UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal

Kátia Regina Freire Lopes

Uso da Dimetilformamida como crioprotetor alternativo para o sêmen canino

Mossoró – Rio Grande do Norte Dezembro de 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal

Kátia Regina Freire Lopes

Uso da Dimetilformamida como crioprotetor alternativo para o sêmen canino

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal Rural do Semi-Árido, como requisito parcial para a obtenção de grau de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Reprodução Animal. Orientador: Alexandre Rodrigues Silva

Mossoró – Rio Grande do Norte Dezembro de 2008

Ficha catalográfica preparada pelo setor de classificação e catalogação da Biblioteca “Orlando Teixeira” da UFERSA

L864m Lopes, Kátia Regina Freire. Uso da dimetilformamida como crioprotetor alternativo

para o sêmen canino. / Kátia Regina Freire Lopes. -- Mossoró: 2008.

76f.: il.

Dissertação (Mestrado em Ciência Animal: Área de concentração: Reprodução Animal) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido. Pró-Reitoria de Pós-Graduação. Orientador: Prof.º Dr.Sc. Alexandre Rodrigues Silva 1.Cão. 2.Criopreservação. 3.Dimetilformamida. Título.

CDD:636.7 Bibliotecária: Marilene Santos de Araújo

CRB-5/1033

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal

Uso da Dimetilformamida como crioprotetor alternativo para o sêmen canino

Kátia Regina Freire Lopes

Dissertação aprovada em ___05___ / __12__ / __2008__

Banca Examinadora

__________________________________________

Prof Dr.Alexandre Rodrigues Silva

Orientador

Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Examinadora

Dra. Ticiana Franco Pereira da Silva Examinadora

És aquele, que vives em matas, ou como adorno de minha casa,

o mesmo que carrega o peso do meu corpo ou quinquilharias

para que eu possa vender em troca do meu pão de cada dia.

És aquele que serve de atração turística em feiras fazendo-me obter glórias.

Açoito, imponho-te pesos maiores do que podes carregar

e te suplicio em rodeios para ter prazer,

rio de tua humilhação, por ficar exposto através de grades,

fazendo-me crer que sou poderoso e que meu chicote domina tua ferocidade.

Vangloriando-me, atirando em suas jaulas gargalhadas e gritos,

não só para demonstrar minha falsa liberdade,

mas também provocando-te morte pelo tédio e lembrança de onde nasceste.

Em retribuição me roubas um sorriso dos lábios ao vê-lo fazer piruetas

ou quando se esfrega em minhas pernas saudando minha existência.

Espantando ratos, insetos, maus-olhados

somente para que eu tenha melhores condições de saúde.

Oferecendo-me proteção e carinho.

Caço, mato-o dizendo ter medo de sua rusticidade.

Abato-o com degola, com marretadas, empurro-o para a morte com choques,

perdendo a chance de viver sadio, pois o veneno de sua carne pútrida

em meu corpo, leva ao desequilíbrio de minhas funções.

Sirvo-me de ti em travessas, panelas e espetos,

que ainda pouco escolhi no balcão do mercado

ou no cardápio do restaurante, para simplesmente, saciar minha fome.

Não me apiedo de teu sofrimento, mesmo sabendo ser inútil,

amarro-o, trancafio-o em gaiolas ou mesmo ao mantê-lo contido em aparelhos de tortura,

submeto-o aos meus experimentos para alcançar fama e poder.

Vítimas solicitadas pela ciência para benefícios da humanidade.

A ti, que nos ensina muito mais através do olhar humilde,

transmitindo a vontade de viver.

Meu reconhecimento, respeito e eterna gratidão.

Kátia Regina

A Kleber Jacinto, meu ponto de apoio

Dê-me uma alavanca e um ponto de apoio,

e eu serei capaz de mover o mundo!

(Arquimedes)

Ao Meu PAI

Antonio Freire Lopes

Dedico.

AGRADECIMENTOS

Aos Principais Colaboradores e seus Tutores: Nagan e Kleber Jacinto, Sadan e Dona

Conceição, Shiro e Rafael Tamashiro, Zeus e Adaucides Câmara, Tayson e Eduardo

Cavalcante.

Aos Coadjuvantes: Sadan, Zeus e Fabio Igo; Sadan, Brutos e Silvestre Stalone; Aquiles e

Luiz Eduardo, Bacco e Ederson Freitas, Skol e Felipe Farias, Logan e Tammy Rodrigues,

Thor e Paulo Fernandes, Bob, Bile e Madom Ferazi, Kiko e Nicholas Bezerra, Rone e

Sabrina Mendonça, que não participaram diretamente dos resultados deste experimento, mas

se voluntariaram para o mesmo.

Ao Dr Alexandre Rodrigues Silva, pela coragem, credibilidade, confiança, compreensão e

principalmente pelo privilegio de me tornar sua primeira orientada em pós-graduação. Ao

orientador fica o reconhecimento e exemplo de amor à profissão e determinação sempre em

busca da excelência. Ao Amigo, impossível simplesmente agradecer. Apesar de tudo o que

aprendi, meu maior legado desta experiência, será sempre, o modelo de caráter e a honra da

amizade.

Aos membros da banca, Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva e Dra. Ticiana Franco

Pereira da Silva, que tão atenciosamente doaram um pouco de seu tempo e seu conhecimento

para o engrandecimento deste trabalho e, conseqüentemente, para o meu engrandecimento

profissional.

A Leonardo Lelis e Gabriela Liberalino que em muitos momentos deixaram de ser meramente

colegas e foram mestres.

A Ana Liza Paz de Souza e Antonio Cavalcante Mota Filho pela relevante colaboração.

A Rafael Godói, Rodrigo Lira, Felipe Farias pela pequena, mas significante contribuição.

A Saul Cortez, Adriene Rosceli, Marcio Rodrigues, Jonatha Werrisimo, Gyslaine Peixoto,

Paulo Fernandes, pelo auxílio na busca por possíveis colaboradores, e a todos os

“verdinhos” pelo apoio e ajuda mesmo que indiretamente, contribuindo para elaboração

deste trabalho.

Aos Mestres: Benito Soto Blanco, José Domingues Fontenele, Sidnei Miyoshi Sakamoto,

Alex Sandro Maia, Jean Berg Alves da Silva, Mestres co-responsáveis pela formação de

mais esta etapa da minha profissionalização.

Aos colegas de Turma: Allyssandra Maria Lima Rodrigues, Ana Liza Paz de Souza, Carolina

de Gouveia Mendes, Daniel Santiago, Erika de Souza Paiva, Idalécio Pacífico da Silva,

Mario Cardoso, Michele Daiana, Nicholas Morais Bezerra, Paulo Henrique Cavalcante,

Roberta Cristina da Rocha e Silva, Tâmara Lúcia dos Santos Silva, Wesley Adson Costa

Coelho, que pela heterogeneidade de formação, deram origem a divergências construtivas

durante a nossa convivência, consolidando nossa formação profissional.

Ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino e as professoras Dra. Cristiane

Salgueiro e Dra Carminda Sandra Brito Salmito Wanderley

Aos Laboratórios de Biofísica, Fisiologia e Farmacologia Veterinária, Histologia

Veterinária, Clinica Veterinária e Imunologia Veterinária da Universidade Federal Rural

do Semi-Árido pela disponibilização de material e estrutura física para a elaboração das

analises.

A Regina Valeria da C Dias, pelo apoio, muitas vezes servindo de muro das lamentações,

conseguido estar sempre presente dividido com Kleber a função de “Divã”, mesmo virtual.

À todos aqueles que fizeram parte desta história de quinze anos, principalmente aos meus

“irmãos” amigos incondicionais, Flavia Moura, Oscar Bezerra e Ylanna Burgos.

À todos os meus “amigos de infância e que estarão comigo por toda vida” pois me

ensinaram a amar cada animal e me deram as primeiras lições veterinárias: Totó, Lessie,

Jabuti, Jack, Jobel, Jaqueline, Pelé, Tauros, Bob, Niki, Nikita, as “Nigra”, os “Popó”,

Hulk, Bob Coco, Yanka, Kate, Tof, Nix, Rock, Adna, Mist,... Aos que convivem comigo hoje:

Mel, Nagan, Judy, Brigith, Yang, Lilo e Stitch.

À minha melhor amiga e companheira de todas as conclusões, que agora não se encontra

deitada nos meus pés, balançando o rabo e esperando calmamente por atenção, mas sem

dúvida nenhuma vai estar em todos os animais que eu encontrar e conviver... Enya Maria.

...e à todas as pessoas que foram capazes de me desejar ao menos um “Bom dia” com

sinceridade.

RESUMO

A origem ancestral dos cães ainda é nebulosa, mas sua importância na vida do homem, seja

pelo contexto afetivo seja pela sua capacidade de trabalho, é inegável. Como ocorre com

outros animais de produção, cada vez é mais premente a necessidade de dominar as técnicas

de reprodução dos canídeos para fins de melhoramento e intercâmbio genético, bem como na

conservação de espécies em rumos de extinção. Existem técnicas já consolidadas de

congelação do sêmen canino, a maioria delas vinculadas ao uso do glicerol, porém o estudo

com outras substâncias agindo como crioprotetores amplia o campo de pesquisa e pode trazer

métodos mais eficientes, de menor custo e mais práticos de executar que os tradicionais. O

objetivo deste estudo foi comparar o efeito do glicerol e da dimetilformamida na

criopreservação de sêmen do cão. O sêmen foi diluído em duas etapas com diluidor à base de

Tris-hidroximetil-aminometano e gema de ovo contendo uma concentração final de 6%

glicerol ou 6% dimetilformamida (DMF), e congelados em palhetas 0,25 mL, expostos à ação

de vapores de nitrogênio líquido. Imediatamente após a descongelação, a motilidade

espermática foi avaliada, tanto sob um microscópio óptico, como através de análise de sêmen

auxiliada por computador (CASA). A integridade funcional da membrana espermática foi

avaliada com o uso de uma solução hiposmótica. Morfologia e porcentagem de

espermatozóides vivos também foram avaliados por microscopia de luz. Depois de

descongelado, uma maior concentração de células vivas foi detectada quando da utilização do

glicerol (P <0,05), mas parâmetros funcionais, tais como, motilidade progressiva e total, bem

como a integridade funcional da membrana não diferiram entre o glicerol e a DMF (P> 0,05),

sugerindo que ambos podem atuar de forma semelhante na criopreservação de sêmen canino.

Foram ainda encontradas interações entre o efeito individual dos cães e os crioprotetores no

decorrer dos procedimentos. Conclui-se que a DMF pode ser utilizada como um crioprotetor

alternativo ao sêmen canino, e sugere-se que seu efeito possa ser especialmente apropriado

para aqueles indivíduos que apresentem alta sensibilidade ao glicerol. É Sugere-se a

realização de novas pesquisas a fim de aprimorar o uso da DMF para o sêmen canino.

ABSTRACT

The ancestral past of the dogs is still nebulous, but its importance in the man’s life, in

emotional context and their ability to work is undeniable. As with other working animals, it is

becoming more urgent the need to domain the reproductive techniques of dogs, for select and

exchange genetic material, as well as the conservation of species from extinction. There are

consolidated techniques of canine semen’s cryopresenvation, most of them linked to the use

of glycerol, but the study with other substances acting as cryoprotectants expands the research

field and can provide more efficient methods with lower cost and more practical to

implement. The purpose of this study was to compare the effect of glycerol and

dimethylformamide (DMF) in the cryopreservation of dog sperm. The semen was diluted in

two stages with Tris-hydroxymethyl-aminomethane plus egg yolk containing a final

concentration of 6% glycerol or 6% DMF, and frozen in 0.25 mL straws, exposed to nitrogen

vapors and maintained in liquid N2. Immediately after thawing, sperm motility was evaluated

both under a light microscope and with a computer-assisted sperm analyzer (CASA). The

functional integrity of sperm membrane was assessed with the use of a hypo-osmotic solution.

