Embed Size (px)
Citation preview
![Page 1: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/1.jpg)
431
Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v28i2.12053
1 Laboratorio de Enfermedades Emergentes y Reemergentes, Centro de Investigaciones Regionales «Dr.Hideyo Noguchi», Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, Yucatán, México
2 Proyecto «Impulso Científico Universitario», 3 Proyecto «Savia», Secretaría de Investigación, Inno-vación y Educación Superior, Mérida, Yucatán, México
4 Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad Autónoma de Yucatán, X’matkuil,Yucatán, México
5 E-mail: [email protected]
Recibido: 20 de junio de 2016Aceptado para publicación: 30 de noviembre de 2016
Detección Molecular de Flavivirus en Suero Sanguíneo deRoedores Capturados en Yucatán, México
MOLECULAR DETECTION OF FLAVIVIRUS IN BLOOD SERUM OF RODENTS CAPTURED
IN YUCATÁN, MEXICO
Marco Torres-Castro1,5, Martha Poot-Pérez2, Carlos Moguel-Lehmer3,Bibiana Reyes-Hernández3, Alonso Panti-May4, Henry Noh-Pech1,
Silvia Hernández-Betancourt4, Nicolás Medina-Espinosa3,Fernando I. Puerto1
RESUMEN
El objetivo de la presente investigación fue estudiar la presencia de flavivirus enroedores de Yucatán, México, mediante una prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR), en su variante semi-anidada. Se capturaron 90 roedores (87 Rattus rattus, dosHeteromys gaumeri y un Mus musculus) y se les recolectó una muestra de sangre. Las 90muestras de suero resultantes fueron agrupadas en 30 triadas (pooles). La PCR semi-anidada arrojó una frecuencia de positividad del 33.3% (10/30).
Palabras clave: Rattus rattus, Flavivirus, Yucatán, México
ABSTRACT
The aim of this investigation was to study the presence of flaviviruses in rodentsfrom Yucatan, Mexico, by the Polymerase Chain Reaction (PCR) in the semi-nested variant.Ninety rodents were captured (87 Rattus rattus, two Heteromys gaumeri and one Musmusculus), and blood samples were collected. The resulting serum samples were groupedinto 30 triads (pools). The semi-nested PCR yielded a positivity frequency of 33.3%(10/30).
Key words: Rattus rattus, Flavivirus, Yucatan, Mexico
![Page 2: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/2.jpg)
Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438432
M.Torres-Castro et al.
INTRODUCCIÓN
Los arbovirus (del inglés arthropod-borne viruses) son responsables de cercadel 23% de las enfermedades emergenteszoonóticas a nivel mundial. Dentro de estosvirus, los cuales son exclusivamente transmi-tidos por la picadura de insectos hematófagoscomo mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos,etc., se encuentran diversas especies perte-necientes al género Flavivirus, como el vi-rus Dengue (DENV), el virus Zika (ZIKV),el virus de la Fiebre Amarilla (YFV) y el vi-rus de la Fiebre Japonesa (JFV), entre otros(Jones et al., 2008).
El género Flavivirus pertenece a la fa-milia Flaviviridae y engloba a un conjunto devirus que comparten un genoma ARN línealde cadena sencilla y polaridad positiva, conuna longitud de 9.5 a 12.3 kilobases. Estegénero contiene más de 40 virus patogénicos,a los cuales se asocian miles de centenas demuertes en seres humanos y animales a nivelmundial (Yan-Jang et al., 2014).
Los roedores son reservorios u hospe-deros de numerosos patógenos zoonóticos,entre ellos distintos flavivirus (Mansfield etal., 2009). Su importancia epidemiológica ra-dica en su alta tasa reproductiva y su rápidaadaptación a hábitats de amplias áreas tropi-cales y templadas, logrando introducir diver-sos patógenos a los ciclos de transmisión ur-banos, expandiendo considerablemente el áreaendémica de muchas enfermedades infeccio-sas (Meerburg et al., 2009). Los roedorestambién representan una fuente importantede alimentación para insectos vectores, prin-cipalmente mosquitos y ectoparásitos.
En Yucatán, México, las especies deroedores más abundantes en ambientes do-mésticos y peridomésticos son el ratón do-méstico (Mus musculus) y la rata negra(Rattus rattus) (Panti-May et al., 2012,2016). Asimismo, estos roedores puedeninteractuar con especies nativas (por ejem-plo, Heteromys gaumeri y Ototylomys
phyllotis) que abundan en localidades rura-les o suburbanas, y que han sido identifica-das en estudios recientes en entornosperidomésticos y domésticos (Panti-May etal., 2015; Zaragoza-Quintana et al., 2016).
