Uso da Genômica para Melhoria da Sanidade

e Produção de Bovinos de Leite

Marcos Vinicius Barbosa da Silva Pesquisador em Bioinformática e Genômica

Embrapa Gado de Leite Canela-RS, 13/10/2016

O que é GENÔMICA?

• Genômica é uma subdisciplina da genética voltada para

–Mapeamento de genes,

–Sequenciamento ,

–Análises Funcionais.

• Inclui também estudos de fenômenos intragenômicos como heterose, epistasia, pleiotropia e outras interações entre locos

Genômica, Proteômica e Bioinformática

• Genômica: lida com sequências de DNA, organização, função e evolução dos genomas;

• Proteômica: auxilia na identificação de todas as proteínas na célula ou organismos, incluindo sua localização, função e interação;

• Bioinformática: conceituação da biologia em termos de moléculas e a aplicação de técnicas computacionais (uso intenso da matemática, ciência da computação e estatística) para entender e organizar as informações associadas à estas moléculas.

Genômica - Proteômica - Bioinformática

Biologia

Computacional

Bioinformática

Genoma

Proteoma

Genômica

funcional

Bioinformática

estrutural

Genômica - Linha do tempo

Genômica - Linha do tempo

6

Genoma Bovino: Sequenciamento e Anotação

Etapas do Sequenciamento

Bioinformática

Montagem do Genoma

Montagem Usando Genoma de Referência

Permitem que a herança seja seguida na região através das gerações

Single nucleotide polymorphisms (SNiP) são os marcadores do futuro!

Grande quantidade!

* 6-12 milhões no genoma!

Polimorfismo “poly” = muitas “morph” =

formas

94%

6%

Single nucleotide

polymorphism

(SNP)

População

Geral

Enfim, os SNPs

Marcadores Genéticos

Km 1000

Km 0

Km 250

Km 500

Km 750

Km 1000

Km 250

Km 0

Km 500

Km 750

Km 450

Km 445

Km 1000

Km 0

Km 250

Km 500

Km 750

Km 450

Km 445 Km 443

Desenvolvimento de ferramentas (chip de DNA)

- Affymetrix 10K chip - Affymetrix 25K chip - Illumina Bovine SNP50K chip - Illumina High-Density Bovine BeadChip (777K) - Affymetrix Axiom Genome-Wide BOS 1 Array (648K) - Affymetrix 3K, 6K - GeneSeek Genomic Profiler (GGP) LD (9K) e HD (78K) - GGP Indicus LD (20K) e HD (78K)

50K 777K 648K

Uso de microarranjos (chips) de DNA

Programas de avaliação e melhoramento: Seleção Genômica

Estudos de prospecção de genes de interesse: Genome-wide Association Study (GWAS)

Como

usar essa

ferramenta?

Seleção Genômica

Definição: seleção simultânea para vários (dezenas ou centenas de milhares) marcadores cobrindo de modo denso todo o genoma, de tal forma que todos os genes estejam em desequilíbrio de ligação com pelo menos alguns desses marcadores

Apresentada por Meuwissen et al. (2001)

Coleta dos dados fenotípicos dos animais (produção e composição do leite, pesos às diversas idades etc.)

Predição do mérito genético dos indivíduos

Seleção dos animais superiores como pais da futura geração

Predição do Mérito Genético

Fenótipo

Pedigree

Metodologia

Estatística

Antiga “caixa-preta”

Programas de Seleção Tradicional em Bovinos

Melhoramento Tradicional - Resultados

Ano de nascimento

Início do Programa

Programa Nacional de Melhoramento do Gir Leiteiro

Início do Programa

Ano de nascimento

Início do Programa

Ano de nascimento

Início do Programa

Ano de nascimento

Início do Programa Início do Programa

Ano de nascimento Ano de nascimento

Fonte: Embrapa Gado de Leite

Genótipo!!

Nova e melhor!!