Morphology and percentage of live sperm were also evaluated by light microscopy. After

thawing, a higher concentration of living cells was detected in the use of glycerol (P <0.05),

but functional parameters such as total and progressive motility as well as the functional

integrity of the membrane does not differ between the glycerol and DMF (P> 0.05) suggesting

that both can act with similar performance in cryopreservation of canine semen. The effect of

the individual animal and interactions between animals and cryoprotectants were verified for

various semen characteristics (P < 0.05) evidencing a marked difference among the semen of

individual dogs in their tolerance to cryopreservation. In conclusion, DMF could be used as

an alternative cryoprotectant for canine semen. It is also suggested that DMF could have a

beneficial effect especially for those individual animals that present high sensitivity to

glycerol. Further studies regarding DMF action on canine semen should be conducted.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 17

JUSTIFICATIVA ................................................................................................................. 19

HIPÓTESE .......................................................................................................................... 20

OBJETIVOS ........................................................................................................................ 21

Objetivo Geral: ......................................................................................................... 21 Objetivos Específicos: .............................................................................................. 21

1. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 22

Artigo 01: Considerações sobre a importância do cão doméstico dentro da

sociedade humana ......................................................................................................... 22

1.1.1 Apresentação ....................................................................................................... 23 1.1.2 Um pouco de História .......................................................................................... 23 1.1.3 Biologia ............................................................................................................... 29 1.1.4 Trabalhando com os humanos .............................................................................. 33 1.1.4 Considerações Finais ........................................................................................... 35 Referências ................................................................................................................... 36

1.2. Criopreservação do sêmen canino .............................................................................. 42

1.2.1 Diluentes ............................................................................................................. 43 1.2.2 Crioprotetores ...................................................................................................... 45

1.2.2.1. Glicerol ........................................................................................................ 45 1.2.2.2. Dimetilformamida ........................................................................................ 46

2. COMPARAÇÃO ENTRE O GLICEROL E A DIMETILFORMAMIDA PARA A

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES .................................................................. 49

Artigo 02: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog semen

cryopreservation ............................................................................................................... 49

2.1 Introdução .................................................................................................................. 51

2.2. Materiais e Métodos .................................................................................................. 52

2.2.1. Animais .............................................................................................................. 52 2.2.2 Colheita e avaliação inicial do sêmen ................................................................... 52 2.2.3 Processamento do Sêmen ..................................................................................... 52 2.2.4. Análise computadorizada do sêmen (CASA) ....................................................... 53 2.2.5 Análise estatística ................................................................................................ 54

2.3. Resultados ................................................................................................................. 54

2.4 Discussão ................................................................................................................... 56

Referências ....................................................................................................................... 59

CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 62

PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 63

ANEXOS ............................................................................................................................. 64

Anexo 01: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog semen

cryopreservation ............................................................................................................... 65

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ºC Graus Celsius. Unidade de temperatura do sistema métrico internacional

µL microlitro. submúltiplo do litro (1x10-6L), unidade de volume do sistema

métrico internacional

ALH amplitude of lateral head. amplitude lateral de cabeça

BCF beat cross frequency. freqüência de batimento de cauda

CASA computer-assisted sperm analysis. Análise de Sêmen assistida por computador

cm centímetros. Submúltiplo do metro (1x10-2m). Unidade de comprimento do

sistema métrico internacional

DMF dimethylformamide. dimetilformamida

DNA Deoxyribonucleic acid. Ácido Desoxirribonucléico

EUA Estados Unidos da América

EYT Egg Yolk Tris. Tris-gema de ovo

FCI Fédération Cynologique Internationale. Federação Internacional de Cinologia

Hz Hertz. Unidade de freqüência do sistema métrico internacional

ITIS Integrated Taxonomic Information System. Sistema de Informação Integrada

de Taxonomia

L litro. Unidade de volume do sistema métrico internacional

m metros. Unidade de comprimento do sistema métrico internacional

min minuto. Múltiplo do segundo, unidade de tempo do sistema métrico

internacional.

mL mililitro. Sub-multiplo do litro (1x10-3L), unidade de volume do sistema

métrico internacional

mOsm/L miliosmol por litro. Medida do peso atômico dividido pelo número de

partículas que exercem determinada pressão osmótica

nm nanômetro. Submúltiplo do metro (1x10-9m). Unidade de comprimento do

sistema métrico internacional

pH potencial Hidrogeniônico. Escala utilizada para medir acidez ou alcalinidade

SD Standard derivation. Desvio padrão

STR straightness. índice de progressão

TGG Tris acrescido de gema de ovo e glicerol

TRIS Tris-hidroximetil-aminometano

VAP velocity average pathway. velocidade média na trajetória

VCL curvilinear velocity. velocidade curvilínea

VSL velocity straight line. velocidade progressiva

LISTA DE FIGURAS

Artigo 01 .............................................................................................................................. 22

Figura 01 – Árvore evolutiva da famíla Canidae. Fonte: WANG & TEDFORD, 2008...... 24

Figura 02 – Distribuição da sub-família Caninae. Fonte: Vilà et al. 1997 .......................... 25

Figura 03 – Tumba H. 104 em Mallaha, Nordeste de Israel, mostrando esqueleto de um

homem com um filhote de cão entre suas mãos. Fonte: DAVIS & VALLA, 1978 ............ 26

Figura 04 – Imagem geral do esqueleto do cão. Fonte: MERRIAM-WEBSTER, 2008. ... 30

Figura 05 – Comparação entre o espectro luminoso visível por cães e humanos. Fonte:

Davis, 1998 ...................................................................................................................... 31

Artigo 02 .............................................................................................................................. 49

Figura 01: Motilidade Progressiva dos espermatozóides frescos (Fr), diluídos (Ext),

resfriado (Cool) e descongelado (Thaw) acrescido de glicerol ou dimetilformamida (DMF).

............................................................................................ Erro! Indicador não definido.

LISTA DE TABELAS

2. COMPARAÇÃO ENTRE O GLICEROL E A DIMETILFORMAMIDA PARA A

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES .................................................................. 49

Artigo 02: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog semen

cryopreservation ............................................................................................................... 49

Tabela 1: Motilidade espermática progressiva (%) no semen canino fresco, diluído,

adicionado de glycerol ou dimetilformamida (DMF) e congelado/descongelado (n=10

ejaculados de 05 cães). ..................................................................................................... 55

Tabela 2: Percentagem (%) da integridade funcional da membrana, espermatozóides vivos,

morfologia espermática normal e alterado em sêmen canino (n=10 ejaculados de 05 cães)

fresco e congelado/descongelado, acrescentado de glicerol ou dimetilformamida (DMF). 55

Tabela 3: Parâmetros de motilidade espermática mensurados por análise espermática

assistida por computador no sêmen canino congelado/descongelado (n=10 ejaculados de 05

cães) usando glicerol ou dimetilformamida (DMF) como crioprotetores. .......................... 56

17

INTRODUÇÃO

A cada novo dia, o homem afasta-se do meio natural. Apesar da crescente

preocupação com o meio ambiente, a evolução tecnológica, o crescimento das cidades e a

dependência da eletrônica têm cobrado um alto preço: a diminuição dos espaços naturais e sua

biodiversidade.

O homem tem tentado minimizar este lado negativo do progresso tomando para si

a responsabilidade de corrigir erros históricos contra a natureza. Assim, crescem o número de

projetos de conservação de espécies silvestres como peixe-boi marinho1, tartaruga marinha2,

baleia-franca3, dentre outros, e também a abertura de espaço na mídia (vide canais de TV4

como Animal Planet, Discovery Channel, National Geographic Channel) para uma

apresentação mais ampla dos animais como companheiros, como auxiliares e como elementos

cruciais nos complexos ecossistemas espalhados pela terra.

Essa popularização ocorre não apenas por uma conscientização na raça humana,

mas porque a vida com animais traz benefícios que remontam à pré-história. Há provas

fósseis do convício com o cão desde cerca de 15000 anos e muitas sociedades até hoje

possuem uma base cultural e mesmo religiosa fortemente pautada no convívio com os cães.

Considerada por especialistas como atividade até mesmo terapêutica, o convívio

com animais fortalece o senso de responsabilidade e prioriza o crescimento de sentimentos

altruísticos (VACCARI & ALMEIDA, 2007). Neste contexto, criar cães tornou-se prática

corriqueira em qualquer aglomerado humano, e nos grandes centros movimenta muitos

recursos financeiros, corresponde a um grande volume de negócios, considerados os mercados

de medicamentos, acessórios, rações e profissionais diretamente ligados ao trato com os

animais, em especial os médicos veterinários.

Assim, para melhorar este convívio com os animais ou ampliar os seus benefícios,

muitos pesquisadores estão utilizando a seleção para aperfeiçoar as raças caninas, exigindo,

por conseguinte, a aplicação das biotécnicas reprodutivas para um aproveitamento do

1 Projeto peixe-boi marinho. http://www.projetopeixe-boi.com.br/ 2 Projeto TAMAR. http://www.projetotamar.org.br/ 3 Projeto Baleia Franca. http://www.baleiafranca.org.br/ 4 Canais distribuídos no Brasil através do modelo de assinatura, que cedem freqüentemente conteúdo para a Televisão aberta.

18

potencial genético dos reprodutores de elevado valor (FORSBERG & FORSBERG, 1993;

CUNHA, 2002).

Estudos estão sendo desenvolvidos para determinação das melhores condições

para a criopreservação do espermatozóide de cães (STROM et al., 1998; PEÑA, 2000;

VERSTEGEN et al. 2002; RIJSSELAERE et al. 2005; SILVA et al., 2006; CARDOSO et al.,

2007). Porém, muitos fatores são envolvidos no processo de criopreservação do sêmen. Até os

dias atuais, nenhuma metodologia parece ser a ideal para todos os cães e para todos os

ejaculados, pois variações intrínsecas às propriedades, como sensibilidade osmótica entre

espermatozóides de diferentes cães e ejaculados fazem com que a resposta à criopreservação

não seja totalmente previsível (EILTS, 2005; MINTER & DeLIBERTO, 2005).

Diversas metodologias têm sido descritas para a criopreservação do sêmen de cães

e variam de acordo com o diluente, protetores de resfriamento e congelamento empregados,

preconizando o uso de diferentes velocidades de criopreservação. Em todas elas, busca-se

minimizar o dano causado ao espermatozóide pelo processamento, visando recuperar um

máximo possível de espermatozóides viáveis (STROM et al., 1997). O método até então mais

utilizado para a criopreservação do sêmen canino é o descrito por Andersen (1975), que

consiste na utilização de um diluidor à base de Tris acrescido de gema de ovo e glicerol

(TGG).

A colaboração que se deseja com este trabalho é a de investigar o efeito da

dimetilformamida como uma alternativa ao glicerol na crioproteção do sêmen canino diluído

em Tris, podendo esta investigação prover subsídios para novas técnicas de reprodução.

A dimetilformamida foi testada e é usada com sucesso em diversas espécies de

animais domésticos e selvagens mas as técnicas que envolvem seu uso foram pouco estudadas

se comparadas a outros crioprotetores, como ao glicerol. Apesar de ser substância

reconhecidamente dotada das características necessárias á criopreservação seu uso na prática é

muito reduzido, em especial pela falta de estudos e métodos que comprovem o sucesso de sua

utilização.

19

JUSTIFICATIVA

Constantemente, observa-se um crescente interesse acerca dos animais de estimação,

principalmente os cães. Estes animais, sem dúvida, têm uma intrínseca relação com o homem,

que os utiliza como simples companhia ou no auxílio em transportes, manejo de rebanho,

tratamento médico, participação em atividades policias, tanto de identificação de contrabando

e drogas, como resgate de vidas. Desse modo, a cada dia, vem-se procurando o melhoramento

genético, mas principalmente a manutenção e dissipação de características destes animais.

Para isso, a utilização de biotécnicas reprodutivas é de suma importância, diminuindo

distâncias, resguardando a sanidade dos animais. Sendo assim, técnicas e alternativas para

aprimorar, e facilitar estes processos a cada dia vem sendo estudadas, e métodos alternativos

são cada vez mais procurados, como forma de ter mais possibilidades e nenhum animal ficar

excluído destes processos.

A busca por aprimorar e apresentar alternativas às técnicas de reprodução assistida é

caminho não somente para atender ao desejo de realizar a seleção e disseminação de raças de

canídeos, mas principalmente podem representar, em curto prazo, métodos concretos para

retirar animais da categoria de espécies em extinção. Possuir técnicas que ampliem a

conservação e o transporte de sêmen canino permitem que raças sejam melhor difundidas,

minimiza-se a consangüinidade, pelo intercâmbio de sêmen, aumenta as fronteiras comerciais

de linhagens com características apropriadas para o trabalho, dentre outras possibilidades.

Possuir alternativas às substâncias crioprotetoras tidas como preferenciais, não só abre

novas fronteiras para pesquisa, como reforçam a não-dependência das oscilações do mercado,

alterações de cotações de moeda ou distribuição/venda sem regularidade.

Algumas substâncias alternativas vêm sendo testadas como crioprotetores. Dentre

estas, a dimetilformamida vem sendo utilizada como tal com sucesso em algumas espécies

como eqüinos, faisões, dentre outros. Principalmente se destacando como substituta ao

glicerol, em animais que possuem sensibilidade ao mesmo.

Em cães, algumas pesquisas já obtiveram resultados relevantes, entretanto a maioria

delas não realizou análises com tecnologias mais recentes como a análise computadorizada do

sêmen (CASA), que certamente validará os resultados com uma maior eficácia e precisão.

20

HIPÓTESE

• A dimetilformamida pode ser utilizada como uma alternativa ao glicerol para a

criopreservação do sêmen canino se observadas as características do sêmen sob a

análise qualitativa realizada através de análise computadorizada (CASA).

21

OBJETIVOS

Objetivo Geral:

• Estudar o uso da dimetilformamida como um crioprotetor alternativo para a

criopreservação do sêmen de cães, utilizando-se o tris-gema de ovo como diluente.

Objetivos Específicos:

• Verificar o efeito da dimetilformamida na conservação das características seminais de

cães após os processos de criopreservação e descongelação;

• Realizar a avaliação computadorizada dos parâmetros de motilidade espermática no

sêmen congelado e descongelado em diferentes crioprotetores.

22

1. REVISÃO DE LITERATURA

Artigo 01:

Considerações sobre a importância do cão doméstico dentro da

sociedade humana

Kátia Regina F. Lopes & Alexandre R. Silva

Laboratório de Manipulação e Conservação de Germoplasma Animal, Universidade

Federal Rural do Semi-Árido / BR 110 - Km 47 Bairro Pres. Costa e Silva; 59.625-900 -

Mossoró – Rio Grande do Norte

Resumo

A origem ancestral do cão doméstico é questionável. A teoria tradicional

defende a intervenção direta do homem há 15.000 anos sobre lobos selvagens que

através de doma e treino, criou uma nova linhagem, esta domesticável e que tornou-

se o cão que conhecemos. Porém, pesquisas recentes apontam para uma nova teoria:

não uma ação do homem, mas um processo de seleção natural aproximou o cão

ancestral das habitações humanas e seus descendentes vivem entre os homens até

hoje. Qualquer que seja a origem, os cães possuem um papel importante na vida do

homem moderno, seja por seu apelo afetivo seja pelo uso de seus sentidos apurados

em atividades e trabalhos. Desse modo, o presente trabalho tece considerações acerca das

interações entre o cão e o homem e sua importância dentro da sociedade humana.

Palavras-Chave: cão, origem, sociedade humana.

Abstract

The origin of the domestic dog is questionable. The traditional theory says that the

direct intervention of humans (15,000 years ago) on the wild wolves created a new domestic

blood line, that became the dogs we know. However, surveys point to a new theory: not a

man´s action, but a process of natural selection has brought the ancestor dog of human

dwellings and their descendants live among men today. Whatever the source, the dogs have

an important role in the life of modern man, either on its emotional appeal or when the man

use your senses in activities and work. Therefore, this review presents considerations on the

interactions between dogs and men and their importance into the human society.