Un par de investigaciones serológicas ymoleculares han evidenciado la exposición adistintos flavivirus en roedores sinantrópicosM. musculus y R. rattus capturados en laciudad de Mérida, Yucatán, México(Machain-Williams, 2015; Cigarroa-Toledo etal., 2016). Es por ello que el presente estudioinvolucra, además de individuos capturadosen ambientes urbanos, a roedores captura-dos en comunidades rurales y en un ambien-te semi-conservado. El objetivo de la presen-te investigación fue estudiar la circulación deFlavivirus en muestras séricas de roedoressinantrópicos y silvestres, capturados enYucatán, a través de una prueba de Reac-ción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ensu variante semi-anidada y contribuir en elconocimiento del ciclo epidemiológico de losflavivirus en la región.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de Estudio y Captura
La captura de roedores se realizó en losbarrios de Plan de Ayala Sur (PAS) y SanJosé Tecoh (SJT), pertenecientes a la ciudadde Mérida (20°58’04’’N, 89°37’18’’O), losmunicipios rurales de Opichén (20°32’59’’N,89°51’25’’O) y Tixméhuac (20°14’07’’,89°06’30’’O), y el Rancho Hobonil, el cualcorresponde al municipio de Tzucacab(20°01’38’’N, 89°00’40’’O). Todos los sitiosde muestreo se encuentran ubicados en elEstado de Yucatán, México.
Los sitios de captura comparten unatemperatura promedio anual de 26-27 °C.Asimismo, en SJT, PAS, Opichén yTixméhuac, se observan distintos grados depobreza y grandes cantidades de desechosorgánicos e inorgánicos en las calles y patios
![Page 3: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/3.jpg)
433Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438
Detección molecular de Flavivirus en roedores
de las casas. En Mérida, el uso del suelo seda principalmente para asentamientos urba-nos, contrario a lo que sucede en Opichén,Tixméhuac y el Rancho Hobonil, donde lamayoría del terreno se utiliza para ganaderíay agricultura (INEGI, 2015).
Captura y Manejo de los Roedores
La captura, manejo y sacrificio de losindividuos utilizados en el estudio se llevó acabo según los lineamientos y estatutos de laAmerican Society of Mammalogists (ASM)y la American Veterinary MedicalAssociation (AVMA), y con la autorizaciónde la Secretaría del Medio Ambiente y Re-cursos Naturales (SEMARNAT) de México(Licencia SGPA/DGVS/02528/13).
Los barrios SJT y PAS fueron divididosen «manzanas» (con un área aproximada de10 000 m2) y en cada una se escogió porconveniencia una casa, bajo el criterio decontar con la aprobación de los propietariospara participar en el estudio; resultando untotal de 30 casas por barrio. El muestreo serealizó de mayo a octubre de 2013 (corres-pondiente a la época de lluvias). En Opichény Tixméhuac se realizó una división de todoel asentimiento urbano, trazando dos ejes ima-ginarios que cruzaron por el centro de la po-blación, dividendo el área en cuatro cuadran-tes, en los cuales se escogieron 50 casas porconveniencia (se contó con la aprobación delos propietarios). El muestreo se condujo enagosto y noviembre de 2013. En el ranchoHobonil se colocaron 120 trampas Sherman(7.5 x 23 x 9 cm; HB Sherman Traps Inc®,Florida, EEUU) en áreas de cultivo y bordesde selva baja sub-caducifolia en recupera-ción.
Las casas seleccionadas en PAS, SJT,Opichén y Tixméhuac se muestrearon sema-nalmente, durante tres noches consecutivas,por tres semanas de cada mes. En cada casase colocaron seis trampas Sherman distribui-das en el interior de la vivienda y el patio.Las trampas eran ubicadas por las mañanas
en lugares como armarios, cocina, baños,cuartos, pasillos, además de los sitios dondelos dueños mencionaron la presencia de roe-dores, y en potenciales fuentes de alimento.Las trampas fueron cebadas con una mezclade hojuelas de vainilla y saborizante artificialde vainilla. Las trampas eran revisadas al díasiguiente y aquellas que tenían capturas eranretiradas y substituidas por una vacía y colo-cada en el mismo sitio.
Todos los participantes del estudio fue-ron comunicados de manera verbal el poten-cial peligro que representaba el manipular lastrampas o los animales capturados en ellas.
Toma de Muestras
Los roedores capturados fueron trasla-dados al Laboratorio de Parasitología delCampus de Ciencias Biológicas yAgropecuarias (CCBA) de la UniversidadAutónoma de Yucatán (UADY). Las espe-cies de los roedores capturados fueron iden-tificadas por biólogos y médicos veterinarioszootecnistas con amplio conocimiento en pe-queños mamíferos de la región y bajo los cri-terios seguidos en investigaciones previas(Torres-Castro et al., 2014; Panti-May et al.,2012, 2015, 2016). Se registró la edad y elsexo (datos no mostrados). Posteriormentese les practicó la eutanasia por dislocacióncervical, previa anestesia con pentobarbitalsódico, vía intraperitoneal.
