a frequência de atividade dessas RONs. As espécies parleárticas Stauroderus
scalaris e Eyprepocnemis plorans (algumas populações da Espanha e do Marrocos)
61
apresentaram sítios de DNAr em todos os cromossomos do complemento. No entanto, a
atividade das RONs nessas espécies encontraram-se restritas a apenas um par cromossômico
(par 3) em S. scalaris e a quatro cromossomos (pares 9, 10, 11 e cromossomo X) em E.
plorans (López-Léon et al., 1994; 1999; Bakkali et al., 2001). Esta situação difere da
encontrada em B. punctulatus, uma vez que, todos os sítios mostraram-se ativos, mas com
frequência de atividade variável. Por outro lado, o grande número de sítios de DNAr
encontrado pode ser explicado pela presença de sequências repetitivas que compõem os genes
de DNAr associados às regiões de heterocromatina, as quais são áreas mais suscetíveis a
rearranjos (Sánchez-Gea et al., 2000).
Em D. fuscus, por sua vez, a FISH também identificou os cromossomos portadores das
RONs, correspondendo ao bivalente M3 e ao bivalente P7. Esse padrão é considerado comum
dentro de Acridoidea (Cabrero et al., 2003; Rocha et al., 2004; Souza e Melo, 2007). A
marcação dos cinetócoros pelo AgNO3 em D. fuscus, também, é comum para algumas
espécies de gafanhotos, tais como Chorthipus jucundus, Arcyptera microptera (Rufas et al.,
1983), A. fusca (Suja et al., 1991), Radacridium nordestinum, R. mariajoseae (Rocha et al.,
1997) e Xestotrachelus robustus (Souza et al., 2003).
A afinidade do AgNO3 por regiões de HC observada em D. fuscus, por sua vez, não
tem sido descrita em gafanhotos. No entanto, esta característica foi amplamente observada em
coleópteros da família Scarabaeidae (Colomba et al., 2000; Moura et al. 2003; Bione et al.,
2005). A afinidade dos íons de prata pela HC ocorre devido à presença de proteínas
argirofílicas distribuídas neste material. Contudo, os blocos de HC marcados pelo AgNO3 em
D. fuscus foram menores quando comparados aos blocos detectados pelo bandeamento C, o
que indica que a HC desta espécie é heterogênea.
Apesar das semelhanças morfológicas, as quais colocaram, anteriormente, B.
punctulatus e D. fuscus dentro de um mesmo gênero (Dichroplus), as espécies podem ser
distinguidas, seguramente, pelas suas características cromossômicas. Estas apresentaram
diferenças em relação ao número diplóide, padrão de distribuição e qualificação da HC e ao
padrão de distribuição das RONs e respectivos sítios de DNAr. Estes dados sugerem que em
Melanoplinae, além de um alto nível de variabilidade cariotípica, podem ocorrer uma grande
riqueza no que se refere à composição da HC e aos mecanismos que controlam as atividades
das RONs. Estudos futuros usando técnicas moleculares nas espécies aqui analisadas e em
outras espécies desta subfamília contribuirão para aumentar o entendimento de sua evolução
cariotípica.
CONCLUSÕES
63
66.. CCoonncclluussõõeess
1. Os diferentes números diplóides 2n=23, X0 e 2n=19,X0 observados em B. punctulatus
e D. fuscus, respectivamente, corroboram a variabilidade cariotípica encontrada na
subfamília Melanoplinae.
2. A presença de cromossomos com dois braços decorrentes da redução do número
cromossômico em D. fuscus indica a ocorrência de fusões cêntricas entre
cromossomos acrocêntricos, sendo este tipo de rearranjo responsável pelas mudanças
cariotípicas na maioria das espécies do gênero Dichroplus.
3. O padrão pericentromérico e a riqueza de pares de bases GC da heterocromatina
detectada nas duas espécies têm sido considerado comum entre a maioria dos
acridoideos. Contudo, a presença de blocos adicionais, bem como a diferença na
quantidade de HC entre B. punctulatus e D. fuscus sugere a ocorrência de rearranjos
envolvendo regiões heterocromáticas ao longo da evolução cromossômica dessas
espécies, acarretando a redução e/ou amplificação destas regiões.
4. A ocorrência em B. punctulatus de seis sítios de DNAr ativos, localizados em três
autossomos grande, dois médio e no cromossomo X, detectados pela impregnação
com AgNO3 e confirmado pela FISH, representa um padrão inédito para a
superfamília Acridoidea.
5. A ampla variabilidade de atividade das RONs encontrada em B. punctulatus sugere
que, provavelmente, diferentes mecanismos de controle gênico são utilizados para
atender as necessidades celulares nessa espécie.
6. A presença de duas RONs ativas em D. fuscus, detectadas pela impregnação de
AgNO3 e pela FISH, localizadas em cromossomos de tamanho médio e pequeno, tem
sido considerado comum para a maioria dos acridoideos.
7. As diferenças em relação ao número e localização das RONs entre B. punctulatus e D.
fuscus indicam que a ocorrência de rearranjos cariotípicos envolvendo sítios de DNAr
tem um papel fundamental na evolução cromossômica da subfamília Melanoplinae.
64
8. A afinidade do AgNO3 por proteínas associadas às regiões de HC observadas em D.
fuscus sugere a ocorrência de uma classe de heterocromatina diferenciada nessa
espécie.
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ANEXO
75
88.. AAnneexxoo
8.1. Fotografias das Espécies Estudadas
Fotografias das espécies estudadas. (a) Baeacris punctulatus; (b) Dichroplus fuscus. FONTE: Carbonell et al., 2006.
![Aula 1 Cromossomos [Modo de Compatibilidade] · 30/8/2011 6 Cariótipo Humano Normal Masculino (15 cromossomos no grupo C e 5 cromossomos no grupo G) - Cariótipo Humano Normal Feminino-(16](https://img.document.onl/doc/110x75/5be4bd3c09d3f20a668d4592/aula-1-cromossomos-modo-de-compatibilidade-3082011-6-cariotipo-humano-normal.jpg)