Keywords: dog, origin, human society.

23

1.1.1 Apresentação

Apesar da estreita relação entre humanos e cães, ainda hoje não é clara a origem dos

animais que conhecemos como “os melhores amigos do homem”. Porém alguns fatos

históricos arqueológicos são relevantes. Não há registro fóssil de cães (Canis lupus familiaris)

além de 15 ou 20 mil anos atrás, fato inesperado para um animal tão comum nos dias atuais, o

que aponta para que a espécie que hoje conhecemos não existia antes desta data. Quando

começam a surgir registros fósseis, estes estão quase sempre associados a nichos de

permanência humana. É possível que a conjunção destes fatos se concretize numa das mais

significativas intervenções do homem sobre a natureza e a consolidação, por seleção natural

ou artificial, de uma das espécies mais bem sucedidas viventes hoje: o cão.

Os cães são parte importante das atividades humanas e por vezes constituem-se

indivíduos das famílias humanas e a evolução cultural e psicológica da humanidade mostra-se

intimamente ligada à presença destes animais. Desse modo, o presente trabalho tece

considerações acerca das interações entre o cão e o homem e sua importância dentro da

sociedade humana.

1.1.2 Um pouco de História

A paleontologia se ocupa, dentre outras atividades, da descrição da vida das espécies

no passado e suas reflexões nas espécies existentes hoje. Este estudo é realizado

principalmente através da existência de fósseis (do latim, fossilis: restos materiais de antigos

organismos ou as manifestações da sua atividade, que ficaram conservados, com maior ou

menor qualidade nas rochas ou em outros fósseis - MENDES, 1988). Sob esta perspectiva é

possível constituir as origens ancestrais dos seres vivos que dominam o mundo atualmente e

determinar a época e o contexto em que surgiram. No caso dos cães, é possível chegar-se aos

seus ancestrais e vincular grau de parentesco com outras espécies de canídeos, porém o “elo

perdido” dos canídeos ainda é alvo de teorias diversas (FUCHSLUGER & WHITE, 2007).

A família Canidae [Reino: Animalia; Filo: Chordata; Classe: Mammalia; Ordem:

Carnivora; Sub-ordem: Caniformia] tem origens no Eoceno (cerca de 40 milhões de anos

atrás), a partir da evolução dos Miacídeos, pequenos carnívoros que seriam ancestrais de

canídeos, felídeos e outros carnívoros, remanescentes do Paleoceno (65 milhões de anos). A

família desenvolveu-se em três grandes ramos evolutivos: a sub-família Hesperocyoninae

24

(hoje extinta, endêmica em toda a América do Norte entre 40 e 15 milhões de anos), a sub-

família Borophaginae (extinta, endêmica em todo o hemisfério norte entre 35 e 2,5 milhões de

anos) e a sub-família Caninae (surgida a 25 milhões de anos e vivente até hoje) a qual engloba

todos os canídeos vivos (WILSON & REEDER, 2005).

A primeira era constituída de pequenos onívoros, espécies adequadas à época posterior

à extinção dos grandes répteis. A segunda família, provavelmente descendeu da sub-família

Hesperocyoninae, e era constituída de carnívoros de maior porte, podendo chegar aos 250kg.

Com mandíbulas curtas e fortes, as suas espécies chegam a ser chamadas de “bone-crushing

dogs” (ou “cães esmaga-ossos”), pois alimentavam-se de toda sua presa, inclusive os ossos.

Por fim, o terceiro ramo evolutivo e que conhecemos até hoje em suas diversas formas, a sub-

família Canineae, que possui membros de porte, modo de vida e nichos ecológicos tão

distintos quanto os lobos da tundra (Canis lupus albus), o cão selvagem africano (Lycaon

pictus), o lobo guará do cerrado brasileiro (Chrysocyon brachyurus) ou o próprio cão

doméstico (Canis lupus familiaris) (WANG & TEDFORD, 2008).

Figura 01 – Árvore evolutiva da famíla Canidae. Fonte: WANG & TEDFORD, 2008

Os registros fósseis demonstram que a família Canidae desenvolveu-se na América do

Norte de onde se espalhou para a América do Sul, Ásia e Europa. Os Hesperocyoninae

predominaram na América do Norte, os Borophaginae difundiram-se no hemisfério norte e os

Caninae espalharam-se em todos os continentes (VILÀ et al., 1997).

25

Figura 02 – Distribuição da sub-família Caninae. Fonte: Vilà et al. 1997

Graças às semelhanças morfológicas e fisiológicas, cães domésticos e lobos sempre

foram considerados parentes, porém desde que foi possível mapear o DNA destas espécies

percebeu-se que a semelhança genética é inconfundível: apresenta cerca de 0,2% de

diferenciação (LEONARD et al., 2002), sendo motivo para a reclassificação taxonômica em

1997, proposta pelo Instituto Smithsonian5 e pela American Society of Mammalogists6, de

Canis familiaris para Canis lupus familiaris, ou seja, o cão doméstico é classificado como

sub-espécie da espécie dos lobos cinzentos (WILSON & REEDER, 2005).

Esta proximidade biológica e histórica gerou uma teoria fortemente aceita sobre a

origem dos cães domésticos: que eles teriam descendido diretamente dos lobos cinzentos

através da ação do homem que selecionara, treinara e domesticara exemplares de lobos e, que

com seqüências de acasalamentos, geraram os cães. Existem evidências concretas destes fatos

pois há registros fósseis da convivência de homens e cães a partir de 12 a 15.000 anos como

as encontradas no nordeste de Israel em 1978 (Figura 03 - DAVIS & VALLA, 1978). Muitos

registros fósseis apontam esta época como aquela em que homens e cães passaram de fato a

conviver em conjunto, não mais como competidores por um nicho, mas como parceiros.

5 Website: http://www.si.edu/ 6 Website: http://www.mammalsociety.org/

26

Figura 03 – Tumba H. 104 em Mallaha, Nordeste de Israel, mostrando esqueleto de um homem com

um filhote de cão entre suas mãos. Fonte: DAVIS & VALLA, 1978

Por esta teoria, o homem havia, pouco a pouco, por compartilhar espaços de caça e de

vivência, aproximando-se dos lobos selvagens. Com o tempo, as duas espécies teriam passado

a cooperar entre si: os lobos alimentando-se dos restos dos alimentos dos homens e os homens

observando o comportamento dos lobos para melhor encontrar recursos, como água e caça.

Essa proximidade teria sido possível pelo comportamento e desejo de vivência em grupo

compartilhada pelas duas espécies. O cão, como espécie consolidada, apenas teria surgido em

virtude da ação direta do homem, que ao treinar e domesticar os lobos, teria realizado uma

seleção artificial e criou a nova espécie (neste caso sub-espécie de lobo) (SERPEL, 1995).

Apesar de aceita e perpetuada, esta teoria não considera que, num tempo histórico e

evolutivo tão curto, os cães teriam perdido características que são importantes para uma

espécie carnívora e caçadora, principalmente se comparada com outros animais domésticos

também carnívoros, como os gatos que possuem garras retráteis como seus ancestrais

selvagens (COPPINGER & COPPINGER, 2002). Os gatos domésticos até hoje exercitam

27

práticas de caça e alimentam-se de insetos e aves, mesmo quando há disponibilidade de

alimento (AMERICAN BIRD CONSERVANCY, 1997).

A referida teoria não considera também o fato de que os lobos são seres que vivem em

sociedade (alcatéias), mas que possuem personalidades individuais muito fortes, e com

funções específicas dentro do grupo (HARRINGTON & PAQUET, 1982). Considerando-se

este fato, seria necessário que não um ou outro lobo fosse domesticado, mas toda uma

alcatéia, para que de um grupo, alguns indivíduos de fato fossem “acostumados” com a

convivência humana (COPPINGER & COPPINGER, 2002). E esta tarefa seria de grande

dificuldade para o homem ancestral que ainda não dominava técnicas avançadas de manejo,

estava deixando uma vida nômade e preocupando-se em aprender a lidar com o cultivo de

vegetais e a domesticação de outras espécies bem mais pacatas como os herbívoros e aves

(ISAAC, 1962; REED, 1959).

Por fim um dos maiores impasses para esta teoria é que por mais que se tente

domesticar lobos atualmente, mesmo pesquisadores ou pessoas com extrema expediência não

conseguem reproduzir plenamente a domesticação. Mesmo criando domesticamente filhotes

de lobos, ao crescerem, não possuem as características sociais dos cães. Seus instintos, por

mais que as técnicas sejam aprimoradas e que seja dedicado todo o cuidado com a modelagem

da personalidade dos animais, afloram e percebe-se que de fato apenas criaram-se lobos um

pouco menos selvagens e não novos cães (ZIMEN, 1981).

Todos estes fatos são observados pelos biólogos Raymond e Lorna Coppinger, em sua

obra Dogs: A New Understanding of Canine Origin, Behavior and Evolution, de 2002. Eles

chamam a teoria vigente de “Hipótese do Pinóquio”. Na estória, o boneco Pinóquio é feito

pelo marceneiro Gepeto, com amor e carinho e, através de duas intervenções mágicas,

primeiro o boneco ganha vida e depois se torna menino de carne e osso. Na opinião dos

autores, tão mágica quanto a estória do Pinóquio é a possibilidade do homem pré-histórico ter

domado plenamente o lobo e “transformado-o” em cão.

Estudos recentes da análise de DNA mitocondrial revelaram que lobos e cães

descendem de um ancestral comum, localizado há cerca de 100.000 anos, bem antes do

contato humano (VILÁ et al., 1997). Neste contexto, apesar da relevância do contato humano,

os cães de fato teriam surgido de um ancestral comum com os lobos, numa época mais remota

que aquela tradicionalmente aceita. Este ancestral comum, chamado de proto-cão por

Coppinger & Coppinger (2002), já bem próximo das características dos cães atuais, não seria

um animal caçador, como os lobos, mas um animal que alimentava-se de restos. Este animal

28

estaria muito mais propenso a não temer e aproximar-se de outros animais, inclusive do

homem (KOLER-MATZNICK, 2002).

O homem começava a fixar-se, constituir pequenas aldeias e a tendência natural é que,

tal qual nas cidades humanas de hoje, os resíduos das ações humanas, em especial de restos de

alimentos, fossem acumulados em locais próximos. Os ancestrais dos cães, que até então,

como o homem, eram nômades, podiam agora fixar-se, pois possuíam reservas de alimentos

disponíveis (COPPINGER & COPPINGER, 2002).

Assim os espécimes ou as espécies que estavam mais aptas a buscar alimentos junto

aos vilarejos foram naturalmente selecionados, e não selecionados pelo homem como no

paradigma anterior, e passaram a viver próximos destes vilarejos. Koler-Matznick (2002)

aponta que mesmo hoje, ainda existem espécies de cães selvagens como o dingo (Canis lupus

dingos) na Austrália e Nova Guiné e o dhole indiano (Cuon alpinus) como provas de que há

espécies selvagens de cães que não coabitam com o homem, mas que vivem em sua presença

sem transtornos. Somente subespécies do Canis lupus reconhecidos, em 2008, pelo Integrated

Taxonomic Information System (ITIS – Sistema de Informação Integrada de Taxonomia)7, há

38 subespécies, muitas delas com as características citadas por Koler-Matznick (2002), sem

considerar-se o fato de que o cruzamento entre estas subespécies podem gerar descendentes

férteis e portando podendo gerar, no futuro como no passado, outras variedades.

É óbvio que o homem deve ter reagido à presença deste cão ancestral, muitas vezes

negativamente, mas possuir um “lixeiro” próximo à vila tinha suas vantagens, e outros

benefícios foram sendo percebidos até que o homem passou a levar o visitante para o interior

das suas moradias (COPPINGER & COPPINGER, 2002).

Não houve assim alteração biológica do DNA, daí a semelhança com os lobos, mas é

certo que o homem passou então a agir sobre os cães. Não à toa evidenciam-se as centenas de

raças hoje existentes com variações de tamanho, pelagem, comportamento e habilidades. A

Fédération Cynologique Internationale (FCI – Federação Cinológica Internacional)8

reconhece hoje mais de oito centenas de raças de cães, reunidos em 10 grupos, a saber Grupo

1 - Cães de Pastor e Boieiros; Grupo 2 - Cães de tipo Pinscher e Schnauzer, Molossóides e

Cães de Montanha, e Boieiros Suíços; Grupo 3 – Terriers; Grupo 4 – Dachshunds; Grupo 5 -

Cães de tipo Spitz e de tipo Primitivo; Grupo 6 - Sabujos Farejadores e Raças Assemelhadas;

Grupo 7 - Cães de Parar ou Cães Apontadores; Grupo 8 - Cães Levantadores e Cobradores de

Caça e Cães de Água; Grupo 9 - Cães de Companhia e Grupo 10 - Galgos (Lébreis).

7 Website: http://www.itis.gov/index.html 8 Website: http://www.fci.be/home.asp?lang=en

29

A discussão ganha volume à medida que o homem cada vez mais integra os cães à

suas atividades de trabalho e lazer. As pesquisas mais recentes apóiam o novo paradigma em

detrimento da antiga idéia da doma dos lobos, esta última ainda muito incorporada no

imaginário popular e mesmo na comunidade científica. Há cientistas que julgam improdutivas

as buscas por uma “verdade” (VERGANO, 2002), mas definir esta origem pode apontar

melhores técnicas de treinamento e formas melhor de lidar com as espécies de canídeos

selvagens.

1.1.3 Biologia

Os cães são mamíferos, quadrúpedes, dotados de pêlos na maior parte do corpo

(exceto algumas raças) sem a presença de dimorfismo sexual, apresentando apenas poucas

diferenças entre os sexos além da presença dos órgãos genitais, como tamanho e peso.

Possuem mandíbulas dotadas de dentes especializados para apreensão, corte e trituração.