La toma de muestras se realizó durantela anestesia del animal. Sangre completa(aproximadamente 300 µl) se extrajo víaintracardiaca con ayuda de jeringas de insulinade 1 ml (Terumo Medical Corporation®, To-kio, Japón) y se depositó en criotubos sinanticoagulante de 2 ml (CorningIncorporated®, Nueva York, EEUU). Lasmuestras se dejaron reposar a 4 °C y se re-colectó el sobrenadante (suero), depositán-dose en tubos para microcentrífuga de 1.5 ml(Eppendorf®, Hamburgo, Alemania). Lasmuestras séricas fueron conservadas a -70 °Chasta su utilización en la extracción de ARN.
![Page 4: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/4.jpg)
Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438434
M.Torres-Castro et al.
Extracción de ARN y Síntesis de ADNComplementario
Previo a la extracción de ARN, lasmuestras se organizaron en 30 pooles, loscuales contenían sueros de tres individuos.Se tomaron 50 µl de cada muestra para unvolumen total de 150 µl por pool. Los suerosprovenientes de los individuos H. gaumeri(2) y M. musculus (1) se procesaron en elmismo pool.
El ARN se extrajo con ayuda delQIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN®,Hilden, Alemania), siguiendo las especifica-ciones de la casa comercial. El ARN viralextraído sirvió para la síntesis de ADN com-plementario (cDNA), proceso que se realizócon el kit RevertAid H Minus First StrandcDNA Synthesis (Thermo Scientific®,Waltham, Massachusetts, EEUU), según elprotocolo establecido por el proveedor. Losproductos fueron conservados a -70 °C has-ta su empleo en la detección molecular deflavivirus por PCR semi-anidada.
PCR Semi-anidada
La detección molecular de flavivirus serealizó por medio de una PCR semi-anidadacon el objetivo de identificar un fragmento dela región NS5, ampliamente conservada envirus del género Flavivirus (Fulop et al.,1993).
En la primera reacción se emplearon loscebadores cFD2 (5’-GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3’), descrito por Kuno(1998) y MAMD (5’-AACATGATGGGRAARAGRGARAA-3’), descrito por Scara-mozzino et al. (2001). Los reactivos utiliza-dos tuvieron las siguientes concentracionesfinales: 10X Buffer, 25 mM de MgCl
2, 10 mM
de dNTP’s, 10 µM de cada cebador, 1U deTaq polimerasa (Thermo Scientific, Waltham,Massachusetts, EEUU) y agua, hasta com-pletar 25 µl de volumen final. Las condicio-nes en el termociclador fueron: desnatura-lización inicial de 95 °C durante 4 min, segui-
da de 25 ciclos con fases de 94 °C por 1 min,53 °C por 1 min y 72 °C durante 1 min. Laextensión final a 72 °C durante 5 min.
Para la segunda reacción, se conservóel cebador cFD2 y se empleó el cebadorFS778 (5’-AARGGHAGYMCDGCHA-THTGGT-3’), descrito por Scaramozzino etal. (2001). Los reactivos empleados en estareacción tuvieron las mismas concentracio-nes que en la primera. Las condiciones en eltermociclador fueron similares, a excepciónde la temperatura de alineamiento que en estareacción fue de 54 °C. El tamaño del amplifi-cado final fue de 250 pb.
Todas las reacciones incluyeron un con-trol positivo (cDNA de un cultivo de DENV,amablemente donado por el Dr. CarlosMachain-Williams) y un control negativo queconsistió en agua estéril.
La electroforesis de los productos de laPCR semi-anidada se realizó en geles deagarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio.Para la visualización se empleó unfotodocumentador (Biorad®, California,EEUU).
RESULTADOS
Se capturaron 90 individuos: 87 R.rattus, dos H. gaumeri y un M. musculus.En el Cuadro 1 se presenta las especies y elnúmero de roedores capturados por sitio deestudio. Los roedores capturados no presen-taron signos clínicos de enfermedad a la ins-pección externa.
La PCR semi-anidada para la identifi-cación de Flavivirus, arrojó una positividaddel 33.3% (10/30) (Figura 1). Esta figuramuestra algunos de los pooles positivos parala reacción molecular. Todos los pooles po-sitivos estuvieron conformados con sueros deR. rattus. El número y sitio de captura de losindividuos cuyos sueros conformaron lospooles positivos, se sintetizan en el Cuadro 2.
![Page 5: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/5.jpg)
435Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438
Detección molecular de Flavivirus en roedores
Cuadro 1. Especies y número de roedores capturados por sitio de muestreo considerado en el estudio
Sitio de estudio Especie Roedores capturados
N.° %
San José Tecoh Rattus rattus 23 25
Plan de Ayala Sur Rattus rattus 52 58
Tixméhuac Mus musculus 1 1
Rattus rattus 6 7
Opichén Rattus rattus 6 7
Rancho Hobonil Heteromys gaumeri 2 2
Total 90 100
Cuadro 2. Especie, número y sitio de captura de los roedores cuyos sueros estuvieron contenidos en los 10 pooles positivos a Flavivirus por PCR semi-anidada
Sitio de muestreo Especie Sueros
N.° %
San José Tecoh Rattus rattus 9 30
Plan de Ayala Sur Rattus rattus 17 56
Tixméhuac Rattus rattus 2 7
Opichén Rattus rattus 2 7
Total 30 100
DISCUSIÓN
Los resultados positivos de la PCR semi-anidada comprueban la exposición de la es-pecie sinantrópica R. rattus a virus pertene-cientes al género Flavivirus. Machain-Williams (2015) reportaron la circulación deflavivirus en muestras de órganos recolecta-dos de R. rattus capturados en la ciudad deMérida, Yucatán, empleando la misma técni-ca molecular. La presencia de roedoressinantrópicos positivos a flavivirus en ambien-tes urbanos y rurales y su contacto con ani-
males domésticos, habitantes de los sitios deestudio, y también con insectos vectores, losposiciona como potenciales riesgos para lasalud pública y veterinaria de la región.