Fenótipo

Predição do Mérito Genético

Pedigree??

Seleção Genômica

Seleção Genômica

Prof. Fabyano Fonseca (UFV)

Seleção Genômica

Prof. Fabyano Fonseca (UFV)

Seleção Genômica em Raças Leiteiras no Brasil

Objetivos

✓Implementar a seleção genômica nas raças Gir Leiteiro, Girolando e Guzerá de modo a potencializar os resultados do TP;

✓Identificar genes associados às características de importância econômica;

Material e Recursos Disponíveis

✓ Financiamento: Embrapa, CNPq e Fapemig = 1,6 Milhão

✓ Genótipos e fenótipos:

- 3.100 animais

✴ 2.500 animais genotipados com Bovine SNP 50k chip

✴ 600 animais genotipados Illumina High-Density Bovine BeadChip (777k)

Resultados no Gir Leiteiro

Correção de Erros de Parentesco

Mãe Animal Pai Provável Pai

Endogamia Genômica vs. Pedigree

Touro Pedigree F (%) Genômica F (%)

Soberano FIV Badajós 3,1 36,9

Losaiko TE da Palma 0,0 29,9

SC Urutu Relógio 8,6 29,2

Diamante TE de Brasília 7,5 6,4

FB Macuco 25,0 23,0

Major TE dos Poções 25,0 13,0

Confiabilidades comparando predição genômica e método tradicional

Confiabilidade

Tradicional Genômico Genômico

Característica PA Realizado Ganho

Leite 38 63 25

Gordura 35 57 22

Proteína 35 55 20

IPP 38 62 24

Acurácias dos Valores Genômicos

Novo Modo de Responder à Uma Antiga Questão!!!

✓Qual dos bezerros candidatos ao teste de progênie é o melhor??

Projeto 03.13.05.004.00.00 Coordenador: Luiz Sérgio Camargo

• Estudo da viabilidade da técnica de biópsia embrionária e genotipagem visando a seleção genômica e diagnóstico de anomalias cromossômicas em sistemas de produção in vitro de embriões bovinos

Biopsias embrionárias

Biopsias feitas a mão

» Embriões em D7 pós-fecundação

»Blastocistos somente

Desenvolvimento in vitro de embriões biopsiados no D7 pós-

fecundação e avaliados 24h após (D8). Embriões progredindo

um estádio. Biop: n=42; Cont: n=46. GI, GII e GIII: qualidade

embrionária – Excelente, bom e regular, respectivamente

%

0,

22,5

45,

67,5

90,

112,5

D8 (24h) GI+GII (D8) GIII (D8)

Biopsia

Controle

Genome-wide Association Studies

Definição: Estudos nos quais são usados mapas densos de marcadores genéticos objetivando detectar associação entre as freqüências dos genótipos e as características complexas e/ou quantitativas.

Mapeamento de Genes - GWAS

Leite Gordura

Proteína

34

Característica BTA Genes SNP Posição P-value

Produção de Leite

10 DIO2 Hapmap32392-BTA-162780 92440993 4.40e-07

21 CRTC3 Hapmap48373-BTA-51706 22520337 6.77e-06

15 NCAM1 ARS-BFGL-NGS-23028 23970148 1.39e-05

1 EPHB1 ARS-BFGL-NGS-2595 135444745 2.13e-05

5 SYT1 BTB-00219231 8978484 2.13e-05

Produção de Gordura

10 DIO2 Hapmap32392-BTA-162780 92440993 2.57e-06

1 NCAM2 ARS-BFGL-NGS-102441 15071831 4.61e-05

1 EPHB1 ARS-BFGL-NGS-2595 135444745 6.56e-05

14 LOC100139328 ARS-BFGL-NGS-116233 19316702 6.78e-05

1 TOPBP1 BTB-00040439 136868487 8.01e-05

Produção de Proteína

10 DIO2 Hapmap32392-BTA-162780 92440993 1.84e-07

21 CRTC3 Hapmap48373-BTA-51706 22520337 1.47e-05

19 GLOD4 ARS-BFGL-NGS-84530 22650660 7.58e-05

22 ITIH4 Hapmap26665-BTA-136771 48628872 7.61e-05

14 LOC782102 UA-IFASA-5275 55954337 1.30e-04

Genômica Aplicada à Saúde Animal

Prevenção é o melhor modo de se lutar contra uma doença!