Possuem, como a maioria dos mamíferos predadores, músculos poderosos e sistema

cardiovascular disponível para ações explosivas, corridas e ataques. O esqueleto possui

características que acompanham esta demanda. Na maior parte das raças, os membros

anteriores são flexíveis e os posteriores possuem grande massa muscular, proporcionando

poder de executar saltos longos e corridas a altas velocidades. As patas apóiam-se sobre as

falanges (terceiras), possuem almofadas plantares macias e garras usadas para fixação ao solo,

escalada ou para ataques (DEWEY & BHAGAT, 2002).

30

Figura 04 – Imagem geral do esqueleto do cão.

Fonte: MERRIAM-WEBSTER, 2008.

Muitas características físicas são específicas de cada raça. As diversas raças de cães

possuem diferenças significativas entre si, em especial quanto ao tamanho, pelagem e

conformação. Por questões relacionadas à genética (OSTRANDER & WAYNE, 2007) e aos

cruzamentos forçados pela ação humana, existem raças com menos de 20 cm como os

Chihuahua, e outras com mais de 1m de altura como o Dinamarquês ou Dogue Alemão. A

diferença corporal não os faz de espécies diferentes, mantendo-se inclusive a possibilidade de

cruzamento (MICHELL, 1999).

A pelagem varia quanto à textura (duro, sedoso, lanoso), densidade, comprimento

(curto, longo ou misto), coloração, brilho, padrão (tigrado, pintalgada, arlequim, etc.), dentre

outras características. Esta diferenciação comumente está ligada à função de trabalho da raça,

bem como com a condição ambiental a que está costumeiramente associado (DE CICCO,

2006). Os padrões são oriundos ainda da vida selvagem quando os animais, como caça ou

caçadores, precisavam ocultar-se em seus ambientes naturais (CUNLIFFE, 2004).

A visão é bastante diferente em cada raça, mas de forma geral os cães possuem campo

de visão (270º em média) muito superior ao dos humanos (180º), porém possuem visão

dicromática, similar aos humanos acometidos de daltonismo (não distinção entre tons de

verde e vermelho) (DAVIS, 1998).

31

Figura 05 – Comparação entre o espectro luminoso visível por cães (“the Dog’s view”) e

humanos(“the Human’s view”). Fonte: DAVIS, 1998

A audição dos cães é muito superior às características da audição humana. No cão

médio, a faixa de freqüência audível vai de 40 a 60.000 Hz, além de uma capacidade de

detectar rapidamente a localização dos sons, em especial pela capacidade de mudar as orelhas

de posição e com isso direcionar a captação do som. Em algumas raças, até dezoito músculos

para realizar rotação e movimentos ascendentes e descendentes das orelhas estão presentes

(ELERT & CONDON, 2003).

O olfato é extremamente desenvolvido, em especial nas raças de focinho longo, por

possuírem cavidades nasais maiores e, conseqüentemente, mais células sensoriais. Em média,

possuem 220 milhões de células sensíveis, enquanto o homem possui apenas 5 milhões. Os

cães conseguem detectar odores em concentrações 100 milhões de vezes menores que os

humanos (ALABAMA & AUBURN UNIVERSITIES, 2008). Esta característica tem

incentivado cientistas a realizar pesquisas na detecção de moléculas associadas a doenças

como o câncer. Em alguns casos esta detecção ocorre com uma precisão de 87 a 95% de

acerto (LOVGREN, 2006; SAGE, 2006).

Possuem caudas, que apesar de muitas vezes serem extraídas por razões estéticas, são

parte importante na comunicação dos cães e possui papel funcional em cães nadadores e na

manutenção do equilíbrio em corridas e situações de caça. Os cães são animais sociáveis, com

os de sua espécie e com outras espécies. Organizam-se de forma hierárquica, normalmente

reconhecendo um líder, que pode ser humano, que possui prioridade em decisões como

32

alimentação. Muitos apontam este fato como o que determina o sucesso do convívio do

homem como líder de seus cães (ZIMEN, 1981).

Zimen (1981) ressalta que a inteligência dos cães varia conforme as raças e por vezes

se confunde com a determinação e personalidade forte, pois definir inteligência significa

medir características subjetivas. Algumas raças são mais sensíveis a treino e aprendizado de

comandos (Border Collies) outras, com forte senso de territorialidade e capacidade de

entender situações de perigo, são protetores, como os Pastores Alemães (JONES &

GOSLING, 2005).

Com corpos distintos entre raças, doenças diferentes atingem cada uma delas. Raças

de focinho curto têm problemas respiratórios; displasia é comum em raças de médio

(TORRES et al., 1999) e grande porte como estes comumente sofrem de doenças de coluna.

A própria longevidade é afetada pela raça: em geral, cães de pequeno porte são mais longevos

que os de grande porte (SHEPHERD, 1986). Muitas doenças não distinguem raça, como a

parvovirose (HAGIWARA et al., 1996), a cinomose (GEBARA et al., 2004), a raiva

(hidrofobia) (SCHNEIDER et al., 1996) e a Leishmaniose visceral (GONTIJO, 2004), estas

duas últimas afetam também a humanos em muitas regiões do Brasil, tendo o cão como vetor

ou reservatório.

Com o convívio humano, a nutrição dos cães alterou-se e muitas substâncias usadas

naturalmente em nossa alimentação podem causar danos aos cães. Os teores de gordura,

açúcar e sal contidos na comida humana são tão danosos aos cães quanto aos humanos.

Chocolates e outros alimentos que contém metilxantinas são potenciais causadores de

vômitos, diarréias, sudorese, arritmia cardíaca, tremores entre outros sintomas (CRUZ et al.,

2001). Uvas e passas podem causar falência renal agudas (McKNIGHT, 2005). Bebidas

alcoólicas em pequenas porções podem facilmente intoxicar cães. Substitutos para os açúcares

encontrados em produtos dietéticos são potencialmente tóxicos (DUNAYER, 2006). Por fim,

os mesmos males da auto-medicação humana afetam também os cães, pois medicações como

o paracetamol, de uso tão comum humano, podem trazer problemas hepáticos para os cães

(ASPCA, 2004).

Entre os cães a maturidade sexual ocorre entre 6 e 12 meses de vida, tanto para

machos quanto para fêmeas e, exceto em caso de problemas, têm vida sexualmente ativa até a

velhice e morte (KUSTRITZ, 2005). O ciclo estral das cadelas é, normalmente, bianual,

período em que se prepara fisicamente para o coito e possível prenhez. A gestação dura cerca

de 60 dias, após os quais nascem, em média, 06 filhotes (ALLEN, 1995). A castração ainda é

um método contraceptivo recomendado, em detrimento de métodos químicos, e executado

33

pela extração plena de útero e ovários ou testículos; não é comum considerar-se a

possibilidade de manutenção de ovários nas cadelas, que permitiria a continuidade dos ciclos

e preservação da carga hormonal. Nos machos é possível a realização de vasectomia

(JACKSON, 1984).

1.1.4 Trabalhando com os humanos

A integração homem-animal, principalmente com o cão, tem sido descrita como

benéfica, tanto para a saúde física, como para a saúde mental do ser humano. Esses benefícios

podem ser observados desde o momento em que se tem um animal de estimação em casa,

propiciando relaxamento e fornecendo carinho à pessoa, até a zooterapia e os serviços

prestados pelos cães aos deficientes físicos (KITAGAWA & COUTINHO, 2004).

Quando passou a fazer parte da comunidade humana, o cão passou a ser treinado para

aproveitar seu potencial na execução de atividades que pudessem auxiliar o homem. A maior

conseqüência deste fato é o grande número de raças existentes hoje. Cada uma delas foi

obtida através do controle e manipulação genética por seleção de indivíduos e cruzamentos

programados para obter destaque em características que se desejava enaltecer (WILSSON &

SUNDGREN, 1997).

No Brasil, essa importância funcional chega ser reconhecida por Lei. O Decreto Nº

4.998, de 27 de Fevereiro de 2004 (que Altera a redação do art. 2º do Regulamento da

Organização, Funcionamento e Execução dos Registros Genealógicos de Animais Domésticos

no País, aprovado pelo Decreto nº 58.984, de 3 de agosto de 1966), em seu artigo segundo,

afirma que “São considerados animais domésticos, para os efeitos deste Regulamento, as

seguintes espécies: asinina, bovina, bubalina, eqüina, suína, ovina, caprina, canina, leporina e

outras de interesse zootécnico e econômico, assim definidas pelo Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento” (PRESIDÊNCIA DA REPÚBLICA FEDERATIVA DO BRASIL,

2004)

As tribos que vivem nas áreas frias do hemisfério Norte, como no Alaska(EUA),

Sibéria(Rússia), Islândia, passaram a domar cães de raças como o Husky Siberiano (nome

alusivo à Sibéria) como cão de trabalho, especialmente para transporte. Povos como os

Esquimós têm toda uma cultura baseada no uso destes animais como força de trabalho e

companheiros das atividades cotidianas (GIPSON, 1983), além de aspetos culturais mais

fortes como a religiosidade.

34

Vários campos da saúde humana têm se aproveitado da afinidade entre homens e cães.

A percepção que o homem possui de que o cão é de fato um ser confiável, digno de ser

chamado de “melhor amigo”, e a sensibilidade dos cães para compreender o mundo à sua

volta, inclusive os sentimentos dos seres ao seu redor, permitem que os cães sejam candidatos

potenciais para trabalhos na reabilitação de pacientes. Animais selecionados e treinados para

este fins têm sido utilizados com sucesso surpreendente em hospitais, ambientes de terapia

ocupacional e em locais de moradia temporária ou permanente de crianças e idosos (ALLEN

& BLASCOVICH, 1996; PEREIRA et al., 2007).

Devido à mesma afinidade, cães são intensamente utilizados para acompanhar pessoas

com necessidades especiais. Em muitos países, inclusive no Brasil (através da Lei no 11.126,

de 27 de junho de 2005), é possível utilizar-se de cães com a função de guias para facilitar o

deslocamento de pessoas com deficiência visual severa ou total, evitando choques com

objetos e exposição a situações de perigo (MIZUKOSHIA et al., 2008). Porém muitas outras

funcionalidades lhes podem ser atribuídas. Desde a década de 70, inicialmente na Inglaterra,

cães são treinados para sinalizar de forma apropriada e diferenciada aos diversos estímulos

sonoros e com isso conseguem complementar as ações do deficiente auditivo (GUEST, 2006).

Para pessoas com deficiências motoras, cães são treinados para buscar objetos sem destruí-

los, ligar e desligar aparelhos elétricos, auxiliar na acomodação em cadeiras de roda,

mictórios, camas; auxiliar em episódios de queda, dentre outras tantas situações vividas pelos

portadores das deficiências (CAMP, 2001).

Graças à capacidade muito superior da detecção de odores que os cães possuem, eles

são constantemente indicados para atividades das mais diversas. Estudos recentes têm

indicado a possibilidade concreta de cães sentirem o odor específico de proteínas resultante da

ação de tumores malignos (câncer) antes mesmo que os testes laboratoriais indiquem a sua

existência (SAGE, 2008).

Em ambientes de grande circulação de pessoas e possibilidade concreta de transporte

de mercadorias ilegais, como nos aeroportos, o olfato dos cães torna-se essencial para

detecção de substâncias ilegais (como narcóticos), explosivos, substâncias orgânicas (como

animais silvestres ou frutas), sem que haja intervenção direta sobre a bagagem dos

passageiros (ROSS & BLOCK, 1988).

Em conjunto com outras características, como a audição aguçada e a capacidade de

infiltrar-se, cavar e vasculhar, cães são utilizados em equipes de busca e salvamento em todo

o mundo. Várias raças são utilizadas para este fim e equipes de bombeiros, salva-vidas e

polícia os utilizam em situações distintas. Possivelmente a ação mais heróica e divulgada da

35

ação destes animais tenha ocorrido em 11 de Setembro de 2001, quando a cidade de Nova

York sofreu o maior atentado terrorista até então praticado. Após a colisão de dois aviões

comerciais com as duas torres do World Trade Center e a queda inevitável dos dois prédios, a

ajuda dos cães de busca e salvamento foi essencial para encontrar pessoas vivas, corpos e

materiais combustíveis ou venenosos (OTTO et al., 2002).

As forças armadas de diversos países possuem agrupamentos especializados no uso de

animais em combate, ações táticas e salvamentos desde a 1ª Guerra mundial e permanecem a

treinar cães ainda hoje (HAVERBEKEA et al., 2008.).

Na zona rural, é comum encontrar animais que são verdadeiramente funcionários da

fazenda. Existem, em alguns países, linhagens de cães que são treinados para realizar o

manejo e o deslocamento de gado (bovino, ovino, caprino), suínos e até mesmo aves. Através

de comandos simples, ou mesmo de forma autônoma, os cães conseguem proezas através da

imposição de sua vontade, latidos e movimentos rápidos é possível ao animal movimentar,

agrupar, separar e conduzir (entre outras opções) grupos ou indivíduos, além de protegerem o

rebanho de animais selvagens (RIGG, 2002).

1.1.4 Considerações Finais

Ainda não é possível definir com plena certeza o momento e a forma que o cão deixou

seu habitat selvagem e tornou-se o animal que conhecemos hoje. Espera-se que mediante

novos estudos a origem dos cães domésticos seja por fim revelada, mas a importância real

destes estudos é permitir que o homem conheça melhor estes animais que se incorporaram tão

bem ao nosso estilo de vida.

Os cães assumiram um papel importante na evolução humana seja executando tarefas,

como até hoje o fazem, seja ocupando espaço entre as famílias humanas. Definir suas origens

ancestrais não somente satisfazem à curiosidade dos pesquisadores, mas principalmente pode

redefinir a forma como são tratados e utilizados.

Com seus sentidos aguçados, seu senso de responsabilidade com o espaço que

ocupam, sua disposição física para ações rápidas e contínuas, e uma fidelidade às vezes

incompreensível para os padrões do homem, os cães devem continuar a cativar as pessoas e

conhecê-los melhor permitirá que alguns dos inconvenientes de seu convívio entre humanos,

como as zoonoses, possam ser melhor estimados e corrigidos.