Aunque las especies de mamíferos sonconsideradas como hospederos o reservoriosfinales de distintos flavivirus, la viremia esusualmente de corta duración y se mantienepor debajo del umbral necesario para infec-tar nuevos insectos vectores (Blitvich, 2008).La prueba molecular empleada en el presen-te estudio arrojó un 33.3% (10/30) depositividad en sueros sanguíneos con respec-
![Page 6: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/6.jpg)
Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438436
M.Torres-Castro et al.
to a los pooles. Por otro lado, si se consideraque cada pool estuvo conformado por sue-ros de tres roedores, se puede afirmar que,al menos, 10 individuos eran positivos a flavi-virus, lo que se traduce en un 11.1% (10/90)de positividad con respecto a la muestra ori-ginal.
Todos los pooles positivos en este es-tudio estuvieron conformados por sueros deR. rattus. El bajo número de captura de ejem-plares de M. musculus y H. gaumeri tuvocomo consecuencia que los resultados nosean suficientes para comparar con trabajosprevios. No obstante, Machain-Williams(2015) estableció un porcentaje de positividadde 1.7 para la especie M. musculus. No seencontraron reportes previos de la circula-ción de flavivirus para la especie H. gaumeri.
Se dispone de escasas investigacionesde flavivirus en roedores de México. EnYucatán, además del estudio de Machain-
Williams (2015). Cigarroa-Toledo et al. (2016)reportaron 65% de prevalencia serológica enR. rattus y 15.1% en M. musculus captura-dos en la ciudad de Mérida. Por otra parte, lapresencia de flavivirus también ha sido evi-denciada en otras especies de animales de laregión, como murciélagos (Machain-Williamset al., 2013), aves (Farfán-Ale et al., 2004;Chaves et al., 2016) y caballos (Loroño-Pinoet al., 2003, 2010), utilizando técnicasdiagnósticas serológicas y moleculares. Deigual forma, varios flavivirus han sido identi-ficados en numerosas especies de mosquitoscapturados en ambientes domésticos y silves-tres (Farfán-Ale et al., 2009, 2010). Estasinvestigaciones ponen en evidencia la impor-tancia que tienen los reservorios, hospederosy vectores en la epidemiología de las enfer-medades ocasionadas por flavivirus en habi-tantes y animales domésticos de Yucatán.
En el presente estudio no se realizó lasecuenciación de los amplicones positivos a
Figura 1. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio, mostrando algunos productospositivos de 250 pb obtenidos en la PCR semi-anidada (C+: control positivo; C-: con-trol negativo; pb: pares de bases; 22, 23 y 24: pooles positivos)
![Page 7: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/7.jpg)
437Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438
Detección molecular de Flavivirus en roedores
la PCR semi-anidada ni el posterior análisisde alineamiento, por lo que no fue posibleidentificar la(s) especie(s) de flavivirus quecircula(n) en los individuos capturados. Tam-bién, al no realizarse PCR individuales, no seconoce el verdadero número de individuospositivos.
CONCLUSIONES
Se determinó la exposición de la espe-cie sinantrópica R. rattus a flavivirus circu-lantes en Yucatán, México.
Agradecimientos
Sinceras gracias al Laboratorio deArbovirología del Centro de InvestigacionesRegionales «Dr. Hideyo Noguchi» por la do-nación de los cebadores utilizados en el pre-sente estudio. Además, a Analilia SolísHernández, Josué Sulú y Lorenzo Sodá porsu invaluable trabajo de campo. El estudiofue realizado por estudiantes de los proyec-tos «Savia» e «Impulso Científico Universi-tario» de la Secretaría de Investigación, In-novación y Educación Superior del Gobiernodel Estado de Yucatán.
LITERATURA CITADA
1. Blitvich BJ. 2008. Transmissiondynamics and changing epidemiology ofWest Nile Virus. Anim Health Res Rev9: 71-86. doi: 10.1017/S146625230-7001430
2. Cigarroa-Toledo N, Talavera-AguilarLG, Baak-Baak CM, García-RejónJE, Hernández-Betancourt S, BlitvichBJ, Machain-Williams C. 2016.Serologic evidence of Flavivirusinfections in peridomestic rodents inMerida, Mexico. J Wildl Dis 52: 168-172.doi: 10.7589/2015-05-116.