Animais selecionados para saúde e bem-estar estão relacionados ao aumento da qualidade e seguraça dos alimentos!

Saúde animal e segurança alimentar são as preocupações primárias do consumidor

Genômica Aplicada à Saúde Animal

Entendimento do Problema Tendência do Aparecimento de Doenças nos EUA

1991 a 2007

Entendimento do Problema Tendência do Aparecimento de Doenças no Canadá

Por que as características de saúde em rebanhos leiteiros são difíceis de serem

melhoradas?

Características de baixa herdabilidade

Quase não são incluídas em índices de seleção (Canadá incluiu mastite em Ago 2014)

Baixa qualidade dos dados e inconsistência dos diagnósticos e registro das doenças

Seleção para uma doença pode ser contra-produtiva para outras doenças

Genômica Aplicada à Saúde Animal

Como auxiliar os estudos em saúde animal?

Sequenciamento de genomas, incluindo montagem, anotação e reconstrução de network metabólicas (To Make a Vaccine, First Sequence a

Genome -“Sequencing the genome of a pathogen "is an extremely effective approach for developing

vaccines”. Guido Grandi, Biochemistry and Molecular Biology Unit of Chiron in Italy.;

Análises comparativas de múltiplos genomas;

Análises de microarranjos de DNA e de expressão;

Combinação de Bioinformática e Quimioinformática:

ex.: identificação de proteínas alvo servindo como pontos de ataque molecular para drogas parasitárias;

Genômica Aplicada à Saúde Animal Estudos relacionados às doenças:

Metabólicas

Carenciais

Reprodutivas

Parasitárias

Infecciosas

Como a genômica pode auxiliar?

Como a genômica pode auxiliar?

Work at the Roslin Institute at the Univerity of Edinburgh found some degree of bovine TB resistance is inherited, with genetic markers associated with resistance also identified. Liz Glass who led the research said the results mean it could be possible to selectively breed cows which are more resistant to the disease.“Over the last two years it has become clear there is variation in cattle response to TB and that there is a substantial genetic component”.

Estudos clínico-andrológico e genético-molecular subfertilidade em touros da raça Gir Leiteiro

no Estado de Minas Gerais

Moura, Guilherme Silva; Fonseca, Pablo Augusto.S; Santos, Fernanda C; Santos, Daniel J.; Rosse, Izinara C; Andrade, Venício J.; Silva, Marcos Vinícius G. B; Vale Filho, Vicente Ribeiro; Carvalho, Maria Raquel S

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

ESCOLA DE VETERINÁRIA

Seleção dos Animais e Caracterização de 27 Fenótipos

Largura do testículo direito

16 X

MARCADOR CROM. POSIÇÃO GENE PRÓXIMO FENÓTIPO VALOR P (LOG-

10)

AX-19223523

AX-19223529 11

45666752

45668127 TTL

Defeitos menores;

Cauda dobrada

5,42

5,26

AX-1917977 11 34729272 CHAC2

Motilidade

progressiva;

Vigor espermático

5,66

4,99

AX-21140863 16 69872262 KCNK2 Acrossomo

defeituoso 5,03

AX-28113641

AX-28113325 X

13449847

13297652 OCRL

Contorno anormal

sptz;

Comprimento TD;