36

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42

1.2. Criopreservação do sêmen canino

Em 1776, Spallanzani observou que uma redução na temperatura diminuía

reversivelmente a atividade metabólica do espermatozóide, possibilitando assim a sua

armazenagem (ENGLAND, 1993). Com a descoberta da ação crioprotetora do glicerol por

Polge et al. (1949), iniciou-se uma era de extenso desenvolvimento de metodologias de

criopreservação de células espermáticas em diversas espécies, com o primeiro sucesso na

congelação do sêmen canino notificado por Rowson em 1954. Em 1969, Seager obteve a

primeira gestação canina, utilizando sêmen criopreservado (ENGLAND, 1993). No Brasil, a

primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado

foi realizada a pouco mais de 20 anos, tendo sido obtida uma ninhada de seis cães normais da

raça Boxer (VASKE et al., 1981).

O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência, reduzindo o metabolismo

e proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na produção de catabólitos

tóxicos, contribuindo para a preservação celular. Da mesma maneira que a congelação pode

diminuir ou paralisar algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, também, acelerar

outras, levando à danos ou mesmo à morte celular (MAZUR et al. 1972, WATSON, 1981;

WATSON, 1995; HOLT, 2000).

O termo “estresse térmico” ou “choque térmico” define um conjunto de alterações

ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos quando resfriados rapidamente da temperatura

corpórea até temperaturas próximas a 5°C, que muitas vezes têm como conseqüência um

decréscimo irreversível da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no

funcionamento das células espermáticas incluindo: diminuição da taxa da glicólise, da

respiração celular e da frutólise, aumento na degeneração do ácido desoxirribonucléico e

liberação de material intracelular (AMANN e GRAHAM, 1993; HOLT, 2000; JASKO, 1994;

WATSON, 2000; ZÚCCARI, 1998). A maioria das alterações causada pelo estresse térmico

se inicia na membrana espermática (HOLT, 2000; JASKO, 1994).

As técnicas de preservação de sêmen em baixas temperaturas causam diminuição

da fertilidade, devido principalmente, às lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides

advindas do estresse térmico (JASKO, 1994; MORTON e BRUCE, 1989). A redução de

temperatura de 37ºC a valores próximos de 4 - 5ºC pode levar ao rearranjo de alguns

fosfolipídios semelhantes dentro da bicamada. Com este rearranjo as propriedades básicas da

membrana biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas, não são

43

mantidas, alterando a funcionalidade da membrana em questão (AMANN e GRAHAM, 1993;

GENNIS, 1989; HOLT, 2000; PARKS e GRAHAM, 1992; JASKO, 1994; WATSON, 1981;

WATSON, 1995; WATSON, 2000). Além da alteração da temperatura, alterações na

osmolaridade, pressão ou pH podem contribuir para mudanças na estrutura e organização da

bicamada de fosfolipídios (GENNIS, 1989).

Rotineiramente, o sêmen congelado é utilizado para a inseminação artificial em

outras espécies como a bovina, eqüina, ovina e caprina, e, na maioria delas, o sêmen

descongelado é depositado no útero, evitando desse modo, a barreira cervical, o que não

ocorre na espécie canina, onde o sêmen é normalmente depositado no fundo da vagina

(LINDE-FORSBERG e FORSBERG, 1989; MORTON e BRUCE, 1989). Estudos realizados

com sêmen congelado de cães demonstraram que o espermatozóide descongelado não

apresenta a mesma motilidade e vigor do sêmen fresco ou refrigerado, conseqüentemente, sua

sobrevivência no trato genital feminino é reduzida (ENGLAND e PONZIO, 1996; GABALDI

e LOPES, 1998; GILL et al., 1970; JOHNSTON et al., 2000; LINDE-FORSBERG e

FORSBERG, 1989; MORTON e BRUCE, 1989; PEÑA et al., 1998; ROTA et al., 1995).

A fim de minimizar esses danos, foram identificadas substâncias de vital

importância na tecnologia do sêmen designados de diluentes (RODRIGUES, 1997).

1.2.1 Diluentes

Os diluentes são utilizados com o intuito de proteger os espermatozóides de todos

os efeitos críticos do processo de congelação. Um bom diluente se caracteriza pela baixa

toxicidade à célula espermática; pela isotonicidade, poder nutritivo, por ser tampão eficaz;

pelos estabilizadores de membrana; pelo pH que favorece a sobrevivência espermática e, por

último por ser de fácil preparo e baixo custo (CONCANNON & BATISTA, 1989; MIES

FILHO, 1987). Johnston (2001) aponta ainda que um bom diluidor possui osmolaridade entre

300 e 325 mOsm e pH de 6,75 e 7,50.

A atividade vital das células espermáticas tem como conseqüência natural o

aumento de íons hidrogênio no meio, cujo aumento de concentração leva a alterações do pH,

que reduzem a longevidade dos espermatozóides, num ciclo de deterioração que somente

equilibra-se se os íons H forem retirados do meio (ENGLAND, 1993) , e as soluções tampão

são ideais para cumprir este papel, de onde parte a necessidade dos diluidores serem boas

soluções tampão.

44

Os primeiros experimentos para a preservação do sêmen canino por períodos

curtos ou longos iniciaram-se com uma adaptação empírica de diluentes usados para o

resfriamento e congelação do sêmen bovino, com o uso dos tampões à base de citrato

(HARROP, 1962), leite desnatado (MARTIN, 1963); cloreto de fosfato (WALES e WHITE,

1963), Tris (FOOTE, 1964; GILL et al., 1970) e lactose (SEAGER, 1969). A maioria dos

grupos de pesquisa da atualidade tem utilizado o diluente Tris, o qual tem se mostrado

superior a outros diluentes (FARSTAD, 1996; SILVA et al., 2000).

Os açúcares têm sido incluídos nos diluentes para a conservação de sêmen a baixas

temperaturas como substrato de energia endógena, como componente osmótico e como agente

crioprotetor (FARSTAD, 1996; PEÑA et al., 1998; HOLT, 2000; JOHNSTON et al., 2001).

Em adição, Phillips e Lardy, em 1940, descobriram os efeitos benéficos da gema de ovo na

conservação dos espermatozóides, sendo que o principal efeito protetor da gema parece

ocorrer pela diminuição dos efeitos negativos do choque frio estabilizando as membranas

espermáticas (HOLT, 2000).

O emprego do leite como meio diluente de sêmen foi primeiramente demonstrado por

Donne em 1837. Segundo Hoffman (1996), o leite é um líquido orgânico com importante

propriedade biológica para a conservação dos espermatozóides por possuir capacidade

tampão, ação bactericida, viscosidade adequada para a manutenção dos espermatozóides no

meio líquido com abundância de carboidratos que seriam utilizados pelos espermatozóides na

produção de energia. Em 1950, Koelliker comprovou a existência de duas substâncias

responsáveis por esta característica: a lactose, que age como elemento energético, e proteínas

que são substâncias capazes de potencializar a atividade cinética dos espermatozóides. Cunha

(1997) e Johnston et al. (2000) verificaram a possibilidade da utilização de um diluente a base

de leite desnatado e glicose, obtendo sucesso com seu uso em processos de refrigeração e

transporte.

O tris-hidroximetil-aminometano, ou simplesmente Tris [(HOCH2)3CNH2], funciona

como solução tampão para uma larga faixa de pH, coincidente com as condições ideais para

maior parte dos organismos viventes, motivo pelo qual é amplamente utilizado em diversos

procedimentos na bioquímica e biologia molecular (GOMORI, 1955). Tornou-se padrão

como diluidor no congelamento de sêmen canino ao longo dos anos, desde seu uso inicial

com Foote (1964), em especial quando combinado com outras substâncias como a gema de

ovo (ENGLAND, 1993).

45

1.2.2 Crioprotetores

A adição de algumas substâncias crioprotetoras ao meio diluente confere proteção

aos espermatozóides no processo de criopreservação. Em contrapartida oferece maior ou

menos grau de toxidade. Segundo Medeiros (2003), os crioprotetores estão subdivididos em

penetrantes, os quais desempenham seu mecanismo de ação no meio extracelular e

intracelular, e os crioprotetores não-penetrantes que atuam somente no meio extracelular.

Os não-penetrantes são representados por macromoléculas com alto peso

molecular, tais como os açúcares, lipoproteínas da gema do ovo, proteínas do leite e alguns

aminoácidos, que atuam através de um efeito osmótico, no qual induz a saída da água do

interior da célula, prevenindo a formação de cristais de gelo no meio intracelular (AMANN &

PICKETT, 1987).

Ashwood-Smith (1987) sumarizou diferentes componentes que podem ser usados

como agentes crioprotetores penetrantes para a criopreservação de sêmen, como os álcoois:

etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol e poli-etilenoglicol; e também as amidas, incluindo a

acetamida, formamida, lactamida. Estes têm estruturas que promovem ligações de hidrogênio

com a molécula da água, estas ligações mudam a orientação da molécula da água nos cristais

de gelo criando um ambiente menos nocivo para as células espermáticas (DALIMATA e

GRAHAM, 1997). Os crioprotetores também interagem direta ou indiretamente com a

membrana celular, estabilizando a estrutura do complexo terciário água, lipídeo e proteína.

(ROWE, 1966).

As características físico-químicas ideais que um agente crioprotetor deve possuir

são: baixo peso molecular, alta solubilidade em meio aquoso e principalmente uma baixa

toxicidade celular (NASH, 1966). Esses agentes agem modificando as características da

molécula da água durante o processo de congelação, limitando a formação de cristais de gelo,

retardando o crescimento dos cristais e reduzindo as concentrações de soluto tanto no meio

extracelular, como no meio intracelular (DALIMATA & GRAHAM, 1997; NASH, 1966;

ROWE, 1966; WATSON, 1979).

1.2.2.1. Glicerol

O glicerol (CH3H8O3), um álcool polihídrico altamente permeável, é o crioprotetor

mais empregado na congelação de sêmen nas diferentes espécies (SILVA et al., 2003). Ele

46

ocasiona um estresse osmótico à célula espermática, impedindo a formação de grandes cristais

de gelo intracelulares (WATSON, 2000). Os efeitos protetores do glicerol são representados

por suas propriedades coligativas, pela diminuição do ponto de criopreservação e pela

conseqüente redução das concentrações de eletrólitos na fração não-congelada da amostra

(LOVELOCK e POLGE, 1954).

Uma outra hipótese do mecanismo de ação do glicerol é a ligação dos átomos de

hidrogênio dos grupos hidroxila do glicerol com os átomos de oxigênio dos grupos fosfatos

dos fosfolipídios da membrana plasmática dos espermatozóides promovendo assim, uma

estabilização da membrana durante o processo de congelação (JOHNSTON et al., 2000).

O glicerol reduz as injúrias causadas durante o criopreservação, embora tenha

demonstrado apresentar toxicidade para as células espermáticas durante a sua adição e durante

a própria crioconservação (ROTA et al., 2001). Fahy et al. (1990) relatam que esta toxicidade

pode resultar em desnaturação de proteínas, alteração de interações da actina e indução da

liberação das proteínas do seu local na membrana. Para Watson (1979), a concentração ideal

de glicerol no diluente seria aquela em que há uma predominância de seus efeitos protetores

sobre os efeitos tóxicos.

Hay et al. (1997), concluíram que a adição do glicerol no meio do criopreservação

de sêmen de cães não promove nenhuma mudança no status acrossomal ou na motilidade, mas

resulta em um declínio na ligação de espermatozóides em oócitos caninos.

1.2.2.2. Dimetilformamida

As amidas podem se ligar ao hidrogênio da água em três sítios de ligação, um

número menor de sítios se comparada ao glicerol. No entanto as amidas possuem uma menor

viscosidade e solubilidade à água em relação ao glicerol, permitindo-as uma maior penetração

na célua (NASH, 1966), diminuindo assim a possibilidade de danos celulares por estresse

osmótico causados pelos crioprotetores (BALL & VO, 2001). Keith (1998) relatou que a

adição de grupos metil nas moléculas de acetamida e formamida foi mais efetiva quanto à

capacidade crioprotetora, comparado às moléculas sem o grupo metil, sugerindo assim que a

estrutura da molécula das amidas determina parcialmente sua habilidade crioprotetora.

Keith (1998) estudou várias formas de amidas como agentes crioprotetores em

comparação com o glicerol em um meio usado para a congelação de sêmen de garanhões, e

encontrou que a metilformamida foi superior em manter o motilidade total dos

47

espermatozóides de garanhões no tempo imediatamente pós-descongelação em relação ao

glicerol e no tempo 20min pós-descongelação.

A dimetilformamida (C3H7NO) vem sendo usada como crioprotetor de sêmen de

várias espécies, como eqüinos (VIDAMENT et al., 2000), suínos (BIANCHI, 2008), caprinos

(SILVA, 2006), peixes (TIAN, 2008), aves (CHALAHA, 1999), inclusive caninos

(OLIVEIRA, 2003). Esta substância é um crioprotetor penetrante, que atua por meio de suas

propriedades coligativas, diminuindo o ponto crioscópico intracelular. Desta forma, maior

quantidade de água vai permanecer no estado líquido sob baixas temperaturas, diminuindo a

concentração intracelular de solutos, proporcionando, assim, um ambiente menos deletério à

célula espermática durante a congelação (WATSON, 1995).

Em sêmen de eqüídeos, a dimetilformamida (DMF) vem sendo testada em

diferentes protocolos e em combinação com diversos diluentes, inclusive comerciais, com

sucesso (MELO et al., 2007). Alguns destes estudos concentram-se em avaliar métodos, de

diluição por exemplo, em detrimento a considerar o uso de outras substâncias crioprotetoras

que não a dimetilformamida (ZIMMERMAN, 2007).