3. Chaves A, Sotomayor-Bonilla J,Monge O, Ramírez A, Galindo F, Sar-miento-Silva RE, et al. 2016. West Nile
Virus in resident birds from Yucatan,Mexico. J Wildl Dis 52: 159-163. doi:10.7589/2015-02-046
4. Farfán-Ale JA, Blitvich BJ, Loroño-Pino MA, Marlenee NL, Rosado-Pa-redes E, García-Rejó JE, et al. 2004.Longitudinal studies of West Nile Virusinfection in avians, Yucatán State,Mexico. Vector Borne Zoonotic Dis 4:3-14.
5. Farfán-Ale JA, Loroño-Pino MA,García-Rejón JE, Hovav E, PowersAM, Lin M, et al. 2009. Detection ofRNA from a novel West Nile-like virusand high prevalence of an insect-specificflavivirus in mosquitoes in the YucatanPeninsula of Mexico. Am J Trop MedHyg 80(1): 85-95.
6. Farfán-Ale JA, Loroño-Pino MA,García-Rejón JE, Soto V, Staley M,Dorman KS, et al. 2010. Detection offlaviviruses and orthobunyaviruses inmosquitoes in the Yucatan Peninsula ofMexico in 2008. Vector Borne ZoonoticDis 10: 777-783. doi: 10.1089/vbz.2009.0196
7. Fulop L, Barrett A, Phillpotts R,Martin K, Leslie D, Titball R. 1993.Rapid identification of flaviviruses basedon conserved NS5 sequences. J VirolMethods 44(2-3): 179-188.
8. [INEGI] Instituto Nacional de Geo-grafía e Historia. 2015. [Internet]. Dis-ponible en: http://www.inegi.org.mx/
9. Jones KE, Patel NG, Levy MS,Storeygard A, Balk D, Gittleman JL,Daszak P. 2008. Global trends inemerging infectious diseases. Nature451: 990-993. doi: 10.1038/nature06536
10. Kuno G. 1998. Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses. J VirolMethods 72: 27-41. doi: 10.1016/S0166-0934(98)00003-2
11. Loroño-Pino MA, Blitvich BJ, Farfán-Ale JA, Puerto FI, Blanco JM,Marlenee NL, et al. 2003. Serologicevidence of West Nile Virus infection inhorses, Yucatan State, Mexico. EmergInfect Dis 9: 857-859. doi: 10.3201/eid0907.030166
![Page 8: v D } o µ o & o À ] À ] µ v ^ µ } ^ v P µ v } Z - SciELO · gh krmxhodv gh ydlqlood \ vderul]dqwh duwlilfldo gh ydlqlood /dv wudpsdv hudq uhylvdgdv do gtd vljxlhqwh \ dtxhoodv](https://reader035.document.onl/reader035/viewer/2022081502/5f036c4e7e708231d4092212/html5/thumbnails/8.jpg)
Rev Inv Vet Perú 2017; 28(2): 431-438438
M.Torres-Castro et al.
12. Loroño-Pino MA, Farfán-Ale JA,García-Rejón JE, Lin M, Rosado-Pa-redes E, Puerto FI, et al. 2010.Antibodies to influenza and West NileVirus in horses in Mexico. Vet Rec 166:22-23. doi: 10.1136/vr.b5586
13. Machain-Williams C, López-Uribe M,Talavera-Aguilar L, Carrillo-Navarrete J, Vera-Escalante L, Puer-to-Manzano F, et al. 2013. Serologicevidence of Flavivirus infection in batsin the Yucatan Peninsula of Mexico. JWildl Dis 49: 684-689. doi: 10.7589/2012-12-318
14. Machain-Williams CI. 2015. Isolationsand characterization of arthropod-borneviruses rodents in Merida city, Mexico.ISID NEWS. [Internet]. Disponible en:h t tp: / /www.is id .org/downloads /p r o g r a m s / G r a n t % 2 0 R e p o r t s /2011_MACHAIN-WILLIAMS.pdf
15. Mansfield KL, Johnson N, Phipps LP,Stephenson JR, Fooks AR, Solomon T.2009. Tick-borne encephalitis virus – areview of an emerging zoonosis. J GenVirol 90: 1781-1794. doi: 10.1099/vir.0.011437-0
16. Meerburg BG, Singleton GR, KijlstraA. 2009. Rodent-borne diseases andtheir risks for public health. Crit RevMicrobiol 35: 221-270. doi: 10.1080/10408410902989837
17. Panti-May JA, Hernández-BetancourtSF, Ruíz-Piña H, Medina-Peralta S.2012. Abundance and populationparameters of commensal rodents presentin rural households in Yucatan, Mexico.Int Biodeterior Biodegradation 66: 77-81.doi: 10.1016/j.ibiod.2011.-10.006
18. Panti-May JA, Torres-Castro M,Hernández-Betancourt S, Dzul-Rosa-do K, Zavala-Castro J, López-Ávila K,et al. 2015. Detection of Rickettsia
felis in wild mammals from threemunicipalities in Yucatan, Mexico.Ecohealth 12: 523-527. doi: 10.1007/s10393-014-1003-2
19. Panti-May JA, Hernández-BetancourtSF, Torres-Castro MA, Machaín-Williams C, Cigarroa-Toledo N, SodáL, et al. 2016. Population characteristicsof human-commensal rodents present inhouseholds from Mérida, Yucatán, Méxi-co. J Parasite Diversity. doi: 10.13014/K2VD6WCX
20. Sacaramizzino N, Crance JM, JoouanA, DeBriel DA, Stoll F, Garin D. 2001.Comparison of flavivirus universal pri-mer pairs and development of a rapid,highly sensitive heminested reverse-transcription-PCR assay for detection offlaviviruses targeted to a conservedregion of the NS5 gene sequences. J ClinMicobiol 39: 1922-1927. doi: 10.1128/JCM.39.5.1922-1927.2001
21. Torres-Castro MA, Gutiérrez-Ruiz E,Hernández-Betancourt S, Peláez-Sánchez R, Agudelo-Flórez P,Guillermo-Cordero L, Puerto IF.2014. First molecular evidence ofLeptospira spp in synantrhopic rodentscaptured in Yucatan, Mexico. Revue MédVét 165: 213-218.