Largura TD

6,68

5,53

5,05

AX-28118988 X 15519311 MST4 Contorno anormal 6,68

AX-24562102 X 20561719 LRRTM3 Contorno anormal

sptz 5,06

AX-28265277 X 91003802 ARAF Contorno anormal

sptz; 5,28

AX-28303957

AX-28303964

AX-28304069

X 109755647 MIR2488 Comprimento TD

Largura TD

6,68 5,19 5,05

AX-28361541 X 133038305 NHS Comprimento TD

Largura TD

6,68

5,05

Identificação de famílias e de indivíduos portadores de anomalias

51

Lábio leporino Anoftalmia e exoftalmia

Hérnias umbilical e inguinal

Ausência de cauda

Agnatismo e prognatismo

Hipo/Hiperplasia gonadal

Encurtamento de tendão

Avaliação do Modelo de Glândula Mamária Extracorpórea para Estudos de Expressão Gênica

Relacionada à Resposta à Mastite

Projeto Edital MCT/CNPq 014/2011 - Universal Coordenador: Marta Martins

Isolamento e Manutenção da Glândula

- Úberes de vacas em lactação abatidas foram colhidos. - Entre 10 a 15 minutos após o abate, foi administrado via artéria pudenda solução de Tyrode e heparina para impedir formação de coágulos dentro dos vasos e consequente obstrução. - As glândulas foram então transportadas para o laboratório em caixas isotérmicas refrigeradas. - O sistema extracorpóreo foi preparado, fixando os úberes mimetizando a posição ortostática em um

suporte. - As artérias e veias maiores foram canuladas e perfundidas

Inoculação

Inóculo - S. agalactiae Coleção de Culturas de Micro-organismos Causadores de Mastite mantida na Embrapa Gado de Leite.

Colheita do tecido

0 e 3 horas

Extração do RNA

Quatro tetos (2 inoculados e 2 não inoculados).

Pool de amostras dos dois tetos inoculados

Pool de amostras dois tetos não inoculados

“Carpe diem…”

Marcos Vinicius Barbosa da Silva

marcos.vb.silva@embrapa.br

• Intersecção

Resultados do RNA-Seq

Resultados do RNA-Seq Número de acesso Termo N* P-value Bonferroni Benjamini FDR

Processo Biológico

GO:0045087 Resposta imune inata 45 5,70E-05 0,01 0,01 0,01

GO:0006954 Resposta inflamatória 42 5,00E-05 0,14 0,07 0,09

GO:0008284 Regulação positiva da proliferação celular 33 6,70E-04 0,87 0,5 1,2

GO:0042493 Resposta à droga 15 9,80E-04 0,95 0,53 1,8

GO:0019433 Catabolismo de triglicerídeos 7 1,40E-03 0,99 0,58 2,5

GO:0050729 Regulação positiva da resposta inflamatória 13 3,10E-03 1 0,79 5,4

GO:0006749 Metabolismo de glutationa 10 4,40E-03 1 0,86 7,7

GO:0007229 Via de sinalização mediada por integrina 10 4,40E-03 1 0,86 7,7

GO:0032760 Regulação positiva de produção do fator de necrose de

tumor 10 4,40E-03 1 0,86 7,7

GO:0030199 Organização de fibrilas de colágeno 9 5,90E-03 1 0,9 10

GO:0007155 Adesão celular 34 6,90E-03 1 0,91 10,2

GO:0045766 Regulação positiva da angiogênese 13 7,70E-03 1 0,91 10,3

- A genômica tem sido de grande importância para o avanço do melhoramento genético de bovinos;

- Alguns países como EUA, Canadá, NZ, Holanda e Fraça, já entregam aos produtores as avaliações genômicas para bovinos, reduzindo o tempo de avaliação de reprodutores e maximizando os ganhos genéticos;

- O uso dos sequenciamentos de DNA e RNA têm possibilitado o mapeamento de genes ligados às características produtivas e aquelas ligadas a saúde animal, que deverão ser incluídas em programas de seleção de raças bovinas leiteiras.

Conclusões

“Carpe diem…”

Marcos Vinicius Barbosa da Silva

marcos.vb.silva@embrapa.br