Em suínos, a dimetilformamida possui, em determinados protocolos, resultados de

motilidade e preservação da membrana espermática superiores a outras aminas e ao glicerol

(BIANCHI, 2008). Em caprinos, as biotécnicas reprodutivas têm ganhado espaço e algumas

pesquisas mostram que a dimetilformamida é no mínimo equivalente ao glicerol quando da

preservação do sêmen (SILVA, 2006)

Em espécies silvestres, em especial aquelas ameaças de extinção, a

dimetilformamida vêm sendo testada como agente crioprotetor, em geral com sucesso

satisfatório ou superior a outras substâncias (TIAN et al., 2008; CHALAHA et al., 1999).

Em cães, foi demonstrado que a dimetilformamida poderia ser utilizada na

criopreservação de sêmen associada aos diluentes lactose-gema (OLIVEIRA, 2003) ou tris-

gema (QUINTELA, 2005), apresentando resultados satisfatórios após a descongelação.

Zimmermann et al (2007) comprovaram que os meios tris-gema com 6% de glicerol e tris-

gema com 7% de dimetilformamida apresentam maior capacidade de preservar a qualidade do

sêmen, podendo ser indicados à criopreservação do sêmen canino. Oliveira (2006) em testes

in vitro, reafirma a viabilidade da dimetilformamida como criopreservador. Futino (2008) em

testes comparativos entre glicerol, metilformamida e dimetilformamida, avaliou que a DMF

em concentrações inferiores a 3% não são eficientes para preservar sêmen canino, mas viável

em concentrações maiores.

48

Apesar da existência de experimentos, ainda que em quantidade limitada, acerca

do uso da dimetilformamida, como crioprotetor para o sêmen do cão, ainda faz-se necessário

avaliá-lo sob o ponto de vista de outras metodologias, bem como fazer o uso de técnicas

laboratoriais avançadas, como a análise computadorizada, bem como a realização de testes in

vivo através de inseminações artificiais.

49

2. COMPARAÇÃO ENTRE O GLICEROL E A DIMETILFORMAMIDA PARA A

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES

Artigo 02: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog

semen cryopreservation

Kátia R.F. Lopes, Leonardo L.M. Costa, Gabriela L. Lima, Ana Liza P. Souza, Alexandre R.

Silva

Laboratório de Manipulação e Conservação de Germoplasma Animal, Universidade

Federal Rural do Semi-Árido / BR 110 - Km 47 Bairro Pres. Costa e Silva; 59.625-900 -

Mossoró – Rio Grande do Norte

Theriogenology (Artigo Submetido)

Resumo

O objetivo deste estudo foi comparar o efeito da dimetilformamida (DMF) e glicerol

para a criopreservação de sêmen cão. O sêmen foi diluído em duas etapas com o diluente Tris-

gema de ovo contendo uma concentração final de 6% glicerol ou ou 6% DMF, e congelado

em palhetas 0,25 mL, com o vapores de nitrogênio líquido. Imediatamente após o

descongelamento das amostras congeladas, motilidade espermática foi avaliada tanto sob um

microscópio ótico e com um sistema de análise de sêmen computadorizada. A Integridade

funcional da membrana espermática foi avaliada com teste de inchaço hipo-osmótico (água

destilada a 0mOsm). A morfologia espermática e percentagem de espermatozóides vivos

também foram avaliadas por microscopia de luz. Após o descongelamento, as células

espermáticas congeladas com glicerol (P <0,05) apresentaram maior percentual de células

vivas, mas não foram observadas diferenças nos parâmetros funcionais, tais como motilidade

total e progressiva, bem como não houve distinção entre DMF e glicerol quanto à integridade

da membrana, sugerindo que ambos podem igualmente ser utilizadas para criopreservação do

sêmen canino. O efeito de cada animal e as interações entre animais e crioprotetores foram

verificadas para diversas características sêmen (P <0,05) evidenciando uma acentuada

diferença entre o sêmen de cada um dos cães na sua tolerância à criopreservação. Em

50

conclusão, DMF pode ser utilizado como uma alternativa para crioprotector sêmen canino.

Também é sugerido que DMF poderia ter um efeito benéfico especialmente para aqueles

animais, que apresentam alta sensibilidade para o glicerol.

Palavras-chave: sêmen; cão; criopreservação; glicerol; Dimetilformamida.

Abstract

The aim of this study was to compare the effect of dimethylformamide (DMF) and

glycerol for cryopreservation of dog semen. The semen was diluted in two steps with an egg-

yolk Tris extender containing a final concentration of either 6% glycerol or 6% DMF, and

frozen in 0.25 mL straws, over nitrogen vapors. Immediately after thawing the frozen

samples, sperm motility was evaluated both under a light microscope and with a computer-

assisted sperm analyzer. Sperm membrane functional integrity was assessed with hypo-

osmotic swelling test (0mOsm distilled water). Sperm morphology and percentage of live

sperms were also evaluated by light microscopy. After thawing, a majority of sperm cells was

live with the use of glycerol (P < 0.05), but no differences were observed in functional

parameters such as subjective-, total- and progressive motility as well as functional membrane

integrity between it and DMF suggesting that both could similarly act on canine semen

cryopreservation. The effect of the individual animal and interactions between animals and

cryoprotectants were verified for various semen characteristics (P < 0.05) evidencing a

marked difference among the semen of individual dogs in their tolerance to cryopreservation.

In conclusion, DMF could be used as an alternative cryoprotectant for canine semen. It is also

suggested that DMF could have a beneficial effect especially for those individual animals that

present high sensitivity to glycerol.

Keywords: Semen; Dog; Cryopreservation; Glycerol; Dimethylformamide.

51

2.1 Introdução

Desde a descoberta da ação crioprotetora de glicerol (POLGE et al., 1949), uma era de

desenvolvimento de metodologias criopreservação de sêmen começou. O glicerol é o

crioprotetor mais freqüentemente utilizado para a preservação de sêmen de várias espécies,

incluindo o cão (SILVA et al., 2006ab; CARDOSO et al., 2007). No entanto, o glicerol induz

mudanças na estrutura lipídica da membrana espermática, e, consequentemente, a estabilidade

e a permeabilidade da água na membrana do espermatozóide pode sofrer alterações. Tais

alterações podem contribuir para reduzir a longevidade e acelerar a capacitação espermática

(WATSON, 1995).

Na busca de crioprotetores alternativos para o sêmen canino, a ação de outras

substâncias, como o etileno glicol (MARTINS-BESSA et al., 2006; ROTA et al., 2006) foi

recentemente relatada. Em equinos (ALVARENGA et al., 2005), coelhos (OKUDA et al.,

2007) e suínos (BIANCHI et al., 2008), as amidas foram sugeridas como agentes

crioprotetores alternativos para congelar o sêmen, principalmente para aqueles indivíduos que

são mais sensíveis para os efeitos tóxicos do glicerol. As amidas apresentam uma relativa

menor viscosidade e menor peso molecular que o glicerol. Este fato favorece uma maior

permeabilidade das amidas na membrana plasmática, resultando em menores danos osmóticos

à célula espermática (ALVARENGA et al., 2005).

Em cães, a dimetilformamida (DMF) foi combinada com lactose (OLIVEIRA et al.,

2006) ou Tris (FUTINO, 2008; ZIMMERMAN et al., 2007), como diluentes para

criopreservação de sêmen canino com resultados semelhantes aos do glicerol. Apesar da

importância destes estudos iniciais, eles estão focados apenas em análises subjetivas e novas

investigações objetivas são sugeridas. Atualmente, a análise auxiliada por computador

(CASA) foi incluída na avaliação de sêmen e seu uso é cada vez mais comum nos laboratórios

de andrologia (VERSTEGEN et al., 2002, Silva et al., 2006). O uso da CASA permite uma

avaliação objetiva das diferentes características celulares, como seu padrão de movimento e

velocidade, com alto nível de precisão e confiabilidade (VERSTEGEN et al., 2002).

O objetivo deste estudo foi comparar o efeito da DMF e glicerol na criopreservação de

sêmen de cães em relação aos parâmetros de motilidade pós-descongelação e velocidades

avaliadas pela CASA, como também sobre a motilidade progressiva subjetiva, morfologia

espermática, percentual de células vivas, e integridade funcional da membrana plasmática.

52

2.2. Materiais e Métodos

2.2.1. Animais

Cinco cães (três American Pit Bull Terriers, um Bull Terrier e um mestiço) de canis

particulares de Mossoró, Brasil, foram selecionados para este experimento. Os cães, com

idades entre 1 a 6 anos, foram mantidos em baias individuais e alimentados com ração

peletizada, uma vez por dia, com livre acesso à água.

2.2.2 Colheita e avaliação inicial do sêmen

Dois ejaculados foram coletados de cada cão por meio de manipulação digital em

intervalos de dez dias, e as frações ricas em espermatozóides foram analisadas. O volume

seminal e a coloração foram avaliados macroscopicamente e a concentração espermática foi

determinada por meio de contagem em câmara de Neubauer. O percentual de espermatozóides

em movimento progressivo foi avaliado subjetivamente utilizando-se um microscópio óptico

sob aumento de 100x e 400x. Esfregaços corados com Rosa-Bengala foram preparados para

avaliar a morfologia espermática usando microscopia óptica (1000X), contando 200 células

por lâmina. A porcentagem de espermatozóides vivos foi estabelecida por meio da análise de

esfregaço corado com azul de bromofenol sob um microscópio óptico (400x), contando 200

células por lâmina. Para a avaliação da funcionalidade da membrana espermática, as amostras

foram submetidas ao teste hipo-osmótico (HOS), com água destilada (0 mOsm / L) como a

solução hipo-osmótica (QUINTELA et al., 2004). Uma alíquota de sêmen (0,01 mL) foi

diluída em solução hipo-osmótica (0,09mL) e mantida em um banho-maria a 38 ºC por 45

min. As avaliações foram realizadas sob microscopia óptica (400x), contando 200 células.

Espermatozóides apresentando caudas enroladas e edemaciadas foram considerados como

apresentando um membrana plenamente funcional.

2.2.3 Processamento do Sêmen

Os reagentes utilizados neste estudo foram obtidos no laboratório Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA). Foi utilizado um diluente constituído por 3,028g Tris-hidroximetil-

aminometano, 1,78g de ácido cítrico mono-hidratado e 1,25g de D-frutose, dissolvidos em

53

100mL de água ultrapura (SILVA et al., 2002). A osmolaridade desta solução era de

295mOsm / L, e o pH, 6,6. Vinte por cento desta solução foi então substituída por gema de

ovo (v / v). Cada amostra foi inicialmente diluída na proporção de uma parte da fraçaõ

espermática para meia parte da solução de TRIS acrescida de gema de ovo (EYT), a 27 º C. O

sêmen foi armazenado em uma caixa térmica por 40min até que alcançasse uma temperatura

de 15 º C, a uma taxa de resfriamento de -0,30 °C/min. As amostras foram então transferidas

para um refrigerador por mais 30min, aonde atingiu 4ºC, a uma taxa de resfriamento de -

0,37°C/min. Depois do resfriamento, as amostras do sêmen foram divididas em duas alíquotas

e cada uma foi acrescentada à outra meia-parte do EYT acrescido de 12% de glicerol ou 12%

DMF, a uma temperatura de 4 ºC, o que culminou com uma concentração final de 6% de

crioprotetor no diluidor. A taxa de diluição final para ambas as alíquotas foi uma parte de

sêmen para uma parte de diluente (1:1). Nesta ocasião, a motilidade progressiva foi reavaliada

subjetivamente por microscopia de luz (100x). As amostras foram acondicionadas em

palhetas de plástico de 0,25ml, que foram colocados horizontalmente em uma caixa térmica

por 5min, posicionados 5 centímetros acima do nitrogênio líquido (N2), e chegaram a uma

temperatura próxima de -70ºC, sob a ação dos vapores do nitrogênio. Finalmente, as palhetas

foram imersas em N2 líquido para armazenamento. Após a passagem de um mês, as amostras

foram transferidas para o Laboratório de Reprodução de Carnívoros da Universidade Estadual

do Ceará (Fortaleza, Brasil) para a descongelação e posterior análise. As amostras foram

descongeladas em um banho-maria à taxa de 38ºC/1min, e posteriormente avaliadas quanto a

motilidade progressiva subjetiva, morfologia espermática, percentual de células vivas, teste

HOS e também pela CASA.

2.2.4. Análise computadorizada do sêmen (CASA)

A análise foi conduzida de acordo com Iguer-Ouada e Verstegen (2001). Depois de

descongeladas, as amostras de sêmen (10 µL) foram colocadas em uma câmara de Makler, e

aguardaram em repouso durante 1 min, mantidos a 38 ºC, e examinadas em microscopia de

contraste de fase com um sistema de iluminação estroboscópica acoplado a uma vídeo-câmera

adaptada para o Sperm Class Analyzer (SCA versão 3.2.0, Microptic SL, Barcelona,

Espanha). Três campos microscópicos diferentes, não consecutivos, selecionados

aleatoriamente foram digitalizados. Os dados foram informatizados e os valores de média ±

desvio padrão foram determinados. Os parâmetros analisados foram motilidade total (%),

54

motilidade progressiva (%), velocidade média no percurso (VAP, µm/seg), velocidade em

linha reta (VSL, µm/seg), velocidade curvilínea (VCL, µm / seg), amplitude lateral da cabeça

(ALH; µm), frequênca de batimento cruzado (BCF; Hz), índice de progressão (STR,%) e de

linearidade (LIN,%).

2.2.5 Análise estatística

Foram realizadas dez repetições para cada tratamento. Os resultados foram expressos

como média ± desvio padrão. Os dados percentuais foram transformados através de arco-

seno. Todos os dados foram submetidos à análise de variância utilizando o modelo linear

geral do Statview Software Pack (Statview 5,0, SAS Institute Inc., Cary, E.U.A.).

As diferenças entre sêmen fresco, diluído, resfriado e descongelado com relação à

motilidade avaliada subjetivamente foram detectados pelo teste t de Student. Os efeitos de

crioprotetores na pós-descongelação (avaliados pela CASA), bem como as comparações entre

sêmen fresco e congelado relativos à morfologia espermática, percentual de células vivas e

funcionalidade da membrana também foram realizados pelo teste t de Student. Os resultados

foram significativos quando P <0,05.