22. Yan-Jang SH, Higgs S, McElroy-Horne K, Vanlandingham DL. 2014.Flavivirus-mosquito interactions. Viruses6: 4703-4730. doi: 10.3390/v6114703
23. Zaragoza-Quintana EP, Pech-CanchéJM, Sosa-Escalante JE, Hernández-Betancourt SF, León-Paniaguas LS,MacSwiney MC. 2016. Los pequeñosroedores de la Península de Yucatán: co-nocimientos y perspectivas en 114 añosde investigación. Therya 7(2). doi:10.12933/therya-16-367
![WZK hdK ì ð o µ o } u ] ' ( ] } µ ( ~' Z P ] } D } } o ] v ...€¦ · 3urgxwr &iofxor gdv (plvv}hv gh *(( 3uhihlwxud 0xqlflsdo gh &dpslqdv zzz zd\fduerq frp ,1752'8d®2 2v sureohpdv](https://img.document.onl/doc/110x75/5faa674f9ad92775fd4b919e/wzk-hdk-o-o-u-z-p-d-o-v-3urgxwr-iofxor.jpg)
![Slides - Webinar - Sabotadores- v2 - Para baixar … · ^ } ] v } } o u v } µ } o Z ^ } v } _ v µ ^Y µ u^ } u } _ ^K µ ( Ì u } _ ^ E } } v µ ] _](https://img.document.onl/doc/110x75/5ffddc4807a141008b44d3fa/slides-webinar-sabotadores-v2-para-baixar-v-o-u-v-o-z.jpg)
![W } i } µ µ o µ u } v µ } v ] } µ v l U ] v ] v o } µ ] u v } o } o ] v o } v · 2018. 8. 29. · 5(6802 $/0(,'$ 3dwulfld 3urmhwr hvwuxwxudo gh xpd frqvwuxomr hqwhuudgd wlsr](https://img.document.onl/doc/110x75/600ac67c42db355f281e728a/w-i-o-u-v-v-v-l-u-v-v-o-u-v-o-o-v-o.jpg)
![RELATÃ RIO - pesquisa dia das maes · 2020-05-06 · ^ ] D µ v ] ] o ' } À v } r ^ 'Ks ^ µ ] v v ! v ] W } } ( } } v µ u ] } t WZK KE ' ! v ] o µ o } W µ ] À X d } v ] v U](https://img.document.onl/doc/110x75/5f35193f2a32842e1f3f9245/relatf-rio-pesquisa-dia-das-maes-2020-05-06-d-v-o-v-r-.jpg)
![µ u } P u ] v } u } v } µ } } } } u } u o E } ^ ] v } v ] Ì E } W µ } ] À v ] ] v ... · 2016. 12. 21. · 5hvxpr 2emhwlyr 2 remhwlyr ghvwh hvwxgr irl dydoldu rv hihlwrv gh xp](https://img.document.onl/doc/110x75/613067541ecc51586944132a/-u-p-u-v-u-v-u-u-o-e-v-v-oe-e-w-v.jpg)
![W ( v } } µ } t ] o o ] u X & } ^ µ o ] v µ v µ u ] v V u ... · 'hilqlomr gh xp 0rghor 1dflrqdo 'h 5hfrqkhflphqwr grv 6lvwhpdv gd 4xdolgdgh qdv ,qvwlwxlo}hv gh 6huylor 6rfldo](https://img.document.onl/doc/110x75/5fc417d9b4a87144d903ac82/w-v-t-o-o-u-x-o-v-v-u-v-v-u-hilqlomr.jpg)
![9Ano Teste fevereiroV1 19 marta - labmatribeirao · 2019. 4. 27. · í X î X u ] v } ] v P µ o } &'2@ / v ] µ } } } o µ o } µ ( µ X ~ í ì } v } ^ µ P } W } u } o µ o ]](https://img.document.onl/doc/110x75/6113a7222b69ab6eec1defdd/9ano-teste-fevereirov1-19-marta-labmatribeirao-2019-4-27-x-x-u-v.jpg)
![Lista definitiva admitidos · 2018-11-05 · 1 gh ,qvfulomr 1rph &pgxod'rf hp )dowd 3urjudpd gh )rupdomr > ] ( ] v ] ] À v ] } u ] ] } Æ o µ _ } } w } ] u v } } v µ o /d î ì](https://img.document.onl/doc/110x75/5f6c307c65997e6c094222eb/lista-definitiva-2018-11-05-1-gh-qvfulomr-1rph-pgxodrf-hp-dowd-3urjudpd.jpg)
![0$18$/ $WHVWH GH 8VR GH 6HUYLoRV 7HOHI{QLFRV )L ......81,9(56,'$'( )('(5$/ '( 0,1$6 *(5$,6 &(1752 '( &20387$d 2 À X v v ] } o } U ò ò î ó t Z ] } ] t ô Ñ v r u µ W u µ o Z](https://img.document.onl/doc/110x75/6085f6ac29b2e14284750058/018-whvwh-gh-8vr-gh-6huylorv-7hohiqlfrv-l-81956-5-.jpg)
![3WGTGU UGT Q TQUVQ FQ RTxZKOQ NKXTQ FC EQNGnlQ...KDK &hE /KE ( } } µ µ u ] u } µ ] ] } v µ v ] } v P µ o u v } } µ o ] v P ] v & } } l } ( ] ] o } o } u W } µ P o t µ u } v](https://img.document.onl/doc/110x75/6109e3a2fa04e248e26d7f74/3wgtgu-ugt-q-tquvq-fq-rtxzkoq-nkxtq-fc-kdk-he-ke-u-u-.jpg)
![W Ì } o ] v U P µ ] ] } v ] ] o ] Ì u } µ u µ u } } u ] v ...€¦ · W Ì } o ] v U P µ ] ] } v ] ] o ] Ì u } µ u µ u } } u ] v ( } u v ] ] } ] v µ u v }](https://img.document.onl/doc/110x75/5f66b514d61239776070c2a9/w-oe-o-v-u-p-v-o-oe-u-u-u-u-v-w-oe-o-v.jpg)
![o ] o v r Z ¨ í U ñ ] o Z } D µ v ] ] } } } u ^ } µ o µ o · 2020. 6. 5. · 0xqlftslrv 8), ylqwh sru fhqwr gh dfrugr frp rv fulwpulrv gh udwhlr gr )xqgr gh 3duwlflsdomr grv](https://img.document.onl/doc/110x75/5fe209a33c04846967152d1d/o-o-v-r-z-u-o-z-d-v-u-o-o-2020-6-5-0xqlftslrv.jpg)
![W o v } } v ] v P ! v ] } } } ] } ^ v } / v ( } , µ u v ... · P µ o } î ì í õ r v }s U u } v } v v ] } u } W o v } } v ] v P ! v ] E ] } v o U µ ( ] v } v _ À o } µ µ }](https://img.document.onl/doc/110x75/5f6c5552a5439c2cda23bc88/w-o-v-v-v-p-v-v-v-u-v-p-o-.jpg)
![D v µ v } W } } d v ( } u } / v o / v µ ] ] t P ] } v ^d ...files.isec.pt/DOCUMENTOS/SERVICOS/BIBLIO/Teses/Tese_Mest_Davide... · / v o / v µ ] ] t P ] } v ^d D r > µ u ] v !](https://img.document.onl/doc/110x75/5c48cf1e93f3c31f4f7b69b4/d-v-v-w-d-v-u-v-o-v-t-p-v-d-filesisecptdocumentosservicosbibliotesestesemestdavide.jpg)
![v } u t ^ } ] ] o ] µ } / v ] ] o ] v } u µ v ... · / v } u t ^ } ] ] o ] µ } / v ] ] o ] v } u µ v ] } ys// } v P](https://img.document.onl/doc/110x75/5be4fe6309d3f22b448b5d46/v-u-t-o-v-o-v-u-v-v-u-t-o-.jpg)
![6DQWDUpP GH 'H]HPEUR GH $VVXQWR &RQFXUVR … · î Ñ } v µ } E ] } v o W } µ } } v ( ] ] d ] ] } v o W } µ o W } µ P µ](https://img.document.onl/doc/110x75/5bec518109d3f2cb5e8c7e20/6dqwdupp-gh-hhpeur-gh-vvxqwr-rqfxuvr-i-n-v-e-v-o-w-.jpg)
![Z ] } : v ] } W ( ] µ D µ v ] ] o D Z ] u v } u } ] } v ...€¦ · } } Z ] } : v ] } W ( ] µ D µ v ] ] o D Z ] u v } u } ] } v } } í ï l ì óY µ W o](https://img.document.onl/doc/110x75/5fbb1a6cc5d958305744b563/z-v-w-d-v-o-d-z-u-v-u-v-z-v-.jpg)
![D v µ o ' } ] v } d µ ] } À ]...0DQXDO GH *HVWmR GH 'HVWLQRV 7XUtVWLFRV $FHVVtYHLV _ 7XULVPR GH 3RUWXJDO ' />> d >, ^ d ^ _ ^ K / '](https://img.document.onl/doc/110x75/6128363fc12cb25bf84d800f/d-v-o-v-d-0dqxdo-gh-hvwmr-gh-hvwlqrv-7xutvwlfrv-fhvvtyhlv.jpg)