Para avaliar o efeito individual cão e suas interações com os efeitos de crioprotetores

sobre as variáveis estudadas, os dados foram analisados pelo teste PSLD de Fisher (P <0,05).

2.3. Resultados

O sêmen fresco dos cães apresentou coloração branco-leitosa. O volume da fração

espermática foi de 288 ± 21 µL, com uma concentração espermática de 788 ± 621 x 106

espermatozóides/mL. A avaliação subjetiva da motilidade progressiva está representada na

Tabela 1. Diferenças entre os crioprotetores foram apenas observadas imediatamente após sua

adição ao sêmen refrigerado (P<0,05)

O efeito dos crioprotetores sobre a morfologia espermática, a viabilidade das células

espermáticas e a integridade funcional da membrana estão apresentados na Tabela 2. As

diferenças estatísticas entre os crioprotetores foram verificadas apenas para a percentagem de

células vivas após a descongelação, que apresentava melhores valores quando da utilização de

glicerol (P <0,05).

55

Tabela 1: Motilidade espermática progressiva (%) no semen canino fresco, diluído,

adicionado de glycerol ou dimetilformamida (DMF) e congelado/descongelado (n=10

ejaculados de 05 cães).

Avaliação do sêmen Glicerol DMF

Fresco 96,5 ± 1,6A

Diluído 96,1 ± 3,3%A

Adicionado de crioprotetor 94,0 ± 4,6Aa 85,0 ± 11,6Bb

Congelado/descongelado 44,1 ± 23,7C 27,1 ± 11,1C a,b Letras minúsculas indicam diferença estatística entre colunas (P < 0,05); A,B,C Letras maiúsculas indicam diferenças estatísticas entre linhas (P < 0,05).

Tabela 2: Percentagem (%) da integridade funcional da membrana, espermatozóides vivos,

morfologia espermática normal e alterado em sêmen canino (n=10 ejaculados de 05 cães)

fresco e congelado/descongelado, acrescentado de glicerol ou dimetilformamida (DMF).

Fresco Resfriado

Glicerol DMF

Resposta osmótica 95,1 ± 5,5a 62,0 ± 12,1b 55,3 ± 11,9b

Porcentagem de vivos 91,0 ± 11,4a 55,5 ± 4,5b 47,5 ± 10,7b

Morfologia Normal 94,9 ± 4,4 96,1 ± 1,9 96,2 ± 1,6

Alterações Morfológicas

Primárias 1,2 ± 0,9 1,5 ± 1,0 1,5 ± 0,9

Secundárias 4,0 ± 3,7 2,5 ± 1,1 2,3 ± 0,9

Totais 5,2 ± 4,4 4,0 ± 1,9 3,8 ± 1,6

Os dados do CASA são apresentados na Tabela 3. A motilidade espermática total foi

de 64,3 ± 24,6% e 52,3 ± 23,6% para o glicerol e DMF, respectivamente, variando de 96,7 a

13,9% no glicerol, e de 86,5 a 20,1% para a DMF. A motilidade progressiva foi de 11,9 ±

9,0% e 7,2 ± 6,8% de glicerol e DMF, respectivamente, variando de 29,0 a 0,2% para o

glicerol e de 17,8 a 0,3% para a DMF. Nenhuma diferença estatisticamente significativa entre

os agentes crioprotetores foi observada relativa aos parâmetros de movimentos e velocidade

dos espermatozóides (P> 0,05).

56

Tabela 3: Parâmetros de motilidade espermática mensurados por análise espermática

assistida por computador no sêmen canino congelado/descongelado (n=10 ejaculados de 05

cães) usando glicerol ou dimetilformamida (DMF) como crioprotetores.

Glicerol Dimetilformamida

Motilidade total 64,3 ± 24,6 52,3 ± 23,6

Motilidade Progressiva 11,9 ± 9,0 07,2 ± 6,8

Velocidade curvilínea 46,2 ± 20,5 37,1 ± 12,8

Velocidade em linha reta 21,2 ± 10,0 15,8 ± 6,1

Velocidade média no percurso 33,4 ± 14,7 22,9 ± 8,4

Linearidade 45,9 ± 10,7 42,6 ± 5,5

Índice de progressão 69,5 ± 8,5 68,9 ± 8,2

Amplitude lateral da cabeça 03,5 ± 0,6 03,9 ± 0,6

Freqüência de batimento cruzado 07,9 ± 2,7 08,7 ± 2,1

P > 0,05

2.4 Discussão

Este estudo investigou o efeito de DMF como uma alternativa para crioproteção de

sêmen canino utilizando a CASA. Demonstrou-se que DMF é semelhante ao glicerol na

preservação do total de espermatozóides e sua motilidade progressiva após a descongelação.

Resultados da motilidade progressiva e total obtidos com o DMF também são semelhantes

aos relatados com o uso de etileno-glicol como um crioprotector de sêmen canino (ROTA et

al., 2006). Parâmetros de velocidade observados neste estudo foram inferiores aos reportados

em outros estudos sobre congelamento de sêmen canino (ROTA et al., 2006, SILVA et al.,

2006). O SCA, sistema adotado para os cálculos, estabelece parâmetros para definir se a

velocidade média é baixa, média ou rápida, mas a inclusão de um grande percentual de

espermatozóides lentos reduziu os valores.

As propriedades crioprotetoras do glicerol e amidas são alcançadas através de

diferentes mecanismos. O glicerol é um álcool que contém três grupos funcionais hidroxila,

que podem aceitar um hidrogênio a partir da molécula da água em seis sítios diferentes. Os

radicais hidroxila do glicerol podem, por vezes, ligar-se entre si diminuindo a probabilidade

de ligação com as moléculas da água, o que é indesejável por aumentar a viscosidade da

solução (DALIMATA & GRAHAM, 1997). Contrariamente, as amidas são formadas por

57

grupos funcionais que contêm nitrogênio (NH–C=O) e interagem com a água através da

ligação de seus constituintes nitrogênio e hidrogênio com os hidrogênios presentes na

molécula da água. A natureza altamente hidrofílica da molécula da amida permite uma maior

interação com a água, o que reduz a formação de cristais de gelo intracelular. Devido ao seu

menor peso molecular (73,09) e viscosidade, em comparação ao glicerol (peso molecular

92,05), as amidas apresentam maior permeabilidade na membrana, diminuindo assim a

possibilidade de danos celulares causados pelo estresse osmótico (BALL & VO, 2001). Além

disso, a adição de radical metil (CH3) na molécula amida aumenta a permeabilidade através da

membrana celular dos espermatozóides e melhora a eficiência da sua ação croprotetora

(BIANCHI et al., 2008)

O efeito do glicerol na criopreservação de sêmen canino tem sido amplamente

estudado. Sabe-se que a concentração glicerol (PEÑA et al., 1998), a forma de adição

(SILVA et al., 2003), e a temperatura de adição (SILVA et al., 2006) são fatores que podem

influenciar a qualidade da congelação/descongelação do sêmen canino. Entretanto, estudos

sobre a ação de amidas como crioprotetores para o sêmen de cães são poucos. Zimmerman et

al. (2007) estudaram diferentes concentrações de DMF em diluente Tris e constatou que 7%

de DMF promove melhores resultados pós-descongelação do que 3,5%. Oliveira et al. (2005)

sugeriram que 5% de DMF no diluidor à base de lactose poderia preservar a qualidade do

sêmen canino após a descongelação. Neste trabalho, optou-se por utilizar 6% de DMF que é

uma concentração similar ao usado atualmente para o glicerol em Tris (SILVA et al., 2006).

Chirinéia et al. (2006) relataram o uso combinado de ambos os crioprotetores. Eles

compararam os resultados obtidos com Tris adicionado de 8% de glicerol aos obtidos com um

diluente comercial acrescentado de glicerol a 3% e 2% de DMF, mas como nós, eles não

observaram diferenças na motilidade subjetiva, morfologia espermática e no teste HOS.

Estudos anteriores relatados para o uso do DMF sozinho mostraram valores médios de 46,7%

e 45,0% para a motilidade subjetiva com o uso de Tris (ZIMMERMAN et al., 2007) e lactose

(OLIVEIRA et al., 2005) como diluentes, respectivamente. Em nosso trabalho, valores

inferiores a 27% de motilidade progressiva avaliada subjetivamente foram encontrados para

DMF, mas nenhuma diferença estatística relacionada ao glicerol foi corroborada pelas

avaliações subjetivas ou computadorizadas.

A única diferença significativa entre os crioprotetores foi verificada após a

descongelação. Apesar de uma maioria de células espermáticas estarem vivas com o uso de

glicerol, não houve diferenças nos parâmetros funcionais como a mobilidade funcional e

integridade da membrana quando comparado com amostras congeladas com DMF. Embora a

58

motilidade seja apenas um dos muitos atributos importantes de um espermatozóide capaz de

fecundar, é o principal parâmetro e continua a ser o mais utilizado indicador da função

espermática. A motilidade é a manifestação da competência estrutural e funcional dos

espermatozóides; assim, a porcentagem de espermatozóides dotados de motilidade

progressiva geralmente é positivamente correlacionada com a integridade da membrana

plasmática (PEÑA-MARTINEZ, 2004). No entanto, uma relação entre a resposta ao teste

HOS e a capacidade de fertilização de espermatozóides caninos não foi estabelecida. Assim,

sugere-se que, ensaios de fertilidade in vitro ou in vivo devam ser conduzidos para avaliar o

desempenho da DMF.

Sabe-se que existe uma marcada diferença entre as amostras de sêmen de cada cão em

relação à sua tolerância à criopreservação (YU et al., 2002) e este fato também foi confirmado

pelos nossos dados. Nós verificamos a presença de diversas interações entre animais e os

crioprotetores, indicando que a congelabilidade com glicerol ou DMF não foi semelhante para

todos os animais. A análise com CASA detectou uma motilidade espermática total variando

de 96,7 a 13,9% com glicerol e de 86,5 a 20,1% com DMF. Essa variação foi verificada para

todos os parâmetros avaliados e poderiam ser responsáveis pelos grandes desvios padrões

encontrados nos resultados. Em garanhões, a utilização de amidas fornece uma alternativa

para a melhoria da motilidade pós-descongelação e integridade das células daqueles

garanhões chamado "bad freezers" cujo sêmen congelado apresentam maus resultados quando

é utilizado glicerol. Assim, é possível que a espécie canina também poderia possuir "good" e

"bad freezers" e a DMF deva ser investigados com maior profundidade como uma alternativa

para a criopreservação de sêmen de cães "bad freezers".

Em conclusão, uma análise objetiva realizada com CASA mostrou que o DMF poderia

ser utilizado como um crioprotetor alternativo para o sêmen canino. A possibilidade de que a

DMF poderia ter ação benéfica para aqueles indivíduos que apresentam alta sensibilidade ao

glicerol existe. Novos estudos precisam ser realizados para investigar melhor a ação

crioprotetora de DMF em diferentes concentrações e suas interações com diferentes

diluidores, fertilidade, sensibilidade individual dos cães a este crioprotetor.

Agradecimentos

Os autores agradecem os Laboratórios de Tecnologia do Sêmen de Caprinos e Ovinos

e de Reprodução de Carnívoros/UECE pelo apoio técnico.

59

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62

CONCLUSÃO

A dimetilformamida pode ser eficientemente utilizada como crioprotetor associado ao

diluente Tris para a criopreservação de sêmen canino com resultados semelhantes aos obtidos

com o processo tradicional utilizando glicerol.

63

PERSPECTIVAS

Novos estudos devem ser conduzidos a fim de aprimorar a utilização da DMF,

investigando melhor a ação crioprotetora da mesma, principalmente em relação a diferentes

concentrações e interações com diferentes diluidores. A DMF mostrou-se similar ao glicerol,

mas pode apresentar um desempenho diferenciado se alterada a metodologia ou a interação

com outros diluentes.

Uma vez que já é conhecido que os cães apresentam diferenças quanto à

congelabilidade do seu ejaculado frente a diferentes diluentes ou crioprotetores, a DMF pode

vir a assumir um papel de grande importância como substituto ao glicerol. Esta possibilidade

pode ser alvo de novas pesquisas e abrirá fronteiras para o desenvolvimentos de novas

técnicas e/ou metodologias de manipulação do sêmen canino.

64

ANEXOS

65

Anexo 01: Comparison between glycerol and dimethylformamide

for dog semen cryopreservation

Kátia R.F. Lopesa, Leonardo L.M. Costaa, Gabriela L. Limaa, Ana Liza P. Souzaa, Alexandre

R. Silvaa*

a Departamento de Ciências Animais, Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA,

BR 110, Km 47, Costa e Silva, 59625-900, Mossoró, RN, Brazil.

Abstract

The aim of this study was to compare the effect of dimethylformamide (DMF) and

glycerol for cryopreservation of dog semen. The semen was diluted in two steps with an egg-

yolk Tris extender containing a final concentration of either 6% glycerol or 6%

dimethylformamide (DMF), and frozen in 0.25 mL straws, over nitrogen vapors. Immediately

after thawing the frozen samples, sperm motility was evaluated both under a light microscope

and with a computer-assisted sperm analyzer. Sperm membrane functional integrity was

assessed with hypo-osmotic swelling test (0mOsm distilled water). Sperm morphology and

percentage of live sperms were also evaluated by light microscopy. After thawing, a majority

of sperm was live with the use of glycerol (P < 0.05), but no differences were observed in

functional parameters such as subjective-, total- and progressive motility as well as functional

membrane integrity between glycerol and DMF suggesting that both could similarly act on

canine semen cryopreservation. The effect of the individual animal and interactions between

animals and cryoprotectants were verified for various semen characteristics (P < 0.05)

* Corresponding author: BR 110, Km 47, Presidente Costa e Silva, 59625-900, Mossoró, RN, Brazil. Tel: +55-84-88571964; fax: +55-84-33151778. E-mail adress: legio2000@yahoo.com (A.R. Silva)

66

evidencing a marked difference among the semen of individual dogs in their tolerance to

cryopreservation. In conclusion, DMF could be used as an alternative cyroprotectant for

canine semen. It is also suggested that DMF could have a beneficial effect especially for those

individual animals that present high sensitivity to glycerol.

Keywords: Semen; Dog; Cryopreservation; Glycerol; Dimethylformamide.

1. Introduction

From the discovery of the cryoprotective action of glycerol (Polge et al., 1949), an era

of extensive development of methodologies for semen cryopreservation began. Glycerol is the

cryoprotectant most frequently used for semen cryopreservation in several species, including

the dog (Silva et al., 2006ab). However, possibilities of glycerol-induced changes in the lipid

packing structure of the sperm membrane exist, and hence the stability and water permeability

of the sperm suffer alteration. Such changes can contribute to reduce sperm longevity and

accelerate capacitation (Watson, 1995).

In the search for alternative cryoprotectants for canine semen, the action of other

substances such as ethylene glycol (Martins-Bessa et al., 2006; Rota et al., 2006) was recently

reported. In stallions (Alvarenga et al., 2005), rabbits (Okuda et al., 2007) and boars (Bianchi

et al., 2008), amides were suggested as alternative cryoprotective agents for semen freezing,

mainly for those individuals who are more sensitive to the toxic effects of glycerol. Amides

present relatively lower viscosity and lower molecular weight than glycerol. This fact favors

an enhanced permeability of the amides into the plasma membrane, resulting in lower osmotic

damage to the sperm (Alvarenga et al., 2005).

In dogs, dimethylformamide (DMF) was combined with lactose (Oliveira et al., 2006)

or Tris (Zimmerman et al., 2007) extenders for freezing canine semen with results similar to

67

those of glycerol. Despite the importance of these initial studies, they are focused only on

subjective analysis and further objective investigations are suggested. Nowadays, computer-

assisted sperm analysis (CASA) has been included in the evaluation of semen and its use is

becoming more popular in andrological laboratories (Verstegen et al., 2002; Silva et al.,

2006). CASA allows an objective assessment of different cell characteristics such as motion

and velocity with high levels of precision and reliability (Verstegen et al., 2002).

The aim of this study was to compare the effect of DMF and glycerol for dog semen

cryopreservation on parameters of post-thaw motility and velocity evaluated by CASA, as

also on subjective progressive motility, sperm morphology, percentage of live cells, and

plasma membrane functional integrity.

2. Materials and methods

2.1. Animals

Five proven stud dogs (three American Pit Bull Terriers, one Bull Terrier and one

crossbreed) from private kennels of Mossoró, Brazil, were selected for this experiment. The

dogs, aged 1 to 6 years, were maintained in individual pens and fed dry food once daily, and

allowed free access to water.

2.2. Semen collection and initial evaluation

Two ejaculates were collected from each dog by manual stimulation at intervals of ten

days, and the sperm-rich fractions were analyzed. Semen volume and color were grossly

evaluated and sperm concentration was determined using a Neubauer counting chamber. The

68

percentage of progressive motile sperms was assessed subjectively using a light microscope

under 100x and 400x magnification. Bengal Rose-stained smears were prepared to evaluate

sperm morphology using light microscopy (1000x), counting 200 cells per slide. Percentage

of live spermatozoa was established by analyzing a slide stained with Bromophenol Blue

under a light microscope (400x), counting 200 cells per slide. For the evaluation of sperm

membrane function, samples were subjected to hypo-osmotic swelling (HOS) tests using the

distilled water (0 mOsmL) as the hypo-osmotic solution (Quintela et al., 2004). An aliquot of

semen (0.01 mL) was diluted in 0.09mL hypo-osmotic solution and kept in a water bath at

38ºC for 45 min. Evaluations were conducted under light microscopy (x400), counting 200

cells. Spermatozoa presenting swollen coiled tails were considered as presenting a functional

membrane.

2.3. Semen processing

The reagents used in this study were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,

USA). An extender consisting of 3.028g Tris-hydroxymethyl-aminomethane (Tris), 1.78g

monohydrated citric acid and 1.25g D-fructose dissolved in 100mL ultrapure water (Silva et

al., 2002) was used. The osmosis of this solution was 295mOsm/L and the pH 6.6. Twenty

percent of this solution was then replaced by egg-yolk (v/v). Each sperm-rich fraction of the

semen was initially extended by one part semen to a half-part egg yolk-Tris (EYT) at 27 ºC.

Semen was stored in a thermal box for 40 min aimed at reaching a temperature of 15ºC, at a

cooling rate of -0.30°C/min. Samples were then transferred to a refrigerator for a further 30

min, where they reached 4ºC at a cooling rate of -0.37°C/min. After so cooling them, the

semen samples were divided in two aliquots and each one was added to the other half-part of

the EYT plus 12% glycerol or 12% DMF also at a temperature of 4ºC, which culminated in a

69

final concentration of 6% cryoprotectant in the extender. The final dilution rate for both

aliquots was one part semen to one part extender (1:1). Progressive sperm were subjectively

reevaluated by light microscopy (100x) at this juncture. Samples were packed into 0.25mL

plastic straws, which were placed horizontally in a thermal box for 5 min, positioned 5cm

above the liquid nitrogen (N2) level, and reached a temperature close to -70ºC in the vapor.

Finally, the straws were immersed into liquid N2 for storage. After storage of one month,

samples were transferred to the Laboratory of Carnivore Reproduction of the State University

of Ceará (Fortaleza, Brazil) for thawing and further analysis. Samples were thawed in a water

bath at the rate of 38ºC/1 min and thereafter evaluated for subjective progressive sperm

motility, sperm morphology, percentage of live cells, HOS test and also by CASA.

2.4. Computer assisted semen analysis (CASA)

CASA was conducted according to Iguer-Ouada and Verstegen (2001). After thawing,

the semen samples (10 µL) were placed in a Makler chamber, allowed to settle for 1 min,

maintained at 38 ºC, and examined in a phase-contrast microcopy system with stroboscopic

illumination coupled to a video-camera adapted to the Sperm Class Analyzer (SCA version

3.2.0, Microptic S.L., Barcelona, Spain). Three different, non-consecutive, randomly selected

microscopic fields were scanned. The data were computerized and the mean value and

standard deviation (SD) determined. The parameters analyzed were total motility (%),

progressive motility (%), velocity average pathway (VAP, µm/sec), velocity straight line

(VSL, µm/sec), curvilinear velocity (VCL, µm/sec), amplitude of lateral head (ALH; µm),

beat cross frequency (BCF; Hz), straightness (STR, %) and linearity (LIN, %).

2.5 Statistical analysis

70

Ten replicates were performed for each treatment. The results were expressed as mean

values ± SD. Percentage data were arcsine-transformed before analysis. All data were

subjected to analysis of variance using the general linear model of the Statview software

package (Statview 5.0, SAS Institute Inc., Cary, USA).

Differences among fresh-, diluted-, cooled- and thawed semen on subjective motility

were detected by the Student t test. The effects of cryoprotectants on post-thaw data from

CASA as well as comparisons among fresh and frozen semen relating to sperm morphology,

percentage of live cells and functional membrane were also conducted by the Student t test.

The results were significant when P < 0.05.

To evaluate the individual dog effect and its interactions with effects of

cryoprotectants on the variables studied, data were analyzed by Fisher’s PSLD test (P < 0.05).

3. Results

The fresh dog semen was white-milky in color. The volume of the sperm-rich fraction

was 288 ± 21 µL, with a sperm concentration of 788 ± 621 x 106 sperm/mL. Evaluation of

subjective progressive motility is shown in Table 1. Differences between cryoprotectants were

only observed immediately after their addition to the cooled semen (P > 0.05).

The effect of cryoprotectants on sperm morphology, livability of sperm and functional

membrane integrity are shown in Table 2. Statistical differences between cryoprotectants

were verified only for the percentage of live sperm that was better preserved by the use of

glycerol (P < 0.05).

CASA data are presented in Table 3. Total sperm motility was 64.3 ± 24.6% and 52.3

± 23.6% for glycerol and DMF, respectively, ranging from 96.7 to 13.9% for glycerol, and

from 86.5 to 20.1% for DMF. Progressive motility was 11.9 ± 9.0% and 7.2 ± 6.8 % for

71

glycerol and DMF, respectively, ranging from 29.0 to 0.2% for glycerol, and from 17.8

to0.3% for DMF. No statistical differences between cryoprotective agents were observed

relating to sperm motion and velocity parameters (P > 0.05).

The effect of the individual dog was significant on total motility, VCL, VSL, VAP,

STR, ALH and sperm morphology (P < 0.05). Interactions between individual dog and

cryoprotectors were obtained for total- and progressive motility, VCL, VSL, VAP, STR,

membrane function and sperm motility.

4. Discussion

This study investigated the effect of DMF as an alternative cryoprotectant for canine

semen using the CASA. We demonstrate that DMF is similar to glycerol in preserving sperm

total and progressive motility after thawing. Results of total and progressive motility obtained

with DMF are also similar to those reported with the use of ethylene glycol as a

cryoprotectant for canine semen (Rota et al., 2006). Velocity parameters observed in this

study were lower than those reported in other studies on canine semen freezing (Rota et al.,

2006; Silva et al., 2006). The SCA system we adopted calculates velocity parameters based on

an average for slow-, medium- and rapid progressive sperm and the inclusion of a large

percentage of slow sperm reduced the values.

The cryoprotectant properties of glycerol and amides are achieved by different

mechanisms. Glycerol is an alcohol that contains three functional hydroxyl groups, which can

accept one hydrogen from the water molecule at six different binding sites. Hydroxyl radicals

of glycerol may sometimes bind among themselves reducing the probability of binding with

water molecules, which is undesirable due to the higher viscosity of the solution (Dalimata e

Graham, 1997). Otherwise, amides are formed by functional groups that contain nitrogen

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(NH–C=O) and interact with the water by binding their nitrogen and hydrogen content to the

hydrogen present in the water molecule. The highly hydrophilic nature of the amide molecule

allows a higher interaction with the water, which reduces the formation of intracellular ice

crystals. Due to their lower molecular weight (73.09) and viscosity in comparison to glycerol

(molecular weight 92.05), amides have higher membrane permeability, thereby decreasing the

possibility of cellular damage caused by osmotic stress (Ball and Vo, 2001). Moreover,

addition of the methyl (CH3) radical into the amide molecule increases its permeability

through the sperm cell membrane and improves the efficiency of its croprotective action

(Bianchi et al., 2008).

The effect of glycerol on canine semen freezing has been widely studied. It is known

that the glycerol concentration (Peña et al., 1998), the form of addition (Silva et al., 2003),

and the temperature of addition (Silva et al., 2006) are factors that can influence the quality of

frozen-thawed canine sperm. However, studies on the action of amides as cryoprotectants for

dog semen are few. Zimmerman et al. (2006) studied different concentrations of DMF in Tris

extender and found that 7% DMF promotes better post-thaw results than 3.5%. By contrast,

Oliveira et al. (2005) suggested that 5% DMF in lactose extender could efficiently preserve

canine semen quality after thawing. We chose to use 6% DMF that is a concentration similar

to that currently used for glycerol in Tris extender (Silva et al., 2006).

Chirinéia et al. (2006) reported the combined use of both cryoprotectants. He

compared results obtained with Tris added 8% glycerol to those obtained with a commercial

extender added to 3% glycerol plus 2% DMF, but like us, he observed no differences in

subjective motility, sperm morphology, and the HOS test. Previous studies reported for the

use of DMF alone showed average values of 46.7% and 45.0% for subjective motility with

the use of Tris- (Zimmerman et al., 2006) and lactose (Oliveira et al., 2005) extenders,

respectively. In our work, lower values of 27% progressive motile sperm evaluated

73

subjectively were found for DMF, but no statistical differences related to glycerol were

substantiated by subjective- or computerized evaluation.

The unique statistical difference between cryoprotectants verified was in the post-thaw

livability of sperm. Despite a majority of sperm being live with the use of glycerol, there were

no differences in functional parameters such as motility and functional membrane integrity

when compared to samples frozen with DMF. Although motility is only one of the many

important attributes of a fertile sperm, it is the primary parameter and continues to be the most

widely used indicator of sperm function. Motility is the manifestation of structural- and

functional competence of the sperm; thus, the percentage of progressively motile sperm is

usually positively correlated with that of plasma membrane integrity (Peña-Martinez, 2004).

However, a relationship between the HOS test response and fertilizing capacity of dog sperm

has not been established. Thus, it is suggested that in vitro- or in vivo fertility assays should

be conducted to further evaluate DMF performance.

It is well known that there is a marked difference among the semen samples of

individual dogs in their tolerance to cryopreservation (Yu et al., 2002) and this was also

confirmed by our data. We verified the presence of interactions between individual animals

and the cryoprotectant indicating that the freezability with glycerol or DMF was not similar

for all animals. CASA detected a total sperm motility varying from 96 to 13% with glycerol

and from 86 to 20% with DMF. This variance was verified for all the parameters evaluated

and could account for the large standard deviations found in the results. In stallions, the use of

amides provides an alternative to improved post-thaw motility and cell integrity of those

stallions called “bad freezers” whose semen freezes poorly when glycerol is used. Thus, it is

possible that the canine species could also consist of “good” and “bad freezers” and DMF

should be investigated in greater depth as an alternative for semen cryopreservation of “bad

freezer” dogs.

74

In conclusion, objective analysis performed with CASA showed that DMF could be

used as an alternative cyroprotectant for canine semen. The possibility that DMF could have

beneficial action for those individuals that present high sensitivity to glycerol exists. Studies

need to be conducted to further investigate the cryoprotective action of DMF of different

concentrations and its interactions with various extenders, fertility assays, and individual

dogs’ sensitivity to it.

Acknowledgements

The authors thank Laboratory of Goat and Ram Semen Technology and Laboratory of

Carnivore Reproduction / UECE for technical assistance.

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