![REGULAMENTO 65º EXAME CORRETORES DE SEGUROS · 2019. 11. 25. · ([dph sdud +delolwdomr gh &ruuhwruhv gh 6hjxurv 3ijlqd gh } v µ u ] } x](https://img.document.onl/doc/110x75/60e1fa6647109c393d2f271b/regulamento-65-exame-corretores-de-seguros-2019-11-25-dph-sdud-delolwdomr.jpg)
![3 - Anexo III Aguaà Rev RCC e RCC em 13 06 2018€¦ · &rpsdqkld gh 6dqhdphqwr %ivlfr gr (vwdgr gh 6mr 3dxor zzz vdehvs frp eu v Æ } /// t µ } } v u ] } r ( ] v v ] } ï](https://img.document.onl/doc/110x75/5f0400ac7e708231d40bd5aa/3-anexo-iii-aguaf-rev-rcc-e-rcc-em-13-06-2018-rpsdqkld-gh-6dqhdphqwr-ivlfr.jpg)
![DOCUMENTO Jornadas SbN 11072021...: } v v ] ^ } o µ ] } v v o E µ o Ì o } v ] À ] Ç µ ] v u ] v o v o u } o / v ( µ µ s î KEd E/ K](https://img.document.onl/doc/110x75/613eef5dc500cf75ab3634d6/documento-jornadas-sbn-11072021-v-v-o-v-v-o-e-o-oe-o-v.jpg)
![FODVLILFDFLyQ GH SDFLHQWHV HQ OD FRQVXOWD · 9DORUDFLyQ \ FODVLILFDFLyQ GH SDFLHQWHV HQ OD FRQVXOWD GHQWDO ^ v Z Ì rd } ] v } í U _ Ì r À } : í U } Ì r> Ì E î U µ Ì r µ](https://img.document.onl/doc/110x75/5f8cbaaa17678a59563fbd9d/fodvlilfdflyq-gh-sdflhqwhv-hq-od-frqvxowd-9dorudflyq-fodvlilfdflyq-gh-sdflhqwhv.jpg)
![3ODQR $QXDO GH $WLYLGDGHV 6RFLRFXOWXUDLV &UHFKH W … · v } ^ } ] o ^ v d ] ^ } µ 3odqr $qxdo gh $wlylgdghv 6rflrfxowxudlv &uhfkh /z^ l í î ñ ] } w ì í](https://img.document.onl/doc/110x75/5fb17bb8b6311739b80425e6/3odqr-qxdo-gh-wlylgdghv-6rflrfxowxudlv-uhfkh-w-v-o-v-d-.jpg)
![Apostila - ResenhaW } P u µ o ^ v ] } µ _ } D v µ o } v ( } Z v Z](https://img.document.onl/doc/110x75/6092ba7ded978160a400fae3/-apostila-resenha-w-p-u-o-v-d-v-o-v-z-v-z.jpg)
![K ] v } W : } µ } Y µ u t } v K ] v } } µ } v P v Z ] ] À](https://img.document.onl/doc/110x75/619d7a29e5ffc10c8d7e3aa7/k-v-w-y-u-t-v-k-v-v-p-v-z-.jpg)
![relatorio 2019 1 - Ipojuca-PE · D ] v ] ] } : µ ] ] v ] ^ ] E ] } v o : µ ] ] v ]](https://img.document.onl/doc/110x75/5f70eb29f4e83d2cb145b332/relatorio-2019-1-ipojuca-pe-d-v-v-e-v-o-v.jpg)
![µ µ ' ! v ] d v ] } ZE u W } ] } }](https://img.document.onl/doc/110x75/62cba7f0088bcc17a757122b/-v-d-v-ze-u-w-.jpg)
![} o ] } v ] } o } P ] µ v ] µ ] µ o U s KWd Z o ] v ] v](https://img.document.onl/doc/110x75/61858e8d3fae02595c6f5651/-o-v-o-p-v-o-u-s-kwd-z-o-v-v-.jpg)
![PRESENTACIîN INSTITUCIONAL...>W} ro( Ì ] v v } o }v u Ç} íñy } µ (µ }vo ( Ì Ç µ oo µ v} }v oµÇ }v ov]À o ]u ]}X v ou } o} } } ]v oµ ] vU µ v o }v }v ] ]( v U }o v Çi](https://img.document.onl/doc/110x75/5e71f16f1578275091135dd2/presentacin-institucional-w-ro-oe-v-v-o-v-u-y-.jpg)